糖尿病性血管合併症の治療方法
本発明は、治療有効量のヤマノイモ属種の抽出産物を、それを必要とする被験体に投与するステップを含む、糖尿病性血管合併症の治療方法を提供する。抽出産物は、（ａ）ヤマノイモ属種の塊茎を、酢酸溶液の存在下でアルコールベースの溶媒を用いて抽出して抽出組成物を形成するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）において得られた産物を供して可溶性画分を得るステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）において得られた可溶性画分から溶媒を除去して抽出産物を得るステップとを含むプロセスによって調製されることが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００６年６月１４日に出願した米国仮特許出願第６０／８０４，６５６号および２００６年１０月１８日に出願した米国非仮特許出願第１１／５８２，８９４号の利益を主張し、それらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、糖尿病性血管合併症の医療、詳細には、ヤマノイモ属種の抽出産物を用いて糖尿病性血管合併症を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
非酵素的な糖化（メイラード反応）は、糖尿病性血管合併症の発病の原因とされている。最近の免疫組織化学的研究によって、糖尿病の被験体では最終糖化反応物（ＡＧＥ）の形成が亢進されていることが示された（Ｌｉｕら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ．４８：２０７４〜２０８２頁、１９９９年）。ＡＧＥ形成は、それ自体が、組織タンパク質の構造および機能特性を変化させることがわかっている。さらに、ＡＧＥ修飾タンパク質と種々の種類の細胞の間の相互作用は、糖尿病の被験体において観察される異常において病的役割を果たすと考えられている。したがって、身体におけるＡＧＥの過剰な蓄積は、アテローム性動脈硬化病変、腎症、血管損傷、神経障害および網膜症などの糖尿病性血管合併症を誘発する主要因と示唆されている（Ｖｌａｓｓａｒａら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２５１：８７〜１０１頁、２００２年）。
【０００４】
慢性高血糖症は、本質的に、糖尿病性血管合併症の発生および進行に関与している。肝臓では、ＡＧＥ修飾タンパク質のエンドサイトーシスが、スカベンジャー受容体の喪失および肝類洞内皮細胞における細胞内輸送の遅延をもたらす（Ｈａｎｓｅｎら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ４５：１３７９〜１３８８頁、２００２年）。腎臓では、ＡＧＥ修飾ＩＶ型コラーゲンおよびラミニンは、負に帯電したプロテオグリカンと相互作用するその能力を低下させ、アルブミンに対する血管透過性を増大させる（Ｓｉｌｂｉｇｅｒら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ４３：８５３〜６４頁、１９９３年）。
【０００５】
今日まで、ＡＧＥ形成を防ぎ、細胞に対するＡＧＥ作用を低減し、既存のＡＧＥ架橋を分解しようとするいくつかのアプローチがあった。重要な薬理学的戦略は、小さな求核ヒドラジン化合物アミノグアニジン、ＡＧＥ媒介性架橋の強力な阻害剤を利用してきた。ラットにおいて糖尿病性糸球体硬化症の進行を防ぐことがわかっているチアゾリジン誘導体ＯＰＢ−９１９５をはじめとする別のＡＧＥ阻害性薬剤は、依然として開発下にある。アンジオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥＩ）、例えば、ランプリル（ｒａｍｐｒｉｌ）も、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）で治療された糖尿病マウスにおいて腎症を軽減することがわかっている。
【０００６】
これまでに開発された化合物または薬物は、ＡＧＥおよびＡＧＥ架橋の形成を阻害することを対象としていたが、既存のＡＧＥは、特定の化合物または薬物によっては除去されず、依然として糖尿病の被験体では細胞および組織を損傷する。糖尿病の被験体に投与された化合物または薬物と関連している毒性および副作用を明らかにすることもまた困難である。
【０００７】
ヤマノイモ属は、漢方に用いられる極めて重要な薬用植物の１種であり、その薬効は長年研究されてきた。１９３６年に、Ｔｓｕｋａｍｏｔｏらが、ヤマノイモ科の植物からジオスゲニン、ヤマノイモ属のステロイドサポニンを単離し、単離されたジオスゲニンを薬用ステロイドの迅速合成のための原材料として用いた。しかし、糖尿病性血管合併症の治療においてヤマノイモ属の抽出産物を用いる研究はいまだ実施されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国仮特許出願第６０／８０４，６５６号
【特許文献２】米国非仮特許出願第１１／５８２，８９４号
【特許文献３】米国特許出願番号１１／２７４，７７５号
【特許文献４】米国特許出願公開第２００６００６８０３６ Ａ１号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｌｉｕら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ．４８：２０７４〜２０８２頁、１９９９年
【非特許文献２】Ｖｌａｓｓａｒａら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２５１：８７〜１０１頁、２００２年
【非特許文献３】Ｈａｎｓｅｎら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ４５：１３７９〜１３８８頁、２００２年
【非特許文献４】Ｓｉｌｂｉｇｅｒら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ４３：８５３〜６４頁、１９９３年
【非特許文献５】Ｎｅｉ，Ｍ．およびＷ．Ｈ．Ｌｉ．１９７９年、Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｅｒｍｓ ｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｏｃ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７６；５２６９〜５２７３頁
【非特許文献６】Ｍｉｙａｔａら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７２（７）：４０３７〜４０４２頁、１９９７年
【非特許文献７】Ｌａｌａｎｉら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １５：８１１〜８１７頁、２００５年
【非特許文献８】Ｓｈｏｒｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅａｓｅａｒｃｈ、３０（８）：１７６７〜１７７３頁、２００２年
【非特許文献９】Ｉｋａｒｉら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ２２８：１７３〜１８４頁、２００３年
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、治療有効量のヤマノイモ属種(Dioscorea species)の抽出産物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、糖尿病性血管合併症の治療方法に関する。
【００１１】
別の言い方をすれば、本発明は、糖尿病性血管合併症を治療するための医薬品の調製のための、ヤマノイモ属種の抽出産物の使用であって、医薬品を、それを必要とする被験体に治療有効量で投与する使用に関する。
【００１２】
前記の概要ならびに以下の発明の詳細な説明は、添付の図面と併せて読まれた場合により良好に理解される。図面には、本発明を例示する目的上、目下のところ好ましいものである実施形態が示されている。しかし、本発明は、図面と関連している厳密な実験条件およびパラメータに制限されないということを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】それぞれ、ヤマノイモ属種のメタノール抽出物およびエタノール抽出物のＨＰＬＣ分析によって生じたピークを示すクロマトグラムである。
【図１Ｂ】それぞれ、ヤマノイモ属種のメタノール抽出物およびエタノール抽出物のＨＰＬＣ分析によって生じたピークを示すクロマトグラムである。
【図２】配列番号１の単一のランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）プライマーを用いて増幅された、１４種のヤマノイモ属種の試験パネルの増幅産物の電気泳動マーカープロフィールを示す合成像である。
【図３】クッパー細胞における一連の遺伝子発現を示す合成像である。
【図４】（図４Ａ〜４Ｄ）ＳＴＺ誘発糖尿病マウスの種々の肝臓組織像を示す顕微鏡画像であり、各画像は４００×の倍率を有し、バースケールは５０μｍを表す。
【図５】（図５Ａ〜５Ｄ）ＳＴＺ誘発糖尿病マウスの種々の腎臓組織像を示す顕微鏡画像であり、各画像は４００×の倍率を有し、バースケールは５０μｍを表す。
【図６】（図６Ａ〜６Ｅ）ＡＧＥ注射マウスの種々の肝臓組織像を示す顕微鏡画像であり、各画像は６４０×の倍率を有し、バースケールは２０μｍを表す。
【図７】（図７Ａ〜７Ｅ）ＡＧＥ注射マウスの種々の腎臓組織像を示す顕微鏡画像であり、各画像は６４０×の倍率を有し、バースケールは２０μｍを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のより良好な理解のために、本明細書において用いられる用語のうちいくつかをより詳細に説明する。
【００１５】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、１または１を超える（すなわち、少なくとも１の）、その冠詞の文法上の対象を指すよう本明細書において用いられる。例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」とは、１つの要素または１を超える要素を意味する。
【００１６】
本明細書において用いられる用語「糖尿病性血管合併症」は、心血管疾患、神経障害、網膜症および腎症をはじめとする、真性糖尿病の経過の間に生じ、糖尿病患者における身体障害および高死亡率の主な原因となり得る血管障害を指す。
【００１７】
本明細書において使用される場合、「パーセント」または「％」とは、成分が一部である組成物の重量に基づいて用いられる成分の重量パーセントを意味する。
【００１８】
本明細書において使用される場合、「被験体」とは、哺乳動物など、具体的にはヒトを含めた、糖尿病性血管合併症でありまたはそれに罹患し得る任意の動物である。
【００１９】
本発明は、治療有効量のヤマノイモ属種の抽出産物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、糖尿病性血管合併症の治療方法を提供する。本発明の一例では、ヤマノイモ属種の抽出産物は、
（ａ）ヤマノイモ属種の塊茎を、酢酸の存在下でアルコールベースの溶媒と混合して、抽出組成物を得るステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）において得られた抽出組成物を分離処理に供して、可溶性画分を得るステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において得られた可溶性画分から溶媒を除去してヤマノイモ属種の抽出産物を得るステップと
を含むプロセスによって調製される。
【００２０】
アルコールベースの溶媒は、溶媒として作用できる任意の適したアルコールを含む。例えば、制限するものではないが、アルコールベースの溶媒は、メタノール、エタノール、イソプロパノールまたはブタノールまたはそれらの混合物を含む。一実施形態によれば、ヤマノイモ属種の塊茎を、約１％の酢酸溶液の存在下、エタノールで抽出する。好ましくは、ヤマノイモ属種の塊茎を、約１％の酢酸溶液の存在下で約５０〜約９０％のエタノールで抽出する。本発明の一実施形態では、ヤマノイモ属種の塊茎を、約１％の酢酸溶液の存在下で約８５％のエタノールで抽出する。別の実施形態によれば、ヤマノイモ属種の塊茎を粉砕し、約１％の酢酸溶液の存在下で約３０％〜約９０％のメタノール（例えば、約４０％のメタノール）と混合する。抽出された混合物を、一晩静置させ、真空濾過などの濾過ステップによって分離して濾液を得る。次いで、濾液を凍結乾燥してヤマノイモ属の粗抽出物を得てもよい。
【００２１】
本発明の一例では、本方法は、調製プロセスのステップ（ａ）の前に、以下のステップを含むヤマノイモ属種の塊茎の予備処理を、必要に応じて含む：
（ｉ）ヤマノイモ属種の塊茎を、約１％の酢酸溶液に浸漬するステップと、
（ｉｉ）ヤマノイモ属種の塊茎を粉砕するステップと、
（ｉｉｉ）粉砕され、酢酸処理されたヤマノイモ属種の塊茎を凍結乾燥して、粉砕され、凍結乾燥され、酢酸処理されたヤマノイモ属種の塊茎を生成するステップ。
【００２２】
本発明の一実施形態によれば、ヤマノイモ属種の塊茎を約１％の酢酸溶液に浸漬し、その後、酢酸処理された塊茎を粉砕し、次いで凍結乾燥するステップと、凍結乾燥された塊茎を、アルコールベースの溶媒を用いて浸漬することによって抽出するステップと、粉砕され、凍結乾燥された塊茎を、アルコールベースの溶媒と混合して、混合物を形成するステップと、混合物を一晩静置させて、抽出産物を得るステップとによって、ヤマノイモ属種の抽出産物を調製してもよい。
【００２３】
本発明はまた、糖尿病性血管合併症の治療方法を提供する。本方法は、治療有効量のヤマノイモ属種の抽出産物を、このような治療を必要とする被験体に投与することを含み、抽出産物は、
（ａ）ヤマノイモ属種の塊茎を、約１％の酢酸溶液に浸漬するステップと、
（ｂ）酢酸処理されたヤマノイモ属種の塊茎を粉砕するステップと、
（ｃ）粉砕され、酢酸処理されたヤマノイモ属種の塊茎を凍結乾燥して、粉砕され、凍結乾燥され、酢酸処理されたヤマノイモ属種の塊茎を生成するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の粉砕され、凍結乾燥され、酢酸処理されたヤマノイモ属種の塊茎の少なくとも一部を、約１％の酢酸溶液の存在下でアルコールベースの溶媒と混合して抽出組成物を得るステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）において得られた抽出組成物を分離処理に供して、可溶性画分を得るステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）において得られた可溶性画分から溶媒を除去して、ヤマノイモ属種の抽出産物を得るステップと
を含むプロセスによって調製される。
【００２４】
本発明の一実施形態によれば、本発明の調製プロセスおよび治療方法において用いられるヤマノイモ属種は、ヤマノイモ属種のゲノムＤＮＡが配列番号９のプライマーを用いて増幅された場合に、以下の１４種のＤＮＡバンド：ヤマノイモ属種のゲノムＤＮＡが配列番号９のプライマーを用いて増幅された場合に、４２８ｂｐ、４５２ｂｐ、５３７ｂｐ、６０２ｂｐ、７２３ｂｐ、８１７ｂｐ、９３４ｂｐ、１１４０ｂｐ、１２４２ｂｐ、１４７８ｂｐ、１６４１ｂｐ、１９０４ｂｐ、２１５１ｂｐおよび２９１８ｂｐを含むランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）フィンガープリントによって特徴付けられる、ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．ファイト（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ａｌａｔａ Ｌ．ｃｖ．Ｐｈｙｔｏ）である。ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）解析は、実施例４に記載されている。
【００２５】
一実施形態によれば、治療有効量のヤマノイモ属種の抽出産物は、糖尿病性血管合併症の治療を必要とする被験体に経口経路によって投与される。しかし、抽出産物は、同様の治療効果を達成するために任意のその他の適当な投与経路、例えば、静脈内、腹腔内、経皮経路、特に、鼻腔経路を含む経粘膜経路において、それを必要とする被験体に投与してもよい。
【００２６】
当業者にとっては、治療有効量ならびに投与量および投与頻度は、その知識および本開示に基づく単なる日常的な実験の標準法に従って容易に決定できる。投与量は、約１〜約１００ｍｇ／体重１ｋｇ／日、好ましくは、約５〜約４０ｍｇ／体重１ｋｇ／日、最も好ましくは、約１０〜約３０ｍｇ／体重１ｋｇ／日であり得る。
【００２７】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するために提供する。これらの実施例は、本発明の範囲を制限することを意図するものではなく、そのように制限しないものと解釈すべきである。
本発明の実施例
【実施例１】
【００２８】
ヤマノイモ属種の粗抽出物（ＰＨ）の調製
皮をむいたヤマノイモ属種の塊茎を、１％酢酸の存在下でアルコールベースの溶液に浸漬した。撹拌した後、混合溶液を一晩静置させた。このプロセスから得られた可溶性部分を凍結乾燥して、ヤマノイモ属種の粗抽出物（ＰＨ）を得た。
【００２９】
具体的には、１．４ｋｇの皮をむいたヤマノイモ属種の塊茎を、角切りにし、１％酢酸溶液に浸漬した。これらの角切りを一晩酢酸溶液に浸漬し、上清を除去した。これらの角切りを凍結乾燥し、その後、抽出した。
【００３０】
凍結乾燥した角切りを粉砕し、約１％の酢酸溶液の存在下で、約１．５〜約２．５Ｌの溶媒として、約３０％〜約９０％のメタノール（例えば、約４０％のメタノール）と混合した。混合物を一晩静置し、真空濾過によって濾過して濾液を得た。次いで、濾液を凍結乾燥して、ヤマノイモ属種の粗抽出物（ＰＨ）を得た。
【００３１】
あるいは、凍結乾燥した角切りを粉砕し、約１％の酢酸溶液の存在下で、約１．５〜約２．５Ｌの溶媒として、約５０〜約９０％のエタノール（例えば、約８５％のエタノール）と混合した。同様に、混合物を一晩静置し、真空濾過によって濾過して濾液を得た。次いで、濾液を凍結乾燥して、ヤマノイモ属種の粗抽出物（ＰＨ）を得た。
【実施例２】
【００３２】
ヤマノイモ属種の粗抽出物（ＰＨ）の分析
実施例１から得られた粗抽出物（メタノールおよびエタノール抽出物を含む）を、２つのポンプ（ＬＣ−１０ＡＴ）、ＳＰＤ−１０Ａ可変波長プログラム可能ＵＶ／Ｖｉｓフォトダイオードアレイ検出器、ＳＣＬ−１０Ａシステムコントローラーおよびガードカラム（３５ｍｍ×４．６ｍｍおよび５μｍパッキング；Ｓｕｐｅｌｃｏ）を取り付けたＣ−１８カラム（Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ、２５０ｍｍ×４．６ｍｍおよび５μｍパッキング；Ｓｕｐｅｌｃｏ、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＵＳＡ）を備えるＳｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣシステム（Ｃｌａｓｓ ＶＰ ６．１２バージョンソフトウェアを用いるＣｌａｓｓ ＶＰシリーズ；Ｓｈｉｍａｄｚｕ、京都、日本）を用いてＨＰＬＣによって分析した。
【００３３】
ＰＨ（１０ｍｇ／ｍＬ）のＨＰＬＣサンプルは、８８％の水（移動相Ａ）と１２％のメチルアルコール（移動相Ｂ）とを含有する移動相を用いて２０μＬのアリコートに調製し、０．９ｍＬ／分の流速で移動相を用いて平衡化したカラムに添加した。すべての有機溶媒は、ＨＰＬＣ等級であり、０．２２μｍのフィルターで濾過し、使用前に脱気した。ＨＰＬＣ法の合計実行時間は２０分に設定した。溶出プロフィールは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＳＰＤ−１０Ａ ＵＶ−Ｖｉｓフォトダイオードアレイ検出器で２６０ｎｍでモニターした。結果は、下記表１に列挙される以下のパラメータに基づいて定量化した。得られたクロマトグラムを、Ｃｌａｓｓ ＶＰ ６．１２バージョンソフトウェア（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、京都、日本）を用いて処理し、記録した。
【００３４】
【表１】
【００３５】
図１Ａおよび１Ｂの両方を参照すると、プロフィール中のピークは十分に分離されていた。プロフィール中にいくつかのピークが観察され、ピーク４はＰＨ中の有効成分を示す。図１Ａおよび１Ｂに示されるように、ピーク４の保持時間は、メタノール抽出物については約７．０４５分であり、エタノール抽出物については約７．４７４であった。したがって、ヤマノイモ属種のメタノール抽出物のＨＰＬＣプロフィールは、エタノール抽出物のものと同様である。ヤマノイモ属種のメタノール抽出物は、化学成分においてヤマノイモ属種のエタノール抽出物とほとんど同様であり、それらは治療において同様の活性および有効性を提供するはずである。
【実施例３】
【００３６】
粗抽出物（ＰＨ）を含有するマウス飼料の調製
Ｐｕｒｉｎａ Ｃｈｏｗ５００１という市販のマウス飼料を粉砕して粉末にした。粉砕された飼料に、凍結乾燥した粗抽出物ＰＨを、同量の粉砕された飼料を置き換える量で加えて、飼料混合物を形成した。飼料混合物を蒸留水と均一に混合し、押し出し成形によって再形成し、電子レンジで適当な出力で２分間焼成し、室温に冷却した後−７０℃で冷凍した。凍結乾燥後、飼料混合物を、元のＰｕｒｉｎａ Ｃｈｏｗ飼料のものと極めて類似したペレットに形成した。このペレットを−２０℃の冷凍庫で保存した。このペレットを、給餌の当日に室温に加温し、滅菌作業台上でＵＶランプ照射によって滅菌した。種々の濃度の粗抽出物を含有する飼料混合物を調製した。
【実施例４】
【００３７】
ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）解析におけるヤマノイモ属種の特徴付け
ＤＮＡ抽出
未知のヤマノイモ属種の１種（サンプル番号１００または１０２として２連で示されている）を、すべて台湾において栽培された、ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．（栽培品種）タイナン（Ｔａｉｎｕｎｇ）番号１（サンプル番号１）、ディオスコレア・エスクレンタ（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）（サンプル番号３）、ディオスコレア・ブルビフェラ（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ｂｕｌｂｉｆｅｒａ）（サンプル番号４）、ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ａｌａｔａ Ｌ．ｃｖ．）８７０２（サンプル番号５）、ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．サンジＡ（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ａｌａｔａ Ｌ．ｃｖ．Ｓａｎｚｈｉ Ａ）（サンプル番号６）、ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．サンジＢ（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ａｌａｔａ Ｌ．ｃｖ．Ｓａｎｚｈｉ Ｂ）（サンプル番号７）、ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．ダイエショウフェング（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ａｌａｔａ Ｌ．ｃｖ．Ｄａｙｅｓｈｏｕｆｅｎｇ）（サンプル番号９）、ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．タイナン（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ａｌａｔａ Ｌ．ｃｖ．Ｔａｉｎｕｎｇ）番号２（サンプル番号１０）、ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．ジーファ（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ａｌａｔａ Ｌ．ｃｖ．Ｊｉｆａ）（サンプル番号６７）、ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．チャンアール（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ａｌａｔａ Ｌ．ｃｖ．Ｚｈａｎｇｅｒ）番号２（サンプル番号６４）、ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．ダーシャン（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ａｌａｔａ Ｌ．ｃｖ．Ｄａｓｈａｎ）番号３（サンプル番号１３）、ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．ダーシャン番号２（サンプル番号１２）およびディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．タイドン（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ａｌａｔａ Ｌ．ｃｖ．Ｔａｉｄｏｎｇ）（サンプル番号１１）を含む１３種の既知のヤマノイモ属種の試験パネルとともに特徴付けた。
【００３８】
配列決定することによってヤマノイモ属種を特徴付けるために、各ヤマノイモ属の０．２ｇの新鮮な葉のサンプルを集め、液体窒素と混合し、乳鉢中で粉砕した。１．５ｍｌの遠心管中で、粉砕された組織を、９００μｌの２％ＣＴＡＢ抽出バッファー（１．４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０の１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．２％（β−メルカプトエタノールを含有）と混合し、続いて、６５℃の水浴中で３０分間インキュベートした。次いで、このサンプルを遠心分離し、上清を、６００μＬのクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を含む清浄な管に移し、サンプルが乳化状態となるまでボルテックス処理をした。このサンプルをさらに遠心分離し、上清を清浄な管に移し、４０μＬの１０％ＣＴＡＢ（０．７Ｍ ＮａＣｌ含有）および４００μＬのクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）と混合した。このサンプルを再度遠心分離し、上清（４００μＬ）を清浄な管に移し、４００μＬのＣＴＡＢ沈殿バッファーと混合し、氷上に約１５〜２０分間静置してＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡサンプルを、４００μＬの高塩ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１Ｍ ＮａＣｌ）および８００μＬの９５％エタノールですすいだ。ＤＮＡサンプルを遠心分離し、ペレットを、４００μＬの７５％エタノールでさらにすすぎ、その後、ＤＮＡペレットを蒸留脱イオン（ｄｄ）Ｈ２Ｏに再懸濁し、−２０℃で保存した。
ＲＡＰＤ反応
ＲＡＰＤ解析では、配列番号１のランダムＲＡＰＤプライマー、この場合にはＯＰＡ−１８（ＡＧＧＴＧＡＣＣＧＴ）（Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）を用いてヤマノイモ属種のゲノムＤＮＡを増幅した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、１０×バッファー、２．５ｍＭの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、２．０μＭのプライマー（Ｏｐｅｒｏｎ）、５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）および５ｎｇの鋳型ＤＮＡを含有する２５μＬ容積で実施した。サンプルを、９４℃で１分間の変性、３６℃で１分間のアニーリング、７２℃で２分間の伸長からなる４１サイクルおよび１回の７２℃で１０分間の最終伸長サイクルにかけた。ＰＣＲを完了した後、１０μＬの反応混合物を、電気泳動のために、０．５μｇ／ｍＬ臭化エチジウムを含有する２％アガロースゲルに添加した。
データ解析
ゲル電気泳動では、５００ｂｐ、１０００ｂｐ、１５００ｂｐ、２０００ｂｐ、２５００ｂｐ、３０００ｂｐ、３５００ｂｐおよび４０００ｂｐなど、種々の大きさの参照バンドを提供するために、ゲルの最初のレーン（左端にある）および最後のレーン（右端にある）の両方に、φＸ１７４ＤＮＡ／ＨａｅＩＩＩマーカー（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏ．，ＵＳＡ）などのＤＮＡ分子量マーカー（Ｍ）を添加し、続いて、各レーンに各ヤマノイモ属種のＰＣＲサンプルを添加した。各サンプルから得られた増幅されたＤＮＡ産物のプロフィールを、蛍光現像剤によって可視化し、画像取得ソフトウェア、ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ １２２０を用いて写真画像を獲得した。試験パネルに由来する各ヤマノイモ属種は、ＲＡＰＤフィンガープリントにおいて独自のＤＮＡバンドを生じたので、本発明のヤマノイモ属種のＲＡＰＤフィンガープラントを、その他のヤマノイモ属種と鑑別するよう調べた。具体的なヤマノイモ属種のフィンガープリントは、ヤマノイモ属種のゲノムＤＮＡを配列番号９のプライマーを用いて増幅した場合に、以下の１４種のＤＮＡバンド：ヤマノイモ属種のゲノムＤＮＡを、未知のヤマノイモ属種を特徴付けるために用いられる配列番号１のＯＰＡ−１８プライマーを用いて増幅した場合に、４２８ｂｐ、４５２ｂｐ、５３７ｂｐ、６０２ｂｐ、７２３ｂｐ、８１７ｂｐ、９３４ｂｐ、１１４０ｂｐ、１２４２ｂｐ、１４７８ｂｐ、１６４１ｂｐ、１９０４ｂｐ、２１５１ｂｐおよび２９１８ｂｐを含む（図２においてサンプル番号１００または１０２として、２連で示されている）。
【００３９】
２種のヤマノイモ属種の間の類似度指数を算出するために、クラスター分析または対分析もＧｅｌ−Ｃｏｍｐａｒソフトウェアを用いて実施した。分析に付されたパラメータは、ＲＡＰＤフィンガープリントから得たものとした。次いで、以下の方程式を用いるクラスター分析において、非加重結合法（ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ ｐａｉｒ−ｇｒｏｕｐｉｎｇ ｍｅａｎ ａｒｉｔｈｍｅｔｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＵＰＧＭＡ）を用いて、類似度指数（Ｆ）を算出した：
Ｆ＝２ｎｘｙ／ｎｘ＋ｎｙ
式中、ｎｘｙは、ヤマノイモ属種ｘおよびｙにおいて共通するＤＮＡバンドの数であり、ｎｘおよびｎｙは、ヤマノイモ属種ｘおよびｙそれぞれにおける総ＤＮＡバンドである（Ｎｅｉ，Ｍ．およびＷ．Ｈ．Ｌｉ．１９７９年、Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｅｒｍｓ ｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｏｃ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７６；５２６９〜５２７３頁）。
【００４０】
未知のヤマノイモ属種は、ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．サンジＡまたはディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．チャンアール番号２と、約８８．９％の類似度指数を有する。さらに、このヤマノイモ属種は、ディオスコレア・ブルビフェラまたはディオスコレア・エスクレンタと約３７．５％の類似度指数を有する。さらに、未知のヤマノイモ属種は、ディオスコレア・ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．タイナン（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ａｌａｔａ Ｌ．ｃｖ．Ｔａｉｎｕｎｇ）番号１、ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．８７０２、ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．サンジＢ、ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．ダイエショウフェング、ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．タイナン番号２、ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．ダーシャン番号３またはディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．ダーシャン番号２と、７５．５％を超える類似度指数を有する。クラスター分析または対分析結果に基づいて、未知のヤマノイモ属種は、既知の種とは異なるが、ディオスコレア・アラータ亜種とより類似しているということが理解された。したがって、未知のヤマノイモ属種を、参照によりその開示が本明細書に組み込まれる、２００５年１１月１５日に出願した米国特許出願番号１１／２７４，７７５号、２００６年３月３０日に公開した米国特許出願公開第２００６００６８０３６ Ａ１号に記載されるディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．ファイトと名付けた。
【実施例５】
【００４１】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ食作用アッセイに対する粗抽出物の効果
クッパー細胞の単離および培養
Ｃ５７ＢＬ６／ｊマウスに、１：３の割合で混合したＲｏｍｐｕｎ（登録商標）キシラジン麻酔およびケタミン（Ｓ−（＋）−ケタミン）麻酔の混合物を用いて腹膜内（ｉｐ）注射した。各マウスの中心静脈にポリエチレンカテーテルを用いてカニューレを挿入し、１０ｍｌのＣａ２＋不含ＨＢＳＳバッファーを用い、１ｍｌ／分の灌流速度で１０分間、０．０５％のＩＶ型コラゲナーゼを含有するＨＢＳＳバッファーを用い、１ｍｌ／分の灌流速度で１０分間肝臓組織を灌流して肝臓組織を軟化させた。軟化させた肝臓組織を摘出し、すすぎ、１対の鉗子によって切り開いて、肝臓組織から細胞懸濁液を放出した。結合組織を剥離した後、細胞懸濁液を、５３番のナイロンメッシュを用いて濾過し、３０ｇで３分間遠心分離した。次いで、細胞懸濁液を、６００ｇで５分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを、１５ｍＬのＲＢＣ溶解バッファーに再懸濁し、２分間反応を行わせた。細胞懸濁液に、１５ｍＬのＲＰＭＩ １６４０培地を加え、遠心分離し、細胞ペレットを、５ｍＬのＲＰＭＩ １６４０培地に再懸濁し、２５％（ｖ／ｖ）Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）密度勾配培地からなるＰｅｒｃｏｌｌ（商標）溶液の頂部の上に重層した。この細胞溶液を遠心分離し、濃縮されたクッパー細胞を含有する細胞ペレットを回収した。濃縮されたクッパー細胞を、ＲＰＭＩ １６４０培地を用いて洗浄し、血清不含ＲＰＭＩ １６４０培地に再懸濁した。
クッパー細胞の食作用アッセイ
クッパー細胞を、９６ウェル培養プレートに播種し（４×１０５個細胞／ウェル）、以下１０％ＦＣＳ ＲＰＭＩ培地としても知られる、１０％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ培地において、少なくとも２４時間培養した。培地を、種々の濃度（１０００μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬおよび１μｇ／ｍＬ）のＰＨを加えた２％ＦＣＳ ＲＰＭＩ培地に変更した。２時間培養した後、各ウェルに５０μｌのＰＢＳに懸濁した１μｍの大きさのＦＩＴＣビーズを加え（５×１０６個／ウェル）、３７℃で１．５時間さらに培養した。次いで、ＰＢＳで４回洗浄することによって結合していない１μｍの大きさのＦＩＴＣビーズを除去した。ＦｌｕｏｒｏＱｕｅｎｃｈ（商標）色素（０．５μＬ／ウェル）を加えて、取り込まれた１μｍの大きさのＦＩＴＣビーズからの蛍光をクエンチした。取り込まれた１μｍの大きさのＦＩＴＣビーズの蛍光は、１時間後にサイトフルオロメーターを用いて測定し、対照群の蛍光を用いて標準化して、表２に示されるように相対食作用指数を求めた。
【００４２】
【表２】
【００４３】
種々の濃度の粗抽出物ＰＨ（１０００μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬおよび１μｇ／ｍＬ）で処理したマウスクッパー細胞はすべて、いずれの処理も施していないマウスクッパー細胞の対照群と比較して取り込み食作用の亢進を示した。種々の濃度の、クッパー細胞食作用を促進し得るタフトシンは、このアッセイにおける陽性対照である。したがって、結果は、ヤマノイモ属の粗抽出物は、マウスクッパー細胞の細胞食作用を有意に促進したということを示唆するものである。
【実施例６】
【００４４】
関連遺伝子の発現に対するＰＨの効果
ＰＨで処理した細胞からの全ＲＮＡの単離
クッパー細胞を、６ウェルプレートにおいて培養した。培養培地を、血清不含培地と置換し、４時間維持した。細胞は、それぞれ１００μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬおよび１μｇ／ｍＬの濃度のＰＨを用いて４８時間処理した。ＰＨを用いて処理した後、細胞を回収し、１ｍＬのＵｌｔｒａｓｐｅｃ（商標）ＲＮＡ単離キット（Ｂｉｏｔｅｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（ＵＳＡ））に懸濁した。全ＲＮＡは、キットの標準プロトコールに従うことによって得た。得られた全ＲＮＡは、定量的に測定した。
逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析
逆転写は、以下の手順に従って実施した。まず、ｍＲＮＡを、２６．５μＬの、０．１μｇのオリゴ−ｄＴ、５μｇの全ＲＮＡを含有するＤＥＰＣ処理滅菌反応混合物中、７０℃で１０分間の熱処理によって変性した。逆転写は、総容積４０μＬとなるよう反応混合物に加えた、４μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、０．５μｌのｒＲＮａｓｉｎ、１μＬのＡＭＶ（トリ骨髄芽球症ウイルス）逆転写酵素（ＲＴ）（１０単位）および８μｌの５×ＲＴバッファーを用いて実施し、４２℃で６０分間インキュベートし、その後、９０℃で５分間熱不活化し、それによってｃＤＮＡ産物が得られた。続いて、２．５μＬのｃＤＮＡ産物に、０．５μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、０．５μＬのＰｒｏｚｙｍｅ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｔｅｃｈ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ，Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）（２単位）、２μＬの１０×Ｐｒｏｚｙｍｅ（商標）バッファー、プライマー（１μＬの１μｇ／μＬのセンスＤＮＡおよび１μＬの１μｇ／μＬのアンチセンスＤＮＡ）および滅菌水を加えて総容積２０μＬとし、ＤＮＡサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ）中でインキュベートした。次いで、変性温度下９４℃、アニーリング温度５０℃および伸長温度７２℃下、３０サイクルのＰＣＲ反応を実施した。標的遺伝子（マウスＣＤ３６、マウスカテプシンおよびマウス肝細胞増殖因子（ＨＧＦ））のセンスおよびアンチセンスプライマーを含むプライマー配列を、下記表３に列挙する。
【００４５】
【表３】
【００４６】
ＣＤ３６は、既知ＡＧＥと結合するＢ型スカベンジャー受容体である（Ｖｌａｓｓａｒａら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２５１：８７〜１０１頁、２００２年）。カテプシンＤは、ＡＧＥを分解する酸性リソソームプロテアーゼである（Ｍｉｙａｔａら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７２（７）：４０３７〜４０４２頁、１９９７年）。ＨＧＦは、肝臓において、クッパー細胞によって産生され、肝細胞の機能を促進する増殖因子である（Ｌａｌａｎｉら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １５：８１１〜８１７頁、２００５年）。粗抽出物ＰＨの効果の測定では、ＣＤ３６遺伝子（３４５ｂｐ）（遺伝子ハツカネズミ属筋肉ＣＤ３６抗原（Ｃｄ３６）、ｍＲＮＡとして規定され、Ｓｈｏｒｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅａｓｅａｒｃｈ，３０（８）：１７６７〜１７７３頁、２００２年における開示に従って設計された、Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ番号（受託）：ＮＭ＿００７６４３参照）、カテプシンＤ遺伝子（８６７ｂｐ）（ハツカネズミ属筋肉カテプシンＤ、ｍＲＮＡ、完全コード配列として規定される、Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ番号（受託）：ＢＣ５４７５８参照）およびＨＧＦ遺伝子（２５０ｂｐ）（ハツカネズミ属筋肉肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ｍＲＮＡとして規定され、Ｉｋａｒｉら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ２２８：１７３〜１８４頁、２００３年における開示に従って設計された、Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ番号（受託）：ＮＭ＿０１０４２７．２参照）の発現パターンを、クッパー細胞において評価し、他方で、β−アクチン遺伝子（５１０ｂｐ）（ハツカネズミ属筋肉アクチン、β、細胞質（ｃｙｔｉｐｌａｓｍｉｃ）（Ａｃｔｂ）、ｍＲＮＡとして規定される、Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ番号（受託）：ＮＭ＿００７３９３参照）の発現は内部対照として提供された。図３に示されるように、粗抽出物は、細胞において、カテプシンＤならびにＣＤ３６およびＨＧＦの発現を増大させた。また、発現パターンは、クッパー細胞の食作用と線形相関を示した。したがって、カテプシンＤ、ＣＤ３６およびＨＧＦ遺伝子の発現の増大を考慮すると、粗抽出物ＰＨが、ＡＧＥの肝クリアランスを亢進することは明らかである。
【実施例７】
【００４７】
ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）動物モデルに対するＰＨの効果
ＳＴＺマウスモデル
この実験では、８週齢のＣ５７ＢＬ／６ｊマウスを選択した。マウスを、正常群（ＳＴＺ誘発ＤＭ（真性糖尿病）をもたない正常マウス）、対照ＳＴＺ群（ＳＴＺ誘発ＤＭマウス）、２００ｍｇ／ｋｇ／日のＰＨ群（２００ｍｇ／ｋｇ／日のＰＨを与えられたＳＴＺ誘発ＤＭマウス）および１０００ｍｇ／ｋｇ／日のＰＨ群（１０００ｍｇ／ｋｇ／日のＰＨを与えられたＳＴＺ誘発ＤＭマウス）に無作為にグループ化した。各群に５匹のマウスとした。マウスにおいてＤＭを誘発するために、ＳＴＺ（０．３ｍＬの０．１Ｍクエン酸バッファー、ｐＨ４．５に溶解した）を、１日目に１２０ｍｇ／ｋｇの用量で腹膜内（ｉｐ）注射し、次の３日間８０ｍｇ／ｋｇの用量でｉｐ注射した。ＳＴＺの最後の注射の後、血漿グルコースを毎週モニターし、高い血漿グルコースレベル（＞４００ｍｇ／ｄＬ）を有するマウスを、以後の実験においてＳＴＺ誘発マウスとして選択した。ＰＨ群マウスには、ＰＨを２カ月間給餌したのに対し、対照および正常群のマウスには正常マウス飼料を与えた。２カ月後、肝臓および腎臓組織病理を評価して薬物有効性を調べた。
尿アルブミン濃度分析
尿を、タンパク質定量化のために１００×希釈した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準を、ＢＣＡ分析のために段階希釈した（２ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、１２５μｇ／ｍＬ、６１．５μｇ／ｍＬ、３１．２５μｇ／ｍＬおよび０μｇ／ｍＬ）。３７℃で３０分間インキュベートした後、Ｏ．Ｄ．５７０ｎｍ吸光度測定値をとり、標準曲線をプロットした。線形回帰分析を実施して、定量的標準曲線およびＲ２値を得た。総タンパク質濃度は、標準曲線から算出した。
尿アルブミンのＥＬＩＳＡ試験
９６ウェルプレートの各ウェルを、固定総タンパク質含量（１００μＬのＰＢＳ中、１００μｇの総タンパク質）を有する希釈した尿サンプルを用いてコーティングし、４℃で一晩保存した。次いで、尿サンプルを洗浄バッファー（ＰＢＳ中、０．０５％ ｖ／ｖ、Ｔｗｅｅｎ（商標）２０）を用いて４回洗浄し、その後、５％ミルクを用いて室温で２時間ブロッキングした。洗浄バッファーを用いて、さらに４回洗浄した後、各ウェルに５０μＬの抗ＭＳＡポリクローナル抗体希釈溶液（３％ミルクで１：１０００）を加え、室温で２時間インキュベートした。洗浄バッファーを用いて６回洗浄した後、各ウェルにペルオキシダーゼとコンジュゲートしているヤギ抗ニワトリＩｇＧ希釈溶液（ＰＢＳ−ＢＳＡで１：１０００）を加え、室温で２時間インキュベートした。１００μＬの１ｍｇ／ｍＬのＯ−フェニレンジアミン（０．１Ｍクエン酸、ｐＨ５．５中）および５μＬのＨ２Ｏ２ととものインキュベーションによって結合しているペルオキシダーゼを調べた。反応は、２ＮのＮＨ２ＳＯ４（２０μＬ／ウェル）を加えることによって、１０分後に停止し、吸光度は、ＥＬＩＳＡリーダーによって４９０ｎｍの波長で測定し、正常マウスの平均吸光度を用いて標準化して、表４に示されるような相関指数を調べた。
【００４８】
【表４】
【００４９】
表４に示される結果から、２００ｍｇ／ｋｇ／日のＰＨまたは１０００ｍｇ／ｋｇ／日のＰＨを与えられたマウスにおける尿アルブミンレベルは、対照群のＳＴＺ誘発マウスよりも有意に低かった。したがって、上記の結果は、２００ｍｇ／ｋｇ／日または１０００ｍｇ／ｋｇ／日の粗抽出物ＰＨが投与された場合に、ＳＴＺ誘発マウスの腎臓機能が回復したことを示す。
組織病理
肝臓および腎臓組織を、犠牲にされた後にマウスから採取し、末梢筋肉組織およびその結合組織を摘出した。次いで、組織を４％パラホルムアデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｄｅｈｙｄｅ）中で固定し、パラフィン包埋し、その後組織を、各々５μｍ厚を有する切片に切断した。これらの組織切片を、キシレン中で脱パラフィンし、勾配エタノール（１００％エタノール、９５％エタノール、８０％エタノール）ですすぎ、その後、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【００５０】
次いで、上記のように調製した肝臓組織切片を、光学顕微鏡下で観察した。図４Ａは、正常なマウスに由来する肝細胞を含む健常な肝臓組織切片を示す。図４Ｂを参照すると、ＳＴＺ誘発マウスの肝臓組織切片において、いくつかの小胞が見られ、このことは、肝細胞における脂肪変性の発生を示した。図４Ｃおよび４Ｄに示されるように、種々の投与量のＰＨを与えられたＳＴＺ誘発マウスでは、肝臓組織が、用量依存的に修復され、損傷が防がれていたが、これらの肝臓組織切片では、わずかなグリコーゲン蓄積は依然として観察される場合がある。
【００５１】
図５Ａは、正常マウスに由来する糸球体を含む健常な腎臓組織切片を示す。図５Ｂでは、ＳＴＺ誘発マウスの腎臓組織切片は、正常マウスの健常な腎臓切片と対照的に、損傷を受けた糸球体を示す。図５Ｃおよび５Ｄに示されるように、ＳＴＺ誘発マウスは、種々の投与量のＰＨを与えられ場合、腎臓組織が、用量依存的に修復され、損傷が防がれていたが、これらの腎臓組織切片では、いくつかの損傷を受けた糸球体が依然として観察される場合がある。
【実施例８】
【００５２】
ＡＧＥ−ＢＳＡマウスモデルに対するＰＨの効果
マウス血清調製
全血サンプルを、眼窩出血によって２週間毎にマウスから採取した。血液を室温で少なくとも２時間凝固させ、次いで、遠心分離して血清を得た。血清はアッセイされるまで−２０℃で保存した。
血清アルブミン精製
マウス血清は０〜４℃で維持した。沈殿物を、同温度、９，０００ｇで１５分間の遠心分離によって除去した。上清を、等容積の５０％エタノール（ｐＨ６．７）を用いてｐＨ６．９に調整し、１０分間静置し、その後さらに、９，０００ｇで１５分間遠心分離して上清の画分Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩを得た。
【００５３】
上清の画分Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩを、半分の容積の７０％エタノール（ｐＨ５．８）を用いて再度滴定して、ｐＨ５．８に調整し、１０分間静置し、その後、９，０００ｇで１５分間遠心分離して画分ＩＶ沈殿物を得た。画分ＩＶ上清はｐＨ４．８に調整し、続いて、−５℃で６０分間氷上で静置し、９，０００ｇで１０分間遠心分離して画分Ｖを得た。画分Ｖは重量分析のために、凍結し、乾燥させた。
ＡＧＥ−ＭＳＡ調製
０．１ｇ／ｍｌ ＭＳＡ（マウス血清アルブミン）および１８０ｍｇ／ｍｌグルコースを、リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）に別個に溶解した。この溶液を、０．２２μｍの滅菌フィルターを用いて濾過した。１５ｍＬ試験管に５ｍＬの溶液を加え、これをパラフィルムで密閉し、３７℃、暗所でインキュベートした。８週間保存した後、溶液を、４℃の蒸留水（１／１００、ｖ／ｖ）で３または４回透析してグルコースを完全に除去した。得られたＡＧＥ−ＭＳＡを、０．２２μｍの滅菌フィルターを用いて濾過し、凍結乾燥して粉末にし、定量し、その後、再溶解し、−２０℃で保存した。
ＡＧＥマウスモデル
１０週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、正常群（いずれの注射も施していない正常マウス）、ＭＳＡ対照群（ＭＳＡで注射されたマウス）、２００ｍｇ／ｋｇ／日のＰＨ群（２００ｍｇ／ｋｇ／日のＰＨを与えられたＡＧＥ注射マウス）、１０００ｍｇ／ｋｇ／日のＰＨ群（１０００ｍｇ／ｋｇ／日のＰＨを与えられたＡＧＥ注射マウス）およびＡＧＥ−ＭＳＡ対照群（糖尿病性血管合併症を誘発するためにＡＧＥ−ＭＳＡを注射されたマウス）に無作為にグループ化した。各群に５匹のマウスとした。２００μＬの容積のＡＧＥｓ−ＭＳＡを用いて、マウスに静脈内注射した。マウスに、８回の静脈内注射で投与し、各注射は４ｍｇ／１回／マウス対照ＭＳＡまたはＡＧＥ−ＭＳＡ（２回／週で４週間）を含有していた。マウスには、１５日目から種々の用量のＰＨを含有するマウス飼料を与えた。２カ月後、マウスを犠牲にし、それらの肝臓および腎臓を組織病理検査用に摘出した。
【００５４】
図６Ｅを参照すると、肝細胞の形が不規則であり、ＡＧＥ−ＭＳＡ対照群におけるマウスの肝臓組織切片において細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の蓄積があり、このことは、大規模な肝細胞が損傷を受けたことを示した。対照的に、粗抽出物ＰＨを与えられたマウスから得た肝臓組織切片では、このような損傷は観察されなかった（図６Ｃおよび６Ｄ）。したがって、粗抽出物ＰＨは、ＡＧＥ−ＭＳＡによって引き起こされる肝臓損傷を最小にすることができるということが実証された。正常またはＭＳＡ対照マウスの腎臓組織切片では、糸球体は無傷であり、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の増大はない（図７Ａおよび７Ｂ）。対照的に、ＡＧＥ−ＭＳＡを注射したマウスから得た腎臓組織切片において観察されるように、糸球体は明らかに損傷を受けており、肥大していた（図７Ｅ）。ＡＧＥ注射されたマウスが、種々の投与量のＰＨ（２００ｍｇ／ｋｇ／日のＰＨおよび１０００ｍｇ／ｋｇ／日のＰＨ）を与えられた場合には、腎臓組織は、それ自体、正常マウスの腎臓に似るよう修復され、回復された。
【００５５】
当業者には当然であろうが、その広範な発明概念から逸脱することなく上記の実施形態に変更を行うことができる。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に制限されないが、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨および範囲内の改変を包含するものであるということが理解される。
【配列表フリーテキスト】
【００５６】
配列番号１〜９ プライマー
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００６年６月１４日に出願した米国仮特許出願第６０／８０４，６５６号および２００６年１０月１８日に出願した米国非仮特許出願第１１／５８２，８９４号の利益を主張し、それらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、糖尿病性血管合併症の医療、詳細には、ヤマノイモ属種の抽出産物を用いて糖尿病性血管合併症を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
非酵素的な糖化（メイラード反応）は、糖尿病性血管合併症の発病の原因とされている。最近の免疫組織化学的研究によって、糖尿病の被験体では最終糖化反応物（ＡＧＥ）の形成が亢進されていることが示された（Ｌｉｕら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ．４８：２０７４〜２０８２頁、１９９９年）。ＡＧＥ形成は、それ自体が、組織タンパク質の構造および機能特性を変化させることがわかっている。さらに、ＡＧＥ修飾タンパク質と種々の種類の細胞の間の相互作用は、糖尿病の被験体において観察される異常において病的役割を果たすと考えられている。したがって、身体におけるＡＧＥの過剰な蓄積は、アテローム性動脈硬化病変、腎症、血管損傷、神経障害および網膜症などの糖尿病性血管合併症を誘発する主要因と示唆されている（Ｖｌａｓｓａｒａら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２５１：８７〜１０１頁、２００２年）。
【０００４】
慢性高血糖症は、本質的に、糖尿病性血管合併症の発生および進行に関与している。肝臓では、ＡＧＥ修飾タンパク質のエンドサイトーシスが、スカベンジャー受容体の喪失および肝類洞内皮細胞における細胞内輸送の遅延をもたらす（Ｈａｎｓｅｎら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ４５：１３７９〜１３８８頁、２００２年）。腎臓では、ＡＧＥ修飾ＩＶ型コラーゲンおよびラミニンは、負に帯電したプロテオグリカンと相互作用するその能力を低下させ、アルブミンに対する血管透過性を増大させる（Ｓｉｌｂｉｇｅｒら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ４３：８５３〜６４頁、１９９３年）。
【０００５】
今日まで、ＡＧＥ形成を防ぎ、細胞に対するＡＧＥ作用を低減し、既存のＡＧＥ架橋を分解しようとするいくつかのアプローチがあった。重要な薬理学的戦略は、小さな求核ヒドラジン化合物アミノグアニジン、ＡＧＥ媒介性架橋の強力な阻害剤を利用してきた。ラットにおいて糖尿病性糸球体硬化症の進行を防ぐことがわかっているチアゾリジン誘導体ＯＰＢ−９１９５をはじめとする別のＡＧＥ阻害性薬剤は、依然として開発下にある。アンジオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥＩ）、例えば、ランプリル（ｒａｍｐｒｉｌ）も、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）で治療された糖尿病マウスにおいて腎症を軽減することがわかっている。
【０００６】
これまでに開発された化合物または薬物は、ＡＧＥおよびＡＧＥ架橋の形成を阻害することを対象としていたが、既存のＡＧＥは、特定の化合物または薬物によっては除去されず、依然として糖尿病の被験体では細胞および組織を損傷する。糖尿病の被験体に投与された化合物または薬物と関連している毒性および副作用を明らかにすることもまた困難である。
【０００７】
ヤマノイモ属は、漢方に用いられる極めて重要な薬用植物の１種であり、その薬効は長年研究されてきた。１９３６年に、Ｔｓｕｋａｍｏｔｏらが、ヤマノイモ科の植物からジオスゲニン、ヤマノイモ属のステロイドサポニンを単離し、単離されたジオスゲニンを薬用ステロイドの迅速合成のための原材料として用いた。しかし、糖尿病性血管合併症の治療においてヤマノイモ属の抽出産物を用いる研究はいまだ実施されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国仮特許出願第６０／８０４，６５６号
【特許文献２】米国非仮特許出願第１１／５８２，８９４号
【特許文献３】米国特許出願番号１１／２７４，７７５号
【特許文献４】米国特許出願公開第２００６００６８０３６ Ａ１号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｌｉｕら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ．４８：２０７４〜２０８２頁、１９９９年
【非特許文献２】Ｖｌａｓｓａｒａら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２５１：８７〜１０１頁、２００２年
【非特許文献３】Ｈａｎｓｅｎら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ４５：１３７９〜１３８８頁、２００２年
【非特許文献４】Ｓｉｌｂｉｇｅｒら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ４３：８５３〜６４頁、１９９３年
【非特許文献５】Ｎｅｉ，Ｍ．およびＷ．Ｈ．Ｌｉ．１９７９年、Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｅｒｍｓ ｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｏｃ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７６；５２６９〜５２７３頁
【非特許文献６】Ｍｉｙａｔａら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７２（７）：４０３７〜４０４２頁、１９９７年
【非特許文献７】Ｌａｌａｎｉら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １５：８１１〜８１７頁、２００５年
【非特許文献８】Ｓｈｏｒｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅａｓｅａｒｃｈ、３０（８）：１７６７〜１７７３頁、２００２年
【非特許文献９】Ｉｋａｒｉら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ２２８：１７３〜１８４頁、２００３年
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、治療有効量のヤマノイモ属種(Dioscorea species)の抽出産物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、糖尿病性血管合併症の治療方法に関する。
【００１１】
別の言い方をすれば、本発明は、糖尿病性血管合併症を治療するための医薬品の調製のための、ヤマノイモ属種の抽出産物の使用であって、医薬品を、それを必要とする被験体に治療有効量で投与する使用に関する。
【００１２】
前記の概要ならびに以下の発明の詳細な説明は、添付の図面と併せて読まれた場合により良好に理解される。図面には、本発明を例示する目的上、目下のところ好ましいものである実施形態が示されている。しかし、本発明は、図面と関連している厳密な実験条件およびパラメータに制限されないということを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】それぞれ、ヤマノイモ属種のメタノール抽出物およびエタノール抽出物のＨＰＬＣ分析によって生じたピークを示すクロマトグラムである。
【図１Ｂ】それぞれ、ヤマノイモ属種のメタノール抽出物およびエタノール抽出物のＨＰＬＣ分析によって生じたピークを示すクロマトグラムである。
【図２】配列番号１の単一のランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）プライマーを用いて増幅された、１４種のヤマノイモ属種の試験パネルの増幅産物の電気泳動マーカープロフィールを示す合成像である。
【図３】クッパー細胞における一連の遺伝子発現を示す合成像である。
【図４】（図４Ａ〜４Ｄ）ＳＴＺ誘発糖尿病マウスの種々の肝臓組織像を示す顕微鏡画像であり、各画像は４００×の倍率を有し、バースケールは５０μｍを表す。
【図５】（図５Ａ〜５Ｄ）ＳＴＺ誘発糖尿病マウスの種々の腎臓組織像を示す顕微鏡画像であり、各画像は４００×の倍率を有し、バースケールは５０μｍを表す。
【図６】（図６Ａ〜６Ｅ）ＡＧＥ注射マウスの種々の肝臓組織像を示す顕微鏡画像であり、各画像は６４０×の倍率を有し、バースケールは２０μｍを表す。
【図７】（図７Ａ〜７Ｅ）ＡＧＥ注射マウスの種々の腎臓組織像を示す顕微鏡画像であり、各画像は６４０×の倍率を有し、バースケールは２０μｍを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のより良好な理解のために、本明細書において用いられる用語のうちいくつかをより詳細に説明する。
【００１５】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、１または１を超える（すなわち、少なくとも１の）、その冠詞の文法上の対象を指すよう本明細書において用いられる。例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」とは、１つの要素または１を超える要素を意味する。
【００１６】
本明細書において用いられる用語「糖尿病性血管合併症」は、心血管疾患、神経障害、網膜症および腎症をはじめとする、真性糖尿病の経過の間に生じ、糖尿病患者における身体障害および高死亡率の主な原因となり得る血管障害を指す。
【００１７】
本明細書において使用される場合、「パーセント」または「％」とは、成分が一部である組成物の重量に基づいて用いられる成分の重量パーセントを意味する。
【００１８】
本明細書において使用される場合、「被験体」とは、哺乳動物など、具体的にはヒトを含めた、糖尿病性血管合併症でありまたはそれに罹患し得る任意の動物である。
【００１９】
本発明は、治療有効量のヤマノイモ属種の抽出産物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、糖尿病性血管合併症の治療方法を提供する。本発明の一例では、ヤマノイモ属種の抽出産物は、
（ａ）ヤマノイモ属種の塊茎を、酢酸の存在下でアルコールベースの溶媒と混合して、抽出組成物を得るステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）において得られた抽出組成物を分離処理に供して、可溶性画分を得るステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において得られた可溶性画分から溶媒を除去してヤマノイモ属種の抽出産物を得るステップと
を含むプロセスによって調製される。
【００２０】
アルコールベースの溶媒は、溶媒として作用できる任意の適したアルコールを含む。例えば、制限するものではないが、アルコールベースの溶媒は、メタノール、エタノール、イソプロパノールまたはブタノールまたはそれらの混合物を含む。一実施形態によれば、ヤマノイモ属種の塊茎を、約１％の酢酸溶液の存在下、エタノールで抽出する。好ましくは、ヤマノイモ属種の塊茎を、約１％の酢酸溶液の存在下で約５０〜約９０％のエタノールで抽出する。本発明の一実施形態では、ヤマノイモ属種の塊茎を、約１％の酢酸溶液の存在下で約８５％のエタノールで抽出する。別の実施形態によれば、ヤマノイモ属種の塊茎を粉砕し、約１％の酢酸溶液の存在下で約３０％〜約９０％のメタノール（例えば、約４０％のメタノール）と混合する。抽出された混合物を、一晩静置させ、真空濾過などの濾過ステップによって分離して濾液を得る。次いで、濾液を凍結乾燥してヤマノイモ属の粗抽出物を得てもよい。
【００２１】
本発明の一例では、本方法は、調製プロセスのステップ（ａ）の前に、以下のステップを含むヤマノイモ属種の塊茎の予備処理を、必要に応じて含む：
（ｉ）ヤマノイモ属種の塊茎を、約１％の酢酸溶液に浸漬するステップと、
（ｉｉ）ヤマノイモ属種の塊茎を粉砕するステップと、
（ｉｉｉ）粉砕され、酢酸処理されたヤマノイモ属種の塊茎を凍結乾燥して、粉砕され、凍結乾燥され、酢酸処理されたヤマノイモ属種の塊茎を生成するステップ。
【００２２】
本発明の一実施形態によれば、ヤマノイモ属種の塊茎を約１％の酢酸溶液に浸漬し、その後、酢酸処理された塊茎を粉砕し、次いで凍結乾燥するステップと、凍結乾燥された塊茎を、アルコールベースの溶媒を用いて浸漬することによって抽出するステップと、粉砕され、凍結乾燥された塊茎を、アルコールベースの溶媒と混合して、混合物を形成するステップと、混合物を一晩静置させて、抽出産物を得るステップとによって、ヤマノイモ属種の抽出産物を調製してもよい。
【００２３】
本発明はまた、糖尿病性血管合併症の治療方法を提供する。本方法は、治療有効量のヤマノイモ属種の抽出産物を、このような治療を必要とする被験体に投与することを含み、抽出産物は、
（ａ）ヤマノイモ属種の塊茎を、約１％の酢酸溶液に浸漬するステップと、
（ｂ）酢酸処理されたヤマノイモ属種の塊茎を粉砕するステップと、
（ｃ）粉砕され、酢酸処理されたヤマノイモ属種の塊茎を凍結乾燥して、粉砕され、凍結乾燥され、酢酸処理されたヤマノイモ属種の塊茎を生成するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の粉砕され、凍結乾燥され、酢酸処理されたヤマノイモ属種の塊茎の少なくとも一部を、約１％の酢酸溶液の存在下でアルコールベースの溶媒と混合して抽出組成物を得るステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）において得られた抽出組成物を分離処理に供して、可溶性画分を得るステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）において得られた可溶性画分から溶媒を除去して、ヤマノイモ属種の抽出産物を得るステップと
を含むプロセスによって調製される。
【００２４】
本発明の一実施形態によれば、本発明の調製プロセスおよび治療方法において用いられるヤマノイモ属種は、ヤマノイモ属種のゲノムＤＮＡが配列番号９のプライマーを用いて増幅された場合に、以下の１４種のＤＮＡバンド：ヤマノイモ属種のゲノムＤＮＡが配列番号９のプライマーを用いて増幅された場合に、４２８ｂｐ、４５２ｂｐ、５３７ｂｐ、６０２ｂｐ、７２３ｂｐ、８１７ｂｐ、９３４ｂｐ、１１４０ｂｐ、１２４２ｂｐ、１４７８ｂｐ、１６４１ｂｐ、１９０４ｂｐ、２１５１ｂｐおよび２９１８ｂｐを含むランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）フィンガープリントによって特徴付けられる、ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．ファイト（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ａｌａｔａ Ｌ．ｃｖ．Ｐｈｙｔｏ）である。ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）解析は、実施例４に記載されている。
【００２５】
一実施形態によれば、治療有効量のヤマノイモ属種の抽出産物は、糖尿病性血管合併症の治療を必要とする被験体に経口経路によって投与される。しかし、抽出産物は、同様の治療効果を達成するために任意のその他の適当な投与経路、例えば、静脈内、腹腔内、経皮経路、特に、鼻腔経路を含む経粘膜経路において、それを必要とする被験体に投与してもよい。
【００２６】
当業者にとっては、治療有効量ならびに投与量および投与頻度は、その知識および本開示に基づく単なる日常的な実験の標準法に従って容易に決定できる。投与量は、約１〜約１００ｍｇ／体重１ｋｇ／日、好ましくは、約５〜約４０ｍｇ／体重１ｋｇ／日、最も好ましくは、約１０〜約３０ｍｇ／体重１ｋｇ／日であり得る。
【００２７】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するために提供する。これらの実施例は、本発明の範囲を制限することを意図するものではなく、そのように制限しないものと解釈すべきである。
本発明の実施例
【実施例１】
【００２８】
ヤマノイモ属種の粗抽出物（ＰＨ）の調製
皮をむいたヤマノイモ属種の塊茎を、１％酢酸の存在下でアルコールベースの溶液に浸漬した。撹拌した後、混合溶液を一晩静置させた。このプロセスから得られた可溶性部分を凍結乾燥して、ヤマノイモ属種の粗抽出物（ＰＨ）を得た。
【００２９】
具体的には、１．４ｋｇの皮をむいたヤマノイモ属種の塊茎を、角切りにし、１％酢酸溶液に浸漬した。これらの角切りを一晩酢酸溶液に浸漬し、上清を除去した。これらの角切りを凍結乾燥し、その後、抽出した。
【００３０】
凍結乾燥した角切りを粉砕し、約１％の酢酸溶液の存在下で、約１．５〜約２．５Ｌの溶媒として、約３０％〜約９０％のメタノール（例えば、約４０％のメタノール）と混合した。混合物を一晩静置し、真空濾過によって濾過して濾液を得た。次いで、濾液を凍結乾燥して、ヤマノイモ属種の粗抽出物（ＰＨ）を得た。
【００３１】
あるいは、凍結乾燥した角切りを粉砕し、約１％の酢酸溶液の存在下で、約１．５〜約２．５Ｌの溶媒として、約５０〜約９０％のエタノール（例えば、約８５％のエタノール）と混合した。同様に、混合物を一晩静置し、真空濾過によって濾過して濾液を得た。次いで、濾液を凍結乾燥して、ヤマノイモ属種の粗抽出物（ＰＨ）を得た。
【実施例２】
【００３２】
ヤマノイモ属種の粗抽出物（ＰＨ）の分析
実施例１から得られた粗抽出物（メタノールおよびエタノール抽出物を含む）を、２つのポンプ（ＬＣ−１０ＡＴ）、ＳＰＤ−１０Ａ可変波長プログラム可能ＵＶ／Ｖｉｓフォトダイオードアレイ検出器、ＳＣＬ−１０Ａシステムコントローラーおよびガードカラム（３５ｍｍ×４．６ｍｍおよび５μｍパッキング；Ｓｕｐｅｌｃｏ）を取り付けたＣ−１８カラム（Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ、２５０ｍｍ×４．６ｍｍおよび５μｍパッキング；Ｓｕｐｅｌｃｏ、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＵＳＡ）を備えるＳｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣシステム（Ｃｌａｓｓ ＶＰ ６．１２バージョンソフトウェアを用いるＣｌａｓｓ ＶＰシリーズ；Ｓｈｉｍａｄｚｕ、京都、日本）を用いてＨＰＬＣによって分析した。
【００３３】
ＰＨ（１０ｍｇ／ｍＬ）のＨＰＬＣサンプルは、８８％の水（移動相Ａ）と１２％のメチルアルコール（移動相Ｂ）とを含有する移動相を用いて２０μＬのアリコートに調製し、０．９ｍＬ／分の流速で移動相を用いて平衡化したカラムに添加した。すべての有機溶媒は、ＨＰＬＣ等級であり、０．２２μｍのフィルターで濾過し、使用前に脱気した。ＨＰＬＣ法の合計実行時間は２０分に設定した。溶出プロフィールは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＳＰＤ−１０Ａ ＵＶ−Ｖｉｓフォトダイオードアレイ検出器で２６０ｎｍでモニターした。結果は、下記表１に列挙される以下のパラメータに基づいて定量化した。得られたクロマトグラムを、Ｃｌａｓｓ ＶＰ ６．１２バージョンソフトウェア（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、京都、日本）を用いて処理し、記録した。
【００３４】
【表１】
【００３５】
図１Ａおよび１Ｂの両方を参照すると、プロフィール中のピークは十分に分離されていた。プロフィール中にいくつかのピークが観察され、ピーク４はＰＨ中の有効成分を示す。図１Ａおよび１Ｂに示されるように、ピーク４の保持時間は、メタノール抽出物については約７．０４５分であり、エタノール抽出物については約７．４７４であった。したがって、ヤマノイモ属種のメタノール抽出物のＨＰＬＣプロフィールは、エタノール抽出物のものと同様である。ヤマノイモ属種のメタノール抽出物は、化学成分においてヤマノイモ属種のエタノール抽出物とほとんど同様であり、それらは治療において同様の活性および有効性を提供するはずである。
【実施例３】
【００３６】
粗抽出物（ＰＨ）を含有するマウス飼料の調製
Ｐｕｒｉｎａ Ｃｈｏｗ５００１という市販のマウス飼料を粉砕して粉末にした。粉砕された飼料に、凍結乾燥した粗抽出物ＰＨを、同量の粉砕された飼料を置き換える量で加えて、飼料混合物を形成した。飼料混合物を蒸留水と均一に混合し、押し出し成形によって再形成し、電子レンジで適当な出力で２分間焼成し、室温に冷却した後−７０℃で冷凍した。凍結乾燥後、飼料混合物を、元のＰｕｒｉｎａ Ｃｈｏｗ飼料のものと極めて類似したペレットに形成した。このペレットを−２０℃の冷凍庫で保存した。このペレットを、給餌の当日に室温に加温し、滅菌作業台上でＵＶランプ照射によって滅菌した。種々の濃度の粗抽出物を含有する飼料混合物を調製した。
【実施例４】
【００３７】
ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）解析におけるヤマノイモ属種の特徴付け
ＤＮＡ抽出
未知のヤマノイモ属種の１種（サンプル番号１００または１０２として２連で示されている）を、すべて台湾において栽培された、ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．（栽培品種）タイナン（Ｔａｉｎｕｎｇ）番号１（サンプル番号１）、ディオスコレア・エスクレンタ（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）（サンプル番号３）、ディオスコレア・ブルビフェラ（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ｂｕｌｂｉｆｅｒａ）（サンプル番号４）、ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ａｌａｔａ Ｌ．ｃｖ．）８７０２（サンプル番号５）、ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．サンジＡ（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ａｌａｔａ Ｌ．ｃｖ．Ｓａｎｚｈｉ Ａ）（サンプル番号６）、ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．サンジＢ（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ａｌａｔａ Ｌ．ｃｖ．Ｓａｎｚｈｉ Ｂ）（サンプル番号７）、ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．ダイエショウフェング（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ａｌａｔａ Ｌ．ｃｖ．Ｄａｙｅｓｈｏｕｆｅｎｇ）（サンプル番号９）、ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．タイナン（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ａｌａｔａ Ｌ．ｃｖ．Ｔａｉｎｕｎｇ）番号２（サンプル番号１０）、ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．ジーファ（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ａｌａｔａ Ｌ．ｃｖ．Ｊｉｆａ）（サンプル番号６７）、ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．チャンアール（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ａｌａｔａ Ｌ．ｃｖ．Ｚｈａｎｇｅｒ）番号２（サンプル番号６４）、ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．ダーシャン（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ａｌａｔａ Ｌ．ｃｖ．Ｄａｓｈａｎ）番号３（サンプル番号１３）、ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．ダーシャン番号２（サンプル番号１２）およびディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．タイドン（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ａｌａｔａ Ｌ．ｃｖ．Ｔａｉｄｏｎｇ）（サンプル番号１１）を含む１３種の既知のヤマノイモ属種の試験パネルとともに特徴付けた。
【００３８】
配列決定することによってヤマノイモ属種を特徴付けるために、各ヤマノイモ属の０．２ｇの新鮮な葉のサンプルを集め、液体窒素と混合し、乳鉢中で粉砕した。１．５ｍｌの遠心管中で、粉砕された組織を、９００μｌの２％ＣＴＡＢ抽出バッファー（１．４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０の１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．２％（β−メルカプトエタノールを含有）と混合し、続いて、６５℃の水浴中で３０分間インキュベートした。次いで、このサンプルを遠心分離し、上清を、６００μＬのクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を含む清浄な管に移し、サンプルが乳化状態となるまでボルテックス処理をした。このサンプルをさらに遠心分離し、上清を清浄な管に移し、４０μＬの１０％ＣＴＡＢ（０．７Ｍ ＮａＣｌ含有）および４００μＬのクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）と混合した。このサンプルを再度遠心分離し、上清（４００μＬ）を清浄な管に移し、４００μＬのＣＴＡＢ沈殿バッファーと混合し、氷上に約１５〜２０分間静置してＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡサンプルを、４００μＬの高塩ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１Ｍ ＮａＣｌ）および８００μＬの９５％エタノールですすいだ。ＤＮＡサンプルを遠心分離し、ペレットを、４００μＬの７５％エタノールでさらにすすぎ、その後、ＤＮＡペレットを蒸留脱イオン（ｄｄ）Ｈ２Ｏに再懸濁し、−２０℃で保存した。
ＲＡＰＤ反応
ＲＡＰＤ解析では、配列番号１のランダムＲＡＰＤプライマー、この場合にはＯＰＡ−１８（ＡＧＧＴＧＡＣＣＧＴ）（Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）を用いてヤマノイモ属種のゲノムＤＮＡを増幅した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、１０×バッファー、２．５ｍＭの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、２．０μＭのプライマー（Ｏｐｅｒｏｎ）、５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）および５ｎｇの鋳型ＤＮＡを含有する２５μＬ容積で実施した。サンプルを、９４℃で１分間の変性、３６℃で１分間のアニーリング、７２℃で２分間の伸長からなる４１サイクルおよび１回の７２℃で１０分間の最終伸長サイクルにかけた。ＰＣＲを完了した後、１０μＬの反応混合物を、電気泳動のために、０．５μｇ／ｍＬ臭化エチジウムを含有する２％アガロースゲルに添加した。
データ解析
ゲル電気泳動では、５００ｂｐ、１０００ｂｐ、１５００ｂｐ、２０００ｂｐ、２５００ｂｐ、３０００ｂｐ、３５００ｂｐおよび４０００ｂｐなど、種々の大きさの参照バンドを提供するために、ゲルの最初のレーン（左端にある）および最後のレーン（右端にある）の両方に、φＸ１７４ＤＮＡ／ＨａｅＩＩＩマーカー（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏ．，ＵＳＡ）などのＤＮＡ分子量マーカー（Ｍ）を添加し、続いて、各レーンに各ヤマノイモ属種のＰＣＲサンプルを添加した。各サンプルから得られた増幅されたＤＮＡ産物のプロフィールを、蛍光現像剤によって可視化し、画像取得ソフトウェア、ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ １２２０を用いて写真画像を獲得した。試験パネルに由来する各ヤマノイモ属種は、ＲＡＰＤフィンガープリントにおいて独自のＤＮＡバンドを生じたので、本発明のヤマノイモ属種のＲＡＰＤフィンガープラントを、その他のヤマノイモ属種と鑑別するよう調べた。具体的なヤマノイモ属種のフィンガープリントは、ヤマノイモ属種のゲノムＤＮＡを配列番号９のプライマーを用いて増幅した場合に、以下の１４種のＤＮＡバンド：ヤマノイモ属種のゲノムＤＮＡを、未知のヤマノイモ属種を特徴付けるために用いられる配列番号１のＯＰＡ−１８プライマーを用いて増幅した場合に、４２８ｂｐ、４５２ｂｐ、５３７ｂｐ、６０２ｂｐ、７２３ｂｐ、８１７ｂｐ、９３４ｂｐ、１１４０ｂｐ、１２４２ｂｐ、１４７８ｂｐ、１６４１ｂｐ、１９０４ｂｐ、２１５１ｂｐおよび２９１８ｂｐを含む（図２においてサンプル番号１００または１０２として、２連で示されている）。
【００３９】
２種のヤマノイモ属種の間の類似度指数を算出するために、クラスター分析または対分析もＧｅｌ−Ｃｏｍｐａｒソフトウェアを用いて実施した。分析に付されたパラメータは、ＲＡＰＤフィンガープリントから得たものとした。次いで、以下の方程式を用いるクラスター分析において、非加重結合法（ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ ｐａｉｒ−ｇｒｏｕｐｉｎｇ ｍｅａｎ ａｒｉｔｈｍｅｔｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＵＰＧＭＡ）を用いて、類似度指数（Ｆ）を算出した：
Ｆ＝２ｎｘｙ／ｎｘ＋ｎｙ
式中、ｎｘｙは、ヤマノイモ属種ｘおよびｙにおいて共通するＤＮＡバンドの数であり、ｎｘおよびｎｙは、ヤマノイモ属種ｘおよびｙそれぞれにおける総ＤＮＡバンドである（Ｎｅｉ，Ｍ．およびＷ．Ｈ．Ｌｉ．１９７９年、Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｅｒｍｓ ｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｏｃ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７６；５２６９〜５２７３頁）。
【００４０】
未知のヤマノイモ属種は、ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．サンジＡまたはディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．チャンアール番号２と、約８８．９％の類似度指数を有する。さらに、このヤマノイモ属種は、ディオスコレア・ブルビフェラまたはディオスコレア・エスクレンタと約３７．５％の類似度指数を有する。さらに、未知のヤマノイモ属種は、ディオスコレア・ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．タイナン（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ａｌａｔａ Ｌ．ｃｖ．Ｔａｉｎｕｎｇ）番号１、ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．８７０２、ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．サンジＢ、ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．ダイエショウフェング、ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．タイナン番号２、ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．ダーシャン番号３またはディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．ダーシャン番号２と、７５．５％を超える類似度指数を有する。クラスター分析または対分析結果に基づいて、未知のヤマノイモ属種は、既知の種とは異なるが、ディオスコレア・アラータ亜種とより類似しているということが理解された。したがって、未知のヤマノイモ属種を、参照によりその開示が本明細書に組み込まれる、２００５年１１月１５日に出願した米国特許出願番号１１／２７４，７７５号、２００６年３月３０日に公開した米国特許出願公開第２００６００６８０３６ Ａ１号に記載されるディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．ファイトと名付けた。
【実施例５】
【００４１】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ食作用アッセイに対する粗抽出物の効果
クッパー細胞の単離および培養
Ｃ５７ＢＬ６／ｊマウスに、１：３の割合で混合したＲｏｍｐｕｎ（登録商標）キシラジン麻酔およびケタミン（Ｓ−（＋）−ケタミン）麻酔の混合物を用いて腹膜内（ｉｐ）注射した。各マウスの中心静脈にポリエチレンカテーテルを用いてカニューレを挿入し、１０ｍｌのＣａ２＋不含ＨＢＳＳバッファーを用い、１ｍｌ／分の灌流速度で１０分間、０．０５％のＩＶ型コラゲナーゼを含有するＨＢＳＳバッファーを用い、１ｍｌ／分の灌流速度で１０分間肝臓組織を灌流して肝臓組織を軟化させた。軟化させた肝臓組織を摘出し、すすぎ、１対の鉗子によって切り開いて、肝臓組織から細胞懸濁液を放出した。結合組織を剥離した後、細胞懸濁液を、５３番のナイロンメッシュを用いて濾過し、３０ｇで３分間遠心分離した。次いで、細胞懸濁液を、６００ｇで５分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを、１５ｍＬのＲＢＣ溶解バッファーに再懸濁し、２分間反応を行わせた。細胞懸濁液に、１５ｍＬのＲＰＭＩ １６４０培地を加え、遠心分離し、細胞ペレットを、５ｍＬのＲＰＭＩ １６４０培地に再懸濁し、２５％（ｖ／ｖ）Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）密度勾配培地からなるＰｅｒｃｏｌｌ（商標）溶液の頂部の上に重層した。この細胞溶液を遠心分離し、濃縮されたクッパー細胞を含有する細胞ペレットを回収した。濃縮されたクッパー細胞を、ＲＰＭＩ １６４０培地を用いて洗浄し、血清不含ＲＰＭＩ １６４０培地に再懸濁した。
クッパー細胞の食作用アッセイ
クッパー細胞を、９６ウェル培養プレートに播種し（４×１０５個細胞／ウェル）、以下１０％ＦＣＳ ＲＰＭＩ培地としても知られる、１０％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ培地において、少なくとも２４時間培養した。培地を、種々の濃度（１０００μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬおよび１μｇ／ｍＬ）のＰＨを加えた２％ＦＣＳ ＲＰＭＩ培地に変更した。２時間培養した後、各ウェルに５０μｌのＰＢＳに懸濁した１μｍの大きさのＦＩＴＣビーズを加え（５×１０６個／ウェル）、３７℃で１．５時間さらに培養した。次いで、ＰＢＳで４回洗浄することによって結合していない１μｍの大きさのＦＩＴＣビーズを除去した。ＦｌｕｏｒｏＱｕｅｎｃｈ（商標）色素（０．５μＬ／ウェル）を加えて、取り込まれた１μｍの大きさのＦＩＴＣビーズからの蛍光をクエンチした。取り込まれた１μｍの大きさのＦＩＴＣビーズの蛍光は、１時間後にサイトフルオロメーターを用いて測定し、対照群の蛍光を用いて標準化して、表２に示されるように相対食作用指数を求めた。
【００４２】
【表２】
【００４３】
種々の濃度の粗抽出物ＰＨ（１０００μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬおよび１μｇ／ｍＬ）で処理したマウスクッパー細胞はすべて、いずれの処理も施していないマウスクッパー細胞の対照群と比較して取り込み食作用の亢進を示した。種々の濃度の、クッパー細胞食作用を促進し得るタフトシンは、このアッセイにおける陽性対照である。したがって、結果は、ヤマノイモ属の粗抽出物は、マウスクッパー細胞の細胞食作用を有意に促進したということを示唆するものである。
【実施例６】
【００４４】
関連遺伝子の発現に対するＰＨの効果
ＰＨで処理した細胞からの全ＲＮＡの単離
クッパー細胞を、６ウェルプレートにおいて培養した。培養培地を、血清不含培地と置換し、４時間維持した。細胞は、それぞれ１００μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬおよび１μｇ／ｍＬの濃度のＰＨを用いて４８時間処理した。ＰＨを用いて処理した後、細胞を回収し、１ｍＬのＵｌｔｒａｓｐｅｃ（商標）ＲＮＡ単離キット（Ｂｉｏｔｅｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（ＵＳＡ））に懸濁した。全ＲＮＡは、キットの標準プロトコールに従うことによって得た。得られた全ＲＮＡは、定量的に測定した。
逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析
逆転写は、以下の手順に従って実施した。まず、ｍＲＮＡを、２６．５μＬの、０．１μｇのオリゴ−ｄＴ、５μｇの全ＲＮＡを含有するＤＥＰＣ処理滅菌反応混合物中、７０℃で１０分間の熱処理によって変性した。逆転写は、総容積４０μＬとなるよう反応混合物に加えた、４μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、０．５μｌのｒＲＮａｓｉｎ、１μＬのＡＭＶ（トリ骨髄芽球症ウイルス）逆転写酵素（ＲＴ）（１０単位）および８μｌの５×ＲＴバッファーを用いて実施し、４２℃で６０分間インキュベートし、その後、９０℃で５分間熱不活化し、それによってｃＤＮＡ産物が得られた。続いて、２．５μＬのｃＤＮＡ産物に、０．５μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、０．５μＬのＰｒｏｚｙｍｅ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｔｅｃｈ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ，Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）（２単位）、２μＬの１０×Ｐｒｏｚｙｍｅ（商標）バッファー、プライマー（１μＬの１μｇ／μＬのセンスＤＮＡおよび１μＬの１μｇ／μＬのアンチセンスＤＮＡ）および滅菌水を加えて総容積２０μＬとし、ＤＮＡサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ）中でインキュベートした。次いで、変性温度下９４℃、アニーリング温度５０℃および伸長温度７２℃下、３０サイクルのＰＣＲ反応を実施した。標的遺伝子（マウスＣＤ３６、マウスカテプシンおよびマウス肝細胞増殖因子（ＨＧＦ））のセンスおよびアンチセンスプライマーを含むプライマー配列を、下記表３に列挙する。
【００４５】
【表３】
【００４６】
ＣＤ３６は、既知ＡＧＥと結合するＢ型スカベンジャー受容体である（Ｖｌａｓｓａｒａら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２５１：８７〜１０１頁、２００２年）。カテプシンＤは、ＡＧＥを分解する酸性リソソームプロテアーゼである（Ｍｉｙａｔａら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７２（７）：４０３７〜４０４２頁、１９９７年）。ＨＧＦは、肝臓において、クッパー細胞によって産生され、肝細胞の機能を促進する増殖因子である（Ｌａｌａｎｉら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １５：８１１〜８１７頁、２００５年）。粗抽出物ＰＨの効果の測定では、ＣＤ３６遺伝子（３４５ｂｐ）（遺伝子ハツカネズミ属筋肉ＣＤ３６抗原（Ｃｄ３６）、ｍＲＮＡとして規定され、Ｓｈｏｒｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅａｓｅａｒｃｈ，３０（８）：１７６７〜１７７３頁、２００２年における開示に従って設計された、Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ番号（受託）：ＮＭ＿００７６４３参照）、カテプシンＤ遺伝子（８６７ｂｐ）（ハツカネズミ属筋肉カテプシンＤ、ｍＲＮＡ、完全コード配列として規定される、Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ番号（受託）：ＢＣ５４７５８参照）およびＨＧＦ遺伝子（２５０ｂｐ）（ハツカネズミ属筋肉肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ｍＲＮＡとして規定され、Ｉｋａｒｉら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ２２８：１７３〜１８４頁、２００３年における開示に従って設計された、Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ番号（受託）：ＮＭ＿０１０４２７．２参照）の発現パターンを、クッパー細胞において評価し、他方で、β−アクチン遺伝子（５１０ｂｐ）（ハツカネズミ属筋肉アクチン、β、細胞質（ｃｙｔｉｐｌａｓｍｉｃ）（Ａｃｔｂ）、ｍＲＮＡとして規定される、Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ番号（受託）：ＮＭ＿００７３９３参照）の発現は内部対照として提供された。図３に示されるように、粗抽出物は、細胞において、カテプシンＤならびにＣＤ３６およびＨＧＦの発現を増大させた。また、発現パターンは、クッパー細胞の食作用と線形相関を示した。したがって、カテプシンＤ、ＣＤ３６およびＨＧＦ遺伝子の発現の増大を考慮すると、粗抽出物ＰＨが、ＡＧＥの肝クリアランスを亢進することは明らかである。
【実施例７】
【００４７】
ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）動物モデルに対するＰＨの効果
ＳＴＺマウスモデル
この実験では、８週齢のＣ５７ＢＬ／６ｊマウスを選択した。マウスを、正常群（ＳＴＺ誘発ＤＭ（真性糖尿病）をもたない正常マウス）、対照ＳＴＺ群（ＳＴＺ誘発ＤＭマウス）、２００ｍｇ／ｋｇ／日のＰＨ群（２００ｍｇ／ｋｇ／日のＰＨを与えられたＳＴＺ誘発ＤＭマウス）および１０００ｍｇ／ｋｇ／日のＰＨ群（１０００ｍｇ／ｋｇ／日のＰＨを与えられたＳＴＺ誘発ＤＭマウス）に無作為にグループ化した。各群に５匹のマウスとした。マウスにおいてＤＭを誘発するために、ＳＴＺ（０．３ｍＬの０．１Ｍクエン酸バッファー、ｐＨ４．５に溶解した）を、１日目に１２０ｍｇ／ｋｇの用量で腹膜内（ｉｐ）注射し、次の３日間８０ｍｇ／ｋｇの用量でｉｐ注射した。ＳＴＺの最後の注射の後、血漿グルコースを毎週モニターし、高い血漿グルコースレベル（＞４００ｍｇ／ｄＬ）を有するマウスを、以後の実験においてＳＴＺ誘発マウスとして選択した。ＰＨ群マウスには、ＰＨを２カ月間給餌したのに対し、対照および正常群のマウスには正常マウス飼料を与えた。２カ月後、肝臓および腎臓組織病理を評価して薬物有効性を調べた。
尿アルブミン濃度分析
尿を、タンパク質定量化のために１００×希釈した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準を、ＢＣＡ分析のために段階希釈した（２ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、１２５μｇ／ｍＬ、６１．５μｇ／ｍＬ、３１．２５μｇ／ｍＬおよび０μｇ／ｍＬ）。３７℃で３０分間インキュベートした後、Ｏ．Ｄ．５７０ｎｍ吸光度測定値をとり、標準曲線をプロットした。線形回帰分析を実施して、定量的標準曲線およびＲ２値を得た。総タンパク質濃度は、標準曲線から算出した。
尿アルブミンのＥＬＩＳＡ試験
９６ウェルプレートの各ウェルを、固定総タンパク質含量（１００μＬのＰＢＳ中、１００μｇの総タンパク質）を有する希釈した尿サンプルを用いてコーティングし、４℃で一晩保存した。次いで、尿サンプルを洗浄バッファー（ＰＢＳ中、０．０５％ ｖ／ｖ、Ｔｗｅｅｎ（商標）２０）を用いて４回洗浄し、その後、５％ミルクを用いて室温で２時間ブロッキングした。洗浄バッファーを用いて、さらに４回洗浄した後、各ウェルに５０μＬの抗ＭＳＡポリクローナル抗体希釈溶液（３％ミルクで１：１０００）を加え、室温で２時間インキュベートした。洗浄バッファーを用いて６回洗浄した後、各ウェルにペルオキシダーゼとコンジュゲートしているヤギ抗ニワトリＩｇＧ希釈溶液（ＰＢＳ−ＢＳＡで１：１０００）を加え、室温で２時間インキュベートした。１００μＬの１ｍｇ／ｍＬのＯ−フェニレンジアミン（０．１Ｍクエン酸、ｐＨ５．５中）および５μＬのＨ２Ｏ２ととものインキュベーションによって結合しているペルオキシダーゼを調べた。反応は、２ＮのＮＨ２ＳＯ４（２０μＬ／ウェル）を加えることによって、１０分後に停止し、吸光度は、ＥＬＩＳＡリーダーによって４９０ｎｍの波長で測定し、正常マウスの平均吸光度を用いて標準化して、表４に示されるような相関指数を調べた。
【００４８】
【表４】
【００４９】
表４に示される結果から、２００ｍｇ／ｋｇ／日のＰＨまたは１０００ｍｇ／ｋｇ／日のＰＨを与えられたマウスにおける尿アルブミンレベルは、対照群のＳＴＺ誘発マウスよりも有意に低かった。したがって、上記の結果は、２００ｍｇ／ｋｇ／日または１０００ｍｇ／ｋｇ／日の粗抽出物ＰＨが投与された場合に、ＳＴＺ誘発マウスの腎臓機能が回復したことを示す。
組織病理
肝臓および腎臓組織を、犠牲にされた後にマウスから採取し、末梢筋肉組織およびその結合組織を摘出した。次いで、組織を４％パラホルムアデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｄｅｈｙｄｅ）中で固定し、パラフィン包埋し、その後組織を、各々５μｍ厚を有する切片に切断した。これらの組織切片を、キシレン中で脱パラフィンし、勾配エタノール（１００％エタノール、９５％エタノール、８０％エタノール）ですすぎ、その後、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【００５０】
次いで、上記のように調製した肝臓組織切片を、光学顕微鏡下で観察した。図４Ａは、正常なマウスに由来する肝細胞を含む健常な肝臓組織切片を示す。図４Ｂを参照すると、ＳＴＺ誘発マウスの肝臓組織切片において、いくつかの小胞が見られ、このことは、肝細胞における脂肪変性の発生を示した。図４Ｃおよび４Ｄに示されるように、種々の投与量のＰＨを与えられたＳＴＺ誘発マウスでは、肝臓組織が、用量依存的に修復され、損傷が防がれていたが、これらの肝臓組織切片では、わずかなグリコーゲン蓄積は依然として観察される場合がある。
【００５１】
図５Ａは、正常マウスに由来する糸球体を含む健常な腎臓組織切片を示す。図５Ｂでは、ＳＴＺ誘発マウスの腎臓組織切片は、正常マウスの健常な腎臓切片と対照的に、損傷を受けた糸球体を示す。図５Ｃおよび５Ｄに示されるように、ＳＴＺ誘発マウスは、種々の投与量のＰＨを与えられ場合、腎臓組織が、用量依存的に修復され、損傷が防がれていたが、これらの腎臓組織切片では、いくつかの損傷を受けた糸球体が依然として観察される場合がある。
【実施例８】
【００５２】
ＡＧＥ−ＢＳＡマウスモデルに対するＰＨの効果
マウス血清調製
全血サンプルを、眼窩出血によって２週間毎にマウスから採取した。血液を室温で少なくとも２時間凝固させ、次いで、遠心分離して血清を得た。血清はアッセイされるまで−２０℃で保存した。
血清アルブミン精製
マウス血清は０〜４℃で維持した。沈殿物を、同温度、９，０００ｇで１５分間の遠心分離によって除去した。上清を、等容積の５０％エタノール（ｐＨ６．７）を用いてｐＨ６．９に調整し、１０分間静置し、その後さらに、９，０００ｇで１５分間遠心分離して上清の画分Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩを得た。
【００５３】
上清の画分Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩを、半分の容積の７０％エタノール（ｐＨ５．８）を用いて再度滴定して、ｐＨ５．８に調整し、１０分間静置し、その後、９，０００ｇで１５分間遠心分離して画分ＩＶ沈殿物を得た。画分ＩＶ上清はｐＨ４．８に調整し、続いて、−５℃で６０分間氷上で静置し、９，０００ｇで１０分間遠心分離して画分Ｖを得た。画分Ｖは重量分析のために、凍結し、乾燥させた。
ＡＧＥ−ＭＳＡ調製
０．１ｇ／ｍｌ ＭＳＡ（マウス血清アルブミン）および１８０ｍｇ／ｍｌグルコースを、リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）に別個に溶解した。この溶液を、０．２２μｍの滅菌フィルターを用いて濾過した。１５ｍＬ試験管に５ｍＬの溶液を加え、これをパラフィルムで密閉し、３７℃、暗所でインキュベートした。８週間保存した後、溶液を、４℃の蒸留水（１／１００、ｖ／ｖ）で３または４回透析してグルコースを完全に除去した。得られたＡＧＥ−ＭＳＡを、０．２２μｍの滅菌フィルターを用いて濾過し、凍結乾燥して粉末にし、定量し、その後、再溶解し、−２０℃で保存した。
ＡＧＥマウスモデル
１０週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、正常群（いずれの注射も施していない正常マウス）、ＭＳＡ対照群（ＭＳＡで注射されたマウス）、２００ｍｇ／ｋｇ／日のＰＨ群（２００ｍｇ／ｋｇ／日のＰＨを与えられたＡＧＥ注射マウス）、１０００ｍｇ／ｋｇ／日のＰＨ群（１０００ｍｇ／ｋｇ／日のＰＨを与えられたＡＧＥ注射マウス）およびＡＧＥ−ＭＳＡ対照群（糖尿病性血管合併症を誘発するためにＡＧＥ−ＭＳＡを注射されたマウス）に無作為にグループ化した。各群に５匹のマウスとした。２００μＬの容積のＡＧＥｓ−ＭＳＡを用いて、マウスに静脈内注射した。マウスに、８回の静脈内注射で投与し、各注射は４ｍｇ／１回／マウス対照ＭＳＡまたはＡＧＥ−ＭＳＡ（２回／週で４週間）を含有していた。マウスには、１５日目から種々の用量のＰＨを含有するマウス飼料を与えた。２カ月後、マウスを犠牲にし、それらの肝臓および腎臓を組織病理検査用に摘出した。
【００５４】
図６Ｅを参照すると、肝細胞の形が不規則であり、ＡＧＥ−ＭＳＡ対照群におけるマウスの肝臓組織切片において細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の蓄積があり、このことは、大規模な肝細胞が損傷を受けたことを示した。対照的に、粗抽出物ＰＨを与えられたマウスから得た肝臓組織切片では、このような損傷は観察されなかった（図６Ｃおよび６Ｄ）。したがって、粗抽出物ＰＨは、ＡＧＥ−ＭＳＡによって引き起こされる肝臓損傷を最小にすることができるということが実証された。正常またはＭＳＡ対照マウスの腎臓組織切片では、糸球体は無傷であり、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の増大はない（図７Ａおよび７Ｂ）。対照的に、ＡＧＥ−ＭＳＡを注射したマウスから得た腎臓組織切片において観察されるように、糸球体は明らかに損傷を受けており、肥大していた（図７Ｅ）。ＡＧＥ注射されたマウスが、種々の投与量のＰＨ（２００ｍｇ／ｋｇ／日のＰＨおよび１０００ｍｇ／ｋｇ／日のＰＨ）を与えられた場合には、腎臓組織は、それ自体、正常マウスの腎臓に似るよう修復され、回復された。
【００５５】
当業者には当然であろうが、その広範な発明概念から逸脱することなく上記の実施形態に変更を行うことができる。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に制限されないが、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨および範囲内の改変を包含するものであるということが理解される。
【配列表フリーテキスト】
【００５６】
配列番号１〜９ プライマー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病性血管合併症を治療するための医薬品の調製のための、ヤマノイモ属種の抽出産物の使用であって、医薬品を、それを必要とする被験体に治療有効量で投与する使用。
【請求項２】
ヤマノイモ属種の抽出産物を経口投与する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ヤマノイモ属種が、ヤマノイモ属種のゲノムＤＮＡが配列番号９のプライマーを用いて増幅された場合に、以下の１４種のＤＮＡバンド：ヤマノイモ属種のゲノムＤＮＡが配列番号９のプライマーを用いて増幅された場合に、４２８ｂｐ、４５２ｂｐ、５３７ｂｐ、６０２ｂｐ、７２３ｂｐ、８１７ｂｐ、９３４ｂｐ、１１４０ｂｐ、１２４２ｂｐ、１４７８ｂｐ、１６４１ｂｐ、１９０４ｂｐ、２１５１ｂｐおよび２９１８ｂｐを含むランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）フィンガープリントにより特徴付けられる、ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．ファイト（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ａｌａｔａ Ｌ．ｃｖ．Ｐｈｙｔｏ）である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
ヤマノイモ属種の抽出産物が、
（ａ）ヤマノイモ属種の塊茎を、酢酸の存在下でアルコールベースの溶媒と混合して抽出組成物を得るステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）において得られた抽出組成物を分離処理に供して、可溶性画分を得るステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において得られた可溶性画分から溶媒を除去してヤマノイモ属種の抽出産物を得るステップと
を含むプロセスによって調製される、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
アルコールベースの溶媒が、メタノールベースの溶媒、エタノールベースの溶媒、またはそれらの混合物である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
ヤマノイモ属種の抽出産物が、
（ａ）ヤマノイモ属種の塊茎を、１％酢酸溶液に浸漬するステップと、
（ｂ）酢酸処理されたヤマノイモ属種の塊茎を粉砕するステップと、
（ｃ）粉砕され、酢酸処理されたヤマノイモ属種の塊茎を凍結乾燥して、粉砕され、凍結乾燥され、酢酸処理されたヤマノイモ属種の塊茎を生成するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の粉砕され、凍結乾燥され、酢酸処理されたヤマノイモ属種の塊茎の少なくとも一部を、約１％の酢酸溶液の存在下でアルコールベースの溶媒と混合して抽出組成物を得るステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）において得られた抽出組成物を分離処理に供して、可溶性画分を得るステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）において得られた可溶性画分から溶媒を除去して、ヤマノイモ属種の抽出産物を得るステップと
を含むプロセスによって調製される、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
アルコールベースの溶媒が、メタノールベースの溶媒、エタノールベースの溶媒、またはそれらの混合物である、請求項６に記載の使用。
【請求項１】
糖尿病性血管合併症を治療するための医薬品の調製のための、ヤマノイモ属種の抽出産物の使用であって、医薬品を、それを必要とする被験体に治療有効量で投与する使用。
【請求項２】
ヤマノイモ属種の抽出産物を経口投与する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ヤマノイモ属種が、ヤマノイモ属種のゲノムＤＮＡが配列番号９のプライマーを用いて増幅された場合に、以下の１４種のＤＮＡバンド：ヤマノイモ属種のゲノムＤＮＡが配列番号９のプライマーを用いて増幅された場合に、４２８ｂｐ、４５２ｂｐ、５３７ｂｐ、６０２ｂｐ、７２３ｂｐ、８１７ｂｐ、９３４ｂｐ、１１４０ｂｐ、１２４２ｂｐ、１４７８ｂｐ、１６４１ｂｐ、１９０４ｂｐ、２１５１ｂｐおよび２９１８ｂｐを含むランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）フィンガープリントにより特徴付けられる、ディオスコレア・アラータ Ｌ．ｃｖ．ファイト（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ａｌａｔａ Ｌ．ｃｖ．Ｐｈｙｔｏ）である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
ヤマノイモ属種の抽出産物が、
（ａ）ヤマノイモ属種の塊茎を、酢酸の存在下でアルコールベースの溶媒と混合して抽出組成物を得るステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）において得られた抽出組成物を分離処理に供して、可溶性画分を得るステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において得られた可溶性画分から溶媒を除去してヤマノイモ属種の抽出産物を得るステップと
を含むプロセスによって調製される、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
アルコールベースの溶媒が、メタノールベースの溶媒、エタノールベースの溶媒、またはそれらの混合物である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
ヤマノイモ属種の抽出産物が、
（ａ）ヤマノイモ属種の塊茎を、１％酢酸溶液に浸漬するステップと、
（ｂ）酢酸処理されたヤマノイモ属種の塊茎を粉砕するステップと、
（ｃ）粉砕され、酢酸処理されたヤマノイモ属種の塊茎を凍結乾燥して、粉砕され、凍結乾燥され、酢酸処理されたヤマノイモ属種の塊茎を生成するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の粉砕され、凍結乾燥され、酢酸処理されたヤマノイモ属種の塊茎の少なくとも一部を、約１％の酢酸溶液の存在下でアルコールベースの溶媒と混合して抽出組成物を得るステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）において得られた抽出組成物を分離処理に供して、可溶性画分を得るステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）において得られた可溶性画分から溶媒を除去して、ヤマノイモ属種の抽出産物を得るステップと
を含むプロセスによって調製される、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
アルコールベースの溶媒が、メタノールベースの溶媒、エタノールベースの溶媒、またはそれらの混合物である、請求項６に記載の使用。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００９−５４０００２（Ｐ２００９−５４０００２Ａ）
【公表日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１５５１８（Ｐ２００９−５１５５１８）
【出願日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１４０８９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４６４２７
【国際公開日】平成１９年１２月２１日（２００７．１２．２１）
【出願人】（５０４００４４６３）國立陽明大學 (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１４０８９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４６４２７
【国際公開日】平成１９年１２月２１日（２００７．１２．２１）
【出願人】（５０４００４４６３）國立陽明大學 (4)
【Ｆターム（参考）】
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