糖質検出用センサー
流体中の糖質被検体（たとえば、グルコース）の検出または測定用センサーは、競合結合アッセイの成分を含み、該アッセイの読み出しは、表示被検体は拡散できるがアッセイ成分は拡散できない材料によって保持された、検出可能なまたは測定可能な光信号（たとえば、ＦＲＥＴアッセイ）であり、アッセイ成分は、動物レクチンと、レクチンに結合する被検体と競合することができる被検体類縁体とを含む。センサーは、体液、たとえば、皮下流体中のグルコースの検出または測定に適切であることが好ましい。被検体類縁体は、生理的カルシウム濃度でグルコースと競合することができることが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、センサー、該センサーを製造する方法および該センサーを使用する方法に関する。
【０００２】
センサーは、光学技術を使用する、流体中の糖質、たとえば体液中のグルコースの測定またはモニタリングにおいて使用してもよい。
【０００３】
特に、センサーは、グルコース濃度を厳密にモニターしなければならない状況および／または糖尿病の管理のように、グルコース測定を繰り返して行わなければならない状況における用途に適切である。
【背景技術】
【０００４】
糖尿病の管理において、血中のグルコースの定期測定は、正確なインシュリン投与を確保するために、必要不可欠である。さらに、糖尿病患者の長期間の患者管理において、血糖値のより良い管理は、もし防止できなければ、網膜疾患、循環障害、およびしばしば糖尿病に伴う他の変性疾患の発症を遅らせる可能性があることが実証されている。したがって、糖尿病患者による血糖値の信頼のおける正確な自己モニタリングが必要である。
【０００５】
糖尿病患者において起こるであろう濃度、すなわち０〜３５ｍＭまたはそれより幾分高い範囲の血糖を測定することが望ましい。
【０００６】
現在、血糖は、糖尿病患者が、市販の比色定量試験片または電気化学的バイオセンサー（たとえば、酵素電極）を用いてモニターしているが、両方とも、ランセット型装置を常に使用し、測定のたびに適量の血液を取り出す必要がある。平均して、多数の糖尿病患者はそのような装置を使用して、１日に２回血糖の測定を行っている。しかし、米国立衛生研究所は、アメリカ糖尿病協会が支持する、血糖の試験は１日に少なくとも４回行うべきであるということを推奨してきた。血糖試験の回数の増加は、糖尿病患者に、特に指先から血液を取るために、ランセットを常用しなければならない長期間の糖尿病患者には、経済面でも、痛みおよび不快な面でも大きな負担をかけることになる。したがって、患者から採血しない、より優れた長期間のグルコースモニタリングシステムが明らかに必要である。
【０００７】
患者から採取する血液を必要としないグルコース測定技術に関して、数多くの提案がある。
【０００８】
皮下液中の被検体の濃度は、血液中の該被検体の濃度と相関することが観察されてきており、したがって、皮下位置に据えられる、グルコースモニタリングデバイスの使用がいくつか報告されている。遠隔的に問い合わせすることができるグルコース用競合結合アッセイの使用は、特に興味を引くものである。
【０００９】
競合的結合をアッセイする方法は、近接度に基づいた信号発生／変調部分ペア（米国特許第６２３２１２０号で検討されている）を使用し、これは、典型的には、エネルギー移動供与体受容体ペア（エネルギー供与体部分とエネルギー受容体部分とを含む）である。エネルギー供与体部分は、光輝性（通常は蛍光性）である。
【００１０】
そのような方法では、エネルギー移動供与体−受容体ペアは、分析すべきサンプル（たとえば、皮下液）と接触している。次いで、サンプルを照らし、得られた発光を検出する。供与体−受容体ペアのエネルギー供与体部分またはエネルギー受容体部分は、受容体担体に結合し、一方、供与体−受容体ペア（リガンド担体に結合する）のもう一方の部分と存在する任意の被検体とは、受容体担体上の結合部位を得るために競合する。供与体および受容体が集まった時、供与体と受容体との間にエネルギー移動が起こり、これによって、エネルギー供与体部分の蛍光の検出可能な寿命の変化（減少）をもたらす。また、エネルギー供与体部分から放射される蛍光信号の割合は抑えられる。
【００１１】
寿命変化は、被検体の競合的結合によって、減少または消去される。したがって、見かけの発光寿命を測定することによって、たとえば、位相変調蛍光光度法または時間分解蛍光光度法(Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press,1983年，第３章参照）によって、サンプル中の被検体の量を決定することができる。
【００１２】
エネルギー移動の効率は、供与体の量子収率、供与体の発光スペクトルと受容体の吸収スペクトルとの重なり、ならびに供与体と受容体との間の相対距離および配置に依存することも注意すべきである。
【００１３】
欧州特許第０５６１６５３号には、先に記載した、受容体とリガンドとを問い合わせする方法が開示されている。
【００１４】
供与体−受容体エネルギー移動の例として、蛍光共鳴エネルギー移動（フェルスター共鳴エネルギー移動、ＦＲＥＴ）があり、これは、最初に励起された供与体（Ｄ）から受容体（Ａ）への励起状態エネルギーの非放射性移行である。供与体は、典型的には、より短い波長で放射し、その発光スペクトルは、受容体の吸収スペクトルと重なり合う。エネルギー移動は、光子が出現することなく起こり、供与体と受容体との間の長距離双極子−双極子相互作用の結果である。
【００１５】
ＦＲＥＴプロセスは光子の出現を伴わないので、用語共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）がより正確である。しかしＦＲＥＴもＲＥＴも互換的に使用されることが多い。
【００１６】
ＦＲＥＴの重要な特徴は、それが、生体高分子の寸法に匹敵する距離上で起こることである。フェルスター距離と呼ばれる、ＦＲＥＴが５０％効率の時の距離は、典型的には、２０〜６０Åの範囲である。２０〜９０Åの範囲のフェルスター距離は、競合的結合の研究には都合がよい。
【００１７】
供与体（Ｄ）による被検体結合部分のラベリングおよび受容体（Ａ）による被検体類縁体のラベリング、またはその逆によって、供与体−受容体応答に基づく測定可能な応答を生み出すことができるアッセイが作り出される。したがって、Ｄ−「被検体結合部分」のＡ−「被検体類縁体」への結合によって、供与体の強度または寿命が減少する結果となる。サンプル中の被検体は、Ｄ−「被検体結合部分」上の被検体結合部分を獲得するために競合し、Ｄ−「被検体結合部分」を受容体（Ａ）から放出する。したがって、供与体の強度減衰時間および位相角は、グルコース濃度が増えるに従って増加することが予測される。
【００１８】
これらの原理は、エネルギー移動によるグルコース感知において使用されてきた。
【００１９】
国際公開公報第９１／０９３１２号には、光学的手段によって遠隔的に問い合わせる、グルコースに基づく親和性アッセイ（エネルギー移動供与体−受容体ペアを組合わせた）を使用する、皮下方法およびデバイスが記載されている。国際公開公報第９７／１９１８８号、国際公開公報第００／０２０４８号、国際公開公報第０３／００６９９２号および国際公開公報第０２／３０２７５の各例には、エネルギー移動によるグルコース感知が記載され、これは、遠隔的に読み取ることができる光信号を提供している。
【００２０】
当業者であれば、受容体が蛍光団になり得るであろうことは理解するであろう。エネルギー受容体部分の吸収スペクトル内の波長で、入射光のビームによる励起に続いてエネルギー受容体部分によって放射される任意の蛍光信号は、ＦＲＥＴプロセスに影響されない。したがって、内部参照信号として、エネルギー受容体部分によって、たとえばセンサーの連続キャリブレーションにおいて、放出される蛍光信号の強度を使用すること、またはセンサーが分解している範囲をモニターすることが可能であり、したがって、新しいセンサーを移植または注射する必要性を示す。許容しうるベースラインレベル未満のこの信号の下降は、新しいセンサーを移植または注射する必要性を示す。
【００２１】
しかし、エネルギー受容体部分は、非蛍光性染料であってもよい。この場合では、蛍光消光能力を持つ化合物を、特定のエネルギー受容体部分の代わりに使用する。強力かつ非特異性の蛍光消光物質の例は、Tyagiら、Nature Biotechnology (1998) 18：第４９頁にある。
【００２２】
先に検討したシステムは、グルコース結合部分として、コンカナバリンＡ（コンＡ）に依存する。コンカナバリンＡはレクチンである。用語「レクチン」は、主要なクラスの免疫グロブリンのいかなるものにも属さない、糖質代謝物に明らかに含まれない任意の糖質結合タンパク質を含む。レクチンは、糖質認識ドメイン（ＣＲＤ）を介して糖質への選択的結合を示す。レクチンは、単量体型および多量体型の両方で自然に発生し、後者は、しばしば、それぞれがいくつかのＣＲＤを有する数多くのサブユニットを含む。
【００２３】
コンカナバリンＡは、アッセイ条件下で長期間安定ではない。発明者らによる実験（実施例８参照）では、コンカナバリンＡは体温で、２０日未満は安定であると示唆する。
【００２４】
また、コンカナバリンＡは毒性があり、潜在的に免疫原生である（しかし、グルコースアッセイにおいては、人体内で安全である考えられる少量で使用されている）。
【００２５】
また、スイトピーおよびレンチルレクチンも、そのような系においてグルコース結合部分として使用することができることが示唆されている(「A Potentially Implantable Fluorescent Glucose Sensor Based on Molecular Recognition in Poly(ethylene glycol) Hydrogels」、Ryan J. Russellら、American Institute of Chemical Engineersに提示されている）。しかし、これらのレクチンは、コンＡと類似の欠点を持つことが予測される。
【００２６】
米国特許第６２３２１３０号には、低原子価レクチン（「糖質結合リガンド」）が使用されるアッセイが開示されている。これらは、３個以下のＣＲＤを有する。該アッセイは、糖質、標識（たとえば、ＦＲＥＴ成分）および担体分子を含む被検体類縁体（「複合糖質」）を使用する。担体分子は、タンパク質（たとえば、ウシ血清アルブミン、ＢＳＡ）または合成ポリマーであってもよい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
本発明者らは、良好な安定性を有し且つコンＡに伴う欠点を有さない糖質結合部分を見い出す必要があることを認識している。本発明者らは、代わりの糖質結合部分の使用を研究してきた。驚いたことに、本発明者らは、ヒトレクチンを含めた動物レクチンを、糖質結合部分として使用することができることを見い出した。
【特許文献１】米国特許第６２３２１２０号
【特許文献２】欧州特許第０５６１６５３号
【特許文献３】国際公開公報第９１／０９３１２号
【特許文献４】国際公開公報第９７／１９１８８号
【特許文献５】国際公開公報第００／０２０４８号
【特許文献６】国際公開公報第０３／００６９９２号
【特許文献７】国際公開公報第０２／３０２７５号
【特許文献８】米国特許第６２３２１３０号
【課題を解決するための手段】
【００２８】
したがって、第一態様では、本発明は、流体中の糖質被検体の検出または測定用センサーであって、センサーは、競合結合アッセイ成分を含み、その読み出しは、被検体の拡散は可能にするがアッセイ成分の拡散は可能にしない材料によって保持された検出可能または測定可能な光信号であり、アッセイ成分は、動物レクチンと、レクチンに結合するための糖質と競合することができる被検体類縁体とを含むセンサーを提供する。
【００２９】
好ましくは、被検体は単糖類である。好ましい実施形態では、被検体はグルコースである。
【００３０】
センサーは、体液、たとえば、皮下流体中のグルコースの検出または測定に適切であることが好ましい。センサーはインビボでの用途に適することが望ましく、このことは以下に詳細に検討する。
【００３１】
被検体類縁体は、生理的カルシウム濃度でグルコースと競合することができることが好ましい。典型的な生理的カルシウム濃度は、１．１５〜１．２９ｍＭの範囲内である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
検出
適切な検出技術として、ＦＲＥＴ、蛍光エネルギー移動、蛍光偏光、蛍光消光、リン光、ルミネセンス増強、ルミネセンス消光、回折またはプラズモン共鳴が挙げられる。
【００３３】
光信号を発生する結合アッセイは、好ましくは、被検体の濃度変動の連続モニタリングが達成できるように、可逆的であるべきである。この可逆性は、アッセイの成分を消費しない、結合アッセイフォーマットの使用の特別の利点である。
【００３４】
検出可能または測定可能な光信号は、近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアを使用して発生させるのが好ましい。該ペアの第一構成要素が、該ペアの第二構成要素に近接近する時、信号が発生または変調される。
【００３５】
近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアは、エネルギー供与体部分およびエネルギー受容体部分ペアであるのが好ましい。エネルギー供与体部分およびエネルギー受容体部分は、それぞれ、供与体発色団および受容体発色団とも言う。蛍光を放射しないエネルギー受容体は、消光部分と言う。
【００３６】
この場合、レクチンを、エネルギー供与体およびエネルギー受容体部分ペアの１つで標識化し、被検体類縁体を、エネルギー供与体およびエネルギー受容体部分ペアのもう１つで標識化する。
【００３７】
本発明のセンサーの最も好ましい実施形態は、ＦＲＥＴの技術を使用して光学読み出しを出すアッセイを組み込む。
【００３８】
アッセイがインビボで使用される場合、供与体は５５０〜約７００ｎｍで蛍光を発し、受容体は約６５０ｎｍで光を吸収するのが望ましい。これにより、低波長での供与体蛍光とインビボ自己蛍光との間のオーバーラップを回避する。
【００３９】
Alexa Fluor 594（商標）（たとえば、スクシンイミジルエステルとして）は、インビボで使用するための、適切な発光スペクトルを持つエネルギー供与体部分である。この染料は、５９４ｎｍで吸収し、６２０ｎｍで蛍光を発する。
【００４０】
国際公開公報第０５／０５９０３７号に記載されているＨＭＣＶ染料は、本発明の用途にとって、適切なエネルギー受容体部分である。これらの染料は、安定化されたカルベニウムイオンである。例として、ヘキサメトキシ−クリスタルバイオレットスクシンイミジルエステル（ＨＭＣＶ−Ｉ）がある。
【００４１】
あるいは、ＱＳＹ２１（商標）を、エネルギー供与体部分としてのAlexa Fluor 594（商標）とともに、エネルギー受容体部分として使用してもよい。
【００４２】
蛍光寿命または蛍光強度の測定を行ってもよい。蛍光寿命は、位相変調技術（以下に検討）によって測定してもよい。
【００４３】
好ましい実施形態では、レクチンをエネルギー供与体部分としてAlexa Fluor 594で標識化し、被検体類縁体をエネルギー受容体部分としてＨＭＣＶ−Ｉで標識化し、蛍光寿命を位相変調技術によって測定する。
【００４４】
アッセイ成分を保持する材料は、エネルギー供与体部分およびエネルギー受容体部分に十分な空間を提供し、互いに結合していない時は、エネルギー移動が中断できるように分離するのが好ましい。
【００４５】
レクチン
レクチンは、アッセイにおいて、少なくとも１０日間は安定な信号を提供するのが好ましく、さらに好ましくは少なくとも１４日間である。人体にセンサーを移植する時に、安定な信号が提供されるのが特に好ましい。
【００４６】
驚いたことに、本発明者らは、ＭＢＬが、グルコースアッセイにおいて、少なくとも１７日間安定であったことを発見した（実施例８参照）。より早いアカウントは、ＭＢＬの生物学的半減期の４〜７日間が報告されている(Kilpatrick (2002) Transfus. Med.12,335)。
【００４７】
好ましくは、レクチンは、Ｃ−型（カルシウム依存性）レクチンである。
【００４８】
動物レクチンは、脊椎動物レクチン、たとえば、哺乳動物レクチンが好ましく、ヒトまたはヒト化レクチンがさらに好ましい。しかし、代わりに、トリレクチン、ウオレクチンまたは昆虫レクチンなどの無脊椎動物レクチンであってもよい。
【００４９】
レクチンは人体由来のヒトレクチンが適切である。代わりに、レクチンは組換え製造されたレクチンであってもよい。
【００５０】
さらなる代替例として、レクチンは、ヒト化動物レクチン、たとえば、ヒト化ウシレクチンであってもよい。これは、対応するヒトレクチンがあるところに適用される。レクチンは、抗体に類似の方法でヒト化してもよい。
【００５１】
レクチンは多量体形態であるのが適切である。多量体レクチンは、人体または動物体由来であってもよい。あるいは、レクチンは、単量体形態であってもよい。単量体レクチンは、組換え方法によって、または人体もしくは動物体由来の天然多量体レクチンにおけるサブユニット間の結合を破壊させることによって形成してもよい。この例は米国特許第６２３２１３０号に記載されている。
【００５２】
レクチンは３個以上のＣＲＤを有するのが好ましい。レクチンは６個以上のＣＲＤを有するのがさらに好ましい。
【００５３】
レクチンはコレクチン（コラーゲン様レクチン）であるのが好ましい。これらは、コラーゲン様配列（Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレット）を持つＣ−型動物レクチンである。ＭＢＬはＣ−型コレクチンであり、一方でコンカナバリンＡはＣ−型レクチンである。単量体コレクチンＣＲＤは、コラゲナーゼの作用によって製造することができる。
【００５４】
レクチンは、マンノース結合レクチン、コングルチニンまたはコレクチン−４３（たとえば、ウシＣＬ−４３）（全血清コレクチン）または肺界面活性タンパク質（肺コレクチン）が好ましい。
【００５５】
マンノース結合レクチン（マンナン結合レクチンまたはマンナン結合タンパク質、ＭＢＬ、ＭＢＰとも言う）、たとえば、ヒトＭＢＬは、特に興味のあるものである。ＭＢＬは、それぞれが３個の同一のポリペプチドで構成される、”花束状”配置において数個（普通、３〜４個（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）であるが、１〜６個の分布が起こりやすい（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ））のサブユニットを含むコラーゲン様防衛分子である。各サブユニットの分子量は、約７５ｋＤａであり、場合によっては、１個以上のＭＢＬ関連セリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）で複合化されている可能性がある。各ポリペプチドはＣＲＤを含む。したがって、各サブユニットは、３個の糖質結合部位を提供する。三量体ＭＢＬおよび四量体ＭＢＬ（これらは、ヒト血清中に存在する主要な形態である。Teilletら,Journal of Immunology, 2005, 第２８７０−２８７７頁）は、それぞれ、９個および１２個の糖質結合部位を提供する。
【００５６】
ＭＢＬは、バクテリアの表面を被覆するマンノース部分を結合する、先天性免疫系の一部として体内で自然に発生する。ヒトＭＢＬは毒性がなく、ヒトに対して非免疫原生である。他の種のＭＢＬは、免疫原生であるがヒトに対して毒性はないと予測される。
【００５７】
ヒトＭＢＬは、人体由来の形態でも組換え製造された形態でも市販されている。これは感染症にかかりやすくなっていると考えられるＭＢＬ欠損患者の治療における代償療法として使用される。
【００５８】
レクチンは、実質的に三量体および／または四量体形態であるＭＢＬが適切である。先に説明したように、三量体ＭＢＬおよび四量体ＭＢＬは、ヒト血清において、主要な自然発生的な多量体形態であると考えられる。
【００５９】
あるいは、レクチンは、ＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｄから選択される肺界面活性タンパク質であってもよい。これらのタンパク質は、ＭＢＬに類似する。これらは、先天性宿主防衛機能においてカルシウム依存性糖質結合タンパク質として作用する水溶性コレクチンである。ＳＰ−Ｄは脂質にも結合する。ＳＰ−Ａは、ＭＢＬの構造に類似する「花束状」構造を持つ（Kilpatrick DC (2000) Handbook of Animal Lectins，第３７頁）。ＳＰ−Ｄは、「Ｘ」の各端部にＣＲＤを有する四量体「Ｘ」構造を持つ。
【００６０】
他の適切な動物レクチンを、以下のリストに挙げる。
・ＰＣ−レクチン（米国特許公開公報第２００３０２１６３００号、米国特許公開公報第２００４０２６５８９８）
・ＣＴＬ−Ｉ（米国特許第１７９５２８／１０号）
・ケラチノサイト膜レクチン（Parfuemerie und Kosmetik74,164-80)
・ＣＤ９４(Eur J Immuno l25,2433-7)
・Ｐ３５（同義語：ヒトＬ−フィコリン、レクチンのグループ）(Immunol Lett 67,109-12）
・ＥＲＧＩＣ−５３（同義語：ＭＲ６０）(MoI Biol Cell, 7, 483-93)
・ＨＩＰ／ＰＡＰ(Eur J Biochem 267, 1665-71)
・ＣＬＥＣＳＦ８（Eur J Immunol 34,210-20)
・ＤＣＬ（レクチンのグループ）（米国特許出願第００２３１９９６／ＵＳ号）
・ＧＬＵＴファミリータンパク質、特に、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ４およびＧＬＵＴ１１（ＰＮＡＳ９７，１１２５−３０）
【００６１】
さらに、適切な動物レクチンは、「Handbook of Animal Lectins: Properties and Biomedical Applications」, David C. Kilpatrick, Wiley 2000の付属書Ａ、ＢおよびＣに記載されている。
【００６２】
レクチンは、先に検討したように標識化されるのが好ましい。レクチンはエネルギー供与体部分で標識化されるのがさらに好ましい。
【００６３】
被検体類縁体
被検体類縁体は、レクチンの結合部位に結合する、複数の糖質部分または糖質様部分を含むのが好ましい。用語「糖質」は、糖類を含む。
【００６４】
適切な糖質様部分は、Ｎ−アセチルグルコサミンを擬態するケラチンペプチド（ＳＦＧＳＧＦＧＧＧＹ）などのペプチドを含む。ケラチンペプチドはＭＢＬを抑制することができることが示されている（Mantactoら,2001 J. Immunol. 166, 4148-4153)。
【００６５】
ＭＢＬに対し一般的な糖質部分の親和性は、Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ロイコロース、エルロース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｌ−フコース＞ミオイノシトール、Ｄ−グルコース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−パラチノース、Ｄ−ツラノース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−リボース、Ｄ−タガトース＞Ｄ−リキソース＞ラクトース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−ガラクトースであることが本発明者らによって見い出されている。
【００６６】
この理論に縛られるものではないが、本発明者らは、ＭＢＬおよび他のレクチンに対する強い結合は、数多くの部位での結合の結果であると考える。各部位での結合は比較的弱い（低親和性）が、累積効果が強い結合（高親和力）である。したがって、全結合部位を結合しない被検体類縁体は、全結合部位と結合する被検体類縁体よりも、全結合部位を結合する被検体と簡単に置き換えられる。このことは、ＭＢＬに対しグルコースより高い親和性を持つ、マンノースを含む被検体類縁体が、グルコースによって置き換えられ得る理由を説明している。
【００６７】
所定のレクチンに対する被検体類縁体の親和力に影響するパラメーターは、以下のものである。
・糖質部分または糖質様部分の数
・レクチンに対する糖質部分または糖質様部分の親和性
・カルシウム濃度（少なくともＭＢＬに対する）および
・被検体類縁体の柔軟性
【００６８】
生理的カルシウム濃度は制御できない。しかし、他のパラメーターは選択し、被検体類縁体に適切な測定範囲を与えることができる。アッセイ性能への被検体類縁体柔軟性の影響は、予め同定または対処されない。
【００６９】
先に開示したように、被検体類縁体（たとえば、米国特許第６２３２１３０号のもの）は、糖質と、エネルギー供与体部分またはエネルギー受容体部分とが複合した球状タンパク質を含む。そのような分子では、糖質と、エネルギー供与体部分またはエネルギー受容体部分とが位置を固定する。これは、複数の糖質部分がレクチンＣＲＤに結合することを可能にする構造を、被検体類縁体が必ずしも採用できるとは限らないことを意味する。
【００７０】
また、そのような被検体類縁体における、糖質とエネルギー供与体部分またはエネルギー受容体部分との相対的位置決めは、被検体類縁体とレクチンとが結合した時、エネルギー供与体部分と受容体部分との間の最適相互作用を可能にしないかもしれない。これは、ＦＲＥＴに影響し、光信号を弱めるであろう。
【００７１】
最後に、これらの被検体類縁体は、生理的カルシウム濃度で、レクチンに結合しないことが多い。ＭＢＬに対するマンノース複合糖質の最適な結合に必要なカルシウム濃度は、約２０ｍＭであることがわかっている。
【００７２】
これらの見識は、同じレクチンに関して異なる親和力を持ち、したがって、異なる範囲にわたって糖質濃度を測定するために使用することができる、種々の被検体類縁体を開発するために、本発明者らによって使用されてきた。
【００７３】
アッセイは、０〜３５ｍＭのグルコースの範囲の少なくとも一部分、たとえば０〜２５ｍＭのグルコースの範囲での濃度に関し、血糖を測定することができるのが好ましい。好適には、ＩＣ50値が約１５ｍＭのグルコースである。アッセイは、２〜１０ｍＭのグルコースの範囲で、グルコース濃度を測定できることがより好ましい。投与−応答曲線は、この範囲内では、できるだけ直線に近づくのが望ましい。
【００７４】
被検体類縁体に関して、３つの異なるタイプの構造体が特に興味深い。
【００７５】
糖質−タンパク質複合体または糖質−デンドリマー複合体
第一に、被検体類縁体は、糖質−タンパク質複合体あるいは糖質−デンドリマー複合体であってもよい。これらのどちらかで、糖質様部分を、糖質部分の代わりにあるいはともに使用してもよい。
【００７６】
そのような複合体において使用するために適した糖質の例として、単糖類およびオリゴ糖がある。
【００７７】
適切な単糖類は、場合によっては誘導化された、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトースまたは高級相同性アルドースまたはケトース、たとえば、場合によっては誘導化されたＤ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｌ−フコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−タガトースまたはＤ−ソルビトールがある。
【００７８】
適切なオリゴマーは、たとえば２〜５０糖質単位を含む直鎖または分岐ホモオリゴマーまたは混合オリゴマーである。
【００７９】
好ましいグリコシル化は、１→３および１→４グリコシル化が、ＭＢＬ結合を妨害することが予測されるので、１→６または１→２である。たとえば、ノナ（１→６）−α−グルコース（デキストラン１５００Ｄａ）は、ＭＢＬに対して、１，３−β−Ｄ−グルコース（たとえばラミナナリヘキサオース）より高い親和力を持つことが予測される。適切なオリゴ糖として、パンノース、マルトース、マルトトリオース、イソマルトトリオース、Ｄ−ロイコロース、エルロース、Ｄ−パラチノース、Ｄ−ツラノースまたは１〜２５０ｋＤａデキストラン（好ましくは１〜４０ｋＤａデキストラン、たとえば、１ｋｄａ、１．５ｋＤａ、５ｋＤａ、６ｋＤａ、１０ｋＤａ、１２ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａまたは４０ｋＤａデキストラン）が挙げられる。
【００８０】
被検体類縁体は、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ロイコロース、Ｎ−アセチル−グルコサミン、Ｄ−マンノース、Ｌ−フコース、Ｎ−アセチル−マンノサミン、Ｄ−アラビノース、ミオイノシトール、Ｄ−タガトース、エルロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−パラチノース、Ｄ−ツラノース、Ｄ−リボース、Ｄ−ソルビトールから選択される少なくとも１種の糖質部分を含むのが好ましい。
【００８１】
ＭＢＬおよび他の動物レクチンに関して高い親和性を持つので、被検体類縁体は、少なくとも１種のグルコース部分および／または少なくとも１種のＮ−アセチルグルコサミン部分および／または少なくとも１種のマンノース部分を含むのがさらに好ましい。これらの部分は、Ｃ３およびＣ４水酸基を介して、レクチンの結合部位に結合すると考えられる。
【００８２】
合成分岐糖類の例として、デンドリマー（たとえば、以下に示す、アミンリンカーを持つＴＲＩＳ誘導三糖類）を構成するために使用されるデンドリマー「ウェッジ」がある。そのような「ウェッジ」は、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）などのタンパク質上に、たとえば二官能性アミンリンカーを介して、接合することができる。
【化１】
【００８３】
複合体における使用に好ましいタンパク質は、分子量が少なくとも１０ｋＤａ、好ましくは少なくとも２０ｋＤａのヒトタンパク質である。タンパク質は非球状全体三次構造を持つことが好ましい。これは、複数の結合部位で結合を助け、高い親和力をもたらすと考えられる。ハーセプチンおよびＲｅｍｉｃａｄｅ（商標）などのモノクローナル抗体（非球状「Ｙ」型全体三次構造を持つ球状ドメインを数箇所有する免疫グロブリン）が適切である。他の代わりの適切なタンパク質は、ヒトチロンビン、ヒトラクトフェリンおよび第８因子である。
【００８４】
糖質−タンパク質複合体の別の例として、タンパク質は、レクチン由来タンパク質、たとえば、ＣＲＤが除去されたレクチンであってもよい。
【００８５】
好適には、複合体は糖質−アルブミン複合体であってもよい。たとえば、複合体は、マンノース−ＨＳＡ複合体またはマンノース−ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）複合体であってもよい。しかし、このタイプの複合体は、先に記載したように、ＭＢＬへの結合がカルシウム濃度に依存することがわかっているので、好ましくない。生理的カルシウム濃度で、２０個のマンノース残基を持つ７０ｋＤａマンノース−ＨＳＡ複合体は、ＭＢＬへの結合が見られなかった。カルシウム濃度に対する依存性は、マンノシル化が増えるにつれ減少する。
【００８６】
当業者であれば、このタイプの複合体への合成経路に関しては承知しているであろう。例として、Ｎ−イソチオシアナト−４−アミノフェニル−Ｏ−α−Ｄ−マンノピラノシド（Ｍａｎ−ＩＴＣ）をＨＳＡ上に接合することができる。
【００８７】
本発明で好ましく使用されるデンドリマーは、アミン官能化、カルボン酸官能化またはヒドロキシル官能化された表面を持つ。デンドリマーとしては、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）またはポリプロピレンイミン（ＤＡＢ）型のデンドリマーが好ましい。分子量は６０ｋＤａ未満、たとえば、約２〜１０ｋＤａが好ましい。そのようなデンドリマーは、腎臓によってクリアーにされ得る（Kobayashiら,2004, J. Mag. Reson. Imaging 20 (3) 512-518)。
【００８８】
多糖類
第二に、被検体類縁体は、糖質部分および／または糖質様部分（両方、本明細書で使用する用語「多糖類」に包含される）の、場合によっては誘導化されたポリマーであってもよい。デキストラン（グルコースポリマー、ポリ（１→６）−α−グルコース）はＭＢＬおよび類似のレクチンに強く結合する。発明者らは、これは、多数のグルコース残基（７０ｋＤａデキストラン中約４３０個の残基）およびデキストランの柔軟性の結果であると考える。したがって、ＭＢＬからデキストランを置き換えるのに必要なグルコースの濃度は高い。
【００８９】
デキストランおよびＭＢＬに基づくグルコースアッセイは、約３０ｍＭのグルコース濃度を最適に測定することができる。これは、血液中の通常の５ｍＭのグルコース濃度よりかなり高い。そのようなアッセイは、全位相応答の約１／３だけの感度（１ｍＭのＧｌｃ当たり０．２５°の位相シフト、実施例７参照）で、０〜１０ｍＭのグルコース濃度を測定することができる。
【００９０】
したがって、本発明者らは、全位相応答の１／３を超える感度が０〜１０ｍＭグルコース範囲で使用可能になるように、ＭＢＬおよび類似のレクチンを結合する強さがより小さな代わりの被検体類縁体を探した。
【００９１】
発明者らは、過ヨウ素酸塩でデキストランを処理する（これは、グルコースピラノース環の２位および３位、または３位および４位の炭素間を酸化的に開裂し、ジアルデヒドを形成する）ことによって、ＭＢＬおよび類似のレクチンに対するデキストランの親和力を減少させるために使用することができることを見い出した。これは、ＭＢＬが先に説明したグルコースの３位および４位のエカトリアル水酸基に結合するためであると思われる。３位および４位の水酸基は、他の方法で不活性化することができる（たとえば、酸化、還元、アルキル化、置換、グリコシル化またはエステル化によって）。
【００９２】
非常に驚いたことに、本発明者らは、過ヨウ素酸塩処理デキストラン−ＭＢＬ結合が生理的カルシウム濃度によって阻止されないことを見い出した。これは、先に検討した、マンノース−ＨＳＡ複合体ＭＢＬ結合とは対照的である。特にデキストランのグルコース部分が、ＭＢＬに対して、マンノース部分より低い親和性を持つので、過ヨウ素酸塩処理デキストランＭＢＬ結合は、生理的カルシウム濃度によって阻止されることが予測されていた。
【００９３】
理論的には、グルコース１単位当たり過ヨウ素酸塩の２当量が消費される（１個／ジオール）。しかし、１〜１００当量の過ヨウ素酸塩が７０ｋＤａデキストランに適切であることが見い出された。
【００９４】
アンモニアまたはアミンによるジアルデヒドの処理、続いて還元（たとえば、ナトリウムシアノボロハイドライドを使用して）を使用し、アミノ化デキストランを得ることができる。ジアルデヒドをアミノ化し、次いで場合によっては接触水素添加を行い、遊離アミンを得る方法も使用することができる。ベンジルアミンは、水素化前の中間体が親油性部分を持つデキストラン誘導体であるので、この点において有用なアミンである。また、分光光度法を用いて過ヨウ素酸塩の開裂の程度を評価するために、ベンジルアミン由来アミノ化デキストランを使用することができる。ベンジル基が接触水素化によって除去される場合は、エネルギー供与体部分またはエネルギー受容体部分が、残っているアミンにカップリングし得る。
【００９５】
あるいは、ＭＢＬおよび類似のレクチンに対して異なる親和性の異なる糖質部分または糖質様部分を有する多糖類系被検体類縁体を合成することができる。コンカナバリンＡ ＦＲＥＴアッセイにおいてグルコース検出範囲を調整するマンノース部分を持つデキストランの誘導化は、Ballerstadtら、Diabetes Technology & Therapeutics,第６巻，ｎｏ．２，２００４に開示されている。
【００９６】
ガラクトースは、非常に低い親和性でＭＢＬに結合する。したがって、ガラクトース部分（たとえば、ガラクトース誘導体化デキストラン）を含む被検体類縁体は、非誘導体化被検体類縁体より低い親和力を持つ。
【００９７】
Ｎ−アセチル−グルコサミンは、ＭＢＬに対し高い親和性を持つ。したがって、Ｎ−アセチル−グルコサミン部分（たとえば、ＧｌｃＮＡｃ誘導体化アミロース）を含む被検体類縁体は、ＭＢＬに対し、非誘導体化被検体類縁体より高い親和力を持つ。
【００９８】
この実施形態において、被検体類縁体は、場合によっては誘導体化されているデキストラン、マンナン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、ヒアルロナート、コンドロイチン、ヘパリン、デキストリン、イヌリン、キシラン、フルクタンおよびキチンから選択されるのが好ましい。ガラクトースはＭＢＬに対して非常に低い親和性を有するので、アガロースなどのガラクトースの非誘導体化ポリマーは、被検体類縁体として好ましくない。
【００９９】
当業者は、多糖類を糖質部分で誘導体化できる方法を承知しているであろう。例示として、アミン官能化多糖類（たとえば、CarboMer, San Diego, California, USA, Cat. No.5-00060またはMolecular Probes, Eugene, Oregon, USA, Cat No. D1862から市販されているアミノデキストラン）または先に挙げたアミノ化デキストランは、好都合にも誘導体化されてよい。あるいは、多糖類中のアルコール基および糖質部分または糖質様部分中のアミン基を、ジビニルスルホンを使用してリンクしてもよい。デキストランの誘導体化方法は、欧州特許第５９４７７２号に開示されている。
【０１００】
多糖類の誘導体化のための適切な糖質部分の例として、前記糖質−タンパク質複合体および糖質−デンドリマー複合体に関して記載したものがある。
【０１０１】
合成ポリマー
第三には、被検体類縁体は合成ポリマーであってもよい。
【０１０２】
タンパク質または多糖類の誘導体化より人工ポリマーの合成のほうが、ポリマーのパラメーター（たとえば、分子の柔軟性、水溶性、分子量、糖質部分または糖質様部分の特性、糖質または糖質様部分の数、近接度に基づいた信号発生／変調部分の数）を簡単に制御し、アッセイ性能を改良することが可能である。多糖類に比べ合成ポリマーは、糖質部分の数をポリマーの長さとは無関係に調整することができるという利点を持つ。さらに、ポリマー中に２−ヒドロキシエチルアクリレート（ＨＥＡ）などのモノマーを含む非環状ポリマーを使用して、デキストランに比べて、増加した分子回転柔軟性が増加させる。
【０１０３】
この理論に縛られるつもりはないが、発明者らは、近接度に基づいた信号発生／変調部分が、強い信号を発生させる結合部分に近いことが重要であると考える。球状リガンドは、それらが接近するように、球面上の結合部分および近接度に基づいた信号発生／変調部分を濃縮する。直鎖状のデキストランでは、骨格が結合部分から構成され、その結果、結合を、近接度に基づいた信号発生／変調部分に近づけるか、遠ざけるかを制御することができない。これは、近接度に基づいた信号発生／変調部分に近い結合部分を配置することによって、合成ポリマーにおいて制御することができる。
【０１０４】
この実施形態では、被検体類縁体は、ペンダント糖質部分または糖質様部分を有する、非糖類の柔軟性のある水溶性ポリマーであるのが好ましい。
【０１０５】
用語「柔軟性のある」は、大きく単量体間回転し得るポリマーを含む。ポリマーは、ペンダント糖質部分や糖質様部分および近接度に基づいた信号発生／変調部分以外は、嵩高い基（たとえば、環構造、ｔ−ブチル基または他の立体的に大きな基）は含まないのが好ましい。そのようなポリマーは、骨格構造中の二重結合が非常に少ない（たとえば、１０％未満）ことが好ましい。そのようなポリマーは、球状三級構造を持たないのが適切であるが、そのような構造を持っていてもよい。
【０１０６】
ポリマーは、非分岐状であるのが好ましい（先に検討したデンドリマーとは違い）。これによりポリマーの柔軟性が改良される。しかし、ポリマーは、ある程度分岐してもよく、また架橋してもよいが、ただし、これによってヒドロゲルが形成されないことが条件である。たとえば、全分子量が１００ｋＤａのポリマー中で、１〜５個の分岐が許容される。
【０１０７】
用語「水溶性」は、室温での水溶性が少なくとも４ｍｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも２５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、たとえば少なくとも１００ｍｇ／ｍｌのポリマーを含む。溶解度は、体温でより高くなる。以下で検討するように、体内でセンサーを使用する時、ポリマーが組織流に溶解するように、ポリマーは水溶性であることが重要である。ポリマーは、ＭＢＬなどの糖質結合分子に結合した時であっても、水溶性であるべきである。
【０１０８】
ポリマーは、１以上５タイプまでのモノマー単位を含むのが好ましく、より好ましくは３以上のモノマー単位を含む。
【０１０９】
ポリマーとしては、ペンダント糖質部分または糖質様部分を有する第一モノマー単位残基と、ぶら下がっている、近接度に基づいた信号発生／変調部分を有する第二モノマー単位残基とを含むコポリマーが適切である。あるいは、またはそれに加えて、ペンダント糖質部分または糖質様部分およびぶら下がっている、近接度に基づいた信号発生／変調部分の両方を有する単一のモノマー単位残基を使用してもよい。第一および第二モノマー単位の使用が好ましい。そうすれば、糖質部分または糖質様部分と近接度に基づいた信号発生／変調部分との量を独立して制御することができる。
【０１１０】
コポリマーとしては、ランダムコポリマーが好ましい。しかし、交互コポリマーを使用してもよい。大きなブロックを持つブロックコポリマーの使用は好ましくない。しかし、低分子量（たとえば、１〜３ｋＤａ）のブロックコポリマーは使用してもよい。
【０１１１】
ＭＢＬを用いるアッセイにおいて糖質結合分子として使用する場合、該ポリマーは、０ｍＭのグルコースで、アミノデキストランの少なくとも５０％強くＭＢＬに結合するのが好ましく、より好ましくは、少なくともアミノデキストランと同じくらい強く結合するが、より簡単に抑制される。ポリマーは、０〜３５ｍＭのグルコースの範囲で簡単に抑制される（全位相応答の大部分）が特に望ましく、とりわけ２〜１５ｍＭの範囲が望ましい。これによって、特に生理学的に関心のあるグルコース濃度にわたりアッセイが提供され、これはアミノデキストランをグルコース類縁体として使用する類似のアッセイより感度が高い。
【０１１２】
複数のタイプの糖質部分または糖質様部分を有するモノマー単位残基が存在してもよい。糖質部分または糖質様部分は異なってもよく、ＭＢＬに対し異なる親和性および類似のレクチンを有してもよい。
【０１１３】
第一モノマー単位（または単一モノマー単位）は、それぞれ、糖質部分または糖質様部分の二重結合含有誘導体であるのが適切である。しかし、第一モノマー単位（または単一モノマー単位）は、それぞれ、適切には重合後、糖質部分または糖質様部分がリンクし得る官能基を含む、二重結合含有分子であってもよい。
【０１１４】
糖質部分または糖質様部分の二重結合含有誘導体は、糖質部分または糖質様部分のアリルまたはビニル含有誘導体であるのが好ましい。糖質部分または糖質様部分の他の適切な二重結合含有誘導体として、アリル誘導体の相同体、たとえば、３−ブテニルまたは４−ペンテニル誘導体、または４位に糖質部分または糖質様部分を持つスチレン誘導体が挙げられる。糖質部分または糖質様部分のさらに適切な二重結合含有誘導体として、ＨＥＡ、２−ヒドロキシエチルメタアクリレート（ＨＥＭＡ）またはビニルアルコール（ＶＡ）系誘導体が挙げられる。
【０１１５】
糖質部分または糖質様部分は、第一モノマー単位（または単一モノマー単位）のアミン、酸、アルコールおよび／またはスルホン官能基とリンクしてもよい。たとえば、モノマー単位中のアルコール基および糖質部分または糖質様部分中のアミン基は、ジビニルスルホンを使用してリンクしてもよい。糖質がマンノースの場合、これらはＭＢＬへの結合で重要なので、Ｃ３−ＯＨまたはＣ４−ＯＨ基を介して結合を形成すべきではない。この場合、ジビニルスルホン結合は不適切である。
【０１１６】
アミノ誘導体化糖質部分は、二糖類の還元アミノ化によって製造することができる。これは糖質部分をそのアノマー位（Ｃ１）でリンクさせる。
【０１１７】
糖質部分または糖質様部分は、フィッシャーグリコシド化によってアルコール基（たとえば、ＨＥＡ中）に結合することができる。
【０１１８】
必ずしも、第一モノマー単位（または単一モノマー単位）が二重結合を含む必要はない。
【０１１９】
コポリマーにおける使用に適切な糖質の例として、前記糖質−タンパク質複合体に関して検討したものがある。
【０１２０】
第二モノマー単位（または単一モノマー単位）は、それぞれ、適切には重合後、近接度に基づいた信号発生／変調部分部分がリンクし得る官能基を含む、二重結合含有分子が適切である。適切な官能基として、酸、アルコールおよび／またはスルホンが挙げられる。重合後の結合は、高価な近接度に基づいた信号発生／変調部分の損失を最小にするのを助ける。
【０１２１】
しかし、第二モノマー単位（あるいは単一モノマー単位）は、近接度に基づいた信号発生／変調部分を含んでもよい。この場合、適切な重合性基および結合の上記の検討が適用される。
【０１２２】
好ましい実施形態では、第二モノマー単位は、それぞれ、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミドまたはその誘導体である。
【０１２３】
好ましい実施形態では、単一モノマー単位は、それぞれ、リシンの誘導体を含む、二重結合含有糖質部分または糖質様部分である。例を以下に示す（多段反応スキーム）：
【化２】
【０１２４】
この反応スキームにおける出発材料は、PolysSciences Europe (Eppelheim, Germany)を通じて入手可能なメタアクリロイル−Ｌ−リシンである。重合後、α−アミン基は、近接度に基づいた信号発生／変調部分にリンクすることができる。
【０１２５】
ポリマーは、さらに、ペンダント糖質部分、糖質様部分または近接度に基づいた信号発生／変調部分を有さない第三モノマー単位残基を含むのが好ましい。これは柔軟性を増やすのを助ける。
【０１２６】
柔軟性は、ＨＥＡなどの立体障害のない第三モノマー単位を使用することによって増やす。また、柔軟性は、帯電していない第三モノマー単位を使用することによっても増やす。第三モノマー単位を含まないポリマーは、静電反発力のため、柔軟性の減少を最小限にするために不活性化する必要のある、プラスに帯電しているアンモニウム基を数多く持つ。
【０１２７】
複数のタイプの第三モノマーをポリマーに含ませることができる。
【０１２８】
第三モノマー単位は、それぞれ、たとえば水酸基などの親水性基を含む二重結合含有分子であるのが好ましい。第三モノマー単位として、スチレンなどの親油性二重結合含有分子であるのは好ましくない。
【０１２９】
好ましい実施形態では、第三モノマー単位は、それぞれ、ＨＥＡ、ビニルピロリドン、ＭＭＡ、ＨＥＭＡ、ビニルアルコールおよび／またはエチレングリコールである。しかし、当業者であれば、使用することのできる親水性基を含む他の多くの二重結合含有分子があることを理解するであろう。
【０１３０】
モノマー単位は付加重合によって反応するのが適切である。付加重合は、たとえば、過硫酸カリウム（ＰＰＳ）または他の過酸化化合物を使用する、遊離基開始重合であってもよい。
【０１３１】
他の可能な重合として、縮合重合（たとえば、イオン縮合重合）、開環重合および原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）が挙げられる。当業者であれば、モノマー単位に性質が、重合の所望の方法に依存する（たとえば、二重結合含有モノマー単位は、縮合重合の必要はない）ことを理解するであろう。
【０１３２】
モノマー単位は開始剤を添加する前に混合するのが適切である。
【０１３３】
重合反応は２日未満かかるのが好ましい。重合の長さは、コポリマー生成物の分子量を制御するために使用することができる。
【０１３４】
重合反応は、酸素のない条件下で行われるのが適切である。
【０１３５】
重合反応は室温で行うのが適切である。
【０１３６】
単一モノマー単位を使用しない場合、第一モノマー単位は、２０〜７０重量％の量で反応混合物中に存在するのが好ましく、より好ましくは、３０〜５０重量％である。
【０１３７】
第三モノマー単位を使用する場合、それらは、５〜１５重量％の量で反応混合物中に存在するのが好ましい。
【０１３８】
ポリマーの組成は、反応混合物中に存在するモノマー単位の量を正確に反映しないことは理解されるであろう。これは、他の要因（たとえば、立体障害および溶解性）の影響があるためである。
【０１３９】
また、被検体類縁体は、２以上の分離した実体（これらは一緒に被検体類縁体として作用する）から構成されてもよいことも留意すべきである。特に、被検体類縁体は、少なくとも２個の被検体類縁体部分を持つ第一実体と、レクチンなどの被検体結合分子である第二実体とで構成されていてもよい。たとえば、受容体標識化されたＭＢＬおよび供与体標識化されたＭＢＬを、標識化されていないデキストランまたは標識化されていない合成ポリマーとともにテンプレートとして使用し、ＦＲＥＴが起こるように、互いの接近性において供与体標識化されたＭＢＬおよび受容体標識化されたＭＢＬをもたらすことができる。（コンＡを使用する例が、Gestwickiら(2002) Chemistry and Biology 9，第ｌ６３頁にある）。
【０１４０】
被検体類縁体は、先に検討したように、１個以上の近接度に基づいた信号発生／変調部分で標識化されるのが好ましい。好ましくは、被検体類縁体は、１種以上のエネルギー受容体部分（たとえば、先に検討した用に、ＨＭＣＶ−１またはAlexa Fluor 594（商標））を含むのが好ましい。しかし、１以上のエネルギー供与体部分を含んでもよい。
【０１４１】
近接度に基づいた信号発生／変調部分は、糖質部分または糖質様部分に関連して先に検討したように、被検体類縁体に結合してもよい。たとえば、デキストランの標識化は、直接ジビニルスルホンカップリング、またはアミノ化（先に記載したような）、続いてカップリングによって、達成することができる。アミン誘導体化デキストランを被検体類縁体として使用する場合、望ましくない析出をもたらす可能性があるので、近接度に基づいた信号発生／変調部分の結合の間の架橋を回避するために、注意しなければならない。架橋を最小化するためのＤＶＳによるデキストランの誘導体化方法は、ＥＰ５９４７７２に検討されている。
【０１４２】
被検体類縁体は、センサーからの逃げを防ぐのに充分な高分子量で、被検体類縁体がレクチンに結合した時、析出が起こらない程度に低分子量であるべきである。被検体類縁体の重さは、２５〜２５０ｋＤａの範囲が好ましく、より好ましくは４０〜２５０ｋＤａであり、さらにより好ましくは７０〜１５０ｋＤａであり、非常に好ましくは１００〜１２０ｋＤａであり、たとえば１１０ｋＤａが好ましい。１１０ｋＤａデキストランに基づく被検体類縁体が、特に好ましい。
【０１４３】
場合によっては、被検体類縁体およびレクチンは、互いにつながっていてもよい。
【０１４４】
センサー構成
アッセイの成分は、被検体の拡散は可能にするがアッセイ成分の拡散は可能にしない孔径を有する材料によって保持されているのが好ましい。しかし、この選択性は、他の方法、たとえば、帯電していない材料の拡散を可能にする材料を使用することによっても達成される。
【０１４５】
アッセイの成分は、シェルまたはマトリックス材料によって保持されるのが好ましい。被検体類縁体および／またはレクチンは、この材料にグラフトされてもよい。材料は、国際公開公報第００／０２０４８号に記載のような生分解性であることはより好ましい。場合によっては、センサーは、国際公開公報第０３／００６９９２号に記載のような、生分解性材料のシェルによって保持された小粒子を含んでもよい。
【０１４６】
好ましい実施形態では、国際公開公報第２００５／１１０２０７号に記載されるような、グルコースをアッセイ成分に接触させながら、アッセイの成分を、アッセイ成分を封入する生分解性材料のシェルによって保持し、該生分解性材料は、疎水性および親水性単位を有するコポリマーを含む。
【０１４７】
１個以上のアッセイ成分チャンバーがシェル内に存在してもよい。
【０１４８】
コポリマーはランダムコポリマーが好ましい。
【０１４９】
コポリマーの透過性は、少なくとも５．０×１０-10ｃｍ2／ｓであるのが好ましい。
【０１５０】
用語「透過性」は、実験的に測定することができる水和コポリマーによる、被検体（グルコース）の全透過性を言うために使用する。
【０１５１】
一度体内に移植されると、該コポリマーは１週間から１年の期間、たとえば３０日間にわたって分解するのが好ましい。代表的なポリマー厚さである５μｍに関して、これは０．１７μｍ／日の分解速度に相当する。
【０１５２】
グルコースの移動性に関して、生分解性材料の分子量カットオフ限界は、２５０００Ｄａ以下が好ましい。より好ましくは、生分解性材料の分子量カットオフ限界は、１００００Ｄａ以下である。
【０１５３】
疎水単位の重量分率は、コポリマーの１０〜９０％が好ましく、より好ましくは、コポリマーの１０〜５０％である。
【０１５４】
各親水性単位の分子量は、２００〜１００００Ｄａが好ましく、より好ましくは４００〜４０００Ｄａである。
【０１５５】
コポリマーの親水性単位は、それぞれ、ポリエチレングリコールと二価の酸とのエステルを含むのが好ましい。ポリエチレングリコールの代わりのものとして、エチレングリコールとプロピレングリコールとの混合ポリマーを使用してもよく、および／またはポリエーテル骨格は、疎水性基および／または親水性基で置換されてもよい。ポリエチレングリコールのさらなる代わりのものとして、ポリテトラヒドロフラン（ポリ−ＴＨＦ）を使用してもよい。
【０１５６】
親水性単位は、テレフタル酸および／またはコハク酸を二価の酸として含むことが好ましい。他の適切な二価の酸として、シュウ酸、酒石酸、フタル酸、アスパラギン酸、マロン酸、およびオリゴマーまたはポリマーの二価の酸、たとえば、ポリ（ダイマー酸−セバシン酸）がである。好ましい実施形態では、二価の酸はテレフタル酸のみである。代わりの好ましい実施形態において、テレフタル酸のコハク酸に対するモル比は、１：２〜２：１であり、１：１が適切である。
【０１５７】
あるいは、コポリマーの親水性単位は、オリゴマーを含んでもよい。適切なオリゴマーは、ヒドロキシエチルメタアクリレート（ＨＥＭＡ）、ビニルピロリドン、ビニルアルコール、糖質、エチレンオキサイドおよび／または２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸のオリゴマーである。親水性単位がＨＥＭＡを含む場合、生分解性結合（たとえば、テレフタレート結合などのエステル結合）がポリマー内にあり、生分解性が増す。
【０１５８】
各疎水性単位の分子量は、４００〜５０００Ｄａが好ましい。
【０１５９】
コポリマーの疎水性単位は、ブタン−１，４−ジオールと二価の酸とのエステルを含むのが好ましい。ブタン−１，４−ジオールの代わりとして、ペンタン−１，５−ジオールまたはヘキサン−１，６−ジオールを使用してもよい。
【０１６０】
疎水性単位が、二価の酸としてテレフタル酸および／またはコハク酸を含むことが好ましい。好ましい実施形態では、テレフタル酸のコハク酸に対するモル比は、１：２〜２：であり、１：１が適切である。あるいは、疎水性単位は、二価の酸として、テレフタル酸のみを使用するのがよい。他の適切な二価の酸は先に記載されている。
【０１６１】
あるいはコポリマーの疎水性単位は、メチルメタアクリレート（ＭＭＡ）、ポリウレタンおよび／またはアミド（たとえば、ナイロン−６、オリゴ−Ｎ−三級ブチルアクリルアミドまたはオリゴ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）のオリゴマーを含み得る。疎水性単位がＭＭＡを含む場合、生分解性結合（たとえば、テレフタレート結合などのエステル結合）は、ポリマー内に提供され、生分解性を増す。
【０１６２】
好ましいポリマーは、一般式：ａＰＥＧ（Ｔ／Ｓ）ｂＰＢ（Ｔ／Ｓ）ｃ（式中、「ａ」は、ＰＥＧ鎖の分子量を示し、「ｂ」は、得られたポリマー中のＰＥＧ（Ｔ／Ｓ）（ポリエチレングリコールテレフタレート／サクシニレート）の重量分率を示し、「ｃ」は、得られたポリマー中のＰＢ（Ｔ／Ｓ）（ポリブチレンテレフタレート／サクシニレート）の重量分率を示す）で表される。このようなポリマーの例として、６００ＰＥＧＴ８０ＰＢＴ２０、１０００ＰＥＧＴ８０ＰＢＴ２０、２０００ＰＥＧＴ８０ＰＢＴ２０、４０００ＰＥＧＴ８０ＰＢＴ２０、１０００ＰＥＧＴ５０ＰＢＴ５０および１０００ＰＥＧ（Ｔ／Ｓ）６０ＰＢ（Ｔ／Ｓ）４０（Ｔ／Ｓ ５０％）がある。ポリマーは、生分解性であり、高グルコース透過性を有し、その分子量カットオフ特性は、約２５０００Ｄａである。
【０１６３】
これらのポリマーのいくつかが米国特許第６３８３２２０号明細書および欧州特許第１２４７５２２号に開示されている。
【０１６４】
コポリマーの外皮の厚さは１〜５０μｍであるのが好ましい。
【０１６５】
第二の態様では、本発明は、本明細書で記載したセンサーを製造する方法に関する。
【０１６６】
ポリマーマイクロカプセルの製造のための化学的方法として、相分離（コアセルベーション）、溶剤蒸発および／または抽出が挙げられる。
【０１６７】
ポリマーマイクロカプセルを製造する適切な物理的方法として、噴霧乾燥、スプレー被覆、スプレー冷却、回転円盤式アトマイゼーション、流動床被覆、共押出し（たとえば、固定ノズル共押出し、遠心性ヘッド共押出しまたは水中ノズル共押出し）およびパンコーティングが挙げられる。
【０１６８】
センサー用途
第三の態様では、本発明は、本明細書で記載したセンサーを使用して、グルコースを検出する方法であって、センサーを哺乳動物の皮膚に移植すること、および外部光学的手段を使用してグルコースを検出または測定することを含む方法に関する。
【０１６９】
第四の態様では、本発明は、前記センサーを使用してグルコースを検出する方法であって、哺乳動物の皮膚内または下に存在するセンサーの照射による外部光学的手段を使用して、グルコースを検出または測定することを含む方法に関する。
【０１７０】
該方法は、さらにセンサー中で生分解性材料を分解することを含むのが好ましい。
【０１７１】
センサーは、注射によって、好ましくはシリンジを用いて、あるいは他の方法で、特に国際公開公報第００／０２０４８号に記載されている任意の方法によって、皮膚内に導入してもよい。センサーは、患者への不快感を最小にするため、狭いゲージ針によって注射するのに適したサイズのものが好ましい。センサーの最高寸法は、２０μｍ〜１ｍｍが好ましい。しかし、大きな最高寸法を持つロッド型のセンサーを使用してもよい。
【０１７２】
センサーは、真皮の厚さ内あるいは皮下に導入してもよいし、表皮に導入してもよいが、後者の場合、もしかしたら、生分解性材料が分解する前に、表皮層の成長によって皮膚から排出される可能性がある。
【０１７３】
センサーは皮膚内に配置されるので、センサーにて発生する光信号は、経皮的に（すなわち、皮膚の上位層を通して）検出されるのが好ましく、したがって、センサーと感染をもたらし得る外部環境との間の任意の直接接触を未然に防ぐ必要がある。
【０１７４】
しかし、代わりに、皮膚を介して光を通すことなくセンサーが外部光学的手段によって照らされるのを可能にする、中空または透明手段（たとえば、針または光ファイバー）を介して検出を行ってもよい。
【０１７５】
一度センサーが皮膚の位置に置かれると、悪影響を起こすことなく必要な回数だけグルコース測定を行うことができる。もしグルコース測定がより頻繁に行われれば、厳密な制御を、血中のグルコースの濃度において維持することができ、不満足に調整された血糖に関連する状態を発症するリスク、たとえば、網膜疾患、腎臓疾患、神経障害、一般的な小血管および大血管損傷、および循環不良を減少させるであろうから、これは、長期間治療の糖尿病患者に対して特に有利である。
【０１７６】
本発明のセンサーは、それ自身は、アッセイの読み出しを問い合わせするために必要な光学成分のいかなるもの（これらは体とは別に備えられ、体の外に置かれるのが好ましい）も含まないので、センサーを、患者に対して最小の不快感で注射し得る形態で、簡単に備えることができる。
【０１７７】
ＦＲＥＴの技術を使用する、アッセイを導入するセンサーには、エネルギー供与体部分の吸収スペクトル内の波長で入射光を供給し、放射された蛍光の強度または励起状態の寿命を測定することによって、問い合わせすることができる。一般的に知られている方法は以下の通りである。
【０１７８】
１．定常状態の測定
２．タイムドメイン寿命の測定
ａ．信号光子の計測
ｂ．ストリークカメラ
ｃ．ゲート検出（パルスサンプリング）
ｄ．アップコンバージョン
３．周波数ドメイン寿命の測定
ａ．位相変調蛍光光度法（ヘテロダイン検出）
ｂ．位相敏感検波法（ホモダイン検出）
【０１７９】
該原理の更なる説明は、Lakowicz, J.R.「Principles of Fluorescence Spectroscopy, 第二編」，１９９９にある。
【０１８０】
アッセイを問い合わせするための好ましい方法は、位相変調蛍光光度法である。
【０１８１】
アッセイを問い合わせするための適切な光学セットアップ（図６）は、エネルギー供与体部分の発光スペクトル内で光を放射する、光放射ダイオード（ＬＥＤ）１１で構成される。ＬＥＤは、好ましくは４５°の範囲で、充分な位相シフトとなる周波数で、ＬＥＤを調整する、ドライバ回路１３によって動作される。３ｎｓの寿命を持つ蛍光団に関して、好ましい周波数は、５０ＭＨｚである。ＬＥＤにより放射された光は、励起フィルター１５によってフィルターをかけられ、ダイクロイックビームスプリッター１７によってセンサー１６に向けられ、レンズ１９によって、注射されたセンサー１６上のセンサー／皮膚に集束される。センサーによって放射された蛍光は、レンズ１９によって集められる。光はダイクロイックビームスプリッターを通り、発光フィルター２１によりフィルターをかけられる。フィルターをかけられた光は、レンズ２３によって検出器２５、この場合アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）に集束される。ＡＰＤは、ＡＰＤバイアス供給２７によって逆バイアスされ、これは、信号処理およびコントロールユニット２９によって制御される。ＡＰＤからの信号は、トランスインピーダンス増幅器３１によって増幅され、バンドパスフィルター３３によってフィルターをかけられ、第一アナログ−デジタル変換器（ＡＤＣ）３５によってサンプリングされる。対応して、ＬＥＤへの変調されたドライブ信号を、第二ＡＤＣ３７によってサンプリングする。第一ＡＤＣ３５上にサンプリングされた信号は、以下である。
Ｙ1（ｔ）＝Ａ1*ｓｉｎ（２*π*ｆ*ｔ＋φf1＋φ1）
【０１８２】
Ａ1は、アッセイから検出された信号の振幅であり、ｆは変調周波数であり、φf1は、供与体蛍光団によって導入された位相差であり、φ1は、電子的光学的セットアップによって導入された固定位相差である。
【０１８３】
第二ＡＤＣ３７上にサンプリングされた信号は以下の通りである。
Ｙ2（ｔ）＝Ａ2*ｓｉｎ（２*π*ｆ*ｔ＋φ2）
【０１８４】
Ａ2は、ＬＥＤへの変調ドライブ信号の振幅であり、φ2は、電気的セットアップによって導入された固定位相差である。
【０１８５】
信号処理およびコントロールユニットは、２つのサンプリングされた信号を比較し、電子機器および工学機器によって導入された固定および公知の位相差を相殺することによって、エネルギー供与体部分によって導入された位相差φf1を導き出す。
【０１８６】
測定は、皮膚に近い蛍光光度計を保持することによって、およびセンサーを有するアラインメントにおいて行う。位相差は、相−被検体−校正関数、たとえば、
被検体濃度＝Ａ＋Ｂｘ／（ｋ＋ｘ）
（式中、Ａは被検体不在時の相であり、Ｂは最大応答時の相であり、ｘは測定相であり、ｋは、受容体と被検体類縁体との間の解離定数である）を使用することによって、被検体濃度に変換する。
【０１８７】
代替測定技術は、蛍光強度の測定である。
【０１８８】
この場合、光学的手段は、エネルギー供与体部分の吸収スペクトル内での波長で入射光の第一ビームを、好ましくは、エネルギー受容体部分の吸収スペクトル内での波長で入射光の第二ビームを（これはエネルギー受容体部分も蛍光団であることに適用される）供給する必要がある。さらに、光学的手段は、好ましくは、センサー内で発生する光信号を、２つの異なる波長、すなわち、エネルギー供与体部分の発光スペクトル内で波長１（被検体の測定に関して発生する信号）およびエネルギー受容体部分（被検体信号、内部参照またはキャリブレーション信号であり得る）の発光スペクトル内では波長２で、測定することができる必要がある。
【０１８９】
蛍光光度計は、以下のパラメーターを別々に測定する。
波長１（エネルギー供与体部分）で
励起光強度、Ｉ（１，０）
周囲の光強度、Ｉ（１，１）
組合わせた蛍光の強度および周囲の光、Ｉ（１，２）
波長２（エネルギー受容体部分）で
励起光強度、Ｉ（２，０）
周囲の光強度、Ｉ（２，１）
組合わせた蛍光の強度および周囲の光、Ｉ（２，２）
再び、測定を、皮膚に近い蛍光光度計を保持することによって、およびセンサーを有するアラインメントにおいて行う。センサー内に発生した蛍光信号の経皮的測定を行う時は、皮膚による信号の吸収を考慮することが必要である。ヒト皮膚の吸収率は、実験によって、４００ｎｍ〜９００ｎｍの範囲内で、最も低いことがわかっている。得られる最終出力は、２つの蛍光団からの蛍光強度の間の標準化された比であり、以下の関係（式１）によって規定される。
最終出力＝（Ｉ（１，２）−Ｉ（１，１））*Ｉ（２，０）／（Ｉ（２，２）−Ｉ（２，１））*Ｉ（１，０）
（１）
【０１９０】
前記式１によって与えられる、光学的手段（たとえば、蛍光光度計）からの最終出力は、好ましくは国際公開公報第００／０２０４８号に規定されている原理に基づいて得ることができる、校正ダータを使用するコンピュータによって、被検体濃度に変換する。
【０１９１】
本発明のさらなる態様
第五態様では、本発明は、流体中の糖質被検体の検出または測定用センサーであって、該センサーは、競合結合アッセイの成分を含み、該アッセイの読み出しは、被検体の拡散は可能にするがアッセイ成分の拡散は可能にしない材料によって保持されている検出可能または測定可能な光信号であり、アッセイ成分は、
レクチンと、
被検体類縁体であって、少なくとも１個のグルコース単位の３−および／または４−水酸基が不活性化されている、場合によっては誘導化されているデキストランを含む被検体類縁体とを含み、被検体類縁体は、レクチンに結合するための被検体と競合することができるセンサーに関する。デキストランは、過ヨウ素酸塩で処理されたデキストランであることが好ましい。
【０１９２】
第六態様では、本発明は、流体中の糖質被検体の検出または測定用センサーであって、センサーは、競合結合アッセイの成分を含み、該アッセイの読み出しは、被検体の拡散は可能にするがアッセイ成分の拡散は可能にしない材料によって保持された検出可能または測定可能な光信号であり、アッセイ成分は、
レクチンと、
レクチンと結合するための被検体と競合することができるマンノース−タンパク質複合体を含む被検体類縁体と
を含むセンサーに関する。
【０１９３】
好ましくは、マンノース−タンパク質複合体は、マンノースのＨＳＡに対するモル比が、１０：１〜１５０：１の範囲、たとえば、１５：１、３０：１、６０：１または１２０：１を使用して製造されたものである。
【０１９４】
第七態様では、本発明は、流体中の糖質被検体の検出または測定用センサーであって、センサーは、競合結合アッセイの成分を含み、該アッセイの読み出しは、被検体の拡散は可能にするがアッセイ成分の拡散は可能にしない材料によって保持された検出可能または測定可能な光信号であり、アッセイ成分は、
近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアの１つで標識化された糖質結合分子と；
糖質結合分子に結合するための被検体と競合することができる糖質類縁体であって、糖質類縁体は柔軟性のある水溶性ポリマーであり、
第一モノマー単位残基が、ペンダント糖質部分または糖質様部分と、近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアのもう一方であるペンダント部分とを有する、第一モノマー単位の重合残基、および／または第二モノマー単位残基がペンダント糖質部分または糖質様部分を有し、第三モノマー単位残基が近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアのもう一方であるペンダント部分を有する、第二モノマー単位および第三モノマー単位の共重合化残基を含む糖質類縁体と
を含むセンサーに関する。
【０１９５】
第八態様では、本発明は、前記ポリマーを製造する方法であって、以下の工程の１つを含む方法に関する：
ａ）それぞれ、ペンダント糖質部分または糖質様部分と、ぶら下がっている近接度に基づいた信号発生／変調部分とを有するモノマー単位と、場合によっては第三モノマー単位とを重合すること；
ｂ）それぞれ糖質部分または糖質様部分を有する第一モノマー単位と、それぞれ、ぶら下がっている近接度に基づいた信号発生／変調部分を有する第二モノマー単位と、場合によっては第三モノマー単位とを共重合すること；
ｃ）それぞれ、ペンダント糖質部分または糖質様部分と、近接度に基づいた信号発生／変調部分にリンクするためのペンダント官能基とを有するモノマー単位と、場合によっては第三モノマー単位とを重合し、次いで、モノマー単位残基を、近接度に基づいた信号発生／変調部分と反応させること；
ｄ）それぞれペンダント糖質部分または糖質様部分を有する第一モノマー単位と、それぞれ、近接度に基づいた信号発生／変調部分にリンクするためのペンダント官能基を有する第二モノマー単位と、場合によっては第三モノマー単位とを共重合し、次いで第二モノマー単位残基を近接度に基づいた信号発生／変調部分と反応させること；
ｅ）それぞれ、糖質部分または糖質様部分にリンクするためのペンダント官能基と近接度に基づいた信号発生／変調部分にリンクするための異なるペンダント官能基とを有するモノマー単位と、場合によっては第三モノマー単位とを重合し、次いでモノマー単位残基を糖質部分または糖質様部分および近接度に基づいた信号発生／変調部分と反応させること；または
ｆ）それぞれ糖質部分または糖質様部分にリンクさせるためのペンダント官能基を有する第一モノマー単位と、それぞれ近接度に基づいた信号発生／変調部分にリンクするための異なるペンダント官能基を有する第二モノマー単位と、場合によっては第三モノマー単位とを共重合し、次いで糖質または糖質様部分を持つ第一モノマー単位残基と、近接度に基づいた信号発生／変調部分を持つ第二モノマー単位残基とを反応させること。
【０１９６】
本発明の任意の態様に関連して記載した特徴は、本発明の他の態様に適用することができる。
【０１９７】
本発明を、実施例および図面を用いてさらに説明する。
【０１９８】
一般
以下の材料を使用した。
ｐ−アミノフェニル−α−Ｄ−マンノピラノシルイソチオシアネート、ウシ血清アルブミン−α−Ｄ−マンノピラノシルイソチオシアネート（２３当量、Ｍａｎ ｐｒ．ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン、過ヨウ素酸ナトリウム、ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｏ−フェニレンジヒドロクロリド、ベンジルアミン、アンモニア、ナトリウムシアノボロハイドライド(Sigma-Aldrich)
Ｎｕｎｃ Ｆ９６ＭａｘｉＳｏｒｐプレート(Nunc, Denmark)
ＰＤ−１０カラム、ストレプトアビジン−ＨＲＰ(Amersham bioscience)
デキストラン(Pharmacosmos, Denmark)
マンナン結合レクチン（いくつかの供給源、たとえば、Statens serum Institute、 Copenhagen, Denmarｋから入手し得る）
透析チューブSpectra/Por (Spectrum Laboratories社,California, USA)、Float-A-Lyzer（商標）２５．０００ＭＷＣＯ 透析チューブは、Spectrum Laboratories Europe (Breda, The Netherlands)から入手した。
【０１９９】
ソルビタンモノオレエート（Ｓｐａｎ（登録商標）８０）、アゾジイソブチロジニトリル（ＡＩＢＮ）および２−ヒドロキシエチルアクリレートは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩は、PolysSciences Europe (Eppelheim, Germany)から入手した。２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］ジヒドロクロリド（ＶＡ−０４４）は、Wako GmbH (Neuss, Germany）から入手した。
【０２００】
アリルα−Ｄ−グルコピラノシドおよびアリル２−アセタミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシドは、Glycon Biochemicals, Germanyから入手した。アリルα−Ｄ−ガラクトピラノシドはSigma-Aldrichから入手した。
【０２０１】
他の記載がない限り、ＰＢＳは、２０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４であり、ＴＢＳは、２０ｍＭのＴＲＩＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．２５ｍＭのＣａＣｌ2、ｐＨ７．４である。
【０２０２】
省略語：ＭＢＬ、マンナン結合レクチン；ＰＢＳ、リン酸緩衝食塩水；ＴＢＳ、ＴＲＩＳ緩衝食塩水；ＥＬＬＡ、酵素結合レクチンアッセイ
【実施例１】
【０２０３】
ＭＢＬの染色
ヒトＭＢＬを、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１．２５ｍＭのＣａ2+を含む１０ｍＭのＮａＨＣＯ3緩衝液、ｐＨ８．７に緩衝液交換（透析法により）した。染色のために使用した染料は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）５９４スクシンイミジルエステル(AF594-SE) (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA)であった。染料を乾燥ＤＭＳＯに溶解し、炭酸水素緩衝液中のＭＢＬにゆっくり（１０分）加えた。反応を１時間行った。染色は、染料の１５倍モル過剰（ポリペプチド単位に関して）で行った。精製を、１０ｍＭのトリス緩衝液ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１．２５ｍＭＣａ2+に対する透析法によって行った。得られた、染色されたタンパク質の標識化度を、ＭＢＬの１サブユニット当たり染料２．３として、ＵＶ分光法によって決定した。
【実施例２】
【０２０４】
デキストランの生成
１５０ｋＤａデキストラン（６．００ｇ，０．４μｍｏｌ）を２５０ｍＭのＫ2ＨＰＯ4、ｐＨ１１．５（６００ｍＬ）に溶解した。水素化ホウ素ナトリウム（３ｇ，０．０８ｍｏｌ）を加え、次いでジビニルスルホン（１５ｍｌ，０．１５ｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で３０分撹拌し、その後濃塩酸でｐＨ７．２に中和した。３０分撹拌した後、得られた混合物を水（３×２５Ｌ）中で透析した（ＭＷＣＯ１０−１２ｋＤａ）。内容物をエルレンマイヤーフラスコに移し、２４％アンモニア（２００ｍＬ）を加えた。２時間後、ｐＨを１０．５に調整し、反応物を一晩撹拌した。過剰のアンモニアを水（８×２５Ｌ）中で透析法（ＭＷＣＯ１０−１２ｋ）により除去し、内容物全てを凍結乾燥し、アミノデキストラン５．７５ｇ（アミノデキストラン、ＭＷ：１８５ｋＤａに対して７８％）を白色綿毛状物質として得た。元素分析を使用して、分子量、アミン導入率および導入されたジビニルスルホンの量の簡易評価を行った。
Ｆｏｕｎｄ Ｃ３９．８６；Ｈ６．２６；Ｎ０．１６；Ｓ３．０８％Ｄｅｘｔｒａｎ１５０ｋ，〜２２ＤＶＳ−ＮＨ2，〜１６０ＤＶＳ−ＯＨ，ａｎｄ〜７２０Ｈ2Ｏ ｒｅｑｕｉｒｅｓ Ｃ３９．５５；Ｈ６．６０；Ｎ０．１６；Ｓ３．０７％
【実施例３】
【０２０５】
ヘキサ−メトキシ−クリスタルバイオレットスクシンイミジルエステル（ＨＭＣＶ−１）の生成
ＨＭＣＶ−１の合成：
【化３】
【０２０６】
スキーム１．Ｉ）４−（Ｎ−メチルアミノ）ブタン酸塩酸塩（１当量）ジイソプロピルエチルアミン、アセトニトリル中、２０℃、２０時間、ＩＩジメチルアミン（過剰量）、ＩＩＩ）ＴＳＴＵ、ジイソプロピルエチルアミン、ｉアセトニトリル、２０℃、２時間
【０２０７】
４ａ （ＢＦ4-）：４−（メチルアミノ）酪酸塩酸塩（１．３６ｇ；８．８ｍｍｏｌ）、１（５．０ｇ；８．３ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（５ｍＬ）をアセトニトリル（１２０ｍＬ）に溶解した。反応混合物を、乾燥窒素雰囲気中で、３０〜３５℃、２２時間撹拌した。ジメチルアミン（４０ｍＬの４０％溶液）水溶液を加え、反応混合物をさらに４日間撹拌した。溶剤および過剰のジメチルアミンを真空除去し、残った材料をクロロホルムに溶解した。クロロホルム溶液を食塩水で２回洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、その後、溶剤を蒸発させ、ＣＨ2Ｃｌ2／エーテルから生成物を再析出させた。収量：４．４ｇ（７０％）、暗青色の粉末
【０２０８】
ＭＳ（ＦＡＢ＋）：ｍ／ｚ６２４（Ｍ＋）
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ８．３４（ＩＨ，ｂｓ），６．０３（２Ｈ，ｓ），５．８３（４Ｈ，ｓ），３．４９（２Ｈ，ｍ），３．４６（６Ｈ，ｓ），３．４４（１２Ｈ，ｓ），３．１２（３Ｈ，ｓ（ｍａｓｋｅｄ）），３．０８（１２Ｈ，ｓ），１．９４（２Ｈ，ｔ），１．７０（２Ｈ，ｍ）
【０２０９】
ＨＭＣＶ−１（Ｃｌ-）：ＴＳＴＵ（２−スクシンイミド−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩；０．８ｇ，２．６ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（１５ｍＬ）中の４ａ（０．９ｇ，１．２６ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（０．５５ｇ，４．５ｍｍｏｌ）溶液に加えた。反応混合物を密閉したフラスコ内で２時間撹拌し、その後これを、ＨＣｌ水溶液（４ｍＬ，２Ｍ）で酸性化した、氷冷したほぼ飽和ＮａＣｌ溶液（約１５０ｍＬ）に注ぎ込んだ。水相をクロロホルム（２×１５０ｍＬ）で抽出した。組合わせたクロロホルム相を、食塩水（２×５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥した。溶剤を蒸発させ、ＣＨ2Ｃｌ2／エーテルから再析出し、暗青色の粉末（０．８０ｇ，８４％）を得た。
【０２１０】
ＭＳ（ＦＡＢ＋）：ｍ／ｚ７２１（Ｍ＋）
1Ｈ−ＭＭＲ 1Ｈ−ＮＭＲ ｂｒ．（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ５．８８（２Ｈ，ｓ），５．８５（４Ｈ，ｓ），３．６０（２Ｈ，Ｓ），３．４６（１２Ｈ，ｓ），３．４５（６Ｈ，ｓ），３．１５（１２Ｈ，ｓ），３．１２（３Ｈ，ｓ），２．８５（４Ｈ，ｓ），２．８０（２Ｈ，ｔ），１．９５（２Ｈ，ｍ）
【実施例４】
【０２１１】
デキストランの染色
実施例２の方法と類似した方法で生成した、７０ｋＤａアミノデキストラン（０．５ｍｍｏｌ ＮＨ2／ｇデキストラン、すなわち、デキストラン１ｍｏｌ当たり３５ｍｏｌのアミン）を、１０ｍＭのＮａＨＣＯ3ｐＨ８．５、ＨＭＣＶ−１（実施例３）を有する１５０ｍＭのＮａＣｌ中で染色した。染料を乾燥ＤＭＳＯに溶解し、炭酸水素緩衝液中でデキストランにゆっくり（１０分）加えた。反応を１時間行った。染色は、染料の８倍モル過剰で行った。精製を、１０ｍＭのトリス緩衝液ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．２５ｍＭのＣａ2+、２ｍＭのＮａＮ3に対する透析法によって行った。得られた、染色されたデキストランの標識化度を、デキストラン１当たり染料７．０として、ＵＶ分光法によって決定した。
【実施例５】
【０２１２】
グルコース測定
ＡＦ５９４で染色されたヒトＭＢＬ（実施例１）とＨＭＣＶ１−デキストラン（実施例４）とをＴＢＳ緩衝液（前記と同じ）中で混合し、（それぞれのＭｗが約２５ｋＤａである、ＭＢＬ−ＡＦ５９４糖質認識ドメイン、ＣＲＤの濃度を使用して）両成分の濃度を１０μＭとした。アッセイ化学検査用混合物を、中空ファイバー（再生セルロース、直径０．２ｍｍ）中に搾取した。
【０２１３】
蛍光寿命測定（周波数ドメイン）をＫＯＡＬＡ自動化サンプルコンパートメント（ＩＳＳ，Ｃｈａｍｐａｉｇｎ ＩＬ）で行った。全溶液をウォーターバス中で３４℃に予熱し、ＫＯＡＬＡ装置中の全測定値を３４℃で記録した。ファイバーおよびファイバーホルダーアッセンブリを含む蛍光セルをＫＯＡＬＡのサンプルホルダー中に置き、グルコースを含む緩衝液で蛍光セルを満たした。
【０２１４】
測定相は、少なくとも４０個の位相角記録の平均であった。測定が完了した後、蛍光セルを、ピペットを使用して空にし、次の濃度のグルコースを含む緩衝液で再び満たした。測定の間を２０分間あけ、アッセイ化学検査が平衡になるようにした。
【０２１５】
グルコース用量応答曲線を作るために、相を、０、５、１０、３０、１００および５００ｍＭのグルコースで測定した。５００ｍＭのグルコースでの位相角の測定の後、ファイバーを、６０分の時間をかけ、１０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液で数回洗浄した。この時点で、０ｍＭのグルコース関して、同じ位相角を得た。これは、アッセイの可逆性を実証している。
【０２１６】
【表１】
【実施例６】
【０２１７】
ＨＭＣＶ１−デキストラン分子量の効果
２０ｋＤａ〜２５０ｋＤａの範囲の分子量を持つＨＭＣＶ１−デキストラン（実施例５で使用したＨＭＣＶ１−デキストランと類似の方法で生成）を使用して、実施例５を繰り返した。１１０ｋＤａのＨＭＣＶ１−デキストランを使用して最高位相シフトに達成したことがわかった。結果を図１に示す。
【実施例７】
【０２１８】
染色されたＭＢＬ：ＨＭＣＶ１−デキストラン比の効果
染色されたＭＢＬ：ＨＭＣＶ１−デキストランの複数の比の範囲を使用して、実施例５を繰り返した。染色されたＭＢＬ：ＨＭＣＶ１−デキストランの比１：４（５μＭの濃度のＭＢＬ−ＡＦ５９４糖質認識ドメイン、ＣＲＤ、それぞれ約２５ｋＤａのＭｗ、および２０μＭのＨＭＣＶ１−デキストラン、分子量は１１０ｋＤａ）で、応答が増加することがわかった。結果を表２に示す。
【０２１９】
【表２】
【実施例８】
【０２２０】
ＭＢＬおよびコンＡの安定性の比較
生理ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ７．４、ナトリウム、カリウムおよびカルシウムが生理的濃度で存在する）中で、レクチンとしてのＭＢＬ−ＡＦ５９４およびコンＡ−ＡＦ５９４を、被検体類縁体としての１１０ｋＤａのＨＭＣＶ１−デキストランとともに使用して、実施例５を繰り返した。グルコース濃度は、１２日間のサイクル中、２．５、５ｍＭ、２５ｍＭおよび５０ｍＭの間で変化させた。測定は、５分間インターバルで、小型時間分解蛍光光度計を使用して行った。ＭＢＬ−ＡＦ５９４に関する実験では、各グルコース濃度での相測定は、長時間一定であった。コンＡに関する実験で、大きなずれが観察され、２０日後に測定相において１０％を超える減少となった。結果を図２に示す。
【実施例９】
【０２２１】
アミノ化過ヨウ素酸塩酸化デキストランの生成
７０ｋＤａデキストラン（２００ｍｇ，０．００２８６ｍｍｏｌ）を水（２．８ｍＬ）に溶解し、水（２．８ｍＬ，１００倍モル過剰）中の過ヨウ素酸ナトリウム溶液１００ｍＭに加えた。混合物を暗所で１時間、室温で撹拌した。得られた混合物を透析チューブ（ＭＷＣＯ１０−１２ｋ）に移し、５Ｌの水に対して一晩透析した。
【０２２２】
透析後、容積を８ｍｌに調整した。過ヨウ素酸塩−酸化デキストランを、２つのアリコート（４ｍＬ，各１００ｍｇ）に分け、２８％アンモニア水溶液（２００μＬ）およびベンジルアミン（３００μＬ）でそれぞれ３０分処理した。次いで、イミンおよびイミニウム誘導体を、ナトリウムシアノボロハイドライド（４５ｍｇ）を使用して、室温およびｐＨ約１０で一晩還元した。
【０２２３】
次の日、反応混合物を、２０ｍＭのＴＢＳ １Ｌに対して２回透析した。
過ヨウ素酸塩酸化デキストラン中のアミン導入度を、元素分析を使用して決定した。
【実施例１０】
【０２２４】
マンノシル化ＨＳＡの生成
４種の複合体を以下の方法で生成した。
２ｍｌエッペンドルフバイアル４本に、それぞれ、２０ｍＭのカーボネート緩衝液（０．４ｍＬ，ｐＨ９．２）に溶解したＨＳＡ（１０ｍｇ）を加えた。ｐ−アミノフェニル−α−Ｄ−マンノピラノシルイソチオシアネート（Ｍａｎ−ＩＴＣ）（１．６ｍＬ）を、１５、３０、６０および１２０モル過剰で加え、以下に説明する４種の溶液を調製した。
【０２２５】
Ｍａｎ−ＩＴＣ（１１．９ｍｇ）を、ＤＭＳＯ（０．１ｍＬ）および２０ｍＭのカーボ−ネート緩衝液（３．９ｍＬ，ｐＨ９．２）に溶解した。この溶液のアリコート（１．６ｍＬ）（１２０倍モル過剰に相当する）を、ＨＳＡ（０．４ｍＬ）を含むエッペンドルフバイアルに加えた。Ｍａｎ−ＩＴＣ溶液の残りを２倍容量に希釈し、該希釈溶液から、アリコート（１．６ｍＬ）を別のエッペンドルフバイアルに加えた。この手順を、４種の異なるＨＳＡ：Ｍａｎ−ＩＴＣ混合物を生成するまで繰り返した。
【０２２６】
４種の反応混合物を、振盪器中で一晩、室温で培養した。得られた複合糖質を、ＰＤ−１０カラムで精製した。精製の間、緩衝液をＴＢＳに変更した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを使用して、結合度を定量した。
【０２２７】
表３：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを使用する結合度の測定
ピーク幅評価は、半値辺りを測定した。マンノースの数は、以下の式（ＭＳ−６６５００中のピーク）／３１３を使用して、決定する。
【表３】
異なるＨＳＡ−マンノース複合体は、ＭＢＬに関し異なる親和性を持つ。
【実施例１１】
【０２２８】
ＥＬＬＡアッセイ
ビオチン化ＭＢＬの生成
ビオチン−ＮＨＳ（ＤＭＳＯ中２０μｌ，７ｍｇ／ｍｌ，〜１０−１５当量／ＭＢＬモノマー）を、ＭＢＬ（３ｍｌ，０．５３ｍｇ）のＰＢＳ（３ｍＬ）溶液に加えた。該溶液を２時間緩やかに撹拌し、次いで、透析チューブ（ＭＷＣＯ１０−１２Ｋ）に移し、ＴＢＳ（２×１Ｌ）に対して２４時間にわたって透析した。得られたＴＢＳ中のビオチン化ＭＢＬ（０．２ｍｇ／ｍｌ）をさらに精製することなく使用した。
【０２２９】
ＭＢＬ ＥＬＬＡアッセイ
ＥＬＬＡアッセイで使用したＴＢＳ緩衝液は、２０ｍＭのＴＲＩＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４である。２０ｍＭのＣａＣｌ2を、抗原がＨＳＡ−マンノースである所で使用し、１．２５ｍＭのＣａＣｌ2（模倣生理的カルシウム濃度）を、抗原がアミノ化過ヨウ素酸塩で処理されたデキストランである所で使用する。
【０２３０】
ＴＢＳ中に抗原（実施例１０からのＨＳＡ−マンノース、アミノデキストラン、実施例９からのベンジルアミノ過ヨウ素酸塩で処理したデキストラン）（１００μＬ，２０μｇ／ｍＬ）をそれぞれ含む２つのカラムを用いて、９６−ウェルマイクロプレートを、５℃、一晩で被覆した。残った結合部位を、ＴＢＳ（１５０μＬ）中の１％（ｗ／ｖ）ＨＳＡを添加してブロックした。次いで、ウェルを（２×２００μＬのＴＢＳ）洗浄した。上記のように調製したビオチン化ＭＢＬ中のグルコース（１００ｍＭ〜０ｍＭ）の希釈液（２μｇ／ｍＬ）を、合計容量１００μＬになるように加えた。２時間培養した後、プレートを空にし、洗浄（２×２００μＬのＴＢＳ）した。ＴＢＳ中のストレプトアビジン−ＨＲＰ０．１％（ｖ／ｖ）（１００μＬ）を加えた。１時間培養した後、プレートを空にし、洗浄（３×２００μｌのＴＢＳ）した。基質溶液（１ｍｇのｏ−フェニレンジヒドロクロリド）の添加によってＨＲＰの存在を可視化し、２分後、１Ｎの硫酸溶液で急冷した。６３０ｎｍでバックグラウンド差し引きし、４９０ｎｍでの吸光度を読むことによって、発色を決定した。
結果を図３および４に示す。
【実施例１２】
【０２３１】
コポリマー合成
水溶性４０％マンノースコポリマーを、以下のようにして、乳化重合で生成した。機械的撹拌器と窒素管とを備える、２５０ｍｌの３つ首丸底フラスコに、Ｓｐａｎ８０界面活性剤（５．７ｇ；ＨＬＢ［親水性−親油性バランス］４．３、トルエンに対して１０％ｗ／ｗ）、ＡＩＢＮ（３０ｍｇ）およびトルエン（５７．３ｇ）を加えた。該フラスコを密封し、窒素でパージし、重合の間中窒素雰囲気下に保った。アリルα−Ｄ−マンノピラノシド（３．５２ｇ）、２−ヒドロキシエチルアクリレート（２．５５２ｇ）およびＮ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（０．３５６ｇ）を水（１２．７ｇ）に溶解し、ろ過して、不溶物質を除去した。この混合物を、丸底フラスコ中で、ゴム膈膜を介して、激しく撹拌されている混合物に加えた。反応混合物を、室温で、安定な乳化物が形成されるまで（３０分）、次いで６０℃４時間、撹拌した。ＶＡ−０４４（１ｍｌ，６０ｍｇ／ｍｌ）の溶液を、膈膜を通して注入し、重合を一晩（１７時間）続けた。反応混合物を室温まで冷却し、乳化物をアセトンの添加によって分離した。これによってポリマーの析出が起こり、析出物を集め、水に再び溶解し、アセトンの添加によって析出させた。生成物を一晩、真空乾燥し、３．２ｇ（５０％）の粗薄黄色ポリマーを得た。粗ポリマーの一部（１．０ｇ）を、水（１０ｍｌ）に溶解し、水中で透析（ＭＷＣＯ［分子量カットオフ］２５，０００）し、低分子量物質を除去した。凍結乾燥によって、０．４６ｇ（４６％）の綿毛状ポリマーを得た。
【実施例１３】
【０２３２】
コポリマーの染色
一般的に、コポリマーの標識化は、Molecular Probes（製品情報ＭＰ００１４３，Ｒｅｖ．２００１年６月）によって提供される記載に従う。
【０２３３】
コポリマー（実施例１２）（８８．６ｍｇ）を、１０ｍＭのＮａＨＣＯ3溶液（３ｍｌ；ｐＨ８．５）に溶解した。ポリマー溶液を３つのエッペンドルフバイアルに３等分した。ＨＭＣＶ−１（実施例３）（１９．６ｍｇ；２６．１μｍｏｌ）を乾燥ＤＭＳＯ（６００μｌ）に溶解した。染料を、第一バイアルは合計で１００μｌ、第二バイアルは２００μｌ、第三バイアルは３００μｌとなるように、１０μｌのアリコート中のポリマー溶液に、３０秒ごとに加えた。最後のアリコートの添加の後、バイアルを１時間穏やかに撹拌し、数種の緩衝液変更のある１０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液中で、透析法緩衝液に色が見えなくなる（通常、５００ｍｌおよび７２時間の緩衝液変更を６〜８回）まで、該溶液を透析（ＭＷＣＯ、１０−１２，０００）した。
【実施例１４】
【０２３４】
ＦＲＥＴアッセイ
１０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液（１２．５μＬ）中の染色したコポリマー溶液（実施例１３）（４μＬ）および染色したＭＢＬ溶液（実施例１）（８．５μＬ）を含むアッセイ化学検査物を混合し、混合後、少なくとも１時間放置した。次いで、アッセイ化学検査物を、シリンジを用いて、実施例５で使用したファイバーに移した。ファイバーを特注設計したファイバーホルダーに載せ、標準蛍光セル（１０ｍｍ×１０ｍｍ）にフィットさせた。
【０２３５】
測定を実施例５のようにして行い、それを表４に示す。
【表４】
【実施例１５】
【０２３６】
センサー成形および移植
ファイバーは、直径７００μｍのガラスロッドを該ポリマーの１５％ｗ／ｗジクロロメタン溶液（ＤＣＭ）に浸漬し、室温で乾燥させることにより、１０００ＰＥＧＴ８０ＰＢＴ２０ポリマー（S.FakirovおよびT.Gogeva, Macromol. Chem. 191 (1990）６０３−６１４に記載のように、８０重量％の親水性セグメントおよび２０重量％の疎水性セグメントを目安として製造）から作った。これによって、外径が９００μｍであり、内腔の直径が７００μｍの中空ファイバーを得た。該ファイバーに、５μＭのAlexa Fluor（商標）で染色したＭＢＬ（実施例１）のＣＲＤおよび２０μＭのＨＭＣＶ−１で染色したアミノデキストラン１５０ｋＤａ（実施例４と類似の方法によって生成した）を満たした。ファイバーを融解して閉じるためにポリマーを熱した。
【０２３７】
試験および挿入の前に、溶接したファイバーの漏出試験を行った。
グルコース応答を、時間分解蛍光分光法（周波数ドメイン）を使用して測定し、それを図５に示す。
【０２３８】
このタイプのファイバーは、針を使用して皮膚の上面に置くことができる。適切なサイズ（湿潤ファイバーを包含するのに充分な大きさ）の針を、皮膚表面に対して平行に、深さ約１ｍｍで置き、皮膚を通して影のように見えるように針を残す。ファイバー（また湿っている）を針の中に置き、次に針を取り去る。通常、挿入が完了した後でも、挿入箇所に放血は観察されない。
【０２３９】
ファイバーを適切な場所に設置したら、読み出しデバイスをファイバーの上に直接置き、測定を始めることができる。
【図面の簡単な説明】
【０２４０】
【図１】ヒトＭＢＬからのグルコース用量応答と、種々のデキストランの分子量に関するデキストランアッセイとを示す。（実施例６）
【図２（ａ）】ヒトＭＢＬおよび１１０ｋＤａデキストランアッセイシステムからのグルコース用量応答を示す。（実施例８）
【図２（ｂ）】コンＡおよび１１０ｋＤａデキストランアッセイシステムからのグルコース用量応答を示す。（実施例８）
【図３】ヒトＭＢＬおよびＨＳＡマンノースＥＬＬＡアッセイシステムからのグルコース用量応答を示す。（実施例１１）
【図４】ヒトＭＢＬおよび過ヨウ素酸塩で処理されたデキストランＥＬＬＡアッセイシステムからのグルコース用量応答を示す。（実施例１１）
【図５】ヒトＭＢＬおよび７０ｋＤａデキストランアッセイシステムからのグルコース用量応答を示す。（実施例１５）
【図６】アッセイを問い合わせするための適切な光学セットアップを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、センサー、該センサーを製造する方法および該センサーを使用する方法に関する。
【０００２】
センサーは、光学技術を使用する、流体中の糖質、たとえば体液中のグルコースの測定またはモニタリングにおいて使用してもよい。
【０００３】
特に、センサーは、グルコース濃度を厳密にモニターしなければならない状況および／または糖尿病の管理のように、グルコース測定を繰り返して行わなければならない状況における用途に適切である。
【背景技術】
【０００４】
糖尿病の管理において、血中のグルコースの定期測定は、正確なインシュリン投与を確保するために、必要不可欠である。さらに、糖尿病患者の長期間の患者管理において、血糖値のより良い管理は、もし防止できなければ、網膜疾患、循環障害、およびしばしば糖尿病に伴う他の変性疾患の発症を遅らせる可能性があることが実証されている。したがって、糖尿病患者による血糖値の信頼のおける正確な自己モニタリングが必要である。
【０００５】
糖尿病患者において起こるであろう濃度、すなわち０〜３５ｍＭまたはそれより幾分高い範囲の血糖を測定することが望ましい。
【０００６】
現在、血糖は、糖尿病患者が、市販の比色定量試験片または電気化学的バイオセンサー（たとえば、酵素電極）を用いてモニターしているが、両方とも、ランセット型装置を常に使用し、測定のたびに適量の血液を取り出す必要がある。平均して、多数の糖尿病患者はそのような装置を使用して、１日に２回血糖の測定を行っている。しかし、米国立衛生研究所は、アメリカ糖尿病協会が支持する、血糖の試験は１日に少なくとも４回行うべきであるということを推奨してきた。血糖試験の回数の増加は、糖尿病患者に、特に指先から血液を取るために、ランセットを常用しなければならない長期間の糖尿病患者には、経済面でも、痛みおよび不快な面でも大きな負担をかけることになる。したがって、患者から採血しない、より優れた長期間のグルコースモニタリングシステムが明らかに必要である。
【０００７】
患者から採取する血液を必要としないグルコース測定技術に関して、数多くの提案がある。
【０００８】
皮下液中の被検体の濃度は、血液中の該被検体の濃度と相関することが観察されてきており、したがって、皮下位置に据えられる、グルコースモニタリングデバイスの使用がいくつか報告されている。遠隔的に問い合わせすることができるグルコース用競合結合アッセイの使用は、特に興味を引くものである。
【０００９】
競合的結合をアッセイする方法は、近接度に基づいた信号発生／変調部分ペア（米国特許第６２３２１２０号で検討されている）を使用し、これは、典型的には、エネルギー移動供与体受容体ペア（エネルギー供与体部分とエネルギー受容体部分とを含む）である。エネルギー供与体部分は、光輝性（通常は蛍光性）である。
【００１０】
そのような方法では、エネルギー移動供与体−受容体ペアは、分析すべきサンプル（たとえば、皮下液）と接触している。次いで、サンプルを照らし、得られた発光を検出する。供与体−受容体ペアのエネルギー供与体部分またはエネルギー受容体部分は、受容体担体に結合し、一方、供与体−受容体ペア（リガンド担体に結合する）のもう一方の部分と存在する任意の被検体とは、受容体担体上の結合部位を得るために競合する。供与体および受容体が集まった時、供与体と受容体との間にエネルギー移動が起こり、これによって、エネルギー供与体部分の蛍光の検出可能な寿命の変化（減少）をもたらす。また、エネルギー供与体部分から放射される蛍光信号の割合は抑えられる。
【００１１】
寿命変化は、被検体の競合的結合によって、減少または消去される。したがって、見かけの発光寿命を測定することによって、たとえば、位相変調蛍光光度法または時間分解蛍光光度法(Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press,1983年，第３章参照）によって、サンプル中の被検体の量を決定することができる。
【００１２】
エネルギー移動の効率は、供与体の量子収率、供与体の発光スペクトルと受容体の吸収スペクトルとの重なり、ならびに供与体と受容体との間の相対距離および配置に依存することも注意すべきである。
【００１３】
欧州特許第０５６１６５３号には、先に記載した、受容体とリガンドとを問い合わせする方法が開示されている。
【００１４】
供与体−受容体エネルギー移動の例として、蛍光共鳴エネルギー移動（フェルスター共鳴エネルギー移動、ＦＲＥＴ）があり、これは、最初に励起された供与体（Ｄ）から受容体（Ａ）への励起状態エネルギーの非放射性移行である。供与体は、典型的には、より短い波長で放射し、その発光スペクトルは、受容体の吸収スペクトルと重なり合う。エネルギー移動は、光子が出現することなく起こり、供与体と受容体との間の長距離双極子−双極子相互作用の結果である。
【００１５】
ＦＲＥＴプロセスは光子の出現を伴わないので、用語共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）がより正確である。しかしＦＲＥＴもＲＥＴも互換的に使用されることが多い。
【００１６】
ＦＲＥＴの重要な特徴は、それが、生体高分子の寸法に匹敵する距離上で起こることである。フェルスター距離と呼ばれる、ＦＲＥＴが５０％効率の時の距離は、典型的には、２０〜６０Åの範囲である。２０〜９０Åの範囲のフェルスター距離は、競合的結合の研究には都合がよい。
【００１７】
供与体（Ｄ）による被検体結合部分のラベリングおよび受容体（Ａ）による被検体類縁体のラベリング、またはその逆によって、供与体−受容体応答に基づく測定可能な応答を生み出すことができるアッセイが作り出される。したがって、Ｄ−「被検体結合部分」のＡ−「被検体類縁体」への結合によって、供与体の強度または寿命が減少する結果となる。サンプル中の被検体は、Ｄ−「被検体結合部分」上の被検体結合部分を獲得するために競合し、Ｄ−「被検体結合部分」を受容体（Ａ）から放出する。したがって、供与体の強度減衰時間および位相角は、グルコース濃度が増えるに従って増加することが予測される。
【００１８】
これらの原理は、エネルギー移動によるグルコース感知において使用されてきた。
【００１９】
国際公開公報第９１／０９３１２号には、光学的手段によって遠隔的に問い合わせる、グルコースに基づく親和性アッセイ（エネルギー移動供与体−受容体ペアを組合わせた）を使用する、皮下方法およびデバイスが記載されている。国際公開公報第９７／１９１８８号、国際公開公報第００／０２０４８号、国際公開公報第０３／００６９９２号および国際公開公報第０２／３０２７５の各例には、エネルギー移動によるグルコース感知が記載され、これは、遠隔的に読み取ることができる光信号を提供している。
【００２０】
当業者であれば、受容体が蛍光団になり得るであろうことは理解するであろう。エネルギー受容体部分の吸収スペクトル内の波長で、入射光のビームによる励起に続いてエネルギー受容体部分によって放射される任意の蛍光信号は、ＦＲＥＴプロセスに影響されない。したがって、内部参照信号として、エネルギー受容体部分によって、たとえばセンサーの連続キャリブレーションにおいて、放出される蛍光信号の強度を使用すること、またはセンサーが分解している範囲をモニターすることが可能であり、したがって、新しいセンサーを移植または注射する必要性を示す。許容しうるベースラインレベル未満のこの信号の下降は、新しいセンサーを移植または注射する必要性を示す。
【００２１】
しかし、エネルギー受容体部分は、非蛍光性染料であってもよい。この場合では、蛍光消光能力を持つ化合物を、特定のエネルギー受容体部分の代わりに使用する。強力かつ非特異性の蛍光消光物質の例は、Tyagiら、Nature Biotechnology (1998) 18：第４９頁にある。
【００２２】
先に検討したシステムは、グルコース結合部分として、コンカナバリンＡ（コンＡ）に依存する。コンカナバリンＡはレクチンである。用語「レクチン」は、主要なクラスの免疫グロブリンのいかなるものにも属さない、糖質代謝物に明らかに含まれない任意の糖質結合タンパク質を含む。レクチンは、糖質認識ドメイン（ＣＲＤ）を介して糖質への選択的結合を示す。レクチンは、単量体型および多量体型の両方で自然に発生し、後者は、しばしば、それぞれがいくつかのＣＲＤを有する数多くのサブユニットを含む。
【００２３】
コンカナバリンＡは、アッセイ条件下で長期間安定ではない。発明者らによる実験（実施例８参照）では、コンカナバリンＡは体温で、２０日未満は安定であると示唆する。
【００２４】
また、コンカナバリンＡは毒性があり、潜在的に免疫原生である（しかし、グルコースアッセイにおいては、人体内で安全である考えられる少量で使用されている）。
【００２５】
また、スイトピーおよびレンチルレクチンも、そのような系においてグルコース結合部分として使用することができることが示唆されている(「A Potentially Implantable Fluorescent Glucose Sensor Based on Molecular Recognition in Poly(ethylene glycol) Hydrogels」、Ryan J. Russellら、American Institute of Chemical Engineersに提示されている）。しかし、これらのレクチンは、コンＡと類似の欠点を持つことが予測される。
【００２６】
米国特許第６２３２１３０号には、低原子価レクチン（「糖質結合リガンド」）が使用されるアッセイが開示されている。これらは、３個以下のＣＲＤを有する。該アッセイは、糖質、標識（たとえば、ＦＲＥＴ成分）および担体分子を含む被検体類縁体（「複合糖質」）を使用する。担体分子は、タンパク質（たとえば、ウシ血清アルブミン、ＢＳＡ）または合成ポリマーであってもよい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
本発明者らは、良好な安定性を有し且つコンＡに伴う欠点を有さない糖質結合部分を見い出す必要があることを認識している。本発明者らは、代わりの糖質結合部分の使用を研究してきた。驚いたことに、本発明者らは、ヒトレクチンを含めた動物レクチンを、糖質結合部分として使用することができることを見い出した。
【特許文献１】米国特許第６２３２１２０号
【特許文献２】欧州特許第０５６１６５３号
【特許文献３】国際公開公報第９１／０９３１２号
【特許文献４】国際公開公報第９７／１９１８８号
【特許文献５】国際公開公報第００／０２０４８号
【特許文献６】国際公開公報第０３／００６９９２号
【特許文献７】国際公開公報第０２／３０２７５号
【特許文献８】米国特許第６２３２１３０号
【課題を解決するための手段】
【００２８】
したがって、第一態様では、本発明は、流体中の糖質被検体の検出または測定用センサーであって、センサーは、競合結合アッセイ成分を含み、その読み出しは、被検体の拡散は可能にするがアッセイ成分の拡散は可能にしない材料によって保持された検出可能または測定可能な光信号であり、アッセイ成分は、動物レクチンと、レクチンに結合するための糖質と競合することができる被検体類縁体とを含むセンサーを提供する。
【００２９】
好ましくは、被検体は単糖類である。好ましい実施形態では、被検体はグルコースである。
【００３０】
センサーは、体液、たとえば、皮下流体中のグルコースの検出または測定に適切であることが好ましい。センサーはインビボでの用途に適することが望ましく、このことは以下に詳細に検討する。
【００３１】
被検体類縁体は、生理的カルシウム濃度でグルコースと競合することができることが好ましい。典型的な生理的カルシウム濃度は、１．１５〜１．２９ｍＭの範囲内である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
検出
適切な検出技術として、ＦＲＥＴ、蛍光エネルギー移動、蛍光偏光、蛍光消光、リン光、ルミネセンス増強、ルミネセンス消光、回折またはプラズモン共鳴が挙げられる。
【００３３】
光信号を発生する結合アッセイは、好ましくは、被検体の濃度変動の連続モニタリングが達成できるように、可逆的であるべきである。この可逆性は、アッセイの成分を消費しない、結合アッセイフォーマットの使用の特別の利点である。
【００３４】
検出可能または測定可能な光信号は、近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアを使用して発生させるのが好ましい。該ペアの第一構成要素が、該ペアの第二構成要素に近接近する時、信号が発生または変調される。
【００３５】
近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアは、エネルギー供与体部分およびエネルギー受容体部分ペアであるのが好ましい。エネルギー供与体部分およびエネルギー受容体部分は、それぞれ、供与体発色団および受容体発色団とも言う。蛍光を放射しないエネルギー受容体は、消光部分と言う。
【００３６】
この場合、レクチンを、エネルギー供与体およびエネルギー受容体部分ペアの１つで標識化し、被検体類縁体を、エネルギー供与体およびエネルギー受容体部分ペアのもう１つで標識化する。
【００３７】
本発明のセンサーの最も好ましい実施形態は、ＦＲＥＴの技術を使用して光学読み出しを出すアッセイを組み込む。
【００３８】
アッセイがインビボで使用される場合、供与体は５５０〜約７００ｎｍで蛍光を発し、受容体は約６５０ｎｍで光を吸収するのが望ましい。これにより、低波長での供与体蛍光とインビボ自己蛍光との間のオーバーラップを回避する。
【００３９】
Alexa Fluor 594（商標）（たとえば、スクシンイミジルエステルとして）は、インビボで使用するための、適切な発光スペクトルを持つエネルギー供与体部分である。この染料は、５９４ｎｍで吸収し、６２０ｎｍで蛍光を発する。
【００４０】
国際公開公報第０５／０５９０３７号に記載されているＨＭＣＶ染料は、本発明の用途にとって、適切なエネルギー受容体部分である。これらの染料は、安定化されたカルベニウムイオンである。例として、ヘキサメトキシ−クリスタルバイオレットスクシンイミジルエステル（ＨＭＣＶ−Ｉ）がある。
【００４１】
あるいは、ＱＳＹ２１（商標）を、エネルギー供与体部分としてのAlexa Fluor 594（商標）とともに、エネルギー受容体部分として使用してもよい。
【００４２】
蛍光寿命または蛍光強度の測定を行ってもよい。蛍光寿命は、位相変調技術（以下に検討）によって測定してもよい。
【００４３】
好ましい実施形態では、レクチンをエネルギー供与体部分としてAlexa Fluor 594で標識化し、被検体類縁体をエネルギー受容体部分としてＨＭＣＶ−Ｉで標識化し、蛍光寿命を位相変調技術によって測定する。
【００４４】
アッセイ成分を保持する材料は、エネルギー供与体部分およびエネルギー受容体部分に十分な空間を提供し、互いに結合していない時は、エネルギー移動が中断できるように分離するのが好ましい。
【００４５】
レクチン
レクチンは、アッセイにおいて、少なくとも１０日間は安定な信号を提供するのが好ましく、さらに好ましくは少なくとも１４日間である。人体にセンサーを移植する時に、安定な信号が提供されるのが特に好ましい。
【００４６】
驚いたことに、本発明者らは、ＭＢＬが、グルコースアッセイにおいて、少なくとも１７日間安定であったことを発見した（実施例８参照）。より早いアカウントは、ＭＢＬの生物学的半減期の４〜７日間が報告されている(Kilpatrick (2002) Transfus. Med.12,335)。
【００４７】
好ましくは、レクチンは、Ｃ−型（カルシウム依存性）レクチンである。
【００４８】
動物レクチンは、脊椎動物レクチン、たとえば、哺乳動物レクチンが好ましく、ヒトまたはヒト化レクチンがさらに好ましい。しかし、代わりに、トリレクチン、ウオレクチンまたは昆虫レクチンなどの無脊椎動物レクチンであってもよい。
【００４９】
レクチンは人体由来のヒトレクチンが適切である。代わりに、レクチンは組換え製造されたレクチンであってもよい。
【００５０】
さらなる代替例として、レクチンは、ヒト化動物レクチン、たとえば、ヒト化ウシレクチンであってもよい。これは、対応するヒトレクチンがあるところに適用される。レクチンは、抗体に類似の方法でヒト化してもよい。
【００５１】
レクチンは多量体形態であるのが適切である。多量体レクチンは、人体または動物体由来であってもよい。あるいは、レクチンは、単量体形態であってもよい。単量体レクチンは、組換え方法によって、または人体もしくは動物体由来の天然多量体レクチンにおけるサブユニット間の結合を破壊させることによって形成してもよい。この例は米国特許第６２３２１３０号に記載されている。
【００５２】
レクチンは３個以上のＣＲＤを有するのが好ましい。レクチンは６個以上のＣＲＤを有するのがさらに好ましい。
【００５３】
レクチンはコレクチン（コラーゲン様レクチン）であるのが好ましい。これらは、コラーゲン様配列（Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレット）を持つＣ−型動物レクチンである。ＭＢＬはＣ−型コレクチンであり、一方でコンカナバリンＡはＣ−型レクチンである。単量体コレクチンＣＲＤは、コラゲナーゼの作用によって製造することができる。
【００５４】
レクチンは、マンノース結合レクチン、コングルチニンまたはコレクチン−４３（たとえば、ウシＣＬ−４３）（全血清コレクチン）または肺界面活性タンパク質（肺コレクチン）が好ましい。
【００５５】
マンノース結合レクチン（マンナン結合レクチンまたはマンナン結合タンパク質、ＭＢＬ、ＭＢＰとも言う）、たとえば、ヒトＭＢＬは、特に興味のあるものである。ＭＢＬは、それぞれが３個の同一のポリペプチドで構成される、”花束状”配置において数個（普通、３〜４個（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）であるが、１〜６個の分布が起こりやすい（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ））のサブユニットを含むコラーゲン様防衛分子である。各サブユニットの分子量は、約７５ｋＤａであり、場合によっては、１個以上のＭＢＬ関連セリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）で複合化されている可能性がある。各ポリペプチドはＣＲＤを含む。したがって、各サブユニットは、３個の糖質結合部位を提供する。三量体ＭＢＬおよび四量体ＭＢＬ（これらは、ヒト血清中に存在する主要な形態である。Teilletら,Journal of Immunology, 2005, 第２８７０−２８７７頁）は、それぞれ、９個および１２個の糖質結合部位を提供する。
【００５６】
ＭＢＬは、バクテリアの表面を被覆するマンノース部分を結合する、先天性免疫系の一部として体内で自然に発生する。ヒトＭＢＬは毒性がなく、ヒトに対して非免疫原生である。他の種のＭＢＬは、免疫原生であるがヒトに対して毒性はないと予測される。
【００５７】
ヒトＭＢＬは、人体由来の形態でも組換え製造された形態でも市販されている。これは感染症にかかりやすくなっていると考えられるＭＢＬ欠損患者の治療における代償療法として使用される。
【００５８】
レクチンは、実質的に三量体および／または四量体形態であるＭＢＬが適切である。先に説明したように、三量体ＭＢＬおよび四量体ＭＢＬは、ヒト血清において、主要な自然発生的な多量体形態であると考えられる。
【００５９】
あるいは、レクチンは、ＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｄから選択される肺界面活性タンパク質であってもよい。これらのタンパク質は、ＭＢＬに類似する。これらは、先天性宿主防衛機能においてカルシウム依存性糖質結合タンパク質として作用する水溶性コレクチンである。ＳＰ−Ｄは脂質にも結合する。ＳＰ−Ａは、ＭＢＬの構造に類似する「花束状」構造を持つ（Kilpatrick DC (2000) Handbook of Animal Lectins，第３７頁）。ＳＰ−Ｄは、「Ｘ」の各端部にＣＲＤを有する四量体「Ｘ」構造を持つ。
【００６０】
他の適切な動物レクチンを、以下のリストに挙げる。
・ＰＣ−レクチン（米国特許公開公報第２００３０２１６３００号、米国特許公開公報第２００４０２６５８９８）
・ＣＴＬ−Ｉ（米国特許第１７９５２８／１０号）
・ケラチノサイト膜レクチン（Parfuemerie und Kosmetik74,164-80)
・ＣＤ９４(Eur J Immuno l25,2433-7)
・Ｐ３５（同義語：ヒトＬ−フィコリン、レクチンのグループ）(Immunol Lett 67,109-12）
・ＥＲＧＩＣ−５３（同義語：ＭＲ６０）(MoI Biol Cell, 7, 483-93)
・ＨＩＰ／ＰＡＰ(Eur J Biochem 267, 1665-71)
・ＣＬＥＣＳＦ８（Eur J Immunol 34,210-20)
・ＤＣＬ（レクチンのグループ）（米国特許出願第００２３１９９６／ＵＳ号）
・ＧＬＵＴファミリータンパク質、特に、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ４およびＧＬＵＴ１１（ＰＮＡＳ９７，１１２５−３０）
【００６１】
さらに、適切な動物レクチンは、「Handbook of Animal Lectins: Properties and Biomedical Applications」, David C. Kilpatrick, Wiley 2000の付属書Ａ、ＢおよびＣに記載されている。
【００６２】
レクチンは、先に検討したように標識化されるのが好ましい。レクチンはエネルギー供与体部分で標識化されるのがさらに好ましい。
【００６３】
被検体類縁体
被検体類縁体は、レクチンの結合部位に結合する、複数の糖質部分または糖質様部分を含むのが好ましい。用語「糖質」は、糖類を含む。
【００６４】
適切な糖質様部分は、Ｎ−アセチルグルコサミンを擬態するケラチンペプチド（ＳＦＧＳＧＦＧＧＧＹ）などのペプチドを含む。ケラチンペプチドはＭＢＬを抑制することができることが示されている（Mantactoら,2001 J. Immunol. 166, 4148-4153)。
【００６５】
ＭＢＬに対し一般的な糖質部分の親和性は、Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ロイコロース、エルロース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｌ−フコース＞ミオイノシトール、Ｄ−グルコース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−パラチノース、Ｄ−ツラノース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−リボース、Ｄ−タガトース＞Ｄ−リキソース＞ラクトース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−ガラクトースであることが本発明者らによって見い出されている。
【００６６】
この理論に縛られるものではないが、本発明者らは、ＭＢＬおよび他のレクチンに対する強い結合は、数多くの部位での結合の結果であると考える。各部位での結合は比較的弱い（低親和性）が、累積効果が強い結合（高親和力）である。したがって、全結合部位を結合しない被検体類縁体は、全結合部位と結合する被検体類縁体よりも、全結合部位を結合する被検体と簡単に置き換えられる。このことは、ＭＢＬに対しグルコースより高い親和性を持つ、マンノースを含む被検体類縁体が、グルコースによって置き換えられ得る理由を説明している。
【００６７】
所定のレクチンに対する被検体類縁体の親和力に影響するパラメーターは、以下のものである。
・糖質部分または糖質様部分の数
・レクチンに対する糖質部分または糖質様部分の親和性
・カルシウム濃度（少なくともＭＢＬに対する）および
・被検体類縁体の柔軟性
【００６８】
生理的カルシウム濃度は制御できない。しかし、他のパラメーターは選択し、被検体類縁体に適切な測定範囲を与えることができる。アッセイ性能への被検体類縁体柔軟性の影響は、予め同定または対処されない。
【００６９】
先に開示したように、被検体類縁体（たとえば、米国特許第６２３２１３０号のもの）は、糖質と、エネルギー供与体部分またはエネルギー受容体部分とが複合した球状タンパク質を含む。そのような分子では、糖質と、エネルギー供与体部分またはエネルギー受容体部分とが位置を固定する。これは、複数の糖質部分がレクチンＣＲＤに結合することを可能にする構造を、被検体類縁体が必ずしも採用できるとは限らないことを意味する。
【００７０】
また、そのような被検体類縁体における、糖質とエネルギー供与体部分またはエネルギー受容体部分との相対的位置決めは、被検体類縁体とレクチンとが結合した時、エネルギー供与体部分と受容体部分との間の最適相互作用を可能にしないかもしれない。これは、ＦＲＥＴに影響し、光信号を弱めるであろう。
【００７１】
最後に、これらの被検体類縁体は、生理的カルシウム濃度で、レクチンに結合しないことが多い。ＭＢＬに対するマンノース複合糖質の最適な結合に必要なカルシウム濃度は、約２０ｍＭであることがわかっている。
【００７２】
これらの見識は、同じレクチンに関して異なる親和力を持ち、したがって、異なる範囲にわたって糖質濃度を測定するために使用することができる、種々の被検体類縁体を開発するために、本発明者らによって使用されてきた。
【００７３】
アッセイは、０〜３５ｍＭのグルコースの範囲の少なくとも一部分、たとえば０〜２５ｍＭのグルコースの範囲での濃度に関し、血糖を測定することができるのが好ましい。好適には、ＩＣ50値が約１５ｍＭのグルコースである。アッセイは、２〜１０ｍＭのグルコースの範囲で、グルコース濃度を測定できることがより好ましい。投与−応答曲線は、この範囲内では、できるだけ直線に近づくのが望ましい。
【００７４】
被検体類縁体に関して、３つの異なるタイプの構造体が特に興味深い。
【００７５】
糖質−タンパク質複合体または糖質−デンドリマー複合体
第一に、被検体類縁体は、糖質−タンパク質複合体あるいは糖質−デンドリマー複合体であってもよい。これらのどちらかで、糖質様部分を、糖質部分の代わりにあるいはともに使用してもよい。
【００７６】
そのような複合体において使用するために適した糖質の例として、単糖類およびオリゴ糖がある。
【００７７】
適切な単糖類は、場合によっては誘導化された、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトースまたは高級相同性アルドースまたはケトース、たとえば、場合によっては誘導化されたＤ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｌ−フコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−タガトースまたはＤ−ソルビトールがある。
【００７８】
適切なオリゴマーは、たとえば２〜５０糖質単位を含む直鎖または分岐ホモオリゴマーまたは混合オリゴマーである。
【００７９】
好ましいグリコシル化は、１→３および１→４グリコシル化が、ＭＢＬ結合を妨害することが予測されるので、１→６または１→２である。たとえば、ノナ（１→６）−α−グルコース（デキストラン１５００Ｄａ）は、ＭＢＬに対して、１，３−β−Ｄ−グルコース（たとえばラミナナリヘキサオース）より高い親和力を持つことが予測される。適切なオリゴ糖として、パンノース、マルトース、マルトトリオース、イソマルトトリオース、Ｄ−ロイコロース、エルロース、Ｄ−パラチノース、Ｄ−ツラノースまたは１〜２５０ｋＤａデキストラン（好ましくは１〜４０ｋＤａデキストラン、たとえば、１ｋｄａ、１．５ｋＤａ、５ｋＤａ、６ｋＤａ、１０ｋＤａ、１２ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａまたは４０ｋＤａデキストラン）が挙げられる。
【００８０】
被検体類縁体は、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ロイコロース、Ｎ−アセチル−グルコサミン、Ｄ−マンノース、Ｌ−フコース、Ｎ−アセチル−マンノサミン、Ｄ−アラビノース、ミオイノシトール、Ｄ−タガトース、エルロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−パラチノース、Ｄ−ツラノース、Ｄ−リボース、Ｄ−ソルビトールから選択される少なくとも１種の糖質部分を含むのが好ましい。
【００８１】
ＭＢＬおよび他の動物レクチンに関して高い親和性を持つので、被検体類縁体は、少なくとも１種のグルコース部分および／または少なくとも１種のＮ−アセチルグルコサミン部分および／または少なくとも１種のマンノース部分を含むのがさらに好ましい。これらの部分は、Ｃ３およびＣ４水酸基を介して、レクチンの結合部位に結合すると考えられる。
【００８２】
合成分岐糖類の例として、デンドリマー（たとえば、以下に示す、アミンリンカーを持つＴＲＩＳ誘導三糖類）を構成するために使用されるデンドリマー「ウェッジ」がある。そのような「ウェッジ」は、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）などのタンパク質上に、たとえば二官能性アミンリンカーを介して、接合することができる。
【化１】
【００８３】
複合体における使用に好ましいタンパク質は、分子量が少なくとも１０ｋＤａ、好ましくは少なくとも２０ｋＤａのヒトタンパク質である。タンパク質は非球状全体三次構造を持つことが好ましい。これは、複数の結合部位で結合を助け、高い親和力をもたらすと考えられる。ハーセプチンおよびＲｅｍｉｃａｄｅ（商標）などのモノクローナル抗体（非球状「Ｙ」型全体三次構造を持つ球状ドメインを数箇所有する免疫グロブリン）が適切である。他の代わりの適切なタンパク質は、ヒトチロンビン、ヒトラクトフェリンおよび第８因子である。
【００８４】
糖質−タンパク質複合体の別の例として、タンパク質は、レクチン由来タンパク質、たとえば、ＣＲＤが除去されたレクチンであってもよい。
【００８５】
好適には、複合体は糖質−アルブミン複合体であってもよい。たとえば、複合体は、マンノース−ＨＳＡ複合体またはマンノース−ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）複合体であってもよい。しかし、このタイプの複合体は、先に記載したように、ＭＢＬへの結合がカルシウム濃度に依存することがわかっているので、好ましくない。生理的カルシウム濃度で、２０個のマンノース残基を持つ７０ｋＤａマンノース−ＨＳＡ複合体は、ＭＢＬへの結合が見られなかった。カルシウム濃度に対する依存性は、マンノシル化が増えるにつれ減少する。
【００８６】
当業者であれば、このタイプの複合体への合成経路に関しては承知しているであろう。例として、Ｎ−イソチオシアナト−４−アミノフェニル−Ｏ−α−Ｄ−マンノピラノシド（Ｍａｎ−ＩＴＣ）をＨＳＡ上に接合することができる。
【００８７】
本発明で好ましく使用されるデンドリマーは、アミン官能化、カルボン酸官能化またはヒドロキシル官能化された表面を持つ。デンドリマーとしては、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）またはポリプロピレンイミン（ＤＡＢ）型のデンドリマーが好ましい。分子量は６０ｋＤａ未満、たとえば、約２〜１０ｋＤａが好ましい。そのようなデンドリマーは、腎臓によってクリアーにされ得る（Kobayashiら,2004, J. Mag. Reson. Imaging 20 (3) 512-518)。
【００８８】
多糖類
第二に、被検体類縁体は、糖質部分および／または糖質様部分（両方、本明細書で使用する用語「多糖類」に包含される）の、場合によっては誘導化されたポリマーであってもよい。デキストラン（グルコースポリマー、ポリ（１→６）−α−グルコース）はＭＢＬおよび類似のレクチンに強く結合する。発明者らは、これは、多数のグルコース残基（７０ｋＤａデキストラン中約４３０個の残基）およびデキストランの柔軟性の結果であると考える。したがって、ＭＢＬからデキストランを置き換えるのに必要なグルコースの濃度は高い。
【００８９】
デキストランおよびＭＢＬに基づくグルコースアッセイは、約３０ｍＭのグルコース濃度を最適に測定することができる。これは、血液中の通常の５ｍＭのグルコース濃度よりかなり高い。そのようなアッセイは、全位相応答の約１／３だけの感度（１ｍＭのＧｌｃ当たり０．２５°の位相シフト、実施例７参照）で、０〜１０ｍＭのグルコース濃度を測定することができる。
【００９０】
したがって、本発明者らは、全位相応答の１／３を超える感度が０〜１０ｍＭグルコース範囲で使用可能になるように、ＭＢＬおよび類似のレクチンを結合する強さがより小さな代わりの被検体類縁体を探した。
【００９１】
発明者らは、過ヨウ素酸塩でデキストランを処理する（これは、グルコースピラノース環の２位および３位、または３位および４位の炭素間を酸化的に開裂し、ジアルデヒドを形成する）ことによって、ＭＢＬおよび類似のレクチンに対するデキストランの親和力を減少させるために使用することができることを見い出した。これは、ＭＢＬが先に説明したグルコースの３位および４位のエカトリアル水酸基に結合するためであると思われる。３位および４位の水酸基は、他の方法で不活性化することができる（たとえば、酸化、還元、アルキル化、置換、グリコシル化またはエステル化によって）。
【００９２】
非常に驚いたことに、本発明者らは、過ヨウ素酸塩処理デキストラン−ＭＢＬ結合が生理的カルシウム濃度によって阻止されないことを見い出した。これは、先に検討した、マンノース−ＨＳＡ複合体ＭＢＬ結合とは対照的である。特にデキストランのグルコース部分が、ＭＢＬに対して、マンノース部分より低い親和性を持つので、過ヨウ素酸塩処理デキストランＭＢＬ結合は、生理的カルシウム濃度によって阻止されることが予測されていた。
【００９３】
理論的には、グルコース１単位当たり過ヨウ素酸塩の２当量が消費される（１個／ジオール）。しかし、１〜１００当量の過ヨウ素酸塩が７０ｋＤａデキストランに適切であることが見い出された。
【００９４】
アンモニアまたはアミンによるジアルデヒドの処理、続いて還元（たとえば、ナトリウムシアノボロハイドライドを使用して）を使用し、アミノ化デキストランを得ることができる。ジアルデヒドをアミノ化し、次いで場合によっては接触水素添加を行い、遊離アミンを得る方法も使用することができる。ベンジルアミンは、水素化前の中間体が親油性部分を持つデキストラン誘導体であるので、この点において有用なアミンである。また、分光光度法を用いて過ヨウ素酸塩の開裂の程度を評価するために、ベンジルアミン由来アミノ化デキストランを使用することができる。ベンジル基が接触水素化によって除去される場合は、エネルギー供与体部分またはエネルギー受容体部分が、残っているアミンにカップリングし得る。
【００９５】
あるいは、ＭＢＬおよび類似のレクチンに対して異なる親和性の異なる糖質部分または糖質様部分を有する多糖類系被検体類縁体を合成することができる。コンカナバリンＡ ＦＲＥＴアッセイにおいてグルコース検出範囲を調整するマンノース部分を持つデキストランの誘導化は、Ballerstadtら、Diabetes Technology & Therapeutics,第６巻，ｎｏ．２，２００４に開示されている。
【００９６】
ガラクトースは、非常に低い親和性でＭＢＬに結合する。したがって、ガラクトース部分（たとえば、ガラクトース誘導体化デキストラン）を含む被検体類縁体は、非誘導体化被検体類縁体より低い親和力を持つ。
【００９７】
Ｎ−アセチル−グルコサミンは、ＭＢＬに対し高い親和性を持つ。したがって、Ｎ−アセチル−グルコサミン部分（たとえば、ＧｌｃＮＡｃ誘導体化アミロース）を含む被検体類縁体は、ＭＢＬに対し、非誘導体化被検体類縁体より高い親和力を持つ。
【００９８】
この実施形態において、被検体類縁体は、場合によっては誘導体化されているデキストラン、マンナン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、ヒアルロナート、コンドロイチン、ヘパリン、デキストリン、イヌリン、キシラン、フルクタンおよびキチンから選択されるのが好ましい。ガラクトースはＭＢＬに対して非常に低い親和性を有するので、アガロースなどのガラクトースの非誘導体化ポリマーは、被検体類縁体として好ましくない。
【００９９】
当業者は、多糖類を糖質部分で誘導体化できる方法を承知しているであろう。例示として、アミン官能化多糖類（たとえば、CarboMer, San Diego, California, USA, Cat. No.5-00060またはMolecular Probes, Eugene, Oregon, USA, Cat No. D1862から市販されているアミノデキストラン）または先に挙げたアミノ化デキストランは、好都合にも誘導体化されてよい。あるいは、多糖類中のアルコール基および糖質部分または糖質様部分中のアミン基を、ジビニルスルホンを使用してリンクしてもよい。デキストランの誘導体化方法は、欧州特許第５９４７７２号に開示されている。
【０１００】
多糖類の誘導体化のための適切な糖質部分の例として、前記糖質−タンパク質複合体および糖質−デンドリマー複合体に関して記載したものがある。
【０１０１】
合成ポリマー
第三には、被検体類縁体は合成ポリマーであってもよい。
【０１０２】
タンパク質または多糖類の誘導体化より人工ポリマーの合成のほうが、ポリマーのパラメーター（たとえば、分子の柔軟性、水溶性、分子量、糖質部分または糖質様部分の特性、糖質または糖質様部分の数、近接度に基づいた信号発生／変調部分の数）を簡単に制御し、アッセイ性能を改良することが可能である。多糖類に比べ合成ポリマーは、糖質部分の数をポリマーの長さとは無関係に調整することができるという利点を持つ。さらに、ポリマー中に２−ヒドロキシエチルアクリレート（ＨＥＡ）などのモノマーを含む非環状ポリマーを使用して、デキストランに比べて、増加した分子回転柔軟性が増加させる。
【０１０３】
この理論に縛られるつもりはないが、発明者らは、近接度に基づいた信号発生／変調部分が、強い信号を発生させる結合部分に近いことが重要であると考える。球状リガンドは、それらが接近するように、球面上の結合部分および近接度に基づいた信号発生／変調部分を濃縮する。直鎖状のデキストランでは、骨格が結合部分から構成され、その結果、結合を、近接度に基づいた信号発生／変調部分に近づけるか、遠ざけるかを制御することができない。これは、近接度に基づいた信号発生／変調部分に近い結合部分を配置することによって、合成ポリマーにおいて制御することができる。
【０１０４】
この実施形態では、被検体類縁体は、ペンダント糖質部分または糖質様部分を有する、非糖類の柔軟性のある水溶性ポリマーであるのが好ましい。
【０１０５】
用語「柔軟性のある」は、大きく単量体間回転し得るポリマーを含む。ポリマーは、ペンダント糖質部分や糖質様部分および近接度に基づいた信号発生／変調部分以外は、嵩高い基（たとえば、環構造、ｔ−ブチル基または他の立体的に大きな基）は含まないのが好ましい。そのようなポリマーは、骨格構造中の二重結合が非常に少ない（たとえば、１０％未満）ことが好ましい。そのようなポリマーは、球状三級構造を持たないのが適切であるが、そのような構造を持っていてもよい。
【０１０６】
ポリマーは、非分岐状であるのが好ましい（先に検討したデンドリマーとは違い）。これによりポリマーの柔軟性が改良される。しかし、ポリマーは、ある程度分岐してもよく、また架橋してもよいが、ただし、これによってヒドロゲルが形成されないことが条件である。たとえば、全分子量が１００ｋＤａのポリマー中で、１〜５個の分岐が許容される。
【０１０７】
用語「水溶性」は、室温での水溶性が少なくとも４ｍｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも２５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、たとえば少なくとも１００ｍｇ／ｍｌのポリマーを含む。溶解度は、体温でより高くなる。以下で検討するように、体内でセンサーを使用する時、ポリマーが組織流に溶解するように、ポリマーは水溶性であることが重要である。ポリマーは、ＭＢＬなどの糖質結合分子に結合した時であっても、水溶性であるべきである。
【０１０８】
ポリマーは、１以上５タイプまでのモノマー単位を含むのが好ましく、より好ましくは３以上のモノマー単位を含む。
【０１０９】
ポリマーとしては、ペンダント糖質部分または糖質様部分を有する第一モノマー単位残基と、ぶら下がっている、近接度に基づいた信号発生／変調部分を有する第二モノマー単位残基とを含むコポリマーが適切である。あるいは、またはそれに加えて、ペンダント糖質部分または糖質様部分およびぶら下がっている、近接度に基づいた信号発生／変調部分の両方を有する単一のモノマー単位残基を使用してもよい。第一および第二モノマー単位の使用が好ましい。そうすれば、糖質部分または糖質様部分と近接度に基づいた信号発生／変調部分との量を独立して制御することができる。
【０１１０】
コポリマーとしては、ランダムコポリマーが好ましい。しかし、交互コポリマーを使用してもよい。大きなブロックを持つブロックコポリマーの使用は好ましくない。しかし、低分子量（たとえば、１〜３ｋＤａ）のブロックコポリマーは使用してもよい。
【０１１１】
ＭＢＬを用いるアッセイにおいて糖質結合分子として使用する場合、該ポリマーは、０ｍＭのグルコースで、アミノデキストランの少なくとも５０％強くＭＢＬに結合するのが好ましく、より好ましくは、少なくともアミノデキストランと同じくらい強く結合するが、より簡単に抑制される。ポリマーは、０〜３５ｍＭのグルコースの範囲で簡単に抑制される（全位相応答の大部分）が特に望ましく、とりわけ２〜１５ｍＭの範囲が望ましい。これによって、特に生理学的に関心のあるグルコース濃度にわたりアッセイが提供され、これはアミノデキストランをグルコース類縁体として使用する類似のアッセイより感度が高い。
【０１１２】
複数のタイプの糖質部分または糖質様部分を有するモノマー単位残基が存在してもよい。糖質部分または糖質様部分は異なってもよく、ＭＢＬに対し異なる親和性および類似のレクチンを有してもよい。
【０１１３】
第一モノマー単位（または単一モノマー単位）は、それぞれ、糖質部分または糖質様部分の二重結合含有誘導体であるのが適切である。しかし、第一モノマー単位（または単一モノマー単位）は、それぞれ、適切には重合後、糖質部分または糖質様部分がリンクし得る官能基を含む、二重結合含有分子であってもよい。
【０１１４】
糖質部分または糖質様部分の二重結合含有誘導体は、糖質部分または糖質様部分のアリルまたはビニル含有誘導体であるのが好ましい。糖質部分または糖質様部分の他の適切な二重結合含有誘導体として、アリル誘導体の相同体、たとえば、３−ブテニルまたは４−ペンテニル誘導体、または４位に糖質部分または糖質様部分を持つスチレン誘導体が挙げられる。糖質部分または糖質様部分のさらに適切な二重結合含有誘導体として、ＨＥＡ、２−ヒドロキシエチルメタアクリレート（ＨＥＭＡ）またはビニルアルコール（ＶＡ）系誘導体が挙げられる。
【０１１５】
糖質部分または糖質様部分は、第一モノマー単位（または単一モノマー単位）のアミン、酸、アルコールおよび／またはスルホン官能基とリンクしてもよい。たとえば、モノマー単位中のアルコール基および糖質部分または糖質様部分中のアミン基は、ジビニルスルホンを使用してリンクしてもよい。糖質がマンノースの場合、これらはＭＢＬへの結合で重要なので、Ｃ３−ＯＨまたはＣ４−ＯＨ基を介して結合を形成すべきではない。この場合、ジビニルスルホン結合は不適切である。
【０１１６】
アミノ誘導体化糖質部分は、二糖類の還元アミノ化によって製造することができる。これは糖質部分をそのアノマー位（Ｃ１）でリンクさせる。
【０１１７】
糖質部分または糖質様部分は、フィッシャーグリコシド化によってアルコール基（たとえば、ＨＥＡ中）に結合することができる。
【０１１８】
必ずしも、第一モノマー単位（または単一モノマー単位）が二重結合を含む必要はない。
【０１１９】
コポリマーにおける使用に適切な糖質の例として、前記糖質−タンパク質複合体に関して検討したものがある。
【０１２０】
第二モノマー単位（または単一モノマー単位）は、それぞれ、適切には重合後、近接度に基づいた信号発生／変調部分部分がリンクし得る官能基を含む、二重結合含有分子が適切である。適切な官能基として、酸、アルコールおよび／またはスルホンが挙げられる。重合後の結合は、高価な近接度に基づいた信号発生／変調部分の損失を最小にするのを助ける。
【０１２１】
しかし、第二モノマー単位（あるいは単一モノマー単位）は、近接度に基づいた信号発生／変調部分を含んでもよい。この場合、適切な重合性基および結合の上記の検討が適用される。
【０１２２】
好ましい実施形態では、第二モノマー単位は、それぞれ、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミドまたはその誘導体である。
【０１２３】
好ましい実施形態では、単一モノマー単位は、それぞれ、リシンの誘導体を含む、二重結合含有糖質部分または糖質様部分である。例を以下に示す（多段反応スキーム）：
【化２】
【０１２４】
この反応スキームにおける出発材料は、PolysSciences Europe (Eppelheim, Germany)を通じて入手可能なメタアクリロイル−Ｌ−リシンである。重合後、α−アミン基は、近接度に基づいた信号発生／変調部分にリンクすることができる。
【０１２５】
ポリマーは、さらに、ペンダント糖質部分、糖質様部分または近接度に基づいた信号発生／変調部分を有さない第三モノマー単位残基を含むのが好ましい。これは柔軟性を増やすのを助ける。
【０１２６】
柔軟性は、ＨＥＡなどの立体障害のない第三モノマー単位を使用することによって増やす。また、柔軟性は、帯電していない第三モノマー単位を使用することによっても増やす。第三モノマー単位を含まないポリマーは、静電反発力のため、柔軟性の減少を最小限にするために不活性化する必要のある、プラスに帯電しているアンモニウム基を数多く持つ。
【０１２７】
複数のタイプの第三モノマーをポリマーに含ませることができる。
【０１２８】
第三モノマー単位は、それぞれ、たとえば水酸基などの親水性基を含む二重結合含有分子であるのが好ましい。第三モノマー単位として、スチレンなどの親油性二重結合含有分子であるのは好ましくない。
【０１２９】
好ましい実施形態では、第三モノマー単位は、それぞれ、ＨＥＡ、ビニルピロリドン、ＭＭＡ、ＨＥＭＡ、ビニルアルコールおよび／またはエチレングリコールである。しかし、当業者であれば、使用することのできる親水性基を含む他の多くの二重結合含有分子があることを理解するであろう。
【０１３０】
モノマー単位は付加重合によって反応するのが適切である。付加重合は、たとえば、過硫酸カリウム（ＰＰＳ）または他の過酸化化合物を使用する、遊離基開始重合であってもよい。
【０１３１】
他の可能な重合として、縮合重合（たとえば、イオン縮合重合）、開環重合および原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）が挙げられる。当業者であれば、モノマー単位に性質が、重合の所望の方法に依存する（たとえば、二重結合含有モノマー単位は、縮合重合の必要はない）ことを理解するであろう。
【０１３２】
モノマー単位は開始剤を添加する前に混合するのが適切である。
【０１３３】
重合反応は２日未満かかるのが好ましい。重合の長さは、コポリマー生成物の分子量を制御するために使用することができる。
【０１３４】
重合反応は、酸素のない条件下で行われるのが適切である。
【０１３５】
重合反応は室温で行うのが適切である。
【０１３６】
単一モノマー単位を使用しない場合、第一モノマー単位は、２０〜７０重量％の量で反応混合物中に存在するのが好ましく、より好ましくは、３０〜５０重量％である。
【０１３７】
第三モノマー単位を使用する場合、それらは、５〜１５重量％の量で反応混合物中に存在するのが好ましい。
【０１３８】
ポリマーの組成は、反応混合物中に存在するモノマー単位の量を正確に反映しないことは理解されるであろう。これは、他の要因（たとえば、立体障害および溶解性）の影響があるためである。
【０１３９】
また、被検体類縁体は、２以上の分離した実体（これらは一緒に被検体類縁体として作用する）から構成されてもよいことも留意すべきである。特に、被検体類縁体は、少なくとも２個の被検体類縁体部分を持つ第一実体と、レクチンなどの被検体結合分子である第二実体とで構成されていてもよい。たとえば、受容体標識化されたＭＢＬおよび供与体標識化されたＭＢＬを、標識化されていないデキストランまたは標識化されていない合成ポリマーとともにテンプレートとして使用し、ＦＲＥＴが起こるように、互いの接近性において供与体標識化されたＭＢＬおよび受容体標識化されたＭＢＬをもたらすことができる。（コンＡを使用する例が、Gestwickiら(2002) Chemistry and Biology 9，第ｌ６３頁にある）。
【０１４０】
被検体類縁体は、先に検討したように、１個以上の近接度に基づいた信号発生／変調部分で標識化されるのが好ましい。好ましくは、被検体類縁体は、１種以上のエネルギー受容体部分（たとえば、先に検討した用に、ＨＭＣＶ−１またはAlexa Fluor 594（商標））を含むのが好ましい。しかし、１以上のエネルギー供与体部分を含んでもよい。
【０１４１】
近接度に基づいた信号発生／変調部分は、糖質部分または糖質様部分に関連して先に検討したように、被検体類縁体に結合してもよい。たとえば、デキストランの標識化は、直接ジビニルスルホンカップリング、またはアミノ化（先に記載したような）、続いてカップリングによって、達成することができる。アミン誘導体化デキストランを被検体類縁体として使用する場合、望ましくない析出をもたらす可能性があるので、近接度に基づいた信号発生／変調部分の結合の間の架橋を回避するために、注意しなければならない。架橋を最小化するためのＤＶＳによるデキストランの誘導体化方法は、ＥＰ５９４７７２に検討されている。
【０１４２】
被検体類縁体は、センサーからの逃げを防ぐのに充分な高分子量で、被検体類縁体がレクチンに結合した時、析出が起こらない程度に低分子量であるべきである。被検体類縁体の重さは、２５〜２５０ｋＤａの範囲が好ましく、より好ましくは４０〜２５０ｋＤａであり、さらにより好ましくは７０〜１５０ｋＤａであり、非常に好ましくは１００〜１２０ｋＤａであり、たとえば１１０ｋＤａが好ましい。１１０ｋＤａデキストランに基づく被検体類縁体が、特に好ましい。
【０１４３】
場合によっては、被検体類縁体およびレクチンは、互いにつながっていてもよい。
【０１４４】
センサー構成
アッセイの成分は、被検体の拡散は可能にするがアッセイ成分の拡散は可能にしない孔径を有する材料によって保持されているのが好ましい。しかし、この選択性は、他の方法、たとえば、帯電していない材料の拡散を可能にする材料を使用することによっても達成される。
【０１４５】
アッセイの成分は、シェルまたはマトリックス材料によって保持されるのが好ましい。被検体類縁体および／またはレクチンは、この材料にグラフトされてもよい。材料は、国際公開公報第００／０２０４８号に記載のような生分解性であることはより好ましい。場合によっては、センサーは、国際公開公報第０３／００６９９２号に記載のような、生分解性材料のシェルによって保持された小粒子を含んでもよい。
【０１４６】
好ましい実施形態では、国際公開公報第２００５／１１０２０７号に記載されるような、グルコースをアッセイ成分に接触させながら、アッセイの成分を、アッセイ成分を封入する生分解性材料のシェルによって保持し、該生分解性材料は、疎水性および親水性単位を有するコポリマーを含む。
【０１４７】
１個以上のアッセイ成分チャンバーがシェル内に存在してもよい。
【０１４８】
コポリマーはランダムコポリマーが好ましい。
【０１４９】
コポリマーの透過性は、少なくとも５．０×１０-10ｃｍ2／ｓであるのが好ましい。
【０１５０】
用語「透過性」は、実験的に測定することができる水和コポリマーによる、被検体（グルコース）の全透過性を言うために使用する。
【０１５１】
一度体内に移植されると、該コポリマーは１週間から１年の期間、たとえば３０日間にわたって分解するのが好ましい。代表的なポリマー厚さである５μｍに関して、これは０．１７μｍ／日の分解速度に相当する。
【０１５２】
グルコースの移動性に関して、生分解性材料の分子量カットオフ限界は、２５０００Ｄａ以下が好ましい。より好ましくは、生分解性材料の分子量カットオフ限界は、１００００Ｄａ以下である。
【０１５３】
疎水単位の重量分率は、コポリマーの１０〜９０％が好ましく、より好ましくは、コポリマーの１０〜５０％である。
【０１５４】
各親水性単位の分子量は、２００〜１００００Ｄａが好ましく、より好ましくは４００〜４０００Ｄａである。
【０１５５】
コポリマーの親水性単位は、それぞれ、ポリエチレングリコールと二価の酸とのエステルを含むのが好ましい。ポリエチレングリコールの代わりのものとして、エチレングリコールとプロピレングリコールとの混合ポリマーを使用してもよく、および／またはポリエーテル骨格は、疎水性基および／または親水性基で置換されてもよい。ポリエチレングリコールのさらなる代わりのものとして、ポリテトラヒドロフラン（ポリ−ＴＨＦ）を使用してもよい。
【０１５６】
親水性単位は、テレフタル酸および／またはコハク酸を二価の酸として含むことが好ましい。他の適切な二価の酸として、シュウ酸、酒石酸、フタル酸、アスパラギン酸、マロン酸、およびオリゴマーまたはポリマーの二価の酸、たとえば、ポリ（ダイマー酸−セバシン酸）がである。好ましい実施形態では、二価の酸はテレフタル酸のみである。代わりの好ましい実施形態において、テレフタル酸のコハク酸に対するモル比は、１：２〜２：１であり、１：１が適切である。
【０１５７】
あるいは、コポリマーの親水性単位は、オリゴマーを含んでもよい。適切なオリゴマーは、ヒドロキシエチルメタアクリレート（ＨＥＭＡ）、ビニルピロリドン、ビニルアルコール、糖質、エチレンオキサイドおよび／または２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸のオリゴマーである。親水性単位がＨＥＭＡを含む場合、生分解性結合（たとえば、テレフタレート結合などのエステル結合）がポリマー内にあり、生分解性が増す。
【０１５８】
各疎水性単位の分子量は、４００〜５０００Ｄａが好ましい。
【０１５９】
コポリマーの疎水性単位は、ブタン−１，４−ジオールと二価の酸とのエステルを含むのが好ましい。ブタン−１，４−ジオールの代わりとして、ペンタン−１，５−ジオールまたはヘキサン−１，６−ジオールを使用してもよい。
【０１６０】
疎水性単位が、二価の酸としてテレフタル酸および／またはコハク酸を含むことが好ましい。好ましい実施形態では、テレフタル酸のコハク酸に対するモル比は、１：２〜２：であり、１：１が適切である。あるいは、疎水性単位は、二価の酸として、テレフタル酸のみを使用するのがよい。他の適切な二価の酸は先に記載されている。
【０１６１】
あるいはコポリマーの疎水性単位は、メチルメタアクリレート（ＭＭＡ）、ポリウレタンおよび／またはアミド（たとえば、ナイロン−６、オリゴ−Ｎ−三級ブチルアクリルアミドまたはオリゴ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）のオリゴマーを含み得る。疎水性単位がＭＭＡを含む場合、生分解性結合（たとえば、テレフタレート結合などのエステル結合）は、ポリマー内に提供され、生分解性を増す。
【０１６２】
好ましいポリマーは、一般式：ａＰＥＧ（Ｔ／Ｓ）ｂＰＢ（Ｔ／Ｓ）ｃ（式中、「ａ」は、ＰＥＧ鎖の分子量を示し、「ｂ」は、得られたポリマー中のＰＥＧ（Ｔ／Ｓ）（ポリエチレングリコールテレフタレート／サクシニレート）の重量分率を示し、「ｃ」は、得られたポリマー中のＰＢ（Ｔ／Ｓ）（ポリブチレンテレフタレート／サクシニレート）の重量分率を示す）で表される。このようなポリマーの例として、６００ＰＥＧＴ８０ＰＢＴ２０、１０００ＰＥＧＴ８０ＰＢＴ２０、２０００ＰＥＧＴ８０ＰＢＴ２０、４０００ＰＥＧＴ８０ＰＢＴ２０、１０００ＰＥＧＴ５０ＰＢＴ５０および１０００ＰＥＧ（Ｔ／Ｓ）６０ＰＢ（Ｔ／Ｓ）４０（Ｔ／Ｓ ５０％）がある。ポリマーは、生分解性であり、高グルコース透過性を有し、その分子量カットオフ特性は、約２５０００Ｄａである。
【０１６３】
これらのポリマーのいくつかが米国特許第６３８３２２０号明細書および欧州特許第１２４７５２２号に開示されている。
【０１６４】
コポリマーの外皮の厚さは１〜５０μｍであるのが好ましい。
【０１６５】
第二の態様では、本発明は、本明細書で記載したセンサーを製造する方法に関する。
【０１６６】
ポリマーマイクロカプセルの製造のための化学的方法として、相分離（コアセルベーション）、溶剤蒸発および／または抽出が挙げられる。
【０１６７】
ポリマーマイクロカプセルを製造する適切な物理的方法として、噴霧乾燥、スプレー被覆、スプレー冷却、回転円盤式アトマイゼーション、流動床被覆、共押出し（たとえば、固定ノズル共押出し、遠心性ヘッド共押出しまたは水中ノズル共押出し）およびパンコーティングが挙げられる。
【０１６８】
センサー用途
第三の態様では、本発明は、本明細書で記載したセンサーを使用して、グルコースを検出する方法であって、センサーを哺乳動物の皮膚に移植すること、および外部光学的手段を使用してグルコースを検出または測定することを含む方法に関する。
【０１６９】
第四の態様では、本発明は、前記センサーを使用してグルコースを検出する方法であって、哺乳動物の皮膚内または下に存在するセンサーの照射による外部光学的手段を使用して、グルコースを検出または測定することを含む方法に関する。
【０１７０】
該方法は、さらにセンサー中で生分解性材料を分解することを含むのが好ましい。
【０１７１】
センサーは、注射によって、好ましくはシリンジを用いて、あるいは他の方法で、特に国際公開公報第００／０２０４８号に記載されている任意の方法によって、皮膚内に導入してもよい。センサーは、患者への不快感を最小にするため、狭いゲージ針によって注射するのに適したサイズのものが好ましい。センサーの最高寸法は、２０μｍ〜１ｍｍが好ましい。しかし、大きな最高寸法を持つロッド型のセンサーを使用してもよい。
【０１７２】
センサーは、真皮の厚さ内あるいは皮下に導入してもよいし、表皮に導入してもよいが、後者の場合、もしかしたら、生分解性材料が分解する前に、表皮層の成長によって皮膚から排出される可能性がある。
【０１７３】
センサーは皮膚内に配置されるので、センサーにて発生する光信号は、経皮的に（すなわち、皮膚の上位層を通して）検出されるのが好ましく、したがって、センサーと感染をもたらし得る外部環境との間の任意の直接接触を未然に防ぐ必要がある。
【０１７４】
しかし、代わりに、皮膚を介して光を通すことなくセンサーが外部光学的手段によって照らされるのを可能にする、中空または透明手段（たとえば、針または光ファイバー）を介して検出を行ってもよい。
【０１７５】
一度センサーが皮膚の位置に置かれると、悪影響を起こすことなく必要な回数だけグルコース測定を行うことができる。もしグルコース測定がより頻繁に行われれば、厳密な制御を、血中のグルコースの濃度において維持することができ、不満足に調整された血糖に関連する状態を発症するリスク、たとえば、網膜疾患、腎臓疾患、神経障害、一般的な小血管および大血管損傷、および循環不良を減少させるであろうから、これは、長期間治療の糖尿病患者に対して特に有利である。
【０１７６】
本発明のセンサーは、それ自身は、アッセイの読み出しを問い合わせするために必要な光学成分のいかなるもの（これらは体とは別に備えられ、体の外に置かれるのが好ましい）も含まないので、センサーを、患者に対して最小の不快感で注射し得る形態で、簡単に備えることができる。
【０１７７】
ＦＲＥＴの技術を使用する、アッセイを導入するセンサーには、エネルギー供与体部分の吸収スペクトル内の波長で入射光を供給し、放射された蛍光の強度または励起状態の寿命を測定することによって、問い合わせすることができる。一般的に知られている方法は以下の通りである。
【０１７８】
１．定常状態の測定
２．タイムドメイン寿命の測定
ａ．信号光子の計測
ｂ．ストリークカメラ
ｃ．ゲート検出（パルスサンプリング）
ｄ．アップコンバージョン
３．周波数ドメイン寿命の測定
ａ．位相変調蛍光光度法（ヘテロダイン検出）
ｂ．位相敏感検波法（ホモダイン検出）
【０１７９】
該原理の更なる説明は、Lakowicz, J.R.「Principles of Fluorescence Spectroscopy, 第二編」，１９９９にある。
【０１８０】
アッセイを問い合わせするための好ましい方法は、位相変調蛍光光度法である。
【０１８１】
アッセイを問い合わせするための適切な光学セットアップ（図６）は、エネルギー供与体部分の発光スペクトル内で光を放射する、光放射ダイオード（ＬＥＤ）１１で構成される。ＬＥＤは、好ましくは４５°の範囲で、充分な位相シフトとなる周波数で、ＬＥＤを調整する、ドライバ回路１３によって動作される。３ｎｓの寿命を持つ蛍光団に関して、好ましい周波数は、５０ＭＨｚである。ＬＥＤにより放射された光は、励起フィルター１５によってフィルターをかけられ、ダイクロイックビームスプリッター１７によってセンサー１６に向けられ、レンズ１９によって、注射されたセンサー１６上のセンサー／皮膚に集束される。センサーによって放射された蛍光は、レンズ１９によって集められる。光はダイクロイックビームスプリッターを通り、発光フィルター２１によりフィルターをかけられる。フィルターをかけられた光は、レンズ２３によって検出器２５、この場合アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）に集束される。ＡＰＤは、ＡＰＤバイアス供給２７によって逆バイアスされ、これは、信号処理およびコントロールユニット２９によって制御される。ＡＰＤからの信号は、トランスインピーダンス増幅器３１によって増幅され、バンドパスフィルター３３によってフィルターをかけられ、第一アナログ−デジタル変換器（ＡＤＣ）３５によってサンプリングされる。対応して、ＬＥＤへの変調されたドライブ信号を、第二ＡＤＣ３７によってサンプリングする。第一ＡＤＣ３５上にサンプリングされた信号は、以下である。
Ｙ1（ｔ）＝Ａ1*ｓｉｎ（２*π*ｆ*ｔ＋φf1＋φ1）
【０１８２】
Ａ1は、アッセイから検出された信号の振幅であり、ｆは変調周波数であり、φf1は、供与体蛍光団によって導入された位相差であり、φ1は、電子的光学的セットアップによって導入された固定位相差である。
【０１８３】
第二ＡＤＣ３７上にサンプリングされた信号は以下の通りである。
Ｙ2（ｔ）＝Ａ2*ｓｉｎ（２*π*ｆ*ｔ＋φ2）
【０１８４】
Ａ2は、ＬＥＤへの変調ドライブ信号の振幅であり、φ2は、電気的セットアップによって導入された固定位相差である。
【０１８５】
信号処理およびコントロールユニットは、２つのサンプリングされた信号を比較し、電子機器および工学機器によって導入された固定および公知の位相差を相殺することによって、エネルギー供与体部分によって導入された位相差φf1を導き出す。
【０１８６】
測定は、皮膚に近い蛍光光度計を保持することによって、およびセンサーを有するアラインメントにおいて行う。位相差は、相−被検体−校正関数、たとえば、
被検体濃度＝Ａ＋Ｂｘ／（ｋ＋ｘ）
（式中、Ａは被検体不在時の相であり、Ｂは最大応答時の相であり、ｘは測定相であり、ｋは、受容体と被検体類縁体との間の解離定数である）を使用することによって、被検体濃度に変換する。
【０１８７】
代替測定技術は、蛍光強度の測定である。
【０１８８】
この場合、光学的手段は、エネルギー供与体部分の吸収スペクトル内での波長で入射光の第一ビームを、好ましくは、エネルギー受容体部分の吸収スペクトル内での波長で入射光の第二ビームを（これはエネルギー受容体部分も蛍光団であることに適用される）供給する必要がある。さらに、光学的手段は、好ましくは、センサー内で発生する光信号を、２つの異なる波長、すなわち、エネルギー供与体部分の発光スペクトル内で波長１（被検体の測定に関して発生する信号）およびエネルギー受容体部分（被検体信号、内部参照またはキャリブレーション信号であり得る）の発光スペクトル内では波長２で、測定することができる必要がある。
【０１８９】
蛍光光度計は、以下のパラメーターを別々に測定する。
波長１（エネルギー供与体部分）で
励起光強度、Ｉ（１，０）
周囲の光強度、Ｉ（１，１）
組合わせた蛍光の強度および周囲の光、Ｉ（１，２）
波長２（エネルギー受容体部分）で
励起光強度、Ｉ（２，０）
周囲の光強度、Ｉ（２，１）
組合わせた蛍光の強度および周囲の光、Ｉ（２，２）
再び、測定を、皮膚に近い蛍光光度計を保持することによって、およびセンサーを有するアラインメントにおいて行う。センサー内に発生した蛍光信号の経皮的測定を行う時は、皮膚による信号の吸収を考慮することが必要である。ヒト皮膚の吸収率は、実験によって、４００ｎｍ〜９００ｎｍの範囲内で、最も低いことがわかっている。得られる最終出力は、２つの蛍光団からの蛍光強度の間の標準化された比であり、以下の関係（式１）によって規定される。
最終出力＝（Ｉ（１，２）−Ｉ（１，１））*Ｉ（２，０）／（Ｉ（２，２）−Ｉ（２，１））*Ｉ（１，０）
（１）
【０１９０】
前記式１によって与えられる、光学的手段（たとえば、蛍光光度計）からの最終出力は、好ましくは国際公開公報第００／０２０４８号に規定されている原理に基づいて得ることができる、校正ダータを使用するコンピュータによって、被検体濃度に変換する。
【０１９１】
本発明のさらなる態様
第五態様では、本発明は、流体中の糖質被検体の検出または測定用センサーであって、該センサーは、競合結合アッセイの成分を含み、該アッセイの読み出しは、被検体の拡散は可能にするがアッセイ成分の拡散は可能にしない材料によって保持されている検出可能または測定可能な光信号であり、アッセイ成分は、
レクチンと、
被検体類縁体であって、少なくとも１個のグルコース単位の３−および／または４−水酸基が不活性化されている、場合によっては誘導化されているデキストランを含む被検体類縁体とを含み、被検体類縁体は、レクチンに結合するための被検体と競合することができるセンサーに関する。デキストランは、過ヨウ素酸塩で処理されたデキストランであることが好ましい。
【０１９２】
第六態様では、本発明は、流体中の糖質被検体の検出または測定用センサーであって、センサーは、競合結合アッセイの成分を含み、該アッセイの読み出しは、被検体の拡散は可能にするがアッセイ成分の拡散は可能にしない材料によって保持された検出可能または測定可能な光信号であり、アッセイ成分は、
レクチンと、
レクチンと結合するための被検体と競合することができるマンノース−タンパク質複合体を含む被検体類縁体と
を含むセンサーに関する。
【０１９３】
好ましくは、マンノース−タンパク質複合体は、マンノースのＨＳＡに対するモル比が、１０：１〜１５０：１の範囲、たとえば、１５：１、３０：１、６０：１または１２０：１を使用して製造されたものである。
【０１９４】
第七態様では、本発明は、流体中の糖質被検体の検出または測定用センサーであって、センサーは、競合結合アッセイの成分を含み、該アッセイの読み出しは、被検体の拡散は可能にするがアッセイ成分の拡散は可能にしない材料によって保持された検出可能または測定可能な光信号であり、アッセイ成分は、
近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアの１つで標識化された糖質結合分子と；
糖質結合分子に結合するための被検体と競合することができる糖質類縁体であって、糖質類縁体は柔軟性のある水溶性ポリマーであり、
第一モノマー単位残基が、ペンダント糖質部分または糖質様部分と、近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアのもう一方であるペンダント部分とを有する、第一モノマー単位の重合残基、および／または第二モノマー単位残基がペンダント糖質部分または糖質様部分を有し、第三モノマー単位残基が近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアのもう一方であるペンダント部分を有する、第二モノマー単位および第三モノマー単位の共重合化残基を含む糖質類縁体と
を含むセンサーに関する。
【０１９５】
第八態様では、本発明は、前記ポリマーを製造する方法であって、以下の工程の１つを含む方法に関する：
ａ）それぞれ、ペンダント糖質部分または糖質様部分と、ぶら下がっている近接度に基づいた信号発生／変調部分とを有するモノマー単位と、場合によっては第三モノマー単位とを重合すること；
ｂ）それぞれ糖質部分または糖質様部分を有する第一モノマー単位と、それぞれ、ぶら下がっている近接度に基づいた信号発生／変調部分を有する第二モノマー単位と、場合によっては第三モノマー単位とを共重合すること；
ｃ）それぞれ、ペンダント糖質部分または糖質様部分と、近接度に基づいた信号発生／変調部分にリンクするためのペンダント官能基とを有するモノマー単位と、場合によっては第三モノマー単位とを重合し、次いで、モノマー単位残基を、近接度に基づいた信号発生／変調部分と反応させること；
ｄ）それぞれペンダント糖質部分または糖質様部分を有する第一モノマー単位と、それぞれ、近接度に基づいた信号発生／変調部分にリンクするためのペンダント官能基を有する第二モノマー単位と、場合によっては第三モノマー単位とを共重合し、次いで第二モノマー単位残基を近接度に基づいた信号発生／変調部分と反応させること；
ｅ）それぞれ、糖質部分または糖質様部分にリンクするためのペンダント官能基と近接度に基づいた信号発生／変調部分にリンクするための異なるペンダント官能基とを有するモノマー単位と、場合によっては第三モノマー単位とを重合し、次いでモノマー単位残基を糖質部分または糖質様部分および近接度に基づいた信号発生／変調部分と反応させること；または
ｆ）それぞれ糖質部分または糖質様部分にリンクさせるためのペンダント官能基を有する第一モノマー単位と、それぞれ近接度に基づいた信号発生／変調部分にリンクするための異なるペンダント官能基を有する第二モノマー単位と、場合によっては第三モノマー単位とを共重合し、次いで糖質または糖質様部分を持つ第一モノマー単位残基と、近接度に基づいた信号発生／変調部分を持つ第二モノマー単位残基とを反応させること。
【０１９６】
本発明の任意の態様に関連して記載した特徴は、本発明の他の態様に適用することができる。
【０１９７】
本発明を、実施例および図面を用いてさらに説明する。
【０１９８】
一般
以下の材料を使用した。
ｐ−アミノフェニル−α−Ｄ−マンノピラノシルイソチオシアネート、ウシ血清アルブミン−α−Ｄ−マンノピラノシルイソチオシアネート（２３当量、Ｍａｎ ｐｒ．ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン、過ヨウ素酸ナトリウム、ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｏ−フェニレンジヒドロクロリド、ベンジルアミン、アンモニア、ナトリウムシアノボロハイドライド(Sigma-Aldrich)
Ｎｕｎｃ Ｆ９６ＭａｘｉＳｏｒｐプレート(Nunc, Denmark)
ＰＤ−１０カラム、ストレプトアビジン−ＨＲＰ(Amersham bioscience)
デキストラン(Pharmacosmos, Denmark)
マンナン結合レクチン（いくつかの供給源、たとえば、Statens serum Institute、 Copenhagen, Denmarｋから入手し得る）
透析チューブSpectra/Por (Spectrum Laboratories社,California, USA)、Float-A-Lyzer（商標）２５．０００ＭＷＣＯ 透析チューブは、Spectrum Laboratories Europe (Breda, The Netherlands)から入手した。
【０１９９】
ソルビタンモノオレエート（Ｓｐａｎ（登録商標）８０）、アゾジイソブチロジニトリル（ＡＩＢＮ）および２−ヒドロキシエチルアクリレートは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩は、PolysSciences Europe (Eppelheim, Germany)から入手した。２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］ジヒドロクロリド（ＶＡ−０４４）は、Wako GmbH (Neuss, Germany）から入手した。
【０２００】
アリルα−Ｄ−グルコピラノシドおよびアリル２−アセタミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシドは、Glycon Biochemicals, Germanyから入手した。アリルα−Ｄ−ガラクトピラノシドはSigma-Aldrichから入手した。
【０２０１】
他の記載がない限り、ＰＢＳは、２０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４であり、ＴＢＳは、２０ｍＭのＴＲＩＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．２５ｍＭのＣａＣｌ2、ｐＨ７．４である。
【０２０２】
省略語：ＭＢＬ、マンナン結合レクチン；ＰＢＳ、リン酸緩衝食塩水；ＴＢＳ、ＴＲＩＳ緩衝食塩水；ＥＬＬＡ、酵素結合レクチンアッセイ
【実施例１】
【０２０３】
ＭＢＬの染色
ヒトＭＢＬを、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１．２５ｍＭのＣａ2+を含む１０ｍＭのＮａＨＣＯ3緩衝液、ｐＨ８．７に緩衝液交換（透析法により）した。染色のために使用した染料は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）５９４スクシンイミジルエステル(AF594-SE) (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA)であった。染料を乾燥ＤＭＳＯに溶解し、炭酸水素緩衝液中のＭＢＬにゆっくり（１０分）加えた。反応を１時間行った。染色は、染料の１５倍モル過剰（ポリペプチド単位に関して）で行った。精製を、１０ｍＭのトリス緩衝液ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１．２５ｍＭＣａ2+に対する透析法によって行った。得られた、染色されたタンパク質の標識化度を、ＭＢＬの１サブユニット当たり染料２．３として、ＵＶ分光法によって決定した。
【実施例２】
【０２０４】
デキストランの生成
１５０ｋＤａデキストラン（６．００ｇ，０．４μｍｏｌ）を２５０ｍＭのＫ2ＨＰＯ4、ｐＨ１１．５（６００ｍＬ）に溶解した。水素化ホウ素ナトリウム（３ｇ，０．０８ｍｏｌ）を加え、次いでジビニルスルホン（１５ｍｌ，０．１５ｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で３０分撹拌し、その後濃塩酸でｐＨ７．２に中和した。３０分撹拌した後、得られた混合物を水（３×２５Ｌ）中で透析した（ＭＷＣＯ１０−１２ｋＤａ）。内容物をエルレンマイヤーフラスコに移し、２４％アンモニア（２００ｍＬ）を加えた。２時間後、ｐＨを１０．５に調整し、反応物を一晩撹拌した。過剰のアンモニアを水（８×２５Ｌ）中で透析法（ＭＷＣＯ１０−１２ｋ）により除去し、内容物全てを凍結乾燥し、アミノデキストラン５．７５ｇ（アミノデキストラン、ＭＷ：１８５ｋＤａに対して７８％）を白色綿毛状物質として得た。元素分析を使用して、分子量、アミン導入率および導入されたジビニルスルホンの量の簡易評価を行った。
Ｆｏｕｎｄ Ｃ３９．８６；Ｈ６．２６；Ｎ０．１６；Ｓ３．０８％Ｄｅｘｔｒａｎ１５０ｋ，〜２２ＤＶＳ−ＮＨ2，〜１６０ＤＶＳ−ＯＨ，ａｎｄ〜７２０Ｈ2Ｏ ｒｅｑｕｉｒｅｓ Ｃ３９．５５；Ｈ６．６０；Ｎ０．１６；Ｓ３．０７％
【実施例３】
【０２０５】
ヘキサ−メトキシ−クリスタルバイオレットスクシンイミジルエステル（ＨＭＣＶ−１）の生成
ＨＭＣＶ−１の合成：
【化３】
【０２０６】
スキーム１．Ｉ）４−（Ｎ−メチルアミノ）ブタン酸塩酸塩（１当量）ジイソプロピルエチルアミン、アセトニトリル中、２０℃、２０時間、ＩＩジメチルアミン（過剰量）、ＩＩＩ）ＴＳＴＵ、ジイソプロピルエチルアミン、ｉアセトニトリル、２０℃、２時間
【０２０７】
４ａ （ＢＦ4-）：４−（メチルアミノ）酪酸塩酸塩（１．３６ｇ；８．８ｍｍｏｌ）、１（５．０ｇ；８．３ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（５ｍＬ）をアセトニトリル（１２０ｍＬ）に溶解した。反応混合物を、乾燥窒素雰囲気中で、３０〜３５℃、２２時間撹拌した。ジメチルアミン（４０ｍＬの４０％溶液）水溶液を加え、反応混合物をさらに４日間撹拌した。溶剤および過剰のジメチルアミンを真空除去し、残った材料をクロロホルムに溶解した。クロロホルム溶液を食塩水で２回洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、その後、溶剤を蒸発させ、ＣＨ2Ｃｌ2／エーテルから生成物を再析出させた。収量：４．４ｇ（７０％）、暗青色の粉末
【０２０８】
ＭＳ（ＦＡＢ＋）：ｍ／ｚ６２４（Ｍ＋）
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ８．３４（ＩＨ，ｂｓ），６．０３（２Ｈ，ｓ），５．８３（４Ｈ，ｓ），３．４９（２Ｈ，ｍ），３．４６（６Ｈ，ｓ），３．４４（１２Ｈ，ｓ），３．１２（３Ｈ，ｓ（ｍａｓｋｅｄ）），３．０８（１２Ｈ，ｓ），１．９４（２Ｈ，ｔ），１．７０（２Ｈ，ｍ）
【０２０９】
ＨＭＣＶ−１（Ｃｌ-）：ＴＳＴＵ（２−スクシンイミド−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩；０．８ｇ，２．６ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（１５ｍＬ）中の４ａ（０．９ｇ，１．２６ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（０．５５ｇ，４．５ｍｍｏｌ）溶液に加えた。反応混合物を密閉したフラスコ内で２時間撹拌し、その後これを、ＨＣｌ水溶液（４ｍＬ，２Ｍ）で酸性化した、氷冷したほぼ飽和ＮａＣｌ溶液（約１５０ｍＬ）に注ぎ込んだ。水相をクロロホルム（２×１５０ｍＬ）で抽出した。組合わせたクロロホルム相を、食塩水（２×５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥した。溶剤を蒸発させ、ＣＨ2Ｃｌ2／エーテルから再析出し、暗青色の粉末（０．８０ｇ，８４％）を得た。
【０２１０】
ＭＳ（ＦＡＢ＋）：ｍ／ｚ７２１（Ｍ＋）
1Ｈ−ＭＭＲ 1Ｈ−ＮＭＲ ｂｒ．（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ５．８８（２Ｈ，ｓ），５．８５（４Ｈ，ｓ），３．６０（２Ｈ，Ｓ），３．４６（１２Ｈ，ｓ），３．４５（６Ｈ，ｓ），３．１５（１２Ｈ，ｓ），３．１２（３Ｈ，ｓ），２．８５（４Ｈ，ｓ），２．８０（２Ｈ，ｔ），１．９５（２Ｈ，ｍ）
【実施例４】
【０２１１】
デキストランの染色
実施例２の方法と類似した方法で生成した、７０ｋＤａアミノデキストラン（０．５ｍｍｏｌ ＮＨ2／ｇデキストラン、すなわち、デキストラン１ｍｏｌ当たり３５ｍｏｌのアミン）を、１０ｍＭのＮａＨＣＯ3ｐＨ８．５、ＨＭＣＶ−１（実施例３）を有する１５０ｍＭのＮａＣｌ中で染色した。染料を乾燥ＤＭＳＯに溶解し、炭酸水素緩衝液中でデキストランにゆっくり（１０分）加えた。反応を１時間行った。染色は、染料の８倍モル過剰で行った。精製を、１０ｍＭのトリス緩衝液ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．２５ｍＭのＣａ2+、２ｍＭのＮａＮ3に対する透析法によって行った。得られた、染色されたデキストランの標識化度を、デキストラン１当たり染料７．０として、ＵＶ分光法によって決定した。
【実施例５】
【０２１２】
グルコース測定
ＡＦ５９４で染色されたヒトＭＢＬ（実施例１）とＨＭＣＶ１−デキストラン（実施例４）とをＴＢＳ緩衝液（前記と同じ）中で混合し、（それぞれのＭｗが約２５ｋＤａである、ＭＢＬ−ＡＦ５９４糖質認識ドメイン、ＣＲＤの濃度を使用して）両成分の濃度を１０μＭとした。アッセイ化学検査用混合物を、中空ファイバー（再生セルロース、直径０．２ｍｍ）中に搾取した。
【０２１３】
蛍光寿命測定（周波数ドメイン）をＫＯＡＬＡ自動化サンプルコンパートメント（ＩＳＳ，Ｃｈａｍｐａｉｇｎ ＩＬ）で行った。全溶液をウォーターバス中で３４℃に予熱し、ＫＯＡＬＡ装置中の全測定値を３４℃で記録した。ファイバーおよびファイバーホルダーアッセンブリを含む蛍光セルをＫＯＡＬＡのサンプルホルダー中に置き、グルコースを含む緩衝液で蛍光セルを満たした。
【０２１４】
測定相は、少なくとも４０個の位相角記録の平均であった。測定が完了した後、蛍光セルを、ピペットを使用して空にし、次の濃度のグルコースを含む緩衝液で再び満たした。測定の間を２０分間あけ、アッセイ化学検査が平衡になるようにした。
【０２１５】
グルコース用量応答曲線を作るために、相を、０、５、１０、３０、１００および５００ｍＭのグルコースで測定した。５００ｍＭのグルコースでの位相角の測定の後、ファイバーを、６０分の時間をかけ、１０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液で数回洗浄した。この時点で、０ｍＭのグルコース関して、同じ位相角を得た。これは、アッセイの可逆性を実証している。
【０２１６】
【表１】
【実施例６】
【０２１７】
ＨＭＣＶ１−デキストラン分子量の効果
２０ｋＤａ〜２５０ｋＤａの範囲の分子量を持つＨＭＣＶ１−デキストラン（実施例５で使用したＨＭＣＶ１−デキストランと類似の方法で生成）を使用して、実施例５を繰り返した。１１０ｋＤａのＨＭＣＶ１−デキストランを使用して最高位相シフトに達成したことがわかった。結果を図１に示す。
【実施例７】
【０２１８】
染色されたＭＢＬ：ＨＭＣＶ１−デキストラン比の効果
染色されたＭＢＬ：ＨＭＣＶ１−デキストランの複数の比の範囲を使用して、実施例５を繰り返した。染色されたＭＢＬ：ＨＭＣＶ１−デキストランの比１：４（５μＭの濃度のＭＢＬ−ＡＦ５９４糖質認識ドメイン、ＣＲＤ、それぞれ約２５ｋＤａのＭｗ、および２０μＭのＨＭＣＶ１−デキストラン、分子量は１１０ｋＤａ）で、応答が増加することがわかった。結果を表２に示す。
【０２１９】
【表２】
【実施例８】
【０２２０】
ＭＢＬおよびコンＡの安定性の比較
生理ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ７．４、ナトリウム、カリウムおよびカルシウムが生理的濃度で存在する）中で、レクチンとしてのＭＢＬ−ＡＦ５９４およびコンＡ−ＡＦ５９４を、被検体類縁体としての１１０ｋＤａのＨＭＣＶ１−デキストランとともに使用して、実施例５を繰り返した。グルコース濃度は、１２日間のサイクル中、２．５、５ｍＭ、２５ｍＭおよび５０ｍＭの間で変化させた。測定は、５分間インターバルで、小型時間分解蛍光光度計を使用して行った。ＭＢＬ−ＡＦ５９４に関する実験では、各グルコース濃度での相測定は、長時間一定であった。コンＡに関する実験で、大きなずれが観察され、２０日後に測定相において１０％を超える減少となった。結果を図２に示す。
【実施例９】
【０２２１】
アミノ化過ヨウ素酸塩酸化デキストランの生成
７０ｋＤａデキストラン（２００ｍｇ，０．００２８６ｍｍｏｌ）を水（２．８ｍＬ）に溶解し、水（２．８ｍＬ，１００倍モル過剰）中の過ヨウ素酸ナトリウム溶液１００ｍＭに加えた。混合物を暗所で１時間、室温で撹拌した。得られた混合物を透析チューブ（ＭＷＣＯ１０−１２ｋ）に移し、５Ｌの水に対して一晩透析した。
【０２２２】
透析後、容積を８ｍｌに調整した。過ヨウ素酸塩−酸化デキストランを、２つのアリコート（４ｍＬ，各１００ｍｇ）に分け、２８％アンモニア水溶液（２００μＬ）およびベンジルアミン（３００μＬ）でそれぞれ３０分処理した。次いで、イミンおよびイミニウム誘導体を、ナトリウムシアノボロハイドライド（４５ｍｇ）を使用して、室温およびｐＨ約１０で一晩還元した。
【０２２３】
次の日、反応混合物を、２０ｍＭのＴＢＳ １Ｌに対して２回透析した。
過ヨウ素酸塩酸化デキストラン中のアミン導入度を、元素分析を使用して決定した。
【実施例１０】
【０２２４】
マンノシル化ＨＳＡの生成
４種の複合体を以下の方法で生成した。
２ｍｌエッペンドルフバイアル４本に、それぞれ、２０ｍＭのカーボネート緩衝液（０．４ｍＬ，ｐＨ９．２）に溶解したＨＳＡ（１０ｍｇ）を加えた。ｐ−アミノフェニル−α−Ｄ−マンノピラノシルイソチオシアネート（Ｍａｎ−ＩＴＣ）（１．６ｍＬ）を、１５、３０、６０および１２０モル過剰で加え、以下に説明する４種の溶液を調製した。
【０２２５】
Ｍａｎ−ＩＴＣ（１１．９ｍｇ）を、ＤＭＳＯ（０．１ｍＬ）および２０ｍＭのカーボ−ネート緩衝液（３．９ｍＬ，ｐＨ９．２）に溶解した。この溶液のアリコート（１．６ｍＬ）（１２０倍モル過剰に相当する）を、ＨＳＡ（０．４ｍＬ）を含むエッペンドルフバイアルに加えた。Ｍａｎ−ＩＴＣ溶液の残りを２倍容量に希釈し、該希釈溶液から、アリコート（１．６ｍＬ）を別のエッペンドルフバイアルに加えた。この手順を、４種の異なるＨＳＡ：Ｍａｎ−ＩＴＣ混合物を生成するまで繰り返した。
【０２２６】
４種の反応混合物を、振盪器中で一晩、室温で培養した。得られた複合糖質を、ＰＤ−１０カラムで精製した。精製の間、緩衝液をＴＢＳに変更した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを使用して、結合度を定量した。
【０２２７】
表３：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを使用する結合度の測定
ピーク幅評価は、半値辺りを測定した。マンノースの数は、以下の式（ＭＳ−６６５００中のピーク）／３１３を使用して、決定する。
【表３】
異なるＨＳＡ−マンノース複合体は、ＭＢＬに関し異なる親和性を持つ。
【実施例１１】
【０２２８】
ＥＬＬＡアッセイ
ビオチン化ＭＢＬの生成
ビオチン−ＮＨＳ（ＤＭＳＯ中２０μｌ，７ｍｇ／ｍｌ，〜１０−１５当量／ＭＢＬモノマー）を、ＭＢＬ（３ｍｌ，０．５３ｍｇ）のＰＢＳ（３ｍＬ）溶液に加えた。該溶液を２時間緩やかに撹拌し、次いで、透析チューブ（ＭＷＣＯ１０−１２Ｋ）に移し、ＴＢＳ（２×１Ｌ）に対して２４時間にわたって透析した。得られたＴＢＳ中のビオチン化ＭＢＬ（０．２ｍｇ／ｍｌ）をさらに精製することなく使用した。
【０２２９】
ＭＢＬ ＥＬＬＡアッセイ
ＥＬＬＡアッセイで使用したＴＢＳ緩衝液は、２０ｍＭのＴＲＩＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４である。２０ｍＭのＣａＣｌ2を、抗原がＨＳＡ−マンノースである所で使用し、１．２５ｍＭのＣａＣｌ2（模倣生理的カルシウム濃度）を、抗原がアミノ化過ヨウ素酸塩で処理されたデキストランである所で使用する。
【０２３０】
ＴＢＳ中に抗原（実施例１０からのＨＳＡ−マンノース、アミノデキストラン、実施例９からのベンジルアミノ過ヨウ素酸塩で処理したデキストラン）（１００μＬ，２０μｇ／ｍＬ）をそれぞれ含む２つのカラムを用いて、９６−ウェルマイクロプレートを、５℃、一晩で被覆した。残った結合部位を、ＴＢＳ（１５０μＬ）中の１％（ｗ／ｖ）ＨＳＡを添加してブロックした。次いで、ウェルを（２×２００μＬのＴＢＳ）洗浄した。上記のように調製したビオチン化ＭＢＬ中のグルコース（１００ｍＭ〜０ｍＭ）の希釈液（２μｇ／ｍＬ）を、合計容量１００μＬになるように加えた。２時間培養した後、プレートを空にし、洗浄（２×２００μＬのＴＢＳ）した。ＴＢＳ中のストレプトアビジン−ＨＲＰ０．１％（ｖ／ｖ）（１００μＬ）を加えた。１時間培養した後、プレートを空にし、洗浄（３×２００μｌのＴＢＳ）した。基質溶液（１ｍｇのｏ−フェニレンジヒドロクロリド）の添加によってＨＲＰの存在を可視化し、２分後、１Ｎの硫酸溶液で急冷した。６３０ｎｍでバックグラウンド差し引きし、４９０ｎｍでの吸光度を読むことによって、発色を決定した。
結果を図３および４に示す。
【実施例１２】
【０２３１】
コポリマー合成
水溶性４０％マンノースコポリマーを、以下のようにして、乳化重合で生成した。機械的撹拌器と窒素管とを備える、２５０ｍｌの３つ首丸底フラスコに、Ｓｐａｎ８０界面活性剤（５．７ｇ；ＨＬＢ［親水性−親油性バランス］４．３、トルエンに対して１０％ｗ／ｗ）、ＡＩＢＮ（３０ｍｇ）およびトルエン（５７．３ｇ）を加えた。該フラスコを密封し、窒素でパージし、重合の間中窒素雰囲気下に保った。アリルα−Ｄ−マンノピラノシド（３．５２ｇ）、２−ヒドロキシエチルアクリレート（２．５５２ｇ）およびＮ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（０．３５６ｇ）を水（１２．７ｇ）に溶解し、ろ過して、不溶物質を除去した。この混合物を、丸底フラスコ中で、ゴム膈膜を介して、激しく撹拌されている混合物に加えた。反応混合物を、室温で、安定な乳化物が形成されるまで（３０分）、次いで６０℃４時間、撹拌した。ＶＡ−０４４（１ｍｌ，６０ｍｇ／ｍｌ）の溶液を、膈膜を通して注入し、重合を一晩（１７時間）続けた。反応混合物を室温まで冷却し、乳化物をアセトンの添加によって分離した。これによってポリマーの析出が起こり、析出物を集め、水に再び溶解し、アセトンの添加によって析出させた。生成物を一晩、真空乾燥し、３．２ｇ（５０％）の粗薄黄色ポリマーを得た。粗ポリマーの一部（１．０ｇ）を、水（１０ｍｌ）に溶解し、水中で透析（ＭＷＣＯ［分子量カットオフ］２５，０００）し、低分子量物質を除去した。凍結乾燥によって、０．４６ｇ（４６％）の綿毛状ポリマーを得た。
【実施例１３】
【０２３２】
コポリマーの染色
一般的に、コポリマーの標識化は、Molecular Probes（製品情報ＭＰ００１４３，Ｒｅｖ．２００１年６月）によって提供される記載に従う。
【０２３３】
コポリマー（実施例１２）（８８．６ｍｇ）を、１０ｍＭのＮａＨＣＯ3溶液（３ｍｌ；ｐＨ８．５）に溶解した。ポリマー溶液を３つのエッペンドルフバイアルに３等分した。ＨＭＣＶ−１（実施例３）（１９．６ｍｇ；２６．１μｍｏｌ）を乾燥ＤＭＳＯ（６００μｌ）に溶解した。染料を、第一バイアルは合計で１００μｌ、第二バイアルは２００μｌ、第三バイアルは３００μｌとなるように、１０μｌのアリコート中のポリマー溶液に、３０秒ごとに加えた。最後のアリコートの添加の後、バイアルを１時間穏やかに撹拌し、数種の緩衝液変更のある１０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液中で、透析法緩衝液に色が見えなくなる（通常、５００ｍｌおよび７２時間の緩衝液変更を６〜８回）まで、該溶液を透析（ＭＷＣＯ、１０−１２，０００）した。
【実施例１４】
【０２３４】
ＦＲＥＴアッセイ
１０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液（１２．５μＬ）中の染色したコポリマー溶液（実施例１３）（４μＬ）および染色したＭＢＬ溶液（実施例１）（８．５μＬ）を含むアッセイ化学検査物を混合し、混合後、少なくとも１時間放置した。次いで、アッセイ化学検査物を、シリンジを用いて、実施例５で使用したファイバーに移した。ファイバーを特注設計したファイバーホルダーに載せ、標準蛍光セル（１０ｍｍ×１０ｍｍ）にフィットさせた。
【０２３５】
測定を実施例５のようにして行い、それを表４に示す。
【表４】
【実施例１５】
【０２３６】
センサー成形および移植
ファイバーは、直径７００μｍのガラスロッドを該ポリマーの１５％ｗ／ｗジクロロメタン溶液（ＤＣＭ）に浸漬し、室温で乾燥させることにより、１０００ＰＥＧＴ８０ＰＢＴ２０ポリマー（S.FakirovおよびT.Gogeva, Macromol. Chem. 191 (1990）６０３−６１４に記載のように、８０重量％の親水性セグメントおよび２０重量％の疎水性セグメントを目安として製造）から作った。これによって、外径が９００μｍであり、内腔の直径が７００μｍの中空ファイバーを得た。該ファイバーに、５μＭのAlexa Fluor（商標）で染色したＭＢＬ（実施例１）のＣＲＤおよび２０μＭのＨＭＣＶ−１で染色したアミノデキストラン１５０ｋＤａ（実施例４と類似の方法によって生成した）を満たした。ファイバーを融解して閉じるためにポリマーを熱した。
【０２３７】
試験および挿入の前に、溶接したファイバーの漏出試験を行った。
グルコース応答を、時間分解蛍光分光法（周波数ドメイン）を使用して測定し、それを図５に示す。
【０２３８】
このタイプのファイバーは、針を使用して皮膚の上面に置くことができる。適切なサイズ（湿潤ファイバーを包含するのに充分な大きさ）の針を、皮膚表面に対して平行に、深さ約１ｍｍで置き、皮膚を通して影のように見えるように針を残す。ファイバー（また湿っている）を針の中に置き、次に針を取り去る。通常、挿入が完了した後でも、挿入箇所に放血は観察されない。
【０２３９】
ファイバーを適切な場所に設置したら、読み出しデバイスをファイバーの上に直接置き、測定を始めることができる。
【図面の簡単な説明】
【０２４０】
【図１】ヒトＭＢＬからのグルコース用量応答と、種々のデキストランの分子量に関するデキストランアッセイとを示す。（実施例６）
【図２（ａ）】ヒトＭＢＬおよび１１０ｋＤａデキストランアッセイシステムからのグルコース用量応答を示す。（実施例８）
【図２（ｂ）】コンＡおよび１１０ｋＤａデキストランアッセイシステムからのグルコース用量応答を示す。（実施例８）
【図３】ヒトＭＢＬおよびＨＳＡマンノースＥＬＬＡアッセイシステムからのグルコース用量応答を示す。（実施例１１）
【図４】ヒトＭＢＬおよび過ヨウ素酸塩で処理されたデキストランＥＬＬＡアッセイシステムからのグルコース用量応答を示す。（実施例１１）
【図５】ヒトＭＢＬおよび７０ｋＤａデキストランアッセイシステムからのグルコース用量応答を示す。（実施例１５）
【図６】アッセイを問い合わせするための適切な光学セットアップを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体中の糖質被検体の検出または測定用センサーであって、センサーは、競合結合アッセイの成分を含み、アッセイの読み出しは、被検体の拡散は可能にするがアッセイ成分の拡散は可能にしない材料によって保持された検出可能または測定可能な光信号であり、アッセイ成分は、動物レクチンと、レクチンに結合するための被検体と競合することができる被検体類縁体とを含むセンサー。
【請求項２】
被検体がグルコースである、請求項１記載のセンサー。
【請求項３】
被検体類縁体が、生理的カルシウム濃度で、グルコースと競合することができる、請求項２記載のセンサー。
【請求項４】
レクチンが、ヒトまたはヒト化レクチンである、請求項１〜３のいずれかに記載のセンサー。
【請求項５】
レクチンが、人体または組換えレクチンから誘導される請求項４に記載のセンサー。
【請求項６】
レクチンが、多量体形態である、請求項１〜５のいずれかに記載のセンサー。
【請求項７】
レクチンが、マンノース結合レクチン、肺界面活性タンパク質、コングルチニンまたはコレクチン−４３から選択されるコレクチンである、請求項１〜６のいずれかに記載のセンサー。
【請求項８】
レクチンが、三量体形態および／または四量体形態のマンノース結合レクチンである、請求項６に従属する請求項７記載のセンサー。
【請求項９】
被検体類縁体が、複数の糖質部分または糖質様部分を含む、請求項１〜８のいずれかに記載のセンサー。
【請求項１０】
被検体類縁体が、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ロイコロース、Ｎ−アセチル−グルコサミン、Ｄ−マンノース、Ｌ−フコース、Ｎ−アセチル−マンノサミン、Ｄ−アラビノース、ミオイノシトール、Ｄ−タガトース、エルロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−パラチノース、Ｄ−ツラノース、Ｄ−リボース、Ｄ−ソルビトールから選択される少なくとも１種の糖質部分を含む、請求項９記載のセンサー。
【請求項１１】
被検体類縁体が、１種以上のエネルギー供与体部分またはエネルギー受容体部分を有する、請求項１〜１０のいずれかに記載のセンサー。
【請求項１２】
被検体類縁体が、場合によっては、糖質部分および／または糖質様部分のポリマーから誘導体化されている、請求項９〜１１のいずれかに記載のセンサー。
【請求項１３】
被検体類縁体が、場合によっては誘導体化された、デキストラン、マンナン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、ヒアルロナート、コンドロイチン、ヘパリン、デキストリン、イヌリン、キシラン、フルクタンおよびキチンから選択される、請求項１２記載のセンサー。
【請求項１４】
被検体類縁体が、場合によっては誘導体化されているデキストランであって、少なくとも１個のグルコース単位の３−および／または４−水酸基が不活性化されたデキストランである、請求項１３記載のセンサー。
【請求項１５】
被検体類縁体が、場合によっては誘導体化されているデキストランであって、過ヨウ素酸塩で処理されたデキストランである、請求項１４記載のセンサー。
【請求項１６】
デキストランがアミノ化されている、請求項１３〜１５のいずれかに記載のセンサー。
【請求項１７】
被検体類縁体が、糖質−タンパク質複合体または糖質−デンドリマー複合体である、請求項９〜１１のいずれかに記載のセンサー。
【請求項１８】
被検体類縁体が、糖質−アルブミン複合体である、請求項１７記載のセンサー。
【請求項１９】
被検体類縁体が、ペンダント糖質部分または糖質様部分を有する、柔軟性のある水溶性非多糖類ポリマーである、請求項９〜１１のいずれかに記載のセンサー。
【請求項２０】
アッセイの成分が、シェル材料またはマトリックス材料によって保持されている、請求項１〜１９のいずれかに記載のセンサー。
【請求項２１】
保持材料が、生分解性である、請求項１〜２０のいずれかに記載のセンサー。
【請求項２２】
グルコースをアッセイ成分に接触させながら、アッセイの成分が、アッセイ成分を封入する生分解性材料のシェルによって保持され、生分解性材料が、疎水性単位および親水性単位を持つコポリマーを含む、請求項２０に従属する請求項２１記載のセンサー。
【請求項２３】
検出可能または測定可能な光信号が、近接度に基づいた信号発生／変調部分によって発生する、請求項１〜２３のいずれかに記載のセンサー。
【請求項２４】
レクチンが、近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアの１つで標識化され、被検体類縁体が、近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアのもう１つで標識化されている、請求項２３記載のセンサー。
【請求項２５】
相分離、溶剤蒸発、抽出、噴霧乾燥、スプレー被覆、スプレー冷却、回転円盤式アトマイゼーション、流動床被覆、共押出しおよびパンコーティングの１以上を含む、請求項１〜２４のいずれかに記載のセンサーを製造する方法。
【請求項２６】
請求項１〜２４のいずれかに記載のセンサーを使用してグルコースを検出する方法であって、哺乳動物の皮膚にセンサーを移植すること、および外部光学的手段と生分解性材料の分解とを使用してグルコースを検出または測定することを含む方法。
【請求項２７】
請求項１〜２４のいずれか１つに記載のセンサーを使用してグルコースを検出する方法であって、哺乳動物の皮膚内または下に存在する前記センサーの照射による外部光学的手段を使用して、グルコースを検出または測定することを含む方法。
【請求項２８】
流体中の糖質被検体の検出または測定用センサーであって、センサーは、競合結合アッセイの成分を含み、該アッセイの読み出しは、被検体の拡散は可能にするがアッセイ成分の拡散は可能にしない材料によって保持された検出可能または測定可能な光信号であり、アッセイ成分は、近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアの１つで標識化された糖質結合分子と、糖質結合分子に結合するための被検体と競合することができる糖質類縁体とを含み、
糖質類縁体は、柔軟性のある水溶性ポリマーであって、モノマー単位の重合残基、ペンダント糖質部分または糖質様部分と、近接度に基づいた別の信号発生／変調部分ペアであるペンダント部分とを有する第一モノマー単位残基、および／または
はペンダント糖質部分または糖質様部分を有する第一モノマー単位残基と、近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアのもう１つであるペンダント部分を有する第二モノマー単位残基との共重合残基を含むセンサー。
【請求項１】
流体中の糖質被検体の検出または測定用センサーであって、センサーは、競合結合アッセイの成分を含み、アッセイの読み出しは、被検体の拡散は可能にするがアッセイ成分の拡散は可能にしない材料によって保持された検出可能または測定可能な光信号であり、アッセイ成分は、動物レクチンと、レクチンに結合するための被検体と競合することができる被検体類縁体とを含むセンサー。
【請求項２】
被検体がグルコースである、請求項１記載のセンサー。
【請求項３】
被検体類縁体が、生理的カルシウム濃度で、グルコースと競合することができる、請求項２記載のセンサー。
【請求項４】
レクチンが、ヒトまたはヒト化レクチンである、請求項１〜３のいずれかに記載のセンサー。
【請求項５】
レクチンが、人体または組換えレクチンから誘導される請求項４に記載のセンサー。
【請求項６】
レクチンが、多量体形態である、請求項１〜５のいずれかに記載のセンサー。
【請求項７】
レクチンが、マンノース結合レクチン、肺界面活性タンパク質、コングルチニンまたはコレクチン−４３から選択されるコレクチンである、請求項１〜６のいずれかに記載のセンサー。
【請求項８】
レクチンが、三量体形態および／または四量体形態のマンノース結合レクチンである、請求項６に従属する請求項７記載のセンサー。
【請求項９】
被検体類縁体が、複数の糖質部分または糖質様部分を含む、請求項１〜８のいずれかに記載のセンサー。
【請求項１０】
被検体類縁体が、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ロイコロース、Ｎ−アセチル−グルコサミン、Ｄ−マンノース、Ｌ−フコース、Ｎ−アセチル−マンノサミン、Ｄ−アラビノース、ミオイノシトール、Ｄ−タガトース、エルロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−パラチノース、Ｄ−ツラノース、Ｄ−リボース、Ｄ−ソルビトールから選択される少なくとも１種の糖質部分を含む、請求項９記載のセンサー。
【請求項１１】
被検体類縁体が、１種以上のエネルギー供与体部分またはエネルギー受容体部分を有する、請求項１〜１０のいずれかに記載のセンサー。
【請求項１２】
被検体類縁体が、場合によっては、糖質部分および／または糖質様部分のポリマーから誘導体化されている、請求項９〜１１のいずれかに記載のセンサー。
【請求項１３】
被検体類縁体が、場合によっては誘導体化された、デキストラン、マンナン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、ヒアルロナート、コンドロイチン、ヘパリン、デキストリン、イヌリン、キシラン、フルクタンおよびキチンから選択される、請求項１２記載のセンサー。
【請求項１４】
被検体類縁体が、場合によっては誘導体化されているデキストランであって、少なくとも１個のグルコース単位の３−および／または４−水酸基が不活性化されたデキストランである、請求項１３記載のセンサー。
【請求項１５】
被検体類縁体が、場合によっては誘導体化されているデキストランであって、過ヨウ素酸塩で処理されたデキストランである、請求項１４記載のセンサー。
【請求項１６】
デキストランがアミノ化されている、請求項１３〜１５のいずれかに記載のセンサー。
【請求項１７】
被検体類縁体が、糖質−タンパク質複合体または糖質−デンドリマー複合体である、請求項９〜１１のいずれかに記載のセンサー。
【請求項１８】
被検体類縁体が、糖質−アルブミン複合体である、請求項１７記載のセンサー。
【請求項１９】
被検体類縁体が、ペンダント糖質部分または糖質様部分を有する、柔軟性のある水溶性非多糖類ポリマーである、請求項９〜１１のいずれかに記載のセンサー。
【請求項２０】
アッセイの成分が、シェル材料またはマトリックス材料によって保持されている、請求項１〜１９のいずれかに記載のセンサー。
【請求項２１】
保持材料が、生分解性である、請求項１〜２０のいずれかに記載のセンサー。
【請求項２２】
グルコースをアッセイ成分に接触させながら、アッセイの成分が、アッセイ成分を封入する生分解性材料のシェルによって保持され、生分解性材料が、疎水性単位および親水性単位を持つコポリマーを含む、請求項２０に従属する請求項２１記載のセンサー。
【請求項２３】
検出可能または測定可能な光信号が、近接度に基づいた信号発生／変調部分によって発生する、請求項１〜２３のいずれかに記載のセンサー。
【請求項２４】
レクチンが、近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアの１つで標識化され、被検体類縁体が、近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアのもう１つで標識化されている、請求項２３記載のセンサー。
【請求項２５】
相分離、溶剤蒸発、抽出、噴霧乾燥、スプレー被覆、スプレー冷却、回転円盤式アトマイゼーション、流動床被覆、共押出しおよびパンコーティングの１以上を含む、請求項１〜２４のいずれかに記載のセンサーを製造する方法。
【請求項２６】
請求項１〜２４のいずれかに記載のセンサーを使用してグルコースを検出する方法であって、哺乳動物の皮膚にセンサーを移植すること、および外部光学的手段と生分解性材料の分解とを使用してグルコースを検出または測定することを含む方法。
【請求項２７】
請求項１〜２４のいずれか１つに記載のセンサーを使用してグルコースを検出する方法であって、哺乳動物の皮膚内または下に存在する前記センサーの照射による外部光学的手段を使用して、グルコースを検出または測定することを含む方法。
【請求項２８】
流体中の糖質被検体の検出または測定用センサーであって、センサーは、競合結合アッセイの成分を含み、該アッセイの読み出しは、被検体の拡散は可能にするがアッセイ成分の拡散は可能にしない材料によって保持された検出可能または測定可能な光信号であり、アッセイ成分は、近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアの１つで標識化された糖質結合分子と、糖質結合分子に結合するための被検体と競合することができる糖質類縁体とを含み、
糖質類縁体は、柔軟性のある水溶性ポリマーであって、モノマー単位の重合残基、ペンダント糖質部分または糖質様部分と、近接度に基づいた別の信号発生／変調部分ペアであるペンダント部分とを有する第一モノマー単位残基、および／または
はペンダント糖質部分または糖質様部分を有する第一モノマー単位残基と、近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアのもう１つであるペンダント部分を有する第二モノマー単位残基との共重合残基を含むセンサー。
【図１】
【図２（ａ）】
【図２（ｂ）】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２（ａ）】
【図２（ｂ）】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００８−５２３３５７（Ｐ２００８−５２３３５７Ａ）
【公表日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４３８０４（Ｐ２００７−５４３８０４）
【出願日】平成１７年１２月７日（２００５．１２．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１３１１４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６１２０７
【国際公開日】平成１８年６月１５日（２００６．６．１５）
【出願人】（５０３１３６０４８）
【氏名又は名称原語表記】ＰＲＥＣＩＳＥＮＳＥ Ａ／Ｓ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月７日（２００５．１２．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１３１１４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６１２０７
【国際公開日】平成１８年６月１５日（２００６．６．１５）
【出願人】（５０３１３６０４８）
【氏名又は名称原語表記】ＰＲＥＣＩＳＥＮＳＥ Ａ／Ｓ
【Ｆターム（参考）】
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