糖化タンパク質濃度測定方法及びバイオセンサ
【目的】 簡単な操作かつ短時間で試料中の糖化タンパク質濃度を定量できるようにする。
【構成】毛細管現象によって試料開口部３１から吸い上げ、前処理部３２に不織布３４に担持させて設けたプロテアーゼによって試料を処理する。その後、試料を流路３３に設けた電極系２２に導き、ポリマーで作用極２２ａに固定化した酵素と、プロテアーゼ処理による分解生成物とを反応させる。そして、電極系２２からの電気信号として検出される、酵素の反応量に基づき、試料中の糖蛋白質濃度を求める。なお、酵素を固定化するポリマーとしては、水溶性光硬化性樹脂又は固体高分子電解質を用いる。
【構成】毛細管現象によって試料開口部３１から吸い上げ、前処理部３２に不織布３４に担持させて設けたプロテアーゼによって試料を処理する。その後、試料を流路３３に設けた電極系２２に導き、ポリマーで作用極２２ａに固定化した酵素と、プロテアーゼ処理による分解生成物とを反応させる。そして、電極系２２からの電気信号として検出される、酵素の反応量に基づき、試料中の糖蛋白質濃度を求める。なお、酵素を固定化するポリマーとしては、水溶性光硬化性樹脂又は固体高分子電解質を用いる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、液体試料中の糖化タンパク質濃度を測定する糖化タンパク質濃度測定方法及び、このような測定を行うためのバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、特許文献１に記載のように、糖化タンパク質の血中濃度が過去の一定期間の平均血糖値を反映しており、その血中濃度の測定値が、糖尿病の症状の診断及び管理の重要な指標となり得ることが知られている。
また、特許文献１には、この糖化タンパク質の血中濃度を、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）を利用して測定する方法が開示されている。また、その測定を行う際、ＦＡＯＤと試料とを反応させる前に、プロテアーゼにより試料を前処理して糖化タンパク質を糖化ペプチド及び糖化アミノ酸に分解しておくことにより、ＦＡＯＤの反応速度を高め、糖化タンパク質の検出感度を高めることができることも開示されている。
【特許文献１】国際公開第９８／４８０４３号パンフレット
【０００３】
一方、０．３〜１０μＬ（マイクロリットル）程度の液体試料をセンサユニット内に吸い上げ、センサユニット内部で種々の試薬により試料を処理してその反応を計測することにより、試料の分析を行う手法が種々提案されている。また特に、試薬として酵素を用い、酵素の基質特異性を利用して試料中の特定の物質の濃度を測定可能なバイオセンサは、種々の物質を含む生体試料の分析に適するため、医療用の検査機器を始め、様々な分野で用いられるようになっている。
【０００４】
このようなバイオセンサとしては、例えば特許文献２に記載のものが知られている。
特許文献２には、ヒトの全血のサンプルからグルコース濃度を測定する電気化学のバイオセンサが簡易血糖値計として開示されている。バイオセンサには試料の吸引口があり、検査試料である全血をこの吸引口に加えると、全血は毛細管現象により毛細管状充填室に引き込まれる。そして、毛細管状充填室の奥に空気口が形成されているために、空気を逃がしながら毛細管状充填室を全血で満たすことができる。また、この毛細管状充填室には作用電極と対電極が配置されていて、血球成分を含んだ全血の状態でグルコース濃度に相関した電流測定値を得て、簡易的に血糖値を測定できる構造になっている。
【特許文献２】特開２００２−３１０９７３号公報（第６−８頁）
【０００５】
また、微量の血液試料を分析する装置としては、特許文献３に記載のものも知られている。
特許文献３には、遠心操作により血漿分離が可能な血液分析装置において、血液試料の流路に、遠心分離時の遠心方向に血球成分が溜まる部分を配置し、そこに遠心分離により血球成分を集積させ、血漿成分が上清みとなるように遠心分離することが開示されている。この血液分析装置では、試料となるヒト全血の導入のために、排出口に外部ポンプを取り付けて、血液吸引口から吸引負圧によって全血を引き込んでいる。また、遠心分離後の血漿成分の移動も同様に、外部ポンプによる吸引負圧によって分析位置に導かれる構造になっている。
【特許文献３】特開２００４−１０９０８２号公報（第６−９頁）
【０００６】
また、バイオセンサとしては、特許文献４に記載のものも知られている。
特許文献４には、酵素反応層における電気化学的な反応検出を妨害する物質を除去するための妨害物質除去部を試料の供給部に設けることにより、反応検出について安定的な応答が得られるようにすることが開示されている。なお、妨害物質とは、具体的には還元性物質を指し、妨害物質除去部は、これを酸化する物質を配置することにより形成されるものである。
【特許文献４】特公平８−２０４００号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ところで、特許文献１にも記載されているが、従来知られている分析法では、試料をプロテアーゼにより前処理する場合、前処理後の試料をＦＡＯＤと反応させる前にプロテアーゼを不活性化させておかないと、ＦＡＯＤ自身がプロテアーゼにより分解されてしまい、結果として糖化タンパク質の検出感度が低下してしまう。
そしてこのため、従来知られている方法では、高感度の検出結果を得るためには、試料をプロテアーゼにて処理した後にそのプロテアーゼを不活性化あるいは除去するといった面倒な手順が必要となり、分析を簡単な操作かつ短時間で行うことが難しかった。
特許文献２乃至４においても、プロテアーゼに対する対策については、特に記載されていない。
【０００８】
この発明は、このような問題を解決し、簡単な操作かつ短時間で試料中の糖化タンパク質濃度を定量できるようにすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者は、試料をプロテアーゼで処理して得た分解生成物質を特定の酵素と反応させることにより上記試料中の糖化タンパク質濃度を定量する場合において、上記試料をプロテアーゼにより前処理した後、その試料を適当なポリマーにより固定化した上記特定の酵素と反応させ、その反応の状態を検出するようにすれば、プロテアーゼ処理後にプロテアーゼの不活性化や除去を行わなくても、上記試料中の糖化タンパク質濃度を定量可能であることを見出した。
本発明は、このような手法により試料中の糖化タンパク質濃度を定量する糖化タンパク質濃度測定方法を提供する。
【００１０】
なお、上記のポリマーとしては、水溶性光硬化性樹脂や固体高分子電解質、特に、感光基としてアジド基あるいはスリチルピリジニウム基を有する光硬化性ポリビニルアルコール樹脂及び、フッ素樹脂とパーフルオロスルホン酸樹脂との共重合物質である固体高分子電解質が有用であった。
また、上記の定量に用いる特定の酵素の具体例としては、濃度を測定しようとする糖化タンパク質のプロテアーゼ分解物質を基質とするフルクトシルアミノ酸酸化酵素（ＦＡＯＤ）が考えられる。
【００１１】
また、上記試料と上記特定の酵素との反応の状態の検出は、電気化学方式又は分光方式で行うことができる。
このうち、検出を電気化学方式で行う場合、上記試料を、上記水溶性光硬化性樹脂により人工電子メディエータと共に電極上に固定した前記特定の酵素と反応させ、反応の状態を、上記特定の酵素を固定した電極と、所定の検出用電極との間の電流値により検出することができる。この場合、人工電子メディエータとしては、例えばｍ−ＰＭＳ（1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate)やルテニウム（Ｒｕ）錯体を用いることができる。
【００１２】
また、上記試料を、上記固体高分子電解質により白金電極上に固定した前記特定の酵素と反応させ、反応の状態を、上記特定の酵素を固定した白金電極と、所定の検出用電極との間の電流値により検出することもできる。
また、上記の前処理において、上記プロテアーゼにより前記試料に含まれる糖化タンパク質を分解する分解工程に加え、上記試料に含まれる、上記特定の酵素との反応の検出を妨害する妨害物質を除去する処理を行うとよい。この妨害物質としては、例えばアスコルビン酸、ビリルビン、尿酸等が考えられ、それぞれ試料にアスコルビン酸オキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ウリカーゼを添加することにより除去することができる。
【００１３】
また、上記前処理において、上記試料のｐＨ及び塩濃度を上記特定の酵素の反応に適した値に調整する処理を実行するようにしてもよい。この処理は、例えばｐＨ及び塩濃度調整用の塩を試料に添加して行うことができる。
また、試料が血液である場合、上記前処理において、上記試料に抗血液凝固剤を添加する処理を実行するようにしてもよい。抗血液凝固剤としては、例えばクエン酸ナトリウム、ヘパリン、あるいはＥＤＴＡ（ethylenediaminetetraacetic acid）・２Ｋを用いることが考えられるが、反応検出への影響を考慮すると、ヘパリンが特に好適であった。
【００１４】
これらの妨害物質除去、ｐＨ及び塩濃度調整、および抗血液凝固剤添加は、複数組み合わせて行ってもよい。また、これらの処理に使用する酵素又は試薬を、それぞれ不織布の異なる断片に担持させておき、試料をその各断片に浸透させることにより行ってもよい。
【００１５】
また、この発明は、毛細管現象によって試料を吸い上げる吸引空洞と、その吸引空洞と連続する分析空洞とを備えたバイオセンサであって、上記吸引空洞にプロテアーゼを備え、上記分析空洞に、上記試料のプロテアーゼ処理による分解生成物と反応させる特定の酵素を、ポリマーにより固定化した状態で備え、上記分析空洞に、上記特定の酵素による反応の状態を外部から検出可能とするための電極又は透明部をさらに備え、上記特定の酵素を固定化しているポリマーが水溶性光硬化性樹脂又は固体高分子電解質としたバイオセンサも提供する。
このようなバイオセンサは、上述の糖化タンパク質濃度測定方法による糖化タンパク質濃度測定に有用である。
【発明の効果】
【００１６】
以上のようなこの発明による糖化タンパク質濃度測定方法によれば、簡単な操作かつ短時間で試料中の糖化タンパク質濃度を定量することができる。
また、この発明のバイオセンサによれば、このような糖化タンパク質濃度測定方法による糖化タンパク質濃度測定を簡単な操作かつ短時間で行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、この発明を実施するための最良の形態につき説明する。
ここでは、血清試料中の糖化タンパク質濃度を、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）を利用して測定する方法について説明するが、測定対象の試料や用いる酵素等がこれに限られないことは、もちろんである。
【００１８】
１．プロテアーゼの選定
まず、糖化タンパク質濃度を測定する試料の前処理に好適なプロテアーゼについて検討を行った。国際公開第９８／４８０４３号パンフレットに記載の通り、ＦＡＯＤを利用して糖化タンパク質濃度の検出を行う場合、ＦＡＯＤと試料とを反応させる前に、プロテアーゼにより試料を前処理して糖化タンパク質を糖化ペプチド及び糖化アミノ酸に分解しておくことにより、ＦＡＯＤの反応速度を高め、糖化タンパク質の検出感度を高めることができる。
【００１９】
そこで、糖化タンパク質を含む血清試料を種々のプロテアーゼで処理し、ＦＡＯＤの反応基質である糖化アミノ酸（フルクトシルアミノ酸：ＦＡ）を効率よく生成するプロテアーゼを選定した。
各プロテアーゼの反応性評価は、以下の通り行った。
【００２０】
試薬の調整
＜プロテアーゼ溶液＞
10mM pH8 リン酸緩衝液
2500U/mL 評価対象のプロテアーゼ
＜管理血清＞
糖化タンパク質を含む管理血清
＜コントロール溶液＞
10mM pH8 リン酸緩衝液
＜酵素溶液＞
72mM 4-AA（4-アミノアンチピリン) 20μL
72mM TODB（N,N-Bis(4-sulfobutyl)-3-methylaniline, disodium salt） 20μL
40U/mL POD（ペルオキシダーゼ） 20μL
100U/mL FAOD(フルクトシルアミノ酸酸化酵素）20μL
計80μL
【００２１】
なお、「Ｕ」は「ユニット」の意味である。
また、ＦＡＯＤとしては、特開２００４−２７５１６８号公報に記載の、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．Ｎ１−１株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター 寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７３２６）由来のフルクトシルアミン酸化酵素（フルクトシルアミノ酸酸化酵素としての活性を有する）を用いた。以下の実験でも特に断らない限り同様である。
【００２２】
操作
Ａ：評価対象のプロテアーゼを含むプロテアーゼ溶液225μLに管理血清15μLを加え、37℃にて種々の時間インキュベートした。
Ｂ：インキュベート後、4℃−5,000×gの遠心条件でスピンカラム(10,000NMWL)にてプロテアーゼを除去した（「NMWL」は分画分子量を示す）。
Ｃ：Ｂで得られた濾液140μLに酵素溶液80μLを加え反応溶液とし、546nmの吸光度を測定した。
Ｄ：反応溶液を37℃で5minインキュベート後、再度546nmの吸光度を測定した。
Ｅ：コントロール試料として管理血清の代わりにコントロール溶液を用いて上記Ａ〜Ｄを行った。
【００２３】
この操作によるプロテアーゼ反応性の測定原理は以下の通りである。
すなわち、操作Ａにより、血清中の糖化タンパク質をプロテアーゼにより糖化アミノ酸に分解する。その後、プロテアーゼを除去した後、操作Ｃにより、糖化アミノ酸とＦＡＯＤを作用させ、グルコソン、アミノ酸、過酸化水素を生成させる。そして、その過酸化水素はＰＯＤ存在下、４−アミノアンチピリンとＴＯＤＢとを酸化縮合させ、色素を生成させる。そして、546nmの吸光度を測定することにより、色素生成量からＦＡＯＤが触媒した酸化反応の量を求めることができる。
そして、糖化タンパク質の初期濃度が一定であれば、反応量が大きいものほど、プロテアーゼによるＦＡＯＤの反応速度向上及び糖化タンパク質の検出感度向上の効果が大きいことがわかる。
【００２４】
発明者は、種々のプロテアーゼについて上記の評価を行った。しかし、Protease Type I、Achromopeptidase、Kallikrein、Protease Type X （全てsigma社製）については、ほとんど反応性が見られなかった（ＦＡＯＤの反応基質となる糖化アミノ酸（ＦＡ）は生成されなかった）。また、α-Chymotrypsin、Protease Type 24は、多少の反応性が見られたものの、十分とは言えなかった。
一方、Subtilisin A （Sigma社製）については、効率よく糖化タンパク質を分解し、ＦＡＯＤの反応基質となる糖化アミノ酸を生成することが見出された。
【００２５】
図１に、評価対象のプロテアーゼとしてSubtilisin Aを用いた場合の測定結果を示す。図１において、グラフの横軸は、上記操作Ａでのインキュベート時間、縦軸は上記操作Ｄで得られた吸光度と操作Ｃで得られた吸光度との差である。
また、この結果を踏まえ、以後の実験ではプロテアーゼとしてSubtilisin A （Sigma社製）を用いることとした。
【００２６】
２．プロテアーゼ反応に対するｐＨの影響
次に、プロテアーゼ反応の至適ｐＨについて、以下の通り検討した。
【００２７】
試薬の調整
＜プロテアーゼ溶液＞
10mM pH12 POPSO緩衝液
50,000U/mL Subtilisin A （評価対象のプロテアーゼ）
ｐHコントロール試薬：NaOH
POPSO: Piperazine-1,4-bis(2-hydroxy-3-propanesulfonic acid)
＜管理血清＞
糖化タンパク質を含む管理血清
＜酵素溶液＞
72mM 4-AA（4-アミノアンチピリン) 20μL
72mM TODB（N,N-Bis(4-sulfobutyl)-3-methylaniline, disodium salt） 20μL
40U/mL POD（ペルオキシダーゼ） 20μL
100U/mL FAOD(フルクトシルアミノ酸酸化酵素）20μL
計80μL
【００２８】
操作
Ａ：NaOHにて反応場のｐHを変化させた各プロテアーゼ溶液225μLに管理血清15μLを加え、25℃で20minインキュベートした。
Ｂ：インキュベート後、4℃−5,000×gの遠心条件でスピンカラム(10,000NMWL)にてプロテアーゼを除去した。
Ｃ：Ｂで得られた濾液140μLに酵素溶液80μLを加え1分間あたりの546nmの吸光度変化を測定し、その値をＸとした。
Ｄ：コントロール試料として各pHのプロテアーゼ溶液と管理血清の混合溶液をインキュベートせず遠心し、濾液に糖化アミノ酸を終濃度500μMとなるように添加し、酵素溶液80μLを加え1分間あたりの546nmの吸光度変化を測定し、その値をＹとした。
【００２９】
この操作によるプロテアーゼ反応性の測定原理は、上述の１．の場合と同様である。また、各ｐＨでの反応速度は、試料中の糖化アミノ酸濃度に比例する。
そこで、上記の操作で得られた結果を基に、下記の糖化アミノ酸換算式（式１）より各ｐHでプロテアーゼを作用させた際の反応効率を見積もり、これらを比較した。
生成した糖化アミノ酸(μM)＝[Ｘ（ΔAbs./min）／Ｙ（ΔAbs./min）]×500
・・・（式１）
【００３０】
この結果を図２に示す。図２において、横軸はプロテアーゼ溶液のｐＨ、縦軸は（式１）に従って求めた糖化アミノ酸量である。
この結果から、プロテアーゼ反応場のｐHが高いほど、Subtilisin Aにより効率よく糖化タンパク質が分解され、ＦＡＯＤの反応基質である糖化アミノ酸（ＦＡ）が生成されることがわかる。
【００３１】
３．アスコルビン酸酸化酵素（ＡＳＯＤ）及びビリルビン酸化酵素（ＢＯＤ）による
反応妨害物質除去反応に対するｐＨの影響
一般に、血中に含まれるアスコルビン酸やビリルビンといった還元性物質が、酸化酵素と基質との反応を電気化学的に測定する際に、その測定値に影響を与え、ノイズを生じさせる反応妨害物質となることが知られている。
【００３２】
例えば、軽部征夫監修、「ＣＭＣテクニカルライブライブラリー１１３ バイオセンサー」、シーエムシー出版、２００２年５月、ｐ．１５７−１６３に記載されているように、電気化学的に検出する電極活物質として過酸化水素を用いて反応を検出する場合、アスコルビン酸やビリルビンの酸化電位が過酸化水素のそれに近いため、酵素電極での測定電流が、（反応で生成した過酸化水素量＋存在する還元性物質量）に応じた値となり、見かけの電流値が上昇してしまう。
【００３３】
また、このような電流値の上昇を抑制する目的で、過酸化水素より酸化電位の低いメディエータを用いたとしても、還元性物質によりメディエータが還元されてしまい、測定電流が、（反応で生成した還元型メディエータ量＋還元性物質により還元された還元型メディエータ量）に応じた値となり、やはり見かけの電流値が上昇してしまう。
【００３４】
従って、血液試料について、ＦＡＯＤを用いて糖化タンパク質量を電気化学的に測定しようとする場合、試料にアスコルビン酸酸化酵素やビリルビン酸化酵素を添加し、予め血液試料中のアスコルビン酸及びビリルビンを酸化して、これらの物質が測定に影響を与えないようにすることが好ましい。
そこで、アスコルビン酸酸化酵素（ＡＳＯＤ）及びビリルビン酸化酵素（ＢＯＤ）による反応妨害物質除去反応の至適ｐＨについて、以下の通り検討した。なお、ＡＳＯＤもＢＯＤも共にアスコルビン酸を酸化することが知られているため、評価には、反応妨害物質としてアスコルビン酸を用いることとした。
【００３５】
試薬の調整
＜アスコルビン酸溶液＞
0, 25, 50, 100μM アスコルビン酸
10mM POPSO緩衝液
ｐHコントロール試薬：NaOH
＜DCIP（2,6-ジクロロフェノールインドフェノール）溶液＞
3mM DCIP水溶液
＜酵素＞
ＡＳＯＤ（オリエンタル酵母工業株式会社製）
ＢＯＤ（天野エンザイム株式会社製）
【００３６】
操作
Ａ：NaOHにてｐHを変化させた各濃度のアスコルビン酸溶液95μLにDCIP溶液5μLを加え、１分間あたりの600nmの吸光度変化を測定し、各ｐHでのアスコルビン酸の検量線を作成した。
Ｂ：各ｐHの100mMアスコルビン酸溶液に酵素を2U/mLとなるように添加後、25℃で5minインキュベートした。
Ｃ：インキュベート後、4℃−5,000×gの遠心条件でスピンカラム(10,000NMWL)にて酵素を除去した。
Ｄ：Ｃで得られた濾液95μLにDCIP溶液5μLを加え、１分間あたりの600nmの吸光度変化を測定し、Ａで作成した検量線よりアスコルビン酸消費量を評価した。
ＤＣＩＰ水溶液は、アスコルビン酸の存在下では還元されて脱色されるため、吸光度の変化量から、溶液中に存在（残存）するアスコルビン酸の濃度を定量することができる。
【００３７】
以上の結果を図３に示す。図３において、横軸は、アスコルビン酸溶液のｐＨを、縦軸は、操作Ｄで測定した濾液において、酵素添加前のアスコルビン酸溶液に含まれていたアスコルビン酸がどの程度減少していたかを示す。
この結果から、ＡＳＯＤ，ＢＯＤ共に、アスコルビン酸酸化の反応性はｐH依存性があることが判る。また、高ｐＨ条件では、ＢＯＤが高い反応性を示した。従って、前処理にて共存するプロテアーゼの反応の至適ｐHが高いことから、反応妨害物質であるアスコルビン酸除去には酵素としてＢＯＤが好ましいことが判る。
【００３８】
４．抗血液凝固剤の酵素活性に対する影響
血液試料について分析を行う場合、その凝固を防止することが好ましい。そして、凝固を防止するための抗血液凝固剤としては、例えばクエン酸ナトリウム、ヘパリン、ＥＤＴＡ−２Ｋ等が知られている。
そこで、これらの抗血液凝固剤につき、ＦＡＯＤを用いた糖化タンパク質検出への影響を調べるため、抗血液凝固剤のＦＡＯＤ活性及びプロテアーゼ活性に対する影響について以下の通り検討した。
【００３９】
操作（ＦＡＯＤ活性に対する影響について）
Ａ：10mM−リン酸緩衝液（pH8）を用いた各濃度レベル（後述）の抗血液凝固剤溶液にＦＡＯＤを終濃度0.5U/mLとなるように混合し、25℃で3minインキュベートしＦＡＯＤ溶液とした。
Ｂ：30mM-4-AA, 30mM-TODB, 40U/mL-POD, 200μM-糖化アミノ酸溶液をそれぞれ10μLずつ混合し、40μLのＦＡＯＤ活性測定用試薬とした。
Ｃ：160μLのＦＡＯＤ溶液に対し、40μLのＦＡＯＤ活性測定用試薬を添加し、１分間あたりの546nmの吸光度変化を測定して、ＦＡＯＤの残存活性を求めた。
ここでは、糖化アミノ酸濃度は一定であるから、ＦＡＯＤによる反応速度は、ＦＡＯＤの残存活性に比例する。
【００４０】
操作（プロテアーゼ活性に対する影響について）
Ａ：10mM−リン酸緩衝液（pH8）を用いた各濃度レベル(後述）の抗血液凝固剤溶液にプロテアーゼを終濃度0.5mg/mLとなるように混合し、30℃で5minインキュベートしプロテアーゼ溶液とした。
Ｂ：プロテアーゼ溶液にアゾカゼインを終濃度0.1wt%となるように混合し、30℃で5minインキュベートし反応液とした。
Ｃ：200μLの反応液に100μLの15%-トリクロロ酢酸水溶液を加えて反応を停止させた反応液を遠心し未反応のアゾカゼインを沈降させた。
Ｄ：100μLの上澄み液に100μLの500mM-NaOH水溶液を添加し、440nmの吸光度を測定してプロテアーゼ活性測定を行った。
【００４１】
なお、実験は、以下の表１に示す各抗血液凝固剤の、各濃度レベルについて行った。濃度レベルは、一般的に用いられる各抗血液凝固剤濃度を濃度レベル１、濃度レベル１の２．５倍濃度を濃度レベル２、濃度レベル１の１０倍濃度を濃度レベル３、未添加は濃度レベル０として定めた。表中の数字は、手順Ａでのインキュベート時における濃度である。
【表１】
【００４２】
図４に、ＦＡＯＤ活性に対する影響についての結果を、図５に、プロテアーゼ活性に対する影響についての結果を示す。これらの図において、縦軸は、抗血液凝固剤の濃度レベル０の場合のＦＡＯＤ活性を１００％とした場合の、各濃度レベルにおける比活性を示す。
これらの図に示す結果から、ヘパリンは、他の抗血液凝固剤とは異なり、広い濃度範囲でＦＡＯＤとプロテアーゼの活性に影響を与えないことが判る。
【００４３】
なお、以下の手順により、ヘパリンのＢＯＤ活性に対する影響も調べた。
操作（ヘパリンのＢＯＤ活性に対する影響について）
Ａ：10mM−リン酸緩衝液(pH8)を用いヘパリン濃度0, 0.01, 0.1mg/mLの各溶液にＢＯＤを終濃度2U/mLとなるように混合し、30℃で5minインキュベートしてＢＯＤ溶液とした。
Ｂ：100μLのＢＯＤ溶液に100μLの100μM−アスコルビン酸溶液を添加し30℃で5minインキュベートした。
Ｃ：インキュベート後、4℃−5,000×gの遠心条件でスピンカラム(10,000NMWL)にて酵素を除去した。
Ｄ：Ｃで得られた濾液95μLに5μLの3mM−DCIP水溶液を加え、1分間あたりの600nmの吸光度変化によりＢＯＤの残存活性を測定した。
【００４４】
その結果を図６に示す。図６において、縦軸は、ヘパリンの濃度レベル０の場合のＢＯＤ活性を１００％とした場合の、各濃度レベルにおける比活性を示す。
この結果から、ヘパリンはＢＯＤ活性にも影響を与えないことがわかった。
【００４５】
５．ＦＡＯＤ固定化ポリマーのプロテアーゼ耐性（酵素電極を用いた電気化学測定）
次に、酵素電極式センサチップを作成して、プロテアーゼ存在下でＦＡＯＤの活性を損なうことなく糖化アミノ酸の酸化反応を行わせることができる条件について検討した。
図７に、作成したセンサチップの構成を示す。（ａ）は平面図を、（ｂ）は（ａ）のＡ−Ａ線における端面図を示す。
【００４６】
図７に示すように、センサチップ１には、絶縁基板１１上に銀箔にて各電極２〜１０の配線下地１２が形成されている。
また、作用極２、対極３、これらの電極からの電気信号を検出するための接続電極５，６、および、作用極２及び対極３と接続電極５，６とをそれぞれ接続する配線電極８，９が、配線下地１２上に、カーボンペーストを用いてスクリーン印刷により形成されている。
【００４７】
さらに、参照極４、参照極４からの電気信号を検出するための接続電極７、および参照極４と接続電極７とを接続する配線電極１０が、配線下地１２上に銀塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）ペーストを用いてスクリーン印刷により形成されている。
そして、各配線電極８〜１０は絶縁材１３にて被覆されると共に、絶縁材１３には作用極２，対極３及び参照極４の露出する試料導入用の開口部１４を設けている。
また、作用極２上には、ＦＡＯＤを後述の方法で人工メディエータと共に固定化する。対極３及び参照極４は、酵素反応に応じた電気信号の取り出しに用いる検出用電極である。
【００４８】
以上の構成を有するセンサチップ１の各接続電極５〜７を、電極間の電圧印加及び電流検出の可能な分析装置に接続し、開口部１４より、作用極２，対極３及び参照極４を覆うように試料を滴下することにより、ＦＡＯＤによる酸化反応量に応じた電流信号が得られる。なお、図７（ａ）では、開口部１４に露出している作用極２、対極３及び参照極４の部分にハッチングを付した。
【００４９】
次に、ＦＡＯＤの作用極２上への固定化方法及びその効果について説明する。
まず、１つの実施例として、水溶性光硬化性樹脂を用いた例について説明する。
この例では、感光基としてアジド基を有する光硬化性ポリビニルアルコール樹脂である東洋合成工業株式会社製のＡＷＰ（Azide-unit pendant Water-soluble Photopolymer）の２ｗｔ％水溶液に、１Ｕ／ｍＬのＦＡＯＤと、ＦＡＯＤの安定化剤としてトレハロース２０ｍＭ（終濃度）と、人工メディエーターであるm-PMS（1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate)２ｍＭ（終濃度）とを溶解した酵素溶液３μＬを作用極２上に滴下し、室温にて送風乾燥後、１００ｍＪ／ｃｍ２の紫外光にてＡＷＰを硬化することにより、ＦＡＯＤを作用極２上に固定化した。
【００５０】
そして、この作用極２を有するセンサチップ１を用いて、以下の電気化学測定を行い、プロテアーゼ存在下での糖化タンパク質濃度検出性能を評価した。
手順
Ａ：以下の表２に示す濃度で糖化アミノ酸及びプロテアーゼを含む試料を調製した。溶媒としては、標準管理血清（日水製薬製の生化学検査用凍結乾燥血清「コンセーラ」を添付処方に従い復水した血清）を用いた。
【表２】
Ｂ：Ａで調製した試料１０μＬを、センサチップ１の作用極２、対極３及び参照極４の全体を覆うように滴下し、２５℃で３分間インキュベートした。
Ｃ：インキュベート後、作用極２と参照極４の間に＋２５ｍＶの電圧を印加し、１００秒後に、作用極２と対極３との間の電流値を測定した。
【００５１】
図８に、その結果を示す。縦軸の単位はナノアンペアである。
この図からわかるように、試料中の糖化アミノ酸濃度に関わらず、プロテアーゼなしの場合（試料１，２）と、プロテアーゼありの場合（試料３，４）とで、ほぼ変わらない測定値が得られた。
このことから、ＦＡＯＤを電極に固定化するためのポリマーとして水溶性光硬化性樹脂ＡＷＰを用いることで、反応系内にプロテアーゼが共存してもＦＡＯＤ活性を損なうことなく糖化アミノ酸濃度が測定可能であることが判る。
【００５２】
次に、比較例として、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）を用いた例について説明する。
この例では、２ｗｔ％−ＡＷＰ水溶液の代わりに１ｗｔ％−ＣＭＣ水溶液を用い、光硬化工程を除いては上述のＡＷＰを用いる例の場合と同様な操作を行ってセンサチップを作製した。そして、表２に示した各試料につき、上述の例と同様に電流値を測定した。
【００５３】
図９に、その結果を示す。
この図からわかるように、プロテアーゼ存在下（試料３，４）では、ＦＡＯＤの基質となる糖化アミノ酸が存在しても、糖化アミノ酸が存在しない場合に比べて電流値が上昇しなかった。
このことから、ＦＡＯＤを電極に固定化するためのポリマーとしてＣＭＣを用いた場合、プロテアーゼ共存下でＦＡＯＤは失活してしまい、ＣＭＣはＦＡＯＤ固定化ポリマーとして適さない事が判る。
【００５４】
６．ＦＡＯＤ固定化ポリマーのプロテアーゼ耐性（酵素電極を用いた電気化学測定の別の例）
ＦＡＯＤを電極に固定化するポリマーにつき、他のポリマーについての検討も行った。ここで述べる実験では、図７に示したようなセンサチップ上ではなく、チューブ内でＦＡＯＤ活性の測定を行った。
【００５５】
ここではまず、ＢＡＳ社製の電気化学測定用白金電極（白金電極径：３ｍｍ、外周径：６ｍｍ）上に５０Ｕ／ｍＬのＦＡＯＤのＰＢＳ（phosphate-buffered saline）溶液（ｐＨ７．４）を５μＬ滴下し室温にて送風乾燥した。その後、ＦＡＯＤ固定化ポリマー溶液としてフッ素樹脂とパーフルオロスルホン酸樹脂との共重合物質で固体高分子電解質であるナフィオン（登録商標）をイソブチルアルコールと純水の混合溶媒中に２０ｗｔ％溶解した溶液２０μＬを、上記の送風乾燥後の電気化学測定用白金電極のうち白金電極部とその外周を覆うように滴下し、室温にて送風乾燥することでＦＡＯＤを固定化した作用極を作製した。なお、この例では、酵素反応に応じて生成する過酸化水素濃度を測定するため、人工電子メディエータは用いていない。また、上記のナフィオン溶液としては、Aldrich社のNafion perfluorinated resin solution（型番527122）を用いた。
【００５６】
以上の作用極に対し、対極に白金ワイヤーを、参照極にＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用い、５ｍＬの緩衝液中で作用極と参照極間に＋６００ｍＶを印加し、緩衝液中に糖化アミノ酸を添加しない場合と、糖化アミノ酸１ｍＭ、２ｍＭで添加した場合とについて、応答電流値を測定した。緩衝液は１０ｍＭ−Ｔｒｉｓバッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８）で、バッファー中に５０ｍｇ／ｍＬのプロテアーゼを添加した系と添加しない系での応答電流値の差異を調べた。
【００５７】
結果を図１０に示す。縦軸は、プロテアーゼ添加有り／無しのそれぞれについて、糖化アミノ酸を添加しない場合の応答電流値を０とした、各糖化アミノ酸濃度における応答電流値の相対値を示している。
この図からわかるように、プロテアーゼなしの場合と、プロテアーゼありの場合とで、糖化アミノ酸濃度に応じてほぼ変わらない増加電流値が得られた。
このことから、ＦＡＯＤ固定化ポリマーとして固体高分子電解質であるナフィオンを用いた場合も、反応系内にプロテアーゼが共存してもＦＡＯＤ活性を損なうことなく糖化アミノ酸濃度が測定可能であることが判る。
【００５８】
以上の図８乃至図１０に示した結果から、全てのポリマーがＦＡＯＤ固定化ポリマーとして有効であるわけではなく、一部のポリマーのみが有効であることが判る。
ＡＷＰは光硬化性樹脂であり、硬化に伴い３次元結合が生成し編み目構造となる。またナフィオン膜はミクロポーラス構造を有することが知られている。これらのポリマーをＦＡＯＤ固定化膜として用いた際にプロテアーゼ耐性を有する原因は明確ではないが、これらのポリマー膜の孔径が約２万７千程度の分子量であるプロテアーゼの有効断面積よりも小さいことに起因するものと考えられる。一方、比較例として示したＣＭＣ等の水溶性高分子は、水溶液中で大きく膨潤するため、膜中にプロテアーゼが進入し、ＦＡＯＤが失活するものと考えられる。
【００５９】
更に、ナフィオン膜はカチオン輸送性を有することが知られており、アニオンのバリア膜としての機能を有することから、本発明の糖化タンパク質濃度測定方法において、試料中に含まれるアスコルビン酸、尿酸、ビリルビン等のアニオン性の検出妨害物質の影響を除去することが可能であり、後述する本発明のバイオセンサに於いて前処理工程での検出妨害物質除去工程を除く事が可能となる。
【００６０】
なお、発明者は、ＦＡＯＤ固定化用ポリマーとして、感光基としてスリチルピリジニウム基を有する光硬化性ポリビニルアルコール樹脂であるＳＰＰ樹脂を用いた実験も行った。
具体的には、ＳＰＰ樹脂として東洋合成工業株式会社製のＳＰＰ−Ｈ；樹脂固形分１１．５ｗｔ％水溶液を用い、２３０ｍｇのＳＰＰ樹脂水溶液と８０Ｕ／ｍＬのＦＡＯＤ溶液１００μＬを混合した溶液を、上記６．の実験例で用いた白金電極上に５μＬ滴下し室温にて送風乾燥した。その後１００ｍＪ／ｃｍ２の紫外光にてＳＰＰを硬化し、ＦＡＯＤを固定化した作用極を作製した。この作用極を用いて上記６．の実験例と同様の実験を行った結果、ＦＡＯＤ固定化用ポリマーとしてナフィオン（登録商標）を用いた場合と同様の結果を得た。
【００６１】
７．前処理部を備えた酵素電極式センサチップを用いた電気化学測定
次に、この発明のバイオセンサの一実施形態である前処理部を備えた酵素電極式センサチップと、そのセンサチップを用いた糖化タンパク質濃度測定方法について説明する。
まず、図１１に、前処理部を備えた酵素電極式センサチップの構成を示す。（ａ）はセンサチップの平面図、（ｂ）は（ａ）の状態から天板を取り外した状態を示す平面図、（ｃ）は（ａ）のＡ−Ａ線における断面図である。
【００６２】
このセンサチップ２０は、絶縁性基板２１上に電極系２２，接続電極２３，配線電極２４及び絶縁膜２５を形成し、さらにその上にスペーサ２６を形成して、スペーサ２６により絶縁性基板２１と天板２７とを貼り合わせた構成である。
また、電極系２２は、作用極２２ａ，対極２２ｂ及び参照極２２ｃを有し、これらの電極２２ａ〜２２ｃは、それぞれ配線電極２４により、対応する接続電極２３と接続されている。そして、３つの接続電極２３を適当な測定装置に接続することにより、外部から電極系２２を構成する電極間に電圧を印加したり、電極間の電流を検出したりすることができる。
【００６３】
また、天板２７の下面（図に表れている面と反対側の面）は空気孔２８の部分を除いて平面であるが、スペーサ２６には窪みを設けてある。そして、天板２７と絶縁性基板２１とを貼り合わせた状態では、スペーサ２６の窪みと天板２７の下面で、試料を吸引し、また電極系２２に導くための空洞を形成している。
【００６４】
この空洞は、開口部３１と、前処理部３２と、流路３３とを有する。そして、開口部３１を液体試料に触れさせることにより、表面張力により試料を開口部３１より前処理部３２に吸引することができる。この前処理部３２が吸引空洞である。また、空気孔２８が前処理部３２と流路３３の間に設けてあり、流路３３には空気孔がないため、センサチップ２０に特に力を加えない状態では、試料は前処理部３２より奥までは吸引されない。しかし、遠心機等により、前処理部３２の試料に対して図で右側に力を加えることにより、試料を流路３３に導くことができる。この流路３３が分析空洞である。
【００６５】
また、前処理部３２（開口部３１から前処理部３２に向かう流路上も含む）には、前処理部３２での処理に使用する酵素や試薬を担持させた不織布３４を配置している。そして、開口部３１から吸引した試料が前処理部３２の不織布３４に接触すると、不織布３４に担持されていた酵素や試薬が試料に溶解し、試料に対し、前処理が行われる。この前処理としては、ここまで説明してきたプロテアーゼ処理、検出妨害物質除去処理、抗血液凝固剤添加処理が考えられる。
なお、開口部３１まで不織布が存在することと、空気孔２８が前処理部３２のうち開口部３１と反対側にある事により、前処理部３２への定量的な試料の吸引（不織布３４の領域のみ）が可能となっている。
【００６６】
そして、前処理の反応後、試料を流路３３の電極系２２に導き、作用極２２ａに固定化したＦＡＯＤと反応させ、その反応の状態を、電気化学的方式で検出する。より具体的には、作用極２２ａと参照極２２ｃとの間に電圧を印加して、作用極２２ａと対極２２ｂとの間に流れる電流値を検出する。そして、この電流値を検量線に当てはめることにより、試料中の糖化タンパク質濃度を測定することができる。
【００６７】
以上のようなセンサチップ２０は、例えば以下の手順で作製することができる。
まず、絶縁性基材２１上に電極系２２、接続電極２３及び配線電極２４のパターン全体をＡｇペーストを用いてスクリーン印刷等により形成する。その後、そのＡｇパターンを覆う形でカーボンペーストを用いてスクリーン印刷等により作用極２２ａ、対極２２ｂと接続電極２３を形成する。同様に、Ａｇ／ＡｇＣｌペーストを用いて参照極２２ｃを形成する。Ａｇペースト、カーボンペースト、Ａｇ／ＡｇＣｌペースト等の導電性インクは印刷後、１２０℃から１５０℃で加熱し溶媒を揮発させることで安定な電極膜となる。
そして、以上の電極を形成後、電極系２２及び接続電極２３上を除く部分に（これらの電極の部分を開口部として）、絶縁膜２５を熱硬化性ポリエステル系樹脂や光硬化性アクリル系樹脂等を用いてスクリーン印刷等により形成する。熱硬化性ポリエステル系樹脂は加熱により、光硬化性アクリル系樹脂は光照射により樹脂が硬化し安定な絶縁膜となる。
【００６８】
その後、作用極２２ａに対し、ＦＡＯＤの固定化処理を行う。
具体的には、作用極２２ａ上に３．３ｍＵ／μＬのＦＡＯＤ，６．７ｎｍｏｌ／μＬのｍ−ＰＭＳ，１６６．７ｎｍｏｌ／μＬのトレハロースを２ｗｔ％のＡＷＰ水溶液に溶解した酵素溶液２．８μＬを滴下する。その後、室温にて送風乾燥し、１００ｍＪ／ｃｍ２の紫外光にてＡＷＰを硬化し、作用極２２ａ上にＦＡＯＤを固定化する。
なお、トレハロースは、ＦＡＯＤの安定化剤として添加するものである。発明者によるＦＡＯＤの高温保存試験（７０℃、１０日）において、トレハロースの添加によるＦＡＯＤ活性の保持が確認されている。同条件でトレハロース無添加の場合、ＦＡＯＤは失活した。
【００６９】
次に、適当な形状に成型したＰＥＴ基材の上下に接着層を設けたスペーサ２６を絶縁性基板２１上に配置し、前処理部３２と流路３３を形成する。
その後、前処理部３２に、必要な酵素や試薬を担持させた不織布３４を配置する。
【００７０】
この不織布３４は、それぞれ前処理用の以下の酵素／試薬溶液を滴下し、凍結乾燥して、必要な酵素や試薬を担持させた３枚の不織布３４ａ〜ｃを、図１２に示すように重ね合わせ、打ち抜き等により前処理部３２のサイズに切断して作製することができる。
なお、前処理部３２に導入された試料が遠心工程を経て効率よく電極系２２に移動できるようにするために、不織布としては、繊維自体は吸水性を持たないポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレン繊維からなるもので、表面に親水処理を施したものを用いると良い。ここでは、不織布３４ａ〜３４ｃとして、シンワ化学株式会社製の親水処理済みポリエステル不織布を用いた。
【００７１】
担持させる酵素及び試薬（センサチップ１枚当たりの担持量）
不織布３４ａ：プロテアーゼ（Subtilisin A）１７５Ｕ
不織布３４ｂ：ヘパリン０．０３５μｇ及びＢＯＤ１７．５ｍＵ
不織布３４ｃ：ＰＯＰＳＯ３５ｎｍｏｌ及びＮａＯＨ０．８４μｍｏｌ
【００７２】
不織布３４ａに担持させるプロテアーゼは、図１に示した実験結果に従って選択した。
不織布３４ｂに担持させる抗血液凝固剤（ヘパリン）及び妨害物質除去酵素（ＢＯＤ）は、図３乃至図５に示した実験結果に従って選択した。
不織布３４ｃに担持させる試薬は、試料のｐＨを前処理部３２における反応に好適なｐＨ及び塩濃度に調整するための試薬である。
【００７３】
このような不織布３４を配置し、前処理部３２に吸引した試料をこの不織布３４の各断片３４ａ〜３４ｃに浸透させる（ここでは同時に浸透させるようにした）ことにより、各断片３４ａ〜３４ｃに担持された試薬や酵素を試料に溶解させ、試料に対し、その試薬や酵素を用いた処理を行うことができる。
なお、酵素を複数前処理部３２に配置する必要がある場合、それら個々の酵素の保存に適したｐＨが異なる場合がある。その場合は、至適ｐＨの異なる酵素はそれぞれ異なる不織布に担持させるとよい。
【００７４】
また、保存に適したｐＨが同じであっても、プロテアーゼ（本実施形態では必須）と他の酵素を同時に不織布に担持することは難しい（他の酵素が分解されてしまうため）。従って、プロテアーゼと他の酵素は異なる不織布に担持する。
さらに、保存に適したｐＨと反応に適したｐＨが異なる酵素もある。その場合は、保存に適したｐＨにて酵素を担持し、異なる不織布に、試料が浸透した際に、その酵素の反応に適したｐＨとなるようなｐＨ調整用試薬を担持させるとよい。
このように、不織布を複数枚用いるこにより、前処理部３２で行わせる反応の設計に高い自由度を得ることができる。
【００７５】
また、前処理部３２から電極系２２に至るまでの流路３３に、２０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）にクエン酸８０ｎｍｏｌ／μＬを溶解したｐＨ調整液１．７５μＬを滴下して乾燥させ、ｐＨ調整部を形成する。試料がこのｐＨ調整部を通過する際、乾燥状態の試薬が溶け込むため、電極系２２に達する試料のｐＨを、ＦＡＯＤの反応に好適なｐＨ８程度に調整することができる。
以上の後、天板２７をスペーサ２６上に貼り合わせることにより、センサチップ２０が完成する。
【００７６】
なお、サイズの一例として、ここでは、試料溶液を前処理部３２に３．５μＬ吸引する構成とするため、絶縁性基材２１として２５０μｍ厚のＰＥＴ（Polyethylene terephthalate）基材を用い、開口部３１を幅２ｍｍ、流路３３は開口部３１から流路端部まで長さ２０ｍｍとした。また、作用極２２ａは面積２．８ｍｍ２、対極２２ｂは面積８．６ｍｍ２、参照極２２ｃは面積２．８ｍｍ２、空気孔２８は０．５ｍｍφとした。
また、スペーサ２６はＰＥＴ基材と上下の接着層を合わせて１８０μｍ厚、前処理部３２は空隙率８０％の不織布３４を配置することを考慮して、総厚１８０μｍ、面積２４．２５ｍｍ２とした。上述の試薬量は、このサイズに合わせて定めたものである。
【００７７】
次に、このようにして作製したセンサチップ２０を用いた糖化タンパク質（フルクトサミン）濃度の測定例を示す。
測定は、以下の手順で行った。なお、管理血清中の糖化タンパク質濃度は、和光純薬工業社（Wako Pure Chemical Industries, Ltd）の「オートワコー フルクトサミン」を用いたＦＯＤ−ＴＯＯＳ法により予め別途測定した。
Ａ：糖化タンパク質濃度が既知の管理血清試料３．５μＬを吸引口３１より自発吸引させ、２５℃で３分間インキュベートし前処理を行った。
Ｂ：その後６００Ｇで３０秒間遠心力を加えて前処理後の試料を流路３３を介して電極系２２の方向へ移動させた。
Ｃ：２５℃で３分間インキュベート後、作用極２２ａと参照極２２ｃの間に＋２５ｍＶの電圧を印加し、１００秒後の作用極２２ａと対極２２ｂの間の電流値を測定した。
【００７８】
図１３に、以上の測定の結果得られた糖化タンパク質濃度と電流値との関係を示す。
この図からわかるように、センサチップ２０による測定結果は、糖化タンパク質濃度と電流値とが高い直線性を示す。このため、センサチップ２０によれば、検出電流値に基づいて高い精度で糖化タンパク質濃度を検出できると言える。
この場合において、前処理で用いたプロテアーゼを不活性化したり除去したりする操作が必要ないため、簡単な操作かつ短時間で、精度のよい測定結果を得ることができる。
【００７９】
また、全血の試料を用いて同じ手順で測定を行った場合でも、ＦＯＤ−ＴＯＯＳ法による測定結果と、センサチップ２０を用いた測定結果との対応関係は、管理血清試料を用いた場合と同様なものであった。従って、試料に血球が含まれた状態で前処理を行っても、糖化タンパク質濃度の測定結果に影響はないと考えられる。
【００８０】
以上で実施形態及び実施例の説明を終了するが、この発明は、これに限られることはない。具体的なバイオセンサの構成、使用する試薬、測定する試料、測定方法等が、これに限られないことはもちろんである。
例えば、酵素と共に作用極に固定するメディエーターとしてｍ−ＰＭＳ以外の物質を用いることが可能である。発明者は、実験により、図１１に示したセンサチップ２０においてｍ−ＰＭＳの代わりに塩化ヘキサアンミンルテニウム（II）を用いた場合でも、糖化アミノ酸濃度に応じた電流値の検出を確認している。
【００８１】
また、センサチップ２０において作用極２２ａを白金電極とし、上記６．で説明したように固体高分子電解質を用いてここのＦＡＯＤを固定化すれば、メディエータを用いなくても糖化タンパク質濃度の測定が可能である。その際は、作用極２２ａはカーボン電極より白金電極にする方が好ましい。過酸化水素が酸化される際の電子の授受が、カーボンよりも白金の方が行われやすいため、高い電流値が得らるからである。
また、上述の実施形態における電気化学測定は、作用極、参照極及び対極を用いる３電極法で行っている。しかし、作用極と対極を用いる２電極法でも測定は可能である。その際は、作用極と対極間に電位を印加し、それらの電極間に流れる電流値を測定すればよい。
【００８２】
また、検査妨害物質の除去剤として、センサチップ２０にはＢＯＤのみを配置したが、これに代えてＡＳＯＤを配置したり、これらに加えて、アスコルビン酸やビリルビンと同様なアニオン性の検出妨害物質である尿酸を除去するためにウリカーゼを配置したりすることも考えられる。
【００８３】
また、センサチップ２０において、分光方式でＦＡＯＤの反応量を測定することも可能である。この場合、流路３３中に透明の窓部を設けると共に、ｐＨ調整部の如く、上述の１．や２．で説明した酵素溶液で用いた４−ＡＡ，ＴＯＤＢ，ＰＯＤ，ＦＡＯＤを窓部付近に乾燥状態で配置しておくとよい。そして、試料にこれらの試薬が溶解し、反応することによって生成される色素を、546nmの吸光度を測定することにより定量し、色素生成量からＦＡＯＤが触媒した酸化反応の量を求めることができる。そして、この酸化反応の量に基づき、試料中の糖化タンパク質濃度を求めることができる。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
以上説明してきたように、この発明による糖化タンパク質濃度測定方法又はバイオセンサによれば、簡単な操作かつ短時間で試料中の糖化タンパク質濃度を定量することができる。
従って、この発明を適用することにより、例えば、臨床診断分野の血液検査で使用できる、簡便な分析器具を提供することができる。糖化タンパク質の血中濃度は、糖尿病の症状の診断及び管理の重要な指標となり得ることから、このような分析器具は、糖尿病の症状の診断及び管理に関する有用なツールとなることが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】プロテアーゼSubtilisin Aについて糖化アルブミンとの反応性を評価した実験の結果を示す図である。
【図２】プロテアーゼSubtilisin Aについて活性のｐＨ依存性を評価した実験の結果を示す図である。
【図３】ＡＳＯＤ及びＢＯＤについて活性のｐＨ依存性を評価した実験の結果を示す図である。
【図４】抗血液凝固剤のＦＡＯＤ活性に対する影響を評価した実験の結果を示す図である。
【図５】抗血液凝固剤のプロテアーゼ活性に対する影響を評価した実験の結果を示す図である。
【００８６】
【図６】ヘパリンのＢＯＤ活性に対する影響を評価した実験の結果を示す図である。
【図７】ポリマーのプロテアーゼ耐性の評価に用いたセンサチップの構造を示す図である。
【図８】図７に示したセンサチップを用いたＡＷＰのプロテアーゼ耐性を評価する実験の結果を示す図である。
【図９】同じく、ＣＭＣのプロテアーゼ耐性を評価する実験の結果を示す図である。
【図１０】チューブ内でナフィオンのプロテアーゼ耐性を評価した実験の結果を示す図である。
【００８７】
【図１１】この発明のバイオセンサの実施形態であるセンサチップの構造を示す図である。
【図１２】図１１に示したバイオセンサに設ける不織布の構成をより詳細に示す図である。
【図１３】図１１に示したバイオセンサを用いた糖化タンパク質濃度の測定結果を示す図である。
【符号の説明】
【００８８】
１，２０：センサチップ、２，２２ａ：作用極、３，２２ｂ：対極、
４，２２ｃ：参照極、５〜７，２３：接続電極、８〜１０，２４：配線電極、
１１：絶縁基板、１２：配線下地、１３：絶縁材、１４：開口部、２１：絶縁性基板、
２２：電極系、２５：絶縁膜、２６：スペーサ、２７：天板、２８：空気孔、
３１：開口部、３２：前処理部、３３：流路、３４：不織布
【技術分野】
【０００１】
この発明は、液体試料中の糖化タンパク質濃度を測定する糖化タンパク質濃度測定方法及び、このような測定を行うためのバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、特許文献１に記載のように、糖化タンパク質の血中濃度が過去の一定期間の平均血糖値を反映しており、その血中濃度の測定値が、糖尿病の症状の診断及び管理の重要な指標となり得ることが知られている。
また、特許文献１には、この糖化タンパク質の血中濃度を、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）を利用して測定する方法が開示されている。また、その測定を行う際、ＦＡＯＤと試料とを反応させる前に、プロテアーゼにより試料を前処理して糖化タンパク質を糖化ペプチド及び糖化アミノ酸に分解しておくことにより、ＦＡＯＤの反応速度を高め、糖化タンパク質の検出感度を高めることができることも開示されている。
【特許文献１】国際公開第９８／４８０４３号パンフレット
【０００３】
一方、０．３〜１０μＬ（マイクロリットル）程度の液体試料をセンサユニット内に吸い上げ、センサユニット内部で種々の試薬により試料を処理してその反応を計測することにより、試料の分析を行う手法が種々提案されている。また特に、試薬として酵素を用い、酵素の基質特異性を利用して試料中の特定の物質の濃度を測定可能なバイオセンサは、種々の物質を含む生体試料の分析に適するため、医療用の検査機器を始め、様々な分野で用いられるようになっている。
【０００４】
このようなバイオセンサとしては、例えば特許文献２に記載のものが知られている。
特許文献２には、ヒトの全血のサンプルからグルコース濃度を測定する電気化学のバイオセンサが簡易血糖値計として開示されている。バイオセンサには試料の吸引口があり、検査試料である全血をこの吸引口に加えると、全血は毛細管現象により毛細管状充填室に引き込まれる。そして、毛細管状充填室の奥に空気口が形成されているために、空気を逃がしながら毛細管状充填室を全血で満たすことができる。また、この毛細管状充填室には作用電極と対電極が配置されていて、血球成分を含んだ全血の状態でグルコース濃度に相関した電流測定値を得て、簡易的に血糖値を測定できる構造になっている。
【特許文献２】特開２００２−３１０９７３号公報（第６−８頁）
【０００５】
また、微量の血液試料を分析する装置としては、特許文献３に記載のものも知られている。
特許文献３には、遠心操作により血漿分離が可能な血液分析装置において、血液試料の流路に、遠心分離時の遠心方向に血球成分が溜まる部分を配置し、そこに遠心分離により血球成分を集積させ、血漿成分が上清みとなるように遠心分離することが開示されている。この血液分析装置では、試料となるヒト全血の導入のために、排出口に外部ポンプを取り付けて、血液吸引口から吸引負圧によって全血を引き込んでいる。また、遠心分離後の血漿成分の移動も同様に、外部ポンプによる吸引負圧によって分析位置に導かれる構造になっている。
【特許文献３】特開２００４−１０９０８２号公報（第６−９頁）
【０００６】
また、バイオセンサとしては、特許文献４に記載のものも知られている。
特許文献４には、酵素反応層における電気化学的な反応検出を妨害する物質を除去するための妨害物質除去部を試料の供給部に設けることにより、反応検出について安定的な応答が得られるようにすることが開示されている。なお、妨害物質とは、具体的には還元性物質を指し、妨害物質除去部は、これを酸化する物質を配置することにより形成されるものである。
【特許文献４】特公平８−２０４００号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ところで、特許文献１にも記載されているが、従来知られている分析法では、試料をプロテアーゼにより前処理する場合、前処理後の試料をＦＡＯＤと反応させる前にプロテアーゼを不活性化させておかないと、ＦＡＯＤ自身がプロテアーゼにより分解されてしまい、結果として糖化タンパク質の検出感度が低下してしまう。
そしてこのため、従来知られている方法では、高感度の検出結果を得るためには、試料をプロテアーゼにて処理した後にそのプロテアーゼを不活性化あるいは除去するといった面倒な手順が必要となり、分析を簡単な操作かつ短時間で行うことが難しかった。
特許文献２乃至４においても、プロテアーゼに対する対策については、特に記載されていない。
【０００８】
この発明は、このような問題を解決し、簡単な操作かつ短時間で試料中の糖化タンパク質濃度を定量できるようにすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者は、試料をプロテアーゼで処理して得た分解生成物質を特定の酵素と反応させることにより上記試料中の糖化タンパク質濃度を定量する場合において、上記試料をプロテアーゼにより前処理した後、その試料を適当なポリマーにより固定化した上記特定の酵素と反応させ、その反応の状態を検出するようにすれば、プロテアーゼ処理後にプロテアーゼの不活性化や除去を行わなくても、上記試料中の糖化タンパク質濃度を定量可能であることを見出した。
本発明は、このような手法により試料中の糖化タンパク質濃度を定量する糖化タンパク質濃度測定方法を提供する。
【００１０】
なお、上記のポリマーとしては、水溶性光硬化性樹脂や固体高分子電解質、特に、感光基としてアジド基あるいはスリチルピリジニウム基を有する光硬化性ポリビニルアルコール樹脂及び、フッ素樹脂とパーフルオロスルホン酸樹脂との共重合物質である固体高分子電解質が有用であった。
また、上記の定量に用いる特定の酵素の具体例としては、濃度を測定しようとする糖化タンパク質のプロテアーゼ分解物質を基質とするフルクトシルアミノ酸酸化酵素（ＦＡＯＤ）が考えられる。
【００１１】
また、上記試料と上記特定の酵素との反応の状態の検出は、電気化学方式又は分光方式で行うことができる。
このうち、検出を電気化学方式で行う場合、上記試料を、上記水溶性光硬化性樹脂により人工電子メディエータと共に電極上に固定した前記特定の酵素と反応させ、反応の状態を、上記特定の酵素を固定した電極と、所定の検出用電極との間の電流値により検出することができる。この場合、人工電子メディエータとしては、例えばｍ−ＰＭＳ（1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate)やルテニウム（Ｒｕ）錯体を用いることができる。
【００１２】
また、上記試料を、上記固体高分子電解質により白金電極上に固定した前記特定の酵素と反応させ、反応の状態を、上記特定の酵素を固定した白金電極と、所定の検出用電極との間の電流値により検出することもできる。
また、上記の前処理において、上記プロテアーゼにより前記試料に含まれる糖化タンパク質を分解する分解工程に加え、上記試料に含まれる、上記特定の酵素との反応の検出を妨害する妨害物質を除去する処理を行うとよい。この妨害物質としては、例えばアスコルビン酸、ビリルビン、尿酸等が考えられ、それぞれ試料にアスコルビン酸オキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ウリカーゼを添加することにより除去することができる。
【００１３】
また、上記前処理において、上記試料のｐＨ及び塩濃度を上記特定の酵素の反応に適した値に調整する処理を実行するようにしてもよい。この処理は、例えばｐＨ及び塩濃度調整用の塩を試料に添加して行うことができる。
また、試料が血液である場合、上記前処理において、上記試料に抗血液凝固剤を添加する処理を実行するようにしてもよい。抗血液凝固剤としては、例えばクエン酸ナトリウム、ヘパリン、あるいはＥＤＴＡ（ethylenediaminetetraacetic acid）・２Ｋを用いることが考えられるが、反応検出への影響を考慮すると、ヘパリンが特に好適であった。
【００１４】
これらの妨害物質除去、ｐＨ及び塩濃度調整、および抗血液凝固剤添加は、複数組み合わせて行ってもよい。また、これらの処理に使用する酵素又は試薬を、それぞれ不織布の異なる断片に担持させておき、試料をその各断片に浸透させることにより行ってもよい。
【００１５】
また、この発明は、毛細管現象によって試料を吸い上げる吸引空洞と、その吸引空洞と連続する分析空洞とを備えたバイオセンサであって、上記吸引空洞にプロテアーゼを備え、上記分析空洞に、上記試料のプロテアーゼ処理による分解生成物と反応させる特定の酵素を、ポリマーにより固定化した状態で備え、上記分析空洞に、上記特定の酵素による反応の状態を外部から検出可能とするための電極又は透明部をさらに備え、上記特定の酵素を固定化しているポリマーが水溶性光硬化性樹脂又は固体高分子電解質としたバイオセンサも提供する。
このようなバイオセンサは、上述の糖化タンパク質濃度測定方法による糖化タンパク質濃度測定に有用である。
【発明の効果】
【００１６】
以上のようなこの発明による糖化タンパク質濃度測定方法によれば、簡単な操作かつ短時間で試料中の糖化タンパク質濃度を定量することができる。
また、この発明のバイオセンサによれば、このような糖化タンパク質濃度測定方法による糖化タンパク質濃度測定を簡単な操作かつ短時間で行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、この発明を実施するための最良の形態につき説明する。
ここでは、血清試料中の糖化タンパク質濃度を、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）を利用して測定する方法について説明するが、測定対象の試料や用いる酵素等がこれに限られないことは、もちろんである。
【００１８】
１．プロテアーゼの選定
まず、糖化タンパク質濃度を測定する試料の前処理に好適なプロテアーゼについて検討を行った。国際公開第９８／４８０４３号パンフレットに記載の通り、ＦＡＯＤを利用して糖化タンパク質濃度の検出を行う場合、ＦＡＯＤと試料とを反応させる前に、プロテアーゼにより試料を前処理して糖化タンパク質を糖化ペプチド及び糖化アミノ酸に分解しておくことにより、ＦＡＯＤの反応速度を高め、糖化タンパク質の検出感度を高めることができる。
【００１９】
そこで、糖化タンパク質を含む血清試料を種々のプロテアーゼで処理し、ＦＡＯＤの反応基質である糖化アミノ酸（フルクトシルアミノ酸：ＦＡ）を効率よく生成するプロテアーゼを選定した。
各プロテアーゼの反応性評価は、以下の通り行った。
【００２０】
試薬の調整
＜プロテアーゼ溶液＞
10mM pH8 リン酸緩衝液
2500U/mL 評価対象のプロテアーゼ
＜管理血清＞
糖化タンパク質を含む管理血清
＜コントロール溶液＞
10mM pH8 リン酸緩衝液
＜酵素溶液＞
72mM 4-AA（4-アミノアンチピリン) 20μL
72mM TODB（N,N-Bis(4-sulfobutyl)-3-methylaniline, disodium salt） 20μL
40U/mL POD（ペルオキシダーゼ） 20μL
100U/mL FAOD(フルクトシルアミノ酸酸化酵素）20μL
計80μL
【００２１】
なお、「Ｕ」は「ユニット」の意味である。
また、ＦＡＯＤとしては、特開２００４−２７５１６８号公報に記載の、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．Ｎ１−１株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター 寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７３２６）由来のフルクトシルアミン酸化酵素（フルクトシルアミノ酸酸化酵素としての活性を有する）を用いた。以下の実験でも特に断らない限り同様である。
【００２２】
操作
Ａ：評価対象のプロテアーゼを含むプロテアーゼ溶液225μLに管理血清15μLを加え、37℃にて種々の時間インキュベートした。
Ｂ：インキュベート後、4℃−5,000×gの遠心条件でスピンカラム(10,000NMWL)にてプロテアーゼを除去した（「NMWL」は分画分子量を示す）。
Ｃ：Ｂで得られた濾液140μLに酵素溶液80μLを加え反応溶液とし、546nmの吸光度を測定した。
Ｄ：反応溶液を37℃で5minインキュベート後、再度546nmの吸光度を測定した。
Ｅ：コントロール試料として管理血清の代わりにコントロール溶液を用いて上記Ａ〜Ｄを行った。
【００２３】
この操作によるプロテアーゼ反応性の測定原理は以下の通りである。
すなわち、操作Ａにより、血清中の糖化タンパク質をプロテアーゼにより糖化アミノ酸に分解する。その後、プロテアーゼを除去した後、操作Ｃにより、糖化アミノ酸とＦＡＯＤを作用させ、グルコソン、アミノ酸、過酸化水素を生成させる。そして、その過酸化水素はＰＯＤ存在下、４−アミノアンチピリンとＴＯＤＢとを酸化縮合させ、色素を生成させる。そして、546nmの吸光度を測定することにより、色素生成量からＦＡＯＤが触媒した酸化反応の量を求めることができる。
そして、糖化タンパク質の初期濃度が一定であれば、反応量が大きいものほど、プロテアーゼによるＦＡＯＤの反応速度向上及び糖化タンパク質の検出感度向上の効果が大きいことがわかる。
【００２４】
発明者は、種々のプロテアーゼについて上記の評価を行った。しかし、Protease Type I、Achromopeptidase、Kallikrein、Protease Type X （全てsigma社製）については、ほとんど反応性が見られなかった（ＦＡＯＤの反応基質となる糖化アミノ酸（ＦＡ）は生成されなかった）。また、α-Chymotrypsin、Protease Type 24は、多少の反応性が見られたものの、十分とは言えなかった。
一方、Subtilisin A （Sigma社製）については、効率よく糖化タンパク質を分解し、ＦＡＯＤの反応基質となる糖化アミノ酸を生成することが見出された。
【００２５】
図１に、評価対象のプロテアーゼとしてSubtilisin Aを用いた場合の測定結果を示す。図１において、グラフの横軸は、上記操作Ａでのインキュベート時間、縦軸は上記操作Ｄで得られた吸光度と操作Ｃで得られた吸光度との差である。
また、この結果を踏まえ、以後の実験ではプロテアーゼとしてSubtilisin A （Sigma社製）を用いることとした。
【００２６】
２．プロテアーゼ反応に対するｐＨの影響
次に、プロテアーゼ反応の至適ｐＨについて、以下の通り検討した。
【００２７】
試薬の調整
＜プロテアーゼ溶液＞
10mM pH12 POPSO緩衝液
50,000U/mL Subtilisin A （評価対象のプロテアーゼ）
ｐHコントロール試薬：NaOH
POPSO: Piperazine-1,4-bis(2-hydroxy-3-propanesulfonic acid)
＜管理血清＞
糖化タンパク質を含む管理血清
＜酵素溶液＞
72mM 4-AA（4-アミノアンチピリン) 20μL
72mM TODB（N,N-Bis(4-sulfobutyl)-3-methylaniline, disodium salt） 20μL
40U/mL POD（ペルオキシダーゼ） 20μL
100U/mL FAOD(フルクトシルアミノ酸酸化酵素）20μL
計80μL
【００２８】
操作
Ａ：NaOHにて反応場のｐHを変化させた各プロテアーゼ溶液225μLに管理血清15μLを加え、25℃で20minインキュベートした。
Ｂ：インキュベート後、4℃−5,000×gの遠心条件でスピンカラム(10,000NMWL)にてプロテアーゼを除去した。
Ｃ：Ｂで得られた濾液140μLに酵素溶液80μLを加え1分間あたりの546nmの吸光度変化を測定し、その値をＸとした。
Ｄ：コントロール試料として各pHのプロテアーゼ溶液と管理血清の混合溶液をインキュベートせず遠心し、濾液に糖化アミノ酸を終濃度500μMとなるように添加し、酵素溶液80μLを加え1分間あたりの546nmの吸光度変化を測定し、その値をＹとした。
【００２９】
この操作によるプロテアーゼ反応性の測定原理は、上述の１．の場合と同様である。また、各ｐＨでの反応速度は、試料中の糖化アミノ酸濃度に比例する。
そこで、上記の操作で得られた結果を基に、下記の糖化アミノ酸換算式（式１）より各ｐHでプロテアーゼを作用させた際の反応効率を見積もり、これらを比較した。
生成した糖化アミノ酸(μM)＝[Ｘ（ΔAbs./min）／Ｙ（ΔAbs./min）]×500
・・・（式１）
【００３０】
この結果を図２に示す。図２において、横軸はプロテアーゼ溶液のｐＨ、縦軸は（式１）に従って求めた糖化アミノ酸量である。
この結果から、プロテアーゼ反応場のｐHが高いほど、Subtilisin Aにより効率よく糖化タンパク質が分解され、ＦＡＯＤの反応基質である糖化アミノ酸（ＦＡ）が生成されることがわかる。
【００３１】
３．アスコルビン酸酸化酵素（ＡＳＯＤ）及びビリルビン酸化酵素（ＢＯＤ）による
反応妨害物質除去反応に対するｐＨの影響
一般に、血中に含まれるアスコルビン酸やビリルビンといった還元性物質が、酸化酵素と基質との反応を電気化学的に測定する際に、その測定値に影響を与え、ノイズを生じさせる反応妨害物質となることが知られている。
【００３２】
例えば、軽部征夫監修、「ＣＭＣテクニカルライブライブラリー１１３ バイオセンサー」、シーエムシー出版、２００２年５月、ｐ．１５７−１６３に記載されているように、電気化学的に検出する電極活物質として過酸化水素を用いて反応を検出する場合、アスコルビン酸やビリルビンの酸化電位が過酸化水素のそれに近いため、酵素電極での測定電流が、（反応で生成した過酸化水素量＋存在する還元性物質量）に応じた値となり、見かけの電流値が上昇してしまう。
【００３３】
また、このような電流値の上昇を抑制する目的で、過酸化水素より酸化電位の低いメディエータを用いたとしても、還元性物質によりメディエータが還元されてしまい、測定電流が、（反応で生成した還元型メディエータ量＋還元性物質により還元された還元型メディエータ量）に応じた値となり、やはり見かけの電流値が上昇してしまう。
【００３４】
従って、血液試料について、ＦＡＯＤを用いて糖化タンパク質量を電気化学的に測定しようとする場合、試料にアスコルビン酸酸化酵素やビリルビン酸化酵素を添加し、予め血液試料中のアスコルビン酸及びビリルビンを酸化して、これらの物質が測定に影響を与えないようにすることが好ましい。
そこで、アスコルビン酸酸化酵素（ＡＳＯＤ）及びビリルビン酸化酵素（ＢＯＤ）による反応妨害物質除去反応の至適ｐＨについて、以下の通り検討した。なお、ＡＳＯＤもＢＯＤも共にアスコルビン酸を酸化することが知られているため、評価には、反応妨害物質としてアスコルビン酸を用いることとした。
【００３５】
試薬の調整
＜アスコルビン酸溶液＞
0, 25, 50, 100μM アスコルビン酸
10mM POPSO緩衝液
ｐHコントロール試薬：NaOH
＜DCIP（2,6-ジクロロフェノールインドフェノール）溶液＞
3mM DCIP水溶液
＜酵素＞
ＡＳＯＤ（オリエンタル酵母工業株式会社製）
ＢＯＤ（天野エンザイム株式会社製）
【００３６】
操作
Ａ：NaOHにてｐHを変化させた各濃度のアスコルビン酸溶液95μLにDCIP溶液5μLを加え、１分間あたりの600nmの吸光度変化を測定し、各ｐHでのアスコルビン酸の検量線を作成した。
Ｂ：各ｐHの100mMアスコルビン酸溶液に酵素を2U/mLとなるように添加後、25℃で5minインキュベートした。
Ｃ：インキュベート後、4℃−5,000×gの遠心条件でスピンカラム(10,000NMWL)にて酵素を除去した。
Ｄ：Ｃで得られた濾液95μLにDCIP溶液5μLを加え、１分間あたりの600nmの吸光度変化を測定し、Ａで作成した検量線よりアスコルビン酸消費量を評価した。
ＤＣＩＰ水溶液は、アスコルビン酸の存在下では還元されて脱色されるため、吸光度の変化量から、溶液中に存在（残存）するアスコルビン酸の濃度を定量することができる。
【００３７】
以上の結果を図３に示す。図３において、横軸は、アスコルビン酸溶液のｐＨを、縦軸は、操作Ｄで測定した濾液において、酵素添加前のアスコルビン酸溶液に含まれていたアスコルビン酸がどの程度減少していたかを示す。
この結果から、ＡＳＯＤ，ＢＯＤ共に、アスコルビン酸酸化の反応性はｐH依存性があることが判る。また、高ｐＨ条件では、ＢＯＤが高い反応性を示した。従って、前処理にて共存するプロテアーゼの反応の至適ｐHが高いことから、反応妨害物質であるアスコルビン酸除去には酵素としてＢＯＤが好ましいことが判る。
【００３８】
４．抗血液凝固剤の酵素活性に対する影響
血液試料について分析を行う場合、その凝固を防止することが好ましい。そして、凝固を防止するための抗血液凝固剤としては、例えばクエン酸ナトリウム、ヘパリン、ＥＤＴＡ−２Ｋ等が知られている。
そこで、これらの抗血液凝固剤につき、ＦＡＯＤを用いた糖化タンパク質検出への影響を調べるため、抗血液凝固剤のＦＡＯＤ活性及びプロテアーゼ活性に対する影響について以下の通り検討した。
【００３９】
操作（ＦＡＯＤ活性に対する影響について）
Ａ：10mM−リン酸緩衝液（pH8）を用いた各濃度レベル（後述）の抗血液凝固剤溶液にＦＡＯＤを終濃度0.5U/mLとなるように混合し、25℃で3minインキュベートしＦＡＯＤ溶液とした。
Ｂ：30mM-4-AA, 30mM-TODB, 40U/mL-POD, 200μM-糖化アミノ酸溶液をそれぞれ10μLずつ混合し、40μLのＦＡＯＤ活性測定用試薬とした。
Ｃ：160μLのＦＡＯＤ溶液に対し、40μLのＦＡＯＤ活性測定用試薬を添加し、１分間あたりの546nmの吸光度変化を測定して、ＦＡＯＤの残存活性を求めた。
ここでは、糖化アミノ酸濃度は一定であるから、ＦＡＯＤによる反応速度は、ＦＡＯＤの残存活性に比例する。
【００４０】
操作（プロテアーゼ活性に対する影響について）
Ａ：10mM−リン酸緩衝液（pH8）を用いた各濃度レベル(後述）の抗血液凝固剤溶液にプロテアーゼを終濃度0.5mg/mLとなるように混合し、30℃で5minインキュベートしプロテアーゼ溶液とした。
Ｂ：プロテアーゼ溶液にアゾカゼインを終濃度0.1wt%となるように混合し、30℃で5minインキュベートし反応液とした。
Ｃ：200μLの反応液に100μLの15%-トリクロロ酢酸水溶液を加えて反応を停止させた反応液を遠心し未反応のアゾカゼインを沈降させた。
Ｄ：100μLの上澄み液に100μLの500mM-NaOH水溶液を添加し、440nmの吸光度を測定してプロテアーゼ活性測定を行った。
【００４１】
なお、実験は、以下の表１に示す各抗血液凝固剤の、各濃度レベルについて行った。濃度レベルは、一般的に用いられる各抗血液凝固剤濃度を濃度レベル１、濃度レベル１の２．５倍濃度を濃度レベル２、濃度レベル１の１０倍濃度を濃度レベル３、未添加は濃度レベル０として定めた。表中の数字は、手順Ａでのインキュベート時における濃度である。
【表１】
【００４２】
図４に、ＦＡＯＤ活性に対する影響についての結果を、図５に、プロテアーゼ活性に対する影響についての結果を示す。これらの図において、縦軸は、抗血液凝固剤の濃度レベル０の場合のＦＡＯＤ活性を１００％とした場合の、各濃度レベルにおける比活性を示す。
これらの図に示す結果から、ヘパリンは、他の抗血液凝固剤とは異なり、広い濃度範囲でＦＡＯＤとプロテアーゼの活性に影響を与えないことが判る。
【００４３】
なお、以下の手順により、ヘパリンのＢＯＤ活性に対する影響も調べた。
操作（ヘパリンのＢＯＤ活性に対する影響について）
Ａ：10mM−リン酸緩衝液(pH8)を用いヘパリン濃度0, 0.01, 0.1mg/mLの各溶液にＢＯＤを終濃度2U/mLとなるように混合し、30℃で5minインキュベートしてＢＯＤ溶液とした。
Ｂ：100μLのＢＯＤ溶液に100μLの100μM−アスコルビン酸溶液を添加し30℃で5minインキュベートした。
Ｃ：インキュベート後、4℃−5,000×gの遠心条件でスピンカラム(10,000NMWL)にて酵素を除去した。
Ｄ：Ｃで得られた濾液95μLに5μLの3mM−DCIP水溶液を加え、1分間あたりの600nmの吸光度変化によりＢＯＤの残存活性を測定した。
【００４４】
その結果を図６に示す。図６において、縦軸は、ヘパリンの濃度レベル０の場合のＢＯＤ活性を１００％とした場合の、各濃度レベルにおける比活性を示す。
この結果から、ヘパリンはＢＯＤ活性にも影響を与えないことがわかった。
【００４５】
５．ＦＡＯＤ固定化ポリマーのプロテアーゼ耐性（酵素電極を用いた電気化学測定）
次に、酵素電極式センサチップを作成して、プロテアーゼ存在下でＦＡＯＤの活性を損なうことなく糖化アミノ酸の酸化反応を行わせることができる条件について検討した。
図７に、作成したセンサチップの構成を示す。（ａ）は平面図を、（ｂ）は（ａ）のＡ−Ａ線における端面図を示す。
【００４６】
図７に示すように、センサチップ１には、絶縁基板１１上に銀箔にて各電極２〜１０の配線下地１２が形成されている。
また、作用極２、対極３、これらの電極からの電気信号を検出するための接続電極５，６、および、作用極２及び対極３と接続電極５，６とをそれぞれ接続する配線電極８，９が、配線下地１２上に、カーボンペーストを用いてスクリーン印刷により形成されている。
【００４７】
さらに、参照極４、参照極４からの電気信号を検出するための接続電極７、および参照極４と接続電極７とを接続する配線電極１０が、配線下地１２上に銀塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）ペーストを用いてスクリーン印刷により形成されている。
そして、各配線電極８〜１０は絶縁材１３にて被覆されると共に、絶縁材１３には作用極２，対極３及び参照極４の露出する試料導入用の開口部１４を設けている。
また、作用極２上には、ＦＡＯＤを後述の方法で人工メディエータと共に固定化する。対極３及び参照極４は、酵素反応に応じた電気信号の取り出しに用いる検出用電極である。
【００４８】
以上の構成を有するセンサチップ１の各接続電極５〜７を、電極間の電圧印加及び電流検出の可能な分析装置に接続し、開口部１４より、作用極２，対極３及び参照極４を覆うように試料を滴下することにより、ＦＡＯＤによる酸化反応量に応じた電流信号が得られる。なお、図７（ａ）では、開口部１４に露出している作用極２、対極３及び参照極４の部分にハッチングを付した。
【００４９】
次に、ＦＡＯＤの作用極２上への固定化方法及びその効果について説明する。
まず、１つの実施例として、水溶性光硬化性樹脂を用いた例について説明する。
この例では、感光基としてアジド基を有する光硬化性ポリビニルアルコール樹脂である東洋合成工業株式会社製のＡＷＰ（Azide-unit pendant Water-soluble Photopolymer）の２ｗｔ％水溶液に、１Ｕ／ｍＬのＦＡＯＤと、ＦＡＯＤの安定化剤としてトレハロース２０ｍＭ（終濃度）と、人工メディエーターであるm-PMS（1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate)２ｍＭ（終濃度）とを溶解した酵素溶液３μＬを作用極２上に滴下し、室温にて送風乾燥後、１００ｍＪ／ｃｍ２の紫外光にてＡＷＰを硬化することにより、ＦＡＯＤを作用極２上に固定化した。
【００５０】
そして、この作用極２を有するセンサチップ１を用いて、以下の電気化学測定を行い、プロテアーゼ存在下での糖化タンパク質濃度検出性能を評価した。
手順
Ａ：以下の表２に示す濃度で糖化アミノ酸及びプロテアーゼを含む試料を調製した。溶媒としては、標準管理血清（日水製薬製の生化学検査用凍結乾燥血清「コンセーラ」を添付処方に従い復水した血清）を用いた。
【表２】
Ｂ：Ａで調製した試料１０μＬを、センサチップ１の作用極２、対極３及び参照極４の全体を覆うように滴下し、２５℃で３分間インキュベートした。
Ｃ：インキュベート後、作用極２と参照極４の間に＋２５ｍＶの電圧を印加し、１００秒後に、作用極２と対極３との間の電流値を測定した。
【００５１】
図８に、その結果を示す。縦軸の単位はナノアンペアである。
この図からわかるように、試料中の糖化アミノ酸濃度に関わらず、プロテアーゼなしの場合（試料１，２）と、プロテアーゼありの場合（試料３，４）とで、ほぼ変わらない測定値が得られた。
このことから、ＦＡＯＤを電極に固定化するためのポリマーとして水溶性光硬化性樹脂ＡＷＰを用いることで、反応系内にプロテアーゼが共存してもＦＡＯＤ活性を損なうことなく糖化アミノ酸濃度が測定可能であることが判る。
【００５２】
次に、比較例として、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）を用いた例について説明する。
この例では、２ｗｔ％−ＡＷＰ水溶液の代わりに１ｗｔ％−ＣＭＣ水溶液を用い、光硬化工程を除いては上述のＡＷＰを用いる例の場合と同様な操作を行ってセンサチップを作製した。そして、表２に示した各試料につき、上述の例と同様に電流値を測定した。
【００５３】
図９に、その結果を示す。
この図からわかるように、プロテアーゼ存在下（試料３，４）では、ＦＡＯＤの基質となる糖化アミノ酸が存在しても、糖化アミノ酸が存在しない場合に比べて電流値が上昇しなかった。
このことから、ＦＡＯＤを電極に固定化するためのポリマーとしてＣＭＣを用いた場合、プロテアーゼ共存下でＦＡＯＤは失活してしまい、ＣＭＣはＦＡＯＤ固定化ポリマーとして適さない事が判る。
【００５４】
６．ＦＡＯＤ固定化ポリマーのプロテアーゼ耐性（酵素電極を用いた電気化学測定の別の例）
ＦＡＯＤを電極に固定化するポリマーにつき、他のポリマーについての検討も行った。ここで述べる実験では、図７に示したようなセンサチップ上ではなく、チューブ内でＦＡＯＤ活性の測定を行った。
【００５５】
ここではまず、ＢＡＳ社製の電気化学測定用白金電極（白金電極径：３ｍｍ、外周径：６ｍｍ）上に５０Ｕ／ｍＬのＦＡＯＤのＰＢＳ（phosphate-buffered saline）溶液（ｐＨ７．４）を５μＬ滴下し室温にて送風乾燥した。その後、ＦＡＯＤ固定化ポリマー溶液としてフッ素樹脂とパーフルオロスルホン酸樹脂との共重合物質で固体高分子電解質であるナフィオン（登録商標）をイソブチルアルコールと純水の混合溶媒中に２０ｗｔ％溶解した溶液２０μＬを、上記の送風乾燥後の電気化学測定用白金電極のうち白金電極部とその外周を覆うように滴下し、室温にて送風乾燥することでＦＡＯＤを固定化した作用極を作製した。なお、この例では、酵素反応に応じて生成する過酸化水素濃度を測定するため、人工電子メディエータは用いていない。また、上記のナフィオン溶液としては、Aldrich社のNafion perfluorinated resin solution（型番527122）を用いた。
【００５６】
以上の作用極に対し、対極に白金ワイヤーを、参照極にＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用い、５ｍＬの緩衝液中で作用極と参照極間に＋６００ｍＶを印加し、緩衝液中に糖化アミノ酸を添加しない場合と、糖化アミノ酸１ｍＭ、２ｍＭで添加した場合とについて、応答電流値を測定した。緩衝液は１０ｍＭ−Ｔｒｉｓバッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８）で、バッファー中に５０ｍｇ／ｍＬのプロテアーゼを添加した系と添加しない系での応答電流値の差異を調べた。
【００５７】
結果を図１０に示す。縦軸は、プロテアーゼ添加有り／無しのそれぞれについて、糖化アミノ酸を添加しない場合の応答電流値を０とした、各糖化アミノ酸濃度における応答電流値の相対値を示している。
この図からわかるように、プロテアーゼなしの場合と、プロテアーゼありの場合とで、糖化アミノ酸濃度に応じてほぼ変わらない増加電流値が得られた。
このことから、ＦＡＯＤ固定化ポリマーとして固体高分子電解質であるナフィオンを用いた場合も、反応系内にプロテアーゼが共存してもＦＡＯＤ活性を損なうことなく糖化アミノ酸濃度が測定可能であることが判る。
【００５８】
以上の図８乃至図１０に示した結果から、全てのポリマーがＦＡＯＤ固定化ポリマーとして有効であるわけではなく、一部のポリマーのみが有効であることが判る。
ＡＷＰは光硬化性樹脂であり、硬化に伴い３次元結合が生成し編み目構造となる。またナフィオン膜はミクロポーラス構造を有することが知られている。これらのポリマーをＦＡＯＤ固定化膜として用いた際にプロテアーゼ耐性を有する原因は明確ではないが、これらのポリマー膜の孔径が約２万７千程度の分子量であるプロテアーゼの有効断面積よりも小さいことに起因するものと考えられる。一方、比較例として示したＣＭＣ等の水溶性高分子は、水溶液中で大きく膨潤するため、膜中にプロテアーゼが進入し、ＦＡＯＤが失活するものと考えられる。
【００５９】
更に、ナフィオン膜はカチオン輸送性を有することが知られており、アニオンのバリア膜としての機能を有することから、本発明の糖化タンパク質濃度測定方法において、試料中に含まれるアスコルビン酸、尿酸、ビリルビン等のアニオン性の検出妨害物質の影響を除去することが可能であり、後述する本発明のバイオセンサに於いて前処理工程での検出妨害物質除去工程を除く事が可能となる。
【００６０】
なお、発明者は、ＦＡＯＤ固定化用ポリマーとして、感光基としてスリチルピリジニウム基を有する光硬化性ポリビニルアルコール樹脂であるＳＰＰ樹脂を用いた実験も行った。
具体的には、ＳＰＰ樹脂として東洋合成工業株式会社製のＳＰＰ−Ｈ；樹脂固形分１１．５ｗｔ％水溶液を用い、２３０ｍｇのＳＰＰ樹脂水溶液と８０Ｕ／ｍＬのＦＡＯＤ溶液１００μＬを混合した溶液を、上記６．の実験例で用いた白金電極上に５μＬ滴下し室温にて送風乾燥した。その後１００ｍＪ／ｃｍ２の紫外光にてＳＰＰを硬化し、ＦＡＯＤを固定化した作用極を作製した。この作用極を用いて上記６．の実験例と同様の実験を行った結果、ＦＡＯＤ固定化用ポリマーとしてナフィオン（登録商標）を用いた場合と同様の結果を得た。
【００６１】
７．前処理部を備えた酵素電極式センサチップを用いた電気化学測定
次に、この発明のバイオセンサの一実施形態である前処理部を備えた酵素電極式センサチップと、そのセンサチップを用いた糖化タンパク質濃度測定方法について説明する。
まず、図１１に、前処理部を備えた酵素電極式センサチップの構成を示す。（ａ）はセンサチップの平面図、（ｂ）は（ａ）の状態から天板を取り外した状態を示す平面図、（ｃ）は（ａ）のＡ−Ａ線における断面図である。
【００６２】
このセンサチップ２０は、絶縁性基板２１上に電極系２２，接続電極２３，配線電極２４及び絶縁膜２５を形成し、さらにその上にスペーサ２６を形成して、スペーサ２６により絶縁性基板２１と天板２７とを貼り合わせた構成である。
また、電極系２２は、作用極２２ａ，対極２２ｂ及び参照極２２ｃを有し、これらの電極２２ａ〜２２ｃは、それぞれ配線電極２４により、対応する接続電極２３と接続されている。そして、３つの接続電極２３を適当な測定装置に接続することにより、外部から電極系２２を構成する電極間に電圧を印加したり、電極間の電流を検出したりすることができる。
【００６３】
また、天板２７の下面（図に表れている面と反対側の面）は空気孔２８の部分を除いて平面であるが、スペーサ２６には窪みを設けてある。そして、天板２７と絶縁性基板２１とを貼り合わせた状態では、スペーサ２６の窪みと天板２７の下面で、試料を吸引し、また電極系２２に導くための空洞を形成している。
【００６４】
この空洞は、開口部３１と、前処理部３２と、流路３３とを有する。そして、開口部３１を液体試料に触れさせることにより、表面張力により試料を開口部３１より前処理部３２に吸引することができる。この前処理部３２が吸引空洞である。また、空気孔２８が前処理部３２と流路３３の間に設けてあり、流路３３には空気孔がないため、センサチップ２０に特に力を加えない状態では、試料は前処理部３２より奥までは吸引されない。しかし、遠心機等により、前処理部３２の試料に対して図で右側に力を加えることにより、試料を流路３３に導くことができる。この流路３３が分析空洞である。
【００６５】
また、前処理部３２（開口部３１から前処理部３２に向かう流路上も含む）には、前処理部３２での処理に使用する酵素や試薬を担持させた不織布３４を配置している。そして、開口部３１から吸引した試料が前処理部３２の不織布３４に接触すると、不織布３４に担持されていた酵素や試薬が試料に溶解し、試料に対し、前処理が行われる。この前処理としては、ここまで説明してきたプロテアーゼ処理、検出妨害物質除去処理、抗血液凝固剤添加処理が考えられる。
なお、開口部３１まで不織布が存在することと、空気孔２８が前処理部３２のうち開口部３１と反対側にある事により、前処理部３２への定量的な試料の吸引（不織布３４の領域のみ）が可能となっている。
【００６６】
そして、前処理の反応後、試料を流路３３の電極系２２に導き、作用極２２ａに固定化したＦＡＯＤと反応させ、その反応の状態を、電気化学的方式で検出する。より具体的には、作用極２２ａと参照極２２ｃとの間に電圧を印加して、作用極２２ａと対極２２ｂとの間に流れる電流値を検出する。そして、この電流値を検量線に当てはめることにより、試料中の糖化タンパク質濃度を測定することができる。
【００６７】
以上のようなセンサチップ２０は、例えば以下の手順で作製することができる。
まず、絶縁性基材２１上に電極系２２、接続電極２３及び配線電極２４のパターン全体をＡｇペーストを用いてスクリーン印刷等により形成する。その後、そのＡｇパターンを覆う形でカーボンペーストを用いてスクリーン印刷等により作用極２２ａ、対極２２ｂと接続電極２３を形成する。同様に、Ａｇ／ＡｇＣｌペーストを用いて参照極２２ｃを形成する。Ａｇペースト、カーボンペースト、Ａｇ／ＡｇＣｌペースト等の導電性インクは印刷後、１２０℃から１５０℃で加熱し溶媒を揮発させることで安定な電極膜となる。
そして、以上の電極を形成後、電極系２２及び接続電極２３上を除く部分に（これらの電極の部分を開口部として）、絶縁膜２５を熱硬化性ポリエステル系樹脂や光硬化性アクリル系樹脂等を用いてスクリーン印刷等により形成する。熱硬化性ポリエステル系樹脂は加熱により、光硬化性アクリル系樹脂は光照射により樹脂が硬化し安定な絶縁膜となる。
【００６８】
その後、作用極２２ａに対し、ＦＡＯＤの固定化処理を行う。
具体的には、作用極２２ａ上に３．３ｍＵ／μＬのＦＡＯＤ，６．７ｎｍｏｌ／μＬのｍ−ＰＭＳ，１６６．７ｎｍｏｌ／μＬのトレハロースを２ｗｔ％のＡＷＰ水溶液に溶解した酵素溶液２．８μＬを滴下する。その後、室温にて送風乾燥し、１００ｍＪ／ｃｍ２の紫外光にてＡＷＰを硬化し、作用極２２ａ上にＦＡＯＤを固定化する。
なお、トレハロースは、ＦＡＯＤの安定化剤として添加するものである。発明者によるＦＡＯＤの高温保存試験（７０℃、１０日）において、トレハロースの添加によるＦＡＯＤ活性の保持が確認されている。同条件でトレハロース無添加の場合、ＦＡＯＤは失活した。
【００６９】
次に、適当な形状に成型したＰＥＴ基材の上下に接着層を設けたスペーサ２６を絶縁性基板２１上に配置し、前処理部３２と流路３３を形成する。
その後、前処理部３２に、必要な酵素や試薬を担持させた不織布３４を配置する。
【００７０】
この不織布３４は、それぞれ前処理用の以下の酵素／試薬溶液を滴下し、凍結乾燥して、必要な酵素や試薬を担持させた３枚の不織布３４ａ〜ｃを、図１２に示すように重ね合わせ、打ち抜き等により前処理部３２のサイズに切断して作製することができる。
なお、前処理部３２に導入された試料が遠心工程を経て効率よく電極系２２に移動できるようにするために、不織布としては、繊維自体は吸水性を持たないポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレン繊維からなるもので、表面に親水処理を施したものを用いると良い。ここでは、不織布３４ａ〜３４ｃとして、シンワ化学株式会社製の親水処理済みポリエステル不織布を用いた。
【００７１】
担持させる酵素及び試薬（センサチップ１枚当たりの担持量）
不織布３４ａ：プロテアーゼ（Subtilisin A）１７５Ｕ
不織布３４ｂ：ヘパリン０．０３５μｇ及びＢＯＤ１７．５ｍＵ
不織布３４ｃ：ＰＯＰＳＯ３５ｎｍｏｌ及びＮａＯＨ０．８４μｍｏｌ
【００７２】
不織布３４ａに担持させるプロテアーゼは、図１に示した実験結果に従って選択した。
不織布３４ｂに担持させる抗血液凝固剤（ヘパリン）及び妨害物質除去酵素（ＢＯＤ）は、図３乃至図５に示した実験結果に従って選択した。
不織布３４ｃに担持させる試薬は、試料のｐＨを前処理部３２における反応に好適なｐＨ及び塩濃度に調整するための試薬である。
【００７３】
このような不織布３４を配置し、前処理部３２に吸引した試料をこの不織布３４の各断片３４ａ〜３４ｃに浸透させる（ここでは同時に浸透させるようにした）ことにより、各断片３４ａ〜３４ｃに担持された試薬や酵素を試料に溶解させ、試料に対し、その試薬や酵素を用いた処理を行うことができる。
なお、酵素を複数前処理部３２に配置する必要がある場合、それら個々の酵素の保存に適したｐＨが異なる場合がある。その場合は、至適ｐＨの異なる酵素はそれぞれ異なる不織布に担持させるとよい。
【００７４】
また、保存に適したｐＨが同じであっても、プロテアーゼ（本実施形態では必須）と他の酵素を同時に不織布に担持することは難しい（他の酵素が分解されてしまうため）。従って、プロテアーゼと他の酵素は異なる不織布に担持する。
さらに、保存に適したｐＨと反応に適したｐＨが異なる酵素もある。その場合は、保存に適したｐＨにて酵素を担持し、異なる不織布に、試料が浸透した際に、その酵素の反応に適したｐＨとなるようなｐＨ調整用試薬を担持させるとよい。
このように、不織布を複数枚用いるこにより、前処理部３２で行わせる反応の設計に高い自由度を得ることができる。
【００７５】
また、前処理部３２から電極系２２に至るまでの流路３３に、２０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）にクエン酸８０ｎｍｏｌ／μＬを溶解したｐＨ調整液１．７５μＬを滴下して乾燥させ、ｐＨ調整部を形成する。試料がこのｐＨ調整部を通過する際、乾燥状態の試薬が溶け込むため、電極系２２に達する試料のｐＨを、ＦＡＯＤの反応に好適なｐＨ８程度に調整することができる。
以上の後、天板２７をスペーサ２６上に貼り合わせることにより、センサチップ２０が完成する。
【００７６】
なお、サイズの一例として、ここでは、試料溶液を前処理部３２に３．５μＬ吸引する構成とするため、絶縁性基材２１として２５０μｍ厚のＰＥＴ（Polyethylene terephthalate）基材を用い、開口部３１を幅２ｍｍ、流路３３は開口部３１から流路端部まで長さ２０ｍｍとした。また、作用極２２ａは面積２．８ｍｍ２、対極２２ｂは面積８．６ｍｍ２、参照極２２ｃは面積２．８ｍｍ２、空気孔２８は０．５ｍｍφとした。
また、スペーサ２６はＰＥＴ基材と上下の接着層を合わせて１８０μｍ厚、前処理部３２は空隙率８０％の不織布３４を配置することを考慮して、総厚１８０μｍ、面積２４．２５ｍｍ２とした。上述の試薬量は、このサイズに合わせて定めたものである。
【００７７】
次に、このようにして作製したセンサチップ２０を用いた糖化タンパク質（フルクトサミン）濃度の測定例を示す。
測定は、以下の手順で行った。なお、管理血清中の糖化タンパク質濃度は、和光純薬工業社（Wako Pure Chemical Industries, Ltd）の「オートワコー フルクトサミン」を用いたＦＯＤ−ＴＯＯＳ法により予め別途測定した。
Ａ：糖化タンパク質濃度が既知の管理血清試料３．５μＬを吸引口３１より自発吸引させ、２５℃で３分間インキュベートし前処理を行った。
Ｂ：その後６００Ｇで３０秒間遠心力を加えて前処理後の試料を流路３３を介して電極系２２の方向へ移動させた。
Ｃ：２５℃で３分間インキュベート後、作用極２２ａと参照極２２ｃの間に＋２５ｍＶの電圧を印加し、１００秒後の作用極２２ａと対極２２ｂの間の電流値を測定した。
【００７８】
図１３に、以上の測定の結果得られた糖化タンパク質濃度と電流値との関係を示す。
この図からわかるように、センサチップ２０による測定結果は、糖化タンパク質濃度と電流値とが高い直線性を示す。このため、センサチップ２０によれば、検出電流値に基づいて高い精度で糖化タンパク質濃度を検出できると言える。
この場合において、前処理で用いたプロテアーゼを不活性化したり除去したりする操作が必要ないため、簡単な操作かつ短時間で、精度のよい測定結果を得ることができる。
【００７９】
また、全血の試料を用いて同じ手順で測定を行った場合でも、ＦＯＤ−ＴＯＯＳ法による測定結果と、センサチップ２０を用いた測定結果との対応関係は、管理血清試料を用いた場合と同様なものであった。従って、試料に血球が含まれた状態で前処理を行っても、糖化タンパク質濃度の測定結果に影響はないと考えられる。
【００８０】
以上で実施形態及び実施例の説明を終了するが、この発明は、これに限られることはない。具体的なバイオセンサの構成、使用する試薬、測定する試料、測定方法等が、これに限られないことはもちろんである。
例えば、酵素と共に作用極に固定するメディエーターとしてｍ−ＰＭＳ以外の物質を用いることが可能である。発明者は、実験により、図１１に示したセンサチップ２０においてｍ−ＰＭＳの代わりに塩化ヘキサアンミンルテニウム（II）を用いた場合でも、糖化アミノ酸濃度に応じた電流値の検出を確認している。
【００８１】
また、センサチップ２０において作用極２２ａを白金電極とし、上記６．で説明したように固体高分子電解質を用いてここのＦＡＯＤを固定化すれば、メディエータを用いなくても糖化タンパク質濃度の測定が可能である。その際は、作用極２２ａはカーボン電極より白金電極にする方が好ましい。過酸化水素が酸化される際の電子の授受が、カーボンよりも白金の方が行われやすいため、高い電流値が得らるからである。
また、上述の実施形態における電気化学測定は、作用極、参照極及び対極を用いる３電極法で行っている。しかし、作用極と対極を用いる２電極法でも測定は可能である。その際は、作用極と対極間に電位を印加し、それらの電極間に流れる電流値を測定すればよい。
【００８２】
また、検査妨害物質の除去剤として、センサチップ２０にはＢＯＤのみを配置したが、これに代えてＡＳＯＤを配置したり、これらに加えて、アスコルビン酸やビリルビンと同様なアニオン性の検出妨害物質である尿酸を除去するためにウリカーゼを配置したりすることも考えられる。
【００８３】
また、センサチップ２０において、分光方式でＦＡＯＤの反応量を測定することも可能である。この場合、流路３３中に透明の窓部を設けると共に、ｐＨ調整部の如く、上述の１．や２．で説明した酵素溶液で用いた４−ＡＡ，ＴＯＤＢ，ＰＯＤ，ＦＡＯＤを窓部付近に乾燥状態で配置しておくとよい。そして、試料にこれらの試薬が溶解し、反応することによって生成される色素を、546nmの吸光度を測定することにより定量し、色素生成量からＦＡＯＤが触媒した酸化反応の量を求めることができる。そして、この酸化反応の量に基づき、試料中の糖化タンパク質濃度を求めることができる。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
以上説明してきたように、この発明による糖化タンパク質濃度測定方法又はバイオセンサによれば、簡単な操作かつ短時間で試料中の糖化タンパク質濃度を定量することができる。
従って、この発明を適用することにより、例えば、臨床診断分野の血液検査で使用できる、簡便な分析器具を提供することができる。糖化タンパク質の血中濃度は、糖尿病の症状の診断及び管理の重要な指標となり得ることから、このような分析器具は、糖尿病の症状の診断及び管理に関する有用なツールとなることが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】プロテアーゼSubtilisin Aについて糖化アルブミンとの反応性を評価した実験の結果を示す図である。
【図２】プロテアーゼSubtilisin Aについて活性のｐＨ依存性を評価した実験の結果を示す図である。
【図３】ＡＳＯＤ及びＢＯＤについて活性のｐＨ依存性を評価した実験の結果を示す図である。
【図４】抗血液凝固剤のＦＡＯＤ活性に対する影響を評価した実験の結果を示す図である。
【図５】抗血液凝固剤のプロテアーゼ活性に対する影響を評価した実験の結果を示す図である。
【００８６】
【図６】ヘパリンのＢＯＤ活性に対する影響を評価した実験の結果を示す図である。
【図７】ポリマーのプロテアーゼ耐性の評価に用いたセンサチップの構造を示す図である。
【図８】図７に示したセンサチップを用いたＡＷＰのプロテアーゼ耐性を評価する実験の結果を示す図である。
【図９】同じく、ＣＭＣのプロテアーゼ耐性を評価する実験の結果を示す図である。
【図１０】チューブ内でナフィオンのプロテアーゼ耐性を評価した実験の結果を示す図である。
【００８７】
【図１１】この発明のバイオセンサの実施形態であるセンサチップの構造を示す図である。
【図１２】図１１に示したバイオセンサに設ける不織布の構成をより詳細に示す図である。
【図１３】図１１に示したバイオセンサを用いた糖化タンパク質濃度の測定結果を示す図である。
【符号の説明】
【００８８】
１，２０：センサチップ、２，２２ａ：作用極、３，２２ｂ：対極、
４，２２ｃ：参照極、５〜７，２３：接続電極、８〜１０，２４：配線電極、
１１：絶縁基板、１２：配線下地、１３：絶縁材、１４：開口部、２１：絶縁性基板、
２２：電極系、２５：絶縁膜、２６：スペーサ、２７：天板、２８：空気孔、
３１：開口部、３２：前処理部、３３：流路、３４：不織布
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料をプロテアーゼで処理して得た分解生成物質を特定の酵素と反応させることにより前記試料中の糖化タンパク質濃度を定量する糖化タンパク質濃度測定方法であって、
前記試料をプロテアーゼ処理する前処理工程と、
前記前処理工程による処理後の、該前処理工程で使用したプロテアーゼを含む試料を、ポリマーにより固定化した前記特定の酵素と反応させる酵素反応工程と、
前記酵素反応工程における反応の状態を検出する検出工程とを含み、
前記特定の酵素を固定化しているポリマーが水溶性光硬化性樹脂又は固体高分子電解質であることを特徴とする糖化タンパク質濃度測定方法。
【請求項２】
請求項１に記載の糖化タンパク質濃度測定方法であって、
前記特定の酵素を固定化しているポリマーが、感光基としてアジド基あるいはスリチルピリジニウム基を有する光硬化性ポリビニルアルコール樹脂であることを特徴とする糖化タンパク質濃度測定方法。
【請求項３】
請求項１に記載の糖化タンパク質濃度測定方法であって、
前記特定の酵素を固定化しているポリマーが、フッ素樹脂とパーフルオロスルホン酸樹脂との共重合物質である固体高分子電解質であることを特徴とする糖化タンパク質濃度測定方法。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか一項に記載の糖化タンパク質濃度測定方法であって、
前記検出工程における検出を電気化学方式で行うことを特徴とする糖化タンパク質濃度測定方法。
【請求項５】
請求項１乃至３のいずれか一項に記載の糖化タンパク質濃度測定方法であって、
前記検出工程における検出を分光方式で行うことを特徴とする糖化タンパク質濃度測定方法。
【請求項６】
請求項４に記載の糖化タンパク質濃度測定方法であって、
前記酵素反応工程において、前記試料を、前記水溶性光硬化性樹脂により人工電子メディエータと共に電極上に固定した前記特定の酵素と反応させ、
前記検出工程において、前記特定の酵素を固定した電極と、所定の検出用電極との間の電流値を検出することを特徴とする糖化タンパク質濃度測定方法。
【請求項７】
請求項４に記載の糖化タンパク質濃度測定方法であって、
前記酵素反応工程において、前記試料を、前記固体高分子電解質により白金電極上に固定した前記特定の酵素と反応させ、
前記検出工程において、前記特定の酵素を固定した白金電極と、所定の検出用電極との間の電流値を検出することを特徴とする糖化タンパク質濃度測定方法。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか一項に記載の糖化タンパク質濃度測定方法であって、
前記特定の酵素が、前記糖化タンパク質のプロテアーゼ分解物質を基質とするフルクトシルアミノ酸酸化酵素であることを特徴とする糖化タンパク質濃度測定方法。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれか一項に記載の糖化タンパク質濃度測定方法であって、
前記前処理工程が、
前記プロテアーゼにより前記試料に含まれる糖化タンパク質を分解する分解工程に加え、
前記試料に含まれる、前記検出工程における検出を妨害する物質を除去する検出妨害物質除去工程、前記試料のｐＨ及び塩濃度を前記特定の酵素の反応に適した値に調整する調整工程、前記試料に抗血液凝固剤を添加する添加工程のうち１つ又は複数を含むことを特徴とする糖化タンパク質濃度測定方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の糖化タンパク質濃度測定方法であって、
前記検出妨害物質除去工程が、
アスコルビン酸オキシダーゼによるアスコルビン酸除去処理、ビリルビンオキシダーゼによるビリルビン除去処理、およびウリカーゼによる尿酸除去処理のうち１つ又は複数を行う工程であることを特徴とする糖化タンパク質濃度測定方法。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の糖化タンパク質濃度測定方法であって、
前記前処理工程は、該前処理工程に含まれる前記各工程の処理に使用する酵素又は試薬を、それぞれ不織布の異なる断片に担持させておき、前記試料をその各断片に浸透させることにより行うことを特徴とする前記糖化タンパク質濃度測定方法。
【請求項１２】
毛細管現象によって試料を吸い上げる吸引空洞と、該吸引空洞と連続する分析空洞とを備えたバイオセンサであって、
前記吸引空洞にプロテアーゼを備え、
前記分析空洞に、前記試料のプロテアーゼ処理による分解生成物と反応させる特定の酵素を、ポリマーにより固定化した状態で備え、
前記分析空洞に、前記特定の酵素による反応の状態を外部から検出可能とするための電極又は透明部をさらに備え、
前記特定の酵素を固定化しているポリマーが水溶性光硬化性樹脂又は固体高分子電解質であることを特徴とするバイオセンサ。
【請求項１】
試料をプロテアーゼで処理して得た分解生成物質を特定の酵素と反応させることにより前記試料中の糖化タンパク質濃度を定量する糖化タンパク質濃度測定方法であって、
前記試料をプロテアーゼ処理する前処理工程と、
前記前処理工程による処理後の、該前処理工程で使用したプロテアーゼを含む試料を、ポリマーにより固定化した前記特定の酵素と反応させる酵素反応工程と、
前記酵素反応工程における反応の状態を検出する検出工程とを含み、
前記特定の酵素を固定化しているポリマーが水溶性光硬化性樹脂又は固体高分子電解質であることを特徴とする糖化タンパク質濃度測定方法。
【請求項２】
請求項１に記載の糖化タンパク質濃度測定方法であって、
前記特定の酵素を固定化しているポリマーが、感光基としてアジド基あるいはスリチルピリジニウム基を有する光硬化性ポリビニルアルコール樹脂であることを特徴とする糖化タンパク質濃度測定方法。
【請求項３】
請求項１に記載の糖化タンパク質濃度測定方法であって、
前記特定の酵素を固定化しているポリマーが、フッ素樹脂とパーフルオロスルホン酸樹脂との共重合物質である固体高分子電解質であることを特徴とする糖化タンパク質濃度測定方法。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか一項に記載の糖化タンパク質濃度測定方法であって、
前記検出工程における検出を電気化学方式で行うことを特徴とする糖化タンパク質濃度測定方法。
【請求項５】
請求項１乃至３のいずれか一項に記載の糖化タンパク質濃度測定方法であって、
前記検出工程における検出を分光方式で行うことを特徴とする糖化タンパク質濃度測定方法。
【請求項６】
請求項４に記載の糖化タンパク質濃度測定方法であって、
前記酵素反応工程において、前記試料を、前記水溶性光硬化性樹脂により人工電子メディエータと共に電極上に固定した前記特定の酵素と反応させ、
前記検出工程において、前記特定の酵素を固定した電極と、所定の検出用電極との間の電流値を検出することを特徴とする糖化タンパク質濃度測定方法。
【請求項７】
請求項４に記載の糖化タンパク質濃度測定方法であって、
前記酵素反応工程において、前記試料を、前記固体高分子電解質により白金電極上に固定した前記特定の酵素と反応させ、
前記検出工程において、前記特定の酵素を固定した白金電極と、所定の検出用電極との間の電流値を検出することを特徴とする糖化タンパク質濃度測定方法。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか一項に記載の糖化タンパク質濃度測定方法であって、
前記特定の酵素が、前記糖化タンパク質のプロテアーゼ分解物質を基質とするフルクトシルアミノ酸酸化酵素であることを特徴とする糖化タンパク質濃度測定方法。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれか一項に記載の糖化タンパク質濃度測定方法であって、
前記前処理工程が、
前記プロテアーゼにより前記試料に含まれる糖化タンパク質を分解する分解工程に加え、
前記試料に含まれる、前記検出工程における検出を妨害する物質を除去する検出妨害物質除去工程、前記試料のｐＨ及び塩濃度を前記特定の酵素の反応に適した値に調整する調整工程、前記試料に抗血液凝固剤を添加する添加工程のうち１つ又は複数を含むことを特徴とする糖化タンパク質濃度測定方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の糖化タンパク質濃度測定方法であって、
前記検出妨害物質除去工程が、
アスコルビン酸オキシダーゼによるアスコルビン酸除去処理、ビリルビンオキシダーゼによるビリルビン除去処理、およびウリカーゼによる尿酸除去処理のうち１つ又は複数を行う工程であることを特徴とする糖化タンパク質濃度測定方法。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の糖化タンパク質濃度測定方法であって、
前記前処理工程は、該前処理工程に含まれる前記各工程の処理に使用する酵素又は試薬を、それぞれ不織布の異なる断片に担持させておき、前記試料をその各断片に浸透させることにより行うことを特徴とする前記糖化タンパク質濃度測定方法。
【請求項１２】
毛細管現象によって試料を吸い上げる吸引空洞と、該吸引空洞と連続する分析空洞とを備えたバイオセンサであって、
前記吸引空洞にプロテアーゼを備え、
前記分析空洞に、前記試料のプロテアーゼ処理による分解生成物と反応させる特定の酵素を、ポリマーにより固定化した状態で備え、
前記分析空洞に、前記特定の酵素による反応の状態を外部から検出可能とするための電極又は透明部をさらに備え、
前記特定の酵素を固定化しているポリマーが水溶性光硬化性樹脂又は固体高分子電解質であることを特徴とするバイオセンサ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２００９−１７１８７４（Ｐ２００９−１７１８７４Ａ）
【公開日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１２１８８（Ｐ２００８−１２１８８）
【出願日】平成２０年１月２３日（２００８．１．２３）
【出願人】（０００００１９６０）シチズンホールディングス株式会社 (1,939)
【出願人】（５０３１９５８５０）有限会社アルティザイム・インターナショナル (31)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月２３日（２００８．１．２３）
【出願人】（０００００１９６０）シチズンホールディングス株式会社 (1,939)
【出願人】（５０３１９５８５０）有限会社アルティザイム・インターナショナル (31)
【Ｆターム（参考）】
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