神経ペプチド２受容体（Ｙ−２Ｒ）アゴニスト及びその使用
本発明は、式（Ｉ）：Ｙ−Ｒ1−Ｒ2−Ｘ−Ｒ3−Ｒ4−Ｒ5−Ｒ6−Ｒ7−Ｒ8−Ｒ9−Ｒ−10−Ｒ11−Ｒ12-Ｒ13−Ｒ14−ＮＨ2の神経ペプチド２受容体アゴニスト、ならびにその薬学的に許容される塩、誘導体及びフラグメントに関し、ここで置換基は、本明細書に開示されるとおりである。これらの化合物及びそれらを含む医薬組成物は、例えば肥満及び糖尿病などの疾患の処置に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＰＹＹ３−３６の短縮された類似体を提供する。この類似体は神経ペプチド２受容体のアゴニストであり、例えば肥満、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性及び脂質異常症などの代謝疾患及び代謝障害の処置に有用である。
【０００２】
本発明は特に式（Ｉ）：
Ｙ−Ｒ１−Ｒ２−Ｘ−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８−Ｒ９−Ｒ１０−Ｒ１１−Ｒ１２−Ｒ１３−Ｒ１４−ＮＨ２ （Ｉ）
［式中、
Ｘは、（４−アミノメチル−ビフェニル−３−イル）−酢酸（Ｃｂａ）、（５−ピペラジン−１−イル−インドール−１−イル）−酢酸（Ｃｉｐ）、３−（４−オキソ−６−ピペラジン−１−イル−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−プロピオン酸（ＨｏｍＰｑａ）、（６−［１，４］ジアゼパン−１−イル−４−オキソ−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−酢酸（Ｄｑａ）、（６−オキソ−２−ピペラジン−１−イル−１，６−ジヒドロプリン−７−イル）−酢酸（Ｐｄｐ）、（２−ピペラジン−１−イル−プリン−７−イル）−酢酸（Ｐｐａ）、（６−アミノ−２−ピペラジン−１−イル−９Ｈ−プリン−８−イル）−酢酸（Ａｐｐａ）、（（１Ｒ，４Ｓ）−６−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−イル−４−オキソ−４Ｈ−キナゾリン）−酢酸（Ｂｑａ）又は（１−オキソ−７−ピペラジン−１−イル−１Ｈ−イソキノリン−２−イル）−酢酸（Ｐｉｐａ）であり；
ＹはＨ又はアシル部分であり；
Ｒ１は、Ｉｌｅ、Ａｌａ、（Ｄ）Ｉｌｅ、Ｎ−メチルＩｌｅ、Ａｉｂ、１−１Ａｉｃ、２−２Ａｉｃ、Ａｃｈ又はＡｃｐであり；
Ｒ２は、Ｌｙｓ、Ａｌａ、（Ｄ）Ｌｙｓ、Ｎ−メチルｌｙｓ、Ｎｌｅ又は（Ｌｙｓ−Ｇｌｙ）であり；
Ｒ３は、Ａｒｇ、Ａｌａ、（Ｄ）Ａｒｇ、Ｎ−メチルＡｒｇ、Ｐｈｅ、３，４，５−トリフルオロＰｈｅ又は２，３，４，５，６−ペンタフルオロＰｈｅであり；
Ｒ４は、Ｈｉｓ、Ａｌａ、（Ｄ）Ｈｉｓ、Ｎ−メチルＨｉｓ、４−ＭｅＯＡｐｃ、３−Ｐａｌ又は４−Ｐａｌであり；
Ｒ５は、Ｔｙｒ、Ａｌａ、（Ｄ）Ｔｙｒ、Ｎ−メチルＴｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｉｃ、Ｂｉｐ、Ｄｉｐ、（１）Ｎａｌ、（２）Ｎａｌ、３，４，５−トリフルオロＰｈｅ又は２，３，４，５，６−ペンタフルオロＰｈｅであり；
Ｒ６は、Ｌｅｕ、Ａｌａ、（Ｄ）Ｌｅｕ又はＮ−メチルＬｅｕであり；
Ｒ７は、Ａｓｎ、Ａｌａ又は（Ｄ）Ａｓｎであり；
Ｒ８は、Ｌｅｕ又はＴｒｐであり；
Ｒ９は、Ｖａｌ、Ａｌａ、（Ｄ）Ｖａｌ又はＮ−メチルＶａｌであり；
Ｒ１０は、Ｔｈｒ、Ａｌａ又はＮ−メチルＴｈｒであり；
Ｒ１１は、Ａｒｇ、（Ｄ）Ａｒｇ又はＮ−メチルＡｒｇであり；
Ｒ１２は、Ｇｌｎ又はＡｌａであり；
Ｒ１３は、Ａｒｇ、（Ｄ）Ａｒｇ又はＮ−メチルＡｒｇであり、
Ｒ１４は、Ｔｙｒ、（Ｄ）ＴｙｒもしくはＮ−メチルＴｙｒ、修飾Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、修飾Ｐｈｅ、（１）Ｎａｌ、（２）Ｎａｌ、Ｃｈａ、Ｃ−α−メチルＴｙｒ又はＴｒｐである］で示される神経ペプチド２受容体アゴニスト又はその薬学的に許容される塩に関する。
【背景技術】
【０００３】
代謝疾患及び代謝障害は、先進国における深刻な健康上の問題として広く認識されており、米国では流行レベルに達している。例えば肥満に関する最近の研究では、米国の人口の５０％超が過体重であると考えられており、２５％超が臨床的に肥満でありかつ心疾患、２型糖尿病及びある種の癌の相当な危険性があると診断されている。年間７００億ドルを超える推定肥満治療費用が米国だけで予想されることから、この流行は医療制度に対する著しい負担となっている。肥満を治療するための戦略は食物摂取の減少及びエネルギー消費の増大を含む。
【０００４】
３６アミノ酸ペプチド神経伝達物質である神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）は、末梢神経系と中枢神経系との両方に存在することがわかっている神経伝達物質／神経ホルモンの膵臓ポリペプチドクラスのメンバーである。ＮＰＹは、最も強力な公知の食欲促進剤の１つであり、ヒトを含む動物における食物摂取の調節に大きな役割を果たすことがわかっている。
【０００５】
ロドプシン様Ｇタンパク質共役７膜貫通受容体（ＧＰＣＲ）に属する６つの神経ペプチドＹ受容体（ＮＰＹ）、すなわちＹ１、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４及びＹ５及びＹ６サブタイプをクローニングした。ＮＰＹ Ｙ２受容体（Ｙ２Ｒ）は、他の公知のＮＰＹ受容体との低い相同性を示しながらＧｉを経由してアデニルシクラーゼの活性化を阻害する、３８１アミノ酸受容体である。９８％アミノ酸同一性を有するラット及びヒトのＹ２受容体の間には高い保存度が存在する。
【０００６】
げっ歯類とヒトとの両方における中枢神経系内にはＹ２Ｒ受容体が広く分布している。視床下部では、Ｙ２ ｍＲＮＡは弓状核、視索前核及び背内側核に局在化している。ヒト脳内では、Ｙ２Ｒが優勢なＹ受容体サブタイプである。弓状核内では、ＮＰＹニューロンの８０％超がＹ２Ｒ ｍＲＮＡを共発現させる。Ｙ２選択的アゴニストの適用がインビトロでの視床下部切片からのＮＰＹの放出を減少させることがわかっている一方、Ｙ２非ペプチドアンタゴニストＢＩＩＥ０２４６はＮＰＹ放出を増加させる。ＮＰＹ放出を制御し、そのため摂食の制御に関与し得るシナプス前自己受容体としてのＹ２Ｒの役割を、これらの発見は支持している（Kaga, T. et al., Peptides 22: 501-506 (2001)及びKing PJ et al., Eur J Pharmacol 396: R1-3 (2000)）。
【０００７】
ペプチドＹＹ３−３６（ＰＹＹ３−３６）は、神経ペプチドＹ２（ＮＰＹ２Ｒ）アゴニスト活性を有する３４アミノ酸線状ペプチドである。弓状核内（ＩＣ）又は腹腔内（ＩＰ）のＰＹＹ３−３６注射がラットにおける摂食を減少させ、臨床治療として体重増加を減少させたことが示されている。ＰＹＹ３−３６の９０分間の静脈内（ＩＶ）注入（０．８pmol／kg／分）は、２４時間にわたる肥満の及び正常なヒト対象における食物摂取を減少させた。これらの発見は、ＰＹＹ系が肥満の処置における治療標的となり得ることを示唆している（Batterham RL et al., Nature 418: 650-654 (2002); Batterham RL et al., New Engl J Med 349: 941-948 (2003)）。さらに、ラット空腸の電位固定粘膜調製物を通じる電流の減少が証明するように、残基５〜２４が長さ５〜８炭素のメチレン鎖で置き換えられたＰＹＹのＣｙｓ２−（Ｄ）Ｃｙｓ２７環化バージョンが腸ＰＹＹ受容体の活性化を示した（Krstenansky, et al. in Peptides, Proceedings of the Twelfth American Peptide Symposium. J. Smith and J. Rivier Editors, ESCOM. Leiden Page 136-137）。
【０００８】
さらに、最近のデータは、Ｒｏｕｘ−ｅｎＹ胃バイパス術患者が、早期の血糖コントロール及び長期の体重維持の原因の一部となり得るＰＹＹレベルの早期かつ過剰な増加を伴うことを示しており、このことは代謝疾患の病因におけるこのペプチドの重要性を証明している。ＰＹＹの他の公知の作用は、食後血糖コントロール改善の原因となる胃内容排出減少及び胃腸管通過遅延を含む。ＨｂＡ１Ｃ及びフルクトサミンなどの高血糖の指標は、２型糖尿病の動物モデルにおけるＰＹＹ３−３６の末梢投与後の用量依存的減少を示す。したがって、これらの結果は、ＰＹＹ３−３６又は薬学的に関連性のあるアゴニストが血糖及び体重のコントロールに対する長期の治療アプローチを提示し得ることを示している（Korner et al., J Clin Endocrinol Metabol 90: 359-365 (2005); Chan JL et al., Obesity 14: 194-198 (2006); Stratis C et al., Obes Surg 16: 752-758 (2006); Borg CM et al., Br J Surg 93: 210-215 (2006); and Pittner RA et al., Int J Obes 28: 963-971 (2004)）。
【０００９】
しかし、同等以上のＹ１、Ｙ４及びＹ５受容体に対する効力及び選択性、薬物動態特性、ならびに薬理特性を有しながらより小さい分子量を有するＰＹＹの新規改変類似体の必要性が存在する。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の化合物は代謝疾患及び代謝障害の処置に有用であることが好ましい。そのような代謝疾患及び代謝障害は、例えば肥満、糖尿病、好ましくは２型糖尿病、メタボリックシンドローム（シンドロームＸとしても知られる）、インスリン抵抗性、脂質異常症、空腹時血中ブドウ糖不良及び耐糖能障害を含む。
【００１１】
Ｘが、（４−アミノメチル−ビフェニル−３−イル）−酢酸（Ｃｂａ）、（５−ピペラジン−１−イル−インドール−１−イル）−酢酸（Ｃｉｐ）、３−（４−オキソ−６−ピペラジン−１−イル−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−プロピオン酸（ＨｏｍＰｑａ）、（６−［１，４］ジアゼパン−１−イル−４−オキソ−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−酢酸（Ｄｑａ）、（６−オキソ−２−ピペラジン−１−イル−１，６−ジヒドロプリン−７−イル）−酢酸（Ｐｄｐ）、（２−ピペラジン−１−イル−プリン−７−イル）−酢酸（Ｐｐａ）、（６−アミノ−２−ピペラジン−１−イル−９Ｈ−プリン−８−イル）−酢酸（Ａｐｐａ）、（（１Ｒ，４Ｓ）−６−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−イル−４−オキソ−４Ｈ−キナゾリン）−酢酸（Ｂｑａ）又は（１−オキソ−７−ピペラジン−１−イル−１Ｈ−イソキノリン−２−イル）−酢酸（Ｐｉｐａ）であり；
Ｙがアシル部分である、
式（Ｉ）で示される神経ペプチド２受容体アゴニストが好ましい。
【００１２】
式（ＩＩ）：
Ｙ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−（ＮＭｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２ （ＩＩ）
［式中、
Ｘは、（４−アミノメチル−ビフェニル−３−イル）−酢酸（Ｃｂａ）、（５−ピペラジン−１−イル−インドール−１−イル）−酢酸（Ｃｉｐ）、３−（４−オキソ−６−ピペラジン−１−イル−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−プロピオン酸（ＨｏｍＰｑａ）、（６−［１，４］ジアゼパン−１−イル−４−オキソ−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−酢酸（Ｄｑａ）、（６−オキソ−２−ピペラジン−１−イル−１，６−ジヒドロプリン−７−イル）−酢酸（Ｐｄｐ）、（２−ピペラジン−１−イル−プリン−７−イル）−酢酸（Ｐｐａ）、（６−アミノ−２−ピペラジン−１−イル−９Ｈ−プリン−８−イル）−酢酸（Ａｐｐａ）、（（１Ｒ，４Ｓ）−６−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−イル−４−オキソ−４Ｈ−キナゾリン）−酢酸（Ｂｑａ）又は（１−オキソ−７−ピペラジン−１−イル−１Ｈ−イソキノリン−２−イル）−酢酸（Ｐｉｐａ）であり；
Ｙはアシル部分である］を有する神経ペプチド２受容体アゴニスト及びその薬学的に許容される塩がさらに好ましい。
【００１３】
以下から選択される請求項１記載の神経ペプチド２受容体アゴニストが特に好ましい：
【００１４】
【表１】
【００１５】
本発明はまた、治療有効量の上記定義の神経ペプチド２受容体アゴニスト又はその塩と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
【００１６】
本発明の化合物は、例えばＰＹＹ３−３６の短縮型であることが理由で有利である。より短いペプチドは、例えば化合物のより容易な合成及び精製を促進するだけでなく、製造手順を改善しかつ製造支出を減少させる。さらに、本発明の化合物はＹ２受容体と相互作用しかつＮＰＹ Ｙ１、Ｙ４及びＹ５などの相同受容体とは相互作用しないことが好ましい。それにより、望まれないアゴニスト又はアンタゴニストの副反応が最小化される。
【００１７】
本発明が本明細書に記載の本発明の特定の態様に限定されず、特定の態様の変更を行うことができ、それらが依然として添付の特許請求の範囲の範囲内にあるということを理解すべきである。使用される用語は特定の態様を記述するためのものであり、限定的であることを意図していないということも理解すべきである。その代わり、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲により確立される。
【００１８】
本明細書に記載のものと類似又は同等の任意の方法、装置及び材料が本発明の実施又は試験において使用可能であるが、好ましい方法、装置及び材料をここに記載する。
【００１９】
本明細書で言及するすべてのペプチド配列は通常の慣行に従って記述され、したがって特記なき限り、Ｎ末端アミノ酸は左側にあり、Ｃ末端アミノ酸は右側にある。２つのアミノ酸残基間の短い線はペプチド結合を示す。アミノ酸が異性体形態を有する場合、別途明示されない限り表示されるのはアミノ酸のＬ形である。本発明を記述する上での便宜のために、様々なアミノ酸について慣行的及び非慣行的略語を使用する。これらの略語は当業者に公知であるが、明確にするために以下に列挙する：
Ａｓｐ＝Ｄ＝アスパラギン酸；Ａｌａ＝Ａ＝アラニン；Ａｒｇ＝Ｒ＝アルギニン；Ａｓｎ＝Ｎ＝アスパラギン；Ｇｌｙ＝Ｇ＝グリシン；Ｇｌｕ＝Ｅ＝グルタミン酸；Ｇｌｎ＝Ｑ＝グルタミン；Ｈｉｓ＝Ｈ＝ヒスチジン；Ｉｌｅ＝Ｉ＝イソロイシン；Ｌｅｕ＝Ｌ＝ロイシン；Ｌｙｓ＝Ｋ＝リジン；Ｍｅｔ＝Ｍ＝メチオニン；Ｐｈｅ＝Ｆ＝フェニルアラニン；Ｐｒｏ＝Ｐ＝プロリン；Ｓｅｒ＝Ｓ＝セリン；Ｔｈｒ＝Ｔ＝スレオニン；Ｔｒｐ＝Ｗ＝トリプトファン；Ｔｙｒ＝Ｙ＝チロシン；Ｃｙｓ＝Ｃ＝システイン；及びＶａｌ＝Ｖ＝バリン。
【００２０】
修飾Ｔｙｒとは、例えばメチル−チロシン、３−ヨード−チロシン、３，５−ジフルオロ−チロシン、２，６−ジ−フルオロチロシン及び２，６−ジメチル−チロシンなどのチロシンに対する任意の修飾のことである。
【００２１】
修飾Ｐｈｅとは、例えば４−メトキシ−フェニルアラニン、４−アミノ−フェニルアラニン、４−フルオロ−フェニルアラニン、４−ヒドロキシメチル−フェニルアラニン、４−トリフルオロメチル−フェニルアラニン、３−フルオロ−フェニルアラニン、２，３，４，５−ペンタフルオロ−フェニルアラニン及び３，４−ジクロロフェニルアラニンなどのフェニルアラニンに対する任意の修飾のことである。
【００２２】
やはり便宜のために、本発明で使用する部分、試薬などを表すために以下の略語又は記号を使用する：
Ｐｑａは、（４−オキソ−６−ピペラジン−１−イル−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−酢酸であり；
Ｃｂａは、（４−アミノメチル−ビフェニル−３−イル）−酢酸であり；
Ｃｉｐは、（５−ピペラジン−１−イル−インドール−１−イル）−酢酸であり；
ＨｏｍＰｑａは、３−ヒドロキシ−２−（４−オキソ−６−ピペラジン−１−イル−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−プロピオン酸であり；
Ｄｑａは、（６−［１，４］ジアゼパン−１−イル−４−オキソ−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−酢酸であり；
Ｐｄｐは、（６−オキソ−２−ピペラジン−１−イル−１，６−ジヒドロプリン−７−イル）−酢酸であり；
Ｐｐａは、（２−ピペラジン−１−イル−プリン−７−イル）−酢酸であり；
Ａｐｐａは、（６−アミノ−２−ピペラジン−１−イル−９Ｈ−プリン−８−イル）−酢酸であり；
Ｂｑａは、（（１Ｒ，４Ｓ）−６−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−イル−４−オキソ−４Ｈ−キナゾリン）−酢酸であり；
Ｐｉｐａは、（１−オキソ−７−ピペラジン−１−イル−１Ｈ−イソキノリン−２−イル）−酢酸であり；
Ｆｍｏｃは、９−フルオレニルメチルオキシカルボニルであり；
Ｍｔｔは、４−メチルトリチルであり；
２Ｐｉｐは、２−フェニルイソプロピルエステルであり；
Ｐｍｃは、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニルであり；
ＣＨ２Ｃｌ２は、塩化メチレンであり；
Ａｃ２Ｏは、無水酢酸であり；
ＣＨ３ＣＮは、アセトニトリルであり；
ＤＭＡｃは、ジメチルアセトアミドであり；
ＤＭＦは、ジメチルホルムアミドであり；
ＤＩＰＥＡは、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンであり；
ＴＦＡは、トリフルオロ酢酸であり；
ｉＰｒ３ＳｉＨは、トリイソプロピルシランであり；
ＨＯＢＴは、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールであり；
ＤＩＣは、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドであり；
ＢＯＰは、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス−（ジメチルアミノ）ホスホニウム−ヘキサフルオロホスフェートであり；
ＨＢＴＵは、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム−ヘキサフルオロホスフェートであり；
ＮＭＰは、１−メチル ２−ピロリジノンであり；
Ｔｍｏｂは、２，４，６−トリメトキシベンジルであり；
Ｄｏｄは、４，４−ジメトキシジチル、（ビス−（４−メトキシフェニル）−メチル）であり、
Ｔｒｔは、トリチルであり；
Ｍｔｓは、メシチレン−２−スルホニルであり；
ＦＡＢ−ＭＳは、高速原子衝撃イオン化質量分析であり；
ＥＳ−ＭＳは、エレクトロスプレーイオン化質量分析である。
【００２３】
本明細書で使用する「アシル」という用語は、カルボニル基を経由して結合している場合により置換されているアルキル基、シクロアルキル基、複素環基、アリール基又はヘテロアリール基を意味し、アセチル、プロピオニル、ベンゾイル、３−ピリジニルカルボニル、２−モルホリノカルボニル、４−ヒドロキシブタノイル、４−フルオロベンゾイル、２−ナフトイル、２−フェニルアセチル、２−メトキシアセチルなどの基を含む。
【００２４】
本明細書で使用する、単独又は他の基との組み合わせでの「アルキル」という用語は、１〜２０個の炭素原子、好ましくは１〜１６個の炭素原子、より好ましくは１〜１０個の炭素原子の、分岐鎖又は直鎖の、一価の飽和脂肪族炭化水素基を意味する。
【００２５】
「シクロアルキル」という用語は、３〜１０個、好ましくは３〜６個の炭素原子の一価の単炭素環式又は多炭素環式基を意味する。この用語はシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、ボルニル、アダマンチルなどの基によりさらに例示される。好ましい態様では、「シクロアルキル」部分は１個、２個、３個又は４個の置換基で置換されていてもよく、特記なき場合は前記置換基がさらに置換されていることはないと理解される。シクロアルキル部分の例は場合により置換されているシクロプロピル、場合により置換されているシクロブチル、場合により置換されているシクロペンチル、場合により置換されているシクロペンテニル、場合により置換されているシクロヘキシル、場合により置換されているシクロヘキシレン、場合により置換されているシクロヘプチルなど、又は本明細書で具体的に例示されているものを含むがそれに限定されない。
【００２６】
「ヘテロシクロアルキル」という用語は、炭素環原子のうち１個、２個又は３個がＮ、Ｏ又はＳなどのヘテロ原子で置き換えられている単環式又は多環式アルキル環を意味する。ヘテロシクロアルキル基の例はモルホリニル、チオモルホリニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロリジニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル、１，３−ジオキサニルなどを含むがそれに限定されない。ヘテロシクロアルキル基は非置換でも置換でもよく、結合は炭素骨格を通じてでも、適切な場合はそのヘテロ原子を通じてでもよく、前記置換基がさらに置換されていることはないと理解される。
【００２７】
単独又は他の基との組み合わせでの「低級アルキル」という用語は、１〜９個の炭素原子、好ましくは１〜６個の炭素原子の、分岐鎖又は直鎖のアルキル基を意味する。この用語はメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、３−メチルブチル、ｎ−ヘキシル、２−エチルブチルなどの基でさらに例示される。
【００２８】
「アリール」という用語は、少なくとも１個の芳香環を有する６〜１２個の炭素原子の芳香族単炭素環式又は多炭素環式基を意味する。そのような基の例はフェニル、ナフチル、１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン、１，２−ジヒドロナフタレン、インダニル、１Ｈ−インデニルなどを含むがそれに限定されない。
【００２９】
アルキル基、低級アルキル基及びアリール基は置換でも非置換でもよい。置換の場合は、例えば１〜４個の置換基が一般に存在するものであり、特記なき場合は前記置換基がさらに置換されていることはないと理解される。これらの置換基は、それらが接続しているアルキル基、低級アルキル基又はアリール基と共に環を形成してもよい。
【００３０】
「ヘテロアリール」という用語は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１個、２個又は３個の環ヘテロ原子を含有し、残りの環原子がＣである、少なくとも１個の芳香環を有する、５〜１２個の原子の芳香族単環式又は多環式基を意味する。ヘテロアリール基の１個又は２個の環炭素原子をカルボニル基で置き換えてもよい。
【００３１】
先に記載のヘテロアリール基は１個、２個又は３個の置換基で独立して置換されていてもよく、特記なき場合は前記置換基がさらに置換されていることはないと理解される。
【００３２】
式Ｉで示される化合物は、１個又は複数の不斉炭素原子を有することができ、光学的に純粋な鏡像異性体、例えばラセミ体などの鏡像異性体の混合物、光学的に純粋なジアステレオ異性体、ジアステレオ異性体の混合物、ジアステレオ異性体のラセミ体、又はジアステレオ異性体のラセミ体の混合物の形態で存在することができる。光学的に活性な形態は、例えば、ラセミ体の分割、不斉合成、又は不斉クロマトグラフィー（キラル吸着剤もしくは溶離液を用いたクロマトグラフィー）により得ることができる。本発明は、これらの形態のすべてを包含する。
【００３３】
代表的な本化合物は、アミノ酸間のペプチド結合の形成用の任意の公知の慣行的手順によって容易に合成することができる。そのような慣行的手順は、そのカルボキシル基及び他の反応性基が保護された、アミノ酸の遊離αアミノ基又はその残基と、そのアミノ基又は他の反応性基が保護された、別のアミノ酸の遊離一級カルボキシル基又はその残基との間の縮合を可能にする、任意の溶液相手順を例えば含む。
【００３４】
本発明の新規化合物を合成するためのそのような慣行的手順は、任意の固相ペプチド合成法を例えば含む。そのような方法では、固相法の一般的原理に従って成長ペプチド鎖に所望のアミノ酸残基を１つ毎に順次組み入れることで、新規化合物の合成を行うことができる。そのような方法は、参照により本明細書に組み入れられるMerrifield, R. B., J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963); Barany et al., The Peptides, Analysis, Synthesis and Biology, Vol. 2, Gross, E. and Meienhofer, J., Eds. Academic Press 1-284 (1980)に例えば開示されている。
【００３５】
ペプチドの化学合成に共通しているのは、好適な保護基による様々なアミノ酸部分の反応性側鎖基の保護であり、これにより、保護基が最終的に除去されるまで、化学反応がその部位で発生することを防ぐ。通常やはり共通しているのは、アミノ酸又は断片上のαアミノ基の、その実体がカルボキシル基で反応している間の保護、それに続く、後続の反応がその部位で行われるようにするためのαアミノ保護基の選択的除去である。固相合成法に関して具体的な保護基が開示されているが、溶液層合成において各アミノ酸用に慣行的に使用される保護基で各アミノ酸を保護することができるということに留意すべきである。
【００３６】
アリルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ならびにｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、ｐ−ビフェニル−イソプロピルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）及びｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル（Ｍｏｚ）などの置換ベンジルオキシカルボニルなどの芳香族ウレタン型保護基；ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ジイソプロピルメチルオキシカルボニル及びイソプロピルオキシカルボニルなどの脂肪族ウレタン型保護基から選択される好適な保護基でαアミノ基を保護することができる。ここで、Ｆｍｏｃがαアミノ保護に最も好ましい。
【００３７】
グアニジノ基は、ニトロ、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）、（Ｚ）、ペンタメチルクロマンスルホニル（Ｐｍｃ）、４−メトキシ−２，３，６，−トリメチルベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）などの好適な保護基で保護することができ、（Ｐｍｃ）及び（Ｍｔｒ）がアルギニン（Ａｒｇ）について最も好ましい。
【００３８】
εアミノ基は、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−Ｃｌ−Ｚ）、２−ブロモベンジルオキシカルボニル（２−Ｂｒ−Ｚ）及びｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）などの好適な保護基で保護することができる。Ｂｏｃが（Ｌｙｓ）について最も好ましい。
【００３９】
ヒドロキシル基（ＯＨ）は、ベンジル（Ｂｚｌ）、２，６−ジクロロベンジル（２，６−ｄｉＣｌ−Ｂｚｌ）及びtert−ブチル（ｔ−Ｂｕ）などの好適な保護基で保護することができ、（ｔ−Ｂｕ）が（Ｔｙｒ）、（Ｓｅｒ）及び（Ｔｈｒ）について最も好ましい。
【００４０】
Ａｓｎ及びＧｌｎのβ及びγアミド基は、４−メチルトリチル（Ｍｔｔ）、２，４，６−トリメトキシベンジル（Ｔｍｏｂ）、４，４−ジメトキシジチルビス−（４−メトキシフェニル）−メチル（Ｄｏｄ）及びトリチル（Ｔｒｔ）などの好適な保護基で保護することができる。Ｔｒｔが（Ａｓｎ）及び（Ｇｌｎ）について最も好ましい。
【００４１】
インドール基はホルミル（Ｆｏｒ）、メシチル−２−スルホニル（Ｍｔｓ）及びｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）から選択される好適な保護基で保護することができる。Ｂｏｃが（Ｔｒｐ）について最も好ましい。
【００４２】
イミダゾール基はベンジル（Ｂｚｌ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）及びトリチル（Ｔｒｔ）から選択される好適な保護基で保護することができる。Ｔｒｔが（Ｈｉｓ）について最も好ましい。
【００４３】
アミノ酸Ｐｑａの合成は、J. Hutchinson et. al（J .Med. Chem. 1996, 39, 4583-4591）に記載されている。Ｆｍｏｃ−Ｐｑａ誘導体はＮｅｏＭＰＳ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サンジエゴ）から購入した。
【００４４】
｛４’−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−メチル］−ビフェニル−３−イル｝−酢酸（Ｆｍｏｃ−Ｃｂａ−ＯＨ）は、慣行的な手段で、例えば４−ブロモフェニル酢酸メチルエステルと４−ホルミルフェニルボロン酸との間の鈴木カップリング、続いて得られた４’−ホルミルビフェニル酢酸メチルエステルの還元的アミノ化を行ってアミノメチルビフェニル酢酸誘導体を得ることで調製することができる。典型的鈴木カップリングの一例はH. Heitsch, et al, Synthesis 1996, 1325に示されている。還元的アミノ化は、E. Baxter, et al. Organic Reactions 2002, 59, 1-714で概観されている標準的方法を経由して行うことができる。９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル誘導体としてのアミノ基のエステル加水分解及び保護は標準的な変換である。典型的手順は中間体の調製の説明において記載する。
【００４５】
すべての溶媒、すなわちイソプロパノール（ｉＰｒＯＨ）、塩化メチレン（ＣＨ２Ｃｌ２）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）をFisher又はBurdick & Jacksonから購入し、さらに処理せずに使用した。トリフルオロ酢酸をHalocarbon又はFlukaから購入し、さらに精製せずに使用した。
【００４６】
ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）をFluka又はAldrichから購入し、さらに精製せずに使用した。ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）、ジメチルスルフィド（ＤＭＳ）及び１，２−エタンジチオール（ＥＤＴ）をSigma Chemical Co.から購入し、さらに精製せずに使用した。保護アミノ酸は一般にＬ配置のものであり、Bachem又はNeosystemから商業的に得た。これらの試薬の純度を、使用前に薄層クロマトグラフィー、ＮＭＲ及び融点により確認した。ベンズヒドリルアミン樹脂（ＢＨＡ）は、Bachem又はAdvanced Chemtechから得たスチレン−１％ジビニルベンゼンの共重合体（１００〜２００又は２００〜４００メッシュ）であった。これらの樹脂の全窒素含有量は一般に０．３〜１．２meq/gであった。
【００４７】
好ましい態様では、Merrifield,（J. Amer. Chem. Soc., 85, 2149 (1963)）に一般に記載の方法により固相合成を用いてペプチドを調製したが、当業者に公知の他の同等の化学合成を先に言及したように使用する可能性がある。保護αアミノ酸を好適な樹脂にカップリングすることで、ペプチドのＣ末端から固相合成を開始する。そのような出発原料は、αアミノ保護アミノ酸をエステル結合によりｐ−ベンジルオキシベンジルアルコール（Ｗａｎｇ）樹脂に結合させるか、又はｐ−（（Ｒ，Ｓ）−α−（１−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）−メトキシホルムアミド）−２，４−ジメチルオキシベンジル）−フェノキシ酢酸（Ｒｉｎｋリンカー）などのＦｍｏｃリンカーとベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂との間のアミド結合により調製することができる。ヒドロキシメチル樹脂の調製は当技術分野で周知である。Ｆｍｏｃリンカー−ＢＨＡ樹脂支持体は市販されており、合成される所望のペプチドがＣ末端で非置換アミドを有する場合に一般に使用される。
【００４８】
典型的には、アミノ酸又は模倣体のＦｍｏｃリンカー−ＢＨＡ樹脂上に対するカップリングを、アミノ酸又は模倣体のＦｍｏｃ保護形態を用い、アミノ酸２〜５当量及び好適なカップリング試薬によって行う。カップリング後、樹脂を洗浄し、減圧乾燥させることができる。樹脂上に対するアミノ酸の結合は、Ｆｍｏｃ−アミノ酸樹脂のアリコートのアミノ酸分析、又はＵＶ分析によるＦｍｏｃ基の決定により決定することができる。樹脂を塩化メチレン中の無水酢酸及びジイソプロピルエチルアミンと反応させることで任意の未反応アミノ基を封止することができる。
【００４９】
αアミノＦｍｏｃ保護基を塩基性条件下で除去する。ＤＭＦ中ピペリジン、ピペラジン又はモルホリン（２０〜４０％ 体積／体積）をこの目的のために使用することができる。ＤＭＦ中４０％ピペリジンを使用することが好ましい。
【００５０】
αアミノ保護基の除去後、引き続き保護アミノ酸を所望の順序で段階的にカップリングして中間体の保護ペプチド樹脂を得る。ペプチドの固相合成におけるアミノ酸のカップリングに使用する活性化試薬は当技術分野で周知である。例えば、そのような合成に適切な試薬はベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリ−（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、ブロモ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｒｏＰ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）及びジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）である。ＨＢＴＵ及びＤＩＣが好ましい。他の活性化剤はBarany and Merrifield（The Peptides, Vol. 2, J. Meienhofer, ed., Academic Press, 1979, pp 1-284所収）に記載されており、これらを使用することができる。１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）及び３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＢＴ）などの各種試薬をカップリング混合物に加えることで、合成サイクルを最適化することができる。ここでＨＯＢＴが好ましい。
【００５１】
Ｎ末端アセチル誘導体の調製のために、５％ ＤＩＥＡを有するＤＭＦ中２０％無水酢酸で樹脂結合ペプチドを処理することでアセチル化を行った。他のＮ末端アシル化について、ＤＩＣ／ＨＯＢｔによりインサイチューで３０分間活性化した対応するカルボン酸を使用してアシル化を行った。
【００５２】
典型的合成サイクルのプロトコールは以下の通りである。
プロトコール１
【００５３】
【表２】
【００５４】
すべての洗浄及びカップリング用の溶媒を１０〜２０ml/g樹脂の量になるように測量した。合成を通じてのカップリング反応をKaiserニンヒドリン試験でモニタリングして、完了の程度を決定した（Kaiser et at. Anal.Biochem.34, 595-598 (1970)）。緩徐な反応動態がＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）について及び立体障害性の酸による二級アミンに対するカップリングについて観察された。任意の不完全なカップリング反応は、新たに調製した活性化アミノ酸と再カップリングしたか、又は先に記載のようにペプチド樹脂を無水酢酸で処理することで封止した。完全に構築したペプチド樹脂を数時間減圧乾燥させた。
【００５５】
大部分の化合物について、ブロッキング基を除去し、ペプチドを樹脂から切断した。例えば、ペプチド樹脂を樹脂１グラム当たりエタンジチオール１００μL、ジメチルスルフィド１００μl、アニソール３００μL及びトリフルオロ酢酸９．５mLにて室温で１８０分間処理した。あるいは、ペプチド樹脂を樹脂１グラム当たりトリイソプロピルシラン１．０mL及びトリフルオロ酢酸９．５mLにて室温で１８０分間処理した。樹脂を濾去し、濾液を冷却エチルエーテル中で析出させた。析出物を遠心分離し、エーテル層をデカントした。残渣を２又は３体積のＥｔ２Ｏで洗浄し、再遠心分離した。粗生成物を減圧乾燥させた。
【００５６】
粗ペプチドの精製を、Shimadzu ＬＣ−８Ａシステム上で、逆相Ｃ−１８カラム（５０ｘ２５０mm、３００Å、１０〜１５μm）上の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により好ましく行った。ペプチドをカラムに対して最小量の０．１ ＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ又はＣＨ３ＣＨ／Ｈ２Ｏ中に注入した。グラジエント溶出を２％ Ｂ緩衝液で一般に開始し、２％〜７０％のＢで７０分間にかけて（緩衝液Ａ：０．１％ ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、緩衝液Ｂ：０．１％ ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）、５０ml／分の流量で行った。ＵＶ検出を２２０／２８０nmで行った。生成物を含有する画分を分離し、その純度をShimadzu ＬＣ−１０ＡＴ分析システム上で逆相Ａｃｅ Ｃ１８カラム（４．６ｘ５０mm）を用いて流量２ml／分、１０分間にわたるグラジエント（２〜７０％）（緩衝液Ａ：０．１％ ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、緩衝液Ｂ：０．１％ ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）で判定した。高純度を有すると判定された画分をプールし、凍結乾燥させた。
【００５７】
先に述べたように、最終生成物の純度を分析用ＨＰＬＣにより逆相カラム上で点検した。全生成物の純度は約９５〜９９％と判定された。また、すべての最終生成物を高速原子衝撃質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）又はエレクトロスプレー質量分析（ＥＳ−ＭＳ）に供した。すべての生成物は許容される範囲内の予想される親Ｍ＋Ｈイオンを生成した。
【００５８】
本発明の化合物を薬学的に許容される塩の形態で与えることができる。好適な塩の例は、薬学的に許容される有機酸、例えば酢酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸又はパモ酸、及びタンニン酸又はカルボキシメチルセルロースなどのポリマー酸と形成されるもの、ならびにハロゲン化水素酸（例えば塩酸）、硫酸又はリン酸などの無機酸と形成される塩である。当業者に公知である薬学的に許容される塩を得るための任意の手順を使用することができる。
【００５９】
本発明の方法の実施において、有効量の本発明のペプチドのいずれか１つもしくは本発明のペプチドのいずれかの組み合わせ、又はその薬学的に許容される塩を、単独又は組み合わせでの当技術分野で公知の通常かつ許容される方法を経由して投与する。投与は、例えば１日１回、３日に１回又は週１回であり得る。したがって、化合物又は組成物を、経口的に（例えば頬側口腔）、舌下に、非経口的に（例えば筋肉内、静脈内もしくは皮下に）、直腸に（例えば坐薬もしくは洗液で）、経皮的に（例えば皮膚電気穿孔）、又は吸入により（例えばエアロゾルにより）、錠剤及び懸濁液剤を含む固体、液体又は気体剤形の形態で投与することができる。投与は、単一単位剤形で連続療法により、又は単一用量療法で自由に、行うことができる。また、治療用組成物は、パモ酸などの親油性塩との組み合わせでの油乳濁液もしくは分散液の形態、又は皮下もしくは筋肉内投与用の生分解性持続放出組成物の形態であり得る。
【００６０】
したがって、本発明の方法は、症状の軽減が特に必要であるかおそらくは緊急である場合に実施される。あるいは、本発明の方法は連続治療又は予防治療として有効に実施される。
【００６１】
本明細書の組成物の調製用の有用な薬学的担体は、固体、液体又は気体であり得るものであり、したがって組成物は錠剤、丸剤、カプセル剤、坐薬、散剤、腸溶コーティング製剤又は他の保護製剤（例えばイオン交換樹脂上に結合もしくは脂質−タンパク質ベシクル中に包装）、持続放出製剤、溶液剤、懸濁液剤、エリキシル剤、エアロゾル剤などの形態を取り得る。担体は石油、動物、植物又は合成起源のものを含む各種の油、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などから選択することができる。水、食塩水、ブドウ糖水溶液及びグリコールが、特に（血液と等張性の場合）注射液剤について好ましい液体担体である。例えば、静脈内投与用製剤は、固体有効成分を水に溶解させて水溶液を生成し、溶液を滅菌することで調製される、有効成分の滅菌水溶液を含む。好適な薬学的賦形剤はデンプン、セルロース、タルク、グルコース、乳糖、タルク、ゼラチン、麦芽、イネ、小麦粉、チョーク、シリカ、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどを含む。組成物を防腐剤、安定剤、湿潤剤又は乳化剤、浸透圧を調整するための塩、緩衝剤などの慣行的な薬学的添加剤に供することができる。好適な薬学的担体及びその調合はE. W. MartinのRemington's Pharmaceutical Sciencesに記載されている。いずれにせよ、そのような組成物は、有効量の活性化合物を、レシピエントに対する適切な投与のために適切な剤形を調製するために好適な担体と共に含有する。
【００６２】
本発明の化合物の用量は、例えば投与様式、対象の年齢及び体重、ならびに処置される対象の状態などのいくつかの要因に依存するものであり、担当の医師又は獣医師により最終的に決定される。担当の医師又は獣医師により決定される活性化合物のそのような量を本明細書及び特許請求の範囲では「有効量」と呼ぶ。例えば、鼻腔内投与の用量は、典型的には約０．００１〜約０．１mg/kg体重の範囲である。ヒトでは、ペプチド含有量に基づく好ましい皮下用量は約０．００１mg〜約１００mg、好ましくは約０．１mg〜約１５mgである。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
ここで限定を行う性質を有さない以下の実施例により本発明を説明する。
【００６４】
実施例
中間体の調製
【００６５】
中間体１の調製
実施例６で使用する中間体（４−（１−カルボキシメチル−１Ｈ−インドール−５−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル（Ｆｍｏｃ−Ｃｉｐ−ＯＨ）を以下のように調製した。
【００６６】
【化１】
【００６７】
工程１：
１−（３−メチル−４−ニトロ−フェニル）−ピペラジンの調製
【００６８】
【化２】
【００６９】
ピペラジン（８６．１４g）及びジメチルホルムアミド（１５０mL）を１１０℃で攪拌して溶解させた。この時点でジメチルホルムアミド１０mLに溶解した４−フルオロ−２−メチル−１−ニトロ−ベンゼン（１００mL）の溶液を３分かけて加え、次に１００℃で３０分間攪拌した。この時点で砕氷及び水（７００mL）を反応混合物に加え、得られた黄色固体を濾去した。濾液を水３００mLで洗浄し、次に真空オーブン中で乾燥させた。このようにして固体１９．４０gを得た。Ｈ１−ＮＭＲ分光測定は１−（３−メチル−４−ニトロ−フェニル）−ピペラジンと一致したスペクトルを示した。
【００７０】
工程２：
４−（３−メチル−４−ニトロ−フェニル）−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルの調製
【００７１】
【化３】
【００７２】
１−（３−メチル−４−ニトロ−フェニル）−ピペラジン（１９．４０g）及び４−ジメチルアミノピリジン（０．２０グラム）をテトラヒドロフラン２００mL中にて室温で攪拌して溶解させた。次に炭酸ジ−tert−ブチルエステル（Ｂｏｃ）２Ｏ ９６．４５gを１回で加えた。この混合物を室温で１時間攪拌した。この時点で反応混合物を蒸発乾固させ、得られた黄色固体を水４００mLに１５分間懸濁させた後、濾過し、固体を水で洗浄した。濾過後に残留する固体を減圧乾燥させて２７．９gを得た。Ｈ１−ＮＭＲ分光測定は４−（３−メチル−４−ニトロ−フェニル）−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルと一致したスペクトルを示した。
【００７３】
工程３：
４−［４−ニトロ−３−（（Ｅ）−２−ピロリジン−１−イル−ビニル）−フェニル］−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルの調製
【００７４】
【化４】
【００７５】
４−（３−メチル−４−ニトロ−フェニル）−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル（２７．９g）をＤＭＦ ５０mLに溶解させ、この溶液にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジメチルアセタール（ＤＭＦ−ＤＭＡ）を加え、次に混合物を１００℃にて１８時間加熱した。この時点で混合物を水で希釈し、水層を酢酸エチルで抽出した。有機層を水で４回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過した。濾液を減圧濃縮して赤色油状物を得た。この油状物をジエチルエーテル及びヘキサンの混合物で粉砕して所期の生成物３１．３１gを得た。Ｈ１−ＮＭＲ分光測定は４−［４−ニトロ−３−（（Ｅ）−２−ピロリジン−１−イル−ビニル）−フェニル］−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルと一致したスペクトルを示した。
【００７６】
工程４：
４−（１Ｈ−インドール−５−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルの調製
【００７７】
【化５】
【００７８】
４−［４−ニトロ−３−（（Ｅ）−２−ピロリジン−１−イル−ビニル）−フェニル］−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルを窒素雰囲気下、メタノール５０mL中にて室温で攪拌した。この混合物にラネーニッケル１．５mL、続いてヒドラジン２．３５gを加えた。この混合物を１５分間攪拌した。この時点でヒドラジンをさらに１．１７g加え、混合物を終夜攪拌した。次に、反応混合物をセライト濾過し、濾液を減圧濃縮した。残渣をジエチルエーテル及び水の混合物中に分配した。有機層を分離し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、等量のヘキサンで希釈し、１：１（体積／体積）ジエチルエーテル／ヘキサンで溶出するシリカゲルプラグを通じて濾過した。濾液の減圧濃縮により得た固体をジエチルエーテル／ヘキサンの混合物で粉砕した。これによりオフホワイト固体３．３３gを得た。Ｈ１−ＮＭＲ分光測定は４−（１Ｈ−インドール−５−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルと一致したスペクトルを示した。
【００７９】
工程５：
４−（１−tert−ブトキシカルボニルメチル−１Ｈ−インドール−５−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルの調製
【００８０】
【化６】
【００８１】
４−（１Ｈ−インドール−５−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル（８．５０g）をＤＭＦ ７０mL中で攪拌し、氷／水浴で冷却した。この混合物に水素化ナトリウム（鉱油中６０％懸濁液１．３５g）を少しずつ加えた。添加が完了した後、混合物を０℃で３０分間攪拌し、その後ブロモ酢酸tert−ブチルエステル７．１５gを加えた。反応混合物を２時間攪拌しながら室温に到達させた。この時点でブラインを混合物に加え、酢酸エチルを有機可溶性成分の抽出に使用した。有機層を水で４回洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過した。濾液を減圧濃縮して得た帯赤色油状物をヘキサン７０mlに溶解させた。３日間の静置により析出物を形成した。濾過及び析出物のペンタンによる洗浄後、固体を乾燥させた。このようにして所望の生成物８．８５gを得た。Ｈ１−ＮＭＲ分光測定は４−（１−tert−ブトキシカルボニルメチル−１Ｈ−インドール−５−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルと一致したスペクトルを示した。
【００８２】
工程６：
（５−ピペラジン−１−イル−インドール−１−イル）−酢酸の調製
【００８３】
【化７】
【００８４】
４−（１−tert−ブトキシカルボニルメチル−１Ｈ−インドール−５−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル（８．８０g）をＴＦＡ ６０mLの塩化メチレン１２０mL中混合物により室温で終夜処理した。この時点で溶媒を減圧除去した。これにより淡黄色残渣１１．２６gを得た。この残渣をさらに精製せずに次の工程で使用した。
【００８５】
工程７：
４−（１−カルボキシメチル−１Ｈ−インドール−５−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステルの調製
【００８６】
【化８】
【００８７】
前回の工程で得た残渣の一部に炭酸カリウム６．６５gならびにジオキサン及び水各２０mLを加えた。この混合物にクロロギ酸９−フルオレニルメチルエステル（２．４９g）を少しずつ加えた。次にこの混合物を１時間攪拌した後、水で希釈した。酢酸を使用して反応混合物を酸性化した。次に混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を減圧濃縮した。酢酸エチル除去により残留した残渣を、酢酸エチル、続いて塩化メチレン中１０％メタノール（体積／体積）で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーを通じて濾過した。次に、合わせた画分を、炭酸カリウム５gを含有する水３００mLで処理し、この混合物をジエチルエーテルで２回抽出した。エーテル層を廃棄し、水層を酢酸で酸性化した。これにより形成された白色固体を濾取した。固体を水で洗浄し、真空オーブン中にて五酸化リンで乾燥させた。このようにして生成物１．７１gを得た。Ｈ１−ＮＭＲ質量分析技術は４−（１−カルボキシメチル−１Ｈ−インドール−５−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステルと一致したスペクトルを示した。
【００８８】
中間体２の調製
実施例７で使用する中間体４−［３−（１−カルボキシ−２−ヒドロキシ−エチル）−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル］−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル（Ｆｍｏｃ−ＨｍｏＰｑａ−ＯＨ）を以下のように調製した。
【００８９】
【化９】
【００９０】
工程１：
２−ニトロ−５−ピペラジン−１−イル−安息香酸の調製
【００９１】
【化１０】
【００９２】
５−クロロ−２−ニトロ−安息香酸（４４g）及びピペリジン（９０g、４．８当量）を無溶媒で混合し、１１０℃で６時間加熱した後、室温で終夜攪拌した。この時点で混合物は固体化した。この固体に１０％ ＫＨＳＯ４（重量／体積、ｐＨ４〜５）水溶液を加え、混合物を超音波処理した。上清をデカントし、新たな１０％ ＫＨＳＯ４（重量／体積）水溶液を加えた。このようにして１０％ ＫＨＳＯ４（重量／体積）水溶液合計１．８リットルを加え、デカントした。室温で攪拌後、固体を濾過し、水ですすいだ。残留固体を真空オーブン中で乾燥させて黄橙色固体（５３．１g）を得た。この材料をさらに精製せずに次の工程に回した。
【００９３】
工程２：
４−（３−カルボキシ−４−ニトロ−フェニル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステルの調製
【００９４】
【化１１】
【００９５】
前回の反応からの固体（１５g）を１０％ ＮａＨＣＯ３（重量／体積）水溶液（１５０mL）及びジオキサン（１２０mL）に懸濁させた。反応混合物を０℃に冷却し、この懸濁液に４０分間かけてクロロギ酸９−フルオレニルメチルエステル（１４．７４g）のジオキサン（７０mL）溶液を加えた。反応混合物を室温に到達させ、終夜攪拌した。この時点で水及び酢酸エチルを反応混合物に加え、相を分離した。水相を分離した後、濃塩酸でｐＨ３〜４に酸性化した。析出した固体を濾過し、水で洗浄した後、真空オーブン中で乾燥させた。このようにして固体１７．８６gを得た。Ｈ１−ＮＭＲ分光測定は４−（３−カルボキシ−４−ニトロ−フェニル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステルと一致したスペクトルを示した。
【００９６】
工程３：
４−［３−（２−tert−ブトキシ−１−tert−ブトキシカルボニル−エチルカルバモイル）−４−ニトロ−フェニル］−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステルの調製
【００９７】
【化１２】
【００９８】
４−（３−カルボキシ−４−ニトロ−フェニル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル（１６．８g）及びＯ−tert−ブチル−Ｌ−セリンtert−ブチルエステル塩酸塩（９．０g）の塩化メチレン懸濁液にＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール３５．５mmolを加え、反応混合物を０℃に冷却した。この懸濁液にトリエチルアミン（１０．４mL）を加えた。これにより懸濁液は溶液になった。この時点で１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（７．５g）を加えた。反応混合物を０℃で１時間、次に室温で２日間攪拌した。この時点で塩化メチレンを減圧除去し、酢酸エチルを加えて固体を形成した。酢酸エチルを蒸発させ、塩化メチレンを加えた。この有機層を１０％ ＫＨＳＯ４（重量／体積）水溶液及びブラインで洗浄した後、５％ ＮａＨＣＯ３（重量／体積）水溶液で洗浄し、最後に再度ブラインで洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固させて固体を得た。この固体を熱酢酸エチル（約２L）で粉砕した。これは固体の大部分を溶解させた。得られた溶液を硫酸マグネシウムで再度乾燥させ、濾過し、蒸発乾固させて得た橙色油状物を室温への冷却により凝固した。この固体をジエチルエーテルにより室温で攪拌しながら粉砕した。濾過及びペンタンでの洗浄により固体２０gを得た。Ｈ１−ＮＭＲ分光測定は４−（３−カルボキシ−４−ニトロ−フェニル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イル−メチルエステルと一致したスペクトルを示した。
【００９９】
工程４：
３−tert−ブトキシ−２−（２−ニトロ−５−ピペラジン−１−イル−ベンゾイルアミノ）−プロピオン酸tert−ブチルエステルの調製
【０１００】
【化１３】
【０１０１】
ジメチルホルムアミド（１８０mL）を使用して４−（３−カルボキシ−４−ニトロ−フェニル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル（１７g）を溶解させ、この溶液にジエチルアミン（１８mL）を加えた。この混合物を室温で１５分間攪拌した。この時点で水及び酢酸エチルを加えた。有機相を分離し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧濃縮した。残渣をジエチルエーテルにより室温で粉砕し、固体を濾過し、ペンタンで洗浄した。これにより固体７．２９gを得た。Ｈ１−ＮＭＲ分光測定は３−tert−ブトキシ−２−（２−ニトロ−５−ピペラジン−１−イル−ベンゾイルアミノ）−プロピオン酸tert−ブチルエステルと一致したスペクトルを示した。
【０１０２】
工程５：
４−［３−（２−tert−ブトキシ−１−tert−ブトキシカルボニル−エチルカルバモイル）−４−ニトロ−フェニル］−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルの調製
【０１０３】
【化１４】
【０１０４】
３−tert−ブトキシ−２−（２−ニトロ−５−ピペラジン−１−イル−ベンゾイルアミノ）−プロピオン酸tert−ブチルエステル（８．５９g）をテトラヒドロフラン（１５０mL）に溶解させ、ジ−tert−ブチルジカルボナート（４．５６g）及び４−ジメチルアミノピリジン（２３０mg）を室温で加えた。反応混合物を室温で２時間攪拌した。この時点で溶媒を減圧除去し、残渣を水及び酢酸エチルに溶解させた。合わせた有機相を１０％ ＫＨＳＯ４（重量／体積）水溶液、水で洗浄した後、５％ ＮａＨＣＯ３（重量／体積）水溶液で洗浄し、最後にブラインで洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させて少量にした。ペンタンの添加により固体析出物を形成した。固体を濾過し、真空オーブン中で乾燥させた。このようにして固体９．６gを得た。Ｈ１−ＮＭＲ分光測定は４−［３−（２−tert−ブトキシ−１−tert−ブトキシカルボニル−エチルカルバモイル）−４−ニトロ−フェニル］−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルと一致したスペクトルを示した。
【０１０５】
工程６：
４−［４−アミノ−３−（２−tert−ブトキシ−１−tert−ブトキシカルボニル−エチルカルバモイル）−フェニル］−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルの調製
【０１０６】
【化１５】
【０１０７】
４−［３−（２−tert−ブトキシ−１−tert−ブトキシカルボニル−エチルカルバモイル）−４−ニトロ−フェニル］−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル（１０g）をメタノール２５０mLに溶解させた。この溶液を窒素雰囲気下、１０％（重量／重量）パラジウム炭素触媒１．２gで処理した。次に混合物を脱気した後、水素ガス１気圧下室温で約２．５時間攪拌した。この時点で反応混合物をセライト濾過し、大量のメタノールで洗浄した。濃色濾液を減圧濃縮し、残渣を五酸化リンでさらに乾燥させた。このようにして所期の生成物９．４９gを灰紫色固体として得た。Ｈ１−ＮＭＲ分光測定は４−［４−アミノ−３−（２−tert−ブトキシ−１−tert−ブトキシカルボニル−エチルカルバモイル）−フェニル］−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルと一致したスペクトルを示した。
【０１０８】
工程7：
４−［３−（２−tert−ブトキシ−１−tert−ブトキシカルボニル−エチル）−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル］−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルの調製
【０１０９】
【化１６】
【０１１０】
４−［４−アミノ−３−（２−tert−ブトキシ−１−tert−ブトキシカルボニル−エチルカルバモイル）−フェニル］−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル（８．７g）をホルムアミジン酢酸塩４．６３gに溶解させ、この混合物を１００〜１１５℃に４０分間加熱した。その時点で反応混合物を室温に冷却し、混合物を減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル及び水中に溶解させた。有機相を分離し、ブラインで洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過及び濾液の減圧濃縮により紫色残渣を得た。酢酸エチル：ヘキサンのステップグラジエント（２０％、３０％、３５％）で溶出するフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ２００g）によりこの残渣を精製した。適切な画分の回収及び溶媒の減圧除去の後、得られた残渣をペンタンで処理し、再度蒸発させた。真空オーブン中で残渣を乾燥させた後、淡色泡状物５．７gを得た。Ｈ１−ＮＭＲ分光測定は４−［３−（２−tert−ブトキシ−１−tert−ブトキシカルボニル−エチル）−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル］−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルと一致したスペクトルを示した。
【０１１１】
工程８：
３−ヒドロキシ−２−（４−オキソ−６−ピペラジン−１−イル−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−プロピオン酸の調製
【０１１２】
【化１７】
【０１１３】
４−［３−（２−tert−ブトキシ−１−tert−ブトキシカルボニル−エチル）−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル］−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル（４．７g）をアニソール（８mL）に溶解させ、氷水浴中で冷却した。トリフルオロ酢酸（８０mL）をゆっくりと加えた。混合物を氷水浴で冷却しながら５分間攪拌した後、室温で５時間攪拌し、この時間のあいだに反応混合物の色は橙色から赤色、紫色、濃青色に経時的に変化した。この時点で反応溶媒を減圧除去して青色油状物を得た。この油状物を乾燥ジエチルエーテルで粉砕し、蒸発乾固させた。残渣を乾燥ジエチルエーテルで再度粉砕し、この溶媒と共に終夜攪拌した。この時点で混合物を濾過し、得られた固体をジエチルエーテルで洗浄し、真空オーブン中で乾燥させて固体４．４gを得た。この固体をさらに精製せずに次の工程で使用した。Ｈ１−ＮＭＲ分光測定は３−ヒドロキシ−２−（４−オキソ−６−ピペラジン−１−イル−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−プロピオン酸と一致したスペクトルを示した。
【０１１４】
工程９：
４−［３−（１−カルボキシ−２−ヒドロキシ−エチル）−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル］−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステルの調製
【０１１５】
【化１８】
【０１１６】
３−ヒドロキシ−２−（４−オキソ−６−ピペラジン−１−イル−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−プロピオン酸（８．８５mmol）を１０％（重量／体積）炭酸水素ナトリウム水溶液に溶解させ、氷浴中に冷却した。ジオキサン３０mLに溶解した炭酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル２．９６gの溶液を０．５時間かけて滴下した。次に混合物を０℃で１時間、次に室温で４時間攪拌した。薄層クロマトグラフィーは反応が４時間の時点で完了したことを示したが、攪拌を終夜続けた。この時点で反応混合物を水で希釈し、酢酸エチルで２回抽出した。水相を０℃に冷却し、２N ＨＣｌ水溶液でｐＨ３に酸性化した。酸性化した水相を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過後、固体が析出し始めるまで濾液を減圧濃縮した。このようにして固体２．４gを得た。濾液のさらなる濃縮により第２の析出物（０．９６g）を得た。濾液にジエチルエーテルを加えることで第３の画分を得た（１．１５g）。合わせた材料の量は４．５３gであった。Ｈ１−ＮＭＲ分光測定は４−［３−（１−カルボキシ−２−ヒドロキシ−エチル）−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル］−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステルと一致したスペクトルを示した。
【０１１７】
中間体３の調製
実施例８で使用する中間体４−（３−カルボキシメチル−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル）−［１，４］ジアゼパン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル（Ｆｍｏｃ−Ｄｑａ−ＯＨ）を以下のように調製した。
【０１１８】
【化１９】
【０１１９】
工程１：
５−［１，４］ジアゼパン−１−イル−２−ニトロ−安息香酸の調製
【０１２０】
【化２０】
【０１２１】
５−クロロ−２−ニトロ−安息香酸（４２．３g）及びホモピペリジン（１００g、４．８当量）を無溶媒で混合し、１１０℃で加熱した。１０分後、混合物を溶融させて橙色の濃厚溶液を得た。４５分の全反応時間後、混合物は濃黒褐色になり、非常に濃厚になった。この時点で混合物を室温に冷却し、１０％ ＫＨＳＯ４（重量／体積）水溶液（ｐＨ４）で希釈した。この混合物を室温で約１時間攪拌した後、濾過した。固体をヘキサン及びジエチルエーテルの混合物、ジエチルエーテル、次にヘキサンですすいだ。次に固体を減圧乾燥させた。これにより濃褐色固体４０．８g（７３％）を得た。化合物をさらに分析又は精製せずに次の工程に回した。
【０１２２】
工程２：
４−（３−カルボキシ−４−ニトロ−フェニル）−［１，４］−ジアゼパン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルの調製
【０１２３】
【化２１】
【０１２４】
５−［１，４］ジアゼパン−１−イル−２−ニトロ−安息香酸（４０．８g）を１N ＮａＯＨ溶液６９３mLに溶解させて濃褐色溶液を得た。この溶液にジオキサン１０００mLを加えた。この混合物を０℃に１時間冷却した後、（Ｂｏｃ）２Ｏ（５３．８g、１．６当量）を加えた。反応混合物を終夜攪拌しながら室温にした。この時点で溶媒を減圧除去した。残渣を水２L中に溶解させた。未溶解の固体を濾去した。水性濾液を１０％ ＫＨＳＯ４水溶液でｐＨ３に酸性化した。析出した固体を濾去し、水ですすいだ。依然として湿潤しているが、固体を酢酸エチル（約３L）で粉砕した。上記酢酸エチル濾液を１０％ ＫＨＳＯ４及びブラインで洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過及び濃縮により析出物が形成され始めた。この析出物を濾過し、ジエチルエーテル及びペンタンですすいだ。このようにして淡褐色固体２４６g（４６％）を得た。
【０１２５】
工程３：
４−［３−（メトキシカルボニルメチル−アミノカルボニル）−４−ニトロ−フェニル］−［１，４］ジアゼパン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルの調製
【０１２６】
【化２２】
【０１２７】
４−（３−カルボキシ−４−ニトロ−フェニル）−［１，４］−ジアゼパン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル（３７．２７g、１０２mmol）及びグリシンメチルエステル塩酸塩１０７．１mmolを塩化メチレンに懸濁させた。この懸濁液にＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール１０２mmolを加え、混合物を氷水浴で冷却した。トリエチルアミン（２１４mmol）を加え、溶解させた。この時点で１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩１．１当量を加えた。この混合物を０℃で１時間、次に室温で３日間攪拌した。この時点で薄層クロマトグラフィーは４−［３−（カルボキシメチル−アミノカルボニル）−４−ニトロ−フェニル］−［１，４］ジアゼパン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルの存在を示した。グリシンメチルエステル塩酸塩及びＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールさらに各５．１mmolならびにトリエチルアミン１０．３mmolを加えた。反応混合物を室温でさらに２４時間攪拌した。この時点で反応混合物を塩化メチレンで希釈し、水、１０％（重量／体積）ＫＨＳＯ４溶液、再度水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、再度水、最後にブラインで洗浄した。塩化メチレン溶液を減圧下で濃縮乾固させて濃褐色油状物を得た。油状物をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製した。すなわち、カラムに塩化メチレン溶液を装入した後、酢酸エチル：ヘキサン（７：３）、最後に酢酸エチルで溶出した。このようにして、画分を回収し、減圧濃縮して４−［３−（メトキシカルボニルメチル−アミノカルボニル）−４−ニトロ−フェニル］−［１，４］ジアゼパン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル４２．０５g（９４．４％）を得た。
【０１２８】
工程４：
４−［４−アミノ−３−（メトキシカルボニルメチル−アミノカルボニル）−フェニル］−［１，４］ジアゼパン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルの調製
【０１２９】
【化２３】
【０１３０】
４−［３−（メトキシカルボニルメチル−アミノカルボニル）−４−ニトロ−フェニル］−［１，４］ジアゼパン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル（３８．４g）をメタノールに溶解させ、炭素上１０％（重量／重量）パラジウム触媒４gを水（１０００mL）と共に窒素雰囲気下で加えた。次に混合物を脱気した後、水素ガス１気圧下室温で約８時間攪拌した。この時点で反応混合物をセライト濾過し、大量のメタノールで洗浄した。濾液を減圧濃縮した。残渣にアセトニトリルを加えた後、溶媒を蒸発させた。４−［４−アミノ−３−（メトキシカルボニルメチル−アミノカルボニル）−フェニル］−［１，４］ジアゼパン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルを濃緑色油状物３４．０５g（９５％）として得た。
【０１３１】
工程５：
４−（３−メトキシカルボニルメチル−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル）−［１，４］ジアゼパン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルの調製
【０１３２】
【化２４】
【０１３３】
４−［４−アミノ−３−（メトキシカルボニルメチル−カルバモイル）−フェニル］−［１，４］ジアゼパン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル（３０．６g）をオルトギ酸トリエチル３７５mLにより１２５℃で１８時間攪拌しながら処理した。この時点で反応混合物を減圧濃縮し、得られた残渣を酢酸エチル及び水中に溶解した。有機相を１０％ＫＨＳＯ４水溶液で３回、水で１回、ブラインで１回洗浄した。次に有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過した。濾液を減圧濃縮した。ヘキサン中６０％〜７０％酢酸エチルで溶出するフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ５００g）により生成物を精製した。適切な画分を回収し、蒸発乾固させた。得られた残渣をジエチルエーテルに溶解させ、再蒸発させ、この溶解及び再蒸発をペンタンを使用して繰り返した。泡状物として得られたすべての固体をプールして全収量１５．５６gの４−（３−メトキシカルボニルメチル−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル）−［１，４］ジアゼパン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルを得た。
【０１３４】
工程６：
４−（３−カルボキシメチル−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル）−［１，４］ジアゼパン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルの調製
【０１３５】
【化２５】
【０１３６】
４−（３−メトキシカルボニルメチル−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル）−［１，４］ジアゼパン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル（１１．４g）をテトラヒドロフラン１４０mL及び水５０mLに溶解させた。水９０mlに溶解した水酸化リチウム一水和物２．３gをこの混合物に滴下した。この混合物を室温で終夜攪拌した。この時点で反応混合物を減圧濃縮した。水を加え、混合物を氷浴で冷却した。反応混合物を１０％ ＫＨＳＯ４（重量／体積）水溶液の添加によりｐＨ４に酸性化して得た析出物を濾過し、水で洗浄した。真空オーブン中で乾燥させた後、固体７．５gを得た。得られた濾液を減圧濃縮し、ペンタンで粉砕した。これにより固体２．５gを得た。固体を合わせて４−（３−カルボキシメチル−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル）−［１，４］ジアゼパン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル１０gを得た。
【０１３７】
工程７：
（４−オキソ−６−ピペラジン−１−イル−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−酢酸塩酸塩の調製
【０１３８】
【化２６】
【０１３９】
４−（３−カルボキシメチル−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル）−［１，４］ジアゼパン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル（９．８g）をジオキサン２０mLに懸濁させた。この懸濁液に４N ＨＣｌ／ジオキサン溶液（１００mL）及びジオキサン２０mLを加え、混合物を室温で３時間攪拌した。この時点で反応混合物の減圧濃縮により溶媒を除去し、残渣にテトラヒドロフランを加えた。混合物を再度減圧濃縮した。残渣を乾燥ジエチルエーテルで粉砕し、濾過し、乾燥ジエチルエーテルで洗浄した。このようにして固体１４．７４gを得た。この固体をさらに精製せずに使用した。
【０１４０】
工程８：
４−（３−カルボキシメチル−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル）−［１，４］ジアゼパン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステルの調製
【０１４１】
【化２７】
【０１４２】
前回の工程で得た粗材料（４−オキソ−６−ピペラジン−１−イル−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−酢酸塩酸塩は１０％（重量／体積）炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ９．５）に溶解させ、氷浴中に冷却した。ジオキサン６０mLに溶解した炭酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル８．１６gの溶液を１時間かけて滴下した。次に混合物を０℃で１時間、次に室温で１時間攪拌した。この時点で反応混合物は濃厚懸濁液になった。この混合物を水（１５００mL）で希釈してゲルを得た。混合物を氷浴で冷却し、機械的攪拌をしながら濃塩酸でｐＨ３に酸性化した。次に混合物を濾過し、水で洗浄した。固体を真空オーブン中で乾燥させて固体１２．５gを得た。固体を熱酢酸エチルで粉砕した。室温に冷却することにより４−（３−カルボキシメチル−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル）−［１，４］ジアゼパン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル１１．６５gを濾取することができた。
【０１４３】
中間体４の調製
実施例９で使用する中間体４−（７−カルボキシメチル−６−オキソ−６，７−ジヒドロ−１Ｈ−プリン−２−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル（Ｆｍｏｃ−Ｐｄｐ−ＯＨ）を以下のように調製した。
【０１４４】
【化２８】
【０１４５】
【化２９】
【０１４６】
工程１：
６−クロロ−３，５−ジヒドロ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−４−オン２の調製
４，６−ジクロロ−３，５−ジヒドロ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジンの水溶液にＮａＯＨ水溶液（２当量）を加えた。反応の完了（ＴＬＣによりモニタリング）まで反応混合物を９０℃で攪拌した。反応混合物を室温に冷却し、濾過して淡黄色残渣を得た。残渣を水に溶解させ、ｐＨ３〜４に酸性化し、濾過して２を得た。
【０１４７】
工程２：
４−（４−オキソ−４，５−ジヒドロ−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−６−イル）ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル３の調製
６−クロロ−３，５−ジヒドロ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−４−オン２のエチレングリコールモノメチルエーテル溶液にＢｏｃ−ピペラジン（１．１当量）を加えた。反応混合物を終夜攪拌還流させた後、濾過して固体を得た。固体を水で洗浄して３を得た。
【０１４８】
工程３：
４−（３−エトキシカルボニルメチル−４−オキソ−４，５−ジヒドロ−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−６−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル４の調製
４−（４−オキソ−４，５−ジヒドロ−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−６−イル）ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル３及び炭酸カリウム（０．８当量）のジメチルホルムアミド溶液にジメチルホルムアミド中ＣｌＣＨ２ＣＯＯＥｔ（１当量）を滴下した。溶液を終夜攪拌した。次に混合物を水で希釈し、塩化メチレンで抽出した。合わせた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を蒸発させた。酢酸エチルで溶出するシリカカラムクロマトグラフィーで生成物をさらに精製して４を固体として得た。
【０１４９】
工程４：
（４−オキソ−６−ピペラジン−１−イル−４，５−ジヒドロ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−３−イル）−酢酸エチルエステル５の調製
４−（３−エトキシカルボニルメチル−４−オキソ−４，５−ジヒドロ−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−６−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル４をＮ２下室温で乾燥塩化メチレンに溶解させた。ＣＦ３ＣＯＯＨ（５当量）を加え、反応混合物を１．５時間攪拌した。次に塩化メチレンを減圧除去し、残渣を精製せずに次の工程に使用した。
【０１５０】
工程５：
４−（３−エトキシカルボニルメチル−４−オキソ−４，５−ジヒドロ−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−６−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル６の調製
（４−オキソ−６−ピペラジン−１−イル−４，５−ジヒドロ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−３−イル）−酢酸エチルエステル５の塩化メチレン溶液に炭酸カリウム（２当量）及びわずかなテトラヒドロフラン／水（１：１）を加えた。混合物を２０分間攪拌した。次に、塩化メチレンに溶解した炭酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルを溶液に加えた。混合物を室温で終夜攪拌し、濾過し、溶媒を除去して得た残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して６を得た。
【０１５１】
工程６：
４−（３−カルボキシメチル−４−オキソ−４，５−ジヒドロ−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−６−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル７の調製
テトラヒドロフラン／水（７：１）に溶解した４−（３−エトキシカルボニルメチル−４−オキソ−４，５−ジヒドロ−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−６−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル６の溶液に１N ＬｉＯＨ水溶液（５当量）を室温で加えた。次に混合物を室温で１０分間攪拌した。溶液を１N ＨＣｌで酸性化した（ｐＨ＝３〜４）。次にテトラヒドロフランを加えた。シリカゲルクロマトグラフィーによる精製により７を得た。
【０１５２】
中間体５の調製
実施例１０で使用する中間体４−（７−カルボキシメチル−６−オキソ−６，７−ジヒドロ−１Ｈ−プリン−２−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル（Ｆｍｏｃ−Ｐｐａ−ＯＨ）を以下のように調製した。
【０１５３】
【化３０】
【０１５４】
工程１
２−クロロ−１，７−ジヒドロ−プリン−６−オン２の合成
化合物２，６−ジクロロ−７Ｈ−プリン１（６０g、３００mL）及びＮａＯＨ（３０g）の水中混合物を１００℃で５時間攪拌した後、反応混合物を室温に冷却し、濾過した。固体を酢酸エチルで洗浄した後、水に溶解させ、ｐＨが４に調整されるまでＨＣｌ水溶液で処理した。析出物を終夜形成し、固体を濾過し、わずかな水で洗浄し、乾燥させて２を得た。
【０１５５】
工程２
４−（６−オキソ−６，７−ジヒドロ−１Ｈ−プリン−２−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル３の合成
２−クロロ−１，７−ジヒドロ−プリン−６−オン２（５g）、ピペラジン（５．５g）及びエチレングリコールモノメチルエーテル３０mLの混合物を終夜還流させた後、室温に冷却した。溶媒を濾去し、固体を水で洗浄して３を得た。
【０１５６】
工程３
４−（７−エトキシカルボニルメチル−６−オキソ−６，７−ジヒドロ−１Ｈ−プリン−２−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル４の合成
４−（６−オキソ−６，７−ジヒドロ−１Ｈ−プリン−２−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル３（１g）、炭酸カリウム及びジメチルホルムアミドの混合物を室温で２時間攪拌した後、ＣｌＣＨ２ＣＯＯＥｔの溶液（０．３８g／ジメチルホルムアミド５mL）を反応混合物に滴下した。１５時間攪拌後、溶液を酢酸エチルと水との間で分配した。酢酸エチル溶液を水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧蒸発させ、カラムクロマトグラフィーの使用による残渣の精製により４を得た。
【０１５７】
工程４
（６−クロロ−２−ピペラジン−１−イル−プリン−７−イル）−酢酸エチルエステル５の合成
４−（７−エトキシカルボニルメチル−６−オキソ−６，７−ジヒドロ−１Ｈ−プリン−２−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル４ ０．６ｇのＰＯＣｌ３ ２０mL中混合物を８０℃に４時間加熱した。過剰のＰＯＣｌ３を減圧濃縮により除去した。残渣を氷水に注いだ。ｐＨを５N ＮａＯＨで調整した。溶液を塩化メチレンで抽出した。有機相を減圧濃縮して５を得た。
【０１５８】
工程５
（２−ピペラジン−１−イル−プリン−７−イル）−酢酸エチルエステル６の合成
（６−クロロ−２−ピペラジン−１−イル−プリン−７−イル）−酢酸エチルエステル５ １．４７ｇのメタノール１００mL溶液にＮ２下で１０％ Ｐｔ／Ｃ ４００mg及びＭｇＯ １．１gを加えた後、反応液を４時間水素化した。触媒及びＭｇＯを濾過し、メタノールで洗浄した。メタノールの減圧蒸発により６を得た。
【０１５９】
工程６
４−（７−エトキシカルボニルメチル−７Ｈ−プリン−２−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルエステル７の合成
（２−ピペラジン−１−イル−プリン−７−イル）−酢酸エチルエステル６ １８mg及びＦｍｏｃ−ＯＳｕ ２０mgを塩化メチレン２０mLに溶解させ、反応混合物を５時間攪拌した後、濾過し、塩化メチレンを減圧除去し、得られた固体をカラムクロマトグラフィーで精製して７を得た。
【０１６０】
工程７
４−（７−カルボキシメチル−７Ｈ−プリン−２−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル８の合成
１N ＬｉＯＨ ０．１mL及び４−（７−エトキシカルボニルメチル−７Ｈ−プリン−２−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルエステル１０mgのテトラヒドロフラン／水（７／１）２．１mL中混合物を室温で１０分間攪拌した。３N ＨＣｌを加えてｐＨを３〜４に調整し、混合物を減圧蒸発させて８を得た。
【０１６１】
中間体６の調製
実施例１１で使用する中間体４−（６−アミノ−７−カルボキシメチル−７Ｈ−プリン−２−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルエステル（Ｆｍｏｃ−Ａｐｐａ−ＯＨ）を以下のように調製した。
【０１６２】
【化３１】
【０１６３】
工程１
６−アミノ−２−クロロプリン２の調製
２，６−ジクロロ−プリン１（３０g、０．１５９mol）をＮＨ３／ＭｅＯＨ溶液（３００ml、ＭｅＯＨ中３０重量％ ＮＨ３）に溶解させた。反応混合物をオートクレーブ中で攪拌し、１００℃に４８時間加熱した。冷却後、混合物を濾過し、固体をメタノールで洗浄した。次にそれを減圧乾燥させて２を淡黄色粉末（１６g、収率６０％）として得た。
【０１６４】
工程２
（６−アミノ−２−クロロ−プリン−７−イル）−酢酸１，１−ジメチルエチルエステル３の調製
化合物６−アミノ−２−クロロプリン（５５g、０．３２４mol）、フッ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム（８．６g、３２．４mmol）及びＫ２ＣＯ３（５３．７g、０．３８９mol）のＤＭＳＯ（６００ml）中混合物を０℃で攪拌した。２−ブロモ酢酸tert−ブチルを滴下した。反応が完了した時点で混合物をブラインに注ぎ、酢酸エチル（３００ml×５）で抽出した。合わせた有機層をブラインで４〜５回洗浄した後、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、蒸発させた。ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ（８：１）で溶出するクロマトグラフィーで残渣を精製して３、６−アミノ−２−クロロ−プリン−７−イル）−酢酸１，１−ジメチルエチルエステル（５g、収率６％）を得た。
【０１６５】
工程３
４−（６−アミノ−７−tert−ブトキシカルボニルメチル−７Ｈ−プリン−２−イル）ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル４の調製
（６−アミノ−２−クロロ−プリン−７−イル）−酢酸１，１−ジメチルエチルエステル３（５g、１７．６mmol）のジメチルスルホキシド（５０ml）中攪拌混合物にピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチル（１０g、５３．８mmol）を１２０℃で加えた。添加後、混合物を約１４時間攪拌した。水（１００ml）及び酢酸エチル（１００ml）を反応混合物に加えた。次に有機層をＨ２Ｏで数回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して得た粗生成物４−（６−アミノ−７−tert−ブトキシカルボニルメチル−７Ｈ−プリン−２−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル４（７g）を精製せずに次の工程に直接使用した。
【０１６６】
工程４
４−（６−アミノ−７−カルボキシメチル−７Ｈ−プリン−２−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル６の調製
粗生成物４（７g）のＣＨ２Ｃｌ２（２００ml）中攪拌混合物にＣＦ３ＣＯ２Ｈ（２００ml）を徐々に加えた。混合物を終夜攪拌した。次に炭酸カリウムを加えてｐＨを７．５に調整した。次に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えてｐＨ８〜９を保持した。ｐＨの調整後、ＴＨＦ中Ｆｍｏｃ−ＯＳｕｃ（１０g）を混合物に加え、それをさらに５時間攪拌した。ＴＨＦを蒸発させ、混合物を酢酸エチル（１５０ml×２）で洗浄した。水層を２N ＨＣｌでｐＨ３に調整し、ジクロロメタン（１５０ml×７）で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮させて粗生成物（０．５g）を得た。分取ＨＰＬＣによるさらなる精製により４−（６−アミノ−７−カルボキシメチル−７Ｈ−プリン−２−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル６（５０mg）を得た。
【０１６７】
中間体７の調製
実施例１２で使用する中間体５−（３−カルボキシメチル−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル）−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル（Ｆｍｏｃ−Ｂｑａ−ＯＨ）を以下のように調製した。
【０１６８】
【化３２】
【０１６９】
工程１
シクロペンタジエン２の合成
ジシクロペンタジエン（２００g、１．５１３mol）を１８０℃で蒸留して２を１５０g得た（収率：７５％）。
【０１７０】
工程２
２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−エン３及び２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−エン−２−カルボン酸フェニルメチルエステル４の合成
シクロペンタジエン２（１２０g、１．８２mol）、塩化アンモニウム（２９１．８g、５．４６mol）及び４０％ホルムアルデヒド（２２１mL、２．７３mol）の水（１L）中混合物を室温で４８時間攪拌した。次にこの混合物にＮａＯＨ（２２０g、５．５mol）、ＣｂｚＣｌ（３１０．５g、１．８２mol）を加え、混合物を室温で終夜攪拌した。有機層を分離し、水相を酢酸エチルで２回抽出した。有機層を合わせて硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固させた。残渣を（石油エーテル／酢酸エチル＝１０：１）で溶出するシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーで精製して生成物４を透明油状物（１９２g、収率：４６％）として得た。
【０１７１】
工程３
endo−５−ヒドロキシ−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−カルボン酸フェニルメチルエステル５の合成
４（５０g、０．２１８mol）のテトラヒドロフラン（５００mL）溶液にＢＨ３・テトラヒドロフラン（１M、２１８mL）を０℃で滴下した。添加後、混合物を室温で２時間攪拌した。反応液を水（１３０mL）の添加によりクエンチした後、ＮａＯＨ（６M、１３０mL）及び水（３０％、１３０mL）を加え、混合物を室温で３０分間攪拌した。テトラヒドロフラン層を分離し、水相を酢酸エチルで３回抽出した。有機層を合わせて硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固させた。塩化メチレン／酢酸エチル（２／１）で溶出するクロマトグラフィーでの精製により生成物５を２１．６g得た（収率：４０％）。
【０１７２】
工程４
５−オキソ−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−カルボン酸フェニルメチルエステル６の合成
酸化クロム（２３．５g）を濃硫酸（２１mL）に冷却しながら溶解させてジョーンズ試薬を調製した後、蒸留水で希釈して全量１７５mLを得た。溶液の色が緑色から橙黄色に変化するまで、５（２０g、０．０８mol）にジョーンズ試薬を室温で加えた。混合物を酢酸エチルで抽出し、水で３回洗浄した。有機層を合わせて硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固させて６（１７g、収率：８５％）を得た。
【０１７３】
工程５
Ｎ−アセチルアントラニル酸８の合成
アントラニル酸（６０g、０．４４mol）の無水酢酸（６０g、０．６０mol）の混合物を６５℃に加熱した。５分後、混合物を１２０℃で約３時間還流させた。反応混合物を水５００mLに注いだ。固体を濾過し、乾燥させて生成物８（６８g、収率：８７％）を得た。
【０１７４】
工程６
Ｎ−アセチル−５−ブロモ−アントラニル酸９の合成
８（６８g、０．３８mol）の酢酸（５００mL）中混合物に臭素（７０ｇ、０．４４mol）を慎重に加えた後、混合物を室温で約１８時間攪拌した。次に反応混合物を水（５００mL）に注ぎ、濾過した。析出物を水で数回洗浄した。固体を乾燥させて生成物９（７１g、７２．４％）を得た。
【０１７５】
工程７
５−ブロモ−アントラニル酸１０の合成
９（７１g、０．２７５mol）の１，４−ジオキサン（４００mL）中混合物にＨＣｌ（４００mL）を加えた。混合物を１１０℃で４時間還流させた。次に混合物を濃縮し、水３００mLに加えた。混合物を濾過し、ｐＨを２N ＮａＯＨで６に調整し、水で洗浄し、乾燥させて１０を白色固体（５４．５g、収率：９１．７％）として得た。
【０１７６】
工程８
６−ブロモキナゾリン１１の合成
１０（５４．５g、０．２５２mol）の２−メトキシエタノール５００mL溶液にホルムアミジン酢酸塩（３４．１g、０．３２８mol）を加えた。反応混合物を４時間還流させ、室温に冷却し、水５００mLを加えた。得られた黄色析出物を濾取して１１（４４．１g、収率：７９％）を得た。
【０１７７】
工程９
５−ヒドロキシ−５−（４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−カルボン酸ベンジルエステル１２の合成
−７８℃で攪拌した１１（２０g、８８．８mmol）のテトラヒドロフラン（５００mL）溶液にＭｅＬｉ（４０mL、１２０．４mmol）を滴下した。添加後、反応混合物を−７８℃で１０分間攪拌した。次に上記溶液にｎ−ＢｕＬｉ（４６mL、２．５M）を−７８℃で滴下した。添加後、混合物を−７８℃で１時間攪拌した。次に、上記反応混合物に６（２１．８g、８８．９mmol）を加え、混合物を−７８℃で２時間攪拌した後、水でクエンチした。混合物のｐＨを２N ＨＣｌで３に調整した後、酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発乾固させた。塩化メチレン／酢酸エチル１／１→塩化メチレン／酢酸エチル／ＭｅＯＨ １／１／０．１で溶出するシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーで残渣を精製して１２を２０．８g得た（収率５９％）。
【０１７８】
工程１０
５−（３−エトキシカルボニルメチル−４−オキソ−３，４−ジヒドロキナゾリン−６−イル）−５−ヒドロキシ−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−カルボン酸ベンジルエステル１３の合成
１２（１０g、２５．６mmol）のジメチルホルムアミド（１００mL）中混合物にＢｒＣＨ２ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ３（５．５５g、３３．２１mmol）を加えた。混合物を室温で終夜攪拌した。反応液を水でクエンチし、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層を水で５回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧濃縮して生成物１３（９．７g、８０％）を得た。
【０１７９】
工程１１
５−（３−カルボキシメチル−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル）−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステルの合成
１３（２２．４g、４７mmol）のＨＯＡｃ（４４８mL）中混合物にＨＩ（２６８mL）を加えた。混合物を１２０℃で終夜加熱還流させた。反応混合物を蒸発させ、そのｐＨを炭酸カリウム及びＮａＨＣＯ３で６〜７に調整した。次にテトラヒドロフラン５０mLを加えた。混合物にＦｍｏｃＣｌ（１５．６８g、６１mmol）を加え、室温で５時間攪拌した。次に反応混合物を酢酸エチルで抽出し、水で３回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固させた。クロマトグラフィー（溶離液：塩化メチレン→塩化メチレン／ＭｅＯＨ／ＨＡｃ ８／１／０．１）による精製により得た粗製の５−（３−カルボキシメチル−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル）−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル１０．３gを分取ＨＰＬＣでさらに精製して純粋な５−（３−カルボキシメチル−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル）−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル２．７gを得た（２工程で収率１１％）。
【０１８０】
中間体８の調製
実施例１３で使用する中間体４−（２−カルボキシメチル−１−オキソ−１，２−ジヒドロ−イソキノリン−７−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル１０（Ｆｍｏｃ−Ｐｉｐａ−ＯＨ）を以下のように調製した。
【０１８１】
【化３３】
【０１８２】
工程１
４−ブロモ桂皮酸２の調製
４−ブロモベンズアルデヒド１（１１０g、０．５９mol）、マロン酸（１１２．５g、１．１８９mol）、ピペリジン（１１mL）のピリジン（３５０mL）溶液を８０℃で１時間加熱した後、３時間還流させた。次に反応混合物を室温に冷却し、冷水で満たした大型ビーカーに注いだ後、濃塩酸２５mLをゆっくりと加えることで酸性化した（ｐＨ＜３）。得られた析出物を濾過し、冷水で洗浄した。粗生成物を水酸化ナトリウム水溶液に溶解させ、酸性化し（ｐＨ＜３）（１：１塩酸／水）、濾過し、洗浄した（冷水）。固体を減圧乾燥させて（６０〜７０℃）２（１１８．８g、８８％）を得た。
【０１８３】
工程２
４−ブロモシンナモイルクロリド３の調製
化合物２（１１３．８g、０．５mol）の塩化チオニル溶液を１．５時間還流させた。次に混合物を減圧濃縮し、粗生成物３を得た（１２６．９g、９３％）。
【０１８４】
工程３
４−ブロモシンナモイルアジド４の調製
【０１８５】
【化３４】
【０１８６】
アジ化ナトリウム（６７g、１mol）を水及びアセトンの混合物（３００mL、１：１）に懸濁させた。混合物を０℃に冷却し、化合物３（１２６．９g、０．５２mol）の乾燥アセトン（４００mL）溶液を５℃で加えた。得られた混合物を０〜５℃で４時間攪拌した後、水（１．５L）に注いだ。析出物を濾去し、水で洗浄し、乾燥させた。Ｐ２Ｏ５でのさらなる減圧乾燥により４（１３０．３g、１００％）を得た。
【０１８７】
工程４
７−ブロモ−２Ｈ−イソキノリン−１−オン５の調製
化合物４（１２１．６g、０．４８mol）及びトリブチルアミン（１７７．９g、０．９６mol）のジフェニルエーテル（１．２L）溶液をＮ２下２１０℃で２時間加熱した。次に混合物を室温に冷却し、析出物を濾過し、ヘキサンで洗浄し、乾燥させて５（３２g、３０％）を得た。
【０１８８】
工程５
７−ブロモ−２−（２−ヒドロキシエチル）−イソキノリン−１−オン６の調製
化合物５（１９．８g、８８．４mmol）、炭酸カリウム（１８．３g、１３３mmol）及び２−ブロモエタノール（１３．３g、１０６mmol）のジメチルホルムアミド（２００mL）溶液を８０℃で１２時間攪拌した。次に混合物を室温に冷却し、水に注いだ。混合物を酢酸エチルで抽出し（５００mLで３回）、乾燥させ（硫酸ナトリウム）、濃縮し、シリカゲル上のクロマトグラフィーで精製して６（１６．２g、６８％）を得た。
【０１８９】
工程６
４−［２−（２−ヒドロキシ−エチル）−１−オキソ−１，２−ジヒドロ−イソキノリン−７−イル］ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル７の合成
化合物６（６．８g、２５．４mmol）、ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチル（５．６８g、３０．５mmol）、Ｐｄ２（ｄｂａ）３（７７５mg、０．８５mmol）、Ｓ−Ｐｈｏｓ（１．１６g）及びｔ−ＢｕＯＫ（５．７g、５０．８mmol）のトルエン（１００mL）溶液を窒素下９０℃に終夜加熱した。次に混合物を室温に冷却し、濾過した。濾液を濃縮し、残渣を塩化メチレンに溶解させ、水で洗浄し、乾燥させ（硫酸ナトリウム）、濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル）で精製して７（６．１g、６４％）を得た。
【０１９０】
工程７
化合物２−（２−ヒドロキシ−エチル）−７−ピペラジン−１イル−イソキノリン−１−オン８の合成
化合物７（６g、１６．１mmol）の塩化メチレン（２０mL）及びトリフルオロ酢酸（２０mL）溶液を室温で１時間攪拌した。次に混合物を減圧濃縮して化合物８（４．３g、９８％）を得た。
【０１９１】
工程８
４−［２−（２−ヒドロキシ−エチル）−１−オキソ−１，２−ジヒドロ−イソキノリン−７−イル］ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル９の合成
飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（８０mL）、化合物８（４．３g、１５．７mmol）のテトラヒドロフラン溶液にクロロギ酸９−フルオレニルメチルエステル（１．５当量）を加えた。混合物を室温で２時間撹拌した後、濃縮した。残渣を酢酸エチルで抽出し、乾燥させ（硫酸ナトリウム）、減圧濃縮して９（４．６g、収率５９％）を得た。
【０１９２】
工程９：
標的化合物４−（２−カルボキシメチル−１−オキソ−１，２−ジヒドロ−イソキノリン−７−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル１０の合成
塩化オキサリル（１．７３g、１３．６mmol）の塩化メチレン１０mL溶液にジメチルスルホキシド（１．４２g、１８．２mmol）を−７０℃で２５分間かけて滴下した後、化合物９（２．２５g、４．５４mmol）の塩化メチレン（２０mL）溶液を−７０℃で５０分間かけて滴下した。反応混合物を−５５℃でさらに１時間攪拌した後、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３．５２g、２７．２mmol）を５分間かけて加えた。混合物を０℃で３０分間攪拌した。１M塩酸溶液（５０mL）を反応混合物に加えた後、混合物を塩化メチレンで抽出し（１００mLで３回）、合わせた有機相を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液及び水で洗浄し、乾燥させ（硫酸ナトリウム）、減圧濃縮してアルデヒドを得た。
【０１９３】
このアルデヒド（２．２g、４．４６mmol）、ｍ−Ｃ６Ｈ４（ＯＨ）２（０．９８g、８．９２mmol）、ＮａＨ２ＰＯ４水溶液（１０mL）、ｔ−ＢｕＯＨ（５mL）のＤＭＳＯ（５０mL）溶液を０℃に冷却した後、ＮａＣｌＯ２水溶液（５mL）を滴下した。反応混合物を０℃で３時間攪拌し、水１００mLを加え、ｐＨ＜５に調整し、酢酸エチルで抽出し（１００mLで３回）、乾燥し（硫酸ナトリウム）、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル）で精製して標的化合物４−（２−カルボキシメチル−１−オキソ−１，２−ジヒドロ−イソキノリン−７−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル１０（１．３５g、収率５８．７％）を得た。
【０１９４】
ここで本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、これらは例示のみとして意図されており、本発明の範囲を限定しない。
【０１９５】
調製例
実施例１
Ｆｍｏｃリンカー−ＢＨＡ樹脂の調製
ベンズヒドリルアミンコポリスチレン−１％ジビニルベンゼン架橋樹脂（１０．０g、９．３ミリ当量、１００〜２００ ＡＳＴＭメッシュ、Advanced ChemTech）をＣＨ２Ｃｌ２ １００mL中で膨潤させ、濾過し、ＣＨ２Ｃｌ２、６％ ＤＩＰＥＡ／ＣＨ２Ｃｌ２（２回）、ＣＨ２Ｃｌ２（２回）各１００mlで連続的に洗浄した。樹脂を２５％ＤＭＦ／ＣＨ２Ｃｌ２ １００mL中ｐ−（（Ｒ，Ｓ）−α−（１−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）−メトキシホルムアミド）−２，４−ジメトキシベンジル）−フェノキシ酢酸（Ｆｍｏｃリンカー）（７．０１g、１３．０mmole）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（２．１６g、１６．０mmole）及びジイソプロピル−カルボジイミド（２．０４ml、１３．０mmol）を室温で２４時間処理した。樹脂を濾過し、ＣＨ２Ｃｌ２（２回）、イソプロパノール（２回）、ＤＭＦ及びＣＨ２Ｃｌ２（３回）各１００mlで連続的に洗浄した。カイザーニンヒドリン分析は陰性であった。樹脂を減圧乾燥させてＦｍｏｃリンカー−ＢＨＡ樹脂１６．１２gを得た。この樹脂の一部（３．５mg）をＦｍｏｃ脱保護及びＵＶ定量分析に供し、この分析は０．５６mmol/gの添加を示した。
【０１９６】
実施例２
フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学を使用するApplied Biosystem ４３３Ａシンセサイザーによるペプチドの合成のプロトコール
Applied Biosystem ４３３Ａシンセサイザー（カリフォルニア州フォスターシティ）による０．２５mmolスケールペプチド合成において、ＦａｓｔＭｏｃ ０．２５mmoleサイクルを樹脂サンプリング又は非樹脂サンプリングのいずれかの４１mL反応容器と共に使用した。Ｆｍｏｃ−アミノ酸樹脂をＮＭＰ ２．１g、０．４５M ＨＯＢＴ／ＨＢＴＵ ２gと共にＤＭＦ及び２M ＤＩＥＡに懸濁させた後、反応容器に移した。塩基性ＦａｓｔＭｏｃカップリングサイクルを「ＢＡＤＥＩＦＤ」として表した。ここで各文字はモジュール（Applied Biosystemsの定義による）を表す。例えば：
Ｂは２０％ピペリジン／ＮＭＰ及び関連洗浄液を使用するＦｍｏｃ脱保護ならびに３０分間の読み取り（ＵＶモニタリング又は伝導率のいずれか）のためのモジュールを表し；Ａはカートリッジ内のアミノ酸の０．４５M ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ及び２．０M ＤＩＥＡによる活性化ならびにＮ２バブリングによる混合のためのモジュールを表し；Ｄは反応容器中の樹脂のＮＭＰ洗浄のためのモジュールを表し；Ｅはカップリング用の反応容器への活性化アミノ酸の移動のためのモジュールを表し；Ｉは反応容器上での又は反応容器から外してのボルテックスを伴う１０分間の待機期間のためのモジュールを表し；Ｆはカートリッジの洗浄、約１０分間のカップリング及び反応容器からの排出のためのモジュールを表す。典型的にはモジュール「Ｉ」を１回又は複数回付加することでカップリングを延長した。例えば、「ＢＡＤＥＩＩＡＤＥＩＦＤ」という手順を行うことで二重カップリングを実行した。塩化メチレン洗浄用のｃ及び無水酢酸でのキャッピング用の「Ｃ」などの他のモジュールも利用可能とした。例えば移動する溶媒又は試薬の量を改変するために移動時間などの様々な関数のタイミングを変化させることで各モジュールの改変も可能であった。上記サイクルを１つのアミノ酸のカップリングに典型的に使用した。しかし、テトラペプチドの合成にはサイクルを繰り返しかつつなぎ合わせた。例えば、ＢＡＤＥＩＩＡＤＥＩＦＤを第１のアミノ酸のカップリングに使用し、続いてＢＡＤＥＩＩＡＤＥＩＦＤを第２のアミノ酸のカップリングに使用し、続いてＢＡＤＥＩＩＡＤＥＩＦＤを第３のアミノ酸のカップリングに使用し、続いてＢＡＤＥＩＩＡＤＥＩＦＤを第４のアミノ酸のカップリングに使用し、続いてＢＩＤＤｃｃを最終脱保護及び洗浄に使用した。
【０１９７】
実施例３
Ｈ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２（ＰＹＹ３−３６）の調製
Applied Biosystem ４３３Ａシンセサイザー上でＦｍｏｃ化学を使用して上記ペプチドを合成した。実施例２に記載のモジュールを使用してシンセサイザーを二重カップリング用にプログラムした。実施例１からのＦｍｏｃリンカー−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmole）を使用して０．２５mmoleスケールで合成を行った。合成の終わりに、切断のために樹脂を振盪機上の反応容器に移した。９７％ ＴＦＡ／３％ Ｈ２Ｏ １３．５mL及びトリイソプロピルシラン１．５mLを室温で１８０分間使用してペプチドを樹脂から切断した。脱保護溶液を冷Ｅｔ２Ｏ １００mLに加え、ＴＦＡ １mL及び冷Ｅｔ２Ｏ ３０mLで洗浄してペプチドを析出させた。ペプチドを２ｘ５０mLポリプロピレンチューブで遠心分離した。各チューブからの析出物を単一チューブ内にて合わせ、冷Ｅｔ２Ｏで３回洗浄し、ハウスバキューム下、デシケーター中で乾燥させた。
【０１９８】
粗材料をPursuit Ｃ１８カラム（２５０ｘ５０mm、粒径１０μm）上で分取ＨＰＬＣにより精製し、２〜７０％ Ｂのリニアグラジエント（緩衝液Ａ：０．１％ ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ；緩衝液Ｂ：０．１％ ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）により９０分、流量６０mL／分及び検出２２０／２８０nmにて溶出した。画分を回収し、分析用ＨＰＬＣで点検した。純粋な生成物を含む画分を合わせて凍結乾燥させ、白色アモルファス粉末１５１mg（１５％）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ Ｃ１８０Ｈ２７９Ｎ５３Ｏ５４の計算値（「calcd」）４０４９．５５ 実測値４０５０．４０
【０１９９】
実施例４
Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｑａ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−（ＮＭｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２の調製
【０２００】
【化３５】
【０２０１】
実施例１からのＦｍｏｃリンカー−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmole）を、Ｆｍｏｃ−Ｐｑａを使用する実施例３に記載の一般的手順に従って固相合成及び精製に供して白色アモルファス粉末５３mg（９％）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ Ｃ１０６Ｈ１５６Ｎ３４Ｏ２２の計算値（「calcd」）２２５７．２１ 実測値２２５７．１９．
【０２０２】
実施例５
Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｃｂａ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−（ＮＭｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２の調製
【０２０３】
【化３６】
【０２０４】
Ｆｍｏｃリンカー−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmole）を実施例１１に記載のように調製し、実施例３の一般的手順に従いかつＦｍｏｃ−Ｃｂａを使用することで固相合成及び精製に供して白色アモルファス粉末１８mg（３．２％）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ Ｃ１０７Ｈ１５５Ｎ３１Ｏ２１の計算値（「calcd」）２２１０．２０，実測値２２１０．１９
【０２０５】
実施例６
Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｃｉｐ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−（ＮＭｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２の調製
【０２０６】
【化３７】
【０２０７】
Ｆｍｏｃリンカー−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmole）を実施例１に記載のように調製し、Ｆｍｏｃ−Ｃｉｐを使用して実施例３の一般的手順に従うことで固相合成及び精製に供して白色アモルファス粉末１６mg（３％）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ Ｃ１０６Ｈ１５７Ｎ３３Ｏ２１の計算値（「calcd」）２２２８．２２、実測値２２２８．２１。
【０２０８】
実施例７
Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−ＨｏｍＰｑａ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−（ＮＭｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２の調製
【０２０９】
【化３８】
【０２１０】
Ｆｍｏｃリンカー−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmole）を実施例１に記載のように調製し、Ｆｍｏｃ−ＨｏｍＰＱＡを使用して実施例３の一般的手順に従うことで固相合成及び精製に供して白色アモルファス粉末１１mg（２％）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ Ｃ１０７Ｈ１５８Ｎ３４Ｏ２３の計算値（「calcd」）２２８７．２２、実測値２２８７．２４。
【０２１１】
実施例８
Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｄｑａ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−（ＮＭｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２の調製
【０２１２】
【化３９】
【０２１３】
Ｆｍｏｃリンカー−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmole）を実施例１に記載のように調製し、Ｆｍｏｃ−Ｄｑａを使用して実施例３の一般的手順に従うことで固相合成及び精製に供して白色アモルファス粉末２２mg（４％）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ Ｃ１０７Ｈ１５８Ｎ３４Ｏ２２の計算値（「calcd」）２２７１．２３、実測値２２７１．２４。
【０２１４】
実施例９
Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｄｐ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−（ＮＭｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２の調製
【０２１５】
【化４０】
【０２１６】
Ｆｍｏｃリンカー−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmole）を実施例１に記載のように調製し、Ｆｍｏｃ−Ｐｄｐを使用して実施例３の一般的手順に従うことで固相合成及び精製に供して白色アモルファス粉末１７mg（３％）を得た。）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ Ｃ１０３Ｈ１５４Ｎ３６Ｏ２２の計算値（「calcd」）２２４７．２１、実測値２２４７．１９。
【０２１７】
実施例１０
Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｐａ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−（ＮＭｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２の調製
【０２１８】
【化４１】
【０２１９】
Ｆｍｏｃリンカー−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmole）を実施例１に記載のように調製し、Ｆｍｏｃ−Ｐｐａを使用して実施例３の一般的手順に従うことで固相合成及び精製に供して白色アモルファス粉末１１７mg（２１％）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ Ｃ１０３Ｈ１５６Ｎ３６Ｏ２１の計算値（「calcd」）２２３３．２２、実測値２２３３．２０。
【０２２０】
実施例１１
Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｐｐａ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−（ＮＭｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２の調製
【０２２１】
【化４２】
【０２２２】
Ｆｍｏｃリンカー−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmole）を実施例１に記載のように調製し、Ｆｍｏｃ−Ａｐｐａを使用して実施例３の一般的手順に従うことで固相合成及び精製に供して白色アモルファス粉末９８mg（１７％）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ Ｃ１０３Ｈ１５５Ｎ３７Ｏ２１の計算値（「calcd」）２２４６．２２、実測値２２４６．２０。
【０２２３】
実施例１２
Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｂｑａ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−（ＮＭｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２の調製
【０２２４】
【化４３】
【０２２５】
Ｆｍｏｃリンカー−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmole）を実施例１に記載のように調製し、Ｆｍｏｃ−Ｂｑａを使用して実施例３の一般的手順に従うことで固相合成及び精製に供して白色アモルファス粉末７９mg（４％）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ Ｃ１０８Ｈ１５７Ｎ３３Ｏ２２の計算値（「calcd」）２２６８．２２、実測値２２６８．２４。
【０２２６】
実施例１３
Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｉｐａ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−（ＮＭｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２の調製
【０２２７】
【化４４】
【０２２８】
Ｆｍｏｃリンカー−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmole）を実施例１に記載のように調製し、Ｆｍｏｃ−Ｐｉｐａを使用して実施例３の一般的手順に従うことで固相合成及び精製に供して白色アモルファス粉末１１８mg（２１％）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ Ｃ１０７Ｈ１５７Ｎ３３Ｏ２２の計算値（「calcd」）２２５６．２２、実測値２２５６．２１。
【０２２９】
実施例１４
ｃＡＭＰアゴニストアッセイ
環状ＡＭＰアッセイ
この実施例では以下の材料を使用した：３８４ウェルプレート；Ｔｒｏｐｉｘ ｃＡＭＰスクリーンキット；ｃＡＭＰ ＥＬＩＳＡシステム（Applied Biosystems、カタログ番号Ｔ１５０５；ＣＳ ２００００）；フォルスコリン（Calbiochemカタログ番号３４４２７０）；細胞：ヒトＮＰＹ２受容体を発現させるＨＥＫ２９３細胞；増殖培地：ＤＭＥＭ（Gibcoカタログ番号１１９９５０６５）、１０％熱不活性化ＦＢＳ（Gibcoカタログ番号１００８２−１４７）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibcoカタログ番号１５１４０−１２２）、５００mg/mL Ｇ４１８（ジェネテシン、Gibcoカタログ番号１１８１１−０３１）；プレーティング培地：ＤＭＥＭ／Ｆ１２、フェノールレッドなし（Gibcoカタログ番号１１３３０３２）、１０％熱不活性化ＦＢＳ（Gibcoカタログ番号１００８２−１４７）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco カタログ番号１５１４０−１２２）、５００mg/mL Ｇ４１８（ジェネテシン、Gibcoカタログ番号１１８１１−０３１）；Versene（Gibcoカタログ番号１５０４００６６）。
【０２３０】
ヒトＮＰＹ２受容体を発現させるＨＥＫ２９３細胞を３８４ウェルプレートにマルチドロップディスペンサーを用いて９０００細胞／ウェルの密度でプレーティングし、プレートを３７℃で終夜増殖させた。翌日、７５〜８５％コンフルエンスに到達した細胞を実験に使用した。
【０２３１】
培地及び試薬を室温に昇温した。希釈液を調製する前に、ＮＰＹ２受容体リガンド及び対照のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Sigmaカタログ番号Ｄ２６５０）のストック溶液を３２℃に５〜１０分間昇温した。インキュベーション培地［０．５mM ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ、Calbiochemカタログ番号４１０９５７）及び０．５mg/mL ＢＳＡ（Sigmaカタログ番号Ａ８８０６）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地］を使用して希釈を行った。インキュベーション培地中のＤＭＳＯ及びフォルスコリンの終濃度をそれぞれ１．１％及び５μMとした。
【０２３２】
プレーティング培地を、ペーパータオル上で３８４ウェルプレートをやさしくひっくり返すことで除去し、様々な濃度のＮＰＹ２受容体リガンド（４つの複製物／濃度）を含有するインキュベーション培地（５０μL/ウェル）で置き換えた。プレートを室温で３０分間インキュベートした。３０分の処理期間後、インキュベーション培地を廃棄し、アッセイ溶解緩衝液（Tropixキットで与える）５０μL／ウェルで置き換えた。プレートを３７℃で４５分間インキュベートすることで細胞を溶解させた。Tropixキットで供給したプレコーティング抗体プレート（３８４ウェル）に溶解液（２０μl）を移した。ＡＰ抱合体（１０μL）及び抗ｃＡＭＰ抗体（２０μL）を各ウェルに加え、プレートを振盪機上にて室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（７０μL／ウェル／洗浄）で５回洗浄し、プレートをタップ乾燥させた。ＣＳＰＤ／Saphire-II ＲＴＵ基質／エンハンサー溶液（３０μL／ウェル）を加え、室温で４５分間インキュベートした。各ウェルのシグナルをルミノメーター（ＶＩＣＴＯＲ−Ｖ）を使用して測定した（１秒／ウェル）。
【０２３３】
実施例１５
ＣａＦｌｕｘアッセイ
Ｈｅｋ−２９３細胞にＧタンパク質キメラＧａｑｉ９を安定的にトランスフェクトし、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子にヒトＮＰＹ２受容体及びＧ４１８抗生物質セレクションをさらにトランスフェクトした。ハイグロマイシンＢとＧ４１８との両方における選択の後、個々のクローンをそのＰＹＹに対する応答についてアッセイした。１０％ウシ胎仔血清、５０μg/mlハイグロマイシンＢ、２mMグルタミン、１００U/mlペニシリン、１００μg／mlストレプトマイシン及び２５０μg/ml Ｇ４１８を補充したＤＭＥＭ培地中でトランスフェクト細胞を培養した。細胞をトリプシン−ＥＤＴＡで収集し、ViaCount試薬を用いて計数した。細胞緩衝液の容量を完全増殖培地で４．８ｘ１０５細胞／mlに調整した。２５μLのアリコートを３８４ウェルポリＤリジンコーティング黒色／透明マイクロプレート（Falcon）に注ぎ、マイクロプレートを３７℃ ＣＯ２インキュベーター中に終夜配置した。２０mM ＨＥＰＥＳ及び５mMプロベネシドを含有するハンクス平衡塩類溶液１０００mlに１つのバイアル（Express Kit）の内容物を溶解させて、添加緩衝液（カルシウム−３アッセイキット、Molecular Devices）を調製した。希釈色素２５μLのアリコートを細胞プレートに分注し、次にプレートを３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション中、試験化合物をＨＢＳＳ（２０mM ＨＥＰＥＳ）／０．０５％ ＢＳＡ／１％ ＤＭＳＯ中の所望濃度の３．５倍で調製し、ＦＬＩＰＲ上での使用のために３８４ウェルプレートに移した。インキュベーション後、細胞プレートと化合物プレートとの両方をＦＬＩＰＲに運び、希釈化合物２０μLをＦＬＩＰＲにより細胞プレートに移した。アッセイ中、１．５秒毎に細胞プレートの全３８４ウェルから同時に蛍光読み取りを取得した。５つの読み取りを取得して安定的なベースラインを確立した後、試料２０μLを速やかに（３０μL／秒）かつ同時に細胞プレートの各ウェルに加えた。１００秒の全経過時間において、試料添加の前、途中及び後に蛍光を連続的にモニタリングした。添加後の各ウェルにおける応答（ピーク蛍光の増加）を決定した。リガンド刺激の前の各ウェルからの初期蛍光読み取りを、そのウェルからのデータのゼロベースライン値として使用した。応答は正の対照の最大応答の％として表した。ｃＡＭＰアッセイ及びＣａＦｌｕｘアッセイ（ＦＬＩＰＲ）において示すように、本発明の化合物はインビトロでの選択的神経ペプチド２受容体活性を示した。実施例３〜１３のインビトロ結果の概要を以下の表１に示す。
【０２３４】
【表３】
【０２３５】
式（Ｉ）に係る化合物は０．００１nM〜１０nMという上記アッセイのうち１つにおける活性（Ｙ２Ｒ ＥＣ５０）を有する。式（Ｉ）で示される最も好ましい化合物は０．００１nM〜５nM、好ましくは０．００１nM〜１nMという上記アッセイのうち１つにおける活性（Ｙ２Ｒ ＥＣ５０）を有する。
【０２３６】
実施例Ａ
以下の成分を含有するフィルムコーティング錠剤を慣行的な様式で製造することができる。
成分 １錠剤当たり
カーネル：
式（Ｉ）で示される化合物 １０．０mg ２００．０mg
微結晶セルロース ２３．５mg ４３．５mg
含水乳糖 ６０．０mg ７０．０mg
ポビドンＫ３０ １２．５mg １５．０mg
グリコール酸デンプンナトリウム １２．５mg １７．０mg
ステアリン酸マグネシウム １．５mg ４．５mg
（カーネル重量） １２０．０mg ３５０．０mg
フィルムコート：
ヒドロキシプロピルメチルセルロース ３．５mg ７．０mg
ポリエチレングリコール６０００ ０．８mg １．６mg
タルク １．３mg ２．６mg
酸化鉄（イエロー） ０．８mg １．６mg
二酸化チタン ０．８mg １．６mg
【０２３７】
有効成分を篩い分け、微結晶セルロースと混合し、混合物をポリビニルピロリドンの水溶液と共に顆粒化する。顆粒をグリコール酸デンプンナトリウム及びステアリン酸マグネシウムと混合し、圧縮して１２０mg又は３５０mgのカーネルをそれぞれ得る。カーネルを上記フィルムコートの水溶液／水性懸濁液でラッカー塗装する。
【０２３８】
実施例Ｂ
以下の成分を含有するカプセル剤を慣行的な様式で製造することができる。
成分 カプセル剤当たり
式（Ｉ）で示される化合物 ２５．０mg
乳糖 １５０．０mg
トウモロコシデンプン ２０．０mg
タルク ５．０mg
【０２３９】
これらの成分を篩い分け、混合し、サイズ２のカプセルに充填する。
【０２４０】
実施例Ｃ
注射液剤は以下の組成を有し得る。
式（Ｉ）で示される化合物 ３．０mg
ポリエチレングリコール４００ １５０．０mg
酢酸 適量約ｐＨ５．０
注射液剤用水 約１．０ml
【０２４１】
有効成分をポリエチレングリコール４００及び注射液剤用水（一部）の混合物に溶解させる。ｐＨを酢酸で５．０に調整する。残りの量の水を加えることで容量を１．０mlに調整する。溶液を濾過し、適切な過剰量を使用してバイアルに充填し、滅菌する。
【０２４２】
実施例Ｄ
以下の成分を含有する軟ゼラチンカプセル剤を慣行的な様式で製造することができる。
カプセル内容物
式（Ｉ）で示される化合物 ５．０mg
黄蝋 ８．０mg
硬化大豆油 ８．０mg
部分硬化植物油 ３４．０mg
大豆油 １１０．０mg
カプセル内容物の重量 １６５．０mg
ゼラチンカプセル
ゼラチン ７５．０mg
グリセロール８５％ ３２．０mg
Ｋａｒｉｏｎ ８３ ８．０mg (乾燥物)
二酸化チタン ０．４mg
酸化鉄イエロー １．１mg
【０２４３】
有効成分を他の成分の暖かい溶融物中に溶解させ、混合物を適切なサイズの軟ゼラチンカプセルに充填する。充填した軟ゼラチンカプセルを通常の手順に従って処理する。
【０２４４】
実施例Ｅ
以下の成分を含有するサシェ剤を慣行的な様式で製造することができる。
式（Ｉ）で示される化合物 ５０．０mg
乳糖、微粉 １０１５．０mg
微結晶セルロース（ＡＶＩＣＥＬ ＰＨ １０２） １４００．０mg
カルボキシメチルセルロースナトリウム １４．０mg
ポリビニルピロリドンＫ ３０ １０．０mg
ステアリン酸マグネシウム １０．０mg
調味添加剤 １．０mg
【０２４５】
有効成分を乳糖、微結晶セルロース及びカルボキシメチルセルロースナトリウムと混合し、ポリビニルピロリドンの水中混合物と共に顆粒化する。顆粒をステアリン酸マグネシウム及び調味添加剤と混合し、サシェ剤に充填する。
【技術分野】
【０００１】
本発明はＰＹＹ３−３６の短縮された類似体を提供する。この類似体は神経ペプチド２受容体のアゴニストであり、例えば肥満、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性及び脂質異常症などの代謝疾患及び代謝障害の処置に有用である。
【０００２】
本発明は特に式（Ｉ）：
Ｙ−Ｒ１−Ｒ２−Ｘ−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８−Ｒ９−Ｒ１０−Ｒ１１−Ｒ１２−Ｒ１３−Ｒ１４−ＮＨ２ （Ｉ）
［式中、
Ｘは、（４−アミノメチル−ビフェニル−３−イル）−酢酸（Ｃｂａ）、（５−ピペラジン−１−イル−インドール−１−イル）−酢酸（Ｃｉｐ）、３−（４−オキソ−６−ピペラジン−１−イル−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−プロピオン酸（ＨｏｍＰｑａ）、（６−［１，４］ジアゼパン−１−イル−４−オキソ−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−酢酸（Ｄｑａ）、（６−オキソ−２−ピペラジン−１−イル−１，６−ジヒドロプリン−７−イル）−酢酸（Ｐｄｐ）、（２−ピペラジン−１−イル−プリン−７−イル）−酢酸（Ｐｐａ）、（６−アミノ−２−ピペラジン−１−イル−９Ｈ−プリン−８−イル）−酢酸（Ａｐｐａ）、（（１Ｒ，４Ｓ）−６−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−イル−４−オキソ−４Ｈ−キナゾリン）−酢酸（Ｂｑａ）又は（１−オキソ−７−ピペラジン−１−イル−１Ｈ−イソキノリン−２−イル）−酢酸（Ｐｉｐａ）であり；
ＹはＨ又はアシル部分であり；
Ｒ１は、Ｉｌｅ、Ａｌａ、（Ｄ）Ｉｌｅ、Ｎ−メチルＩｌｅ、Ａｉｂ、１−１Ａｉｃ、２−２Ａｉｃ、Ａｃｈ又はＡｃｐであり；
Ｒ２は、Ｌｙｓ、Ａｌａ、（Ｄ）Ｌｙｓ、Ｎ−メチルｌｙｓ、Ｎｌｅ又は（Ｌｙｓ−Ｇｌｙ）であり；
Ｒ３は、Ａｒｇ、Ａｌａ、（Ｄ）Ａｒｇ、Ｎ−メチルＡｒｇ、Ｐｈｅ、３，４，５−トリフルオロＰｈｅ又は２，３，４，５，６−ペンタフルオロＰｈｅであり；
Ｒ４は、Ｈｉｓ、Ａｌａ、（Ｄ）Ｈｉｓ、Ｎ−メチルＨｉｓ、４−ＭｅＯＡｐｃ、３−Ｐａｌ又は４−Ｐａｌであり；
Ｒ５は、Ｔｙｒ、Ａｌａ、（Ｄ）Ｔｙｒ、Ｎ−メチルＴｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｉｃ、Ｂｉｐ、Ｄｉｐ、（１）Ｎａｌ、（２）Ｎａｌ、３，４，５−トリフルオロＰｈｅ又は２，３，４，５，６−ペンタフルオロＰｈｅであり；
Ｒ６は、Ｌｅｕ、Ａｌａ、（Ｄ）Ｌｅｕ又はＮ−メチルＬｅｕであり；
Ｒ７は、Ａｓｎ、Ａｌａ又は（Ｄ）Ａｓｎであり；
Ｒ８は、Ｌｅｕ又はＴｒｐであり；
Ｒ９は、Ｖａｌ、Ａｌａ、（Ｄ）Ｖａｌ又はＮ−メチルＶａｌであり；
Ｒ１０は、Ｔｈｒ、Ａｌａ又はＮ−メチルＴｈｒであり；
Ｒ１１は、Ａｒｇ、（Ｄ）Ａｒｇ又はＮ−メチルＡｒｇであり；
Ｒ１２は、Ｇｌｎ又はＡｌａであり；
Ｒ１３は、Ａｒｇ、（Ｄ）Ａｒｇ又はＮ−メチルＡｒｇであり、
Ｒ１４は、Ｔｙｒ、（Ｄ）ＴｙｒもしくはＮ−メチルＴｙｒ、修飾Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、修飾Ｐｈｅ、（１）Ｎａｌ、（２）Ｎａｌ、Ｃｈａ、Ｃ−α−メチルＴｙｒ又はＴｒｐである］で示される神経ペプチド２受容体アゴニスト又はその薬学的に許容される塩に関する。
【背景技術】
【０００３】
代謝疾患及び代謝障害は、先進国における深刻な健康上の問題として広く認識されており、米国では流行レベルに達している。例えば肥満に関する最近の研究では、米国の人口の５０％超が過体重であると考えられており、２５％超が臨床的に肥満でありかつ心疾患、２型糖尿病及びある種の癌の相当な危険性があると診断されている。年間７００億ドルを超える推定肥満治療費用が米国だけで予想されることから、この流行は医療制度に対する著しい負担となっている。肥満を治療するための戦略は食物摂取の減少及びエネルギー消費の増大を含む。
【０００４】
３６アミノ酸ペプチド神経伝達物質である神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）は、末梢神経系と中枢神経系との両方に存在することがわかっている神経伝達物質／神経ホルモンの膵臓ポリペプチドクラスのメンバーである。ＮＰＹは、最も強力な公知の食欲促進剤の１つであり、ヒトを含む動物における食物摂取の調節に大きな役割を果たすことがわかっている。
【０００５】
ロドプシン様Ｇタンパク質共役７膜貫通受容体（ＧＰＣＲ）に属する６つの神経ペプチドＹ受容体（ＮＰＹ）、すなわちＹ１、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４及びＹ５及びＹ６サブタイプをクローニングした。ＮＰＹ Ｙ２受容体（Ｙ２Ｒ）は、他の公知のＮＰＹ受容体との低い相同性を示しながらＧｉを経由してアデニルシクラーゼの活性化を阻害する、３８１アミノ酸受容体である。９８％アミノ酸同一性を有するラット及びヒトのＹ２受容体の間には高い保存度が存在する。
【０００６】
げっ歯類とヒトとの両方における中枢神経系内にはＹ２Ｒ受容体が広く分布している。視床下部では、Ｙ２ ｍＲＮＡは弓状核、視索前核及び背内側核に局在化している。ヒト脳内では、Ｙ２Ｒが優勢なＹ受容体サブタイプである。弓状核内では、ＮＰＹニューロンの８０％超がＹ２Ｒ ｍＲＮＡを共発現させる。Ｙ２選択的アゴニストの適用がインビトロでの視床下部切片からのＮＰＹの放出を減少させることがわかっている一方、Ｙ２非ペプチドアンタゴニストＢＩＩＥ０２４６はＮＰＹ放出を増加させる。ＮＰＹ放出を制御し、そのため摂食の制御に関与し得るシナプス前自己受容体としてのＹ２Ｒの役割を、これらの発見は支持している（Kaga, T. et al., Peptides 22: 501-506 (2001)及びKing PJ et al., Eur J Pharmacol 396: R1-3 (2000)）。
【０００７】
ペプチドＹＹ３−３６（ＰＹＹ３−３６）は、神経ペプチドＹ２（ＮＰＹ２Ｒ）アゴニスト活性を有する３４アミノ酸線状ペプチドである。弓状核内（ＩＣ）又は腹腔内（ＩＰ）のＰＹＹ３−３６注射がラットにおける摂食を減少させ、臨床治療として体重増加を減少させたことが示されている。ＰＹＹ３−３６の９０分間の静脈内（ＩＶ）注入（０．８pmol／kg／分）は、２４時間にわたる肥満の及び正常なヒト対象における食物摂取を減少させた。これらの発見は、ＰＹＹ系が肥満の処置における治療標的となり得ることを示唆している（Batterham RL et al., Nature 418: 650-654 (2002); Batterham RL et al., New Engl J Med 349: 941-948 (2003)）。さらに、ラット空腸の電位固定粘膜調製物を通じる電流の減少が証明するように、残基５〜２４が長さ５〜８炭素のメチレン鎖で置き換えられたＰＹＹのＣｙｓ２−（Ｄ）Ｃｙｓ２７環化バージョンが腸ＰＹＹ受容体の活性化を示した（Krstenansky, et al. in Peptides, Proceedings of the Twelfth American Peptide Symposium. J. Smith and J. Rivier Editors, ESCOM. Leiden Page 136-137）。
【０００８】
さらに、最近のデータは、Ｒｏｕｘ−ｅｎＹ胃バイパス術患者が、早期の血糖コントロール及び長期の体重維持の原因の一部となり得るＰＹＹレベルの早期かつ過剰な増加を伴うことを示しており、このことは代謝疾患の病因におけるこのペプチドの重要性を証明している。ＰＹＹの他の公知の作用は、食後血糖コントロール改善の原因となる胃内容排出減少及び胃腸管通過遅延を含む。ＨｂＡ１Ｃ及びフルクトサミンなどの高血糖の指標は、２型糖尿病の動物モデルにおけるＰＹＹ３−３６の末梢投与後の用量依存的減少を示す。したがって、これらの結果は、ＰＹＹ３−３６又は薬学的に関連性のあるアゴニストが血糖及び体重のコントロールに対する長期の治療アプローチを提示し得ることを示している（Korner et al., J Clin Endocrinol Metabol 90: 359-365 (2005); Chan JL et al., Obesity 14: 194-198 (2006); Stratis C et al., Obes Surg 16: 752-758 (2006); Borg CM et al., Br J Surg 93: 210-215 (2006); and Pittner RA et al., Int J Obes 28: 963-971 (2004)）。
【０００９】
しかし、同等以上のＹ１、Ｙ４及びＹ５受容体に対する効力及び選択性、薬物動態特性、ならびに薬理特性を有しながらより小さい分子量を有するＰＹＹの新規改変類似体の必要性が存在する。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の化合物は代謝疾患及び代謝障害の処置に有用であることが好ましい。そのような代謝疾患及び代謝障害は、例えば肥満、糖尿病、好ましくは２型糖尿病、メタボリックシンドローム（シンドロームＸとしても知られる）、インスリン抵抗性、脂質異常症、空腹時血中ブドウ糖不良及び耐糖能障害を含む。
【００１１】
Ｘが、（４−アミノメチル−ビフェニル−３−イル）−酢酸（Ｃｂａ）、（５−ピペラジン−１−イル−インドール−１−イル）−酢酸（Ｃｉｐ）、３−（４−オキソ−６−ピペラジン−１−イル−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−プロピオン酸（ＨｏｍＰｑａ）、（６−［１，４］ジアゼパン−１−イル−４−オキソ−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−酢酸（Ｄｑａ）、（６−オキソ−２−ピペラジン−１−イル−１，６−ジヒドロプリン−７−イル）−酢酸（Ｐｄｐ）、（２−ピペラジン−１−イル−プリン−７−イル）−酢酸（Ｐｐａ）、（６−アミノ−２−ピペラジン−１−イル−９Ｈ−プリン−８−イル）−酢酸（Ａｐｐａ）、（（１Ｒ，４Ｓ）−６−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−イル−４−オキソ−４Ｈ−キナゾリン）−酢酸（Ｂｑａ）又は（１−オキソ−７−ピペラジン−１−イル−１Ｈ−イソキノリン−２−イル）−酢酸（Ｐｉｐａ）であり；
Ｙがアシル部分である、
式（Ｉ）で示される神経ペプチド２受容体アゴニストが好ましい。
【００１２】
式（ＩＩ）：
Ｙ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−（ＮＭｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２ （ＩＩ）
［式中、
Ｘは、（４−アミノメチル−ビフェニル−３−イル）−酢酸（Ｃｂａ）、（５−ピペラジン−１−イル−インドール−１−イル）−酢酸（Ｃｉｐ）、３−（４−オキソ−６−ピペラジン−１−イル−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−プロピオン酸（ＨｏｍＰｑａ）、（６−［１，４］ジアゼパン−１−イル−４−オキソ−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−酢酸（Ｄｑａ）、（６−オキソ−２−ピペラジン−１−イル−１，６−ジヒドロプリン−７−イル）−酢酸（Ｐｄｐ）、（２−ピペラジン−１−イル−プリン−７−イル）−酢酸（Ｐｐａ）、（６−アミノ−２−ピペラジン−１−イル−９Ｈ−プリン−８−イル）−酢酸（Ａｐｐａ）、（（１Ｒ，４Ｓ）−６−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−イル−４−オキソ−４Ｈ−キナゾリン）−酢酸（Ｂｑａ）又は（１−オキソ−７−ピペラジン−１−イル−１Ｈ−イソキノリン−２−イル）−酢酸（Ｐｉｐａ）であり；
Ｙはアシル部分である］を有する神経ペプチド２受容体アゴニスト及びその薬学的に許容される塩がさらに好ましい。
【００１３】
以下から選択される請求項１記載の神経ペプチド２受容体アゴニストが特に好ましい：
【００１４】
【表１】
【００１５】
本発明はまた、治療有効量の上記定義の神経ペプチド２受容体アゴニスト又はその塩と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
【００１６】
本発明の化合物は、例えばＰＹＹ３−３６の短縮型であることが理由で有利である。より短いペプチドは、例えば化合物のより容易な合成及び精製を促進するだけでなく、製造手順を改善しかつ製造支出を減少させる。さらに、本発明の化合物はＹ２受容体と相互作用しかつＮＰＹ Ｙ１、Ｙ４及びＹ５などの相同受容体とは相互作用しないことが好ましい。それにより、望まれないアゴニスト又はアンタゴニストの副反応が最小化される。
【００１７】
本発明が本明細書に記載の本発明の特定の態様に限定されず、特定の態様の変更を行うことができ、それらが依然として添付の特許請求の範囲の範囲内にあるということを理解すべきである。使用される用語は特定の態様を記述するためのものであり、限定的であることを意図していないということも理解すべきである。その代わり、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲により確立される。
【００１８】
本明細書に記載のものと類似又は同等の任意の方法、装置及び材料が本発明の実施又は試験において使用可能であるが、好ましい方法、装置及び材料をここに記載する。
【００１９】
本明細書で言及するすべてのペプチド配列は通常の慣行に従って記述され、したがって特記なき限り、Ｎ末端アミノ酸は左側にあり、Ｃ末端アミノ酸は右側にある。２つのアミノ酸残基間の短い線はペプチド結合を示す。アミノ酸が異性体形態を有する場合、別途明示されない限り表示されるのはアミノ酸のＬ形である。本発明を記述する上での便宜のために、様々なアミノ酸について慣行的及び非慣行的略語を使用する。これらの略語は当業者に公知であるが、明確にするために以下に列挙する：
Ａｓｐ＝Ｄ＝アスパラギン酸；Ａｌａ＝Ａ＝アラニン；Ａｒｇ＝Ｒ＝アルギニン；Ａｓｎ＝Ｎ＝アスパラギン；Ｇｌｙ＝Ｇ＝グリシン；Ｇｌｕ＝Ｅ＝グルタミン酸；Ｇｌｎ＝Ｑ＝グルタミン；Ｈｉｓ＝Ｈ＝ヒスチジン；Ｉｌｅ＝Ｉ＝イソロイシン；Ｌｅｕ＝Ｌ＝ロイシン；Ｌｙｓ＝Ｋ＝リジン；Ｍｅｔ＝Ｍ＝メチオニン；Ｐｈｅ＝Ｆ＝フェニルアラニン；Ｐｒｏ＝Ｐ＝プロリン；Ｓｅｒ＝Ｓ＝セリン；Ｔｈｒ＝Ｔ＝スレオニン；Ｔｒｐ＝Ｗ＝トリプトファン；Ｔｙｒ＝Ｙ＝チロシン；Ｃｙｓ＝Ｃ＝システイン；及びＶａｌ＝Ｖ＝バリン。
【００２０】
修飾Ｔｙｒとは、例えばメチル−チロシン、３−ヨード−チロシン、３，５−ジフルオロ−チロシン、２，６−ジ−フルオロチロシン及び２，６−ジメチル−チロシンなどのチロシンに対する任意の修飾のことである。
【００２１】
修飾Ｐｈｅとは、例えば４−メトキシ−フェニルアラニン、４−アミノ−フェニルアラニン、４−フルオロ−フェニルアラニン、４−ヒドロキシメチル−フェニルアラニン、４−トリフルオロメチル−フェニルアラニン、３−フルオロ−フェニルアラニン、２，３，４，５−ペンタフルオロ−フェニルアラニン及び３，４−ジクロロフェニルアラニンなどのフェニルアラニンに対する任意の修飾のことである。
【００２２】
やはり便宜のために、本発明で使用する部分、試薬などを表すために以下の略語又は記号を使用する：
Ｐｑａは、（４−オキソ−６−ピペラジン−１−イル−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−酢酸であり；
Ｃｂａは、（４−アミノメチル−ビフェニル−３−イル）−酢酸であり；
Ｃｉｐは、（５−ピペラジン−１−イル−インドール−１−イル）−酢酸であり；
ＨｏｍＰｑａは、３−ヒドロキシ−２−（４−オキソ−６−ピペラジン−１−イル−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−プロピオン酸であり；
Ｄｑａは、（６−［１，４］ジアゼパン−１−イル−４−オキソ−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−酢酸であり；
Ｐｄｐは、（６−オキソ−２−ピペラジン−１−イル−１，６−ジヒドロプリン−７−イル）−酢酸であり；
Ｐｐａは、（２−ピペラジン−１−イル−プリン−７−イル）−酢酸であり；
Ａｐｐａは、（６−アミノ−２−ピペラジン−１−イル−９Ｈ−プリン−８−イル）−酢酸であり；
Ｂｑａは、（（１Ｒ，４Ｓ）−６−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−イル−４−オキソ−４Ｈ−キナゾリン）−酢酸であり；
Ｐｉｐａは、（１−オキソ−７−ピペラジン−１−イル−１Ｈ−イソキノリン−２−イル）−酢酸であり；
Ｆｍｏｃは、９−フルオレニルメチルオキシカルボニルであり；
Ｍｔｔは、４−メチルトリチルであり；
２Ｐｉｐは、２−フェニルイソプロピルエステルであり；
Ｐｍｃは、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニルであり；
ＣＨ２Ｃｌ２は、塩化メチレンであり；
Ａｃ２Ｏは、無水酢酸であり；
ＣＨ３ＣＮは、アセトニトリルであり；
ＤＭＡｃは、ジメチルアセトアミドであり；
ＤＭＦは、ジメチルホルムアミドであり；
ＤＩＰＥＡは、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンであり；
ＴＦＡは、トリフルオロ酢酸であり；
ｉＰｒ３ＳｉＨは、トリイソプロピルシランであり；
ＨＯＢＴは、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールであり；
ＤＩＣは、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドであり；
ＢＯＰは、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス−（ジメチルアミノ）ホスホニウム−ヘキサフルオロホスフェートであり；
ＨＢＴＵは、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム−ヘキサフルオロホスフェートであり；
ＮＭＰは、１−メチル ２−ピロリジノンであり；
Ｔｍｏｂは、２，４，６−トリメトキシベンジルであり；
Ｄｏｄは、４，４−ジメトキシジチル、（ビス−（４−メトキシフェニル）−メチル）であり、
Ｔｒｔは、トリチルであり；
Ｍｔｓは、メシチレン−２−スルホニルであり；
ＦＡＢ−ＭＳは、高速原子衝撃イオン化質量分析であり；
ＥＳ−ＭＳは、エレクトロスプレーイオン化質量分析である。
【００２３】
本明細書で使用する「アシル」という用語は、カルボニル基を経由して結合している場合により置換されているアルキル基、シクロアルキル基、複素環基、アリール基又はヘテロアリール基を意味し、アセチル、プロピオニル、ベンゾイル、３−ピリジニルカルボニル、２−モルホリノカルボニル、４−ヒドロキシブタノイル、４−フルオロベンゾイル、２−ナフトイル、２−フェニルアセチル、２−メトキシアセチルなどの基を含む。
【００２４】
本明細書で使用する、単独又は他の基との組み合わせでの「アルキル」という用語は、１〜２０個の炭素原子、好ましくは１〜１６個の炭素原子、より好ましくは１〜１０個の炭素原子の、分岐鎖又は直鎖の、一価の飽和脂肪族炭化水素基を意味する。
【００２５】
「シクロアルキル」という用語は、３〜１０個、好ましくは３〜６個の炭素原子の一価の単炭素環式又は多炭素環式基を意味する。この用語はシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、ボルニル、アダマンチルなどの基によりさらに例示される。好ましい態様では、「シクロアルキル」部分は１個、２個、３個又は４個の置換基で置換されていてもよく、特記なき場合は前記置換基がさらに置換されていることはないと理解される。シクロアルキル部分の例は場合により置換されているシクロプロピル、場合により置換されているシクロブチル、場合により置換されているシクロペンチル、場合により置換されているシクロペンテニル、場合により置換されているシクロヘキシル、場合により置換されているシクロヘキシレン、場合により置換されているシクロヘプチルなど、又は本明細書で具体的に例示されているものを含むがそれに限定されない。
【００２６】
「ヘテロシクロアルキル」という用語は、炭素環原子のうち１個、２個又は３個がＮ、Ｏ又はＳなどのヘテロ原子で置き換えられている単環式又は多環式アルキル環を意味する。ヘテロシクロアルキル基の例はモルホリニル、チオモルホリニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロリジニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル、１，３−ジオキサニルなどを含むがそれに限定されない。ヘテロシクロアルキル基は非置換でも置換でもよく、結合は炭素骨格を通じてでも、適切な場合はそのヘテロ原子を通じてでもよく、前記置換基がさらに置換されていることはないと理解される。
【００２７】
単独又は他の基との組み合わせでの「低級アルキル」という用語は、１〜９個の炭素原子、好ましくは１〜６個の炭素原子の、分岐鎖又は直鎖のアルキル基を意味する。この用語はメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、３−メチルブチル、ｎ−ヘキシル、２−エチルブチルなどの基でさらに例示される。
【００２８】
「アリール」という用語は、少なくとも１個の芳香環を有する６〜１２個の炭素原子の芳香族単炭素環式又は多炭素環式基を意味する。そのような基の例はフェニル、ナフチル、１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン、１，２−ジヒドロナフタレン、インダニル、１Ｈ−インデニルなどを含むがそれに限定されない。
【００２９】
アルキル基、低級アルキル基及びアリール基は置換でも非置換でもよい。置換の場合は、例えば１〜４個の置換基が一般に存在するものであり、特記なき場合は前記置換基がさらに置換されていることはないと理解される。これらの置換基は、それらが接続しているアルキル基、低級アルキル基又はアリール基と共に環を形成してもよい。
【００３０】
「ヘテロアリール」という用語は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１個、２個又は３個の環ヘテロ原子を含有し、残りの環原子がＣである、少なくとも１個の芳香環を有する、５〜１２個の原子の芳香族単環式又は多環式基を意味する。ヘテロアリール基の１個又は２個の環炭素原子をカルボニル基で置き換えてもよい。
【００３１】
先に記載のヘテロアリール基は１個、２個又は３個の置換基で独立して置換されていてもよく、特記なき場合は前記置換基がさらに置換されていることはないと理解される。
【００３２】
式Ｉで示される化合物は、１個又は複数の不斉炭素原子を有することができ、光学的に純粋な鏡像異性体、例えばラセミ体などの鏡像異性体の混合物、光学的に純粋なジアステレオ異性体、ジアステレオ異性体の混合物、ジアステレオ異性体のラセミ体、又はジアステレオ異性体のラセミ体の混合物の形態で存在することができる。光学的に活性な形態は、例えば、ラセミ体の分割、不斉合成、又は不斉クロマトグラフィー（キラル吸着剤もしくは溶離液を用いたクロマトグラフィー）により得ることができる。本発明は、これらの形態のすべてを包含する。
【００３３】
代表的な本化合物は、アミノ酸間のペプチド結合の形成用の任意の公知の慣行的手順によって容易に合成することができる。そのような慣行的手順は、そのカルボキシル基及び他の反応性基が保護された、アミノ酸の遊離αアミノ基又はその残基と、そのアミノ基又は他の反応性基が保護された、別のアミノ酸の遊離一級カルボキシル基又はその残基との間の縮合を可能にする、任意の溶液相手順を例えば含む。
【００３４】
本発明の新規化合物を合成するためのそのような慣行的手順は、任意の固相ペプチド合成法を例えば含む。そのような方法では、固相法の一般的原理に従って成長ペプチド鎖に所望のアミノ酸残基を１つ毎に順次組み入れることで、新規化合物の合成を行うことができる。そのような方法は、参照により本明細書に組み入れられるMerrifield, R. B., J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963); Barany et al., The Peptides, Analysis, Synthesis and Biology, Vol. 2, Gross, E. and Meienhofer, J., Eds. Academic Press 1-284 (1980)に例えば開示されている。
【００３５】
ペプチドの化学合成に共通しているのは、好適な保護基による様々なアミノ酸部分の反応性側鎖基の保護であり、これにより、保護基が最終的に除去されるまで、化学反応がその部位で発生することを防ぐ。通常やはり共通しているのは、アミノ酸又は断片上のαアミノ基の、その実体がカルボキシル基で反応している間の保護、それに続く、後続の反応がその部位で行われるようにするためのαアミノ保護基の選択的除去である。固相合成法に関して具体的な保護基が開示されているが、溶液層合成において各アミノ酸用に慣行的に使用される保護基で各アミノ酸を保護することができるということに留意すべきである。
【００３６】
アリルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ならびにｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、ｐ−ビフェニル−イソプロピルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）及びｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル（Ｍｏｚ）などの置換ベンジルオキシカルボニルなどの芳香族ウレタン型保護基；ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ジイソプロピルメチルオキシカルボニル及びイソプロピルオキシカルボニルなどの脂肪族ウレタン型保護基から選択される好適な保護基でαアミノ基を保護することができる。ここで、Ｆｍｏｃがαアミノ保護に最も好ましい。
【００３７】
グアニジノ基は、ニトロ、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）、（Ｚ）、ペンタメチルクロマンスルホニル（Ｐｍｃ）、４−メトキシ−２，３，６，−トリメチルベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）などの好適な保護基で保護することができ、（Ｐｍｃ）及び（Ｍｔｒ）がアルギニン（Ａｒｇ）について最も好ましい。
【００３８】
εアミノ基は、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−Ｃｌ−Ｚ）、２−ブロモベンジルオキシカルボニル（２−Ｂｒ−Ｚ）及びｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）などの好適な保護基で保護することができる。Ｂｏｃが（Ｌｙｓ）について最も好ましい。
【００３９】
ヒドロキシル基（ＯＨ）は、ベンジル（Ｂｚｌ）、２，６−ジクロロベンジル（２，６−ｄｉＣｌ−Ｂｚｌ）及びtert−ブチル（ｔ−Ｂｕ）などの好適な保護基で保護することができ、（ｔ−Ｂｕ）が（Ｔｙｒ）、（Ｓｅｒ）及び（Ｔｈｒ）について最も好ましい。
【００４０】
Ａｓｎ及びＧｌｎのβ及びγアミド基は、４−メチルトリチル（Ｍｔｔ）、２，４，６−トリメトキシベンジル（Ｔｍｏｂ）、４，４−ジメトキシジチルビス−（４−メトキシフェニル）−メチル（Ｄｏｄ）及びトリチル（Ｔｒｔ）などの好適な保護基で保護することができる。Ｔｒｔが（Ａｓｎ）及び（Ｇｌｎ）について最も好ましい。
【００４１】
インドール基はホルミル（Ｆｏｒ）、メシチル−２−スルホニル（Ｍｔｓ）及びｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）から選択される好適な保護基で保護することができる。Ｂｏｃが（Ｔｒｐ）について最も好ましい。
【００４２】
イミダゾール基はベンジル（Ｂｚｌ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）及びトリチル（Ｔｒｔ）から選択される好適な保護基で保護することができる。Ｔｒｔが（Ｈｉｓ）について最も好ましい。
【００４３】
アミノ酸Ｐｑａの合成は、J. Hutchinson et. al（J .Med. Chem. 1996, 39, 4583-4591）に記載されている。Ｆｍｏｃ−Ｐｑａ誘導体はＮｅｏＭＰＳ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サンジエゴ）から購入した。
【００４４】
｛４’−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−メチル］−ビフェニル−３−イル｝−酢酸（Ｆｍｏｃ−Ｃｂａ−ＯＨ）は、慣行的な手段で、例えば４−ブロモフェニル酢酸メチルエステルと４−ホルミルフェニルボロン酸との間の鈴木カップリング、続いて得られた４’−ホルミルビフェニル酢酸メチルエステルの還元的アミノ化を行ってアミノメチルビフェニル酢酸誘導体を得ることで調製することができる。典型的鈴木カップリングの一例はH. Heitsch, et al, Synthesis 1996, 1325に示されている。還元的アミノ化は、E. Baxter, et al. Organic Reactions 2002, 59, 1-714で概観されている標準的方法を経由して行うことができる。９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル誘導体としてのアミノ基のエステル加水分解及び保護は標準的な変換である。典型的手順は中間体の調製の説明において記載する。
【００４５】
すべての溶媒、すなわちイソプロパノール（ｉＰｒＯＨ）、塩化メチレン（ＣＨ２Ｃｌ２）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）をFisher又はBurdick & Jacksonから購入し、さらに処理せずに使用した。トリフルオロ酢酸をHalocarbon又はFlukaから購入し、さらに精製せずに使用した。
【００４６】
ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）をFluka又はAldrichから購入し、さらに精製せずに使用した。ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）、ジメチルスルフィド（ＤＭＳ）及び１，２−エタンジチオール（ＥＤＴ）をSigma Chemical Co.から購入し、さらに精製せずに使用した。保護アミノ酸は一般にＬ配置のものであり、Bachem又はNeosystemから商業的に得た。これらの試薬の純度を、使用前に薄層クロマトグラフィー、ＮＭＲ及び融点により確認した。ベンズヒドリルアミン樹脂（ＢＨＡ）は、Bachem又はAdvanced Chemtechから得たスチレン−１％ジビニルベンゼンの共重合体（１００〜２００又は２００〜４００メッシュ）であった。これらの樹脂の全窒素含有量は一般に０．３〜１．２meq/gであった。
【００４７】
好ましい態様では、Merrifield,（J. Amer. Chem. Soc., 85, 2149 (1963)）に一般に記載の方法により固相合成を用いてペプチドを調製したが、当業者に公知の他の同等の化学合成を先に言及したように使用する可能性がある。保護αアミノ酸を好適な樹脂にカップリングすることで、ペプチドのＣ末端から固相合成を開始する。そのような出発原料は、αアミノ保護アミノ酸をエステル結合によりｐ−ベンジルオキシベンジルアルコール（Ｗａｎｇ）樹脂に結合させるか、又はｐ−（（Ｒ，Ｓ）−α−（１−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）−メトキシホルムアミド）−２，４−ジメチルオキシベンジル）−フェノキシ酢酸（Ｒｉｎｋリンカー）などのＦｍｏｃリンカーとベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂との間のアミド結合により調製することができる。ヒドロキシメチル樹脂の調製は当技術分野で周知である。Ｆｍｏｃリンカー−ＢＨＡ樹脂支持体は市販されており、合成される所望のペプチドがＣ末端で非置換アミドを有する場合に一般に使用される。
【００４８】
典型的には、アミノ酸又は模倣体のＦｍｏｃリンカー−ＢＨＡ樹脂上に対するカップリングを、アミノ酸又は模倣体のＦｍｏｃ保護形態を用い、アミノ酸２〜５当量及び好適なカップリング試薬によって行う。カップリング後、樹脂を洗浄し、減圧乾燥させることができる。樹脂上に対するアミノ酸の結合は、Ｆｍｏｃ−アミノ酸樹脂のアリコートのアミノ酸分析、又はＵＶ分析によるＦｍｏｃ基の決定により決定することができる。樹脂を塩化メチレン中の無水酢酸及びジイソプロピルエチルアミンと反応させることで任意の未反応アミノ基を封止することができる。
【００４９】
αアミノＦｍｏｃ保護基を塩基性条件下で除去する。ＤＭＦ中ピペリジン、ピペラジン又はモルホリン（２０〜４０％ 体積／体積）をこの目的のために使用することができる。ＤＭＦ中４０％ピペリジンを使用することが好ましい。
【００５０】
αアミノ保護基の除去後、引き続き保護アミノ酸を所望の順序で段階的にカップリングして中間体の保護ペプチド樹脂を得る。ペプチドの固相合成におけるアミノ酸のカップリングに使用する活性化試薬は当技術分野で周知である。例えば、そのような合成に適切な試薬はベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリ−（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、ブロモ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｒｏＰ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）及びジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）である。ＨＢＴＵ及びＤＩＣが好ましい。他の活性化剤はBarany and Merrifield（The Peptides, Vol. 2, J. Meienhofer, ed., Academic Press, 1979, pp 1-284所収）に記載されており、これらを使用することができる。１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）及び３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＢＴ）などの各種試薬をカップリング混合物に加えることで、合成サイクルを最適化することができる。ここでＨＯＢＴが好ましい。
【００５１】
Ｎ末端アセチル誘導体の調製のために、５％ ＤＩＥＡを有するＤＭＦ中２０％無水酢酸で樹脂結合ペプチドを処理することでアセチル化を行った。他のＮ末端アシル化について、ＤＩＣ／ＨＯＢｔによりインサイチューで３０分間活性化した対応するカルボン酸を使用してアシル化を行った。
【００５２】
典型的合成サイクルのプロトコールは以下の通りである。
プロトコール１
【００５３】
【表２】
【００５４】
すべての洗浄及びカップリング用の溶媒を１０〜２０ml/g樹脂の量になるように測量した。合成を通じてのカップリング反応をKaiserニンヒドリン試験でモニタリングして、完了の程度を決定した（Kaiser et at. Anal.Biochem.34, 595-598 (1970)）。緩徐な反応動態がＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）について及び立体障害性の酸による二級アミンに対するカップリングについて観察された。任意の不完全なカップリング反応は、新たに調製した活性化アミノ酸と再カップリングしたか、又は先に記載のようにペプチド樹脂を無水酢酸で処理することで封止した。完全に構築したペプチド樹脂を数時間減圧乾燥させた。
【００５５】
大部分の化合物について、ブロッキング基を除去し、ペプチドを樹脂から切断した。例えば、ペプチド樹脂を樹脂１グラム当たりエタンジチオール１００μL、ジメチルスルフィド１００μl、アニソール３００μL及びトリフルオロ酢酸９．５mLにて室温で１８０分間処理した。あるいは、ペプチド樹脂を樹脂１グラム当たりトリイソプロピルシラン１．０mL及びトリフルオロ酢酸９．５mLにて室温で１８０分間処理した。樹脂を濾去し、濾液を冷却エチルエーテル中で析出させた。析出物を遠心分離し、エーテル層をデカントした。残渣を２又は３体積のＥｔ２Ｏで洗浄し、再遠心分離した。粗生成物を減圧乾燥させた。
【００５６】
粗ペプチドの精製を、Shimadzu ＬＣ−８Ａシステム上で、逆相Ｃ−１８カラム（５０ｘ２５０mm、３００Å、１０〜１５μm）上の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により好ましく行った。ペプチドをカラムに対して最小量の０．１ ＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ又はＣＨ３ＣＨ／Ｈ２Ｏ中に注入した。グラジエント溶出を２％ Ｂ緩衝液で一般に開始し、２％〜７０％のＢで７０分間にかけて（緩衝液Ａ：０．１％ ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、緩衝液Ｂ：０．１％ ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）、５０ml／分の流量で行った。ＵＶ検出を２２０／２８０nmで行った。生成物を含有する画分を分離し、その純度をShimadzu ＬＣ−１０ＡＴ分析システム上で逆相Ａｃｅ Ｃ１８カラム（４．６ｘ５０mm）を用いて流量２ml／分、１０分間にわたるグラジエント（２〜７０％）（緩衝液Ａ：０．１％ ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、緩衝液Ｂ：０．１％ ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）で判定した。高純度を有すると判定された画分をプールし、凍結乾燥させた。
【００５７】
先に述べたように、最終生成物の純度を分析用ＨＰＬＣにより逆相カラム上で点検した。全生成物の純度は約９５〜９９％と判定された。また、すべての最終生成物を高速原子衝撃質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）又はエレクトロスプレー質量分析（ＥＳ−ＭＳ）に供した。すべての生成物は許容される範囲内の予想される親Ｍ＋Ｈイオンを生成した。
【００５８】
本発明の化合物を薬学的に許容される塩の形態で与えることができる。好適な塩の例は、薬学的に許容される有機酸、例えば酢酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸又はパモ酸、及びタンニン酸又はカルボキシメチルセルロースなどのポリマー酸と形成されるもの、ならびにハロゲン化水素酸（例えば塩酸）、硫酸又はリン酸などの無機酸と形成される塩である。当業者に公知である薬学的に許容される塩を得るための任意の手順を使用することができる。
【００５９】
本発明の方法の実施において、有効量の本発明のペプチドのいずれか１つもしくは本発明のペプチドのいずれかの組み合わせ、又はその薬学的に許容される塩を、単独又は組み合わせでの当技術分野で公知の通常かつ許容される方法を経由して投与する。投与は、例えば１日１回、３日に１回又は週１回であり得る。したがって、化合物又は組成物を、経口的に（例えば頬側口腔）、舌下に、非経口的に（例えば筋肉内、静脈内もしくは皮下に）、直腸に（例えば坐薬もしくは洗液で）、経皮的に（例えば皮膚電気穿孔）、又は吸入により（例えばエアロゾルにより）、錠剤及び懸濁液剤を含む固体、液体又は気体剤形の形態で投与することができる。投与は、単一単位剤形で連続療法により、又は単一用量療法で自由に、行うことができる。また、治療用組成物は、パモ酸などの親油性塩との組み合わせでの油乳濁液もしくは分散液の形態、又は皮下もしくは筋肉内投与用の生分解性持続放出組成物の形態であり得る。
【００６０】
したがって、本発明の方法は、症状の軽減が特に必要であるかおそらくは緊急である場合に実施される。あるいは、本発明の方法は連続治療又は予防治療として有効に実施される。
【００６１】
本明細書の組成物の調製用の有用な薬学的担体は、固体、液体又は気体であり得るものであり、したがって組成物は錠剤、丸剤、カプセル剤、坐薬、散剤、腸溶コーティング製剤又は他の保護製剤（例えばイオン交換樹脂上に結合もしくは脂質−タンパク質ベシクル中に包装）、持続放出製剤、溶液剤、懸濁液剤、エリキシル剤、エアロゾル剤などの形態を取り得る。担体は石油、動物、植物又は合成起源のものを含む各種の油、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などから選択することができる。水、食塩水、ブドウ糖水溶液及びグリコールが、特に（血液と等張性の場合）注射液剤について好ましい液体担体である。例えば、静脈内投与用製剤は、固体有効成分を水に溶解させて水溶液を生成し、溶液を滅菌することで調製される、有効成分の滅菌水溶液を含む。好適な薬学的賦形剤はデンプン、セルロース、タルク、グルコース、乳糖、タルク、ゼラチン、麦芽、イネ、小麦粉、チョーク、シリカ、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどを含む。組成物を防腐剤、安定剤、湿潤剤又は乳化剤、浸透圧を調整するための塩、緩衝剤などの慣行的な薬学的添加剤に供することができる。好適な薬学的担体及びその調合はE. W. MartinのRemington's Pharmaceutical Sciencesに記載されている。いずれにせよ、そのような組成物は、有効量の活性化合物を、レシピエントに対する適切な投与のために適切な剤形を調製するために好適な担体と共に含有する。
【００６２】
本発明の化合物の用量は、例えば投与様式、対象の年齢及び体重、ならびに処置される対象の状態などのいくつかの要因に依存するものであり、担当の医師又は獣医師により最終的に決定される。担当の医師又は獣医師により決定される活性化合物のそのような量を本明細書及び特許請求の範囲では「有効量」と呼ぶ。例えば、鼻腔内投与の用量は、典型的には約０．００１〜約０．１mg/kg体重の範囲である。ヒトでは、ペプチド含有量に基づく好ましい皮下用量は約０．００１mg〜約１００mg、好ましくは約０．１mg〜約１５mgである。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
ここで限定を行う性質を有さない以下の実施例により本発明を説明する。
【００６４】
実施例
中間体の調製
【００６５】
中間体１の調製
実施例６で使用する中間体（４−（１−カルボキシメチル−１Ｈ−インドール−５−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル（Ｆｍｏｃ−Ｃｉｐ−ＯＨ）を以下のように調製した。
【００６６】
【化１】
【００６７】
工程１：
１−（３−メチル−４−ニトロ−フェニル）−ピペラジンの調製
【００６８】
【化２】
【００６９】
ピペラジン（８６．１４g）及びジメチルホルムアミド（１５０mL）を１１０℃で攪拌して溶解させた。この時点でジメチルホルムアミド１０mLに溶解した４−フルオロ−２−メチル−１−ニトロ−ベンゼン（１００mL）の溶液を３分かけて加え、次に１００℃で３０分間攪拌した。この時点で砕氷及び水（７００mL）を反応混合物に加え、得られた黄色固体を濾去した。濾液を水３００mLで洗浄し、次に真空オーブン中で乾燥させた。このようにして固体１９．４０gを得た。Ｈ１−ＮＭＲ分光測定は１−（３−メチル−４−ニトロ−フェニル）−ピペラジンと一致したスペクトルを示した。
【００７０】
工程２：
４−（３−メチル−４−ニトロ−フェニル）−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルの調製
【００７１】
【化３】
【００７２】
１−（３−メチル−４−ニトロ−フェニル）−ピペラジン（１９．４０g）及び４−ジメチルアミノピリジン（０．２０グラム）をテトラヒドロフラン２００mL中にて室温で攪拌して溶解させた。次に炭酸ジ−tert−ブチルエステル（Ｂｏｃ）２Ｏ ９６．４５gを１回で加えた。この混合物を室温で１時間攪拌した。この時点で反応混合物を蒸発乾固させ、得られた黄色固体を水４００mLに１５分間懸濁させた後、濾過し、固体を水で洗浄した。濾過後に残留する固体を減圧乾燥させて２７．９gを得た。Ｈ１−ＮＭＲ分光測定は４−（３−メチル−４−ニトロ−フェニル）−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルと一致したスペクトルを示した。
【００７３】
工程３：
４−［４−ニトロ−３−（（Ｅ）−２−ピロリジン−１−イル−ビニル）−フェニル］−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルの調製
【００７４】
【化４】
【００７５】
４−（３−メチル−４−ニトロ−フェニル）−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル（２７．９g）をＤＭＦ ５０mLに溶解させ、この溶液にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジメチルアセタール（ＤＭＦ−ＤＭＡ）を加え、次に混合物を１００℃にて１８時間加熱した。この時点で混合物を水で希釈し、水層を酢酸エチルで抽出した。有機層を水で４回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過した。濾液を減圧濃縮して赤色油状物を得た。この油状物をジエチルエーテル及びヘキサンの混合物で粉砕して所期の生成物３１．３１gを得た。Ｈ１−ＮＭＲ分光測定は４−［４−ニトロ−３−（（Ｅ）−２−ピロリジン−１−イル−ビニル）−フェニル］−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルと一致したスペクトルを示した。
【００７６】
工程４：
４−（１Ｈ−インドール−５−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルの調製
【００７７】
【化５】
【００７８】
４−［４−ニトロ−３−（（Ｅ）−２−ピロリジン−１−イル−ビニル）−フェニル］−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルを窒素雰囲気下、メタノール５０mL中にて室温で攪拌した。この混合物にラネーニッケル１．５mL、続いてヒドラジン２．３５gを加えた。この混合物を１５分間攪拌した。この時点でヒドラジンをさらに１．１７g加え、混合物を終夜攪拌した。次に、反応混合物をセライト濾過し、濾液を減圧濃縮した。残渣をジエチルエーテル及び水の混合物中に分配した。有機層を分離し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、等量のヘキサンで希釈し、１：１（体積／体積）ジエチルエーテル／ヘキサンで溶出するシリカゲルプラグを通じて濾過した。濾液の減圧濃縮により得た固体をジエチルエーテル／ヘキサンの混合物で粉砕した。これによりオフホワイト固体３．３３gを得た。Ｈ１−ＮＭＲ分光測定は４−（１Ｈ−インドール−５−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルと一致したスペクトルを示した。
【００７９】
工程５：
４−（１−tert−ブトキシカルボニルメチル−１Ｈ−インドール−５−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルの調製
【００８０】
【化６】
【００８１】
４−（１Ｈ−インドール−５−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル（８．５０g）をＤＭＦ ７０mL中で攪拌し、氷／水浴で冷却した。この混合物に水素化ナトリウム（鉱油中６０％懸濁液１．３５g）を少しずつ加えた。添加が完了した後、混合物を０℃で３０分間攪拌し、その後ブロモ酢酸tert−ブチルエステル７．１５gを加えた。反応混合物を２時間攪拌しながら室温に到達させた。この時点でブラインを混合物に加え、酢酸エチルを有機可溶性成分の抽出に使用した。有機層を水で４回洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過した。濾液を減圧濃縮して得た帯赤色油状物をヘキサン７０mlに溶解させた。３日間の静置により析出物を形成した。濾過及び析出物のペンタンによる洗浄後、固体を乾燥させた。このようにして所望の生成物８．８５gを得た。Ｈ１−ＮＭＲ分光測定は４−（１−tert−ブトキシカルボニルメチル−１Ｈ−インドール−５−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルと一致したスペクトルを示した。
【００８２】
工程６：
（５−ピペラジン−１−イル−インドール−１−イル）−酢酸の調製
【００８３】
【化７】
【００８４】
４−（１−tert−ブトキシカルボニルメチル−１Ｈ−インドール−５−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル（８．８０g）をＴＦＡ ６０mLの塩化メチレン１２０mL中混合物により室温で終夜処理した。この時点で溶媒を減圧除去した。これにより淡黄色残渣１１．２６gを得た。この残渣をさらに精製せずに次の工程で使用した。
【００８５】
工程７：
４−（１−カルボキシメチル−１Ｈ−インドール−５−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステルの調製
【００８６】
【化８】
【００８７】
前回の工程で得た残渣の一部に炭酸カリウム６．６５gならびにジオキサン及び水各２０mLを加えた。この混合物にクロロギ酸９−フルオレニルメチルエステル（２．４９g）を少しずつ加えた。次にこの混合物を１時間攪拌した後、水で希釈した。酢酸を使用して反応混合物を酸性化した。次に混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を減圧濃縮した。酢酸エチル除去により残留した残渣を、酢酸エチル、続いて塩化メチレン中１０％メタノール（体積／体積）で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーを通じて濾過した。次に、合わせた画分を、炭酸カリウム５gを含有する水３００mLで処理し、この混合物をジエチルエーテルで２回抽出した。エーテル層を廃棄し、水層を酢酸で酸性化した。これにより形成された白色固体を濾取した。固体を水で洗浄し、真空オーブン中にて五酸化リンで乾燥させた。このようにして生成物１．７１gを得た。Ｈ１−ＮＭＲ質量分析技術は４−（１−カルボキシメチル−１Ｈ−インドール−５−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステルと一致したスペクトルを示した。
【００８８】
中間体２の調製
実施例７で使用する中間体４−［３−（１−カルボキシ−２−ヒドロキシ−エチル）−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル］−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル（Ｆｍｏｃ−ＨｍｏＰｑａ−ＯＨ）を以下のように調製した。
【００８９】
【化９】
【００９０】
工程１：
２−ニトロ−５−ピペラジン−１−イル−安息香酸の調製
【００９１】
【化１０】
【００９２】
５−クロロ−２−ニトロ−安息香酸（４４g）及びピペリジン（９０g、４．８当量）を無溶媒で混合し、１１０℃で６時間加熱した後、室温で終夜攪拌した。この時点で混合物は固体化した。この固体に１０％ ＫＨＳＯ４（重量／体積、ｐＨ４〜５）水溶液を加え、混合物を超音波処理した。上清をデカントし、新たな１０％ ＫＨＳＯ４（重量／体積）水溶液を加えた。このようにして１０％ ＫＨＳＯ４（重量／体積）水溶液合計１．８リットルを加え、デカントした。室温で攪拌後、固体を濾過し、水ですすいだ。残留固体を真空オーブン中で乾燥させて黄橙色固体（５３．１g）を得た。この材料をさらに精製せずに次の工程に回した。
【００９３】
工程２：
４−（３−カルボキシ−４−ニトロ−フェニル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステルの調製
【００９４】
【化１１】
【００９５】
前回の反応からの固体（１５g）を１０％ ＮａＨＣＯ３（重量／体積）水溶液（１５０mL）及びジオキサン（１２０mL）に懸濁させた。反応混合物を０℃に冷却し、この懸濁液に４０分間かけてクロロギ酸９−フルオレニルメチルエステル（１４．７４g）のジオキサン（７０mL）溶液を加えた。反応混合物を室温に到達させ、終夜攪拌した。この時点で水及び酢酸エチルを反応混合物に加え、相を分離した。水相を分離した後、濃塩酸でｐＨ３〜４に酸性化した。析出した固体を濾過し、水で洗浄した後、真空オーブン中で乾燥させた。このようにして固体１７．８６gを得た。Ｈ１−ＮＭＲ分光測定は４−（３−カルボキシ−４−ニトロ−フェニル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステルと一致したスペクトルを示した。
【００９６】
工程３：
４−［３−（２−tert−ブトキシ−１−tert−ブトキシカルボニル−エチルカルバモイル）−４−ニトロ−フェニル］−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステルの調製
【００９７】
【化１２】
【００９８】
４−（３−カルボキシ−４−ニトロ−フェニル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル（１６．８g）及びＯ−tert−ブチル−Ｌ−セリンtert−ブチルエステル塩酸塩（９．０g）の塩化メチレン懸濁液にＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール３５．５mmolを加え、反応混合物を０℃に冷却した。この懸濁液にトリエチルアミン（１０．４mL）を加えた。これにより懸濁液は溶液になった。この時点で１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（７．５g）を加えた。反応混合物を０℃で１時間、次に室温で２日間攪拌した。この時点で塩化メチレンを減圧除去し、酢酸エチルを加えて固体を形成した。酢酸エチルを蒸発させ、塩化メチレンを加えた。この有機層を１０％ ＫＨＳＯ４（重量／体積）水溶液及びブラインで洗浄した後、５％ ＮａＨＣＯ３（重量／体積）水溶液で洗浄し、最後に再度ブラインで洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固させて固体を得た。この固体を熱酢酸エチル（約２L）で粉砕した。これは固体の大部分を溶解させた。得られた溶液を硫酸マグネシウムで再度乾燥させ、濾過し、蒸発乾固させて得た橙色油状物を室温への冷却により凝固した。この固体をジエチルエーテルにより室温で攪拌しながら粉砕した。濾過及びペンタンでの洗浄により固体２０gを得た。Ｈ１−ＮＭＲ分光測定は４−（３−カルボキシ−４−ニトロ−フェニル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イル−メチルエステルと一致したスペクトルを示した。
【００９９】
工程４：
３−tert−ブトキシ−２−（２−ニトロ−５−ピペラジン−１−イル−ベンゾイルアミノ）−プロピオン酸tert−ブチルエステルの調製
【０１００】
【化１３】
【０１０１】
ジメチルホルムアミド（１８０mL）を使用して４−（３−カルボキシ−４−ニトロ−フェニル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル（１７g）を溶解させ、この溶液にジエチルアミン（１８mL）を加えた。この混合物を室温で１５分間攪拌した。この時点で水及び酢酸エチルを加えた。有機相を分離し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧濃縮した。残渣をジエチルエーテルにより室温で粉砕し、固体を濾過し、ペンタンで洗浄した。これにより固体７．２９gを得た。Ｈ１−ＮＭＲ分光測定は３−tert−ブトキシ−２−（２−ニトロ−５−ピペラジン−１−イル−ベンゾイルアミノ）−プロピオン酸tert−ブチルエステルと一致したスペクトルを示した。
【０１０２】
工程５：
４−［３−（２−tert−ブトキシ−１−tert−ブトキシカルボニル−エチルカルバモイル）−４−ニトロ−フェニル］−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルの調製
【０１０３】
【化１４】
【０１０４】
３−tert−ブトキシ−２−（２−ニトロ−５−ピペラジン−１−イル−ベンゾイルアミノ）−プロピオン酸tert−ブチルエステル（８．５９g）をテトラヒドロフラン（１５０mL）に溶解させ、ジ−tert−ブチルジカルボナート（４．５６g）及び４−ジメチルアミノピリジン（２３０mg）を室温で加えた。反応混合物を室温で２時間攪拌した。この時点で溶媒を減圧除去し、残渣を水及び酢酸エチルに溶解させた。合わせた有機相を１０％ ＫＨＳＯ４（重量／体積）水溶液、水で洗浄した後、５％ ＮａＨＣＯ３（重量／体積）水溶液で洗浄し、最後にブラインで洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させて少量にした。ペンタンの添加により固体析出物を形成した。固体を濾過し、真空オーブン中で乾燥させた。このようにして固体９．６gを得た。Ｈ１−ＮＭＲ分光測定は４−［３−（２−tert−ブトキシ−１−tert−ブトキシカルボニル−エチルカルバモイル）−４−ニトロ−フェニル］−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルと一致したスペクトルを示した。
【０１０５】
工程６：
４−［４−アミノ−３−（２−tert−ブトキシ−１−tert−ブトキシカルボニル−エチルカルバモイル）−フェニル］−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルの調製
【０１０６】
【化１５】
【０１０７】
４−［３−（２−tert−ブトキシ−１−tert−ブトキシカルボニル−エチルカルバモイル）−４−ニトロ−フェニル］−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル（１０g）をメタノール２５０mLに溶解させた。この溶液を窒素雰囲気下、１０％（重量／重量）パラジウム炭素触媒１．２gで処理した。次に混合物を脱気した後、水素ガス１気圧下室温で約２．５時間攪拌した。この時点で反応混合物をセライト濾過し、大量のメタノールで洗浄した。濃色濾液を減圧濃縮し、残渣を五酸化リンでさらに乾燥させた。このようにして所期の生成物９．４９gを灰紫色固体として得た。Ｈ１−ＮＭＲ分光測定は４−［４−アミノ−３−（２−tert−ブトキシ−１−tert−ブトキシカルボニル−エチルカルバモイル）−フェニル］−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルと一致したスペクトルを示した。
【０１０８】
工程7：
４−［３−（２−tert−ブトキシ−１−tert−ブトキシカルボニル−エチル）−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル］−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルの調製
【０１０９】
【化１６】
【０１１０】
４−［４−アミノ−３−（２−tert−ブトキシ−１−tert−ブトキシカルボニル−エチルカルバモイル）−フェニル］−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル（８．７g）をホルムアミジン酢酸塩４．６３gに溶解させ、この混合物を１００〜１１５℃に４０分間加熱した。その時点で反応混合物を室温に冷却し、混合物を減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル及び水中に溶解させた。有機相を分離し、ブラインで洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過及び濾液の減圧濃縮により紫色残渣を得た。酢酸エチル：ヘキサンのステップグラジエント（２０％、３０％、３５％）で溶出するフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ２００g）によりこの残渣を精製した。適切な画分の回収及び溶媒の減圧除去の後、得られた残渣をペンタンで処理し、再度蒸発させた。真空オーブン中で残渣を乾燥させた後、淡色泡状物５．７gを得た。Ｈ１−ＮＭＲ分光測定は４−［３−（２−tert−ブトキシ−１−tert−ブトキシカルボニル−エチル）−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル］−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルと一致したスペクトルを示した。
【０１１１】
工程８：
３−ヒドロキシ−２−（４−オキソ−６−ピペラジン−１−イル−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−プロピオン酸の調製
【０１１２】
【化１７】
【０１１３】
４−［３−（２−tert−ブトキシ−１−tert−ブトキシカルボニル−エチル）−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル］−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル（４．７g）をアニソール（８mL）に溶解させ、氷水浴中で冷却した。トリフルオロ酢酸（８０mL）をゆっくりと加えた。混合物を氷水浴で冷却しながら５分間攪拌した後、室温で５時間攪拌し、この時間のあいだに反応混合物の色は橙色から赤色、紫色、濃青色に経時的に変化した。この時点で反応溶媒を減圧除去して青色油状物を得た。この油状物を乾燥ジエチルエーテルで粉砕し、蒸発乾固させた。残渣を乾燥ジエチルエーテルで再度粉砕し、この溶媒と共に終夜攪拌した。この時点で混合物を濾過し、得られた固体をジエチルエーテルで洗浄し、真空オーブン中で乾燥させて固体４．４gを得た。この固体をさらに精製せずに次の工程で使用した。Ｈ１−ＮＭＲ分光測定は３−ヒドロキシ−２−（４−オキソ−６−ピペラジン−１−イル−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−プロピオン酸と一致したスペクトルを示した。
【０１１４】
工程９：
４−［３−（１−カルボキシ−２−ヒドロキシ−エチル）−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル］−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステルの調製
【０１１５】
【化１８】
【０１１６】
３−ヒドロキシ−２−（４−オキソ−６−ピペラジン−１−イル−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−プロピオン酸（８．８５mmol）を１０％（重量／体積）炭酸水素ナトリウム水溶液に溶解させ、氷浴中に冷却した。ジオキサン３０mLに溶解した炭酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル２．９６gの溶液を０．５時間かけて滴下した。次に混合物を０℃で１時間、次に室温で４時間攪拌した。薄層クロマトグラフィーは反応が４時間の時点で完了したことを示したが、攪拌を終夜続けた。この時点で反応混合物を水で希釈し、酢酸エチルで２回抽出した。水相を０℃に冷却し、２N ＨＣｌ水溶液でｐＨ３に酸性化した。酸性化した水相を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過後、固体が析出し始めるまで濾液を減圧濃縮した。このようにして固体２．４gを得た。濾液のさらなる濃縮により第２の析出物（０．９６g）を得た。濾液にジエチルエーテルを加えることで第３の画分を得た（１．１５g）。合わせた材料の量は４．５３gであった。Ｈ１−ＮＭＲ分光測定は４−［３−（１−カルボキシ−２−ヒドロキシ−エチル）−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル］−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステルと一致したスペクトルを示した。
【０１１７】
中間体３の調製
実施例８で使用する中間体４−（３−カルボキシメチル−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル）−［１，４］ジアゼパン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル（Ｆｍｏｃ−Ｄｑａ−ＯＨ）を以下のように調製した。
【０１１８】
【化１９】
【０１１９】
工程１：
５−［１，４］ジアゼパン−１−イル−２−ニトロ−安息香酸の調製
【０１２０】
【化２０】
【０１２１】
５−クロロ−２−ニトロ−安息香酸（４２．３g）及びホモピペリジン（１００g、４．８当量）を無溶媒で混合し、１１０℃で加熱した。１０分後、混合物を溶融させて橙色の濃厚溶液を得た。４５分の全反応時間後、混合物は濃黒褐色になり、非常に濃厚になった。この時点で混合物を室温に冷却し、１０％ ＫＨＳＯ４（重量／体積）水溶液（ｐＨ４）で希釈した。この混合物を室温で約１時間攪拌した後、濾過した。固体をヘキサン及びジエチルエーテルの混合物、ジエチルエーテル、次にヘキサンですすいだ。次に固体を減圧乾燥させた。これにより濃褐色固体４０．８g（７３％）を得た。化合物をさらに分析又は精製せずに次の工程に回した。
【０１２２】
工程２：
４−（３−カルボキシ−４−ニトロ−フェニル）−［１，４］−ジアゼパン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルの調製
【０１２３】
【化２１】
【０１２４】
５−［１，４］ジアゼパン−１−イル−２−ニトロ−安息香酸（４０．８g）を１N ＮａＯＨ溶液６９３mLに溶解させて濃褐色溶液を得た。この溶液にジオキサン１０００mLを加えた。この混合物を０℃に１時間冷却した後、（Ｂｏｃ）２Ｏ（５３．８g、１．６当量）を加えた。反応混合物を終夜攪拌しながら室温にした。この時点で溶媒を減圧除去した。残渣を水２L中に溶解させた。未溶解の固体を濾去した。水性濾液を１０％ ＫＨＳＯ４水溶液でｐＨ３に酸性化した。析出した固体を濾去し、水ですすいだ。依然として湿潤しているが、固体を酢酸エチル（約３L）で粉砕した。上記酢酸エチル濾液を１０％ ＫＨＳＯ４及びブラインで洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過及び濃縮により析出物が形成され始めた。この析出物を濾過し、ジエチルエーテル及びペンタンですすいだ。このようにして淡褐色固体２４６g（４６％）を得た。
【０１２５】
工程３：
４−［３−（メトキシカルボニルメチル−アミノカルボニル）−４−ニトロ−フェニル］−［１，４］ジアゼパン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルの調製
【０１２６】
【化２２】
【０１２７】
４−（３−カルボキシ−４−ニトロ−フェニル）−［１，４］−ジアゼパン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル（３７．２７g、１０２mmol）及びグリシンメチルエステル塩酸塩１０７．１mmolを塩化メチレンに懸濁させた。この懸濁液にＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール１０２mmolを加え、混合物を氷水浴で冷却した。トリエチルアミン（２１４mmol）を加え、溶解させた。この時点で１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩１．１当量を加えた。この混合物を０℃で１時間、次に室温で３日間攪拌した。この時点で薄層クロマトグラフィーは４−［３−（カルボキシメチル−アミノカルボニル）−４−ニトロ−フェニル］−［１，４］ジアゼパン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルの存在を示した。グリシンメチルエステル塩酸塩及びＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールさらに各５．１mmolならびにトリエチルアミン１０．３mmolを加えた。反応混合物を室温でさらに２４時間攪拌した。この時点で反応混合物を塩化メチレンで希釈し、水、１０％（重量／体積）ＫＨＳＯ４溶液、再度水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、再度水、最後にブラインで洗浄した。塩化メチレン溶液を減圧下で濃縮乾固させて濃褐色油状物を得た。油状物をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製した。すなわち、カラムに塩化メチレン溶液を装入した後、酢酸エチル：ヘキサン（７：３）、最後に酢酸エチルで溶出した。このようにして、画分を回収し、減圧濃縮して４−［３−（メトキシカルボニルメチル−アミノカルボニル）−４−ニトロ−フェニル］−［１，４］ジアゼパン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル４２．０５g（９４．４％）を得た。
【０１２８】
工程４：
４−［４−アミノ−３−（メトキシカルボニルメチル−アミノカルボニル）−フェニル］−［１，４］ジアゼパン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルの調製
【０１２９】
【化２３】
【０１３０】
４−［３−（メトキシカルボニルメチル−アミノカルボニル）−４−ニトロ−フェニル］−［１，４］ジアゼパン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル（３８．４g）をメタノールに溶解させ、炭素上１０％（重量／重量）パラジウム触媒４gを水（１０００mL）と共に窒素雰囲気下で加えた。次に混合物を脱気した後、水素ガス１気圧下室温で約８時間攪拌した。この時点で反応混合物をセライト濾過し、大量のメタノールで洗浄した。濾液を減圧濃縮した。残渣にアセトニトリルを加えた後、溶媒を蒸発させた。４−［４−アミノ−３−（メトキシカルボニルメチル−アミノカルボニル）−フェニル］−［１，４］ジアゼパン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルを濃緑色油状物３４．０５g（９５％）として得た。
【０１３１】
工程５：
４−（３−メトキシカルボニルメチル−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル）−［１，４］ジアゼパン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルの調製
【０１３２】
【化２４】
【０１３３】
４−［４−アミノ−３−（メトキシカルボニルメチル−カルバモイル）−フェニル］−［１，４］ジアゼパン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル（３０．６g）をオルトギ酸トリエチル３７５mLにより１２５℃で１８時間攪拌しながら処理した。この時点で反応混合物を減圧濃縮し、得られた残渣を酢酸エチル及び水中に溶解した。有機相を１０％ＫＨＳＯ４水溶液で３回、水で１回、ブラインで１回洗浄した。次に有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過した。濾液を減圧濃縮した。ヘキサン中６０％〜７０％酢酸エチルで溶出するフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ５００g）により生成物を精製した。適切な画分を回収し、蒸発乾固させた。得られた残渣をジエチルエーテルに溶解させ、再蒸発させ、この溶解及び再蒸発をペンタンを使用して繰り返した。泡状物として得られたすべての固体をプールして全収量１５．５６gの４−（３−メトキシカルボニルメチル−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル）−［１，４］ジアゼパン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルを得た。
【０１３４】
工程６：
４−（３−カルボキシメチル−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル）−［１，４］ジアゼパン−１−カルボン酸tert−ブチルエステルの調製
【０１３５】
【化２５】
【０１３６】
４−（３−メトキシカルボニルメチル−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル）−［１，４］ジアゼパン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル（１１．４g）をテトラヒドロフラン１４０mL及び水５０mLに溶解させた。水９０mlに溶解した水酸化リチウム一水和物２．３gをこの混合物に滴下した。この混合物を室温で終夜攪拌した。この時点で反応混合物を減圧濃縮した。水を加え、混合物を氷浴で冷却した。反応混合物を１０％ ＫＨＳＯ４（重量／体積）水溶液の添加によりｐＨ４に酸性化して得た析出物を濾過し、水で洗浄した。真空オーブン中で乾燥させた後、固体７．５gを得た。得られた濾液を減圧濃縮し、ペンタンで粉砕した。これにより固体２．５gを得た。固体を合わせて４−（３−カルボキシメチル−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル）−［１，４］ジアゼパン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル１０gを得た。
【０１３７】
工程７：
（４−オキソ−６−ピペラジン−１−イル−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−酢酸塩酸塩の調製
【０１３８】
【化２６】
【０１３９】
４−（３−カルボキシメチル−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル）−［１，４］ジアゼパン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル（９．８g）をジオキサン２０mLに懸濁させた。この懸濁液に４N ＨＣｌ／ジオキサン溶液（１００mL）及びジオキサン２０mLを加え、混合物を室温で３時間攪拌した。この時点で反応混合物の減圧濃縮により溶媒を除去し、残渣にテトラヒドロフランを加えた。混合物を再度減圧濃縮した。残渣を乾燥ジエチルエーテルで粉砕し、濾過し、乾燥ジエチルエーテルで洗浄した。このようにして固体１４．７４gを得た。この固体をさらに精製せずに使用した。
【０１４０】
工程８：
４−（３−カルボキシメチル−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル）−［１，４］ジアゼパン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステルの調製
【０１４１】
【化２７】
【０１４２】
前回の工程で得た粗材料（４−オキソ−６−ピペラジン−１−イル−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−酢酸塩酸塩は１０％（重量／体積）炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ９．５）に溶解させ、氷浴中に冷却した。ジオキサン６０mLに溶解した炭酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル８．１６gの溶液を１時間かけて滴下した。次に混合物を０℃で１時間、次に室温で１時間攪拌した。この時点で反応混合物は濃厚懸濁液になった。この混合物を水（１５００mL）で希釈してゲルを得た。混合物を氷浴で冷却し、機械的攪拌をしながら濃塩酸でｐＨ３に酸性化した。次に混合物を濾過し、水で洗浄した。固体を真空オーブン中で乾燥させて固体１２．５gを得た。固体を熱酢酸エチルで粉砕した。室温に冷却することにより４−（３−カルボキシメチル−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル）−［１，４］ジアゼパン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル１１．６５gを濾取することができた。
【０１４３】
中間体４の調製
実施例９で使用する中間体４−（７−カルボキシメチル−６−オキソ−６，７−ジヒドロ−１Ｈ−プリン−２−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル（Ｆｍｏｃ−Ｐｄｐ−ＯＨ）を以下のように調製した。
【０１４４】
【化２８】
【０１４５】
【化２９】
【０１４６】
工程１：
６−クロロ−３，５−ジヒドロ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−４−オン２の調製
４，６−ジクロロ−３，５−ジヒドロ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジンの水溶液にＮａＯＨ水溶液（２当量）を加えた。反応の完了（ＴＬＣによりモニタリング）まで反応混合物を９０℃で攪拌した。反応混合物を室温に冷却し、濾過して淡黄色残渣を得た。残渣を水に溶解させ、ｐＨ３〜４に酸性化し、濾過して２を得た。
【０１４７】
工程２：
４−（４−オキソ−４，５−ジヒドロ−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−６−イル）ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル３の調製
６−クロロ−３，５−ジヒドロ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−４−オン２のエチレングリコールモノメチルエーテル溶液にＢｏｃ−ピペラジン（１．１当量）を加えた。反応混合物を終夜攪拌還流させた後、濾過して固体を得た。固体を水で洗浄して３を得た。
【０１４８】
工程３：
４−（３−エトキシカルボニルメチル−４−オキソ−４，５−ジヒドロ−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−６−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル４の調製
４−（４−オキソ−４，５−ジヒドロ−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−６−イル）ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル３及び炭酸カリウム（０．８当量）のジメチルホルムアミド溶液にジメチルホルムアミド中ＣｌＣＨ２ＣＯＯＥｔ（１当量）を滴下した。溶液を終夜攪拌した。次に混合物を水で希釈し、塩化メチレンで抽出した。合わせた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を蒸発させた。酢酸エチルで溶出するシリカカラムクロマトグラフィーで生成物をさらに精製して４を固体として得た。
【０１４９】
工程４：
（４−オキソ−６−ピペラジン−１−イル−４，５−ジヒドロ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−３−イル）−酢酸エチルエステル５の調製
４−（３−エトキシカルボニルメチル−４−オキソ−４，５−ジヒドロ−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−６−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル４をＮ２下室温で乾燥塩化メチレンに溶解させた。ＣＦ３ＣＯＯＨ（５当量）を加え、反応混合物を１．５時間攪拌した。次に塩化メチレンを減圧除去し、残渣を精製せずに次の工程に使用した。
【０１５０】
工程５：
４−（３−エトキシカルボニルメチル−４−オキソ−４，５−ジヒドロ−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−６−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル６の調製
（４−オキソ−６−ピペラジン−１−イル−４，５−ジヒドロ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−３−イル）−酢酸エチルエステル５の塩化メチレン溶液に炭酸カリウム（２当量）及びわずかなテトラヒドロフラン／水（１：１）を加えた。混合物を２０分間攪拌した。次に、塩化メチレンに溶解した炭酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルを溶液に加えた。混合物を室温で終夜攪拌し、濾過し、溶媒を除去して得た残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して６を得た。
【０１５１】
工程６：
４−（３−カルボキシメチル−４−オキソ−４，５−ジヒドロ−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−６−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル７の調製
テトラヒドロフラン／水（７：１）に溶解した４−（３−エトキシカルボニルメチル−４−オキソ−４，５−ジヒドロ−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−６−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル６の溶液に１N ＬｉＯＨ水溶液（５当量）を室温で加えた。次に混合物を室温で１０分間攪拌した。溶液を１N ＨＣｌで酸性化した（ｐＨ＝３〜４）。次にテトラヒドロフランを加えた。シリカゲルクロマトグラフィーによる精製により７を得た。
【０１５２】
中間体５の調製
実施例１０で使用する中間体４−（７−カルボキシメチル−６−オキソ−６，７−ジヒドロ−１Ｈ−プリン−２−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル（Ｆｍｏｃ−Ｐｐａ−ＯＨ）を以下のように調製した。
【０１５３】
【化３０】
【０１５４】
工程１
２−クロロ−１，７−ジヒドロ−プリン−６−オン２の合成
化合物２，６−ジクロロ−７Ｈ−プリン１（６０g、３００mL）及びＮａＯＨ（３０g）の水中混合物を１００℃で５時間攪拌した後、反応混合物を室温に冷却し、濾過した。固体を酢酸エチルで洗浄した後、水に溶解させ、ｐＨが４に調整されるまでＨＣｌ水溶液で処理した。析出物を終夜形成し、固体を濾過し、わずかな水で洗浄し、乾燥させて２を得た。
【０１５５】
工程２
４−（６−オキソ−６，７−ジヒドロ−１Ｈ−プリン−２−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル３の合成
２−クロロ−１，７−ジヒドロ−プリン−６−オン２（５g）、ピペラジン（５．５g）及びエチレングリコールモノメチルエーテル３０mLの混合物を終夜還流させた後、室温に冷却した。溶媒を濾去し、固体を水で洗浄して３を得た。
【０１５６】
工程３
４−（７−エトキシカルボニルメチル−６−オキソ−６，７−ジヒドロ−１Ｈ−プリン−２−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル４の合成
４−（６−オキソ−６，７−ジヒドロ−１Ｈ−プリン−２−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル３（１g）、炭酸カリウム及びジメチルホルムアミドの混合物を室温で２時間攪拌した後、ＣｌＣＨ２ＣＯＯＥｔの溶液（０．３８g／ジメチルホルムアミド５mL）を反応混合物に滴下した。１５時間攪拌後、溶液を酢酸エチルと水との間で分配した。酢酸エチル溶液を水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧蒸発させ、カラムクロマトグラフィーの使用による残渣の精製により４を得た。
【０１５７】
工程４
（６−クロロ−２−ピペラジン−１−イル−プリン−７−イル）−酢酸エチルエステル５の合成
４−（７−エトキシカルボニルメチル−６−オキソ−６，７−ジヒドロ−１Ｈ−プリン−２−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル４ ０．６ｇのＰＯＣｌ３ ２０mL中混合物を８０℃に４時間加熱した。過剰のＰＯＣｌ３を減圧濃縮により除去した。残渣を氷水に注いだ。ｐＨを５N ＮａＯＨで調整した。溶液を塩化メチレンで抽出した。有機相を減圧濃縮して５を得た。
【０１５８】
工程５
（２−ピペラジン−１−イル−プリン−７−イル）−酢酸エチルエステル６の合成
（６−クロロ−２−ピペラジン−１−イル−プリン−７−イル）−酢酸エチルエステル５ １．４７ｇのメタノール１００mL溶液にＮ２下で１０％ Ｐｔ／Ｃ ４００mg及びＭｇＯ １．１gを加えた後、反応液を４時間水素化した。触媒及びＭｇＯを濾過し、メタノールで洗浄した。メタノールの減圧蒸発により６を得た。
【０１５９】
工程６
４−（７−エトキシカルボニルメチル−７Ｈ−プリン−２−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルエステル７の合成
（２−ピペラジン−１−イル−プリン−７−イル）−酢酸エチルエステル６ １８mg及びＦｍｏｃ−ＯＳｕ ２０mgを塩化メチレン２０mLに溶解させ、反応混合物を５時間攪拌した後、濾過し、塩化メチレンを減圧除去し、得られた固体をカラムクロマトグラフィーで精製して７を得た。
【０１６０】
工程７
４−（７−カルボキシメチル−７Ｈ−プリン−２−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル８の合成
１N ＬｉＯＨ ０．１mL及び４−（７−エトキシカルボニルメチル−７Ｈ−プリン−２−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルエステル１０mgのテトラヒドロフラン／水（７／１）２．１mL中混合物を室温で１０分間攪拌した。３N ＨＣｌを加えてｐＨを３〜４に調整し、混合物を減圧蒸発させて８を得た。
【０１６１】
中間体６の調製
実施例１１で使用する中間体４−（６−アミノ−７−カルボキシメチル−７Ｈ−プリン−２−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルエステル（Ｆｍｏｃ−Ａｐｐａ−ＯＨ）を以下のように調製した。
【０１６２】
【化３１】
【０１６３】
工程１
６−アミノ−２−クロロプリン２の調製
２，６−ジクロロ−プリン１（３０g、０．１５９mol）をＮＨ３／ＭｅＯＨ溶液（３００ml、ＭｅＯＨ中３０重量％ ＮＨ３）に溶解させた。反応混合物をオートクレーブ中で攪拌し、１００℃に４８時間加熱した。冷却後、混合物を濾過し、固体をメタノールで洗浄した。次にそれを減圧乾燥させて２を淡黄色粉末（１６g、収率６０％）として得た。
【０１６４】
工程２
（６−アミノ−２−クロロ−プリン−７−イル）−酢酸１，１−ジメチルエチルエステル３の調製
化合物６−アミノ−２−クロロプリン（５５g、０．３２４mol）、フッ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム（８．６g、３２．４mmol）及びＫ２ＣＯ３（５３．７g、０．３８９mol）のＤＭＳＯ（６００ml）中混合物を０℃で攪拌した。２−ブロモ酢酸tert−ブチルを滴下した。反応が完了した時点で混合物をブラインに注ぎ、酢酸エチル（３００ml×５）で抽出した。合わせた有機層をブラインで４〜５回洗浄した後、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、蒸発させた。ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ（８：１）で溶出するクロマトグラフィーで残渣を精製して３、６−アミノ−２−クロロ−プリン−７−イル）−酢酸１，１−ジメチルエチルエステル（５g、収率６％）を得た。
【０１６５】
工程３
４−（６−アミノ−７−tert−ブトキシカルボニルメチル−７Ｈ−プリン−２−イル）ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル４の調製
（６−アミノ−２−クロロ−プリン−７−イル）−酢酸１，１−ジメチルエチルエステル３（５g、１７．６mmol）のジメチルスルホキシド（５０ml）中攪拌混合物にピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチル（１０g、５３．８mmol）を１２０℃で加えた。添加後、混合物を約１４時間攪拌した。水（１００ml）及び酢酸エチル（１００ml）を反応混合物に加えた。次に有機層をＨ２Ｏで数回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して得た粗生成物４−（６−アミノ−７−tert−ブトキシカルボニルメチル−７Ｈ−プリン−２−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル４（７g）を精製せずに次の工程に直接使用した。
【０１６６】
工程４
４−（６−アミノ−７−カルボキシメチル−７Ｈ−プリン−２−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル６の調製
粗生成物４（７g）のＣＨ２Ｃｌ２（２００ml）中攪拌混合物にＣＦ３ＣＯ２Ｈ（２００ml）を徐々に加えた。混合物を終夜攪拌した。次に炭酸カリウムを加えてｐＨを７．５に調整した。次に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えてｐＨ８〜９を保持した。ｐＨの調整後、ＴＨＦ中Ｆｍｏｃ−ＯＳｕｃ（１０g）を混合物に加え、それをさらに５時間攪拌した。ＴＨＦを蒸発させ、混合物を酢酸エチル（１５０ml×２）で洗浄した。水層を２N ＨＣｌでｐＨ３に調整し、ジクロロメタン（１５０ml×７）で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮させて粗生成物（０．５g）を得た。分取ＨＰＬＣによるさらなる精製により４−（６−アミノ−７−カルボキシメチル−７Ｈ−プリン−２−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル６（５０mg）を得た。
【０１６７】
中間体７の調製
実施例１２で使用する中間体５−（３−カルボキシメチル−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル）−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル（Ｆｍｏｃ−Ｂｑａ−ＯＨ）を以下のように調製した。
【０１６８】
【化３２】
【０１６９】
工程１
シクロペンタジエン２の合成
ジシクロペンタジエン（２００g、１．５１３mol）を１８０℃で蒸留して２を１５０g得た（収率：７５％）。
【０１７０】
工程２
２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−エン３及び２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−エン−２−カルボン酸フェニルメチルエステル４の合成
シクロペンタジエン２（１２０g、１．８２mol）、塩化アンモニウム（２９１．８g、５．４６mol）及び４０％ホルムアルデヒド（２２１mL、２．７３mol）の水（１L）中混合物を室温で４８時間攪拌した。次にこの混合物にＮａＯＨ（２２０g、５．５mol）、ＣｂｚＣｌ（３１０．５g、１．８２mol）を加え、混合物を室温で終夜攪拌した。有機層を分離し、水相を酢酸エチルで２回抽出した。有機層を合わせて硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固させた。残渣を（石油エーテル／酢酸エチル＝１０：１）で溶出するシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーで精製して生成物４を透明油状物（１９２g、収率：４６％）として得た。
【０１７１】
工程３
endo−５−ヒドロキシ−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−カルボン酸フェニルメチルエステル５の合成
４（５０g、０．２１８mol）のテトラヒドロフラン（５００mL）溶液にＢＨ３・テトラヒドロフラン（１M、２１８mL）を０℃で滴下した。添加後、混合物を室温で２時間攪拌した。反応液を水（１３０mL）の添加によりクエンチした後、ＮａＯＨ（６M、１３０mL）及び水（３０％、１３０mL）を加え、混合物を室温で３０分間攪拌した。テトラヒドロフラン層を分離し、水相を酢酸エチルで３回抽出した。有機層を合わせて硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固させた。塩化メチレン／酢酸エチル（２／１）で溶出するクロマトグラフィーでの精製により生成物５を２１．６g得た（収率：４０％）。
【０１７２】
工程４
５−オキソ−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−カルボン酸フェニルメチルエステル６の合成
酸化クロム（２３．５g）を濃硫酸（２１mL）に冷却しながら溶解させてジョーンズ試薬を調製した後、蒸留水で希釈して全量１７５mLを得た。溶液の色が緑色から橙黄色に変化するまで、５（２０g、０．０８mol）にジョーンズ試薬を室温で加えた。混合物を酢酸エチルで抽出し、水で３回洗浄した。有機層を合わせて硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固させて６（１７g、収率：８５％）を得た。
【０１７３】
工程５
Ｎ−アセチルアントラニル酸８の合成
アントラニル酸（６０g、０．４４mol）の無水酢酸（６０g、０．６０mol）の混合物を６５℃に加熱した。５分後、混合物を１２０℃で約３時間還流させた。反応混合物を水５００mLに注いだ。固体を濾過し、乾燥させて生成物８（６８g、収率：８７％）を得た。
【０１７４】
工程６
Ｎ−アセチル−５−ブロモ−アントラニル酸９の合成
８（６８g、０．３８mol）の酢酸（５００mL）中混合物に臭素（７０ｇ、０．４４mol）を慎重に加えた後、混合物を室温で約１８時間攪拌した。次に反応混合物を水（５００mL）に注ぎ、濾過した。析出物を水で数回洗浄した。固体を乾燥させて生成物９（７１g、７２．４％）を得た。
【０１７５】
工程７
５−ブロモ−アントラニル酸１０の合成
９（７１g、０．２７５mol）の１，４−ジオキサン（４００mL）中混合物にＨＣｌ（４００mL）を加えた。混合物を１１０℃で４時間還流させた。次に混合物を濃縮し、水３００mLに加えた。混合物を濾過し、ｐＨを２N ＮａＯＨで６に調整し、水で洗浄し、乾燥させて１０を白色固体（５４．５g、収率：９１．７％）として得た。
【０１７６】
工程８
６−ブロモキナゾリン１１の合成
１０（５４．５g、０．２５２mol）の２−メトキシエタノール５００mL溶液にホルムアミジン酢酸塩（３４．１g、０．３２８mol）を加えた。反応混合物を４時間還流させ、室温に冷却し、水５００mLを加えた。得られた黄色析出物を濾取して１１（４４．１g、収率：７９％）を得た。
【０１７７】
工程９
５−ヒドロキシ−５−（４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−カルボン酸ベンジルエステル１２の合成
−７８℃で攪拌した１１（２０g、８８．８mmol）のテトラヒドロフラン（５００mL）溶液にＭｅＬｉ（４０mL、１２０．４mmol）を滴下した。添加後、反応混合物を−７８℃で１０分間攪拌した。次に上記溶液にｎ−ＢｕＬｉ（４６mL、２．５M）を−７８℃で滴下した。添加後、混合物を−７８℃で１時間攪拌した。次に、上記反応混合物に６（２１．８g、８８．９mmol）を加え、混合物を−７８℃で２時間攪拌した後、水でクエンチした。混合物のｐＨを２N ＨＣｌで３に調整した後、酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発乾固させた。塩化メチレン／酢酸エチル１／１→塩化メチレン／酢酸エチル／ＭｅＯＨ １／１／０．１で溶出するシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーで残渣を精製して１２を２０．８g得た（収率５９％）。
【０１７８】
工程１０
５−（３−エトキシカルボニルメチル−４−オキソ−３，４−ジヒドロキナゾリン−６−イル）−５−ヒドロキシ−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−カルボン酸ベンジルエステル１３の合成
１２（１０g、２５．６mmol）のジメチルホルムアミド（１００mL）中混合物にＢｒＣＨ２ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ３（５．５５g、３３．２１mmol）を加えた。混合物を室温で終夜攪拌した。反応液を水でクエンチし、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層を水で５回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧濃縮して生成物１３（９．７g、８０％）を得た。
【０１７９】
工程１１
５−（３−カルボキシメチル−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル）−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステルの合成
１３（２２．４g、４７mmol）のＨＯＡｃ（４４８mL）中混合物にＨＩ（２６８mL）を加えた。混合物を１２０℃で終夜加熱還流させた。反応混合物を蒸発させ、そのｐＨを炭酸カリウム及びＮａＨＣＯ３で６〜７に調整した。次にテトラヒドロフラン５０mLを加えた。混合物にＦｍｏｃＣｌ（１５．６８g、６１mmol）を加え、室温で５時間攪拌した。次に反応混合物を酢酸エチルで抽出し、水で３回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固させた。クロマトグラフィー（溶離液：塩化メチレン→塩化メチレン／ＭｅＯＨ／ＨＡｃ ８／１／０．１）による精製により得た粗製の５−（３−カルボキシメチル−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル）−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル１０．３gを分取ＨＰＬＣでさらに精製して純粋な５−（３−カルボキシメチル−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−６−イル）−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル２．７gを得た（２工程で収率１１％）。
【０１８０】
中間体８の調製
実施例１３で使用する中間体４−（２−カルボキシメチル−１−オキソ−１，２−ジヒドロ−イソキノリン−７−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル１０（Ｆｍｏｃ−Ｐｉｐａ−ＯＨ）を以下のように調製した。
【０１８１】
【化３３】
【０１８２】
工程１
４−ブロモ桂皮酸２の調製
４−ブロモベンズアルデヒド１（１１０g、０．５９mol）、マロン酸（１１２．５g、１．１８９mol）、ピペリジン（１１mL）のピリジン（３５０mL）溶液を８０℃で１時間加熱した後、３時間還流させた。次に反応混合物を室温に冷却し、冷水で満たした大型ビーカーに注いだ後、濃塩酸２５mLをゆっくりと加えることで酸性化した（ｐＨ＜３）。得られた析出物を濾過し、冷水で洗浄した。粗生成物を水酸化ナトリウム水溶液に溶解させ、酸性化し（ｐＨ＜３）（１：１塩酸／水）、濾過し、洗浄した（冷水）。固体を減圧乾燥させて（６０〜７０℃）２（１１８．８g、８８％）を得た。
【０１８３】
工程２
４−ブロモシンナモイルクロリド３の調製
化合物２（１１３．８g、０．５mol）の塩化チオニル溶液を１．５時間還流させた。次に混合物を減圧濃縮し、粗生成物３を得た（１２６．９g、９３％）。
【０１８４】
工程３
４−ブロモシンナモイルアジド４の調製
【０１８５】
【化３４】
【０１８６】
アジ化ナトリウム（６７g、１mol）を水及びアセトンの混合物（３００mL、１：１）に懸濁させた。混合物を０℃に冷却し、化合物３（１２６．９g、０．５２mol）の乾燥アセトン（４００mL）溶液を５℃で加えた。得られた混合物を０〜５℃で４時間攪拌した後、水（１．５L）に注いだ。析出物を濾去し、水で洗浄し、乾燥させた。Ｐ２Ｏ５でのさらなる減圧乾燥により４（１３０．３g、１００％）を得た。
【０１８７】
工程４
７−ブロモ−２Ｈ−イソキノリン−１−オン５の調製
化合物４（１２１．６g、０．４８mol）及びトリブチルアミン（１７７．９g、０．９６mol）のジフェニルエーテル（１．２L）溶液をＮ２下２１０℃で２時間加熱した。次に混合物を室温に冷却し、析出物を濾過し、ヘキサンで洗浄し、乾燥させて５（３２g、３０％）を得た。
【０１８８】
工程５
７−ブロモ−２−（２−ヒドロキシエチル）−イソキノリン−１−オン６の調製
化合物５（１９．８g、８８．４mmol）、炭酸カリウム（１８．３g、１３３mmol）及び２−ブロモエタノール（１３．３g、１０６mmol）のジメチルホルムアミド（２００mL）溶液を８０℃で１２時間攪拌した。次に混合物を室温に冷却し、水に注いだ。混合物を酢酸エチルで抽出し（５００mLで３回）、乾燥させ（硫酸ナトリウム）、濃縮し、シリカゲル上のクロマトグラフィーで精製して６（１６．２g、６８％）を得た。
【０１８９】
工程６
４−［２−（２−ヒドロキシ−エチル）−１−オキソ−１，２−ジヒドロ−イソキノリン−７−イル］ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル７の合成
化合物６（６．８g、２５．４mmol）、ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチル（５．６８g、３０．５mmol）、Ｐｄ２（ｄｂａ）３（７７５mg、０．８５mmol）、Ｓ−Ｐｈｏｓ（１．１６g）及びｔ−ＢｕＯＫ（５．７g、５０．８mmol）のトルエン（１００mL）溶液を窒素下９０℃に終夜加熱した。次に混合物を室温に冷却し、濾過した。濾液を濃縮し、残渣を塩化メチレンに溶解させ、水で洗浄し、乾燥させ（硫酸ナトリウム）、濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル）で精製して７（６．１g、６４％）を得た。
【０１９０】
工程７
化合物２−（２−ヒドロキシ−エチル）−７−ピペラジン−１イル−イソキノリン−１−オン８の合成
化合物７（６g、１６．１mmol）の塩化メチレン（２０mL）及びトリフルオロ酢酸（２０mL）溶液を室温で１時間攪拌した。次に混合物を減圧濃縮して化合物８（４．３g、９８％）を得た。
【０１９１】
工程８
４−［２−（２−ヒドロキシ−エチル）−１−オキソ−１，２−ジヒドロ−イソキノリン−７−イル］ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル９の合成
飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（８０mL）、化合物８（４．３g、１５．７mmol）のテトラヒドロフラン溶液にクロロギ酸９−フルオレニルメチルエステル（１．５当量）を加えた。混合物を室温で２時間撹拌した後、濃縮した。残渣を酢酸エチルで抽出し、乾燥させ（硫酸ナトリウム）、減圧濃縮して９（４．６g、収率５９％）を得た。
【０１９２】
工程９：
標的化合物４−（２−カルボキシメチル−１−オキソ−１，２−ジヒドロ−イソキノリン−７−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル１０の合成
塩化オキサリル（１．７３g、１３．６mmol）の塩化メチレン１０mL溶液にジメチルスルホキシド（１．４２g、１８．２mmol）を−７０℃で２５分間かけて滴下した後、化合物９（２．２５g、４．５４mmol）の塩化メチレン（２０mL）溶液を−７０℃で５０分間かけて滴下した。反応混合物を−５５℃でさらに１時間攪拌した後、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３．５２g、２７．２mmol）を５分間かけて加えた。混合物を０℃で３０分間攪拌した。１M塩酸溶液（５０mL）を反応混合物に加えた後、混合物を塩化メチレンで抽出し（１００mLで３回）、合わせた有機相を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液及び水で洗浄し、乾燥させ（硫酸ナトリウム）、減圧濃縮してアルデヒドを得た。
【０１９３】
このアルデヒド（２．２g、４．４６mmol）、ｍ−Ｃ６Ｈ４（ＯＨ）２（０．９８g、８．９２mmol）、ＮａＨ２ＰＯ４水溶液（１０mL）、ｔ−ＢｕＯＨ（５mL）のＤＭＳＯ（５０mL）溶液を０℃に冷却した後、ＮａＣｌＯ２水溶液（５mL）を滴下した。反応混合物を０℃で３時間攪拌し、水１００mLを加え、ｐＨ＜５に調整し、酢酸エチルで抽出し（１００mLで３回）、乾燥し（硫酸ナトリウム）、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル）で精製して標的化合物４−（２−カルボキシメチル−１−オキソ−１，２−ジヒドロ−イソキノリン−７−イル）−ピペラジン−１−カルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル１０（１．３５g、収率５８．７％）を得た。
【０１９４】
ここで本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、これらは例示のみとして意図されており、本発明の範囲を限定しない。
【０１９５】
調製例
実施例１
Ｆｍｏｃリンカー−ＢＨＡ樹脂の調製
ベンズヒドリルアミンコポリスチレン−１％ジビニルベンゼン架橋樹脂（１０．０g、９．３ミリ当量、１００〜２００ ＡＳＴＭメッシュ、Advanced ChemTech）をＣＨ２Ｃｌ２ １００mL中で膨潤させ、濾過し、ＣＨ２Ｃｌ２、６％ ＤＩＰＥＡ／ＣＨ２Ｃｌ２（２回）、ＣＨ２Ｃｌ２（２回）各１００mlで連続的に洗浄した。樹脂を２５％ＤＭＦ／ＣＨ２Ｃｌ２ １００mL中ｐ−（（Ｒ，Ｓ）−α−（１−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）−メトキシホルムアミド）−２，４−ジメトキシベンジル）−フェノキシ酢酸（Ｆｍｏｃリンカー）（７．０１g、１３．０mmole）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（２．１６g、１６．０mmole）及びジイソプロピル−カルボジイミド（２．０４ml、１３．０mmol）を室温で２４時間処理した。樹脂を濾過し、ＣＨ２Ｃｌ２（２回）、イソプロパノール（２回）、ＤＭＦ及びＣＨ２Ｃｌ２（３回）各１００mlで連続的に洗浄した。カイザーニンヒドリン分析は陰性であった。樹脂を減圧乾燥させてＦｍｏｃリンカー−ＢＨＡ樹脂１６．１２gを得た。この樹脂の一部（３．５mg）をＦｍｏｃ脱保護及びＵＶ定量分析に供し、この分析は０．５６mmol/gの添加を示した。
【０１９６】
実施例２
フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学を使用するApplied Biosystem ４３３Ａシンセサイザーによるペプチドの合成のプロトコール
Applied Biosystem ４３３Ａシンセサイザー（カリフォルニア州フォスターシティ）による０．２５mmolスケールペプチド合成において、ＦａｓｔＭｏｃ ０．２５mmoleサイクルを樹脂サンプリング又は非樹脂サンプリングのいずれかの４１mL反応容器と共に使用した。Ｆｍｏｃ−アミノ酸樹脂をＮＭＰ ２．１g、０．４５M ＨＯＢＴ／ＨＢＴＵ ２gと共にＤＭＦ及び２M ＤＩＥＡに懸濁させた後、反応容器に移した。塩基性ＦａｓｔＭｏｃカップリングサイクルを「ＢＡＤＥＩＦＤ」として表した。ここで各文字はモジュール（Applied Biosystemsの定義による）を表す。例えば：
Ｂは２０％ピペリジン／ＮＭＰ及び関連洗浄液を使用するＦｍｏｃ脱保護ならびに３０分間の読み取り（ＵＶモニタリング又は伝導率のいずれか）のためのモジュールを表し；Ａはカートリッジ内のアミノ酸の０．４５M ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ及び２．０M ＤＩＥＡによる活性化ならびにＮ２バブリングによる混合のためのモジュールを表し；Ｄは反応容器中の樹脂のＮＭＰ洗浄のためのモジュールを表し；Ｅはカップリング用の反応容器への活性化アミノ酸の移動のためのモジュールを表し；Ｉは反応容器上での又は反応容器から外してのボルテックスを伴う１０分間の待機期間のためのモジュールを表し；Ｆはカートリッジの洗浄、約１０分間のカップリング及び反応容器からの排出のためのモジュールを表す。典型的にはモジュール「Ｉ」を１回又は複数回付加することでカップリングを延長した。例えば、「ＢＡＤＥＩＩＡＤＥＩＦＤ」という手順を行うことで二重カップリングを実行した。塩化メチレン洗浄用のｃ及び無水酢酸でのキャッピング用の「Ｃ」などの他のモジュールも利用可能とした。例えば移動する溶媒又は試薬の量を改変するために移動時間などの様々な関数のタイミングを変化させることで各モジュールの改変も可能であった。上記サイクルを１つのアミノ酸のカップリングに典型的に使用した。しかし、テトラペプチドの合成にはサイクルを繰り返しかつつなぎ合わせた。例えば、ＢＡＤＥＩＩＡＤＥＩＦＤを第１のアミノ酸のカップリングに使用し、続いてＢＡＤＥＩＩＡＤＥＩＦＤを第２のアミノ酸のカップリングに使用し、続いてＢＡＤＥＩＩＡＤＥＩＦＤを第３のアミノ酸のカップリングに使用し、続いてＢＡＤＥＩＩＡＤＥＩＦＤを第４のアミノ酸のカップリングに使用し、続いてＢＩＤＤｃｃを最終脱保護及び洗浄に使用した。
【０１９７】
実施例３
Ｈ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２（ＰＹＹ３−３６）の調製
Applied Biosystem ４３３Ａシンセサイザー上でＦｍｏｃ化学を使用して上記ペプチドを合成した。実施例２に記載のモジュールを使用してシンセサイザーを二重カップリング用にプログラムした。実施例１からのＦｍｏｃリンカー−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmole）を使用して０．２５mmoleスケールで合成を行った。合成の終わりに、切断のために樹脂を振盪機上の反応容器に移した。９７％ ＴＦＡ／３％ Ｈ２Ｏ １３．５mL及びトリイソプロピルシラン１．５mLを室温で１８０分間使用してペプチドを樹脂から切断した。脱保護溶液を冷Ｅｔ２Ｏ １００mLに加え、ＴＦＡ １mL及び冷Ｅｔ２Ｏ ３０mLで洗浄してペプチドを析出させた。ペプチドを２ｘ５０mLポリプロピレンチューブで遠心分離した。各チューブからの析出物を単一チューブ内にて合わせ、冷Ｅｔ２Ｏで３回洗浄し、ハウスバキューム下、デシケーター中で乾燥させた。
【０１９８】
粗材料をPursuit Ｃ１８カラム（２５０ｘ５０mm、粒径１０μm）上で分取ＨＰＬＣにより精製し、２〜７０％ Ｂのリニアグラジエント（緩衝液Ａ：０．１％ ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ；緩衝液Ｂ：０．１％ ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）により９０分、流量６０mL／分及び検出２２０／２８０nmにて溶出した。画分を回収し、分析用ＨＰＬＣで点検した。純粋な生成物を含む画分を合わせて凍結乾燥させ、白色アモルファス粉末１５１mg（１５％）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ Ｃ１８０Ｈ２７９Ｎ５３Ｏ５４の計算値（「calcd」）４０４９．５５ 実測値４０５０．４０
【０１９９】
実施例４
Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｑａ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−（ＮＭｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２の調製
【０２００】
【化３５】
【０２０１】
実施例１からのＦｍｏｃリンカー−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmole）を、Ｆｍｏｃ−Ｐｑａを使用する実施例３に記載の一般的手順に従って固相合成及び精製に供して白色アモルファス粉末５３mg（９％）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ Ｃ１０６Ｈ１５６Ｎ３４Ｏ２２の計算値（「calcd」）２２５７．２１ 実測値２２５７．１９．
【０２０２】
実施例５
Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｃｂａ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−（ＮＭｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２の調製
【０２０３】
【化３６】
【０２０４】
Ｆｍｏｃリンカー−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmole）を実施例１１に記載のように調製し、実施例３の一般的手順に従いかつＦｍｏｃ−Ｃｂａを使用することで固相合成及び精製に供して白色アモルファス粉末１８mg（３．２％）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ Ｃ１０７Ｈ１５５Ｎ３１Ｏ２１の計算値（「calcd」）２２１０．２０，実測値２２１０．１９
【０２０５】
実施例６
Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｃｉｐ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−（ＮＭｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２の調製
【０２０６】
【化３７】
【０２０７】
Ｆｍｏｃリンカー−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmole）を実施例１に記載のように調製し、Ｆｍｏｃ−Ｃｉｐを使用して実施例３の一般的手順に従うことで固相合成及び精製に供して白色アモルファス粉末１６mg（３％）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ Ｃ１０６Ｈ１５７Ｎ３３Ｏ２１の計算値（「calcd」）２２２８．２２、実測値２２２８．２１。
【０２０８】
実施例７
Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−ＨｏｍＰｑａ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−（ＮＭｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２の調製
【０２０９】
【化３８】
【０２１０】
Ｆｍｏｃリンカー−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmole）を実施例１に記載のように調製し、Ｆｍｏｃ−ＨｏｍＰＱＡを使用して実施例３の一般的手順に従うことで固相合成及び精製に供して白色アモルファス粉末１１mg（２％）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ Ｃ１０７Ｈ１５８Ｎ３４Ｏ２３の計算値（「calcd」）２２８７．２２、実測値２２８７．２４。
【０２１１】
実施例８
Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｄｑａ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−（ＮＭｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２の調製
【０２１２】
【化３９】
【０２１３】
Ｆｍｏｃリンカー−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmole）を実施例１に記載のように調製し、Ｆｍｏｃ−Ｄｑａを使用して実施例３の一般的手順に従うことで固相合成及び精製に供して白色アモルファス粉末２２mg（４％）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ Ｃ１０７Ｈ１５８Ｎ３４Ｏ２２の計算値（「calcd」）２２７１．２３、実測値２２７１．２４。
【０２１４】
実施例９
Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｄｐ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−（ＮＭｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２の調製
【０２１５】
【化４０】
【０２１６】
Ｆｍｏｃリンカー−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmole）を実施例１に記載のように調製し、Ｆｍｏｃ−Ｐｄｐを使用して実施例３の一般的手順に従うことで固相合成及び精製に供して白色アモルファス粉末１７mg（３％）を得た。）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ Ｃ１０３Ｈ１５４Ｎ３６Ｏ２２の計算値（「calcd」）２２４７．２１、実測値２２４７．１９。
【０２１７】
実施例１０
Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｐａ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−（ＮＭｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２の調製
【０２１８】
【化４１】
【０２１９】
Ｆｍｏｃリンカー−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmole）を実施例１に記載のように調製し、Ｆｍｏｃ−Ｐｐａを使用して実施例３の一般的手順に従うことで固相合成及び精製に供して白色アモルファス粉末１１７mg（２１％）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ Ｃ１０３Ｈ１５６Ｎ３６Ｏ２１の計算値（「calcd」）２２３３．２２、実測値２２３３．２０。
【０２２０】
実施例１１
Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｐｐａ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−（ＮＭｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２の調製
【０２２１】
【化４２】
【０２２２】
Ｆｍｏｃリンカー−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmole）を実施例１に記載のように調製し、Ｆｍｏｃ−Ａｐｐａを使用して実施例３の一般的手順に従うことで固相合成及び精製に供して白色アモルファス粉末９８mg（１７％）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ Ｃ１０３Ｈ１５５Ｎ３７Ｏ２１の計算値（「calcd」）２２４６．２２、実測値２２４６．２０。
【０２２３】
実施例１２
Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｂｑａ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−（ＮＭｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２の調製
【０２２４】
【化４３】
【０２２５】
Ｆｍｏｃリンカー−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmole）を実施例１に記載のように調製し、Ｆｍｏｃ−Ｂｑａを使用して実施例３の一般的手順に従うことで固相合成及び精製に供して白色アモルファス粉末７９mg（４％）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ Ｃ１０８Ｈ１５７Ｎ３３Ｏ２２の計算値（「calcd」）２２６８．２２、実測値２２６８．２４。
【０２２６】
実施例１３
Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｉｐａ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−（ＮＭｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２の調製
【０２２７】
【化４４】
【０２２８】
Ｆｍｏｃリンカー−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmole）を実施例１に記載のように調製し、Ｆｍｏｃ−Ｐｉｐａを使用して実施例３の一般的手順に従うことで固相合成及び精製に供して白色アモルファス粉末１１８mg（２１％）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ Ｃ１０７Ｈ１５７Ｎ３３Ｏ２２の計算値（「calcd」）２２５６．２２、実測値２２５６．２１。
【０２２９】
実施例１４
ｃＡＭＰアゴニストアッセイ
環状ＡＭＰアッセイ
この実施例では以下の材料を使用した：３８４ウェルプレート；Ｔｒｏｐｉｘ ｃＡＭＰスクリーンキット；ｃＡＭＰ ＥＬＩＳＡシステム（Applied Biosystems、カタログ番号Ｔ１５０５；ＣＳ ２００００）；フォルスコリン（Calbiochemカタログ番号３４４２７０）；細胞：ヒトＮＰＹ２受容体を発現させるＨＥＫ２９３細胞；増殖培地：ＤＭＥＭ（Gibcoカタログ番号１１９９５０６５）、１０％熱不活性化ＦＢＳ（Gibcoカタログ番号１００８２−１４７）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibcoカタログ番号１５１４０−１２２）、５００mg/mL Ｇ４１８（ジェネテシン、Gibcoカタログ番号１１８１１−０３１）；プレーティング培地：ＤＭＥＭ／Ｆ１２、フェノールレッドなし（Gibcoカタログ番号１１３３０３２）、１０％熱不活性化ＦＢＳ（Gibcoカタログ番号１００８２−１４７）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco カタログ番号１５１４０−１２２）、５００mg/mL Ｇ４１８（ジェネテシン、Gibcoカタログ番号１１８１１−０３１）；Versene（Gibcoカタログ番号１５０４００６６）。
【０２３０】
ヒトＮＰＹ２受容体を発現させるＨＥＫ２９３細胞を３８４ウェルプレートにマルチドロップディスペンサーを用いて９０００細胞／ウェルの密度でプレーティングし、プレートを３７℃で終夜増殖させた。翌日、７５〜８５％コンフルエンスに到達した細胞を実験に使用した。
【０２３１】
培地及び試薬を室温に昇温した。希釈液を調製する前に、ＮＰＹ２受容体リガンド及び対照のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Sigmaカタログ番号Ｄ２６５０）のストック溶液を３２℃に５〜１０分間昇温した。インキュベーション培地［０．５mM ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ、Calbiochemカタログ番号４１０９５７）及び０．５mg/mL ＢＳＡ（Sigmaカタログ番号Ａ８８０６）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地］を使用して希釈を行った。インキュベーション培地中のＤＭＳＯ及びフォルスコリンの終濃度をそれぞれ１．１％及び５μMとした。
【０２３２】
プレーティング培地を、ペーパータオル上で３８４ウェルプレートをやさしくひっくり返すことで除去し、様々な濃度のＮＰＹ２受容体リガンド（４つの複製物／濃度）を含有するインキュベーション培地（５０μL/ウェル）で置き換えた。プレートを室温で３０分間インキュベートした。３０分の処理期間後、インキュベーション培地を廃棄し、アッセイ溶解緩衝液（Tropixキットで与える）５０μL／ウェルで置き換えた。プレートを３７℃で４５分間インキュベートすることで細胞を溶解させた。Tropixキットで供給したプレコーティング抗体プレート（３８４ウェル）に溶解液（２０μl）を移した。ＡＰ抱合体（１０μL）及び抗ｃＡＭＰ抗体（２０μL）を各ウェルに加え、プレートを振盪機上にて室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（７０μL／ウェル／洗浄）で５回洗浄し、プレートをタップ乾燥させた。ＣＳＰＤ／Saphire-II ＲＴＵ基質／エンハンサー溶液（３０μL／ウェル）を加え、室温で４５分間インキュベートした。各ウェルのシグナルをルミノメーター（ＶＩＣＴＯＲ−Ｖ）を使用して測定した（１秒／ウェル）。
【０２３３】
実施例１５
ＣａＦｌｕｘアッセイ
Ｈｅｋ−２９３細胞にＧタンパク質キメラＧａｑｉ９を安定的にトランスフェクトし、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子にヒトＮＰＹ２受容体及びＧ４１８抗生物質セレクションをさらにトランスフェクトした。ハイグロマイシンＢとＧ４１８との両方における選択の後、個々のクローンをそのＰＹＹに対する応答についてアッセイした。１０％ウシ胎仔血清、５０μg/mlハイグロマイシンＢ、２mMグルタミン、１００U/mlペニシリン、１００μg／mlストレプトマイシン及び２５０μg/ml Ｇ４１８を補充したＤＭＥＭ培地中でトランスフェクト細胞を培養した。細胞をトリプシン−ＥＤＴＡで収集し、ViaCount試薬を用いて計数した。細胞緩衝液の容量を完全増殖培地で４．８ｘ１０５細胞／mlに調整した。２５μLのアリコートを３８４ウェルポリＤリジンコーティング黒色／透明マイクロプレート（Falcon）に注ぎ、マイクロプレートを３７℃ ＣＯ２インキュベーター中に終夜配置した。２０mM ＨＥＰＥＳ及び５mMプロベネシドを含有するハンクス平衡塩類溶液１０００mlに１つのバイアル（Express Kit）の内容物を溶解させて、添加緩衝液（カルシウム−３アッセイキット、Molecular Devices）を調製した。希釈色素２５μLのアリコートを細胞プレートに分注し、次にプレートを３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション中、試験化合物をＨＢＳＳ（２０mM ＨＥＰＥＳ）／０．０５％ ＢＳＡ／１％ ＤＭＳＯ中の所望濃度の３．５倍で調製し、ＦＬＩＰＲ上での使用のために３８４ウェルプレートに移した。インキュベーション後、細胞プレートと化合物プレートとの両方をＦＬＩＰＲに運び、希釈化合物２０μLをＦＬＩＰＲにより細胞プレートに移した。アッセイ中、１．５秒毎に細胞プレートの全３８４ウェルから同時に蛍光読み取りを取得した。５つの読み取りを取得して安定的なベースラインを確立した後、試料２０μLを速やかに（３０μL／秒）かつ同時に細胞プレートの各ウェルに加えた。１００秒の全経過時間において、試料添加の前、途中及び後に蛍光を連続的にモニタリングした。添加後の各ウェルにおける応答（ピーク蛍光の増加）を決定した。リガンド刺激の前の各ウェルからの初期蛍光読み取りを、そのウェルからのデータのゼロベースライン値として使用した。応答は正の対照の最大応答の％として表した。ｃＡＭＰアッセイ及びＣａＦｌｕｘアッセイ（ＦＬＩＰＲ）において示すように、本発明の化合物はインビトロでの選択的神経ペプチド２受容体活性を示した。実施例３〜１３のインビトロ結果の概要を以下の表１に示す。
【０２３４】
【表３】
【０２３５】
式（Ｉ）に係る化合物は０．００１nM〜１０nMという上記アッセイのうち１つにおける活性（Ｙ２Ｒ ＥＣ５０）を有する。式（Ｉ）で示される最も好ましい化合物は０．００１nM〜５nM、好ましくは０．００１nM〜１nMという上記アッセイのうち１つにおける活性（Ｙ２Ｒ ＥＣ５０）を有する。
【０２３６】
実施例Ａ
以下の成分を含有するフィルムコーティング錠剤を慣行的な様式で製造することができる。
成分 １錠剤当たり
カーネル：
式（Ｉ）で示される化合物 １０．０mg ２００．０mg
微結晶セルロース ２３．５mg ４３．５mg
含水乳糖 ６０．０mg ７０．０mg
ポビドンＫ３０ １２．５mg １５．０mg
グリコール酸デンプンナトリウム １２．５mg １７．０mg
ステアリン酸マグネシウム １．５mg ４．５mg
（カーネル重量） １２０．０mg ３５０．０mg
フィルムコート：
ヒドロキシプロピルメチルセルロース ３．５mg ７．０mg
ポリエチレングリコール６０００ ０．８mg １．６mg
タルク １．３mg ２．６mg
酸化鉄（イエロー） ０．８mg １．６mg
二酸化チタン ０．８mg １．６mg
【０２３７】
有効成分を篩い分け、微結晶セルロースと混合し、混合物をポリビニルピロリドンの水溶液と共に顆粒化する。顆粒をグリコール酸デンプンナトリウム及びステアリン酸マグネシウムと混合し、圧縮して１２０mg又は３５０mgのカーネルをそれぞれ得る。カーネルを上記フィルムコートの水溶液／水性懸濁液でラッカー塗装する。
【０２３８】
実施例Ｂ
以下の成分を含有するカプセル剤を慣行的な様式で製造することができる。
成分 カプセル剤当たり
式（Ｉ）で示される化合物 ２５．０mg
乳糖 １５０．０mg
トウモロコシデンプン ２０．０mg
タルク ５．０mg
【０２３９】
これらの成分を篩い分け、混合し、サイズ２のカプセルに充填する。
【０２４０】
実施例Ｃ
注射液剤は以下の組成を有し得る。
式（Ｉ）で示される化合物 ３．０mg
ポリエチレングリコール４００ １５０．０mg
酢酸 適量約ｐＨ５．０
注射液剤用水 約１．０ml
【０２４１】
有効成分をポリエチレングリコール４００及び注射液剤用水（一部）の混合物に溶解させる。ｐＨを酢酸で５．０に調整する。残りの量の水を加えることで容量を１．０mlに調整する。溶液を濾過し、適切な過剰量を使用してバイアルに充填し、滅菌する。
【０２４２】
実施例Ｄ
以下の成分を含有する軟ゼラチンカプセル剤を慣行的な様式で製造することができる。
カプセル内容物
式（Ｉ）で示される化合物 ５．０mg
黄蝋 ８．０mg
硬化大豆油 ８．０mg
部分硬化植物油 ３４．０mg
大豆油 １１０．０mg
カプセル内容物の重量 １６５．０mg
ゼラチンカプセル
ゼラチン ７５．０mg
グリセロール８５％ ３２．０mg
Ｋａｒｉｏｎ ８３ ８．０mg (乾燥物)
二酸化チタン ０．４mg
酸化鉄イエロー １．１mg
【０２４３】
有効成分を他の成分の暖かい溶融物中に溶解させ、混合物を適切なサイズの軟ゼラチンカプセルに充填する。充填した軟ゼラチンカプセルを通常の手順に従って処理する。
【０２４４】
実施例Ｅ
以下の成分を含有するサシェ剤を慣行的な様式で製造することができる。
式（Ｉ）で示される化合物 ５０．０mg
乳糖、微粉 １０１５．０mg
微結晶セルロース（ＡＶＩＣＥＬ ＰＨ １０２） １４００．０mg
カルボキシメチルセルロースナトリウム １４．０mg
ポリビニルピロリドンＫ ３０ １０．０mg
ステアリン酸マグネシウム １０．０mg
調味添加剤 １．０mg
【０２４５】
有効成分を乳糖、微結晶セルロース及びカルボキシメチルセルロースナトリウムと混合し、ポリビニルピロリドンの水中混合物と共に顆粒化する。顆粒をステアリン酸マグネシウム及び調味添加剤と混合し、サシェ剤に充填する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
Ｙ−Ｒ１−Ｒ２−Ｘ−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８−Ｒ９−Ｒ１０−Ｒ１１−Ｒ１２−Ｒ１３−Ｒ１４−ＮＨ２ （Ｉ）
［式中、
Ｘは、（４−アミノメチル−ビフェニル−３−イル）−酢酸（Ｃｂａ）、（５−ピペラジン−１−イル−インドール−１−イル）−酢酸（Ｃｉｐ）、３−（４−オキソ−６−ピペラジン−１−イル−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−プロピオン酸（ＨｏｍＰｑａ）、（６−［１，４］ジアゼパン−１−イル−４−オキソ−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−酢酸（Ｄｑａ）、（６−オキソ−２−ピペラジン−１−イル−１，６−ジヒドロプリン−７−イル）−酢酸（Ｐｄｐ）、（２−ピペラジン−１−イル−プリン−７−イル）−酢酸（Ｐｐａ）、（６−アミノ−２−ピペラジン−１−イル−９Ｈ−プリン−８−イル）−酢酸（Ａｐｐａ）、（（１Ｒ，４Ｓ）−６−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−イル−４−オキソ−４Ｈ−キナゾリン）−酢酸（Ｂｑａ）又は（１−オキソ−７−ピペラジン−１−イル−１Ｈ−イソキノリン−２−イル）−酢酸（Ｐｉｐａ）であり；
ＹはＨ又はアシル部分であり；
Ｒ１は、Ｉｌｅ、Ａｌａ、（Ｄ）Ｉｌｅ、Ｎ−メチルＩｌｅ、Ａｉｂ、１−１Ａｉｃ、２−２Ａｉｃ、Ａｃｈ又はＡｃｐであり；
Ｒ２は、Ｌｙｓ、Ａｌａ、（Ｄ）Ｌｙｓ、Ｎ−メチルｌｙｓ、Ｎｌｅ又は（Ｌｙｓ−Ｇｌｙ）であり；
Ｒ３は、Ａｒｇ、Ａｌａ、（Ｄ）Ａｒｇ、Ｎ−メチルＡｒｇ、Ｐｈｅ、３，４，５−トリフルオロＰｈｅ又は２，３，４，５，６−ペンタフルオロＰｈｅであり；
Ｒ４は、Ｈｉｓ、Ａｌａ、（Ｄ）Ｈｉｓ、Ｎ−メチルＨｉｓ、４−ＭｅＯＡｐｃ、３−Ｐａｌ又は４−Ｐａｌであり；
Ｒ５は、Ｔｙｒ、Ａｌａ、（Ｄ）Ｔｙｒ、Ｎ−メチルＴｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｉｃ、Ｂｉｐ、Ｄｉｐ、（１）Ｎａｌ、（２）Ｎａｌ、３，４，５−トリフルオロＰｈｅ又は２，３，４，５，６−ペンタフルオロＰｈｅであり；
Ｒ６は、Ｌｅｕ、Ａｌａ、（Ｄ）Ｌｅｕ又はＮ−メチルＬｅｕであり；
Ｒ７は、Ａｓｎ、Ａｌａ又は（Ｄ）Ａｓｎであり；
Ｒ８は、Ｌｅｕ又はＴｒｐであり；
Ｒ９は、Ｖａｌ、Ａｌａ、（Ｄ）Ｖａｌ又はＮ−メチルＶａｌであり；
Ｒ１０は、Ｔｈｒ、Ａｌａ又はＮ−メチルＴｈｒであり；
Ｒ１１は、Ａｒｇ、（Ｄ）Ａｒｇ又はＮ−メチルＡｒｇであり；
Ｒ１２は、Ｇｌｎ又はＡｌａであり；
Ｒ１３は、Ａｒｇ、（Ｄ）Ａｒｇ又はＮ−メチルＡｒｇであり、
Ｒ１４は、Ｔｙｒ、（Ｄ）ＴｙｒもしくはＮ−メチルＴｙｒ、修飾Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、修飾Ｐｈｅ、（１）Ｎａｌ、（２）Ｎａｌ、Ｃｈａ、Ｃ−α−メチルＴｙｒ又はＴｒｐである］で示される神経ペプチド２受容体アゴニスト又はその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
Ｘが、（４−アミノメチル−ビフェニル−３−イル）−酢酸（Ｃｂａ）、（５−ピペラジン−１−イル−インドール−１−イル）−酢酸（Ｃｉｐ）、３−（４−オキソ−６−ピペラジン−１−イル−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−プロピオン酸（ＨｏｍＰｑａ）、（６−［１，４］ジアゼパン−１−イル−４−オキソ−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−酢酸（Ｄｑａ）、（６−オキソ−２−ピペラジン−１−イル−１，６−ジヒドロプリン−７−イル）−酢酸（Ｐｄｐ）、（２−ピペラジン−１−イル−プリン−７−イル）−酢酸（Ｐｐａ）、（６−アミノ−２−ピペラジン−１−イル−９Ｈ−プリン−８−イル）−酢酸（Ａｐｐａ）、（（１Ｒ，４Ｓ）−６−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−イル−４−オキソ−４Ｈ−キナゾリン）−酢酸（Ｂｑａ）又は（１−オキソ−７−ピペラジン−１−イル−１Ｈ−イソキノリン−２−イル）−酢酸（Ｐｉｐａ）であり；
Ｙがアシル部分である、
請求項１記載の神経ペプチド２受容体アゴニスト。
【請求項３】
式（ＩＩ）：
Ｙ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−（ＮＭｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２ （ＩＩ）
［式中、
Ｘは、（４−アミノメチル−ビフェニル−３−イル）−酢酸（Ｃｂａ）、（５−ピペラジン−１−イル−インドール−１−イル）−酢酸（Ｃｉｐ）、３−（４−オキソ−６−ピペラジン−１−イル−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−プロピオン酸（ＨｏｍＰｑａ）、（６−［１，４］ジアゼパン−１−イル−４−オキソ−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−酢酸（Ｄｑａ）、（６−オキソ−２−ピペラジン−１−イル−１，６−ジヒドロプリン−７−イル）−酢酸（Ｐｄｐ）、（２−ピペラジン−１−イル−プリン−７−イル）−酢酸（Ｐｐａ）、（６−アミノ−２−ピペラジン−１−イル−９Ｈ−プリン−８−イル）−酢酸（Ａｐｐａ）、（（１Ｒ，４Ｓ）−６−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−イル−４−オキソ−４Ｈ−キナゾリン）−酢酸（Ｂｑａ）又は（１−オキソ−７−ピペラジン−１−イル−１Ｈ−イソキノリン−２−イル）−酢酸（Ｐｉｐａ）であり；
Ｙはアシル部分である］を有する、請求項１又は２記載の神経ペプチド２受容体アゴニスト。
【請求項４】
以下から選択される、請求項１〜３のいずれか一項記載の神経ペプチド２受容体アゴニスト。
【表４】
【請求項５】
治療活性物質として使用される、請求項１〜４のいずれか一項記載の神経ペプチド２受容体アゴニスト。
【請求項６】
神経ペプチド２受容体アゴニストにより調節される疾患の治療又は予防のための治療活性物質として使用される、請求項１〜４のいずれか一項記載の神経ペプチド２受容体アゴニスト。
【請求項７】
治療有効量の請求項１〜４のいずれか一項記載の神経ペプチド２受容体アゴニストと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項８】
神経ペプチド２受容体アゴニストにより調節される疾患の治療又は予防のための請求項１〜４のいずれか一項記載の神経ペプチド２受容体アゴニストの使用。
【請求項９】
肥満、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性又は脂質異常症の治療又は予防のための請求項１〜４のいずれか一項記載の神経ペプチド２受容体アゴニストの使用。
【請求項１０】
肥満、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性又は脂質異常症の治療又は予防のための医薬の調製のための請求項１〜４のいずれか一項記載の神経ペプチド２受容体アゴニストの使用。
【請求項１１】
肥満、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性又は脂質異常症の治療又は予防のための方法であって、有効量の請求項１〜４のいずれか一項記載の神経ペプチド２受容体アゴニストを投与する段階を含む方法。
【請求項１２】
以上に記載の発明。
【請求項１】
式（Ｉ）：
Ｙ−Ｒ１−Ｒ２−Ｘ−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８−Ｒ９−Ｒ１０−Ｒ１１−Ｒ１２−Ｒ１３−Ｒ１４−ＮＨ２ （Ｉ）
［式中、
Ｘは、（４−アミノメチル−ビフェニル−３−イル）−酢酸（Ｃｂａ）、（５−ピペラジン−１−イル−インドール−１−イル）−酢酸（Ｃｉｐ）、３−（４−オキソ−６−ピペラジン−１−イル−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−プロピオン酸（ＨｏｍＰｑａ）、（６−［１，４］ジアゼパン−１−イル−４−オキソ−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−酢酸（Ｄｑａ）、（６−オキソ−２−ピペラジン−１−イル−１，６−ジヒドロプリン−７−イル）−酢酸（Ｐｄｐ）、（２−ピペラジン−１−イル−プリン−７−イル）−酢酸（Ｐｐａ）、（６−アミノ−２−ピペラジン−１−イル−９Ｈ−プリン−８−イル）−酢酸（Ａｐｐａ）、（（１Ｒ，４Ｓ）−６−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−イル−４−オキソ−４Ｈ−キナゾリン）−酢酸（Ｂｑａ）又は（１−オキソ−７−ピペラジン−１−イル−１Ｈ−イソキノリン−２−イル）−酢酸（Ｐｉｐａ）であり；
ＹはＨ又はアシル部分であり；
Ｒ１は、Ｉｌｅ、Ａｌａ、（Ｄ）Ｉｌｅ、Ｎ−メチルＩｌｅ、Ａｉｂ、１−１Ａｉｃ、２−２Ａｉｃ、Ａｃｈ又はＡｃｐであり；
Ｒ２は、Ｌｙｓ、Ａｌａ、（Ｄ）Ｌｙｓ、Ｎ−メチルｌｙｓ、Ｎｌｅ又は（Ｌｙｓ−Ｇｌｙ）であり；
Ｒ３は、Ａｒｇ、Ａｌａ、（Ｄ）Ａｒｇ、Ｎ−メチルＡｒｇ、Ｐｈｅ、３，４，５−トリフルオロＰｈｅ又は２，３，４，５，６−ペンタフルオロＰｈｅであり；
Ｒ４は、Ｈｉｓ、Ａｌａ、（Ｄ）Ｈｉｓ、Ｎ−メチルＨｉｓ、４−ＭｅＯＡｐｃ、３−Ｐａｌ又は４−Ｐａｌであり；
Ｒ５は、Ｔｙｒ、Ａｌａ、（Ｄ）Ｔｙｒ、Ｎ−メチルＴｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｉｃ、Ｂｉｐ、Ｄｉｐ、（１）Ｎａｌ、（２）Ｎａｌ、３，４，５−トリフルオロＰｈｅ又は２，３，４，５，６−ペンタフルオロＰｈｅであり；
Ｒ６は、Ｌｅｕ、Ａｌａ、（Ｄ）Ｌｅｕ又はＮ−メチルＬｅｕであり；
Ｒ７は、Ａｓｎ、Ａｌａ又は（Ｄ）Ａｓｎであり；
Ｒ８は、Ｌｅｕ又はＴｒｐであり；
Ｒ９は、Ｖａｌ、Ａｌａ、（Ｄ）Ｖａｌ又はＮ−メチルＶａｌであり；
Ｒ１０は、Ｔｈｒ、Ａｌａ又はＮ−メチルＴｈｒであり；
Ｒ１１は、Ａｒｇ、（Ｄ）Ａｒｇ又はＮ−メチルＡｒｇであり；
Ｒ１２は、Ｇｌｎ又はＡｌａであり；
Ｒ１３は、Ａｒｇ、（Ｄ）Ａｒｇ又はＮ−メチルＡｒｇであり、
Ｒ１４は、Ｔｙｒ、（Ｄ）ＴｙｒもしくはＮ−メチルＴｙｒ、修飾Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、修飾Ｐｈｅ、（１）Ｎａｌ、（２）Ｎａｌ、Ｃｈａ、Ｃ−α−メチルＴｙｒ又はＴｒｐである］で示される神経ペプチド２受容体アゴニスト又はその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
Ｘが、（４−アミノメチル−ビフェニル−３−イル）−酢酸（Ｃｂａ）、（５−ピペラジン−１−イル−インドール−１−イル）−酢酸（Ｃｉｐ）、３−（４−オキソ−６−ピペラジン−１−イル−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−プロピオン酸（ＨｏｍＰｑａ）、（６−［１，４］ジアゼパン−１−イル−４−オキソ−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−酢酸（Ｄｑａ）、（６−オキソ−２−ピペラジン−１−イル−１，６−ジヒドロプリン−７−イル）−酢酸（Ｐｄｐ）、（２−ピペラジン−１−イル−プリン−７−イル）−酢酸（Ｐｐａ）、（６−アミノ−２−ピペラジン−１−イル−９Ｈ−プリン−８−イル）−酢酸（Ａｐｐａ）、（（１Ｒ，４Ｓ）−６−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−イル−４−オキソ−４Ｈ−キナゾリン）−酢酸（Ｂｑａ）又は（１−オキソ−７−ピペラジン−１−イル−１Ｈ−イソキノリン−２−イル）−酢酸（Ｐｉｐａ）であり；
Ｙがアシル部分である、
請求項１記載の神経ペプチド２受容体アゴニスト。
【請求項３】
式（ＩＩ）：
Ｙ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−（ＮＭｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２ （ＩＩ）
［式中、
Ｘは、（４−アミノメチル−ビフェニル−３−イル）−酢酸（Ｃｂａ）、（５−ピペラジン−１−イル−インドール−１−イル）−酢酸（Ｃｉｐ）、３−（４−オキソ−６−ピペラジン−１−イル−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−プロピオン酸（ＨｏｍＰｑａ）、（６−［１，４］ジアゼパン−１−イル−４−オキソ−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−酢酸（Ｄｑａ）、（６−オキソ−２−ピペラジン−１−イル−１，６−ジヒドロプリン−７−イル）−酢酸（Ｐｄｐ）、（２−ピペラジン−１−イル−プリン−７−イル）−酢酸（Ｐｐａ）、（６−アミノ−２−ピペラジン−１−イル−９Ｈ−プリン−８−イル）−酢酸（Ａｐｐａ）、（（１Ｒ，４Ｓ）−６−２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−イル−４−オキソ−４Ｈ−キナゾリン）−酢酸（Ｂｑａ）又は（１−オキソ−７−ピペラジン−１−イル−１Ｈ−イソキノリン−２−イル）−酢酸（Ｐｉｐａ）であり；
Ｙはアシル部分である］を有する、請求項１又は２記載の神経ペプチド２受容体アゴニスト。
【請求項４】
以下から選択される、請求項１〜３のいずれか一項記載の神経ペプチド２受容体アゴニスト。
【表４】
【請求項５】
治療活性物質として使用される、請求項１〜４のいずれか一項記載の神経ペプチド２受容体アゴニスト。
【請求項６】
神経ペプチド２受容体アゴニストにより調節される疾患の治療又は予防のための治療活性物質として使用される、請求項１〜４のいずれか一項記載の神経ペプチド２受容体アゴニスト。
【請求項７】
治療有効量の請求項１〜４のいずれか一項記載の神経ペプチド２受容体アゴニストと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項８】
神経ペプチド２受容体アゴニストにより調節される疾患の治療又は予防のための請求項１〜４のいずれか一項記載の神経ペプチド２受容体アゴニストの使用。
【請求項９】
肥満、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性又は脂質異常症の治療又は予防のための請求項１〜４のいずれか一項記載の神経ペプチド２受容体アゴニストの使用。
【請求項１０】
肥満、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性又は脂質異常症の治療又は予防のための医薬の調製のための請求項１〜４のいずれか一項記載の神経ペプチド２受容体アゴニストの使用。
【請求項１１】
肥満、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性又は脂質異常症の治療又は予防のための方法であって、有効量の請求項１〜４のいずれか一項記載の神経ペプチド２受容体アゴニストを投与する段階を含む方法。
【請求項１２】
以上に記載の発明。
【公表番号】特表２０１２−５０２８８８（Ｐ２０１２−５０２８８８Ａ）
【公表日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２６４７１（Ｐ２０１１−５２６４７１）
【出願日】平成２１年９月７日（２００９．９．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６１５２４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３１７０７
【国際公開日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月７日（２００９．９．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６１５２４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３１７０７
【国際公開日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]