真性赤血球増加症に関与するＪＡＫ２の変異の識別方法
本発明は、真性赤血球増加症の原因となっている、ＪＡＫ２チロシンキナーゼタンパク質のＶ６１７Ｆ変異体に関するものである。また、本発明は、赤血球増加症と血小板増加症を骨髄増殖症候群に関連付けることを可能にする、赤血球増加症および血小板増加症の一次診断方法、すなわち、赤血球増加症と血小板増加症を新たな疾病群に再分類することを可能にする、骨髄増殖症候群におけるＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体の検出にも関するものであり、そして、特異的阻害剤とｓｉＲＮＡの識別にも関するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真性赤血球増加症の原因となっている、ＪＡＫ２チロシンキナーゼタンパク質のＶ６１７Ｆ変異体に関するものである。また、本発明は、赤血球増加症と血小板増加症を骨髄増殖症候群に関連付けることを可能にする、赤血球増加症および血小板増加症の一次診断方法、すなわち、赤血球増加症と血小板増加症を新たな疾病群に再分類することを可能にする、骨髄増殖症候群におけるＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体の検出にも関わるものであり、そして、特異的阻害剤とｓｉＲＮＡの識別にも関わるものである。
【背景技術】
【０００２】
真性赤血球増加症（Ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａ ＶｅｒａすなわちＰＶ）は、慢性骨髄増殖症候群のひとつであり、該慢性骨髄増殖症候群は、真性赤血球増加症を、またしばしば血小板増加症および白血球増加症を伴う。それは、造血幹細胞のクローン性の後天性疾患である。ＰＶの造血前駆細胞はエリスロポエチン（Ｅｐｏ）の不在下で、「自然発生コロニー」と呼ばれる赤芽球コロニーを形成する能力がある。インターロイキン３（ＩＬ−３）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）およびインスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）など、その他のいくつかの成長因子に対する、ＰＶの造血前駆細胞の過敏性も証明されている。いくつかのチームがＰＶの生理病理学に関心を寄せているが、疾患の原因である分子異常は今日でも未知のままである（Ｈ．Ｐａｈｌ，２０００）。
【０００３】
いくつかのサイトカインに対するＰＶの前駆細胞の過敏性により、サイトカイン受容体に共通のシグナル伝達経路における異常を検査することができる。ＰＶにおいては分子マーカーの存在はかつて証明されたことがないが、ＰＶとその他の骨髄増殖症候群との間にある類似性、特にＬＭＣとの間にある類似性を考慮すると、Ｂｃｒ−Ａｂｌによって誘発されるものに近い分子メカニズムが、とりわけ悪性クローンの増殖とその最終分化の原因になっていると考えられる。この仮説は近年、二つの珍しい骨髄増殖症候群において確証が得られており、その一つは、ＦＧＦ受容体の構成的活性化を誘発する８ｐ１１染色体領域における転座に関連する骨髄増殖症候群であり、もう一つは、潜在性の染色体の欠失によりキメラ遺伝子ＰＤＧＦＲα−ＦＩＰ１Ｌ１が生じる好酸球増加症候群である。両方の場合において、分子異常により、構成的なチロシンキナーゼ活性を有する融合タンパク質が生じる。
【０００４】
患者の１０％〜１５％で２０ｑの欠失が検出され、約３０％のケースで９ｐのヘテロ接合性の消失が検出されても、ＰＶにおいて再発性の細胞遺伝学的異常が見られたことはない（Ｋｒａｌｏｖｉｃｓ，２００２）。しかし、これらの異常は当該疾患に特異的なものではない。
【０００５】
ＰＶ細胞がＥｐｏに依存していないため、Ｅｐｏ受容体（Ｅｐｏ−Ｒ）経路に対する研究が行われてきた。まず、受容体は構造レベルでも機能レベルでも正常である（Ｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４、Ｌｅ Ｃｏｕｅｄｉｃ ｅｔ ａｌ．，１９９６、Ｍｅａｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。Ｅｐｏによる刺激が止まるとＥｐｏ−ＲとＪＡＫ２を脱リン酸化するフォスファターゼＳＨＰ−１は、通常、ＲＮＡとタンパク質のレベルで発現する（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７、Ａｓｉｍａｋｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。Ｅｐｏ−Ｒのシグナル伝達のさらに下流では、ＰＶを示す患者の多核球（ＰＮＮ）においてＳＴＡＴ５の異常な活性化が研究されたが、異常は発見できていない。逆に、ＳＴＡＴ３の構成的リン酸化が、研究された１４例中４例のＰＶのＰＮＮで明らかにされた（Ｒｏｄｅｒ，２００１）。最後に、ＳＴＡＴ５の転写標的である、抗アポトーシスタンパク質ｂｃｌ−ｘｌの発現が、免疫組織化学およびフローサイトメトリーで研究されている（Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。そして、ｂｃｌ−ｘｌがＰＶの赤芽球で高発現すること、とりわけ、通常このタンパク質が発現しなくなる、より成熟した段階で高発現することが示された。
【０００６】
真性赤血球増加症において、主要な診断基準は現在、臨床的なものである（ＰＶＳＧ基準、Ｐｅａｒｓｏｎ，２００１）。生物学的診断は、主としてＥｐｏの不在下での、赤血球前駆細胞の培養の実施に基づいている（内因性コロニーの検出）。その良好な実施に専門技術が必要であることと、多くの「技術者の時間」が費やされることから、この試験はすべてのセンターで可能なわけではなく、経験を積んだ研究所によって実施されるときにだけ信頼できるものである。さらに、良好な感度を得るために、この試験は患者から採取した骨髄細胞に対して行う必要があり、これは患者にとって無害とは言えない。
【０００７】
サブトラクティブハイブリダイゼーション法により、ドイツの研究グループが、ＰＲＶ１（Ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａ Ｒｕｂｒａ Ｖｅｒａ １）と呼ばれる、ＰＶのＰＮＮで高発現した遺伝子をクローニングしている（Ｔｅｍｅｒｉｎａｃ ｅｔ ａｌ．，２０００）。ＰＲＶ−１タンパク質は表面受容体ｕＰＡＲのスーパーファミリーに属している。ＰＶの多核球においてＰＲＶ−１をコードしているｍＲＮＡの高発現はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって容易に検出可能であり、近年発見された疾患の、生理病理学的役割のないマーカーを構成する。しかし、最近公刊された研究では、それは特に感度が良いわけでも特異的でもないことが示されている。
【０００８】
Ｓｐｉｖａｋ ＪＬ ｅｔ ａｌ．，２００３（「Ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」；Ｈｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ；２００３；２００ ２４．）では、いくつかのＰＶマーカーが記載されている。好中球抗原ＮＢＩ／ＣＤ１７７のｍＲＮＡはＰＶ患者の顆粒球において過剰発現する。しかし、患者の中にはこの過剰発現を示さないものもおり、また、この過剰発現が真性赤血球増加症以外の骨髄増殖症候群の患者でも観察されうるため、このマーカーはＰＶを検出するための信頼できる手段とは考えられない。血小板上のトロンボポエチン受容体Ｍｐｌの発現が少ないこともＰＶでは認められている。この異常はＰＶで支配的だが、その他の骨髄増殖症候群でも見られる。ほかにも、専門の研究所でしか実施できない、実現が難しい試験もある。
【０００９】
このように、従来技術では、信頼できるＰＶ診断を可能にする方法はない。また、利用可能な治療も特異的なものではない。正常範囲内にヘマトクリット値を維持するための瀉血、細胞毒性薬の使用あるいはＩＦＮの使用が問題となる。
【特許文献１】国際公開第０２／４４３２１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第００／４４８９５号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の枠組みにおいて、我々は試験した患者の約９０％においてＪＡＫ２遺伝子に変異を発見しただけではなく、この変異が、このチロシンキナーゼの構成的活性の原因であることも明らかにし、そして、該変異を阻害することによって、ＰＶ赤芽球の自然発生的な増殖と分化を妨げることが可能になることを証明した。
【００１１】
ＪＡＫ２はＪａｎｕｓキナーゼファミリー（ＪＡＫ）に属し、該ファミリーは、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３およびＴＹＫ２という複数の細胞質内チロシンキナーゼからなる。ＪＡＫタンパク質は多くの膜受容体の細胞内シグナル伝達に関与するものであり、該膜受容体は、サイトカイン受容体スーパーファミリーのいくつかのメンバー、特にＥｐｏ受容体（Ｅｐｏ−Ｒ）のように、内在的なチロシンキナーゼ活性を有していない。ＪＡＫ２タンパク質は２３個のエクソンを含んだ遺伝子によってコードされている。相補的ＤＮＡは３５００塩基対のサイズを有し、１１３２個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする（１３０ｋＤ）（図１）。我々はＰＣＲとシーケンシングによって、ＰＶ患者の９０％近くにおいてＪＡＫ２のエクソン１２でクローン性の後天的な点変異を識別した。通常バリン（Ｖ）をコードしているコドン６１７「ＧＴＣ」が、フェニルアラニン（Ｆ）をコードする「ＴＴＣ」に変異している。この変異Ｖ６１７Ｆは、２５人の対照または試験した二次性赤血球増加症患者では見られなかった。逆に、本態性血小板増加症の４０％と骨髄線維症の５０％では観察され、したがって、この変異は、Ｂｃｒ−Ａｂｌが慢性骨髄性白血病を定義したように、骨髄増殖症候群の新たな枠を定義するものである。
【００１２】
本発明によるＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体を、血液学における診断研究所で従来的に用いられている広く普及した手段で効果的に検出することができるかどうか調べるために、我々は骨髄増殖症の疑いのある患者に由来する１１９のサンプルを分析した。ＪＡＫ２ Ｖ６１７ＦがＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）法とＴａｑＭａｎ（登録商標）法によって効果的に検出されることが示されたが、これらの技術はシーケンシングよりわずかに感度が良いものである。次に我々は、５１％を超えるヘマクリット値を有する８８人の患者において一次診断試験としてＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの検出値を算定し、変異が、赤血球増加症において１００％の陽性的中率で、ＷＨＯ基準（Ｒ＝０．８７９）とＰＶＳＧ基準（Ｒ＝０．７１７）にしたがったＰＶ診断に対応することを示した。これらのデータに基づいて我々は、赤血球量の測定、骨髄の吸引および内因性赤血球コロニーの形成のインビトロでの分析の実施を避けるべく、顆粒球におけるＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの検出を赤血球増加症患者の一次診断試験としてみなすべきであることを提案する。また、この検出は骨髄増殖症候群の全体あるいはそれらの疑いに対する一次診断にまで広げることができるものである。この検出は、骨髄増殖症候群を確認するための確実な生物学的試験が存在しない慢性血小板増加症においても特に重要となるものである。また、この検出は骨髄線維症の診断において重要な検査となるものであり、不確定な病因による血栓症に関連する臨床所見に適用することができるものである。
【００１３】
このように、本発明は第一に診断手段をもたらし、ＰＶとこの変異に関連する骨髄増殖症候群を対象とする治療に至る道筋を開くものである。より特定的には、我々はＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異の検出を赤血球増加症の枠組みにおける一次診断試験として提案し、このことによって、大半の患者および慢性血小板増加症における、骨髄の吸引ならびに赤血球と内因性赤血球細胞（ＥＥＣ）の量の測定を避けることが可能になり、このことによって長期の病因調査を避けることが可能となる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
このように、第一の特徴として、本発明は単離したＪＡＫ２（Ｊａｎｕｓキナーゼ２）タンパク質、特にヒトＪａｎｕｓキナーゼ２タンパク質（ＮＣＢＩ寄託番号ＮＭ＿００４９７２、ＧＩ：１３３２５０６２）に関するものであり、該タンパク質は、６１７番アミノ酸（ｃＤＮＡの、ＡＴＧから数えて６１７番目のコドン）における変異、より特徴的にはＶ６１７Ｆ変異を含んでおり、以下ではＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体と称し、以下のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１で示される。
【００１５】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１（Ｖ６１７ＦヒトＪａｎｕｓキナーゼ２すなわちＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ）
【００１６】
また、本発明は他の哺乳動物の６１７位が変異したこのタンパク質の等価物、たとえば、ラット（ＮＭ＿０３１５１４）、ブタ、マウス（ＮＭ＿００８４１３）などの他の哺乳動物のＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆも目的とし、また、変異体の活性および３Ｄ構造に影響を与えない一つまたは複数の修飾をさらに含んだ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１の変異体も目的としている。
【００１７】
また、本発明はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１をコードするヌクレオチド配列、好ましくはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２（コドン６１７においてＧＴＣの代わりにコドンＴＴＣを有する（以下Ｇ１８４９Ｔと称する、翻訳開始を示すＡＴＧから数えて１８４９位におけるｇ／ｔ変異）ヒトＪＡＫ２遺伝子配列）も対象としている。
【００１８】
この配列は、ウイルスベクターまたはプラスミドベクター、あるいは哺乳動物の細胞で有効なプロモーターの制御下にある裸ＤＮＡに存在しうるものである。したがって、本発明はＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆタンパク質を発現するベクターにも及ぶものである。本発明のベクターはクローニングベクターおよび／または発現ベクターとすることができ、また、宿主細胞、とりわけ哺乳動物の細胞、好ましくはヒトＣＤ３４+前駆細胞をトランスフェクトするために用いることができる。
【００１９】
ＰＶおよびその他の骨髄増殖症候群のトランスジェニック動物モデル
【００２０】
本発明はまた、組換えＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを発現する、ヒトではないトランスジェニック動物も対象とする。この動物は、好ましくはマウスまたはラットとすることができる。モデルとして用いられるトランスジェニックのラットまたはマウスは、当業者によって一般的に用いられているあらゆる方法、とりわけ、相同組換えまたはＣｒｅ−ＬｏｘＰもしくはＦＬＰ−ＦＲＴシステムでの部位特異的組換えによってＥＳ細胞にノックイン（標的位置への配列の挿入）することで得ることができる。本発明の好ましい実施態様によると、本発明によるトランスジェニック細胞は、宿主細胞のゲノムの一つまたは複数の配列でのＪＡＫ２ Ｇ１８４９Ｔ変異体の遺伝子ターゲッティングによって得られる。より詳細には、導入遺伝子は、宿主細胞のゲノムの相同配列の相同組換えにより安定した方法で挿入される。トランスジェニック動物を産生するためのトランスジェニック細胞を得ようとする場合、宿主細胞は好ましくは胚性幹細胞（ＥＳ細胞）である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。遺伝子ターゲッティングは、標的とする内因性配列と配列の相同性を有している外来ＤＮＡ配列での相同組換えによる、染色体座の部位特異的な修飾である。さまざまなタイプの遺伝子ターゲッティングがある。ここでは、遺伝子ターゲッティングは特に、野生型ＪＡＫ２遺伝子をＪＡＫ２ Ｇ１８４９Ｔ変異体の遺伝子または遺伝的に類似した他のあらゆる変異体で置換するために用いることができる。この場合、遺伝子ターゲッティングは「ノックイン」（Ｋ−ｉｎ）と呼ばれる。あるいは、遺伝子ターゲッティングは、野生型ＪＡＫ２の発現を減らすかまたは消失させてＪＡＫ２変異体の遺伝子を導入するために用いることができる。このとき遺伝子ターゲッティングは「ノックアウト」（ＫＯ）と呼ばれる（Ｂｏｌｋｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８９参照）。本発明による細胞は、導入遺伝子が安定してその細胞のゲノムに組み込まれることと、その発現が内因性遺伝子の調節エレメントによって制御されることを特徴としている。安定した組み込みとは、導入遺伝子を本発明による細胞のゲノムＤＮＡに挿入することを意味する。このように挿入された導入遺伝子は、次に細胞の子孫に伝わる。導入遺伝子の組み込みは、標的である内因性ＪＡＫ２遺伝子の上流、下流、または中心で行う。任意で、一つまたは複数の正の選択または負の選択の遺伝子を用いることができる。また、レポーター遺伝子部分の両側または挿入すべき完全配列の両側に位置している好ましくは二つの標的遺伝子座と相同的なＤＮＡ領域を用いることができる。「相同的なＤＮＡ領域」とは、最適なアラインメントの後および比較の後に、通常少なくともおよそ９０％〜９５％のヌクレオチドが同一であり、好ましくは、少なくともおよそ９８％〜９９．５％のヌクレオチドが同一である二つのＤＮＡ配列を意味する。比較のための配列の最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）による局所的相同性アルゴリズム、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）による局所的相同性アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）による類似性検索法、これらのアルゴリズムを用いるソフトウェア（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅの中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ Ｎ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて行うことができる。細菌および哺乳動物の細胞における相同組換えを行うためには１４ｂｐが１００％相同であれば十分であるが、より長い相同配列の部分が好ましい（一般的にはこれらの部分は相同配列の各部分について少なくとも２０００ｂｐであり、好ましくは少なくとも５０００ｂｐである）。好適には、ＪＡＫ変異体の配列は内因性型の調節を確実にするエレメントの一群、すなわち、少なくとも内因性ＪＡＫ遺伝子のプロモーター、調節配列（エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター）、終結シグナルを含んだ一群に挿入される。
【００２１】
特徴的な実施態様によると、ＪＡＫ Ｇ１８４９Ｔ導入遺伝子は、少なくともコード配列と、レコンビナーゼの作用に対して特異的な部位に挟まれた、または挟まれていない正の選択のカセット、たとえば、前記配列の５’位に存在することができるＬｏｘ／Ｎｅｏ−ＴＫ／Ｌｏｘまたはｌｏｘ／Ｎｅｏ／ｌｏｘまたはＦＲＴ／Ｎｅｏ−ＴＫ／ＦＲＴまたはＦＲＴ／Ｎｅｏ／ＦＲＴカセットを有しており、たとえば一つまたは複数のＤＴＡ遺伝子および／またはＴＫ遺伝子を含む負の選択のカセットが導入遺伝子の末端の少なくとも一方に存在していることを特徴としている。本発明の導入遺伝子は、好ましくは動物細胞に天然に存在している外来のＤＮＡ配列に直接由来する。この天然の形態のＤＮＡ配列は、たとえばクローニングに必要な制限酵素認識部位を挿入すること、および／または、部位特異的組換えの部位（ｌｏｘ配列およびｆｌｐ配列）を挿入することで修飾することができる。
【００２２】
このために、ＪＡＫ２ Ｇ１８４９Ｔ変異体は、宿主細胞内でのその増殖を確実にすることができるクローニングベクターに、および／または任意には、導入遺伝子の発現を確実にすることができる発現ベクターにクローニングすることができる。本発明によるクローニングベクターおよび／または発現ベクターを構築するために用いられるＤＮＡ組換え技術は当業者に知られているものである。標準的な技術がクローニング、ＤＮＡの単離、増幅、および精製に用いられ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼに関わる酵素反応は製造者の推薦にしたがって実施される。これらの技術およびその他の技術はほとんどの場合Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）にしたがって行われる。ベクターは、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、レトロウイルスおよびその他の動物ウイルス、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＨＡＣのような人工染色体、ならびにその他の類似のベクターを含んでいる。
【００２３】
本発明によるトランスジェニック細胞を生成するための方法はＧｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９に記載されている。哺乳動物の細胞をトランスフェクトするためのさまざまな技術がＫｅｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０によって概説されている。線状化されたもしくはされていないベクター、またはベクター断片の形状のものに任意で含まれる、本発明による導入遺伝子は、たとえば核へのマイクロインジェクション（米国特許第４８７３１９１号明細書）、リン酸カルシウム沈殿によるトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション（Ｌｏ，１９８３）、熱ショック、陽イオンポリマー（ＰＥＧ、ポリブレン、ＤＥＡＥ−デキストランなど）による形質転換あるいはウイルス感染（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５）といった標準的な方法によって宿主細胞に導入することができる。
【００２４】
細胞が導入遺伝子によって形質転換されると、細胞はインビトロで培養することができ、あるいは、ヒトではないトランスジェニック動物を産生するために用いることができる。形質転換後、細胞を培養層および／または適切な培地に播種する。構築物を含んだ細胞は選択培地を用いて検出することができる。コロニーが生じるのに十分な時間の後、コロニーを回収し、相同組換えおよび／または当該構築物の組み込みが生じているかどうか判定するために分析する。相同組換えをしていると考えられるクローンのスクリーニングを行うために、選択遺伝子と呼ばれる陽性および陰性のマーカーを相同組換えベクターに挿入することができる。相同組換えが生じた細胞を選択するさまざまなシステムが説明されている（米国特許第５６２７０５９号明細書参照）。本発明による前記陽性選択遺伝子は、好ましくは抗生物質耐性遺伝子から選択される。抗生物質としては、網羅的ではないが、ネオマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、フレオマイシン、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、クロラムフェニコール、カルベニシリン、ジェネティシン、ピューロマイシンを挙げることができる。これらの抗生物質に対応する耐性遺伝子は当業者には知られており、たとえばネオマイシン耐性遺伝子は、培養培地における抗生物質Ｇ４１８の存在に対する耐性を細胞に付与する。また、陽性の選択遺伝子はＨｉｓＤ遺伝子から選択することができ、対応する選択剤はヒスチジノールである。また、陽性の選択遺伝子はグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧｐＴ）遺伝子から選択することができ、対応する選択剤はキサンチンである。また、陽性の選択遺伝子はヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子から選択することができ、対応する選択剤はヒポキサンチンである。相同組換えを同定することを可能にするために用いられる一つまたは複数の選択マーカーは、後に遺伝子発現に影響を与えることがあり、必要であれば、Ｌｏｘ部位に特異的なＣｒｅリコンビナーゼ（Ｓａｕｅｒ，１９９４、Ｒａｊｅｗｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９９６、Ｓａｕｅｒ，１９９８）またはＦＲＴ部位に特異的なＦＬＰリコンビナーゼ（Ｋｉｌｂｙ ｅｔ ａｌ．，１９９３）といった部位に特異的なリコンビナーゼを利用することで除去することができる。
【００２５】
陽性のコロニー、すなわち少なくとも一つの相同組換えが生じている細胞を含んだコロニーは、サザンブロット法および／またはＰＣＲ法による分析で識別する。単離細胞または本発明によるトランスジェニック動物の細胞における、導入遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルは、ノーザンブロット法による分析、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法による分析、ＲＴ−ＰＣＲ法による分析を含む技術によって判定することもできる。同様に、導入遺伝子を発現している動物細胞または動物組織は、レポータータンパク質に対する抗体を用いて識別することができる。次に、陽性細胞は、胚の操作、とりわけ修飾された細胞を相同組換えによって胚盤胞内へ注入するために用いることができる。
【００２６】
マウスでは、胚盤胞は４〜６週齢の過剰排卵した雌から得る。細胞をトリプシン処理し、修飾された細胞を胚盤胞の胞胚腔に注入する。注入後、胚盤胞を偽妊娠した雌の子宮角に導入する。次に、雌が満期に達するまで待ち、構築物を有する変異細胞の存在を判定するために、得られた子を分析する。産まれた胎児の細胞と胚盤胞細胞あるいはＥＳ細胞との間での異なる表現型を分析することで、キメラの新生児を検出することが可能となる。そして、キメラの胎児を成体まで育てる。キメラまたはキメラ動物は、細胞の一つの亜集団のみに改変したゲノムが存在する動物である。一つまたは複数の修飾された遺伝子を有するキメラ動物は、一般的にはそれらの間でまたは野生型の動物と交配させることで、ヘテロ接合またはホモ接合の子を得ることができる。次に、ヘテロ接合の雄と雌を交配することで、ホモ接合動物を作成する。指示しない限り、本発明によるヒトではないトランスジェニック動物は生殖系列細胞のヌクレオチド配列の安定した変化を含んでいる。
【００２７】
本発明のもう一つの実施態様によると、本発明によるヒトではないトランスジェニック細胞は核の移動すなわち核移植の枠組みにおける核のドナー細胞として利用することができる。核移植とは、脊椎動物の成体個体または胎児段階の個体の生きたドナー細胞の核を、同種または異種の除核したレシピエント細胞の細胞質に移すことを意味する。移植された核はクローン胚の成長を導くように再プログラムされ、続いて該クローン胚は胎児および新生児を産生するために受胚雌に移植することができ、あるいは、培養で内細胞塊の細胞を産生するために用いることができる。核クローニング用のさまざまな技術を用いることができ、該技術の中では、網羅的ではないが、特許出願の対象となっている国際公開第９５／１７５００号パンフレット、国際公開第９７／０７６６８号パンフレット、国際公開第９７／０７６６９号パンフレット、国際公開第９８／３０６８３号パンフレット、国際公開第９９／０１１６３号パンフレットおよび国際公開第９９／３７１４３号パンフレットを挙げることができる。
【００２８】
このように、本発明はＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆをコードする組換え配列を含んだ、ヒトではないトランスジェニック動物にまで及ぶものである。これらの動物はホモ接合体あるいはヘテロ接合体（ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ／ＪＡＫ２ Ｖ６１７ＦあるいはＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ／ＪＡＫ２）でありうる。これらの動物は、とりわけ真性赤血球増加症を再現するが、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆによって誘発されるあらゆる骨髄増殖症候群も再現する。したがって、該動物によってチロシンキナーゼ阻害剤を機能的にスクリーニングすること、とりわけＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆに特異的な阻害剤のスクリーニングを行うことが可能になる。
【００２９】
もう一つの変形例は、真性赤血球増加症またはその他の骨髄増殖症候群のモデルを実現させるために、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体を発現する能力を有するウイルスベクター（レトロウイルスまたはレンチウイルスまたはその他）を造血細胞株、前駆細胞またはＥＳ細胞に注入することで構成することができる。
【００３０】
診断手段
第三の特徴として、本発明は、骨髄増殖症候群に冒された、あるいは骨髄増殖症候群を示す可能性のある哺乳動物において、とりわけ赤血球増加症を示す患者または真性赤血球増加症、血小板増加症および／もしくは骨髄線維症の兆候を示している疑いのある患者において、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異の有無を検出することを可能にする診断手段を目的としている。
【００３１】
そのため、本発明は、以下に記載した配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２における変異の有無の検出を可能にするプライマーおよびプローブに関わるものである。より特徴的には、本発明は、エクソン１２または以下の配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ３または４の連続した少なくとも１０個、１２個、１５個、２０個、３０個、４０個または５０個のヌクレオチドの配列（たとえば１０〜３０個のヌクレオチドまたは１０〜２５個のヌクレオチド）を有し、また変異ヌクレオチドｔ1849を含む、たとえば１０〜３０個のヌクレオチドの単離された核酸にも関するものである。
【００３２】
【００３３】
下線を引いた配列は、１８４９位における変異に特異的なプローブまたはプライマーの設計を可能にする上流または下流の領域の一例を示している（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ４）。
【００３４】
本発明のさまざまな好ましいプライマーおよびプローブの例
【００３５】
ＤＮＡ、ＰＣＲプライマー：
ＪＡＫ２エクソン１２−ＰＣＲＦ センス ５’−ＧＧＧＴＴＴＣＣＴＣＡＧＡＡＣＧＴＴＧＡ−３’（５４８０４−５４８２３）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ５）
ＪＡＫ２エクソン１２−ＰＣＲＲ アンチセンス ５’−ＴＴＧＣＴＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＣＡＡＧＡ−３’（５５２４０−５５２６０）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ６）
【００３６】
ＤＮＡ、シーケンシングプライマー：
ＪＡＫ２エクソン１２ＳＥＱＦ センス ５’ＣＡＧＡＡＣＧＴＴＧＡＴＧＧＣＡＧＴＴＧ−３’（５４８１３−５４８３２）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ７）
ＪＡＫ２エクソン１２ＳＥＱＲ アンチセンス ５’ＴＧＡＡＴＡＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＧＴＴＴＴＣＡＧＴＴＴ−３’（５５２０７−５５２３３）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ８）
【００３７】
ｃＤＮＡ、ＰＣＲプライマーおよびシーケンシングプライマー：
センス ５’−ＣＡＡＣＣＴＣＡＧＴＧＧＧＡＣＡＡＡＧＡＡ−３’（１３８６−１４０７）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ９）
アンチセンス ５’−ＧＣＡＧＡＡＴＡＴＴＴＴＴＧＧＣＡＣＡＴＡＣＡ−３’（２０１９−２０４１）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１０）
【００３８】
ＳＮＰＳプローブ、変異検出プローブおよびｓｉＲＮＡプローブ（１８２９−１８７０）：
ＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＴＧＧＡＧＴＡＴＧＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡＧＡＣＧＡＧＡＡＴＡＴＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１１）
【００３９】
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒでの遺伝子型決定（ＰＮＮまたは骨髄のＤＮＡ）
オリゴ「Ｓ」（センス） ＧＧＣＡＧＡＧＡＧＡＡＴＴＴＴＣＴＧＡＡＣ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１５）
オリゴ「Ｒ」（アンチセンス） ＧＣＴＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＣＡＡＧＡＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１６）
センサーｗｔ ＧＴＣＴＣＣＡＣＡＧＡＣＡＣＡＴＡＣＴＣＣＡＴＡＡ３’−ＦＬ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１７）
アンカーＪＡＫ２ ５’−ＬＣ Ｒｅｄ６４０ＡＡＡＡＣＣＡＡＡＴＧＣＴＴＧＴＧＡＧＡＡＡＧＣＴ３’−ＰＨ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１８）
【００４０】
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒでの遺伝子型決定（たとえば血小板のｃＤＮＡ）
ｃＪＡＫ２Ｆ ＧＣＡＣＡＣＡＧＡＡＡＣＴＡＴＴＣＡＧＡＧＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１９）
ｃＪＡＫ２Ｓ ＡＧＣＡＧＣＡＡＧＴＡＴＧＡＴＧＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２０）
ｃＪＡＫ２Ａ ＣＴＡＧＴＧＡＴＣＣＡＡＡＴＴＴＴＡＣＡＡＡＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２１）
ｃＪＡＫ２Ｒ ＧＴＴＴＡＧＣＡＡＣＴＴＣＡＡＧＴＴＴＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２２）
センサーｗｔ ＧＴＣＴＣＣＡＣＡＧＡＣＡＣＡＴＡＣＴＣＣＡＴＡＡ３’−ＦＬ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２３）
アンカーＪＡＫ２ ５’−ＬＣ Ｒｅｄ６４０ＡＡＡＡＣＣＡＡＡＴＧＣＴＴＧＴＧＡＧＡＡＡＧＣＴ３’−ＰＨ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２４）
【００４１】
Ｔａｑｍａｎ法による遺伝子型決定（たとえば骨髄の単核細胞のＤＮＡにおいて）
対立遺伝子に特異的な蛍光プローブおよび一本鎖ＤＮＡによる認識
ＰＣＲ反応
センスプライマー配列：ＡＡＧＣＴＴＴＣＴＣＡＣＡＡＧＣＡＴＴＴＧＧＴＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２５）
アンチセンスプライマー配列：ＡＧＡＡＡＧＧＣＡＴＴＡＧＡＡＡＧＣＣＴＧＴＡＧＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２６）
リポーター１配列（ＶＩＣ）：ＴＣＴＣＣＡＣＡＧＡＣＡＣＡＴＡＣ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２７）
リポーター２配列（ＦＡＭ）：ＴＣＣＡＣＡＧＡＡＡＣＡＴＡＣ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２８）
【００４２】
その他の特徴として、本発明は、サンプルにおけるＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異の有無を検出することを可能にするインビトロまたはエクスビボでの診断方法にも関するものである。
【００４３】
本発明の核酸を用いた試験
【００４４】
第一の実施態様において、Ｇ１８４９Ｔ変異体（ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異に対応する）はＪＡＫ２遺伝子の核酸分子の分析によって検出することができる。本発明の範囲において、「核酸」とはｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡあるいはｍＲＮＡから派生したｃＤＮＡを意味する。
【００４５】
Ｇ１８４９Ｔ変異体の核酸の有無は、シーケンシング、増幅ならびに／または、上述した特異的プローブおよび特異的プライマー、つまりＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ３または４、およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ５〜１１、あるいはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１５〜２４に由来する配列とのハイブリダイゼーションによって、検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
したがって、本発明は、ＰＶ患者またはＰＶもしくは他のあらゆる骨髄増殖症候群、とりわけ赤血球増加症、血小板増加症および骨髄線維症を発症する可能性のある患者のサンプルにおいて、ＪＡＫ２遺伝子のＧ１８４９Ｔ変異体の有無を判定するためのエクスビボまたはインビトロでの方法を提案するものであり、該方法は、
ａ）患者の核酸のサンプルを得ること、
ｂ）前記核酸のサンプルにおけるＪＡＫ２遺伝子のＧ１８４９Ｔ変異体の有無を検出すること
を含んでおり、
Ｇ１８４９Ｔ変異体の存在がＰＶまたは他のあらゆる骨髄増殖症候群の指標となることを特徴としている。
【００４７】
核酸のサンプルはどのような細胞源または組織生検からも得ることができる。これらの細胞は造血性のものに由来する必要があり、循環血液、造血組織または血液細胞が入ったあらゆる液体から得ることができる。ＤＮＡは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）に記載されている方法のような、従来技術で知られているあらゆる方法を用いて抽出することができる。またＲＮＡも、たとえば生検時に得られる組織などから、グアニジウムチオフェネート−フェノール−クロロホルムによる抽出のような、当業者によく知られている標準的な方法を用いて単離することができる。
【００４８】
ＪＡＫ２遺伝子のＧ１８４９Ｔ変異体は、ＲＮＡまたはＤＮＡのサンプルにおいて、好ましくは増幅後に検出可能である。たとえば、変異部位に特異的なオリゴヌクレオチド、あるいは、たとえばエクソン１２またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ３もしくは４のような変異を含む領域を増幅することを可能にするオリゴヌクレオチドを用いるＲＴ−ＰＣＲ反応のように、単離されたＲＮＡを逆転写にかけ、次に増幅することができる。「オリゴヌクレオチド」という表現は、ここでは少なくとも１０個、好ましくは１５〜２５個のヌクレオチド、好ましくは１００個未満のヌクレオチドからなる核酸を指すために用い、ＪＡＫ２のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡとハイブリダイズする能力がある。
【００４９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、放射性標識、蛍光標識または酵素標識などの当業者に知られたあらゆる技術によって標識することができる。標識されたオリゴヌクレオチドはＪＡＫ２遺伝子のＶ６１７Ｆ変異体の有無を検出するためのプローブとして用いることができる。
【００５０】
このように、本発明で有効なプローブおよびプライマーは１８４９位（転写開始を示すＡＴＧからのナンバリング）のヌクレオチドの近くでＪＡＫ２遺伝子の領域と特異的にハイブリダイズするものである。
【００５１】
上述した方法において、核酸は対立遺伝子の変異の検出前にＰＣＲで増幅することができる。対立遺伝子の変異の検出方法は、たとえば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」第二版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）、およびＵ．Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ編、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６、およびＮｅｗｔｏｎ ＆ ＧｒａｈａｍによるＰＣＲ第２版、ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９７で説明されている。
【００５２】
したがって、増幅過程の後に、目的の変異体の有無に応じてサンプルを選別することを可能にする検出過程を組み合わせることが可能である。
【００５３】
このために採用されるさまざまな技術は欧州特許第１１８６６７２号明細書に示されており、該技術とはたとえば、ＤＮＡシーケンシング、ＳＳＣＰ、ＤＧＧＥ、ＴＧＧＥのハイブリダイゼーションによるシーケンシング、ヘテロ二本鎖分析、ＣＭＣ、酵素によるミスマッチの切断、「ハイブリダイゼーションベースの固相ハイブリダイゼーション」、ＤＮＡチップ、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）液相ハイブリダイゼーション（米国特許第５２１００１５号明細書および米国特許第５４８７９７２号明細書）、ならびにＲＦＬＰ法などである。
【００５４】
検出は、ＦＲＥＴ、蛍光消光、偏光蛍光、化学発光、電気化学発光、放射能および比色分析法といったその他のさまざまな方法を用いて行うことができる。
【００５５】
本発明による方法は、サンプルを得ることおよびそのサンプルの核酸を抽出することからなる過程を含んでいてもいなくてもよい。
【００５６】
上述したように、用いるサンプルは個体から得られた血液もしくは他のあらゆる体液または組織とすることができる。核酸の抽出過程および精製過程の後、上述したプライマーを用いたＰＣＲ増幅をシグナルの検出を向上させるために用いることができる。
【００５７】
このように、本発明による方法は前記プライマーを用いた増幅過程と、その後に続く、ハイストリンジェンシーの条件の下で上述したＧ１８４９Ｔ変異領域に対応する配列とハイブリダイズする少なくとも一つのプローブ、好ましくは二つのプローブとのハイブリダイゼーション過程、そして前記プローブの標識によって生成したシグナルの検出を含むことができる。
【００５８】
たとえば、本発明はより特徴的には、ＰＶ患者、またはＰＶもしくは他のあらゆる骨髄増殖症候群を発症する可能性のある患者のサンプルにおいて、ＪＡＫ２遺伝子のＧ１８４９Ｔ変異体の有無を判定するためのインビトロでの方法を目的とし、該方法は、ＪＡＫ２遺伝子のＧ１８４９Ｔ変異に特異的な一つまたは複数のＳＮＰ（一塩基変異多型）、とりわけＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１７と１８、あるいは、２３と２４を用いて、前記核酸のサンプルにおいてＪＡＫ２遺伝子のＧ１８４９Ｔ変異体の有無を検出することを含むものであり、Ｇ１８４９Ｔ変異体の存在がＰＶまたは他のあらゆる骨髄増殖症候群の指標となることを特徴としている。
【００５９】
ＳＮＰを用いたこの検出は、対立遺伝子の識別を可能にするＴａｑｍａｎ（登録商標）法によって実施することができる。基本的に、この方法は一本鎖ＤＮＡにおけるＪＡＫ２を１８４９対立遺伝子に特異的な蛍光プローブによって認識することで構成され、ＰＣＲ反応（５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによる）、ハイブリダイズしたＳＮＰの対立遺伝子に特異的な蛍光発光の検出、最終的な蛍光を読み取ることによる遺伝子型の決定（ホモ接合変異ＤＮＡ、ヘテロ接合変異ＤＮＡおよび正常ＤＮＡのクラスタを示す画像の取得）を含んでいる。
【００６０】
ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異タンパク質の検出
【００６１】
もう一つの実施態様によると、変異体はＪＡＫ２タンパク質内で直接検出することができる。
【００６２】
そのために、本発明は、ＰＶまたは他のあらゆる骨髄増殖症候群、とりわけ赤血球増加症、血小板増加症および骨髄線維症に冒された、またはこれらを発症する可能性のある患者のサンプルにおいて、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体の有無を検出するためのエクスビボあるいはインビトロでの方法を目的とし、該方法は、
ａ）患者のサンプルを得ること、
ｂ）ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体の有無を検出すること
を含んでおり、
前記変異体の存在がＰＶまたは他のあらゆる骨髄増殖症候群の指標となることを特徴としている。
【００６３】
前記ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体は従来技術で知られているあらゆる適切な方法で検出することができる。
【００６４】
より特徴的には、個体から得られたサンプルは、タンパク質ＪＡＫ２のＶ６１７Ｆ変異体に特異的な抗体、たとえばＶ６１７Ｆ変異体と変異していないＪＡＫ２タンパク質（およびその他のあらゆるタンパク質）とを区別する能力をもった抗体と接触させることができる。
【００６５】
本発明の抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、一本鎖または二本鎖、キメラ抗体、ヒト化抗体、あるいは、抗原と結合する断片［ヒト断片、ヒトＦ（ａｂ’）２およびＦ（ｖ）］に対応することが従来技術で知られている部分を含む免疫グロブリン分子の部分とすることができる。
【００６６】
これらの抗体は、たとえば毒素またはマーカーとの免疫複合体とすることができる。
【００６７】
ポリクローナル抗体を得るための手順は当業者には良く知られている。典型的には、そのような抗体は、免疫前血清を得るために事前に用意したニュージーランドホワイトウサギにＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体を皮下注射で投与することで得ることができる。抗原は６箇所の異なった部位に部位あたり１００μｌまで注射することができる。ウサギは最初の注射の二週間前に用意し、続いて同一の抗原によって、６週間ごとにおよそ３回、定期的に刺激を与える。そして、血清サンプルを各注射の１０日後に得る。次に、ポリクローナル抗体を、抗体を捕捉するためにＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆタンパク質を用いてアフィニティークロマトグラフィーにより血清から精製する。
【００６８】
モノクローナル抗体は特異性が高いため、ポリクローナル抗体より好ましい。
【００６９】
ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体が野生型ＪＡＫ２タンパク質とは異なった３Ｄ構造を有しているため、このようなモノクローナル抗体を得ることは当業者にとって可能である。「モノクローナル抗体」という表現は、抗原のエピトープだけを認識することができる抗体を意味している。
【００７０】
モノクローナル抗体は、哺乳動物、たとえばマウス、ラット、あるいは他の哺乳動物に、精製されたＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体で免疫付与することで得ることができる。抗体を産生する免疫付与した哺乳動物の細胞を単離し、雑種細胞（ハイブリドーマ）を産生するために骨髄腫または異種骨髄腫の細胞と融合させる。
【００７１】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を抗体の産生源として用いる。免疫付与を必要としない抗体の生成技術も本発明の目的である。たとえば「ファージディスプレイ」法である。
【００７２】
ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体に対する抗体は、ある種の場合には野生型ＪＡＫ２タンパク質との交差反応を示すことがある。これに該当する場合、Ｖ６１７Ｆ変異体に特異的な抗体を選択することが必要となる。したがって、たとえば野生型ＪＡＫ２との交差反応を示しうる抗体を捕捉するために、野生型ＪＡＫ２タンパク質でのアフィニティークロマトグラフィーを用いることができる。
【００７３】
このように、本発明はＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体を特異的に認識するモノクローナル抗体ならびに該抗体を産生するハイブリドーマ系を目的としている。
【００７４】
また、本発明は、サンプルにおけるＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体の有無を検出するための前記抗体を用いたＥＬＩＳＡ法も対象とする。
【００７５】
抗体の利用に代わる方法は、たとえば、特定の分子の認識を可能にする分子クラスであるハプタマーを調製し、識別することからなる。
【００７６】
ハプタマーは、高い親和性と特異性で標的分子のいかなるクラスも実質的に認識することができるオリゴヌクレオチドまたはオリゴペプチドである。
【００７７】
キット
【００７８】
もう一つの特徴によると、本発明は、患者が真性赤血球増加症またはＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体が関与する他のあらゆる骨髄増殖症候群に冒されているかどうかを判定するためのキットに関するものである。
【００７９】
本発明のキットは、ＪＡＫ２遺伝子におけるＧ１８４９Ｔ変異の有無を特異的に検出するための、上記で定義した一つまたは複数のプローブまたはプライマーを含むことができる。
【００８０】
またキットは、ＰＣＲ増幅のための耐熱ポリメラーゼ、増幅および／またはハイブリダイゼーション過程のための一つまたは複数の溶液、ならびに、マーカーの検出を可能にするあらゆる試薬も含むことができる。
【００８１】
もう一つの実施態様において、キットは上記で定義した抗体を含んでいる。
【００８２】
さらに、本発明のキットは、固体担体上でのハイブリダイゼーションまたは免疫反応に適したあらゆる試薬を含むことができる。
【００８３】
検出方法および検出キットは、好適には、５１％を超えるヘマトクリット値を示す患者の亜集団に対して用いられる。また、検出方法および検出キットもまた、好適には、４５００００を超える血小板の割合を示す患者の亜集団に対して用いられる。
【００８４】
本発明のｓｉＲＮＡ
【００８５】
第四の特徴として、本発明はまた、６１７位が変異したＪＡＫ２、特にＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの発現を５０％以上、７５％以上、９０％以上または９５％以上、あるいは９９％以上減少させることを可能にするｓｉＲＮＡも対象としている。これらのｓｉＲＮＡは、リポフェクション、形質導入あるいはエレクトロポレーションによって細胞または組織内に注入することができる。このｓｉＲＮＡによって、数多くの可能な治療法の適用とりわけ真性赤血球増加症の治療を必要とさせる、ＪＡＫ２ Ｖ６１７ＦをコードするｍＲＮＡを特異的に破壊することが可能となる。
【００８６】
ｓｉＲＮＡは米国特許第６０／０６８５６２号明細書（ＣＡＲＮＥＧＩＥ）に記載されている。このＲＮＡは、二本鎖（ｄｓ）構造の領域を有することを特徴とする。阻害は標的配列に特異的であり、ＲＮＡのｄｓ領域の一方の鎖のヌクレオチド配列は少なくとも２５個の塩基を含み、標的遺伝子の部分と同一である。ＲＮＡのｄｓ領域の他方の鎖のヌクレオチド配列は前者の鎖および標的遺伝子の部分に対して相補的である。また、国際公開第０２／４４３２１号パンフレット（ＭＩＴ／ＭＡＸ ＰＬＡＮＣＫ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ）は二本鎖ＲＮＡ（あるいは化学的に合成された同一の性質のオリゴヌクレオチド）を記載しており、該ＲＮＡの各鎖は１９〜２５個のヌクレオチド長を有し、ＲＮＡ干渉プロセスによって標的遺伝子の転写後の発現を特異的に阻害することで、遺伝子の機能を判定し、細胞または個体におけるこの機能を変化させる能力をもっている。最後に、国際公開第００／４４８９５号パンフレット（ＲＩＢＯＰＨＡＲＭＡ）は真核細胞における所与の標的遺伝子の発現をインビトロで阻害する方法を対象としており、該方法において、別々の二つの一本鎖ＲＮＡで形成されたｄｓＲＮＡが細胞内に導入され、ｄｓＲＮＡの一方の鎖は、標的遺伝子と相補的な、２５対未満の連続したヌクレオチドを有する領域を有することを特徴としている。本発明のｓｉＲＮＡを調製するために、当業者はこの文書に含まれる教示内容を参照することができる。
【００８７】
より特徴的には、本発明は、Ｇ１８４９Ｔ変異を含むＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ３の配列に相補的（鎖１）な、および同一（鎖２）の、およそ１５〜３０個のヌクレオチド、１９〜２５個のヌクレオチド、好ましくは約１９個のヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡを対象としている。本発明のこれらのｓｉＲＮＡは、さらに３’末端にジヌクレオチドＴＴまたはＵＵを含むことができる。
【００８８】
多くのプログラムが本発明のｓｉＲＮＡを設計するために利用可能である。
−「ｓｉＳｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒａｍ」、ｈｔｔｐ：／／ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ．ｃｇｂ．ｋｉ．ｓｅ／ｓｉＳｅａｒｃｈ／ｓｉＳｅａｒｃｈ＿１．６．ｈｔｍｌ（「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｎｄ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｓｉＲＮＡ」，Ｃｈａｌｋ ＡＭ，Ｗａｈｌｅｓｄｅｌｔ Ｃ，ａｎｄ Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ ＥＬＬ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２００４）。
−「ＳｉＤｉｒｅｃｔ」、ｈｔｔｐ：／／ｄｅｓｉｇｎ．ｒｎａｉ．ｊｐ／ｓｉｄｉｒｅｃｔ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ（Ｄｉｒｅｃｔ：ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ，ｔａｒｇｅｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ｍａｍｍａｌｉａｎ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，Ｙｕｋｉ Ｎａｉｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（著作権），２００４）。
−「ｓｉＲＮＡ Ｔａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ」、Ａｍｂｉｏｎ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｍｉｓｃ／ｓｉＲＮＡ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ。
−「ｓｉＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎ ｔｏｏｌ」、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＭＩＴ、ｈｔｔｐ：／／ｊｕｒａ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｐｕｂｉｎｔ／ｈｔｔｐ：／／ｉｏｎａ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｓｉＲＮＡｅｘｔ／。
【００８９】
その他のプログラムは以下にリストされている。
ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｍｍｃｍａｎｕｓ／ｗｗｗ／ｈｏｍｅ１．２ｆｉｌｅｓ／ｓｉＲＮＡｓ．ｈｔｍ、とりわけ、
ｈｔｔｐ：／／ａｔｈｅｎａ．ｂｉｏｃ．ｕｖｉｃ．ｃａ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｅｍｂｏｓｓ．ｐｌ？＿ａｃｔｉｏｎ＝ｉｎｐｕｔ＆＿ａｐｐ＝ｓｉｒｎａ。
【００９０】
たとえば、配列ＴＡＴＧＧＡＧＴＡＴＧＴＴ1849ＴＣＴＧＴＧＧＡＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１２）に対しては、センスｓｉＲＮＡはＵＧＧＡＧＵＡＵＧＵＵＵＣＵＧＵＧＧＡｄＴｄＴ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１３）であり、アンチセンスｓｉＲＮＡはＵＣＣＡＣＡＧＡＡＡＣＡＵＡＣＵＣＣＡｄＴｄＴ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１４）である。
【００９１】
特定の実施態様によると、上記の本発明のｓｉＲＮＡは、野生型ＪＡＫ２の発現にできるだけ影響を与えずにＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの発現を減少させる能力、ひいては特異的にブロックする能力について試験、選別されている。たとえば本発明は、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの発現を８０％より多く、９０％より多く、９５％より多くまたは９９％より多く減少させ、野生型ＪＡＫ２についてはまったく減少させない、あるいは、５０％未満、２５％未満、１５％未満、１０％未満または５％未満、さらには１％未満の減少とすることが可能な、ｓｉＲＮＡを目的とするものである。
【００９２】
たとえば、本発明のｓｉＲＮＡは、
−ＵＧＧＡＧＵＡＵＧＵＵＵＣＵＧＵＧＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２９）、
−ＧＧＡＧＵＡＵＧＵＵＵＣＵＧＵＧＧＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ３０）、
−ＧＡＧＵＡＵＧＵＵＵＣＵＧＵＧＧＡＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ３１）、
から構成されるグループから選択することができる。
【００９３】
もう一つの実施態様では、本発明は、国際公開第０１／７０９４９号パンフレット（Ｂｅｎｉｔｅｃ）に包括的に記載されているｄｄＲＮＡｉ分子に関するものであるが、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを特異的に標的としている。本発明のｄｄＲＮＡｉは、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆをコードしている配列を消失させることを可能にするものであり、該ｄｄＲＮＡｉは、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ３、４または１１と同一の配列、（ｉｉ）（ｉ）で定義した配列に相補的な配列、（ｉｉｉ）前記配列（ｉ）および（ｉｉ）を隔てるイントロン、そしてＪＡＫ Ｖ６１７Ｆの発現を変化させる能力をもったＲＮＡを産生する細胞または組織にこの構築物を導入することを含んでいる。
【００９４】
また、本発明は、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの発現をブロックし、遅らせ、または減少させる能力を持った遺伝子構築物を含む一つまたは複数の細胞を有する、遺伝的に修飾された、ヒトではない動物も対象としている。このような遺伝的に修飾された動物を産生する方法は国際公開第０４／０２２７４８号パンフレット（Ｂｅｎｉｔｅｃ）に示されている。
【００９５】
スクリーニング方法
【００９６】
第五の特徴として、本発明はＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの特異的阻害剤のスクリーニング方法を目的としている。
【００９７】
「特異的阻害剤」とは、ＪＡＫ２ Ｖ６１７ＦのＩＣ５０に対するＪＡＫ２のＩＣ５０の比率が５、１０、２５あるいは５０を超える化合物を意味する。たとえば、この化合物はＪＡＫ２ Ｖ６１７ＦのＩＣ５０が１μＭ未満、好ましくは１００ｎＭ未満であるのに対し、ＪＡＫ２のＩＣ５０は５μＭまたは１０μＭを超える。
【００９８】
この方法は、本発明のタンパク質、前記タンパク質を含んだ膜画分、前記タンパク質を発現する細胞、あるいは上述したヒトではないトランスジェニック動物を用いて実施することができる。
【００９９】
このように、本発明は、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの特異的阻害を一つまたは複数の化合物によって判定することを可能にする試験を対象とし、該試験は、一つまたは複数の化合物を、固定、特異的な固定の検出および／またはＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの阻害の検出に適した条件下で、上記のＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆタンパク質、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを含む膜画分、あるいは上記のＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを発現する細胞と接触させることからなる過程を含んでいる。
【０１００】
この方法はさらに野生型ＪＡＫ２への固定の測定を含むことができる。
【０１０１】
また、この方法は複数の分子に対する一連の試験で構成することができ、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆに対して１μＭ未満、好ましくは１００ｎＭ未満のＩＣ５０を示す分子を選択する過程を含むことができる。
【０１０２】
さらにこの方法は、ＪＡＫ２に対して５μＭまたは１μＭ未満のＩＣ５０を示す前述した分子の負の選択を行う過程を含むことができる。
【０１０３】
本発明は、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆのリン酸化の阻害を免疫沈降によって判定する、上述したインビトロでのスクリーニングを対象とする。
【０１０４】
また、本発明は、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）の不在下で分化する能力があるＣＤ３４＋ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ前駆細胞に対する、インビボでのスクリーニングも対象としている。このような細胞は真性赤血球増加症の患者から単離する。ＣＤ３４＋ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ細胞はＳＣＦおよびＩＬ−３を含んだ培地で培養することができる。化合物を培養培地に加え、細胞の増殖能力および３６＋／ＧＰＡ−細胞に分化する能力を判定する。３６＋／ＧＰＡ−クローンの数の減少が観察される化合物を選択する。このように、本発明は、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）の不在下で、またはＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体の導入によって独立因子となった細胞系上で分化する能力がある、ＣＤ３４＋ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの初代前駆細胞を用いた上記スクリーニング方法を対象としている。同様のタイプの分析を半流動培地におけるＣＦＵ−Ｅ型の骨髄培養物に対して行うことができ、コロニーの自然発生的な増加の阻害について化合物を直接試験することができる。
【０１０５】
また、組換えＪＡＫ Ｖ６１７Ｆを発現する上記の哺乳動物のあらゆる細胞系を利用することもできる。
【０１０６】
また、本発明は医薬品の候補を識別するための方法も対象としており、該方法は、真性赤血球増加症を再現し、および／または、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの存在に関連する骨髄増殖症候群に冒されている、上述したＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを発現する、ヒトではないトランスジェニック動物に化合物を投与することと、化合物の効果を判定し、真性赤血球増加症における赤芽球の増殖および自然発生的な分化の減少もしくはブロックまたはＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの存在に関連する細胞増殖の減少が観察される医薬品候補を選択することとからなる過程を含んでいる。
【０１０７】
より特徴的には、この方法は、上述したＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ Ｋ−ｉｎマウスまたはＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ Ｋ−ｉｎラットで実施する。
【０１０８】
これらの化合物のうち、たとえば前述したＪＡＫ２の変異したエクソン１２を標的とするｓｉＲＮＡ、特に、変異ヌクレオチドｔ1849を含んだ配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ３、４または配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１１を標的とするｓｉＲＮＡを挙げることができる。
【０１０９】
もう一つの特徴として、本発明は、医薬品の製造のために、前記ｓｉＲＮＡまたは上記のｄｄＲＮＡｉおよびＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを特異的に阻害する化合物を利用することを対象としている。前記医薬品はとりわけ、血液の癌、特に真性赤血球増加症、本態性血小板増加症、骨髄性脾腫つまり原発性骨髄線維症、および慢性骨髄性白血病（ＬＭＣ）を含む骨髄増殖症候群の治療を目的としている。また、前記医薬品は、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異に関連するその他の悪性血液疾患、場合によってはＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを発現する充実性腫瘍、癌腫、黒色腫および神経芽腫の治療も目的としている。
【０１１０】
明細書の以下の部分および実施例については、以下に説明した図面を参照するものとする。
【０１１１】
図面の説明
【０１１２】
図１：ＰＶにおけるＪＡＫ２の主要な役割の発見
平常時では、ＪＡＫ２はリン酸化していない状態でボックス１に固定されている。Ｅｐｏとの結合によって受容体の立体構造が変化し、ＪＡＫ２のリン酸転移が可能となり、それを受けてＪＡＫ２はＥｐｏ−Ｒの細胞質内残基をリン酸化し、シグナル伝達のさまざまな正のエフェクター（→）または負のエフェクター（┤）を動員する。
【０１１３】
図２：エリスロポエチンの不在下で分化できるＰＶのＣＤ３４＋前駆細胞の培養モデルの設定
２Ａ：Ｅｐｏ、ＳＣＦおよびＩＬ−３を用いた培養。
２Ｂ：Ｅｐｏの不在下での培養。
【０１１４】
図３：ＪＡＫ−ＳＴＡＴ、Ｐｉ３−ＫおよびＳｒｃキナーゼ経路の阻害による赤血球の自然発生的な分化の抑制。
【０１１５】
図４：ＰＶ前駆細胞におけるＪＡＫ２の阻害の手順。
【０１１６】
図５：ＰＶ前駆細胞におけるＪＡＫ２の阻害の結果
５Ａ：３６＋／ｇｐａ−のクローニング能力の減少。１〜６日目にＳＣＦ−ＩＬ３において培養し、５日目にエレクトロポレーションを行い、６日目に選別する（形態／３６＋／ｇｐａ−）。
メチルＳＣＦのみ。１３日目（選別後７日目）に計数を行う。
５Ｂ：Ｖ６１７Ｆ変異を有するＪＡＫ２の構造（エクソン１２）。
【０１１７】
図６：ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）法およびＴａｑＭａｎ（登録商標）法による、ゲノムＤＮＡにおけるＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異を検出するためのＳＮＰの遺伝子型決定分析。
ＡおよびＢ：ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブを用いたＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）の融解曲線分析による変異の検出。Ａ：ＴＦ−１のＤＮＡにおけるさまざまな希釈度のＨＥＬのＤＮＡを用いた実験の結果が示されている。ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆのピーク（５７℃）は１％の希釈度でも依然として検出可能である。Ｂ：代表的な患者のサンプルの結果を示している（＃１：ホモ接合体、＃２：ヘテロ接合体、＃３：弱い、＃４：変異なし）。
Ｃ：ＴａｑＭａｎ（登録商標）を用いた対立遺伝子に特異的な増幅による変異の検出。ＨＥＬのＤＮＡの希釈物での実験（１００〜１％のＨＥＬ：白抜きの四角、ＴＦ−１細胞：白抜きの丸）と代表的な患者のいくつかのサンプル（黒の十字）を示している。＃ａ：ホモ接合体の患者、＃ｂ：ヘテロ接合体の患者、＃ｃ：弱い患者、＃ｄ：変異のない患者。
【０１１８】
図７：赤血球増加症（つまり５１％を超えるクリマトクリット値）を診断するために提案する診断シート。
シートの各段階についての患者の数は各欄の端に記載されており（ｎ）、ここではすべての臨床データを示す患者のみをリストしている（ｎ＝８１）。一次診断試験であるＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの検出の結果、８１人中５８人の患者において、ＰＶ型の骨髄増殖症候群を診断するためのその他の調査を避けた。
【０１１９】
図８および図９：ＨＥＬ細胞におけるＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの発現が、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆに特異的なｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ＃１、＃３および＃４）による処理の２４時間後に減少する。
０〜６：ＪＡＫ２ Ｖ６１７ＦのｓｉＲＮＡで処理した（１〜６）または処理していない（０）ＨＥＬ細胞。
Ｃ＋：ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ ＲＶベクターでトランスフェクトした２９３ＨＥＫ細胞。
Ｃ−：２９３ＨＥＫ。
【０１２０】
図１０：Ｋ５６２細胞におけるＷＴ ＪＡＫ２の発現レベルは、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆに特異的なｓｉＲＮＡによる処理の２４時間後にも変化しなかった。
Ｊｅ：ＷＴ ＪＡＫ２のｓｉＲＮＡで処理したＫ５６２細胞。
０〜６：ＪＡＫ２ Ｖ６１７ＦのｓｉＲＮＡで処理したＫ５６２細胞。
Ｃ−：２９３ＨＥＫ（ＪＡＫ２の発現なし）。
【実施例１】
【０１２１】
４３人中３９人の患者におけるＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異の識別
【０１２２】
疾病状態にある前駆細胞の培養モデルの設定と生化学的阻害剤の利用によって、ＪＡＫ２−ＳＴＡＴ５、ＰＩ３キナーゼおよびＳｒｃキナーゼの経路がＰＶ前駆細胞のＥｐｏに依存しない分化に必要であることが明らかになった（Ｕｇｏ ｅｔ ａｌ，２００４）。これらの結果は、ＰＶが原因である原発性の分子異常が、シグナル伝達経路に構成的活性を与えるチロシンキナーゼの変異のような、シグナル伝達経路の脱制御につながる主要タンパク質の異常であるという、我々の仮説を裏付けている。とはいえ、ＪＡＫ２タンパク質の主要な役割は真性赤血球増加症に冒された４３人の患者に対する検査により特定することができたのであり、該タンパク質はこれらのさまざまなシグナル伝達経路の最も上流に位置するタンパク質で、サイトカイン受容体のシグナル伝達経路に共通しているものであり、該受容体に対する応答の異常はＰＶにおいて説明されてきている。我々は、
−機能的アプローチ（ＲＮＡ干渉によるＰＶ細胞におけるＪＡＫ２の阻害）、
−ゲノム的アプローチ（遺伝子の２３個のエクソンのシーケンシング）、および、
−構成的活性化の原因となるＪＡＫ２のリン酸化の異常を発見するための生化学的アプローチ
という３つの補足的なアプローチによって、ＰＶの病理におけるＪＡＫ２プロテインキナーゼの関与を研究した。
【０１２３】
用いた生物材料は、赤血球増加症に冒されている、承諾を得た患者に由来するものであり、診断目的で採取され、Ｈｏｔｅｌ ＤｉｅｕのＬａｂｏｒａｔｏｉｒｅ Ｃｅｎｔｒａｌ ｄ’Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｅに送られたサンプルの残りと、治療のための瀉血に対応するものである。
【０１２４】
１．１ 機能的研究
真性赤血球増加症に冒された患者の赤芽球におけるＪＡＫ２の機能の研究は、ＪＡＫ２のｍＲＮＡのエクソン１５に位置する配列を標的として認識する、ＪＡＫ２配列に特異的なｓｉＲＮＡ（ＡＭＢＩＯＮ、Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ、イギリス）を、エレクトロポレーションによってＰＶの赤芽球に形質導入することで行った。我々は、ＪＡＫ２の阻害によって、Ｅｐｏの不在下でのＰＶ前駆細胞のクローニング能力と「自然発生的な」分化がかなり減少することを示した。ＪＡＫ２のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした正常な赤芽球前駆細胞は、コントロールｓｉＲＮＡと比較してクローン化能力が７０％減少しており、このことは、ＪＡＫ２のｓｉＲＮＡによるトランスフェクションが有効であることを確証している。ＰＶでは、赤芽球前駆細胞においてＪＡＫ２を阻害する効果がＥｐｏ不在の培養モデルにおいて研究されており、これによって悪性クローン細胞の研究が可能となっている。我々は、ＪＡＫ２のｓｉＲＮＡによるトランスフェクション後のＰＶの赤芽球前駆細胞のクローン化能力、アポトーシスおよび分化を、コントロールｓｉＲＮＡの場合と比較した。Ｅｐｏの不在下で培養したＰＶ前駆細胞のクローン化能力の研究により、コントロールｓｉＲＮＡの場合と比較して、ＪＡＫ２のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした後にコロニーの数が明らかに減少したことが示された。これらの細胞のアポトーシスについてのフローサイトメトリー分析は、ＪＡＫ２のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞では、関連のないｓｉＲＮＡの場合と比較してアポトーシスが顕著に増加したことを示している（７０％対５３％）。分化に対するＪＡＫ２のｓｉＲＮＡの効果に関する研究（フローサイトメトリーで検出されたグリコフォリンＡの回収）では、コントロールｓｉＲＮＡとＪＡＫ２のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした前駆細胞の間ではわずかな違いを示しただけである。
【０１２５】
したがって、細胞研究の結果は、ＰＶの赤芽球前駆細胞がＥｐｏに依存せずに分化するにはＪＡＫ２が必要であることを示している。生化学的研究（免疫沈降）の第一の結果は、ＰＶの赤血球前駆細胞をサイトカインから遮断すると、正常細胞と比較して、ＪＡＫ２のより長いリン酸化が起こることを示している。
【０１２６】
１．２ ＪＡＫ２のゲノム的研究
２３個のエクソンに対するＰＣＲをゲノムＤＮＡに基づいて正常な被験者に対して行った。そして、細胞培養後にインビトロで得られた赤血球細胞のゲノムＤＮＡを抽出した後に、３人のＰＶ患者について研究した。
【０１２７】
我々は、ＪＡＫ２のエクソン１２に位置し、試験した３人の患者のうち２人に存在した点変異を識別した。この変異はコード配列の１８４９番塩基（［ＡＴＧから開始したナンバリング］、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ＿００４９７２）に関与し、ＪＡＫ２タンパク質のコドン６１７を変化させる（Ｖ６１７Ｆ）。
・通常のコドン６１７：バリン（Ｖ）をコードするｇｔｃ。
・変異したコドン６１７：フェニルアラニン（Ｆ）をコードするｔｔｃ。
【０１２８】
インターネット上に公開されているデータベースにより、我々はそれが既知の多型ではないことを確認した。
【０１２９】
次に、我々は被験者群を広げた。現在、変異は試験した４３ケースのうち３９人のＰＶ患者で見つかっている。対照（試験した１５ケース）あるいは二次性赤血球増加症の患者（試験した１８ケース）では変異を有する者は見つかっていない。
【０１３０】
患者におけるシーケンシングの結果
・試験した４３のＰＶ中３９の変異（９０％）。
・２／３のヘテロ接合体。
・１３／３９、つまり３０％のケースが「ホモ接合体」（９ｐでのヘテロ接合性の喪失と同じ割合）。
【０１３１】
コントロール
・試験した３３人の対照中０例の変異。
−うち、１５人は正常な被験者。
−１８人は二次性赤血球増加症（自然発生的なコロニーなし）。
【０１３２】
ＪＡＫ２のこの異常の発見は、ＰＶに関わる多くの成長因子（Ｅｐｏ、ＴＰＯ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、インスリン）に対する過敏性を説明している。実際、ＪＡＫ２はこれらサイトカインの受容体のシグナル伝達経路に関与するタンパク質である。
【０１３３】
さらに、ＪＡＫ２とＥｐｏ−Ｒとの連関は、ＪＡＫ２が構成的にＥｐｏ−Ｒに固定されるという点で特徴的である。つまり、ゴルジ装置内で開始されるＪＡＫ２／Ｅｐｏ−Ｒの連関は、赤芽球の膜でのＥｐｏ−Ｒのプロセッシングに必要である。したがって、ＪＡＫ２とＲ−Ｅｐｏとの連関の変化の原因となっているＪＡＫ２の異常は、赤芽球系での骨髄の過形成の優位性を説明しうるが、一方、このタンパク質は多くのシグナル伝達経路に関与するものである。また、Ｍｏｌｉｔｅｒｎｏ ｅｔ ｃｏｌｌ（Ｍｏｌｉｔｅｒｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８、Ｍｏｌｉｔｅｒｎｏ ｅｔ Ｓｐｉｖａｋ，１９９９）は、グリコシル化の欠如に関連するｍｐｌの膜発現の欠如を立証している。Ｅｐｏ−Ｒから類推して、ＪＡＫ２がｃ−ｍｐｌのプロセッシングに必要である可能性がある。ＪＡＫ２の異常は、ＰＶで見られるｃ−ｍｐｌの膜発現の欠如を説明するものであろう。
【０１３４】
ＪＡＫ２は、その近位ドメインにおいて、Ｅｐｏ−Ｒの、よく保存されたドメインであるＢｏｘ２に結合する。Ｅｐｏによる刺激がないとき、ＪＡＫ２は構成的にＥｐｏ−Ｒに固定されるが、リン酸化していない形態であり、したがって非活性的である。Ｅｐｏによる受容体の刺激後、二つのＪＡＫ２分子はリン酸化し、そしてＥｐｏ−Ｒをリン酸化するのだが、このことによって、ＳＴＡＴ５、Ｇｒｂ２、ＰＩ３Ｋタンパク質のようなシグナル伝達に関与するその他のタンパク質を動員し、リン酸化することが可能になる。ＪＡＫ２タンパク質はすべてのＪＡＫと同様、機能的なキナーゼ領域（ＪＨ１）、チロシンキナーゼ活性のない偽キナーゼ領域（ＪＨ２）および、ＪＡＫファミリーのメンバーに特徴的な複数の保存ドメイン（ＪＨ３〜ＪＨ７）を有している。ＪＨ２ドメインはＪＡＫ２のチロシンキナーゼ活性の調整に関与すると考えられる。ＪＡＫ２タンパク質のマッピングに関する入手可能なデータ（Ｌｉｎｄａｕｅｒ，２００１）によると、６１７番アミノ酸はこのＪＨ２ドメインに位置し、モデル化の研究によると、キナーゼ活性の調節に特に重要な領域に位置している。
【０１３５】
この発見（サイトカインに依存しないメカニズムの理解、さまざまなＳＭＰの分類）の生理病理学的利点を越えて、患者における変異の実証は、診断の確認を可能にする試験を初めて提供するものである。医療診断のアプローチにおいて、ＪＡＫ２の変異の検査は、悪性クローンに属する血液多核球に対して行うことができるものである。
【０１３６】
また、本発明は、変異タンパク質に特異的なキナーゼを阻害するタイプの特異的な処理、あるいは遺伝子治療の開発を提供するものでもある。
【実施例２】
【０１３７】
赤血球増加症の一次診断のためのＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体の検出
【０１３８】
２．１ 患者、材料および方法
ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを検出するための、シーケンシングと二つのＳＮＰ遺伝子型決定法の比較。
【０１３９】
患者の細胞
ＭＰＤ（すなわち赤血球増加症、血小板増加症、白血球増加症）の疑いがある１１９のサンプルを分析した。５８の血液サンプルをこのために採取し、骨髄バンクの６１のサンプルを遡及的に分析した。
【０１４０】
製造者（Ｅｕｒｏｂｉｏ、フランス）の指示にしたがって密度勾配を用いて末梢顆粒球を単離した。Ｆｉｃｏｌｌを用いた勾配遠心法を利用して骨髄の単核細胞を単離した。標準的な手順でゲノムＤＮＡを抽出した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）法およびＴａｑＭａｎ（登録商標）法の感度を知るために、最少残基の野生型対立遺伝子とのホモ接合のサンプルに由来するＤＮＡを、正常ＤＮＡで連続希釈した。
【０１４１】
細胞系
標準的なポジティブコントロールであるＴＦ−１細胞系（変異なし）のＤＮＡにおける、ホモ接合性で変異した（ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ）ヒト赤白血病細胞系（ＨＥＬ）のＤＮＡの連続希釈物（１、０．５、０．１、０．０５、０．０１）を用いた。この細胞系を、ウシ胎児血清を加えたＭＥＭ−α培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で成長させた。
【０１４２】
ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブを用いたＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）の融解曲線分析による変異の検出
ＪＡＫ２のエクソン１２の標的配列の増幅および該配列とのハイブリダイゼーションのために、プライマーとプローブを設計した。変異部位の位置（１８４９Ｇ／Ｔ）を、３’をフルオレセインで標識したドナーキャプチャープローブと、５’末端をＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ６４０（ＬＣＲｅｄ６４０）で標識した、隣接するアクセプターアンカープローブで覆い、該アンカープローブの３’末端は伸長を避けるためにリン酸化した。増幅および融解曲線分析はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）の機器（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍｅｙｌａｎ、フランス）で実施した。最終的な反応体積は２０μｌであり、１０ｎｇのＤＮＡ、１４μｌのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ混合物、３ｍＭのＭｇＣｌ2、０．２μＭのプライマー、０．０７５μＭの各プローブが含まれている。簡単に説明すると、サンプルを９５℃で１０分間加熱し、４５サイクル（９５℃で１０秒、５３℃で１０秒、７２℃で１５秒）のＰＣＲ増幅の後、９５℃で１０秒間の変性過程と、それぞれ３０秒にわたる６３℃と４５℃での二回のハイブリダイゼーション過程を行い、そして融解曲線は４５℃と７０℃（０．１℃／秒）の間に含まれる領域にあった。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）プログラム上での分析は、温度に対する蛍光産物の曲線［Ｔに対する２（ｄＦｌ２／Ｆｌ１）／ｄＴ）］をプロットすることで行った。変異体およびＷＴのピークはそれぞれ５７℃と６３℃で見られた。
【０１４３】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）を用いた対立遺伝子に特異的な増幅による変異の検出
１８４９位でのＳＮＰを含む９２ｂｐの産物を増幅するために二つのプライマーを設計した。二つのＭＧＢ蛍光プローブを、異なる色で蛍光標識して、一つはＷＴ対立遺伝子を標的とし、もう一つは変異対立遺伝子を標的とするよう設計した。９６ウェルプレート上で、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲに基づく方法を用いて遺伝子型決定を行った。最終的な反応体積は１２．５μｌであり、１０ｎｇのゲノムＤＮＡ、６．２５μｌのＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘおよび０．３１μｌの４０×Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ ＳＮＰ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ａｓｓａｙ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が含まれている。プレートを９５℃で１０分間加熱し、その後、９２℃で１５秒の４０回の変性サイクルと６０℃で１分間の対合／伸長を行った。熱サイクルは７５００ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。分析はＳＤＳプログラムのバージョン１．３を用いて実施した。最終的な対立遺伝子の識別のための遺伝子型決定は、ＰＣＲ後の蛍光読み取りに基づいて得られた変異ＪＡＫ２の蛍光の曲線（Ｒｎ）に対する、ＷＴプローブに由来するＲｎの目視による判定で行った。
【０１４４】
赤血球増加症の患者とサンプルの採集
何らかの治療を行う前に、診断時に、５１％を超えるヘマトクリット値を有する８８人の患者を調べ、ＷＨＯ基準およびＰＶＳＧ基準の有無について検査した。５１％という値はヘマトクリット値の正常域の上限である（Ｐｅａｒｓｏｎ ＴＣ ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａ Ｖｅｒａ Ｕｐｄａｔｅｄ：Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ（Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｅｄｕｃ．Ｐｒｏｇｒａｍ．）２０００：５１−６８）。骨髄細胞をクローン化の測定のために採取し、過剰量の細胞をＤＮＡ抽出のために採取した。血清中のエリスロポエチン（Ｅｐｏ）をさまざまな研究所で測定し、その結果、該エリスロポエチンが各研究所の正常域の下限値より低いときには低いとの報告を、同様にして正常あるいは高いとの報告を受けた。同じ患者に由来する末梢顆粒球を先述のように精製し、各時間における血液サンプルを利用できるようにした。骨髄サンプルおよび血液サンプルをインフォームドコンセントを得た後に採取した。
【０１４５】
ＥＥＣの分析
Ｅｐｏに対する赤血球の応答特性のインビトロでの測定を、同一の研究所（Ｈｏｔｅｌ Ｄｉｅｕ、パリ）において、先述した凝固血漿培養法によって行った（Ｃａｓａｄｅｖａｌｌ Ｎ，Ｄｕｐｕｙ Ｅ，Ｍｏｌｈｏ−Ｓａｂａｔｉｅｒ Ｐ，Ｔｏｂｅｌｅｍ Ｇ，Ｖａｒｅｔ Ｂ，Ｍａｙｅｕｘ Ｐ．Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｉｎ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ｐｕｒｅ ｒｅｄ−ｃｅｌｌ ａｐｌａｓｉａ． Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９９６；３３４：６３０−６３３）。
【０１４６】
統計分析
マーカーの相関関係はスピアマンの順位相関係数（Ｒ）を用いて求めた。
【０１４７】
２．２ 結果
ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異を検出するためのＰＣＲに基づく遺伝子型決定法の実行可能性と感度
ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異を検出するためのシーケンシング、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）法およびＴａｑｍａｎ（登録商標）法の効率を評価するために、ＭＰＤの疑いのある患者に由来する１１９のサンプルにおいて、３つの方法を平行して利用して該変異の存在を調査した。ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異は１１９サンプル中８３サンプルで効果的に検出され、３５サンプルは３つの方法のいずれによっても変異を示さなかった。１サンプルのみにおいて、シーケンシングではＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）とＴａｑｍａｎ（登録商標）の二つの方法で明らかになった変異を検出できなかったことから、後者の方法がより感度が良いことが示唆される。
【０１４８】
方法の感度を評価するため、二つの異なった方法を用いた。つまり、変異のないＴＦ−１細胞系のＤＮＡにおける、ホモ接合性で変異したＨＥＬ細胞系のＤＮＡの連続希釈液を試験し、また、正常ＤＮＡにおける、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異についてホモ接合の患者に由来するゲノムＤＮＡの連続希釈液を試験した。シーケンシングでは、ＴＦ−１細胞系のＤＮＡで希釈した５％未満のＨＥＬ細胞系のＤＮＡ、正常ＤＮＡで希釈した１０％未満のホモ接合性の変異患者のＤＮＡでは、変異した対立遺伝子を検出できなかった。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）法およびＴａｑｍａｎ（登録商標）法の感度は同等で、シーケンシングをわずかに上回っており、ＴＦ−１細胞系のＤＮＡで希釈したＨＥＬ細胞系のＤＮＡでは０．５〜１％（図６）、正常ＤＮＡで希釈したホモ接合性の変異患者のＤＮＡでは２〜４％まで可能であった。
【０１４９】
診断時の赤血球増加症患者の特徴
診断時に５１％を超えるヘマトクリット値を有する８８人の患者の主要な特徴を表１にまとめた。
【０１５０】
【表１】
【０１５１】
５１％を超えるヘマトクリット値を有する８８人の患者をＰＶＳＧ基準とＷＨＯ基準にしたがって診断し、真性赤血球増加症（ＰＶ）、突発性赤血球増加症、二次性赤血球増加症、および測定した赤血球量の増加していないときの「絶対的赤血球増加症ではない」（ＡＥではない）という四つのグループに分けた。８人の患者は、いくつかの臨床データが入手不可能であったため、決定的な診断を得ることができなかった。Ｈｔ：ヘマトクリット、Ｈｂ：ヘモグロビン、ＷＢＣ：白血球、ＥＥＣ：内因性赤血球コロニー、Ｅｐｏ：エリスロポエチン、σ：標準偏差。患者は、ＷＨＯ基準（Ｐｉｅｒｒｅ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，ｅｄｉｔｅｕｒｓ．Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｕｒｓ；Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｕｍｏｕｒｓ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ａｎｄ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｌｙｏｎ：ＩＡＲＣ Ｐｒｅｓｓ；２００１：３２−３４）とＰＶＳＧ基準（Ｐｅａｒｓｏｎ ＴＣ，Ｍｅｓｓｉｎｅｚｙ Ｍ． Ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｏｆ ｐｏｌｙｃｙｔｈａｅｍｉａ ｒｕｂｒａ ｖｅｒａ．Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ １９９６：２２ Ｓｕｐｐｌ １：８７−９３）のそれぞれに応じて、ＰＶ診断を受けた６１〜４５人の患者、二次性赤血球増加症の５人、突発性赤血球増加症の１１〜２１人、そして絶対的赤血球増加症ではない３人（正常な赤血球量）の、４つの主要グループに分けることができた。臨床データは７人の患者について不完全であったが、それは、ＰＶの診断がＷＨＯ基準でもＰＶＳＧ基準でも確認できなかったということである。二つの分類におけるＡ１基準の間にある違いのために、赤血球量の測定を行っていない６人の患者はＷＨＯ分類に入れることはできるが、ＰＶＳＧ分類には入れることができない。一人の患者は低酸素血症とＥＥＣの形成を同時に示し、したがって診断が困難であった。細胞遺伝学的分析を３５人の患者で行い、３２人のＰＶ患者（ＷＨＯ基準による）のうち７人が細胞遺伝学的異常を有し、そのうち５人が９トリソミーを、１人が７ｑトリソミーを有しており、そして１人が１８番染色体に付加的な物質を有していた。
【０１５２】
ＰＶのＰＶＳＧ基準とＷＨＯ基準に対応するＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの存在
ＰＶＳＧ基準によりＰＶとして診断された４５人の患者のうち４３人（９６％）でＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆが存在し、ＷＨＯ基準で診断された６１人の患者のうち５７人（９３％）で存在した（表１）。しかし、ＰＶＳＧ分類にしたがってＰＶでないとして分類された２９人の患者のうち８人は変異を示したのに対し、ＷＨＯ分類にしたがってＰＶでないとされた患者１９人は変異を示さなかった。これら８人の患者はＰＶＳＧ基準によればＩＥであると考えられ、ＷＨＯ基準によればＰＶであると考えられる。ＳＥと診断された患者も正常な赤血球量を有する患者（「ＡＥではない」）も変異を有していなかった。したがって、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの有無は、ＷＨＯ基準を用いた場合には８０人中７６人の患者で（９５％、Ｒ＝０．８７９、ｐ＜０．０００１）、ＰＶＳＧ基準を用いた場合では７４人中６４人の患者で（８６．５％、Ｒ＝０．７１７、ｐ＜０．０００１）、ＰＶの陽性診断に対応する。さらに、ＷＨＯ基準でＰＶでないと診断された患者はいずれも変異を有していなかったため、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの検出は絶対的赤血球増加症においては１００％の予測値を有することになる。
【０１５３】
一部の著者（Ｍｏｓｓｕｚ Ｐ． ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｌｅｖｅｌ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｏｓｉｓ． Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ２００４；８９：１１９４−１１９８）は血清Ｅｐｏレベルの測定を、絶対的赤血球増加症の患者に対する一次診断試験と考えており、Ｅｐｏレベルが正常域の下限値の下にあれば、ＰＶの診断について９７％の特異度と９７．８％の予測値を有する。我々の研究において、ＥｐｏレベルとＷＨＯ基準およびＰＶＳＧ基準によるＰＶ診断との相関関係は、それぞれ６１人中５０人（８２％、Ｒ＝０．４８８、ｐ＝０．０００２）および５６人中３９人（７０％、Ｒ＝０．３５８、ｐ＝０．００６７）の患者で見られた。次に、我々はＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの存在下または不在下で血清Ｅｐｏレベルを比較し、６８人の患者のうち５２人（７６％、Ｒ＝０．４１６、ｐ＝０．０００４）が適切な相関関係を有することを見出した。
【０１５４】
ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異の存在はＥＥＣを形成する能力に対応する。
【０１５５】
異なる三つのチームにより、ＪＡＫ２ Ｖ６１７ＦをトランスフェクトしたＥｐｏに依存する細胞系が、増殖についてはＥｐｏに依存しておらずＥｐｏに対して過敏であり、ＰＶにおいて説明されている赤血球前駆細胞の非依存性および過敏性と似た振る舞いを見せることが示されている。したがって我々は、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを有する患者がＥＥＣの形成も示すという仮説を立てた。ＥＥＣの形成をまったく示さない２０人の赤血球増加症患者のうち、一人は変異を示し、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの検出に関する陽性の予測値に疑問が生じた。しかし、この患者がＥＥＣも全く示さなくとも、該患者は多くの陽性のＷＨＯ基準およびＰＶＳＧ基準を満たしており、該患者を両方の分類法においてＰＶとして分類することができる。したがって、この患者は「ＪＡＫ２について偽陽性」というよりも「ＥＥＣについて偽陰性」と捉えるべきである。ＥＥＣを有する６７人の患者のうち、６２人はＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを有しており、５人の患者は検出に感度のある方法を用いた際には変異していなかった。これら５人の患者のうち、５人中４人と５人中２人は、それぞれＷＨＯ基準とＰＶＳＧ基準にしたがってＰＶグループに分類することができた。全体では、分析した８７人の患者のうち、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異の有無が、８７人中８１人の患者（９３．１％、Ｒ＝０．８２４、ｐ＜０．０００１）においてＥＥＣを形成する能力の有無に対応していた。
【０１５６】
骨髄の単核細胞（ＢＭＭＣ）におけるＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異の存在は、末梢顆粒球における該変異の存在に対応している。
【０１５７】
診断時にＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異を検出するために末梢血顆粒球を用いることで骨髄細胞の分析の実施を避けられるかどうかを検討するために、我々は、骨髄サンプルと末梢血サンプルが診断時に両方利用可能な５０人の患者について（３５人のＰＶ患者、８人のＳＥ患者および８人のＭＰＤの疑いのある者を含む）、シーケンシング法、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）法およびＴａｑＭａｎ（登録商標）法のそれぞれで得られた結果を比較した。すべての場合（変異のある３４人、変異のない１６人）で、変異は同様に検出された。
【０１５８】
ＩＩＩ−結論
このように、我々は、明白な二次的赤血球増加症の場合を除き、顆粒球におけるＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを感度の良い方法で検出することが赤血球増加症の診断の最初のステップである（図７）、新規なＰＶ診断カードを提案する。このアプローチにはいくつかの利点があり、常に実行可能というわけではなく結果を検討しなくてはならないことのある、アイソトープを有する赤血球量の測定を避けることができる。また、骨髄の吸引や、時間がかかり標準化されていないＥＥＣ分析の実行を避けることもできる。これによりＰＶの陽性診断のコストが大きく低下するのだが、それは、５１％を超えるヘマトクリット値を有しＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆについて陰性の患者のみが、赤血球増加症を特徴づけるために実際に行う全ての調査を受けることになるからである。赤血球増加症におけるＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの検出だけでＰＶの診断が支持されても、骨髄の生検の実施は依然として有効であるが、それは、該生検を行うことで骨髄線維症の兆候または芽球細胞の存在を明らかにすることができ、それによりＰＶの白血病性形質転換が確認されるからである。しかし、骨髄の生検は、細胞遺伝学的分析とともに、随意的な研究として行われるべきものであると考えられる。
【０１５９】
また、３０％のＥＴ、５０％のＩＭＦ、そして特徴が明らかにされていない、稀ないくつかのＭＰＤにおいてもＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆが検出され、これにより、異なる臨床所見を伴うＭＰＤの新しいグループを決定した。これらの違いの理由はまだ分かっておらず、共通の生理病理学的原因と異なる表現型とによってこれらの病気を一つの骨髄増殖群にまとめるにはまだ早い。今後の詳しい臨床研究によって、より特定的に、ＰＶ、ＥＴ、ＩＭＦおよびＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを有するその他の稀なＭＰＤの間で共通する兆候が、特に絶対的赤血球増加症、Ｅｐｏレベル、骨髄線維症そして細胞遺伝学的異常の枠組みで、より的確に特徴づけられるであろう。したがって、慢性的白血球増加症、血小板増加症および赤血球増加症の診断における最初の手段としてＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの検出を用いることも考えられる。ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの存在はＭＰＤグループの新たな定義を可能とするだけではなく、確実に、特異的ターゲッティング療法の開発の基礎となるものでもある。
【０１６０】
実施例３：ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを阻害するがＷＴ ＪＡＫ２は阻害しない、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異に特異的なｓｉＲＮＡ。
【０１６１】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２５〜２７に対応するｓｉＲＮＡ １、３および４は、ＨＥＬ系で発現するＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異タンパク質を阻害するが、Ｋ５６２系で発現する野生型ＪＡＫ２タンパク質は阻害しない。結果は図８、図９および図１０に示している。
【０１６２】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】ＰＶにおけるＪＡＫ２の主要な役割を示した図。
【図２】エリスロポエチンの不在下で分化できるＰＶのＣＤ３４＋前駆細胞の培養モデルの設定を示した図。
【図３】ＪＡＫ−ＳＴＡＴ、Ｐｉ３−ＫおよびＳｒｃキナーゼ経路の阻害による赤血球の自然発生的な分化の抑制を示した図。
【図４】ＰＶ前駆細胞におけるＪＡＫ２の阻害の手順を示した図。
【図５】ＰＶ前駆細胞におけるＪＡＫ２の阻害の結果を示した図。
【図６Ａ】ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブを用いたＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）の融解曲線分析による変異の検出を示したグラフ。
【図６Ｂ】ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブを用いたＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）の融解曲線分析による変異の検出を示したグラフ。
【図６Ｃ】ＴａｑＭａｎ（登録商標）を用いた対立遺伝子に特異的な増幅による変異の検出を示したグラフ。
【図７】赤血球増加症（つまり５１％を超えるクリマトクリット値）を診断するために提案する診断シートを示した図。
【図８】ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆに特異的なｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ＃１、＃３および＃４）を示した図。
【図９】ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆに特異的なｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ＃１、＃３および＃４）による処理により減少した、ＨＥＬ細胞におけるＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの発現を示した図。
【図１０】ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆに特異的なｓｉＲＮＡによる処理によって変化しない、Ｋ５６２細胞におけるＷＴ ＪＡＫ２の発現レベルを示した図。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真性赤血球増加症の原因となっている、ＪＡＫ２チロシンキナーゼタンパク質のＶ６１７Ｆ変異体に関するものである。また、本発明は、赤血球増加症と血小板増加症を骨髄増殖症候群に関連付けることを可能にする、赤血球増加症および血小板増加症の一次診断方法、すなわち、赤血球増加症と血小板増加症を新たな疾病群に再分類することを可能にする、骨髄増殖症候群におけるＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体の検出にも関わるものであり、そして、特異的阻害剤とｓｉＲＮＡの識別にも関わるものである。
【背景技術】
【０００２】
真性赤血球増加症（Ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａ ＶｅｒａすなわちＰＶ）は、慢性骨髄増殖症候群のひとつであり、該慢性骨髄増殖症候群は、真性赤血球増加症を、またしばしば血小板増加症および白血球増加症を伴う。それは、造血幹細胞のクローン性の後天性疾患である。ＰＶの造血前駆細胞はエリスロポエチン（Ｅｐｏ）の不在下で、「自然発生コロニー」と呼ばれる赤芽球コロニーを形成する能力がある。インターロイキン３（ＩＬ−３）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）およびインスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）など、その他のいくつかの成長因子に対する、ＰＶの造血前駆細胞の過敏性も証明されている。いくつかのチームがＰＶの生理病理学に関心を寄せているが、疾患の原因である分子異常は今日でも未知のままである（Ｈ．Ｐａｈｌ，２０００）。
【０００３】
いくつかのサイトカインに対するＰＶの前駆細胞の過敏性により、サイトカイン受容体に共通のシグナル伝達経路における異常を検査することができる。ＰＶにおいては分子マーカーの存在はかつて証明されたことがないが、ＰＶとその他の骨髄増殖症候群との間にある類似性、特にＬＭＣとの間にある類似性を考慮すると、Ｂｃｒ−Ａｂｌによって誘発されるものに近い分子メカニズムが、とりわけ悪性クローンの増殖とその最終分化の原因になっていると考えられる。この仮説は近年、二つの珍しい骨髄増殖症候群において確証が得られており、その一つは、ＦＧＦ受容体の構成的活性化を誘発する８ｐ１１染色体領域における転座に関連する骨髄増殖症候群であり、もう一つは、潜在性の染色体の欠失によりキメラ遺伝子ＰＤＧＦＲα−ＦＩＰ１Ｌ１が生じる好酸球増加症候群である。両方の場合において、分子異常により、構成的なチロシンキナーゼ活性を有する融合タンパク質が生じる。
【０００４】
患者の１０％〜１５％で２０ｑの欠失が検出され、約３０％のケースで９ｐのヘテロ接合性の消失が検出されても、ＰＶにおいて再発性の細胞遺伝学的異常が見られたことはない（Ｋｒａｌｏｖｉｃｓ，２００２）。しかし、これらの異常は当該疾患に特異的なものではない。
【０００５】
ＰＶ細胞がＥｐｏに依存していないため、Ｅｐｏ受容体（Ｅｐｏ−Ｒ）経路に対する研究が行われてきた。まず、受容体は構造レベルでも機能レベルでも正常である（Ｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４、Ｌｅ Ｃｏｕｅｄｉｃ ｅｔ ａｌ．，１９９６、Ｍｅａｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。Ｅｐｏによる刺激が止まるとＥｐｏ−ＲとＪＡＫ２を脱リン酸化するフォスファターゼＳＨＰ−１は、通常、ＲＮＡとタンパク質のレベルで発現する（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７、Ａｓｉｍａｋｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。Ｅｐｏ−Ｒのシグナル伝達のさらに下流では、ＰＶを示す患者の多核球（ＰＮＮ）においてＳＴＡＴ５の異常な活性化が研究されたが、異常は発見できていない。逆に、ＳＴＡＴ３の構成的リン酸化が、研究された１４例中４例のＰＶのＰＮＮで明らかにされた（Ｒｏｄｅｒ，２００１）。最後に、ＳＴＡＴ５の転写標的である、抗アポトーシスタンパク質ｂｃｌ−ｘｌの発現が、免疫組織化学およびフローサイトメトリーで研究されている（Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。そして、ｂｃｌ−ｘｌがＰＶの赤芽球で高発現すること、とりわけ、通常このタンパク質が発現しなくなる、より成熟した段階で高発現することが示された。
【０００６】
真性赤血球増加症において、主要な診断基準は現在、臨床的なものである（ＰＶＳＧ基準、Ｐｅａｒｓｏｎ，２００１）。生物学的診断は、主としてＥｐｏの不在下での、赤血球前駆細胞の培養の実施に基づいている（内因性コロニーの検出）。その良好な実施に専門技術が必要であることと、多くの「技術者の時間」が費やされることから、この試験はすべてのセンターで可能なわけではなく、経験を積んだ研究所によって実施されるときにだけ信頼できるものである。さらに、良好な感度を得るために、この試験は患者から採取した骨髄細胞に対して行う必要があり、これは患者にとって無害とは言えない。
【０００７】
サブトラクティブハイブリダイゼーション法により、ドイツの研究グループが、ＰＲＶ１（Ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａ Ｒｕｂｒａ Ｖｅｒａ １）と呼ばれる、ＰＶのＰＮＮで高発現した遺伝子をクローニングしている（Ｔｅｍｅｒｉｎａｃ ｅｔ ａｌ．，２０００）。ＰＲＶ−１タンパク質は表面受容体ｕＰＡＲのスーパーファミリーに属している。ＰＶの多核球においてＰＲＶ−１をコードしているｍＲＮＡの高発現はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって容易に検出可能であり、近年発見された疾患の、生理病理学的役割のないマーカーを構成する。しかし、最近公刊された研究では、それは特に感度が良いわけでも特異的でもないことが示されている。
【０００８】
Ｓｐｉｖａｋ ＪＬ ｅｔ ａｌ．，２００３（「Ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」；Ｈｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ；２００３；２００ ２４．）では、いくつかのＰＶマーカーが記載されている。好中球抗原ＮＢＩ／ＣＤ１７７のｍＲＮＡはＰＶ患者の顆粒球において過剰発現する。しかし、患者の中にはこの過剰発現を示さないものもおり、また、この過剰発現が真性赤血球増加症以外の骨髄増殖症候群の患者でも観察されうるため、このマーカーはＰＶを検出するための信頼できる手段とは考えられない。血小板上のトロンボポエチン受容体Ｍｐｌの発現が少ないこともＰＶでは認められている。この異常はＰＶで支配的だが、その他の骨髄増殖症候群でも見られる。ほかにも、専門の研究所でしか実施できない、実現が難しい試験もある。
【０００９】
このように、従来技術では、信頼できるＰＶ診断を可能にする方法はない。また、利用可能な治療も特異的なものではない。正常範囲内にヘマトクリット値を維持するための瀉血、細胞毒性薬の使用あるいはＩＦＮの使用が問題となる。
【特許文献１】国際公開第０２／４４３２１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第００／４４８９５号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の枠組みにおいて、我々は試験した患者の約９０％においてＪＡＫ２遺伝子に変異を発見しただけではなく、この変異が、このチロシンキナーゼの構成的活性の原因であることも明らかにし、そして、該変異を阻害することによって、ＰＶ赤芽球の自然発生的な増殖と分化を妨げることが可能になることを証明した。
【００１１】
ＪＡＫ２はＪａｎｕｓキナーゼファミリー（ＪＡＫ）に属し、該ファミリーは、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３およびＴＹＫ２という複数の細胞質内チロシンキナーゼからなる。ＪＡＫタンパク質は多くの膜受容体の細胞内シグナル伝達に関与するものであり、該膜受容体は、サイトカイン受容体スーパーファミリーのいくつかのメンバー、特にＥｐｏ受容体（Ｅｐｏ−Ｒ）のように、内在的なチロシンキナーゼ活性を有していない。ＪＡＫ２タンパク質は２３個のエクソンを含んだ遺伝子によってコードされている。相補的ＤＮＡは３５００塩基対のサイズを有し、１１３２個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする（１３０ｋＤ）（図１）。我々はＰＣＲとシーケンシングによって、ＰＶ患者の９０％近くにおいてＪＡＫ２のエクソン１２でクローン性の後天的な点変異を識別した。通常バリン（Ｖ）をコードしているコドン６１７「ＧＴＣ」が、フェニルアラニン（Ｆ）をコードする「ＴＴＣ」に変異している。この変異Ｖ６１７Ｆは、２５人の対照または試験した二次性赤血球増加症患者では見られなかった。逆に、本態性血小板増加症の４０％と骨髄線維症の５０％では観察され、したがって、この変異は、Ｂｃｒ−Ａｂｌが慢性骨髄性白血病を定義したように、骨髄増殖症候群の新たな枠を定義するものである。
【００１２】
本発明によるＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体を、血液学における診断研究所で従来的に用いられている広く普及した手段で効果的に検出することができるかどうか調べるために、我々は骨髄増殖症の疑いのある患者に由来する１１９のサンプルを分析した。ＪＡＫ２ Ｖ６１７ＦがＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）法とＴａｑＭａｎ（登録商標）法によって効果的に検出されることが示されたが、これらの技術はシーケンシングよりわずかに感度が良いものである。次に我々は、５１％を超えるヘマクリット値を有する８８人の患者において一次診断試験としてＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの検出値を算定し、変異が、赤血球増加症において１００％の陽性的中率で、ＷＨＯ基準（Ｒ＝０．８７９）とＰＶＳＧ基準（Ｒ＝０．７１７）にしたがったＰＶ診断に対応することを示した。これらのデータに基づいて我々は、赤血球量の測定、骨髄の吸引および内因性赤血球コロニーの形成のインビトロでの分析の実施を避けるべく、顆粒球におけるＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの検出を赤血球増加症患者の一次診断試験としてみなすべきであることを提案する。また、この検出は骨髄増殖症候群の全体あるいはそれらの疑いに対する一次診断にまで広げることができるものである。この検出は、骨髄増殖症候群を確認するための確実な生物学的試験が存在しない慢性血小板増加症においても特に重要となるものである。また、この検出は骨髄線維症の診断において重要な検査となるものであり、不確定な病因による血栓症に関連する臨床所見に適用することができるものである。
【００１３】
このように、本発明は第一に診断手段をもたらし、ＰＶとこの変異に関連する骨髄増殖症候群を対象とする治療に至る道筋を開くものである。より特定的には、我々はＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異の検出を赤血球増加症の枠組みにおける一次診断試験として提案し、このことによって、大半の患者および慢性血小板増加症における、骨髄の吸引ならびに赤血球と内因性赤血球細胞（ＥＥＣ）の量の測定を避けることが可能になり、このことによって長期の病因調査を避けることが可能となる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
このように、第一の特徴として、本発明は単離したＪＡＫ２（Ｊａｎｕｓキナーゼ２）タンパク質、特にヒトＪａｎｕｓキナーゼ２タンパク質（ＮＣＢＩ寄託番号ＮＭ＿００４９７２、ＧＩ：１３３２５０６２）に関するものであり、該タンパク質は、６１７番アミノ酸（ｃＤＮＡの、ＡＴＧから数えて６１７番目のコドン）における変異、より特徴的にはＶ６１７Ｆ変異を含んでおり、以下ではＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体と称し、以下のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１で示される。
【００１５】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１（Ｖ６１７ＦヒトＪａｎｕｓキナーゼ２すなわちＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ）
【００１６】
また、本発明は他の哺乳動物の６１７位が変異したこのタンパク質の等価物、たとえば、ラット（ＮＭ＿０３１５１４）、ブタ、マウス（ＮＭ＿００８４１３）などの他の哺乳動物のＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆも目的とし、また、変異体の活性および３Ｄ構造に影響を与えない一つまたは複数の修飾をさらに含んだ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１の変異体も目的としている。
【００１７】
また、本発明はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１をコードするヌクレオチド配列、好ましくはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２（コドン６１７においてＧＴＣの代わりにコドンＴＴＣを有する（以下Ｇ１８４９Ｔと称する、翻訳開始を示すＡＴＧから数えて１８４９位におけるｇ／ｔ変異）ヒトＪＡＫ２遺伝子配列）も対象としている。
【００１８】
この配列は、ウイルスベクターまたはプラスミドベクター、あるいは哺乳動物の細胞で有効なプロモーターの制御下にある裸ＤＮＡに存在しうるものである。したがって、本発明はＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆタンパク質を発現するベクターにも及ぶものである。本発明のベクターはクローニングベクターおよび／または発現ベクターとすることができ、また、宿主細胞、とりわけ哺乳動物の細胞、好ましくはヒトＣＤ３４+前駆細胞をトランスフェクトするために用いることができる。
【００１９】
ＰＶおよびその他の骨髄増殖症候群のトランスジェニック動物モデル
【００２０】
本発明はまた、組換えＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを発現する、ヒトではないトランスジェニック動物も対象とする。この動物は、好ましくはマウスまたはラットとすることができる。モデルとして用いられるトランスジェニックのラットまたはマウスは、当業者によって一般的に用いられているあらゆる方法、とりわけ、相同組換えまたはＣｒｅ−ＬｏｘＰもしくはＦＬＰ−ＦＲＴシステムでの部位特異的組換えによってＥＳ細胞にノックイン（標的位置への配列の挿入）することで得ることができる。本発明の好ましい実施態様によると、本発明によるトランスジェニック細胞は、宿主細胞のゲノムの一つまたは複数の配列でのＪＡＫ２ Ｇ１８４９Ｔ変異体の遺伝子ターゲッティングによって得られる。より詳細には、導入遺伝子は、宿主細胞のゲノムの相同配列の相同組換えにより安定した方法で挿入される。トランスジェニック動物を産生するためのトランスジェニック細胞を得ようとする場合、宿主細胞は好ましくは胚性幹細胞（ＥＳ細胞）である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。遺伝子ターゲッティングは、標的とする内因性配列と配列の相同性を有している外来ＤＮＡ配列での相同組換えによる、染色体座の部位特異的な修飾である。さまざまなタイプの遺伝子ターゲッティングがある。ここでは、遺伝子ターゲッティングは特に、野生型ＪＡＫ２遺伝子をＪＡＫ２ Ｇ１８４９Ｔ変異体の遺伝子または遺伝的に類似した他のあらゆる変異体で置換するために用いることができる。この場合、遺伝子ターゲッティングは「ノックイン」（Ｋ−ｉｎ）と呼ばれる。あるいは、遺伝子ターゲッティングは、野生型ＪＡＫ２の発現を減らすかまたは消失させてＪＡＫ２変異体の遺伝子を導入するために用いることができる。このとき遺伝子ターゲッティングは「ノックアウト」（ＫＯ）と呼ばれる（Ｂｏｌｋｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８９参照）。本発明による細胞は、導入遺伝子が安定してその細胞のゲノムに組み込まれることと、その発現が内因性遺伝子の調節エレメントによって制御されることを特徴としている。安定した組み込みとは、導入遺伝子を本発明による細胞のゲノムＤＮＡに挿入することを意味する。このように挿入された導入遺伝子は、次に細胞の子孫に伝わる。導入遺伝子の組み込みは、標的である内因性ＪＡＫ２遺伝子の上流、下流、または中心で行う。任意で、一つまたは複数の正の選択または負の選択の遺伝子を用いることができる。また、レポーター遺伝子部分の両側または挿入すべき完全配列の両側に位置している好ましくは二つの標的遺伝子座と相同的なＤＮＡ領域を用いることができる。「相同的なＤＮＡ領域」とは、最適なアラインメントの後および比較の後に、通常少なくともおよそ９０％〜９５％のヌクレオチドが同一であり、好ましくは、少なくともおよそ９８％〜９９．５％のヌクレオチドが同一である二つのＤＮＡ配列を意味する。比較のための配列の最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）による局所的相同性アルゴリズム、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）による局所的相同性アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）による類似性検索法、これらのアルゴリズムを用いるソフトウェア（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅの中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ Ｎ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて行うことができる。細菌および哺乳動物の細胞における相同組換えを行うためには１４ｂｐが１００％相同であれば十分であるが、より長い相同配列の部分が好ましい（一般的にはこれらの部分は相同配列の各部分について少なくとも２０００ｂｐであり、好ましくは少なくとも５０００ｂｐである）。好適には、ＪＡＫ変異体の配列は内因性型の調節を確実にするエレメントの一群、すなわち、少なくとも内因性ＪＡＫ遺伝子のプロモーター、調節配列（エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター）、終結シグナルを含んだ一群に挿入される。
【００２１】
特徴的な実施態様によると、ＪＡＫ Ｇ１８４９Ｔ導入遺伝子は、少なくともコード配列と、レコンビナーゼの作用に対して特異的な部位に挟まれた、または挟まれていない正の選択のカセット、たとえば、前記配列の５’位に存在することができるＬｏｘ／Ｎｅｏ−ＴＫ／Ｌｏｘまたはｌｏｘ／Ｎｅｏ／ｌｏｘまたはＦＲＴ／Ｎｅｏ−ＴＫ／ＦＲＴまたはＦＲＴ／Ｎｅｏ／ＦＲＴカセットを有しており、たとえば一つまたは複数のＤＴＡ遺伝子および／またはＴＫ遺伝子を含む負の選択のカセットが導入遺伝子の末端の少なくとも一方に存在していることを特徴としている。本発明の導入遺伝子は、好ましくは動物細胞に天然に存在している外来のＤＮＡ配列に直接由来する。この天然の形態のＤＮＡ配列は、たとえばクローニングに必要な制限酵素認識部位を挿入すること、および／または、部位特異的組換えの部位（ｌｏｘ配列およびｆｌｐ配列）を挿入することで修飾することができる。
【００２２】
このために、ＪＡＫ２ Ｇ１８４９Ｔ変異体は、宿主細胞内でのその増殖を確実にすることができるクローニングベクターに、および／または任意には、導入遺伝子の発現を確実にすることができる発現ベクターにクローニングすることができる。本発明によるクローニングベクターおよび／または発現ベクターを構築するために用いられるＤＮＡ組換え技術は当業者に知られているものである。標準的な技術がクローニング、ＤＮＡの単離、増幅、および精製に用いられ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼに関わる酵素反応は製造者の推薦にしたがって実施される。これらの技術およびその他の技術はほとんどの場合Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）にしたがって行われる。ベクターは、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、レトロウイルスおよびその他の動物ウイルス、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＨＡＣのような人工染色体、ならびにその他の類似のベクターを含んでいる。
【００２３】
本発明によるトランスジェニック細胞を生成するための方法はＧｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９に記載されている。哺乳動物の細胞をトランスフェクトするためのさまざまな技術がＫｅｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０によって概説されている。線状化されたもしくはされていないベクター、またはベクター断片の形状のものに任意で含まれる、本発明による導入遺伝子は、たとえば核へのマイクロインジェクション（米国特許第４８７３１９１号明細書）、リン酸カルシウム沈殿によるトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション（Ｌｏ，１９８３）、熱ショック、陽イオンポリマー（ＰＥＧ、ポリブレン、ＤＥＡＥ−デキストランなど）による形質転換あるいはウイルス感染（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５）といった標準的な方法によって宿主細胞に導入することができる。
【００２４】
細胞が導入遺伝子によって形質転換されると、細胞はインビトロで培養することができ、あるいは、ヒトではないトランスジェニック動物を産生するために用いることができる。形質転換後、細胞を培養層および／または適切な培地に播種する。構築物を含んだ細胞は選択培地を用いて検出することができる。コロニーが生じるのに十分な時間の後、コロニーを回収し、相同組換えおよび／または当該構築物の組み込みが生じているかどうか判定するために分析する。相同組換えをしていると考えられるクローンのスクリーニングを行うために、選択遺伝子と呼ばれる陽性および陰性のマーカーを相同組換えベクターに挿入することができる。相同組換えが生じた細胞を選択するさまざまなシステムが説明されている（米国特許第５６２７０５９号明細書参照）。本発明による前記陽性選択遺伝子は、好ましくは抗生物質耐性遺伝子から選択される。抗生物質としては、網羅的ではないが、ネオマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、フレオマイシン、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、クロラムフェニコール、カルベニシリン、ジェネティシン、ピューロマイシンを挙げることができる。これらの抗生物質に対応する耐性遺伝子は当業者には知られており、たとえばネオマイシン耐性遺伝子は、培養培地における抗生物質Ｇ４１８の存在に対する耐性を細胞に付与する。また、陽性の選択遺伝子はＨｉｓＤ遺伝子から選択することができ、対応する選択剤はヒスチジノールである。また、陽性の選択遺伝子はグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧｐＴ）遺伝子から選択することができ、対応する選択剤はキサンチンである。また、陽性の選択遺伝子はヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子から選択することができ、対応する選択剤はヒポキサンチンである。相同組換えを同定することを可能にするために用いられる一つまたは複数の選択マーカーは、後に遺伝子発現に影響を与えることがあり、必要であれば、Ｌｏｘ部位に特異的なＣｒｅリコンビナーゼ（Ｓａｕｅｒ，１９９４、Ｒａｊｅｗｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９９６、Ｓａｕｅｒ，１９９８）またはＦＲＴ部位に特異的なＦＬＰリコンビナーゼ（Ｋｉｌｂｙ ｅｔ ａｌ．，１９９３）といった部位に特異的なリコンビナーゼを利用することで除去することができる。
【００２５】
陽性のコロニー、すなわち少なくとも一つの相同組換えが生じている細胞を含んだコロニーは、サザンブロット法および／またはＰＣＲ法による分析で識別する。単離細胞または本発明によるトランスジェニック動物の細胞における、導入遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルは、ノーザンブロット法による分析、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法による分析、ＲＴ−ＰＣＲ法による分析を含む技術によって判定することもできる。同様に、導入遺伝子を発現している動物細胞または動物組織は、レポータータンパク質に対する抗体を用いて識別することができる。次に、陽性細胞は、胚の操作、とりわけ修飾された細胞を相同組換えによって胚盤胞内へ注入するために用いることができる。
【００２６】
マウスでは、胚盤胞は４〜６週齢の過剰排卵した雌から得る。細胞をトリプシン処理し、修飾された細胞を胚盤胞の胞胚腔に注入する。注入後、胚盤胞を偽妊娠した雌の子宮角に導入する。次に、雌が満期に達するまで待ち、構築物を有する変異細胞の存在を判定するために、得られた子を分析する。産まれた胎児の細胞と胚盤胞細胞あるいはＥＳ細胞との間での異なる表現型を分析することで、キメラの新生児を検出することが可能となる。そして、キメラの胎児を成体まで育てる。キメラまたはキメラ動物は、細胞の一つの亜集団のみに改変したゲノムが存在する動物である。一つまたは複数の修飾された遺伝子を有するキメラ動物は、一般的にはそれらの間でまたは野生型の動物と交配させることで、ヘテロ接合またはホモ接合の子を得ることができる。次に、ヘテロ接合の雄と雌を交配することで、ホモ接合動物を作成する。指示しない限り、本発明によるヒトではないトランスジェニック動物は生殖系列細胞のヌクレオチド配列の安定した変化を含んでいる。
【００２７】
本発明のもう一つの実施態様によると、本発明によるヒトではないトランスジェニック細胞は核の移動すなわち核移植の枠組みにおける核のドナー細胞として利用することができる。核移植とは、脊椎動物の成体個体または胎児段階の個体の生きたドナー細胞の核を、同種または異種の除核したレシピエント細胞の細胞質に移すことを意味する。移植された核はクローン胚の成長を導くように再プログラムされ、続いて該クローン胚は胎児および新生児を産生するために受胚雌に移植することができ、あるいは、培養で内細胞塊の細胞を産生するために用いることができる。核クローニング用のさまざまな技術を用いることができ、該技術の中では、網羅的ではないが、特許出願の対象となっている国際公開第９５／１７５００号パンフレット、国際公開第９７／０７６６８号パンフレット、国際公開第９７／０７６６９号パンフレット、国際公開第９８／３０６８３号パンフレット、国際公開第９９／０１１６３号パンフレットおよび国際公開第９９／３７１４３号パンフレットを挙げることができる。
【００２８】
このように、本発明はＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆをコードする組換え配列を含んだ、ヒトではないトランスジェニック動物にまで及ぶものである。これらの動物はホモ接合体あるいはヘテロ接合体（ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ／ＪＡＫ２ Ｖ６１７ＦあるいはＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ／ＪＡＫ２）でありうる。これらの動物は、とりわけ真性赤血球増加症を再現するが、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆによって誘発されるあらゆる骨髄増殖症候群も再現する。したがって、該動物によってチロシンキナーゼ阻害剤を機能的にスクリーニングすること、とりわけＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆに特異的な阻害剤のスクリーニングを行うことが可能になる。
【００２９】
もう一つの変形例は、真性赤血球増加症またはその他の骨髄増殖症候群のモデルを実現させるために、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体を発現する能力を有するウイルスベクター（レトロウイルスまたはレンチウイルスまたはその他）を造血細胞株、前駆細胞またはＥＳ細胞に注入することで構成することができる。
【００３０】
診断手段
第三の特徴として、本発明は、骨髄増殖症候群に冒された、あるいは骨髄増殖症候群を示す可能性のある哺乳動物において、とりわけ赤血球増加症を示す患者または真性赤血球増加症、血小板増加症および／もしくは骨髄線維症の兆候を示している疑いのある患者において、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異の有無を検出することを可能にする診断手段を目的としている。
【００３１】
そのため、本発明は、以下に記載した配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２における変異の有無の検出を可能にするプライマーおよびプローブに関わるものである。より特徴的には、本発明は、エクソン１２または以下の配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ３または４の連続した少なくとも１０個、１２個、１５個、２０個、３０個、４０個または５０個のヌクレオチドの配列（たとえば１０〜３０個のヌクレオチドまたは１０〜２５個のヌクレオチド）を有し、また変異ヌクレオチドｔ1849を含む、たとえば１０〜３０個のヌクレオチドの単離された核酸にも関するものである。
【００３２】
【００３３】
下線を引いた配列は、１８４９位における変異に特異的なプローブまたはプライマーの設計を可能にする上流または下流の領域の一例を示している（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ４）。
【００３４】
本発明のさまざまな好ましいプライマーおよびプローブの例
【００３５】
ＤＮＡ、ＰＣＲプライマー：
ＪＡＫ２エクソン１２−ＰＣＲＦ センス ５’−ＧＧＧＴＴＴＣＣＴＣＡＧＡＡＣＧＴＴＧＡ−３’（５４８０４−５４８２３）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ５）
ＪＡＫ２エクソン１２−ＰＣＲＲ アンチセンス ５’−ＴＴＧＣＴＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＣＡＡＧＡ−３’（５５２４０−５５２６０）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ６）
【００３６】
ＤＮＡ、シーケンシングプライマー：
ＪＡＫ２エクソン１２ＳＥＱＦ センス ５’ＣＡＧＡＡＣＧＴＴＧＡＴＧＧＣＡＧＴＴＧ−３’（５４８１３−５４８３２）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ７）
ＪＡＫ２エクソン１２ＳＥＱＲ アンチセンス ５’ＴＧＡＡＴＡＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＧＴＴＴＴＣＡＧＴＴＴ−３’（５５２０７−５５２３３）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ８）
【００３７】
ｃＤＮＡ、ＰＣＲプライマーおよびシーケンシングプライマー：
センス ５’−ＣＡＡＣＣＴＣＡＧＴＧＧＧＡＣＡＡＡＧＡＡ−３’（１３８６−１４０７）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ９）
アンチセンス ５’−ＧＣＡＧＡＡＴＡＴＴＴＴＴＧＧＣＡＣＡＴＡＣＡ−３’（２０１９−２０４１）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１０）
【００３８】
ＳＮＰＳプローブ、変異検出プローブおよびｓｉＲＮＡプローブ（１８２９−１８７０）：
ＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＴＧＧＡＧＴＡＴＧＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡＧＡＣＧＡＧＡＡＴＡＴＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１１）
【００３９】
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒでの遺伝子型決定（ＰＮＮまたは骨髄のＤＮＡ）
オリゴ「Ｓ」（センス） ＧＧＣＡＧＡＧＡＧＡＡＴＴＴＴＣＴＧＡＡＣ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１５）
オリゴ「Ｒ」（アンチセンス） ＧＣＴＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＣＡＡＧＡＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１６）
センサーｗｔ ＧＴＣＴＣＣＡＣＡＧＡＣＡＣＡＴＡＣＴＣＣＡＴＡＡ３’−ＦＬ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１７）
アンカーＪＡＫ２ ５’−ＬＣ Ｒｅｄ６４０ＡＡＡＡＣＣＡＡＡＴＧＣＴＴＧＴＧＡＧＡＡＡＧＣＴ３’−ＰＨ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１８）
【００４０】
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒでの遺伝子型決定（たとえば血小板のｃＤＮＡ）
ｃＪＡＫ２Ｆ ＧＣＡＣＡＣＡＧＡＡＡＣＴＡＴＴＣＡＧＡＧＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１９）
ｃＪＡＫ２Ｓ ＡＧＣＡＧＣＡＡＧＴＡＴＧＡＴＧＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２０）
ｃＪＡＫ２Ａ ＣＴＡＧＴＧＡＴＣＣＡＡＡＴＴＴＴＡＣＡＡＡＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２１）
ｃＪＡＫ２Ｒ ＧＴＴＴＡＧＣＡＡＣＴＴＣＡＡＧＴＴＴＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２２）
センサーｗｔ ＧＴＣＴＣＣＡＣＡＧＡＣＡＣＡＴＡＣＴＣＣＡＴＡＡ３’−ＦＬ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２３）
アンカーＪＡＫ２ ５’−ＬＣ Ｒｅｄ６４０ＡＡＡＡＣＣＡＡＡＴＧＣＴＴＧＴＧＡＧＡＡＡＧＣＴ３’−ＰＨ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２４）
【００４１】
Ｔａｑｍａｎ法による遺伝子型決定（たとえば骨髄の単核細胞のＤＮＡにおいて）
対立遺伝子に特異的な蛍光プローブおよび一本鎖ＤＮＡによる認識
ＰＣＲ反応
センスプライマー配列：ＡＡＧＣＴＴＴＣＴＣＡＣＡＡＧＣＡＴＴＴＧＧＴＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２５）
アンチセンスプライマー配列：ＡＧＡＡＡＧＧＣＡＴＴＡＧＡＡＡＧＣＣＴＧＴＡＧＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２６）
リポーター１配列（ＶＩＣ）：ＴＣＴＣＣＡＣＡＧＡＣＡＣＡＴＡＣ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２７）
リポーター２配列（ＦＡＭ）：ＴＣＣＡＣＡＧＡＡＡＣＡＴＡＣ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２８）
【００４２】
その他の特徴として、本発明は、サンプルにおけるＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異の有無を検出することを可能にするインビトロまたはエクスビボでの診断方法にも関するものである。
【００４３】
本発明の核酸を用いた試験
【００４４】
第一の実施態様において、Ｇ１８４９Ｔ変異体（ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異に対応する）はＪＡＫ２遺伝子の核酸分子の分析によって検出することができる。本発明の範囲において、「核酸」とはｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡあるいはｍＲＮＡから派生したｃＤＮＡを意味する。
【００４５】
Ｇ１８４９Ｔ変異体の核酸の有無は、シーケンシング、増幅ならびに／または、上述した特異的プローブおよび特異的プライマー、つまりＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ３または４、およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ５〜１１、あるいはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１５〜２４に由来する配列とのハイブリダイゼーションによって、検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
したがって、本発明は、ＰＶ患者またはＰＶもしくは他のあらゆる骨髄増殖症候群、とりわけ赤血球増加症、血小板増加症および骨髄線維症を発症する可能性のある患者のサンプルにおいて、ＪＡＫ２遺伝子のＧ１８４９Ｔ変異体の有無を判定するためのエクスビボまたはインビトロでの方法を提案するものであり、該方法は、
ａ）患者の核酸のサンプルを得ること、
ｂ）前記核酸のサンプルにおけるＪＡＫ２遺伝子のＧ１８４９Ｔ変異体の有無を検出すること
を含んでおり、
Ｇ１８４９Ｔ変異体の存在がＰＶまたは他のあらゆる骨髄増殖症候群の指標となることを特徴としている。
【００４７】
核酸のサンプルはどのような細胞源または組織生検からも得ることができる。これらの細胞は造血性のものに由来する必要があり、循環血液、造血組織または血液細胞が入ったあらゆる液体から得ることができる。ＤＮＡは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）に記載されている方法のような、従来技術で知られているあらゆる方法を用いて抽出することができる。またＲＮＡも、たとえば生検時に得られる組織などから、グアニジウムチオフェネート−フェノール−クロロホルムによる抽出のような、当業者によく知られている標準的な方法を用いて単離することができる。
【００４８】
ＪＡＫ２遺伝子のＧ１８４９Ｔ変異体は、ＲＮＡまたはＤＮＡのサンプルにおいて、好ましくは増幅後に検出可能である。たとえば、変異部位に特異的なオリゴヌクレオチド、あるいは、たとえばエクソン１２またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ３もしくは４のような変異を含む領域を増幅することを可能にするオリゴヌクレオチドを用いるＲＴ−ＰＣＲ反応のように、単離されたＲＮＡを逆転写にかけ、次に増幅することができる。「オリゴヌクレオチド」という表現は、ここでは少なくとも１０個、好ましくは１５〜２５個のヌクレオチド、好ましくは１００個未満のヌクレオチドからなる核酸を指すために用い、ＪＡＫ２のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡとハイブリダイズする能力がある。
【００４９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、放射性標識、蛍光標識または酵素標識などの当業者に知られたあらゆる技術によって標識することができる。標識されたオリゴヌクレオチドはＪＡＫ２遺伝子のＶ６１７Ｆ変異体の有無を検出するためのプローブとして用いることができる。
【００５０】
このように、本発明で有効なプローブおよびプライマーは１８４９位（転写開始を示すＡＴＧからのナンバリング）のヌクレオチドの近くでＪＡＫ２遺伝子の領域と特異的にハイブリダイズするものである。
【００５１】
上述した方法において、核酸は対立遺伝子の変異の検出前にＰＣＲで増幅することができる。対立遺伝子の変異の検出方法は、たとえば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」第二版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）、およびＵ．Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ編、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６、およびＮｅｗｔｏｎ ＆ ＧｒａｈａｍによるＰＣＲ第２版、ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９７で説明されている。
【００５２】
したがって、増幅過程の後に、目的の変異体の有無に応じてサンプルを選別することを可能にする検出過程を組み合わせることが可能である。
【００５３】
このために採用されるさまざまな技術は欧州特許第１１８６６７２号明細書に示されており、該技術とはたとえば、ＤＮＡシーケンシング、ＳＳＣＰ、ＤＧＧＥ、ＴＧＧＥのハイブリダイゼーションによるシーケンシング、ヘテロ二本鎖分析、ＣＭＣ、酵素によるミスマッチの切断、「ハイブリダイゼーションベースの固相ハイブリダイゼーション」、ＤＮＡチップ、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）液相ハイブリダイゼーション（米国特許第５２１００１５号明細書および米国特許第５４８７９７２号明細書）、ならびにＲＦＬＰ法などである。
【００５４】
検出は、ＦＲＥＴ、蛍光消光、偏光蛍光、化学発光、電気化学発光、放射能および比色分析法といったその他のさまざまな方法を用いて行うことができる。
【００５５】
本発明による方法は、サンプルを得ることおよびそのサンプルの核酸を抽出することからなる過程を含んでいてもいなくてもよい。
【００５６】
上述したように、用いるサンプルは個体から得られた血液もしくは他のあらゆる体液または組織とすることができる。核酸の抽出過程および精製過程の後、上述したプライマーを用いたＰＣＲ増幅をシグナルの検出を向上させるために用いることができる。
【００５７】
このように、本発明による方法は前記プライマーを用いた増幅過程と、その後に続く、ハイストリンジェンシーの条件の下で上述したＧ１８４９Ｔ変異領域に対応する配列とハイブリダイズする少なくとも一つのプローブ、好ましくは二つのプローブとのハイブリダイゼーション過程、そして前記プローブの標識によって生成したシグナルの検出を含むことができる。
【００５８】
たとえば、本発明はより特徴的には、ＰＶ患者、またはＰＶもしくは他のあらゆる骨髄増殖症候群を発症する可能性のある患者のサンプルにおいて、ＪＡＫ２遺伝子のＧ１８４９Ｔ変異体の有無を判定するためのインビトロでの方法を目的とし、該方法は、ＪＡＫ２遺伝子のＧ１８４９Ｔ変異に特異的な一つまたは複数のＳＮＰ（一塩基変異多型）、とりわけＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１７と１８、あるいは、２３と２４を用いて、前記核酸のサンプルにおいてＪＡＫ２遺伝子のＧ１８４９Ｔ変異体の有無を検出することを含むものであり、Ｇ１８４９Ｔ変異体の存在がＰＶまたは他のあらゆる骨髄増殖症候群の指標となることを特徴としている。
【００５９】
ＳＮＰを用いたこの検出は、対立遺伝子の識別を可能にするＴａｑｍａｎ（登録商標）法によって実施することができる。基本的に、この方法は一本鎖ＤＮＡにおけるＪＡＫ２を１８４９対立遺伝子に特異的な蛍光プローブによって認識することで構成され、ＰＣＲ反応（５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによる）、ハイブリダイズしたＳＮＰの対立遺伝子に特異的な蛍光発光の検出、最終的な蛍光を読み取ることによる遺伝子型の決定（ホモ接合変異ＤＮＡ、ヘテロ接合変異ＤＮＡおよび正常ＤＮＡのクラスタを示す画像の取得）を含んでいる。
【００６０】
ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異タンパク質の検出
【００６１】
もう一つの実施態様によると、変異体はＪＡＫ２タンパク質内で直接検出することができる。
【００６２】
そのために、本発明は、ＰＶまたは他のあらゆる骨髄増殖症候群、とりわけ赤血球増加症、血小板増加症および骨髄線維症に冒された、またはこれらを発症する可能性のある患者のサンプルにおいて、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体の有無を検出するためのエクスビボあるいはインビトロでの方法を目的とし、該方法は、
ａ）患者のサンプルを得ること、
ｂ）ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体の有無を検出すること
を含んでおり、
前記変異体の存在がＰＶまたは他のあらゆる骨髄増殖症候群の指標となることを特徴としている。
【００６３】
前記ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体は従来技術で知られているあらゆる適切な方法で検出することができる。
【００６４】
より特徴的には、個体から得られたサンプルは、タンパク質ＪＡＫ２のＶ６１７Ｆ変異体に特異的な抗体、たとえばＶ６１７Ｆ変異体と変異していないＪＡＫ２タンパク質（およびその他のあらゆるタンパク質）とを区別する能力をもった抗体と接触させることができる。
【００６５】
本発明の抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、一本鎖または二本鎖、キメラ抗体、ヒト化抗体、あるいは、抗原と結合する断片［ヒト断片、ヒトＦ（ａｂ’）２およびＦ（ｖ）］に対応することが従来技術で知られている部分を含む免疫グロブリン分子の部分とすることができる。
【００６６】
これらの抗体は、たとえば毒素またはマーカーとの免疫複合体とすることができる。
【００６７】
ポリクローナル抗体を得るための手順は当業者には良く知られている。典型的には、そのような抗体は、免疫前血清を得るために事前に用意したニュージーランドホワイトウサギにＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体を皮下注射で投与することで得ることができる。抗原は６箇所の異なった部位に部位あたり１００μｌまで注射することができる。ウサギは最初の注射の二週間前に用意し、続いて同一の抗原によって、６週間ごとにおよそ３回、定期的に刺激を与える。そして、血清サンプルを各注射の１０日後に得る。次に、ポリクローナル抗体を、抗体を捕捉するためにＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆタンパク質を用いてアフィニティークロマトグラフィーにより血清から精製する。
【００６８】
モノクローナル抗体は特異性が高いため、ポリクローナル抗体より好ましい。
【００６９】
ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体が野生型ＪＡＫ２タンパク質とは異なった３Ｄ構造を有しているため、このようなモノクローナル抗体を得ることは当業者にとって可能である。「モノクローナル抗体」という表現は、抗原のエピトープだけを認識することができる抗体を意味している。
【００７０】
モノクローナル抗体は、哺乳動物、たとえばマウス、ラット、あるいは他の哺乳動物に、精製されたＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体で免疫付与することで得ることができる。抗体を産生する免疫付与した哺乳動物の細胞を単離し、雑種細胞（ハイブリドーマ）を産生するために骨髄腫または異種骨髄腫の細胞と融合させる。
【００７１】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を抗体の産生源として用いる。免疫付与を必要としない抗体の生成技術も本発明の目的である。たとえば「ファージディスプレイ」法である。
【００７２】
ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体に対する抗体は、ある種の場合には野生型ＪＡＫ２タンパク質との交差反応を示すことがある。これに該当する場合、Ｖ６１７Ｆ変異体に特異的な抗体を選択することが必要となる。したがって、たとえば野生型ＪＡＫ２との交差反応を示しうる抗体を捕捉するために、野生型ＪＡＫ２タンパク質でのアフィニティークロマトグラフィーを用いることができる。
【００７３】
このように、本発明はＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体を特異的に認識するモノクローナル抗体ならびに該抗体を産生するハイブリドーマ系を目的としている。
【００７４】
また、本発明は、サンプルにおけるＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体の有無を検出するための前記抗体を用いたＥＬＩＳＡ法も対象とする。
【００７５】
抗体の利用に代わる方法は、たとえば、特定の分子の認識を可能にする分子クラスであるハプタマーを調製し、識別することからなる。
【００７６】
ハプタマーは、高い親和性と特異性で標的分子のいかなるクラスも実質的に認識することができるオリゴヌクレオチドまたはオリゴペプチドである。
【００７７】
キット
【００７８】
もう一つの特徴によると、本発明は、患者が真性赤血球増加症またはＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体が関与する他のあらゆる骨髄増殖症候群に冒されているかどうかを判定するためのキットに関するものである。
【００７９】
本発明のキットは、ＪＡＫ２遺伝子におけるＧ１８４９Ｔ変異の有無を特異的に検出するための、上記で定義した一つまたは複数のプローブまたはプライマーを含むことができる。
【００８０】
またキットは、ＰＣＲ増幅のための耐熱ポリメラーゼ、増幅および／またはハイブリダイゼーション過程のための一つまたは複数の溶液、ならびに、マーカーの検出を可能にするあらゆる試薬も含むことができる。
【００８１】
もう一つの実施態様において、キットは上記で定義した抗体を含んでいる。
【００８２】
さらに、本発明のキットは、固体担体上でのハイブリダイゼーションまたは免疫反応に適したあらゆる試薬を含むことができる。
【００８３】
検出方法および検出キットは、好適には、５１％を超えるヘマトクリット値を示す患者の亜集団に対して用いられる。また、検出方法および検出キットもまた、好適には、４５００００を超える血小板の割合を示す患者の亜集団に対して用いられる。
【００８４】
本発明のｓｉＲＮＡ
【００８５】
第四の特徴として、本発明はまた、６１７位が変異したＪＡＫ２、特にＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの発現を５０％以上、７５％以上、９０％以上または９５％以上、あるいは９９％以上減少させることを可能にするｓｉＲＮＡも対象としている。これらのｓｉＲＮＡは、リポフェクション、形質導入あるいはエレクトロポレーションによって細胞または組織内に注入することができる。このｓｉＲＮＡによって、数多くの可能な治療法の適用とりわけ真性赤血球増加症の治療を必要とさせる、ＪＡＫ２ Ｖ６１７ＦをコードするｍＲＮＡを特異的に破壊することが可能となる。
【００８６】
ｓｉＲＮＡは米国特許第６０／０６８５６２号明細書（ＣＡＲＮＥＧＩＥ）に記載されている。このＲＮＡは、二本鎖（ｄｓ）構造の領域を有することを特徴とする。阻害は標的配列に特異的であり、ＲＮＡのｄｓ領域の一方の鎖のヌクレオチド配列は少なくとも２５個の塩基を含み、標的遺伝子の部分と同一である。ＲＮＡのｄｓ領域の他方の鎖のヌクレオチド配列は前者の鎖および標的遺伝子の部分に対して相補的である。また、国際公開第０２／４４３２１号パンフレット（ＭＩＴ／ＭＡＸ ＰＬＡＮＣＫ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ）は二本鎖ＲＮＡ（あるいは化学的に合成された同一の性質のオリゴヌクレオチド）を記載しており、該ＲＮＡの各鎖は１９〜２５個のヌクレオチド長を有し、ＲＮＡ干渉プロセスによって標的遺伝子の転写後の発現を特異的に阻害することで、遺伝子の機能を判定し、細胞または個体におけるこの機能を変化させる能力をもっている。最後に、国際公開第００／４４８９５号パンフレット（ＲＩＢＯＰＨＡＲＭＡ）は真核細胞における所与の標的遺伝子の発現をインビトロで阻害する方法を対象としており、該方法において、別々の二つの一本鎖ＲＮＡで形成されたｄｓＲＮＡが細胞内に導入され、ｄｓＲＮＡの一方の鎖は、標的遺伝子と相補的な、２５対未満の連続したヌクレオチドを有する領域を有することを特徴としている。本発明のｓｉＲＮＡを調製するために、当業者はこの文書に含まれる教示内容を参照することができる。
【００８７】
より特徴的には、本発明は、Ｇ１８４９Ｔ変異を含むＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ３の配列に相補的（鎖１）な、および同一（鎖２）の、およそ１５〜３０個のヌクレオチド、１９〜２５個のヌクレオチド、好ましくは約１９個のヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡを対象としている。本発明のこれらのｓｉＲＮＡは、さらに３’末端にジヌクレオチドＴＴまたはＵＵを含むことができる。
【００８８】
多くのプログラムが本発明のｓｉＲＮＡを設計するために利用可能である。
−「ｓｉＳｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒａｍ」、ｈｔｔｐ：／／ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ．ｃｇｂ．ｋｉ．ｓｅ／ｓｉＳｅａｒｃｈ／ｓｉＳｅａｒｃｈ＿１．６．ｈｔｍｌ（「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｎｄ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｓｉＲＮＡ」，Ｃｈａｌｋ ＡＭ，Ｗａｈｌｅｓｄｅｌｔ Ｃ，ａｎｄ Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ ＥＬＬ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２００４）。
−「ＳｉＤｉｒｅｃｔ」、ｈｔｔｐ：／／ｄｅｓｉｇｎ．ｒｎａｉ．ｊｐ／ｓｉｄｉｒｅｃｔ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ（Ｄｉｒｅｃｔ：ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ，ｔａｒｇｅｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ｍａｍｍａｌｉａｎ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，Ｙｕｋｉ Ｎａｉｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（著作権），２００４）。
−「ｓｉＲＮＡ Ｔａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ」、Ａｍｂｉｏｎ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｍｉｓｃ／ｓｉＲＮＡ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ。
−「ｓｉＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎ ｔｏｏｌ」、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＭＩＴ、ｈｔｔｐ：／／ｊｕｒａ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｐｕｂｉｎｔ／ｈｔｔｐ：／／ｉｏｎａ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｓｉＲＮＡｅｘｔ／。
【００８９】
その他のプログラムは以下にリストされている。
ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｍｍｃｍａｎｕｓ／ｗｗｗ／ｈｏｍｅ１．２ｆｉｌｅｓ／ｓｉＲＮＡｓ．ｈｔｍ、とりわけ、
ｈｔｔｐ：／／ａｔｈｅｎａ．ｂｉｏｃ．ｕｖｉｃ．ｃａ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｅｍｂｏｓｓ．ｐｌ？＿ａｃｔｉｏｎ＝ｉｎｐｕｔ＆＿ａｐｐ＝ｓｉｒｎａ。
【００９０】
たとえば、配列ＴＡＴＧＧＡＧＴＡＴＧＴＴ1849ＴＣＴＧＴＧＧＡＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１２）に対しては、センスｓｉＲＮＡはＵＧＧＡＧＵＡＵＧＵＵＵＣＵＧＵＧＧＡｄＴｄＴ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１３）であり、アンチセンスｓｉＲＮＡはＵＣＣＡＣＡＧＡＡＡＣＡＵＡＣＵＣＣＡｄＴｄＴ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１４）である。
【００９１】
特定の実施態様によると、上記の本発明のｓｉＲＮＡは、野生型ＪＡＫ２の発現にできるだけ影響を与えずにＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの発現を減少させる能力、ひいては特異的にブロックする能力について試験、選別されている。たとえば本発明は、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの発現を８０％より多く、９０％より多く、９５％より多くまたは９９％より多く減少させ、野生型ＪＡＫ２についてはまったく減少させない、あるいは、５０％未満、２５％未満、１５％未満、１０％未満または５％未満、さらには１％未満の減少とすることが可能な、ｓｉＲＮＡを目的とするものである。
【００９２】
たとえば、本発明のｓｉＲＮＡは、
−ＵＧＧＡＧＵＡＵＧＵＵＵＣＵＧＵＧＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２９）、
−ＧＧＡＧＵＡＵＧＵＵＵＣＵＧＵＧＧＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ３０）、
−ＧＡＧＵＡＵＧＵＵＵＣＵＧＵＧＧＡＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ３１）、
から構成されるグループから選択することができる。
【００９３】
もう一つの実施態様では、本発明は、国際公開第０１／７０９４９号パンフレット（Ｂｅｎｉｔｅｃ）に包括的に記載されているｄｄＲＮＡｉ分子に関するものであるが、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを特異的に標的としている。本発明のｄｄＲＮＡｉは、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆをコードしている配列を消失させることを可能にするものであり、該ｄｄＲＮＡｉは、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ３、４または１１と同一の配列、（ｉｉ）（ｉ）で定義した配列に相補的な配列、（ｉｉｉ）前記配列（ｉ）および（ｉｉ）を隔てるイントロン、そしてＪＡＫ Ｖ６１７Ｆの発現を変化させる能力をもったＲＮＡを産生する細胞または組織にこの構築物を導入することを含んでいる。
【００９４】
また、本発明は、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの発現をブロックし、遅らせ、または減少させる能力を持った遺伝子構築物を含む一つまたは複数の細胞を有する、遺伝的に修飾された、ヒトではない動物も対象としている。このような遺伝的に修飾された動物を産生する方法は国際公開第０４／０２２７４８号パンフレット（Ｂｅｎｉｔｅｃ）に示されている。
【００９５】
スクリーニング方法
【００９６】
第五の特徴として、本発明はＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの特異的阻害剤のスクリーニング方法を目的としている。
【００９７】
「特異的阻害剤」とは、ＪＡＫ２ Ｖ６１７ＦのＩＣ５０に対するＪＡＫ２のＩＣ５０の比率が５、１０、２５あるいは５０を超える化合物を意味する。たとえば、この化合物はＪＡＫ２ Ｖ６１７ＦのＩＣ５０が１μＭ未満、好ましくは１００ｎＭ未満であるのに対し、ＪＡＫ２のＩＣ５０は５μＭまたは１０μＭを超える。
【００９８】
この方法は、本発明のタンパク質、前記タンパク質を含んだ膜画分、前記タンパク質を発現する細胞、あるいは上述したヒトではないトランスジェニック動物を用いて実施することができる。
【００９９】
このように、本発明は、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの特異的阻害を一つまたは複数の化合物によって判定することを可能にする試験を対象とし、該試験は、一つまたは複数の化合物を、固定、特異的な固定の検出および／またはＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの阻害の検出に適した条件下で、上記のＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆタンパク質、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを含む膜画分、あるいは上記のＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを発現する細胞と接触させることからなる過程を含んでいる。
【０１００】
この方法はさらに野生型ＪＡＫ２への固定の測定を含むことができる。
【０１０１】
また、この方法は複数の分子に対する一連の試験で構成することができ、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆに対して１μＭ未満、好ましくは１００ｎＭ未満のＩＣ５０を示す分子を選択する過程を含むことができる。
【０１０２】
さらにこの方法は、ＪＡＫ２に対して５μＭまたは１μＭ未満のＩＣ５０を示す前述した分子の負の選択を行う過程を含むことができる。
【０１０３】
本発明は、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆのリン酸化の阻害を免疫沈降によって判定する、上述したインビトロでのスクリーニングを対象とする。
【０１０４】
また、本発明は、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）の不在下で分化する能力があるＣＤ３４＋ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ前駆細胞に対する、インビボでのスクリーニングも対象としている。このような細胞は真性赤血球増加症の患者から単離する。ＣＤ３４＋ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ細胞はＳＣＦおよびＩＬ−３を含んだ培地で培養することができる。化合物を培養培地に加え、細胞の増殖能力および３６＋／ＧＰＡ−細胞に分化する能力を判定する。３６＋／ＧＰＡ−クローンの数の減少が観察される化合物を選択する。このように、本発明は、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）の不在下で、またはＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体の導入によって独立因子となった細胞系上で分化する能力がある、ＣＤ３４＋ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの初代前駆細胞を用いた上記スクリーニング方法を対象としている。同様のタイプの分析を半流動培地におけるＣＦＵ−Ｅ型の骨髄培養物に対して行うことができ、コロニーの自然発生的な増加の阻害について化合物を直接試験することができる。
【０１０５】
また、組換えＪＡＫ Ｖ６１７Ｆを発現する上記の哺乳動物のあらゆる細胞系を利用することもできる。
【０１０６】
また、本発明は医薬品の候補を識別するための方法も対象としており、該方法は、真性赤血球増加症を再現し、および／または、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの存在に関連する骨髄増殖症候群に冒されている、上述したＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを発現する、ヒトではないトランスジェニック動物に化合物を投与することと、化合物の効果を判定し、真性赤血球増加症における赤芽球の増殖および自然発生的な分化の減少もしくはブロックまたはＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの存在に関連する細胞増殖の減少が観察される医薬品候補を選択することとからなる過程を含んでいる。
【０１０７】
より特徴的には、この方法は、上述したＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ Ｋ−ｉｎマウスまたはＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ Ｋ−ｉｎラットで実施する。
【０１０８】
これらの化合物のうち、たとえば前述したＪＡＫ２の変異したエクソン１２を標的とするｓｉＲＮＡ、特に、変異ヌクレオチドｔ1849を含んだ配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ３、４または配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１１を標的とするｓｉＲＮＡを挙げることができる。
【０１０９】
もう一つの特徴として、本発明は、医薬品の製造のために、前記ｓｉＲＮＡまたは上記のｄｄＲＮＡｉおよびＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを特異的に阻害する化合物を利用することを対象としている。前記医薬品はとりわけ、血液の癌、特に真性赤血球増加症、本態性血小板増加症、骨髄性脾腫つまり原発性骨髄線維症、および慢性骨髄性白血病（ＬＭＣ）を含む骨髄増殖症候群の治療を目的としている。また、前記医薬品は、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異に関連するその他の悪性血液疾患、場合によってはＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを発現する充実性腫瘍、癌腫、黒色腫および神経芽腫の治療も目的としている。
【０１１０】
明細書の以下の部分および実施例については、以下に説明した図面を参照するものとする。
【０１１１】
図面の説明
【０１１２】
図１：ＰＶにおけるＪＡＫ２の主要な役割の発見
平常時では、ＪＡＫ２はリン酸化していない状態でボックス１に固定されている。Ｅｐｏとの結合によって受容体の立体構造が変化し、ＪＡＫ２のリン酸転移が可能となり、それを受けてＪＡＫ２はＥｐｏ−Ｒの細胞質内残基をリン酸化し、シグナル伝達のさまざまな正のエフェクター（→）または負のエフェクター（┤）を動員する。
【０１１３】
図２：エリスロポエチンの不在下で分化できるＰＶのＣＤ３４＋前駆細胞の培養モデルの設定
２Ａ：Ｅｐｏ、ＳＣＦおよびＩＬ−３を用いた培養。
２Ｂ：Ｅｐｏの不在下での培養。
【０１１４】
図３：ＪＡＫ−ＳＴＡＴ、Ｐｉ３−ＫおよびＳｒｃキナーゼ経路の阻害による赤血球の自然発生的な分化の抑制。
【０１１５】
図４：ＰＶ前駆細胞におけるＪＡＫ２の阻害の手順。
【０１１６】
図５：ＰＶ前駆細胞におけるＪＡＫ２の阻害の結果
５Ａ：３６＋／ｇｐａ−のクローニング能力の減少。１〜６日目にＳＣＦ−ＩＬ３において培養し、５日目にエレクトロポレーションを行い、６日目に選別する（形態／３６＋／ｇｐａ−）。
メチルＳＣＦのみ。１３日目（選別後７日目）に計数を行う。
５Ｂ：Ｖ６１７Ｆ変異を有するＪＡＫ２の構造（エクソン１２）。
【０１１７】
図６：ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）法およびＴａｑＭａｎ（登録商標）法による、ゲノムＤＮＡにおけるＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異を検出するためのＳＮＰの遺伝子型決定分析。
ＡおよびＢ：ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブを用いたＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）の融解曲線分析による変異の検出。Ａ：ＴＦ−１のＤＮＡにおけるさまざまな希釈度のＨＥＬのＤＮＡを用いた実験の結果が示されている。ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆのピーク（５７℃）は１％の希釈度でも依然として検出可能である。Ｂ：代表的な患者のサンプルの結果を示している（＃１：ホモ接合体、＃２：ヘテロ接合体、＃３：弱い、＃４：変異なし）。
Ｃ：ＴａｑＭａｎ（登録商標）を用いた対立遺伝子に特異的な増幅による変異の検出。ＨＥＬのＤＮＡの希釈物での実験（１００〜１％のＨＥＬ：白抜きの四角、ＴＦ−１細胞：白抜きの丸）と代表的な患者のいくつかのサンプル（黒の十字）を示している。＃ａ：ホモ接合体の患者、＃ｂ：ヘテロ接合体の患者、＃ｃ：弱い患者、＃ｄ：変異のない患者。
【０１１８】
図７：赤血球増加症（つまり５１％を超えるクリマトクリット値）を診断するために提案する診断シート。
シートの各段階についての患者の数は各欄の端に記載されており（ｎ）、ここではすべての臨床データを示す患者のみをリストしている（ｎ＝８１）。一次診断試験であるＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの検出の結果、８１人中５８人の患者において、ＰＶ型の骨髄増殖症候群を診断するためのその他の調査を避けた。
【０１１９】
図８および図９：ＨＥＬ細胞におけるＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの発現が、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆに特異的なｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ＃１、＃３および＃４）による処理の２４時間後に減少する。
０〜６：ＪＡＫ２ Ｖ６１７ＦのｓｉＲＮＡで処理した（１〜６）または処理していない（０）ＨＥＬ細胞。
Ｃ＋：ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ ＲＶベクターでトランスフェクトした２９３ＨＥＫ細胞。
Ｃ−：２９３ＨＥＫ。
【０１２０】
図１０：Ｋ５６２細胞におけるＷＴ ＪＡＫ２の発現レベルは、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆに特異的なｓｉＲＮＡによる処理の２４時間後にも変化しなかった。
Ｊｅ：ＷＴ ＪＡＫ２のｓｉＲＮＡで処理したＫ５６２細胞。
０〜６：ＪＡＫ２ Ｖ６１７ＦのｓｉＲＮＡで処理したＫ５６２細胞。
Ｃ−：２９３ＨＥＫ（ＪＡＫ２の発現なし）。
【実施例１】
【０１２１】
４３人中３９人の患者におけるＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異の識別
【０１２２】
疾病状態にある前駆細胞の培養モデルの設定と生化学的阻害剤の利用によって、ＪＡＫ２−ＳＴＡＴ５、ＰＩ３キナーゼおよびＳｒｃキナーゼの経路がＰＶ前駆細胞のＥｐｏに依存しない分化に必要であることが明らかになった（Ｕｇｏ ｅｔ ａｌ，２００４）。これらの結果は、ＰＶが原因である原発性の分子異常が、シグナル伝達経路に構成的活性を与えるチロシンキナーゼの変異のような、シグナル伝達経路の脱制御につながる主要タンパク質の異常であるという、我々の仮説を裏付けている。とはいえ、ＪＡＫ２タンパク質の主要な役割は真性赤血球増加症に冒された４３人の患者に対する検査により特定することができたのであり、該タンパク質はこれらのさまざまなシグナル伝達経路の最も上流に位置するタンパク質で、サイトカイン受容体のシグナル伝達経路に共通しているものであり、該受容体に対する応答の異常はＰＶにおいて説明されてきている。我々は、
−機能的アプローチ（ＲＮＡ干渉によるＰＶ細胞におけるＪＡＫ２の阻害）、
−ゲノム的アプローチ（遺伝子の２３個のエクソンのシーケンシング）、および、
−構成的活性化の原因となるＪＡＫ２のリン酸化の異常を発見するための生化学的アプローチ
という３つの補足的なアプローチによって、ＰＶの病理におけるＪＡＫ２プロテインキナーゼの関与を研究した。
【０１２３】
用いた生物材料は、赤血球増加症に冒されている、承諾を得た患者に由来するものであり、診断目的で採取され、Ｈｏｔｅｌ ＤｉｅｕのＬａｂｏｒａｔｏｉｒｅ Ｃｅｎｔｒａｌ ｄ’Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｅに送られたサンプルの残りと、治療のための瀉血に対応するものである。
【０１２４】
１．１ 機能的研究
真性赤血球増加症に冒された患者の赤芽球におけるＪＡＫ２の機能の研究は、ＪＡＫ２のｍＲＮＡのエクソン１５に位置する配列を標的として認識する、ＪＡＫ２配列に特異的なｓｉＲＮＡ（ＡＭＢＩＯＮ、Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ、イギリス）を、エレクトロポレーションによってＰＶの赤芽球に形質導入することで行った。我々は、ＪＡＫ２の阻害によって、Ｅｐｏの不在下でのＰＶ前駆細胞のクローニング能力と「自然発生的な」分化がかなり減少することを示した。ＪＡＫ２のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした正常な赤芽球前駆細胞は、コントロールｓｉＲＮＡと比較してクローン化能力が７０％減少しており、このことは、ＪＡＫ２のｓｉＲＮＡによるトランスフェクションが有効であることを確証している。ＰＶでは、赤芽球前駆細胞においてＪＡＫ２を阻害する効果がＥｐｏ不在の培養モデルにおいて研究されており、これによって悪性クローン細胞の研究が可能となっている。我々は、ＪＡＫ２のｓｉＲＮＡによるトランスフェクション後のＰＶの赤芽球前駆細胞のクローン化能力、アポトーシスおよび分化を、コントロールｓｉＲＮＡの場合と比較した。Ｅｐｏの不在下で培養したＰＶ前駆細胞のクローン化能力の研究により、コントロールｓｉＲＮＡの場合と比較して、ＪＡＫ２のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした後にコロニーの数が明らかに減少したことが示された。これらの細胞のアポトーシスについてのフローサイトメトリー分析は、ＪＡＫ２のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞では、関連のないｓｉＲＮＡの場合と比較してアポトーシスが顕著に増加したことを示している（７０％対５３％）。分化に対するＪＡＫ２のｓｉＲＮＡの効果に関する研究（フローサイトメトリーで検出されたグリコフォリンＡの回収）では、コントロールｓｉＲＮＡとＪＡＫ２のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした前駆細胞の間ではわずかな違いを示しただけである。
【０１２５】
したがって、細胞研究の結果は、ＰＶの赤芽球前駆細胞がＥｐｏに依存せずに分化するにはＪＡＫ２が必要であることを示している。生化学的研究（免疫沈降）の第一の結果は、ＰＶの赤血球前駆細胞をサイトカインから遮断すると、正常細胞と比較して、ＪＡＫ２のより長いリン酸化が起こることを示している。
【０１２６】
１．２ ＪＡＫ２のゲノム的研究
２３個のエクソンに対するＰＣＲをゲノムＤＮＡに基づいて正常な被験者に対して行った。そして、細胞培養後にインビトロで得られた赤血球細胞のゲノムＤＮＡを抽出した後に、３人のＰＶ患者について研究した。
【０１２７】
我々は、ＪＡＫ２のエクソン１２に位置し、試験した３人の患者のうち２人に存在した点変異を識別した。この変異はコード配列の１８４９番塩基（［ＡＴＧから開始したナンバリング］、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ＿００４９７２）に関与し、ＪＡＫ２タンパク質のコドン６１７を変化させる（Ｖ６１７Ｆ）。
・通常のコドン６１７：バリン（Ｖ）をコードするｇｔｃ。
・変異したコドン６１７：フェニルアラニン（Ｆ）をコードするｔｔｃ。
【０１２８】
インターネット上に公開されているデータベースにより、我々はそれが既知の多型ではないことを確認した。
【０１２９】
次に、我々は被験者群を広げた。現在、変異は試験した４３ケースのうち３９人のＰＶ患者で見つかっている。対照（試験した１５ケース）あるいは二次性赤血球増加症の患者（試験した１８ケース）では変異を有する者は見つかっていない。
【０１３０】
患者におけるシーケンシングの結果
・試験した４３のＰＶ中３９の変異（９０％）。
・２／３のヘテロ接合体。
・１３／３９、つまり３０％のケースが「ホモ接合体」（９ｐでのヘテロ接合性の喪失と同じ割合）。
【０１３１】
コントロール
・試験した３３人の対照中０例の変異。
−うち、１５人は正常な被験者。
−１８人は二次性赤血球増加症（自然発生的なコロニーなし）。
【０１３２】
ＪＡＫ２のこの異常の発見は、ＰＶに関わる多くの成長因子（Ｅｐｏ、ＴＰＯ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、インスリン）に対する過敏性を説明している。実際、ＪＡＫ２はこれらサイトカインの受容体のシグナル伝達経路に関与するタンパク質である。
【０１３３】
さらに、ＪＡＫ２とＥｐｏ−Ｒとの連関は、ＪＡＫ２が構成的にＥｐｏ−Ｒに固定されるという点で特徴的である。つまり、ゴルジ装置内で開始されるＪＡＫ２／Ｅｐｏ−Ｒの連関は、赤芽球の膜でのＥｐｏ−Ｒのプロセッシングに必要である。したがって、ＪＡＫ２とＲ−Ｅｐｏとの連関の変化の原因となっているＪＡＫ２の異常は、赤芽球系での骨髄の過形成の優位性を説明しうるが、一方、このタンパク質は多くのシグナル伝達経路に関与するものである。また、Ｍｏｌｉｔｅｒｎｏ ｅｔ ｃｏｌｌ（Ｍｏｌｉｔｅｒｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８、Ｍｏｌｉｔｅｒｎｏ ｅｔ Ｓｐｉｖａｋ，１９９９）は、グリコシル化の欠如に関連するｍｐｌの膜発現の欠如を立証している。Ｅｐｏ−Ｒから類推して、ＪＡＫ２がｃ−ｍｐｌのプロセッシングに必要である可能性がある。ＪＡＫ２の異常は、ＰＶで見られるｃ−ｍｐｌの膜発現の欠如を説明するものであろう。
【０１３４】
ＪＡＫ２は、その近位ドメインにおいて、Ｅｐｏ−Ｒの、よく保存されたドメインであるＢｏｘ２に結合する。Ｅｐｏによる刺激がないとき、ＪＡＫ２は構成的にＥｐｏ−Ｒに固定されるが、リン酸化していない形態であり、したがって非活性的である。Ｅｐｏによる受容体の刺激後、二つのＪＡＫ２分子はリン酸化し、そしてＥｐｏ−Ｒをリン酸化するのだが、このことによって、ＳＴＡＴ５、Ｇｒｂ２、ＰＩ３Ｋタンパク質のようなシグナル伝達に関与するその他のタンパク質を動員し、リン酸化することが可能になる。ＪＡＫ２タンパク質はすべてのＪＡＫと同様、機能的なキナーゼ領域（ＪＨ１）、チロシンキナーゼ活性のない偽キナーゼ領域（ＪＨ２）および、ＪＡＫファミリーのメンバーに特徴的な複数の保存ドメイン（ＪＨ３〜ＪＨ７）を有している。ＪＨ２ドメインはＪＡＫ２のチロシンキナーゼ活性の調整に関与すると考えられる。ＪＡＫ２タンパク質のマッピングに関する入手可能なデータ（Ｌｉｎｄａｕｅｒ，２００１）によると、６１７番アミノ酸はこのＪＨ２ドメインに位置し、モデル化の研究によると、キナーゼ活性の調節に特に重要な領域に位置している。
【０１３５】
この発見（サイトカインに依存しないメカニズムの理解、さまざまなＳＭＰの分類）の生理病理学的利点を越えて、患者における変異の実証は、診断の確認を可能にする試験を初めて提供するものである。医療診断のアプローチにおいて、ＪＡＫ２の変異の検査は、悪性クローンに属する血液多核球に対して行うことができるものである。
【０１３６】
また、本発明は、変異タンパク質に特異的なキナーゼを阻害するタイプの特異的な処理、あるいは遺伝子治療の開発を提供するものでもある。
【実施例２】
【０１３７】
赤血球増加症の一次診断のためのＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体の検出
【０１３８】
２．１ 患者、材料および方法
ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを検出するための、シーケンシングと二つのＳＮＰ遺伝子型決定法の比較。
【０１３９】
患者の細胞
ＭＰＤ（すなわち赤血球増加症、血小板増加症、白血球増加症）の疑いがある１１９のサンプルを分析した。５８の血液サンプルをこのために採取し、骨髄バンクの６１のサンプルを遡及的に分析した。
【０１４０】
製造者（Ｅｕｒｏｂｉｏ、フランス）の指示にしたがって密度勾配を用いて末梢顆粒球を単離した。Ｆｉｃｏｌｌを用いた勾配遠心法を利用して骨髄の単核細胞を単離した。標準的な手順でゲノムＤＮＡを抽出した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）法およびＴａｑＭａｎ（登録商標）法の感度を知るために、最少残基の野生型対立遺伝子とのホモ接合のサンプルに由来するＤＮＡを、正常ＤＮＡで連続希釈した。
【０１４１】
細胞系
標準的なポジティブコントロールであるＴＦ−１細胞系（変異なし）のＤＮＡにおける、ホモ接合性で変異した（ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ）ヒト赤白血病細胞系（ＨＥＬ）のＤＮＡの連続希釈物（１、０．５、０．１、０．０５、０．０１）を用いた。この細胞系を、ウシ胎児血清を加えたＭＥＭ−α培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で成長させた。
【０１４２】
ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブを用いたＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）の融解曲線分析による変異の検出
ＪＡＫ２のエクソン１２の標的配列の増幅および該配列とのハイブリダイゼーションのために、プライマーとプローブを設計した。変異部位の位置（１８４９Ｇ／Ｔ）を、３’をフルオレセインで標識したドナーキャプチャープローブと、５’末端をＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ６４０（ＬＣＲｅｄ６４０）で標識した、隣接するアクセプターアンカープローブで覆い、該アンカープローブの３’末端は伸長を避けるためにリン酸化した。増幅および融解曲線分析はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）の機器（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍｅｙｌａｎ、フランス）で実施した。最終的な反応体積は２０μｌであり、１０ｎｇのＤＮＡ、１４μｌのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ混合物、３ｍＭのＭｇＣｌ2、０．２μＭのプライマー、０．０７５μＭの各プローブが含まれている。簡単に説明すると、サンプルを９５℃で１０分間加熱し、４５サイクル（９５℃で１０秒、５３℃で１０秒、７２℃で１５秒）のＰＣＲ増幅の後、９５℃で１０秒間の変性過程と、それぞれ３０秒にわたる６３℃と４５℃での二回のハイブリダイゼーション過程を行い、そして融解曲線は４５℃と７０℃（０．１℃／秒）の間に含まれる領域にあった。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）プログラム上での分析は、温度に対する蛍光産物の曲線［Ｔに対する２（ｄＦｌ２／Ｆｌ１）／ｄＴ）］をプロットすることで行った。変異体およびＷＴのピークはそれぞれ５７℃と６３℃で見られた。
【０１４３】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）を用いた対立遺伝子に特異的な増幅による変異の検出
１８４９位でのＳＮＰを含む９２ｂｐの産物を増幅するために二つのプライマーを設計した。二つのＭＧＢ蛍光プローブを、異なる色で蛍光標識して、一つはＷＴ対立遺伝子を標的とし、もう一つは変異対立遺伝子を標的とするよう設計した。９６ウェルプレート上で、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲに基づく方法を用いて遺伝子型決定を行った。最終的な反応体積は１２．５μｌであり、１０ｎｇのゲノムＤＮＡ、６．２５μｌのＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘおよび０．３１μｌの４０×Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ ＳＮＰ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ａｓｓａｙ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が含まれている。プレートを９５℃で１０分間加熱し、その後、９２℃で１５秒の４０回の変性サイクルと６０℃で１分間の対合／伸長を行った。熱サイクルは７５００ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。分析はＳＤＳプログラムのバージョン１．３を用いて実施した。最終的な対立遺伝子の識別のための遺伝子型決定は、ＰＣＲ後の蛍光読み取りに基づいて得られた変異ＪＡＫ２の蛍光の曲線（Ｒｎ）に対する、ＷＴプローブに由来するＲｎの目視による判定で行った。
【０１４４】
赤血球増加症の患者とサンプルの採集
何らかの治療を行う前に、診断時に、５１％を超えるヘマトクリット値を有する８８人の患者を調べ、ＷＨＯ基準およびＰＶＳＧ基準の有無について検査した。５１％という値はヘマトクリット値の正常域の上限である（Ｐｅａｒｓｏｎ ＴＣ ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａ Ｖｅｒａ Ｕｐｄａｔｅｄ：Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ（Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｅｄｕｃ．Ｐｒｏｇｒａｍ．）２０００：５１−６８）。骨髄細胞をクローン化の測定のために採取し、過剰量の細胞をＤＮＡ抽出のために採取した。血清中のエリスロポエチン（Ｅｐｏ）をさまざまな研究所で測定し、その結果、該エリスロポエチンが各研究所の正常域の下限値より低いときには低いとの報告を、同様にして正常あるいは高いとの報告を受けた。同じ患者に由来する末梢顆粒球を先述のように精製し、各時間における血液サンプルを利用できるようにした。骨髄サンプルおよび血液サンプルをインフォームドコンセントを得た後に採取した。
【０１４５】
ＥＥＣの分析
Ｅｐｏに対する赤血球の応答特性のインビトロでの測定を、同一の研究所（Ｈｏｔｅｌ Ｄｉｅｕ、パリ）において、先述した凝固血漿培養法によって行った（Ｃａｓａｄｅｖａｌｌ Ｎ，Ｄｕｐｕｙ Ｅ，Ｍｏｌｈｏ−Ｓａｂａｔｉｅｒ Ｐ，Ｔｏｂｅｌｅｍ Ｇ，Ｖａｒｅｔ Ｂ，Ｍａｙｅｕｘ Ｐ．Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｉｎ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ｐｕｒｅ ｒｅｄ−ｃｅｌｌ ａｐｌａｓｉａ． Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９９６；３３４：６３０−６３３）。
【０１４６】
統計分析
マーカーの相関関係はスピアマンの順位相関係数（Ｒ）を用いて求めた。
【０１４７】
２．２ 結果
ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異を検出するためのＰＣＲに基づく遺伝子型決定法の実行可能性と感度
ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異を検出するためのシーケンシング、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）法およびＴａｑｍａｎ（登録商標）法の効率を評価するために、ＭＰＤの疑いのある患者に由来する１１９のサンプルにおいて、３つの方法を平行して利用して該変異の存在を調査した。ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異は１１９サンプル中８３サンプルで効果的に検出され、３５サンプルは３つの方法のいずれによっても変異を示さなかった。１サンプルのみにおいて、シーケンシングではＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）とＴａｑｍａｎ（登録商標）の二つの方法で明らかになった変異を検出できなかったことから、後者の方法がより感度が良いことが示唆される。
【０１４８】
方法の感度を評価するため、二つの異なった方法を用いた。つまり、変異のないＴＦ−１細胞系のＤＮＡにおける、ホモ接合性で変異したＨＥＬ細胞系のＤＮＡの連続希釈液を試験し、また、正常ＤＮＡにおける、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異についてホモ接合の患者に由来するゲノムＤＮＡの連続希釈液を試験した。シーケンシングでは、ＴＦ−１細胞系のＤＮＡで希釈した５％未満のＨＥＬ細胞系のＤＮＡ、正常ＤＮＡで希釈した１０％未満のホモ接合性の変異患者のＤＮＡでは、変異した対立遺伝子を検出できなかった。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）法およびＴａｑｍａｎ（登録商標）法の感度は同等で、シーケンシングをわずかに上回っており、ＴＦ−１細胞系のＤＮＡで希釈したＨＥＬ細胞系のＤＮＡでは０．５〜１％（図６）、正常ＤＮＡで希釈したホモ接合性の変異患者のＤＮＡでは２〜４％まで可能であった。
【０１４９】
診断時の赤血球増加症患者の特徴
診断時に５１％を超えるヘマトクリット値を有する８８人の患者の主要な特徴を表１にまとめた。
【０１５０】
【表１】
【０１５１】
５１％を超えるヘマトクリット値を有する８８人の患者をＰＶＳＧ基準とＷＨＯ基準にしたがって診断し、真性赤血球増加症（ＰＶ）、突発性赤血球増加症、二次性赤血球増加症、および測定した赤血球量の増加していないときの「絶対的赤血球増加症ではない」（ＡＥではない）という四つのグループに分けた。８人の患者は、いくつかの臨床データが入手不可能であったため、決定的な診断を得ることができなかった。Ｈｔ：ヘマトクリット、Ｈｂ：ヘモグロビン、ＷＢＣ：白血球、ＥＥＣ：内因性赤血球コロニー、Ｅｐｏ：エリスロポエチン、σ：標準偏差。患者は、ＷＨＯ基準（Ｐｉｅｒｒｅ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，ｅｄｉｔｅｕｒｓ．Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｕｒｓ；Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｕｍｏｕｒｓ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ａｎｄ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｌｙｏｎ：ＩＡＲＣ Ｐｒｅｓｓ；２００１：３２−３４）とＰＶＳＧ基準（Ｐｅａｒｓｏｎ ＴＣ，Ｍｅｓｓｉｎｅｚｙ Ｍ． Ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｏｆ ｐｏｌｙｃｙｔｈａｅｍｉａ ｒｕｂｒａ ｖｅｒａ．Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ １９９６：２２ Ｓｕｐｐｌ １：８７−９３）のそれぞれに応じて、ＰＶ診断を受けた６１〜４５人の患者、二次性赤血球増加症の５人、突発性赤血球増加症の１１〜２１人、そして絶対的赤血球増加症ではない３人（正常な赤血球量）の、４つの主要グループに分けることができた。臨床データは７人の患者について不完全であったが、それは、ＰＶの診断がＷＨＯ基準でもＰＶＳＧ基準でも確認できなかったということである。二つの分類におけるＡ１基準の間にある違いのために、赤血球量の測定を行っていない６人の患者はＷＨＯ分類に入れることはできるが、ＰＶＳＧ分類には入れることができない。一人の患者は低酸素血症とＥＥＣの形成を同時に示し、したがって診断が困難であった。細胞遺伝学的分析を３５人の患者で行い、３２人のＰＶ患者（ＷＨＯ基準による）のうち７人が細胞遺伝学的異常を有し、そのうち５人が９トリソミーを、１人が７ｑトリソミーを有しており、そして１人が１８番染色体に付加的な物質を有していた。
【０１５２】
ＰＶのＰＶＳＧ基準とＷＨＯ基準に対応するＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの存在
ＰＶＳＧ基準によりＰＶとして診断された４５人の患者のうち４３人（９６％）でＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆが存在し、ＷＨＯ基準で診断された６１人の患者のうち５７人（９３％）で存在した（表１）。しかし、ＰＶＳＧ分類にしたがってＰＶでないとして分類された２９人の患者のうち８人は変異を示したのに対し、ＷＨＯ分類にしたがってＰＶでないとされた患者１９人は変異を示さなかった。これら８人の患者はＰＶＳＧ基準によればＩＥであると考えられ、ＷＨＯ基準によればＰＶであると考えられる。ＳＥと診断された患者も正常な赤血球量を有する患者（「ＡＥではない」）も変異を有していなかった。したがって、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの有無は、ＷＨＯ基準を用いた場合には８０人中７６人の患者で（９５％、Ｒ＝０．８７９、ｐ＜０．０００１）、ＰＶＳＧ基準を用いた場合では７４人中６４人の患者で（８６．５％、Ｒ＝０．７１７、ｐ＜０．０００１）、ＰＶの陽性診断に対応する。さらに、ＷＨＯ基準でＰＶでないと診断された患者はいずれも変異を有していなかったため、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの検出は絶対的赤血球増加症においては１００％の予測値を有することになる。
【０１５３】
一部の著者（Ｍｏｓｓｕｚ Ｐ． ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｌｅｖｅｌ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｏｓｉｓ． Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ２００４；８９：１１９４−１１９８）は血清Ｅｐｏレベルの測定を、絶対的赤血球増加症の患者に対する一次診断試験と考えており、Ｅｐｏレベルが正常域の下限値の下にあれば、ＰＶの診断について９７％の特異度と９７．８％の予測値を有する。我々の研究において、ＥｐｏレベルとＷＨＯ基準およびＰＶＳＧ基準によるＰＶ診断との相関関係は、それぞれ６１人中５０人（８２％、Ｒ＝０．４８８、ｐ＝０．０００２）および５６人中３９人（７０％、Ｒ＝０．３５８、ｐ＝０．００６７）の患者で見られた。次に、我々はＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの存在下または不在下で血清Ｅｐｏレベルを比較し、６８人の患者のうち５２人（７６％、Ｒ＝０．４１６、ｐ＝０．０００４）が適切な相関関係を有することを見出した。
【０１５４】
ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異の存在はＥＥＣを形成する能力に対応する。
【０１５５】
異なる三つのチームにより、ＪＡＫ２ Ｖ６１７ＦをトランスフェクトしたＥｐｏに依存する細胞系が、増殖についてはＥｐｏに依存しておらずＥｐｏに対して過敏であり、ＰＶにおいて説明されている赤血球前駆細胞の非依存性および過敏性と似た振る舞いを見せることが示されている。したがって我々は、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを有する患者がＥＥＣの形成も示すという仮説を立てた。ＥＥＣの形成をまったく示さない２０人の赤血球増加症患者のうち、一人は変異を示し、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの検出に関する陽性の予測値に疑問が生じた。しかし、この患者がＥＥＣも全く示さなくとも、該患者は多くの陽性のＷＨＯ基準およびＰＶＳＧ基準を満たしており、該患者を両方の分類法においてＰＶとして分類することができる。したがって、この患者は「ＪＡＫ２について偽陽性」というよりも「ＥＥＣについて偽陰性」と捉えるべきである。ＥＥＣを有する６７人の患者のうち、６２人はＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを有しており、５人の患者は検出に感度のある方法を用いた際には変異していなかった。これら５人の患者のうち、５人中４人と５人中２人は、それぞれＷＨＯ基準とＰＶＳＧ基準にしたがってＰＶグループに分類することができた。全体では、分析した８７人の患者のうち、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異の有無が、８７人中８１人の患者（９３．１％、Ｒ＝０．８２４、ｐ＜０．０００１）においてＥＥＣを形成する能力の有無に対応していた。
【０１５６】
骨髄の単核細胞（ＢＭＭＣ）におけるＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異の存在は、末梢顆粒球における該変異の存在に対応している。
【０１５７】
診断時にＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異を検出するために末梢血顆粒球を用いることで骨髄細胞の分析の実施を避けられるかどうかを検討するために、我々は、骨髄サンプルと末梢血サンプルが診断時に両方利用可能な５０人の患者について（３５人のＰＶ患者、８人のＳＥ患者および８人のＭＰＤの疑いのある者を含む）、シーケンシング法、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）法およびＴａｑＭａｎ（登録商標）法のそれぞれで得られた結果を比較した。すべての場合（変異のある３４人、変異のない１６人）で、変異は同様に検出された。
【０１５８】
ＩＩＩ−結論
このように、我々は、明白な二次的赤血球増加症の場合を除き、顆粒球におけるＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを感度の良い方法で検出することが赤血球増加症の診断の最初のステップである（図７）、新規なＰＶ診断カードを提案する。このアプローチにはいくつかの利点があり、常に実行可能というわけではなく結果を検討しなくてはならないことのある、アイソトープを有する赤血球量の測定を避けることができる。また、骨髄の吸引や、時間がかかり標準化されていないＥＥＣ分析の実行を避けることもできる。これによりＰＶの陽性診断のコストが大きく低下するのだが、それは、５１％を超えるヘマトクリット値を有しＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆについて陰性の患者のみが、赤血球増加症を特徴づけるために実際に行う全ての調査を受けることになるからである。赤血球増加症におけるＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの検出だけでＰＶの診断が支持されても、骨髄の生検の実施は依然として有効であるが、それは、該生検を行うことで骨髄線維症の兆候または芽球細胞の存在を明らかにすることができ、それによりＰＶの白血病性形質転換が確認されるからである。しかし、骨髄の生検は、細胞遺伝学的分析とともに、随意的な研究として行われるべきものであると考えられる。
【０１５９】
また、３０％のＥＴ、５０％のＩＭＦ、そして特徴が明らかにされていない、稀ないくつかのＭＰＤにおいてもＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆが検出され、これにより、異なる臨床所見を伴うＭＰＤの新しいグループを決定した。これらの違いの理由はまだ分かっておらず、共通の生理病理学的原因と異なる表現型とによってこれらの病気を一つの骨髄増殖群にまとめるにはまだ早い。今後の詳しい臨床研究によって、より特定的に、ＰＶ、ＥＴ、ＩＭＦおよびＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを有するその他の稀なＭＰＤの間で共通する兆候が、特に絶対的赤血球増加症、Ｅｐｏレベル、骨髄線維症そして細胞遺伝学的異常の枠組みで、より的確に特徴づけられるであろう。したがって、慢性的白血球増加症、血小板増加症および赤血球増加症の診断における最初の手段としてＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの検出を用いることも考えられる。ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの存在はＭＰＤグループの新たな定義を可能とするだけではなく、確実に、特異的ターゲッティング療法の開発の基礎となるものでもある。
【０１６０】
実施例３：ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを阻害するがＷＴ ＪＡＫ２は阻害しない、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異に特異的なｓｉＲＮＡ。
【０１６１】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２５〜２７に対応するｓｉＲＮＡ １、３および４は、ＨＥＬ系で発現するＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異タンパク質を阻害するが、Ｋ５６２系で発現する野生型ＪＡＫ２タンパク質は阻害しない。結果は図８、図９および図１０に示している。
【０１６２】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】ＰＶにおけるＪＡＫ２の主要な役割を示した図。
【図２】エリスロポエチンの不在下で分化できるＰＶのＣＤ３４＋前駆細胞の培養モデルの設定を示した図。
【図３】ＪＡＫ−ＳＴＡＴ、Ｐｉ３−ＫおよびＳｒｃキナーゼ経路の阻害による赤血球の自然発生的な分化の抑制を示した図。
【図４】ＰＶ前駆細胞におけるＪＡＫ２の阻害の手順を示した図。
【図５】ＰＶ前駆細胞におけるＪＡＫ２の阻害の結果を示した図。
【図６Ａ】ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブを用いたＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）の融解曲線分析による変異の検出を示したグラフ。
【図６Ｂ】ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブを用いたＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）の融解曲線分析による変異の検出を示したグラフ。
【図６Ｃ】ＴａｑＭａｎ（登録商標）を用いた対立遺伝子に特異的な増幅による変異の検出を示したグラフ。
【図７】赤血球増加症（つまり５１％を超えるクリマトクリット値）を診断するために提案する診断シートを示した図。
【図８】ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆに特異的なｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ＃１、＃３および＃４）を示した図。
【図９】ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆに特異的なｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ＃１、＃３および＃４）による処理により減少した、ＨＥＬ細胞におけるＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの発現を示した図。
【図１０】ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆに特異的なｓｉＲＮＡによる処理によって変化しない、Ｋ５６２細胞におけるＷＴ ＪＡＫ２の発現レベルを示した図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下で「ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体」と称する、６１７番アミノ酸に変異を含む、より特徴的にはＶ６１７Ｆ変異を含むことを特徴とする、単離されたＪＡＫ２（Ｊａｎｕｓキナーゼ２）タンパク質であり、該タンパク質の配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１で表されるか、またはその他の哺乳動物における類似配列であるタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体をコードするヌクレオチド配列であり、とりわけ、転写開始を示すＡＴＧから数えて１８４９位でｔ／ｇ変異を有する配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２。
【請求項３】
ウイルス、プラスミド、または裸ＤＮＡ型のクローニングベクターおよび／または発現ベクターであり、哺乳動物の細胞で有効なプロモータの制御下で請求項２に記載の配列を含むことを特徴とするベクター。
【請求項４】
請求項１に記載の組換えＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体を発現する哺乳動物の細胞。
【請求項５】
請求項１に記載の組換えＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを発現する、ヒトではないトランスジェニック動物。
【請求項６】
相同組換えまたは部位特異的組換えにより、ゲノム中に少なくともＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆをコードする配列を組み込んだマウスまたはラットであることを特徴とする、請求項５に記載のヒトではないトランスジェニック動物。
【請求項７】
ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ／ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆホモ接合体またはＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ／ＪＡＫ２ヘテロ接合体であり、真性赤血球増加症および／またはＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆによって誘発される骨髄増殖症候群を再現することを特徴とする、請求項５または請求項６に記載のヒトではないトランスジェニック動物。
【請求項８】
配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ３または４の連続する１０〜３０個のヌクレオチドを含み、変異ヌクレオチドｔ1849を含むプローブまたはプライマー。
【請求項９】
配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ５〜１１および１５〜２８から選択される、請求項８に記載のプローブまたはプライマー。
【請求項１０】
ＰＶ患者またはＰＶもしくはその他のあらゆる骨髄増殖症候群、とりわけ赤血球増加症、白血球増加症、血小板増加症および骨髄線維症を発症する恐れのある患者のサンプルにおいて、ＪＡＫ２遺伝子のＧ１８４９Ｔ変異体の有無を判定するためのエクスビボまたはインビトロでの方法であり、
ａ）患者の核酸サンプルを得ること、
ｂ）前記核酸サンプルにおいてＪＡＫ２遺伝子のＧ１８４９Ｔ変異体の有無を検出すること
を含み、
Ｇ１８４９Ｔ変異体の存在がＰＶまたは他のあらゆる骨髄増殖症候群の指標となることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項８または請求項９に記載の少なくとも一つのプローブとのハイブリダイゼーションの過程を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項８または請求項９に記載の少なくとも一つのプライマー対を用いたＰＣＲ反応による増幅の過程を含むことを特徴とする、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
個体のｍＲＮＡについて実施され、ＲＴ−ＰＣＲ反応を含むことを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１４】
前記プライマーを用いた増幅過程と、それに続く、ハイストリンジェンシーの条件の下でＧ１８４９Ｔ変異領域に対応する配列とハイブリダイズする少なくとも一つのプローブ、好ましくは二つのプローブとのハイブリダイゼーションの過程、そして前記プローブのマーカーが生成するシグナルの検出を含み、プローブとプライマーが請求項８または請求項９で定義されたものであることを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１５】
ＪＡＫ２遺伝子のＧ１８４９Ｔ変異に特異的な一つまたは複数のＳＮＰ（一塩基変異多型）、とりわけＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１７と１８、２３と２４、あるいは、２７と２８を用いて、前記核酸サンプルにおいてＪＡＫ２遺伝子のＧ１８４９Ｔ変異体の有無を検出することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
ＰＶまたは他のあらゆる骨髄増殖症候群に冒された、あるいはこれらを発症する恐れのある患者のサンプルにおいてＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体の有無を検出するためのエクスビボまたはインビトロでの方法であり、
ａ）患者のサンプルを得ること、
ｂ）ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体の有無を検出すること
を含んでおり、
前記変異体の存在がＰＶまたは他のあらゆる骨髄増殖症候群の指標となることを特徴とする方法。
【請求項１７】
サンプルを、ＪＡＫ２タンパク質のＶ６１７Ｆ変異体に特異的な抗体、好ましくはＶ６１７Ｆ変異体と変異していないＪＡＫ２タンパク質を区別する能力を有する抗体と接触させることを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
抗体がモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、一本鎖または二本鎖、キメラ抗体、ヒト化抗体、あるいは抗体に結合する断片である抗体Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ｖ）であることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＥＬＩＳＡ試験であることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
５１％を超えるヘマトクリット値を有する患者の亜集団に対して実施されることを特徴とする、請求項１０〜１９のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２１】
４５００００を超える血小板の割合を有する患者の亜集団に対して実施されることを特徴とする、請求項１０〜１９のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２２】
ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体を特異的に認識するモノクローナル抗体。
【請求項２３】
請求項２２に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項２４】
ＪＡＫ２遺伝子のＧ１８４９Ｔ変異の有無を特異的に検出するための、請求項８または９で定義した一つまたは複数のプライマーあるいはプローブを含む、ガンにおけるＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体を検出するためのキット。
【請求項２５】
患者が真性赤血球増加症またはＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体が関与する他のあらゆる骨髄増殖症候群、とりわけ赤血球増加症、白血球増加症、血小板増加症および骨髄線維症に冒されているかどうか判定するためのキットであり、ＪＡＫ２遺伝子におけるＧ１８４９Ｔ変異の有無を特異的に検出するための、請求項８または９で定義した一つまたは複数のプローブまたはプライマーを含むキット。
【請求項２６】
さらに、ＰＣＲ増幅のための耐熱ポリメラーゼ、増幅および／またはハイブリダイゼーション過程のための一つまたは複数の溶液、ならびに、マーカーの検出を可能にするあらゆる試薬から選択される少なくとも一つの要素を含む、請求項２４または２５に記載のキット。
【請求項２７】
請求項２２に記載の抗体を含む、患者が真性赤血球増加症またはＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体が関与する他のあらゆる骨髄増殖症候群に冒されているかどうかを判定するためのキット。
【請求項２８】
請求項１に記載のＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体の発現を５０％以上あるいは９５％以上減少させる能力を有するｓｉＲＮＡ。
【請求項２９】
１９〜２５個のヌクレオチド、好ましくは１９個のヌクレオチド長を有し、第一の鎖の配列が、ｔ1849変異ヌクレオチドを含む配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ４またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１１に同一であり、第二の鎖の配列がそれらの配列に相補的であることを特徴とする、請求項２８に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項３０】
ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの発現を８０％より多く、あるいは９０％より多く減少させ、野生型ＪＡＫ２の発現を２５％より少なく、あるいは５％より少なく減少させることを特徴とする、請求項２８または２９に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項３１】
−ＵＧＧＡＧＵＡＵＧＵＵＵＣＵＧＵＧＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２９）、
−ＧＧＡＧＵＡＵＧＵＵＵＣＵＧＵＧＧＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ３０）、
−ＧＡＧＵＡＵＧＵＵＵＣＵＧＵＧＧＡＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ３１）、
から構成されるグループから選択されることを特徴とする、請求項２８に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項３２】
一つまたは複数の化合物によるＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆに特異的な阻害を判定することを可能にする方法であり、
ａ）一つまたは複数の化合物を、固定および／または阻害に適した条件下で、請求項１に記載のＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆタンパク質、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを含む膜画分、あるいは、請求項４に記載のＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを発現する細胞と接触させること、および
ｂ）ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの特異的な固定および／または阻害を検出することから成る過程を含む方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の複数の分子に対する一連の試験と、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆに対して１μＭ未満、好ましくは１００ｎＭ未満のＩＣ５０を有する分子を選択する過程とを含むスクリーニング方法。
【請求項３４】
さらに、ＪＡＫ２に対して５μＭ未満あるいは１μＭ未満のＩＣ５０を有する分子の負の選択を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆのリン酸化の阻害を免疫沈降によって判定する、請求項３２〜３４のいずれか一つに記載のインビトロでのスクリーニング方法。
【請求項３６】
エリスロポエチン（Ｅｐｏ）の不在下で分化する能力を有する初代前駆細胞ＣＤ３４＋ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆに対する、あるいは、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体の導入によって独立因子となった細胞系に対する、請求項３２〜３５のいずれか一つに記載のインビボでのスクリーニング方法。
【請求項３７】
請求項４に記載の細胞を用いた、請求項３２〜３６のいずれか一つに記載のインビボでのスクリーニング方法。
【請求項３８】
医薬品の候補を識別するための方法であり、
ａ）真性赤血球増加症を再現している、および／または、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの存在に関連する骨髄増殖症候群に冒されている、請求項５〜７のいずれか一つで定義したＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを発現するヒトではないトランスジェニック動物に、化合物を投与すること、
ｂ）化合物の効果を判定し、真性赤血球増加症の赤芽球の増殖および自然発生的な分化の減少もしくはブロック、またはＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの存在に関連する細胞増殖の減少が観察される医薬品の候補を選択すること
からなる過程を含む方法。
【請求項３９】
医薬品製造のための、請求項２８〜３１のいずれか一つに記載のｓｉＲＮＡの利用方法。
【請求項４０】
悪性血液疾患、特に、真性赤血球増加症、本態性血小板増加症、骨髄性脾腫あるいは原発性骨髄線維症を含む骨髄増殖症候群の治療を目的とする医薬品を調製するための、請求項３９に記載の利用方法。
【請求項４１】
ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異に関連する骨髄増殖症候群、その他の悪性血液疾患、およびＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを発現する癌腫、黒色腫および神経芽腫のような充実性腫瘍の治療を目的とする医薬品を調製するための、請求項３９に記載の利用方法。
【請求項４２】
請求項２８〜３１のいずれか一つに記載のｓｉＲＮＡと薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物。
【請求項１】
以下で「ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体」と称する、６１７番アミノ酸に変異を含む、より特徴的にはＶ６１７Ｆ変異を含むことを特徴とする、単離されたＪＡＫ２（Ｊａｎｕｓキナーゼ２）タンパク質であり、該タンパク質の配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１で表されるか、またはその他の哺乳動物における類似配列であるタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体をコードするヌクレオチド配列であり、とりわけ、転写開始を示すＡＴＧから数えて１８４９位でｔ／ｇ変異を有する配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２。
【請求項３】
ウイルス、プラスミド、または裸ＤＮＡ型のクローニングベクターおよび／または発現ベクターであり、哺乳動物の細胞で有効なプロモータの制御下で請求項２に記載の配列を含むことを特徴とするベクター。
【請求項４】
請求項１に記載の組換えＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体を発現する哺乳動物の細胞。
【請求項５】
請求項１に記載の組換えＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを発現する、ヒトではないトランスジェニック動物。
【請求項６】
相同組換えまたは部位特異的組換えにより、ゲノム中に少なくともＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆをコードする配列を組み込んだマウスまたはラットであることを特徴とする、請求項５に記載のヒトではないトランスジェニック動物。
【請求項７】
ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ／ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆホモ接合体またはＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ／ＪＡＫ２ヘテロ接合体であり、真性赤血球増加症および／またはＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆによって誘発される骨髄増殖症候群を再現することを特徴とする、請求項５または請求項６に記載のヒトではないトランスジェニック動物。
【請求項８】
配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ３または４の連続する１０〜３０個のヌクレオチドを含み、変異ヌクレオチドｔ1849を含むプローブまたはプライマー。
【請求項９】
配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ５〜１１および１５〜２８から選択される、請求項８に記載のプローブまたはプライマー。
【請求項１０】
ＰＶ患者またはＰＶもしくはその他のあらゆる骨髄増殖症候群、とりわけ赤血球増加症、白血球増加症、血小板増加症および骨髄線維症を発症する恐れのある患者のサンプルにおいて、ＪＡＫ２遺伝子のＧ１８４９Ｔ変異体の有無を判定するためのエクスビボまたはインビトロでの方法であり、
ａ）患者の核酸サンプルを得ること、
ｂ）前記核酸サンプルにおいてＪＡＫ２遺伝子のＧ１８４９Ｔ変異体の有無を検出すること
を含み、
Ｇ１８４９Ｔ変異体の存在がＰＶまたは他のあらゆる骨髄増殖症候群の指標となることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項８または請求項９に記載の少なくとも一つのプローブとのハイブリダイゼーションの過程を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項８または請求項９に記載の少なくとも一つのプライマー対を用いたＰＣＲ反応による増幅の過程を含むことを特徴とする、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
個体のｍＲＮＡについて実施され、ＲＴ−ＰＣＲ反応を含むことを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１４】
前記プライマーを用いた増幅過程と、それに続く、ハイストリンジェンシーの条件の下でＧ１８４９Ｔ変異領域に対応する配列とハイブリダイズする少なくとも一つのプローブ、好ましくは二つのプローブとのハイブリダイゼーションの過程、そして前記プローブのマーカーが生成するシグナルの検出を含み、プローブとプライマーが請求項８または請求項９で定義されたものであることを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１５】
ＪＡＫ２遺伝子のＧ１８４９Ｔ変異に特異的な一つまたは複数のＳＮＰ（一塩基変異多型）、とりわけＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１７と１８、２３と２４、あるいは、２７と２８を用いて、前記核酸サンプルにおいてＪＡＫ２遺伝子のＧ１８４９Ｔ変異体の有無を検出することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
ＰＶまたは他のあらゆる骨髄増殖症候群に冒された、あるいはこれらを発症する恐れのある患者のサンプルにおいてＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体の有無を検出するためのエクスビボまたはインビトロでの方法であり、
ａ）患者のサンプルを得ること、
ｂ）ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体の有無を検出すること
を含んでおり、
前記変異体の存在がＰＶまたは他のあらゆる骨髄増殖症候群の指標となることを特徴とする方法。
【請求項１７】
サンプルを、ＪＡＫ２タンパク質のＶ６１７Ｆ変異体に特異的な抗体、好ましくはＶ６１７Ｆ変異体と変異していないＪＡＫ２タンパク質を区別する能力を有する抗体と接触させることを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
抗体がモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、一本鎖または二本鎖、キメラ抗体、ヒト化抗体、あるいは抗体に結合する断片である抗体Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ｖ）であることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＥＬＩＳＡ試験であることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
５１％を超えるヘマトクリット値を有する患者の亜集団に対して実施されることを特徴とする、請求項１０〜１９のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２１】
４５００００を超える血小板の割合を有する患者の亜集団に対して実施されることを特徴とする、請求項１０〜１９のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２２】
ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体を特異的に認識するモノクローナル抗体。
【請求項２３】
請求項２２に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項２４】
ＪＡＫ２遺伝子のＧ１８４９Ｔ変異の有無を特異的に検出するための、請求項８または９で定義した一つまたは複数のプライマーあるいはプローブを含む、ガンにおけるＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体を検出するためのキット。
【請求項２５】
患者が真性赤血球増加症またはＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体が関与する他のあらゆる骨髄増殖症候群、とりわけ赤血球増加症、白血球増加症、血小板増加症および骨髄線維症に冒されているかどうか判定するためのキットであり、ＪＡＫ２遺伝子におけるＧ１８４９Ｔ変異の有無を特異的に検出するための、請求項８または９で定義した一つまたは複数のプローブまたはプライマーを含むキット。
【請求項２６】
さらに、ＰＣＲ増幅のための耐熱ポリメラーゼ、増幅および／またはハイブリダイゼーション過程のための一つまたは複数の溶液、ならびに、マーカーの検出を可能にするあらゆる試薬から選択される少なくとも一つの要素を含む、請求項２４または２５に記載のキット。
【請求項２７】
請求項２２に記載の抗体を含む、患者が真性赤血球増加症またはＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体が関与する他のあらゆる骨髄増殖症候群に冒されているかどうかを判定するためのキット。
【請求項２８】
請求項１に記載のＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体の発現を５０％以上あるいは９５％以上減少させる能力を有するｓｉＲＮＡ。
【請求項２９】
１９〜２５個のヌクレオチド、好ましくは１９個のヌクレオチド長を有し、第一の鎖の配列が、ｔ1849変異ヌクレオチドを含む配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ４またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１１に同一であり、第二の鎖の配列がそれらの配列に相補的であることを特徴とする、請求項２８に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項３０】
ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの発現を８０％より多く、あるいは９０％より多く減少させ、野生型ＪＡＫ２の発現を２５％より少なく、あるいは５％より少なく減少させることを特徴とする、請求項２８または２９に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項３１】
−ＵＧＧＡＧＵＡＵＧＵＵＵＣＵＧＵＧＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２９）、
−ＧＧＡＧＵＡＵＧＵＵＵＣＵＧＵＧＧＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ３０）、
−ＧＡＧＵＡＵＧＵＵＵＣＵＧＵＧＧＡＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ３１）、
から構成されるグループから選択されることを特徴とする、請求項２８に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項３２】
一つまたは複数の化合物によるＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆに特異的な阻害を判定することを可能にする方法であり、
ａ）一つまたは複数の化合物を、固定および／または阻害に適した条件下で、請求項１に記載のＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆタンパク質、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを含む膜画分、あるいは、請求項４に記載のＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを発現する細胞と接触させること、および
ｂ）ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの特異的な固定および／または阻害を検出することから成る過程を含む方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の複数の分子に対する一連の試験と、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆに対して１μＭ未満、好ましくは１００ｎＭ未満のＩＣ５０を有する分子を選択する過程とを含むスクリーニング方法。
【請求項３４】
さらに、ＪＡＫ２に対して５μＭ未満あるいは１μＭ未満のＩＣ５０を有する分子の負の選択を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆのリン酸化の阻害を免疫沈降によって判定する、請求項３２〜３４のいずれか一つに記載のインビトロでのスクリーニング方法。
【請求項３６】
エリスロポエチン（Ｅｐｏ）の不在下で分化する能力を有する初代前駆細胞ＣＤ３４＋ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆに対する、あるいは、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異体の導入によって独立因子となった細胞系に対する、請求項３２〜３５のいずれか一つに記載のインビボでのスクリーニング方法。
【請求項３７】
請求項４に記載の細胞を用いた、請求項３２〜３６のいずれか一つに記載のインビボでのスクリーニング方法。
【請求項３８】
医薬品の候補を識別するための方法であり、
ａ）真性赤血球増加症を再現している、および／または、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの存在に関連する骨髄増殖症候群に冒されている、請求項５〜７のいずれか一つで定義したＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを発現するヒトではないトランスジェニック動物に、化合物を投与すること、
ｂ）化合物の効果を判定し、真性赤血球増加症の赤芽球の増殖および自然発生的な分化の減少もしくはブロック、またはＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆの存在に関連する細胞増殖の減少が観察される医薬品の候補を選択すること
からなる過程を含む方法。
【請求項３９】
医薬品製造のための、請求項２８〜３１のいずれか一つに記載のｓｉＲＮＡの利用方法。
【請求項４０】
悪性血液疾患、特に、真性赤血球増加症、本態性血小板増加症、骨髄性脾腫あるいは原発性骨髄線維症を含む骨髄増殖症候群の治療を目的とする医薬品を調製するための、請求項３９に記載の利用方法。
【請求項４１】
ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ変異に関連する骨髄増殖症候群、その他の悪性血液疾患、およびＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆを発現する癌腫、黒色腫および神経芽腫のような充実性腫瘍の治療を目的とする医薬品を調製するための、請求項３９に記載の利用方法。
【請求項４２】
請求項２８〜３１のいずれか一つに記載のｓｉＲＮＡと薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００８−５１７６１３（Ｐ２００８−５１７６１３Ａ）
【公表日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３８４２１（Ｐ２００７−５３８４２１）
【出願日】平成１７年１０月２６日（２００５．１０．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０５５５８６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４５８２７
【国際公開日】平成１８年５月４日（２００６．５．４）
【出願人】（５０７１３９８３４）
【出願人】（５０７１３８９３０）アンスティテュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル（インセルム） (4)
【出願人】（５０７１３８９４１）
【出願人】（５０７１３８９５２）ユニヴェルシテ ドゥ ヴェルサイユ−サン クァンタン アン イヴェリーヌ (2)
【出願人】（５０７１３９８４５）ユニヴェルシテ パリ−シュド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月２６日（２００５．１０．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０５５５８６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４５８２７
【国際公開日】平成１８年５月４日（２００６．５．４）
【出願人】（５０７１３９８３４）
【出願人】（５０７１３８９３０）アンスティテュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル（インセルム） (4)
【出願人】（５０７１３８９４１）
【出願人】（５０７１３８９５２）ユニヴェルシテ ドゥ ヴェルサイユ−サン クァンタン アン イヴェリーヌ (2)
【出願人】（５０７１３９８４５）ユニヴェルシテ パリ−シュド (2)
【Ｆターム（参考）】
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