糖ペプチド抗生物質Ａ４０９２６を生合成する遺伝子およびタンパク質
本発明は、抗生物質の分野、より具体的には、糖ペプチド抗生物質Ａ４０９２６の合成経路をコードする核酸分子の単離に関する。Ａ４０９２６産生に関与する遺伝子産物の機能が開示される。本発明は、Ａ４０９２６産生をコードする新規生合成遺伝子、コードされたポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換えベクター、該ベクターで形質導入された宿主細胞、およびＡ４０９２６、その前駆体、その誘導体、またはＡ４０９２６またはその前駆体とは異なる修飾された糖ペプチドを産生する方法を含む、該形質導入された宿主細胞を用いて糖ペプチドを産生する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
放線菌は、構造上異なりかつ生物学的に活性な二次代謝産物（多くが、商業用用途（例えば、抗生物質）を見出されている）を産生する能力についてよく知られている。重要な代謝産物は、ストレプトマイセス亜種（Streptomyces spp.）（最も詳細に研究されている）だけでなく、あまり知られていない放線菌属によっても産生される：例えば、現在、リファマイシン、テイコプラニン、およびエリスロマイシンが、それぞれアミコラトプシス（Amycolatopsis）種、アクチノプラネス（Actinoplanes）種、およびサッカロポリスポラ（Saccharopolyspora）種により産業上製造されている。二次代謝産物の生合成を支配している遺伝因子は、代謝産物の合成、調節、および抵抗性に必要な遺伝子全てを含有する遺伝子群に組織化されている。
【０００２】
多くの異なる二次代謝物は、類似の酵素が介入する、共通の生合成経路を有している。このことは、ポリケチド（Katz and McDaniel 1999）、非リボソーム合成ペプチド（non-ribosomally synthesized peptide）（Marahiel 1997）、およびデオキシ糖（Rodriguez et al. 2000）について完全に示されている。しかしながら、この類似性にもかかわらず、ある微生物での特定の二次代謝物の合成に関与する遺伝子群の組織化を、演繹的に定義することはできない。事実、非常に類似する二次代謝物の合成は、対応する産生株が同属にないとき、別に組織化された群により支配され得る。この種の例は、マクロライド系抗生物質間で見出すことができる（Katz and McDaniel 1999）。さらに産生株内の所望の群の同定は、放線菌において、同じ経路の酵素を特定する複数群の存在により複雑になる。このことは、ポリケチド（例えば、Ruan et al. 1997）およびペプチド（例えば、Sosio et al. 2000a）について示され、遺伝子配列決定により確かめられている（Omura et al. 2001；Bentley et al. 2002）。結論として、既に知られているものと比較して、新たな群の組織化、ヌクレオチド配列、または同一性の程度を演繹的に理解することはできない。
【０００３】
糖ペプチドは、その作用機序（Parenti and Cavalleri 1989）によりダルバヘプチド（dalbaheptide）としても知られ、細菌細胞壁の架橋結合と干渉し、現在臨床上用いられているバンコマイシンおよびテイコプラニンと干渉する、重要な種の抗生物質である。これらは大抵、生命を脅かす感染症の処置において最終選択となる抗生物質である。他方、腸球菌での糖ペプチドに対する耐性の出現、およびこの高レベルの耐性が結局メチシリン耐性黄色ブドウ球菌において拡大し得るという恐れが、この種の第２世代薬物の探索を促している。有望な結果が、改善した活性、拡大した抗細菌スペクトル、または良好な薬物動態を有する半合成誘導体の開発により、得られている（Malabarba and Ciabatti 2001）。
【０００４】
ゆえに、天然に存在する化合物の操作により、改良した糖ペプチドを得る可能性および有用性が存在する。しかしながら、糖ペプチドは構造上複雑な分子であり、化学的性質へのアクセスしやすさは、該分子の数カ所の位置に制限されている。例えば、糖は糖ペプチドから化学的に容易に取り除かれ、対応するアグリコンが生成され得る一方、化学的手段により、異なる糖を特定位置に位置選択性に結合させることは、非常に困難である。糖ペプチドの塩素化の程度が抗菌活性に影響することが示されている。同様に、糖ペプチドの芳香環の化学的脱塩素化は、容易に達成され得るが、構造中の所望の環の選択的ハロゲン化は、比較的複雑である。最後の例として、テイコプラニンファミリーの糖ペプチドは、位置４のアリールアミノ酸と結合したグルコサミンと結合したアシル鎖を含有しているが、バンコマイシン類の化合物は含有していない。化学的または生体内変換（Lancini and Cavalleri 1997）のいずれかによる糖ペプチドのアシル化および脱アシル化が報告されているが、これは通常、全体的に低収率となる。上記に照らし、化学的手段により生成することが困難であるか、または不可能な誘導体を得るために、糖ペプチド形成においてこれらの工程を再指向するのに有用な遺伝子および酵素を有することが望まれる。このことは、塩素化の程度が糖ペプチドの生物学的活性に影響すること、ならびに改良した誘導体が、糖ペプチドのグリコシル化またはアシル化パターンを変化させることにより、得られ得ること（Malabarba and Ciabatti 2001）が示されているため、特に適切である。化学的性質についての主な制限の１つは、ペプチド骨格に存在するアミノ酸の種類または順序を変えることである。化学的には、比較的低収率でアミノ酸１および３にのみ介入することが可能であると示されている（Malabarba et al. 1997）。従って、正確に操作された株での発酵過程により新規糖ペプチド誘導体を直接設計する一般的な方法が、大変望まれている。
【０００５】
興味をそそる代わりとなる方法は、天然に存在する糖ペプチドの生合成過程を操作することにより、改良した抗生物質を創出することである。この種の例は報告されている。実際、バンコマイシンおよびクロロエレモマイシン（chloroeremomycin）遺伝子群から糖転移酵素が発現した後にインビトロおよびインビボの両方で糖ペプチドアグリコンを選択的にグリコシル化することが可能である（Solenberg et al. 1997；Loosey et al. 2001）。しかしながら、上記の酵素のうち、所望の位置にグルコサミン残基を結合させることが可能なものはない。同様に、バルヒマイシン（balhimycin）産生アミコラトプシス・メディテッラネイ（A. mediterranei）の選択された遺伝子の不活性化により、バルヒマイシン誘導体が得られる（Pelzer et al. 1999）。しかしながら、テイコプラニンファミリーの糖ペプチド産生株についてのかかる実験は記載されていない。
【０００６】
抗生物質Ａ４０９２６は、糖ペプチドのテイコプラニンファミリーに属する（Parenti and Cavalleri 1989）。これは、密接に関連する分子の複合体からなり、そのコア構造は、アミノ酸１〜３、２〜４、および４〜６間のエーテル結合、およびアミノ酸５〜７間のＣ−Ｃ結合により決定される強固な足場を有するヘプタペプチド骨格に最構成され得る。加えて、２個の糖残基および２個の塩素原子が該分子に存在する。Ａ４０９２６複合体の構成要素の構造は、以下に示される式
【化１】
（ここで、Ｒは、ファクターＡ１を有する［Ｃ９−Ｃ１２］アルキル（Ｒ＝ｎ−デシル）、ファクターＢ０を有する［Ｃ９−Ｃ１２］アルキル（Ｒ＝９−メチルデシル）、およびファクターＢ１（Ｒ＝ｎ−ウンデシル）を有する［Ｃ９−Ｃ１２］アルキルを表し、これらが主な構成要素である）により、表される。
【０００７】
もともとアクチノマヅラ種（ＡＴＣＣ３９７２７）として知られていた産生株は、最近、ノノムリア種（Nonomuria sp.）（ＡＴＣＣ３９７２７）として再分類された（Zhang et al. 1998）。固有の抗菌活性を示すことに加えて、Ａ４０９２６はまた、半合成糖ペプチドダルババンシンの前駆体である（もともとＢＩ３９７またはＭＤＬ ６２３９７として知られていた；Malabarba and Ciabatti 2001）。それゆえ、Ａ４０９２６の構造を操作し、その収率を増加させるさらなる手段が、大変望まれている。しかしながら、ノノムリア属の他のメンバー由来の上記の群の例は存在しない。それゆえ、ノノムリアでのＡ４０９２６の生成、およびその調節に必要な遺伝子はまた、産生過程を最適化するのに有用であり得る。
【０００８】
最近、糖ペプチドのクロロエレモマイシン（van Wageningen et al. 1998）、バルヒマイシン（Pelzer et al. 1999）、コンプレスタチン（complestatin）（Chiu et al. 2001）、およびＡ４７９３４（Pootoolal et al. 2002）の生成に関与する遺伝子群が明らかにされた。それぞれ、ｃｅｐ、ｂａｌ、ｃｏｍ、およびｓｔａと呼ばれるこれらの群は、それぞれ、アミコラトプシス・オリエンタリス（Amycolatopsis orientalis）、アミコラトプシス・メディテッラネイ（Amycolatopsis mediterranei）、ストレプトマイセス・ラベンジュレ（Streptomyces lavendulae）、およびストレプトマイセス・トヨカネシス（Streptomyces toyocaensis）から得られたものである。これらの群は、糖ペプチド経路を操作するのに有用ないくつかの遺伝子を提供してきた。しかしながら、ある種の工程は、上記群により行われることはできない。例えば、利用可能な遺伝子群は、糖の酸化状態を変化させるか、脂肪酸鎖を結合させるか、あるいはアミノ酸３の芳香族部分に塩素原子もたらす能力のある官能基をコードしていない。これらの官能基は全て、本発明において記載されている。
【０００９】
抗生物質を製造する産業上の過程の設計は、比較的成功しており、１Ｌ当たり数ｇのレベルに至る抗生物質タイターを有する巨大サイズの発酵を生じる。これは、主に経験的な試行錯誤に従い達成され、論理的な基盤を欠いている。従って、新たな方法の開発、および現行技術の改良は、依然時間を必要とし、不安定で、一貫性なく機能し、そして非所望の副産物を蓄積する細菌群を生じ得る。ここ数年、理論的方法が適用され、ストレプトマイセス亜種により産生される抗生物質のレベルが十分に増加している。これは大抵、対象の遺伝子群に存在する鍵となる調節エレメントの操作、または経路の律速段階の過剰発現を含んでいる。それゆえ、かかる群関連調節因子または合成の律速段階をコードする遺伝子は、収率を改善する有効な手段であり得る。しかしながら、放線菌で今までに同定された群関連調節因子は、いくつかの異なるタンパク質ファミリーに属する（Chater and Bibb 1997）。１つのファミリー内でさえ、配列同一性の相当なバリエーションが存在する。それゆえ、群関連調節因子の存在、性質、数、および配列は、他の群（たとえ関連する抗生物質を特定するものであっても）との比較により推定されることはできない。例えば、チロシン遺伝子群は、４個の異なる調節因子をコードしているが、このうち、関連するマクロライド系抗生物質であるエリスロマイシンを特定する群において見出されるものはない（Bate et al. 1999）。同様に、生合成経路の律速段階の性質および論拠は、演繹的に確立されることはできない。
【００１０】
発明の概要
本発明は、微生物での糖ペプチドＡ４０９２６の生合成に必要な単離ポリヌクレオチドのセットを提供する。本発明の１つの態様において、ポリヌクレオチド分子は、ノノムリア種（ＡＴＣＣ３９７２７）から単離されたｄｂｖ遺伝子群を表し、Ａ４０９２６生成に必要なポリペプチドをコードする３７個のＯＲＦからなる、連続ＤＮＡ配列（配列番号：１）から選択される。該３７個のＯＲＦによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２から３８において提供される。
【００１１】
本発明は、
ａ）Ａ４０９２６の合成に必要なポリペプチドをコードするｄｂｖ遺伝子群（配列番号：１）;
ｂ）ｄｂｖ遺伝子群自体のヌクレオチド配列以外であって、ｄｂｖ遺伝子群（配列番号：１）によりコードされるのと同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号：２から３８のポリペプチドをコードする、ｄｂｖ ＯＲＦ１から３７の任意のヌクレオチド配列；
ｄ）該ＯＲＦ以外のヌクレオチド配列以外であって、ｄｂｖの ＯＲＦ１から３７のいずれかによりコードされるのと同じポリペプチド（配列番号：２から３８）をコードするヌクレオチド配列；
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸を提供する。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、
ｅ）配列番号：４から５、７から１１、１９から２１、２３から２４、３０から３１、および３７で特定されるポリペプチドをコードする、ｄｂｖ ＯＲＦ３から４、６から１０、１８から２０、２２から２３、２９から３０、および３６のいずれかのヌクレオチド配列；
ｆ）該ｄｂｖ ＯＲＦのヌクレオチド配列以外であって、ｄｂｖ ＯＲＦ３から４、６から１０、１８から２０、２２から２３、２９から３０、および３６のいずれかによりコードされるのと同じポリペプチド（配列番号：４から５、７から１１、１９から２１、２３から２４、３０から３１、および３７）をコードするヌクレオチド配列；
ｇ）ｄｂｖ ＯＲＦ３、６から９、１８から２０、２２から２３、２９から３０、および３６のいずれかによりコードされるポリペプチド（配列番号：４、７から１０、１９から２１、２３から２４、３０から３１、および３７）とアミノ酸配列が、少なくとも８０％、好ましくは、８６％、より好ましくは、９０％、最も好ましくは、９５％またはそれ以上同一のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｈ）ｄｂｖ ＯＲＦ４および１０のいずれかによりコードされるポリペプチド（配列番号：５および１１）とアミノ酸配列が、少なくとも８７％、好ましくは、９０％、より好ましくは、９５％またはそれ以上同一のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸を提供することである。
【００１３】
１つの実施態様において、本発明の単離核酸は、ＯＲＦ１から３７（配列番号：２から３８）から選択されるＯＲＦの組合せを含み、これは、Ａ４０９２６の４−ヒドロキシフェニルグリシン（ＨＰＧ）残基の合成に必要なポリペプチドをコードする。別の実施態様において、核酸は、ＯＲＦ１から３７（配列番号：２から３８）から選択されるＯＲＦの組合せを含み、これは、Ａ４０９２６の３，５−ジヒドロキシフェニルグリシン（ＤＰＧ）残基の合成に必要なポリペプチドをコードする。なお別の実施態様において、核酸は、ＯＲＦ１から３７（配列番号：２から３８）から選択されるＯＲＦの組合せを含み、これは、Ａ４０９２６のヘプタペプチド骨格の合成に必要なポリペプチドをコードする。別の実施態様によると、本発明の核酸において、ＯＲＦ１から３７（配列番号：２から３８）から選択されるＯＲＦの組合せが提供され、これは、Ａ４０９２６のアミノ酸３および６の芳香族残基の塩素化に必要なポリペプチドをコードする。なお別の実施態様において、ＯＲＦ１から３７（配列番号：２から３８）から選択されるＯＲＦの組合せを含む核酸が提供され、これは、Ａ４０９２６のアミノ酸６のチロシン残基のβ−ヒドロキシル化に必要なポリペプチドをコードする。なお別の実施態様において、ＯＲＦ１から３７（配列番号：２から３８）から選択されるＯＲＦの組合せを含む核酸が提供され、これは、Ａ４０９２６の位置２および４、４および６、１および３、および５および７のアミノ酸の芳香族残基の架橋結合に必要なポリペプチドをコードする。別の実施態様によると、本発明の核酸において、ＯＲＦ１から３７（配列番号：２から３８）から選択されるＯＲＦの組合せが提供され、これは、Ｎ−アシルグルクロンアミン残基の付加および形成に必要なポリペプチドをコードする。なお別の実施態様において、ＯＲＦ１から３７（配列番号：２から３８）から選択されるＯＲＦの組合せを含む核酸が提供され、これは、マンノシル残基の結合に必要なポリペプチドをコードする。なお別の実施態様において、ＯＲＦ１から３７（配列番号：２から３８）から選択されるＯＲＦの組合せを含む核酸が提供され、これは、Ａ４０９２６のＮ−メチル化に必要なポリペプチドをコードする。なお別の実施態様によると、ＯＲＦ１から３７（配列番号：２から３８）から選択されるＯＲＦの組合せを含む核酸が提供され、これは、Ａ４０９２６の輸送およびＡ４０９２６の抵抗性に必要なポリペプチドをコードする。なお別の実施態様において、ＯＲＦ１から３７（配列番号：２から３８）から選択されるＯＲＦの組合せを含む核酸が提供され、これは、ｄｂｖ遺伝子群の発現の調節に必要なポリペプチドをコードする。なお別の実施態様において、ＯＲＦ１ないし３７（配列番号：２から３８）から選択されるＯＲＦの発現レベルを増強する、配列番号：１から選択される１以上のＤＮＡセグメントを含む核酸が提供される。
【００１４】
当業者は、本発明は、Ａ４０９２６の生合成経路のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供し、また、かかるポリペプチドに由来するフラグメントをコードするヌクレオチドを提供することを理解する。加えて、当業者は、遺伝暗号が縮重するため、配列番号：２から３８において特定される同じポリペプチドが、ＯＲＦ１から３７の天然変異体または人工変異体、すなわち、ＯＲＦ１から３７により特定されるゲノムヌクレオチド配列以外だが、同じポリペプチドをコードするヌクレオチドによりコードされ得ることを理解する。さらに、天然に存在する変異体または人工的に製造された変異体は、配列番号：２から３８において特定されるペプチドを生じ、該変異体が、上記の原型ポリペプチドと同じ機能を有するが、フォールディングまたは触媒機能に必須でないアミノ酸のアミノ酸の付加、欠失、または置換、または必須アミノ酸の保存的置換を含有することも理解される。
【００１５】
当業者はまた、本発明が、Ａ４０９２６の生合成に必要な群全体のヌクレオチド配列を提供し、該群に存在する遺伝子の発現に必要なヌクレオチド配列も提供することを理解する。かかる調節配列は、プロモーター配列およびエンハンサー配列、アンチセンス配列、転写ターミネーター配列およびアンチターミネーター配列を含むが、これらに限らない。これらの配列は、ｄｂｖ遺伝子群に存在する遺伝子の発現を調節するのに有用である。該ヌクレオチドを単独で、あるいは他のヌクレオチド配列と融合して有する細胞も、本発明の範囲にある。
【００１６】
１つの態様において、本発明は、Ｎ−アシル−グルコサミン残基の糖ペプチド抗生物質前駆体のコア構造との結合に有用なＯＲＦ９ポリペプチド（配列番号：１０）、または該ポリペプチドの天然に存在する変異体または誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸を提供する。別の態様において、本発明は、脂肪酸残基の糖ペプチド抗生物質前駆体のコア構造との結合に有用なＯＲＦ２３ポリペプチド（配列番号：２４）、または該ポリペプチドの天然に存在する変異体または誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。なお別の態様において、本発明は、糖ペプチド抗生物質前駆体に結合した糖部分の酸化に有用なＯＲＦ２９ポリペプチド（配列番号：３０）、または該ポリペプチドの天然に存在する変異体または誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。別の態様において、本発明は、コアの糖ポリペプチド抗生物質前駆体のβ−ヒドロキシチロシンおよびＤＰＧ残基の塩素化に有用なＯＲＦ１０ポリペプチド（配列番号：１１）、または該ポリペプチドの天然に存在する変異体または誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。別の態様において、本発明は、マンノシル残基の糖ペプチド抗生物質前駆体のコア構造との結合に有用なＯＲＦ２０ポリペプチド（配列番号：２１）、または該ポリペプチドの天然に存在する変異体または誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００１７】
別の態様において、本発明は、細胞からの糖ペプチド抗生物質または糖ペプチド抗生物質前駆体の輸送、および抵抗性の付与に有用なＯＲＦ７、１８、１９、２４、および３５によりコードされるポリペプチド（配列番号：８、１９、２０、２５、および３６）、または該ポリペプチドの天然または人工的に存在する変異体または誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。別の態様において、本発明は、糖ペプチド抗生物質または糖ペプチド抗生物質前駆体産生株に抵抗性を付与するのに有用なＯＲＦ７ポリペプチド（配列番号：８）、または該ポリペプチドの天然または人工的に存在する変異体または誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。別の態様において、本発明は、糖ペプチド抗生物質前駆体の収率を増加させるのに有用なＯＲＦ３、４、６、２２、および３６ポリペプチド（配列番号：４、５、７、２３、および３７）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００１８】
１つの実施態様において、本発明は、ＯＲＦ１ないし３７（配列番号：２から３８）のいずれかから選択される少なくとも１個のＯＲＦを特定するヌクレオチド配列の追加（extra）コピーを有する、糖ペプチド産生株を提供する。１つの好ましい実施態様において、かかる糖ペプチド産生株は、アクチノマイセス（Actinomycetales）目に属する任意の株である。なお別の好ましい実施態様において、かかる糖ペプチド産生株は、ノノムリア属のメンバーである。１つのさらなる態様において、本発明は、配列番号：１において特定されるヌクレオチド配列に１以上のバリエーションを含有するノノムリア株を提供し、かかるバリエーションは、ＯＲＦ１ないし３７（配列番号：２から３８）のうち１個以上の発現を増加あるいは減少させる。
【００１９】
１つの好ましい実施態様において、本発明は、別の細胞によるＡ４０９２６、１つ以上のその前駆体または誘導体の産生に有用な１以上のベクター上に担持された、配列番号：１、またはその一部分により特定されるヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。１つの好ましい実施態様において、該ヌクレオチド配列またはその一部分は、１つのベクター上に担持されている。なお別の好ましい実施態様において、かかるベクターは、細菌の人工染色体である。なお別の態様において、該細菌の人工染色体は、ＥＳＡＣベクター（ＷＯ９９／６３６７４に記載）である。別の好ましい実施態様において、本発明は、配列番号：１により特定される遺伝子群を含有するノノムリア種（ＡＴＣＣ３９７２７）以外の組換え放線菌株を提供し、該遺伝子群は、該組換え放線菌株の染色体に組み込まれたＥＳＡＣベクターにの担持されている。
【００２０】
１つの態様において、本発明は、Ａ４０９２６の産生を増加させる方法を提供し、該方法は、次の工程：（１）組換えＤＮＡベクターで生合成経路によりＡ４０９２６またはＡ４０９２６前駆体を産生する微生物を形質導入すること（該ベクターは、該経路を律速する活性をコードする、ＯＲＦ１ないし３７（配列番号：２ないし３８）のいずれかから選択されたＤＮＡ配列を含む）；（２）該ベクターで形質導入された該微生物を、細胞増殖、該遺伝子の発現、および該抗生物質または抗生物質前駆体の産生に適した条件下で培養することを含む。
【００２１】
別の態様において、本発明は、Ａ４０９２６の誘導体を産生する方法を提供し、該方法は、次の工程：（１）適当なベクターに、配列番号；１により定義されるヌクレオチド配列から選択されたセグメントをクローニングすること（該セグメントは、ＯＲＦ１ないし３７（配列番号：２ないし３８）の１つの少なくとも一部分を含有し、該ＯＲＦは、回避することが望まれる生合成段階を触媒するポリペプチドをコードする）；（２）該ＯＲＦを、該ポリペプチドの活性に必須のアミノ酸について特定する１個以上のコドンを取り除くかあるいは置換することにより不活性化すること；（３）該組換えＤＮＡベクターで生合成経路によりＡ４０９２６またはＡ４０９２６前駆体を産生する微生物を形質導入すること；（４）得られた形質導入体を該ＤＮＡ配列が変異コピーにより置き換えられ、従って破壊された遺伝子を生じるものについてスクリーニングすること；次に、（５）該変異体細胞を、細胞増殖、該経路の発現、および該経路の類似体の産生に適した条件下で培養することを含む。
【００２２】
なお別の態様において、本発明は、新規糖ペプチドを産生する方法を提供し、該方法は、次の工程：（１）組換えＤＮＡベクターで、生合成経路によりＡ４０９２６またはその前駆体とは異なる糖ペプチドまたは糖ペプチド前駆体を産生する微生物を形質導入すること（該ベクターは、ＯＲＦ１ないし３７（配列番号：２ないし３８）から選択された１個以上のＯＲＦを含み、該糖ペプチドまたは糖ペプチド前駆体を修飾する１以上のポリペプチドの発現をコードする）；（２）該ベクターで形質導入された該微生物を、細胞増殖、該遺伝子の発現、および該抗生物質または抗生物質前駆体の産生に適した条件下で培養することを含む。
【００２３】
この方法を行うのに適した糖ペプチドまたは糖ペプチド前駆体を産生する微生物の例は、ストレプトマイセス属、アミコラトプシス属、アクチノプラネス属、ノノムリア属などに属する株である。
【００２４】
なお別の態様において、本発明は、新規糖ペプチドを産生するさらなる方法を提供し、該方法は、次の工程：（１）組換えＤＮＡベクターで微生物を形質導入すること（該ベクターは、糖ペプチドまたは糖ペプチド前駆体を修飾する１以上のポリペプチド（活性なポリペプチド）をコードする、ＯＲＦ１ないし３７（配列番号：２ないし３８）から選択される１個以上のＯＲＦを含み、そして該微生物は、糖ペプチドまたは糖ペプチド前駆体を産生せず、かつ導入されたＯＲＦを効率的に発現できるものから選択される）；（２）該微生物の細胞抽出物または細胞分画を活性なポリペプチドの存在に適した条件下で調製すること（該細胞抽出物または細胞分画は、少なくとも該活性なポリペプチドを含有する）；（３）糖ペプチドまたは糖ペプチド前駆体を該細胞抽出物または細胞分画に添加し、次に該混合物を該活性なポリペプチドが該糖ペプチドまたは糖ペプチド前駆体を修飾できる条件下でインキュベーションすることを含む。
【００２５】
この方法を行うのに適した微生物の例は、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）種、ストレプトマイセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor）種、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）種、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）種などに属する株である。
【００２６】
本発明のさらなる態様は、
ａ）ｄｂｖ ＯＲＦ１から３７（配列番号：２ないし３８）のいずれかによりコードされるＯＲＦポリペプチド、またはｄｂｖ ＯＲＦ１から３７（配列番号：２ないし３８）のいずれか、好ましくは、ｄｂｖ ＯＲＦ３から４、６から１０、１８から２０、２２から２３、２９から３０（配列番号：４から５、７から１１、１９から２１、２３から２４、３０から３１、および３７）のいずれか１つによりコードされるポリペプチドとアミノ酸配列が同一のポリペプチド；
ｂ）ｄｂｖ ＯＲＦ３、６から９、１８から２０、２２から２３、２９から３０、および３６（配列番号：４、７から１０、１９から２１、２３から２４、３０から３１、および３７）のいずれかによりコードされるポリペプチドとアミノ酸配列が、少なくとも８０％、好ましくは、８６％、より好ましくは、９０％、最も好ましくは、９５％またはそれ以上同一のポリペプチド；
ｃ）ｄｂｖ ＯＲＦ４から１０（配列番号：５から１１）のいずれかによりコードされるポリペプチドとアミノ酸配列が、少なくとも８７％、好ましくは、９０％、より好ましくは、９５％またはそれ以上同一のポリペプチド、
から選択されるＡ４０９２６の生合成経路に関与するポリペプチド配列を含む単離ポリペプチドを含む。
【００２７】
定義
用語「単離核酸」は、ゲノムＤＮＡまたは相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）のいずれかとしてのＤＮＡ分子を意味し、これは、天然および合成起源の１本鎖または２本鎖であり得る。この用語はまた、天然または合成起源のＲＮＡ分子を意味する。
【００２８】
用語「ヌクレオチド配列」は、本明細書に開示されるＯＲＦの全長または一部分の配列、および遺伝子間領域を意味する。配列表に示される本発明のヌクレオチド配列のいずれか１つは、（ａ）コード配列、（ｂ）（ａ）の転写からもたらされるＲＮＡ分子、（ｃ）同一ポリペプチドをコードするために遺伝暗号の縮重を用いるコード配列、または（ｄ）プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、およびアンチターミネーター配列を含有する遺伝子間領域である。
【００２９】
用語「遺伝子群（gene cluster）」、「群（cluster）」、および「生合成群（biosynthesis cluster）」は全て、二次代謝産物の合成に必要な遺伝子全てを含有する微生物のゲノムの連続セグメントを示す。
【００３０】
用語「ｄｂｖ」は、ノノムリア種（ＡＴＣＣ３９７２７）におけるＡ４０９２６生合成に関与する遺伝因子を意味する。
【００３１】
用語「ＯＲＦ」は、１つのポリペプチドをコードするゲノムヌクレオチド配列を意味する。本発明において、用語ＯＲＦは「遺伝子」と同意語である。
【００３２】
用語「ＯＲＦポリペプチド」は、ＯＲＦによりコードされるポリペプチドを意味する。
用語「ｄｂｖ ＯＲＦ」は、ｄｂｖ遺伝子群内に含まれるＯＲＦを意味する。
【００３３】
用語「ＮＲＰＳ」は、二次代謝産物のオリゴペプチド骨格へのアミノ酸の取込みに関与する触媒活性体の複合体である、非リボソームペプチド合成酵素を意味する。機能的なＮＲＰＳは、オリゴペプチドへの１個以上のアミノ酸の取込みを触媒するものである。
【００３４】
用語「ＮＲＰＳモジュール」、または「モジュール」は、オリゴペプチドに対する１個のアミノ酸の活性化、取込み、および修飾を指揮するＮＲＰＳのセグメントを意味する。
用語「ＮＲＰＳ遺伝子」は、ＮＲＰＳをコードする遺伝子を意味する。
【００３５】
用語「二次代謝産物」は、遺伝子群により特定される遺伝子セットの発現により、微生物により産生される生物活性物質を意味する。
【００３６】
用語「産生宿主」は、二次代謝産物の生成が、ドナー生物に由来する遺伝子群により指揮されるている微生物である。
【００３７】
用語「ＥＳＡＣ」は、「エシェリキア・コリ−ストレプトマイセス人工染色体」、すなわち、エシェリキア・コリ宿主において巨大なＤＮＡインサートを有し、維持し、かつ放線菌産生宿主において導入され、維持され得る組換えベクターを示す。ＥＳＡＣの例は、ＷＯ９９／６７３７４において示されている。
【００３８】
図面の簡単な説明
図１ ノノムリア種（ＡＴＣＣ３９７２７）の染色体に由来する単離ＤＮＡセグメント
太線は、配列番号：１において記載されるセグメントを示す。該単離ＤＮＡセグメントを有するコスミドを、１１Ａ５、７Ｆ３、７Ｅ９、１Ｂ１、７Ａ２、１１Ｂ９、および７Ｃ７と命名する。
【００３９】
図２ ｄｂｖ群の遺伝子の組織化
それぞれのＯＲＦは、矢印および表１の番号で示されている。向きは、図１と同じである。目盛りの数字は、配列座標（ｋｂ）を示す。
【００４０】
発明の詳細な説明
Ａ．ノノムリア由来のｄｂｖ遺伝子
Ａ４０９２６は、ノノムリア種（ＡＴＣＣ３９７２７）により産生される、密接に関連する糖ペプチド抗生物質の複合体である。本発明は、Ａ４０９２６の生合成のための遺伝子群の核酸配列および特徴決定を提供する。Ａ４０９２６遺伝子群の物理的な組織化は、フランキングＤＮＡ配列と共に図１（ノノムリア種（ＡＴＣＣ３９７２７）のゲノム由来の９０ｋｂゲノムセグメントの物理的なマップをかかるセグメントを定義するコスミドのセットと共に示す）で報告されている。ｄｂｖ群と呼ばれる、Ａ４０９２６生合成を支配するＤＮＡセグメントの遺伝子の組織化は、図２において示され、そしてそのヌクレオチド配列は配列番号：１として報告されている。
【００４１】
群の正確な境界は、他の糖ペプチド群との比較により、そしてその遺伝子産物の機能から確立され得る。それ故、左端（図１）にｄｂｖ群が、ＨＰＧの合成に関与する酵素ＨｍｏＳ（配列番号：２）をコードするｄｂｖ ＯＲＦ１により区切られている。右端には、ｄｂｖ群が、配列番号：１のヌクレオチド７１０６５から７１１３８にまたがるｔＲＮＡ遺伝子の３’末端と類似する、ａｔｔＬ部位のレムナントにより区切られている。ｄｂｖ群は、約７１，１００塩基対にまたがり、ＯＲＦ１ないしＯＲＦ３７と呼ばれる３７個のＯＲＦを含有する。配列番号：１の連続ヌクレオチド配列（７１１３８塩基対）は、配列番号：２から３８に挙げられる３７個の推定タンパク質をコードする。ＯＲＦ１（配列番号：２）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド１１４０から４０を翻訳したものから推定される、３６６個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ２（配列番号：３）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド２３２９から１２５９を翻訳したものから推定される、３５６個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ３（配列番号：４）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド５１６１から２５５８を翻訳したものから推定される、８６７個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ４（配列番号：５）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド６２３１から５２６６を翻訳したものから推定される、３２１個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ５（配列番号：６）は、配列番号：１のヌクレオチド７１８５から８２９２を翻訳したものから推定される、３６９個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ６（配列番号：７）は、配列番号：１のヌクレオチド８３２０から８９７３を翻訳したものから推定される、２１７個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ７（配列番号：８）は、配列番号：１のヌクレオチド９０６９から９６５９を翻訳したものから推定される、１９６個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ８（配列番号：９）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド１０６６７から９７０８を翻訳したものから推定される、３１９個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ９（配列番号：１０）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド１１８９６から１０６７０を翻訳したものから推定される、４０８個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ１０（配列番号：１１）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド１３４１９から１１９５０を翻訳したものから推定される、４８９個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ１１（配列番号：１２）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド１４７４１から１３４７９を翻訳したものから推定される、４２０個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ１２（配列番号：１３）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド１６０１９から１４８２３を翻訳したものから推定される、３９８個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ１３（配列番号：１４）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド１７１６３から１６００９を翻訳したものから推定される、３８４個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ１４（配列番号：１５）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド１８３６６から１７１８５を翻訳したものから推定される、３９３個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ１５（配列番号：１６）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド１８６７１から１８４６２を翻訳したものから推定される、６９個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ１６（配列番号：１７）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド２４２５９から１８６６８を翻訳したものから推定される、１８６３個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ１７（配列番号：１８）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド３６５２９から２４２７８を翻訳したものから推定される、４０８３個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ１８（配列番号：１９）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド３９０２１から３６７６０を翻訳したものから推定される、７５３個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ１９（配列番号：２０）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド３９８５１から３９１５２を翻訳したものから推定される、２３２個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ２０（配列番号：２１）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド４１７３２から４０１２５を翻訳したものから推定される、５３５個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ２１（配列番号：２２）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド４２５８４から４１７７２を翻訳したものから推定される、２７０個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ２２（配列番号：２３）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド４４１３０から４２８６８を翻訳したものから推定される、４２０個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ２３（配列番号：２４）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド４６３５５から４４２２６を翻訳したものから推定される、７０９個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ２４（配列番号：２５）は、配列番号：１のヌクレオチド４６６３２から４８５７８を翻訳したものから推定される、６４８個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ２５（配列番号：２６）は、配列番号：１のヌクレオチド４８５７５から５４８６８を翻訳したものから推定される、２０９７個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ２６（配列番号：２７）は、配列番号：１のヌクレオチド５４８６５から５８０５６を翻訳したものから推定される、１０６３個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ２７（配列番号：２８）は、配列番号：１のヌクレオチオ５８１５２から５８９８５を翻訳したものから推定される、２７７個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ２８（配列番号：２９）は、配列番号：１のヌクレオチド５９０４６から６０６４１を翻訳したものから推定される、５３１個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ２９（配列番号：３０）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド６２４４５から６０８７４を翻訳したものから推定される、５２３個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ３０（配列番号：３１）は、配列番号：１のヌクレオチド６２８８７から６３３１２を翻訳したものから推定される、１４１個のアミノ酸配列を表す。ＯＲＦ３１（配列番号：３２）は、配列番号：１のヌクレオチド６３４６９から６４５８７を翻訳したものから推定される、３７２個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ３２（配列番号：３３）は、配列番号：１のヌクレオチド６４５９９から６５２４０を翻訳したものから推定される、２１３個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ３３（配列番号：３４）は、配列番号：１のヌクレオチド６５２３７から６６５４１を翻訳したものから推定される、４３４個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ３４（配列番号：３５）は、配列番号：１のヌクレオチド６６５３８から６７３３５を翻訳したものから推定される、２６５個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ３５（配列番号：３６）は、配列番号：１のヌクレオチド６７３３２から６８６１８を翻訳したものから推定される、４２８個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ３６（配列番号：３７）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド６９４２３から６８６８５を翻訳したものから推定される、２５１個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ３７（配列番号：３８）は、配列番号：１のヌクレオチド６９６０８から７０８９４を翻訳したものから推定される、４２８個のアミノ酸を表す。
【００４２】
ｄｂｖ群は、他の糖ペプチド群のものとは実質的に異なる、組織化を示す。５つのｂａｌ、ｃｅｐ、ｃｏｍ、ｓｔａ、およびｄｂｖ群間の比較を表１に概説する。
【表１】
【００４３】
【表２】
【００４４】
【表３】
ａ＋記号は、他の記載の糖ペプチド遺伝子群におけるオルソログの存在を示す。
ｂオルソログが他の糖ペプチド遺伝子群において存在しない場合、ＧｅｎｅＢａｎｋでのＢｌａｓｔ検索の結果を報告する。
ｃ他の糖ペプチド群の存在、およびＧｅｎｅＢａｎｋでのＢｌａｓｔ検索の結果の組合せに基づき推定したｄｂｖ ＯＲＦの機能。
ｄこの列は、他の糖ペプチド遺伝子群、およびそれが源を発する群由来の配列同一性のパーセンテージを報告する。
ｅ最高値を有するＧｅｎｅＢａｎｋエントリーの受託番号
ｆＢｌａｓｔ検索から得た確率の値
ｇ前の列に由来するＧｅｎｅＢａｎｋエントリーの生物および推定機能。略語は、Ｓ．，ストレプトマイセス；Ｍ．，メソリゾビウム（Mesorhizobium）；Ａ．，アミコラプトシス。
ｈＢｌａｓｔ検索により報告される保存ドメイン
＊他の糖ペプチド群に存在するが、高い同一性を有する配列がデータベース上の別の箇所に存在する。
【００４５】
実際、ＮＲＰＳの７個のモジュールをコードする遺伝子は、１２ｋｂセグメントにより分けられた、２つの不一致の翻訳領域として組織化されている（図２）。これは、ＮＲＰＳ遺伝子の７個のモジュールが、コンパクトな領域に存在し、全て同じ向きに翻訳される、ｂａｌ、ｃｅｐ、ｃｏｍ、およびｓｔａ群の組織化とは対照的である。さらに、ｂａｌ、ｃｅｐ、ｃｏｍ、およびｓｔａ群において、１個のＯＲＦ以外の全ＯＲＦが、同じ向きに翻訳される一方、３７個のｄｂｖ ＯＲＦのうち２２個のみが、ある向きに翻訳され、残る１５個は、反対向きに翻訳される。このことは、ｄｂｖ群の翻訳上の複雑さを示している。
【００４６】
ｄｂｖ群はまた、ｂａｌ、ｃｅｐ、ｃｏｍ、およびｓｔａ群において相同性が見られないいくつかのＯＲＦの存在により、特徴付けられる。これらは、ｄｂｖ ＯＲＦ３、６ないし８、１８ないし２０、２２、２３、２９、３０、および３６（配列番号：４、７ないし９、１９ないし２１、２３、２４、３０、３１、および３７）を含む。５つのｂａｌ、ｃｅｐ、ｃｏｍ、ｓｔａ、およびｄｂｖ群間の比較は、表１に概説されている。要するに、本明細書に記載のｄｂｖ群の遺伝子の組織化は、他の糖ペプチドの合成に関与する他の群のものと実質的に異なる。それゆえこれは、かかかる遺伝子の組織化を有する群の第１の例を表している。
【００４７】
Ｂ．ｄｖ遺伝子の役割
本発明は、特に、Ａ４０９２６のヘプタペプチド前駆体の合成に関与するＮＲＰＳをコードするＤＮＡ配列を開示する。ｄｂｖ ＮＲＰＳは４つのポリペプチドからなり、それぞれが１から３個のモジュールを含有している。これらは、ｄｂｖ ＯＲＦ１６、ＯＲＦ１７、ＯＲＦ２５、そしてＯＲＦ２６（配列番号：１７、１８、２６、そして２７）と呼ばれている。ＮＲＰＳによるペプチド合成は、モジュラーシステムにより行われ、ここで、ローディングモジュールが、一連の伸長モジュールに続いている。ＮＲＰＳにおいて、それぞれの伸長モジュールは、少なくとも３個のドメイン：基質認識および活性化に関与する、アデニル化（Ａ）ドメイン；チオエステルアミノ酸および伸長ペプチドとして共有結合する、チオール化（Ｔ）ドメイン；およびペプチド結合形成を触媒する、縮合（Ｃ）ドメインの存在により特徴付けられる。最後のモジュールは、これらのコアドメインに加え、完成したペプチドのＮＲＰＳとのエステル結合を加水分解する、チオエステラーゼ（Ｔｅ）ドメインを含有する。いくつかのモジュールは、Ｄ型にエピマー化（Ｅ）ドメインの作用により、Ｌ−アミノ酸を転換する。ｄｂｖ ＮＲＰＳは、７個のモジュール、計７個のＡドメイン、７個のＴドメイン、６個のＣドメイン、３個のＥドメイン、および１個のＴｅドメインからなる。特に、ｄｂｖ ＯＲＦ２６（配列番号：２７）は、ＮＲＰＳモジュール１および２をコードし、ドメインＡ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｅ−Ｔの配列を特定し、Ａ４０９２６のヘプタペプチドコアでのＨＰＧおよびＴｙｒ残基（最初の２つのアミノ酸）の取込みに必要とされ；ｄｂｖ ＯＲＦ２５（配列番号：２６）は、ＮＲＰＳモジュール３をコードし、ドメインＣ−Ａ−Ｔの配列を特定し、ＤＰＧ残基の取込みに関与し；ｄｂｖ ＯＲＦ１７（配列番号：１８）は、ＮＲＰＳモジュール４ないし６をコードし、ドメインＣ−Ａ−Ｅ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｅ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｔの配列を特定し、Ａ４０９２６ヘプタペプチドコアでの２個のＨＰＧおよびＴｙｒ残基の取込みに関与し；そしてｄｂｖ ＯＲＦ１６（配列番号：１７）は、ＮＲＰＳモジュール７をコードし、ドメインＣ−Ａ−Ｔ−Ｃ＊−Ｔ−Ｔｅ（Ｃ＊は、機能未知の非典型的な凝結を示す）の配列を特定し、最後のＤＰＧ残基の取込み、およびＡ４０９２６のヘプタペプチド前駆体の放出に必要とされる。
【００４８】
ｄｂｖ群に存在する他の遺伝子は、Ａ４０９２６の産生の増加、または新規代謝産物の合成に有用な新規遺伝因子を表す。これらの中で、ｄｂｖ ＯＲＦ９（配列番号：１０）は、Ｎ−アシル−グルコサミン残基をヘプタペプチド（式Ｉ）の位置４のＨＰＧ残基のフェノール性ヒドロキシルと結合させる糖転移酵素をコードする。この遺伝子は、クローニングされ、Ｎ−アシル−グルコサミン残基を他の糖ペプチドアグリコンに結合させることができる活性酵素を生じる、異種性宿主において発現させられ得る。代わりに、ｄｂｖ ＯＲＦ９は、産生株において不活性化され、Ａ４０９２６アグリコンが生成される。このアグリコンは、化学的手段（Malabarba and Ciabatti 2001）により得られるが、化学反応の介入を必要とすることなく、単一の発酵過程によりこれを産生することが望まれ得る。
【００４９】
本発明の他のなお好ましい核酸分子は、Ａ４０９２６のアミノ酸３およびアミノ酸６での塩素（chorine）原子の付加に関与するハロゲナーゼをコードするｄｂｖ ＯＲＦ１０（配列番号：１１）を含む。ｄｂｖ ＯＲＦ１０は、ｃｅｐ、ｃｏｍ、ｓｔａ、およびｂａｌ群に存在するハロゲン化酵素遺伝子と異なる、新規遺伝因子を表す。事実、Ａ４０９２６の塩素化パターンは、これらの糖ペプチドの中でもむしろ独特である。この遺伝子はクローニングされ、糖ペプチドの芳香族残基３および６を塩素化することができる活性酵素を生じるように、異種性宿主において発現され得る。
【００５０】
本発明の他のなお好ましい核酸分子は、アミノ酸４でのグルコサミン残基の脂肪酸によるＮ−アシル化に関与する、アシルトランスフェラーゼをコードするｄｂｖ ＯＲＦ２３（配列番号：２４）を含む。ｄｂｖ ＯＲＦ２３は、ｃｅｐ、ｃｏｍ、ｓｔａ、およびｂａｌ群の存在しない、新規遺伝因子を表す。この遺伝子はクローニングされ、異なる糖ペプチドの糖部分をＮ−アシル化することができる活性酵素を生じるように、異種性宿主において発現され得る。
【００５１】
本発明の他のなお好ましい核酸分子は、Ａ４０９２６のアミノ酸４に結合したＤ−グルコサミンのアミノグルクロン酸に対する酸化に関与する、ヘキソースオキシダーゼをコードするｄｂｖ ＯＲＦ２９（配列番号：３０）を含む。ｄｂｖ ＯＲＦ２９は、ｃｅｐ、ｃｏｍ、ｓｔａ、およびｂａｌ群の存在しない、新規遺伝因子を表す。この遺伝子はクローニングされ、糖ペプチドに結合したＤ−グルコサミン残基を酸化することができる活性酵素を生じるように、異種性宿主において発現され得る。
【００５２】
本発明の他のなお好ましい核酸分子は、ＮＲＰＳ由来の異常な中間体ペプチドの加水分解に関与する、チオエステラーゼをコードするｄｂｖ ＯＲＦ３６（配列番号：３７）を含む。ＮＲＰＳとは異なるポリペプチドとして存在する他のチオエステラーゼ（Kotowska et al. 2002）と同様に、ｄｂｖ ＯＲＦ３６産物は、さらにヘプタペプチドに処理されることのないＮＲＰＳの全チオエステルを加水分解することにより、Ａ４０９２６の生合成に有効なＮＲＰＳの維持に関与する。従って、これは、ｃｅｐ、ｓｔａ、ｃｏｍ、およびｂａｌ群にはない、新規遺伝因子を表している。この遺伝子はクローニングされ、生成産物の収率を増加させるために別の糖ペプチド産生株において発現され得る。宿主株は、アクチノマイセス目、ストレプトスポランギアセア（Streptosporangiaceae）科、ミクロモノスポラセア（Micromonosporaceae）科、シュードノカルディアセア（Pseudonocardiaceae）科、およびストレプトマイセス（Streptomycetaceae）科、ノノムリア属、アクチノプラネス属、アミコラプトシス属、ストレプトマイセス属などに属する株を含むが、これらに限らない。
【００５３】
本発明の他のなお好ましい核酸分子は、マンノシル残基をアミノ酸７と結合させるのに関与する、マンノシルトランスフェラーゼをコードするｄｂｖ ＯＲＦ２０（配列番号：２１）を含む。従って、これは、ｃｅｐ、ｓｔａ、ｃｏｍ、およびｂａｌ群には存在しない、新規遺伝因子を表している。この遺伝子はクローニングされ、アミノ酸７と結合しているマンノシル残基を有する糖ペプチドを生じるために別の糖ペプチド産生株において発現され得る。代わりに、ｄｂｖ ＯＲＦ２０は、産生株において不活性化され、脱マンノシル−Ａ４０９２６が生成される。この化合物を、他の手段（Lancini and Cavalleri 1997）によって得ることができるが、単一の発酵過程によりこれを産生することが望まれ得る。
【００５４】
ｄｂｖ群はまた、非タンパク新生アミノ酸ＨＰＧおよびＤＰＧの合成に関与する、多数の遺伝子を含む。前者の合成のために、ｄｂｖ ＯＲＦ１、２、５、および３７（配列番号：２、３、６、および３８）産生が必要とされる。ＤＰＧの合成は、ＯＲＦ３７（配列番号：３８）に加えて、ｄｂｖ ＯＲＦ３１から３４（配列番号：３２から３５）の関与を必要とする。これらの役割は、表１に概説されている。ＨＰＧおよびＤＰＧは、非タンパク新生アミノ酸であるため、ＮＲＰＳによるヘプタペプチドの合成は、その有効性に依存する。結果として、これらの酵素の活性は、糖ペプチド生合成における律速段階となる。従って、糖ペプチドの収率の増加は、これらのＯＲＦの発現を増加させることにより得られ得る。これらの遺伝子は、個々、またはこれらの任意の組合せでＡ４０９２６の収率を増加させるためにＡ４０９２６産生株において過剰発現され得る。
【００５５】
ｄｂｖ群はまた、糖ペプチド中間体または完成産物の細胞質外への輸送、および産生細胞への抵抗性の付与に関与する、多数の遺伝子を含む。これらの遺伝子は、ｄｂｖ ＯＲＦ７、１８から１９、２４、および３５（配列番号：８、１９から２０、２５、および３６）を含む。ｄｂｖ ＯＲＦ７は、生成中のペプチドグリカンから末端のＤ−アラニン部分を除去するのに関与するカルボキシペプチダーゼをコードする。これは、ｃｅｐ、ｃｏｍ、ｓｔａ、およびｂａｌ群には存在しない、新規遺伝因子を表す。ｄｂｖ ＯＲＦ１８から１９、および２４は、Ａ４０９２６またはその中間体のＡＴＰ依存性排出に関与する、ＡＢＣ型トランスポーター（van Veen and Konings 1998）をコードする。ｄｂｖ ＯＲＦ３５は、タンパク質勾配に逆らったＡ４０９２６またはその中間体の輸送に関与する、Ｎａ／Ｋイオン−アンチポーターをコードする。これらの遺伝子はクローニングされ、個別にまたはそれらとの任意の組合せで、生成産物の収率を増加させるために別の糖ペプチド産生株において発現され得る。宿主株は、アクチノマイセス目、ストレプトスポランギアセア科、ミクロモノスポラセア科、シュードノカルディアセア科、およびストレプトマイセス科、ノノムリア属、アクチノプラネス属、アミコラトプシス属、ストレプトマイセス属などに属する株を含むが、これらに限らない。代わりに、これらの遺伝子は、個別にまたはこれらとの任意の組合せでＡ４０９２６の収率を増加させるためにＡ４０９２６産生株において過剰発現され得る。
【００５６】
ｄｂｖ群はまた、Ａ４０９２６産生中に生合成および抵抗性遺伝子の発現を直接的または間接的に活性化するのに関与する、多数の調節遺伝子を含む。これらの遺伝子は、ｄｂｖ ＯＲＦ３、４、６、および２２（配列番号：４、５、７、および２３）を含む。ｄｂｖ ＯＲＦ３は、ストレプトマイセス・ヒグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）由来の遺伝子群に存在するポジティブレギュレーターであるＨｙｇＲ（Ruan et al. 1997）と密接に関連する。これは、ｃｅｐ、ｃｏｍ、ｂａｌ、およびｓｔａ群には存在しない、新規遺伝因子を表している。ｄｂｖ ＯＲＦ４は、他の糖ペプチド群に存在する同様のレギュレーターと密接に関連する。ｄｂｖ ＯＲＦ６および２２は、一体となって、２つの成分のシグナル伝達系をコードする。これら４つの遺伝子はクローニングされ、個別にまたはこれらとの任意の組合せで、生成産物の収率を増加させるために別の糖ペプチド産生株において発現され得る。宿主株は、アクチノマイセス目、ストレプトスポランギアセア科、ミクロモノスポラセア科、シュードノカルディアセア科、およびストレプトマイセス科、ノノムリア属、アクチノプラネス属、アミコラトプシス属、ストレプトマイセス属などを含むが、これらに限らない。代わりに、これらの遺伝子は、個別にまたはこれらとの任意の組合せで、Ａ４０９２６の収率を増加させるためにＡ４０９２６産生株において過剰発現され得る。
【００５７】
Ｃ．ｄｂｖ群の使用
本発明はまた、完全なＡ４０９２６分子、その前駆体のいずれか、またはその誘導体の発現のための核酸を提供する。かかる核酸は、Ａ４０９２６のアセンブリを指揮するのに十分なポリペプチドをコードするＯＲＦを含む、単離遺伝子群を含む。１例として、完全なｄｂｖ群（配列番号：１）は、適当なベクターに導入され、これを用いて、所望の産生宿主が形質導入される。１つの態様において、このＤＮＡセグメントは、長いＤＮＡセグメントを有することができる適当なベクターに導入される。かかるベクターの例は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクターまたはＥＳＡＣベクターの様な特定の誘導体を含むが、これらに限らない（Shizuya et al. 1992; Ioannou et al. 1994; Sosio et al. 2000b）。別の態様において、ｄｂｖ群は、２つの別々のセグメントとして２つの異なるベクターにクローニングされ、所望の産生宿主において適合可能になる。なお別の態様において、ｄｂｖ群は、３つのセグメントに再分割され、それぞれが、別々の適合ベクターにクローニングされる。１、２、または３つのベクターシステムの使用例が、文献（例えば、Xue et al. 1999）に記載されている。
【００５８】
ｄｂｖ群が、１つまたはそれ以上のベクターに適当にクローニングされると、それは、多数の適当な産生宿主に導入され、ここで、糖ペプチド抗生物質の産生が、天然の宿主においてより非常に効率的に生じ得る。好ましい宿主細胞は、放線菌遺伝子を効果的に発現できる種または株のものである。かかる宿主は、アクチノマイセス、ストレプトスポランギアセア、ミクロモノスポラセア、シュードノカルディアセア、およびストレプトマイセス、ノノムリア、アクチノプラネス、アミコラトプシス、およびストレプトマイセスなどを含むが、これらに限らない。代わりに、１つまたはそれ以上の適当なベクターにクローニングされたｄｂｖ群の第２コピーが、Ａ４０９２６産生株に導入され、ここで、ｄｂｖ遺伝子の第２コピーがＡ４０９２６の収率を増加させる。
【００５９】
十分に特徴付けられた宿主細胞に産生能力を受け渡すことは、冒頭の最適化および開発の過程のいくつかの部分：産生株での天然産物のタイターが、より有効に増加され得ること；天然産物の精製が、活性と干渉する可能性のある既知のバックグランドで行われ得ること；複合体の組成が、より有効に調節され得ること；天然産物の変化した誘導体が、発酵条件の操作により、あるいは経路工学により、より有効に産生され得ることを実質的に改善できる。
【００６０】
代わりに、生合成遺伝子群は、修飾され、宿主細胞に挿入され、多種多様な代謝産物を合成または化学的に修飾するために用いられ得る（例えば、オープンリィーディングフレームが、再配列され、修飾され、そして他の糖ペプチド合成遺伝子群と組み合わされ得る）。
【００６１】
本明細書において提供される情報を用いて、Ａ４０９２６核酸のクローニングおよび発現は、日常的およびよく知られた方法を用いて行われ得る。
【００６２】
別の可能性のある使用において、ｄｂｖ遺伝子群由来の選択されたＯＲＦは、日常的な分子生物学的技術を用いて、単離され、不活性化される。ノノムリア種（ＡＴＣＣ３９７２７）染色体において該ＯＲＦとフランクするＤＮＡセグメントを含有する適当なベクターにクローニングされた変異型ＯＲＦは、該ノノムリア株に導入され、２度の二重交差混合現象である相同組換えにより、産生株での該ＯＲＦの不活性化を生じる。この産生株は、有効な方法でのＡ４０９２６の前駆体または誘導体の産生に有用である。
【００６３】
別の可能性のある使用において、ｄｂｖ遺伝子群由来の選択されたＯＲＦが単離され、所望のプロモーターの調節下に置かれる。適当なベクターにクローニングされた、操作されたＯＲＦは、次に、上記オリジナルのＯＲＦを置き換えることにより、または該ＯＲＦのさらなるコピーとして、ノノムリア種（ＡＴＣＣ３９７２７）に導入される。この産生株は、Ａ４０９２６分子、その前駆体または誘導体の産生の決定因子であるＯＲＦの発現レベルを増加あるいは減少させるのに有用である。
【００６４】
実施例
以下の実施例は、Ａ４０９２６遺伝子群が同定された原理および方法論、および全ｄｂｖ遺伝子が同定され、分析された原理および方法論を説明するものである。これらの実施例は、本発明の原理および方法論を説明するものであって、その範囲を制限することを意味するものではない。
【００６５】
一般的方法
特に示さない限り、細菌株およびクローニングベクターは全て、公的なコレクションまたは商業用供給源から得ることができる。分子生物学の標準的方法を用いている（例えば、Sambrook et al. 1989；Kieser et al. 2000）。ノノムリアをＨＴアガー（Kieser et al. 2000）、およびＲａｒｅ３培地（１０ｇ／ｌ グルコース、４ｇ／ｌ 酵母エキス、１０ｇ／ｌ 麦芽エキス、２ｇ／ｌ ペプトン、２ｇ／ｌ ＭｇＣｌ２、０．５％ グリセロール）にて増殖させた。糖ペプチドを公開された方法（Lancini and Cavalleri, 1997）に従い単離する。配列分析を、Wisconsinパッケージ（バージョン９．１）(Accelrys)のプログラムを用いて行う。データベース検索を、公開サイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/index.htmlおよびhttp://www.ebi.ac.uk/fasta33）のＢｌａｓｔまたはＦａｓｔａプログラムにより行う。
【００６６】
実施例１−Ａ４０９２６生合成遺伝子の単離
ゲノムライブラリーを、コスミドベクターＳｕｐｅｒｃｏｓ（Stratagene, La Jolla, CA 92037）においてノノムリア（ＡＴＣＣ３９７２７）由来のＤＮＡにより作成する。ノノムリア（ＡＴＣＣ３９７２７）由来の全ＤＮＡを、フラグメントサイズを４０ｋｂの範囲に最適化するためにＳａｕ３ＡＩで部分的に切断した。部分的に切断したＤＮＡを、アルカリホスファターゼ処理し、ＢａｍＨＩであらかじめ切断したＳｕｐｅｒｃｏｓにライゲーションした。ライゲーション混合物を、インビトロでパッケージングし、これを用いて、エシェリキア・コリＸＬ１Ｂｌｕｅ細胞にトランスフェクションした。得られたコスミドライブラリーを、アミコラトプシス・メディテッラネイＤＳＭ５９０８ゲノムＤＮＡを鋳型として用いた、ｂａｌ群由来セグメントのＰＣＲ増幅から得た２つのプローブでのハイブリダイゼーションにより、スクリーニングした。これらのプローブは、オリゴ５’−ＡＴＧＣＧＣＧＴＧＴＴＧＡＴＣＴＣＧ−３’（配列番号：３９）および５’−ＣＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＧＧＣＧＡＡＣ−３’（配列番号：４０）での増幅から得た、ｂｇｔｆＡ；およびオリゴ５’−ＣＧＴＧＧＧＧＧＴＧ ＧＡＴＧＴＡＴＣＧＡ−３’（配列番号：４１）および５’−ＴＣＡＣＣＡＴＴＧＧＡＴＣＡＧＣＧ−３’（配列番号：４２）での増幅から得た、ｄｐｇＡであった。全てのオリゴを、受託番号Ｙ１６９５２でＧｅｎＢａｎｋに蓄積された配列から設計した。さらなるハイブリダイゼーションを、オリゴヌクレオチドＰｅｐ８（Sosio et al. 2000a）により行った。これらのプローブのうち１つ以上にポジティブなコスミドを単離し、制限酵素で物理的に位置決定した。かかる実験より、図１で報告したコスミドを同定した。従って、ノノムリア種（ＡＴＣＣ３９７２７）のゲノムから同定したセグメントは、抗生物質Ａ４０９２６の合成に関与するｄｂｖ遺伝子群を含有している。
【００６７】
上記の実施例は、ｄｂｖ群を単離できる原理および方法論を説明するものである。ｄｂｖ群を種々のベクターにクローニングできることは当業者にとって当然のことであろう。しかしながら、７２ｋｂの大きさであるｄｂｖ群を与える、好ましいベクターは、λベクター、コスミドベクター、およびＢＡＣベクターの様な長いインサートを有することができるものであるということを、当業者は理解する。他のプローブを用いて、かかるライブラリーからｄｂｖ群を同定できることを、当業者は理解する。配列番号：１で報告した配列より、任意のフラグメントを、ノノムリア種（ＡＴＣＣ３９７２７）ＤＮＡからＰＣＲ増幅でき、これを用いて、かかるＤＮＡで作成したライブラリーをスクリーニングできる。該ライブラリーから１またはそれ以上のクローンを同定することができ、これは、配列番号：１でカバーされる任意のセグメントを含んでいる。さらに、ｃｅｐ、ｂａｌ、ｃｏｍ、およびｓｔａ群に由来するものの様な異種性プローブの使用により、表１で提供する情報を用いて、ｄｂｖ群を同定することも可能である。代わりに、二次代謝産物の合成を指揮する他の遺伝子群は、異種性ハイブリダイゼーションを可能にするためにｄｂｖ遺伝子と十分に関連する遺伝子を含有する。これらのバリエーションは全て、本発明の範囲にある。
【００６８】
実施例２−Ａ４０９２６遺伝子群の配列分析
実施例１で記載のように同定したｄｂｖ群を、ショットガンアプローチにより配列決定した。ｄｂｖ群の配列を配列番号：１として本明細書において提供する。得られたＤＮＡ配列を、Codonpreference［ＧＣＧ，（Genetic Computer group, Madison, WI 53711）バージョン９．１］により分析し、適当なコード配列を同定した。次に、この方法で同定したそれぞれのコード配列を、プログラムＴｆａｓｔａ（ＧＣＧ，バージョン９．１）を用いてｂａｌ、ｃｅｐ、ｃｏｍ、およびｓｔａ群との比較により分析した。これらの群のいずれにおいても一致を同定しないコード配列を、次に、プログラムＢｌａｓｔを利用してＧｅｎＢａｎｋに対して、またはＦａｓｔａを用いてＳｗｉｓｓＰｒｏｔに対して検索した。最後に、それぞれのＯＲＦの正確な開始コドンを、プログラムＰｉｌｅｕｐ（ＧＣＧ，バージョン９．１）による関連配列の複数アラインメントにより、あるいは上流のリボソーム結合部位の検索により、確立した。合計３７個のＯＲＦ（ｄｂｖ ＯＲＦ１ないしｄｂｖ ＯＲＦ３７と呼ぶ）を同定する。これらの分析の結果を表１で概説し、配列番号：２ないし配列番号：３８として配列表において本明細書で提供している。詳細は、以下に示す。
【００６９】
２Ａ．特定したアミノ酸ＨＰＧおよびＤＰＧの合成
ｄｂｖ群によりコードされる７つのタンパク質が、特定したアミノ酸ＨＰＧおよびＤＰＧの合成に関与する。すなわち、ＯＲＦ１およびＯＲＦ２（配列番号：２および３）は、Ａ４０９２６生成に必要なＨＰＧ残基の合成に関与し、これらは、それぞれｐ−ヒドロキシマンデル酸オキシダーゼ、およびｐ−ヒドロキシマンデル酸合成酵素をコードしている。これらのＯＲＦの相同体を、他の糖ペプチド群（表１）において見出し、その役割を実験で確立した（Li et al. 2001; Hubbard et al. 2000）。ＯＲＦ３１から３４（配列番号：３２から３５）は、Ａ４０９２６生成に必要なＤＰＧ残基の合成に関与している。これらのＯＲＦの相同体を、ＤＰＧ残基を含有するヘプタペプチドの合成を指揮する他の糖ペプチド（表１）において見出し、対応する遺伝子産物の関与を、実験で決定した（Pfeifer et al. 2001; Chen et al. 2001）。ＯＲＦ３７（配列番号：３８）は、それぞれ、ＨＰＧおよびＤＰＧを生じるために、ｐ−ヒドロキシフェニルグリオキシレートおよび３，５−ジヒドロキシフェニルグリオキシレートの両方のアミノ基転移に必要なアミノトランスフェラーゼをコードする。この役割を実験で確立（Pfeifer et al. 2001; Hubbard et al. 2000）し、これは、アミノドナーとして好ましくはチロシンを利用する（Hubbard et al. 2000）。この反応は、ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸塩を生成し、次に、ＯＲＦ２（配列番号：２）の遺伝子産物の作用により、ｐ−ヒドロキシマンデル酸塩に転換できる。
【００７０】
ＨＰＧおよびＤＰＧの合成に直接的に関与する他のＯＲＦも、ｄｂｖ群において見出し、ＯＲＦ５およびＯＲＦ３０（配列番号：６および３１）と命名する。ＯＲＦ５（配列番号：６）は、ＯＲＦ２（配列番号：３）産生の基質である、ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸塩の合成に関与する、プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする。それゆえ、このＯＲＦは、チロシンをＨＰＧに転換するサイクルを刺激する酵素をコードする。それゆえ、このＯＲＦの発現レベルは、Ａ４０９２６生成のためＨＰＧの十分なレベルを提供するのに重要である。ＯＲＦ３０（配列番号：３１）は、ストレプトマイセス・コエリカラー由来のＮＰ＿６２６９１１．１により表される最も一致する細菌ゲノム配列から同定した機能未知の推定ポリペプチドと非常に類似するポリペプチド（表１）をコードする。しかしながら、これらのタンパク質は全て、４−ヒドロキシベンゾイル−ＣｏＡチオエステラーゼ（Benning et al. 1998）の典型的な転換ドメインを表す。従って、ＯＲＦ３０（配列番号：３１）産物は、この小ポリケチドの合成中にＤＰＧまたはその前駆体の１つの放出を促進するようである。ＯＲＦ３０（配列番号：３１）は、ｄｂｖ群（表１）に固有である。
【００７１】
２Ｂ．Ａ４０９２６のヘプタペプチド前駆体の合成
ＯＲＦ１６、１７、２５、および２６（配列番号：１７、１８、２６、および２７）によりコードされる４つのタンパク質は、Ａ４０９２６のヘプタペプチドコアの合成に関与する。これらの全てが、他のＮＲＰＳとの有意な類似性を示す。他のＮＲＰＳ系でのアラインメントに基づき、これら４個のＯＲＦによりコードされるタンパク質の推定ドメイン組成および特異性を表２において報告する。
【００７２】
表２．ｄｂｖ ＮＲＰＳのドメイン組成および役割
【表４】
【００７３】
ｄｂｖ ＮＲＰＳ遺伝子の特定の役割の指定を、ｄｂｖ群でのその遺伝子座により推定することはできない。事実、報告した糖ペプチド群全てについて、現在までに、モジュールの遺伝指令と、対応するアミノ酸をポリペプチドに取り込んだ指令との共直線性は存在するが、そのＮＲＰＳ遺伝子を別々に翻訳するので、これはｄｂｖ群（図２）の場合ではない。しかしながら、その役割および特異性を、次の知見：
ｉ）ＯＲＦ１６（配列番号：１７）により特定されるタンパク質のドメイン組成、およびそれがチオエステラーゼドメインで終結するという事実が、ＤＰＧ残基およびヘプタペプチドの最後のペプチド結合の形成の認識、次に、酵素結合チオエステルの分解（表２）における役割と最も一致すること；
ｉｉ）ＯＲＦ１７（配列番号：１８）のモジュール組織化およびドメイン組成は、ヘプタペプチドのアミノ酸４から６の認識、そしてその取込みに必要とされるモジュール４から６を含有するポリペプチドと最も一致すること（これは、他の糖ペプチドＮＲＰＳ系（van Wageningen et al 1998; Pelzer et al. 1999; Chiu et al. 2001; Pootoolal et al. 2002）で見られる）；
ｉｉｉ）ＯＲＦ２５（配列番号：２６）産物のドメイン認識は、このＯＲＦが２つのモジュールだがたった１つのＣドメインをコードする（表２）ので、ヘプタペプチド合成の開始、および第１のペプチド結合形成の触媒でのその役割と一致すること；
ｉｖ）ＯＲＦ２６（配列番号：２７）のドメインの組織化は、このモジュールがＥドメイン（モジュール２、４、および５の役割により必要とされる）を含有せず、かつそれぞれＣドメインおよびＴｅドメインの存在または不存在（表２）が、このＯＲＦがそれぞれモジュール１および７をコードすることを除外するので、ヘプタペプチドの第３のアミノ酸の認識および取込みに関与するモジュール３を含有するこのポリペプチドと一致すること、
に基づき推定できる。
【００７４】
Ａ４０９２６のヘプタペプチド前駆体の合成に直接関与する他のＯＲＦも、ｄｂｖ群で見られ、ＯＲＦ１５およびＯＲＦ３６（配列番号：１６および３７）と命名する。ＯＲＦ１５（配列番号：１６）は、機能未知の短いペプチドをコードする。この遺伝子産物の相同体を、ＮＲＰＳ系をコードする多くの群で見られる。ＯＲＦ３６（配列番号：３７）は、ＮＲＰＳまたはポリケチド合成酵素遺伝子を含有する他の群によりしばしばコードされるタンパク質である、ＩＩ型チオエステラーゼをコードする。これらのチオエステラーゼの推定の役割は、ＮＲＰＳ系およびＰＫＳ系が、酵素と共有結合した異常な中間体を取り除くことにより作動することで有効性を増強することである（Heathcote et al. 2001）。このタンパク質のオルソログを、他の既知の糖ペプチド群はコードしない（表１）。
【００７５】
２Ｃ．ヘプタペプチドでの芳香族残基の架橋結合
ＯＲＦ１１ないし１４（配列番号：１２ないし１５）によりコードされる４つのタンパク質は、Ａ４０９２６ヘプタペプチド前駆体の芳香族残基と共に結合する、架橋結合反応に関与する。これらの４つのタンパク質は、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼとの有意な相同性を示す（表１）。他の糖ペプチド群で見られるＰ４５０モノオキシゲナーゼとの同一性のレベル、およびｂａｌ群に存在する遺伝子によりコードされるＰ４５０モノオキシゲナーゼの推定される役割（Bischoff et al. 2001）に基づき、次の予測をすることができる。すなわち、ＯＲＦ１４（配列番号：１５）産物は、アミノ酸２および４の芳香族残基の架橋結合に関与するようであり；ＯＲＦ１２（配列番号：１３）産物は、アミノ酸４および６の芳香族残基の架橋結合に関与するようであり；そしてＯＲＦ１１（配列番号：１２）産物は、アミノ酸５および７の芳香族残基の架橋結合に関与するようである。ＯＲＦ１３（配列番号：１４）のオルソログは、ｂａｌ、ｃｅｐ、およびｃｏｍ群には存在しないが、ｓｔａ群では見られる（表１）。Ａ４０９２６様のＡ４７９３４構造は、アミノ酸１および３の芳香族残基間にさらなる架橋結合を含有するので、ＯＲＦ１３（配列番号：１４）産物は、この架橋結合反応に関与するようである。
【００７６】
２Ｄ．芳香族残基のβ−ヒトドロキシチロシンの生成および塩素化
ＯＲＦ１０およびＯＲＦ２８（配列番号：１１および２９）によりコードされる２つのタンパク質は、ヘプタペプチドにおいてアミノ酸６として存在するチロシン残基へのβ−ヒドロキシ基の付加、およびアミノ酸２および６の芳香族残基の塩素化に関与する。他の糖ペプチド群において見られるハロゲン化酵素をコードする遺伝子との同一性のレベル、およびｂａｌ群に存在するハロゲン化酵素遺伝子の予測される役割（Puk et al. 2002）に基づき、ＯＲＦ１０（配列番号：１１）産物は、アミノ酸３および６の芳香族残基への塩素原子の導入に関与するようである。ＯＲＦ２８（配列番号：２９）産物は、非ヘム鉄ジオキシゲナーゼの典型的なモチーフを含有するタンパク質ファミリーと非常に関連する。かかるタンパク質の１つは、ｓｔａ群から推定され（Pootoolal et al. 2002）、チロシンのβ−ヒドロキシル化に関与すると示唆される。このヒドロキシ化反応の正確なタイミングは、現在分かっていない。それは、ヘプタペプチドへのアミノ酸６の取込み（これは、バンヒマイシンの合成において起こる）前に生じ得る（Bischoff et al. 2001）；それは、ヘプタペプチド合成中、あるいはヘプタペプチド骨格の完成後生じ得る。
【００７７】
２Ｅ．糖の付加および修飾、およびＮ−メチル化
ＯＲＦ９、２０、２３、２７、および２９（配列番号：１０、２１、２４、１８、および３０）によりコードされる５つのタンパク質は、Ａ４０９２６合成の後期段階のいくつかに関与する。これらの推定される役割は次のとおりである。ＯＲＦ９（配列番号：１０）は、他の糖ペプチド群によりコードされるタンパク質と非常に関連し、これは、位置４に存在するアミノ酸残基の芳香環のｐ−ヒドロキシル基への糖の結合に関与する（Solenberg et al. 1997）。特に、ＯＲＦ９（配列番号：１０）は、Ａ４０９２６アグリコンへのＮ−アシル−グルコサミン残基の結合に関与する糖転移酵素をコードする。かかる特異性を有する他の糖転移酵素のうち、記載の他の糖ペプチド群によりコードされるものはない。
【００７８】
ＯＲＦ２０（配列番号：２１）の相同体は、他の記載の糖ペプチド群においては見られない。このタンパク質は、タンパク質マンノシルトランスフェラーゼファミリーの典型的なモチーフを含有している（表１）。さらに、このＯＲＦの相同体を、ストレプトマイセス・コエリカラーのゲノム（表１）、ならびに抗生物質ラモプラニン（ramoplanin）（ＷＯ０２３１１５５）の合成を特定するアクチノプラネス亜種群において同定した。ラモプラニンは、ペプチドコアと結合したマンノシル残基を含有するので、これらのデータは全て、アミノ酸７のヒドロキシル基とのマンノシル残基の結合におけるＯＲＦ２０（配列番号：２１）の役割を指摘するものである。この推定の役割を以下の実施例４においても示す。
【００７９】
ＯＲＦ２３（配列番号：２４）の相同体は、記載の糖ペプチド群において見られない。このタンパク質は、アシルトランスフェラーゼファミリー３の典型的なモチーフを含有する（表１）。Ａ４０９２６は、アミノ糖残基のＮＨ２基と結合したアシル残基を含有するので、このＯＲＦ産物は、Ａ４０９２６前駆体のアシル化に直接的または間接的に関与するようであり、Ａ４０９２６複合体を特徴付ける化合物ファミリーを生じる。
【００８０】
ＯＲＦ２７（配列番号：２８）の相同体は、ｂａｌ、およびｃｅｐ群において見られる（表１）。ｃｅｐ群由来のＯＲＦ２７の相同体は、クロロエレモマイシンの中間体の末端のロイシン残基のＮ−メチル化に関与することを示した。ＨＰＧ残基は、Ａ４０９２６のＮ−末端に存在する。結論として、ＯＲＦ２７（配列番号：２８）産物は、糖ペプチド前駆体でのＨＰＧ残基のＮ−メチル化を触媒するようであり、従って、他の記載のメチルトランスフェラーゼとは異なる特異性が付与される。
【００８１】
ＯＲＦ２９（配列番号：３０）の相同体は、他の記載の糖ペプチド群において見られない（表１）。このタンパク質は、ＦＡＤ結合の典型的なモチーフを含有し、ヘキソースオキシダーゼとかなりの一致を示す（表１）。Ａ４０９２６は、アミノ酸４と結合したグルクロンアミン残基を含有するので、ＯＲＦ２９（配列番号：３０）によりコードされるタンパク質は、グルコサミン残基の酸化に関与するようである。このタンパク質はまた、細胞質から分泌されたタンパク質の典型的な推定シグナルペプチド配列を含有するので、酸化は、糖ペプチドコアと結合したグルコサミン残基を基質として用いて、細胞質外で生じるようである。
【００８２】
２Ｆ．輸送および抵抗性
ＯＲＦ７、１８、１９、２４、および３５（配列番号：８、１９、２０、２５、および３６）によりコードされる５つのタンパク質は、Ａ４０９２６、またはその前駆体のいくつかの細胞質外への輸送、および産生株への抵抗性の付与に関与する。その推定される役割は次のとおりである。
【００８３】
ＯＲＦ７（配列番号：８）の相同体は、他の記載糖ペプチド群において見られない。このタンパク質は、カルボキシペプチダーゼのＶａｎＹファミリーの典型的なモチーフを含有する（表１）。このファミリーは、いくつかのバンコマイシン耐性腸球菌でよく研究されている。これは、発生期のペプチドグリカンのペンタペプチドのいくつかから末端のアラニル残基を除去するのに関与し、従って、その分子標的と結合する糖ペプチドの範囲を減少される（Evers et al. 1996）。それゆえ、ＯＲＦ７（配列番号：８）は、産生株ノノムリア種（ＡＴＣＣ３８７２７）においてＡ４０９２６にあるレベルの抵抗性を付与するのに関与するようである。
【００８４】
ＯＲＦ２４およびＯＲＦ３５（配列番号：２５および３６）の相同体は、他の糖ペプチド群に存在する（表１）。これらは、それぞれＡＢＣ型膜貫通型輸送体およびイオン依存性膜貫通型輸送体をコードすると予測される。従って、これらは、Ａ４０９２６またはその前駆体のいくつかの輸送または区画化に関与するようである。ＯＲＦ１８およびＯＲＦ１９（配列番号：１９および２０）の相同体は、他の記載の糖ペプチド群において見られない（表１）。これらは、さらなるＡＢＣ型輸送体をコードすると推定され、このうちＯＲＦ１８（配列番号：１９）のみが、膜貫通型タンパク質であると推定される。従って、これらは、Ａ４０９２６またはその前駆体のいくつかの輸送または区画化に関与するようである。
【００８５】
２Ｇ．調節
ＯＲＦ３、４、および２２（配列番号：４、５、７、および２３）によりコードされる４つのタンパク質は、１またはそれ以上のｄｂｖ遺伝子の発現の調節に関与する。ＯＲＦ３（配列番号：４）の相同体は、他の記載の糖ペプチド群において見られない。このタンパク質は、ＬｕｘＲファミリーのポジティブレギュレーターの典型的なモチーフを含有し、ストレプトマイセス・ヒグロスコピカス由来のＰＫＳ群において見られる１つのポジティブレギュレーターと最も関連する（Ruan et al. 1997）。ＯＲＦ４（配列番号：５）の相同体は、他の糖ペプチド群において存在（表１）し、ポジティブ転写レギュレーターのＬｙｓＲ型ファミリーに属する。それゆえ、ＯＲＦ３および４（配列番号：４および５）は、１またはそれ以上のｄｂｖ遺伝子の発現に必要とされるようである。ＯＲＦ６およびＯＲＦ２２（配列番号：７および２３）は、細菌の２成分のシグナル伝達系の２つのメンバーをコードする。前者のタンパク質は、ストレプトマイセス・コエリカラーＣｕｔＲタンパク質で見出された最も一致する応答レギュレーターであるようである（表１）。後者のタンパク質は、ストレプトマイセス・ヒグロスコピカス由来の推定センサータンパク質キナーゼと最も関連する膜貫通型ヒスチジンキナーゼであるようである（表１）。それゆえ、ＯＲＦ６および２２（配列番号：２３）は、ｄｂｖ群での１またはそれ以上の遺伝子の発現の引き金となるシグナルの検出に関与するようである。
【００８６】
実施例３−ＥＳＡＣベクターにおけるｄｂｖ群の単離
実施例２で提供の情報を用いて、ｄｂｖ群を、次の様にＥＳＡＣベクターにおいて単離した。ゲノムライブラリーを、ｐＰＡＣ−Ｓ１ベクター（Sosio et al. 2000b）においてノノムリア（ＡＴＣＣ３９７２７）由来ＤＮＡにより作成した。ノノムリア（ＡＴＣＣ３９７２７）由来ＤＮＡを、アガロースプラグ（Sosio et al. 2000b；ＷＯ９９／６７３７４記載）に埋め込んで調製し、１００〜２００ｋｂの範囲にフラグメントサイズを最適化するためにＳａｕ３ＡＩで部分的に切断した。生じたＤＮＡフラグメントを、ＰＦＧＥゲルにて簡単に泳動し、アガロースゲルから回収し、遊離させた（Sosio et al. 2000b；ＷＯ９９／６７３７４に記載）。ベクター調製、ライゲーション、およびエシェリキア・コリＤＨ１０Ｂコンピテント細胞のエレクトロポレーションを含む次の工程を、記載（Sosio et al. 2000b；ＷＯ９９／６７３７４）のように行った。得られたコロニーをナイロンフィルターに移して分析し、ノノムリア（ＡＴＣＣ３９７２７）ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した２つのプローブでのハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。プローブＡを、オリゴ５’−ＴＣＡＧＧＡＧＡＣＧＡＡＣＣＣＣＧＣ−３’（配列番号：４３）および５’−ＧＴＧＣＡＣＧＡＡＡＧＴＣＣＣＧＴＣ−３’（配列番号：４４）を用いて；そしてプローブＢを、５’−ＡＴＧＧＡＣＴＣＣＣＡＣＧＴＴＣＴＣ−３’（配列番号：４５）および５’−ＴＣＡＧＧＧＧＡＧＡＣＡＴＧＣＧＧＴ−３’（配列番号：４６）を用いて得た。これらの配列は全て、配列番号：１に由来するものである。次に、これらのプローブ全てに対してポジティブのＥＳＡＣクローンを単離し、ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶでの切断により物理的に位置決定した。かかる実験の１つから、約８４ｋｂのインサートを含有するＥＳＡＣクローンＮｍＥＳ１を単離し、ＮｍＥＳ１は、完全なｄｂｖ群（配列番号：１）を含み、これを約５ｋｂ、配列番号：１のヌクレオチド１の５’方向、そして約８ｋｂ、配列番号：１のヌクレオチド７１１３８の３’方向に拡大する。
【００８７】
上記の実施例は、ｄｂｖ群をＥＳＡＣベクターにおいて得ることができる、原理および方法論を説明するものである。ベクターｐＰＡＣ−Ｓ１は、この目的で用い得るＥＳＡＣベクターのただ１例であることは、当業者は理解するであろう。完全なｄｂｖ遺伝子群のクローニング、および適当な放線菌宿主への移行に有用な他のベクターは、記載（Sosio et al. 2000b；ＷＯ９９／６７３７４）されている。さらに、部分的な切断、フラグメントの分離および回収、ベクター調製、ライゲーション、およびエシェリキア・コリ細胞の形質導入を含む（これらに限らない）、ノノムリア種（ＡＴＣＣ３９７２７）ＤＮＡの長いインサートライブラリーを調製する他の方法はまた、本発明の範囲にある。ｄｂｖ群の境界を配列番号：１において確立すると、上記のプローブＡおよびＢ以外の任意のプローブまたはプローブの組合せを用いて、インサートが完全なｄｂｖ群に及ぶクローンを同定するためにノノムリア種（ＡＴＣＣ３９７２７）により作成したライブラリーをスクリーニングできることを、当業者は理解するであろう。代わりに、配列番号：１および表１においてい提供した情報により、他の有用なプローブを、異種性ハイブリダイゼーションを可能とするｄｂｖ遺伝子と有意に関連する遺伝子を含有する他の遺伝子群から得ることができる。これらすべてのバリエーションが、本発明の範囲にある。
【００８８】
実施例４−遺伝子の置き換えによるＡ４０９２６の操作
実施例２において提供した情報を用いて、ＯＲＦ２０のインフレーム欠失を、次の様に行った。フラグメントＡを、オリゴ５’−ＴＴＴＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＧＣＧＡＴＣＣＧＴＣＣＧＴＣＴ−３’（配列番号：４７）および５’−ＴＴＴＴＣＴＡＧＡＧＣＣＣＧＧＡＣＡＣＣＣＧＧＧＧＧＣＴＧＡ−３’（配列番号：４８）による;そしてフラグメントＢを、オリゴ５’−ＴＴＴＴＣＴＡＧＡＡＧＴＣＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＧＣＧＡＣＡＴ−３’（配列番号：４９）および５’−ＴＴＴＴＡＡＧＣＴＴＡＴＧＴＴＧＣＡＧＧＡＣＧＣＣＧＡＣＣＧ−３’（配列番号：５０）による増幅により得た。次に、フラグメントＡをＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで、フラグメントＢをＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、両者を、あらかじめＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＳＥＴ１５２（Bierman et al. 1992）にライゲーションした。ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩエシェリキア・コリＤＨ５ａ細胞の形質導入後、得られたプラスミド（ｐＳＭ４と命名）を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでの切断後の４ｋｂおよび１．５ｋｂのフラグメントの存在により認識した。アリコートのｐＳＭ４を、エシェリキア・コリＥＴ１２５６７（ｐＵＢ３０７）（Kieser et al. 2000）細胞に移行し、ＳＭ４株を得た。次に、ＬＢで一晩培養したものからの約１０８ＣＦＵのＳＭ４細胞を、約８０時間Ｒａｒｅ３培地で増殖させた、約１０７ＣＦＵのノノムリア（ＡＴＣＣ３９７２７）と混合した。得られた混合物をＨＴプレートに広げ、次に、２８℃で約２０時間インキュベーションした。軽く水で洗浄し、過剰なエシェリキア・コリ細胞を除去した後、プレートを、ナリジクス酸 ２００ｍｇおよび１５ｍｇ／ｍｌ アプラマイシン含有ソフトアガー ３ｍｌで覆った。２８℃で３〜５週間さらにインキュベーションした後、ノノムリア外結合体を、新しいアプラマイシン含有培地に画線した。かかる外結合体（ex-conjugate）の１つ（ＳＳ１８株と命名）をさらに処理した。次に、ＳＳ１８株をアプラマイシンを含まないＨＴ培地にて何度か継代して増殖させ、適当な希釈物をアプラマイシンを含まないＨＴアガーに蒔いた。次に、個々のクローンを、オリゴ５’−ＴＴＴＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＧＣＧＡＴＣＣＧＴＣＣＧＴＣＴ−３’（配列番号：４７）および５’−ＴＴＴＴＡＡＧＣＴＴＡＴＧＴＴＧＣＡＧＧＡＣＧＣＣＧＡＣＣＧ−３’（配列番号：５０）を用いて、ＰＣＲにて分析した。ＯＲＦ２０欠失対立遺伝子を含有するコロニーを、１．５ｋｂのバンドの存在により認識した。かかるコロニーの１つ（ＳＳＭ１８と命名）をＨＴ培地にて増殖させ、脱マンノシルＡ４０９２６の生成を、信頼できるスタンダード（Malabarba and Ciabatti 2001）との比較により確認した。
【００８９】
上記の実施例は、配列番号：２から３８により特定されるもののいずれかから選択したＯＲＦを、Ａ４０９２６産生株ノノムリア種（ＡＴＣＣ３９７２７）において変異コピーにより置き換えることができる、原理および方法論を説明したものである。ＯＲＦ２０（配列番号：２１）が、配列番号：１により特定される群でのインフレームの欠失を創出する方法論の１例にすぎないことを当業者は理解するだろう。当業者はまた、インフレーム欠失は変異を創出する１つの方法であって、インフレームシフト変異を含む（これに限らない）他の方法、挿入、および部位指定変異を用いて、配列番号：２から３８により特定されるＯＲＦのいずれかにおいて無変異体を創出できることを理解する。当業者はまた、配列番号：１により特定されるＯＲＦのいずれかにおいて変異を創出する確立された方法があるので、これらと同じ方法論を適用して、これらと同じＯＲＦの発現レベルを変化させることができることを理解する。このことがいかにして成され得るかの例は、ノノムリア種（ＡＴＣＣ３９７２７）ゲノムの任意の位置への複数コピーの該ＯＲＦの組み込み、該ＯＲＦの発現を調節するプロモーターにおける変化、アンチセンスＲＮＡまたはその発現に干渉する転写ターミネーターの除去を含むが、これらに限らない。
【００９０】
最後に、ノノムリア種（ＡＴＣＣ３９７２７）に変異型対立遺伝子を導入するのに有用なベクター、宿主およびレシピエント株の接合および培養条件、外結合体およびその誘導体の選択方法およびスクリーニング方法におけるバリエーションは全て、本発明の範囲にある。
【００９１】
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【配列表】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
放線菌は、構造上異なりかつ生物学的に活性な二次代謝産物（多くが、商業用用途（例えば、抗生物質）を見出されている）を産生する能力についてよく知られている。重要な代謝産物は、ストレプトマイセス亜種（Streptomyces spp.）（最も詳細に研究されている）だけでなく、あまり知られていない放線菌属によっても産生される：例えば、現在、リファマイシン、テイコプラニン、およびエリスロマイシンが、それぞれアミコラトプシス（Amycolatopsis）種、アクチノプラネス（Actinoplanes）種、およびサッカロポリスポラ（Saccharopolyspora）種により産業上製造されている。二次代謝産物の生合成を支配している遺伝因子は、代謝産物の合成、調節、および抵抗性に必要な遺伝子全てを含有する遺伝子群に組織化されている。
【０００２】
多くの異なる二次代謝物は、類似の酵素が介入する、共通の生合成経路を有している。このことは、ポリケチド（Katz and McDaniel 1999）、非リボソーム合成ペプチド（non-ribosomally synthesized peptide）（Marahiel 1997）、およびデオキシ糖（Rodriguez et al. 2000）について完全に示されている。しかしながら、この類似性にもかかわらず、ある微生物での特定の二次代謝物の合成に関与する遺伝子群の組織化を、演繹的に定義することはできない。事実、非常に類似する二次代謝物の合成は、対応する産生株が同属にないとき、別に組織化された群により支配され得る。この種の例は、マクロライド系抗生物質間で見出すことができる（Katz and McDaniel 1999）。さらに産生株内の所望の群の同定は、放線菌において、同じ経路の酵素を特定する複数群の存在により複雑になる。このことは、ポリケチド（例えば、Ruan et al. 1997）およびペプチド（例えば、Sosio et al. 2000a）について示され、遺伝子配列決定により確かめられている（Omura et al. 2001；Bentley et al. 2002）。結論として、既に知られているものと比較して、新たな群の組織化、ヌクレオチド配列、または同一性の程度を演繹的に理解することはできない。
【０００３】
糖ペプチドは、その作用機序（Parenti and Cavalleri 1989）によりダルバヘプチド（dalbaheptide）としても知られ、細菌細胞壁の架橋結合と干渉し、現在臨床上用いられているバンコマイシンおよびテイコプラニンと干渉する、重要な種の抗生物質である。これらは大抵、生命を脅かす感染症の処置において最終選択となる抗生物質である。他方、腸球菌での糖ペプチドに対する耐性の出現、およびこの高レベルの耐性が結局メチシリン耐性黄色ブドウ球菌において拡大し得るという恐れが、この種の第２世代薬物の探索を促している。有望な結果が、改善した活性、拡大した抗細菌スペクトル、または良好な薬物動態を有する半合成誘導体の開発により、得られている（Malabarba and Ciabatti 2001）。
【０００４】
ゆえに、天然に存在する化合物の操作により、改良した糖ペプチドを得る可能性および有用性が存在する。しかしながら、糖ペプチドは構造上複雑な分子であり、化学的性質へのアクセスしやすさは、該分子の数カ所の位置に制限されている。例えば、糖は糖ペプチドから化学的に容易に取り除かれ、対応するアグリコンが生成され得る一方、化学的手段により、異なる糖を特定位置に位置選択性に結合させることは、非常に困難である。糖ペプチドの塩素化の程度が抗菌活性に影響することが示されている。同様に、糖ペプチドの芳香環の化学的脱塩素化は、容易に達成され得るが、構造中の所望の環の選択的ハロゲン化は、比較的複雑である。最後の例として、テイコプラニンファミリーの糖ペプチドは、位置４のアリールアミノ酸と結合したグルコサミンと結合したアシル鎖を含有しているが、バンコマイシン類の化合物は含有していない。化学的または生体内変換（Lancini and Cavalleri 1997）のいずれかによる糖ペプチドのアシル化および脱アシル化が報告されているが、これは通常、全体的に低収率となる。上記に照らし、化学的手段により生成することが困難であるか、または不可能な誘導体を得るために、糖ペプチド形成においてこれらの工程を再指向するのに有用な遺伝子および酵素を有することが望まれる。このことは、塩素化の程度が糖ペプチドの生物学的活性に影響すること、ならびに改良した誘導体が、糖ペプチドのグリコシル化またはアシル化パターンを変化させることにより、得られ得ること（Malabarba and Ciabatti 2001）が示されているため、特に適切である。化学的性質についての主な制限の１つは、ペプチド骨格に存在するアミノ酸の種類または順序を変えることである。化学的には、比較的低収率でアミノ酸１および３にのみ介入することが可能であると示されている（Malabarba et al. 1997）。従って、正確に操作された株での発酵過程により新規糖ペプチド誘導体を直接設計する一般的な方法が、大変望まれている。
【０００５】
興味をそそる代わりとなる方法は、天然に存在する糖ペプチドの生合成過程を操作することにより、改良した抗生物質を創出することである。この種の例は報告されている。実際、バンコマイシンおよびクロロエレモマイシン（chloroeremomycin）遺伝子群から糖転移酵素が発現した後にインビトロおよびインビボの両方で糖ペプチドアグリコンを選択的にグリコシル化することが可能である（Solenberg et al. 1997；Loosey et al. 2001）。しかしながら、上記の酵素のうち、所望の位置にグルコサミン残基を結合させることが可能なものはない。同様に、バルヒマイシン（balhimycin）産生アミコラトプシス・メディテッラネイ（A. mediterranei）の選択された遺伝子の不活性化により、バルヒマイシン誘導体が得られる（Pelzer et al. 1999）。しかしながら、テイコプラニンファミリーの糖ペプチド産生株についてのかかる実験は記載されていない。
【０００６】
抗生物質Ａ４０９２６は、糖ペプチドのテイコプラニンファミリーに属する（Parenti and Cavalleri 1989）。これは、密接に関連する分子の複合体からなり、そのコア構造は、アミノ酸１〜３、２〜４、および４〜６間のエーテル結合、およびアミノ酸５〜７間のＣ−Ｃ結合により決定される強固な足場を有するヘプタペプチド骨格に最構成され得る。加えて、２個の糖残基および２個の塩素原子が該分子に存在する。Ａ４０９２６複合体の構成要素の構造は、以下に示される式
【化１】
（ここで、Ｒは、ファクターＡ１を有する［Ｃ９−Ｃ１２］アルキル（Ｒ＝ｎ−デシル）、ファクターＢ０を有する［Ｃ９−Ｃ１２］アルキル（Ｒ＝９−メチルデシル）、およびファクターＢ１（Ｒ＝ｎ−ウンデシル）を有する［Ｃ９−Ｃ１２］アルキルを表し、これらが主な構成要素である）により、表される。
【０００７】
もともとアクチノマヅラ種（ＡＴＣＣ３９７２７）として知られていた産生株は、最近、ノノムリア種（Nonomuria sp.）（ＡＴＣＣ３９７２７）として再分類された（Zhang et al. 1998）。固有の抗菌活性を示すことに加えて、Ａ４０９２６はまた、半合成糖ペプチドダルババンシンの前駆体である（もともとＢＩ３９７またはＭＤＬ ６２３９７として知られていた；Malabarba and Ciabatti 2001）。それゆえ、Ａ４０９２６の構造を操作し、その収率を増加させるさらなる手段が、大変望まれている。しかしながら、ノノムリア属の他のメンバー由来の上記の群の例は存在しない。それゆえ、ノノムリアでのＡ４０９２６の生成、およびその調節に必要な遺伝子はまた、産生過程を最適化するのに有用であり得る。
【０００８】
最近、糖ペプチドのクロロエレモマイシン（van Wageningen et al. 1998）、バルヒマイシン（Pelzer et al. 1999）、コンプレスタチン（complestatin）（Chiu et al. 2001）、およびＡ４７９３４（Pootoolal et al. 2002）の生成に関与する遺伝子群が明らかにされた。それぞれ、ｃｅｐ、ｂａｌ、ｃｏｍ、およびｓｔａと呼ばれるこれらの群は、それぞれ、アミコラトプシス・オリエンタリス（Amycolatopsis orientalis）、アミコラトプシス・メディテッラネイ（Amycolatopsis mediterranei）、ストレプトマイセス・ラベンジュレ（Streptomyces lavendulae）、およびストレプトマイセス・トヨカネシス（Streptomyces toyocaensis）から得られたものである。これらの群は、糖ペプチド経路を操作するのに有用ないくつかの遺伝子を提供してきた。しかしながら、ある種の工程は、上記群により行われることはできない。例えば、利用可能な遺伝子群は、糖の酸化状態を変化させるか、脂肪酸鎖を結合させるか、あるいはアミノ酸３の芳香族部分に塩素原子もたらす能力のある官能基をコードしていない。これらの官能基は全て、本発明において記載されている。
【０００９】
抗生物質を製造する産業上の過程の設計は、比較的成功しており、１Ｌ当たり数ｇのレベルに至る抗生物質タイターを有する巨大サイズの発酵を生じる。これは、主に経験的な試行錯誤に従い達成され、論理的な基盤を欠いている。従って、新たな方法の開発、および現行技術の改良は、依然時間を必要とし、不安定で、一貫性なく機能し、そして非所望の副産物を蓄積する細菌群を生じ得る。ここ数年、理論的方法が適用され、ストレプトマイセス亜種により産生される抗生物質のレベルが十分に増加している。これは大抵、対象の遺伝子群に存在する鍵となる調節エレメントの操作、または経路の律速段階の過剰発現を含んでいる。それゆえ、かかる群関連調節因子または合成の律速段階をコードする遺伝子は、収率を改善する有効な手段であり得る。しかしながら、放線菌で今までに同定された群関連調節因子は、いくつかの異なるタンパク質ファミリーに属する（Chater and Bibb 1997）。１つのファミリー内でさえ、配列同一性の相当なバリエーションが存在する。それゆえ、群関連調節因子の存在、性質、数、および配列は、他の群（たとえ関連する抗生物質を特定するものであっても）との比較により推定されることはできない。例えば、チロシン遺伝子群は、４個の異なる調節因子をコードしているが、このうち、関連するマクロライド系抗生物質であるエリスロマイシンを特定する群において見出されるものはない（Bate et al. 1999）。同様に、生合成経路の律速段階の性質および論拠は、演繹的に確立されることはできない。
【００１０】
発明の概要
本発明は、微生物での糖ペプチドＡ４０９２６の生合成に必要な単離ポリヌクレオチドのセットを提供する。本発明の１つの態様において、ポリヌクレオチド分子は、ノノムリア種（ＡＴＣＣ３９７２７）から単離されたｄｂｖ遺伝子群を表し、Ａ４０９２６生成に必要なポリペプチドをコードする３７個のＯＲＦからなる、連続ＤＮＡ配列（配列番号：１）から選択される。該３７個のＯＲＦによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２から３８において提供される。
【００１１】
本発明は、
ａ）Ａ４０９２６の合成に必要なポリペプチドをコードするｄｂｖ遺伝子群（配列番号：１）;
ｂ）ｄｂｖ遺伝子群自体のヌクレオチド配列以外であって、ｄｂｖ遺伝子群（配列番号：１）によりコードされるのと同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号：２から３８のポリペプチドをコードする、ｄｂｖ ＯＲＦ１から３７の任意のヌクレオチド配列；
ｄ）該ＯＲＦ以外のヌクレオチド配列以外であって、ｄｂｖの ＯＲＦ１から３７のいずれかによりコードされるのと同じポリペプチド（配列番号：２から３８）をコードするヌクレオチド配列；
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸を提供する。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、
ｅ）配列番号：４から５、７から１１、１９から２１、２３から２４、３０から３１、および３７で特定されるポリペプチドをコードする、ｄｂｖ ＯＲＦ３から４、６から１０、１８から２０、２２から２３、２９から３０、および３６のいずれかのヌクレオチド配列；
ｆ）該ｄｂｖ ＯＲＦのヌクレオチド配列以外であって、ｄｂｖ ＯＲＦ３から４、６から１０、１８から２０、２２から２３、２９から３０、および３６のいずれかによりコードされるのと同じポリペプチド（配列番号：４から５、７から１１、１９から２１、２３から２４、３０から３１、および３７）をコードするヌクレオチド配列；
ｇ）ｄｂｖ ＯＲＦ３、６から９、１８から２０、２２から２３、２９から３０、および３６のいずれかによりコードされるポリペプチド（配列番号：４、７から１０、１９から２１、２３から２４、３０から３１、および３７）とアミノ酸配列が、少なくとも８０％、好ましくは、８６％、より好ましくは、９０％、最も好ましくは、９５％またはそれ以上同一のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｈ）ｄｂｖ ＯＲＦ４および１０のいずれかによりコードされるポリペプチド（配列番号：５および１１）とアミノ酸配列が、少なくとも８７％、好ましくは、９０％、より好ましくは、９５％またはそれ以上同一のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸を提供することである。
【００１３】
１つの実施態様において、本発明の単離核酸は、ＯＲＦ１から３７（配列番号：２から３８）から選択されるＯＲＦの組合せを含み、これは、Ａ４０９２６の４−ヒドロキシフェニルグリシン（ＨＰＧ）残基の合成に必要なポリペプチドをコードする。別の実施態様において、核酸は、ＯＲＦ１から３７（配列番号：２から３８）から選択されるＯＲＦの組合せを含み、これは、Ａ４０９２６の３，５−ジヒドロキシフェニルグリシン（ＤＰＧ）残基の合成に必要なポリペプチドをコードする。なお別の実施態様において、核酸は、ＯＲＦ１から３７（配列番号：２から３８）から選択されるＯＲＦの組合せを含み、これは、Ａ４０９２６のヘプタペプチド骨格の合成に必要なポリペプチドをコードする。別の実施態様によると、本発明の核酸において、ＯＲＦ１から３７（配列番号：２から３８）から選択されるＯＲＦの組合せが提供され、これは、Ａ４０９２６のアミノ酸３および６の芳香族残基の塩素化に必要なポリペプチドをコードする。なお別の実施態様において、ＯＲＦ１から３７（配列番号：２から３８）から選択されるＯＲＦの組合せを含む核酸が提供され、これは、Ａ４０９２６のアミノ酸６のチロシン残基のβ−ヒドロキシル化に必要なポリペプチドをコードする。なお別の実施態様において、ＯＲＦ１から３７（配列番号：２から３８）から選択されるＯＲＦの組合せを含む核酸が提供され、これは、Ａ４０９２６の位置２および４、４および６、１および３、および５および７のアミノ酸の芳香族残基の架橋結合に必要なポリペプチドをコードする。別の実施態様によると、本発明の核酸において、ＯＲＦ１から３７（配列番号：２から３８）から選択されるＯＲＦの組合せが提供され、これは、Ｎ−アシルグルクロンアミン残基の付加および形成に必要なポリペプチドをコードする。なお別の実施態様において、ＯＲＦ１から３７（配列番号：２から３８）から選択されるＯＲＦの組合せを含む核酸が提供され、これは、マンノシル残基の結合に必要なポリペプチドをコードする。なお別の実施態様において、ＯＲＦ１から３７（配列番号：２から３８）から選択されるＯＲＦの組合せを含む核酸が提供され、これは、Ａ４０９２６のＮ−メチル化に必要なポリペプチドをコードする。なお別の実施態様によると、ＯＲＦ１から３７（配列番号：２から３８）から選択されるＯＲＦの組合せを含む核酸が提供され、これは、Ａ４０９２６の輸送およびＡ４０９２６の抵抗性に必要なポリペプチドをコードする。なお別の実施態様において、ＯＲＦ１から３７（配列番号：２から３８）から選択されるＯＲＦの組合せを含む核酸が提供され、これは、ｄｂｖ遺伝子群の発現の調節に必要なポリペプチドをコードする。なお別の実施態様において、ＯＲＦ１ないし３７（配列番号：２から３８）から選択されるＯＲＦの発現レベルを増強する、配列番号：１から選択される１以上のＤＮＡセグメントを含む核酸が提供される。
【００１４】
当業者は、本発明は、Ａ４０９２６の生合成経路のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供し、また、かかるポリペプチドに由来するフラグメントをコードするヌクレオチドを提供することを理解する。加えて、当業者は、遺伝暗号が縮重するため、配列番号：２から３８において特定される同じポリペプチドが、ＯＲＦ１から３７の天然変異体または人工変異体、すなわち、ＯＲＦ１から３７により特定されるゲノムヌクレオチド配列以外だが、同じポリペプチドをコードするヌクレオチドによりコードされ得ることを理解する。さらに、天然に存在する変異体または人工的に製造された変異体は、配列番号：２から３８において特定されるペプチドを生じ、該変異体が、上記の原型ポリペプチドと同じ機能を有するが、フォールディングまたは触媒機能に必須でないアミノ酸のアミノ酸の付加、欠失、または置換、または必須アミノ酸の保存的置換を含有することも理解される。
【００１５】
当業者はまた、本発明が、Ａ４０９２６の生合成に必要な群全体のヌクレオチド配列を提供し、該群に存在する遺伝子の発現に必要なヌクレオチド配列も提供することを理解する。かかる調節配列は、プロモーター配列およびエンハンサー配列、アンチセンス配列、転写ターミネーター配列およびアンチターミネーター配列を含むが、これらに限らない。これらの配列は、ｄｂｖ遺伝子群に存在する遺伝子の発現を調節するのに有用である。該ヌクレオチドを単独で、あるいは他のヌクレオチド配列と融合して有する細胞も、本発明の範囲にある。
【００１６】
１つの態様において、本発明は、Ｎ−アシル−グルコサミン残基の糖ペプチド抗生物質前駆体のコア構造との結合に有用なＯＲＦ９ポリペプチド（配列番号：１０）、または該ポリペプチドの天然に存在する変異体または誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸を提供する。別の態様において、本発明は、脂肪酸残基の糖ペプチド抗生物質前駆体のコア構造との結合に有用なＯＲＦ２３ポリペプチド（配列番号：２４）、または該ポリペプチドの天然に存在する変異体または誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。なお別の態様において、本発明は、糖ペプチド抗生物質前駆体に結合した糖部分の酸化に有用なＯＲＦ２９ポリペプチド（配列番号：３０）、または該ポリペプチドの天然に存在する変異体または誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。別の態様において、本発明は、コアの糖ポリペプチド抗生物質前駆体のβ−ヒドロキシチロシンおよびＤＰＧ残基の塩素化に有用なＯＲＦ１０ポリペプチド（配列番号：１１）、または該ポリペプチドの天然に存在する変異体または誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。別の態様において、本発明は、マンノシル残基の糖ペプチド抗生物質前駆体のコア構造との結合に有用なＯＲＦ２０ポリペプチド（配列番号：２１）、または該ポリペプチドの天然に存在する変異体または誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００１７】
別の態様において、本発明は、細胞からの糖ペプチド抗生物質または糖ペプチド抗生物質前駆体の輸送、および抵抗性の付与に有用なＯＲＦ７、１８、１９、２４、および３５によりコードされるポリペプチド（配列番号：８、１９、２０、２５、および３６）、または該ポリペプチドの天然または人工的に存在する変異体または誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。別の態様において、本発明は、糖ペプチド抗生物質または糖ペプチド抗生物質前駆体産生株に抵抗性を付与するのに有用なＯＲＦ７ポリペプチド（配列番号：８）、または該ポリペプチドの天然または人工的に存在する変異体または誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。別の態様において、本発明は、糖ペプチド抗生物質前駆体の収率を増加させるのに有用なＯＲＦ３、４、６、２２、および３６ポリペプチド（配列番号：４、５、７、２３、および３７）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００１８】
１つの実施態様において、本発明は、ＯＲＦ１ないし３７（配列番号：２から３８）のいずれかから選択される少なくとも１個のＯＲＦを特定するヌクレオチド配列の追加（extra）コピーを有する、糖ペプチド産生株を提供する。１つの好ましい実施態様において、かかる糖ペプチド産生株は、アクチノマイセス（Actinomycetales）目に属する任意の株である。なお別の好ましい実施態様において、かかる糖ペプチド産生株は、ノノムリア属のメンバーである。１つのさらなる態様において、本発明は、配列番号：１において特定されるヌクレオチド配列に１以上のバリエーションを含有するノノムリア株を提供し、かかるバリエーションは、ＯＲＦ１ないし３７（配列番号：２から３８）のうち１個以上の発現を増加あるいは減少させる。
【００１９】
１つの好ましい実施態様において、本発明は、別の細胞によるＡ４０９２６、１つ以上のその前駆体または誘導体の産生に有用な１以上のベクター上に担持された、配列番号：１、またはその一部分により特定されるヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。１つの好ましい実施態様において、該ヌクレオチド配列またはその一部分は、１つのベクター上に担持されている。なお別の好ましい実施態様において、かかるベクターは、細菌の人工染色体である。なお別の態様において、該細菌の人工染色体は、ＥＳＡＣベクター（ＷＯ９９／６３６７４に記載）である。別の好ましい実施態様において、本発明は、配列番号：１により特定される遺伝子群を含有するノノムリア種（ＡＴＣＣ３９７２７）以外の組換え放線菌株を提供し、該遺伝子群は、該組換え放線菌株の染色体に組み込まれたＥＳＡＣベクターにの担持されている。
【００２０】
１つの態様において、本発明は、Ａ４０９２６の産生を増加させる方法を提供し、該方法は、次の工程：（１）組換えＤＮＡベクターで生合成経路によりＡ４０９２６またはＡ４０９２６前駆体を産生する微生物を形質導入すること（該ベクターは、該経路を律速する活性をコードする、ＯＲＦ１ないし３７（配列番号：２ないし３８）のいずれかから選択されたＤＮＡ配列を含む）；（２）該ベクターで形質導入された該微生物を、細胞増殖、該遺伝子の発現、および該抗生物質または抗生物質前駆体の産生に適した条件下で培養することを含む。
【００２１】
別の態様において、本発明は、Ａ４０９２６の誘導体を産生する方法を提供し、該方法は、次の工程：（１）適当なベクターに、配列番号；１により定義されるヌクレオチド配列から選択されたセグメントをクローニングすること（該セグメントは、ＯＲＦ１ないし３７（配列番号：２ないし３８）の１つの少なくとも一部分を含有し、該ＯＲＦは、回避することが望まれる生合成段階を触媒するポリペプチドをコードする）；（２）該ＯＲＦを、該ポリペプチドの活性に必須のアミノ酸について特定する１個以上のコドンを取り除くかあるいは置換することにより不活性化すること；（３）該組換えＤＮＡベクターで生合成経路によりＡ４０９２６またはＡ４０９２６前駆体を産生する微生物を形質導入すること；（４）得られた形質導入体を該ＤＮＡ配列が変異コピーにより置き換えられ、従って破壊された遺伝子を生じるものについてスクリーニングすること；次に、（５）該変異体細胞を、細胞増殖、該経路の発現、および該経路の類似体の産生に適した条件下で培養することを含む。
【００２２】
なお別の態様において、本発明は、新規糖ペプチドを産生する方法を提供し、該方法は、次の工程：（１）組換えＤＮＡベクターで、生合成経路によりＡ４０９２６またはその前駆体とは異なる糖ペプチドまたは糖ペプチド前駆体を産生する微生物を形質導入すること（該ベクターは、ＯＲＦ１ないし３７（配列番号：２ないし３８）から選択された１個以上のＯＲＦを含み、該糖ペプチドまたは糖ペプチド前駆体を修飾する１以上のポリペプチドの発現をコードする）；（２）該ベクターで形質導入された該微生物を、細胞増殖、該遺伝子の発現、および該抗生物質または抗生物質前駆体の産生に適した条件下で培養することを含む。
【００２３】
この方法を行うのに適した糖ペプチドまたは糖ペプチド前駆体を産生する微生物の例は、ストレプトマイセス属、アミコラトプシス属、アクチノプラネス属、ノノムリア属などに属する株である。
【００２４】
なお別の態様において、本発明は、新規糖ペプチドを産生するさらなる方法を提供し、該方法は、次の工程：（１）組換えＤＮＡベクターで微生物を形質導入すること（該ベクターは、糖ペプチドまたは糖ペプチド前駆体を修飾する１以上のポリペプチド（活性なポリペプチド）をコードする、ＯＲＦ１ないし３７（配列番号：２ないし３８）から選択される１個以上のＯＲＦを含み、そして該微生物は、糖ペプチドまたは糖ペプチド前駆体を産生せず、かつ導入されたＯＲＦを効率的に発現できるものから選択される）；（２）該微生物の細胞抽出物または細胞分画を活性なポリペプチドの存在に適した条件下で調製すること（該細胞抽出物または細胞分画は、少なくとも該活性なポリペプチドを含有する）；（３）糖ペプチドまたは糖ペプチド前駆体を該細胞抽出物または細胞分画に添加し、次に該混合物を該活性なポリペプチドが該糖ペプチドまたは糖ペプチド前駆体を修飾できる条件下でインキュベーションすることを含む。
【００２５】
この方法を行うのに適した微生物の例は、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）種、ストレプトマイセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor）種、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）種、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）種などに属する株である。
【００２６】
本発明のさらなる態様は、
ａ）ｄｂｖ ＯＲＦ１から３７（配列番号：２ないし３８）のいずれかによりコードされるＯＲＦポリペプチド、またはｄｂｖ ＯＲＦ１から３７（配列番号：２ないし３８）のいずれか、好ましくは、ｄｂｖ ＯＲＦ３から４、６から１０、１８から２０、２２から２３、２９から３０（配列番号：４から５、７から１１、１９から２１、２３から２４、３０から３１、および３７）のいずれか１つによりコードされるポリペプチドとアミノ酸配列が同一のポリペプチド；
ｂ）ｄｂｖ ＯＲＦ３、６から９、１８から２０、２２から２３、２９から３０、および３６（配列番号：４、７から１０、１９から２１、２３から２４、３０から３１、および３７）のいずれかによりコードされるポリペプチドとアミノ酸配列が、少なくとも８０％、好ましくは、８６％、より好ましくは、９０％、最も好ましくは、９５％またはそれ以上同一のポリペプチド；
ｃ）ｄｂｖ ＯＲＦ４から１０（配列番号：５から１１）のいずれかによりコードされるポリペプチドとアミノ酸配列が、少なくとも８７％、好ましくは、９０％、より好ましくは、９５％またはそれ以上同一のポリペプチド、
から選択されるＡ４０９２６の生合成経路に関与するポリペプチド配列を含む単離ポリペプチドを含む。
【００２７】
定義
用語「単離核酸」は、ゲノムＤＮＡまたは相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）のいずれかとしてのＤＮＡ分子を意味し、これは、天然および合成起源の１本鎖または２本鎖であり得る。この用語はまた、天然または合成起源のＲＮＡ分子を意味する。
【００２８】
用語「ヌクレオチド配列」は、本明細書に開示されるＯＲＦの全長または一部分の配列、および遺伝子間領域を意味する。配列表に示される本発明のヌクレオチド配列のいずれか１つは、（ａ）コード配列、（ｂ）（ａ）の転写からもたらされるＲＮＡ分子、（ｃ）同一ポリペプチドをコードするために遺伝暗号の縮重を用いるコード配列、または（ｄ）プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、およびアンチターミネーター配列を含有する遺伝子間領域である。
【００２９】
用語「遺伝子群（gene cluster）」、「群（cluster）」、および「生合成群（biosynthesis cluster）」は全て、二次代謝産物の合成に必要な遺伝子全てを含有する微生物のゲノムの連続セグメントを示す。
【００３０】
用語「ｄｂｖ」は、ノノムリア種（ＡＴＣＣ３９７２７）におけるＡ４０９２６生合成に関与する遺伝因子を意味する。
【００３１】
用語「ＯＲＦ」は、１つのポリペプチドをコードするゲノムヌクレオチド配列を意味する。本発明において、用語ＯＲＦは「遺伝子」と同意語である。
【００３２】
用語「ＯＲＦポリペプチド」は、ＯＲＦによりコードされるポリペプチドを意味する。
用語「ｄｂｖ ＯＲＦ」は、ｄｂｖ遺伝子群内に含まれるＯＲＦを意味する。
【００３３】
用語「ＮＲＰＳ」は、二次代謝産物のオリゴペプチド骨格へのアミノ酸の取込みに関与する触媒活性体の複合体である、非リボソームペプチド合成酵素を意味する。機能的なＮＲＰＳは、オリゴペプチドへの１個以上のアミノ酸の取込みを触媒するものである。
【００３４】
用語「ＮＲＰＳモジュール」、または「モジュール」は、オリゴペプチドに対する１個のアミノ酸の活性化、取込み、および修飾を指揮するＮＲＰＳのセグメントを意味する。
用語「ＮＲＰＳ遺伝子」は、ＮＲＰＳをコードする遺伝子を意味する。
【００３５】
用語「二次代謝産物」は、遺伝子群により特定される遺伝子セットの発現により、微生物により産生される生物活性物質を意味する。
【００３６】
用語「産生宿主」は、二次代謝産物の生成が、ドナー生物に由来する遺伝子群により指揮されるている微生物である。
【００３７】
用語「ＥＳＡＣ」は、「エシェリキア・コリ−ストレプトマイセス人工染色体」、すなわち、エシェリキア・コリ宿主において巨大なＤＮＡインサートを有し、維持し、かつ放線菌産生宿主において導入され、維持され得る組換えベクターを示す。ＥＳＡＣの例は、ＷＯ９９／６７３７４において示されている。
【００３８】
図面の簡単な説明
図１ ノノムリア種（ＡＴＣＣ３９７２７）の染色体に由来する単離ＤＮＡセグメント
太線は、配列番号：１において記載されるセグメントを示す。該単離ＤＮＡセグメントを有するコスミドを、１１Ａ５、７Ｆ３、７Ｅ９、１Ｂ１、７Ａ２、１１Ｂ９、および７Ｃ７と命名する。
【００３９】
図２ ｄｂｖ群の遺伝子の組織化
それぞれのＯＲＦは、矢印および表１の番号で示されている。向きは、図１と同じである。目盛りの数字は、配列座標（ｋｂ）を示す。
【００４０】
発明の詳細な説明
Ａ．ノノムリア由来のｄｂｖ遺伝子
Ａ４０９２６は、ノノムリア種（ＡＴＣＣ３９７２７）により産生される、密接に関連する糖ペプチド抗生物質の複合体である。本発明は、Ａ４０９２６の生合成のための遺伝子群の核酸配列および特徴決定を提供する。Ａ４０９２６遺伝子群の物理的な組織化は、フランキングＤＮＡ配列と共に図１（ノノムリア種（ＡＴＣＣ３９７２７）のゲノム由来の９０ｋｂゲノムセグメントの物理的なマップをかかるセグメントを定義するコスミドのセットと共に示す）で報告されている。ｄｂｖ群と呼ばれる、Ａ４０９２６生合成を支配するＤＮＡセグメントの遺伝子の組織化は、図２において示され、そしてそのヌクレオチド配列は配列番号：１として報告されている。
【００４１】
群の正確な境界は、他の糖ペプチド群との比較により、そしてその遺伝子産物の機能から確立され得る。それ故、左端（図１）にｄｂｖ群が、ＨＰＧの合成に関与する酵素ＨｍｏＳ（配列番号：２）をコードするｄｂｖ ＯＲＦ１により区切られている。右端には、ｄｂｖ群が、配列番号：１のヌクレオチド７１０６５から７１１３８にまたがるｔＲＮＡ遺伝子の３’末端と類似する、ａｔｔＬ部位のレムナントにより区切られている。ｄｂｖ群は、約７１，１００塩基対にまたがり、ＯＲＦ１ないしＯＲＦ３７と呼ばれる３７個のＯＲＦを含有する。配列番号：１の連続ヌクレオチド配列（７１１３８塩基対）は、配列番号：２から３８に挙げられる３７個の推定タンパク質をコードする。ＯＲＦ１（配列番号：２）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド１１４０から４０を翻訳したものから推定される、３６６個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ２（配列番号：３）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド２３２９から１２５９を翻訳したものから推定される、３５６個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ３（配列番号：４）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド５１６１から２５５８を翻訳したものから推定される、８６７個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ４（配列番号：５）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド６２３１から５２６６を翻訳したものから推定される、３２１個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ５（配列番号：６）は、配列番号：１のヌクレオチド７１８５から８２９２を翻訳したものから推定される、３６９個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ６（配列番号：７）は、配列番号：１のヌクレオチド８３２０から８９７３を翻訳したものから推定される、２１７個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ７（配列番号：８）は、配列番号：１のヌクレオチド９０６９から９６５９を翻訳したものから推定される、１９６個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ８（配列番号：９）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド１０６６７から９７０８を翻訳したものから推定される、３１９個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ９（配列番号：１０）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド１１８９６から１０６７０を翻訳したものから推定される、４０８個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ１０（配列番号：１１）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド１３４１９から１１９５０を翻訳したものから推定される、４８９個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ１１（配列番号：１２）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド１４７４１から１３４７９を翻訳したものから推定される、４２０個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ１２（配列番号：１３）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド１６０１９から１４８２３を翻訳したものから推定される、３９８個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ１３（配列番号：１４）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド１７１６３から１６００９を翻訳したものから推定される、３８４個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ１４（配列番号：１５）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド１８３６６から１７１８５を翻訳したものから推定される、３９３個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ１５（配列番号：１６）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド１８６７１から１８４６２を翻訳したものから推定される、６９個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ１６（配列番号：１７）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド２４２５９から１８６６８を翻訳したものから推定される、１８６３個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ１７（配列番号：１８）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド３６５２９から２４２７８を翻訳したものから推定される、４０８３個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ１８（配列番号：１９）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド３９０２１から３６７６０を翻訳したものから推定される、７５３個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ１９（配列番号：２０）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド３９８５１から３９１５２を翻訳したものから推定される、２３２個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ２０（配列番号：２１）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド４１７３２から４０１２５を翻訳したものから推定される、５３５個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ２１（配列番号：２２）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド４２５８４から４１７７２を翻訳したものから推定される、２７０個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ２２（配列番号：２３）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド４４１３０から４２８６８を翻訳したものから推定される、４２０個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ２３（配列番号：２４）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド４６３５５から４４２２６を翻訳したものから推定される、７０９個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ２４（配列番号：２５）は、配列番号：１のヌクレオチド４６６３２から４８５７８を翻訳したものから推定される、６４８個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ２５（配列番号：２６）は、配列番号：１のヌクレオチド４８５７５から５４８６８を翻訳したものから推定される、２０９７個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ２６（配列番号：２７）は、配列番号：１のヌクレオチド５４８６５から５８０５６を翻訳したものから推定される、１０６３個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ２７（配列番号：２８）は、配列番号：１のヌクレオチオ５８１５２から５８９８５を翻訳したものから推定される、２７７個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ２８（配列番号：２９）は、配列番号：１のヌクレオチド５９０４６から６０６４１を翻訳したものから推定される、５３１個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ２９（配列番号：３０）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド６２４４５から６０８７４を翻訳したものから推定される、５２３個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ３０（配列番号：３１）は、配列番号：１のヌクレオチド６２８８７から６３３１２を翻訳したものから推定される、１４１個のアミノ酸配列を表す。ＯＲＦ３１（配列番号：３２）は、配列番号：１のヌクレオチド６３４６９から６４５８７を翻訳したものから推定される、３７２個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ３２（配列番号：３３）は、配列番号：１のヌクレオチド６４５９９から６５２４０を翻訳したものから推定される、２１３個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ３３（配列番号：３４）は、配列番号：１のヌクレオチド６５２３７から６６５４１を翻訳したものから推定される、４３４個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ３４（配列番号：３５）は、配列番号：１のヌクレオチド６６５３８から６７３３５を翻訳したものから推定される、２６５個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ３５（配列番号：３６）は、配列番号：１のヌクレオチド６７３３２から６８６１８を翻訳したものから推定される、４２８個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ３６（配列番号：３７）は、配列番号：１の相補鎖のヌクレオチド６９４２３から６８６８５を翻訳したものから推定される、２５１個のアミノ酸を表す。ＯＲＦ３７（配列番号：３８）は、配列番号：１のヌクレオチド６９６０８から７０８９４を翻訳したものから推定される、４２８個のアミノ酸を表す。
【００４２】
ｄｂｖ群は、他の糖ペプチド群のものとは実質的に異なる、組織化を示す。５つのｂａｌ、ｃｅｐ、ｃｏｍ、ｓｔａ、およびｄｂｖ群間の比較を表１に概説する。
【表１】
【００４３】
【表２】
【００４４】
【表３】
ａ＋記号は、他の記載の糖ペプチド遺伝子群におけるオルソログの存在を示す。
ｂオルソログが他の糖ペプチド遺伝子群において存在しない場合、ＧｅｎｅＢａｎｋでのＢｌａｓｔ検索の結果を報告する。
ｃ他の糖ペプチド群の存在、およびＧｅｎｅＢａｎｋでのＢｌａｓｔ検索の結果の組合せに基づき推定したｄｂｖ ＯＲＦの機能。
ｄこの列は、他の糖ペプチド遺伝子群、およびそれが源を発する群由来の配列同一性のパーセンテージを報告する。
ｅ最高値を有するＧｅｎｅＢａｎｋエントリーの受託番号
ｆＢｌａｓｔ検索から得た確率の値
ｇ前の列に由来するＧｅｎｅＢａｎｋエントリーの生物および推定機能。略語は、Ｓ．，ストレプトマイセス；Ｍ．，メソリゾビウム（Mesorhizobium）；Ａ．，アミコラプトシス。
ｈＢｌａｓｔ検索により報告される保存ドメイン
＊他の糖ペプチド群に存在するが、高い同一性を有する配列がデータベース上の別の箇所に存在する。
【００４５】
実際、ＮＲＰＳの７個のモジュールをコードする遺伝子は、１２ｋｂセグメントにより分けられた、２つの不一致の翻訳領域として組織化されている（図２）。これは、ＮＲＰＳ遺伝子の７個のモジュールが、コンパクトな領域に存在し、全て同じ向きに翻訳される、ｂａｌ、ｃｅｐ、ｃｏｍ、およびｓｔａ群の組織化とは対照的である。さらに、ｂａｌ、ｃｅｐ、ｃｏｍ、およびｓｔａ群において、１個のＯＲＦ以外の全ＯＲＦが、同じ向きに翻訳される一方、３７個のｄｂｖ ＯＲＦのうち２２個のみが、ある向きに翻訳され、残る１５個は、反対向きに翻訳される。このことは、ｄｂｖ群の翻訳上の複雑さを示している。
【００４６】
ｄｂｖ群はまた、ｂａｌ、ｃｅｐ、ｃｏｍ、およびｓｔａ群において相同性が見られないいくつかのＯＲＦの存在により、特徴付けられる。これらは、ｄｂｖ ＯＲＦ３、６ないし８、１８ないし２０、２２、２３、２９、３０、および３６（配列番号：４、７ないし９、１９ないし２１、２３、２４、３０、３１、および３７）を含む。５つのｂａｌ、ｃｅｐ、ｃｏｍ、ｓｔａ、およびｄｂｖ群間の比較は、表１に概説されている。要するに、本明細書に記載のｄｂｖ群の遺伝子の組織化は、他の糖ペプチドの合成に関与する他の群のものと実質的に異なる。それゆえこれは、かかかる遺伝子の組織化を有する群の第１の例を表している。
【００４７】
Ｂ．ｄｖ遺伝子の役割
本発明は、特に、Ａ４０９２６のヘプタペプチド前駆体の合成に関与するＮＲＰＳをコードするＤＮＡ配列を開示する。ｄｂｖ ＮＲＰＳは４つのポリペプチドからなり、それぞれが１から３個のモジュールを含有している。これらは、ｄｂｖ ＯＲＦ１６、ＯＲＦ１７、ＯＲＦ２５、そしてＯＲＦ２６（配列番号：１７、１８、２６、そして２７）と呼ばれている。ＮＲＰＳによるペプチド合成は、モジュラーシステムにより行われ、ここで、ローディングモジュールが、一連の伸長モジュールに続いている。ＮＲＰＳにおいて、それぞれの伸長モジュールは、少なくとも３個のドメイン：基質認識および活性化に関与する、アデニル化（Ａ）ドメイン；チオエステルアミノ酸および伸長ペプチドとして共有結合する、チオール化（Ｔ）ドメイン；およびペプチド結合形成を触媒する、縮合（Ｃ）ドメインの存在により特徴付けられる。最後のモジュールは、これらのコアドメインに加え、完成したペプチドのＮＲＰＳとのエステル結合を加水分解する、チオエステラーゼ（Ｔｅ）ドメインを含有する。いくつかのモジュールは、Ｄ型にエピマー化（Ｅ）ドメインの作用により、Ｌ−アミノ酸を転換する。ｄｂｖ ＮＲＰＳは、７個のモジュール、計７個のＡドメイン、７個のＴドメイン、６個のＣドメイン、３個のＥドメイン、および１個のＴｅドメインからなる。特に、ｄｂｖ ＯＲＦ２６（配列番号：２７）は、ＮＲＰＳモジュール１および２をコードし、ドメインＡ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｅ−Ｔの配列を特定し、Ａ４０９２６のヘプタペプチドコアでのＨＰＧおよびＴｙｒ残基（最初の２つのアミノ酸）の取込みに必要とされ；ｄｂｖ ＯＲＦ２５（配列番号：２６）は、ＮＲＰＳモジュール３をコードし、ドメインＣ−Ａ−Ｔの配列を特定し、ＤＰＧ残基の取込みに関与し；ｄｂｖ ＯＲＦ１７（配列番号：１８）は、ＮＲＰＳモジュール４ないし６をコードし、ドメインＣ−Ａ−Ｅ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｅ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｔの配列を特定し、Ａ４０９２６ヘプタペプチドコアでの２個のＨＰＧおよびＴｙｒ残基の取込みに関与し；そしてｄｂｖ ＯＲＦ１６（配列番号：１７）は、ＮＲＰＳモジュール７をコードし、ドメインＣ−Ａ−Ｔ−Ｃ＊−Ｔ−Ｔｅ（Ｃ＊は、機能未知の非典型的な凝結を示す）の配列を特定し、最後のＤＰＧ残基の取込み、およびＡ４０９２６のヘプタペプチド前駆体の放出に必要とされる。
【００４８】
ｄｂｖ群に存在する他の遺伝子は、Ａ４０９２６の産生の増加、または新規代謝産物の合成に有用な新規遺伝因子を表す。これらの中で、ｄｂｖ ＯＲＦ９（配列番号：１０）は、Ｎ−アシル−グルコサミン残基をヘプタペプチド（式Ｉ）の位置４のＨＰＧ残基のフェノール性ヒドロキシルと結合させる糖転移酵素をコードする。この遺伝子は、クローニングされ、Ｎ−アシル−グルコサミン残基を他の糖ペプチドアグリコンに結合させることができる活性酵素を生じる、異種性宿主において発現させられ得る。代わりに、ｄｂｖ ＯＲＦ９は、産生株において不活性化され、Ａ４０９２６アグリコンが生成される。このアグリコンは、化学的手段（Malabarba and Ciabatti 2001）により得られるが、化学反応の介入を必要とすることなく、単一の発酵過程によりこれを産生することが望まれ得る。
【００４９】
本発明の他のなお好ましい核酸分子は、Ａ４０９２６のアミノ酸３およびアミノ酸６での塩素（chorine）原子の付加に関与するハロゲナーゼをコードするｄｂｖ ＯＲＦ１０（配列番号：１１）を含む。ｄｂｖ ＯＲＦ１０は、ｃｅｐ、ｃｏｍ、ｓｔａ、およびｂａｌ群に存在するハロゲン化酵素遺伝子と異なる、新規遺伝因子を表す。事実、Ａ４０９２６の塩素化パターンは、これらの糖ペプチドの中でもむしろ独特である。この遺伝子はクローニングされ、糖ペプチドの芳香族残基３および６を塩素化することができる活性酵素を生じるように、異種性宿主において発現され得る。
【００５０】
本発明の他のなお好ましい核酸分子は、アミノ酸４でのグルコサミン残基の脂肪酸によるＮ−アシル化に関与する、アシルトランスフェラーゼをコードするｄｂｖ ＯＲＦ２３（配列番号：２４）を含む。ｄｂｖ ＯＲＦ２３は、ｃｅｐ、ｃｏｍ、ｓｔａ、およびｂａｌ群の存在しない、新規遺伝因子を表す。この遺伝子はクローニングされ、異なる糖ペプチドの糖部分をＮ−アシル化することができる活性酵素を生じるように、異種性宿主において発現され得る。
【００５１】
本発明の他のなお好ましい核酸分子は、Ａ４０９２６のアミノ酸４に結合したＤ−グルコサミンのアミノグルクロン酸に対する酸化に関与する、ヘキソースオキシダーゼをコードするｄｂｖ ＯＲＦ２９（配列番号：３０）を含む。ｄｂｖ ＯＲＦ２９は、ｃｅｐ、ｃｏｍ、ｓｔａ、およびｂａｌ群の存在しない、新規遺伝因子を表す。この遺伝子はクローニングされ、糖ペプチドに結合したＤ−グルコサミン残基を酸化することができる活性酵素を生じるように、異種性宿主において発現され得る。
【００５２】
本発明の他のなお好ましい核酸分子は、ＮＲＰＳ由来の異常な中間体ペプチドの加水分解に関与する、チオエステラーゼをコードするｄｂｖ ＯＲＦ３６（配列番号：３７）を含む。ＮＲＰＳとは異なるポリペプチドとして存在する他のチオエステラーゼ（Kotowska et al. 2002）と同様に、ｄｂｖ ＯＲＦ３６産物は、さらにヘプタペプチドに処理されることのないＮＲＰＳの全チオエステルを加水分解することにより、Ａ４０９２６の生合成に有効なＮＲＰＳの維持に関与する。従って、これは、ｃｅｐ、ｓｔａ、ｃｏｍ、およびｂａｌ群にはない、新規遺伝因子を表している。この遺伝子はクローニングされ、生成産物の収率を増加させるために別の糖ペプチド産生株において発現され得る。宿主株は、アクチノマイセス目、ストレプトスポランギアセア（Streptosporangiaceae）科、ミクロモノスポラセア（Micromonosporaceae）科、シュードノカルディアセア（Pseudonocardiaceae）科、およびストレプトマイセス（Streptomycetaceae）科、ノノムリア属、アクチノプラネス属、アミコラプトシス属、ストレプトマイセス属などに属する株を含むが、これらに限らない。
【００５３】
本発明の他のなお好ましい核酸分子は、マンノシル残基をアミノ酸７と結合させるのに関与する、マンノシルトランスフェラーゼをコードするｄｂｖ ＯＲＦ２０（配列番号：２１）を含む。従って、これは、ｃｅｐ、ｓｔａ、ｃｏｍ、およびｂａｌ群には存在しない、新規遺伝因子を表している。この遺伝子はクローニングされ、アミノ酸７と結合しているマンノシル残基を有する糖ペプチドを生じるために別の糖ペプチド産生株において発現され得る。代わりに、ｄｂｖ ＯＲＦ２０は、産生株において不活性化され、脱マンノシル−Ａ４０９２６が生成される。この化合物を、他の手段（Lancini and Cavalleri 1997）によって得ることができるが、単一の発酵過程によりこれを産生することが望まれ得る。
【００５４】
ｄｂｖ群はまた、非タンパク新生アミノ酸ＨＰＧおよびＤＰＧの合成に関与する、多数の遺伝子を含む。前者の合成のために、ｄｂｖ ＯＲＦ１、２、５、および３７（配列番号：２、３、６、および３８）産生が必要とされる。ＤＰＧの合成は、ＯＲＦ３７（配列番号：３８）に加えて、ｄｂｖ ＯＲＦ３１から３４（配列番号：３２から３５）の関与を必要とする。これらの役割は、表１に概説されている。ＨＰＧおよびＤＰＧは、非タンパク新生アミノ酸であるため、ＮＲＰＳによるヘプタペプチドの合成は、その有効性に依存する。結果として、これらの酵素の活性は、糖ペプチド生合成における律速段階となる。従って、糖ペプチドの収率の増加は、これらのＯＲＦの発現を増加させることにより得られ得る。これらの遺伝子は、個々、またはこれらの任意の組合せでＡ４０９２６の収率を増加させるためにＡ４０９２６産生株において過剰発現され得る。
【００５５】
ｄｂｖ群はまた、糖ペプチド中間体または完成産物の細胞質外への輸送、および産生細胞への抵抗性の付与に関与する、多数の遺伝子を含む。これらの遺伝子は、ｄｂｖ ＯＲＦ７、１８から１９、２４、および３５（配列番号：８、１９から２０、２５、および３６）を含む。ｄｂｖ ＯＲＦ７は、生成中のペプチドグリカンから末端のＤ−アラニン部分を除去するのに関与するカルボキシペプチダーゼをコードする。これは、ｃｅｐ、ｃｏｍ、ｓｔａ、およびｂａｌ群には存在しない、新規遺伝因子を表す。ｄｂｖ ＯＲＦ１８から１９、および２４は、Ａ４０９２６またはその中間体のＡＴＰ依存性排出に関与する、ＡＢＣ型トランスポーター（van Veen and Konings 1998）をコードする。ｄｂｖ ＯＲＦ３５は、タンパク質勾配に逆らったＡ４０９２６またはその中間体の輸送に関与する、Ｎａ／Ｋイオン−アンチポーターをコードする。これらの遺伝子はクローニングされ、個別にまたはそれらとの任意の組合せで、生成産物の収率を増加させるために別の糖ペプチド産生株において発現され得る。宿主株は、アクチノマイセス目、ストレプトスポランギアセア科、ミクロモノスポラセア科、シュードノカルディアセア科、およびストレプトマイセス科、ノノムリア属、アクチノプラネス属、アミコラトプシス属、ストレプトマイセス属などに属する株を含むが、これらに限らない。代わりに、これらの遺伝子は、個別にまたはこれらとの任意の組合せでＡ４０９２６の収率を増加させるためにＡ４０９２６産生株において過剰発現され得る。
【００５６】
ｄｂｖ群はまた、Ａ４０９２６産生中に生合成および抵抗性遺伝子の発現を直接的または間接的に活性化するのに関与する、多数の調節遺伝子を含む。これらの遺伝子は、ｄｂｖ ＯＲＦ３、４、６、および２２（配列番号：４、５、７、および２３）を含む。ｄｂｖ ＯＲＦ３は、ストレプトマイセス・ヒグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）由来の遺伝子群に存在するポジティブレギュレーターであるＨｙｇＲ（Ruan et al. 1997）と密接に関連する。これは、ｃｅｐ、ｃｏｍ、ｂａｌ、およびｓｔａ群には存在しない、新規遺伝因子を表している。ｄｂｖ ＯＲＦ４は、他の糖ペプチド群に存在する同様のレギュレーターと密接に関連する。ｄｂｖ ＯＲＦ６および２２は、一体となって、２つの成分のシグナル伝達系をコードする。これら４つの遺伝子はクローニングされ、個別にまたはこれらとの任意の組合せで、生成産物の収率を増加させるために別の糖ペプチド産生株において発現され得る。宿主株は、アクチノマイセス目、ストレプトスポランギアセア科、ミクロモノスポラセア科、シュードノカルディアセア科、およびストレプトマイセス科、ノノムリア属、アクチノプラネス属、アミコラトプシス属、ストレプトマイセス属などを含むが、これらに限らない。代わりに、これらの遺伝子は、個別にまたはこれらとの任意の組合せで、Ａ４０９２６の収率を増加させるためにＡ４０９２６産生株において過剰発現され得る。
【００５７】
Ｃ．ｄｂｖ群の使用
本発明はまた、完全なＡ４０９２６分子、その前駆体のいずれか、またはその誘導体の発現のための核酸を提供する。かかる核酸は、Ａ４０９２６のアセンブリを指揮するのに十分なポリペプチドをコードするＯＲＦを含む、単離遺伝子群を含む。１例として、完全なｄｂｖ群（配列番号：１）は、適当なベクターに導入され、これを用いて、所望の産生宿主が形質導入される。１つの態様において、このＤＮＡセグメントは、長いＤＮＡセグメントを有することができる適当なベクターに導入される。かかるベクターの例は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクターまたはＥＳＡＣベクターの様な特定の誘導体を含むが、これらに限らない（Shizuya et al. 1992; Ioannou et al. 1994; Sosio et al. 2000b）。別の態様において、ｄｂｖ群は、２つの別々のセグメントとして２つの異なるベクターにクローニングされ、所望の産生宿主において適合可能になる。なお別の態様において、ｄｂｖ群は、３つのセグメントに再分割され、それぞれが、別々の適合ベクターにクローニングされる。１、２、または３つのベクターシステムの使用例が、文献（例えば、Xue et al. 1999）に記載されている。
【００５８】
ｄｂｖ群が、１つまたはそれ以上のベクターに適当にクローニングされると、それは、多数の適当な産生宿主に導入され、ここで、糖ペプチド抗生物質の産生が、天然の宿主においてより非常に効率的に生じ得る。好ましい宿主細胞は、放線菌遺伝子を効果的に発現できる種または株のものである。かかる宿主は、アクチノマイセス、ストレプトスポランギアセア、ミクロモノスポラセア、シュードノカルディアセア、およびストレプトマイセス、ノノムリア、アクチノプラネス、アミコラトプシス、およびストレプトマイセスなどを含むが、これらに限らない。代わりに、１つまたはそれ以上の適当なベクターにクローニングされたｄｂｖ群の第２コピーが、Ａ４０９２６産生株に導入され、ここで、ｄｂｖ遺伝子の第２コピーがＡ４０９２６の収率を増加させる。
【００５９】
十分に特徴付けられた宿主細胞に産生能力を受け渡すことは、冒頭の最適化および開発の過程のいくつかの部分：産生株での天然産物のタイターが、より有効に増加され得ること；天然産物の精製が、活性と干渉する可能性のある既知のバックグランドで行われ得ること；複合体の組成が、より有効に調節され得ること；天然産物の変化した誘導体が、発酵条件の操作により、あるいは経路工学により、より有効に産生され得ることを実質的に改善できる。
【００６０】
代わりに、生合成遺伝子群は、修飾され、宿主細胞に挿入され、多種多様な代謝産物を合成または化学的に修飾するために用いられ得る（例えば、オープンリィーディングフレームが、再配列され、修飾され、そして他の糖ペプチド合成遺伝子群と組み合わされ得る）。
【００６１】
本明細書において提供される情報を用いて、Ａ４０９２６核酸のクローニングおよび発現は、日常的およびよく知られた方法を用いて行われ得る。
【００６２】
別の可能性のある使用において、ｄｂｖ遺伝子群由来の選択されたＯＲＦは、日常的な分子生物学的技術を用いて、単離され、不活性化される。ノノムリア種（ＡＴＣＣ３９７２７）染色体において該ＯＲＦとフランクするＤＮＡセグメントを含有する適当なベクターにクローニングされた変異型ＯＲＦは、該ノノムリア株に導入され、２度の二重交差混合現象である相同組換えにより、産生株での該ＯＲＦの不活性化を生じる。この産生株は、有効な方法でのＡ４０９２６の前駆体または誘導体の産生に有用である。
【００６３】
別の可能性のある使用において、ｄｂｖ遺伝子群由来の選択されたＯＲＦが単離され、所望のプロモーターの調節下に置かれる。適当なベクターにクローニングされた、操作されたＯＲＦは、次に、上記オリジナルのＯＲＦを置き換えることにより、または該ＯＲＦのさらなるコピーとして、ノノムリア種（ＡＴＣＣ３９７２７）に導入される。この産生株は、Ａ４０９２６分子、その前駆体または誘導体の産生の決定因子であるＯＲＦの発現レベルを増加あるいは減少させるのに有用である。
【００６４】
実施例
以下の実施例は、Ａ４０９２６遺伝子群が同定された原理および方法論、および全ｄｂｖ遺伝子が同定され、分析された原理および方法論を説明するものである。これらの実施例は、本発明の原理および方法論を説明するものであって、その範囲を制限することを意味するものではない。
【００６５】
一般的方法
特に示さない限り、細菌株およびクローニングベクターは全て、公的なコレクションまたは商業用供給源から得ることができる。分子生物学の標準的方法を用いている（例えば、Sambrook et al. 1989；Kieser et al. 2000）。ノノムリアをＨＴアガー（Kieser et al. 2000）、およびＲａｒｅ３培地（１０ｇ／ｌ グルコース、４ｇ／ｌ 酵母エキス、１０ｇ／ｌ 麦芽エキス、２ｇ／ｌ ペプトン、２ｇ／ｌ ＭｇＣｌ２、０．５％ グリセロール）にて増殖させた。糖ペプチドを公開された方法（Lancini and Cavalleri, 1997）に従い単離する。配列分析を、Wisconsinパッケージ（バージョン９．１）(Accelrys)のプログラムを用いて行う。データベース検索を、公開サイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/index.htmlおよびhttp://www.ebi.ac.uk/fasta33）のＢｌａｓｔまたはＦａｓｔａプログラムにより行う。
【００６６】
実施例１−Ａ４０９２６生合成遺伝子の単離
ゲノムライブラリーを、コスミドベクターＳｕｐｅｒｃｏｓ（Stratagene, La Jolla, CA 92037）においてノノムリア（ＡＴＣＣ３９７２７）由来のＤＮＡにより作成する。ノノムリア（ＡＴＣＣ３９７２７）由来の全ＤＮＡを、フラグメントサイズを４０ｋｂの範囲に最適化するためにＳａｕ３ＡＩで部分的に切断した。部分的に切断したＤＮＡを、アルカリホスファターゼ処理し、ＢａｍＨＩであらかじめ切断したＳｕｐｅｒｃｏｓにライゲーションした。ライゲーション混合物を、インビトロでパッケージングし、これを用いて、エシェリキア・コリＸＬ１Ｂｌｕｅ細胞にトランスフェクションした。得られたコスミドライブラリーを、アミコラトプシス・メディテッラネイＤＳＭ５９０８ゲノムＤＮＡを鋳型として用いた、ｂａｌ群由来セグメントのＰＣＲ増幅から得た２つのプローブでのハイブリダイゼーションにより、スクリーニングした。これらのプローブは、オリゴ５’−ＡＴＧＣＧＣＧＴＧＴＴＧＡＴＣＴＣＧ−３’（配列番号：３９）および５’−ＣＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＧＧＣＧＡＡＣ−３’（配列番号：４０）での増幅から得た、ｂｇｔｆＡ；およびオリゴ５’−ＣＧＴＧＧＧＧＧＴＧ ＧＡＴＧＴＡＴＣＧＡ−３’（配列番号：４１）および５’−ＴＣＡＣＣＡＴＴＧＧＡＴＣＡＧＣＧ−３’（配列番号：４２）での増幅から得た、ｄｐｇＡであった。全てのオリゴを、受託番号Ｙ１６９５２でＧｅｎＢａｎｋに蓄積された配列から設計した。さらなるハイブリダイゼーションを、オリゴヌクレオチドＰｅｐ８（Sosio et al. 2000a）により行った。これらのプローブのうち１つ以上にポジティブなコスミドを単離し、制限酵素で物理的に位置決定した。かかる実験より、図１で報告したコスミドを同定した。従って、ノノムリア種（ＡＴＣＣ３９７２７）のゲノムから同定したセグメントは、抗生物質Ａ４０９２６の合成に関与するｄｂｖ遺伝子群を含有している。
【００６７】
上記の実施例は、ｄｂｖ群を単離できる原理および方法論を説明するものである。ｄｂｖ群を種々のベクターにクローニングできることは当業者にとって当然のことであろう。しかしながら、７２ｋｂの大きさであるｄｂｖ群を与える、好ましいベクターは、λベクター、コスミドベクター、およびＢＡＣベクターの様な長いインサートを有することができるものであるということを、当業者は理解する。他のプローブを用いて、かかるライブラリーからｄｂｖ群を同定できることを、当業者は理解する。配列番号：１で報告した配列より、任意のフラグメントを、ノノムリア種（ＡＴＣＣ３９７２７）ＤＮＡからＰＣＲ増幅でき、これを用いて、かかるＤＮＡで作成したライブラリーをスクリーニングできる。該ライブラリーから１またはそれ以上のクローンを同定することができ、これは、配列番号：１でカバーされる任意のセグメントを含んでいる。さらに、ｃｅｐ、ｂａｌ、ｃｏｍ、およびｓｔａ群に由来するものの様な異種性プローブの使用により、表１で提供する情報を用いて、ｄｂｖ群を同定することも可能である。代わりに、二次代謝産物の合成を指揮する他の遺伝子群は、異種性ハイブリダイゼーションを可能にするためにｄｂｖ遺伝子と十分に関連する遺伝子を含有する。これらのバリエーションは全て、本発明の範囲にある。
【００６８】
実施例２−Ａ４０９２６遺伝子群の配列分析
実施例１で記載のように同定したｄｂｖ群を、ショットガンアプローチにより配列決定した。ｄｂｖ群の配列を配列番号：１として本明細書において提供する。得られたＤＮＡ配列を、Codonpreference［ＧＣＧ，（Genetic Computer group, Madison, WI 53711）バージョン９．１］により分析し、適当なコード配列を同定した。次に、この方法で同定したそれぞれのコード配列を、プログラムＴｆａｓｔａ（ＧＣＧ，バージョン９．１）を用いてｂａｌ、ｃｅｐ、ｃｏｍ、およびｓｔａ群との比較により分析した。これらの群のいずれにおいても一致を同定しないコード配列を、次に、プログラムＢｌａｓｔを利用してＧｅｎＢａｎｋに対して、またはＦａｓｔａを用いてＳｗｉｓｓＰｒｏｔに対して検索した。最後に、それぞれのＯＲＦの正確な開始コドンを、プログラムＰｉｌｅｕｐ（ＧＣＧ，バージョン９．１）による関連配列の複数アラインメントにより、あるいは上流のリボソーム結合部位の検索により、確立した。合計３７個のＯＲＦ（ｄｂｖ ＯＲＦ１ないしｄｂｖ ＯＲＦ３７と呼ぶ）を同定する。これらの分析の結果を表１で概説し、配列番号：２ないし配列番号：３８として配列表において本明細書で提供している。詳細は、以下に示す。
【００６９】
２Ａ．特定したアミノ酸ＨＰＧおよびＤＰＧの合成
ｄｂｖ群によりコードされる７つのタンパク質が、特定したアミノ酸ＨＰＧおよびＤＰＧの合成に関与する。すなわち、ＯＲＦ１およびＯＲＦ２（配列番号：２および３）は、Ａ４０９２６生成に必要なＨＰＧ残基の合成に関与し、これらは、それぞれｐ−ヒドロキシマンデル酸オキシダーゼ、およびｐ−ヒドロキシマンデル酸合成酵素をコードしている。これらのＯＲＦの相同体を、他の糖ペプチド群（表１）において見出し、その役割を実験で確立した（Li et al. 2001; Hubbard et al. 2000）。ＯＲＦ３１から３４（配列番号：３２から３５）は、Ａ４０９２６生成に必要なＤＰＧ残基の合成に関与している。これらのＯＲＦの相同体を、ＤＰＧ残基を含有するヘプタペプチドの合成を指揮する他の糖ペプチド（表１）において見出し、対応する遺伝子産物の関与を、実験で決定した（Pfeifer et al. 2001; Chen et al. 2001）。ＯＲＦ３７（配列番号：３８）は、それぞれ、ＨＰＧおよびＤＰＧを生じるために、ｐ−ヒドロキシフェニルグリオキシレートおよび３，５−ジヒドロキシフェニルグリオキシレートの両方のアミノ基転移に必要なアミノトランスフェラーゼをコードする。この役割を実験で確立（Pfeifer et al. 2001; Hubbard et al. 2000）し、これは、アミノドナーとして好ましくはチロシンを利用する（Hubbard et al. 2000）。この反応は、ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸塩を生成し、次に、ＯＲＦ２（配列番号：２）の遺伝子産物の作用により、ｐ−ヒドロキシマンデル酸塩に転換できる。
【００７０】
ＨＰＧおよびＤＰＧの合成に直接的に関与する他のＯＲＦも、ｄｂｖ群において見出し、ＯＲＦ５およびＯＲＦ３０（配列番号：６および３１）と命名する。ＯＲＦ５（配列番号：６）は、ＯＲＦ２（配列番号：３）産生の基質である、ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸塩の合成に関与する、プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする。それゆえ、このＯＲＦは、チロシンをＨＰＧに転換するサイクルを刺激する酵素をコードする。それゆえ、このＯＲＦの発現レベルは、Ａ４０９２６生成のためＨＰＧの十分なレベルを提供するのに重要である。ＯＲＦ３０（配列番号：３１）は、ストレプトマイセス・コエリカラー由来のＮＰ＿６２６９１１．１により表される最も一致する細菌ゲノム配列から同定した機能未知の推定ポリペプチドと非常に類似するポリペプチド（表１）をコードする。しかしながら、これらのタンパク質は全て、４−ヒドロキシベンゾイル−ＣｏＡチオエステラーゼ（Benning et al. 1998）の典型的な転換ドメインを表す。従って、ＯＲＦ３０（配列番号：３１）産物は、この小ポリケチドの合成中にＤＰＧまたはその前駆体の１つの放出を促進するようである。ＯＲＦ３０（配列番号：３１）は、ｄｂｖ群（表１）に固有である。
【００７１】
２Ｂ．Ａ４０９２６のヘプタペプチド前駆体の合成
ＯＲＦ１６、１７、２５、および２６（配列番号：１７、１８、２６、および２７）によりコードされる４つのタンパク質は、Ａ４０９２６のヘプタペプチドコアの合成に関与する。これらの全てが、他のＮＲＰＳとの有意な類似性を示す。他のＮＲＰＳ系でのアラインメントに基づき、これら４個のＯＲＦによりコードされるタンパク質の推定ドメイン組成および特異性を表２において報告する。
【００７２】
表２．ｄｂｖ ＮＲＰＳのドメイン組成および役割
【表４】
【００７３】
ｄｂｖ ＮＲＰＳ遺伝子の特定の役割の指定を、ｄｂｖ群でのその遺伝子座により推定することはできない。事実、報告した糖ペプチド群全てについて、現在までに、モジュールの遺伝指令と、対応するアミノ酸をポリペプチドに取り込んだ指令との共直線性は存在するが、そのＮＲＰＳ遺伝子を別々に翻訳するので、これはｄｂｖ群（図２）の場合ではない。しかしながら、その役割および特異性を、次の知見：
ｉ）ＯＲＦ１６（配列番号：１７）により特定されるタンパク質のドメイン組成、およびそれがチオエステラーゼドメインで終結するという事実が、ＤＰＧ残基およびヘプタペプチドの最後のペプチド結合の形成の認識、次に、酵素結合チオエステルの分解（表２）における役割と最も一致すること；
ｉｉ）ＯＲＦ１７（配列番号：１８）のモジュール組織化およびドメイン組成は、ヘプタペプチドのアミノ酸４から６の認識、そしてその取込みに必要とされるモジュール４から６を含有するポリペプチドと最も一致すること（これは、他の糖ペプチドＮＲＰＳ系（van Wageningen et al 1998; Pelzer et al. 1999; Chiu et al. 2001; Pootoolal et al. 2002）で見られる）；
ｉｉｉ）ＯＲＦ２５（配列番号：２６）産物のドメイン認識は、このＯＲＦが２つのモジュールだがたった１つのＣドメインをコードする（表２）ので、ヘプタペプチド合成の開始、および第１のペプチド結合形成の触媒でのその役割と一致すること；
ｉｖ）ＯＲＦ２６（配列番号：２７）のドメインの組織化は、このモジュールがＥドメイン（モジュール２、４、および５の役割により必要とされる）を含有せず、かつそれぞれＣドメインおよびＴｅドメインの存在または不存在（表２）が、このＯＲＦがそれぞれモジュール１および７をコードすることを除外するので、ヘプタペプチドの第３のアミノ酸の認識および取込みに関与するモジュール３を含有するこのポリペプチドと一致すること、
に基づき推定できる。
【００７４】
Ａ４０９２６のヘプタペプチド前駆体の合成に直接関与する他のＯＲＦも、ｄｂｖ群で見られ、ＯＲＦ１５およびＯＲＦ３６（配列番号：１６および３７）と命名する。ＯＲＦ１５（配列番号：１６）は、機能未知の短いペプチドをコードする。この遺伝子産物の相同体を、ＮＲＰＳ系をコードする多くの群で見られる。ＯＲＦ３６（配列番号：３７）は、ＮＲＰＳまたはポリケチド合成酵素遺伝子を含有する他の群によりしばしばコードされるタンパク質である、ＩＩ型チオエステラーゼをコードする。これらのチオエステラーゼの推定の役割は、ＮＲＰＳ系およびＰＫＳ系が、酵素と共有結合した異常な中間体を取り除くことにより作動することで有効性を増強することである（Heathcote et al. 2001）。このタンパク質のオルソログを、他の既知の糖ペプチド群はコードしない（表１）。
【００７５】
２Ｃ．ヘプタペプチドでの芳香族残基の架橋結合
ＯＲＦ１１ないし１４（配列番号：１２ないし１５）によりコードされる４つのタンパク質は、Ａ４０９２６ヘプタペプチド前駆体の芳香族残基と共に結合する、架橋結合反応に関与する。これらの４つのタンパク質は、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼとの有意な相同性を示す（表１）。他の糖ペプチド群で見られるＰ４５０モノオキシゲナーゼとの同一性のレベル、およびｂａｌ群に存在する遺伝子によりコードされるＰ４５０モノオキシゲナーゼの推定される役割（Bischoff et al. 2001）に基づき、次の予測をすることができる。すなわち、ＯＲＦ１４（配列番号：１５）産物は、アミノ酸２および４の芳香族残基の架橋結合に関与するようであり；ＯＲＦ１２（配列番号：１３）産物は、アミノ酸４および６の芳香族残基の架橋結合に関与するようであり；そしてＯＲＦ１１（配列番号：１２）産物は、アミノ酸５および７の芳香族残基の架橋結合に関与するようである。ＯＲＦ１３（配列番号：１４）のオルソログは、ｂａｌ、ｃｅｐ、およびｃｏｍ群には存在しないが、ｓｔａ群では見られる（表１）。Ａ４０９２６様のＡ４７９３４構造は、アミノ酸１および３の芳香族残基間にさらなる架橋結合を含有するので、ＯＲＦ１３（配列番号：１４）産物は、この架橋結合反応に関与するようである。
【００７６】
２Ｄ．芳香族残基のβ−ヒトドロキシチロシンの生成および塩素化
ＯＲＦ１０およびＯＲＦ２８（配列番号：１１および２９）によりコードされる２つのタンパク質は、ヘプタペプチドにおいてアミノ酸６として存在するチロシン残基へのβ−ヒドロキシ基の付加、およびアミノ酸２および６の芳香族残基の塩素化に関与する。他の糖ペプチド群において見られるハロゲン化酵素をコードする遺伝子との同一性のレベル、およびｂａｌ群に存在するハロゲン化酵素遺伝子の予測される役割（Puk et al. 2002）に基づき、ＯＲＦ１０（配列番号：１１）産物は、アミノ酸３および６の芳香族残基への塩素原子の導入に関与するようである。ＯＲＦ２８（配列番号：２９）産物は、非ヘム鉄ジオキシゲナーゼの典型的なモチーフを含有するタンパク質ファミリーと非常に関連する。かかるタンパク質の１つは、ｓｔａ群から推定され（Pootoolal et al. 2002）、チロシンのβ−ヒドロキシル化に関与すると示唆される。このヒドロキシ化反応の正確なタイミングは、現在分かっていない。それは、ヘプタペプチドへのアミノ酸６の取込み（これは、バンヒマイシンの合成において起こる）前に生じ得る（Bischoff et al. 2001）；それは、ヘプタペプチド合成中、あるいはヘプタペプチド骨格の完成後生じ得る。
【００７７】
２Ｅ．糖の付加および修飾、およびＮ−メチル化
ＯＲＦ９、２０、２３、２７、および２９（配列番号：１０、２１、２４、１８、および３０）によりコードされる５つのタンパク質は、Ａ４０９２６合成の後期段階のいくつかに関与する。これらの推定される役割は次のとおりである。ＯＲＦ９（配列番号：１０）は、他の糖ペプチド群によりコードされるタンパク質と非常に関連し、これは、位置４に存在するアミノ酸残基の芳香環のｐ−ヒドロキシル基への糖の結合に関与する（Solenberg et al. 1997）。特に、ＯＲＦ９（配列番号：１０）は、Ａ４０９２６アグリコンへのＮ−アシル−グルコサミン残基の結合に関与する糖転移酵素をコードする。かかる特異性を有する他の糖転移酵素のうち、記載の他の糖ペプチド群によりコードされるものはない。
【００７８】
ＯＲＦ２０（配列番号：２１）の相同体は、他の記載の糖ペプチド群においては見られない。このタンパク質は、タンパク質マンノシルトランスフェラーゼファミリーの典型的なモチーフを含有している（表１）。さらに、このＯＲＦの相同体を、ストレプトマイセス・コエリカラーのゲノム（表１）、ならびに抗生物質ラモプラニン（ramoplanin）（ＷＯ０２３１１５５）の合成を特定するアクチノプラネス亜種群において同定した。ラモプラニンは、ペプチドコアと結合したマンノシル残基を含有するので、これらのデータは全て、アミノ酸７のヒドロキシル基とのマンノシル残基の結合におけるＯＲＦ２０（配列番号：２１）の役割を指摘するものである。この推定の役割を以下の実施例４においても示す。
【００７９】
ＯＲＦ２３（配列番号：２４）の相同体は、記載の糖ペプチド群において見られない。このタンパク質は、アシルトランスフェラーゼファミリー３の典型的なモチーフを含有する（表１）。Ａ４０９２６は、アミノ糖残基のＮＨ２基と結合したアシル残基を含有するので、このＯＲＦ産物は、Ａ４０９２６前駆体のアシル化に直接的または間接的に関与するようであり、Ａ４０９２６複合体を特徴付ける化合物ファミリーを生じる。
【００８０】
ＯＲＦ２７（配列番号：２８）の相同体は、ｂａｌ、およびｃｅｐ群において見られる（表１）。ｃｅｐ群由来のＯＲＦ２７の相同体は、クロロエレモマイシンの中間体の末端のロイシン残基のＮ−メチル化に関与することを示した。ＨＰＧ残基は、Ａ４０９２６のＮ−末端に存在する。結論として、ＯＲＦ２７（配列番号：２８）産物は、糖ペプチド前駆体でのＨＰＧ残基のＮ−メチル化を触媒するようであり、従って、他の記載のメチルトランスフェラーゼとは異なる特異性が付与される。
【００８１】
ＯＲＦ２９（配列番号：３０）の相同体は、他の記載の糖ペプチド群において見られない（表１）。このタンパク質は、ＦＡＤ結合の典型的なモチーフを含有し、ヘキソースオキシダーゼとかなりの一致を示す（表１）。Ａ４０９２６は、アミノ酸４と結合したグルクロンアミン残基を含有するので、ＯＲＦ２９（配列番号：３０）によりコードされるタンパク質は、グルコサミン残基の酸化に関与するようである。このタンパク質はまた、細胞質から分泌されたタンパク質の典型的な推定シグナルペプチド配列を含有するので、酸化は、糖ペプチドコアと結合したグルコサミン残基を基質として用いて、細胞質外で生じるようである。
【００８２】
２Ｆ．輸送および抵抗性
ＯＲＦ７、１８、１９、２４、および３５（配列番号：８、１９、２０、２５、および３６）によりコードされる５つのタンパク質は、Ａ４０９２６、またはその前駆体のいくつかの細胞質外への輸送、および産生株への抵抗性の付与に関与する。その推定される役割は次のとおりである。
【００８３】
ＯＲＦ７（配列番号：８）の相同体は、他の記載糖ペプチド群において見られない。このタンパク質は、カルボキシペプチダーゼのＶａｎＹファミリーの典型的なモチーフを含有する（表１）。このファミリーは、いくつかのバンコマイシン耐性腸球菌でよく研究されている。これは、発生期のペプチドグリカンのペンタペプチドのいくつかから末端のアラニル残基を除去するのに関与し、従って、その分子標的と結合する糖ペプチドの範囲を減少される（Evers et al. 1996）。それゆえ、ＯＲＦ７（配列番号：８）は、産生株ノノムリア種（ＡＴＣＣ３８７２７）においてＡ４０９２６にあるレベルの抵抗性を付与するのに関与するようである。
【００８４】
ＯＲＦ２４およびＯＲＦ３５（配列番号：２５および３６）の相同体は、他の糖ペプチド群に存在する（表１）。これらは、それぞれＡＢＣ型膜貫通型輸送体およびイオン依存性膜貫通型輸送体をコードすると予測される。従って、これらは、Ａ４０９２６またはその前駆体のいくつかの輸送または区画化に関与するようである。ＯＲＦ１８およびＯＲＦ１９（配列番号：１９および２０）の相同体は、他の記載の糖ペプチド群において見られない（表１）。これらは、さらなるＡＢＣ型輸送体をコードすると推定され、このうちＯＲＦ１８（配列番号：１９）のみが、膜貫通型タンパク質であると推定される。従って、これらは、Ａ４０９２６またはその前駆体のいくつかの輸送または区画化に関与するようである。
【００８５】
２Ｇ．調節
ＯＲＦ３、４、および２２（配列番号：４、５、７、および２３）によりコードされる４つのタンパク質は、１またはそれ以上のｄｂｖ遺伝子の発現の調節に関与する。ＯＲＦ３（配列番号：４）の相同体は、他の記載の糖ペプチド群において見られない。このタンパク質は、ＬｕｘＲファミリーのポジティブレギュレーターの典型的なモチーフを含有し、ストレプトマイセス・ヒグロスコピカス由来のＰＫＳ群において見られる１つのポジティブレギュレーターと最も関連する（Ruan et al. 1997）。ＯＲＦ４（配列番号：５）の相同体は、他の糖ペプチド群において存在（表１）し、ポジティブ転写レギュレーターのＬｙｓＲ型ファミリーに属する。それゆえ、ＯＲＦ３および４（配列番号：４および５）は、１またはそれ以上のｄｂｖ遺伝子の発現に必要とされるようである。ＯＲＦ６およびＯＲＦ２２（配列番号：７および２３）は、細菌の２成分のシグナル伝達系の２つのメンバーをコードする。前者のタンパク質は、ストレプトマイセス・コエリカラーＣｕｔＲタンパク質で見出された最も一致する応答レギュレーターであるようである（表１）。後者のタンパク質は、ストレプトマイセス・ヒグロスコピカス由来の推定センサータンパク質キナーゼと最も関連する膜貫通型ヒスチジンキナーゼであるようである（表１）。それゆえ、ＯＲＦ６および２２（配列番号：２３）は、ｄｂｖ群での１またはそれ以上の遺伝子の発現の引き金となるシグナルの検出に関与するようである。
【００８６】
実施例３−ＥＳＡＣベクターにおけるｄｂｖ群の単離
実施例２で提供の情報を用いて、ｄｂｖ群を、次の様にＥＳＡＣベクターにおいて単離した。ゲノムライブラリーを、ｐＰＡＣ−Ｓ１ベクター（Sosio et al. 2000b）においてノノムリア（ＡＴＣＣ３９７２７）由来ＤＮＡにより作成した。ノノムリア（ＡＴＣＣ３９７２７）由来ＤＮＡを、アガロースプラグ（Sosio et al. 2000b；ＷＯ９９／６７３７４記載）に埋め込んで調製し、１００〜２００ｋｂの範囲にフラグメントサイズを最適化するためにＳａｕ３ＡＩで部分的に切断した。生じたＤＮＡフラグメントを、ＰＦＧＥゲルにて簡単に泳動し、アガロースゲルから回収し、遊離させた（Sosio et al. 2000b；ＷＯ９９／６７３７４に記載）。ベクター調製、ライゲーション、およびエシェリキア・コリＤＨ１０Ｂコンピテント細胞のエレクトロポレーションを含む次の工程を、記載（Sosio et al. 2000b；ＷＯ９９／６７３７４）のように行った。得られたコロニーをナイロンフィルターに移して分析し、ノノムリア（ＡＴＣＣ３９７２７）ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した２つのプローブでのハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。プローブＡを、オリゴ５’−ＴＣＡＧＧＡＧＡＣＧＡＡＣＣＣＣＧＣ−３’（配列番号：４３）および５’−ＧＴＧＣＡＣＧＡＡＡＧＴＣＣＣＧＴＣ−３’（配列番号：４４）を用いて；そしてプローブＢを、５’−ＡＴＧＧＡＣＴＣＣＣＡＣＧＴＴＣＴＣ−３’（配列番号：４５）および５’−ＴＣＡＧＧＧＧＡＧＡＣＡＴＧＣＧＧＴ−３’（配列番号：４６）を用いて得た。これらの配列は全て、配列番号：１に由来するものである。次に、これらのプローブ全てに対してポジティブのＥＳＡＣクローンを単離し、ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶでの切断により物理的に位置決定した。かかる実験の１つから、約８４ｋｂのインサートを含有するＥＳＡＣクローンＮｍＥＳ１を単離し、ＮｍＥＳ１は、完全なｄｂｖ群（配列番号：１）を含み、これを約５ｋｂ、配列番号：１のヌクレオチド１の５’方向、そして約８ｋｂ、配列番号：１のヌクレオチド７１１３８の３’方向に拡大する。
【００８７】
上記の実施例は、ｄｂｖ群をＥＳＡＣベクターにおいて得ることができる、原理および方法論を説明するものである。ベクターｐＰＡＣ−Ｓ１は、この目的で用い得るＥＳＡＣベクターのただ１例であることは、当業者は理解するであろう。完全なｄｂｖ遺伝子群のクローニング、および適当な放線菌宿主への移行に有用な他のベクターは、記載（Sosio et al. 2000b；ＷＯ９９／６７３７４）されている。さらに、部分的な切断、フラグメントの分離および回収、ベクター調製、ライゲーション、およびエシェリキア・コリ細胞の形質導入を含む（これらに限らない）、ノノムリア種（ＡＴＣＣ３９７２７）ＤＮＡの長いインサートライブラリーを調製する他の方法はまた、本発明の範囲にある。ｄｂｖ群の境界を配列番号：１において確立すると、上記のプローブＡおよびＢ以外の任意のプローブまたはプローブの組合せを用いて、インサートが完全なｄｂｖ群に及ぶクローンを同定するためにノノムリア種（ＡＴＣＣ３９７２７）により作成したライブラリーをスクリーニングできることを、当業者は理解するであろう。代わりに、配列番号：１および表１においてい提供した情報により、他の有用なプローブを、異種性ハイブリダイゼーションを可能とするｄｂｖ遺伝子と有意に関連する遺伝子を含有する他の遺伝子群から得ることができる。これらすべてのバリエーションが、本発明の範囲にある。
【００８８】
実施例４−遺伝子の置き換えによるＡ４０９２６の操作
実施例２において提供した情報を用いて、ＯＲＦ２０のインフレーム欠失を、次の様に行った。フラグメントＡを、オリゴ５’−ＴＴＴＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＧＣＧＡＴＣＣＧＴＣＣＧＴＣＴ−３’（配列番号：４７）および５’−ＴＴＴＴＣＴＡＧＡＧＣＣＣＧＧＡＣＡＣＣＣＧＧＧＧＧＣＴＧＡ−３’（配列番号：４８）による;そしてフラグメントＢを、オリゴ５’−ＴＴＴＴＣＴＡＧＡＡＧＴＣＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＧＣＧＡＣＡＴ−３’（配列番号：４９）および５’−ＴＴＴＴＡＡＧＣＴＴＡＴＧＴＴＧＣＡＧＧＡＣＧＣＣＧＡＣＣＧ−３’（配列番号：５０）による増幅により得た。次に、フラグメントＡをＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで、フラグメントＢをＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、両者を、あらかじめＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＳＥＴ１５２（Bierman et al. 1992）にライゲーションした。ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩエシェリキア・コリＤＨ５ａ細胞の形質導入後、得られたプラスミド（ｐＳＭ４と命名）を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでの切断後の４ｋｂおよび１．５ｋｂのフラグメントの存在により認識した。アリコートのｐＳＭ４を、エシェリキア・コリＥＴ１２５６７（ｐＵＢ３０７）（Kieser et al. 2000）細胞に移行し、ＳＭ４株を得た。次に、ＬＢで一晩培養したものからの約１０８ＣＦＵのＳＭ４細胞を、約８０時間Ｒａｒｅ３培地で増殖させた、約１０７ＣＦＵのノノムリア（ＡＴＣＣ３９７２７）と混合した。得られた混合物をＨＴプレートに広げ、次に、２８℃で約２０時間インキュベーションした。軽く水で洗浄し、過剰なエシェリキア・コリ細胞を除去した後、プレートを、ナリジクス酸 ２００ｍｇおよび１５ｍｇ／ｍｌ アプラマイシン含有ソフトアガー ３ｍｌで覆った。２８℃で３〜５週間さらにインキュベーションした後、ノノムリア外結合体を、新しいアプラマイシン含有培地に画線した。かかる外結合体（ex-conjugate）の１つ（ＳＳ１８株と命名）をさらに処理した。次に、ＳＳ１８株をアプラマイシンを含まないＨＴ培地にて何度か継代して増殖させ、適当な希釈物をアプラマイシンを含まないＨＴアガーに蒔いた。次に、個々のクローンを、オリゴ５’−ＴＴＴＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＧＣＧＡＴＣＣＧＴＣＣＧＴＣＴ−３’（配列番号：４７）および５’−ＴＴＴＴＡＡＧＣＴＴＡＴＧＴＴＧＣＡＧＧＡＣＧＣＣＧＡＣＣＧ−３’（配列番号：５０）を用いて、ＰＣＲにて分析した。ＯＲＦ２０欠失対立遺伝子を含有するコロニーを、１．５ｋｂのバンドの存在により認識した。かかるコロニーの１つ（ＳＳＭ１８と命名）をＨＴ培地にて増殖させ、脱マンノシルＡ４０９２６の生成を、信頼できるスタンダード（Malabarba and Ciabatti 2001）との比較により確認した。
【００８９】
上記の実施例は、配列番号：２から３８により特定されるもののいずれかから選択したＯＲＦを、Ａ４０９２６産生株ノノムリア種（ＡＴＣＣ３９７２７）において変異コピーにより置き換えることができる、原理および方法論を説明したものである。ＯＲＦ２０（配列番号：２１）が、配列番号：１により特定される群でのインフレームの欠失を創出する方法論の１例にすぎないことを当業者は理解するだろう。当業者はまた、インフレーム欠失は変異を創出する１つの方法であって、インフレームシフト変異を含む（これに限らない）他の方法、挿入、および部位指定変異を用いて、配列番号：２から３８により特定されるＯＲＦのいずれかにおいて無変異体を創出できることを理解する。当業者はまた、配列番号：１により特定されるＯＲＦのいずれかにおいて変異を創出する確立された方法があるので、これらと同じ方法論を適用して、これらと同じＯＲＦの発現レベルを変化させることができることを理解する。このことがいかにして成され得るかの例は、ノノムリア種（ＡＴＣＣ３９７２７）ゲノムの任意の位置への複数コピーの該ＯＲＦの組み込み、該ＯＲＦの発現を調節するプロモーターにおける変化、アンチセンスＲＮＡまたはその発現に干渉する転写ターミネーターの除去を含むが、これらに限らない。
【００９０】
最後に、ノノムリア種（ＡＴＣＣ３９７２７）に変異型対立遺伝子を導入するのに有用なベクター、宿主およびレシピエント株の接合および培養条件、外結合体およびその誘導体の選択方法およびスクリーニング方法におけるバリエーションは全て、本発明の範囲にある。
【００９１】
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【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）Ａ４０９２６（配列番号：１）の合成に必要なポリペプチドをコードするｄｂｖ遺伝子群；
ｂ）ｄｂｖ遺伝子群のヌクレオチド配列以外であって、ｄｂｖ遺伝子群（配列番号：１）によりコードされるのと同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号：２から３８のポリペプチドをコードする、ｄｂｖ ＯＲＦ１から３７の任意のヌクレオチド配列；
ｄ）該ＯＲＦのヌクレオチド配列以外であって、ｄｂｖ ＯＲＦ１から３７（配列番号；２から３８）のいずれかによりコードされるのと同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
【請求項２】
ｅ）ｄｂｖ ＯＲＦ３から４、６から１０、１８から２０、２２から２３、２９から３０、および３６（配列番号：４から５、７から１１、１９から２１、２３から２４、３０から３１、および３７）のいずれかのヌクレオチド配列；
ｆ）該ＯＲＦのヌクレオチド配列以外であって、ｄｂｖ ＯＲＦ３から４、６から１０、１８から２０、２２から２３、２９から３０、および３６（配列番号：４から５、７から１１、１９から２１、２３から２４、３０から３１、および３７）のいずれかによりコードされるのと同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｇ）ｄｂｖ ＯＲＦ３、６から９、１８から２０、２２から２３、２９から３０、および３６（配列番号：４、７から１０、１９から２１、２３から２４、３０から３１、および３７）のいずれかによりコードされるポリペプチドとアミノ酸配列が、少なくとも８０％、好ましくは、８６％、より好ましくは、９０％、最も好ましくは、９５％またはそれ以上同一のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｈ）ｄｂｖ ＯＲＦ４および１０（配列番号：５および１１）のいずれかによりコードされるポリペプチドとアミノ酸配列が、少なくとも８７％、好ましくは、９０％、より好ましくは、９５％またはそれ以上同一のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の単離核酸。
【請求項３】
ｄｂｖ ＯＲＦ１、２、５、および３７（配列番号：２、３、６、および３８）、または該ＯＲＦのヌクレオチド配列以外であって、同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる、Ａ４０９２６の４−ヒドロキシ−フェニルグリシン残基の合成に必要とされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の組合せを含む、請求項２記載の単離核酸。
【請求項４】
ｄｂｖ ＯＲＦ３０から３４、および３７（配列番号：３１から３５、および３８）、または該ＯＲＦのヌクレオチド配列以外であって、同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から、なるＡ４０９２６の３，５−ジヒドロキシ−フェニルグリシン残基の合成に必要とされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の組合せを含む、請求項２記載の単離核酸。
【請求項５】
ｄｂｖ ＯＲＦ１６、１７、２５、２６，および３６（配列番号：１７から１８、２６から２７、および３７）、または該ＯＲＦのヌクレオチド配列以外であって、同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる、Ａ４０９２６のヘプタペプチド骨格の合成に必要とされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の組合せを含む、請求項２記載の単離核酸。
【請求項６】
ｄｂｖ ＯＲＦ１０（配列番号：１１）、または該ＯＲＦのヌクレオチド配列以外であって、同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる、Ａ４０９２６のアミノ酸３および６の芳香族残基の塩素化に必要とされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２記載の単離核酸。
【請求項７】
ｄｂｖ ＯＲＦ２８（配列番号：２９）、または該ＯＲＦのヌクレオチド配列以外であって、同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる、Ａ４０９２６のアミノ酸６のチロシン残基のβ−ヒドロキシル化に必要とされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２記載の単離核酸。
【請求項８】
ｄｂｖ ＯＲＦ１１から１４（配列番号：１２から１５）、または該ＯＲＦのヌクレオチド配列以外であって、同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる、Ａ４０９２６の位置２および４、４および６、１および３、および５および７のアミノ酸の芳香族残基の架橋結合に必要とされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の組合せを含む、請求項２記載の単離核酸。
【請求項９】
ＯＲＦ９、２３、および２９（配列番号：１０、２４、および３０）、または該ＯＲＦのヌクレオチド配列以外であって、同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる、Ａ４０９２６のＮ−アシルグルクロンアミン残基の付加および生成に必要とされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の組合せを含む、請求項２記載の単離核酸。
【請求項１０】
ｄｂｖ ＯＲＦ２０（配列番号：２１）、または該ＯＲＦのヌクレオチド配列以外であって、同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる、Ａ４０９２６のマンノシル残基の結合に必要とされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２記載の単離核酸。
【請求項１１】
ｄｂｖ ＯＲＦ２７（配列番号：２８）、または該ＯＲＦのヌクレオチド配列以外であって、同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる、Ａ４０９２６のＮ−メチル化に必要とされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２記載の単離核酸。
【請求項１２】
Ａ４０９２６またはその前駆体のいくつかの細胞質外への輸送、およびＡ４０９２６に抵抗性を、ｄｂｖ ＯＲＦ７、１８、１９、２４、および３５（配列番号：８、１９から２０、２５、および３６）、または該ＯＲＦのヌクレオチド配列以外であって、同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる、産生株に付与するのに必要とされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の組合せを含む、請求項２記載の単離核酸。
【請求項１３】
ｄｂｖ ＯＲＦ３、４、６、および２２（配列番号：４、５、７、および２３）、または該ＯＲＦのヌクレオチド配列以外であって、同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる、ｄｂｖ遺伝子群のうち１またはそれ以上の遺伝子の発現の調節に必要とされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の組合せを含む、請求項２記載の単離核酸。
【請求項１４】
インフレームの欠失が、マンノシル残基の結合に必要とされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に導入されている、Ａ４０９２６の合成に必要とされるポリペプチドをコードするｄｂｖ遺伝子群からなるヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の単離核酸。
【請求項１５】
ｄｂｖ ＯＲＦ１から３７（配列番号：２から３８）、または該ｄｂｖ ＯＲＦのヌクレオチド配列以外であって、該ｄｂｖ ＯＲＦによりコードされるのと同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のうち少なくとも１つの少なくとも１個の追加コピーを有するヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の単離核酸。
【請求項１６】
ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列である、請求項１から１５のいずれか記載の単離核酸。
【請求項１７】
請求項１から１５のいずれかで定義されたＤＮＡ配列を含む、組換えＤＮＡベクター。
【請求項１８】
ＥＳＡＣベクターである、請求項１７に記載の組換えベクター。
【請求項１９】
請求項１７または１８のいずれか記載のベクターで形質導入された宿主細胞。
【請求項２０】
アクチノマイセス（Actinomycetales）目、好ましくは、ストレプトスポランギアセア（Streptosporangiaceae）科、ミクロモノスポラセア（Micromonosporaceae）科、シュードノカルディアセア（Pseudonocardiaceae）科、またはストレプトマイセス（Streptomycetaceae）科、より好ましくは、ノノムリア（Nonomureae）属、アクチノプラネス（Actinoplanes）属、アミコラトプシス（Amycolatopsis）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属などに属する、請求項１９に記載の形質導入された宿主細胞。
【請求項２１】
生合成経路によりＡ４０９２６またはその前駆体を産生する能力のある微生物によるＡ４０９２６の産生を増加させる方法であって、
ａ）請求項１７記載の組換えＤＮＡベクターで、生合成経路によりＡ４０９２６またはＡ４０９２６前駆体を産生する微生物を形質導入すること、ここで、該ＤＮＡベクターは該経路の律速である活性の発現をコードする；
ｂ）該ベクターで形質導入された該微生物を、細胞増殖、該遺伝子の発現、および該抗生物質または抗生物質前駆体の産生に適した条件下で培養すること、
を含む方法。
【請求項２２】
ゲノムのＡ４０９２６合成遺伝子が、請求項１５記載のヌクレオチド配列の挿入により修飾されている、Ａ４０９２６または前駆体、またはそれらの誘導体を産生する形質導入された微生物。
【請求項２３】
請求項２２記載の形質導入されたＡ４０９２６産生微生物を培養することを含む、Ａ４０９２６または前駆体、またはそれらの誘導体を産生する方法。
【請求項２４】
ｄｂｖ ＯＲＦ１から３７（配列番号：２から３８）から選択されるＡ４０９２６生合成遺伝子の少なくとも１つが破壊されている、ゲノムにＡ４０９２６生合成遺伝子を有する、形質導入されたＡ４０９２６産生微生物。
【請求項２５】
破壊されている生合成遺伝子が、マンノシル残基の結合に関与する遺伝子である、請求項２４記載の形質導入された微生物。
【請求項２６】
請求項２４記載の形質導入されたＡ４０９２６産生微生物を含む、Ａ４０９２６前駆体または誘導体を産生する方法。
【請求項２７】
Ａ４０９２６またはその前駆体とは異なる糖ペプチドを産生する方法であって、
ａ）（ｉ）組換えＤＮＡベクターで、生合成経路によりＡ４０９２６またはその前駆体と異なる糖ペプチドまたは糖ペプチド前駆体を産生する微生物を形質導入すること、該ベクターまたはその一部分質は、該糖ペプチドまたは糖ペプチド前駆体を修飾する１またはそれ以上のポリペプチドの発現をコードする、請求項１から１３のいずれか記載の１またはそれ以上のヌクレオチド配列を含み；次に
（ｉｉ）該ベクターで形質導入された該微生物を、細胞増殖、該遺伝子の発現、および該抗生物質または抗生物質前駆体の産生に適した条件下で培養すること；
あるいは、
ｂ）（ｉ）組換えＤＮＡベクターで微生物を形質導入すること、該ベクターは、糖ペプチドまたは糖ペプチド前駆体を修飾する１またはそれ以上のポリペプチドをコードする、請求項１から１３のいずれか記載の１またはそれ以上のヌクレオチド配列を含み、該微生物は、糖ペプチドまたは糖ペプチド前駆体を産生せず、かつ導入されたヌクレオチド配列を効率的に発現できるものから選択され；
（ｉｉ）該微生物の細胞抽出物または細胞分画を、活性なポリペプチドの存在に適した条件下で調製すること、該細胞抽出物または細胞分画は、少なくとも該活性なポリペプチドを含有する；次に、
（ｉｉｉ）糖ペプチドまたは糖ペプチド前駆体を該細胞抽出物または細胞分画に添加し、次に該混合物を該活性なポリペプチドが糖ペプチドまたは糖ペプチド前駆体を修飾できる条件下でインキュベーションすること、
を含む方法。
【請求項２８】
ａ）ｄｂｖ ＯＲＦ１から３７（配列番号：２ないし３８）のいずれかによりコードされるＯＲＦポリペプチド、またはｄｂｖ ＯＲＦ１から３７（配列番号：２ないし３８）のいずれか、好ましくは、ｄｂｖ ＯＲＦ３から４、６から１０、１８から２０、２２から２３、２９から３０（配列番号：４から５、７から１１、１９から２１、２３から２４、３０から３１、および３７）のいずれか１個によりコードされるＯＲＦポリペプチドとアミノ酸配列が同一のポリペプチド；
ｂ）ｄｂｖ ＯＲＦ３、６から９、１８から２０、２２から２３、２９から３０、および３６（配列番号：４、７から１０、１９から２１、２３から２４、３０から３１、および３７）のいずれかによりコードされるポリペプチドとアミノ酸配列が、少なくとも８０％、好ましくは、８６％、より好ましくは、９０％、最も好ましくは、９５％またはそれ以上同一のポリペプチド；および
ｃ）ｄｂｖ ＯＲＦ４および１０（配列番号：５および１１）のいずれかによりコードされるポリペプチドとアミノ酸配列が、少なくとも８７％、好ましくは、９０％、より好ましくは、９５％またはそれ以上同一のポリペプチド、
から選択されるＡ４０９２６の生合成経路に関与するポリペプチド配列を含む、単離ポリペプチド。
【請求項２９】
請求項３から１６のいずれか記載の核酸のいずれかによりコードされるポリペプチドから選択されるＡ４０９２６の生合成経路に関与するポリペプチドを含む、単離ポリペプチド。
【請求項１】
ａ）Ａ４０９２６（配列番号：１）の合成に必要なポリペプチドをコードするｄｂｖ遺伝子群；
ｂ）ｄｂｖ遺伝子群のヌクレオチド配列以外であって、ｄｂｖ遺伝子群（配列番号：１）によりコードされるのと同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号：２から３８のポリペプチドをコードする、ｄｂｖ ＯＲＦ１から３７の任意のヌクレオチド配列；
ｄ）該ＯＲＦのヌクレオチド配列以外であって、ｄｂｖ ＯＲＦ１から３７（配列番号；２から３８）のいずれかによりコードされるのと同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
【請求項２】
ｅ）ｄｂｖ ＯＲＦ３から４、６から１０、１８から２０、２２から２３、２９から３０、および３６（配列番号：４から５、７から１１、１９から２１、２３から２４、３０から３１、および３７）のいずれかのヌクレオチド配列；
ｆ）該ＯＲＦのヌクレオチド配列以外であって、ｄｂｖ ＯＲＦ３から４、６から１０、１８から２０、２２から２３、２９から３０、および３６（配列番号：４から５、７から１１、１９から２１、２３から２４、３０から３１、および３７）のいずれかによりコードされるのと同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｇ）ｄｂｖ ＯＲＦ３、６から９、１８から２０、２２から２３、２９から３０、および３６（配列番号：４、７から１０、１９から２１、２３から２４、３０から３１、および３７）のいずれかによりコードされるポリペプチドとアミノ酸配列が、少なくとも８０％、好ましくは、８６％、より好ましくは、９０％、最も好ましくは、９５％またはそれ以上同一のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｈ）ｄｂｖ ＯＲＦ４および１０（配列番号：５および１１）のいずれかによりコードされるポリペプチドとアミノ酸配列が、少なくとも８７％、好ましくは、９０％、より好ましくは、９５％またはそれ以上同一のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の単離核酸。
【請求項３】
ｄｂｖ ＯＲＦ１、２、５、および３７（配列番号：２、３、６、および３８）、または該ＯＲＦのヌクレオチド配列以外であって、同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる、Ａ４０９２６の４−ヒドロキシ−フェニルグリシン残基の合成に必要とされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の組合せを含む、請求項２記載の単離核酸。
【請求項４】
ｄｂｖ ＯＲＦ３０から３４、および３７（配列番号：３１から３５、および３８）、または該ＯＲＦのヌクレオチド配列以外であって、同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から、なるＡ４０９２６の３，５−ジヒドロキシ−フェニルグリシン残基の合成に必要とされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の組合せを含む、請求項２記載の単離核酸。
【請求項５】
ｄｂｖ ＯＲＦ１６、１７、２５、２６，および３６（配列番号：１７から１８、２６から２７、および３７）、または該ＯＲＦのヌクレオチド配列以外であって、同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる、Ａ４０９２６のヘプタペプチド骨格の合成に必要とされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の組合せを含む、請求項２記載の単離核酸。
【請求項６】
ｄｂｖ ＯＲＦ１０（配列番号：１１）、または該ＯＲＦのヌクレオチド配列以外であって、同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる、Ａ４０９２６のアミノ酸３および６の芳香族残基の塩素化に必要とされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２記載の単離核酸。
【請求項７】
ｄｂｖ ＯＲＦ２８（配列番号：２９）、または該ＯＲＦのヌクレオチド配列以外であって、同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる、Ａ４０９２６のアミノ酸６のチロシン残基のβ−ヒドロキシル化に必要とされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２記載の単離核酸。
【請求項８】
ｄｂｖ ＯＲＦ１１から１４（配列番号：１２から１５）、または該ＯＲＦのヌクレオチド配列以外であって、同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる、Ａ４０９２６の位置２および４、４および６、１および３、および５および７のアミノ酸の芳香族残基の架橋結合に必要とされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の組合せを含む、請求項２記載の単離核酸。
【請求項９】
ＯＲＦ９、２３、および２９（配列番号：１０、２４、および３０）、または該ＯＲＦのヌクレオチド配列以外であって、同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる、Ａ４０９２６のＮ−アシルグルクロンアミン残基の付加および生成に必要とされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の組合せを含む、請求項２記載の単離核酸。
【請求項１０】
ｄｂｖ ＯＲＦ２０（配列番号：２１）、または該ＯＲＦのヌクレオチド配列以外であって、同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる、Ａ４０９２６のマンノシル残基の結合に必要とされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２記載の単離核酸。
【請求項１１】
ｄｂｖ ＯＲＦ２７（配列番号：２８）、または該ＯＲＦのヌクレオチド配列以外であって、同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる、Ａ４０９２６のＮ−メチル化に必要とされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２記載の単離核酸。
【請求項１２】
Ａ４０９２６またはその前駆体のいくつかの細胞質外への輸送、およびＡ４０９２６に抵抗性を、ｄｂｖ ＯＲＦ７、１８、１９、２４、および３５（配列番号：８、１９から２０、２５、および３６）、または該ＯＲＦのヌクレオチド配列以外であって、同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる、産生株に付与するのに必要とされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の組合せを含む、請求項２記載の単離核酸。
【請求項１３】
ｄｂｖ ＯＲＦ３、４、６、および２２（配列番号：４、５、７、および２３）、または該ＯＲＦのヌクレオチド配列以外であって、同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる、ｄｂｖ遺伝子群のうち１またはそれ以上の遺伝子の発現の調節に必要とされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の組合せを含む、請求項２記載の単離核酸。
【請求項１４】
インフレームの欠失が、マンノシル残基の結合に必要とされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に導入されている、Ａ４０９２６の合成に必要とされるポリペプチドをコードするｄｂｖ遺伝子群からなるヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の単離核酸。
【請求項１５】
ｄｂｖ ＯＲＦ１から３７（配列番号：２から３８）、または該ｄｂｖ ＯＲＦのヌクレオチド配列以外であって、該ｄｂｖ ＯＲＦによりコードされるのと同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のうち少なくとも１つの少なくとも１個の追加コピーを有するヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の単離核酸。
【請求項１６】
ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列である、請求項１から１５のいずれか記載の単離核酸。
【請求項１７】
請求項１から１５のいずれかで定義されたＤＮＡ配列を含む、組換えＤＮＡベクター。
【請求項１８】
ＥＳＡＣベクターである、請求項１７に記載の組換えベクター。
【請求項１９】
請求項１７または１８のいずれか記載のベクターで形質導入された宿主細胞。
【請求項２０】
アクチノマイセス（Actinomycetales）目、好ましくは、ストレプトスポランギアセア（Streptosporangiaceae）科、ミクロモノスポラセア（Micromonosporaceae）科、シュードノカルディアセア（Pseudonocardiaceae）科、またはストレプトマイセス（Streptomycetaceae）科、より好ましくは、ノノムリア（Nonomureae）属、アクチノプラネス（Actinoplanes）属、アミコラトプシス（Amycolatopsis）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属などに属する、請求項１９に記載の形質導入された宿主細胞。
【請求項２１】
生合成経路によりＡ４０９２６またはその前駆体を産生する能力のある微生物によるＡ４０９２６の産生を増加させる方法であって、
ａ）請求項１７記載の組換えＤＮＡベクターで、生合成経路によりＡ４０９２６またはＡ４０９２６前駆体を産生する微生物を形質導入すること、ここで、該ＤＮＡベクターは該経路の律速である活性の発現をコードする；
ｂ）該ベクターで形質導入された該微生物を、細胞増殖、該遺伝子の発現、および該抗生物質または抗生物質前駆体の産生に適した条件下で培養すること、
を含む方法。
【請求項２２】
ゲノムのＡ４０９２６合成遺伝子が、請求項１５記載のヌクレオチド配列の挿入により修飾されている、Ａ４０９２６または前駆体、またはそれらの誘導体を産生する形質導入された微生物。
【請求項２３】
請求項２２記載の形質導入されたＡ４０９２６産生微生物を培養することを含む、Ａ４０９２６または前駆体、またはそれらの誘導体を産生する方法。
【請求項２４】
ｄｂｖ ＯＲＦ１から３７（配列番号：２から３８）から選択されるＡ４０９２６生合成遺伝子の少なくとも１つが破壊されている、ゲノムにＡ４０９２６生合成遺伝子を有する、形質導入されたＡ４０９２６産生微生物。
【請求項２５】
破壊されている生合成遺伝子が、マンノシル残基の結合に関与する遺伝子である、請求項２４記載の形質導入された微生物。
【請求項２６】
請求項２４記載の形質導入されたＡ４０９２６産生微生物を含む、Ａ４０９２６前駆体または誘導体を産生する方法。
【請求項２７】
Ａ４０９２６またはその前駆体とは異なる糖ペプチドを産生する方法であって、
ａ）（ｉ）組換えＤＮＡベクターで、生合成経路によりＡ４０９２６またはその前駆体と異なる糖ペプチドまたは糖ペプチド前駆体を産生する微生物を形質導入すること、該ベクターまたはその一部分質は、該糖ペプチドまたは糖ペプチド前駆体を修飾する１またはそれ以上のポリペプチドの発現をコードする、請求項１から１３のいずれか記載の１またはそれ以上のヌクレオチド配列を含み；次に
（ｉｉ）該ベクターで形質導入された該微生物を、細胞増殖、該遺伝子の発現、および該抗生物質または抗生物質前駆体の産生に適した条件下で培養すること；
あるいは、
ｂ）（ｉ）組換えＤＮＡベクターで微生物を形質導入すること、該ベクターは、糖ペプチドまたは糖ペプチド前駆体を修飾する１またはそれ以上のポリペプチドをコードする、請求項１から１３のいずれか記載の１またはそれ以上のヌクレオチド配列を含み、該微生物は、糖ペプチドまたは糖ペプチド前駆体を産生せず、かつ導入されたヌクレオチド配列を効率的に発現できるものから選択され；
（ｉｉ）該微生物の細胞抽出物または細胞分画を、活性なポリペプチドの存在に適した条件下で調製すること、該細胞抽出物または細胞分画は、少なくとも該活性なポリペプチドを含有する；次に、
（ｉｉｉ）糖ペプチドまたは糖ペプチド前駆体を該細胞抽出物または細胞分画に添加し、次に該混合物を該活性なポリペプチドが糖ペプチドまたは糖ペプチド前駆体を修飾できる条件下でインキュベーションすること、
を含む方法。
【請求項２８】
ａ）ｄｂｖ ＯＲＦ１から３７（配列番号：２ないし３８）のいずれかによりコードされるＯＲＦポリペプチド、またはｄｂｖ ＯＲＦ１から３７（配列番号：２ないし３８）のいずれか、好ましくは、ｄｂｖ ＯＲＦ３から４、６から１０、１８から２０、２２から２３、２９から３０（配列番号：４から５、７から１１、１９から２１、２３から２４、３０から３１、および３７）のいずれか１個によりコードされるＯＲＦポリペプチドとアミノ酸配列が同一のポリペプチド；
ｂ）ｄｂｖ ＯＲＦ３、６から９、１８から２０、２２から２３、２９から３０、および３６（配列番号：４、７から１０、１９から２１、２３から２４、３０から３１、および３７）のいずれかによりコードされるポリペプチドとアミノ酸配列が、少なくとも８０％、好ましくは、８６％、より好ましくは、９０％、最も好ましくは、９５％またはそれ以上同一のポリペプチド；および
ｃ）ｄｂｖ ＯＲＦ４および１０（配列番号：５および１１）のいずれかによりコードされるポリペプチドとアミノ酸配列が、少なくとも８７％、好ましくは、９０％、より好ましくは、９５％またはそれ以上同一のポリペプチド、
から選択されるＡ４０９２６の生合成経路に関与するポリペプチド配列を含む、単離ポリペプチド。
【請求項２９】
請求項３から１６のいずれか記載の核酸のいずれかによりコードされるポリペプチドから選択されるＡ４０９２６の生合成経路に関与するポリペプチドを含む、単離ポリペプチド。
【公表番号】特表２００６−５１６８８５（Ｐ２００６−５１６８８５Ａ）
【公表日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５４５８５４（Ｐ２００４−５４５８５４）
【出願日】平成１５年１０月１５日（２００３．１０．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／０１１３９８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３８０２５
【国際公開日】平成１６年５月６日（２００４．５．６）
【出願人】（５０４４６４３８０）ビキュロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド (4)
【氏名又は名称原語表記】ＶＩＣＵＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１０月１５日（２００３．１０．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／０１１３９８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３８０２５
【国際公開日】平成１６年５月６日（２００４．５．６）
【出願人】（５０４４６４３８０）ビキュロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド (4)
【氏名又は名称原語表記】ＶＩＣＵＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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