皮膚老化関連成分の産生調整剤、及びその皮膚老化関連成分の産生調整剤を配合した皮膚老化防止用外用剤
【課題】 皮膚細胞に作用することにより、コラーゲン、ラミニン等の細胞外マトリクスを構成しているタンパク質の合成能を向上させ、或いはメラニン合成能を抑制する等、皮膚老化に関連のあるタンパク質や色素等の成分の産生を調整する産生調整剤と、
そのような産生調整剤を配合して優れたシワ抑制効果や色素沈着等の抑制効果を有する皮膚老化防止用外用剤に関し、低分子化された成分を直接皮膚細胞に作用させることにより、コラーゲンやラミニン等の細胞外マトリクスを構成するタンパク質の合成を促進させ、或いはメラニンの生成を抑制し、それによって老化による皮膚のシワやシミ・ソバカスの発生を予防し、或いは発生したシワ、シミ・ソバカスを軽減させて、滑らかでみずみずしく若々しい肌を実現させる皮膚老化防止用外用剤を提供することを課題とする。
【解決手段】 藍藻類の加水分解物を含有することを特徴とする。
そのような産生調整剤を配合して優れたシワ抑制効果や色素沈着等の抑制効果を有する皮膚老化防止用外用剤に関し、低分子化された成分を直接皮膚細胞に作用させることにより、コラーゲンやラミニン等の細胞外マトリクスを構成するタンパク質の合成を促進させ、或いはメラニンの生成を抑制し、それによって老化による皮膚のシワやシミ・ソバカスの発生を予防し、或いは発生したシワ、シミ・ソバカスを軽減させて、滑らかでみずみずしく若々しい肌を実現させる皮膚老化防止用外用剤を提供することを課題とする。
【解決手段】 藍藻類の加水分解物を含有することを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚細胞に作用することにより、コラーゲン、ラミニン等の細胞外マトリクスを構成しているタンパク質の合成能を向上させ、或いはメラニン合成能を抑制する等、皮膚老化に関連のあるタンパク質や色素等の成分の産生を調整する産生調整剤と、
そのような産生調整剤を配合して優れたシワ抑制効果や色素沈着等の抑制効果を有する皮膚老化防止用外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢化社会を迎えた現代では、加齢とともに増加するシワ、シミなどの皮膚の老化症状に対する意識も高まる中、ＱＯＬ向上の流れも加わり、シワ、シミなどの皮膚の老化症状を防止したい、改善したいという要望が高まってきている。そうした要望に応えるべく皮膚に限らず老化に対する研究が盛んに行われている。
【０００３】
皮膚の老化症状であるシワ、シミの発生機序については必ずしも十分に解明されていないが、一般的にシワについては、真皮を構成する細胞外マトリクスの大部分をしめるコラーゲンが加齢や長期紫外線暴露により減少または変性することが一因と考えられている。
【０００４】
下記非特許文献１によれば、コラーゲンが真皮に存在する線維芽細胞内でプロコラーゲンとして生成された後、３本螺旋構造を形成し、プロリン、リジン基が水酸化を受けた後、細胞外に分泌され、分泌された後にプロコラーゲンのＮ末端とＣ末端のプロペプチドが切断され、それぞれの螺旋構造鎖が重合してコラーゲン線維を形成するとの報告がなされている。そして、このようにして形成されるコラーゲン線維は、真皮の柔軟性、弾力性に大きな影響を与え、コラーゲンの減少や変性が皮膚の柔軟性、弾力性の低下を招き、シワの発生につながるものである。
【０００５】
【非特許文献１】鈴木正人、老化防止・美白・保湿化粧品の開発、２００１年、ｐ．１３５〜１３７
【０００６】
一方、近年においては、皮膚の表皮と真皮の境界に存在する表皮基底膜が紫外線や酸化、乾燥などの外的要因によって傷害をうけ、表皮基底膜構造が断片、多重化していることが、下記非特許文献２等に報告されている。表皮基底膜は表皮細胞の分化および機能維持に重要な役割を果たしており、この基底膜構造の傷害が蓄積することによって、真皮の細胞外マトリクスに構造異常を起こさせ、しわ、たるみの発生につながる。
【０００７】
【非特許文献２】天野聡、化粧品技術者会誌、第３５巻 第１号、２００１年、ｐ．１〜７
【０００８】
皮膚の老化症状を改善する手段としては、皮膚におけるコラーゲン含量およびその機能に着目して、ブタ、ウシ、魚類などを起源とするコラーゲンが種々の化粧料に配合されている。しかし、これらの化粧料は、コラーゲンを皮膚表面に塗布するだけのものであり、コラーゲンが高分子化合物であることから塗布しても皮膚に吸収されにくい。
【０００９】
また、コラーゲンと同様に細胞外マトリクスの構成成分であるラミニンも、皮膚の柔軟性、弾力性の維持、シワの発生に関連のあるタンパク質であることが近年報告されており、ラミニンの合成を促進する合成促進剤として下記特許文献１のような出願がなされている。しかしながら、このような化粧料では、皮膚への透過性や安定性の問題からシワのような皮膚トラブルを満足しうる程度まで改善することは困難である。
【００１０】
【特許文献１】特開２００３−１３７７６７公報
【００１１】
一方、シミについては、ホルモンの異常や太陽光に含まれる紫外線の刺激が原因となってメラニン色素が生合成され、これらが皮膚内に異常沈着するものと考えられている。このメラニン色素は、皮膚内では表皮基底層に存在するメラニン細胞（メラノサイト）内のメラニン生成顆粒（メラノソーム）において生合成され、生合成されたメラニンは隣接する表皮細胞へ拡散する。このメラノサイト内におけるメラニン生成反応は、次のようなものが考えられている。すなわち、アミノ酸であるチロシンが酵素チロシナーゼの作用によりドーパキノンとなり、これが酵素的または非酵素的に反応が進行し、最終的に黒色のメラニンが生成される過程がメラニン色素の生成過程である。従って、こうしたメラニン色素の生成反応の第一段階であるチロシナーゼの作用を抑制することがメラニン生成の抑制に重要である。
【００１２】
こうしたことから、従来より日焼け後の色素沈着・しみ・そばかす等の予防および改善を目的に、乳液、化粧水、クリーム、ジェル、パック、洗浄料、ファンデーション、軟膏などの皮膚外用剤には、アスコルビン酸類、グルタチオンなどの美白成分が配合されている。たとえばアスコルビン酸を配合するものとして、下記特許文献２や特許文献３のような出願がなされ、グルタチオンを配合するものとして、下記特許文献４のような出願がなされている。
【００１３】
【特許文献２】特開２００３−１０４８６４公報
【特許文献３】特開２００３−７３２５２公報
【特許文献４】特開平５−３０１８１１公報
【００１４】
しかし、これらの美白成分を配合した化粧料では、美白成分の効果が十分でなかったり、あるいは製剤中で変質するなどして十分な効果が得られず、シミのような皮膚トラブルを満足しうる程度まで改善することは困難である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、上記のような問題を解決するものであり、低分子化された成分を直接皮膚細胞に作用させることにより、コラーゲンやラミニン等の細胞外マトリクスを構成するタンパク質の合成を促進させ、或いはメラニンの生成を抑制し、それによって老化による皮膚のシワやシミ・ソバカスの発生を予防し、或いは発生したシワ、シミ・ソバカスを軽減させて、滑らかでみずみずしく若々しい肌を実現させる皮膚老化防止用外用剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者等は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、藍藻類の加水分解物がコラーゲンやラミニン等の細胞外マトリクスを構成するタンパク質の優れた合成促進効果やメラニン生成抑制効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち皮膚老化関連成分の産生調整剤に係る請求項１記載の発明は、藍藻類の加水分解物を含有することを特徴とする。また細胞外マトリクス構成タンパク質の合成促進及びメラニンの生成抑制作用を有する皮膚老化関連成分の産生調整剤に係る請求項２記載の発明は、藍藻類の加水分解物を含有することを特徴とする。
【００１８】
さらに請求項３記載の発明は、請求項１又は２記載の皮膚老化関連成分の産生調整剤において、藍藻類がオルソスピラ属であることを特徴とする。さらに皮膚老化防止用外用剤に係る請求項４記載の発明は、請求項１乃至３のいずれかに記載の皮膚老化関連成分の産生調整剤を配合したことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によって、コラーゲンやラミニン等の細胞外マトリクスを構成するタンパク質の優れた促進効果や、優れたメラニン生成抑制効果を有し、人体に対して安全性の高い
細胞外マトリクス構成タンパク質の合成促進及びメラニンの生成抑制作用を有する皮膚老化関連成分の産生調整剤、及びその産生調整剤を配合した皮膚老化防止用外用剤を提供することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の皮膚老化関連成分の産生調整剤は、上述のように藍藻類の加水分解物を含有するものである。ここで「含有する」とは、本発明の皮膚老化関連成分の産生調整剤が藍藻類の加水分解物のみからなるものであってもよく、また皮膚老化関連成分の産生調整剤に藍藻類の加水分解物以外のものが含有されていてもよいことを意味する。
【００２１】
本発明の皮膚老化関連成分の産生調整剤に用いる藍藻類としては、たとえば、ユレモ目のオルソスピラ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ）属、スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）属、ハロスピルリナ（Ｈａｌｏｓｐｉｒｕｌｉｎａ）属等、ネンジュモ目のアナベナ（Ａｎａｂｅｎａ）属、ノーストック（Ｎｏｓｔｏｃ）属等、クロオコックス目のシネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属等が例示される。
【００２２】
これらの藍藻類のなかでも、好ましくはユレモ目、より好ましくはオルソスピラ属、スピルリナ属、ハロスピルリナ属の藻が用いられる。これら３属の藻は、いずれも「スピルリナ」と通称されており、タンパク質の含有量がきわめて多いことから健康食品等として広く使用されている。
【００２３】
オルソスピラ属の藍藻類としては、たとえばＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ＰＣＣ８００５、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｆｕｓｈｉｆｏｒｍｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ＦＡＣＨＢ４３８、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ＦＡＣＨＢ４３９、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｎｔｅｎｓｉｓ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｎｔｅｎｓｉｓ）、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ＯＵＱＤＳ６、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．等を使用することができる。
【００２４】
またスピルリナ属の藍藻類としては、たとえばＳｐｉｒｕｌｉｎａ ＭＰＩＳ４、
Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｓｔｒａｉｎＣＣＣ、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｓｕｂｓａｌａ等を使用することができる。さらにハロスピルリナ属の藍藻類としては、Ｈａｌｏｓｐｉｒｕｌｉｎａ ＣＣＣ、Ｈａｌｏｓｐｉｒｕｌｉｎａ ＭＰＩ、Ｈａｌｏｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｔａｐｅｔｉｃｏｌａ等を使用することができる。
【００２５】
本発明においては、上述のように藍藻類の加水分解物を好適に使用することができる。
本発明者等が鋭意研究したところ、特にミャンマー国内のＹｅ Ｋｈａｒｒ（イェーカー）湖及びＴｗｉｎ Ｔａｕｎｇ（ツウィンタン）湖の各湖に生息する藻に、コラーゲンやラミニン等の細胞外マトリクスを構成するタンパク質の優れた促進効果や、優れたメラニン生成抑制効果が認められることを見出した。
【００２６】
これらの藻について１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の部分相同性検索を行ったところ、その相同性は次のとおりであった。
〔Ｙｅ Ｋｈａｒｒ（イェーカー）湖の藻〕
Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ＰＣＣ８００５との相同性 ：９８．８％
Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａとの相同性 ：９９．３％
Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｆｕｓｈｉｆｏｒｍｉｓとの相同性 ：９９．３％
Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｎｔｅｎｓｉｓとの相同性 ：９８．８％
Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．との相同性 ：９８．４％
Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．との相同性 ：９４．２％
Ａｎａｂｅｎａ ｓｐ．との相同性 ：８８．２％
Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐｏｎｇｅｌｉａｅとの相同性 ：８９．７％
Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｓｔｒａｉｎＣＣＣとの相同性 ：９１．０％
Ｈａｌｏｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｔａｐｅｔｉｃｏｌａとの相同性：８９．２％
【００２７】
〔Ｔｗｉｎ Ｔａｕｎｇ（ツウィンタン）湖の藻〕
Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ＰＣＣ８００５との相同性 ：９９．１％
Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａとの相同性 ：９９．５％
Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｆｕｓｈｉｆｏｒｍｉｓとの相同性 ：９９．５％
Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｎｔｅｎｓｉｓとの相同性 ：９９．１％
Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．との相同性 ：９８．８％
Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．との相同性 ：９４．７％
Ａｎａｂｅｎａ ｓｐ．との相同性 ：８９．２％
Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐｏｎｇｅｌｉａｅとの相同性 ：９０．０％
Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｓｔｒａｉｎＣＣＣとの相同性 ：９１．６％
Ｈａｌｏｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｔａｐｅｔｉｃｏｌａとの相同性：９０．１％
【００２８】
以上の結果からも明らかなように、Ｙｅ Ｋｈａｒｒ（イェーカー）湖の藻及び
Ｔｗｉｎ Ｔａｕｎｇ（ツウィンタン）湖の藻は、ユレモ目リングビア属、ネンジュモ目アナベナ属、ユレモ目ユレモ属（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐｏｎｇｅｌｉａｅ）、ユレモ目スピルリナ属、ユレモ目ハロスピルリナ属の各藍藻類との相同性に比べ、ユレモ目オルソスピラ属の藍藻類との相同性が高いことから、Ｙｅ Ｋｈａｒｒ（イェーカー）湖の藻及びＴｗｉｎ Ｔａｕｎｇ（ツウィンタン）湖の藻は、いずれもオルソスピラ属に属する藍藻類であると認定することができる。
【００２９】
ちなみに、Ｙｅ Ｋｈａｒｒ（イェーカー）湖の藻とＴｗｉｎ Ｔａｕｎｇ（ツウィンタン）湖の藻との相同性は９９．０％であった。この２種の藍藻類をミャンマースピルリナと称する。尚、上記１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の部分相同性は、得られたスピルリナＤＮＡから１６ＳｒＲＮＡ遺伝子専用プライマーを用いて１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の遺伝領域をＰＣＲ法により増幅した後、ABI PRISM 310 Genetic Analyzer（PE Biosysytems社製）を用いたサーマルシークエンス法により塩基配列を決定し、NCBI（National Center for Biotechnology Information）の生物検索ソフトBLASTを用いて求めた。
尚、ＰＣＲ法で用いたプライマーの塩基配列は次のとおりである。
（１６ＳｒＲＮＡ Ｆｏｒｗａｒｄ）
５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’
（１６ＳｒＲＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ）
５’−ＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣ−３’
またＤＮＡポリメラーゼとしては、AmpliTaq Gold DNA polymerase (PE Biosystems) を用いた。
さらに温度条件は次の通りである。
（１）９５℃ １０分
（２）９５℃ １分
（３）４７℃〜５６℃ １分
（４）７２℃ １分
（５）７２℃ １０分
尚、（２）〜（４）の変性、アニーリング、ポリメラーゼ伸長の各工程は、３０サイクル行った。また（３）のアニーリングでは４７℃〜５６℃の温度範囲で最適の条件を求め、それを温度条件とした。
【００３０】
本発明の皮膚老化関連成分の産生調整剤には、コラーゲンやラミニン等の細胞外マトリクス構成タンパク質の合成促進作用のみを有する藍藻類の加水分解物、及びメラニンの生成抑制作用のみを有する藍藻類の加水分解物のいずれをも含む。しかしながら、上記オルソスピラ属の藍藻類、とりわけ上記ミャンマースピルリナには、細胞外マトリクス構成タンパク質の合成促進作用と、メラニンの生成抑制作用との双方の作用が認められるので、特に好適に使用することができる。尚、細胞外マトリクスを構成するタンパク質としては、上記コラーゲンやラミニンの他、エラスチン、プロテオグリカン等のタンパク質もあり、これらのタンパク質の合成を促進することによっても、皮膚老化の防止が図られるものと認められる。
【００３１】
本発明の藍藻類の加水分解物は、藻類を構成するタンパク質が加水分解されて生成するポリペプチド、アミノ酸、アミンなどで構成されている。前記加水分解物は、たとえば平均分子量１００〜２００００のペプチド混合物を含んでいることが好ましい。
【００３２】
加水分解は、藍藻類またはその粉末などの処理物に、たとえば酸、アルカリ、酵素等を作用させることにより行われる。酸としては、たとえば塩酸、リン酸、硫酸、硝酸などの無機酸、ｐ−トルエンスルホン酸（ＰＴＳ）、メタンスルホン酸などの有機酸などが挙げられる。前記酸としては添加後に系内で酸を生成する水溶性化合物を用いてもよい。酸の使用量は、用いる酸の濃度および種類によって異なるが、例えば、１〜６０重量％程度で使用される。酸の使用量、濃度、種類を適宜選択することにより、加水分解処理物の平均分子量を調整することができる。
【００３３】
アルカリとしては、たとえばアンモニア、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウムなどのアルカリ金属またはアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩などが例示できる。アルカリは、用いるアルカリの濃度および種類によって異なるが、例えば１〜６０重量％程度で使用される。アルカリの使用量、濃度、種類を適宜選択することにより、加水分解処理物の平均分子量を調整することができる。
【００３４】
上記酸およびアルカリによる加水分解は、たとえば藍藻類またはその処理物の水に分散させた分散懸濁液に酸またはアルカリを添加し、常圧、減圧、加圧の何れかの雰囲気下、加熱下で撹拌または還流させることにより行われる。加水分解時の処理温度は、たとえば４０〜１１０℃、好ましくは、７０〜１００℃、特に好ましくは７５〜９５℃である。処理時間は、たとえば２〜１２時間、好ましくは５〜１０時間程度である。加水分解時の圧力、温度、反応時間は、加水分解により生成されるペプチド混合物の平均分子量に応じて適宜選択される。酸またはアルカリによる加水分解処理後は、速やかに中和処理を行うことにより、所望の平均分子量のペプチド混合物からなる加水分解物を得ることができるため好ましい。さらに、必要に応じて減圧真空蒸留操作による脱アンモニア処理、電気透析器を用いた脱塩処理、活性炭処理、濾過処理等の処理が行われる。たとえばアルカリによる加水分解処理後には、減圧真空蒸留操作による脱アンモニア処理を行うことが好ましい。アンモニアの除去が不十分であると、後の変色の原因となるためである。
【００３５】
加水分解に用いる酵素としては、タンパク質を加水分解するプロテアーゼ（アルカリプロテアーゼ等）、ペプチダーゼが好ましく、例えばＲｈｉｚｏｐｕｓ（リゾプス）属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（アスペルギルス）属、Ｍｕｃｏｒ（ムコール）属、Ｂａｃｉｌｕｓ（バチルス）属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（シュードモナス）属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ストレプトコッカス）属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（エシェリシア）属等の微生物由来の酵素、トリプシン、レニン、パンクレアチン等の動物由来の酵素、パパイン、ブロメライン、フィシン等の植物由来の酵素等を用いることができる。好ましくは、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ（リゾプス）属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（アスペルギルス）属、Ｂａｃｉｌｕｓ（バチルス）属由来の酵素が用いられ、これらの精製品や粗製品を単独でまたは複数を組み合わせて使用される。使用する酵素により特性の異なる加水分解物（ペプチド混合物）を得ることができる。酵素反応条件としては、特に限定されず、用いる酵素の種類に応じて適宜選択される。酵素の添加量は、加水分解物の平均分子量が上記の範囲内となる量を用いるのが好ましく、藍藻類の乾燥重量１ｇに対するタンパク分解酵素の活性単位を１０〜５００００単位、好ましくは１００〜３００００単位の範囲から適宜選択される。
【００３６】
こうして得られた加水分解物は、さらに慣用の分離、濃縮、精製手段を施すことができる。藍藻類は、通常、フィコシアニン（青色色素）等の水溶性色素、クロロフィル、カロチン等の脂溶性色素を豊富に含んでいる。本発明に用いる藍藻類の加水分解物は、上記方法により得た加水分解物に色素除去処理を施すことも可能である。色素の除去方法としては、遠心分離、濾過、溶媒抽出、活性炭等による吸着処理などの分離精製手段を用いることができる。濾過処理は、例えば、濾紙、濾布、メンブレンフィルターなどを用いて行うことができる。
【００３７】
溶媒抽出に用いる溶媒としては、有色色素が溶解しうる溶媒であれば特に限定されず、たとえばアルコール、ケトン、エーテル、酢酸エチル等のエステルを用いることができる。なかでもアルコールが好ましく、化粧品用途の観点からエチルアルコール等の低級アルコールが好ましく用いられる。溶媒抽出は、前記溶媒を添加し、たとえば所定時間静置する方法、加熱還流操作を行う方法により実施される。脂溶性色素は前記抽出溶媒を添加後、静置することにより除去することも可能である。一方、藍藻類に水溶性色素が非常に多く含まれており、これらの水溶性色素の除去を目的とする場合には、静置では十分に色素が除去されず、加熱還流操作を施すことが好ましい。
【００３８】
吸着処理には、たとえば活性炭などの多孔性物質を用いることができる。吸着は、たとえば活性炭を添加し、たとえば１０分〜５時間、好ましくは３０分〜３時間撹拌することによって行われる。
【００３９】
これらの色素除去手段は、単独でまたは複数組み合わせて用いられる。藻類は、一般に色素の含有量が多いため、色素を十分に除去するためには、通常、上記の手段を２以上組み合わせたり、除去操作を繰り返すことを要する。また、脂溶性色素は比較的低温で除去することが可能であるが、水溶性色素を除去する場合には、加熱下で還流するなどの操作を行うことが好ましい。
【００４０】
色素除去工程における処理温度は、処理手段に応じて適宜選択できるが、たとえば０〜１２０℃、好ましくは０〜１００℃、より好ましくは０〜８５℃、特に４〜７５℃程度である。水溶性色素の除去処理は低温で行うことが多いが、雑菌の混入を防ぐことができる範囲で室温〜８５℃で行うこともできる。色素除去は、減圧下、加圧下、常圧下のいずれかの雰囲気下で行ってもよい。色素除去により、淡黄色の処理液が得られる。
【００４１】
上記方法により色素を除去することにより、同時に臭いを除くこともできる点で有利である。色素除去工程は、上記の加水分解処理の前工程および後工程のいずれに設けてもよいが、色素除去工程の後に加水分解処理工程を設けることが好ましい。
【００４２】
本発明の皮膚老化防止剤中のスピルリナ加水分解物の配合量は、通常乾燥固形分として、０．０００１〜５０重量％とすることが好ましい。０．０００１重量％未満では本発明の効果が充分に得られない可能性があり、一方、５０重量％を越えても、その増量に見合った効果の向上は認められないからである。この観点から、０．００１〜１０重量％が特に好ましい。
【００４３】
本発明の老化防止用皮膚外用剤中には本発明の効果を損なわない範囲において、一般に化粧料で用いられ、或いは医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤に用いられる各種任意成分を必要に応じて適宜配合することができる。このような任意成分として、例えば、精製水、エタノール、油性成分、保湿剤、増粘剤、防腐剤、乳化剤、薬効成分、粉体、紫外線吸収剤、色素、香料、乳化安定剤等を挙げることができる。
【００４４】
本発明の老化防止用皮膚外用剤の形態は、液状、乳液、軟膏、クリーム、ゲル、エアゾール、石けん等皮膚に適用可能な性状のものであれば問われるものではなく、必要に応じて適宜基剤成分等を配合して所望の形態の老化防止用皮膚外用剤を調製することができる。また、本発明の老化防止用皮膚外用剤は、医薬品、医薬部外品又は化粧品等の多様な分野において適用可能である。
【００４５】
本発明の老化防止用皮膚外用剤は、老化によるシワ、シミ・ソバカスの予防や改善に用いることが可能である。なお、ここに示した老化症状は例示であり、これらの老化症状に本発明の皮膚老化関連成分の産生調整剤、及びその産生調整剤を含有する老化防止用皮膚外用剤の適用が限定されるものではない。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明の実施例について説明する。
【００４７】
（実施例１）
ミャンマースピルリナ（ミャンマー国Ｙｅ Ｋｈａｒｒ（イェーカー）湖に生息する藍藻類ユレモ目オルソスピラ属の種）を６０℃で乾燥して得た粉末１容量部に純水５容量部を加え、４℃で２日間放置した後、遠心分離と濾過を繰り返し行い、６０℃で乾燥することにより、青色色素が除去されたスピルリナ粉末を得た。得られた乾燥粉末１容量部にエチルアルコール５容量部を加え、４つ口フラスコに移し、４時間加熱還流を行った。系外に取り出した後、濾液に着色が見られなくなるまで濾過を繰り返し行い、スピルリナの粗抽出液物を得た。さらに、６０℃で乾燥することにより、スピルリナの粗抽出物の乾燥粉末を得た。
【００４８】
（実施例２）
実施例１で得た乾燥粉末１容量部と１０重量％濃度水酸化ナトリウム水溶液５容量部とを入れ、８５℃で６時間、加熱還流した。系外に移し、減圧真空蒸留操作により、脱アンモニア処理を行い、直ちに１０重量％濃度塩酸を加えて処理液を中和した（ｐＨ６〜７．５）。濾過操作を繰り返し行うことにより、透明な液体を回収した後、電気透析器を用いて脱塩処理を行った（４μＳ以下）。さらに以下の方法で活性炭処理を行った。すなわち、１重量％の活性炭を加えて２時間撹拌し、静置後、濾紙による濾過処理、次いでφ０．２μｍメンブレンフィルターによる濾過処理を施すことにより、スピルリナの加水分解物を得た。
【００４９】
（実施例３）
４つ口フラスコに、実施例１で得た乾燥粉末１容量部と４Ｎ塩酸５容量部とを入れ、８５℃で８時間、加熱還流した。系外に移し、４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えて処理液を中和した（ｐＨ６〜７．５）。濾過操作を繰り返し行うことにより、透明な液体を回収した後、電気透析器を用いて脱塩処理を行った（４μＳ以下）。さらに以下の方法で活性炭処理を行った。すなわち、１重量％の活性炭を加えて２時間撹拌し、静置後、濾紙による濾過処理、次いでφ０．２μｍメンブレンフィルターによる濾過処理を施すことにより、スピルリナの加水分解物を得た。
【００５０】
（実施例４）
実施例１で得た乾燥粉末１容量部に純水５容量部を入れ、ｐＨ９．５に調製した後、４つ口フラスコへ移し、タンパク質分解酵素［アルカリプロテアーゼ（長瀬産業社製）：力価５万ユニット］０．００２容量部を加え、３７℃で２時間保持することにより酵素処理を施した。系外に移し、４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用いて処理液をｐＨ１１以上に調整した後、減圧真空蒸留操作によりアンモニアを除去した。濾過操作を繰り返し行うことにより、透明な液体を回収した後、電気透析器を用いて脱塩処理を行った（４μＳ以下）。さらに以下の方法で活性炭処理を行った。すなわち、１重量％の活性炭を加えて２時間撹拌し、静置後、濾紙による濾過処理、次いでφ０．２μｍメンブレンフィルターによる濾過処理を施すことにより、スピルリナの加水分解物を得た。
【００５１】
（試験例１）
〔正常ヒト皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン合成能の測定〕
正常ヒト皮膚線維芽細胞（Cascade Biologics社製）を、１０容量％ウシ胎児血清（ＩＣＮ社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（シグマ社製）に細胞密度が１０×１０4個／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルマイクロプレート（ＩＷＡＫＩ社製）へ１ｍｌずつ播種し、ＣＯ2インキュベーター（９５容量％空気、５容量％二酸化炭素）内、３７℃の条件下で４８時間培養した。
【００５２】
４８時間培養後、マイクロプレート中の培地を除去し、あらかじめスピルリナ加水分解物（実施例２）が最終濃度０．０１％〜１．０重量％となるように添加されたウシ胎児血清を含まないダルベッコ改変イーグル培地（シグマ社製）を加えて、ＣＯ2インキュベーター（９５容量％空気、５容量％二酸化炭素）内、３７℃の条件下で培養し、４８時間後、培養上清を回収した。
【００５３】
上記のようにして得られた培養上清を用いてコラーゲン合成能を測定した。
コラーゲン合成能は、プロコラーゲン タイプＩ Ｃ−ペプチド ＥＩＡキット（Ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅＩ Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ （ＰＩＰ） ＥＩＡ Ｋｉｔ：タカラバイオ社製）を用いて行った。プロコラーゲン タイプＩ Ｃ−ペプチドは、細胞内で合成されたＩ型コラーゲンの前駆体であるＩ型プロコラーゲンが細胞外へ分泌される時にエンドペプチダーゼにより切断される遊離ペプチドで、生体内のコラーゲン合成量を反映する生化学的指標である。
【００５４】
すなわち、抗ＰＩＰモノクローナル抗体がコートされたマイクロプレートに、適宜希釈された培養上清とペルオキシダーゼ標識抗ＰＩＰモノクローナル抗体を加えて、３時間、３７℃で反応させた。その後、洗浄を行い、ペルオキシダーゼ用基質溶液を加えて発色させ、１Ｎ硫酸を加えた後、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に測定したＰＩＰ標準液から標準曲線を作成し、被験物の吸光度からＰＩＰ濃度を求めた。スピルリナ加水分解物のコラーゲン合成促進効果はダルベッコ改変イーグル培地のみで培養した場合のコラーゲン合成能、すなわちＰＩＰ量を１００とした場合の値（比率）で示した。その結果を表１に示す。
【００５５】
【表１】
【００５６】
表１からも明らかなようにスピルリナ加水分解物は正常ヒト皮膚線維芽細胞のコラーゲン合成能を促進させることがわかった。
【００５７】
（試験例２）
〔正常ヒト皮膚線維芽細胞におけるラミニン合成能の測定〕
正常ヒト皮膚線維芽細胞（Cascade Biologics社製）を、１０容量％ウシ胎児血清（ＩＣＮ社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（シグマ社製）に細胞密度が１０×１０4
個／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルマイクロプレート（ＩＷＡＫＩ社製）へ１ｍｌずつ播種し、ＣＯ2インキュベーター（９５容量％空気、５容量％二酸化炭素）内、３７℃の条件下で４８時間培養した。４８時間培養後、マイクロプレート中の培地を除去し、あらかじめスピルリナ加水分解物（実施例２）が最終濃度０．０１〜１．０重量％となるように添加されたウシ胎児血清を含まないダルベッコ改変イーグル培地（シグマ社製）を加えて、ＣＯ2インキュベーター（９５容量％空気、５容量％二酸化炭素）内、３７℃の条件下で培養し、４８時間後、培養上清を回収した。
【００５８】
上記のようにして得られた培養上清を用いてラミニン合成能を測定した。ラミニン合成能は、ラミニン ＥＩＡキット（Ｌａｍｉｎｉｎ ＥＩＡ Ｋｉｔ：タカラバイオ社製）を用いて行った。すなわち、抗ヒトラミニンモノクローナル抗体がコートされたマイクロプレートに適宜希釈された培養上清加えて１時間、２５℃で反応させた。洗浄を行い、ペルオキシダーゼ標識抗ラミニンモノクローナル抗体を加えて、１時間、２５℃で反応させた。その後、洗浄を行い、ペルオキシダーゼ用基質溶液を加えて発色させ、１Ｎ硫酸を加えた後、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に測定したヒトラミニン標準液から標準曲線を作成し、被験物の吸光度からラミニン濃度を求めた。スピルリナ加水分解物のラミニン合成促進効果はダルベッコ改変イーグル培地のみで培養した場合のラミニン量を１００とした場合の値（比率）で示した。その結果を表２に示す。
【００５９】
【表２】
【００６０】
表２からも明らかなようにスピルリナ加水分解物は正常ヒト皮膚線維芽細胞のラミニン合成能を促進させることがわかった。
【００６１】
（試験例３）
〔ヘアレスマウスにおける長期紫外線照射による皮膚変化に対する加水分解スピルリナ分解物の効果〕
実験動物としてヘアレスマウス（Ｓｋｈ／ＨＲ−１）雌（６週齢）を用い、東芝ＦＬ２０Ｓ・Ｅランプにて低用量のＵＶＢ（９５ｍＪ／ｃｍ2／日）を週５回、１０週間、背部皮膚に照射することにより、シワを形成させる方法を用いた。塗布試料は、加水分解スピルリナ分解物を１０％含有した２０％１，３−ブチレンクリコール溶液とし、ブランクは２０％１，３−ブチレンクリコールとし、各群６匹に対して４週間試料を塗布し、塗布終了後にヘアレスマウス背部のシワ程度を下記に示す基準をもとに肉眼により判定した。
【００６２】
各群の肉眼判定の基準を表３に示し、判定結果を平均化し、表４に示した。
【００６３】
【表３】
【００６４】
【表４】
【００６５】
表４からも明らかなように加水分解スピルリナ分解物を塗布することにより、シワの平均スコアが低下し、紫外線により誘発されたシワが改善されたことが示された。
【００６６】
（試験例４）
〔小ジワへの改善効果〕
上記のとおり、正常ヒト線維芽細胞におけるコラーゲン合成促進効果および紫外線によりマウス背部皮膚に誘発させたシワの改善効果をもつ加水分解スピルリナ分解物を配合したクリームを下記のような製造方法にて調製し、皮膚の老化症状である小ジワに対する改善効果を検討した。
【００６７】
スクワレン、セチルイソオクタノエート、およびマイクロクリスタリンワックスを加熱溶解後、粘土鉱物、ＰＯＥグリセロールトリイソステアリン酸エステル（界面活性剤）を加え、７０℃に保ち、均一に分散・溶解して油性ゲルを得た。
次に、加水分解スピルリナ分解物を所定濃度となるように精製水に溶解し、７０℃に加温した後、油性ゲルの中へ十分に撹拌しながらゆっくりと添加した。ホモミキサーで均一に混合した後、減圧下にて脱気をし、室温まで冷却し、クリームを得た。このようにして得られたクリームの組成および配合比は次のとおりである。
【００６８】
（処方例１）
組成 配合比（重量％）
スクワレン ２０ ％
セチルイソオクタノエート ８．５％
マイクロクリスタリンワックス １．０％
粘土鉱物 １．３％
ＰＯＥグリセロールトリイソステアリン酸エステル ０．２％
加水分解スピルリナ分解物 ５．０％
水 残量
【００６９】
（比較例１）
組成 配合比（重量％）
スクワレン ２０ ％
セチルイソオクタノエート ８．５％
マイクロクリスタリンワックス １．０％
粘土鉱物 １．３％
ＰＯＥグリセロールトリイソステアリン酸エステル ０．２％
水 残量
【００７０】
女性パネル（３３〜５２歳）２０名をランダムに２グループに分け、一方のグループには処方例１のクリームを、もう一方のグループには比較例１のクリームを、毎日朝と夜の２回、２ヶ月間にわたって洗顔後に顔面に塗布した。試験開始前および終了後の肌状態を比較して評価した。評価は、肉眼判定によりクリーム塗布による小ジワの改善度を表５に示す基準に従い行った。
【００７１】
【表５】
【００７２】
各群における各パネルの小じわ改善度の評価点を合計し、表６に示した。
【００７３】
【表６】
【００７４】
表６からも明らかなように処方例３を用いたパネルに小ジワの改善度が高く、加水分解スピルリナ分解物を含有するクリームが小ジワの改善に効果があることが明らかとなった。
【００７５】
（試験例５）
〔メラニン生成抑制試験〕
マウス由来のＢ１６メラノーマ培養細胞を用いた。１０％牛胎児血清（ＩＣＮ社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（シグマ社製）にＢ１６メラノーマ細胞を懸濁し、６ウェルマイクロプレート（ＩＷＡＫＩ社製）に播種し、ＣＯ2インキュベーター（９５容量％空気、５容量％二酸化炭素）内、３７℃の条件下で２４時間培養した。
【００７６】
２４時間培養後、マイクロプレート中の培地を除去し、あらかじめスピルリナ加水分解物（実施例２）が最終濃度０．０１％〜１．０重量％となるように添加された１０％牛胎児血清（ＩＣＮ社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（シグマ社製）を加えて、ＣＯ2インキュベーター（９５容量％空気、５容量％二酸化炭素）内、３７℃の条件下で７日間培養した。培地を除去し、ＰＢＳ１ｍｌで１回洗浄したのち、０．２ｍｌの３Ｎ水酸化ナトリウム溶液を加えて、細胞を完全に溶解した。この細胞溶解液の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。標準メラニンに合成メラニン（シグマ社製）を用いて検量線を作成し、メラニン量を求めた。また、細胞溶解液中のタンパク質量はプロテインアッセイ（バイオラッド社製）を用いて求めた。メラニン生成量はタンパク質量あたりのメラニン量で比較した。スピルリナ加水分解物のメラニン合成抑制効果は１０％牛胎児血清（ＩＣＮ社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地のみで培養した場合のメラニン生成量を１００とした場合の値（比率）で示した。その結果を表７に示す。
【００７７】
【表７】
【００７８】
表７からも明らかなようにスピルリナ加水分解物はマウス由来のＢ１６メラノーマ培養細胞のメラニン産生量を抑制させることがわかる。
【００７９】
（試験例６）美白効果試験
上記のとおり、優れたメラニン合成抑制剤であるスピルリナ加水分解物を配合した化粧水を下記製法にて調製し、その美白効果を調べた。
ＰＯＥ（２０）オレイルアルコールエーテル（界面活性剤）、メチルセルロースおよびクインスシード（増粘剤）、エタノールを含有する化粧水基剤を調製し、所定濃度のスピルリナ加水分解物を添加した。得られた処方例２の化粧水の組成及び配合比は次のとおりである。
【００８０】
（処方例２）
組成 配合比（重量％）
ＰＯＥ（２０）オレイルアルコールエーテル ０．５％
メチルセルロース ０．２％
クインスシード ０．１％
エタノール １０ ％
スピルリナ加水分解物 ３．０％
水 残量
【００８１】
（比較例２）
組成 配合比（重量％）
ＰＯＥ（２０）オレイルアルコールエーテル ０．５％
メチルセルロース ０．２％
クインスシード ０．１％
エタノール １０ ％
水 残量
【００８２】
女性パネル（２９〜５４歳）２０名をランダムに２グループに分け、一方のグループには処方例２の化粧水を、もう一方のグループには比較例２の化粧水を、毎日朝と夜の２回、２ヶ月間にわたって洗顔後に顔面に塗布した。試験開始前および終了後の肌状態を比較して評価した。評価は、肉眼判定により化粧水塗布による美肌効果を表８の基準によって評価した。
【００８３】
【表８】
【００８４】
表９に美白効果試験の結果を示す。
【００８５】
【表９】
【００８６】
表９からも明らかなように処方例２を用いたパネルに肌のくすみに対する有効性が認められ、加水分解スピルリナ分解物を含有する化粧水が肌のくすみなどの予防、改善することができ、美しい肌とすることが明らかとなった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚細胞に作用することにより、コラーゲン、ラミニン等の細胞外マトリクスを構成しているタンパク質の合成能を向上させ、或いはメラニン合成能を抑制する等、皮膚老化に関連のあるタンパク質や色素等の成分の産生を調整する産生調整剤と、
そのような産生調整剤を配合して優れたシワ抑制効果や色素沈着等の抑制効果を有する皮膚老化防止用外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢化社会を迎えた現代では、加齢とともに増加するシワ、シミなどの皮膚の老化症状に対する意識も高まる中、ＱＯＬ向上の流れも加わり、シワ、シミなどの皮膚の老化症状を防止したい、改善したいという要望が高まってきている。そうした要望に応えるべく皮膚に限らず老化に対する研究が盛んに行われている。
【０００３】
皮膚の老化症状であるシワ、シミの発生機序については必ずしも十分に解明されていないが、一般的にシワについては、真皮を構成する細胞外マトリクスの大部分をしめるコラーゲンが加齢や長期紫外線暴露により減少または変性することが一因と考えられている。
【０００４】
下記非特許文献１によれば、コラーゲンが真皮に存在する線維芽細胞内でプロコラーゲンとして生成された後、３本螺旋構造を形成し、プロリン、リジン基が水酸化を受けた後、細胞外に分泌され、分泌された後にプロコラーゲンのＮ末端とＣ末端のプロペプチドが切断され、それぞれの螺旋構造鎖が重合してコラーゲン線維を形成するとの報告がなされている。そして、このようにして形成されるコラーゲン線維は、真皮の柔軟性、弾力性に大きな影響を与え、コラーゲンの減少や変性が皮膚の柔軟性、弾力性の低下を招き、シワの発生につながるものである。
【０００５】
【非特許文献１】鈴木正人、老化防止・美白・保湿化粧品の開発、２００１年、ｐ．１３５〜１３７
【０００６】
一方、近年においては、皮膚の表皮と真皮の境界に存在する表皮基底膜が紫外線や酸化、乾燥などの外的要因によって傷害をうけ、表皮基底膜構造が断片、多重化していることが、下記非特許文献２等に報告されている。表皮基底膜は表皮細胞の分化および機能維持に重要な役割を果たしており、この基底膜構造の傷害が蓄積することによって、真皮の細胞外マトリクスに構造異常を起こさせ、しわ、たるみの発生につながる。
【０００７】
【非特許文献２】天野聡、化粧品技術者会誌、第３５巻 第１号、２００１年、ｐ．１〜７
【０００８】
皮膚の老化症状を改善する手段としては、皮膚におけるコラーゲン含量およびその機能に着目して、ブタ、ウシ、魚類などを起源とするコラーゲンが種々の化粧料に配合されている。しかし、これらの化粧料は、コラーゲンを皮膚表面に塗布するだけのものであり、コラーゲンが高分子化合物であることから塗布しても皮膚に吸収されにくい。
【０００９】
また、コラーゲンと同様に細胞外マトリクスの構成成分であるラミニンも、皮膚の柔軟性、弾力性の維持、シワの発生に関連のあるタンパク質であることが近年報告されており、ラミニンの合成を促進する合成促進剤として下記特許文献１のような出願がなされている。しかしながら、このような化粧料では、皮膚への透過性や安定性の問題からシワのような皮膚トラブルを満足しうる程度まで改善することは困難である。
【００１０】
【特許文献１】特開２００３−１３７７６７公報
【００１１】
一方、シミについては、ホルモンの異常や太陽光に含まれる紫外線の刺激が原因となってメラニン色素が生合成され、これらが皮膚内に異常沈着するものと考えられている。このメラニン色素は、皮膚内では表皮基底層に存在するメラニン細胞（メラノサイト）内のメラニン生成顆粒（メラノソーム）において生合成され、生合成されたメラニンは隣接する表皮細胞へ拡散する。このメラノサイト内におけるメラニン生成反応は、次のようなものが考えられている。すなわち、アミノ酸であるチロシンが酵素チロシナーゼの作用によりドーパキノンとなり、これが酵素的または非酵素的に反応が進行し、最終的に黒色のメラニンが生成される過程がメラニン色素の生成過程である。従って、こうしたメラニン色素の生成反応の第一段階であるチロシナーゼの作用を抑制することがメラニン生成の抑制に重要である。
【００１２】
こうしたことから、従来より日焼け後の色素沈着・しみ・そばかす等の予防および改善を目的に、乳液、化粧水、クリーム、ジェル、パック、洗浄料、ファンデーション、軟膏などの皮膚外用剤には、アスコルビン酸類、グルタチオンなどの美白成分が配合されている。たとえばアスコルビン酸を配合するものとして、下記特許文献２や特許文献３のような出願がなされ、グルタチオンを配合するものとして、下記特許文献４のような出願がなされている。
【００１３】
【特許文献２】特開２００３−１０４８６４公報
【特許文献３】特開２００３−７３２５２公報
【特許文献４】特開平５−３０１８１１公報
【００１４】
しかし、これらの美白成分を配合した化粧料では、美白成分の効果が十分でなかったり、あるいは製剤中で変質するなどして十分な効果が得られず、シミのような皮膚トラブルを満足しうる程度まで改善することは困難である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、上記のような問題を解決するものであり、低分子化された成分を直接皮膚細胞に作用させることにより、コラーゲンやラミニン等の細胞外マトリクスを構成するタンパク質の合成を促進させ、或いはメラニンの生成を抑制し、それによって老化による皮膚のシワやシミ・ソバカスの発生を予防し、或いは発生したシワ、シミ・ソバカスを軽減させて、滑らかでみずみずしく若々しい肌を実現させる皮膚老化防止用外用剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者等は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、藍藻類の加水分解物がコラーゲンやラミニン等の細胞外マトリクスを構成するタンパク質の優れた合成促進効果やメラニン生成抑制効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち皮膚老化関連成分の産生調整剤に係る請求項１記載の発明は、藍藻類の加水分解物を含有することを特徴とする。また細胞外マトリクス構成タンパク質の合成促進及びメラニンの生成抑制作用を有する皮膚老化関連成分の産生調整剤に係る請求項２記載の発明は、藍藻類の加水分解物を含有することを特徴とする。
【００１８】
さらに請求項３記載の発明は、請求項１又は２記載の皮膚老化関連成分の産生調整剤において、藍藻類がオルソスピラ属であることを特徴とする。さらに皮膚老化防止用外用剤に係る請求項４記載の発明は、請求項１乃至３のいずれかに記載の皮膚老化関連成分の産生調整剤を配合したことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によって、コラーゲンやラミニン等の細胞外マトリクスを構成するタンパク質の優れた促進効果や、優れたメラニン生成抑制効果を有し、人体に対して安全性の高い
細胞外マトリクス構成タンパク質の合成促進及びメラニンの生成抑制作用を有する皮膚老化関連成分の産生調整剤、及びその産生調整剤を配合した皮膚老化防止用外用剤を提供することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の皮膚老化関連成分の産生調整剤は、上述のように藍藻類の加水分解物を含有するものである。ここで「含有する」とは、本発明の皮膚老化関連成分の産生調整剤が藍藻類の加水分解物のみからなるものであってもよく、また皮膚老化関連成分の産生調整剤に藍藻類の加水分解物以外のものが含有されていてもよいことを意味する。
【００２１】
本発明の皮膚老化関連成分の産生調整剤に用いる藍藻類としては、たとえば、ユレモ目のオルソスピラ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ）属、スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）属、ハロスピルリナ（Ｈａｌｏｓｐｉｒｕｌｉｎａ）属等、ネンジュモ目のアナベナ（Ａｎａｂｅｎａ）属、ノーストック（Ｎｏｓｔｏｃ）属等、クロオコックス目のシネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属等が例示される。
【００２２】
これらの藍藻類のなかでも、好ましくはユレモ目、より好ましくはオルソスピラ属、スピルリナ属、ハロスピルリナ属の藻が用いられる。これら３属の藻は、いずれも「スピルリナ」と通称されており、タンパク質の含有量がきわめて多いことから健康食品等として広く使用されている。
【００２３】
オルソスピラ属の藍藻類としては、たとえばＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ＰＣＣ８００５、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｆｕｓｈｉｆｏｒｍｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ＦＡＣＨＢ４３８、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ＦＡＣＨＢ４３９、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｎｔｅｎｓｉｓ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｎｔｅｎｓｉｓ）、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ＯＵＱＤＳ６、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．等を使用することができる。
【００２４】
またスピルリナ属の藍藻類としては、たとえばＳｐｉｒｕｌｉｎａ ＭＰＩＳ４、
Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｓｔｒａｉｎＣＣＣ、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｓｕｂｓａｌａ等を使用することができる。さらにハロスピルリナ属の藍藻類としては、Ｈａｌｏｓｐｉｒｕｌｉｎａ ＣＣＣ、Ｈａｌｏｓｐｉｒｕｌｉｎａ ＭＰＩ、Ｈａｌｏｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｔａｐｅｔｉｃｏｌａ等を使用することができる。
【００２５】
本発明においては、上述のように藍藻類の加水分解物を好適に使用することができる。
本発明者等が鋭意研究したところ、特にミャンマー国内のＹｅ Ｋｈａｒｒ（イェーカー）湖及びＴｗｉｎ Ｔａｕｎｇ（ツウィンタン）湖の各湖に生息する藻に、コラーゲンやラミニン等の細胞外マトリクスを構成するタンパク質の優れた促進効果や、優れたメラニン生成抑制効果が認められることを見出した。
【００２６】
これらの藻について１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の部分相同性検索を行ったところ、その相同性は次のとおりであった。
〔Ｙｅ Ｋｈａｒｒ（イェーカー）湖の藻〕
Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ＰＣＣ８００５との相同性 ：９８．８％
Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａとの相同性 ：９９．３％
Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｆｕｓｈｉｆｏｒｍｉｓとの相同性 ：９９．３％
Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｎｔｅｎｓｉｓとの相同性 ：９８．８％
Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．との相同性 ：９８．４％
Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．との相同性 ：９４．２％
Ａｎａｂｅｎａ ｓｐ．との相同性 ：８８．２％
Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐｏｎｇｅｌｉａｅとの相同性 ：８９．７％
Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｓｔｒａｉｎＣＣＣとの相同性 ：９１．０％
Ｈａｌｏｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｔａｐｅｔｉｃｏｌａとの相同性：８９．２％
【００２７】
〔Ｔｗｉｎ Ｔａｕｎｇ（ツウィンタン）湖の藻〕
Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ＰＣＣ８００５との相同性 ：９９．１％
Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａとの相同性 ：９９．５％
Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｆｕｓｈｉｆｏｒｍｉｓとの相同性 ：９９．５％
Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｎｔｅｎｓｉｓとの相同性 ：９９．１％
Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．との相同性 ：９８．８％
Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．との相同性 ：９４．７％
Ａｎａｂｅｎａ ｓｐ．との相同性 ：８９．２％
Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐｏｎｇｅｌｉａｅとの相同性 ：９０．０％
Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｓｔｒａｉｎＣＣＣとの相同性 ：９１．６％
Ｈａｌｏｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｔａｐｅｔｉｃｏｌａとの相同性：９０．１％
【００２８】
以上の結果からも明らかなように、Ｙｅ Ｋｈａｒｒ（イェーカー）湖の藻及び
Ｔｗｉｎ Ｔａｕｎｇ（ツウィンタン）湖の藻は、ユレモ目リングビア属、ネンジュモ目アナベナ属、ユレモ目ユレモ属（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐｏｎｇｅｌｉａｅ）、ユレモ目スピルリナ属、ユレモ目ハロスピルリナ属の各藍藻類との相同性に比べ、ユレモ目オルソスピラ属の藍藻類との相同性が高いことから、Ｙｅ Ｋｈａｒｒ（イェーカー）湖の藻及びＴｗｉｎ Ｔａｕｎｇ（ツウィンタン）湖の藻は、いずれもオルソスピラ属に属する藍藻類であると認定することができる。
【００２９】
ちなみに、Ｙｅ Ｋｈａｒｒ（イェーカー）湖の藻とＴｗｉｎ Ｔａｕｎｇ（ツウィンタン）湖の藻との相同性は９９．０％であった。この２種の藍藻類をミャンマースピルリナと称する。尚、上記１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の部分相同性は、得られたスピルリナＤＮＡから１６ＳｒＲＮＡ遺伝子専用プライマーを用いて１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の遺伝領域をＰＣＲ法により増幅した後、ABI PRISM 310 Genetic Analyzer（PE Biosysytems社製）を用いたサーマルシークエンス法により塩基配列を決定し、NCBI（National Center for Biotechnology Information）の生物検索ソフトBLASTを用いて求めた。
尚、ＰＣＲ法で用いたプライマーの塩基配列は次のとおりである。
（１６ＳｒＲＮＡ Ｆｏｒｗａｒｄ）
５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’
（１６ＳｒＲＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ）
５’−ＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣ−３’
またＤＮＡポリメラーゼとしては、AmpliTaq Gold DNA polymerase (PE Biosystems) を用いた。
さらに温度条件は次の通りである。
（１）９５℃ １０分
（２）９５℃ １分
（３）４７℃〜５６℃ １分
（４）７２℃ １分
（５）７２℃ １０分
尚、（２）〜（４）の変性、アニーリング、ポリメラーゼ伸長の各工程は、３０サイクル行った。また（３）のアニーリングでは４７℃〜５６℃の温度範囲で最適の条件を求め、それを温度条件とした。
【００３０】
本発明の皮膚老化関連成分の産生調整剤には、コラーゲンやラミニン等の細胞外マトリクス構成タンパク質の合成促進作用のみを有する藍藻類の加水分解物、及びメラニンの生成抑制作用のみを有する藍藻類の加水分解物のいずれをも含む。しかしながら、上記オルソスピラ属の藍藻類、とりわけ上記ミャンマースピルリナには、細胞外マトリクス構成タンパク質の合成促進作用と、メラニンの生成抑制作用との双方の作用が認められるので、特に好適に使用することができる。尚、細胞外マトリクスを構成するタンパク質としては、上記コラーゲンやラミニンの他、エラスチン、プロテオグリカン等のタンパク質もあり、これらのタンパク質の合成を促進することによっても、皮膚老化の防止が図られるものと認められる。
【００３１】
本発明の藍藻類の加水分解物は、藻類を構成するタンパク質が加水分解されて生成するポリペプチド、アミノ酸、アミンなどで構成されている。前記加水分解物は、たとえば平均分子量１００〜２００００のペプチド混合物を含んでいることが好ましい。
【００３２】
加水分解は、藍藻類またはその粉末などの処理物に、たとえば酸、アルカリ、酵素等を作用させることにより行われる。酸としては、たとえば塩酸、リン酸、硫酸、硝酸などの無機酸、ｐ−トルエンスルホン酸（ＰＴＳ）、メタンスルホン酸などの有機酸などが挙げられる。前記酸としては添加後に系内で酸を生成する水溶性化合物を用いてもよい。酸の使用量は、用いる酸の濃度および種類によって異なるが、例えば、１〜６０重量％程度で使用される。酸の使用量、濃度、種類を適宜選択することにより、加水分解処理物の平均分子量を調整することができる。
【００３３】
アルカリとしては、たとえばアンモニア、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウムなどのアルカリ金属またはアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩などが例示できる。アルカリは、用いるアルカリの濃度および種類によって異なるが、例えば１〜６０重量％程度で使用される。アルカリの使用量、濃度、種類を適宜選択することにより、加水分解処理物の平均分子量を調整することができる。
【００３４】
上記酸およびアルカリによる加水分解は、たとえば藍藻類またはその処理物の水に分散させた分散懸濁液に酸またはアルカリを添加し、常圧、減圧、加圧の何れかの雰囲気下、加熱下で撹拌または還流させることにより行われる。加水分解時の処理温度は、たとえば４０〜１１０℃、好ましくは、７０〜１００℃、特に好ましくは７５〜９５℃である。処理時間は、たとえば２〜１２時間、好ましくは５〜１０時間程度である。加水分解時の圧力、温度、反応時間は、加水分解により生成されるペプチド混合物の平均分子量に応じて適宜選択される。酸またはアルカリによる加水分解処理後は、速やかに中和処理を行うことにより、所望の平均分子量のペプチド混合物からなる加水分解物を得ることができるため好ましい。さらに、必要に応じて減圧真空蒸留操作による脱アンモニア処理、電気透析器を用いた脱塩処理、活性炭処理、濾過処理等の処理が行われる。たとえばアルカリによる加水分解処理後には、減圧真空蒸留操作による脱アンモニア処理を行うことが好ましい。アンモニアの除去が不十分であると、後の変色の原因となるためである。
【００３５】
加水分解に用いる酵素としては、タンパク質を加水分解するプロテアーゼ（アルカリプロテアーゼ等）、ペプチダーゼが好ましく、例えばＲｈｉｚｏｐｕｓ（リゾプス）属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（アスペルギルス）属、Ｍｕｃｏｒ（ムコール）属、Ｂａｃｉｌｕｓ（バチルス）属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（シュードモナス）属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ストレプトコッカス）属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（エシェリシア）属等の微生物由来の酵素、トリプシン、レニン、パンクレアチン等の動物由来の酵素、パパイン、ブロメライン、フィシン等の植物由来の酵素等を用いることができる。好ましくは、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ（リゾプス）属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（アスペルギルス）属、Ｂａｃｉｌｕｓ（バチルス）属由来の酵素が用いられ、これらの精製品や粗製品を単独でまたは複数を組み合わせて使用される。使用する酵素により特性の異なる加水分解物（ペプチド混合物）を得ることができる。酵素反応条件としては、特に限定されず、用いる酵素の種類に応じて適宜選択される。酵素の添加量は、加水分解物の平均分子量が上記の範囲内となる量を用いるのが好ましく、藍藻類の乾燥重量１ｇに対するタンパク分解酵素の活性単位を１０〜５００００単位、好ましくは１００〜３００００単位の範囲から適宜選択される。
【００３６】
こうして得られた加水分解物は、さらに慣用の分離、濃縮、精製手段を施すことができる。藍藻類は、通常、フィコシアニン（青色色素）等の水溶性色素、クロロフィル、カロチン等の脂溶性色素を豊富に含んでいる。本発明に用いる藍藻類の加水分解物は、上記方法により得た加水分解物に色素除去処理を施すことも可能である。色素の除去方法としては、遠心分離、濾過、溶媒抽出、活性炭等による吸着処理などの分離精製手段を用いることができる。濾過処理は、例えば、濾紙、濾布、メンブレンフィルターなどを用いて行うことができる。
【００３７】
溶媒抽出に用いる溶媒としては、有色色素が溶解しうる溶媒であれば特に限定されず、たとえばアルコール、ケトン、エーテル、酢酸エチル等のエステルを用いることができる。なかでもアルコールが好ましく、化粧品用途の観点からエチルアルコール等の低級アルコールが好ましく用いられる。溶媒抽出は、前記溶媒を添加し、たとえば所定時間静置する方法、加熱還流操作を行う方法により実施される。脂溶性色素は前記抽出溶媒を添加後、静置することにより除去することも可能である。一方、藍藻類に水溶性色素が非常に多く含まれており、これらの水溶性色素の除去を目的とする場合には、静置では十分に色素が除去されず、加熱還流操作を施すことが好ましい。
【００３８】
吸着処理には、たとえば活性炭などの多孔性物質を用いることができる。吸着は、たとえば活性炭を添加し、たとえば１０分〜５時間、好ましくは３０分〜３時間撹拌することによって行われる。
【００３９】
これらの色素除去手段は、単独でまたは複数組み合わせて用いられる。藻類は、一般に色素の含有量が多いため、色素を十分に除去するためには、通常、上記の手段を２以上組み合わせたり、除去操作を繰り返すことを要する。また、脂溶性色素は比較的低温で除去することが可能であるが、水溶性色素を除去する場合には、加熱下で還流するなどの操作を行うことが好ましい。
【００４０】
色素除去工程における処理温度は、処理手段に応じて適宜選択できるが、たとえば０〜１２０℃、好ましくは０〜１００℃、より好ましくは０〜８５℃、特に４〜７５℃程度である。水溶性色素の除去処理は低温で行うことが多いが、雑菌の混入を防ぐことができる範囲で室温〜８５℃で行うこともできる。色素除去は、減圧下、加圧下、常圧下のいずれかの雰囲気下で行ってもよい。色素除去により、淡黄色の処理液が得られる。
【００４１】
上記方法により色素を除去することにより、同時に臭いを除くこともできる点で有利である。色素除去工程は、上記の加水分解処理の前工程および後工程のいずれに設けてもよいが、色素除去工程の後に加水分解処理工程を設けることが好ましい。
【００４２】
本発明の皮膚老化防止剤中のスピルリナ加水分解物の配合量は、通常乾燥固形分として、０．０００１〜５０重量％とすることが好ましい。０．０００１重量％未満では本発明の効果が充分に得られない可能性があり、一方、５０重量％を越えても、その増量に見合った効果の向上は認められないからである。この観点から、０．００１〜１０重量％が特に好ましい。
【００４３】
本発明の老化防止用皮膚外用剤中には本発明の効果を損なわない範囲において、一般に化粧料で用いられ、或いは医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤に用いられる各種任意成分を必要に応じて適宜配合することができる。このような任意成分として、例えば、精製水、エタノール、油性成分、保湿剤、増粘剤、防腐剤、乳化剤、薬効成分、粉体、紫外線吸収剤、色素、香料、乳化安定剤等を挙げることができる。
【００４４】
本発明の老化防止用皮膚外用剤の形態は、液状、乳液、軟膏、クリーム、ゲル、エアゾール、石けん等皮膚に適用可能な性状のものであれば問われるものではなく、必要に応じて適宜基剤成分等を配合して所望の形態の老化防止用皮膚外用剤を調製することができる。また、本発明の老化防止用皮膚外用剤は、医薬品、医薬部外品又は化粧品等の多様な分野において適用可能である。
【００４５】
本発明の老化防止用皮膚外用剤は、老化によるシワ、シミ・ソバカスの予防や改善に用いることが可能である。なお、ここに示した老化症状は例示であり、これらの老化症状に本発明の皮膚老化関連成分の産生調整剤、及びその産生調整剤を含有する老化防止用皮膚外用剤の適用が限定されるものではない。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明の実施例について説明する。
【００４７】
（実施例１）
ミャンマースピルリナ（ミャンマー国Ｙｅ Ｋｈａｒｒ（イェーカー）湖に生息する藍藻類ユレモ目オルソスピラ属の種）を６０℃で乾燥して得た粉末１容量部に純水５容量部を加え、４℃で２日間放置した後、遠心分離と濾過を繰り返し行い、６０℃で乾燥することにより、青色色素が除去されたスピルリナ粉末を得た。得られた乾燥粉末１容量部にエチルアルコール５容量部を加え、４つ口フラスコに移し、４時間加熱還流を行った。系外に取り出した後、濾液に着色が見られなくなるまで濾過を繰り返し行い、スピルリナの粗抽出液物を得た。さらに、６０℃で乾燥することにより、スピルリナの粗抽出物の乾燥粉末を得た。
【００４８】
（実施例２）
実施例１で得た乾燥粉末１容量部と１０重量％濃度水酸化ナトリウム水溶液５容量部とを入れ、８５℃で６時間、加熱還流した。系外に移し、減圧真空蒸留操作により、脱アンモニア処理を行い、直ちに１０重量％濃度塩酸を加えて処理液を中和した（ｐＨ６〜７．５）。濾過操作を繰り返し行うことにより、透明な液体を回収した後、電気透析器を用いて脱塩処理を行った（４μＳ以下）。さらに以下の方法で活性炭処理を行った。すなわち、１重量％の活性炭を加えて２時間撹拌し、静置後、濾紙による濾過処理、次いでφ０．２μｍメンブレンフィルターによる濾過処理を施すことにより、スピルリナの加水分解物を得た。
【００４９】
（実施例３）
４つ口フラスコに、実施例１で得た乾燥粉末１容量部と４Ｎ塩酸５容量部とを入れ、８５℃で８時間、加熱還流した。系外に移し、４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えて処理液を中和した（ｐＨ６〜７．５）。濾過操作を繰り返し行うことにより、透明な液体を回収した後、電気透析器を用いて脱塩処理を行った（４μＳ以下）。さらに以下の方法で活性炭処理を行った。すなわち、１重量％の活性炭を加えて２時間撹拌し、静置後、濾紙による濾過処理、次いでφ０．２μｍメンブレンフィルターによる濾過処理を施すことにより、スピルリナの加水分解物を得た。
【００５０】
（実施例４）
実施例１で得た乾燥粉末１容量部に純水５容量部を入れ、ｐＨ９．５に調製した後、４つ口フラスコへ移し、タンパク質分解酵素［アルカリプロテアーゼ（長瀬産業社製）：力価５万ユニット］０．００２容量部を加え、３７℃で２時間保持することにより酵素処理を施した。系外に移し、４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用いて処理液をｐＨ１１以上に調整した後、減圧真空蒸留操作によりアンモニアを除去した。濾過操作を繰り返し行うことにより、透明な液体を回収した後、電気透析器を用いて脱塩処理を行った（４μＳ以下）。さらに以下の方法で活性炭処理を行った。すなわち、１重量％の活性炭を加えて２時間撹拌し、静置後、濾紙による濾過処理、次いでφ０．２μｍメンブレンフィルターによる濾過処理を施すことにより、スピルリナの加水分解物を得た。
【００５１】
（試験例１）
〔正常ヒト皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン合成能の測定〕
正常ヒト皮膚線維芽細胞（Cascade Biologics社製）を、１０容量％ウシ胎児血清（ＩＣＮ社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（シグマ社製）に細胞密度が１０×１０4個／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルマイクロプレート（ＩＷＡＫＩ社製）へ１ｍｌずつ播種し、ＣＯ2インキュベーター（９５容量％空気、５容量％二酸化炭素）内、３７℃の条件下で４８時間培養した。
【００５２】
４８時間培養後、マイクロプレート中の培地を除去し、あらかじめスピルリナ加水分解物（実施例２）が最終濃度０．０１％〜１．０重量％となるように添加されたウシ胎児血清を含まないダルベッコ改変イーグル培地（シグマ社製）を加えて、ＣＯ2インキュベーター（９５容量％空気、５容量％二酸化炭素）内、３７℃の条件下で培養し、４８時間後、培養上清を回収した。
【００５３】
上記のようにして得られた培養上清を用いてコラーゲン合成能を測定した。
コラーゲン合成能は、プロコラーゲン タイプＩ Ｃ−ペプチド ＥＩＡキット（Ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅＩ Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ （ＰＩＰ） ＥＩＡ Ｋｉｔ：タカラバイオ社製）を用いて行った。プロコラーゲン タイプＩ Ｃ−ペプチドは、細胞内で合成されたＩ型コラーゲンの前駆体であるＩ型プロコラーゲンが細胞外へ分泌される時にエンドペプチダーゼにより切断される遊離ペプチドで、生体内のコラーゲン合成量を反映する生化学的指標である。
【００５４】
すなわち、抗ＰＩＰモノクローナル抗体がコートされたマイクロプレートに、適宜希釈された培養上清とペルオキシダーゼ標識抗ＰＩＰモノクローナル抗体を加えて、３時間、３７℃で反応させた。その後、洗浄を行い、ペルオキシダーゼ用基質溶液を加えて発色させ、１Ｎ硫酸を加えた後、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に測定したＰＩＰ標準液から標準曲線を作成し、被験物の吸光度からＰＩＰ濃度を求めた。スピルリナ加水分解物のコラーゲン合成促進効果はダルベッコ改変イーグル培地のみで培養した場合のコラーゲン合成能、すなわちＰＩＰ量を１００とした場合の値（比率）で示した。その結果を表１に示す。
【００５５】
【表１】
【００５６】
表１からも明らかなようにスピルリナ加水分解物は正常ヒト皮膚線維芽細胞のコラーゲン合成能を促進させることがわかった。
【００５７】
（試験例２）
〔正常ヒト皮膚線維芽細胞におけるラミニン合成能の測定〕
正常ヒト皮膚線維芽細胞（Cascade Biologics社製）を、１０容量％ウシ胎児血清（ＩＣＮ社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（シグマ社製）に細胞密度が１０×１０4
個／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルマイクロプレート（ＩＷＡＫＩ社製）へ１ｍｌずつ播種し、ＣＯ2インキュベーター（９５容量％空気、５容量％二酸化炭素）内、３７℃の条件下で４８時間培養した。４８時間培養後、マイクロプレート中の培地を除去し、あらかじめスピルリナ加水分解物（実施例２）が最終濃度０．０１〜１．０重量％となるように添加されたウシ胎児血清を含まないダルベッコ改変イーグル培地（シグマ社製）を加えて、ＣＯ2インキュベーター（９５容量％空気、５容量％二酸化炭素）内、３７℃の条件下で培養し、４８時間後、培養上清を回収した。
【００５８】
上記のようにして得られた培養上清を用いてラミニン合成能を測定した。ラミニン合成能は、ラミニン ＥＩＡキット（Ｌａｍｉｎｉｎ ＥＩＡ Ｋｉｔ：タカラバイオ社製）を用いて行った。すなわち、抗ヒトラミニンモノクローナル抗体がコートされたマイクロプレートに適宜希釈された培養上清加えて１時間、２５℃で反応させた。洗浄を行い、ペルオキシダーゼ標識抗ラミニンモノクローナル抗体を加えて、１時間、２５℃で反応させた。その後、洗浄を行い、ペルオキシダーゼ用基質溶液を加えて発色させ、１Ｎ硫酸を加えた後、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に測定したヒトラミニン標準液から標準曲線を作成し、被験物の吸光度からラミニン濃度を求めた。スピルリナ加水分解物のラミニン合成促進効果はダルベッコ改変イーグル培地のみで培養した場合のラミニン量を１００とした場合の値（比率）で示した。その結果を表２に示す。
【００５９】
【表２】
【００６０】
表２からも明らかなようにスピルリナ加水分解物は正常ヒト皮膚線維芽細胞のラミニン合成能を促進させることがわかった。
【００６１】
（試験例３）
〔ヘアレスマウスにおける長期紫外線照射による皮膚変化に対する加水分解スピルリナ分解物の効果〕
実験動物としてヘアレスマウス（Ｓｋｈ／ＨＲ−１）雌（６週齢）を用い、東芝ＦＬ２０Ｓ・Ｅランプにて低用量のＵＶＢ（９５ｍＪ／ｃｍ2／日）を週５回、１０週間、背部皮膚に照射することにより、シワを形成させる方法を用いた。塗布試料は、加水分解スピルリナ分解物を１０％含有した２０％１，３−ブチレンクリコール溶液とし、ブランクは２０％１，３−ブチレンクリコールとし、各群６匹に対して４週間試料を塗布し、塗布終了後にヘアレスマウス背部のシワ程度を下記に示す基準をもとに肉眼により判定した。
【００６２】
各群の肉眼判定の基準を表３に示し、判定結果を平均化し、表４に示した。
【００６３】
【表３】
【００６４】
【表４】
【００６５】
表４からも明らかなように加水分解スピルリナ分解物を塗布することにより、シワの平均スコアが低下し、紫外線により誘発されたシワが改善されたことが示された。
【００６６】
（試験例４）
〔小ジワへの改善効果〕
上記のとおり、正常ヒト線維芽細胞におけるコラーゲン合成促進効果および紫外線によりマウス背部皮膚に誘発させたシワの改善効果をもつ加水分解スピルリナ分解物を配合したクリームを下記のような製造方法にて調製し、皮膚の老化症状である小ジワに対する改善効果を検討した。
【００６７】
スクワレン、セチルイソオクタノエート、およびマイクロクリスタリンワックスを加熱溶解後、粘土鉱物、ＰＯＥグリセロールトリイソステアリン酸エステル（界面活性剤）を加え、７０℃に保ち、均一に分散・溶解して油性ゲルを得た。
次に、加水分解スピルリナ分解物を所定濃度となるように精製水に溶解し、７０℃に加温した後、油性ゲルの中へ十分に撹拌しながらゆっくりと添加した。ホモミキサーで均一に混合した後、減圧下にて脱気をし、室温まで冷却し、クリームを得た。このようにして得られたクリームの組成および配合比は次のとおりである。
【００６８】
（処方例１）
組成 配合比（重量％）
スクワレン ２０ ％
セチルイソオクタノエート ８．５％
マイクロクリスタリンワックス １．０％
粘土鉱物 １．３％
ＰＯＥグリセロールトリイソステアリン酸エステル ０．２％
加水分解スピルリナ分解物 ５．０％
水 残量
【００６９】
（比較例１）
組成 配合比（重量％）
スクワレン ２０ ％
セチルイソオクタノエート ８．５％
マイクロクリスタリンワックス １．０％
粘土鉱物 １．３％
ＰＯＥグリセロールトリイソステアリン酸エステル ０．２％
水 残量
【００７０】
女性パネル（３３〜５２歳）２０名をランダムに２グループに分け、一方のグループには処方例１のクリームを、もう一方のグループには比較例１のクリームを、毎日朝と夜の２回、２ヶ月間にわたって洗顔後に顔面に塗布した。試験開始前および終了後の肌状態を比較して評価した。評価は、肉眼判定によりクリーム塗布による小ジワの改善度を表５に示す基準に従い行った。
【００７１】
【表５】
【００７２】
各群における各パネルの小じわ改善度の評価点を合計し、表６に示した。
【００７３】
【表６】
【００７４】
表６からも明らかなように処方例３を用いたパネルに小ジワの改善度が高く、加水分解スピルリナ分解物を含有するクリームが小ジワの改善に効果があることが明らかとなった。
【００７５】
（試験例５）
〔メラニン生成抑制試験〕
マウス由来のＢ１６メラノーマ培養細胞を用いた。１０％牛胎児血清（ＩＣＮ社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（シグマ社製）にＢ１６メラノーマ細胞を懸濁し、６ウェルマイクロプレート（ＩＷＡＫＩ社製）に播種し、ＣＯ2インキュベーター（９５容量％空気、５容量％二酸化炭素）内、３７℃の条件下で２４時間培養した。
【００７６】
２４時間培養後、マイクロプレート中の培地を除去し、あらかじめスピルリナ加水分解物（実施例２）が最終濃度０．０１％〜１．０重量％となるように添加された１０％牛胎児血清（ＩＣＮ社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（シグマ社製）を加えて、ＣＯ2インキュベーター（９５容量％空気、５容量％二酸化炭素）内、３７℃の条件下で７日間培養した。培地を除去し、ＰＢＳ１ｍｌで１回洗浄したのち、０．２ｍｌの３Ｎ水酸化ナトリウム溶液を加えて、細胞を完全に溶解した。この細胞溶解液の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。標準メラニンに合成メラニン（シグマ社製）を用いて検量線を作成し、メラニン量を求めた。また、細胞溶解液中のタンパク質量はプロテインアッセイ（バイオラッド社製）を用いて求めた。メラニン生成量はタンパク質量あたりのメラニン量で比較した。スピルリナ加水分解物のメラニン合成抑制効果は１０％牛胎児血清（ＩＣＮ社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地のみで培養した場合のメラニン生成量を１００とした場合の値（比率）で示した。その結果を表７に示す。
【００７７】
【表７】
【００７８】
表７からも明らかなようにスピルリナ加水分解物はマウス由来のＢ１６メラノーマ培養細胞のメラニン産生量を抑制させることがわかる。
【００７９】
（試験例６）美白効果試験
上記のとおり、優れたメラニン合成抑制剤であるスピルリナ加水分解物を配合した化粧水を下記製法にて調製し、その美白効果を調べた。
ＰＯＥ（２０）オレイルアルコールエーテル（界面活性剤）、メチルセルロースおよびクインスシード（増粘剤）、エタノールを含有する化粧水基剤を調製し、所定濃度のスピルリナ加水分解物を添加した。得られた処方例２の化粧水の組成及び配合比は次のとおりである。
【００８０】
（処方例２）
組成 配合比（重量％）
ＰＯＥ（２０）オレイルアルコールエーテル ０．５％
メチルセルロース ０．２％
クインスシード ０．１％
エタノール １０ ％
スピルリナ加水分解物 ３．０％
水 残量
【００８１】
（比較例２）
組成 配合比（重量％）
ＰＯＥ（２０）オレイルアルコールエーテル ０．５％
メチルセルロース ０．２％
クインスシード ０．１％
エタノール １０ ％
水 残量
【００８２】
女性パネル（２９〜５４歳）２０名をランダムに２グループに分け、一方のグループには処方例２の化粧水を、もう一方のグループには比較例２の化粧水を、毎日朝と夜の２回、２ヶ月間にわたって洗顔後に顔面に塗布した。試験開始前および終了後の肌状態を比較して評価した。評価は、肉眼判定により化粧水塗布による美肌効果を表８の基準によって評価した。
【００８３】
【表８】
【００８４】
表９に美白効果試験の結果を示す。
【００８５】
【表９】
【００８６】
表９からも明らかなように処方例２を用いたパネルに肌のくすみに対する有効性が認められ、加水分解スピルリナ分解物を含有する化粧水が肌のくすみなどの予防、改善することができ、美しい肌とすることが明らかとなった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
藍藻類の加水分解物を含有することを特徴とする皮膚老化関連成分の産生調整剤。
【請求項２】
藍藻類の加水分解物を含有することを特徴とする、細胞外マトリクス構成タンパク質の合成促進及びメラニンの生成抑制作用を有する皮膚老化関連成分の産生調整剤。
【請求項３】
藍藻類がオルソスピラ属である請求項１又は２記載の皮膚老化関連成分の産生調整剤。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかに記載の皮膚老化関連成分の産生調整剤を配合したことを特徴とする皮膚老化防止用外用剤。
【請求項１】
藍藻類の加水分解物を含有することを特徴とする皮膚老化関連成分の産生調整剤。
【請求項２】
藍藻類の加水分解物を含有することを特徴とする、細胞外マトリクス構成タンパク質の合成促進及びメラニンの生成抑制作用を有する皮膚老化関連成分の産生調整剤。
【請求項３】
藍藻類がオルソスピラ属である請求項１又は２記載の皮膚老化関連成分の産生調整剤。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかに記載の皮膚老化関連成分の産生調整剤を配合したことを特徴とする皮膚老化防止用外用剤。
【公開番号】特開２００７−４５７４７（Ｐ２００７−４５７４７Ａ）
【公開日】平成１９年２月２２日（２００７．２．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２３２２５８（Ｐ２００５−２３２２５８）
【出願日】平成１７年８月１０日（２００５．８．１０）
【出願人】（０００１１２２６６）ピアス株式会社 (49)
【出願人】（５０２１８３６５８）嵯峨野観光鉄道株式会社 (3)
【出願人】（５０３１８８６２３）株式会社 タイムリー (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年２月２２日（２００７．２．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月１０日（２００５．８．１０）
【出願人】（０００１１２２６６）ピアス株式会社 (49)
【出願人】（５０２１８３６５８）嵯峨野観光鉄道株式会社 (3)
【出願人】（５０３１８８６２３）株式会社 タイムリー (2)
【Ｆターム（参考）】
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