粒子凝集判定用容器
【課題】免疫学的な反応による凝集物のパターンを上下方向から容易かつ正確に判定でき、大量検体処理を自動分析機によって行うことが可能な粒子凝集判定用容器を提供する。
【解決手段】抗体または抗原を含む検体と凝集用粒子との反応を含む凝集反応により生成する凝集物に基づいて免疫学的分析を行う粒子凝集判定用容器であって、互いに対向する内面どうしの間に層状の間隙を形成するようにそれぞれ傾斜して配置された底部透明板状部材および上部透明板状部材と、前記層状の間隙に形成された、凝集物を分離する不溶性粒子を含む流動性分離層とを具備したことを特徴とする粒子凝集判定用容器。
【解決手段】抗体または抗原を含む検体と凝集用粒子との反応を含む凝集反応により生成する凝集物に基づいて免疫学的分析を行う粒子凝集判定用容器であって、互いに対向する内面どうしの間に層状の間隙を形成するようにそれぞれ傾斜して配置された底部透明板状部材および上部透明板状部材と、前記層状の間隙に形成された、凝集物を分離する不溶性粒子を含む流動性分離層とを具備したことを特徴とする粒子凝集判定用容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的分析に用いる容器に関するものであり、抗原抗体結合等による凝集反応、特に赤血球を用いた凝集反応により、被検物質を定性的あるいは定量的に判定するための粒子凝集判定用容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、抗原または抗体の有無を判定する方法として、抗原または抗体を結合させたラテックスや抗原が既に存在する赤血球に抗体または抗原を一定時間反応させ、ラテックスまたは赤血球の凝集パターンにより判定する受身凝集法が知られている。
【０００３】
上述の凝集パターンにより判定する受身凝集法の判定は、古くから試験管を反応容器として用いていた。この方法は、試験管内で赤血球とそれに反応する抗体を混合し、形成された赤血球−抗体の凝集物を自然沈降或いは遠心により一度沈殿させた後、試験管を振り揺らすことにより沈殿物をほぐして判定する方法である。この方法によれば、沈殿物がほぐれなければ陽性、ほぐれれば陰性であることを示す。しかしながら、実際にはこれらの中間の反応（弱陽性）も存在するが、この方法では肉眼で検出するのは困難である。また、試験管を使用する場合は試験管数が増大し、多数の検体を扱う場合には最適な方法とはいえない。
【０００４】
そこで、大量検査を行う場合は、たとえばＶ底やＵ底のウェルを多数備えたマイクロプレートに代表される反応容器を用いる。この方法においては、上述した方法と同様に、各ウェル内で赤血球とそれに反応する抗体を混合し、形成された赤血球−抗体の凝集物を自然沈降により沈殿させる。このとき、赤血球−抗体の凝集が生じていれば、反応容器の底面に凝集物が捕捉され、赤血球が底面に広がったようなパターンが得られる（陽性）。一方、凝集が生じなければ赤血球は反応容器の底面の最下部に集まる（陰性）。また、この中間の反応（弱陽性）も検出できる。この方法では反応容器であるマイクロプレートの底面における凝集物の捕捉を、マイクロプレートの上或いは下より目視、或いは光学的に検出することができるので大量検体処理に適している。マイクロプレート底面における凝集物の捕捉は、底面の状態に大きく左右される。凝集物は底面に安定に付着しなければならないが、何も加工を施していない平滑な底面では弱い凝集はすぐに滑り落ちてしまい、偽陰性となってしまう。そこで、特許文献１および特許文献２に述べられているように反応容器の底面に凹凸を作ったり、底面を粗面にしたりすることで、凝集物の捕捉をある程度は向上できる。しかしながら、ウェル底面のみによる凝集物の捕捉には限度がある。また、この方法では血球を自然沈降させるため、時間がかかる。
【０００５】
近年、これらの凝集物を更に効率よく捕捉する容器が考案されており、これを使用した受身凝集法を一般にマイクロカラム凝集法と呼んでいる。
【０００６】
Ｙ．Ｌａｐｉｅｒｒｅらは、特許文献３において、カード上に配置した細長いマイクロ反応容器に、１０〜２００μｍのポリマー粒子やガラス粒子に代表される不溶性粒子を充填し、遠心によって効率よく赤血球の凝集物と非凝集物を区別できる反応容器を考案している。また、特許文献４ではガラスビーズを用いた同様な反応容器が考案されている。いずれの方法も不溶性粒子が充填された細長いマイクロ反応容器が板状のプラスチック板に複数個埋め込まれたようになっており、マイクロ反応容器を垂直方向に立てた状態で使用する。通常、不溶性粒子は抗Ａ抗体や抗Ｂ抗体或いは抗ヒトグロブリン血清といった赤血球と反応する試薬（抗血清）に分散されている。不溶性粒子に抗体や抗原等の免疫学的反応をする物質を結合させて、赤血球をこれらの活性化された不溶性粒子に捕捉する方法も、特許文献５に述べられている。
【０００７】
分析に際しては、垂直に立てたマイクロ反応容器の上部開口から液体サンプルを注入するが、開口部はロート状になっていて反応槽として使用する。ここで、反応槽と不溶性粒子層とは、液体サンプルと不溶性粒子層とが反応前に接しないように、空気で隔離されている。反応させた後に遠心を行い、比重の関係により血球（およびそれに結合した抗体）のみを不溶性粒子槽に移動させて凝集物を不溶性粒子で捕捉する。そして側面から不溶性粒子による凝集物の捕捉を目視、或いは光学的に検出する。凝集物が不溶性粒子の上にある場合は強陽性反応を示し、凝集物が不溶性粒子の中層に存在する場合は弱陽性反応を示し、凝集物が下にある場合は陰性を示す。
【０００８】
ここで、不規則性抗体などの中には、赤血球上の抗原と反応しても凝集を起こさないものも存在する（不完全抗体）。このような抗体を検出する場合には、抗原抗体反応をさせた後に、２次抗体として抗グロブリン抗体（クームス血清）を添加することにより抗体を架橋し、赤血球の凝集を生じさせる（間接抗グロブリン試験（ＩＡＴ））。しかしながら通常、血漿等の検体中には試薬である赤血球に結合する抗体以外にも複数種の抗体が含まれるため、２次抗体が他の抗体にも結合してしまう。これを防ぐためには、赤血球上の抗原に目的の抗体を結合させた後に、遠心、洗浄操作を繰り返し、赤血球を洗浄して余分な抗体を除去する（Ｂ／Ｆ分離）必要がある。このような複雑な操作を機械によって自動化することは難しい。しかしながら、マイクロカラム凝集法においては、不溶性粒子層に抗グロブリン抗体を含有させておき、隔離された反応槽で赤血球−抗体の反応を行った後、遠心分離を行う。すると、比重の影響により血球（およびそれに結合した抗体）のみが不溶性粒子層に移動し、そこで抗グロブリン抗体と反応し、凝集を形成する。したがって、この方法によれば、赤血球の洗浄（Ｂ／Ｆ分離）を行うことなくＩＡＴを実施できる。
【０００９】
上述したような細長いマイクロ反応容器では、遠心分離法を用いることにより短時間で反応を終了させることができ、また陽性および陰性で凝集パターンの違いが明確であるため、判定が容易にできる。しかしながら、凝集パターンの展開が垂直方向であるということと、不溶性粒子層が不透明であるために上下方向から判定することは出来ず、横面から観察する必要がある。したがって何枚ものカードの凝集物を観察する際には、その都度カードを持ち上げて横面から判定しなければならず、このことは大量検体処理を自動分析機によって行わせる場合に、大きな障害となっている。また、このような問題の解決方法として、マイクロカラム凝集法を用いて大量検体処理を実施するために、底部の少なくとも一部が細くなっている容器に不溶性粒子を充填し、これをマイクロプレート状にしたものが、特許文献６に開示されている。これによれば、陽性の場合は凝集物が平らに広がったパターンが得られ、陰性の場合は非凝集物が細くなった部分に集まったパターンが得られるため、上下方向からの観察が可能となる。しかしながら、不溶性粒子の中には不透明なものもあり、そのような場合、特に弱陽性の反応が起きた場合に、上下方向からの検出が正確にできなくなるという問題がある。
【特許文献１】特公昭６１−４４２６８号公報
【特許文献２】特公昭６３−６０８５４号公報
【特許文献３】特公平８−７２１５号公報
【特許文献４】欧州特許出願公開第０７２５２７６号明細書
【特許文献５】国際公開第９５／３１７３１号パンフレット
【特許文献６】ドイツ特許第１００６１５１５号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って本発明は、凝集パターンの判定が容易かつ正確にでき、また上下方向から観察可能であり、大量検体処理を自動分析機によって行うことが可能な粒子凝集判定用容器を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第１の態様における粒子凝集判定用容器は、抗体または抗原を含む検体と凝集用粒子との反応を含む凝集反応により生成する凝集物に基づいて免疫学的分析を行う粒子凝集判定用容器であって、底面の少なくとも一部が斜面をなすように検体収容部が形成された透明容器本体と、前記検体収容部の底面との間に層状の間隙を形成するように前記検体収容部内に配置されたスペーサーと、前記層状の間隙に形成された、凝集物を分離する不溶性粒子を含む流動性分離層とを具備したことを特徴とする。
【００１２】
第１の態様の粒子凝集判定用容器においては、スペーサーの上部にスペーサーと一体化させた反応槽を設け、かつ反応槽の下部側面に小孔またはメッシュを設けることもできる。
【００１３】
第１の態様の粒子凝集判定用容器においては、検体収容部の底面に形成された斜面の傾斜角度は、水平面から４５°以上７５°以下であることが好ましい。また、斜面の傾斜が深部に向かうほど増加していてもよい。さらに、斜面は粗面化されていてもよい。
【００１４】
第１の態様の粒子凝集判定用容器においては、流動性分離層の厚さは、０．５〜２ｍｍであることが好ましい。また、不溶性粒子は、粒径２５〜２００μｍのガラスビーズまたは架橋ポリマーであることが好ましい。さらに、流動性分離層は、抗血清を含んでいてもよい。
【００１５】
第１の態様の粒子凝集判定用容器においては、同一の透明容器本体に複数の検体収容部を形成することが好ましい。
【００１６】
本発明の第２の態様における粒子凝集判定用容器は、抗体または抗原を含む検体と凝集用粒子との反応を含む凝集反応により生成する凝集物に基づいて免疫学的分析を行う粒子凝集判定用容器であって、互いに対向する内面どうしの間に層状の間隙を形成するようにそれぞれ傾斜して配置された底部透明板状部材および上部透明板状部材と、前記層状の間隙に形成された、凝集物を分離する不溶性粒子を含む流動性分離層とを具備したことを特徴とする。
【００１７】
第２の態様の粒子凝集判定用容器においては、底部透明板状部材の内面の傾斜角度は、水平面から４５°以上７５°以下であることが好ましい。また、底部透明板状部材の内面は粗面化されていてもよい。
【００１８】
第２の態様の粒子凝集判定用容器においても、流動性分離層の厚さは、０．５〜２ｍｍであることが好ましい。また、不溶性粒子は、粒径２５〜２００μｍのガラスビーズまたは架橋ポリマーであることが好ましい。さらに、流動性分離層は、抗血清を含んでいてもよい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、凝集パターンの判定が容易かつ正確にでき、また凝集パターンを上下方向から観察できる。さらに、本発明の容器をマイクロプレート状にすることにより、大量検体処理を自動分析機によって行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明を図面を用いてより詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２１】
図１は、本発明の第１の実施形態に係る粒子凝集判定用容器１０の断面図である。透明容器本体たとえば透明樹脂からなるマイクロプレート１１には、底面１３の少なくとも一部が斜面をなすように検体収容部としてのウェル１２が形成されている。ウェル１２内には、ウェル底面１３との間に層状の間隙を形成するように、ウェル底面１３にほぼ平行に対向する下面を有するスペーサー１４が配置されている（スペーサー１４の支持部材は図示していない）。ウェル底面１３とスペーサー１４の下面との間の間隙には凝集物を分離する不溶性粒子を含む流動性分離層１５が形成されている。流動性分離層１５は、ウェル１２の下方から凝集パターンの観察が容易にできるように、その上面がウェル底面１３の斜面が始まる点とほぼ一致するように不溶性粒子の量を調整することが好ましい。
【００２２】
スペーサー１４は、容器に蓋を設けて蓋に固定する等して、スペーサー１４とウェル底面１３との間の間隔、すなわち流動性分離層１５の厚さが調節される。流動性分離層１５の厚さは０．５ｍｍ〜２ｍｍ程度が好ましい。スペーサー１４上部のウェル１２内部は反応槽として用いることができる。反応槽に収容された反応液と流動性分離層１５とが接触することを防ぐため、スペーサー１４は流動性分離層１５の上方に張り出していることが好ましい。
【００２３】
本発明において、流動性分離層１５に使用される不溶性粒子は従来のマイクロカラム凝集法において通常使用されているものであれば良く、比重の大きい不溶性粒子が扱いやすいが、特に限定されるものではない。また、ＥＰ７９７０９７に記載される様な多孔物質を用いることもできる。好ましくはガラスビーズまたは架橋ポリマーを使用する。粒径は２５〜２００μｍが好ましい。また、ＩＡＴなどの試験項目によっては、不溶性粒子を抗血清中に浮遊させてもよい。
【００２４】
図１のような構成のウェル１２を同一マイクロプレート１１に複数個形成することにより、多数の検体を同時に処理することができる。例えば、８×１２のウェルを２次元的に配列したマイクロプレートが挙げられる。
【００２５】
本発明の粒子凝集判定用容器の使用方法を次に示すが、これに限定するものではなく、多少の改変が可能である。また、ここでは受身凝集法について説明するが、本発明の容器の用途はこれに限定されるものではない。まず、抗原または抗体が結合したラテックスまたは赤血球などの凝集用粒子と、凝集用粒子上の抗原または抗体と結合する抗体または抗原を含む検体とを、図１に示すウェル１２内のスペーサー１４上部の空間（反応槽）で必要に応じて一定時間反応させるか、ウェル１２の外部で一定時間反応させた後にウェル１２に入れる。この反応液を遠心分離にかけると、反応液はウェル底面１３とスペーサー１４との間隙に入って流動性分離層１５に接し、比重の関係により凝集用粒子（およびこれに結合した抗体または抗原）のみが流動性分離層１５中に移動し、斜面をなすウェル底面１３に沿って最下部へ向かって沈降する。強い凝集が起こった場合には、凝集物１６が流動性分離層１５内の上部に捕捉される（図２ａおよび下から見た図３ａ）。比較的弱い凝集の場合には、凝集物１６は流動性分離層１５の中間部に捕捉される（図２ｂおよび下から見た図３ｂ）。陰性の場合には、凝集用粒子は最下部に沈降する（図２ｃおよび下から見た図３ｃ）。このように、ウェル１２内にスペーサー１４を設け、ウェル１２底面の斜面に沿うように層状の流動性分離層１５を設けることにより、不溶性粒子が不透明であっても、下側からの観察で容易に凝集物の捕捉を判定できる。
【００２６】
図１においてはウェル１２の底面１３がＶ状の斜面をなし、その斜面の水平面からの傾斜角度が約６５°である場合を示しているが、図４に示すように、底面１３ａの傾斜を深部に向かうほど増加するように連続的に変化させ、スペーサー１４の下面を底面１３ａに対応させた形状としてもよい。
【００２７】
通常市販されているマイクロプレートのウェルのＶ状底面は傾斜角度が約３０°であるが、斜面２の傾斜が緩いと非凝集の粒子が底部に集まったときに薄く広がったようなパターンになってしまい、陰性の判断がしにくい。したがって図１に示す容器のウェル底面の斜面の傾斜角度は水平面から４５°以上が好ましく、特に５５°〜７５°が好ましい。この場合、遠心条件は、斜面の角度と使用する不溶性粒子の種類にもよるが、７０Ｇ〜６００Ｇで５〜１０分が好ましい。なお、陽性パターンを得るためには遠心Ｇは低い方が好ましいので、７０Ｇ〜１１５Ｇで遠心することが最も好ましい。
【００２８】
特公平８−７２１５やＥＰ７２５２７６に述べられている細長いマイクロ反応容器では、壁面が垂直であるため凝集物の捕捉は１００％粒子によっているが、本発明に係る容器では斜面をなす底面の傾斜角度が水平に近づくにつれ、凝集物の捕捉は底面の影響を受けるようになる。このため、図５に示すように、ウェル１２の底面１３ｂを粗面化してもよい。図５に示すウェル１２の底面１３ｂは例えば特公昭６１−４４２６８や特公昭６３−６０８５４に記載されるものと同様である。なお、図５ではスペーサーを省略している。ここでいう粗面とは、凝集物のみが捕捉される程度の凹凸を有する面である。したがって、図５に示したウェル底面１３ｂのように規則的な凹凸を設けてもよいし、不規則な凹凸を有していても良い。
【００２９】
また、図６に示すように、スペーサー１４の上部にスペーサー１４と一体化した反応槽を設けることもできる。この場合、各ウェル１２に挿入される個々のスペーサー１４は蓋状の保持部１７により互いに連結され、スペーサー１４上部に保持部１７の垂直壁面によって囲まれた円筒状の反応槽１８が設けられる。反応槽１８の下部壁面には小孔またはメッシュ１９が形成されている。なお、この小孔またはメッシュ１９は、反応により生じた凝集物が透過でき、かつ反応液が遠心操作前に流出しない程度の大きさである。
【００３０】
このような構成においては、保持部１７により一体化されたスペーサー１４をマイクロプレート１１から取り外し、反応槽１８内で検体と凝集用粒子を予め反応させてから、マイクロプレート１１に取り付け、遠心操作を行う方法も可能である。このように、スペーサーの上部を反応槽として使用することで、ＩＡＴの様な２段階の反応ステップの必要な試験項目においても、検体の移動が必要なく一つの反応容器で処理することが可能である。
【００３１】
図７は、本発明の第２の実施形態に係る粒子凝集判定用容器３０の断面図である。この粒子凝集判定用容器３０は、たとえば平面形状が三角形の透明樹脂からなる底部透明板状部材３１および上部透明板状部材３２を、互いに対向する内面どうしの間に層状の間隙を形成するようにそれぞれ傾斜して配置し、この層状の間隙に凝集物を分離する不溶性粒子を含む流動性分離層３３を形成したものである。なお、底部透明板状部材３１および上部透明板状部材３２の側面も同様の素材で覆われている。このような構成とすることにより、本発明の第１の実施形態と同様に、層状の流動性分離層３３を形成することができる。なお、底部透明板状部材３１および上部透明板状部材３２の平面形状は三角形に限定されるものではないが、非凝集物の沈殿の確認が容易にできるように、深部に向かうほど幅が狭くなる形状であることが好ましい。
【００３２】
底部透明板状部材３１および上部透明板状部材３２の内面は曲面を有していてもよく、例えば流動性分離層３３が円筒形や円錐形であっても良い。底部透明板状部材３１および上部透明板状部材３２との間隔は０．５ｍｍ〜２ｍｍ程度が好ましく、流動性分離層３３の上部は反応槽として使用することができる。底部透明板状部材３１の内面の傾斜角度は水平面から４５°〜７５°が好ましい。底部透明板状部材３１の内面は凝集物が付着するように粗面化しておいてもよい。
【００３３】
不溶性粒子は試験項目に応じて抗血清に浮遊させておくことができる。使用する不溶性粒子は、上記第１の実施形態において説明したものと同様であり、比重の大きい不溶性粒子が扱いやすいが限定されるものではない。また、多孔性物質を使用することもできる。粒径は２５〜２００μｍが好ましい。
【００３４】
本実施形態の容器を使用するには、上記第１の実施形態において説明したのと同様に、流動性分離層３３の上部（反応槽）に検体を分注し、必要に応じて一定時間反応させた後、遠心を行う。凝集用粒子は底部透明板状部材３１と上部透明板状部材３２との間隙の流動性分離層３３中で斜面に沿って滑り落ちる。このとき、強陽性であれば、凝集物３５が流動性分離層３３上部に捕捉される（図８ａおよび図９ａ）。比較的弱い凝集の場合には、凝集物３５は流動性分離層３３の中間に捕捉される（図８ｂおよび図９ｂ）。陰性の場合には、凝集用粒子は流動性分離層３３の最下部に沈降する（図８ｃおよび図９ｃ）。
【００３５】
本発明においては、短時間で所望の沈殿を達成するために、遠心分離法によりパターン形成することが好ましい。遠心の最適条件の決定は、使用する容器の形状、不溶性粒子の種類、分析対象それぞれについて確認しなければならない。その理由は、凝集物および凝集していない凝集用粒子、遊離している抗体および抗原ならびに不溶性粒子のそれぞれの比重、大きさ、形、変形性、安定性が影響力を有しており、それは計算によって得ることが困難であるからである。
【００３６】
以上詳述したように本発明によれば、粒子の凝集判定を短時間で容易に行うことができ、しかも斜面に沿って凝集用粒子を沈降させることによって、粒子にかかる重力（遠心力）は斜面方向に分散されるため、弱い力で凝集用粒子を展開できるので、弱い凝集反応もより高感度に検出できる。また、上下方向からの判定が可能なために、この容器を同一基板上に２次元的に複数個形成することにより、従来問題となっていた大量検体処理を自動分析機により行うことができる。
【００３７】
本発明の粒子凝集判定用容器を同一基板上に形成し、マイクロプレート状にした容器を用いて、凝集の有無を自動判定装置により判定する方法はいくつか考えられるが、その一例を以下に示す。
【００３８】
図１０は、自動判定装置８１の一例を示す模式図である。この装置は、検査者の目視判定により近付けるために、ＣＣＤカメラ８５を用いて反応パターンを１ウェルずつ走査するものである。マイクロプレート８２の上部には、蛍光管８３、および光散乱板８４が設置されている。蛍光管８３から放射された光は光散乱板８４を通って光の分布が一様になるように散乱され、マイクロプレート８２のウェルに照射される。マイクロプレート８２の下部にはＣＣＤカメラ８５が設置され、ウェル内の凝集パターンを透過した光はＣＣＤカメラ８５で電気信号に変換される。電気信号に変換されたウェル内の画像情報は画像処理回路８６に入力され、高速ＣＰＵにより凝集・非凝集を判定するために画像処理される。これを１ウェルずつ走査し、種々の判定パラメーターを用いて高速ＣＰＵにより自動判定することにより、大量の検体を自動的に処理することができる。
【００３９】
ここで、凝集・非凝集を判定するためのパラメーターとしては、透過光量の変化から算出したウェル内各部（例えば、ウェルの中心から同心円状に中心部、内部、外周部の３部分に分ける）における凝集物の面積や、ウェル内各部における透過光量の比、およびウェル外の透過光量とウェル内各部の透過光量の比などを用いることができる。
【実施例】
【００４０】
以下本発明を実施例により説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。
【００４１】
＜実施例１：容器底面の傾斜角度と遠心Ｇの最適化＞
底面が種々の傾斜角度（３０°、４５°、６０°、７５°）の斜面をなすロート状容器を準備した。一方、不溶性粒子としてガラスビーズ（ＵＢ６７ＬＲＳ；（株）ユニオン）をＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液に懸濁させた懸濁液を調製した。それぞれのロート状容器に上記懸濁液を分注してガラスビーズを沈殿させた。次に、懸濁液の上部にＡ型ドナー血漿１００μＬおよび０．５％に希釈したＡ型血球（Ｏｒｔｈｏ社アファーマジェン）１００μＬを分注し、３６Ｇ〜５７０Ｇにおいて５分間遠心を行い、陰性パターンを観察した。この結果を表１に示す。
【表１】
【００４２】
底面の傾斜角度が４５°以下では、形成された陰性パターンが容器最下部で広がった形になり、好ましくなかった。また、底面の傾斜角度が７５°以上では、容器最下部の陰性パターンを下方から観察するのが困難であった。
【００４３】
上記とは別に陽性反応を観察したところ、遠心Ｇが４５０Ｇ以上では陽性反応が弱まる傾向にあった。
【００４４】
以上の結果から、好ましい底面の傾斜角度は４５°〜７５°であり、試験に際しては７０Ｇ〜３００Ｇで５〜１０分遠心することが好ましいと考えられた。以下の実施例においては、底面の傾斜角度が６０°である容器を用い、７０Ｇ、１０分間の条件で遠心して検討することにした。
【００４５】
＜実施例２：血液型オモテ検査＞
図１に示すように、マイクロプレート１１に開口部の直径が約１ｃｍ、斜面をなす底面１３の傾斜角度が６０°であるウェル１２を複数形成した。一方、不溶性粒子として粒径約１００μｍのガラスビーズ（ＵＢ６７ＬＲＳ；（株）ユニオン）を、抗Ａ或いは抗Ｂ血清を含むＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液に懸濁させて懸濁液を調製した。各懸濁液をそれぞれのウェルに分注した後、スペーサー１４をウェル１２内に挿入し、ウェル底面１３とスペーサー１４の下面との間の間隙に層状の流動性分離層１５を形成した。このとき、流動性分離層１５の上面がウェル底面１３の傾斜が始まる位置とほぼ一致するように懸濁液の量を調整した。
【００４６】
次に、各ウェル１２内に、生理食塩水で０．５％に希釈したＡ型血球（Ｏｒｔｈｏ社アファーマジェン）或いはＢ型血球（Ｏｒｔｈｏ社アファーマジェン）を１００μＬ分注して、７０Ｇで１０分間遠心した。
【００４７】
遠心後、各ウェル１２の下方から凝集パターンを観察した。その結果、Ａ型血球は、抗Ａ血清と反応して図３（ａ）の様にガラスビーズ上に血球が凝集した陽性パターンを呈し、抗Ｂ血清と反応せず図３（ｃ）の様な陰性パターンを呈した。逆に、Ｂ型血球は、抗Ａ血清と反応せず図３（ｃ）の様な陰性パターンを呈し、抗Ｂ血清と反応して図３（ａ）の様にガラスビーズ上に血球が凝集した陽性パターンを呈した。このように、オモテ検査の陽性、陰性が正しく判定された。
【００４８】
＜実施例３：血液型ウラ検査＞
実施例２と同様に、図１に示すように、マイクロプレート１１に開口部の直径が約１ｃｍ、斜面をなす底面１３の傾斜角度が６０°であるウェル１２を複数形成した。一方、不溶性粒子として粒径約１００μｍのガラスビーズ（ＵＢ６７ＬＲＳ；（株）ユニオン）を、ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液に懸濁させて懸濁液を調製した。この懸濁液をそれぞれのウェルに分注した後、スペーサー１４をウェル１２内に挿入し、ウェル底面１３とスペーサー１４の下面との間の間隙に層状の流動性分離層１５を形成した。このとき、流動性分離層１５の上面がウェル底面１３の傾斜が始まる位置とほぼ一致するように懸濁液の量を調整した。
【００４９】
次に、各ウェル１２内に、生理食塩水で０．５％に希釈したＡ型血球或いはＢ型血球（Ｏｒｔｈｏ社アファーマジェン）を１００μＬ分注し、さらにＢ型ドナー由来のＡＣＤ加血漿をＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液で２〜６４倍に希釈したものを検体として１００μＬ分注し、室温で５分間放置後、７０Ｇで１０分間遠心した。
【００５０】
遠心後、各ウェル１２の下方から凝集パターンを観察した。その結果、Ａ型血球は図３（ａ）の様にガラスビーズ上に血球が凝集した陽性パターンを呈し、Ｂ型血球は図３（ｃ）の様な陰性パターンを呈した。このように、Ｂ型ドナーのウラ検査は正しく判定された。
【００５１】
このとき、各希釈検体の凝集パターンを２，１，ｗ，０の４段階で評価した結果を表２に示した。なお、２は強陽性を、１，ｗは弱陽性を、０は陰性を示す。
【００５２】
同じ希釈検体についてＩＤ−Ｓｙｓｔｅｍ ＮａＣｌカード（ＤｉａＭｅｄ ＡＧ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ Ｍｏｒａｔ）、およびＩＤ−ＤｉａＣｅｌｌ Ａ１，Ｂ血球（ＤｉａＭｅｄ ＡＧ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ Ｍｏｒａｔ）を使用して試験を行い、反応性を確認した。メーカーのマニュアルに従って、各希釈検体の凝集パターンを４，３，２，１，ｗ，０の６段階で評価した結果を表２に示した。なお、４は強陽性を、３〜ｗは弱陽性を、０は陰性を示す。
【００５３】
表２から、本実施例の粒子凝集判定用容器の方が、ＩＤ−Ｓｙｓｔｅｍより希釈感度が高いことが分かった。
【表２】
【００５４】
＜実施例４：不規則抗体検査＞
実施例２、３と同様に、図１に示すように、マイクロプレート１１に開口部の直径が約１ｃｍ、斜面をなす底面１３の傾斜角度が６０°であるウェル１２を複数形成した。一方、不溶性粒子として粒径約１００μｍのガラスビーズ（ＵＢ６７ＬＲＳ；（株）ユニオン）を、抗ヒトグロブリン試薬（Ｏｒｔｈｏ社）に懸濁させて懸濁液を調製した。この懸濁液をそれぞれのウェルに分注した後、スペーサー１４をウェル１２内に挿入し、ウェル底面１３とスペーサー１４の下面との間の間隙に層状の流動性分離層１５を形成した。このとき、流動性分離層１５の上面がウェル底面１３の傾斜が始まる位置とほぼ一致するように懸濁液の量を調整した。
【００５５】
各ウェル１２に、生理食塩水で０．５％に希釈したＯ型Ｒ１Ｒ１血球（Ｏｒｔｈｏ社サージスクリーン）或いはＯ型ｒｒ血球（Ｏｒｔｈｏ社サージスクリーン）を１００μＬ分注し、更にドナー由来の抗Ｄ抗体保有血漿を１００μＬ分注し、３７℃で１０分間インキュベートした後、７０Ｇで１０分間遠心した。
【００５６】
遠心後、ウェルの下方から凝集パターンを観察した。Ｏ型Ｒ１Ｒ１血球は、図３（ａ）の様なガラスビーズの上に血球が凝集した陽性パターンを呈した。Ｏ型ｒｒ血球は、図３（ｃ）の様な陰性パターンを呈した。このように、２段階の反応を要するＩＡＴも、洗浄操作を行わずに１つの容器内で行うことができた。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る粒子凝集判定用容器の断面図。
【図２】本発明の第１の実施形態に係る粒子凝集判定用容器を用いて試験を行った場合の、陽性（ａ）、弱陽性（ｂ）、および陰性（ｃ）反応のそれぞれの凝集パターンを横から見た図。
【図３】本発明の第１の実施形態に係る粒子凝集判定用容器を用いて試験を行った場合の、陽性（ａ）、弱陽性（ｂ）、および陰性（ｃ）反応のそれぞれ凝集パターンを下方から見た図。
【図４】本発明の第１の実施形態に係る粒子凝集判定用容器の変形例の断面図。
【図５】本発明の第１の実施形態に係る粒子凝集判定用容器の変形例の断面図。
【図６】本発明の第１の実施形態に係る粒子凝集判定用容器の変形例の断面図。
【図７】本発明の第２の実施形態に係る粒子凝集判定用容器の断面図。
【図８】本発明の第２の実施形態に係る粒子凝集判定用容器を用いて試験を行った場合の、陽性（ａ）、弱陽性（ｂ）、および陰性（ｃ）反応のそれぞれ凝集パターンを横から見た図。
【図９】本発明の第２の実施形態に係る粒子凝集判定用容器を用いて試験を行った場合の、陽性（ａ）、弱陽性（ｂ）、および陰性（ｃ）反応のそれぞれ凝集パターンを上方から見た図。
【図１０】本発明の粒子凝集判定用容器に適用可能な、凝集・非凝集の自動判定装置の一例を示す模式図。
【符号の説明】
【００５８】
１０…粒子凝集判定用容器
１１…透明容器本体
１２…検体収容部
１３、１３ａ、１３ｂ…底面
１４…スペーサー
１５…流動性分離層
１６…凝集物
１７…保持部
１８…反応槽
１９…小孔またはメッシュ
３０…粒子凝集判定用容器
３１…底部透明板状部材
３２…上部透明板状部材
３３…流動性分離層
３５…凝集物
８１…自動判定装置
８２…マイクロプレート
８３…蛍光管
８４…光散乱板
８５…ＣＣＤカメラ
８６…画像処理回路
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的分析に用いる容器に関するものであり、抗原抗体結合等による凝集反応、特に赤血球を用いた凝集反応により、被検物質を定性的あるいは定量的に判定するための粒子凝集判定用容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、抗原または抗体の有無を判定する方法として、抗原または抗体を結合させたラテックスや抗原が既に存在する赤血球に抗体または抗原を一定時間反応させ、ラテックスまたは赤血球の凝集パターンにより判定する受身凝集法が知られている。
【０００３】
上述の凝集パターンにより判定する受身凝集法の判定は、古くから試験管を反応容器として用いていた。この方法は、試験管内で赤血球とそれに反応する抗体を混合し、形成された赤血球−抗体の凝集物を自然沈降或いは遠心により一度沈殿させた後、試験管を振り揺らすことにより沈殿物をほぐして判定する方法である。この方法によれば、沈殿物がほぐれなければ陽性、ほぐれれば陰性であることを示す。しかしながら、実際にはこれらの中間の反応（弱陽性）も存在するが、この方法では肉眼で検出するのは困難である。また、試験管を使用する場合は試験管数が増大し、多数の検体を扱う場合には最適な方法とはいえない。
【０００４】
そこで、大量検査を行う場合は、たとえばＶ底やＵ底のウェルを多数備えたマイクロプレートに代表される反応容器を用いる。この方法においては、上述した方法と同様に、各ウェル内で赤血球とそれに反応する抗体を混合し、形成された赤血球−抗体の凝集物を自然沈降により沈殿させる。このとき、赤血球−抗体の凝集が生じていれば、反応容器の底面に凝集物が捕捉され、赤血球が底面に広がったようなパターンが得られる（陽性）。一方、凝集が生じなければ赤血球は反応容器の底面の最下部に集まる（陰性）。また、この中間の反応（弱陽性）も検出できる。この方法では反応容器であるマイクロプレートの底面における凝集物の捕捉を、マイクロプレートの上或いは下より目視、或いは光学的に検出することができるので大量検体処理に適している。マイクロプレート底面における凝集物の捕捉は、底面の状態に大きく左右される。凝集物は底面に安定に付着しなければならないが、何も加工を施していない平滑な底面では弱い凝集はすぐに滑り落ちてしまい、偽陰性となってしまう。そこで、特許文献１および特許文献２に述べられているように反応容器の底面に凹凸を作ったり、底面を粗面にしたりすることで、凝集物の捕捉をある程度は向上できる。しかしながら、ウェル底面のみによる凝集物の捕捉には限度がある。また、この方法では血球を自然沈降させるため、時間がかかる。
【０００５】
近年、これらの凝集物を更に効率よく捕捉する容器が考案されており、これを使用した受身凝集法を一般にマイクロカラム凝集法と呼んでいる。
【０００６】
Ｙ．Ｌａｐｉｅｒｒｅらは、特許文献３において、カード上に配置した細長いマイクロ反応容器に、１０〜２００μｍのポリマー粒子やガラス粒子に代表される不溶性粒子を充填し、遠心によって効率よく赤血球の凝集物と非凝集物を区別できる反応容器を考案している。また、特許文献４ではガラスビーズを用いた同様な反応容器が考案されている。いずれの方法も不溶性粒子が充填された細長いマイクロ反応容器が板状のプラスチック板に複数個埋め込まれたようになっており、マイクロ反応容器を垂直方向に立てた状態で使用する。通常、不溶性粒子は抗Ａ抗体や抗Ｂ抗体或いは抗ヒトグロブリン血清といった赤血球と反応する試薬（抗血清）に分散されている。不溶性粒子に抗体や抗原等の免疫学的反応をする物質を結合させて、赤血球をこれらの活性化された不溶性粒子に捕捉する方法も、特許文献５に述べられている。
【０００７】
分析に際しては、垂直に立てたマイクロ反応容器の上部開口から液体サンプルを注入するが、開口部はロート状になっていて反応槽として使用する。ここで、反応槽と不溶性粒子層とは、液体サンプルと不溶性粒子層とが反応前に接しないように、空気で隔離されている。反応させた後に遠心を行い、比重の関係により血球（およびそれに結合した抗体）のみを不溶性粒子槽に移動させて凝集物を不溶性粒子で捕捉する。そして側面から不溶性粒子による凝集物の捕捉を目視、或いは光学的に検出する。凝集物が不溶性粒子の上にある場合は強陽性反応を示し、凝集物が不溶性粒子の中層に存在する場合は弱陽性反応を示し、凝集物が下にある場合は陰性を示す。
【０００８】
ここで、不規則性抗体などの中には、赤血球上の抗原と反応しても凝集を起こさないものも存在する（不完全抗体）。このような抗体を検出する場合には、抗原抗体反応をさせた後に、２次抗体として抗グロブリン抗体（クームス血清）を添加することにより抗体を架橋し、赤血球の凝集を生じさせる（間接抗グロブリン試験（ＩＡＴ））。しかしながら通常、血漿等の検体中には試薬である赤血球に結合する抗体以外にも複数種の抗体が含まれるため、２次抗体が他の抗体にも結合してしまう。これを防ぐためには、赤血球上の抗原に目的の抗体を結合させた後に、遠心、洗浄操作を繰り返し、赤血球を洗浄して余分な抗体を除去する（Ｂ／Ｆ分離）必要がある。このような複雑な操作を機械によって自動化することは難しい。しかしながら、マイクロカラム凝集法においては、不溶性粒子層に抗グロブリン抗体を含有させておき、隔離された反応槽で赤血球−抗体の反応を行った後、遠心分離を行う。すると、比重の影響により血球（およびそれに結合した抗体）のみが不溶性粒子層に移動し、そこで抗グロブリン抗体と反応し、凝集を形成する。したがって、この方法によれば、赤血球の洗浄（Ｂ／Ｆ分離）を行うことなくＩＡＴを実施できる。
【０００９】
上述したような細長いマイクロ反応容器では、遠心分離法を用いることにより短時間で反応を終了させることができ、また陽性および陰性で凝集パターンの違いが明確であるため、判定が容易にできる。しかしながら、凝集パターンの展開が垂直方向であるということと、不溶性粒子層が不透明であるために上下方向から判定することは出来ず、横面から観察する必要がある。したがって何枚ものカードの凝集物を観察する際には、その都度カードを持ち上げて横面から判定しなければならず、このことは大量検体処理を自動分析機によって行わせる場合に、大きな障害となっている。また、このような問題の解決方法として、マイクロカラム凝集法を用いて大量検体処理を実施するために、底部の少なくとも一部が細くなっている容器に不溶性粒子を充填し、これをマイクロプレート状にしたものが、特許文献６に開示されている。これによれば、陽性の場合は凝集物が平らに広がったパターンが得られ、陰性の場合は非凝集物が細くなった部分に集まったパターンが得られるため、上下方向からの観察が可能となる。しかしながら、不溶性粒子の中には不透明なものもあり、そのような場合、特に弱陽性の反応が起きた場合に、上下方向からの検出が正確にできなくなるという問題がある。
【特許文献１】特公昭６１−４４２６８号公報
【特許文献２】特公昭６３−６０８５４号公報
【特許文献３】特公平８−７２１５号公報
【特許文献４】欧州特許出願公開第０７２５２７６号明細書
【特許文献５】国際公開第９５／３１７３１号パンフレット
【特許文献６】ドイツ特許第１００６１５１５号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って本発明は、凝集パターンの判定が容易かつ正確にでき、また上下方向から観察可能であり、大量検体処理を自動分析機によって行うことが可能な粒子凝集判定用容器を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第１の態様における粒子凝集判定用容器は、抗体または抗原を含む検体と凝集用粒子との反応を含む凝集反応により生成する凝集物に基づいて免疫学的分析を行う粒子凝集判定用容器であって、底面の少なくとも一部が斜面をなすように検体収容部が形成された透明容器本体と、前記検体収容部の底面との間に層状の間隙を形成するように前記検体収容部内に配置されたスペーサーと、前記層状の間隙に形成された、凝集物を分離する不溶性粒子を含む流動性分離層とを具備したことを特徴とする。
【００１２】
第１の態様の粒子凝集判定用容器においては、スペーサーの上部にスペーサーと一体化させた反応槽を設け、かつ反応槽の下部側面に小孔またはメッシュを設けることもできる。
【００１３】
第１の態様の粒子凝集判定用容器においては、検体収容部の底面に形成された斜面の傾斜角度は、水平面から４５°以上７５°以下であることが好ましい。また、斜面の傾斜が深部に向かうほど増加していてもよい。さらに、斜面は粗面化されていてもよい。
【００１４】
第１の態様の粒子凝集判定用容器においては、流動性分離層の厚さは、０．５〜２ｍｍであることが好ましい。また、不溶性粒子は、粒径２５〜２００μｍのガラスビーズまたは架橋ポリマーであることが好ましい。さらに、流動性分離層は、抗血清を含んでいてもよい。
【００１５】
第１の態様の粒子凝集判定用容器においては、同一の透明容器本体に複数の検体収容部を形成することが好ましい。
【００１６】
本発明の第２の態様における粒子凝集判定用容器は、抗体または抗原を含む検体と凝集用粒子との反応を含む凝集反応により生成する凝集物に基づいて免疫学的分析を行う粒子凝集判定用容器であって、互いに対向する内面どうしの間に層状の間隙を形成するようにそれぞれ傾斜して配置された底部透明板状部材および上部透明板状部材と、前記層状の間隙に形成された、凝集物を分離する不溶性粒子を含む流動性分離層とを具備したことを特徴とする。
【００１７】
第２の態様の粒子凝集判定用容器においては、底部透明板状部材の内面の傾斜角度は、水平面から４５°以上７５°以下であることが好ましい。また、底部透明板状部材の内面は粗面化されていてもよい。
【００１８】
第２の態様の粒子凝集判定用容器においても、流動性分離層の厚さは、０．５〜２ｍｍであることが好ましい。また、不溶性粒子は、粒径２５〜２００μｍのガラスビーズまたは架橋ポリマーであることが好ましい。さらに、流動性分離層は、抗血清を含んでいてもよい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、凝集パターンの判定が容易かつ正確にでき、また凝集パターンを上下方向から観察できる。さらに、本発明の容器をマイクロプレート状にすることにより、大量検体処理を自動分析機によって行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明を図面を用いてより詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２１】
図１は、本発明の第１の実施形態に係る粒子凝集判定用容器１０の断面図である。透明容器本体たとえば透明樹脂からなるマイクロプレート１１には、底面１３の少なくとも一部が斜面をなすように検体収容部としてのウェル１２が形成されている。ウェル１２内には、ウェル底面１３との間に層状の間隙を形成するように、ウェル底面１３にほぼ平行に対向する下面を有するスペーサー１４が配置されている（スペーサー１４の支持部材は図示していない）。ウェル底面１３とスペーサー１４の下面との間の間隙には凝集物を分離する不溶性粒子を含む流動性分離層１５が形成されている。流動性分離層１５は、ウェル１２の下方から凝集パターンの観察が容易にできるように、その上面がウェル底面１３の斜面が始まる点とほぼ一致するように不溶性粒子の量を調整することが好ましい。
【００２２】
スペーサー１４は、容器に蓋を設けて蓋に固定する等して、スペーサー１４とウェル底面１３との間の間隔、すなわち流動性分離層１５の厚さが調節される。流動性分離層１５の厚さは０．５ｍｍ〜２ｍｍ程度が好ましい。スペーサー１４上部のウェル１２内部は反応槽として用いることができる。反応槽に収容された反応液と流動性分離層１５とが接触することを防ぐため、スペーサー１４は流動性分離層１５の上方に張り出していることが好ましい。
【００２３】
本発明において、流動性分離層１５に使用される不溶性粒子は従来のマイクロカラム凝集法において通常使用されているものであれば良く、比重の大きい不溶性粒子が扱いやすいが、特に限定されるものではない。また、ＥＰ７９７０９７に記載される様な多孔物質を用いることもできる。好ましくはガラスビーズまたは架橋ポリマーを使用する。粒径は２５〜２００μｍが好ましい。また、ＩＡＴなどの試験項目によっては、不溶性粒子を抗血清中に浮遊させてもよい。
【００２４】
図１のような構成のウェル１２を同一マイクロプレート１１に複数個形成することにより、多数の検体を同時に処理することができる。例えば、８×１２のウェルを２次元的に配列したマイクロプレートが挙げられる。
【００２５】
本発明の粒子凝集判定用容器の使用方法を次に示すが、これに限定するものではなく、多少の改変が可能である。また、ここでは受身凝集法について説明するが、本発明の容器の用途はこれに限定されるものではない。まず、抗原または抗体が結合したラテックスまたは赤血球などの凝集用粒子と、凝集用粒子上の抗原または抗体と結合する抗体または抗原を含む検体とを、図１に示すウェル１２内のスペーサー１４上部の空間（反応槽）で必要に応じて一定時間反応させるか、ウェル１２の外部で一定時間反応させた後にウェル１２に入れる。この反応液を遠心分離にかけると、反応液はウェル底面１３とスペーサー１４との間隙に入って流動性分離層１５に接し、比重の関係により凝集用粒子（およびこれに結合した抗体または抗原）のみが流動性分離層１５中に移動し、斜面をなすウェル底面１３に沿って最下部へ向かって沈降する。強い凝集が起こった場合には、凝集物１６が流動性分離層１５内の上部に捕捉される（図２ａおよび下から見た図３ａ）。比較的弱い凝集の場合には、凝集物１６は流動性分離層１５の中間部に捕捉される（図２ｂおよび下から見た図３ｂ）。陰性の場合には、凝集用粒子は最下部に沈降する（図２ｃおよび下から見た図３ｃ）。このように、ウェル１２内にスペーサー１４を設け、ウェル１２底面の斜面に沿うように層状の流動性分離層１５を設けることにより、不溶性粒子が不透明であっても、下側からの観察で容易に凝集物の捕捉を判定できる。
【００２６】
図１においてはウェル１２の底面１３がＶ状の斜面をなし、その斜面の水平面からの傾斜角度が約６５°である場合を示しているが、図４に示すように、底面１３ａの傾斜を深部に向かうほど増加するように連続的に変化させ、スペーサー１４の下面を底面１３ａに対応させた形状としてもよい。
【００２７】
通常市販されているマイクロプレートのウェルのＶ状底面は傾斜角度が約３０°であるが、斜面２の傾斜が緩いと非凝集の粒子が底部に集まったときに薄く広がったようなパターンになってしまい、陰性の判断がしにくい。したがって図１に示す容器のウェル底面の斜面の傾斜角度は水平面から４５°以上が好ましく、特に５５°〜７５°が好ましい。この場合、遠心条件は、斜面の角度と使用する不溶性粒子の種類にもよるが、７０Ｇ〜６００Ｇで５〜１０分が好ましい。なお、陽性パターンを得るためには遠心Ｇは低い方が好ましいので、７０Ｇ〜１１５Ｇで遠心することが最も好ましい。
【００２８】
特公平８−７２１５やＥＰ７２５２７６に述べられている細長いマイクロ反応容器では、壁面が垂直であるため凝集物の捕捉は１００％粒子によっているが、本発明に係る容器では斜面をなす底面の傾斜角度が水平に近づくにつれ、凝集物の捕捉は底面の影響を受けるようになる。このため、図５に示すように、ウェル１２の底面１３ｂを粗面化してもよい。図５に示すウェル１２の底面１３ｂは例えば特公昭６１−４４２６８や特公昭６３−６０８５４に記載されるものと同様である。なお、図５ではスペーサーを省略している。ここでいう粗面とは、凝集物のみが捕捉される程度の凹凸を有する面である。したがって、図５に示したウェル底面１３ｂのように規則的な凹凸を設けてもよいし、不規則な凹凸を有していても良い。
【００２９】
また、図６に示すように、スペーサー１４の上部にスペーサー１４と一体化した反応槽を設けることもできる。この場合、各ウェル１２に挿入される個々のスペーサー１４は蓋状の保持部１７により互いに連結され、スペーサー１４上部に保持部１７の垂直壁面によって囲まれた円筒状の反応槽１８が設けられる。反応槽１８の下部壁面には小孔またはメッシュ１９が形成されている。なお、この小孔またはメッシュ１９は、反応により生じた凝集物が透過でき、かつ反応液が遠心操作前に流出しない程度の大きさである。
【００３０】
このような構成においては、保持部１７により一体化されたスペーサー１４をマイクロプレート１１から取り外し、反応槽１８内で検体と凝集用粒子を予め反応させてから、マイクロプレート１１に取り付け、遠心操作を行う方法も可能である。このように、スペーサーの上部を反応槽として使用することで、ＩＡＴの様な２段階の反応ステップの必要な試験項目においても、検体の移動が必要なく一つの反応容器で処理することが可能である。
【００３１】
図７は、本発明の第２の実施形態に係る粒子凝集判定用容器３０の断面図である。この粒子凝集判定用容器３０は、たとえば平面形状が三角形の透明樹脂からなる底部透明板状部材３１および上部透明板状部材３２を、互いに対向する内面どうしの間に層状の間隙を形成するようにそれぞれ傾斜して配置し、この層状の間隙に凝集物を分離する不溶性粒子を含む流動性分離層３３を形成したものである。なお、底部透明板状部材３１および上部透明板状部材３２の側面も同様の素材で覆われている。このような構成とすることにより、本発明の第１の実施形態と同様に、層状の流動性分離層３３を形成することができる。なお、底部透明板状部材３１および上部透明板状部材３２の平面形状は三角形に限定されるものではないが、非凝集物の沈殿の確認が容易にできるように、深部に向かうほど幅が狭くなる形状であることが好ましい。
【００３２】
底部透明板状部材３１および上部透明板状部材３２の内面は曲面を有していてもよく、例えば流動性分離層３３が円筒形や円錐形であっても良い。底部透明板状部材３１および上部透明板状部材３２との間隔は０．５ｍｍ〜２ｍｍ程度が好ましく、流動性分離層３３の上部は反応槽として使用することができる。底部透明板状部材３１の内面の傾斜角度は水平面から４５°〜７５°が好ましい。底部透明板状部材３１の内面は凝集物が付着するように粗面化しておいてもよい。
【００３３】
不溶性粒子は試験項目に応じて抗血清に浮遊させておくことができる。使用する不溶性粒子は、上記第１の実施形態において説明したものと同様であり、比重の大きい不溶性粒子が扱いやすいが限定されるものではない。また、多孔性物質を使用することもできる。粒径は２５〜２００μｍが好ましい。
【００３４】
本実施形態の容器を使用するには、上記第１の実施形態において説明したのと同様に、流動性分離層３３の上部（反応槽）に検体を分注し、必要に応じて一定時間反応させた後、遠心を行う。凝集用粒子は底部透明板状部材３１と上部透明板状部材３２との間隙の流動性分離層３３中で斜面に沿って滑り落ちる。このとき、強陽性であれば、凝集物３５が流動性分離層３３上部に捕捉される（図８ａおよび図９ａ）。比較的弱い凝集の場合には、凝集物３５は流動性分離層３３の中間に捕捉される（図８ｂおよび図９ｂ）。陰性の場合には、凝集用粒子は流動性分離層３３の最下部に沈降する（図８ｃおよび図９ｃ）。
【００３５】
本発明においては、短時間で所望の沈殿を達成するために、遠心分離法によりパターン形成することが好ましい。遠心の最適条件の決定は、使用する容器の形状、不溶性粒子の種類、分析対象それぞれについて確認しなければならない。その理由は、凝集物および凝集していない凝集用粒子、遊離している抗体および抗原ならびに不溶性粒子のそれぞれの比重、大きさ、形、変形性、安定性が影響力を有しており、それは計算によって得ることが困難であるからである。
【００３６】
以上詳述したように本発明によれば、粒子の凝集判定を短時間で容易に行うことができ、しかも斜面に沿って凝集用粒子を沈降させることによって、粒子にかかる重力（遠心力）は斜面方向に分散されるため、弱い力で凝集用粒子を展開できるので、弱い凝集反応もより高感度に検出できる。また、上下方向からの判定が可能なために、この容器を同一基板上に２次元的に複数個形成することにより、従来問題となっていた大量検体処理を自動分析機により行うことができる。
【００３７】
本発明の粒子凝集判定用容器を同一基板上に形成し、マイクロプレート状にした容器を用いて、凝集の有無を自動判定装置により判定する方法はいくつか考えられるが、その一例を以下に示す。
【００３８】
図１０は、自動判定装置８１の一例を示す模式図である。この装置は、検査者の目視判定により近付けるために、ＣＣＤカメラ８５を用いて反応パターンを１ウェルずつ走査するものである。マイクロプレート８２の上部には、蛍光管８３、および光散乱板８４が設置されている。蛍光管８３から放射された光は光散乱板８４を通って光の分布が一様になるように散乱され、マイクロプレート８２のウェルに照射される。マイクロプレート８２の下部にはＣＣＤカメラ８５が設置され、ウェル内の凝集パターンを透過した光はＣＣＤカメラ８５で電気信号に変換される。電気信号に変換されたウェル内の画像情報は画像処理回路８６に入力され、高速ＣＰＵにより凝集・非凝集を判定するために画像処理される。これを１ウェルずつ走査し、種々の判定パラメーターを用いて高速ＣＰＵにより自動判定することにより、大量の検体を自動的に処理することができる。
【００３９】
ここで、凝集・非凝集を判定するためのパラメーターとしては、透過光量の変化から算出したウェル内各部（例えば、ウェルの中心から同心円状に中心部、内部、外周部の３部分に分ける）における凝集物の面積や、ウェル内各部における透過光量の比、およびウェル外の透過光量とウェル内各部の透過光量の比などを用いることができる。
【実施例】
【００４０】
以下本発明を実施例により説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。
【００４１】
＜実施例１：容器底面の傾斜角度と遠心Ｇの最適化＞
底面が種々の傾斜角度（３０°、４５°、６０°、７５°）の斜面をなすロート状容器を準備した。一方、不溶性粒子としてガラスビーズ（ＵＢ６７ＬＲＳ；（株）ユニオン）をＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液に懸濁させた懸濁液を調製した。それぞれのロート状容器に上記懸濁液を分注してガラスビーズを沈殿させた。次に、懸濁液の上部にＡ型ドナー血漿１００μＬおよび０．５％に希釈したＡ型血球（Ｏｒｔｈｏ社アファーマジェン）１００μＬを分注し、３６Ｇ〜５７０Ｇにおいて５分間遠心を行い、陰性パターンを観察した。この結果を表１に示す。
【表１】
【００４２】
底面の傾斜角度が４５°以下では、形成された陰性パターンが容器最下部で広がった形になり、好ましくなかった。また、底面の傾斜角度が７５°以上では、容器最下部の陰性パターンを下方から観察するのが困難であった。
【００４３】
上記とは別に陽性反応を観察したところ、遠心Ｇが４５０Ｇ以上では陽性反応が弱まる傾向にあった。
【００４４】
以上の結果から、好ましい底面の傾斜角度は４５°〜７５°であり、試験に際しては７０Ｇ〜３００Ｇで５〜１０分遠心することが好ましいと考えられた。以下の実施例においては、底面の傾斜角度が６０°である容器を用い、７０Ｇ、１０分間の条件で遠心して検討することにした。
【００４５】
＜実施例２：血液型オモテ検査＞
図１に示すように、マイクロプレート１１に開口部の直径が約１ｃｍ、斜面をなす底面１３の傾斜角度が６０°であるウェル１２を複数形成した。一方、不溶性粒子として粒径約１００μｍのガラスビーズ（ＵＢ６７ＬＲＳ；（株）ユニオン）を、抗Ａ或いは抗Ｂ血清を含むＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液に懸濁させて懸濁液を調製した。各懸濁液をそれぞれのウェルに分注した後、スペーサー１４をウェル１２内に挿入し、ウェル底面１３とスペーサー１４の下面との間の間隙に層状の流動性分離層１５を形成した。このとき、流動性分離層１５の上面がウェル底面１３の傾斜が始まる位置とほぼ一致するように懸濁液の量を調整した。
【００４６】
次に、各ウェル１２内に、生理食塩水で０．５％に希釈したＡ型血球（Ｏｒｔｈｏ社アファーマジェン）或いはＢ型血球（Ｏｒｔｈｏ社アファーマジェン）を１００μＬ分注して、７０Ｇで１０分間遠心した。
【００４７】
遠心後、各ウェル１２の下方から凝集パターンを観察した。その結果、Ａ型血球は、抗Ａ血清と反応して図３（ａ）の様にガラスビーズ上に血球が凝集した陽性パターンを呈し、抗Ｂ血清と反応せず図３（ｃ）の様な陰性パターンを呈した。逆に、Ｂ型血球は、抗Ａ血清と反応せず図３（ｃ）の様な陰性パターンを呈し、抗Ｂ血清と反応して図３（ａ）の様にガラスビーズ上に血球が凝集した陽性パターンを呈した。このように、オモテ検査の陽性、陰性が正しく判定された。
【００４８】
＜実施例３：血液型ウラ検査＞
実施例２と同様に、図１に示すように、マイクロプレート１１に開口部の直径が約１ｃｍ、斜面をなす底面１３の傾斜角度が６０°であるウェル１２を複数形成した。一方、不溶性粒子として粒径約１００μｍのガラスビーズ（ＵＢ６７ＬＲＳ；（株）ユニオン）を、ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液に懸濁させて懸濁液を調製した。この懸濁液をそれぞれのウェルに分注した後、スペーサー１４をウェル１２内に挿入し、ウェル底面１３とスペーサー１４の下面との間の間隙に層状の流動性分離層１５を形成した。このとき、流動性分離層１５の上面がウェル底面１３の傾斜が始まる位置とほぼ一致するように懸濁液の量を調整した。
【００４９】
次に、各ウェル１２内に、生理食塩水で０．５％に希釈したＡ型血球或いはＢ型血球（Ｏｒｔｈｏ社アファーマジェン）を１００μＬ分注し、さらにＢ型ドナー由来のＡＣＤ加血漿をＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液で２〜６４倍に希釈したものを検体として１００μＬ分注し、室温で５分間放置後、７０Ｇで１０分間遠心した。
【００５０】
遠心後、各ウェル１２の下方から凝集パターンを観察した。その結果、Ａ型血球は図３（ａ）の様にガラスビーズ上に血球が凝集した陽性パターンを呈し、Ｂ型血球は図３（ｃ）の様な陰性パターンを呈した。このように、Ｂ型ドナーのウラ検査は正しく判定された。
【００５１】
このとき、各希釈検体の凝集パターンを２，１，ｗ，０の４段階で評価した結果を表２に示した。なお、２は強陽性を、１，ｗは弱陽性を、０は陰性を示す。
【００５２】
同じ希釈検体についてＩＤ−Ｓｙｓｔｅｍ ＮａＣｌカード（ＤｉａＭｅｄ ＡＧ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ Ｍｏｒａｔ）、およびＩＤ−ＤｉａＣｅｌｌ Ａ１，Ｂ血球（ＤｉａＭｅｄ ＡＧ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ Ｍｏｒａｔ）を使用して試験を行い、反応性を確認した。メーカーのマニュアルに従って、各希釈検体の凝集パターンを４，３，２，１，ｗ，０の６段階で評価した結果を表２に示した。なお、４は強陽性を、３〜ｗは弱陽性を、０は陰性を示す。
【００５３】
表２から、本実施例の粒子凝集判定用容器の方が、ＩＤ−Ｓｙｓｔｅｍより希釈感度が高いことが分かった。
【表２】
【００５４】
＜実施例４：不規則抗体検査＞
実施例２、３と同様に、図１に示すように、マイクロプレート１１に開口部の直径が約１ｃｍ、斜面をなす底面１３の傾斜角度が６０°であるウェル１２を複数形成した。一方、不溶性粒子として粒径約１００μｍのガラスビーズ（ＵＢ６７ＬＲＳ；（株）ユニオン）を、抗ヒトグロブリン試薬（Ｏｒｔｈｏ社）に懸濁させて懸濁液を調製した。この懸濁液をそれぞれのウェルに分注した後、スペーサー１４をウェル１２内に挿入し、ウェル底面１３とスペーサー１４の下面との間の間隙に層状の流動性分離層１５を形成した。このとき、流動性分離層１５の上面がウェル底面１３の傾斜が始まる位置とほぼ一致するように懸濁液の量を調整した。
【００５５】
各ウェル１２に、生理食塩水で０．５％に希釈したＯ型Ｒ１Ｒ１血球（Ｏｒｔｈｏ社サージスクリーン）或いはＯ型ｒｒ血球（Ｏｒｔｈｏ社サージスクリーン）を１００μＬ分注し、更にドナー由来の抗Ｄ抗体保有血漿を１００μＬ分注し、３７℃で１０分間インキュベートした後、７０Ｇで１０分間遠心した。
【００５６】
遠心後、ウェルの下方から凝集パターンを観察した。Ｏ型Ｒ１Ｒ１血球は、図３（ａ）の様なガラスビーズの上に血球が凝集した陽性パターンを呈した。Ｏ型ｒｒ血球は、図３（ｃ）の様な陰性パターンを呈した。このように、２段階の反応を要するＩＡＴも、洗浄操作を行わずに１つの容器内で行うことができた。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る粒子凝集判定用容器の断面図。
【図２】本発明の第１の実施形態に係る粒子凝集判定用容器を用いて試験を行った場合の、陽性（ａ）、弱陽性（ｂ）、および陰性（ｃ）反応のそれぞれの凝集パターンを横から見た図。
【図３】本発明の第１の実施形態に係る粒子凝集判定用容器を用いて試験を行った場合の、陽性（ａ）、弱陽性（ｂ）、および陰性（ｃ）反応のそれぞれ凝集パターンを下方から見た図。
【図４】本発明の第１の実施形態に係る粒子凝集判定用容器の変形例の断面図。
【図５】本発明の第１の実施形態に係る粒子凝集判定用容器の変形例の断面図。
【図６】本発明の第１の実施形態に係る粒子凝集判定用容器の変形例の断面図。
【図７】本発明の第２の実施形態に係る粒子凝集判定用容器の断面図。
【図８】本発明の第２の実施形態に係る粒子凝集判定用容器を用いて試験を行った場合の、陽性（ａ）、弱陽性（ｂ）、および陰性（ｃ）反応のそれぞれ凝集パターンを横から見た図。
【図９】本発明の第２の実施形態に係る粒子凝集判定用容器を用いて試験を行った場合の、陽性（ａ）、弱陽性（ｂ）、および陰性（ｃ）反応のそれぞれ凝集パターンを上方から見た図。
【図１０】本発明の粒子凝集判定用容器に適用可能な、凝集・非凝集の自動判定装置の一例を示す模式図。
【符号の説明】
【００５８】
１０…粒子凝集判定用容器
１１…透明容器本体
１２…検体収容部
１３、１３ａ、１３ｂ…底面
１４…スペーサー
１５…流動性分離層
１６…凝集物
１７…保持部
１８…反応槽
１９…小孔またはメッシュ
３０…粒子凝集判定用容器
３１…底部透明板状部材
３２…上部透明板状部材
３３…流動性分離層
３５…凝集物
８１…自動判定装置
８２…マイクロプレート
８３…蛍光管
８４…光散乱板
８５…ＣＣＤカメラ
８６…画像処理回路
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体または抗原を含む検体と凝集用粒子との反応を含む凝集反応により生成する凝集物に基づいて免疫学的分析を行う粒子凝集判定用容器であって、互いに対向する内面どうしの間に層状の間隙を形成するようにそれぞれ傾斜して配置された底部透明板状部材および上部透明板状部材と、前記層状の間隙に形成された、凝集物を分離する不溶性粒子を含む流動性分離層とを具備したことを特徴とする粒子凝集判定用容器。
【請求項２】
前記底部透明板状部材の内面の傾斜角度が、水平面から４５°以上７５°以下であることを特徴とする請求項１記載の粒子凝集判定用容器。
【請求項３】
前記底部透明板状部材および前記上部透明板状部材の平面形状が、深部に向かうほど幅が狭くなる形状であることを特徴とする請求項１または２記載の粒子凝集判定用容器。
【請求項４】
前記前記底部透明板状部材の内面が粗面化されていることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項記載の粒子凝集判定用容器。
【請求項５】
前記流動性分離層の厚さが０．５〜２ｍｍであることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項記載の粒子凝集判定用容器。
【請求項６】
前記不溶性粒子が粒径２５〜２００μｍのガラスビーズまたは架橋ポリマーであることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項記載の粒子凝集判定用容器。
【請求項７】
前記流動性分離層が抗血清を含むことを特徴とする請求項１ないし６のいずれか１項記載の粒子凝集判定用容器。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の粒子凝集判定用容器を用いた凝集パターンの形成方法であって、
抗体または抗原を含む検体と凝集用粒子とを反応させる工程と、
反応後の検体および凝集用粒子を、前記判定用容器の上部から深部に向けて遠心力で移動させる工程と
を含み、
ここで前記移動工程が、前記反応後の凝集用粒子が前記流動性分離層において凝集パターンを形成するまで続けられることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８に記載の凝集パターンの形成方法であって、前記凝集パターンが、
（i）前記判定用容器の上部に、凝集した粒子が分布し、
（ii）前記判定用容器の深部に向かうほど、より凝集が弱い粒子が分布し、
（iii）前記判定用容器の最下部に、非凝集の粒子が分布する
ものであることを特徴とする方法。
【請求項１】
抗体または抗原を含む検体と凝集用粒子との反応を含む凝集反応により生成する凝集物に基づいて免疫学的分析を行う粒子凝集判定用容器であって、互いに対向する内面どうしの間に層状の間隙を形成するようにそれぞれ傾斜して配置された底部透明板状部材および上部透明板状部材と、前記層状の間隙に形成された、凝集物を分離する不溶性粒子を含む流動性分離層とを具備したことを特徴とする粒子凝集判定用容器。
【請求項２】
前記底部透明板状部材の内面の傾斜角度が、水平面から４５°以上７５°以下であることを特徴とする請求項１記載の粒子凝集判定用容器。
【請求項３】
前記底部透明板状部材および前記上部透明板状部材の平面形状が、深部に向かうほど幅が狭くなる形状であることを特徴とする請求項１または２記載の粒子凝集判定用容器。
【請求項４】
前記前記底部透明板状部材の内面が粗面化されていることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項記載の粒子凝集判定用容器。
【請求項５】
前記流動性分離層の厚さが０．５〜２ｍｍであることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項記載の粒子凝集判定用容器。
【請求項６】
前記不溶性粒子が粒径２５〜２００μｍのガラスビーズまたは架橋ポリマーであることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項記載の粒子凝集判定用容器。
【請求項７】
前記流動性分離層が抗血清を含むことを特徴とする請求項１ないし６のいずれか１項記載の粒子凝集判定用容器。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の粒子凝集判定用容器を用いた凝集パターンの形成方法であって、
抗体または抗原を含む検体と凝集用粒子とを反応させる工程と、
反応後の検体および凝集用粒子を、前記判定用容器の上部から深部に向けて遠心力で移動させる工程と
を含み、
ここで前記移動工程が、前記反応後の凝集用粒子が前記流動性分離層において凝集パターンを形成するまで続けられることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８に記載の凝集パターンの形成方法であって、前記凝集パターンが、
（i）前記判定用容器の上部に、凝集した粒子が分布し、
（ii）前記判定用容器の深部に向かうほど、より凝集が弱い粒子が分布し、
（iii）前記判定用容器の最下部に、非凝集の粒子が分布する
ものであることを特徴とする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００７−２４０５３８（Ｐ２００７−２４０５３８Ａ）
【公開日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１１０７０８（Ｐ２００７−１１０７０８）
【出願日】平成１９年４月１９日（２００７．４．１９）
【分割の表示】特願２００２−１８０１３５（Ｐ２００２−１８０１３５）の分割
【原出願日】平成１４年６月２０日（２００２．６．２０）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月１９日（２００７．４．１９）
【分割の表示】特願２００２−１８０１３５（Ｐ２００２−１８０１３５）の分割
【原出願日】平成１４年６月２０日（２００２．６．２０）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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