短鎖干渉ＲＮＡライブラリーならびに合成および使用の方法
一面において、本発明は、ランダムまたは半ランダムのsiRNA(コード)ライブラリーを提供する。本発明の別の一面は、ランダムまたは半ランダムのsiRNA(コード)ライブラリーの構築のための方法に関する。本発明の別の一面は、siRNAライブラリーを構築する際に使用するためおよび/または構成的および誘導性の様式の両方で単一のsiRNAおよびsiRNAライブラリーを発現し得るベクター系である。別の態様において、本発明は、siRNAライブラリーを使用する方法を提供する。このsiRNAライブラリーは細胞の集団中に導入される。次いで、この細胞の集団は選択プロセスに供されて、集団の残部とは異なる挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な特性を示す細胞の部分集団が選択される。この選択プロセスの後、この細胞の部分集団は、所望に応じて単離、分析および/またはクローニングされ得る。この部分集団のこのような分析は、集団の残部と比較して異なるこの部分集団の特性を担うsiRNA種の同定および配列決定であり得る。あるいは、この部分集団は、ゲノミクスアッセイ、プロテオミクスアッセイおよび/またはセロミクスアッセイによってさらに分析され得る。このようなゲノミクスアッセイ、プロテオミクスアッセイおよび/またはセロミクスアッセイが使用される場合、この方法は、いくつかの有用なバイオインフォマティクス産物を生成し得る。このプロセスを介して同定された特異的siRNAは、直接的な治療的価値を有し得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(関連出願の相互参照)
本出願は、米国仮特許出願60/469,169号(2003年5月9日出願)の優先権を主張し、その全体が本明細書中に参照することによって組み込まれる。
【０００２】
(発明の分野)
本発明は、短鎖干渉RNA(siRNA)ライブラリー、特にランダムまたは半ランダムのsiRNAライブラリー、このようなライブラリーを調製するための方法およびこのようなライブラリーを使用するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
(発明の背景)
短鎖干渉RNA(siRNA)は、一致する配列を含む細胞内の任意のRNAを特異的に破壊する二本鎖RNAである。この様式において、siRNAは、RNA干渉(RNAi)として公知の現象を介した、種々の遺伝子(癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子を含む)の有効なサプレッサーである。RNA干渉は、二本鎖RNAを利用する細胞系を介して遺伝子発現を破壊する。この現象の認識は、Caenorhabditis elegansにおいて最初に同定された(例えば、Fire et al., Nature 391, 806-811(1998)を参照のこと)。より最近、2ヌクレオチドの3’オーバーハングを有する21ヌクレオチドまたは22ヌクレオチドの二本鎖RNAが、哺乳動物細胞においてRNAi活性を示すことが報告されている(例えば、Elbashir et al., Nature 411, 494-98 (2001)およびCaplen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 9742-47 (2001)を参照のこと)。Miyagishi et al.は、短いDNA配列のセンスバージョンまたはアンチセンスバージョンのいずれかの転写を別々に駆動する２つのU6 RNAポリメラーゼIIIプロモーターを使用したsiRNA発現ベクターの構築を記載した。転写後、siRNAは、RNA転写物のセンス鎖とアンチセンス鎖との間での二重鎖形成から誘導された(Miyagishi et al., Nature Biotech. 19,497-500 (2002) を参照のこと)。Brummelkamp et al.は、同じ19ヌクレオチドの遺伝子特異的挿入物のアンチセンス配列から短いスペーサー配列によって分離された19ヌクレオチドの遺伝子特異的挿入物(センス)に連結されたポリメラーゼ-III H1-RNA遺伝子プロモーターを使用して哺乳動物発現ベクターを構築した。得られたRNAの相補的性質により、これらの転写物は19塩基対のステム-ループ構造を形成した(Brummelkamp et al., Science,296, 550-553(2002)を参照のこと)。
【０００４】
RNAiは、機能ゲノミクスのための強力なツールとして働き得るであろう。例えば、Kamath et al.は、C. elegansにおける遺伝子の表現型同定を試みるための干渉RNA系を記載した(Kamath et al., Nature 421,231-237 (2003)を参照のこと)。彼らの特定のアプローチは、数百塩基対長の二本鎖RNA配列を使用した。しかし、このアプローチは、高等生物(例えば、哺乳動物の系(ここでは、二本鎖RNAが30塩基対長を超えると、ｍRNAおよびタンパク質の翻訳を非特異的に阻害するインターフェロン経路を介した宿主の防御応答が誘導される))における適用には適切でないだろう。Kamath et al.によって記載された系は、実質的により長い二本鎖RNAを使用したので、哺乳動物細胞における使用には適切でないだろう。さらに、Kamath et al.の系は、ヌクレオチドのランダムな組み合わせからは生成されず、従って、機能ゲノミクス適用のために広く適用可能であるわけではないだろう。
【０００５】
高等生物の機能ゲノミクスのために、12〜25ヌクレオチド長の短い二本鎖RNAのセットが有用であろう。この長さの二本鎖RNAは宿主防御応答を誘導しない。最適には、機能ゲノミクスは、生物の全ての遺伝子が少なくとも１つのsiRNAによって統計的に示されるように、各々がユニークな配列を有するsiRNAの大きいセットを必要とする。このような「siRNAライブラリー」(すなわち、siRNAのランダムまたは半ランダムなセットを含む)は、高等生物(例えば哺乳動物細胞)において生じた表現型を担う特定の遺伝子またはウイルスの同定を容易にし得るだろう。
【０００６】
創薬および疾患の緩和のためのsiRNAライブラリーの望ましさは、ライブラリー構築への２つの最近のアプローチを促進した。第１の「ブルートフォース(brute force)」アプローチは、伝統的な方法を使用して、１度に１つの遺伝子に対して指向されるsiRNA配列を生成させ、これらをプールしてsiRNAライブラリーを形成する(Boutros, M, et al, Science, 303 (5659): 832-35. (2004)、Paddison, PJ et al, Nature; 428 (6981) : 427-31 (2004) )。第２のアプローチは、酵素Mme1を使用してcDNAをsiRNAのための20bpのテンプレートへと消化することによって、プールされたcDNAからsiRNAライブラリーを誘導する(Sen et al., Nat Genet. ; 36 (2): 183-89 (2004); Shirane et al., Nat Genet. ; 36 (2): 190-96 (2004))。
【０００７】
siRNAライブラリーを生成する「ブルートフォース」法は多数の制限を有する。このアプローチに関与する作業量は膨大であり、このようなライブラリーは数種の生物について報告されているにすぎない。さらに、「ブルートフォース」ライブラリーおよびcDNA由来ライブラリーの両方において、いくつかの理由のために多数の欠如が予測される。第１に、このようなライブラリーはコードRNAのみを減弱させる。これらのアプローチにおいて使用されるコードRNAは、ゲノムの約4%を構成することに留意すべきである。非コードRNAは、経路の調節およびタンパク質の封鎖(sequestration)を含む、細胞における重要な機能的役割を果たすことがますます認識されている。例えば、非コードRNAであるSCA8は、神経変性を引き起こすことが示されている(Mutsuddi, M. et. al., Curr. Biol., 14, 302-08 (2004) )。全ての機能的非コードRNAは、指向された(「ブルートストレングス(brute-strength)」)ライブラリーおよびcDNAから誘導されたライブラリーの両方において欠如するであろう。第２に、siRNAは、ゲノムDNAの特定の領域のヘテロクロマチン形成を誘発し得、プロモーターのサイレンシングおよびおそらく他の効果を生じる(Volpe et al. Science; 297 (5588):1833-37 (2002))。非常に永続性があり得るであろう、いかなるこのようなゲノム効果も、指向された(「ブルートストレングス」)ライブラリーおよびcDNAから誘導されたライブラリーの両方において欠如するであろう。第３に、指向された(「ブルートストレングス」)ライブラリーおよびcDNAから誘導されたライブラリーは、これらのライブラリーがそれ用に設計された組織および生物以外の組織および生物の遺伝子を減弱させるのに充分適しているわけではない。従って例えば、このようなライブラリーは、新生および未知のウイルスの遺伝子を減弱させる際にはほとんど役に立たないだろう。第４に、siRNAライブラリーを生成するためのブルートフォースクローニングのさらなる制約は、このアプローチが、75%を超えて抑制性の配列を収集する可能性があることである。タンパク質が50%減弱されるといくつかの表現型がシフトし、このタンパク質がいっそうひどく抑制されると再度シフトする(例えば、Muraoka RS Mol Cell Biol. 2002 Apr; 22 (7): 2204-19を参照のこと)。これらのアプローチの第５の制約は、どれもそれほど効率的でないことである。例えば、ブルートフォースアプローチは、非常に時間がかかり、スプライスバリアントに関して欠陥を含む。重要な生理学的遺伝子(例えば、p53、p73、サイクリン)は、その機能において変動する多数のスプライス形態で発現される。いくつかのスプライス形態は、互いに反対の効果を有する。遺伝子の全てのスプライスバリアントを標的化する干渉RNAは、ポジティブに作用するスプライス形態およびネガティブに作用するスプライス形態の両方を減少させる場合には大きな影響を有さない可能性がある。cDNAベースのライブラリーに対する第６の主要な欠点は、これらのライブラリーが一般的なメッセージに対して指向されたsiRNAまたはshRNAの大量の過剰提示を含み、その一方で最も興味を持たれる標的遺伝子(例えば、転写レギュレーター、ホスファターゼ)の多くが低レベルで発現されることである。
【０００８】
指向された「ブルートストレングス」ライブラリーおよびcDNAベースのライブラリーの制約の各々は、ランダムsiRNA配列からなるライブラリーによって対処することが可能であろう。しかし、ランダムsiRNAの合成は充分確立されておらず、ランダムsiRNAライブラリーの構築はこれまで実証されていない。siRNAライブラリーの生成を挫折させているのは、未知の配列を有するランダムDNAオリゴマーをそれらの正確な相補配列に結合させること（ここで、このような構築物の生成は、所望の長さのオリゴマー中のヌクレオチドの全ての組み合わせをカバーするのに充分である。テンプレートDNAオリゴマーからの二本鎖RNA二重鎖の形成が必要であることは、克服すべきさらなるハードルである）の困難さである。
【０００９】
Miyagashi et al. (Nature Biotech., 19, 497-500 (2002) )は、対向するU6プロモーター系が、ランダム化されたsiRNAライブラリーの生成を可能にし得ることを推測した。しかし、このMiyagashiの報告は、このようなライブラリーの構築を全く開示しておらず、さらなる技術的特徴を開示することもこのようなライブラリーの構築に関する指示を提供することも全くしていない。
【００１０】
米国特許出願公開20040005593(Lorens)は、干渉RNA分子のランダムライブラリーが、制限部位、ランダム化されたsiRNA配列、相補性領域の配列およびヘアピン形成リンカー配列(任意選択で、Uターンモチーフ、リボザイムおよび/またはヘアピン構造もしくはステム-ループ構造を形成する２つの相補的配列)を含むオリゴヌクレオチドのプールを合成することによって構築され得ることを推測している。公開されたLorensの出願によれば、これらのオリゴヌクレオチドはヘアピン構造をとり、このヘアピン構造は、DNAポリメラーゼの基質として機能し、ランダム化されたsiRNA配列の相補配列の合成を促進するのだろう。公開されたLorensの出願によれば、このヘアピン構造は次いで変性され、3’末端でプライマーとハイブリダイズして、DNAポリメラーゼによる二本鎖DNAへの総配列の転換を可能にする。次いで、siRNA配列のランダムな取り合わせをおそらくコードする二本鎖オリゴヌクレオチドがレトロウイルスベクター中にクローニングされて、siRNA発現ベクターライブラリーを生成する。しかし、公開されたLorensの出願は、ランダムsiRNAライブラリーの構築を全く開示していない。さらに、Lorensによって提唱されたアプローチはランダムライブラリーを生じないであろう。Lorensのアプローチの首尾よい適用のための技術的ハードルは、このヘアピン構造がそれ自体に対する高い相同性を有し、自己アニーリングする傾向があることである。従って、相補鎖プライミングを促進するためには、テンプレートよりも大過剰の量のプライマーを使用する必要があろうが、これはLorensによって教示されていない。ヘアピン構造の高い自己相同性の別の結果は、Lorensによって開示されたアプローチに従うなら、自己アニーリングが実際には非ランダムライブラリーを導くことである。ヘアピン構造の自己アニーリングは相補鎖の重合を妨げるだろう。このような重合が自己アニーリングを防止する条件下で生じない限り、GC含量に富んだ領域はAT含量に富んだ領域よりも自己アニーリングする可能性が高く、従って、GCリッチな配列がこのプロセスにおいて意に反して選択されるだろう。Lorensは、重合の前のヘアピンの変性(これは、プライマーの結合を可能にする任意の事象において必要である)を要する。しかし、Lorensは、この重合がヘアピン構造の変性を維持する条件下で生じることを具体的に述べていない。従って、Lorensのアプローチによって生成されたライブラリーにおける配列の配分は、GCリッチではない配列と比較して、GCリッチな配列に関して非ランダムであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
既存の技術に関する欠陥を考慮すると、ランダムsiRNAライブラリー(siRNAコードライブラリーおよびshRNAコードライブラリーを含む)を生成し得る新たな合成方法が必要とされる。このような方法および得られたライブラリーは、多くの仕事(例えば、目的の遺伝子の同定、遺伝子機能の分析および治療的に有用なsiRNA配列の同定)を容易にするであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
(発明の簡単な要旨)
一面において、本発明は、ランダムsiRNA(コード)ライブラリーを提供する。本発明の別の一面は、siRNAライブラリーの構築のための方法である。この方法は、適切な宿主細胞においてこのランダム配列の逆方向反復[センス-アンチセンス]を生成するための部位特異的リコンビナーゼ部位を含むベクター中にクローニングされ、次いで、それらがアニーリングすると相補的なステム-ループRNAを生成するように、RNAポリメラーゼプロモーターを有する発現ベクター中にクローニングされ得る、ランダムオリゴデオキシリボヌクレオチドの集団を生成することを含む。このランダムヘアピン[センス-アンチセンス]配列は、ベクター中に単独でクローニングされ得るか、複数の直列の挿入物としてクローニングされ得るかのいずれかである。あるいは、このランダム配列は、ステム-ループを生成する自己プライミングポリメラーゼ反応のためにアニーリングするように操作され、その後発現ベクター中にクローニングされ得る。別の一面において、siRNAライブラリーは、cDNAライブラリーを消化して、これらの消化物が２つの対向するRNAポリメラーゼプロモーターに挟まれるようにこれらの消化物をプラスミド中にクローニングすること、または２つのRNAポリメラーゼプロモーター間にランダムオリゴヌクレオチドライブラリーをクローニングすることのいずれかによって、生成され得る。
【００１３】
別の一面において、本発明は、例えば目的の表現型を媒介する候補遺伝子を同定するためにsiRNAライブラリーを使用する方法を提供する。このsiRNAライブラリーは細胞の集団中に導入される。次いで、この細胞の集団は、集団の残部とは異なる挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な特性を示す細胞の部分集団を選択するために選択プロセスに供される。選択プロセスの後、細胞の部分集団(すなわちサブセット)は、所望に応じて単離、分析および/またはクローニングされ得る。部分集団のこのような分析は、集団の残部と比較して異なるこの部分集団の特性を担うsiRNA種の同定であり得る。あるいは、この部分集団は、ゲノミクスアッセイ、プロテオミクスアッセイおよび/またはセロミクスアッセイによってさらに分析され得る。このようなゲノミクスアッセイ、プロテオミクスアッセイおよび/またはセロミクスアッセイが使用される場合、この方法は、いくつかの有用なバイオインフォマティクス産物を生成し得る。
【００１４】
本発明によって記載されるsiRNAライブラリーは、癌、細胞分化、ウイルス感染、細菌病原性、代謝経路、シグナル伝達経路、溶解経路(lytic pathway)に関与する重要な遺伝子の迅速な機能的同定ならびに表現型分析に依存する他の研究分野において有用である。このプロセスを介して同定された特異的siRNAは、直接的な治療的価値を有し得る。
【００１５】
本発明の別の一面は、siRNAライブラリーを構築するのに使用するための、かつ/または構成的および誘導性様式の両方で単一のsiRNAおよびsiRNAライブラリーを発現し得るベクター系である。
【００１６】
本発明のこれらの面および利点ならびにさらなる発明的特徴は、添付の図面からおよび以下の詳細な説明を読んだ際にさらに明らかとなろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
(発明の詳細な説明)
本発明の文脈において、「siRNA」(短鎖干渉RNA)は、二本鎖構造を有するRNAの１種であり、その各々の鎖は、約12ヌクレオチド長と約35ヌクレオチド長との間である。siRNAは、相補的塩基対合を介してのみ結合する２つの別個の鎖を含み得るか、またはsiRNAは、センス鎖とアンチセンス鎖との間にループを有する一本鎖であり得るかのいずれかである。これらは一緒に折り畳まって、細胞内でプロセシングされて純粋に二本鎖のsiRNAを作る、ヘアピンループまたは短鎖ヘアピンRNA(shRNA)を作る。
【００１８】
本発明の一面は、ランダムまたは半ランダムのsiRNAライブラリーである。この文脈において、「siRNAライブラリー」は、siRNAもしくはshRNAを含むかまたはこれらをコードする別個の配列の収集である。従って、このライブラリーは、DNAまたはRNAのいずれかを含み得る。DNAを含むsiRNAライブラリーの例は、siRNAまたはshRNAをコードする別個の配列を含むDNAベースの発現ベクター(例えば、プラスミド、ウイルスなど)のライブラリーである。これらのDNAベクターは、ベクター内のDNA配列を転写するのに適切な環境(例えば、細胞系もしくは細菌系、または適切なin vitro転写環境)中に導入されると、siRNAまたはshRNAを産生する。次に、細胞内で、各shRNAはsiRNAへとプロセシングされる。DNAを含むsiRNAライブラリーの別の例は、shRNAをコードする別個の配列を含むDNAベースの発現ベクターを含む細胞の集団である。RNAを含むsiRNAライブラリーの例は、別個のsiRNA種またはshRNA種の収集である。
【００１９】
本発明のライブラリーは、ランダム配列もしくは半ランダム配列(または留意されるように、このような配列をコードするDNA)を有するsiRNAまたはshRNAの収集である。このライブラリーは半ランダムであり得るが、真にランダムなsiRNAライブラリーまたはshRNAライブラリーが最も望ましい。なぜなら、このようなライブラリーは、等しい割合で全ての可能な配列を含み得るからである。また、高等生物の細胞(または高等生物に由来する細胞株)におけるゲノミクス試薬としての使用のために、このライブラリー内のRNAは細胞の宿主防御系を回避するのに充分短いことが非常に望ましいが、このsiRNAは、センス-ループ-アンチセンス構造を形成し、細胞内で相補的RNA種に対する活性を有するのに充分長くなければならない。従って好ましくは、このライブラリー内のsiRNAまたはshRNAは、約10より長い、例えば約12ヌクレオチドと35ヌクレオチドとの間、または約15ヌクレオチドと約30ヌクレオチドとの間、より典型的には約17ヌクレオチドと約23ヌクレオチドとの間のランダムセンス配列を有し、19merまたは20merの配列が最も典型的である。
【００２０】
ランダムなsiRNAライブラリーまたはshRNAライブラリーは、高発現した標的(例えばアクチン)を減弱させる確率と実質的に等しい確率で低発現した標的または稀にしか発現しない標的を減弱するために使用され得る。ランダムライブラリーは、表現型によって選択可能な等級付けされた応答を生じるために、siRNAもしくはshRNAを含むかまたはこれらをコードする。ランダムなsiRNAライブラリーまたはshRNAライブラリーは、スプライス形態特異的RNAi配列、ならびにゲノムDNA配列(例えば、コードDNAおよび非コードDNAの両方)を標的化し得る配列を含む。真にランダムなライブラリーは、未知の配列(例えば新生の疾患、未知のウイルスまたは人工変異体において見出される配列)に対して指向されるsiRNAコード配列またはshRNAコード配列を含む。従って、本発明のランダムまたは半ランダムのsiRNAライブラリーまたはshRNAライブラリーは、健康および安全性に対するこのような潜在的脅威中の配列の発現を調節するために特に有用である。ランダムライブラリーの完全性はまた、多様な組織、種および遺伝子バリアントの設定におけるその使用を促進する。
【００２１】
ランダムまたは半ランダムのsiRNAライブラリーまたはshRNAライブラリーは、任意の適切な方法に従って作製され得る。しかし、本発明の別の一面は、siRNAライブラリーまたはshRNAライブラリーを調製するための方法を提供する。
【００２２】
本発明の方法の１実施形態によれば、少なくともそれらの配列の一部分として上記のランダムヌクレオチドまたは半ランダムヌクレオチドを有するオリゴデオキシリボヌクレオチド(オリゴDNA)の集団が最初に合成される。任意の適切な方法(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、RNAライブラリーの逆転写、生物からのDNAフラグメントの単離、ヌクレオチド重合の任意の他の手段)が、オリゴDNAの集団を生成するために使用され得る。しかし、好ましい方法は、標準的なオリゴDNA合成機構を使用することを含み、この機構は、合成の間に４種のヌクレオチドの推計学的にランダムな混合物を使用することによってランダム配列または半ランダム配列の集団を産生し得る。
【００２３】
オリゴDNAの開始集団はランダム配列または半ランダム配列を含むが、この開始オリゴDNAの全体がランダムまたは半ランダムである必要はない。実際、１つの好ましい実施形態において、このランダム配列または半ランダム配列は、予め選択された5’制限酵素部位および3’制限酵素部位に挟まれている。この実施形態において、このランダム配列または半ランダム配列に隣接する制限酵素部位は同じでも異なってもよいが、クローニング後の構築物の操作を容易にするために、この3’制限部位は5’制限部位とは異なることが好ましい。また、このような制限酵素認識部位は、少なくとも6ヌクレオチド、より好ましくは8ヌクレオチドを含むことが好ましい。なぜなら、これにより、クローニングの間の引き続く制限消化の後にランダムオリゴDNAまたは半ランダムオリゴDNAが失われる可能性が低くなるからである。さらに、この制限部位は、消化後に粘着性であって平滑末端を生じないことが好ましい。なぜなら、これにより、クローニングの間の相補的末端の容易なライゲーションが促進されるからである。オリゴDNAの3’末端および5’末端中に操作するための好ましい制限部位には、AscI、FseI、BglII、BstEII、PstI、NotIおよびEagIが含まれるが、当業者は、他の部位が適切に使用され得ることを理解するだろう。
【００２４】
ランダム配列または半ランダム配列に隣接する5’制限部位および3’制限部位を含むように操作されたオリゴDNAのこのような集団は、成熟したセンス-スペーサー-アンチセンス配列を構築するために適切なベクター中にクローニングされ得る。通常、ベクター中への挿入の前に、一本鎖オリゴDNAの集団がプライミングされる。これらのオリゴDNAには制限部位が隣接し、プライミング配列がその後に続く。好ましくは、このランダム配列は、約15ヌクレオチドと約30ヌクレオチドとの間、最も好ましくは約20ヌクレオチドである。このプライミング配列は、好ましくは少なくとも約5ヌクレオチドである。相補鎖は標準的な方法論によって合成される。
【００２５】
好ましい実施形態において、これらのオリゴDNAは、部位特異的リコンビナーゼに対する２つのリコンビナーゼ結合部位を有するプラスミド中にクローニングされ得、このプラスミドにおいて、各リコンビナーゼ結合部位内の中心のスペーサー配列は、他方の部位に対して反対方向である。このようなリコンビナーゼ部位は、例えば、２つのFRT(これらはFLPリコンビナーゼによって認識される)または２つのloxP部位(これらはcreリコンビナーゼによって認識される)あるいは任意の他の適切なリコンビナーゼおよびその認識配列であり得、そのうちいくつかは当該分野で公知である(Sadowski, PD. 1995, Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 51: 53-91)。これらのオリゴDNAは、２つのこのような反対方向のリコンビナーゼ部位間でプラスミド系中にクローニングされる。なぜなら、このような方向は、これらの部位間に配列の逆方向反復を生成することによってセンス-スペーサー-アンチセンス構築物を生成するために必要とされるからである。より好ましくは、これらのオリゴDNAは、オリゴDNA内の制限部位が２つのリコンビナーゼ認識配列間ではあるがそのうち一方の近傍にあるようにこのようなプラスミド中に導入され、その結果、このオリゴDNAはFRT間に非対称的に配置される[例えば、90%：10%][方法１Ａ-図１Ａ〜１Ｃを参照のこと]。
【００２６】
二重リコンビナーゼ部位-オリゴDNAカセットを含むこのようなプラスミドが生成された後に、プラスミドの集団は、プラスミド中に存在する特定のリコンビナーゼ認識部位に適切なリコンビナーゼ酵素を産生する宿主細胞の集団中に導入される。望ましくは、このような宿主細胞は細菌であるが、培養物中で容易に増殖する他の細胞(例えば、酵母、形質転換細胞株など)であり得る。さらに、この宿主細胞集団はリコンビナーゼ酵素を発現することが望ましく、１つのアプローチにおいて、この宿主細胞集団は所望のリコンビナーゼ酵素を誘導可能に発現する。好ましい実施形態において、このオリゴDNAのために使用されるプラスミドはまた、細菌[例えば、E. coli]においてリコンビナーゼ(例えばFLP)を誘導可能に発現するように操作される。このプラスミドは、構成的または誘導性のいずれかの様式でリコンビナーゼを発現し得、宿主細胞が適切なリコンビナーゼ酵素をコードする必要性をなくす。このプラスミド構築物による宿主細胞の形質転換は、当該分野で公知の任意の適切な様式(例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介性の方法、DEAE-デキストラン媒介性の方法、塩化カルシウム媒介性の方法、Hanahan法、Inoue法、化学的処理媒介性の方法および当該分野で公知の他の技術)によって達成され得る。しかし、１つより多くのプラスミドが単一の宿主細胞に入る可能性を低下させる比率でこれらのプラスミドを宿主細胞中にトランスフェクトすることが望ましい。好ましくは、このプラスミド構築物は、約1:1(プラスミド:細胞)の比率で宿主細胞中に形質転換される。
【００２７】
平均的な哺乳動物の遺伝子は約2400nt長であるので、ライブラリー全体は、所定の遺伝子を標的化する縮重配列を含み得る(例えば、ライブラリー全体は、約2400の重複する部位で各遺伝子を標的化する)。siRNA末端によって標的化されるメッセンジャーRNA配列中の１番目または２番目のヌクレオチドにおいてアデニンが好まれるので、ランダムsiRNA配列の２分の１が最適に標的化されると概算される。siRNA配列の４分の１が非常に有効であると概算されている。従って、いくつかの実施形態において、約5×109の細菌形質転換(現在の細菌コンピテンシーレベル内に充分入る)が、全ての遺伝子に対して有効なライブラリーを生成し得る。
【００２８】
次いで、これらのプラスミドは、これらのプラスミドが複製されてリコンビナーゼに曝露されるように、細菌宿主細胞内でインキュベートされる。リコンビナーゼの存在下で、宿主細胞の集団中の所定の細胞内の反対方向のリコンビナーゼ認識部位間で部位特異的組換えが生じ、該部位間の配列を逆転させる。組換えにより、所定の細胞内に３つの型のプラスミドを含む混合集団が得られ、このプラスミドは各々、２つのリコンビナーゼ部位-オリゴDNAカセットを含む開始プラスミドに由来する：(ａ)元のプラスミドと同じ方向でこのカセットを含むプラスミド(A形態)、(ｂ)逆平行(すなわち「フリップした(flipped)」)方向でこのカセットを含むプラスミド(B形態)、およびA形態のプラスミドとB形態のプラスミドとの間の組換えから生じる、併合されているがなお分離された「二重カセット」を含むプラスミド[方法１Ａ、工程４ａ、図１Ｂを参照のこと]。しかし、これらの逆方向反復は、介在するプラスミド配列によって分離されている。もちろん、プラスミド(ｃ)はプラスミド(ａ)および(ｂ)のサイズの２倍であり、そのことが消化およびゲル電気泳動による単離を容易にする。従って、リコンビナーゼ活性の後に、このプラスミドDNAは、任意の適切な技術(例えば、ＳＤＳによる溶解、ＳＤＳによるアルカリ溶解、煮沸溶解、つまようじミニプレパレーション(minipreparation)プロトコル、ミディプレパレーション(midipreparation)プロトコル、マキシプレパレーション(maxipreparation)プロトコルならびに当該分野で公知の他の技術)を使用して、宿主細胞の集団から単離される。単離後、このプラスミドDNAは、オリゴDNAの開始集団中に操作された3’制限部位または5’制限部位に特異的な制限酵素の１つによって消化され、リコンビナーゼ部位間のランダムオリゴDNAの非対称的な配置に起因して「小さい」プラスミドおよび「大きい」プラスミドを生成する。この後に、ゲル分離および単離が実施される[方法１Ａ、工程５ａ、図１Ｃならびに図１０Ａおよび１０Ｂ]。各反復は、一方の側のユニークな制限部位と他方の側の別の制限部位とに挟まれたので、両方の逆方向反復を含む小さい方のフラグメントは酵素のうち１つ(例えばPstI)を使用して単離され、このフラグメントは次いで自己連結されて(すなわち、それ自体で閉じて)、これらの逆方向反復を連続させ得る。
【００２９】
得られた連結されたプラスミド内で、逆方向ランダムカセットは、開始オリゴDNA中に存在する２つの制限部位の２つ目に特異的な制限エンドヌクレアーゼ(例えばBglII)で望ましくは消化される。この酵素は、センスおよびアンチセンスのランダム配列または半ランダム配列の各側上で切断する。消化後、小さいDNAフラグメントはsiRNAをコードし、siRNAコードカセットを作成するために適切なRNA発現ベクター中にクローニングされ得る。siRNAコードカセットの各々は、センスおよびアンチセンスのランダムDNAまたは半ランダムDNAを分離する、3’制限部位または5’制限部位のいずれかに由来する(すなわち、内部制限部位の粘着末端に由来する)スペーサーによって分離されたセンスランダム配列および相補的なアンチセンス配列を含む。制限部位に依存して、得られるスペーサーは、約4ヌクレオチド長と約15ヌクレオチド長との間、好ましくは約6ヌクレオチド長と約10ヌクレオチド長との間(例えば、約7ヌクレオチド長または8ヌクレオチド長)であろう。制限部位スペーサーによるセンスDNA配列およびアンチセンスDNA配列の分離は、このような発現系において有効であることが示されている(例えば、Devroe et al. , BMC Biotechnology,. 2, pg. 1-5 (2002)を参照のこと)。また、二重カセット(siRNAコードカセット)は、単一の挿入物またはオリゴマー挿入物としてプラスミド中にクローニングされ得る。このような挿入物は、例えば、約2個と約10個との間の挿入物、または約10個〜100個の挿入物、またはさらに約100個と約1000個以上との間の挿入物を含み得る。いくつかの場合において、既知の特異的ヘアピンコード二本鎖DNAが、重複するかまたは重複しない遺伝子経路またはシグナル伝達経路を標的化するために、ベクター内のランダム配列および/または他の既知の配列と直列に組合わされるだろう。従って、本発明の方法は、予め規定された配列を有するsiRNA(例えばshRNA)をコードする１つまたは複数のカセットと直列に、ランダムまたは半ランダムのsiRNA(例えばshRNA)をコードする二重カセットをクローニングすることをさらに含み得る。
【００３０】
単離後、逆方向反復カセットは、スクリーニングのために標的細胞中でRNAを生成するのに適切なベクター中にクローニングされる。例えば、このカセットは、RNA発現ベクター中にクローニングされ得る。これらのカセットは、単一でかまたは直列のマルチマーとしてかのいずれかでこの発現ベクター中にクローニングされ得る。例示的なRNAベクターには、最も好ましくは、レトロウイルスベクター、プラスミド、アデノウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターが含まれ得るが、他の適切なRNA発現ベクターが当該分野で公知である。RNA発現ベクターは、典型的にはRNAポリメラーゼプロモーターおよび転写終結部位(例えば、ポリチミジン(TTTTT)終結部位または他の適切な部位)を含み、逆方向反復カセットは、このプロモーターとターミネーターとの間に位置付けられる。このようなベクターは典型的に、高等生物の細胞内でRNA発現を達成するための、このような細胞中への導入に適切である。好ましくは、このRNAポリメラーゼプロモーターはRNAポリメラーゼIIIプロモーターであり、最も好ましくはU6 RNAポリメラーゼIIIプロモーターもしくはH1 RNAポリメラーゼIIIプロモーターまたはT7バクテリオファージプロモーターである。また、いくつかの実施形態において、レシピエントベクターは、対向するプロモーター(例えば、対向するH1プロモーターおよび/またはU6プロモーター)を有することが好ましい。このような実施形態において、各プロモーターは反対方向からshRNAを転写し得る。別の実施形態において、ポリメラーゼIプロモーターまたはポリメラーゼIIプロモーターが使用され得るか、あるいは任意のDNA依存的RNAポリメラーゼに対するプロモーターを含む複数の直列のプロモーターが使用され得る。望ましくは、二重カセットは、RNAプロモーターの直ぐ下流かつ終結部位(例えば、ポリT部位(例えばTTTTT))の直ぐ上流でこのようなベクター中にクローニングされる。
【００３１】
あるいは、siRNAをコードする最終カセットのクローニングの前に、RNAポリメラーゼ終結シグナル(すなわち、siRNAコード配列の3’側のRNA発現ベクター中の終結シグナルとは別個の第２の終結シグナル)に隣接する２つの平行なリコンビナーゼ部位を含む挿入物が、RNAポリメラーゼプロモーターとsiRNAコード配列との間に導入され得る[方法１Ｂ、図２Ａ〜２Ｂを参照のこと]。このような挿入物中のリコンビナーゼ部位は平行である(すなわち、同じ方向に配向したスペーサー)ので、リコンビナーゼ酵素の存在下で、これらの二重リコンビナーゼ部位は単一の部位へと変形され、従って終結シグナルが切り出される。従って、適切なリコンビナーゼが添加されるまでsiRNAコードベクターは「オフ」であり、siRNA配列を転写できないだろうから、この変形は、誘導性siRNAライブラリーの構築を可能にする。従って、引き続く使用のために、このライブラリーはリコンビナーゼが存在する場合に活性化され得る。
【００３２】
発現ベクター内のRNAプロモーターがT7バクテリオファージプロモーターである場合、この終結部位は最も好ましくは、T7転写のCATCTGTTTT(配列番号1)ターミネーターである(He et. al. , JBC, v273, 18802-11 (1998) )[方法１Ｃ、図３を参照のこと]。哺乳動物細胞内のsiRNAカセットの効率的な発現を確実にするために、このようなカセットを含むプラスミドはまた、T7バクテリオファージプロモーターからの転写を指向できるタンパク質(例えば、T7タンパク質または誘導体)をコードする(例えば、哺乳動物細胞において遺伝子を発現するのに適切な)発現カセットを好ましくは含む。１つの好ましい誘導体は、T7タンパク質(T7由来のDNA結合ドメインおよび転写活性化ドメインを少なくとも含む)と核局在化配列(例えば、SV40または別のタンパク質由来)との間の融合物であり、その結果、これは核に入って、プラスミド中のT7プロモーターと相互作用することができる。この系はさらに、哺乳動物細胞での実験ならびに最終的には動物モデルおよびヒト疾患処置における使用のために非常に重要であり得るsiRNAライブラリーの誘導性の発現を促進する。例えば、このT7は、タモキシフェンに応答するがエストロゲンには応答しないヒトエストロゲンレセプター変異体(例えば(G521R))のアミノ酸251〜595をコードする遺伝子との融合タンパク質として発現され得る(Danielian et al, 1993, Mol. Endo. 7: 232-240)。マウス変異体エストロゲンレセプターG525Rとの同様の融合物もまた使用され得る。これは、タモキシフェンが添加されるまで抑制されているT7ポリメラーゼを生じる。従って、タモキシフェンは、このsiRNAライブラリーの発現を制御する。この誘導性の系はまた、特定の遺伝子に対して指向された単一のsiRNAの誘導された制御のために非常に有用であり、本発明は、このようなT7-ポリメラーゼ-エストロゲンレセプター融合タンパク質を使用する、T7により駆動されるsiRNAの発現を誘導可能に調節する方法を提供する。
【００３３】
siRNA発現カセットを含むRNA発現ベクターは、siRNAライブラリーを形成するためにプールされたユニークなRNA発現カセットの集団を提示し、これらのカセットは各々ランダム配列または半ランダム配列を含む。このような集団内のベクターは、ベクター１個当たり１つのユニークなカセットを各々が含み得るか、またはこれらのベクターは、各ベクター中に複数の直列カセットを含むように構築され得る。このライブラリーは、ライブラリーを含むプラスミドを適切な宿主細胞中に導入することによって発現され得る。
【００３４】
上記のことは、DNA部位特異的リコンビナーゼ(例えば、ELPまたはCre)を使用してDNAヘアピンを生成する方法を提供することが観察されるだろう。記載されるように、オリゴDNAの開始集団の配列がランダムまたは半ランダムである場合、得られるヘアピンは、ランダムまたは半ランダムのsiRNAコードライブラリーである。しかし、この方法は、特定の標的に対して指向されたDNAヘアピンを生成するためにも使用され得る。従って、オリゴDNAの開始集団が予め設計された配列を有する場合、得られるDNAヘアピンは特異的siRNAコード配列である。１つまたは数個のヌクレオチド以外が特定され得るオリゴDNAが生成され得る限り、本発明の方法は、さもなくば共通である配列の１部分または数個の部分のみが互いに変動するsiRNA集団をコードするDNAヘアピンの構築をも達成し得ることが理解されるだろう。このようなライブラリーは、半ランダムライブラリーの１つの型であるということができる。
【００３５】
本発明の方法を容易にするために、本発明はまた、リコンビナーゼを使用してDNAヘアピンの生成を促進するのに適切なベクターを提供する。このようなベクターは、互いに向かって配向した２つのリコンビナーゼ認識部位を含み、これら２つのリコンビナーゼ認識部位(例えば、CreまたはLoxP)間にDNAの配列を有するプラスミドである。これら２つのリコンビナーゼ認識部位間の配列は、少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ認識配列(例えば、AscIまたはFseI)を含み、最も好ましくは少なくとも２つの制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。これら２つのエンドヌクレアーゼ認識部位は同じでも異なってもよいが、好ましくはこれら２つの制限エンドヌクレアーゼ認識配列は同じ配列ではない。このプラスミドはまた、プラスミド中の２つのリコンビナーゼ認識部位を認識するのに適切なリコンビナーゼ酵素(例えばFLPまたはCRE)をコードする発現カセットを含み得る。好ましくは、この酵素は、(例えば温度感受性発現系を使用して)プラスミドから誘導可能に発現され得、ほとんどの細菌株においてこのプラスミドが使用されるのを可能にするだろう。このプラスミドがこのようなリコンビナーゼ発現カセットを含む場合、好ましくは、この発現カセットは２つの制限エンドヌクレアーゼ配列間には存在しない。(DNAヘアピンがこの方法によって生成される)DNAの半ヘアピン配列が、エンドヌクレアーゼ認識配列の部位で発現プラスミド中にクローニングされる。従って、本発明のプラスミドはまた、ヘアピンコードshRNA(ランダムまたは指向性)の半分をコードするDNA配列を含み得る。一般に、プラスミドがDNA半ヘアピン配列を含む場合、これは、２つの制限エンドヌクレアーゼ認識配列間にある。このようなプラスミドの１例はpFRTである(図１Ａを参照のこと)。
【００３６】
本発明の方法の別の実施形態は、リコンビナーゼを産生する宿主細胞を必要としない。本発明の方法のこの実施形態によれば、制限部位に挟まれるランダムオリゴヌクレオチド配列または半ランダムオリゴヌクレオチド配列は、当該分野で公知の標準的な方法を使用して3’制限部位に相補的なプライマーを用いてプライミングした後に二本鎖になる。これらのオリゴDNAには制限部位が隣接し、プライミング配列がその後に続く。好ましくは、このランダム配列は、約15ヌクレオチドと約30ヌクレオチドとの間、最も好ましくは約20ヌクレオチドである。このプライミング配列は、好ましくは少なくとも約5ヌクレオチドである。ランダムオリゴDNAまたは半ランダムオリゴDNAの開始集団は、２つのRNAポリメラーゼプロモーター間(すなわち、第１のRNAプロモーターと第２のRNAプロモーターとの間)で適切なRNA発現ベクター中に直に接してクローニングされる。これら２つのRNAポリメラーゼプロモーターは、互いに反対の鎖上の他方のRNAプロモーターの方を向いて、反対方向でRNA転写を指向するように「内側に」配向される。好ましくは、オリゴDNAの開始集団は、２つのプロモーターの間に直接クローニングされるか、またはランダム配列もしくは半ランダム配列と隣接する第１および第２のRNAプロモーターとの間に数(例えば約10未満(例えば約5未満)の)塩基対を伴って２つのプロモーター間に位置付けられる。いくつかの例において、２つのポリメラーゼプロモーター間でプラスミド中にクローニングされる場合、ランダム配列または半ランダム配列は、予め選択されたポリA配列およびポリT配列が隣接したランダム配列または半ランダム配列を含むように開始オリゴDNAを操作することによって、5’ポリA(例えばAAAAA)および/またはポリT3’(例えばTTTTT)が直に接して隣接し得る。これらの配列は、特定のRNAポリメラーゼプロモーター(例えばU6およびH1)からの転写を終結させる[方法２、図４Ａを参照のこと]。好ましくは、これらのプロモーターのうち少なくとも１つがH1プロモーターもしくはT7プロモーターであるか、またはこれらのプロモーターの両方がT7プロモーターであり、クラスII T7ターミネーターが隣接しているか、またはより好ましくは、これら２つのプロモーターは互いに異なる(例えば、１つのプロモーターはU6プロモーターであり、他方のプロモーターはH1プロモーターである)(例えば図４Ｂを参照のこと)。上記のように、これらのオリゴDNAはまた、クローニングを容易にするために3’制限部位および5’制限部位を含み得る(好ましくは含む)。
【００３７】
最後に、これらのRNA発現ベクターはプールされて、第１のプロモーターと第２のプロモーターとの間に異なるランダムDNAまたは半ランダムDNAを含む類似のベクターのライブラリーを形成する。
【００３８】
この実施形態において、開始オリゴDNAの集団が２つのRNAプロモーターの間でRNA発現ベクター中にクローニングされた後、第１および第２のRNAプロモーターは、これらの間に配置されたランダム配列または半ランダム配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれの転写を指向することが理解されるだろう。宿主細胞内でのプラスミドのセンスおよびアンチセンスのランダム配列または半ランダム配列の二重転写は、宿主細胞内で自己アニーリングしてsiRNAを形成する初期相補的転写物を生じる。隣接するポリA配列またはポリT配列がオリゴDNAの開始集団に含まれない場合(または、開始オリゴDNA配列の挿入の部位に隣接してRNA発現ベクター中に含まれない場合)、RNA転写は、ランダム配列または半ランダム配列を通過して続くだろう。しかし、適切な終結配列は、多数のRNAプロモーターに対してアンチセンスな配列中に存在する。従って、例えば第１または第２のRNAプロモーターがU6プロモーターである場合、適切な終結配列(CATTTTA)は、対向するプロモーターに向かって約70塩基対で見出される。さらなる量の転写された配列は、細胞内のDICER酵素によって切断されるだろう。従って、この実施形態の発現ベクター中の第１および第２のRNAプロモーターの一方または両方がU6 RNAプロモーターであることが好ましい。別の実施形態において、ヘアピン[センス-アンチセンス]RNAコードカセットは、このヘアピンカセットからの発現を増大させるために、２つのプロモーター間に配置され得る。
【００３９】
プロモーターがT7プロモーターである同様のアプローチが使用され得る。この実施形態において、開始オリゴDNAは、反対方向のT7停止配列が遠位で隣接し、反対方向のT7プロモーター(すなわち、内側を向いた第１および第２のT7プロモーター)が近位で隣接する、ランダム配列または半ランダム配列を含み得る[方法３、図５を参照のこと]。このT7プロモーターは好ましくは、短縮された19塩基対のプロモーター配列(例えばTAATACGACTCACTATAGG(配列番号2))である。なぜなら、これにより相補鎖との重複が最小限にされるからである。しかし、完全な23塩基対のT7プロモーターもまた使用され得る。反対方向のプロモーターは、プラスミド中へのクローニングを容易にするために制限部位に隣接する。また、この実施形態において、このT7停止配列は好ましくは、クラスII T7ターミネーターである(例えば、Macdonald, J Mol Biol, 232, 1030 (1994)を参照のこと、例示的な配列はCATCTGTTT(配列番号3)である)。典型的なクラスIターミネーターとは反対に、クラスII T7ターミネーターはヘアピンループを形成せず、従ってそれらに対して直ぐ3’側にあるT7プロモーターの転写開始を遮断しない。
【００４０】
適切なプラスミド(または他のベクター)中へのクローニングの後、第１および第２のT7プロモーターの各々からの転写は、ランダム配列または半ランダム配列を通過して進み、対向するT7プロモーターを通過して進んで、その後停止配列に遭遇する。得られる転写物は、(ランダム配列または半ランダム配列の長さに依存して)約60塩基対長であろう。しかし、相補的な(センスおよびアンチセンス)ランダム配列もしくは半ランダム配列のみがアニーリングして二本鎖DNA構築物を形成する。この実施形態に対するさらなるバリエーションとして、このRNA発現ベクターは、上記のような核局在化シグナルおよびタモキシフェンに対してそれを応答性にするドメインを有するT7由来のRNAポリメラーゼをコードするカセットをさらに含み得る。
【００４１】
別の実施形態において、この開始オリゴDNA集団は、以下の配列を有するオリゴDNAを含む：(5’から3’で)予め選択された制限部位、任意選択のAAジヌクレオチド配列、ランダム配列もしくは半ランダム配列、プライミングループに寄与する第１の配列、スペーサー配列およびプライミングループに寄与する第２の配列。プライミングループに寄与する第１の配列 プライミングループに寄与する第２の配列はアニーリングしてループを形成するべきであり、好ましくはこれらの配列は互いに対して相補的である[方法４、図６Ａ〜６Ｂを参照のこと]。プライミングループに寄与する第１の配列および第２の配列は、約3塩基対〜約10塩基対を各々が含み得、互いにアニーリングしてループを形成する必要がある。好ましくは、これらの配列は、約4塩基対と約6塩基対との間を含む。１実施形態において、プライミングループに寄与する第１の配列はGCリッチな配列であり、プライミングループに寄与する第２の配列もまた第２のGCリッチな配列であり、１つの好ましいCGリッチな配列はCCGGである。このスペーサー配列は、プライミングループを形成するための第１の配列と第２の配列との間でのループの形成を促進するように、好ましくは約3塩基対と約10塩基対との間、より好ましくは約4塩基対と約6塩基対との間を含む。このスペーサーはまた、集団中の他のオリゴDNAとの二本鎖の形成(すなわち、GCリッチな配列の交差アニーリングを介した)を阻害するべきである。スペーサーのための１つの好ましい配列はAGAGである。
【００４２】
得られた自己アニーリングループは、合成されたDNAの相補鎖(すなわち、ランダム配列または半ランダム配列のアンチセンス)の合成をプライミングするために使用される。これは、テンプレート鎖の予め選択された制限部位を通って第２のGCリッチな配列の末端から相補鎖を伸長するのに適切な条件下でDNAポリメラーゼにオリゴDNAを曝露し、二本鎖DNAオリゴマーを生じることによって達成される。相補鎖の合成の適切な方法は当該分野で周知である(例えば、Molecular Cloning : a laboratory manual, Sambrook et al. , A4.22-A4.23 (2001) を参照のこと)。しかし、RNA重合の間にオリゴDNAの自己アニーリングしたループ構造を保存するために、逆鎖の合成は最も好ましくは室温またはその近傍で実施され、自己アニーリングしたDNAの変性を回避する。
【００４３】
伸長後、これらのDNAオリゴマーは、一本鎖DNAを形成するために変性される。二本鎖DNAの変性は、当該分野で公知の任意の適切な方法(例えば、変性ゲル、熱処理およびアルカリ性変性溶液)によって達成され得る。一本鎖の変性した伸長されたオリゴDNAが次いで単離される。単離後、伸長されたオリゴDNAは、開始オリゴDNAの5’末端中に操作された配列を使用して、相補鎖の合成のためにプライミングされる[方法４、図６Ａ〜６Ｂを参照のこと]。
【００４４】
これらの相補鎖は、（望ましくはin vitroのDNA合成法を介して）テンプレート鎖の5’末端まで合成される。相補鎖の合成は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって達成され得るが、相補鎖の合成を妨げるテンプレートの相補的な部分の自己アニーリングを最小限にするかまたは防止する条件下で相補鎖を合成することが重要である。室温では、これは生じるとしても非常に低い収率である。(ATリッチな配列と比較して)GCリッチな配列が優先的に自己アニーリングしてランダムなプールからこれらの配列が脱落するために、shRNAコード配列がいくらか首尾よく形成されたとしてもランダムではないだろう。テンプレートの自己アニーリングを最小限にする１つの方法は、変性温度(例えば、約50℃よりも高い温度)で相補鎖の合成を実施することである。好ましくは、合成のための温度は約60℃〜約75℃の間であり、最も好ましくは、合成のための温度は、DNA合成の間にテンプレートの変性を保存するために約65℃である。もちろん、このような上昇した温度で合成を実施するのに適切なポリメラーゼ(例えば、Taq、TaqStoffelフラグメント、rTth、Tfl、Hot Tub、Tbr、UlTma、rBst、Isotherm Bstの大きいフラグメント、Pwo、Tli、DeepVentおよびPfuなど)が使用されるべきである。しかし、相補的なDNAを合成するために適切な酵素および反応条件を選択することは当業者の範囲内である。相補鎖を合成するために高温条件を使用することの代替としてかまたはそれに加えて、相補鎖の形成は、テンプレート上へのプライマーの一本鎖侵入を促進する酵素の存在下で実施され得る。このような酵素の非限定的な例には、E. coliのrecAおよびrecE/rec/T経路の酵素が含まれ(例えば、Gamper et al., Biochem, 42 (9), 2643-55 (2003)およびNoirot et al., J. Biol. Chem., 273 (20), 12274-80 (1998)を参照のこと)、他の生物中の類似の経路の類似の酵素もまた適切に使用され得る。
【００４５】
合成後、二本鎖siRNAコードDNAは、予め選択された制限部位が隣接し、スペーサー配列によって分離された、２つの相補的なランダム配列または半ランダム配列を含み、ここで第１の配列は第２の配列のアンチセンス配列である。この段階で、siRNAコードDNAの集団をプールして、siRNAコードライブラリーを形成することができる。あるいは、このsiRNAコードDNAは、予め選択された制限部位に対応する制限酵素によって消化され、上記のようなRNA発現ベクター中にクローニングされ得る。望ましくは、このカセットは、適切なRNAポリメラーゼプロモーターと作動可能なRNAポリメラーゼ終結配列との間でこのようなベクター中に導入される。このようなクローニングの後、得られたDNA発現ベクターをプールして、siRNAライブラリーを形成することができる。
【００４６】
別の好ましい実施形態において、本発明は、ランダム配列または半ランダム配列を含む短いオリゴDNAの合成を含まない、siRNAライブラリーを産生するための方法を提供する。この実施形態は、ランダムに生成されたDNAオリゴマーに依存することなく、細胞によって転写されたRNAの分析に有利である。任意の適切なcDNAライブラリーが使用され得、これらのうち多くが市販されているかまたは当業者によって容易に産生され得る。所望される場合、目的の生物由来のcDNAライブラリーは、所望の制限酵素で任意選択で消化され得る。この制限酵素は、約100塩基対長と約1000塩基対長との間の消化フラグメントを産生するように選択される(例えば、HaeIII、Sau3A、MboIなど)。もちろん、全長のcDNAが所望の場合に使用され得る。
【００４７】
cDNA(またはその消化フラグメント)は、任意の適切なクローニング技術を使用してプラスミド中にクローニングされる。クローニングのために使用されるプラスミドは、センス鎖およびアンチセンス鎖の上流のRNAポリメラーゼプロモーターからの二方向性の転写を有するべきである。このプラスミドはまた、クローニング部位に対してシスで、E3L遺伝子または選択マーカーの遺伝子との融合遺伝子としてのE3L遺伝子のいずれかを有し得る[方法５、図７Ａ〜７Ｂを参照のこと]。選択マーカー遺伝子の例には、GFP、Neo、Puroおよび当業者に公知の他のマーカーが含まれるがこれらに限定されない。E3L遺伝子を有するプラスミドに対する代替として、このE3L遺伝子は、ライブラリーを試験するために使用される細胞内で内因的にかまたは別の外因性発現カセットから、安定にまたは誘導可能に発現され得る。例えば、構成的または誘導性のE3L発現プラスミドは、ランダムライブラリーの前に最初に細胞中に(一過的にまたは安定に)トランスフェクト/形質導入され得る。E3Lタンパク質の活性は調節可能であることが望ましい。例えば、E3L遺伝子の発現は、誘導性プロモーターの制御下であり得る。あるいは、このE3Lタンパク質は、翻訳後レベルで調節され得る(例えば、タグとの融合タンパク質(例えば、E3L活性を同族リガンドによって誘導可能にしているステロイドホルモンレセプター))。このE3L遺伝子は、インターフェロン誘導性の二本鎖RNA依存的経路を阻害する(例えば、Garcia et al. , Oncogene, 21, 8379 (2002); Xiang et al, J. Viril., 76, 5251 (2002)を参照のこと)。E3L遺伝子および二本鎖RNAはシスで細胞中にトランスフェクトされるので、比較的長い二本鎖RNAに対するインターフェロン応答が阻害され、比較的長い二本鎖RNA転写物は、結果として細胞死を導かない。しかし、DICER酵素は、宿主細胞内でアニーリングしてsiRNAを形成し得る、約15〜30塩基対長のsiRNAを生成する長い二本鎖RNAを切断する。この実施形態は、siRNAが数百もしくは数千の標的に対するsiRNAの「ブルートフォース」クローニングによってcDNAライブラリーに対して生成されるか、またはcDNAの短片(例えば35bp未満)からなるライブラリー(例えば、Mme1消化に基づくもの)に対して生成される他のアプローチを超える利点を有する。この実施形態において、大きい二本鎖RNAは、細胞内のDicer酵素によってsiRNAへと天然にプロセシングされる。これは、最適に有効な短いsiRNAフラグメントを導くより効率的なプロセスである(Tijsterman, et al., Cell ;117 : 1-4 (2004)およびこの中の参考文献)。siRNAライブラリーを使用する表現型スクリーニングのために意図されたレシピエント細胞株は、(例えば、エストロゲンレセプタードメインと融合されてタモキシフェン依存性を付与する)誘導性E3L遺伝子を安定に含むように代替的に操作され得る。これは、長い二本鎖RNAをコードするライブラリーで細胞をトランスフェクトする直前にタモキシフェンによって誘導され得る。
【００４８】
siRNAライブラリーを構築するための方法を提供したので、本発明は、高等生物由来の細胞(特に哺乳動物細胞)における使用に適切なsiRNAライブラリーを提供することが理解されるだろう。望ましくは、これらのライブラリーは、約12ヌクレオチドと約35ヌクレオチドとの間(例えば約15ヌクレオチドと約30ヌクレオチドとの間(望ましくは約19ヌクレオチドと約23ヌクレオチドとの間))の相補的なセンス配列およびアンチセンス配列を含むランダムsiRNAまたは半ランダムsiRNAをコードするカセットの集団を含む。
【００４９】
本発明はまた、siRNA(またはshRNA)を発現するためのプラスミドを提供する。ランダムまたは非ランダムのsiRNA(またはshRNA)を発現するために適切なプラスミドは、挿入された配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖が転写されるように、siRNAコード配列についてのクローニング部位をそれらの間に含む、反対に配向したU6プロモーターおよびH1プロモーターを含む。好ましくは、このようなプラスミド内のU6プロモーターは、クローニング部位の前に27bpまたは28bpのU6コード配列を含んで、siRNAの安定性を増強し得る。別の好ましいプラスミドは、リコンビナーゼ(例えばFLP)への曝露によるsiRNAの誘導性の発現を可能にする。このようなプラスミドは、リコンビナーゼ部位(例えばFRT)が後に続くポリメラーゼIIIプロモーター、その中にポリチミジン反復(一列に４つ以上のT)を含むスペーサー配列、その後の第１の部位と同じ方向でのリコンビナーゼについての第２の部位、および最後にshRNAコードヘアピンについてのクローニング部位を含む。好ましくは、このようなプラスミド内のsiRNAコード配列は、対向するポリメラーゼIIIプロモーターに挟まれ、これらのプロモーターのうち１つは、siRNAコード配列に対して5’側にリコンビナーゼ部位-ポリチミジン-リコンビナーゼ部位カセットを挿入している。このようなプラスミドを使用して、本発明は、インテグラーゼファミリーのリコンビナーゼ(例えばFLP)を使用してsiRNAの発現を調節する方法を提供する。リコンビナーゼに曝露すると、このプラスミド内の組換え事象により、終結配列として作用するポリチミジン反復が除去されるだろう。従って、ポリチミジン配列の除去は、コードするsiコード配列をポリメラーゼが発現させることを可能にするだろう。このような方法において、このリコンビナーゼタンパク質は好ましくは、例えば調節可能なプロモーターによって、またはエストロゲンレセプターとの融合物として誘導可能に発現され、その結果、組換え事象およびsiRNA(またはshRNA)の発現が制御され得る。
【００５０】
別の一面において、本発明はsiRNAライブラリーを使用する方法を提供する。例えば、siRNAライブラリーは、得られた挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な特性に対応する遺伝子または非コード配列を同定するために使用され得る。得られた挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な特性に対応する遺伝子または非コード配列には以下が含まれ得るがこれらに限定されない：腫瘍抑制、発癌、アポトーシス、転移、シグナル伝達(例えば、正常細胞および疾患細胞における)、ウイルスのタンパク質または合成、病原性経路、既知または未知の生物兵器感受性の同定、新生の感染を引き起こす因子の遺伝子配列または感受性の同定、および溶解経路の要求、ならびに当該分野で公知の他の遺伝的に関連した挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な特性に関与する遺伝子または非コード配列。siRNAライブラリーは、このライブラリーへの曝露の結果として共通の挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な特性を示す細胞の部分集団を生成するためにも使用され得る。例えば、所望の挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な特性に影響を与える候補薬物または他の因子をスクリーニングするために、このような細胞の部分集団が使用され得る。
【００５１】
この方法を実証するフローチャートが図８として示される。上記のように、ランダム(または半ランダム)なsiRNAライブラリー101または指向されたsiRNAライブラリー(cDNAに対してのみ指向されたか、またはcDNAのサブセットに対してまでも指向された)104が最初に生成される。次いで、このsiRNAライブラリーは細胞の集団102、105中に導入される。次いで、この細胞の集団は選択プロセス103に供されて、集団の残部とは異なる挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な特性を示す細胞の部分集団が選択される。選択プロセス103の後、この細胞の部分集団(すなわちサブセット)が、所望に応じて単離、分析および/またはクローニングされ得る106。部分集団のこのような分析は、集団の残部と比較して異なる部分集団の特性を担うsiRNA種の同定であり得る。あるいは、この部分集団は、ゲノミクスアッセイ、プロテオミクスアッセイおよび/またはセロミクスアッセイ107によってさらに分析され得る。このようなゲノミクスアッセイ、プロテオミクスアッセイおよび/またはセロミクスアッセイが使用される場合、この方法は、いくつかの有用なバイオインフォマティクス産物108を生成し得る。
【００５２】
本発明の方法は、任意のsiRNAライブラリーの使用に関し、このライブラリーは、本明細書中に記載されるようなランダムもしくは半ランダムのsiRNAライブラリー101、または指向されたsiRNAライブラリー(例えば、cDNAに対してのみ指向されたか、またはcDNAのサブセットに対してまでも指向された)104であり得るかまたはこれらを含み得る。ライブラリー101、104は、本明細書中に記載されるように構築され得る。本発明の方法によれば、ライブラリー101、104を構築した後、このsiRNAライブラリー配列101、104は、細胞の集団102、105中に導入される。任意の適切な方法が、siRNAライブラリー101、104を細胞102、105中に導入するために使用され得る。例えば、siRNA分子を含むsiRNAライブラリー101、104は、細胞の集団102、105中に直接導入され得る。あるいは、このライブラリー101、104がsiRNAをコードする転写カセットを有するベクターの集団を含む場合、このライブラリー101、104は、ベクターがプラスミドベクターである場合にはこれらのベクターで細胞をトランスフェクトすることによって、またはライブラリーを含むウイルスベクターを細胞に感染させることによって、細胞の集団102、105中に導入され得る。ライブラリー101、104が、siRNAライブラリーをコードするベクター系で集団をトランスフェクトまたは感染させることによって集団102、105中に送達される場合、好ましくは、この細胞の集団は、約1:1の比率でライブラリーでトランスフェクト/感染され、その結果、この集団内の各細胞は、ライブラリー由来の単一のsiRNA種のみを転写する。しかし、複数のsiRNAの各細胞中へのトランスフェクションは、さらなる分析工程を犠牲にしてスクリーニングの効率を実質的に増大させ得る。複数の特異的siRNAが単一細胞内で機能的であることが示されている(Yu, Molecular Therapy,vol 7,228-236 (2003) )。
【００５３】
この細胞の集団は任意の所望の細胞種を含み得、望ましくは、高等生物(例えば、真核生物、好ましくはヒトのような哺乳動物)由来の細胞である。細胞の適切な集団を選択することは当業者の範囲内であり、当業者は、この選択において、このライブラリーの使用によって調査されている所望の挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な特性によって手引きされるだろう。しかし、このライブラリー101、104がベクター系(例えば、このライブラリーをコードする発現カセットを含むプラスミドまたはウイルスベクター系)として細胞の集団102、105中に導入される場合、この細胞の集団102、105は、ベクター内のsiRNAコード配列が細胞の集団内でsiRNAを産生するように、このベクター系と適合性でなければならない。
【００５４】
細胞の集団102、105中へのライブラリー101、104の導入後、この集団は選択プロセス103に供されて、挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な変化または特性に基づいて、集団の残部から識別され得る細胞(または細胞の部分集団もしくはクローン)が選択される。特定の刺激から生じる挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な変化の例には、以下が含まれるがこれらに限定されない：細胞死、制御されないかまたは異常な細胞増殖、色の変化、タンパク質合成の変化、細胞形態学の変化、細胞分化の変化および細胞代謝の変化、細胞運動性の変化ならびに他の関連の表現型。
【００５５】
選択プロセス103によれば、細胞の集団102、105中へのライブラリー101、104の導入後、これらの細胞を観察して、細胞の挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な変化または特性を検出する。いくつかの実施形態において、この集団は、この集団内のいくつかの細胞内の挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な変化を促進し得る刺激に供される。このような刺激には以下が含まれ得るがこれらに限定されない：物理的条件における変更への曝露(例えば、温度変化、特定の型の培養デバイスまたは培養基質中での配置、光または暗黒への曝露、放射線への曝露など)、細胞増殖に影響を与える１つまたは複数の因子への曝露、細胞代謝に影響を与える１つまたは複数の因子への曝露、細胞の移動に影響を与える１つまたは複数の因子への曝露、細胞のストレス応答に影響を与える１つまたは複数の因子への曝露、１つまたは複数の化学物質(例えば毒素)への曝露、１つまたは複数の分化因子への曝露、１つまたは複数の栄養因子への曝露、１つまたは複数のウイルス(これは、既知のウイルスまたは未知のウイルスであり得る)への曝露、ならびに特定の表現型を生じることが当該分野で公知の他の刺激。この刺激は、細胞の集団に対して既知の効果、予測された効果または予期可能な効果(ライブラリー内のsiRNAの効果がなければ)を有するように選択され得るか、あるいはこの刺激は、細胞の集団に対するその効果を知らずに選択され得る。
【００５６】
集団の残部と比較した、この集団内の特定の細胞の示差的な挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な変化または応答は、このような細胞が本発明の方法に従ってサブセットまたは「部分集団」106として選択される103のを可能にする。例えば、細胞の部分集団106は、刺激が既知の変化または予期可能な変化を促進するように選択された場合、刺激に応答した予測された挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な特性または変化を示さない細胞を含むものとして選択され得る103。あるいは、細胞の部分集団106は、集団の残部が示さない、刺激に対する挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な応答を示す細胞として選択され得る103。
【００５７】
この部分集団106は、任意の測定可能な挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な特性または変化に基づいて選択され得るだろう103。このような特性および/または変化の評価は、評価される特性に依存して変動するが、このような変化についてアッセイすることは当業者の範囲内である。例えば、変化が形態学的なものである場合、細胞の部分集団106は、観察された形態学的特徴に基づいて手動で選択され得る103。同様に、変化または特性が生化学的なものである場合、細胞の部分集団106は、適切な生化学的アッセイに基づいて選択され得る(例えば、色の変化は、部分集団106の選択103を容易にし得る)。
【００５８】
非限定的な例には、細胞の運動性または侵襲性に対するsiRNAライブラリーの効果に基づいて部分集団106を選択すること103が含まれる。このような特性は、Boydenチャンバのような、デバイスの１つの部分から他の部分への細胞の移動を制限するデバイス中に細胞の集団を導入することによってアッセイされ得る。このようなデバイスにおいて、これらの細胞は、制限障壁を横切って移動することが許容され得る。移動を生じさせた後、侵襲活性を増強させた細胞は適用部位とは反対側の障壁の側面から回収され、侵襲活性を阻害した細胞は元の適用部位から回収される。次いで、細胞の２つの部分集団が、細胞の移動性および侵襲性に対するsiRNAの効果を評価するために、本明細書中に記載されるように単離されさらに研究され得る。
【００５９】
別の非限定的な例として、この集団中へのsiRNAライブラリーの導入後、部分集団106は、細胞毒性であるかまたはアポトーシスを誘導する因子に対する細胞の感受性における変化について選択され得る103。このような部分集団106を選択する103ために、siRNAライブラリーにより改変された細胞集団は、１つまたは複数のストレス因子(例えば、化学的または生物学的な化合物または毒素、複数の波長の光エネルギー、電離放射線、熱、冷却、電気、音波またはそれらの組み合わせ)へと集団を曝露する条件下で培養され得る。特に有効な選択技術は、1分間から数時間〜数日間までの範囲の期間にわたって1nM〜1mMの範囲の濃度のエトポシドに(集団中にライブラリーを導入した後で)細胞の集団を曝露することである。従って、部分集団106は、この処理を生き延びる細胞を含むように選択され得る103。
【００６０】
別の非限定的な例として、細胞増殖に対するsiRNAライブラリーの効果が、増殖し続ける細胞を選択的に殺傷する１つまたは複数の因子に集団を曝露させることによって評価され得る。これらの因子には、5-フルオロウラシルのような核酸アナログまたはパクリタキセルのような微小管調節薬物が含まれるがこれらに限定されない。従って、部分集団106は、この処理を生き延びる細胞を含むように選択され得る103。別の非限定的な例として、アッセイは、容易に認識可能な特性(例えば、所定の培地中での生存)を所望の変化と関連付けるように設計され得る。例えば、分化(潜在的にアッセイが困難な表現型の変化)についてアッセイするために、チミジンキナーゼ(TK)を欠損したあまり分化していない細胞(例えば、マウスの胚性幹細胞(例えば、Dobrovolsky, Mol Genet Metab., 78 (1) : 1-10 (2003)を参照のこと))が、発生の間に示差的に発現される遺伝子産物によって制御されるプロモーターの制御下にTKを配置する外因性TK発現カセットを含むように操作され得る。例えば、胚性幹細胞が分化するにつれ、このような細胞におけるRex-1プロモーターの活性は減弱される。従って、このTKカセットが、内因性TKを欠くマウス胚性幹細胞においてRex-1プロモーターの制御下に配置される場合、例えば因子への曝露に応答して分化する細胞は、認識可能な量でTKを発現することをやめる。このような部分集団106は、TKを発現する細胞(この例示的なアッセイ系において、これは未分化の胚性幹細胞である)を殺傷する培地(例えばHAT培地)中で細胞を培養することによって選択され得る103。この系において、部分集団106は、HAT培地中で生存する細胞として選択され得る103。同様の選択は、その発現が胚性幹細胞の場合、未分化状態のマーカーである他の遺伝子に関連付けられたTK発現を使用し得る(Niwa, Nat Genet. 2000 Apr; 24 (4): 372-6)。例えば、Oct 3/4プロモーターによって駆動されるTKは、栄養外胚葉への移行に関与する経路を分析するために使用され得る。
【００６１】
どの方法が選択されても、本発明の方法に従って選択された部分集団(またはサブセット)106は、それ以外の細胞の集団に対するこの部分集団内の細胞の挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な差異と因果関係を有する候補であるsiRNAを有する細胞を含む。いくつかの実施形態において、この部分集団は、細胞の一般的な集団から物理的に単離され得る106。従って、本発明は、細胞の開始集団から実質的に単離されたこのような細胞の部分集団を提供する。好ましくは、この部分集団は、細胞の開始集団から完全に単離される。さらに、部分集団も同様にクローニングまたは培養することが所望され得る106。従って、本発明は、クローン性集団としてこの細胞の部分集団を提供する。この部分集団は、当業者に公知の方法によって、単離および/またはクローン増殖され得る106。
【００６２】
部分集団の選択後、本発明の方法は、この部分集団106の分析をさらに含む。この部分集団は、探査された情報の性質に依存して任意の適切な様式で分析され得る106。例えば、この部分集団は、挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的に分析され得る106。分析の性質は、例えば、部分集団と開始集団との間の差異の評価、または所望される場合、この部分集団内の細胞に共通する特徴の評価であり得る。
【００６３】
留意されるように、部分集団内の細胞(これは、主要集団とは異なる挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な特性を示す)由来のsiRNAは、目的の挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な特性を調節する遺伝子または非コード領域を阻害するための候補とみなされる。従って、本発明の方法の1実施形態において、この部分集団は、さらなる研究(これには、反復アッセイまたは単離されたsiRNAの配列決定が含まれ得る)のためにこの部分集団の細胞からsiRNA(例えばsiRNA発現カセット)を単離することによって分析され得る106。候補siRNAを単離する方法には、例えば、当該分野で周知の技術である逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)が含まれる。あるいは、このsiRNAライブラリーがレトロウイルス発現ベクターとして使用される場合、siRNA候補は、候補siRNAを含むレトロウイルスベクターを非複製レトロウイルス(これは、細胞の上清から単離され得る)中にパッケージングするように、この部分集団内の細胞にレトロウイルスヘルパープラスミドをトランスフェクトすることによってレスキューされ得る。次いで、候補siRNAを含むこのようなレトロウイルスは、レトロウイルスcDNAライブラリーにおいて機能的遺伝子を同定するために第２回または引き続く回のアッセイにおいて使用され得る(例えば、Bhattacharya et al., Proc. Nat. Aead. Sci. (USA), 99, 8838 (2002)を参照のこと)。従って、本発明は、上記のように細胞の部分集団から単離されたsiRNAを含む。このようなsiRNAは、異なる配列の収集物を含み得るか、または実質的もしくは完全に同質であり得る。
【００６４】
従って、この方法は、細胞の集団中にライブラリーを導入すること、既知の表現型変化を引き起こす刺激にこの細胞の集団を曝露すること、この表現型変化を示さない集団内の細胞を同定すること、およびこれらの細胞からsiRNAをレスキューすることを含み得る。次いで、これらの細胞由来のsiRNAが配列決定されてデータベースに対して比較され得るか、または目的の特定の表現型変化への関与についての候補である遺伝子配列を同定するためのプローブを生成するために使用され得る。本発明によって記載されるsiRNAライブラリーは、癌、細胞分化、ウイルス感染、細菌病原性、代謝経路、シグナル伝達経路、溶解経路に関与する重要な遺伝子の迅速な機能的同定ならびに表現型分析に依存する他の研究分野において有用である。このプロセスを介して同定された特異的siRNAは、直接的な治療的価値を有し得る。
【００６５】
また留意されるように、この部分集団内の細胞(これは、主要集団とは異なる挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な特性を示す)は、目的の挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な特性を調節する遺伝子または非コード領域を阻害するsiRNAを保有する候補とみなされる。従って、本発明の方法の別の実施形態において、この部分集団は、ゲノミクス的手法、プロテオミクス的手法、セロミクス的手法またはそれらの組み合わせ107によってさらに分析され得る。ゲノミクス分析の例として、この部分集団内の細胞の遺伝子発現は、例えばマイクロアレイ分析によって評価され得る。これは、例えば遺伝子の相補群の構築を容易にし得る。すなわち、ある共通の細胞選択表現型を導くランダムライブラリーから生成されたsiRNAの効果は、別個の遺伝子経路または重複する遺伝子経路に影響を与え得るだろう。プロテオミクス分析は、部分集団内でのタンパク質の構造、機能、活性および/または発現レベルにおける変化をマッピングすることを含み得る。プロテオミクス評価は、この部分集団の細胞内に見出される単一、複数またはプロテオーム規模のタンパク質に焦点を当て得る。セロミクス分析は、例えば、細胞の特性および経路(例えば、挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的)の評価を含み得る。このような特性は、この部分集団内の細胞または全体としてのこの部分集団の型のプロファイルを明らかにするために、時間的および空間的に評価され得る。これらのパラメータには以下が含まれるがこれらに限定されない：「ハイコンテンツ測定」(例えば、シグナル伝達事象、細胞周期調節事象、代謝活性、細胞の形状および運動性における変化、細胞内のオルガネラと区画との間の分子輸送、ならびに細胞死またはアポトーシスに関連する分子事象の測定)。
【００６６】
もちろん、この部分集団のゲノミクス分析、プロテオミクス分析およびセロミクス分析は互いに排他的ではない；このような分析様式は、別々にかまたは組み合わせて使用され得る。全ての細胞の測定から生成されたデータベースは、ゲノミクス分析、プロテオミクス分析およびセロミクス分析から得られた情報に関連する知識的土台のための基礎を形成する。このような情報は、バイオインフォマティクスにおいて有用ないくつかの産物108を生じ得る。例えば、この方法は、共通の挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な特徴を有する(この部分集団から単離された)細胞のライブラリーあるいは組を生成し得る。このようなライブラリーまたは組は、候補薬物のスクリーニング、未知の毒素または感染性因子の同定などのような複数の使用のための試薬として働き得る。ゲノミクス分析、プロテオミクス分析およびセロミクス分析を組み合わせた使用はまた、特定の遺伝子の減弱を生物学的経路と関連付ける情報の知識的土台を生じ得る。ゲノミクス分析、プロテオミクス分析およびセロミクス分析を組み合わせた使用はまた、特定の遺伝子の減弱を細胞の表現型と関連付ける情報の知識的土台を生じ得る。このような知識は、例えば推定上の治療的介入のための標的を同定することを補助し得る。この方法はまた、特定の遺伝子型を高度に規定された表現型と関連付けるバイオインフォマティクスデータベースを生じ得る。ゲノミクス分析、プロテオミクス分析およびセロミクス分析を組み合わせた使用はまた、細胞ベースの試薬の産生のための新たなプロセスを導き得る。
【００６７】
非限定的な例として、選択プロセス103は、示差的な運動性または侵襲活性を示す細胞の部分集団を選択することを含み得ることが上記される。この部分集団のさらなる分析は、特定の表現型を構成的に発現するかまたは表現型を誘導性形態で発現する(例えば、誘導性のランダムsiRNAライブラリー101が細胞102中に導入される場合)かのいずれかである細胞株が生成されるように、このような部分集団106を単離、クローニングおよび増殖させることを含み得る。次いでこの表現型は、ゲノミクス分析、プロテオミクス分析およびセロミクス分析107を使用して分子的に分析される。従って、例えば、遺伝子発現パターンは、侵襲活性の変化と関連する単一、複数またはゲノム規模の配列をコードするmRNAレベルの変化を明らかにし得る。遺伝子発現パターンの代替としてまたはそれと相補的に、侵襲活性の変化を発現する細胞の部分集団内に見出される単一、複数またはプロテオーム規模のタンパク質の構造、活性および発現レベルにおける変化が測定され得る。これらのプロテオミクス測定には以下が含まれるがこれらに限定されない：細胞の運動性を担う細胞骨格タンパク質(例えば、ケラチン、チューブリンおよびアクチン)、ならびに細胞の細胞骨格に結合しそれを調節する多数のタンパク質のレベルまたは活性の変化。ゲノミクス測定およびプロテオミクス測定に対してさらに相補的に、細胞の侵襲活性の変化を担う分子プロセスの時間的および空間的な測定は、単一細胞の部分集団内で評価される。
【００６８】
細胞の部分集団の組み合わされたゲノミクス分析、プロテオミクス分析およびセロミクス分析の別の非限定的な例として、選択プロセス103は、細胞毒性特性およびアポトーシス特性の変化を示す細胞の部分集団を選択することを含み得ることが上記される。これらの部分集団のさらなる分析は、特定の表現型を構成的に発現するかまたは表現型を誘導性形態で発現するかのいずれかである細胞株が生成されるように、このような部分集団106を単離、クローニングおよび増殖させることを含み得る。次いでこの表現型は、ゲノミクス分析、プロテオミクス分析およびセロミクス分析107を使用して分子的に分析される。このような部分集団のゲノミクス評価は、細胞毒性活性またはアポトーシス活性の変化に関連する単一、複数またはゲノム規模の配列をコードするmRNAレベルの変化を明らかにする遺伝子発現パターンを同定し得る。プロテオミクス評価は、細胞毒性またはアポトーシスの変化を発現する細胞内で見出される単一、複数またはプロテオーム規模のタンパク質の構造、活性および発現レベルにおける変化を測定することを含む。これらの測定には、アポトーシス細胞死を担うタンパク質(例えば、カスパーゼ、チトクロムcまたはPARP)のレベル、細胞内局在または活性における変化が含まれ得るがこれらに限定されない。セロミクス評価は、単一の細胞の集団内の細胞の毒性活性またはアポトーシス活性の変化を担う分子プロセスの時間的および空間的な測定を含み得る。このような部分集団のゲノミクス分析、プロテオミクス分析およびセロミクス分析を組み合わせた使用からの産物は、調節領域であり得るDNAの同定された非コード領域および/またはコード領域を阻害/ノックダウンし、既知または未知のいずれかの遺伝子/タンパク質をノックダウンする、同定されたsiRNAを含む細胞のライブラリーである。各細胞種についてのゲノミクスデータ、プロテオミクスデータおよびセロミクスデータは、ライブラリー特徴のデータベースを構築するために使用され得る。これらの特徴付けられた細胞株は、既知および未知の化合物の細胞毒性/アポトーシスについてスクリーニングする際に使用され得る。
【００６９】
細胞の部分集団の組み合わされたゲノミクス分析、プロテオミクス分析およびセロミクス分析の別の非限定的な例として、選択プロセス103は、TKプロモーター発現の変化、および好ましくは分化活性の変化を示す細胞の部分集団を選択することを含み得ることが上記される。この部分集団のさらなる分析は、特定の表現型を構成的に発現するかまたは表現型を誘導性形態で発現するかのいずれかである細胞系が生成されるように、このような部分集団106を単離、クローニングおよび増殖させることを含み得る。次いでこの表現型は、ゲノミクス分析、プロテオミクス分析およびセロミクス分析107を使用して分子的に分析される。このような部分集団のゲノミクス評価は、分化表現型の変化に関連する単一、複数またはゲノム規模の配列をコードするｍRNAレベルの変化を明らかにする遺伝子発現パターンを同定し得る。このような部分集団のプロテオミクス評価は、分化に関連する細胞内で見出される単一、複数またはプロテオーム規模のタンパク質の構造、活性および発現レベルにおける変化を測定することを含み得る。これらの測定には、細胞シグナル伝達(例えば、ホルモン分泌およびレセプターの発現)、遺伝子発現の調節(例えば転写因子)および分化マーカーを担うタンパク質のレベル、細胞内局在または活性における変化が含まれ得るがこれらに限定されない。セロミクス評価は、単一の細胞の集団内の分化挙動の変化を担う分子プロセスの時間的および空間的な測定を含み得る。このような部分集団のゲノミクス分析、プロテオミクス分析およびセロミクス分析を組み合わせた使用からの産物は、調節領域であり得るDNAの同定された非コード領域および/またはコード領域を阻害/ノックダウンし、既知または未知のいずれかの遺伝子/タンパク質をノックダウンする、同定されたsiRNAを含む細胞のライブラリーである。各細胞種についてのゲノミクスデータ、プロテオミクスデータおよびセロミクスデータは、ライブラリー特徴のデータベースを構築するために使用され得る。これらの特徴付けられた細胞株は、既知および未知の化合物の細胞分化に対する効果についてスクリーニングする際に使用され得る。
【００７０】
以下の実施例は本発明をさらに例示するが、言うまでもなく、本発明の範囲を限定するものと決して解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００７１】
この実施例は、siRNAライブラリーを調製する方法を実証する[方法１Ａ、図１Ａ〜１Ｃを参照のこと]。ランダムな20merのDNAを、DNA合成機を使用して生成する。この20merを、それぞれBglII(5’)およびPstI(3’)である２つの別個の制限部位で挟む。この20merおよび隣接する制限部位を、PstI部位および3’隣接配列に対して相補的な配列を使用してプライミングする。プライムされた配列を使用して、各20merおよびその制限部位に対する相補鎖を合成および伸長する。
【００７２】
得られた二本鎖DNAの20merを、互いに対して配向されたFRT部位および制限酵素部位(BglIIおよびPstI)ならびにFLPリコンビナーゼのコード配列(Sadowski, PD. 1995, Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 51: 53-91)を有するプラスミド中に、FRT部位間でクローニングした[方法１Ａ、図１Ａを参照のこと]。このプラスミドはpFRTである。20merをこれらのプラスミド中にクローニングした後、これらのプラスミドを細菌中に形質転換した。細菌の形質転換後、FLP酵素をこの細菌中で発現させた。FLP-FRT系の作用にもかかわらず、これらの組換え部位間に元の配列(A)または逆方向配列(B)を含む、単一のプラスミドの同等な混合が生じる。同様に、FLPは、A形態およびB形態の両方からなる合わされたダブルプラスミド(C形態)を生じる。この合わされたプラスミドは２つのDNA挿入物を有し、その第１のDNA挿入物は、第２のDNA挿入物のアンチセンス配列である配列を有する。全ての組換え体プラスミドをこの細菌から単離した。プラスミドpFRTの２つの単離体を調査し、各々を異なる量の誘導されたFLP活性で増殖させた。単離体１は単離体２よりも多いスーパーコイル(sc)のモノマー形態を実証し、同様に、単離体２は単離体１よりも多いダイマー形態およびマルチマー形態を示した(図１０Ａ)。モノマーがFRT部位においてFLP活性を介して互いの中に挿入すると、より高次の形態が生成される。しかし、単離体１および２をpFRTのFRT間で逆転可能な配列の外側で酵素によって消化した場合、全てのスーパーコイルのマルチマー形態が、6.5kbのプラスミドについて予測されたように、3.8kbおよび2.7kbの２つのバンドへと消化された(図１０Ｂ)。
【００７３】
単離体の各々を酵素PstIによって消化すると、いくつかの産物が形成された。モノマーのバンドは、線状のA形態およびB形態のプラスミドを含む(図１Ａ〜１Ｃを参照のこと)。さらに、AおよびBの組み合わせダイマーから得られたCプラスミドは、pFRTのFRT間に非対称的に配置されたPstIによって切断した場合大きい断片および小さい断片を生じた。単離体２は、より高い割合のダイマーを有し、従って、単離体１よりも高い割合のC-ラージおよびC-スモールを生じる(図１０Ａ)。
【００７４】
小さいPstIフラグメント「C-スモール」を単離し、次いで一緒に連結した。得られたプラスミドを第２の酵素(BglII)で消化して、DNAフラグメントの中でもとりわけ、小さい(約50bpの)BglIIフラグメントを生成した。次いで、これらの小さいBglIIが隣接したDNAフラグメント(20ヌクレオチドの配列の逆方向反復を含むカセットを含む)を、U6プロモーターの直ぐ下流かつポリT終結部位の上流で、レトロウイルスベクター中のBamHI部位中にサブクローニングした。得られたベクターは、20mer配列の上流のU6プロモーター、20mer配列に対するアンチセンス配列、および２つの20mer配列を分離する6塩基対の配列を有する発現カセットを含む。最後に、これらの発現ベクターを合わせて、siRNAライブラリー(すなわち、siRNAをコードするライブラリー)を得た。
【００７５】
得られたライブラリーのサンプルを単離し、挿入物の配列を決定した。このライブラリー内の少量のクローンにより、これらの挿入物が別個の配列を有することが明らかとなった。このライブラリー内の配列の例は以下のとおりである(5’から3’で)：
【００７６】
AGGCGTAACCCCATTAGTTTCTGCAGAAACTAATGGGGTTACGCCT(配列番号4)
【００７７】
TCAGGGTTTTACGTATTGTGCTGCAGCACAATACGTAAAACCCTGA(配列番号5)
【００７８】
TGACCGGCAGCAATAGGAGGCTGCAGCCTCCTATTGCTGCCGGTCA(配列番号6)
【００７９】
TGTTTGGGGGGGTGGCTACGCTGCAGCGTAGCCACCCCCCCAAACA(配列番号7)
【００８０】
AAGTGCGACTAAGGCCGTAACTGCAGTTACGGCCTTAGTCGCACTT(配列番号8)
【００８１】
AGCTAGGTGGGGGTCGCTGGCTGCAGCCAGCGACCCCCACCTAGCT(配列番号9)
【００８２】
GAGGGGAGGCCCTCGCTGGGCTGCAGCCCAGCGAGGGCCTCCCCTC(配列番号10)
【００８３】
AACAGTCGGTGCTCAGGCGGCTGCAGCCGCCTGAGCACCGACTGTT(配列番号11)
【００８４】
GGATAGAGGGAGGTCGCGAACTGCAGTTCGCGACCTCCCTCTATCC(配列番号12)
【実施例２】
【００８５】
この実施例は、誘導性siRNAライブラリーを調製する方法を実証する。制限部位(それぞれBglII(5’)およびPstI(3’))で挟まれたランダムな19merの配列を含むオリゴDNAを、DNA合成機を使用して生成する。これらのオリゴDNAを、PstI配列に対して相補的な配列を使用してプライミングする。プライミングした配列を使用して、各19merおよびその制限部位に対する相補鎖を合成および伸長する。
【００８６】
得られた二本鎖DNAの19merを、互いに対して配向したFRT部位およびこのFRT部位間に制限酵素部位(AscIおよびFseI)を有し、これらの部位間にFLP酵素コード配列を含むプラスミド中にクローニングする。一旦19merがこれらのプラスミド中にクローニングされると、これらのプラスミドは、誘導性FLPリコンビナーゼを有する細菌中に形質転換される。細菌の形質転換後、これらの細菌はFLP酵素を発現する。FLP-FRT系の作用にもかかわらず、合わされたプラスミドが生成される。この合わされたプラスミドは２つのDNA挿入物を有し、その第１のDNA挿入物は、第２のDNA挿入物のアンチセンス配列である配列を有する。
【００８７】
全ての組換え体プラスミドをこの細菌から単離する。次いで、これらのプラスミドをPstIで消化し、ゲル精製し(C-ショート)、一緒に再連結する。次いで、プラスミドのこのプールを第２の酵素BglIIで消化し得る。これは、DNAの中でもとりわけ、小さいBglIIフラグメント(約50bp)を生じる。次いで、これらのDNAフラグメントを、T7バクテリオファージプロモーターの直ぐ下流かつT7転写のターミネーター(CATCTGTTTT(配列番号1))の上流で、改変されたpMIGレトロウイルスベクター内のBamH1部位中にサブクローニングする。このクローニング部位の上流に、このpMIGレトロウイルスベクターは、MSCV LTR、その後ろにN末端のSV40核局在化シグナルを含み、エストロゲンレセプター変異体(G521R)(これは、タモキシフェンには応答するがエストロゲンには応答しない)の融合タンパク質として発現されるように改変されたT7ポリメラーゼのコード配列、ならびに内部リボソーム侵入部位およびGFP(緑色蛍光タンパク質)もまた有する(Welsh and Kay, 1997, Curr Opin Biotechnol 8: 617-22)[方法１Ｃ、図３]。各々がランダム19merのセンスおよびアンチセンスのコードカセットを含むこのようなベクターのプールされた集団は、誘導性siRNAライブラリーである。
【実施例３】
【００８８】
この実施例は、誘導性siRNAライブラリーを調製する代替的な方法を実証する。制限部位(それぞれBglII(5’)およびPstI(3’))に挟まれたランダム配列(例えば19mer)を含むオリゴDNAを、DNA合成機を使用して生成する。各ランダム配列およびその制限部位に対して相補的な鎖を合成するために、これらのオリゴDNAをプライミングして使用する。
【００８９】
得られた二本鎖オリゴDNAを、互いに対して配向したFRT部位およびFRT部位間に制限酵素部位(BglIIおよびPstI)を有するプラスミド中にクローニングする。一旦ランダム配列がこれらのプラスミド中にクローニングされると、これらのプラスミドは、誘導性FLPリコンビナーゼを有する細菌中に形質転換される。細菌の形質転換後、これらの細菌を、FLP酵素を発現するように誘導する。FLP-FRT系の作用にもかかわらず、合わされたプラスミドが生成される。この合わされたプラスミドは２つのDNA挿入物を有し、その第１のDNA挿入物は、第２のDNA挿入物のアンチセンス配列である配列を有する。全ての組換え体プラスミドをこれらの細菌から単離する。次いで、これらのプラスミドをPstIで消化し、ゲル電気泳動に供する。
【００９０】
２つのDNA挿入物を含むDNAフラグメントを、ゲル電気泳動を介して同定し(C-ショート)、ゲルから切り出す。これらのフラグメントを自己連結し、BglIIで消化してヘアピンDNAカセットを遊離させ、これを次いで調節ドメインの直ぐ下流でレトロウイルスベクター中にクローニングする。このドメインは、同じ方向で配向した２つのFRT部位が隣接するポリT終結配列からなり、ここで両方のFRT部位は、5’末端または3’末端のいずれかを向いた方向であり、これらのFRT部位およびポリT終結配列は、U6プロモーターとこのU6プロモーターの直ぐ下流にクローニングされたDNAヘアピンカセットとの間に介在する。
【００９１】
これらのレトロウイルスベクターは、エストロゲンレセプター変異体(G521R)(これは、タモキシフェンには応答するがエストロゲンには応答しない)の一部分との融合タンパク質として発現される誘導性FLP、ならびに内部リボソーム侵入部位およびGFPをシスで有し得る。タモキシフェンによる誘導はFLP融合タンパク質の活性を解放して、２つのFRT部位を１つのFRT部位に変形し、介在するポリT終結配列を排除してsiRNAの発現を生じる。各々がランダムな19merのセンスおよびアンチセンスのコードカセットを含むこのようなベクターのプールされた集団は、siRNAライブラリーである。
【実施例４】
【００９２】
この実施例は、siRNAライブラリーを調製するための代替的な方法を実証する。以下の配列(5’から3’で)を有するオリゴDNAを合成する：XhoI制限部位、AAジヌクレオチド配列、ランダム19mer配列、第１のGCリッチな配列(GGCC)、スペーサー配列(GAGA)および第２のGCリッチな配列(GGCC)[方法４、図６Ａ〜６Ｂ]。
【００９３】
第１および第２のCGリッチな配列は自己アニーリングしてループを形成し、これを使用して逆鎖合成をプライミングする。逆鎖合成は室温で実施され、この合成は、テンプレート鎖上の5’制限部位を通って進行する。得られた二本鎖19merを変性ゲル上で分離し、38ヌクレオチドの一本鎖DNAを生じる。ここでこの元の19merは、DNAの第２のGCリッチな領域の後に、この19ヌクレオチドの配列に対してアンチセンスである配列を有する。
【００９４】
この一本鎖DNAを相補的配列5'-GTCGCTCGAGAA(配列番号13)でプライミングし、逆鎖合成を約65℃の温度でTaqポリメラーゼを用いて実施する。得られた二本鎖DNAは、同じ鎖上に、同じ転写方向でセンス19merおよびアンチセンス19merを有する。これらの二本鎖DNAをXhoIで消化し、発現ベクター中にクローニングした。各々がランダムセンス配列およびアンチセンスの19merのランダム配列を含むこのようなベクターのプールされた集団は、siRNA発現ライブラリーである。
【実施例５】
【００９５】
この実施例は、siRNAライブラリーを調製するための代替的な方法を実証する。各々がそれぞれSalI(5’)およびClaI(3’)に挟まれたランダム19mer配列を含み、ポリT終結部位を有するオリゴDNAを、DNA合成機を使用して生成する。これらのオリゴDNAを、このオリゴDNAの3’末端にハイブリダイズする配列を使用してプライミングし、それらの相補鎖を合成する。一方のU6プロモーターが19merのセンス鎖を転写し、他方のU6プロモーターが19merのアンチセンス鎖を転写するように、内側に面した２つのU6プロモーター(センスおよびアンチセンス)を有するpMIGレトロウイルスベクター中に、これら２つのU6プロモーター間にあってこれらのプロモーターの各々に作動可能に連結されるように、得られた二本鎖DNAの19merをクローニングする[方法２、図４Ａ]。各々がランダム19merを含むこのようなベクターのプールされた集団は、siRNAライブラリーである。
【実施例６】
【００９６】
この実施例は、siRNAライブラリーを調製するための代替的な方法を実証する。各々がそれぞれSalI(5’)およびClaI(3’)に挟まれたランダム19mer配列を含み、ポリT終結部位を有するオリゴDNAを、DNA合成機を使用して生成する。これらのオリゴDNAを、このオリゴDNAの3’末端にハイブリダイズする配列を使用してプライミングし、それらの相補鎖を合成する。H1プロモーターが19merのセンス鎖を転写し、U6プロモーターが19merのアンチセンス鎖を転写するように、互いに対して面した１つのU6プロモーターおよび１つのH1プロモーターを有するpMIGレトロウイルスベクター中に、これら２つのプロモーター間にあってこれらのプロモーターの各々に作動可能に連結されるように、得られた二本鎖DNAの19merをクローニングする[方法２、図４Ｂ]。各々がランダム19merを含むこのようなベクターのプールされた集団は、siRNAライブラリーである。
【実施例７】
【００９７】
この実施例は、siRNAライブラリーを調製する代替的方法を実証する。オリゴDNAを、以下の配列を有するようにDNA合成機を使用して生成する：互いに対して(すなわち、ランダム19mer配列の転写を指向するように)配向した19塩基対のT7プロモーターに近位で挟まれ、互いから反対方向で配向したクラスII T7ポリメラーゼ停止配列に遠位で挟まれるランダム19mer配列[方法３、図５]。この19merの5’末端の停止配列は3’から5’の位置で配向され、この19merの3’末端の停止配列は、5’から3’の位置で配向される。別個の制限部位が、この19merの5’末端の制限部位がこの19merの3’末端の制限部位とは異なるように、停止配列にさらに隣接する。
【００９８】
隣接する制限部位を有する19merを、3’制限部位に対して相補的な配列を使用してプライミングする。このプライミングした配列を使用して、各19merおよびその制限部位に対して相補的な鎖を合成および伸長する。
【００９９】
得られた二本鎖DNAの19merを隣接する制限部位で消化し、T7バクテリオファージプロモーターの直ぐ下流で、改変されたpMIGレトロウイルスベクター中にクローニングする。このクローニング部位の上流で、このpMIGレトロウイルスベクターは、内部リボソーム侵入部位およびGFP(緑色蛍光タンパク質)に作動可能に連結されたT7ポリメラーゼのコード配列もまた有する。
【０１００】
各々がセンスおよびアンチセンスのランダム19merを含む得られたベクターのプールされた集団は、siRNA発現ライブラリーである。
【実施例８】
【０１０１】
この方法は、細胞死を導く抗ウイルス応答を誘導せずに、siRNAのサイズ制限を超える二本鎖RNAライブラリーを調製する方法を実証する。
【０１０２】
ヒトcDNAライブラリーを、標準的な方法論によって調製するか、または試薬カタログから購入する。このcDNAライブラリーを、制限酵素(例えばSau3A)を使用して、100塩基対〜1000塩基対のフラグメントへと消化する[方法５、図７Ａ〜７Ｂを参照のこと]。得られたフラグメントを、隣接する反対方向のT7プロモーターによって二方向性転写が駆動されるプラスミド中にクローニングし、ここでこのクローニングされたフラグメントのセンス配列およびアンチセンス配列が共に転写される(例えば、実施例５、６および７を参照のこと)。これらのプラスミドはまた、消化されたcDNAフラグメントとシスでクローニングされたワクシニアのE3L遺伝子を有する。
【０１０３】
各々がランダム19merのセンスコピーおよびアンチセンスコピーを含むプラスミドの得られた集団は、siRNAライブラリーである。哺乳動物細胞にトランスフェクションすると、このライブラリーは、比較的長い(約100塩基対と約1000塩基対との間)の二本鎖RNAを転写し、この二本鎖RNAは二重鎖を形成するだろう。しかし、このライブラリーはE3Lタンパク質もまた発現し、このタンパク質は、長い二本鎖RNAに対するインターフェロン応答を阻害して、細胞死を防止するだろう。これにより、内因性のDICER酵素が長い二本鎖RNAを21塩基対〜23塩基対のsiRNAへとプロセシングすることが可能となるだろう。
【実施例９】
【０１０４】
この実施例は、siRNAコード配列を受容するために使用され得る蛍光コードレトロウイルスレシピエントベクターの生成を実証した。
【０１０５】
IRESおよび緑色蛍光タンパク質を保有するレトロウイルスベクターであるベクターpMIG(Parij s et al)をHpaIで消化し、ccdクローニングカセット(Clontech, Inc)を挿入してpMigCCDを生成した。そのBamH1部位とHindIII部位との間にヘアピンsiRNAスタッファーを含むU6プロモーターフラグメントを、プライマー5'-CACCGAGGAGAAGCATGAATTCC-3'(配列番号14)(センス)および5'-CGTTGTAAAACGACGGCCAG-3'(配列番号15)(アンチセンス)を使用してpSilencer 2.0(Ambion, Inc)から増幅した。このPCRフラグメントをシャトルベクターpTopoEntr(Clontech)中にクローニングし、Clonase反応を使用してpMigCCDと組換えた。これにより、pMig中のIRES-GFPの5’側のU6プロモーターの挿入(プラスミドpMigU6IG)が得られた。このU6プロモーターはIRESに向かって配向している。この手順はまた、得られたプラスミド中のU6プロモーターの5’側にNot1部位を挿入する。プラスミドpMigAdapterU6は、GFPに向かって配向した(すなわち、pMIGU6IG中のU6プロモーターと対向した)、IRES-GFPの3’側のU6プロモーターを含む。pMigベクターをSal1およびClaで消化し、アニーリングしたオリゴヌクレオチド5'TCGACGCGTGACTCGAGTCGGATCCGCGGCCGCAT3'(配列番号16)および5'GCGACTGAGCTCAGCCTAGGCGCCGGCGTAGC3'(配列番号17)からなるアダプター配列を挿入して、ユニークな部位Sal1-Mlu1-PshA1-Xho1-BamH1-Not1-Cla1を挿入した。U6プロモーターを、5'GAGAGCGGCCGCGTCCTTTCCACAAGATAT3'(配列番号18)および5'GCGCCATCGATAAGGTCGGGCAGGAAGAGGG3'(配列番号19)を使用してpSilencer 2.0からPCR増幅し、Not1およびCla1で消化し、このNot1-Cla部位中にクローニングしてpMigAdapterU6を作製した。
【０１０６】
反対方向で２つのU6プロモーターを含む別のベクター(レトロウイルス)を作製した。このプラスミドもまたGFPを発現する。プラスミドpMigU6IGをSalおよびClaで消化し、pMigAdapter U6のSal1＋Cla1消化によって誘導されたU6プロモーターをその中にクローニングして、プラスミドpMigU6IGU6を生成した。別の例において、赤色蛍光および緑色蛍光の両方を発現し、２つのU6プロモーターを含むレトロウイルスプラスミドを、pMigU6IGU6をBgl2で消化し、BamH1部位に挟まれたdsred2の遺伝子中にクローニングすることによって構築した。このdsred2挿入物を、プライマー5'CACGGGATCCACCGGTCGCCACCATG3(配列番号20)および5'CAGCGGATCCTACAGGAACAGGTGGTGGC3'(配列番号21)を用いた、プラスミドpdsred2N1(Clonetech)のPCR増幅ならびに得られた産物のBamH1での消化によって誘導した。この得られたプラスミドはpdsredMigU6IGU6である。
【０１０７】
別の例において、１つのU6プロモーターを含み赤色蛍光のみを発現するプラスミドを構築した。１つのプラスミドは、pdsredMigU6IGU6をNot1で消化し、それを連結して閉じることによって、所望の遺伝子に向かって配向したU6プロモーターを含んだ。別の例において、所望の遺伝子から離れて配向したU6プロモーターを含む赤色蛍光ベクターを、pdsredMigU6IGU6をBamH1およびCla1の両方で消化し、ポリTポリメラーゼIII停止部位とその後ろのHindIII部位とをBamH1部位とCla1部位との間に挿入する配列5'GATCCTTTTTAAGCTTGGAT3'(配列番号22)および5'CGATCCAAGCTTAAAAAG3'(配列番号23)をアニーリングすることによって生成されたアダプターとこれを連結することによって構築して、プラスミドpdsredMigU6BTHCを生成した。
【実施例１０】
【０１０８】
この実施例はsiRNAライブラリーの生成を実証する。
【０１０９】
H1ポリメラーゼIIIプロモーターとその後ろのBamH1およびHindIIIを含むベクターpSilencer puro 3.1(Ambion, Inc.)を、制限酵素BamH1およびHindIIIで消化した。アニーリングしたセンス鎖5'GATCCTTTTTTATCGATAAACCTCGAGTC-3'(配列番号24)およびアンチセンス鎖5'AGCTTACTCGAGGTTTATCGATAAAAAAG-3'(配列番号25)からなるアダプターを、この消化したベクター中にクローニングした。このことは、BamH1部位から始まって以下の部位をベクター中に挿入する:BamHI/ポリメラーゼIII転写物についてのポリT停止部位/Cla1部位、Xho1部位、HindIII部位。得られたプラスミド(pSilpuroAdapter)をXho1およびHindIIIで消化した。Xho1およびHindIIIが隣接したU6プロモーターフラグメントを、プライマー5'-GCGCCAAGCTTAAGGTCGGGCAGGAAGAGGG-3'(配列番号26)(センス)および転写物の安定性を増強させると考えられるU6プロモーター配列のさらなる27bpを含むアンチセンスプライマー:5'-GGCCTCGAGCTGCCGAAGCGAGCACGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG-3'(配列番号27)を用いたU6プロモーター含有プラスミドpSilencer 2.0(Ambion, Inc)のPCR増幅を使用して調製した。PCR産物をHindIII制限酵素およびXho1制限酵素で消化し、H1プロモーターおよびU6プロモーターが互いに対して反対方向になるように、pSilpuroAdapter中にクローニングした。
【０１１０】
siRNAライブラリーを生成するために、得られたプラスミドpSilpuroBCSU6-H1をBamH1およびXho1で消化し、その末端にBgl2部位およびXho1部位を含むように操作されたランダム挿入物を消化し、このプラスミド中にクローニングした。１つの実験において、このランダム挿入物は、配列5'CTTGAGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCGAGTGTACACATGGCGA-3'(配列番号28)を配列5'-TCGCCATGTGTACACTCGAG-3'(配列番号29)とアニーリングさせることによって生成した。これらの配列をKlenow緩衝液を使用してうめ、精製し、クローニングのためにBgl2およびXho1で消化した。別の実験において、pSilpuroAdaptor由来のH1プロモーターおよびアダプタークローニング部位またはpSilpuroBCSU6-H1由来のH1-U6カセットをPCRによって増幅し、pTopoEntr(Invitrogen)中にクローニングし、次いでClonaseリコンビナーゼを用いてpLenti6/Block-it-DESTベクター(Invitrogen)中にクローニングして、ランダムヘアピンのレンチウイルスベクター中へのクローニングを容易にした。
【０１１１】
得られたライブラリーのサンプルを単離し、挿入物の配列を決定した。このライブラリー内の少量のクローンにより、これらの挿入物が別個の配列を有することが明らかとなった。このライブラリー内の配列の例は以下のとおりである：
【０１１２】
ATTTCTAAAGGCGTGTCCGA(配列番号30)
【０１１３】
CCTCTTGGACTGATACAGCT(配列番号31)
【０１１４】
GATGTTCGAGCCAGAGGTCT(配列番号32)
【０１１５】
CCTCAGTGAGGCCAATTGAG(配列番号33)
【０１１６】
GTTCTTGTCTTAAACGGAGG(配列番号34)
【０１１７】
ATCCGCTTGTAATCTACAGG(配列番号35)
【０１１８】
TCACTTTTATGGGGTCATTA(配列番号36)
【０１１９】
CGGTTTGCAATTGCAAGCAT(配列番号37)
【０１２０】
CTTTCGAGGCAGGGCTCTGA(配列番号38)
【０１２１】
ACACCTCTGCTGATCAAATT(配列番号39)
【０１２２】
TATGCGGCGTTCAGACCGCA(配列番号40)
【０１２３】
ATCGCTGTGACTTCATGACA(配列番号41)
【０１２４】
TAACAAATGCGCTACGTCCT(配列番号42)
【０１２５】
ATCAGGCGGAGTATAGTTTC(配列番号43)
【０１２６】
AGTACCTTTTGCGCCTCTCC(配列番号44)
【実施例１１】
【０１２７】
この実施例は、遺伝子発現の有効な阻害を有するsiRNAが、実施例１中に記載されるリコンビナーゼアプローチを使用して生成され得ることを実証する。この実施例において、エストロゲンレセプターα(ERα)を阻害するsiRNAが使用されるが、これは、ランダム配列または半ランダム配列の代用である。
【０１２８】
エストロゲンレセプターαの２つの21bpの配列一致部分を、リコンビナーゼによるsiRNAの生成のためのテンプレートとして選択した。これらの配列は以下のとおりであった：
【０１２９】
AAGGCCTTCTTCAAGAGAAGT(配列番号45)
【０１３０】
AAGATCACAGACACTTTGATC(配列番号46)
【０１３１】
投入として各21bpの配列を使用して、ds-RNAコードヘアピンを生成した。図１Ａ〜１Ｃ中に示される方法を使用してヘアピンを生成した。得られたヘアピンの配列は以下のとおりであった：
【０１３２】
AAGGCCTTCTTCAAGAGAAGT-GGTAACC-ACTTCTCTTGAAGAAGGCCTT(siRNA#1)(配列番号47)
【０１３３】
AAGATCACAGACACTTTGATC-GGTAACC-GATCAAAGTGTCTGTGATCTT(siRNA#2)(配列番号48)
【０１３４】
半ヘアピン(配列番号46および47)をコードする配列を有するこれらのオリゴDNAを発現プラスミド中にクローニングした。プラスミド名「siR1」および「siR4」はこのsiRNA#1配列をコードし、プラスミド名「siR7」および「siR11」は、このsiRNA#2配列をコードした。
【０１３５】
ERα発現に対するsiRNA#1配列およびsiRNA#2配列の効果をアッセイするために、CV-1細胞に、ERα発現プラスミド、試験siRNAコードプラスミド(すなわち、siR1、siR4、siR7およびsiR11のうち１つまたはコントロールプラスミドC1およびC2)、ERE-tk-ルシフェラーゼレポータープラスミドおよびCMV-β-galコントロールプラスミドを同時トランスフェクトした。次の日、新たな培地または100nMの17-β-エストラジオール(E2)を含む培地のいずれかを細胞に与えた。処置の24時間後、これらの細胞を回収し、(A)ERαおよびアクチンの発現についてウェスタンブロットによって、または(B)ルシフェラーゼおよびβ-galレポーター遺伝子の活性についてアッセイした。siR1、siR4(両方とも上記配列siRNA#1を有する)、siR7またはsiR11(両方とも上記配列siRNA#2を含む)のトランスフェクションは、ERαタンパク質発現およびE2誘導性のERα転写活性の低下を生じたが、ベクターコントロール(C1およびC2)はそれらを生じなかった。これらの結果は図９中にグラフで示される。これらの結果は、siRNA#1配列およびsiRNA#2配列の両方がERα発現を減弱させることが可能であり、従って、これらがsiRNA配列であることを実証している。
【０１３６】
上記のように、ERα siRNAがこの実施例においてランダム配列または半ランダム配列の代用として使用されているが、本発明は、以下から選択される少なくとも10個連続する核酸を含むかまたはこのような核酸から本質的になる核酸分子を提供する：AAGGCCTTCTTCAAGAGAAGT(配列番号45)、AAGATCACAGACACTTTGATC(配列番号46)、AAGGCCUUCUUCAAGAGAAGU(配列番号49)およびAAGAUCACAGACACUUUGAUC(配列番号50)。いくつかの実施形態において、本発明の核酸は、２つの配列のいずれかに由来する少なくとも約15個連続する核酸を含むかまたはこのような核酸から本質的になり得る。望ましくは、本発明の核酸はsiRNAまたはshRNAであり、ERαの発現を減弱し得る。しかし、この核酸はDNAでもあり得る。例えば、この核酸は、この核酸をRNAとして発現し得る発現カセット(通常はDNAを含む)の一部を形成し得る。発現カセットは、適切なプロモーター、コード配列および終結配列を含む。このような発現カセットは、細胞内でRNAになるように細胞中への導入に適切なベクター系(例えば、プラスミドまたはウイルスの発現ベクター系)中に操作され得る。プラスミドおよびウイルスの発現ベクターを構築することは当業者の範囲内である。
【０１３７】
本発明の核酸は、ERαの発現を減弱させるために使用され得、本発明は、本発明の核酸を使用してERαの発現を減弱させるための方法を提供する。本発明の方法によれば、本発明の核酸は、本発明の核酸が細胞内でERαの発現を減弱させる条件下で、ERαを発現する細胞中に導入される。この細胞は、in vivoまたはin vitroのいずれかであり得る。本発明の核酸がRNA分子(例えば、siRNAまたはshRNA)として細胞に提供される場合、これらは、当業者に公知の形質導入方法を使用して細胞中に導入される。あるいは、本発明の核酸分子は、siRNAまたはshRNAのような核酸をコードする発現カセットを含む発現ベクターでこの細胞をトランスフェクト、形質導入または感染することによってこの細胞に提供され得る。このような実施形態において、このRNAは細胞内で産生され、この場所でこのRNAは、ERαの発現を減弱させるためのsiRNAまたはshRNAとして作用し得るだろう。
【０１３８】
本明細書中に列挙される全ての参考文献(刊行物、特許出願および特許を含む)は、各参考文献が参考として援用されると個々にかつ具体的に示され、その全体が本明細書中で示されたのと同じ程度まで、本明細書中で参考として援用される。また、他の刊行物に対する本明細書中の言及は、このような刊行物が本願の前に構成されたことを認めるものではない。
【０１３９】
本発明を説明することに関して(特に、添付の特許請求の範囲に関して)用語「a」および「an」および「the」ならびに同様の指示対象の使用は、本明細書中で他のように示されるかまたは文脈によって明確に否定されるかしない限り、単数形および複数形の両方をカバーすると解釈されるべきである。用語「含む(comprising)」、「有する」、「含む(including)」および「含む(containing)」は、他のように示されない限り、開放型の用語(すなわち、「〜を含むがこれらに限定されない」を意味する)と解釈されるべきである。本明細書中の値の範囲の列挙は、本明細書中で他のように示されない限り、その範囲内に入る各別個の値を個々に参照する簡略な方法として働くことが意図されているだけであり、各別個の値は、それが本明細書中で個々に列挙されているかのごとく本明細書中に組み込まれる。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中で他のように示されるかまたは文脈によって明確に否定されるかしない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書中に提供される任意および全ての例または例示的語句(例えば、「例えば/〜のような」)の使用は、本発明をよりよく例示するためだけに意図されているのであり、他のように特許請求されない限り本発明の範囲に対する限定ではない。本明細書中の語句は、任意の特許請求されていない要素を本発明の実施に必須であるとして示していると解釈すべきではない。
【０１４０】
本発明を実施するための本発明者らが知る最良の様式を含む本発明の好ましい実施形態が本明細書中に記載される。好ましい実施形態のバリエーションは、上記の説明を読んだときに当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者が適切な場合にこのようなバリエーションを使用することを予測しており、本発明者らは、本発明が本明細書中に具体的に記載されているのとは異なって実施されることを意図している。従って、本発明は、適用可能な法律によって許容されるような本明細書に添付された特許請求の範囲中に列挙される対象の全ての改変および等価物を含む。さらに、その全ての可能なバリエーションにおける上記の要素の任意の組み合わせが、本明細書中で他のように示されるかまたは文脈によって明確に否定されるかしない限り、本発明によって包含される。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１Ａ】図１Ａは、DNAヘアピンおよびランダムsiRNAライブラリーを生成するための方法を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、DNAヘアピンおよびランダムsiRNAライブラリーを生成するための方法を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、DNAヘアピンおよびランダムsiRNAライブラリーを生成するための方法を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、誘導性FLPリコンビナーゼを使用してランダムsiRNAライブラリーの発現を調節するための方法を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、誘導性FLPリコンビナーゼを使用してランダムsiRNAライブラリーの発現を調節するための方法を示す。
【図３】図３は、誘導性T7ポリメラーゼを使用してランダムsiRNAライブラリーの発現を調節するための方法を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、PolIIIプロモーターを使用する二方向性アプローチを使用してランダムsiRNAライブラリーを構築するための方法を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、PolIIIプロモーターを使用する二方向性アプローチを使用してランダムsiRNAライブラリーを構築するための方法を示す。
【図５】図５は、T7プロモーターを使用する二方向性アプローチを使用してランダムsiRNAライブラリーを構築するための方法を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、自己アニーリングするヘアピンを使用してランダムsiRNAライブラリーを生成するための方法を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、自己アニーリングするヘアピンを使用してランダムsiRNAライブラリーを生成するための方法を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、cDNAライブラリーをsiRNAライブラリーへと適合させる方法を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、cDNAライブラリーをsiRNAライブラリーへと適合させる方法を示す。
【図８】図８は、ランダムsiRNAライブラリーの使用を示すフローチャートである。
【図９】図９は、本発明の方法に従って調製されたsiRNAを使用したエストロゲンレセプターαの阻害を実証する実験の結果を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、下記の方法１に従う、FLP-FRT系を使用したランダムsiRNAライブラリーの構築における工程を実証するゲルを示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、下記の方法１に従う、FLP-FRT系を使用したランダムsiRNAライブラリーの構築における工程を実証するゲルを示す。
【技術分野】
【０００１】
(関連出願の相互参照)
本出願は、米国仮特許出願60/469,169号(2003年5月9日出願)の優先権を主張し、その全体が本明細書中に参照することによって組み込まれる。
【０００２】
(発明の分野)
本発明は、短鎖干渉RNA(siRNA)ライブラリー、特にランダムまたは半ランダムのsiRNAライブラリー、このようなライブラリーを調製するための方法およびこのようなライブラリーを使用するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
(発明の背景)
短鎖干渉RNA(siRNA)は、一致する配列を含む細胞内の任意のRNAを特異的に破壊する二本鎖RNAである。この様式において、siRNAは、RNA干渉(RNAi)として公知の現象を介した、種々の遺伝子(癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子を含む)の有効なサプレッサーである。RNA干渉は、二本鎖RNAを利用する細胞系を介して遺伝子発現を破壊する。この現象の認識は、Caenorhabditis elegansにおいて最初に同定された(例えば、Fire et al., Nature 391, 806-811(1998)を参照のこと)。より最近、2ヌクレオチドの3’オーバーハングを有する21ヌクレオチドまたは22ヌクレオチドの二本鎖RNAが、哺乳動物細胞においてRNAi活性を示すことが報告されている(例えば、Elbashir et al., Nature 411, 494-98 (2001)およびCaplen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 9742-47 (2001)を参照のこと)。Miyagishi et al.は、短いDNA配列のセンスバージョンまたはアンチセンスバージョンのいずれかの転写を別々に駆動する２つのU6 RNAポリメラーゼIIIプロモーターを使用したsiRNA発現ベクターの構築を記載した。転写後、siRNAは、RNA転写物のセンス鎖とアンチセンス鎖との間での二重鎖形成から誘導された(Miyagishi et al., Nature Biotech. 19,497-500 (2002) を参照のこと)。Brummelkamp et al.は、同じ19ヌクレオチドの遺伝子特異的挿入物のアンチセンス配列から短いスペーサー配列によって分離された19ヌクレオチドの遺伝子特異的挿入物(センス)に連結されたポリメラーゼ-III H1-RNA遺伝子プロモーターを使用して哺乳動物発現ベクターを構築した。得られたRNAの相補的性質により、これらの転写物は19塩基対のステム-ループ構造を形成した(Brummelkamp et al., Science,296, 550-553(2002)を参照のこと)。
【０００４】
RNAiは、機能ゲノミクスのための強力なツールとして働き得るであろう。例えば、Kamath et al.は、C. elegansにおける遺伝子の表現型同定を試みるための干渉RNA系を記載した(Kamath et al., Nature 421,231-237 (2003)を参照のこと)。彼らの特定のアプローチは、数百塩基対長の二本鎖RNA配列を使用した。しかし、このアプローチは、高等生物(例えば、哺乳動物の系(ここでは、二本鎖RNAが30塩基対長を超えると、ｍRNAおよびタンパク質の翻訳を非特異的に阻害するインターフェロン経路を介した宿主の防御応答が誘導される))における適用には適切でないだろう。Kamath et al.によって記載された系は、実質的により長い二本鎖RNAを使用したので、哺乳動物細胞における使用には適切でないだろう。さらに、Kamath et al.の系は、ヌクレオチドのランダムな組み合わせからは生成されず、従って、機能ゲノミクス適用のために広く適用可能であるわけではないだろう。
【０００５】
高等生物の機能ゲノミクスのために、12〜25ヌクレオチド長の短い二本鎖RNAのセットが有用であろう。この長さの二本鎖RNAは宿主防御応答を誘導しない。最適には、機能ゲノミクスは、生物の全ての遺伝子が少なくとも１つのsiRNAによって統計的に示されるように、各々がユニークな配列を有するsiRNAの大きいセットを必要とする。このような「siRNAライブラリー」(すなわち、siRNAのランダムまたは半ランダムなセットを含む)は、高等生物(例えば哺乳動物細胞)において生じた表現型を担う特定の遺伝子またはウイルスの同定を容易にし得るだろう。
【０００６】
創薬および疾患の緩和のためのsiRNAライブラリーの望ましさは、ライブラリー構築への２つの最近のアプローチを促進した。第１の「ブルートフォース(brute force)」アプローチは、伝統的な方法を使用して、１度に１つの遺伝子に対して指向されるsiRNA配列を生成させ、これらをプールしてsiRNAライブラリーを形成する(Boutros, M, et al, Science, 303 (5659): 832-35. (2004)、Paddison, PJ et al, Nature; 428 (6981) : 427-31 (2004) )。第２のアプローチは、酵素Mme1を使用してcDNAをsiRNAのための20bpのテンプレートへと消化することによって、プールされたcDNAからsiRNAライブラリーを誘導する(Sen et al., Nat Genet. ; 36 (2): 183-89 (2004); Shirane et al., Nat Genet. ; 36 (2): 190-96 (2004))。
【０００７】
siRNAライブラリーを生成する「ブルートフォース」法は多数の制限を有する。このアプローチに関与する作業量は膨大であり、このようなライブラリーは数種の生物について報告されているにすぎない。さらに、「ブルートフォース」ライブラリーおよびcDNA由来ライブラリーの両方において、いくつかの理由のために多数の欠如が予測される。第１に、このようなライブラリーはコードRNAのみを減弱させる。これらのアプローチにおいて使用されるコードRNAは、ゲノムの約4%を構成することに留意すべきである。非コードRNAは、経路の調節およびタンパク質の封鎖(sequestration)を含む、細胞における重要な機能的役割を果たすことがますます認識されている。例えば、非コードRNAであるSCA8は、神経変性を引き起こすことが示されている(Mutsuddi, M. et. al., Curr. Biol., 14, 302-08 (2004) )。全ての機能的非コードRNAは、指向された(「ブルートストレングス(brute-strength)」)ライブラリーおよびcDNAから誘導されたライブラリーの両方において欠如するであろう。第２に、siRNAは、ゲノムDNAの特定の領域のヘテロクロマチン形成を誘発し得、プロモーターのサイレンシングおよびおそらく他の効果を生じる(Volpe et al. Science; 297 (5588):1833-37 (2002))。非常に永続性があり得るであろう、いかなるこのようなゲノム効果も、指向された(「ブルートストレングス」)ライブラリーおよびcDNAから誘導されたライブラリーの両方において欠如するであろう。第３に、指向された(「ブルートストレングス」)ライブラリーおよびcDNAから誘導されたライブラリーは、これらのライブラリーがそれ用に設計された組織および生物以外の組織および生物の遺伝子を減弱させるのに充分適しているわけではない。従って例えば、このようなライブラリーは、新生および未知のウイルスの遺伝子を減弱させる際にはほとんど役に立たないだろう。第４に、siRNAライブラリーを生成するためのブルートフォースクローニングのさらなる制約は、このアプローチが、75%を超えて抑制性の配列を収集する可能性があることである。タンパク質が50%減弱されるといくつかの表現型がシフトし、このタンパク質がいっそうひどく抑制されると再度シフトする(例えば、Muraoka RS Mol Cell Biol. 2002 Apr; 22 (7): 2204-19を参照のこと)。これらのアプローチの第５の制約は、どれもそれほど効率的でないことである。例えば、ブルートフォースアプローチは、非常に時間がかかり、スプライスバリアントに関して欠陥を含む。重要な生理学的遺伝子(例えば、p53、p73、サイクリン)は、その機能において変動する多数のスプライス形態で発現される。いくつかのスプライス形態は、互いに反対の効果を有する。遺伝子の全てのスプライスバリアントを標的化する干渉RNAは、ポジティブに作用するスプライス形態およびネガティブに作用するスプライス形態の両方を減少させる場合には大きな影響を有さない可能性がある。cDNAベースのライブラリーに対する第６の主要な欠点は、これらのライブラリーが一般的なメッセージに対して指向されたsiRNAまたはshRNAの大量の過剰提示を含み、その一方で最も興味を持たれる標的遺伝子(例えば、転写レギュレーター、ホスファターゼ)の多くが低レベルで発現されることである。
【０００８】
指向された「ブルートストレングス」ライブラリーおよびcDNAベースのライブラリーの制約の各々は、ランダムsiRNA配列からなるライブラリーによって対処することが可能であろう。しかし、ランダムsiRNAの合成は充分確立されておらず、ランダムsiRNAライブラリーの構築はこれまで実証されていない。siRNAライブラリーの生成を挫折させているのは、未知の配列を有するランダムDNAオリゴマーをそれらの正確な相補配列に結合させること（ここで、このような構築物の生成は、所望の長さのオリゴマー中のヌクレオチドの全ての組み合わせをカバーするのに充分である。テンプレートDNAオリゴマーからの二本鎖RNA二重鎖の形成が必要であることは、克服すべきさらなるハードルである）の困難さである。
【０００９】
Miyagashi et al. (Nature Biotech., 19, 497-500 (2002) )は、対向するU6プロモーター系が、ランダム化されたsiRNAライブラリーの生成を可能にし得ることを推測した。しかし、このMiyagashiの報告は、このようなライブラリーの構築を全く開示しておらず、さらなる技術的特徴を開示することもこのようなライブラリーの構築に関する指示を提供することも全くしていない。
【００１０】
米国特許出願公開20040005593(Lorens)は、干渉RNA分子のランダムライブラリーが、制限部位、ランダム化されたsiRNA配列、相補性領域の配列およびヘアピン形成リンカー配列(任意選択で、Uターンモチーフ、リボザイムおよび/またはヘアピン構造もしくはステム-ループ構造を形成する２つの相補的配列)を含むオリゴヌクレオチドのプールを合成することによって構築され得ることを推測している。公開されたLorensの出願によれば、これらのオリゴヌクレオチドはヘアピン構造をとり、このヘアピン構造は、DNAポリメラーゼの基質として機能し、ランダム化されたsiRNA配列の相補配列の合成を促進するのだろう。公開されたLorensの出願によれば、このヘアピン構造は次いで変性され、3’末端でプライマーとハイブリダイズして、DNAポリメラーゼによる二本鎖DNAへの総配列の転換を可能にする。次いで、siRNA配列のランダムな取り合わせをおそらくコードする二本鎖オリゴヌクレオチドがレトロウイルスベクター中にクローニングされて、siRNA発現ベクターライブラリーを生成する。しかし、公開されたLorensの出願は、ランダムsiRNAライブラリーの構築を全く開示していない。さらに、Lorensによって提唱されたアプローチはランダムライブラリーを生じないであろう。Lorensのアプローチの首尾よい適用のための技術的ハードルは、このヘアピン構造がそれ自体に対する高い相同性を有し、自己アニーリングする傾向があることである。従って、相補鎖プライミングを促進するためには、テンプレートよりも大過剰の量のプライマーを使用する必要があろうが、これはLorensによって教示されていない。ヘアピン構造の高い自己相同性の別の結果は、Lorensによって開示されたアプローチに従うなら、自己アニーリングが実際には非ランダムライブラリーを導くことである。ヘアピン構造の自己アニーリングは相補鎖の重合を妨げるだろう。このような重合が自己アニーリングを防止する条件下で生じない限り、GC含量に富んだ領域はAT含量に富んだ領域よりも自己アニーリングする可能性が高く、従って、GCリッチな配列がこのプロセスにおいて意に反して選択されるだろう。Lorensは、重合の前のヘアピンの変性(これは、プライマーの結合を可能にする任意の事象において必要である)を要する。しかし、Lorensは、この重合がヘアピン構造の変性を維持する条件下で生じることを具体的に述べていない。従って、Lorensのアプローチによって生成されたライブラリーにおける配列の配分は、GCリッチではない配列と比較して、GCリッチな配列に関して非ランダムであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
既存の技術に関する欠陥を考慮すると、ランダムsiRNAライブラリー(siRNAコードライブラリーおよびshRNAコードライブラリーを含む)を生成し得る新たな合成方法が必要とされる。このような方法および得られたライブラリーは、多くの仕事(例えば、目的の遺伝子の同定、遺伝子機能の分析および治療的に有用なsiRNA配列の同定)を容易にするであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
(発明の簡単な要旨)
一面において、本発明は、ランダムsiRNA(コード)ライブラリーを提供する。本発明の別の一面は、siRNAライブラリーの構築のための方法である。この方法は、適切な宿主細胞においてこのランダム配列の逆方向反復[センス-アンチセンス]を生成するための部位特異的リコンビナーゼ部位を含むベクター中にクローニングされ、次いで、それらがアニーリングすると相補的なステム-ループRNAを生成するように、RNAポリメラーゼプロモーターを有する発現ベクター中にクローニングされ得る、ランダムオリゴデオキシリボヌクレオチドの集団を生成することを含む。このランダムヘアピン[センス-アンチセンス]配列は、ベクター中に単独でクローニングされ得るか、複数の直列の挿入物としてクローニングされ得るかのいずれかである。あるいは、このランダム配列は、ステム-ループを生成する自己プライミングポリメラーゼ反応のためにアニーリングするように操作され、その後発現ベクター中にクローニングされ得る。別の一面において、siRNAライブラリーは、cDNAライブラリーを消化して、これらの消化物が２つの対向するRNAポリメラーゼプロモーターに挟まれるようにこれらの消化物をプラスミド中にクローニングすること、または２つのRNAポリメラーゼプロモーター間にランダムオリゴヌクレオチドライブラリーをクローニングすることのいずれかによって、生成され得る。
【００１３】
別の一面において、本発明は、例えば目的の表現型を媒介する候補遺伝子を同定するためにsiRNAライブラリーを使用する方法を提供する。このsiRNAライブラリーは細胞の集団中に導入される。次いで、この細胞の集団は、集団の残部とは異なる挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な特性を示す細胞の部分集団を選択するために選択プロセスに供される。選択プロセスの後、細胞の部分集団(すなわちサブセット)は、所望に応じて単離、分析および/またはクローニングされ得る。部分集団のこのような分析は、集団の残部と比較して異なるこの部分集団の特性を担うsiRNA種の同定であり得る。あるいは、この部分集団は、ゲノミクスアッセイ、プロテオミクスアッセイおよび/またはセロミクスアッセイによってさらに分析され得る。このようなゲノミクスアッセイ、プロテオミクスアッセイおよび/またはセロミクスアッセイが使用される場合、この方法は、いくつかの有用なバイオインフォマティクス産物を生成し得る。
【００１４】
本発明によって記載されるsiRNAライブラリーは、癌、細胞分化、ウイルス感染、細菌病原性、代謝経路、シグナル伝達経路、溶解経路(lytic pathway)に関与する重要な遺伝子の迅速な機能的同定ならびに表現型分析に依存する他の研究分野において有用である。このプロセスを介して同定された特異的siRNAは、直接的な治療的価値を有し得る。
【００１５】
本発明の別の一面は、siRNAライブラリーを構築するのに使用するための、かつ/または構成的および誘導性様式の両方で単一のsiRNAおよびsiRNAライブラリーを発現し得るベクター系である。
【００１６】
本発明のこれらの面および利点ならびにさらなる発明的特徴は、添付の図面からおよび以下の詳細な説明を読んだ際にさらに明らかとなろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
(発明の詳細な説明)
本発明の文脈において、「siRNA」(短鎖干渉RNA)は、二本鎖構造を有するRNAの１種であり、その各々の鎖は、約12ヌクレオチド長と約35ヌクレオチド長との間である。siRNAは、相補的塩基対合を介してのみ結合する２つの別個の鎖を含み得るか、またはsiRNAは、センス鎖とアンチセンス鎖との間にループを有する一本鎖であり得るかのいずれかである。これらは一緒に折り畳まって、細胞内でプロセシングされて純粋に二本鎖のsiRNAを作る、ヘアピンループまたは短鎖ヘアピンRNA(shRNA)を作る。
【００１８】
本発明の一面は、ランダムまたは半ランダムのsiRNAライブラリーである。この文脈において、「siRNAライブラリー」は、siRNAもしくはshRNAを含むかまたはこれらをコードする別個の配列の収集である。従って、このライブラリーは、DNAまたはRNAのいずれかを含み得る。DNAを含むsiRNAライブラリーの例は、siRNAまたはshRNAをコードする別個の配列を含むDNAベースの発現ベクター(例えば、プラスミド、ウイルスなど)のライブラリーである。これらのDNAベクターは、ベクター内のDNA配列を転写するのに適切な環境(例えば、細胞系もしくは細菌系、または適切なin vitro転写環境)中に導入されると、siRNAまたはshRNAを産生する。次に、細胞内で、各shRNAはsiRNAへとプロセシングされる。DNAを含むsiRNAライブラリーの別の例は、shRNAをコードする別個の配列を含むDNAベースの発現ベクターを含む細胞の集団である。RNAを含むsiRNAライブラリーの例は、別個のsiRNA種またはshRNA種の収集である。
【００１９】
本発明のライブラリーは、ランダム配列もしくは半ランダム配列(または留意されるように、このような配列をコードするDNA)を有するsiRNAまたはshRNAの収集である。このライブラリーは半ランダムであり得るが、真にランダムなsiRNAライブラリーまたはshRNAライブラリーが最も望ましい。なぜなら、このようなライブラリーは、等しい割合で全ての可能な配列を含み得るからである。また、高等生物の細胞(または高等生物に由来する細胞株)におけるゲノミクス試薬としての使用のために、このライブラリー内のRNAは細胞の宿主防御系を回避するのに充分短いことが非常に望ましいが、このsiRNAは、センス-ループ-アンチセンス構造を形成し、細胞内で相補的RNA種に対する活性を有するのに充分長くなければならない。従って好ましくは、このライブラリー内のsiRNAまたはshRNAは、約10より長い、例えば約12ヌクレオチドと35ヌクレオチドとの間、または約15ヌクレオチドと約30ヌクレオチドとの間、より典型的には約17ヌクレオチドと約23ヌクレオチドとの間のランダムセンス配列を有し、19merまたは20merの配列が最も典型的である。
【００２０】
ランダムなsiRNAライブラリーまたはshRNAライブラリーは、高発現した標的(例えばアクチン)を減弱させる確率と実質的に等しい確率で低発現した標的または稀にしか発現しない標的を減弱するために使用され得る。ランダムライブラリーは、表現型によって選択可能な等級付けされた応答を生じるために、siRNAもしくはshRNAを含むかまたはこれらをコードする。ランダムなsiRNAライブラリーまたはshRNAライブラリーは、スプライス形態特異的RNAi配列、ならびにゲノムDNA配列(例えば、コードDNAおよび非コードDNAの両方)を標的化し得る配列を含む。真にランダムなライブラリーは、未知の配列(例えば新生の疾患、未知のウイルスまたは人工変異体において見出される配列)に対して指向されるsiRNAコード配列またはshRNAコード配列を含む。従って、本発明のランダムまたは半ランダムのsiRNAライブラリーまたはshRNAライブラリーは、健康および安全性に対するこのような潜在的脅威中の配列の発現を調節するために特に有用である。ランダムライブラリーの完全性はまた、多様な組織、種および遺伝子バリアントの設定におけるその使用を促進する。
【００２１】
ランダムまたは半ランダムのsiRNAライブラリーまたはshRNAライブラリーは、任意の適切な方法に従って作製され得る。しかし、本発明の別の一面は、siRNAライブラリーまたはshRNAライブラリーを調製するための方法を提供する。
【００２２】
本発明の方法の１実施形態によれば、少なくともそれらの配列の一部分として上記のランダムヌクレオチドまたは半ランダムヌクレオチドを有するオリゴデオキシリボヌクレオチド(オリゴDNA)の集団が最初に合成される。任意の適切な方法(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、RNAライブラリーの逆転写、生物からのDNAフラグメントの単離、ヌクレオチド重合の任意の他の手段)が、オリゴDNAの集団を生成するために使用され得る。しかし、好ましい方法は、標準的なオリゴDNA合成機構を使用することを含み、この機構は、合成の間に４種のヌクレオチドの推計学的にランダムな混合物を使用することによってランダム配列または半ランダム配列の集団を産生し得る。
【００２３】
オリゴDNAの開始集団はランダム配列または半ランダム配列を含むが、この開始オリゴDNAの全体がランダムまたは半ランダムである必要はない。実際、１つの好ましい実施形態において、このランダム配列または半ランダム配列は、予め選択された5’制限酵素部位および3’制限酵素部位に挟まれている。この実施形態において、このランダム配列または半ランダム配列に隣接する制限酵素部位は同じでも異なってもよいが、クローニング後の構築物の操作を容易にするために、この3’制限部位は5’制限部位とは異なることが好ましい。また、このような制限酵素認識部位は、少なくとも6ヌクレオチド、より好ましくは8ヌクレオチドを含むことが好ましい。なぜなら、これにより、クローニングの間の引き続く制限消化の後にランダムオリゴDNAまたは半ランダムオリゴDNAが失われる可能性が低くなるからである。さらに、この制限部位は、消化後に粘着性であって平滑末端を生じないことが好ましい。なぜなら、これにより、クローニングの間の相補的末端の容易なライゲーションが促進されるからである。オリゴDNAの3’末端および5’末端中に操作するための好ましい制限部位には、AscI、FseI、BglII、BstEII、PstI、NotIおよびEagIが含まれるが、当業者は、他の部位が適切に使用され得ることを理解するだろう。
【００２４】
ランダム配列または半ランダム配列に隣接する5’制限部位および3’制限部位を含むように操作されたオリゴDNAのこのような集団は、成熟したセンス-スペーサー-アンチセンス配列を構築するために適切なベクター中にクローニングされ得る。通常、ベクター中への挿入の前に、一本鎖オリゴDNAの集団がプライミングされる。これらのオリゴDNAには制限部位が隣接し、プライミング配列がその後に続く。好ましくは、このランダム配列は、約15ヌクレオチドと約30ヌクレオチドとの間、最も好ましくは約20ヌクレオチドである。このプライミング配列は、好ましくは少なくとも約5ヌクレオチドである。相補鎖は標準的な方法論によって合成される。
【００２５】
好ましい実施形態において、これらのオリゴDNAは、部位特異的リコンビナーゼに対する２つのリコンビナーゼ結合部位を有するプラスミド中にクローニングされ得、このプラスミドにおいて、各リコンビナーゼ結合部位内の中心のスペーサー配列は、他方の部位に対して反対方向である。このようなリコンビナーゼ部位は、例えば、２つのFRT(これらはFLPリコンビナーゼによって認識される)または２つのloxP部位(これらはcreリコンビナーゼによって認識される)あるいは任意の他の適切なリコンビナーゼおよびその認識配列であり得、そのうちいくつかは当該分野で公知である(Sadowski, PD. 1995, Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 51: 53-91)。これらのオリゴDNAは、２つのこのような反対方向のリコンビナーゼ部位間でプラスミド系中にクローニングされる。なぜなら、このような方向は、これらの部位間に配列の逆方向反復を生成することによってセンス-スペーサー-アンチセンス構築物を生成するために必要とされるからである。より好ましくは、これらのオリゴDNAは、オリゴDNA内の制限部位が２つのリコンビナーゼ認識配列間ではあるがそのうち一方の近傍にあるようにこのようなプラスミド中に導入され、その結果、このオリゴDNAはFRT間に非対称的に配置される[例えば、90%：10%][方法１Ａ-図１Ａ〜１Ｃを参照のこと]。
【００２６】
二重リコンビナーゼ部位-オリゴDNAカセットを含むこのようなプラスミドが生成された後に、プラスミドの集団は、プラスミド中に存在する特定のリコンビナーゼ認識部位に適切なリコンビナーゼ酵素を産生する宿主細胞の集団中に導入される。望ましくは、このような宿主細胞は細菌であるが、培養物中で容易に増殖する他の細胞(例えば、酵母、形質転換細胞株など)であり得る。さらに、この宿主細胞集団はリコンビナーゼ酵素を発現することが望ましく、１つのアプローチにおいて、この宿主細胞集団は所望のリコンビナーゼ酵素を誘導可能に発現する。好ましい実施形態において、このオリゴDNAのために使用されるプラスミドはまた、細菌[例えば、E. coli]においてリコンビナーゼ(例えばFLP)を誘導可能に発現するように操作される。このプラスミドは、構成的または誘導性のいずれかの様式でリコンビナーゼを発現し得、宿主細胞が適切なリコンビナーゼ酵素をコードする必要性をなくす。このプラスミド構築物による宿主細胞の形質転換は、当該分野で公知の任意の適切な様式(例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介性の方法、DEAE-デキストラン媒介性の方法、塩化カルシウム媒介性の方法、Hanahan法、Inoue法、化学的処理媒介性の方法および当該分野で公知の他の技術)によって達成され得る。しかし、１つより多くのプラスミドが単一の宿主細胞に入る可能性を低下させる比率でこれらのプラスミドを宿主細胞中にトランスフェクトすることが望ましい。好ましくは、このプラスミド構築物は、約1:1(プラスミド:細胞)の比率で宿主細胞中に形質転換される。
【００２７】
平均的な哺乳動物の遺伝子は約2400nt長であるので、ライブラリー全体は、所定の遺伝子を標的化する縮重配列を含み得る(例えば、ライブラリー全体は、約2400の重複する部位で各遺伝子を標的化する)。siRNA末端によって標的化されるメッセンジャーRNA配列中の１番目または２番目のヌクレオチドにおいてアデニンが好まれるので、ランダムsiRNA配列の２分の１が最適に標的化されると概算される。siRNA配列の４分の１が非常に有効であると概算されている。従って、いくつかの実施形態において、約5×109の細菌形質転換(現在の細菌コンピテンシーレベル内に充分入る)が、全ての遺伝子に対して有効なライブラリーを生成し得る。
【００２８】
次いで、これらのプラスミドは、これらのプラスミドが複製されてリコンビナーゼに曝露されるように、細菌宿主細胞内でインキュベートされる。リコンビナーゼの存在下で、宿主細胞の集団中の所定の細胞内の反対方向のリコンビナーゼ認識部位間で部位特異的組換えが生じ、該部位間の配列を逆転させる。組換えにより、所定の細胞内に３つの型のプラスミドを含む混合集団が得られ、このプラスミドは各々、２つのリコンビナーゼ部位-オリゴDNAカセットを含む開始プラスミドに由来する：(ａ)元のプラスミドと同じ方向でこのカセットを含むプラスミド(A形態)、(ｂ)逆平行(すなわち「フリップした(flipped)」)方向でこのカセットを含むプラスミド(B形態)、およびA形態のプラスミドとB形態のプラスミドとの間の組換えから生じる、併合されているがなお分離された「二重カセット」を含むプラスミド[方法１Ａ、工程４ａ、図１Ｂを参照のこと]。しかし、これらの逆方向反復は、介在するプラスミド配列によって分離されている。もちろん、プラスミド(ｃ)はプラスミド(ａ)および(ｂ)のサイズの２倍であり、そのことが消化およびゲル電気泳動による単離を容易にする。従って、リコンビナーゼ活性の後に、このプラスミドDNAは、任意の適切な技術(例えば、ＳＤＳによる溶解、ＳＤＳによるアルカリ溶解、煮沸溶解、つまようじミニプレパレーション(minipreparation)プロトコル、ミディプレパレーション(midipreparation)プロトコル、マキシプレパレーション(maxipreparation)プロトコルならびに当該分野で公知の他の技術)を使用して、宿主細胞の集団から単離される。単離後、このプラスミドDNAは、オリゴDNAの開始集団中に操作された3’制限部位または5’制限部位に特異的な制限酵素の１つによって消化され、リコンビナーゼ部位間のランダムオリゴDNAの非対称的な配置に起因して「小さい」プラスミドおよび「大きい」プラスミドを生成する。この後に、ゲル分離および単離が実施される[方法１Ａ、工程５ａ、図１Ｃならびに図１０Ａおよび１０Ｂ]。各反復は、一方の側のユニークな制限部位と他方の側の別の制限部位とに挟まれたので、両方の逆方向反復を含む小さい方のフラグメントは酵素のうち１つ(例えばPstI)を使用して単離され、このフラグメントは次いで自己連結されて(すなわち、それ自体で閉じて)、これらの逆方向反復を連続させ得る。
【００２９】
得られた連結されたプラスミド内で、逆方向ランダムカセットは、開始オリゴDNA中に存在する２つの制限部位の２つ目に特異的な制限エンドヌクレアーゼ(例えばBglII)で望ましくは消化される。この酵素は、センスおよびアンチセンスのランダム配列または半ランダム配列の各側上で切断する。消化後、小さいDNAフラグメントはsiRNAをコードし、siRNAコードカセットを作成するために適切なRNA発現ベクター中にクローニングされ得る。siRNAコードカセットの各々は、センスおよびアンチセンスのランダムDNAまたは半ランダムDNAを分離する、3’制限部位または5’制限部位のいずれかに由来する(すなわち、内部制限部位の粘着末端に由来する)スペーサーによって分離されたセンスランダム配列および相補的なアンチセンス配列を含む。制限部位に依存して、得られるスペーサーは、約4ヌクレオチド長と約15ヌクレオチド長との間、好ましくは約6ヌクレオチド長と約10ヌクレオチド長との間(例えば、約7ヌクレオチド長または8ヌクレオチド長)であろう。制限部位スペーサーによるセンスDNA配列およびアンチセンスDNA配列の分離は、このような発現系において有効であることが示されている(例えば、Devroe et al. , BMC Biotechnology,. 2, pg. 1-5 (2002)を参照のこと)。また、二重カセット(siRNAコードカセット)は、単一の挿入物またはオリゴマー挿入物としてプラスミド中にクローニングされ得る。このような挿入物は、例えば、約2個と約10個との間の挿入物、または約10個〜100個の挿入物、またはさらに約100個と約1000個以上との間の挿入物を含み得る。いくつかの場合において、既知の特異的ヘアピンコード二本鎖DNAが、重複するかまたは重複しない遺伝子経路またはシグナル伝達経路を標的化するために、ベクター内のランダム配列および/または他の既知の配列と直列に組合わされるだろう。従って、本発明の方法は、予め規定された配列を有するsiRNA(例えばshRNA)をコードする１つまたは複数のカセットと直列に、ランダムまたは半ランダムのsiRNA(例えばshRNA)をコードする二重カセットをクローニングすることをさらに含み得る。
【００３０】
単離後、逆方向反復カセットは、スクリーニングのために標的細胞中でRNAを生成するのに適切なベクター中にクローニングされる。例えば、このカセットは、RNA発現ベクター中にクローニングされ得る。これらのカセットは、単一でかまたは直列のマルチマーとしてかのいずれかでこの発現ベクター中にクローニングされ得る。例示的なRNAベクターには、最も好ましくは、レトロウイルスベクター、プラスミド、アデノウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターが含まれ得るが、他の適切なRNA発現ベクターが当該分野で公知である。RNA発現ベクターは、典型的にはRNAポリメラーゼプロモーターおよび転写終結部位(例えば、ポリチミジン(TTTTT)終結部位または他の適切な部位)を含み、逆方向反復カセットは、このプロモーターとターミネーターとの間に位置付けられる。このようなベクターは典型的に、高等生物の細胞内でRNA発現を達成するための、このような細胞中への導入に適切である。好ましくは、このRNAポリメラーゼプロモーターはRNAポリメラーゼIIIプロモーターであり、最も好ましくはU6 RNAポリメラーゼIIIプロモーターもしくはH1 RNAポリメラーゼIIIプロモーターまたはT7バクテリオファージプロモーターである。また、いくつかの実施形態において、レシピエントベクターは、対向するプロモーター(例えば、対向するH1プロモーターおよび/またはU6プロモーター)を有することが好ましい。このような実施形態において、各プロモーターは反対方向からshRNAを転写し得る。別の実施形態において、ポリメラーゼIプロモーターまたはポリメラーゼIIプロモーターが使用され得るか、あるいは任意のDNA依存的RNAポリメラーゼに対するプロモーターを含む複数の直列のプロモーターが使用され得る。望ましくは、二重カセットは、RNAプロモーターの直ぐ下流かつ終結部位(例えば、ポリT部位(例えばTTTTT))の直ぐ上流でこのようなベクター中にクローニングされる。
【００３１】
あるいは、siRNAをコードする最終カセットのクローニングの前に、RNAポリメラーゼ終結シグナル(すなわち、siRNAコード配列の3’側のRNA発現ベクター中の終結シグナルとは別個の第２の終結シグナル)に隣接する２つの平行なリコンビナーゼ部位を含む挿入物が、RNAポリメラーゼプロモーターとsiRNAコード配列との間に導入され得る[方法１Ｂ、図２Ａ〜２Ｂを参照のこと]。このような挿入物中のリコンビナーゼ部位は平行である(すなわち、同じ方向に配向したスペーサー)ので、リコンビナーゼ酵素の存在下で、これらの二重リコンビナーゼ部位は単一の部位へと変形され、従って終結シグナルが切り出される。従って、適切なリコンビナーゼが添加されるまでsiRNAコードベクターは「オフ」であり、siRNA配列を転写できないだろうから、この変形は、誘導性siRNAライブラリーの構築を可能にする。従って、引き続く使用のために、このライブラリーはリコンビナーゼが存在する場合に活性化され得る。
【００３２】
発現ベクター内のRNAプロモーターがT7バクテリオファージプロモーターである場合、この終結部位は最も好ましくは、T7転写のCATCTGTTTT(配列番号1)ターミネーターである(He et. al. , JBC, v273, 18802-11 (1998) )[方法１Ｃ、図３を参照のこと]。哺乳動物細胞内のsiRNAカセットの効率的な発現を確実にするために、このようなカセットを含むプラスミドはまた、T7バクテリオファージプロモーターからの転写を指向できるタンパク質(例えば、T7タンパク質または誘導体)をコードする(例えば、哺乳動物細胞において遺伝子を発現するのに適切な)発現カセットを好ましくは含む。１つの好ましい誘導体は、T7タンパク質(T7由来のDNA結合ドメインおよび転写活性化ドメインを少なくとも含む)と核局在化配列(例えば、SV40または別のタンパク質由来)との間の融合物であり、その結果、これは核に入って、プラスミド中のT7プロモーターと相互作用することができる。この系はさらに、哺乳動物細胞での実験ならびに最終的には動物モデルおよびヒト疾患処置における使用のために非常に重要であり得るsiRNAライブラリーの誘導性の発現を促進する。例えば、このT7は、タモキシフェンに応答するがエストロゲンには応答しないヒトエストロゲンレセプター変異体(例えば(G521R))のアミノ酸251〜595をコードする遺伝子との融合タンパク質として発現され得る(Danielian et al, 1993, Mol. Endo. 7: 232-240)。マウス変異体エストロゲンレセプターG525Rとの同様の融合物もまた使用され得る。これは、タモキシフェンが添加されるまで抑制されているT7ポリメラーゼを生じる。従って、タモキシフェンは、このsiRNAライブラリーの発現を制御する。この誘導性の系はまた、特定の遺伝子に対して指向された単一のsiRNAの誘導された制御のために非常に有用であり、本発明は、このようなT7-ポリメラーゼ-エストロゲンレセプター融合タンパク質を使用する、T7により駆動されるsiRNAの発現を誘導可能に調節する方法を提供する。
【００３３】
siRNA発現カセットを含むRNA発現ベクターは、siRNAライブラリーを形成するためにプールされたユニークなRNA発現カセットの集団を提示し、これらのカセットは各々ランダム配列または半ランダム配列を含む。このような集団内のベクターは、ベクター１個当たり１つのユニークなカセットを各々が含み得るか、またはこれらのベクターは、各ベクター中に複数の直列カセットを含むように構築され得る。このライブラリーは、ライブラリーを含むプラスミドを適切な宿主細胞中に導入することによって発現され得る。
【００３４】
上記のことは、DNA部位特異的リコンビナーゼ(例えば、ELPまたはCre)を使用してDNAヘアピンを生成する方法を提供することが観察されるだろう。記載されるように、オリゴDNAの開始集団の配列がランダムまたは半ランダムである場合、得られるヘアピンは、ランダムまたは半ランダムのsiRNAコードライブラリーである。しかし、この方法は、特定の標的に対して指向されたDNAヘアピンを生成するためにも使用され得る。従って、オリゴDNAの開始集団が予め設計された配列を有する場合、得られるDNAヘアピンは特異的siRNAコード配列である。１つまたは数個のヌクレオチド以外が特定され得るオリゴDNAが生成され得る限り、本発明の方法は、さもなくば共通である配列の１部分または数個の部分のみが互いに変動するsiRNA集団をコードするDNAヘアピンの構築をも達成し得ることが理解されるだろう。このようなライブラリーは、半ランダムライブラリーの１つの型であるということができる。
【００３５】
本発明の方法を容易にするために、本発明はまた、リコンビナーゼを使用してDNAヘアピンの生成を促進するのに適切なベクターを提供する。このようなベクターは、互いに向かって配向した２つのリコンビナーゼ認識部位を含み、これら２つのリコンビナーゼ認識部位(例えば、CreまたはLoxP)間にDNAの配列を有するプラスミドである。これら２つのリコンビナーゼ認識部位間の配列は、少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ認識配列(例えば、AscIまたはFseI)を含み、最も好ましくは少なくとも２つの制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。これら２つのエンドヌクレアーゼ認識部位は同じでも異なってもよいが、好ましくはこれら２つの制限エンドヌクレアーゼ認識配列は同じ配列ではない。このプラスミドはまた、プラスミド中の２つのリコンビナーゼ認識部位を認識するのに適切なリコンビナーゼ酵素(例えばFLPまたはCRE)をコードする発現カセットを含み得る。好ましくは、この酵素は、(例えば温度感受性発現系を使用して)プラスミドから誘導可能に発現され得、ほとんどの細菌株においてこのプラスミドが使用されるのを可能にするだろう。このプラスミドがこのようなリコンビナーゼ発現カセットを含む場合、好ましくは、この発現カセットは２つの制限エンドヌクレアーゼ配列間には存在しない。(DNAヘアピンがこの方法によって生成される)DNAの半ヘアピン配列が、エンドヌクレアーゼ認識配列の部位で発現プラスミド中にクローニングされる。従って、本発明のプラスミドはまた、ヘアピンコードshRNA(ランダムまたは指向性)の半分をコードするDNA配列を含み得る。一般に、プラスミドがDNA半ヘアピン配列を含む場合、これは、２つの制限エンドヌクレアーゼ認識配列間にある。このようなプラスミドの１例はpFRTである(図１Ａを参照のこと)。
【００３６】
本発明の方法の別の実施形態は、リコンビナーゼを産生する宿主細胞を必要としない。本発明の方法のこの実施形態によれば、制限部位に挟まれるランダムオリゴヌクレオチド配列または半ランダムオリゴヌクレオチド配列は、当該分野で公知の標準的な方法を使用して3’制限部位に相補的なプライマーを用いてプライミングした後に二本鎖になる。これらのオリゴDNAには制限部位が隣接し、プライミング配列がその後に続く。好ましくは、このランダム配列は、約15ヌクレオチドと約30ヌクレオチドとの間、最も好ましくは約20ヌクレオチドである。このプライミング配列は、好ましくは少なくとも約5ヌクレオチドである。ランダムオリゴDNAまたは半ランダムオリゴDNAの開始集団は、２つのRNAポリメラーゼプロモーター間(すなわち、第１のRNAプロモーターと第２のRNAプロモーターとの間)で適切なRNA発現ベクター中に直に接してクローニングされる。これら２つのRNAポリメラーゼプロモーターは、互いに反対の鎖上の他方のRNAプロモーターの方を向いて、反対方向でRNA転写を指向するように「内側に」配向される。好ましくは、オリゴDNAの開始集団は、２つのプロモーターの間に直接クローニングされるか、またはランダム配列もしくは半ランダム配列と隣接する第１および第２のRNAプロモーターとの間に数(例えば約10未満(例えば約5未満)の)塩基対を伴って２つのプロモーター間に位置付けられる。いくつかの例において、２つのポリメラーゼプロモーター間でプラスミド中にクローニングされる場合、ランダム配列または半ランダム配列は、予め選択されたポリA配列およびポリT配列が隣接したランダム配列または半ランダム配列を含むように開始オリゴDNAを操作することによって、5’ポリA(例えばAAAAA)および/またはポリT3’(例えばTTTTT)が直に接して隣接し得る。これらの配列は、特定のRNAポリメラーゼプロモーター(例えばU6およびH1)からの転写を終結させる[方法２、図４Ａを参照のこと]。好ましくは、これらのプロモーターのうち少なくとも１つがH1プロモーターもしくはT7プロモーターであるか、またはこれらのプロモーターの両方がT7プロモーターであり、クラスII T7ターミネーターが隣接しているか、またはより好ましくは、これら２つのプロモーターは互いに異なる(例えば、１つのプロモーターはU6プロモーターであり、他方のプロモーターはH1プロモーターである)(例えば図４Ｂを参照のこと)。上記のように、これらのオリゴDNAはまた、クローニングを容易にするために3’制限部位および5’制限部位を含み得る(好ましくは含む)。
【００３７】
最後に、これらのRNA発現ベクターはプールされて、第１のプロモーターと第２のプロモーターとの間に異なるランダムDNAまたは半ランダムDNAを含む類似のベクターのライブラリーを形成する。
【００３８】
この実施形態において、開始オリゴDNAの集団が２つのRNAプロモーターの間でRNA発現ベクター中にクローニングされた後、第１および第２のRNAプロモーターは、これらの間に配置されたランダム配列または半ランダム配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれの転写を指向することが理解されるだろう。宿主細胞内でのプラスミドのセンスおよびアンチセンスのランダム配列または半ランダム配列の二重転写は、宿主細胞内で自己アニーリングしてsiRNAを形成する初期相補的転写物を生じる。隣接するポリA配列またはポリT配列がオリゴDNAの開始集団に含まれない場合(または、開始オリゴDNA配列の挿入の部位に隣接してRNA発現ベクター中に含まれない場合)、RNA転写は、ランダム配列または半ランダム配列を通過して続くだろう。しかし、適切な終結配列は、多数のRNAプロモーターに対してアンチセンスな配列中に存在する。従って、例えば第１または第２のRNAプロモーターがU6プロモーターである場合、適切な終結配列(CATTTTA)は、対向するプロモーターに向かって約70塩基対で見出される。さらなる量の転写された配列は、細胞内のDICER酵素によって切断されるだろう。従って、この実施形態の発現ベクター中の第１および第２のRNAプロモーターの一方または両方がU6 RNAプロモーターであることが好ましい。別の実施形態において、ヘアピン[センス-アンチセンス]RNAコードカセットは、このヘアピンカセットからの発現を増大させるために、２つのプロモーター間に配置され得る。
【００３９】
プロモーターがT7プロモーターである同様のアプローチが使用され得る。この実施形態において、開始オリゴDNAは、反対方向のT7停止配列が遠位で隣接し、反対方向のT7プロモーター(すなわち、内側を向いた第１および第２のT7プロモーター)が近位で隣接する、ランダム配列または半ランダム配列を含み得る[方法３、図５を参照のこと]。このT7プロモーターは好ましくは、短縮された19塩基対のプロモーター配列(例えばTAATACGACTCACTATAGG(配列番号2))である。なぜなら、これにより相補鎖との重複が最小限にされるからである。しかし、完全な23塩基対のT7プロモーターもまた使用され得る。反対方向のプロモーターは、プラスミド中へのクローニングを容易にするために制限部位に隣接する。また、この実施形態において、このT7停止配列は好ましくは、クラスII T7ターミネーターである(例えば、Macdonald, J Mol Biol, 232, 1030 (1994)を参照のこと、例示的な配列はCATCTGTTT(配列番号3)である)。典型的なクラスIターミネーターとは反対に、クラスII T7ターミネーターはヘアピンループを形成せず、従ってそれらに対して直ぐ3’側にあるT7プロモーターの転写開始を遮断しない。
【００４０】
適切なプラスミド(または他のベクター)中へのクローニングの後、第１および第２のT7プロモーターの各々からの転写は、ランダム配列または半ランダム配列を通過して進み、対向するT7プロモーターを通過して進んで、その後停止配列に遭遇する。得られる転写物は、(ランダム配列または半ランダム配列の長さに依存して)約60塩基対長であろう。しかし、相補的な(センスおよびアンチセンス)ランダム配列もしくは半ランダム配列のみがアニーリングして二本鎖DNA構築物を形成する。この実施形態に対するさらなるバリエーションとして、このRNA発現ベクターは、上記のような核局在化シグナルおよびタモキシフェンに対してそれを応答性にするドメインを有するT7由来のRNAポリメラーゼをコードするカセットをさらに含み得る。
【００４１】
別の実施形態において、この開始オリゴDNA集団は、以下の配列を有するオリゴDNAを含む：(5’から3’で)予め選択された制限部位、任意選択のAAジヌクレオチド配列、ランダム配列もしくは半ランダム配列、プライミングループに寄与する第１の配列、スペーサー配列およびプライミングループに寄与する第２の配列。プライミングループに寄与する第１の配列 プライミングループに寄与する第２の配列はアニーリングしてループを形成するべきであり、好ましくはこれらの配列は互いに対して相補的である[方法４、図６Ａ〜６Ｂを参照のこと]。プライミングループに寄与する第１の配列および第２の配列は、約3塩基対〜約10塩基対を各々が含み得、互いにアニーリングしてループを形成する必要がある。好ましくは、これらの配列は、約4塩基対と約6塩基対との間を含む。１実施形態において、プライミングループに寄与する第１の配列はGCリッチな配列であり、プライミングループに寄与する第２の配列もまた第２のGCリッチな配列であり、１つの好ましいCGリッチな配列はCCGGである。このスペーサー配列は、プライミングループを形成するための第１の配列と第２の配列との間でのループの形成を促進するように、好ましくは約3塩基対と約10塩基対との間、より好ましくは約4塩基対と約6塩基対との間を含む。このスペーサーはまた、集団中の他のオリゴDNAとの二本鎖の形成(すなわち、GCリッチな配列の交差アニーリングを介した)を阻害するべきである。スペーサーのための１つの好ましい配列はAGAGである。
【００４２】
得られた自己アニーリングループは、合成されたDNAの相補鎖(すなわち、ランダム配列または半ランダム配列のアンチセンス)の合成をプライミングするために使用される。これは、テンプレート鎖の予め選択された制限部位を通って第２のGCリッチな配列の末端から相補鎖を伸長するのに適切な条件下でDNAポリメラーゼにオリゴDNAを曝露し、二本鎖DNAオリゴマーを生じることによって達成される。相補鎖の合成の適切な方法は当該分野で周知である(例えば、Molecular Cloning : a laboratory manual, Sambrook et al. , A4.22-A4.23 (2001) を参照のこと)。しかし、RNA重合の間にオリゴDNAの自己アニーリングしたループ構造を保存するために、逆鎖の合成は最も好ましくは室温またはその近傍で実施され、自己アニーリングしたDNAの変性を回避する。
【００４３】
伸長後、これらのDNAオリゴマーは、一本鎖DNAを形成するために変性される。二本鎖DNAの変性は、当該分野で公知の任意の適切な方法(例えば、変性ゲル、熱処理およびアルカリ性変性溶液)によって達成され得る。一本鎖の変性した伸長されたオリゴDNAが次いで単離される。単離後、伸長されたオリゴDNAは、開始オリゴDNAの5’末端中に操作された配列を使用して、相補鎖の合成のためにプライミングされる[方法４、図６Ａ〜６Ｂを参照のこと]。
【００４４】
これらの相補鎖は、（望ましくはin vitroのDNA合成法を介して）テンプレート鎖の5’末端まで合成される。相補鎖の合成は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって達成され得るが、相補鎖の合成を妨げるテンプレートの相補的な部分の自己アニーリングを最小限にするかまたは防止する条件下で相補鎖を合成することが重要である。室温では、これは生じるとしても非常に低い収率である。(ATリッチな配列と比較して)GCリッチな配列が優先的に自己アニーリングしてランダムなプールからこれらの配列が脱落するために、shRNAコード配列がいくらか首尾よく形成されたとしてもランダムではないだろう。テンプレートの自己アニーリングを最小限にする１つの方法は、変性温度(例えば、約50℃よりも高い温度)で相補鎖の合成を実施することである。好ましくは、合成のための温度は約60℃〜約75℃の間であり、最も好ましくは、合成のための温度は、DNA合成の間にテンプレートの変性を保存するために約65℃である。もちろん、このような上昇した温度で合成を実施するのに適切なポリメラーゼ(例えば、Taq、TaqStoffelフラグメント、rTth、Tfl、Hot Tub、Tbr、UlTma、rBst、Isotherm Bstの大きいフラグメント、Pwo、Tli、DeepVentおよびPfuなど)が使用されるべきである。しかし、相補的なDNAを合成するために適切な酵素および反応条件を選択することは当業者の範囲内である。相補鎖を合成するために高温条件を使用することの代替としてかまたはそれに加えて、相補鎖の形成は、テンプレート上へのプライマーの一本鎖侵入を促進する酵素の存在下で実施され得る。このような酵素の非限定的な例には、E. coliのrecAおよびrecE/rec/T経路の酵素が含まれ(例えば、Gamper et al., Biochem, 42 (9), 2643-55 (2003)およびNoirot et al., J. Biol. Chem., 273 (20), 12274-80 (1998)を参照のこと)、他の生物中の類似の経路の類似の酵素もまた適切に使用され得る。
【００４５】
合成後、二本鎖siRNAコードDNAは、予め選択された制限部位が隣接し、スペーサー配列によって分離された、２つの相補的なランダム配列または半ランダム配列を含み、ここで第１の配列は第２の配列のアンチセンス配列である。この段階で、siRNAコードDNAの集団をプールして、siRNAコードライブラリーを形成することができる。あるいは、このsiRNAコードDNAは、予め選択された制限部位に対応する制限酵素によって消化され、上記のようなRNA発現ベクター中にクローニングされ得る。望ましくは、このカセットは、適切なRNAポリメラーゼプロモーターと作動可能なRNAポリメラーゼ終結配列との間でこのようなベクター中に導入される。このようなクローニングの後、得られたDNA発現ベクターをプールして、siRNAライブラリーを形成することができる。
【００４６】
別の好ましい実施形態において、本発明は、ランダム配列または半ランダム配列を含む短いオリゴDNAの合成を含まない、siRNAライブラリーを産生するための方法を提供する。この実施形態は、ランダムに生成されたDNAオリゴマーに依存することなく、細胞によって転写されたRNAの分析に有利である。任意の適切なcDNAライブラリーが使用され得、これらのうち多くが市販されているかまたは当業者によって容易に産生され得る。所望される場合、目的の生物由来のcDNAライブラリーは、所望の制限酵素で任意選択で消化され得る。この制限酵素は、約100塩基対長と約1000塩基対長との間の消化フラグメントを産生するように選択される(例えば、HaeIII、Sau3A、MboIなど)。もちろん、全長のcDNAが所望の場合に使用され得る。
【００４７】
cDNA(またはその消化フラグメント)は、任意の適切なクローニング技術を使用してプラスミド中にクローニングされる。クローニングのために使用されるプラスミドは、センス鎖およびアンチセンス鎖の上流のRNAポリメラーゼプロモーターからの二方向性の転写を有するべきである。このプラスミドはまた、クローニング部位に対してシスで、E3L遺伝子または選択マーカーの遺伝子との融合遺伝子としてのE3L遺伝子のいずれかを有し得る[方法５、図７Ａ〜７Ｂを参照のこと]。選択マーカー遺伝子の例には、GFP、Neo、Puroおよび当業者に公知の他のマーカーが含まれるがこれらに限定されない。E3L遺伝子を有するプラスミドに対する代替として、このE3L遺伝子は、ライブラリーを試験するために使用される細胞内で内因的にかまたは別の外因性発現カセットから、安定にまたは誘導可能に発現され得る。例えば、構成的または誘導性のE3L発現プラスミドは、ランダムライブラリーの前に最初に細胞中に(一過的にまたは安定に)トランスフェクト/形質導入され得る。E3Lタンパク質の活性は調節可能であることが望ましい。例えば、E3L遺伝子の発現は、誘導性プロモーターの制御下であり得る。あるいは、このE3Lタンパク質は、翻訳後レベルで調節され得る(例えば、タグとの融合タンパク質(例えば、E3L活性を同族リガンドによって誘導可能にしているステロイドホルモンレセプター))。このE3L遺伝子は、インターフェロン誘導性の二本鎖RNA依存的経路を阻害する(例えば、Garcia et al. , Oncogene, 21, 8379 (2002); Xiang et al, J. Viril., 76, 5251 (2002)を参照のこと)。E3L遺伝子および二本鎖RNAはシスで細胞中にトランスフェクトされるので、比較的長い二本鎖RNAに対するインターフェロン応答が阻害され、比較的長い二本鎖RNA転写物は、結果として細胞死を導かない。しかし、DICER酵素は、宿主細胞内でアニーリングしてsiRNAを形成し得る、約15〜30塩基対長のsiRNAを生成する長い二本鎖RNAを切断する。この実施形態は、siRNAが数百もしくは数千の標的に対するsiRNAの「ブルートフォース」クローニングによってcDNAライブラリーに対して生成されるか、またはcDNAの短片(例えば35bp未満)からなるライブラリー(例えば、Mme1消化に基づくもの)に対して生成される他のアプローチを超える利点を有する。この実施形態において、大きい二本鎖RNAは、細胞内のDicer酵素によってsiRNAへと天然にプロセシングされる。これは、最適に有効な短いsiRNAフラグメントを導くより効率的なプロセスである(Tijsterman, et al., Cell ;117 : 1-4 (2004)およびこの中の参考文献)。siRNAライブラリーを使用する表現型スクリーニングのために意図されたレシピエント細胞株は、(例えば、エストロゲンレセプタードメインと融合されてタモキシフェン依存性を付与する)誘導性E3L遺伝子を安定に含むように代替的に操作され得る。これは、長い二本鎖RNAをコードするライブラリーで細胞をトランスフェクトする直前にタモキシフェンによって誘導され得る。
【００４８】
siRNAライブラリーを構築するための方法を提供したので、本発明は、高等生物由来の細胞(特に哺乳動物細胞)における使用に適切なsiRNAライブラリーを提供することが理解されるだろう。望ましくは、これらのライブラリーは、約12ヌクレオチドと約35ヌクレオチドとの間(例えば約15ヌクレオチドと約30ヌクレオチドとの間(望ましくは約19ヌクレオチドと約23ヌクレオチドとの間))の相補的なセンス配列およびアンチセンス配列を含むランダムsiRNAまたは半ランダムsiRNAをコードするカセットの集団を含む。
【００４９】
本発明はまた、siRNA(またはshRNA)を発現するためのプラスミドを提供する。ランダムまたは非ランダムのsiRNA(またはshRNA)を発現するために適切なプラスミドは、挿入された配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖が転写されるように、siRNAコード配列についてのクローニング部位をそれらの間に含む、反対に配向したU6プロモーターおよびH1プロモーターを含む。好ましくは、このようなプラスミド内のU6プロモーターは、クローニング部位の前に27bpまたは28bpのU6コード配列を含んで、siRNAの安定性を増強し得る。別の好ましいプラスミドは、リコンビナーゼ(例えばFLP)への曝露によるsiRNAの誘導性の発現を可能にする。このようなプラスミドは、リコンビナーゼ部位(例えばFRT)が後に続くポリメラーゼIIIプロモーター、その中にポリチミジン反復(一列に４つ以上のT)を含むスペーサー配列、その後の第１の部位と同じ方向でのリコンビナーゼについての第２の部位、および最後にshRNAコードヘアピンについてのクローニング部位を含む。好ましくは、このようなプラスミド内のsiRNAコード配列は、対向するポリメラーゼIIIプロモーターに挟まれ、これらのプロモーターのうち１つは、siRNAコード配列に対して5’側にリコンビナーゼ部位-ポリチミジン-リコンビナーゼ部位カセットを挿入している。このようなプラスミドを使用して、本発明は、インテグラーゼファミリーのリコンビナーゼ(例えばFLP)を使用してsiRNAの発現を調節する方法を提供する。リコンビナーゼに曝露すると、このプラスミド内の組換え事象により、終結配列として作用するポリチミジン反復が除去されるだろう。従って、ポリチミジン配列の除去は、コードするsiコード配列をポリメラーゼが発現させることを可能にするだろう。このような方法において、このリコンビナーゼタンパク質は好ましくは、例えば調節可能なプロモーターによって、またはエストロゲンレセプターとの融合物として誘導可能に発現され、その結果、組換え事象およびsiRNA(またはshRNA)の発現が制御され得る。
【００５０】
別の一面において、本発明はsiRNAライブラリーを使用する方法を提供する。例えば、siRNAライブラリーは、得られた挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な特性に対応する遺伝子または非コード配列を同定するために使用され得る。得られた挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な特性に対応する遺伝子または非コード配列には以下が含まれ得るがこれらに限定されない：腫瘍抑制、発癌、アポトーシス、転移、シグナル伝達(例えば、正常細胞および疾患細胞における)、ウイルスのタンパク質または合成、病原性経路、既知または未知の生物兵器感受性の同定、新生の感染を引き起こす因子の遺伝子配列または感受性の同定、および溶解経路の要求、ならびに当該分野で公知の他の遺伝的に関連した挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な特性に関与する遺伝子または非コード配列。siRNAライブラリーは、このライブラリーへの曝露の結果として共通の挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な特性を示す細胞の部分集団を生成するためにも使用され得る。例えば、所望の挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な特性に影響を与える候補薬物または他の因子をスクリーニングするために、このような細胞の部分集団が使用され得る。
【００５１】
この方法を実証するフローチャートが図８として示される。上記のように、ランダム(または半ランダム)なsiRNAライブラリー101または指向されたsiRNAライブラリー(cDNAに対してのみ指向されたか、またはcDNAのサブセットに対してまでも指向された)104が最初に生成される。次いで、このsiRNAライブラリーは細胞の集団102、105中に導入される。次いで、この細胞の集団は選択プロセス103に供されて、集団の残部とは異なる挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な特性を示す細胞の部分集団が選択される。選択プロセス103の後、この細胞の部分集団(すなわちサブセット)が、所望に応じて単離、分析および/またはクローニングされ得る106。部分集団のこのような分析は、集団の残部と比較して異なる部分集団の特性を担うsiRNA種の同定であり得る。あるいは、この部分集団は、ゲノミクスアッセイ、プロテオミクスアッセイおよび/またはセロミクスアッセイ107によってさらに分析され得る。このようなゲノミクスアッセイ、プロテオミクスアッセイおよび/またはセロミクスアッセイが使用される場合、この方法は、いくつかの有用なバイオインフォマティクス産物108を生成し得る。
【００５２】
本発明の方法は、任意のsiRNAライブラリーの使用に関し、このライブラリーは、本明細書中に記載されるようなランダムもしくは半ランダムのsiRNAライブラリー101、または指向されたsiRNAライブラリー(例えば、cDNAに対してのみ指向されたか、またはcDNAのサブセットに対してまでも指向された)104であり得るかまたはこれらを含み得る。ライブラリー101、104は、本明細書中に記載されるように構築され得る。本発明の方法によれば、ライブラリー101、104を構築した後、このsiRNAライブラリー配列101、104は、細胞の集団102、105中に導入される。任意の適切な方法が、siRNAライブラリー101、104を細胞102、105中に導入するために使用され得る。例えば、siRNA分子を含むsiRNAライブラリー101、104は、細胞の集団102、105中に直接導入され得る。あるいは、このライブラリー101、104がsiRNAをコードする転写カセットを有するベクターの集団を含む場合、このライブラリー101、104は、ベクターがプラスミドベクターである場合にはこれらのベクターで細胞をトランスフェクトすることによって、またはライブラリーを含むウイルスベクターを細胞に感染させることによって、細胞の集団102、105中に導入され得る。ライブラリー101、104が、siRNAライブラリーをコードするベクター系で集団をトランスフェクトまたは感染させることによって集団102、105中に送達される場合、好ましくは、この細胞の集団は、約1:1の比率でライブラリーでトランスフェクト/感染され、その結果、この集団内の各細胞は、ライブラリー由来の単一のsiRNA種のみを転写する。しかし、複数のsiRNAの各細胞中へのトランスフェクションは、さらなる分析工程を犠牲にしてスクリーニングの効率を実質的に増大させ得る。複数の特異的siRNAが単一細胞内で機能的であることが示されている(Yu, Molecular Therapy,vol 7,228-236 (2003) )。
【００５３】
この細胞の集団は任意の所望の細胞種を含み得、望ましくは、高等生物(例えば、真核生物、好ましくはヒトのような哺乳動物)由来の細胞である。細胞の適切な集団を選択することは当業者の範囲内であり、当業者は、この選択において、このライブラリーの使用によって調査されている所望の挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な特性によって手引きされるだろう。しかし、このライブラリー101、104がベクター系(例えば、このライブラリーをコードする発現カセットを含むプラスミドまたはウイルスベクター系)として細胞の集団102、105中に導入される場合、この細胞の集団102、105は、ベクター内のsiRNAコード配列が細胞の集団内でsiRNAを産生するように、このベクター系と適合性でなければならない。
【００５４】
細胞の集団102、105中へのライブラリー101、104の導入後、この集団は選択プロセス103に供されて、挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な変化または特性に基づいて、集団の残部から識別され得る細胞(または細胞の部分集団もしくはクローン)が選択される。特定の刺激から生じる挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な変化の例には、以下が含まれるがこれらに限定されない：細胞死、制御されないかまたは異常な細胞増殖、色の変化、タンパク質合成の変化、細胞形態学の変化、細胞分化の変化および細胞代謝の変化、細胞運動性の変化ならびに他の関連の表現型。
【００５５】
選択プロセス103によれば、細胞の集団102、105中へのライブラリー101、104の導入後、これらの細胞を観察して、細胞の挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な変化または特性を検出する。いくつかの実施形態において、この集団は、この集団内のいくつかの細胞内の挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な変化を促進し得る刺激に供される。このような刺激には以下が含まれ得るがこれらに限定されない：物理的条件における変更への曝露(例えば、温度変化、特定の型の培養デバイスまたは培養基質中での配置、光または暗黒への曝露、放射線への曝露など)、細胞増殖に影響を与える１つまたは複数の因子への曝露、細胞代謝に影響を与える１つまたは複数の因子への曝露、細胞の移動に影響を与える１つまたは複数の因子への曝露、細胞のストレス応答に影響を与える１つまたは複数の因子への曝露、１つまたは複数の化学物質(例えば毒素)への曝露、１つまたは複数の分化因子への曝露、１つまたは複数の栄養因子への曝露、１つまたは複数のウイルス(これは、既知のウイルスまたは未知のウイルスであり得る)への曝露、ならびに特定の表現型を生じることが当該分野で公知の他の刺激。この刺激は、細胞の集団に対して既知の効果、予測された効果または予期可能な効果(ライブラリー内のsiRNAの効果がなければ)を有するように選択され得るか、あるいはこの刺激は、細胞の集団に対するその効果を知らずに選択され得る。
【００５６】
集団の残部と比較した、この集団内の特定の細胞の示差的な挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な変化または応答は、このような細胞が本発明の方法に従ってサブセットまたは「部分集団」106として選択される103のを可能にする。例えば、細胞の部分集団106は、刺激が既知の変化または予期可能な変化を促進するように選択された場合、刺激に応答した予測された挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な特性または変化を示さない細胞を含むものとして選択され得る103。あるいは、細胞の部分集団106は、集団の残部が示さない、刺激に対する挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な応答を示す細胞として選択され得る103。
【００５７】
この部分集団106は、任意の測定可能な挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な特性または変化に基づいて選択され得るだろう103。このような特性および/または変化の評価は、評価される特性に依存して変動するが、このような変化についてアッセイすることは当業者の範囲内である。例えば、変化が形態学的なものである場合、細胞の部分集団106は、観察された形態学的特徴に基づいて手動で選択され得る103。同様に、変化または特性が生化学的なものである場合、細胞の部分集団106は、適切な生化学的アッセイに基づいて選択され得る(例えば、色の変化は、部分集団106の選択103を容易にし得る)。
【００５８】
非限定的な例には、細胞の運動性または侵襲性に対するsiRNAライブラリーの効果に基づいて部分集団106を選択すること103が含まれる。このような特性は、Boydenチャンバのような、デバイスの１つの部分から他の部分への細胞の移動を制限するデバイス中に細胞の集団を導入することによってアッセイされ得る。このようなデバイスにおいて、これらの細胞は、制限障壁を横切って移動することが許容され得る。移動を生じさせた後、侵襲活性を増強させた細胞は適用部位とは反対側の障壁の側面から回収され、侵襲活性を阻害した細胞は元の適用部位から回収される。次いで、細胞の２つの部分集団が、細胞の移動性および侵襲性に対するsiRNAの効果を評価するために、本明細書中に記載されるように単離されさらに研究され得る。
【００５９】
別の非限定的な例として、この集団中へのsiRNAライブラリーの導入後、部分集団106は、細胞毒性であるかまたはアポトーシスを誘導する因子に対する細胞の感受性における変化について選択され得る103。このような部分集団106を選択する103ために、siRNAライブラリーにより改変された細胞集団は、１つまたは複数のストレス因子(例えば、化学的または生物学的な化合物または毒素、複数の波長の光エネルギー、電離放射線、熱、冷却、電気、音波またはそれらの組み合わせ)へと集団を曝露する条件下で培養され得る。特に有効な選択技術は、1分間から数時間〜数日間までの範囲の期間にわたって1nM〜1mMの範囲の濃度のエトポシドに(集団中にライブラリーを導入した後で)細胞の集団を曝露することである。従って、部分集団106は、この処理を生き延びる細胞を含むように選択され得る103。
【００６０】
別の非限定的な例として、細胞増殖に対するsiRNAライブラリーの効果が、増殖し続ける細胞を選択的に殺傷する１つまたは複数の因子に集団を曝露させることによって評価され得る。これらの因子には、5-フルオロウラシルのような核酸アナログまたはパクリタキセルのような微小管調節薬物が含まれるがこれらに限定されない。従って、部分集団106は、この処理を生き延びる細胞を含むように選択され得る103。別の非限定的な例として、アッセイは、容易に認識可能な特性(例えば、所定の培地中での生存)を所望の変化と関連付けるように設計され得る。例えば、分化(潜在的にアッセイが困難な表現型の変化)についてアッセイするために、チミジンキナーゼ(TK)を欠損したあまり分化していない細胞(例えば、マウスの胚性幹細胞(例えば、Dobrovolsky, Mol Genet Metab., 78 (1) : 1-10 (2003)を参照のこと))が、発生の間に示差的に発現される遺伝子産物によって制御されるプロモーターの制御下にTKを配置する外因性TK発現カセットを含むように操作され得る。例えば、胚性幹細胞が分化するにつれ、このような細胞におけるRex-1プロモーターの活性は減弱される。従って、このTKカセットが、内因性TKを欠くマウス胚性幹細胞においてRex-1プロモーターの制御下に配置される場合、例えば因子への曝露に応答して分化する細胞は、認識可能な量でTKを発現することをやめる。このような部分集団106は、TKを発現する細胞(この例示的なアッセイ系において、これは未分化の胚性幹細胞である)を殺傷する培地(例えばHAT培地)中で細胞を培養することによって選択され得る103。この系において、部分集団106は、HAT培地中で生存する細胞として選択され得る103。同様の選択は、その発現が胚性幹細胞の場合、未分化状態のマーカーである他の遺伝子に関連付けられたTK発現を使用し得る(Niwa, Nat Genet. 2000 Apr; 24 (4): 372-6)。例えば、Oct 3/4プロモーターによって駆動されるTKは、栄養外胚葉への移行に関与する経路を分析するために使用され得る。
【００６１】
どの方法が選択されても、本発明の方法に従って選択された部分集団(またはサブセット)106は、それ以外の細胞の集団に対するこの部分集団内の細胞の挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な差異と因果関係を有する候補であるsiRNAを有する細胞を含む。いくつかの実施形態において、この部分集団は、細胞の一般的な集団から物理的に単離され得る106。従って、本発明は、細胞の開始集団から実質的に単離されたこのような細胞の部分集団を提供する。好ましくは、この部分集団は、細胞の開始集団から完全に単離される。さらに、部分集団も同様にクローニングまたは培養することが所望され得る106。従って、本発明は、クローン性集団としてこの細胞の部分集団を提供する。この部分集団は、当業者に公知の方法によって、単離および/またはクローン増殖され得る106。
【００６２】
部分集団の選択後、本発明の方法は、この部分集団106の分析をさらに含む。この部分集団は、探査された情報の性質に依存して任意の適切な様式で分析され得る106。例えば、この部分集団は、挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的に分析され得る106。分析の性質は、例えば、部分集団と開始集団との間の差異の評価、または所望される場合、この部分集団内の細胞に共通する特徴の評価であり得る。
【００６３】
留意されるように、部分集団内の細胞(これは、主要集団とは異なる挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な特性を示す)由来のsiRNAは、目的の挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な特性を調節する遺伝子または非コード領域を阻害するための候補とみなされる。従って、本発明の方法の1実施形態において、この部分集団は、さらなる研究(これには、反復アッセイまたは単離されたsiRNAの配列決定が含まれ得る)のためにこの部分集団の細胞からsiRNA(例えばsiRNA発現カセット)を単離することによって分析され得る106。候補siRNAを単離する方法には、例えば、当該分野で周知の技術である逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)が含まれる。あるいは、このsiRNAライブラリーがレトロウイルス発現ベクターとして使用される場合、siRNA候補は、候補siRNAを含むレトロウイルスベクターを非複製レトロウイルス(これは、細胞の上清から単離され得る)中にパッケージングするように、この部分集団内の細胞にレトロウイルスヘルパープラスミドをトランスフェクトすることによってレスキューされ得る。次いで、候補siRNAを含むこのようなレトロウイルスは、レトロウイルスcDNAライブラリーにおいて機能的遺伝子を同定するために第２回または引き続く回のアッセイにおいて使用され得る(例えば、Bhattacharya et al., Proc. Nat. Aead. Sci. (USA), 99, 8838 (2002)を参照のこと)。従って、本発明は、上記のように細胞の部分集団から単離されたsiRNAを含む。このようなsiRNAは、異なる配列の収集物を含み得るか、または実質的もしくは完全に同質であり得る。
【００６４】
従って、この方法は、細胞の集団中にライブラリーを導入すること、既知の表現型変化を引き起こす刺激にこの細胞の集団を曝露すること、この表現型変化を示さない集団内の細胞を同定すること、およびこれらの細胞からsiRNAをレスキューすることを含み得る。次いで、これらの細胞由来のsiRNAが配列決定されてデータベースに対して比較され得るか、または目的の特定の表現型変化への関与についての候補である遺伝子配列を同定するためのプローブを生成するために使用され得る。本発明によって記載されるsiRNAライブラリーは、癌、細胞分化、ウイルス感染、細菌病原性、代謝経路、シグナル伝達経路、溶解経路に関与する重要な遺伝子の迅速な機能的同定ならびに表現型分析に依存する他の研究分野において有用である。このプロセスを介して同定された特異的siRNAは、直接的な治療的価値を有し得る。
【００６５】
また留意されるように、この部分集団内の細胞(これは、主要集団とは異なる挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な特性を示す)は、目的の挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な特性を調節する遺伝子または非コード領域を阻害するsiRNAを保有する候補とみなされる。従って、本発明の方法の別の実施形態において、この部分集団は、ゲノミクス的手法、プロテオミクス的手法、セロミクス的手法またはそれらの組み合わせ107によってさらに分析され得る。ゲノミクス分析の例として、この部分集団内の細胞の遺伝子発現は、例えばマイクロアレイ分析によって評価され得る。これは、例えば遺伝子の相補群の構築を容易にし得る。すなわち、ある共通の細胞選択表現型を導くランダムライブラリーから生成されたsiRNAの効果は、別個の遺伝子経路または重複する遺伝子経路に影響を与え得るだろう。プロテオミクス分析は、部分集団内でのタンパク質の構造、機能、活性および/または発現レベルにおける変化をマッピングすることを含み得る。プロテオミクス評価は、この部分集団の細胞内に見出される単一、複数またはプロテオーム規模のタンパク質に焦点を当て得る。セロミクス分析は、例えば、細胞の特性および経路(例えば、挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的)の評価を含み得る。このような特性は、この部分集団内の細胞または全体としてのこの部分集団の型のプロファイルを明らかにするために、時間的および空間的に評価され得る。これらのパラメータには以下が含まれるがこれらに限定されない：「ハイコンテンツ測定」(例えば、シグナル伝達事象、細胞周期調節事象、代謝活性、細胞の形状および運動性における変化、細胞内のオルガネラと区画との間の分子輸送、ならびに細胞死またはアポトーシスに関連する分子事象の測定)。
【００６６】
もちろん、この部分集団のゲノミクス分析、プロテオミクス分析およびセロミクス分析は互いに排他的ではない；このような分析様式は、別々にかまたは組み合わせて使用され得る。全ての細胞の測定から生成されたデータベースは、ゲノミクス分析、プロテオミクス分析およびセロミクス分析から得られた情報に関連する知識的土台のための基礎を形成する。このような情報は、バイオインフォマティクスにおいて有用ないくつかの産物108を生じ得る。例えば、この方法は、共通の挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な特徴を有する(この部分集団から単離された)細胞のライブラリーあるいは組を生成し得る。このようなライブラリーまたは組は、候補薬物のスクリーニング、未知の毒素または感染性因子の同定などのような複数の使用のための試薬として働き得る。ゲノミクス分析、プロテオミクス分析およびセロミクス分析を組み合わせた使用はまた、特定の遺伝子の減弱を生物学的経路と関連付ける情報の知識的土台を生じ得る。ゲノミクス分析、プロテオミクス分析およびセロミクス分析を組み合わせた使用はまた、特定の遺伝子の減弱を細胞の表現型と関連付ける情報の知識的土台を生じ得る。このような知識は、例えば推定上の治療的介入のための標的を同定することを補助し得る。この方法はまた、特定の遺伝子型を高度に規定された表現型と関連付けるバイオインフォマティクスデータベースを生じ得る。ゲノミクス分析、プロテオミクス分析およびセロミクス分析を組み合わせた使用はまた、細胞ベースの試薬の産生のための新たなプロセスを導き得る。
【００６７】
非限定的な例として、選択プロセス103は、示差的な運動性または侵襲活性を示す細胞の部分集団を選択することを含み得ることが上記される。この部分集団のさらなる分析は、特定の表現型を構成的に発現するかまたは表現型を誘導性形態で発現する(例えば、誘導性のランダムsiRNAライブラリー101が細胞102中に導入される場合)かのいずれかである細胞株が生成されるように、このような部分集団106を単離、クローニングおよび増殖させることを含み得る。次いでこの表現型は、ゲノミクス分析、プロテオミクス分析およびセロミクス分析107を使用して分子的に分析される。従って、例えば、遺伝子発現パターンは、侵襲活性の変化と関連する単一、複数またはゲノム規模の配列をコードするmRNAレベルの変化を明らかにし得る。遺伝子発現パターンの代替としてまたはそれと相補的に、侵襲活性の変化を発現する細胞の部分集団内に見出される単一、複数またはプロテオーム規模のタンパク質の構造、活性および発現レベルにおける変化が測定され得る。これらのプロテオミクス測定には以下が含まれるがこれらに限定されない：細胞の運動性を担う細胞骨格タンパク質(例えば、ケラチン、チューブリンおよびアクチン)、ならびに細胞の細胞骨格に結合しそれを調節する多数のタンパク質のレベルまたは活性の変化。ゲノミクス測定およびプロテオミクス測定に対してさらに相補的に、細胞の侵襲活性の変化を担う分子プロセスの時間的および空間的な測定は、単一細胞の部分集団内で評価される。
【００６８】
細胞の部分集団の組み合わされたゲノミクス分析、プロテオミクス分析およびセロミクス分析の別の非限定的な例として、選択プロセス103は、細胞毒性特性およびアポトーシス特性の変化を示す細胞の部分集団を選択することを含み得ることが上記される。これらの部分集団のさらなる分析は、特定の表現型を構成的に発現するかまたは表現型を誘導性形態で発現するかのいずれかである細胞株が生成されるように、このような部分集団106を単離、クローニングおよび増殖させることを含み得る。次いでこの表現型は、ゲノミクス分析、プロテオミクス分析およびセロミクス分析107を使用して分子的に分析される。このような部分集団のゲノミクス評価は、細胞毒性活性またはアポトーシス活性の変化に関連する単一、複数またはゲノム規模の配列をコードするmRNAレベルの変化を明らかにする遺伝子発現パターンを同定し得る。プロテオミクス評価は、細胞毒性またはアポトーシスの変化を発現する細胞内で見出される単一、複数またはプロテオーム規模のタンパク質の構造、活性および発現レベルにおける変化を測定することを含む。これらの測定には、アポトーシス細胞死を担うタンパク質(例えば、カスパーゼ、チトクロムcまたはPARP)のレベル、細胞内局在または活性における変化が含まれ得るがこれらに限定されない。セロミクス評価は、単一の細胞の集団内の細胞の毒性活性またはアポトーシス活性の変化を担う分子プロセスの時間的および空間的な測定を含み得る。このような部分集団のゲノミクス分析、プロテオミクス分析およびセロミクス分析を組み合わせた使用からの産物は、調節領域であり得るDNAの同定された非コード領域および/またはコード領域を阻害/ノックダウンし、既知または未知のいずれかの遺伝子/タンパク質をノックダウンする、同定されたsiRNAを含む細胞のライブラリーである。各細胞種についてのゲノミクスデータ、プロテオミクスデータおよびセロミクスデータは、ライブラリー特徴のデータベースを構築するために使用され得る。これらの特徴付けられた細胞株は、既知および未知の化合物の細胞毒性/アポトーシスについてスクリーニングする際に使用され得る。
【００６９】
細胞の部分集団の組み合わされたゲノミクス分析、プロテオミクス分析およびセロミクス分析の別の非限定的な例として、選択プロセス103は、TKプロモーター発現の変化、および好ましくは分化活性の変化を示す細胞の部分集団を選択することを含み得ることが上記される。この部分集団のさらなる分析は、特定の表現型を構成的に発現するかまたは表現型を誘導性形態で発現するかのいずれかである細胞系が生成されるように、このような部分集団106を単離、クローニングおよび増殖させることを含み得る。次いでこの表現型は、ゲノミクス分析、プロテオミクス分析およびセロミクス分析107を使用して分子的に分析される。このような部分集団のゲノミクス評価は、分化表現型の変化に関連する単一、複数またはゲノム規模の配列をコードするｍRNAレベルの変化を明らかにする遺伝子発現パターンを同定し得る。このような部分集団のプロテオミクス評価は、分化に関連する細胞内で見出される単一、複数またはプロテオーム規模のタンパク質の構造、活性および発現レベルにおける変化を測定することを含み得る。これらの測定には、細胞シグナル伝達(例えば、ホルモン分泌およびレセプターの発現)、遺伝子発現の調節(例えば転写因子)および分化マーカーを担うタンパク質のレベル、細胞内局在または活性における変化が含まれ得るがこれらに限定されない。セロミクス評価は、単一の細胞の集団内の分化挙動の変化を担う分子プロセスの時間的および空間的な測定を含み得る。このような部分集団のゲノミクス分析、プロテオミクス分析およびセロミクス分析を組み合わせた使用からの産物は、調節領域であり得るDNAの同定された非コード領域および/またはコード領域を阻害/ノックダウンし、既知または未知のいずれかの遺伝子/タンパク質をノックダウンする、同定されたsiRNAを含む細胞のライブラリーである。各細胞種についてのゲノミクスデータ、プロテオミクスデータおよびセロミクスデータは、ライブラリー特徴のデータベースを構築するために使用され得る。これらの特徴付けられた細胞株は、既知および未知の化合物の細胞分化に対する効果についてスクリーニングする際に使用され得る。
【００７０】
以下の実施例は本発明をさらに例示するが、言うまでもなく、本発明の範囲を限定するものと決して解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００７１】
この実施例は、siRNAライブラリーを調製する方法を実証する[方法１Ａ、図１Ａ〜１Ｃを参照のこと]。ランダムな20merのDNAを、DNA合成機を使用して生成する。この20merを、それぞれBglII(5’)およびPstI(3’)である２つの別個の制限部位で挟む。この20merおよび隣接する制限部位を、PstI部位および3’隣接配列に対して相補的な配列を使用してプライミングする。プライムされた配列を使用して、各20merおよびその制限部位に対する相補鎖を合成および伸長する。
【００７２】
得られた二本鎖DNAの20merを、互いに対して配向されたFRT部位および制限酵素部位(BglIIおよびPstI)ならびにFLPリコンビナーゼのコード配列(Sadowski, PD. 1995, Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 51: 53-91)を有するプラスミド中に、FRT部位間でクローニングした[方法１Ａ、図１Ａを参照のこと]。このプラスミドはpFRTである。20merをこれらのプラスミド中にクローニングした後、これらのプラスミドを細菌中に形質転換した。細菌の形質転換後、FLP酵素をこの細菌中で発現させた。FLP-FRT系の作用にもかかわらず、これらの組換え部位間に元の配列(A)または逆方向配列(B)を含む、単一のプラスミドの同等な混合が生じる。同様に、FLPは、A形態およびB形態の両方からなる合わされたダブルプラスミド(C形態)を生じる。この合わされたプラスミドは２つのDNA挿入物を有し、その第１のDNA挿入物は、第２のDNA挿入物のアンチセンス配列である配列を有する。全ての組換え体プラスミドをこの細菌から単離した。プラスミドpFRTの２つの単離体を調査し、各々を異なる量の誘導されたFLP活性で増殖させた。単離体１は単離体２よりも多いスーパーコイル(sc)のモノマー形態を実証し、同様に、単離体２は単離体１よりも多いダイマー形態およびマルチマー形態を示した(図１０Ａ)。モノマーがFRT部位においてFLP活性を介して互いの中に挿入すると、より高次の形態が生成される。しかし、単離体１および２をpFRTのFRT間で逆転可能な配列の外側で酵素によって消化した場合、全てのスーパーコイルのマルチマー形態が、6.5kbのプラスミドについて予測されたように、3.8kbおよび2.7kbの２つのバンドへと消化された(図１０Ｂ)。
【００７３】
単離体の各々を酵素PstIによって消化すると、いくつかの産物が形成された。モノマーのバンドは、線状のA形態およびB形態のプラスミドを含む(図１Ａ〜１Ｃを参照のこと)。さらに、AおよびBの組み合わせダイマーから得られたCプラスミドは、pFRTのFRT間に非対称的に配置されたPstIによって切断した場合大きい断片および小さい断片を生じた。単離体２は、より高い割合のダイマーを有し、従って、単離体１よりも高い割合のC-ラージおよびC-スモールを生じる(図１０Ａ)。
【００７４】
小さいPstIフラグメント「C-スモール」を単離し、次いで一緒に連結した。得られたプラスミドを第２の酵素(BglII)で消化して、DNAフラグメントの中でもとりわけ、小さい(約50bpの)BglIIフラグメントを生成した。次いで、これらの小さいBglIIが隣接したDNAフラグメント(20ヌクレオチドの配列の逆方向反復を含むカセットを含む)を、U6プロモーターの直ぐ下流かつポリT終結部位の上流で、レトロウイルスベクター中のBamHI部位中にサブクローニングした。得られたベクターは、20mer配列の上流のU6プロモーター、20mer配列に対するアンチセンス配列、および２つの20mer配列を分離する6塩基対の配列を有する発現カセットを含む。最後に、これらの発現ベクターを合わせて、siRNAライブラリー(すなわち、siRNAをコードするライブラリー)を得た。
【００７５】
得られたライブラリーのサンプルを単離し、挿入物の配列を決定した。このライブラリー内の少量のクローンにより、これらの挿入物が別個の配列を有することが明らかとなった。このライブラリー内の配列の例は以下のとおりである(5’から3’で)：
【００７６】
AGGCGTAACCCCATTAGTTTCTGCAGAAACTAATGGGGTTACGCCT(配列番号4)
【００７７】
TCAGGGTTTTACGTATTGTGCTGCAGCACAATACGTAAAACCCTGA(配列番号5)
【００７８】
TGACCGGCAGCAATAGGAGGCTGCAGCCTCCTATTGCTGCCGGTCA(配列番号6)
【００７９】
TGTTTGGGGGGGTGGCTACGCTGCAGCGTAGCCACCCCCCCAAACA(配列番号7)
【００８０】
AAGTGCGACTAAGGCCGTAACTGCAGTTACGGCCTTAGTCGCACTT(配列番号8)
【００８１】
AGCTAGGTGGGGGTCGCTGGCTGCAGCCAGCGACCCCCACCTAGCT(配列番号9)
【００８２】
GAGGGGAGGCCCTCGCTGGGCTGCAGCCCAGCGAGGGCCTCCCCTC(配列番号10)
【００８３】
AACAGTCGGTGCTCAGGCGGCTGCAGCCGCCTGAGCACCGACTGTT(配列番号11)
【００８４】
GGATAGAGGGAGGTCGCGAACTGCAGTTCGCGACCTCCCTCTATCC(配列番号12)
【実施例２】
【００８５】
この実施例は、誘導性siRNAライブラリーを調製する方法を実証する。制限部位(それぞれBglII(5’)およびPstI(3’))で挟まれたランダムな19merの配列を含むオリゴDNAを、DNA合成機を使用して生成する。これらのオリゴDNAを、PstI配列に対して相補的な配列を使用してプライミングする。プライミングした配列を使用して、各19merおよびその制限部位に対する相補鎖を合成および伸長する。
【００８６】
得られた二本鎖DNAの19merを、互いに対して配向したFRT部位およびこのFRT部位間に制限酵素部位(AscIおよびFseI)を有し、これらの部位間にFLP酵素コード配列を含むプラスミド中にクローニングする。一旦19merがこれらのプラスミド中にクローニングされると、これらのプラスミドは、誘導性FLPリコンビナーゼを有する細菌中に形質転換される。細菌の形質転換後、これらの細菌はFLP酵素を発現する。FLP-FRT系の作用にもかかわらず、合わされたプラスミドが生成される。この合わされたプラスミドは２つのDNA挿入物を有し、その第１のDNA挿入物は、第２のDNA挿入物のアンチセンス配列である配列を有する。
【００８７】
全ての組換え体プラスミドをこの細菌から単離する。次いで、これらのプラスミドをPstIで消化し、ゲル精製し(C-ショート)、一緒に再連結する。次いで、プラスミドのこのプールを第２の酵素BglIIで消化し得る。これは、DNAの中でもとりわけ、小さいBglIIフラグメント(約50bp)を生じる。次いで、これらのDNAフラグメントを、T7バクテリオファージプロモーターの直ぐ下流かつT7転写のターミネーター(CATCTGTTTT(配列番号1))の上流で、改変されたpMIGレトロウイルスベクター内のBamH1部位中にサブクローニングする。このクローニング部位の上流に、このpMIGレトロウイルスベクターは、MSCV LTR、その後ろにN末端のSV40核局在化シグナルを含み、エストロゲンレセプター変異体(G521R)(これは、タモキシフェンには応答するがエストロゲンには応答しない)の融合タンパク質として発現されるように改変されたT7ポリメラーゼのコード配列、ならびに内部リボソーム侵入部位およびGFP(緑色蛍光タンパク質)もまた有する(Welsh and Kay, 1997, Curr Opin Biotechnol 8: 617-22)[方法１Ｃ、図３]。各々がランダム19merのセンスおよびアンチセンスのコードカセットを含むこのようなベクターのプールされた集団は、誘導性siRNAライブラリーである。
【実施例３】
【００８８】
この実施例は、誘導性siRNAライブラリーを調製する代替的な方法を実証する。制限部位(それぞれBglII(5’)およびPstI(3’))に挟まれたランダム配列(例えば19mer)を含むオリゴDNAを、DNA合成機を使用して生成する。各ランダム配列およびその制限部位に対して相補的な鎖を合成するために、これらのオリゴDNAをプライミングして使用する。
【００８９】
得られた二本鎖オリゴDNAを、互いに対して配向したFRT部位およびFRT部位間に制限酵素部位(BglIIおよびPstI)を有するプラスミド中にクローニングする。一旦ランダム配列がこれらのプラスミド中にクローニングされると、これらのプラスミドは、誘導性FLPリコンビナーゼを有する細菌中に形質転換される。細菌の形質転換後、これらの細菌を、FLP酵素を発現するように誘導する。FLP-FRT系の作用にもかかわらず、合わされたプラスミドが生成される。この合わされたプラスミドは２つのDNA挿入物を有し、その第１のDNA挿入物は、第２のDNA挿入物のアンチセンス配列である配列を有する。全ての組換え体プラスミドをこれらの細菌から単離する。次いで、これらのプラスミドをPstIで消化し、ゲル電気泳動に供する。
【００９０】
２つのDNA挿入物を含むDNAフラグメントを、ゲル電気泳動を介して同定し(C-ショート)、ゲルから切り出す。これらのフラグメントを自己連結し、BglIIで消化してヘアピンDNAカセットを遊離させ、これを次いで調節ドメインの直ぐ下流でレトロウイルスベクター中にクローニングする。このドメインは、同じ方向で配向した２つのFRT部位が隣接するポリT終結配列からなり、ここで両方のFRT部位は、5’末端または3’末端のいずれかを向いた方向であり、これらのFRT部位およびポリT終結配列は、U6プロモーターとこのU6プロモーターの直ぐ下流にクローニングされたDNAヘアピンカセットとの間に介在する。
【００９１】
これらのレトロウイルスベクターは、エストロゲンレセプター変異体(G521R)(これは、タモキシフェンには応答するがエストロゲンには応答しない)の一部分との融合タンパク質として発現される誘導性FLP、ならびに内部リボソーム侵入部位およびGFPをシスで有し得る。タモキシフェンによる誘導はFLP融合タンパク質の活性を解放して、２つのFRT部位を１つのFRT部位に変形し、介在するポリT終結配列を排除してsiRNAの発現を生じる。各々がランダムな19merのセンスおよびアンチセンスのコードカセットを含むこのようなベクターのプールされた集団は、siRNAライブラリーである。
【実施例４】
【００９２】
この実施例は、siRNAライブラリーを調製するための代替的な方法を実証する。以下の配列(5’から3’で)を有するオリゴDNAを合成する：XhoI制限部位、AAジヌクレオチド配列、ランダム19mer配列、第１のGCリッチな配列(GGCC)、スペーサー配列(GAGA)および第２のGCリッチな配列(GGCC)[方法４、図６Ａ〜６Ｂ]。
【００９３】
第１および第２のCGリッチな配列は自己アニーリングしてループを形成し、これを使用して逆鎖合成をプライミングする。逆鎖合成は室温で実施され、この合成は、テンプレート鎖上の5’制限部位を通って進行する。得られた二本鎖19merを変性ゲル上で分離し、38ヌクレオチドの一本鎖DNAを生じる。ここでこの元の19merは、DNAの第２のGCリッチな領域の後に、この19ヌクレオチドの配列に対してアンチセンスである配列を有する。
【００９４】
この一本鎖DNAを相補的配列5'-GTCGCTCGAGAA(配列番号13)でプライミングし、逆鎖合成を約65℃の温度でTaqポリメラーゼを用いて実施する。得られた二本鎖DNAは、同じ鎖上に、同じ転写方向でセンス19merおよびアンチセンス19merを有する。これらの二本鎖DNAをXhoIで消化し、発現ベクター中にクローニングした。各々がランダムセンス配列およびアンチセンスの19merのランダム配列を含むこのようなベクターのプールされた集団は、siRNA発現ライブラリーである。
【実施例５】
【００９５】
この実施例は、siRNAライブラリーを調製するための代替的な方法を実証する。各々がそれぞれSalI(5’)およびClaI(3’)に挟まれたランダム19mer配列を含み、ポリT終結部位を有するオリゴDNAを、DNA合成機を使用して生成する。これらのオリゴDNAを、このオリゴDNAの3’末端にハイブリダイズする配列を使用してプライミングし、それらの相補鎖を合成する。一方のU6プロモーターが19merのセンス鎖を転写し、他方のU6プロモーターが19merのアンチセンス鎖を転写するように、内側に面した２つのU6プロモーター(センスおよびアンチセンス)を有するpMIGレトロウイルスベクター中に、これら２つのU6プロモーター間にあってこれらのプロモーターの各々に作動可能に連結されるように、得られた二本鎖DNAの19merをクローニングする[方法２、図４Ａ]。各々がランダム19merを含むこのようなベクターのプールされた集団は、siRNAライブラリーである。
【実施例６】
【００９６】
この実施例は、siRNAライブラリーを調製するための代替的な方法を実証する。各々がそれぞれSalI(5’)およびClaI(3’)に挟まれたランダム19mer配列を含み、ポリT終結部位を有するオリゴDNAを、DNA合成機を使用して生成する。これらのオリゴDNAを、このオリゴDNAの3’末端にハイブリダイズする配列を使用してプライミングし、それらの相補鎖を合成する。H1プロモーターが19merのセンス鎖を転写し、U6プロモーターが19merのアンチセンス鎖を転写するように、互いに対して面した１つのU6プロモーターおよび１つのH1プロモーターを有するpMIGレトロウイルスベクター中に、これら２つのプロモーター間にあってこれらのプロモーターの各々に作動可能に連結されるように、得られた二本鎖DNAの19merをクローニングする[方法２、図４Ｂ]。各々がランダム19merを含むこのようなベクターのプールされた集団は、siRNAライブラリーである。
【実施例７】
【００９７】
この実施例は、siRNAライブラリーを調製する代替的方法を実証する。オリゴDNAを、以下の配列を有するようにDNA合成機を使用して生成する：互いに対して(すなわち、ランダム19mer配列の転写を指向するように)配向した19塩基対のT7プロモーターに近位で挟まれ、互いから反対方向で配向したクラスII T7ポリメラーゼ停止配列に遠位で挟まれるランダム19mer配列[方法３、図５]。この19merの5’末端の停止配列は3’から5’の位置で配向され、この19merの3’末端の停止配列は、5’から3’の位置で配向される。別個の制限部位が、この19merの5’末端の制限部位がこの19merの3’末端の制限部位とは異なるように、停止配列にさらに隣接する。
【００９８】
隣接する制限部位を有する19merを、3’制限部位に対して相補的な配列を使用してプライミングする。このプライミングした配列を使用して、各19merおよびその制限部位に対して相補的な鎖を合成および伸長する。
【００９９】
得られた二本鎖DNAの19merを隣接する制限部位で消化し、T7バクテリオファージプロモーターの直ぐ下流で、改変されたpMIGレトロウイルスベクター中にクローニングする。このクローニング部位の上流で、このpMIGレトロウイルスベクターは、内部リボソーム侵入部位およびGFP(緑色蛍光タンパク質)に作動可能に連結されたT7ポリメラーゼのコード配列もまた有する。
【０１００】
各々がセンスおよびアンチセンスのランダム19merを含む得られたベクターのプールされた集団は、siRNA発現ライブラリーである。
【実施例８】
【０１０１】
この方法は、細胞死を導く抗ウイルス応答を誘導せずに、siRNAのサイズ制限を超える二本鎖RNAライブラリーを調製する方法を実証する。
【０１０２】
ヒトcDNAライブラリーを、標準的な方法論によって調製するか、または試薬カタログから購入する。このcDNAライブラリーを、制限酵素(例えばSau3A)を使用して、100塩基対〜1000塩基対のフラグメントへと消化する[方法５、図７Ａ〜７Ｂを参照のこと]。得られたフラグメントを、隣接する反対方向のT7プロモーターによって二方向性転写が駆動されるプラスミド中にクローニングし、ここでこのクローニングされたフラグメントのセンス配列およびアンチセンス配列が共に転写される(例えば、実施例５、６および７を参照のこと)。これらのプラスミドはまた、消化されたcDNAフラグメントとシスでクローニングされたワクシニアのE3L遺伝子を有する。
【０１０３】
各々がランダム19merのセンスコピーおよびアンチセンスコピーを含むプラスミドの得られた集団は、siRNAライブラリーである。哺乳動物細胞にトランスフェクションすると、このライブラリーは、比較的長い(約100塩基対と約1000塩基対との間)の二本鎖RNAを転写し、この二本鎖RNAは二重鎖を形成するだろう。しかし、このライブラリーはE3Lタンパク質もまた発現し、このタンパク質は、長い二本鎖RNAに対するインターフェロン応答を阻害して、細胞死を防止するだろう。これにより、内因性のDICER酵素が長い二本鎖RNAを21塩基対〜23塩基対のsiRNAへとプロセシングすることが可能となるだろう。
【実施例９】
【０１０４】
この実施例は、siRNAコード配列を受容するために使用され得る蛍光コードレトロウイルスレシピエントベクターの生成を実証した。
【０１０５】
IRESおよび緑色蛍光タンパク質を保有するレトロウイルスベクターであるベクターpMIG(Parij s et al)をHpaIで消化し、ccdクローニングカセット(Clontech, Inc)を挿入してpMigCCDを生成した。そのBamH1部位とHindIII部位との間にヘアピンsiRNAスタッファーを含むU6プロモーターフラグメントを、プライマー5'-CACCGAGGAGAAGCATGAATTCC-3'(配列番号14)(センス)および5'-CGTTGTAAAACGACGGCCAG-3'(配列番号15)(アンチセンス)を使用してpSilencer 2.0(Ambion, Inc)から増幅した。このPCRフラグメントをシャトルベクターpTopoEntr(Clontech)中にクローニングし、Clonase反応を使用してpMigCCDと組換えた。これにより、pMig中のIRES-GFPの5’側のU6プロモーターの挿入(プラスミドpMigU6IG)が得られた。このU6プロモーターはIRESに向かって配向している。この手順はまた、得られたプラスミド中のU6プロモーターの5’側にNot1部位を挿入する。プラスミドpMigAdapterU6は、GFPに向かって配向した(すなわち、pMIGU6IG中のU6プロモーターと対向した)、IRES-GFPの3’側のU6プロモーターを含む。pMigベクターをSal1およびClaで消化し、アニーリングしたオリゴヌクレオチド5'TCGACGCGTGACTCGAGTCGGATCCGCGGCCGCAT3'(配列番号16)および5'GCGACTGAGCTCAGCCTAGGCGCCGGCGTAGC3'(配列番号17)からなるアダプター配列を挿入して、ユニークな部位Sal1-Mlu1-PshA1-Xho1-BamH1-Not1-Cla1を挿入した。U6プロモーターを、5'GAGAGCGGCCGCGTCCTTTCCACAAGATAT3'(配列番号18)および5'GCGCCATCGATAAGGTCGGGCAGGAAGAGGG3'(配列番号19)を使用してpSilencer 2.0からPCR増幅し、Not1およびCla1で消化し、このNot1-Cla部位中にクローニングしてpMigAdapterU6を作製した。
【０１０６】
反対方向で２つのU6プロモーターを含む別のベクター(レトロウイルス)を作製した。このプラスミドもまたGFPを発現する。プラスミドpMigU6IGをSalおよびClaで消化し、pMigAdapter U6のSal1＋Cla1消化によって誘導されたU6プロモーターをその中にクローニングして、プラスミドpMigU6IGU6を生成した。別の例において、赤色蛍光および緑色蛍光の両方を発現し、２つのU6プロモーターを含むレトロウイルスプラスミドを、pMigU6IGU6をBgl2で消化し、BamH1部位に挟まれたdsred2の遺伝子中にクローニングすることによって構築した。このdsred2挿入物を、プライマー5'CACGGGATCCACCGGTCGCCACCATG3(配列番号20)および5'CAGCGGATCCTACAGGAACAGGTGGTGGC3'(配列番号21)を用いた、プラスミドpdsred2N1(Clonetech)のPCR増幅ならびに得られた産物のBamH1での消化によって誘導した。この得られたプラスミドはpdsredMigU6IGU6である。
【０１０７】
別の例において、１つのU6プロモーターを含み赤色蛍光のみを発現するプラスミドを構築した。１つのプラスミドは、pdsredMigU6IGU6をNot1で消化し、それを連結して閉じることによって、所望の遺伝子に向かって配向したU6プロモーターを含んだ。別の例において、所望の遺伝子から離れて配向したU6プロモーターを含む赤色蛍光ベクターを、pdsredMigU6IGU6をBamH1およびCla1の両方で消化し、ポリTポリメラーゼIII停止部位とその後ろのHindIII部位とをBamH1部位とCla1部位との間に挿入する配列5'GATCCTTTTTAAGCTTGGAT3'(配列番号22)および5'CGATCCAAGCTTAAAAAG3'(配列番号23)をアニーリングすることによって生成されたアダプターとこれを連結することによって構築して、プラスミドpdsredMigU6BTHCを生成した。
【実施例１０】
【０１０８】
この実施例はsiRNAライブラリーの生成を実証する。
【０１０９】
H1ポリメラーゼIIIプロモーターとその後ろのBamH1およびHindIIIを含むベクターpSilencer puro 3.1(Ambion, Inc.)を、制限酵素BamH1およびHindIIIで消化した。アニーリングしたセンス鎖5'GATCCTTTTTTATCGATAAACCTCGAGTC-3'(配列番号24)およびアンチセンス鎖5'AGCTTACTCGAGGTTTATCGATAAAAAAG-3'(配列番号25)からなるアダプターを、この消化したベクター中にクローニングした。このことは、BamH1部位から始まって以下の部位をベクター中に挿入する:BamHI/ポリメラーゼIII転写物についてのポリT停止部位/Cla1部位、Xho1部位、HindIII部位。得られたプラスミド(pSilpuroAdapter)をXho1およびHindIIIで消化した。Xho1およびHindIIIが隣接したU6プロモーターフラグメントを、プライマー5'-GCGCCAAGCTTAAGGTCGGGCAGGAAGAGGG-3'(配列番号26)(センス)および転写物の安定性を増強させると考えられるU6プロモーター配列のさらなる27bpを含むアンチセンスプライマー:5'-GGCCTCGAGCTGCCGAAGCGAGCACGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG-3'(配列番号27)を用いたU6プロモーター含有プラスミドpSilencer 2.0(Ambion, Inc)のPCR増幅を使用して調製した。PCR産物をHindIII制限酵素およびXho1制限酵素で消化し、H1プロモーターおよびU6プロモーターが互いに対して反対方向になるように、pSilpuroAdapter中にクローニングした。
【０１１０】
siRNAライブラリーを生成するために、得られたプラスミドpSilpuroBCSU6-H1をBamH1およびXho1で消化し、その末端にBgl2部位およびXho1部位を含むように操作されたランダム挿入物を消化し、このプラスミド中にクローニングした。１つの実験において、このランダム挿入物は、配列5'CTTGAGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCGAGTGTACACATGGCGA-3'(配列番号28)を配列5'-TCGCCATGTGTACACTCGAG-3'(配列番号29)とアニーリングさせることによって生成した。これらの配列をKlenow緩衝液を使用してうめ、精製し、クローニングのためにBgl2およびXho1で消化した。別の実験において、pSilpuroAdaptor由来のH1プロモーターおよびアダプタークローニング部位またはpSilpuroBCSU6-H1由来のH1-U6カセットをPCRによって増幅し、pTopoEntr(Invitrogen)中にクローニングし、次いでClonaseリコンビナーゼを用いてpLenti6/Block-it-DESTベクター(Invitrogen)中にクローニングして、ランダムヘアピンのレンチウイルスベクター中へのクローニングを容易にした。
【０１１１】
得られたライブラリーのサンプルを単離し、挿入物の配列を決定した。このライブラリー内の少量のクローンにより、これらの挿入物が別個の配列を有することが明らかとなった。このライブラリー内の配列の例は以下のとおりである：
【０１１２】
ATTTCTAAAGGCGTGTCCGA(配列番号30)
【０１１３】
CCTCTTGGACTGATACAGCT(配列番号31)
【０１１４】
GATGTTCGAGCCAGAGGTCT(配列番号32)
【０１１５】
CCTCAGTGAGGCCAATTGAG(配列番号33)
【０１１６】
GTTCTTGTCTTAAACGGAGG(配列番号34)
【０１１７】
ATCCGCTTGTAATCTACAGG(配列番号35)
【０１１８】
TCACTTTTATGGGGTCATTA(配列番号36)
【０１１９】
CGGTTTGCAATTGCAAGCAT(配列番号37)
【０１２０】
CTTTCGAGGCAGGGCTCTGA(配列番号38)
【０１２１】
ACACCTCTGCTGATCAAATT(配列番号39)
【０１２２】
TATGCGGCGTTCAGACCGCA(配列番号40)
【０１２３】
ATCGCTGTGACTTCATGACA(配列番号41)
【０１２４】
TAACAAATGCGCTACGTCCT(配列番号42)
【０１２５】
ATCAGGCGGAGTATAGTTTC(配列番号43)
【０１２６】
AGTACCTTTTGCGCCTCTCC(配列番号44)
【実施例１１】
【０１２７】
この実施例は、遺伝子発現の有効な阻害を有するsiRNAが、実施例１中に記載されるリコンビナーゼアプローチを使用して生成され得ることを実証する。この実施例において、エストロゲンレセプターα(ERα)を阻害するsiRNAが使用されるが、これは、ランダム配列または半ランダム配列の代用である。
【０１２８】
エストロゲンレセプターαの２つの21bpの配列一致部分を、リコンビナーゼによるsiRNAの生成のためのテンプレートとして選択した。これらの配列は以下のとおりであった：
【０１２９】
AAGGCCTTCTTCAAGAGAAGT(配列番号45)
【０１３０】
AAGATCACAGACACTTTGATC(配列番号46)
【０１３１】
投入として各21bpの配列を使用して、ds-RNAコードヘアピンを生成した。図１Ａ〜１Ｃ中に示される方法を使用してヘアピンを生成した。得られたヘアピンの配列は以下のとおりであった：
【０１３２】
AAGGCCTTCTTCAAGAGAAGT-GGTAACC-ACTTCTCTTGAAGAAGGCCTT(siRNA#1)(配列番号47)
【０１３３】
AAGATCACAGACACTTTGATC-GGTAACC-GATCAAAGTGTCTGTGATCTT(siRNA#2)(配列番号48)
【０１３４】
半ヘアピン(配列番号46および47)をコードする配列を有するこれらのオリゴDNAを発現プラスミド中にクローニングした。プラスミド名「siR1」および「siR4」はこのsiRNA#1配列をコードし、プラスミド名「siR7」および「siR11」は、このsiRNA#2配列をコードした。
【０１３５】
ERα発現に対するsiRNA#1配列およびsiRNA#2配列の効果をアッセイするために、CV-1細胞に、ERα発現プラスミド、試験siRNAコードプラスミド(すなわち、siR1、siR4、siR7およびsiR11のうち１つまたはコントロールプラスミドC1およびC2)、ERE-tk-ルシフェラーゼレポータープラスミドおよびCMV-β-galコントロールプラスミドを同時トランスフェクトした。次の日、新たな培地または100nMの17-β-エストラジオール(E2)を含む培地のいずれかを細胞に与えた。処置の24時間後、これらの細胞を回収し、(A)ERαおよびアクチンの発現についてウェスタンブロットによって、または(B)ルシフェラーゼおよびβ-galレポーター遺伝子の活性についてアッセイした。siR1、siR4(両方とも上記配列siRNA#1を有する)、siR7またはsiR11(両方とも上記配列siRNA#2を含む)のトランスフェクションは、ERαタンパク質発現およびE2誘導性のERα転写活性の低下を生じたが、ベクターコントロール(C1およびC2)はそれらを生じなかった。これらの結果は図９中にグラフで示される。これらの結果は、siRNA#1配列およびsiRNA#2配列の両方がERα発現を減弱させることが可能であり、従って、これらがsiRNA配列であることを実証している。
【０１３６】
上記のように、ERα siRNAがこの実施例においてランダム配列または半ランダム配列の代用として使用されているが、本発明は、以下から選択される少なくとも10個連続する核酸を含むかまたはこのような核酸から本質的になる核酸分子を提供する：AAGGCCTTCTTCAAGAGAAGT(配列番号45)、AAGATCACAGACACTTTGATC(配列番号46)、AAGGCCUUCUUCAAGAGAAGU(配列番号49)およびAAGAUCACAGACACUUUGAUC(配列番号50)。いくつかの実施形態において、本発明の核酸は、２つの配列のいずれかに由来する少なくとも約15個連続する核酸を含むかまたはこのような核酸から本質的になり得る。望ましくは、本発明の核酸はsiRNAまたはshRNAであり、ERαの発現を減弱し得る。しかし、この核酸はDNAでもあり得る。例えば、この核酸は、この核酸をRNAとして発現し得る発現カセット(通常はDNAを含む)の一部を形成し得る。発現カセットは、適切なプロモーター、コード配列および終結配列を含む。このような発現カセットは、細胞内でRNAになるように細胞中への導入に適切なベクター系(例えば、プラスミドまたはウイルスの発現ベクター系)中に操作され得る。プラスミドおよびウイルスの発現ベクターを構築することは当業者の範囲内である。
【０１３７】
本発明の核酸は、ERαの発現を減弱させるために使用され得、本発明は、本発明の核酸を使用してERαの発現を減弱させるための方法を提供する。本発明の方法によれば、本発明の核酸は、本発明の核酸が細胞内でERαの発現を減弱させる条件下で、ERαを発現する細胞中に導入される。この細胞は、in vivoまたはin vitroのいずれかであり得る。本発明の核酸がRNA分子(例えば、siRNAまたはshRNA)として細胞に提供される場合、これらは、当業者に公知の形質導入方法を使用して細胞中に導入される。あるいは、本発明の核酸分子は、siRNAまたはshRNAのような核酸をコードする発現カセットを含む発現ベクターでこの細胞をトランスフェクト、形質導入または感染することによってこの細胞に提供され得る。このような実施形態において、このRNAは細胞内で産生され、この場所でこのRNAは、ERαの発現を減弱させるためのsiRNAまたはshRNAとして作用し得るだろう。
【０１３８】
本明細書中に列挙される全ての参考文献(刊行物、特許出願および特許を含む)は、各参考文献が参考として援用されると個々にかつ具体的に示され、その全体が本明細書中で示されたのと同じ程度まで、本明細書中で参考として援用される。また、他の刊行物に対する本明細書中の言及は、このような刊行物が本願の前に構成されたことを認めるものではない。
【０１３９】
本発明を説明することに関して(特に、添付の特許請求の範囲に関して)用語「a」および「an」および「the」ならびに同様の指示対象の使用は、本明細書中で他のように示されるかまたは文脈によって明確に否定されるかしない限り、単数形および複数形の両方をカバーすると解釈されるべきである。用語「含む(comprising)」、「有する」、「含む(including)」および「含む(containing)」は、他のように示されない限り、開放型の用語(すなわち、「〜を含むがこれらに限定されない」を意味する)と解釈されるべきである。本明細書中の値の範囲の列挙は、本明細書中で他のように示されない限り、その範囲内に入る各別個の値を個々に参照する簡略な方法として働くことが意図されているだけであり、各別個の値は、それが本明細書中で個々に列挙されているかのごとく本明細書中に組み込まれる。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中で他のように示されるかまたは文脈によって明確に否定されるかしない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書中に提供される任意および全ての例または例示的語句(例えば、「例えば/〜のような」)の使用は、本発明をよりよく例示するためだけに意図されているのであり、他のように特許請求されない限り本発明の範囲に対する限定ではない。本明細書中の語句は、任意の特許請求されていない要素を本発明の実施に必須であるとして示していると解釈すべきではない。
【０１４０】
本発明を実施するための本発明者らが知る最良の様式を含む本発明の好ましい実施形態が本明細書中に記載される。好ましい実施形態のバリエーションは、上記の説明を読んだときに当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者が適切な場合にこのようなバリエーションを使用することを予測しており、本発明者らは、本発明が本明細書中に具体的に記載されているのとは異なって実施されることを意図している。従って、本発明は、適用可能な法律によって許容されるような本明細書に添付された特許請求の範囲中に列挙される対象の全ての改変および等価物を含む。さらに、その全ての可能なバリエーションにおける上記の要素の任意の組み合わせが、本明細書中で他のように示されるかまたは文脈によって明確に否定されるかしない限り、本発明によって包含される。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１Ａ】図１Ａは、DNAヘアピンおよびランダムsiRNAライブラリーを生成するための方法を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、DNAヘアピンおよびランダムsiRNAライブラリーを生成するための方法を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、DNAヘアピンおよびランダムsiRNAライブラリーを生成するための方法を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、誘導性FLPリコンビナーゼを使用してランダムsiRNAライブラリーの発現を調節するための方法を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、誘導性FLPリコンビナーゼを使用してランダムsiRNAライブラリーの発現を調節するための方法を示す。
【図３】図３は、誘導性T7ポリメラーゼを使用してランダムsiRNAライブラリーの発現を調節するための方法を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、PolIIIプロモーターを使用する二方向性アプローチを使用してランダムsiRNAライブラリーを構築するための方法を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、PolIIIプロモーターを使用する二方向性アプローチを使用してランダムsiRNAライブラリーを構築するための方法を示す。
【図５】図５は、T7プロモーターを使用する二方向性アプローチを使用してランダムsiRNAライブラリーを構築するための方法を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、自己アニーリングするヘアピンを使用してランダムsiRNAライブラリーを生成するための方法を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、自己アニーリングするヘアピンを使用してランダムsiRNAライブラリーを生成するための方法を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、cDNAライブラリーをsiRNAライブラリーへと適合させる方法を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、cDNAライブラリーをsiRNAライブラリーへと適合させる方法を示す。
【図８】図８は、ランダムsiRNAライブラリーの使用を示すフローチャートである。
【図９】図９は、本発明の方法に従って調製されたsiRNAを使用したエストロゲンレセプターαの阻害を実証する実験の結果を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、下記の方法１に従う、FLP-FRT系を使用したランダムsiRNAライブラリーの構築における工程を実証するゲルを示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、下記の方法１に従う、FLP-FRT系を使用したランダムsiRNAライブラリーの構築における工程を実証するゲルを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
短鎖干渉RNA(siRNA)ライブラリーを調製するための方法であって、該方法は、
（１）その各々が3’制限部位および5’制限部位に挟まれるランダム配列または半ランダム配列を含むオリゴDNAの集団を生成することであって、この3’制限部位は5’制限部位とは異なる、
（２）互いに対して配向された２つのリコンビナーゼ部位を有するプラスミド中にオリゴDNAをクローニングして、3’制限部位および5’制限部位に挟まれるランダム配列を二重リコンビナーゼ部位間に配向させること、
（３）プラスミド中に存在する特定のリコンビナーゼ認識部位に適切なリコンビナーゼ酵素を産生する宿主細胞の集団内でプラスミドを複製すること、
（４）宿主細胞内のリコンビナーゼ酵素にプラスミドを曝すこと、
（５）集団宿主細胞からプラスミドDNAを単離し、3’制限部位または5’制限部位のいずれかに対して特異的な制限酵素でこの単離されたプラスミドを消化すること、
（６）二重カセットを含む消化されたフラグメントを自己連結することであって、この二重カセットは、3’制限部位または5’制限部位のいずれかを含むスペーサー配列によって分離されたセンスランダム配列および相補的なアンチセンス配列を含む、
（７）逆方向反復に特異的に隣接する制限酵素で二重カセットを消化し、二重カセットの集団をRNA発現ベクター系中にクローニングすることであって、このRNA発現ベクター系は、二重カセットがRNAプロモーターと終結配列との間に挿入されるように、RNAポリメラーゼプロモーターおよびRNAポリメラーゼ終結配列を有するRNA発現ベクターを含む、
（８）ベクターをプールして、siRNAコードライブラリーを形成すること、
を含む、方法。
【請求項２】
RNA発現ベクター内のRNAポリメラーゼプロモーターがT7バクテリオファージプロモーターであり、RNA終結配列がT7転写のターミネーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
RNA発現ベクターが対向するプロモーターを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
二重カセットが、単一の挿入物としてRNA発現ベクター中にクローニングされる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
二重カセットが、少なくとも２つの二重カセットを含むオリゴマー挿入物としてRNA発現ベクター中にクローニングされる、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ランダムsiRNAをコードする二重カセットが、予め規定された配列を含むsiRNAをコードするカセットと直列でRNA発現ベクター中にクローニングされる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
RNA発現ベクターが、T7バクテリオファージRNAポリメラーゼのDNA結合ドメインおよび転写活性化ドメイン、核局在化シグナルならびにT7ポリメラーゼのリガンド依存的な活性を付与するリガンド結合ドメインを含む野生型または変異体のステロイドホルモンレセプターの一部分を含む融合タンパク質をコードする発現カセットをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
siRNAライブラリーを調製するための方法であって、該方法は、
（１）制限部位が隣接し、任意でプライミング配列が後に続くランダム配列または半ランダム配列をその各々が含むオリゴDNAの集団を生成すること、
（２）相補鎖を伸長して二本鎖オリゴDNAを作製すること、
（３）第１のRNAプロモーターおよび第２のRNAプロモーターを含むベクターを有するRNA発現ベクター系中にオリゴDNAをクローニングすることであって、この第１のプロモーターおよび第２のプロモーターは、第１のRNAプロモーターと第２のRNAプロモーターとの間に位置するセンス配列およびアンチセンス相補配列のそれぞれのRNA転写を指向するように内側に配向され、オリゴDNA配列は第１のプロモーターと第２のプロモーターとの間でベクター中にクローニングされる；ならびに
（４）工程（３）からの挿入物を含むベクターをプールして、siRNAコードライブラリーを形成すること、
を含む、方法。
【請求項９】
第１のRNAプロモーターおよび第２のRNAプロモーターの一方または両方がU6 RNAプロモーターである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
一方のプロモーターがH1プロモーターである、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
一方のプロモーターがT7プロモーターである、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
両方のプロモーターがクラスII T7ターミネーターによって隣接されたT7プロモーターである、請求項８〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
siRNAライブラリーを調製するための方法であって、該方法は、
（１）その各々が予め選択された制限部位、ランダム配列もしくは半ランダム配列、プライミングループに寄与する第１の配列、スペーサー配列およびプライミングループに寄与する第２の配列を(5’から3’で)含み、それによってプライミングループに寄与する第１の配列およびプライミングループに寄与する第２の配列がアニーリングしてループを形成するオリゴDNAの集団を生成すること、
（２）プライミングループに寄与する第２の配列の末端からテンプレート鎖の予め選択された制限部位を通って相補鎖を伸長するのに適切な条件下で、オリゴDNAの集団をDNAポリメラーゼに曝すこと；
（３）一本鎖の伸長したオリゴDNAを形成するために二本鎖の伸長したオリゴDNAを変性させること；
（４）テンプレートの自己アニーリングを最小限にする条件下でsiRNAコードDNAを形成するために一本鎖の伸長したオリゴDNAに対する相補鎖を合成すること；
（５）siRNAコードDNAをプールしてsiRNAコードライブラリーを形成すること、
を含む、方法。
【請求項１４】
さらに、
予め選択された制限部位に対応する制限酵素でsiRNAコードDNAを消化すること；
RNA発現ベクターの集団中に二本鎖DNAをクローニングすること；
ベクターをプールしてsiRNAコードライブラリーを形成すること、
を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
プライミングループに寄与する第１の配列および第２の配列の両方がGCリッチな配列である、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
オリゴDNAが、予め選択された制限部位とランダム配列との間にAAジヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
ランダム配列および半ランダム配列がランダム配列である、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
二本鎖RNAライブラリーを調製する方法であって、該方法は、
（１）cDNAライブラリーを得ること；
（２）２つのRNAポリメラーゼプロモーターに挟まれるクローニング部位を含むプラスミド中にcDNAをクローニングすることであって、第１のRNAポリメラーゼプロモーターがセンス鎖を転写し、第２のRNAポリメラーゼプロモーターがアンチセンス鎖を転写し、消化されたcDNAが第１のRNAポリメラーゼプロモーターと第２のRNAポリメラーゼプロモーターとの間でプラスミド中に導入されて、ユニークな発現カセットを生じる；
（４）得られたプラスミドを合わせて、二本鎖RNAコードライブラリーを形成すること、
を含む、方法。
【請求項１９】
次いでプラスミド中にクローニングされる約100塩基対〜約1000塩基対のcDNAフラグメントが、残りのcDNAのサイズよりも優位を占めるようにcDNAライブラリーが制限酵素で消化される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
プラスミドがE3Lタンパク質をコードする発現カセットをさらに含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
E3Lタンパク質が翻訳後レベルで調節される、請求項１８〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれかに記載の方法によって調製される、ライブラリー。
【請求項２３】
ランダムsiRNAライブラリーまたは半ランダムsiRNAライブラリー。
【請求項２４】
ランダムライブラリーである、請求項２２または２３に記載のsiRNAライブラリー。
【請求項２５】
その各々がsiRNAをコードする別個の配列を含むDNAベースの発現ベクターのライブラリーを含む、請求項２２〜２４のいずれかに記載のsiRNAライブラリー。
【請求項２６】
発現ベクターがプラスミドである、請求項２５に記載のsiRNAライブラリー。
【請求項２７】
発現ベクターがウイルスベクターである、請求項２５に記載のsiRNAライブラリー。
【請求項２８】
集団内の別個の細胞がsiRNAをコードする別個の種のベクターを含む細胞の集団を含む、請求項２２〜２４のいずれかに記載のsiRNAライブラリー。
【請求項２９】
挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な特性に基づいて請求項２８に記載のsiRNAライブラリーから選択された、細胞の部分集団。
【請求項３０】
siRNAがshRNAである、請求項２２〜２８のいずれかに記載のライブラリー。
【請求項３１】
siRNAライブラリーを使用する方法であって、該方法は、
siRNAライブラリーを細胞の集団中に導入すること、および
細胞の集団を選択プロセスに供して、集団の残部とは異なる挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な特性を示す細胞の部分集団を選択すること、
を含む、方法。
【請求項３２】
ライブラリーがランダムsiRNAライブラリーまたは半ランダムsiRNAライブラリーである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ライブラリーが指向されたsiRNAライブラリーである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
ライブラリーが、siRNAをコードする転写カセットを有するベクターの集団を含み、このライブラリーが、ベクターでの細胞の集団のトランスフェクション、形質導入または感染によって細胞の集団中に導入される、請求項３１〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
選択プロセスが、集団内のいくつかの細胞内での挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な変化を促進し得る刺激に細胞の集団を供することを含む、請求項３１〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
刺激が、既知または未知のウイルスへの細胞の集団の曝露を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
刺激が、毒素への細胞の集団の曝露を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
刺激が、分化因子への細胞の集団の曝露を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
刺激が、細胞増殖に影響を与える因子への細胞の集団の曝露を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
刺激が、細胞の移動に影響を与える因子への細胞の集団の曝露を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
刺激が、細胞の代謝に影響を与える因子への細胞の集団の曝露を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
刺激が、細胞のストレス応答に影響を与える因子への細胞の集団の曝露を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
刺激が、集団に対する既知の効果、予測された効果または予期可能な効果を有するように選択され、部分集団が、刺激後に既知の効果、予測された効果または予期可能な効果を示さない細胞を含むものとして選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４４】
刺激が、集団に対する未知の効果を有するように選択され、部分集団が、集団の残部で観察された効果とは異なる刺激後の効果を示す細胞を含むものとして選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
集団から部分集団を実質的に単離することをさらに含む、請求項３１〜４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
部分集団をクローン増殖することをさらに含む、請求項３１〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
ゲノミクス的手法、プロテオミクス的手法、セロミクス的手法またはそれらの組み合わせによって部分集団を分析することをさらに含む、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項４８】
部分集団が、マイクロアレイ分析によって部分集団の細胞内の遺伝子発現を評価することを含むゲノミクス的手法によって分析される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
部分集団が、部分集団の細胞内の単一、複数またはプロテオーム規模のタンパク質のタンパク質構造、機能、活性および/または発現レベルにおける変化をマッピングすることを含むプロテオミクス的手法によって分析される、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項５０】
部分集団が、細胞の特性ならびに経路を時間的および空間的に評価することを含むセロミクス的手法によって分析される、請求項４７〜４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
部分集団由来の細胞からsiRNAコードカセットを単離することをさらに含む、請求項３１〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
部分集団から単離された単離siRNAを配列決定することをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
細胞の開始集団から実質的に単離された、請求項４５に記載の方法に従って単離された部分集団。
【請求項５４】
細胞の開始集団から完全に単離された、請求項５３に記載の部分集団。
【請求項５５】
請求項５１に記載の方法に従って部分集団から単離されたsiRNA。
【請求項５６】
siRNA種の実質的に同質の集団を含む、請求項５５に記載のsiRNA。
【請求項５７】
以下の配列またはそれらの相補配列から選択される少なくとも10個連続する核酸を含む配列を有する核酸分子：
AAGGCCTTCTTCAAGAGAAGT(配列番号45)、
AAGATCACAGACACTTTGATC(配列番号46)、
AAGGCCUUCUUCAAGAGAAGU(配列番号49)および
AAGAUCACAGACACUUUGAUC(配列番号50)。
【請求項５８】
siRNAまたはshRNAである、請求項５７に記載の核酸分子。
【請求項５９】
DNAである、請求項５７に記載の核酸分子。
【請求項６０】
請求項５７〜５９のいずれかに記載の核酸分子をコードするかまたはこのような核酸分子を含むDNA発現カセット。
【請求項６１】
エストロゲンレセプターαの発現を減弱させる方法であって、該方法は、細胞内のエストロゲンレセプターαの発現を核酸分子が減弱させるような条件下で、エストロゲンレセプターαを発現する細胞中に請求項５８に記載の核酸分子を導入することを含む、方法。
【請求項６２】
核酸分子が、核酸分子をコードするベクターを細胞中に導入することによって細胞中に導入される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
DNAヘアピンを生成する方法であって、該方法は、
（１）その各々が3’制限部位および5’制限部位に挟まれるオリゴDNAの集団を生成することであって、この3’制限部位は5’制限部位とは異なる；
（２）互いに対して配向された２つのリコンビナーゼ部位を有するプラスミド中にオリゴDNAをクローニングして、3’制限部位および5’制限部位に挟まれるオリゴDNAを二重リコンビナーゼ部位間に配向させること；
（３）プラスミド中に存在する特定のリコンビナーゼ認識部位に適切なリコンビナーゼ酵素を産生する宿主細胞の集団内でプラスミドを複製すること；
（４）宿主細胞内のリコンビナーゼ酵素にプラスミドを曝すこと；
（５）宿主細胞の集団からプラスミドDNAを単離し、3’制限部位または5’制限部位のいずれかに対して特異的な制限酵素でこの単離されたプラスミドを消化すること；
（６）二重カセットを含む消化されたフラグメントを自己連結することであって、この二重カセットは、3’制限部位または5’制限部位のいずれかを含むスペーサー配列によって分離されたオリゴDNAに対応するセンス配列および相補的配列を含む、
を含む、方法。
【請求項６４】
リコンビナーゼがFLPまたはCreである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
オリゴDNAの集団が予め設計された配列を有し、得られたヘアピンが特異的siRNAコードヘアピンである、請求項６３または６４に記載の方法。
【請求項６６】
オリゴDNAの集団内の配列がランダムまたは半ランダムであり、得られたヘアピンがランダムまたは半ランダムのsiRNAコードライブラリーである、請求項６３〜６５のいずれかに記載の方法。
【請求項６７】
互いに対して配向された２つのリコンビナーゼ認識部位を含み、２つのリコンビナーゼ制限部位間にDNAの配列を有するプラスミドであって、この配列が、少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む、プラスミド。
【請求項６８】
配列が、少なくとも２つの制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む、請求項６７に記載のプラスミド。
【請求項６９】
２つの制限エンドヌクレアーゼ認識配列が同じ配列ではない、請求項６７または６８に記載のプラスミド。
【請求項７０】
２つのリコンビナーゼ認識部位を認識するリコンビナーゼ酵素をコードする発現カセットをさらに含む、請求項６７〜６９のいずれかに記載のプラスミド。
【請求項７１】
発現カセットが２つの制限エンドヌクレアーゼ配列間には存在しない、請求項６７〜７０のいずれかに記載のプラスミド。
【請求項７２】
siRNAの一方の鎖をコードするDNA配列をさらに含み、このDNA配列が２つの制限エンドヌクレアーゼ認識配列間に存在する、請求項６７〜７１のいずれかに記載のプラスミド。
【請求項７３】
２つのリコンビナーゼ認識部位がFRTである、請求項７２に記載のプラスミド。
【請求項７４】
２つのリコンビナーゼ認識部位がloxPである、請求項７２に記載のプラスミド。
【請求項１】
短鎖干渉RNA(siRNA)ライブラリーを調製するための方法であって、該方法は、
（１）その各々が3’制限部位および5’制限部位に挟まれるランダム配列または半ランダム配列を含むオリゴDNAの集団を生成することであって、この3’制限部位は5’制限部位とは異なる、
（２）互いに対して配向された２つのリコンビナーゼ部位を有するプラスミド中にオリゴDNAをクローニングして、3’制限部位および5’制限部位に挟まれるランダム配列を二重リコンビナーゼ部位間に配向させること、
（３）プラスミド中に存在する特定のリコンビナーゼ認識部位に適切なリコンビナーゼ酵素を産生する宿主細胞の集団内でプラスミドを複製すること、
（４）宿主細胞内のリコンビナーゼ酵素にプラスミドを曝すこと、
（５）集団宿主細胞からプラスミドDNAを単離し、3’制限部位または5’制限部位のいずれかに対して特異的な制限酵素でこの単離されたプラスミドを消化すること、
（６）二重カセットを含む消化されたフラグメントを自己連結することであって、この二重カセットは、3’制限部位または5’制限部位のいずれかを含むスペーサー配列によって分離されたセンスランダム配列および相補的なアンチセンス配列を含む、
（７）逆方向反復に特異的に隣接する制限酵素で二重カセットを消化し、二重カセットの集団をRNA発現ベクター系中にクローニングすることであって、このRNA発現ベクター系は、二重カセットがRNAプロモーターと終結配列との間に挿入されるように、RNAポリメラーゼプロモーターおよびRNAポリメラーゼ終結配列を有するRNA発現ベクターを含む、
（８）ベクターをプールして、siRNAコードライブラリーを形成すること、
を含む、方法。
【請求項２】
RNA発現ベクター内のRNAポリメラーゼプロモーターがT7バクテリオファージプロモーターであり、RNA終結配列がT7転写のターミネーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
RNA発現ベクターが対向するプロモーターを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
二重カセットが、単一の挿入物としてRNA発現ベクター中にクローニングされる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
二重カセットが、少なくとも２つの二重カセットを含むオリゴマー挿入物としてRNA発現ベクター中にクローニングされる、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ランダムsiRNAをコードする二重カセットが、予め規定された配列を含むsiRNAをコードするカセットと直列でRNA発現ベクター中にクローニングされる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
RNA発現ベクターが、T7バクテリオファージRNAポリメラーゼのDNA結合ドメインおよび転写活性化ドメイン、核局在化シグナルならびにT7ポリメラーゼのリガンド依存的な活性を付与するリガンド結合ドメインを含む野生型または変異体のステロイドホルモンレセプターの一部分を含む融合タンパク質をコードする発現カセットをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
siRNAライブラリーを調製するための方法であって、該方法は、
（１）制限部位が隣接し、任意でプライミング配列が後に続くランダム配列または半ランダム配列をその各々が含むオリゴDNAの集団を生成すること、
（２）相補鎖を伸長して二本鎖オリゴDNAを作製すること、
（３）第１のRNAプロモーターおよび第２のRNAプロモーターを含むベクターを有するRNA発現ベクター系中にオリゴDNAをクローニングすることであって、この第１のプロモーターおよび第２のプロモーターは、第１のRNAプロモーターと第２のRNAプロモーターとの間に位置するセンス配列およびアンチセンス相補配列のそれぞれのRNA転写を指向するように内側に配向され、オリゴDNA配列は第１のプロモーターと第２のプロモーターとの間でベクター中にクローニングされる；ならびに
（４）工程（３）からの挿入物を含むベクターをプールして、siRNAコードライブラリーを形成すること、
を含む、方法。
【請求項９】
第１のRNAプロモーターおよび第２のRNAプロモーターの一方または両方がU6 RNAプロモーターである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
一方のプロモーターがH1プロモーターである、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
一方のプロモーターがT7プロモーターである、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
両方のプロモーターがクラスII T7ターミネーターによって隣接されたT7プロモーターである、請求項８〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
siRNAライブラリーを調製するための方法であって、該方法は、
（１）その各々が予め選択された制限部位、ランダム配列もしくは半ランダム配列、プライミングループに寄与する第１の配列、スペーサー配列およびプライミングループに寄与する第２の配列を(5’から3’で)含み、それによってプライミングループに寄与する第１の配列およびプライミングループに寄与する第２の配列がアニーリングしてループを形成するオリゴDNAの集団を生成すること、
（２）プライミングループに寄与する第２の配列の末端からテンプレート鎖の予め選択された制限部位を通って相補鎖を伸長するのに適切な条件下で、オリゴDNAの集団をDNAポリメラーゼに曝すこと；
（３）一本鎖の伸長したオリゴDNAを形成するために二本鎖の伸長したオリゴDNAを変性させること；
（４）テンプレートの自己アニーリングを最小限にする条件下でsiRNAコードDNAを形成するために一本鎖の伸長したオリゴDNAに対する相補鎖を合成すること；
（５）siRNAコードDNAをプールしてsiRNAコードライブラリーを形成すること、
を含む、方法。
【請求項１４】
さらに、
予め選択された制限部位に対応する制限酵素でsiRNAコードDNAを消化すること；
RNA発現ベクターの集団中に二本鎖DNAをクローニングすること；
ベクターをプールしてsiRNAコードライブラリーを形成すること、
を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
プライミングループに寄与する第１の配列および第２の配列の両方がGCリッチな配列である、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
オリゴDNAが、予め選択された制限部位とランダム配列との間にAAジヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
ランダム配列および半ランダム配列がランダム配列である、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
二本鎖RNAライブラリーを調製する方法であって、該方法は、
（１）cDNAライブラリーを得ること；
（２）２つのRNAポリメラーゼプロモーターに挟まれるクローニング部位を含むプラスミド中にcDNAをクローニングすることであって、第１のRNAポリメラーゼプロモーターがセンス鎖を転写し、第２のRNAポリメラーゼプロモーターがアンチセンス鎖を転写し、消化されたcDNAが第１のRNAポリメラーゼプロモーターと第２のRNAポリメラーゼプロモーターとの間でプラスミド中に導入されて、ユニークな発現カセットを生じる；
（４）得られたプラスミドを合わせて、二本鎖RNAコードライブラリーを形成すること、
を含む、方法。
【請求項１９】
次いでプラスミド中にクローニングされる約100塩基対〜約1000塩基対のcDNAフラグメントが、残りのcDNAのサイズよりも優位を占めるようにcDNAライブラリーが制限酵素で消化される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
プラスミドがE3Lタンパク質をコードする発現カセットをさらに含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
E3Lタンパク質が翻訳後レベルで調節される、請求項１８〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれかに記載の方法によって調製される、ライブラリー。
【請求項２３】
ランダムsiRNAライブラリーまたは半ランダムsiRNAライブラリー。
【請求項２４】
ランダムライブラリーである、請求項２２または２３に記載のsiRNAライブラリー。
【請求項２５】
その各々がsiRNAをコードする別個の配列を含むDNAベースの発現ベクターのライブラリーを含む、請求項２２〜２４のいずれかに記載のsiRNAライブラリー。
【請求項２６】
発現ベクターがプラスミドである、請求項２５に記載のsiRNAライブラリー。
【請求項２７】
発現ベクターがウイルスベクターである、請求項２５に記載のsiRNAライブラリー。
【請求項２８】
集団内の別個の細胞がsiRNAをコードする別個の種のベクターを含む細胞の集団を含む、請求項２２〜２４のいずれかに記載のsiRNAライブラリー。
【請求項２９】
挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な特性に基づいて請求項２８に記載のsiRNAライブラリーから選択された、細胞の部分集団。
【請求項３０】
siRNAがshRNAである、請求項２２〜２８のいずれかに記載のライブラリー。
【請求項３１】
siRNAライブラリーを使用する方法であって、該方法は、
siRNAライブラリーを細胞の集団中に導入すること、および
細胞の集団を選択プロセスに供して、集団の残部とは異なる挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な特性を示す細胞の部分集団を選択すること、
を含む、方法。
【請求項３２】
ライブラリーがランダムsiRNAライブラリーまたは半ランダムsiRNAライブラリーである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ライブラリーが指向されたsiRNAライブラリーである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
ライブラリーが、siRNAをコードする転写カセットを有するベクターの集団を含み、このライブラリーが、ベクターでの細胞の集団のトランスフェクション、形質導入または感染によって細胞の集団中に導入される、請求項３１〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
選択プロセスが、集団内のいくつかの細胞内での挙動的、生化学的、化学的、機能的、分子的、形態学的、表現型的または物理的な変化を促進し得る刺激に細胞の集団を供することを含む、請求項３１〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
刺激が、既知または未知のウイルスへの細胞の集団の曝露を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
刺激が、毒素への細胞の集団の曝露を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
刺激が、分化因子への細胞の集団の曝露を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
刺激が、細胞増殖に影響を与える因子への細胞の集団の曝露を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
刺激が、細胞の移動に影響を与える因子への細胞の集団の曝露を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
刺激が、細胞の代謝に影響を与える因子への細胞の集団の曝露を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
刺激が、細胞のストレス応答に影響を与える因子への細胞の集団の曝露を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
刺激が、集団に対する既知の効果、予測された効果または予期可能な効果を有するように選択され、部分集団が、刺激後に既知の効果、予測された効果または予期可能な効果を示さない細胞を含むものとして選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４４】
刺激が、集団に対する未知の効果を有するように選択され、部分集団が、集団の残部で観察された効果とは異なる刺激後の効果を示す細胞を含むものとして選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
集団から部分集団を実質的に単離することをさらに含む、請求項３１〜４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
部分集団をクローン増殖することをさらに含む、請求項３１〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
ゲノミクス的手法、プロテオミクス的手法、セロミクス的手法またはそれらの組み合わせによって部分集団を分析することをさらに含む、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項４８】
部分集団が、マイクロアレイ分析によって部分集団の細胞内の遺伝子発現を評価することを含むゲノミクス的手法によって分析される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
部分集団が、部分集団の細胞内の単一、複数またはプロテオーム規模のタンパク質のタンパク質構造、機能、活性および/または発現レベルにおける変化をマッピングすることを含むプロテオミクス的手法によって分析される、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項５０】
部分集団が、細胞の特性ならびに経路を時間的および空間的に評価することを含むセロミクス的手法によって分析される、請求項４７〜４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
部分集団由来の細胞からsiRNAコードカセットを単離することをさらに含む、請求項３１〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
部分集団から単離された単離siRNAを配列決定することをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
細胞の開始集団から実質的に単離された、請求項４５に記載の方法に従って単離された部分集団。
【請求項５４】
細胞の開始集団から完全に単離された、請求項５３に記載の部分集団。
【請求項５５】
請求項５１に記載の方法に従って部分集団から単離されたsiRNA。
【請求項５６】
siRNA種の実質的に同質の集団を含む、請求項５５に記載のsiRNA。
【請求項５７】
以下の配列またはそれらの相補配列から選択される少なくとも10個連続する核酸を含む配列を有する核酸分子：
AAGGCCTTCTTCAAGAGAAGT(配列番号45)、
AAGATCACAGACACTTTGATC(配列番号46)、
AAGGCCUUCUUCAAGAGAAGU(配列番号49)および
AAGAUCACAGACACUUUGAUC(配列番号50)。
【請求項５８】
siRNAまたはshRNAである、請求項５７に記載の核酸分子。
【請求項５９】
DNAである、請求項５７に記載の核酸分子。
【請求項６０】
請求項５７〜５９のいずれかに記載の核酸分子をコードするかまたはこのような核酸分子を含むDNA発現カセット。
【請求項６１】
エストロゲンレセプターαの発現を減弱させる方法であって、該方法は、細胞内のエストロゲンレセプターαの発現を核酸分子が減弱させるような条件下で、エストロゲンレセプターαを発現する細胞中に請求項５８に記載の核酸分子を導入することを含む、方法。
【請求項６２】
核酸分子が、核酸分子をコードするベクターを細胞中に導入することによって細胞中に導入される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
DNAヘアピンを生成する方法であって、該方法は、
（１）その各々が3’制限部位および5’制限部位に挟まれるオリゴDNAの集団を生成することであって、この3’制限部位は5’制限部位とは異なる；
（２）互いに対して配向された２つのリコンビナーゼ部位を有するプラスミド中にオリゴDNAをクローニングして、3’制限部位および5’制限部位に挟まれるオリゴDNAを二重リコンビナーゼ部位間に配向させること；
（３）プラスミド中に存在する特定のリコンビナーゼ認識部位に適切なリコンビナーゼ酵素を産生する宿主細胞の集団内でプラスミドを複製すること；
（４）宿主細胞内のリコンビナーゼ酵素にプラスミドを曝すこと；
（５）宿主細胞の集団からプラスミドDNAを単離し、3’制限部位または5’制限部位のいずれかに対して特異的な制限酵素でこの単離されたプラスミドを消化すること；
（６）二重カセットを含む消化されたフラグメントを自己連結することであって、この二重カセットは、3’制限部位または5’制限部位のいずれかを含むスペーサー配列によって分離されたオリゴDNAに対応するセンス配列および相補的配列を含む、
を含む、方法。
【請求項６４】
リコンビナーゼがFLPまたはCreである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
オリゴDNAの集団が予め設計された配列を有し、得られたヘアピンが特異的siRNAコードヘアピンである、請求項６３または６４に記載の方法。
【請求項６６】
オリゴDNAの集団内の配列がランダムまたは半ランダムであり、得られたヘアピンがランダムまたは半ランダムのsiRNAコードライブラリーである、請求項６３〜６５のいずれかに記載の方法。
【請求項６７】
互いに対して配向された２つのリコンビナーゼ認識部位を含み、２つのリコンビナーゼ制限部位間にDNAの配列を有するプラスミドであって、この配列が、少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む、プラスミド。
【請求項６８】
配列が、少なくとも２つの制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む、請求項６７に記載のプラスミド。
【請求項６９】
２つの制限エンドヌクレアーゼ認識配列が同じ配列ではない、請求項６７または６８に記載のプラスミド。
【請求項７０】
２つのリコンビナーゼ認識部位を認識するリコンビナーゼ酵素をコードする発現カセットをさらに含む、請求項６７〜６９のいずれかに記載のプラスミド。
【請求項７１】
発現カセットが２つの制限エンドヌクレアーゼ配列間には存在しない、請求項６７〜７０のいずれかに記載のプラスミド。
【請求項７２】
siRNAの一方の鎖をコードするDNA配列をさらに含み、このDNA配列が２つの制限エンドヌクレアーゼ認識配列間に存在する、請求項６７〜７１のいずれかに記載のプラスミド。
【請求項７３】
２つのリコンビナーゼ認識部位がFRTである、請求項７２に記載のプラスミド。
【請求項７４】
２つのリコンビナーゼ認識部位がloxPである、請求項７２に記載のプラスミド。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【公表番号】特表２００７−５０２１２９（Ｐ２００７−５０２１２９Ａ）
【公表日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３２８９８（Ｐ２００６−５３２８９８）
【出願日】平成１６年５月１０日（２００４．５．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１４４９４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０１７８８
【国際公開日】平成１６年１１月２５日（２００４．１１．２５）
【出願人】（５０００９１３１３）ユニヴァーシティ オヴ ピッツバーグ オヴ ザ コモンウェルス システム オヴ ハイアー エデュケーション (10)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年５月１０日（２００４．５．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１４４９４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０１７８８
【国際公開日】平成１６年１１月２５日（２００４．１１．２５）
【出願人】（５０００９１３１３）ユニヴァーシティ オヴ ピッツバーグ オヴ ザ コモンウェルス システム オヴ ハイアー エデュケーション (10)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]