糖鎖アスパラギン誘導体およびその製造方法
下記式（１）で表される１１〜３糖を有する糖鎖アスパラギン誘導体、
〔式中、Ｒ１およびＲ２は、水素原子、明細書記載の式（２）〜（６）で示される基であり、同一でも異なっていてもよい。Ｑはビオチン基又はＦＩＴＣ基を示す。〕
ビオチン基又はＦＩＴＣ基でアスパラギンのアミノ基窒素が修飾された糖鎖アスパラギンの非還元末端側のＮ−アセチルグルコサミンに少なくとも１個以上のフコースを含む糖鎖アスパラギン誘導体、ビオチン化糖鎖アスパラギンを結合させたマイクロプレート、並びにビオチン化糖鎖アスパラギンを結合させたアフィニティーカラム。
〔式中、Ｒ１およびＲ２は、水素原子、明細書記載の式（２）〜（６）で示される基であり、同一でも異なっていてもよい。Ｑはビオチン基又はＦＩＴＣ基を示す。〕
ビオチン基又はＦＩＴＣ基でアスパラギンのアミノ基窒素が修飾された糖鎖アスパラギンの非還元末端側のＮ−アセチルグルコサミンに少なくとも１個以上のフコースを含む糖鎖アスパラギン誘導体、ビオチン化糖鎖アスパラギンを結合させたマイクロプレート、並びにビオチン化糖鎖アスパラギンを結合させたアフィニティーカラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明はビオチン化糖鎖アスパラギン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）化糖鎖アスパラギン、それらの製造方法及びその用途に関する。
【背景技術】
近年、核酸（ＤＮＡ）、タンパク質に続く第三の鎖状生命分子として、糖鎖分子が注目されてきている。ヒトの体は、約６０兆個の細胞から成っている一大細胞社会であり、全ての細胞表面は糖鎖分子によって覆われている。例えば、ＡＢＯ式血液型は細胞表面の糖鎖の違いにより決定されている。
糖鎖は、細胞間の認識や相互作用に関わる働きをもち、細胞社会を成り立たせる要となっている。細胞社会の乱れは、癌、慢性疾患、感染症、老化などにつながる。
例えば、細胞が癌化すると糖鎖の構造変化が起こることが分かっている。また、コレラ菌やインフルエンザウイルスなどは、ある特定の糖鎖を認識し結合することにより、細胞に侵入し感染することが知られている。
糖鎖は単糖の配列、結合様式・部位、鎖の長さ・分岐様式、全体の高次構造などの多様性から、核酸やタンパク質の構造と比べると非常に複雑な構造である。従って、その構造に由来する生物学的な情報は核酸やタンパク質に比べて多種多様である。糖鎖は、研究の重要性を認識されながらも、その構造の複雑さや多様性により、核酸やタンパク質に比べて研究の推進が遅れている状況にある。
上述のようにある特定の糖鎖とタンパク質とが認識し結合能を有しているかを解明することにより、新しい原理に基づく医薬品や食品の開発などをもたらし、病気の予防、治療に貢献するなど、幅広い応用が期待されている。
そこで、ビオチン・アビジンの結合特異性を利用し、ビオチン化した複数の糖鎖をアビジン化されたマイクロプレート上で反応させるだけで簡単に糖鎖マイクロチップを製造することができる。これにより、特定の糖鎖と結合能を有するタンパク質を解明することができる。
また、ある特定のタンパク質を分離精製する目的で、アビジン化したアフィニティーカラムに特定のビオチン化した糖鎖を結合し固定化し、そこに、ビオチン化した糖鎖と特異的結合能を有するタンパク質を含む混合物を通すことにより目的とするタンパク質のみを単離することができる。
またＦＩＴＣ化した糖鎖アスパラギンは、キャピラリー電気泳動法等により微量であっても単離することができる。更にそれからＦＩＴＣをはずして糖鎖アスパラギン自身を単離することもできる。
本発明の課題は、アスパラギンのアミノ基窒素をビオチン化又はＦＩＴＣ化した糖鎖アスパラギン、その製造方法及びその用途を提供することにある。
【発明の開示】
本発明は、下記の発明に係る。
１．下記式（１）で表される１１〜３糖を有する糖鎖アスパラギン誘導体。
〔式中、Ｒ１およびＲ２は、水素原子、式（２）〜（６）で示される基であり、同一でも異なっていてもよい。Ｑはビオチン基又はＦＩＴＣ基を示す。〕
２．ビオチン基又はＦＩＴＣ基でアスパラギンのアミノ基窒素が修飾された糖鎖アスパラギンの非還元末端側のＮ−アセチルグルコサミンに少なくとも１個以上のフコースを含む糖鎖アスパラギン誘導体。
３．式（９）で表される１１〜３糖を有する糖鎖アスパラギンをビオチン化することを特徴とするビオチン化糖鎖アスパラギンの製造方法。
〔式中、Ｒ１およびＲ２は上記に同じ。〕
４．式（９）で表される１１〜３糖を有する糖鎖アスパラギンをフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）化することを特徴とするＦＩＴＣ化糖鎖アスパラギンの製造方法。
５．上記のビオチン化糖鎖アスパラギンを結合させたマイクロプレート。
６．上記のビオチン化糖鎖アスパラギンを結合させたアフィニティーカラム。
本発明者は、先に特願２００１−１８５６８５号（以下、先願という）において、種々の単離された糖鎖アスパラギン誘導体を従来に比べて非常に容易かつ大量に得ることができる、糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギン、糖鎖の製造方法、更には糖残基が任意に欠失した糖鎖が結合した新規な糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギン、糖鎖を開発した。
この先願の方法は例えば
（１） （ａ）１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程、
ならびに
（ｂ）該糖鎖アスパラギン誘導体混合物または該糖鎖アスパラギン誘導体混合物に含まれる糖鎖アスパラギン誘導体を加水分解して得られる混合物をクロマトグラフィーに供して各糖鎖アスパラギン誘導体を分離する工程、
を含む、糖鎖アスパラギン由来の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法、
（２） （ｂ’）工程（ｂ）で分離された糖鎖アスパラギン誘導体を糖加水分解酵素を用いて加水分解する工程をさらに含む前記（１）記載の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法、
（３） １種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物が、下記式（Ａ）の化合物および／または該化合物において１以上の糖残基が欠失した化合物を含むものである、前記（１）または（２）記載の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法、
（４） 脂溶性の保護基がフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基である前記（１）〜（３）いずれか記載の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法、
（５） 工程（ａ）が、非還元末端にシアル酸残基を有する１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖アスパラギンにＦｍｏｃ基を導入し、かつシアル酸残基にベンジル基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程である、前記（１）〜（３）いずれか記載の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法、
（６） （ａ）１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程、
（ｂ）該糖鎖アスパラギン誘導体混合物または該糖鎖アスパラギン誘導体混合物に含まれる糖鎖アスパラギン誘導体を加水分解して得られる混合物をクロマトグラフィーに供して各糖鎖アスパラギン誘導体を分離する工程、ならびに
（ｃ）工程（ｂ）で分離された糖鎖アスパラギン誘導体の保護基を除去して糖鎖アスパラギンを得る工程、
を含む、糖鎖アスパラギンの製造方法、
（７） （ｂ’）工程（ｂ）で分離された糖鎖アスパラギン誘導体を糖加水分解酵素を用いて加水分解する工程、および／または
（ｃ’）工程（ｃ）で得られた糖鎖アスパラギンを糖加水分解酵素を用いて加水分解する工程、
をさらに含む、前記（６）記載の糖鎖アスパラギンの製造方法、
（８） １種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物が、下記式（Ａ）の化合物および／または該化合物において１以上の糖残基が欠失した化合物を含むものである、前記（６）または（７）記載の糖鎖アスパラギンの製造方法、
（９） 脂溶性の保護基がＦｍｏｃ基である前記（６）〜（８）いずれか記載の糖鎖アスパラギンの製造方法、
（１０） 工程（ａ）が、非還元末端にシアル酸残基を有する１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖アスパラギンにＦｍｏｃ基を導入し、かつシアル酸残基にベンジル基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程である、前記（６）〜（８）いずれか記載の糖鎖アスパラギンの製造方法などである。
これら糖鎖アスパラギン誘導体及び糖鎖アスパラギンの製造についての詳細は、上記先願に述べられているので、これを引用する。しかし若干先願の内容について述べると、先願の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法は、たとえば、天然の糖タンパク質に由来する糖鎖アスパラギン、好ましくはアスパラギン結合型糖鎖から得られる糖鎖アスパラギンの混合物に含まれる当該糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入（結合）して糖鎖アスパラギン誘導体の混合物を得た後に当該混合物を各糖鎖アスパラギン誘導体に分離することを１つの大きな特徴とする。なお、本明細書において、「糖鎖アスパラギン」とはアスパラギンが結合した状態の糖鎖をいう。また、「アスパラギン結合型糖鎖」とはタンパク質のポリペプチド中のアスパラギン（Ａｓｎ）の酸アミノ基に、還元末端に存在するＮ−アセチルグルコサミンがＮ−グリコシド結合した糖鎖群であって、Ｍａｎ（β１−４），ＧｌｃＮａｃ（β１−４）ＧｌｃＮａｃを母核とする糖鎖群をいう。「糖鎖アスパラギン誘導体」とはアスパラギン残基に脂溶性の保護基が結合した状態の糖鎖アスパラギンをいう。また、化合物の構造式中、「ＡｃＨＮ」はアセトアミド基を示す。
前記するように、天然の糖タンパク質に由来する糖鎖は非還元末端の糖残基がランダムに欠失した糖鎖の混合物である。本発明者らは、意外にも天然の糖タンパク質に由来する糖鎖、具体的には糖鎖アスパラギンの混合物に含まれる当該糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入することで、当該保護基が導入された糖鎖アスパラギン誘導体の混合物を公知のクロマトグラフィーの手法を用いて容易に個々の糖鎖アスパラギン誘導体に分離することができることを見出した。それにより、種々の構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体をそれぞれ大量に調製することが可能となった。たとえば、従来分離が困難であった類似構造の糖鎖アスパラギン誘導体同士の分離が可能となり、それらの化合物を各々、容易かつ大量に調製することができる。また、得られた糖鎖アスパラギン誘導体を元に、たとえば、糖加水分解酵素を順次作用させて糖残基を除去することにより、さらに様々な糖鎖アスパラギン誘導体を合成することもできる。
このように、糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入して誘導体化することにより個々の糖鎖アスパラギン誘導体の分離が可能となったが、これは、脂溶性の保護基を導入したことにより糖鎖アスパラギン誘導体の全体の脂溶性が高まり、たとえば、好適に使用される逆相系カラムとの相互作用が格段に向上し、その結果、より鋭敏に糖鎖構造の差を反映して個々の糖鎖アスパラギン誘導体が分離されるようになったことによると考えられる。
さらに、先願によれば、得られた糖鎖アスパラギン誘導体の保護基を除去することにより種々の糖鎖アスパラギンを、人工的に容易かつ大量に得ることができる。
上記先願で得られる糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギン及び糖鎖はいずれもα２，６結合体のものであった。
また、上記先願で得られる糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギン及び糖鎖はいずれもフコースが結合していない糖鎖アスパラギン誘導体であった。
ここで、α２，３結合体とα２，６結合体の相異について以下に説明する。
α２，３結合体、α２，６結合体とは、シアル酸とガラクトースとの結合様式を表わすものである。前者は、シアル酸の２位の炭素と、ガラクトースの３位の炭素がα結合しているものをいい、後者は、シアル酸の２位の炭素と、ガラクトースの６位の炭素がα結合しているものをいう。これらは、ガラクトースとの結合炭素の違いではある。
本発明の方法においては先ず、出発化合物である脂溶性の保護基で保護された糖鎖アスパラギン（９糖−Ａｓｎ−Ｆｍｏｃ）をシアル酸転移酵素を用いてシアル酸あるいはシアル酸の誘導体を転移させ、得られた脂溶性の保護基で保護された糖鎖アスパラギンをクロマトグラフィーに供することにより分離し、脂溶性の保護基で保護されたジシアロ糖鎖アスパラギン誘導体および２種のモノシアロ糖鎖アスパラギン誘導体が得られる。
次いで、得られたジシアロ糖鎖アスパラギン誘導体および２種のモノシアロ糖鎖アスパラギン誘導体を糖加水分解することにより、シアル酸あるいはシアル酸誘導体を有する９〜７糖鎖アスパラギン誘導体が得られる。
また、上記で得られた１１〜７糖鎖アスパラギン誘導体やジシアロ糖鎖アスパラギン（α２，６−１１糖−Ａｓｎ−Ｆｍｏｃ）を出発原料としそれを糖加水分解することにより得られる１０〜６糖鎖アスパラギン誘導体に、糖転移酵素によりフコースを転移することによりフコースを含む１３〜７糖鎖アスパラギン誘導体が得られる。
当該保護基としては特に限定されるものではなく、例えば、Ｆｍｏｃ基やｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジル基、アリル基、アリルオキシカルボニル基、アセチル基等の、カーボネート系またはアミド系の保護基等を使用することができる。得られた糖鎖アスパラギン誘導体を直ちに所望の糖ペプチドの合成に使用できるという観点から、当該保護基としては、Ｆｍｏｃ基またはＢｏｃ基などが好ましく、Ｆｍｏｃ基がより好ましい。Ｆｍｏｃ基はシアル酸等比較的酸性条件に不安定な糖が糖鎖に存在する場合に特に有効である。また、保護基の導入は公知の方法（たとえば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ ＩＮＣ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９１，ＩＳＢＮ ０−４７１−６２３０１−６を参照）に従って行えばよい。
たとえば、Ｆｍｏｃ基を用いる場合、糖鎖アスパラギンに対しアセトンを適量加えた後、さらに９−フルオレニルメチル−Ｎ−スクシニミヂルカーボネートと炭酸水素ナトリウムを加えて溶解し、２５℃にてアスパラギン残基へのＦｍｏｃ基の結合反応を行うことにより、当該糖鎖アスパラギンのアスパラギン残基にＦｍｏｃ基を導入することができる。
以上の操作により、脂溶性の保護基が導入された糖鎖アスパラギン誘導体が得られる。
シアル酸としては、一般に市販されているシアル酸あるいは化学合成したものを用いることができる。
シアル酸の誘導体としては、一般に市販されているシアル酸の誘導体あるいは化学合成したものを用いることができる。具体的には、シアル酸の７位、８位あるいは９位の炭素に結合している水酸基を水素原子あるいはハロゲン原子で置換したものを挙げることができる。ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素等を挙げることができるが、好ましくはフッ素がよい。
シアル酸転移酵素としては、一般に市販されているもの、天然由来のもの、遺伝子組換えにより生産されたものを用いることができ、転移させるシアル酸あるいはシアル酸の誘導体の種類により適宜選択することができる。具体的には、α２，３転移酵素であるＲａｔ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来のもの、α２，６転移酵素であるＲａｔ Ｌｉｖｅｒ由来のものを挙げることができる。また、シアリターゼをもちいてｐＨ調整等により平衡をずらすことにより、シアル酸あるいはシアル酸の誘導体を転移させてもよい。
上記糖鎖アスパラギン誘導体のクロマトグラフィーによる分離は、適宜、公知のクロマトグラフィーを単独でまたは複数組み合わせて用いることにより行うことができる。
たとえば、得られた糖鎖アスパラギン誘導体混合物をゲル濾過カラムクロマトグラフィーで精製後、ＨＰＬＣを用いて精製する。ＨＰＬＣにおいて用い得るカラムとしては逆相系のカラムが好適であり、たとえば、ＯＤＳ、Ｐｈｅｎｙｌ系、ニトリル系や、陰イオン交換系のカラム、具体的には、たとえば、ファルマシア社製モノＱカラム、イヤトロン社製イアトロビーズカラムなどが利用可能である。分離条件等は適宜、公知の条件を参照して調整すればよい。以上の操作により、糖鎖アスパラギン誘導体混合物から所望の各糖鎖アスパラギン誘導体を得ることができる。
次に、上記で分離された糖鎖アスパラギン誘導体を加水分解することにより、所望の糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体を効率的に得ることができる。たとえば、糖鎖アスパラギン誘導体を分離する段階においては混合物に含まれる糖鎖アスパラギン誘導体の種類を制限して糖鎖アスパラギン誘導体を大まかに分離し、次いで加水分解、たとえば、糖加水分解酵素を用いて加水分解することにより所望の糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体を効率的に得ることができる。なお、加水分解は前記と同様にして行うことができる。特に、所望の糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体をより効率的に得る観点から、糖残基の切断様式が明確な糖加水分解酵素を用いて加水分解するのが好ましい。
たとえば、ガラクトース残基の除去は、加水分解される化合物を緩衝液（たとえば、リン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、グッド緩衝溶液など）に溶かし、公知の条件に従ってガラクトース加水分解酵素を用いてガラクトース残基の切断反応を行うことにより成し得る。なお、加水分解される化合物は各々単離されたものであっても混合物であってもよい。この反応で用いるガラクトース加水分解酵素は市販されている公知のエキソ型の酵素を利用するのが好ましい。また、同様の活性を有するものであれば、新たに単離された酵素、遺伝子工学的に創製された酵素であってもよい。次いで、前記と同様にして、反応後に得られる反応液（糖残基が切断された糖鎖アスパラギン誘導体の混合物）をクロマトグラフィーに供し、各糖鎖アスパラギン誘導体を得ればよい。たとえば、分離はＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８２：１８）で行うのが好ましい。
Ｎ−アセチルグルコサミン残基の除去は、加水分解される化合物を緩衝液（たとえば、リン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、グッド緩衝溶液など）に溶かし、公知の条件に従ってＮ−アセチルグルコサミン加水分解酵素を用いてＮ−アセチルグルコサミン残基の切断反応を行うことにより成し得る。また、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ加水分解酵素を用いてもよい。なお、加水分解される化合物は各々単離されたものであっても混合物であってもよい。この反応で用いる各酵素は市販されているエキソ型の酵素を利用するのが好ましい。また、同様の活性を有するものであれば、新たに単離された酵素、遺伝子工学的に創製された酵素であってもよい。次いで、前記と同様にして、反応後に得られる反応液（糖残基が切断された糖鎖アスパラギン誘導体の混合物）をクロマトグラフィーに供し、各糖鎖アスパラギン誘導体を得ればよい。たとえば、分離はＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：メタノール＝６５：３５または５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８２：１８）で行うのが好ましい。
マンノース残基の除去は、加水分解される化合物を緩衝液（たとえば、リン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、グッド緩衝溶液など）に溶かし、公知の条件に従ってマンノース加水分解酵素を用いてマンノース残基の切断反応を行うことにより成し得る。なお、加水分解される化合物は各々単離されたものであっても混合物であってもよい。この反応で用いるマンノース加水分解酵素は市販されているエキソ型の酵素を利用するのが好ましい。また、同様の活性を有するものであれば、新たに単離された酵素、遺伝子工学的に創製された酵素であってもよい。次いで、前記と同様にして、反応後に得られる反応液（糖残基が切断された糖鎖アスパラギン誘導体の混合物）をクロマトグラフィーに供し、各糖鎖アスパラギン誘導体を得ればよい。たとえば、分離はＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、展開溶媒は、１０〜２００ｍＭ程度の酢酸アンモニウムなどの緩衝溶液とアセトニトリル、あるいはエタノール、あるいはメタノール、あるいはブタノール、あるいはプロパノールなどの脂溶性のある水溶性有機溶剤を適宜混ぜて用いることができる。ここに例示する場合、展開溶媒としては５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８２：１８が好適である）で行うのが好ましい。
このようにして得られた各糖鎖アスパラギン誘導体を得た後、フコースを転移させることにより本発明の脂溶性の保護基でアスパラギンのアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンの非還元末端側のＮ−アセチルグルコサミンに少なくとも１個以上のフコースを含む新規な糖鎖アスパラギン誘導体を製造することができる。
フコースとしては、一般に市販されているフコースあるいは化学合成したものを用いることができる。
フコース転移酵素としては、一般に市販されているもの、天然由来のもの、遺伝子組換えにより生産されたものを用いることができ、転移させるフコースの種類により適宜選択することができる。具体的には、糖鎖アスパラギンの非還元末端側のＮ−アセチルグルコサミンにフコースを転移させる酵素であるＦｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｖ（Ｈｕｍａｎ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、血漿由来、血清由来、乳汁由来、肝臓由来）などを挙げることができる。また、フコース加水分解酵素を用いてｐＨ調整等により平衡ずらすことにより、フコースを転移させてもよい。
上記糖鎖アスパラギン誘導体のクロマトグラフィーによる分離は、適宜、公知のクロマトグラフィーを単独でまたは複数組合せて用いることにより行うことができる。
たとえば、得られた糖鎖アスパラギン誘導体混合物をゲル濾過カラムクロマトグラフィーで精製後、ＨＰＬＣを用いて精製する。ＨＰＬＣにおいて用い得るカラムとしては逆相系のカラムが好適であり、たとえば、ＯＤＳ、Ｐｈｅｎｙｌ系、ニトリル系や、陰イオン交換系のカラム、具体的には、たとえば、ファルマシア社製モノＱカラム、イヤトロン社製イアトロビーズカラムなどが利用可能である。分離条件等は適宜、公知の条件を参照して調整すればよい。以上の操作により、糖鎖アスパラギン誘導体混合物から所望の各糖鎖アスパラギン誘導体を得ることができる。
このように、各糖鎖アスパラギン誘導体を得た後、さらに各種糖加水分解酵素等を用いて当該誘導体を加水分解し、糖鎖の非還元末端の糖残基を除去することにより、たとえば、糖鎖の末端の分岐構造が不均一な様々な糖鎖アスパラギン誘導体をそれぞれ単一化合物として得ることができる。また、種々の糖加水分解酵素を用い、加水分解する順番やその種類を変えることで、より多くの種類の糖鎖アスパラギン誘導体を製造することができる。
従来の方法によれば、極限られた糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体を分析スケールで得るのにさえ膨大な時間とコストが必要であったが、本発明によれば、特別の装置や試薬を必要とすることなく、慣用のゲルろ過カラム、ＨＰＬＣカラムや、少なくとも３種類の糖加水分解酵素（たとえば、ガラクトース加水分解酵素、マンノース加水分解酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン加水分解酵素）等を使って、２週間程度で所望の糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体を１グラム程度調製することが可能である。
本発明では、上記先願で得られた各種の糖鎖アスパラギン、上記先願に記載のないα２，３結合体の糖鎖アスパラギン、並びに（α２，３）（α２，６）結合体の糖鎖アスパラギン、更にはこれらのフコース結合体の糖鎖アスパラギンを用いて、目的とするビオチン化又はＦＩＴＣ化した糖鎖アスパラギン誘導体を得るものである。
本発明は、糖鎖アスパラギンのアミノ基窒素をビオチン化又はＦＩＴＣ化した糖鎖アスパラギンである。
本発明のビオチン化糖鎖アスパラギンとしては、例えば、下記式で表される化合物を挙げることができる。
〔式中、Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、又は式（２）〜（６）で示される基であり、同一でも異なっていてもよい。〕
本発明のＦＩＴＣ化糖鎖アスパラギンとしては、例えば、下記式で表される化合物を挙げることができる。
〔式中、Ｒ１およびＲ２は上記と同じである。〕
また、本発明は、糖鎖アスパラギンのアミノ基窒素をビオチン化又はＦＩＴＣ化したビオチン化又はＦＩＴＣ化糖鎖アスパラギンの製造方法である。
本発明のビオチン化又はＦＩＴＣ化糖鎖アスパラギンの製造方法としては、例えば、上記に示した種々の単離された糖鎖アスパラギンのアスパラギンのアミノ基窒素をビオチン化又はＦＩＴＣ化することにより得ることができる。
本発明で使用される糖鎖アスパラギンとしては、例えば、式（７）で表される化合物を挙げることができる。
（式中、Ｒ１およびＲ２は上記に同じ。）
具体的な糖鎖アスパラギンとしては、先願に記載された化合物を挙げることができる。即ち、先願の第３〜４図に示されたα２，６化合物を同様に用いることができ、記号化したこれら化合物を本発明の表１〜３に示す。
また上記糖鎖アスパラギンを合成するために用いられた糖鎖アスパラギン誘導体としても、先願に記載されたα２，６化合物を挙げることができる。即ち、先願の第１〜２図に示された化合物を同様に用いることができ、記号化したこれら化合物を本発明の表４〜６に示す。
また上記先願に記載された糖鎖アスパラギン以外に、α２，３結合体の糖鎖アスパラギン、並びに（α２，３）（α２，６）結合体の糖鎖アスパラギン、更にはこれらのフコース結合体の糖鎖アスパラギンを用いることができる。
本発明のビオチン化としては、公知の方法に従って行うことができる。例えば、糖鎖アスパラギンを水に溶かし重炭酸ナトリウムを加え、ここに、Ｄ−（＋）−ビオチニルスクシンイミドを溶かしたジメチルホルムアミドを加え、室温で２０分反応させ、ゲルろ過カラム等で精製し、ビオチン化糖鎖アスパラギンを得ることができる。
本発明のビオチン化糖鎖アスパラギンを結合させたマイクロプレートは、市販のアビジン化したマイクロプレート（例えば、ピアス社製）に、ビオチン化した糖鎖アスパラギンを反応させることにより製造することができる。
また、本発明のビオチン化糖鎖アスパラギンを結合させたアフィニティーカラムは、市販のアビジン化したアフィニティーカラムに、ビオチン化した糖鎖アスパラギンを反応させることにより製造することができる。
本発明のＦＩＴＣ化としては、公知の方法に従って行うことができる。例えば、糖鎖アスパラギンを水に溶かし、アセトン、重炭酸ナトリウムを加え、ここに、フルオレセインイソチオシアネートを加え、室温で２時間反応させ、ゲルろ過カラム等で精製し、ＦＩＴＣ化糖鎖アスパラギンを得ることができる。
本発明で得られたＦＩＴＣ化糖鎖アスパラギンは、例えば生体組織中の糖類の受容体の研究、レクチンの糖結合特異性の研究に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下に実施例を挙げて説明するが、本発明は何らこれら実施例に限定されるものではない。なお、１Ｈ−ＮＭＲのデータは、実施例１〜７及び参考例４５については３０℃でＨＯＤを４．８ｐｐｍとして、参考例１〜４４については３０℃で内部標準としてアセトンのメチル基のシグナルを２．２２５ｐｐｍ、ＨＯＤを４．７１８ｐｐｍとして測定して得られた値である。また、Ｆｍｏｃ基が除去された化合物については測定溶媒中に５０ｍＭの炭酸水素アンモニウムを共存させて測定した。
参考例１ ジシアロ糖鎖アスパラギン（化合物２４）の合成
卵由来粗精製ＳＧＰ（シアリルグリコペプチド）２．６ｇをトリス−塩酸・塩化カルシウム緩衝溶液（ＴＲＩＺＭＡ ＢＡＳＥ ０．０５ｍｏｌ／ｌ、塩化カルシウム０．０１ｍｏｌ／ｌ、ｐＨ７．５）１００ｍｌに溶解させた。これにアジ化ナトリウム５８ｍｇ（７７２μｍｏｌ）とアクチナーゼ−Ｅ（科研製薬社製）５２６ｍｇを加え、３７℃で静置した。６５時間後、再びアクチナーゼ−Ｅを２６３ｍｇ加え、更に３７℃で２４時間静置した。この溶液を凍結乾燥した後、残留物をゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、２．５φ×１ｍ、展開溶媒は水、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎ・）で２回精製し、化合物２４を１．３ｇ（５５５μｍｏｌ）得た。
得られた化合物２４の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
５．１５（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０６（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９５（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８２（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６９（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．６７（２Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ１），４．５３（２Ｈ，ｄ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ１），４．３４（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２７（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），４．１９（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），３．０３（１Ｈ，ｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），３．００（１Ｈ，ｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７６（２Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ｅｑ），２．１５（１８Ｈ，ｓ×６，−Ａｃ），１．７９（２Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ａｘ）
参考例２ 化合物１、２、６および１０の合成
参考例１で得られた化合物２４（６０９ｍｇ，２６１μｍｏｌ）を水２０．７ｍｌに溶解させ、さらに０．１規定塩酸１３．８ｍｌを加えた。この溶液を７０℃で３５分間加熱した後速やかに氷冷し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えｐＨ７とした。これを凍結乾燥した後、残留物をゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、２．５φ×１ｍ、展開溶媒は水、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎ・）で精製したところ、化合物２４、化合物２５および２９、化合物３３の混合物５３４ｍｇを得た。この４成分はそれぞれを単離することなく次の工程に進めた。
なお、得られた糖鎖混合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
５．１３（ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．１２（ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０１（ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９４（ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．９３（ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８２（ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６０（ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．５８（ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ１），４．４７（ｄｄ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ１），４．４４（ｄ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ１），４．２４（ｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．１９（ｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），４．１１（ｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），２．９７（ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７２（ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．６４（ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１５（ｓ×５，−Ａｃ），１．７９（ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ３ａｘ）
得られた糖鎖の混合物４２９ｍｇをアセトン１６．３ｍｌと水１１．２ｍｌに溶解させた。ここに９−フルオレニルメチル−Ｎ−スクシニミヂルカーボネート（１５５．７ｍｇ，４６１．７μｍｏｌ）と炭酸水素ナトリウム（８０．４ｍｇ，９５７μｍｏｌ）を加え、室温で２時間攪拌した。この溶液をエバポレーターに供してアセトンを除き、残りの溶液をゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、２．５φ×１ｍ、展開溶媒は水、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎ・）で精製したところ、化合物１、化合物２および６、化合物１０の混合物３０９ｍｇが得られた。この混合物をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：メタノール＝６５：３５、２．０φ×２５ｃｍ、流速３ｍｌ／ｍｉｎ）を用いて精製したところ、５１分後に化合物１が、６７分後に化合物２および６の混合物が、９３分後に化合物１０が溶出した。それぞれを取り分け凍結乾燥を行った後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、２．５φ×３０ｃｍ、展開溶媒は水、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎ・）で脱塩することで目的の化合物２および６の混合物１５０ｍｇを得た。
なお、得られた化合物１の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
７．９９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５５（４Ｈ，ｍ，Ｆｍｏｃ），５．１５（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０６（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９５（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８２（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６９（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．６７（２Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ１），４．５３（２Ｈ，ｄ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ１），４．３４（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２７（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），４．１９（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），３．０３（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），３．００（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７６（２Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ｅｑ），２．１５（１８Ｈ，ｓ×６，−Ａｃ），１．７９（２Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ａｘ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１０３Ｈ１５４Ｎ８ＮａＯ６６［Ｍ＋Ｎａ＋］２５８１．８８３８，ｆｏｕｎｄ，２５８１．８８２１
上記の糖鎖の構造を記号化すると次のようになる。ここで
ＮｅｕＡｃ：シアル酸 Ｇａｌ：Ｄ−ガラクトース ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン Ｍａｎ：Ｄ−マンノース Ａｓｎ：アスパラギン
を示す。
また、得られた化合物２および６の混合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
７．９９（ｄ，Ｆｍｏｃ），７．７９（ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５５（ｍ，Ｆｍｏｃ），５．１４（ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．１２（ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ），５．００（ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９４（ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．９３（ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８２（ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６０（ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．５８（ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ１），４．４６（ｄｄ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ１），４．４４（ｄ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ１），４．２４（ｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．１９（ｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），４．１１（ｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），２．９７（ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７２（ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．６４（ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１５（ｓ×５，−Ａｃ），１．７９（ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ３ａｘ）
また、得られた化合物１０の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
７．９９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５５（４Ｈ，ｍ，Ｆｍｏｃ），５．１２（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０６（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９３（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８２（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６９（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．６７（２Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ１），４．５３（２Ｈ，ｄ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ１），４．３４（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２７（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），４．１９（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），３．０３（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），３．００（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１５（１２Ｈ，ｓ×４，−Ａｃ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ８１Ｈ１２０Ｎ６ＮａＯ５０［Ｍ＋Ｎａ＋］１９９９．６９３０，ｆｏｕｎｄ，１９９９．６９３９
参考例３ 化合物３および７の合成
参考例２で得られた化合物２および６の混合物（２２４ｍｇ，９７μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン２４ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ６．０）２２ｍｌに溶解させ、さらにＤｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来β−ガラクトシダーゼ（１．３５Ｕ）を加えた。この溶液を３７℃で１５時間静置した後、凍結乾燥を行った。残留物をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８５：１５、流速３ｍｌ／ｍｉｎ）で精製したところ、１２９分後に化合物３が、１３４分後に化合物７が溶出した。それぞれを取り分け、凍結乾燥を行った。続いてＨＰＬＣ〔ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は最初の１５分間が水、１６分後から３０分後までは水：アセトニトリル（容量比）＝１０：０から８５：１５、３１分後から４５分後までは水：アセトニトリル＝８５：１５から８０：２０になるようにグラジエントを掛けた。流速は３．０ｍｌ／ｍｉｎ・〕を用いて脱塩処理を行ったところ、目的とする化合物３が８１ｍｇ、化合物７が７５ｍｇ得られた。
なお、得られた化合物３の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
７．９９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５５（４Ｈ，ｍ，Ｆｍｏｃ），５．１５（１Ｈ，Ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０６（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９５（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８２（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６９（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．６７（２Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ１），４．５３（１Ｈ，ｄ，Ｇａｌ６’−Ｈ１），４．３４（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２７（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），４．１９（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），２．９７（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７６（１Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ３ｅｑ），２．６１（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１５（１５Ｈ，ｓ×５，−Ａｃ），１．７９（１Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ３ａｘ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ８６Ｈ１２７Ｎ７ＮａＯ５３［Ｍ＋Ｎａ＋］２１２８．７３５６，ｆｏｕｎｄ，２１２８．７３６３
また、得られた化合物７の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
７．９９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５５（４Ｈ，ｍ，Ｆｍｏｃ），５．１５（１Ｈ，Ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０６（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９５（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８２（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６９（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．６７（２Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ１），４．５３（１Ｈ，ｄ，Ｇａｌ６−Ｈ１），４．３４（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２７（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），４．１９（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），２．９７（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７６（１Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．６０（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１５（１５Ｈ，ｓ×５，−Ａｃ），１．７９（１Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ８６Ｈ１２５Ｎ７Ｎａ３Ｏ５３［Ｍ＋Ｎａ＋］２１７２．６９９５，ｆｏｕｎｄ，２１７２．７０８４
参考例４ 化合物４および８の合成
参考例３で得られた化合物３および７の混合物（９０ｍｇ，４７．３μｍｏｌ）をそれぞれ分離することなく、ウシ血清アルブミン８ｍｇと共にＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ６．０）８．１ｍｌに溶解させ、さらにＢｏｖｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ由来β−グルコサミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｂｏｖｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ）を２．８８Ｕ加えた。この溶液を３７℃で１８時間静置した後凍結乾燥し、残留物をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：メタノール＝６５：３５、流速３ｍｌ／ｍｉｎ）で精製したところ、１１７分後に化合物４が、１２７分後に化合物８が溶出した。それぞれを取り分け、凍結乾燥を行った。続いてＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は最初の１５分間が水、１６分後から３０分後までは水：アセトニトリル＝１０：０から８５：１５、３１分後から４５分後までは水：アセトニトリル＝８５：１５から８０：２０になるようにグラジエントを掛けた。流速は３．０ｍｌ／ｍｉｎ・）を用いて脱塩処理を行ったところ、目的とする化合物４が４０ｍｇ、化合物８が３７ｍｇ得られた。
なお、得られた化合物４の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
８．０１（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．８０（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５６（４Ｈ，ｍ，Ｆｍｏｃ），５．２２（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０８（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９４（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８４（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６９（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．６７（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５−Ｈ１），４．５５（１Ｈ，ｄ，Ｇａｌ６−Ｈ１），４．３３（１Ｈ，ｄｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２０（１Ｈ，ｄｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．１５（１Ｈ，ｄｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），２．９７（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７６（２Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ｅｑ），２．６２（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１５（１２Ｈ，ｓ×４，−Ａｃ），１．７９（２Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ａｘ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ７８Ｈ１１４Ｎ６ＮａＯ４８［Ｍ＋Ｎａ＋］１９２５．６５６２，ｆｏｕｎｄ，１９２５．６５３９
また、得られた化合物８の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
７．９９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５５（４Ｈ，ｍ，Ｆｍｏｃ），５．１５（１Ｈ，Ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０６（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９５（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８２（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６９（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．６７（２Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ１），４．５３（２Ｈ，ｄ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ１），４．３４（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２７（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），２．９７（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ２），２．７６（１Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ３ｅｑ），２．６１（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ２），２．１５（１２Ｈ，ｓ×４，−Ａｃ），１．７９（１Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ３ａｘ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ７８Ｈ１１４Ｎ６ＮａＯ４８［Ｍ＋Ｎａ＋］１９２５．６５６２，ｆｏｕｎｄ，１９２５．６５３３
参考例５ 化合物５の合成
参考例４で得られた化合物４（３０ｍｇ，４７３μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン３ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ６．０）６ｍｌに溶解させ、さらにＪａｃｋ Ｂｅａｎｓ由来α−マンノシダーゼを１０Ｕ加えた。この溶液を３７℃で２１時間静置した後凍結乾燥し、続いてＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は最初の１５分間が水、１６分後から３０分後までは水：アセトニトリル＝１０：０から８５：１５、３１分後から４５分後までは水：アセトニトリル＝８５：１５から８０：２０になるようにグラジエントを掛けた。流速は３．０ｍｌ／ｍｉｎ・）を用いて精製したところ、目的とする化合物５が２０ｍｇ得られた。
なお、得られた化合物５の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
８．０１（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．８０（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５６（４Ｈ，ｍ，Ｆｍｏｃ），５．００（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９５（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８４（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６７（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．５６（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５−Ｈ１），４．４４（１Ｈ，ｄ，Ｇａｌ６−Ｈ１），４．１１（１Ｈ，ｄｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），４．０７（１Ｈ，ｄｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），２．９７（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７６（１Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ３ｅｑ），２．６２（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１５（１２Ｈ，ｓ×４，−Ａｃ），１．７９（２Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ３ａｘ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ７２Ｈ１０４Ｎ６ＮａＯ４３［Ｍ＋Ｎａ＋］１７６３．６０３４，ｆｏｕｎｄ，１７６３．６０７４
参考例６ 化合物９の合成
参考例４で得られた化合物８（４０ｍｇ，６３０μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン５ｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ６．０）７．８ｍｌに溶解させ、Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ由来α−マンノシダーゼを３８Ｕ加えた。この溶液を３７℃で６３時間静置した後凍結乾燥し、続いてＨＰＬＣＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は最初の１５分間が水、１６分後から３０分後までは水：アセトニトリル＝１０：０から８５：１５、３１分後から４５分後までは８５：１５から８０：２０になるようにグラジエントを掛けた。流速は３．０ｍｌ／ｍｉｎ）を用いて精製したところ、目的とする化合物９が３０ｍｇ得られた。
なお、得られた化合物９の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
８．０１（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．８０（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５６（４Ｈ，ｍ，Ｆｍｏｃ），５．２３（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０８（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．５３（１Ｈ，ｄ，Ｇａｌ６−Ｈ１），４．３２（１Ｈ，ｄｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２８（１Ｈ，ｄｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），２．８１（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７６（１Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．５９（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１３（１２Ｈ，ｓ×４，−Ａｃ），１．８０（１Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７Ｈ３ａｘ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ７２Ｈ１０４Ｎ６ＮａＯ４３［Ｍ＋Ｎａ＋］１７６３．６０３４，ｆｏｕｎｄ，１７６３．６０４１
参考例７ Ｆｍｏｃ基の脱保護（化合物３３の合成）
参考例２で得られた化合物１０（１０．５ｍｇ，５．２７μｍｏｌ）を５０％モルホリン／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液１．４ｍｌに溶解させ、室温・アルゴン雰囲気下で２時間反応させた。この溶液にトルエン３ｍｌを加え、３５℃でエバポレーターに供した。この操作を三回繰り返し、反応溶媒を取り除いた。残留物をゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、２．５φ×３０ｃｍ、展開溶媒は水、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎ・）で精製したところ、目的とする化合物３３が７ｍｇ得られた（収率は７６％）。なお、得られた化合物の構造は、参考例２から得られる化合物３３と１Ｈ−ＮＭＲスペクトルが一致したことから確認した。
化合物３３の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．１２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ−１），４．５８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ−１），４．４７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ−１），４．２４（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１９（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１．４Ｈｚ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），４．１２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１．４Ｈｚ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．９３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，１７．０Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．９３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１７．０Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），２．０５（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），２．０１（ｓ，３Ｈ，Ａｃ）
参考例８ 化合物１４の合成
化合物３（２８ｍｇ，２１．３μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１．０ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，４５４μＬ）に溶解させ、ノイラミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｖｉｂｌｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ，１９８ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で２０時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。反応溶液をＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物１４（１７ｍｇ，収率７０％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ７．９１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．７１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．５１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．１２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），４．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．５８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ−１），４．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ５’−Ｈ−１），４．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｇａｌ６’−Ｈ−１），４．３４（ｔ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２４（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１８（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，３．３Ｈｚ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），４．１１（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，３．５Ｈｚ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），２．７２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１５．７Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．５２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１５．７Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０６，２．０５，２．０４，１．８９（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ７５Ｈ１１０Ｎ６ＮａＯ４５［Ｍ＋Ｎａ＋］１８３７．６４０２，ｆｏｕｎｄ １８３７．６４７１
参考例９ 化合物１９の合成
化合物７（２０ｍｇ，９．４μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１．６ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，３２３μＬ）に溶解させ、ノイラミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｖｉｂｌｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ，１４１ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で１８時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。続いてＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物１９（１３ｍｇ，収率７６％）を得た。得られた化合物の構造は１Ｈ−ＮＭＲが標品と一致したことから確認した。
参考例１０ 化合物１５の合成
化合物４（４５ｍｇ，２４μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１．７ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，８２０μＬ）に溶解させ、ノイラミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｖｉｂｌｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ，１３４ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で１４時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。続いて、反応溶液をＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物１５（２８ｍｇ，収率７４％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ７．９２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．７１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．５１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４４（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．１０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），４．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．５８（ｄ，２Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５’−Ｈ−１），４．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｇａｌ６’−Ｈ−１），４．３５（ｔ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２４（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１１（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），４．０７（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．７２（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．５２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０６，２．０４，１．８９（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ６７Ｈ９７Ｎ５ＮａＯ４０［Ｍ＋Ｎａ＋ １６３４．５６０８，ｆｏｕｎｄ，１６３４．５５６４
参考例１１ 化合物７０の合成
化合物１５（１１ｍｇ，６．８μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１．５ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，２６９μＬ）に溶解させ、β−ガラクトシダーゼ（生化学工業社製、ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ，１１μＬ，２７５ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で１４時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。反応溶液をＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物７０（６．３ｍｇ，収率６４％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ７．９１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．７０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．５０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．１０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），４．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．５５（ｄ，２Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５’−Ｈ−１），４．３２（ｔ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２４（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１０（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），４．０６（ｂｓ，１Ｈ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），２．７２（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．０Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．５２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，１４．８Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０６，２．０５，１．８９（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ６１Ｈ８８Ｎ５Ｏ３５［Ｍ＋Ｈ＋］１４５０．５，ｆｏｕｎｄ，１４５０．４
参考例１２ 化合物２０の合成
化合物８（４７ｍｇ，２５μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１．９ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，８４０μＬ）に溶解させ、ノイラミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｖｉｂｌｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ，３６９ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で３７時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。反応溶液を凍結乾燥し、続いてＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物２０（２６ｍｇ，収率６５％）を得た。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ７．９２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．７１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．５１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．１２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），４．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．５７（ｂｄ，２Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５’−Ｈ−１），４．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｇａｌ６’−Ｈ−１），４．３４（ｔ，３Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２４（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），４．１９（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．７２（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．５２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０６，２．０５，１．８９（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ６７Ｈ９７Ｎ５ＮａＯ４０［Ｍ＋Ｎａ＋］１６３４．５６０８，ｆｏｕｎｄ，１６３４．５６４４
参考例１３ 化合物７１の合成
化合物２０（１２ｍｇ，７．４μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１．０ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，３３０μＬ）に溶解させ、β−ガラクトシダーゼ（生化学工業社製、ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ，１２μＬ，２９７ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で４６時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。反応溶液をＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ。最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物７１（６．６ｍｇ，収率６１％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ７．９０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．７０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４９（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４２（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．１１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），４．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．５５（ｄ，２Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５−Ｈ−１），４．３１（ｂ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２４（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１８（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），３．９７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，３．３Ｈｚ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），２．７２（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．５２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−ββＣＨ），２．０６，２．０５，１．８８（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ６１Ｈ８８Ｎ５Ｏ３５［Ｍ＋Ｈ＋］１４５０．５，ｆｏｕｎｄ，１４５０．３
参考例１４ 化合物１６の合成
化合物５（３２ｍｇ，１８．４μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン２．５ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，７１３μＬ）に溶解させ、ノイラミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｖｉｂｌｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ，１３４ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で１７時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。続いて、反応溶液をＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物１６（１３ｍｇ，収率５２％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ７．９２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．７１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．５１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４４（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７５（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．５８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２，５’−Ｈ−１），４．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｇａｌ６’−Ｈ−１），４．３４（ｔ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．１０（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．０７（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），２．７２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．５２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０７，２．０５，１．８９（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ６１Ｈ８８Ｎ５Ｏ３５［Ｍ＋Ｈ＋］１４５０．５，ｆｏｕｎｄ，１４５０．３
参考例１５ 化合物１７の合成
化合物１６（９ｍｇ，６．２μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１．６ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，６１３μＬ）に溶解させ、β−ガラクトシダーゼ（生化学工業社製、ｆｒｏｍ−Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ，１８６ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で３２時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。反応溶液をＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物１７（５．４ｍｇ，収率６８％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ７．８９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．６８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４９（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４２（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），４．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２，５’−Ｈ−１），４．０９，４．０７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２，Ｍａｎ３−Ｈ−２），２．７２（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．５６（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０７，２．０５，１．８９（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ５５Ｈ７７Ｎ５ＮａＯ３０［Ｍ＋Ｎａ＋］１３１０．５，ｆｏｕｎｄ，１３１０．２
参考例１６ 化合物１８の合成
化合物１７（３．４ｍｇ，２．６μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１．１ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，２５７μＬ）に溶解させ、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（シグマアルドリッチ ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ，１４４ｍＵ），加えた。この溶液を３７℃で２４時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。反応溶液をＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ。最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物１８（２．１ｍｇ，収率７５％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ７．９１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．７１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．５１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．５８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ−１），４．３４（ｔ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），３．９７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，３．７Ｈｚ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），２．７２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１５．１Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．５２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１５．１Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０７，１．８９（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４７Ｈ６５Ｎ４Ｏ２５［Ｍ＋Ｎａ＋］１０８５．４，ｆｏｕｎｄ，１０８５．３
参考例１７ 化合物２１の合成
化合物９（２８ｍｇ，１６μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１．７ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，６２４μＬ）に溶解させ、ノイラミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｖｉｂｌｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ，１１７ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で１７時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。続いて、反応溶液をＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ。最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物２１（１４．６ｍｇ，収率６８％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ７．９２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．７１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．５０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．１２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），４．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．７７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．５７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ−１），４．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｇａｌ６−Ｈ−１），４．３４（ｔ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２２（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１９（ｂ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．７２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．５２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０５（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），１．８９（ｓ，３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ６１Ｈ８８Ｎ５Ｏ３５［Ｍ＋Ｈ＋］１４５０．５，ｆｏｕｎｄ，１４５０．３
参考例１８ 化合物２２の合成
化合物２１（１０ｍｇ，６．９μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１．６ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，６７２μＬ）に溶解させ、β−ガラクトシダーゼ（生化学工業社製、ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ，２０５ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で２０時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。反応溶液をＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物２２（５．６ｍｇ，収率６４％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ７．８７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．６７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４８（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．１２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），４．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．７６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．５５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２，５−Ｈ−１），４．２６（ｔ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１８（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，３．３Ｈｚ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．７２（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．５４（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０５（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），１．８８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ５５Ｈ７８Ｎ５Ｏ３０［Ｍ＋Ｈ＋］１２８８．５，ｆｏｕｎｄ，１２８８．３
参考例１９ 化合物２３の合成
化合物２２（３．６ｍｇ，２．８μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１．２ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，２７７μＬ）に溶解させ、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（シグマアルドリッチ ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ，１９５ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で２４時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。反応溶液をＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物２３（２．３ｍｇ，収率７７％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ７．９１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．７０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．５０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．１１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），４．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．７７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．５７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ−Ｈ−１），４．３３（ｔ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．０７（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．７２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．５２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０５，１．８９（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４７Ｈ６５Ｎ４Ｏ２５［Ｍ＋Ｈ＋］１０８５．４，ｆｏｕｎｄ，１０８５．３
参考例２０ 化合物１１の合成
化合物１０（１２３ｍｇ，６２μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン（１．１ｍｇ）をＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，２．５ｍＬ）に溶解させ、β−ガラクトシダーゼ（生化学工業社製、ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ，２４μＬ，６１２ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で６１時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。反応溶液を凍結乾燥し、続いてＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速３．５ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ。最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物１１（７１ｍｇ，収率７０％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ７．９１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．７１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．５０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．１１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），４．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．５５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２，５−Ｈ−１），４．３４（ｔ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２４（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１８（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），４．１０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），２．７２（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．５１（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０６（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），２．０５（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），１．８８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ６９Ｈ１００Ｎ６ＮａＯ４０［Ｍ＋Ｎａ＋］１６７５．５８７３，ｆｏｕｎｄ，１６７５．５８４１
参考例２１ 化合物１２の合成
化合物１１（５０ｍｇ，３０μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン２．０ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，９２０μＬ）に溶解させ、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ，２．１Ｕ）を加えた。この溶液を３７℃で４８時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。反応溶液をＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製し、凍結乾燥を行った。この残留物をＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物１２（２５ｍｇ，収率６６％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ７．９１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．７０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．５０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．１０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），４．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９１（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．５８〜４．５２（ｂ，１Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ−１），４．３３（ｔ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２４（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．０６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，３．２Ｈｚ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），３．９７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，３．５Ｈｚ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），２．７２（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．５３（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０５，１．８８（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ），
参考例２２ 化合物１３の合成
化合物１２（１０ｍｇ，１１μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン０．９ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，４４０μＬ）に溶解させ、α−マンノシダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ，３０μＬ，３．２Ｕ）を加えた。この溶液を３７℃で２１時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。続いてＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製を行った。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物１３（３ｍｇ，収率４３％）を得た。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ７．９２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．７１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．５１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），４．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．７６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．５７（１Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ−１），４．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），２．７２（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．５２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０５，１．８９（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ），
（糖鎖アスパラギン誘導体のＦｍｏｃ基の脱保護）
全ての糖鎖アスパラギン誘導体において、以下の手順でＦｍｏｃ基の脱保護を行った。まず、糖鎖アスパラギンＦｍｏｃ体１μｍｏｌあたりに２４０μＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、１６０μＬのモルホリンを加え、室温・アルゴン雰囲気下で反応させた。ＴＬＣ（展開溶媒として１Ｍ 酢酸アンモニウム：イソプロパノール＝８：５を用いた）にて反応終了を確認した後、氷水で冷却した。ここにジエチルエーテルを反応溶液の１０倍量加えて１５分間攪拌した後、析出した沈殿物をろ別した。得られた残渣を水に溶解させ、３５℃でエバポレートした。更にトルエンを３ｍＬ加えエバポレートするという操作を三回繰り返した。残留物を逆相カラムクロマトグラフィー（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、展開溶媒は水）により精製した。
参考例２３ 化合物３３の合成
化合物１０（１０．５ｍｇ，５．３μｍｏｌ）を上記の操作で７時間反応させたところ、目的とする化合物３３（７ｍｇ，収率７６％）が得られた。得られた化合物は１Ｈ−ＮＭＲが標品と一致したことから確認した。
参考例２４ 化合物２６の合成
化合物３（８．０ｍｇ，３．８μｍｏｌ）を上記の操作で２１時間反応させたところ、目的とする化合物２６（６．３ｍｇ，収率８８％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．１３（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９５（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７８（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６２（２Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５’−Ｈ−１），４．５６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ５−Ｈ−１），４．５２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｇａｌ６’−Ｈ−１），４．２５（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１９（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），４．１２（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．９４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，１７．０Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．８５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１７．０Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．６８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１２．４Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ−３ｅｑ），２．０８，２．０７，２．０６，２．０４，２．０２（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ），１．７２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ，１２．１Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ−３ａｘ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ７１Ｈ１１８Ｎ７Ｏ５１［Ｍ＋Ｈ＋］１８８４．７，ｆｏｕｎｄ，１８８４．５
参考例２５ 化合物２７の合成
化合物４（１１．０ｍｇ，５．８μｍｏｌ）を上記の操作で２３時間反応させたところ、目的とする化合物２７（８．５ｍｇ，収率８８％）で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．１１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９５（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７８（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６２（ｄ，２Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５’−Ｈ−１），４．４５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｇａｌ６’−Ｈ−１），４．２６（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１２（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），４．０８（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，３．３Ｈｚ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．９４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１７．２Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．８５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１７．２Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．６８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，１２．１Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ−３ｅｑ），２．０９，２．０７，２．０４，２．０２（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ），１．７２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ，１２．１Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ−３ａｘ），；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ６３Ｈ１０４Ｎ６ＮａＯ４６［Ｍ＋Ｎａ＋］１７０３．６，ｆｏｕｎｄ，１７０３．１
参考例２６ 化合物２８の合成
化合物５（７．０ｍｇ，４．０μｍｏｌ）を上記の操作で２１時間反応させたところ、目的とする化合物２８（５．３ｍｇ，収率８７％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９４（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６１，４．５９（ｅａｃｈ ｄ，ｅａｃｈ １Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５’−Ｈ−１），４．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｇａｌ６’−Ｈ−１），４．１０，４．０７（ｅａｃｈ １Ｈ，Ｍａｎ４’，３−Ｈ−２），２．９３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１７．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．８５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１７．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．６７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１２．２Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ−３ｅｑ），２．０８，２．０６，２．０２，２．０１（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ），１．７１（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ，１２．２Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ−３ａｘ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ５７Ｈ９４Ｎ６ＮａＯ４１［Ｍ＋Ｎａ＋］１５４１．５，ｆｏｕｎｄ，１５４１．３
参考例２７ 化合物３０の合成
化合物７（１３．９ｍｇ，６．６μｍｏｌ）を上記の操作で７時間反応させたところ、目的とする化合物３０（８．０ｍｇ，収率６４％）を得た。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．１３（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’―Ｈ−１），４．７７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６１，４．６０（ｅａｃｈ ｄ，ｅａｃｈ １Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２，５−Ｈ−１），４．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ５’−Ｈ−１），４．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｇａｌ６−Ｈ−１），４．２４（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１９（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，３．２Ｈｚ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），４．１０（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，３．２Ｈｚ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．９０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，１６．７Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．８０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１６．７Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．６６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１２．４Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ−３ｅｑ），２．０７，２．０６，２．０５，２．０２，２．０１（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ），１．７１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，１２．４Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ−３ａｘ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ７１Ｈ１１７Ｎ７ＮａＯ５１［Ｍ＋Ｎａ＋］１９０６．７，ｆｏｕｎｄ，１９０６．１
参考例２８ 化合物３１の合成
化合物８（８．０ｍｇ，４．２μｍｏｌ）を上記の操作で１２時間反応させたところ、目的とする化合物３１（６．０ｍｇ，収率８６％）を得た。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．１２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６１，４．５９（ｅａｃｈ ｄ，ｅａｃｈ １Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５−Ｈ−１），４．４３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｇａｌ６−Ｈ−１），４．２４（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１８（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），２．９１（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝１７．０Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．８１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１７．０Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．６６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１２．６Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ−３ｅｑ），２．０６，２．０６，２．０２，２．００（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ），１．７０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．６Ｈｚ，１２．６Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ−３ａｘ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ６３Ｈ１０４Ｎ６ＮａＯ４６［Ｍ＋Ｎａ＋］１７０３．６，ｆｏｕｎｄ，１７０３．０
参考例２９ 化合物３２の合成
化合物９（７．７ｍｇ，４．４μｍｏｌ）を上記の操作で２３時間反応させたところ、目的とする化合物３２（５．２ｍｇ，収率７８％）で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．１４（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．７８（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６１，４，６０（ｅａｃｈ ｄ，ｅａｃｈ １Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５−Ｈ−１），４．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｇａｌ６−Ｈ−１），４．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１９（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，２．９Ｈｚ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．９２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，１７．２Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１２．７Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．６７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１２．７Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ−３ｅｑ），２．０６（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），２．０３，２．０１（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ），１．７１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ，１２．７Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ−３ａｘ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ５７Ｈ９４Ｎ６ＮａＯ４１［Ｍ＋Ｎａ＋］１５４１．５，ｆｏｕｎｄ，１５４１．２
参考例３０ 化合物３７の合成
化合物１４（９．１ｍｇ，５．０μｍｏｌ）を上記の操作で１３時間反応させたところ、目的とする化合物３７（６．５ｍｇ，収率７７％）で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．１１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７５（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６１，４．５７，４．５５（ｅａｃｈ ｄ，ｅａｃｈ １Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２，５，５’−Ｈ−１），４．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，Ｇａｌ６’−Ｈ−１），４．２３（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１８（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），４．１０（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．８７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１７．０Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１７．０Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０７（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），２．０４（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），２．００（ｓ，３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ６０Ｈ１００Ｎ６ＮａＯ４３［Ｍ＋Ｎａ＋］１６１５．６，ｆｏｕｎｄ，１６１５．０
参考例３１ 化合物４２の合成
化合物１９（９．８ｍｇ，５．４μｍｏｌ）を上記の操作で１３時間反応させたところ、目的とする化合物４２（８．０ｍｇ，収率８８％）で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．１１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６０，４．５７，４．５５（ｅａｃｈ ｄ，ｅａｃｈ １Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５，５’−Ｈ−１），４．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｇａｌ６−Ｈ−１），４．２８（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１８（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），４．１０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．８８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１６．６Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１６．６Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０７（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），２．０４（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），２．００（ｓ，３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ６０Ｈ１０１Ｎ６Ｏ４３［Ｍ＋Ｈ＋］１５９３．６，ｆｏｕｎｄ，１５９３．８
参考例３２ 化合物３８の合成
化合物１５（５．１ｍｇ，３．２μｍｏｌ）を上記の操作で１１時間反応させたところ、目的とする化合物３８（４．０ｍｇ，収率９１％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．１０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６１，４．５７（ｅａｃｈ ｄ，ｅａｃｈ １Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２，５’−Ｈ−１），４．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｇａｌ６’−Ｈ−１），４．２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１０，４．０６（ｅａｃｈ ｂｄ，ｅａｃｈ １Ｈ，Ｍａｎ４’，４−Ｈ−２），２．９０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，１６．８Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．８１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１６．８Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０７，２．０４，２．０１（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ５２Ｈ８８Ｎ５Ｏ３８［Ｍ＋Ｈ＋］１３９０．５，ｆｏｕｎｄ，１３９０．１
参考例３３ 化合物７２の合成
化合物７０（４．０ｍｇ，２．８μｍｏｌ）を上記の操作で１３時間反応させたところ、目的とする化合物７２（２．９ｍｇ，収率８５％）で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．０９（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６１，４．５４（ｅａｃｈ ｄ，ｅａｃｈ １Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５−Ｈ−１），４．２４（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１０，４．０６（ｅａｃｈ ｂｓ，ｅａｃｈ １Ｈ，Ｍａｎ４，４’−Ｈ−２），２．８７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１７．２Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１７．２Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０７，２．０４，２．００（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４６Ｈ７８Ｎ５Ｏ３３［Ｍ＋Ｈ＋］１２２８．５，ｆｏｕｎｄ，１２２８．３
参考例３４ 化合物４３の合成
化合物２０（５．４ｍｇ，３．３μｍｏｌ）を上記の操作で１１時間反応させたところ、目的とする化合物４３（４．１ｍｇ，収率８７％）で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．１１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６１，４．５７（ｅａｃｈ ｄ，ｅａｃｈ １Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５−Ｈ−１），４．４６（ｄ，１Ｈ，Ｇａｌ６−Ｈ−１），４．２４（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１８（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．９０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１７．０Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．８０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１７．０Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０７，２．０４，２．０１（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ５２Ｈ８８Ｎ５Ｏ３８［Ｍ＋Ｈ＋］１３９０．５，ｆｏｕｎｄ，１３９０．２
参考例３５ 化合物７３の合成
化合物７１（４．０ｍｇ，２．８μｍｏｌ）を上記の操作で１３時間反応させたところ、目的とする化合物７３（２．９ｍｇ，収率８５％）で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．１１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６０，４．５４（ｅａｃｈ ｄ，ｅａｃｈ １Ｈ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２，５−Ｈ−１），４．２４（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１．６Ｈｚ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），３．９６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１．６Ｈｚ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．８８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，１６．８Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１６．８Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０６，２．０４，２．００（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４６Ｈ７８Ｎ５Ｏ３３［Ｍ＋Ｈ＋］１２２８．５，ｆｏｕｎｄ，１２２８．３
参考例３６ 化合物３９の合成
化合物１６（２．２ｍｇ，１．５μｍｏｌ）を上記の操作で７時間反応させたところ、目的とする化合物３９（１．６ｍｇ，収率８４％）で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７５（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６２，４．５８（ｅａｃｈ ｄ，ｅａｃｈ １Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５−Ｈ−１），４．０９，４．０８（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ １Ｈ，Ｍａｎ３，４’−Ｈ−２），２．９１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，１６．９Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．８１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１６．９Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０８，２．０４，２．０１（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４６Ｈ７７Ｎ５ＮａＯ３３［Ｍ＋Ｎａ＋］１２５０．４，ｆｏｕｎｄ，１２５０．３
参考例３７ 化合物４０の合成
化合物１７（１．５ｍｇ，１．２μｍｏｌ）を上記の操作で１４時間反応させたところ、目的とする化合物４０（１．１ｍｇ，収率８９％）で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６２，４．５５（ｅａｃｈ ｄ，ｅａｃｈ １Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５−Ｈ−１），４．１０，４．０７（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ １Ｈ，Ｍａｎ４’，３−Ｈ−２），２．８９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１７．０Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１７．０Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０７，２．０５，２．０１（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４０Ｈ６７Ｎ５ＮａＯ２８［Ｍ＋Ｎａ＋］１０８８．４，ｆｏｕｎｄ，１０８８．２
参考例３８ 化合物４１の合成
化合物１８（１．３ｍｇ，１．２μｍｏｌ）を上記の操作で１４時間反応させたところ、目的とする化合物４１（０．８ｍｇ，収率８０％）で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ−１），４．０８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），２．９２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，１７．３Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１７．３Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０７，２．０１（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３２Ｈ５５Ｎ４Ｏ２７［Ｍ＋Ｈ＋］８６３．３，ｆｏｕｎｄ ８６３．２
参考例３９ 化合物４４の合成
化合物２１（２．３ｍｇ，１．６μｍｏｌ）を上記の操作で７時間反応させたところ、目的とする化合物４４（１．６ｍｇ，収率８４％）で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．１１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．７７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６１，４．５７（ｅａｃｈ ｄ，ｅａｃｈ １Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５−Ｈ−１），４．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｇａｌ−Ｈ−１），４．２２，４．１８（ｅａｃｈ ｂｓ，ｅａｃｈ １Ｈ，Ｍａｎ３，４−Ｈ−２），２．９１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，１７．３Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．８２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１７．３Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０５，２．０４，２．０１（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４６Ｈ７８Ｎ５Ｏ３３［Ｍ＋Ｈ＋］１２２８．５，ｆｏｕｎｄ，１２２８．３
参考例４０ 化合物４５の合成
化合物２２（１．６ｍｇ，１．３μｍｏｌ）を上記の操作で１４時間反応させたところ、目的とする化合物４５（１．１ｍｇ，収率８５％）で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．１２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．７７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６１，４．５４（ｅａｃｈ ｄ，ｅａｃｈ １Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５−Ｈ−１），４．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，３．０Ｈｚ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），２．８９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，１６．９Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１６．９Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０６，２．０５，２．０１（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４０Ｈ６７Ｎ５ＮａＯ２８［Ｍ＋Ｎａ＋］１０８８．４，ｆｏｕｎｄ，１０８８．３
参考例４１ 化合物４６の合成
化合物２３（１．６ｍｇ，１．５μｍｏｌ）を上記の操作で１４時間反応させたところ、目的とする化合物４６（１．１ｍｇ，６．４μｍｏｌ，収率８５％）で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．１０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．７７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ−１），４．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．０７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，３．０Ｈｚ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），２．９０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，１７．０Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．８０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１７．２Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０５，２．０１（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３２Ｈ５５Ｎ４Ｏ２３［Ｍ＋Ｈ＋］８６３．３，ｆｏｕｎｄ ８６３．３
参考例４２ 化合物３４の合成
化合物１１（１２．４ｍｇ，７．５μｍｏｌ）を上記の操作で１１時間反応させたところ、目的とする化合物３４（９．２ｍｇ，収率８６％）で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．１１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ−１），４．５５（ｄ，２Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ−１），４．２４（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１８（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），４．１０（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．８０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．８Ｈｚ，１５．６Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．６３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１５．６Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０７（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），２．０５（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），２．０１（ｓ，３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ５４Ｈ９０Ｎ６ＮａＯ３８［Ｍ＋Ｎａ＋］１４５３．５，ｆｏｕｎｄ，１４５３．２
参考例４３ 化合物３５の合成
化合物１２（１２．０ｍｇ，８．４μｍｏｌ）を上記の操作で１１時間反応させたところ、目的とする化合物３５（７．０ｍｇ，収率８１％）で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．１０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７８（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ−１），４．２５（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．０６（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），３．９７（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．７９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１７．０Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．６１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１７．０Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０７，２．０１（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３８Ｈ６５Ｎ４Ｏ２８［Ｍ＋Ｈ＋］１０２５．４，ｆｏｕｎｄ，１０２５．２
参考例４４ 化合物３６の合成
化合物１３（８．４μｍｏｌ）を上記の操作で１１時間反応させたところ、目的とする化合物３６で得られた。
参考例４５ 化合物７６、７７の合成および単離
化合物２及び化合物６の混合物（５．０ｍｇ，２．２μｍｏｌ）を２２０μＬの水に溶解させ、２２ｍＭの炭酸セシウム水溶液を１００μＬ加え、ｐＨ７．０とした。この溶液を凍結乾燥した。乾燥後の固形物にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを４３０μＬ加え、更に６．６μｍｏｌのベンジルブロマイド／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液を２０μＬ加えた。この溶液をアルゴン雰囲気下で攪拌した。４８時間後、ＴＬＣ（展開溶媒は１Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ：イソプロパノール＝１：２を用いた）にて原料の消失を確認した後、４．４ｍＬのジエチルエーテルを加えて化合物を沈殿させた。沈殿した糖鎖を濾過し、残った糖鎖を水に溶解させ凍結乾燥した。凍結乾燥後の残留物を分取ＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝７８：２２、流速４．０ｍＬ／ｍｉｎ）で精製したところ、８８分後に化合物７７が、９１分後に化合物７６が溶出した。それぞれを取り分け、更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、化合物２のベンジル体が１．６ｍｇ、化合物６のベンジル体が１．８ｍｇ得られた。
化合物２のベンジル体（１０糖、１３．６ｍｇ、５．８ｍｍｏｌ）を、氷冷下にＮａＯＨａｑ．（ｐＨ＝１２）１．４ｍｌに溶解させた。反応をＨＰＬＣでモニターしながら約８時間撹拌した。反応の進行が終了した時点で、反応液を４０ｍＭ ＨＣｌにてｐＨ＝７．０に調整した。中和後の液を、メンブランフィルターで濾過した後、濃縮、次いでＨＰＬＣ（ＹＭＣ− Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＭ，ＳＨ−３４３−５ＡＭ，２０×２５０ｍｍ，ＡＮ／２５ｍＭ ＡｃＯＮＨ４ ｂｕｆｆｅｒ＝２０／８０，７．０ｍｌ／ｍｉｎ．，ｗａｖｅ ｌｅｎｇｔｈ；２７４ｎｍ）にて分取・精製を行った。分取した液を濃縮後、ＯＤＳカラム（コスモシール ７５Ｃ１８−ＯＰＮ，ナカライテスク社製）にて脱塩処理を行い、濃縮、凍結乾燥を行うと、化合物２の単品（６．２ｍｇ，４７．４％）が得られた。
得られた化合物２（４．０ｍｇ，１．７６ｍｍｏｌ）に、ＤＭＳＯ２８２ｍｌを加え溶解させた。この反応液に、モルホリン２８２ｍｌを加えて室温下に撹拌を行った。反応を、ＴＬＣにてモニターしながら約１時間反応を行った。原料が消失したことを確認した後、反応液にアセトン／ジイソプロピルエーテル（ＩＰＥ）＝１／１の溶液５ｍｌを加える。このスラリーを、メンブランフィルターにてろ過を行った後、残渣を精製水で溶出させた。水層を濃縮後、ゲルカラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５，Ｈ２Ｏ）にて精製を行った。目的物の含まれる分画を集め濃縮後、凍結乾燥を行うと、目的とするモノシアロ糖鎖アスパラギン（化合物７６）（３．３ｍｇ，９１．５％ｙｉｅｌｄ）が得られた。化合物７６のＮＭＲデータを以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ５．２２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．０１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．８５（ｓ，１Ｈ），４．６５−４．７５（ｍ，３Ｈ），４．５４（ｄｄ，２Ｈ，Ｊａ＝１０．８，Ｊｂ＝７．６），４．３３（ｓ，１Ｈ），４．２７（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．１９（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４），２．９５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１６．８，Ｊｂ＝４．４，Ａｓｎ−βＣＨ），２．８２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１６．８，Ｊｂ＝７．２，Ａｓｎ−βＣＨ）２．７４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．４，Ｊｂ＝４．４，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．１６，２．１５，２．１３，２．１１，２．０９（ｅａｃｈｓ，１５Ｈ，Ａｃｘ５），１．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．４，Ｊｂ＝１２．０，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
化合物６のベンジル体（１０糖、５．０ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ）を、氷冷下にＮａＯＨａｑ．（ｐＨ＝１２）２．０ｍｌに溶解させた。反応をＨＰＬＣでモニターしながら約５時間撹拌した。反応の進行が終了した時点で、反応液を４０ｍＭ ＨＣｌにてｐＨ＝７．０に調整した。中和後の液を、メンブランフィルターで濾過した後、濃縮、次いでＨＰＬＣ（ＹＭＣ− Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＭ，ＳＨ−３４３−５ＡＭ，２０×２５０ｍｍ，ＡＮ／２５ｍＭ ＡｃＯＮＨ４ ｂｕｆｆｅｒ＝２０／８０，７．０ｍｌ／ｍｉｎ．，ｗａｖｅ ｌｅｎｇｔｈ；２７４ｎｍ）にて分取・精製を行った。分取した液を濃縮後、ＯＤＳカラム（コスモシール ７５Ｃ１８−ＯＰＮ，ナカライテスク社製）にて脱塩処理を行い、濃縮、凍結乾燥を行うと、化合物６の単品（２．５ｍｇ，５２．０％）が得られた。
得られた化合物６（１．５ｍｇ，０．６７ｍｍｏｌ）に、ＤＭＳＯ１０５ｍｌを加え溶解させた。この反応液に、モルホリン１０５ｍｌを加えて室温下に撹拌を行った。反応を、ＴＬＣにてモニターしながら約１時間反応を行った。原料が消失したことを確認した後、反応液にアセトン／ジイソプロピルエーテル（ＩＰＥ）＝１／１の溶液５ｍｌを加えた。このスラリーを、メンブランフィルターにてろ過を行った後、残渣を精製水で溶出させた。水層を濃縮後、ゲルカラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５，Ｈ２Ｏ）にて精製を行った。目的物の含まれる分画を集め濃縮後、凍結乾燥を行うと、目的とするモノシアロ糖鎖アスパラギン（化合物７７）（１．４ｍｇ，９９％ｙｉｅｌｄ）が得られた。
化合物７７のＮＭＲデータを以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ５．２０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．６，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．０２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．８５（ｓ，１Ｈ），４．６３−４．７３（ｍ，３Ｈ），４．５３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊａ＝７．６，Ｊｂ＝７．２），４．３３（ｓ，１Ｈ），４．２７（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．１９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０），２．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１６．０，Ｊｂ＝４．０，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．４，Ｊｂ＝４．８，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ）２．６２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１６．０Ｊｂ＝８．０，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１６，２．１４，２．１３，２．１１，２．０９（ｅａｃｈｓ，１５Ｈ，Ａｃｘ５），１．７９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．４，Ｊｂ＝１１．６，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
【実施例１】
参考例１で得られた化合物２４（６ｍｇ，２．５８ｍｍｏｌ）を水（３００ｍＬ）溶かし重炭酸ナトリウム（２．１ｍｇ，２４．９ｍｍｏｌ）を加えた。ここに、Ｄ−（＋）−ビオチニルスクシンイミド（４．２ｍｇ，１２．３ｍｍｏｌ）を溶かしたジメチルホルムアミド（３００ｍＬ）を加え、室温で２０分反応させた。原料消失をＴＬＣ（イソプロパノール：１Ｍ 酢酸アンモニウム水溶液＝３：２）で確認後、エバポレーターを用いて濃縮した。残渣をゲルろ過カラム（ｆ２０ｍｍ×３００ｍｍ，Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５，水）で精製し、目的とする化合物（６．２ｍｇ，９４％）を得た。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ｍＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
ｄ５．２２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．１４（ｄ，１Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．０３（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．５９（ｄｄ，１Ｈ），４．８６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．７４−４．６６（ｍ，３Ｈ，，ＧｌｃＮＡｃ２，５，５’−Ｈ１），４．５３（ｄ，２Ｈ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ１），４．３４（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２８（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．１９（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），３．０９（ｄｄ，２Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ｅｑ），２．９４−２．８６（ｍ，２Ｈ，ｂｉｏｔｉｎ），２．７８−２．７１（ｍ，２Ｈ，ｂｉｏｔｉｎ），２．３７（ｔ，１Ｈ，ｂｉｏｔｉｎ），２．１７，２．１６，２．１３，２．１１（ｅａｃｈ ｓ，Ａｃ），１．８０（ｄｄ，２Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ａｘ），１．８０−１．６７（ｍ，ｂｉｏｔｉｎ），１．５２−１．４７（ｍ，ｂｉｏｔｉｎ），１．３２（ｄｄ，ｂｉｏｔｉｎ）
【実施例２】
参考例４５で得られた化合物７６を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例３】
参考例４５で得られた化合物７７を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例４】
参考例７で得られた化合物３３を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例５】
参考例２４で得られた化合物２６を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例６】
参考例２５で得られた化合物２７を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例７】
参考例２６で得られた化合物２８を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例８】
参考例２７で得られた化合物３０を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例９】
参考例２８で得られた化合物３１を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例１０】
参考例２９で得られた化合物３２を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例１１】
参考例３０で得られた化合物３７を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例１２】
参考例３１で得られた化合物４２を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例１３】
参考例３２で得られた化合物３８を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例１４】
参考例３３で得られた化合物７２を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例１５】
参考例３４で得られた化合物４３を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例１６】
参考例３５で得られた化合物７３を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例１７】
参考例３６で得られた化合物３９を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例１８】
参考例３７で得られた化合物４０を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例１９】
参考例３８で得られた化合物４１を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例２０】
参考例３９で得られた化合物４４を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例２１】
参考例４０で得られた化合物４５を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例２２】
参考例４１で得られた化合物４６を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例２３】
参考例４２で得られた化合物３４を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例２４】
参考例４３で得られた化合物３５を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例２５】
参考例４４で得られた化合物３６を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
実施例２６ Ｆｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したジシアロα２，３糖鎖アスパラギン（Ｃ１−１）およびＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護した２種のモノシアロα２，３糖鎖アスパラギン（Ｃ１−２及びＣ１−３）の合成
参考例２で得られたＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したアシアロ糖鎖アスパラギンにシアル酸転移酵素を用いてＣＭＰ−シアル酸を転移させた。
シアル酸転移酵素としてα２，３転移酵素である市販のＲａｔ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来のものを用いた。
参考例２で得られたアシアロ９糖（２０ｍｇ，１０．１μｍｏｌ）を５０ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ＝６．０，５ｍｌ）に溶解させた後、牛血清アルブミン（ＢＳＡ，５ｍｇ）を加える。これに、ＣＭＰ−シアル酸（２６ｍｇ，４０．４μｍｏｌ）、Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（５μｌ，１２５ｕｎｉｔ）を加え均一化する。最後に、α２，３−Ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製、１００μｌ）を加え３７℃で４８時間静置させる。ＨＰＬＣで反応をモニターしながら原料が目的量まで減少した時点で反応を終了させ、反応液をメンブランフィルターにて濾過する。濾液を濃縮し液量を減じた後、ＨＰＬＣ分取カラムにて精製した（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｒ＆Ｄ ＯＤＳ，Ｄ−ＯＤＳ−５−Ａ，２０×２５０ｍｍ，ＡＮ／２５ｍＭ ＡｃＯＮＨ４ ｂｕｆｆｅｒ＝１８／８２，７．５ｍｌ／ｍｉｎ．，ｗａｖｅ ｌｅｎｇｔｈ；２７４ｎｍ）ところ、２５分後にジシアロ１１糖 化合物（Ｃ１−１）が、それぞれ３０分後、３４分後に各モノシアロ１０糖 化合物（Ｃ１−２）及び（Ｃ１−３）が溶出してきた。それぞれを分取した後、脱塩処理、次いで凍結乾燥を行うと、各化合物１、２、３がそれぞれ０．７ｍｇ（２．７％）、１．９ｍｇ（８．３％）、３．５ｍｇ（１５．３％）得られた。各化合物のＮＭＲデータは以下のとおりである。
化合物（Ｃ１−１）
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ７．９０（ｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．６９（ｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．４９（ｄｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．４２（ｄｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），５．１０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），４．９７（ｄ，１Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．５０−４．６０（ｍ，４Ｈ），４．３４（１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２４（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．１８（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．１０（ｍ，２Ｈ），２．７４（ｍ，３Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ｅｑ），２．４０−２．６０（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０５，２．０３，２．０２（ｅａｃｈ ｓ，Ａｃ），１．７７（ｄｄ，２Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ａｘ）．
化合物（Ｃ１−２）
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ７．９０（ｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．６９（ｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．４９（ｄｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．４２（ｄｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），５．１０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），４．９７（ｄ，１Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．４７−４．６０（ｍ），４．４３（ｄ，１Ｈ），４．３２（１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２２（ｂｓ，２Ｈ），４．１７（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．０６−４．１３（ｍ，２Ｈ），２．７２（ｍ，２Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．５０−２．６０（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０５，２．０３，２．０１（ｅａｃｈ ｓ，Ａｃ），１．７７（ｄｄ，１Ｈ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
化合物（Ｃ１−３）
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ７．９０（ｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．６９（ｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．４９（ｄｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．４２（ｄｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），５．１０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），４．９７（ｄ，１Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．５０−４．６０（ｍ），４．４５（ｄ，１Ｈ），４．３３（１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２２（ｍ，２Ｈ），４．１７（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．０９（ｍ，２Ｈ），２．７４（ｍ，２Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．４５−２．６０（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０５，２．０３，２．０２，２．００（ｅａｃｈ ｓ，Ａｃ），１．７７（ｄｄ，１Ｈ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）
得られた（Ｃ−１）〜（Ｃ−３）の各化合物を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例２７】
実施例２６で得られた化合物（Ｃ１−２）（２ｍｇ，０．８８μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０）１００μｌに溶解させ、さらにβ−ガラクトシダーゼ（生化学工業社製、ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ，５μＬ，１００ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で１５時間静置した後、メンブランフィルターでろ過を行った。ろ液をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８２：１８、流速７．５ｍｌ／ｍｉｎ）で精製した後、溶媒を濃縮、次いで凍結乾燥を行った。残留物を水２００μｌに溶解させＯＤＳ−カラムクロマトグラフィー（コスモシール７５Ｃ１８−ｏｐｎ、最初に水で洗浄を行い、次いで２５％アセトニトリル水溶液で溶出させる）を用いて脱塩処理を行ったところ、目的とする化合物（Ｃ２）が０．５μｇ得られた。ＮＭＲデータは以下のとおりである。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ７．９０（ｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．６９（ｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．４９（ｄｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．４２（ｄｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），５．１０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），４．９８（ｄ，１Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．５０−４．６０（ｍ），４．３３（１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２２（ｍ，２Ｈ），４．１７（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．１０（ｍ，２Ｈ），２．７４（ｍ，２Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．４５−２．６０（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０５，２．０３，２．０１（ｅａｃｈ ｓ，Ａｃ），１．７８（ｄｄ，１Ｈ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）
得られた（Ｃ２）の化合物を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例２８】
実施例２７で得られた化合物（Ｃ２）（１．８ｍｇ，０．８６μｍｏｌ）を、ウシ血清アルブミン１ｍｇと共にＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０）９０μｌに溶解させ、さらにＮ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ）を４μｌ（２５０ｍＵ）加えた。この溶液を３７℃で２４時間静置した後、メンブランフィルターでろ過を行った。ろ液をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８２：１８、流速７．５ｍｌ／ｍｉｎ）で精製した後、溶媒を濃縮、次いで凍結乾燥を行った。残留物を水２００μｌに溶解させＯＤＳ−カラムクロマトグラフィー（コスモシール７５Ｃ１８−ｏｐｎ、最初に水で洗浄を行い、次いで２５％アセトニトリル水溶液で溶出させる）を用いて脱塩処理を行ったところ、目的とする化合物（Ｃ３）が０．９μｇ得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ８．０１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．８０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．６０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．５３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），５．２１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．００（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．８７（ｓ，１Ｈ），４．６０−４．７８（ｍ，５Ｈ），４．４０−４．５０（ｂｍ，２Ｈ），４．３４（ｓ，１Ｈ），４．２８（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．２０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝３．０，Ｊｂ＝９．９），２．８０−２．９５（ｍ，２Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．６５−２．７５（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１６，２．１４，２．１２（ｅａｃｈ ｓ，Ａｃｘ３），１．９８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．８９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．１，Ｊｂ＝１１．９，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
得られた（Ｃ３）の化合物を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例２９】
実施例２８で得られた化合物（Ｃ３）（０．８ｍｇ，０．４２μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０）５０μｌに溶解させ、α−マンノシダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ）３０μｌ（２．９Ｕ）加えた。この溶液を３７℃で６３時間静置した後、メンブランフィルターでろ過を行った。ろ液をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速７．５ｍｌ／ｍｉｎ）で精製した後、溶媒を濃縮、次いで凍結乾燥を行った。残留物を水２００μｌに溶解させＯＤＳ−カラムクロマトグラフィー（コスモシール７５Ｃ１８−ｏｐｎ、最初に水で洗浄を行い、次いで２５％アセトニトリル水溶液で溶出させる）を用いて脱塩処理を行ったところ、目的とする化合物（Ｃ４）が０．６μｇ得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０ｏＣ，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ８．００（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．７９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．５９（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．５２（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），５．２１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．６０−４．７５（ｍ，），４．４０−４．５０（ｍ，２Ｈ），４．３２（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３），４．２８（ｂｓ，１Ｈ），４．２２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝９．７，Ｊｂ＝２．８，Ｍａｎ４−Ｈ２），２．８０−２．９５（ｍ，２Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．６０−２．７５（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１４，２．１４，２．１２（ｅａｃｈｓ，Ａｃｘ３），１．９８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．８８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．１，Ｊｂ＝１２．０，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
得られた（Ｃ４）の化合物を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例３０】
実施例２６で得られた化合物（Ｃ１−３）（１ｍｇ，０．４４μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０）５０μｌに溶解させ、さらにβ−ガラクトシダーゼ（生化学工業社製、ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ，５μＬ，１００ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で１５時間静置した後、メンブランフィルターでろ過を行った。ろ液をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８２：１８、流速７．５ｍｌ／ｍｉｎ）で精製した後、溶媒を濃縮、次いで凍結乾燥を行った。残留物を水２００μｌに溶解させＯＤＳ−カラムクロマトグラフィー（コスモシール７５Ｃ１８−ｏｐｎ、最初に水で洗浄を行い、次いで２５％アセトニトリル水溶液で溶出させる）を用いて脱塩処理を行ったところ、目的とする化合物（Ｃ５）が０．３μｇ得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ８．０１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．８１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．６０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．５３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），５．２１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．６，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．０２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．５５−４．７０（ｍ），４．４４（１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．３０−４．３８（ｂｍ，２Ｈ），４．２８（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．１７−４．２５（ｍ，２Ｈ），２．７８−２．９５（ｍ，２Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．５５−２．７０（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１６，２．１５，２．１４，２．１２（ｅａｃｈｓ，１２Ｈ，Ａｃｘ４），１．９８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．８９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．２，Ｊｂ＝１２．０，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
得られた（Ｃ５）の化合物を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例３１】
実施例３０で得られた化合物（Ｃ５）（１．０ｍｇ，０．４８μｍｏｌ）を、ウシ血清アルブミン１ｍｇと共にＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０）５０μｌに溶解させ、さらにＮ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ）を４μｌ（２５０ｍＵ）加えた。この溶液を３７℃で２２時間静置した後、メンブランフィルターでろ過を行った。ろ液をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８２：１８、流速７．５ｍｌ／ｍｉｎ）で精製した後、溶媒を濃縮、次いで凍結乾燥を行った。残留物を水２００μｌに溶解させＯＤＳ−カラムクロマトグラフィー（コスモシール７５Ｃ１８−ｏｐｎ、最初に水で洗浄を行い、次いで２５％アセトニトリル水溶液で溶出させる）を用いて脱塩処理を行ったところ、目的とする化合物（Ｃ６）が０．６μｇ得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ８．０１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．８０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．６０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．５３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），５．１９（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．０２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．８５（ｓ，１Ｈ）４．５８−４．７５（ｍ，５Ｈ），４．３８−４．４８（ｍ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．４０（ｂｄ，Ｊ＝２．４，１Ｈ），４．１８−４．２５（ｍ，２Ｈ），４．１５（ｍ，１Ｈ），２．８０−２．９５（ｍ，２Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．６５−２．７５（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１６，２．１３，２．１２（ｅａｃｈｓ，９Ｈ，Ａｃｘ３），１．９８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．８９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．２，Ｊｂ＝１２．０，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
得られた（Ｃ６）の化合物を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例３２】
実施例３１で得られた化合物（Ｃ６）（１．０ｍｇ，０．５３μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０）５０μｌに溶解させ、α−マンノシダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ）１０μｌ（０．９Ｕ）加えた。この溶液を３７℃で２０時間静置した後、メンブランフィルターでろ過を行った。ろ液をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速７．５ｍｌ／ｍｉｎ）で精製した後、溶媒を濃縮、次いで凍結乾燥を行った。残留物を水２００μｌに溶解させＯＤＳ−カラムクロマトグラフィー（コスモシール７５Ｃ１８−ｏｐｎ、最初に水で洗浄を行い、次いで２５％アセトニトリル水溶液で溶出させる）を用いて脱塩処理を行ったところ、目的とする化合物（Ｃ７）が０．５μｇ得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ８．０１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．８１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．６０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．５３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），５．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．０１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．８４（ｓ，１Ｈ），４．５５−４．７０（ｍ，５Ｈ），４．４４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．０，Ｆｍｏｃ），４．３０−４．３８（ｂｓ，１Ｈ），４．１５−４．２５（ｍ，２Ｈ），４．１７（ｓ，１Ｈ），２．８０−２．９５（ｍ，２Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．５５−２．７０（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１６，２．１３，２．１２（ｅａｃｈｓ，Ａｃｘ３），１．９８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ）１．８９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．２，Ｊｂ＝１２．３，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
得られた（Ｃ７）の化合物を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例３３】
Ｆｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したジシアロ（α２，６）（α２，３）糖鎖アスパラギンの合成
参考例４５で得られたＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したモノシアロ糖鎖アスパラギン（化合物２）にシアル酸転移酵素を用いてＣＭＰ−シアル酸を転移させた。
シアル酸転移酵素としてα２，３転移酵素である市販のＲａｔ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来のものを用いた。
参考例４５で得られた化合物２（１．７ｍｇ，０．７５μｍｏｌ）を５０ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ＝５．０，８５μｌ）に溶解させた後、牛血清アルブミン（ＢＳＡ，１ｍｇ）を加える。これに、ＣＭＰ−シアル酸（４．８ｍｇ，７．５μｍｏｌ）、Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（１μｌ，７５ｕｎｉｔ）を加え均一化する。最後に、α２，３−Ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製、７５μｌ，３４ｍＵ）を加え３７℃で３．５時間静置させる。ＨＰＬＣで反応をモニターしながら原料が消失した時点で反応を終了させ、反応液をメンブランフィルターにて濾過する。濾液を濃縮し液量を減じた後、ＨＰＬＣ分取カラムにて精製した（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｒ＆Ｄ ＯＤＳ，Ｄ−ＯＤＳ−５−Ａ，２０×２５０ｍｍ，ＡＮ／２５ｍＭ ＡｃＯＮＨ４ ｂｕｆｆｅｒ＝１８／８２，７．５ｍｌ／ｍｉｎ．，ｗａｖｅ ｌｅｎｇｔｈ；２７４ｎｍ）ところ、２５分後に化合物（Ｃ７Ａ）が溶出してきた。分取した後、脱塩処理、次いで凍結乾燥を行うと、化合物（Ｃ７Ａ）が１．３ｍｇ（６７．８％）得られた。化合物のＮＭＲデータは以下のとおりである。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ８．００（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．７９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．６０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．５２（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），５．２１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．０３（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．８６（ｓ，１Ｈ），４．５８−４．７２（ｍ，５Ｈ），４．５４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０），４．３８−４．４８（ｍ，２Ｈ）４．３４（ｂｓ，１Ｈ），４．２８（ｂｓ，１Ｈ），４．１５−４．２５（ｍ，２Ｈ），２．８０−２．８６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝４．４，Ｊｂ＝１２．４，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．７３−２．８３（ｍ，ｄｄ，３Ｈ，Ｊａ＝４．４，Ｊｂ＝１２．４，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．６０−２．７２（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１６，２．１５，２．１４，２．１２（ｅａｃｈ ｓ，Ａｃ ｘ５），１．９８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．８９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．４，Ｊｂ＝１２．０，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ），１．８１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．４，Ｊｂ＝１２．０，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
得られた（Ｃ７Ａ）の化合物を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例３４】
Ｆｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したジシアロ（α２，３）（α２，６）糖鎖アスパラギンの合成
参考例４５で得られたＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したモノシアロ糖鎖アスパラギン（化合物６）にシアル酸転移酵素を用いてＣＭＰ−シアル酸を転移させた。
シアル酸転移酵素としてα２，３転移酵素である市販のＲａｔ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来のものを用いた。
参考例４５で得られた化合物６（１．２ｍｇ，０．５３μｍｏｌ）を５０ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ＝５．０，６０μｌ）に溶解させた後、牛血清アルブミン（ＢＳＡ，１ｍｇ）を加える。これに、ＣＭＰ−シアル酸（３．４ｍｇ，５．３μｍｏｌ）、Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（１μｌ，７５ｕｎｉｔ）を加え均一化する。最後に、α２，３−Ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製、５２．９μｌ，２４ｍＵ）を加え３７℃で３時間静置させる。ＨＰＬＣで反応をモニターしながら原料が全て消費された時点で反応を終了させ、反応液をメンブランフィルターにて濾過する。濾液を濃縮し液量を減じた後、ＨＰＬＣ分取カラムにて精製した（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｒ＆Ｄ ＯＤＳ，Ｄ−ＯＤＳ−５−Ａ，２０×２５０ｍｍ，ＡＮ／２５ｍＭ ＡｃＯＮＨ４ ｂｕｆｆｅｒ＝１８／８２，７．５ｍｌ／ｍｉｎ．，ｗａｖｅ ｌｅｎｇｔｈ；２７４ｎｍ）ところ、２３分後に化合物（Ｃ７Ｂ）が溶出してきた。分取した後、脱塩処理、次いで凍結乾燥を行うと、各化合物（Ｃ７Ｂ）が１．１ｍｇ（８１．２％）得られた。各化合物のＮＭＲデータは以下のとおりである。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ８．００（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．７９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．５９（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．５１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），５．２１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．００（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．８４（ｓ，１Ｈ），４．６０−４．７２（ｍ，５Ｈ），４．５２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６），４．３５−４．４５（ｍ，２Ｈ），４．３３（ｂｓ，１Ｈ），４．２７（ｂｓ，１Ｈ），４．１５−４．２５（ｍ，２Ｈ），２．８０−２．８６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝４．８，Ｊｂ＝１２．４，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．７３−２．８３（ｂｓ，ｄｄ，３Ｈ，Ｊａ＝４．８，Ｊｂ＝１２．４，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．６０−２．７２（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１５，２．１２，２．１０（ｅａｃｈ ｓ，Ａｃ ｘ５），１．９７（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．８８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．４，Ｊｂ＝１２．４，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ），１．８０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．４，Ｊｂ＝１２．４，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
得られた（Ｃ７Ｂ）の化合物を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例３５〜５２】
参考例２、８〜１０、１２、１４、１７、４５、実施例２６〜３２で製造した各Ｆｍｏｃ−糖鎖アスパラギン ２ｎｍｏｌを、トリス塩酸緩衝液 約１０ｍｌに溶解させた。このものに、ＧＤＰ−フコース２００ｎｍｏｌ、Ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｖ（Ｈｕｍａｎ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）０．５ｍＵを加え、３７℃で約２時間静置、反応させた。反応液を超純水２０ｍｌで希釈したのち、キャピラリー電気泳動（ｆｕｓｅｄ ｓｉｌｉｃａ ｃａｐｉｌｌａｒｙ，５０ｍｍ ｉ．ｄ．，６０ｃｍ，ｂｕｆｆｅｒ；１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ｂｏｒａｔｅ，ｐＨ＝８．３，１００ｍＭ Ｈｅｐｔａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ，印加電圧２７ｋＶ，温度２５℃，２１４ｍｍ）で分離を行いフコースを含む糖鎖アスパラギン誘導体を得た。得られた上記糖鎖アスパラギン誘導体を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。得られたビオチン化糖鎖アスパラギンを以下に示す。
【実施例３５】
【実施例３６】
【実施例３７】
【実施例３８】
【実施例３９】
【実施例４０】
【実施例４１】
【実施例４２】
【実施例４３】
【実施例４４】
【実施例４５】
【実施例４６】
【実施例４７】
【実施例４８】
【実施例４９】
【実施例５０】
【実施例５１】
【実施例５２】
【実施例５３】
ジシアロ糖鎖アスパラギン（化合物２４）（１１糖、１．４ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）を、精製水 ７０ｍｌに溶解させた。このものにアセトン７０ｍｌ、ＮａＨＣＯ３（０．７６ｍｇ，９ｍｍｏｌ）を加え、室温下に撹拌した後、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ，０．９５ｍｇ，２．４ｍｍｏｌ，Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を加え約２時間撹拌した。２時間後、ＴＬＣにて反応の終了を確認した後、アセトンを減圧下に留去させ、残った水溶液をゲルカラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５，Ｈ２Ｏ）にて精製し目的物の含まれる分画を集めた。集めた分画を濃縮後、ＨＰＬＣ（ＹＭＣ− Ｐａｃｋ ＯＤＳ＝ＡＭ，ＳＨ−３４３−５ＡＭ，２０×２５０ｍｍ，ＡＮ／２５ｍＭ ＡｃＯＮＨ４ ｂｕｆｆｅｒ＝１０／９０，７．５ｍｌ／ｍｉｎ．，ｗａｖｅ ｌｅｎｇｔｈ；２７４ｎｍ）で分取した後、ゲルカラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５，Ｈ２Ｏ）にて脱塩処理を行った。目的物の含まれる分画を集め、濃縮後、凍結乾燥を行うと目的とするＦＩＴＣ化されたジシアロ糖鎖誘導体（１．２ｍｇ，７３．５％ ｙｉｅｌｄ）が得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ７．８６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０，ＦＩＴＣ），７．７５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝８．０，Ｊｂ＝２．０，ＦＩＴＣ），７．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０，ＦＩＴＣ），７．４１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．６，ＦＩＴＣ），６．７１−６．８３（ｂｍ，４Ｈ，ＦＩＴＣ），５．２２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．１０−５．２０（ｂｍ，２Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．０３（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７０−４．８０（ｍ，３Ｈ），４．５３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０），４．３３（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．２７（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），４．１８（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．９０−３．００（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．８５−２．９５（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７５（ｄｄ，２Ｈ，Ｊａ＝１２．０，Ｊｂ＝２．８，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｘ），２．１５，２．１４，２．１２，２．０９（ｅａｃｈｓ，１８Ｈ，Ａｃｘ６），１．８０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊａ＝１２．０，Ｊｂ＝１２．０，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
【実施例５４】
化合物２４の代わりに、化合物７６を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例５５】
化合物２４の代わりに、化合物７７を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例５６】
化合物２４の代わりに、化合物３３を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
得られたＦＩＴＣ化糖鎖アスパラギンのＮＭＲデータを以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ７．８８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０，ＦＩＴＣ），７．７６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝８．０，Ｊｂ＝２．０，ＦＩＴＣ），７．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０，ＦＬＴＣ），７．４５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８，ＦＩＴＣ），６．８５−６．９３（ｍ，４Ｈ，ＦＩＴＣ），５．２１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０５−５．２０（ｂｄ，２Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．０１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．６７（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．６），４．５５（ｄ，２Ｈ），４．３４（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．２８（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），４．２０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），３．００−３．１０（ｂｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．９０−３．００（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７５（ｄｄ，２Ｈ，Ｊａ＝１２．０，Ｊｂ＝２．８，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｘ），２．１４，２．１３，２．１２，２．０８（ｅａｃｈｓ，１２Ｈ，Ａｃｘ４）．
【実施例５７】
化合物２４の代わりに、化合物２６を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例５８】
化合物２４の代わりに、化合物２７を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例５９】
化合物２４の代わりに、化合物２８を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例６０】
化合物２４の代わりに、化合物３０を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例６１】
化合物２４の代わりに、化合物３１を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例６２】
化合物２４の代わりに、化合物３２を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例６３】
化合物２４の代わりに、化合物３７を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例６４】
化合物２４の代わりに、化合物４２を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例６５】
化合物２４の代わりに、化合物３８を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例６６】
化合物２４の代わりに、化合物７２を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例６７】
化合物２４の代わりに、化合物４３を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例６８】
化合物２４の代わりに、化合物７３を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例６９】
化合物２４の代わりに、化合物３９を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例７０】
化合物２４の代わりに、化合物４０を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例７１】
化合物２４の代わりに、化合物４１を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例７２】
化合物２４の代わりに、化合物４４を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例７３】
化合物２４の代わりに、化合物４５を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例７４】
化合物２４の代わりに、化合物４６を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例７５】
化合物２４の代わりに、化合物３４を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例７６】
化合物２４の代わりに、化合物３５を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例７７】
化合物２４の代わりに、化合物３６を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例７８】
実施例２６で得られた（Ｃ−１）〜（Ｃ−３）の各化合物を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例５３と同様にＦＩＴＣ化を行った。
【実施例７９】
実施例２７で得られた（Ｃ２）の各化合物を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例５３と同様にＦＩＴＣ化を行った。
【実施例８０】
実施例２８で得られた（Ｃ３）の各化合物を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例５３と同様にＦＩＴＣ化を行った。
【実施例８１】
実施例２９で得られた（Ｃ４）の各化合物を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例５３と同様にＦＩＴＣ化を行った。
【実施例８２】
実施例３０で得られた（Ｃ５）の各化合物を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例５３と同様にＦＩＴＣ化を行った。
【実施例８３】
実施例３１で得られた（Ｃ６）の各化合物を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例５３と同様にＦＩＴＣ化を行った。
【実施例８４】
実施例３２で得られた（Ｃ７）の各化合物を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例５３と同様にＦＩＴＣ化を行った。
【実施例８５】
実施例３３で得られた（Ｃ７Ａ）の各化合物を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例５３と同様にＦＩＴＣ化を行った。
【実施例８６】
実施例３４で得られた（Ｃ７Ｂ）の各化合物を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例５３と同様にＦＩＴＣ化を行った。
【実施例８７〜１０４】
実施例３５〜５２で得られたフコースを含む糖鎖アスパラギン誘導体を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例８７】
【実施例８８】
【実施例８９】
【実施例９０】
【実施例９１】
【実施例９２】
【実施例９３】
【実施例９４】
【実施例９５】
【実施例９６】
【実施例９７】
【実施例９８】
【実施例９９】
【実施例１００】
【実施例１０１】
【実施例１０２】
【実施例１０３】
【実施例１０４】
実施例１０５（マイクロプレートの製造）
９６穴ＢＤバイオコートストレプトアビジン（ＢＤバイオサイエンス社製：バイオアッセイ用、結合能：５ｎｇ／１穴）に、実施例１のビオチン化糖鎖アスパラギン１００μｇ（ビオチン結合能の約１０倍相当量）を蒸留水に溶かし１０００μｌとした。この調整溶液を１穴当り１０μｌとなるように各ウェルに加え、蒸留水で３回洗浄し、マイクロプレートを製造した。各ビオチン化糖鎖アスパラギンの結合収率は９５％以上であった。固定化率の確認は、洗い出された非固定化糖鎖残量より算出した。
実施例１０６（アフィニティーカラムの製造）
アビジンコートビーズ（日立ソフトウェアーエンジニアリング社製、ｘＭＡＰ ＬｕｍＡｖｉｄｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ １ｍｌ）１０ｍｌと実施例１のビオチン化糖鎖アスパラギン３０ｍｇをスラリー状態で撹拌し、ビーズをろ過、洗浄した。洗浄は、ビーズ体積の２倍量の蒸留水を使用して、３回ろ紙上で洗浄した。固定化の確認は、洗浄回収されたビオチン化糖鎖アスパラギンの残量により確認した。次に上記のビオチン化糖鎖アスパラギン固定ビーズ１０ｍｌを３０ｍｌの蒸留水でスラリー状態のまま、ガラス製のオープンクロマトカラム（φ２０ｍｍ、長さ３００ｍｍ）に充填し、アフィニティーカラムを製造した。
【産業上の利用可能性】
本発明によれば、アスパラギンのアミノ基窒素をビオチン化又はＦＩＴＣ化した糖鎖アスパラギンが得られる。
更に本発明によれば、ビオチン・アビジンの結合特異性を利用し、ビオチン化した複数の糖鎖をアビジン化されたマイクロプレート上で反応させるだけで簡単に糖鎖マイクロチップを製造することができる。これにより、特定の糖鎖と結合能を有するタンパク質を解明することができる。
また、ある特定のタンパク質を分離精製する目的で、アビジン化したアフィニティーカラムに特定のビオチン化した糖鎖を結合し固定化し、そこに、ビオチン化した糖鎖と特異的結合能を有するタンパク質を含む混合物を通すことにより目的とするタンパク質のみを単離することができる。
更に本発明で得られたＦＩＴＣ化糖鎖アスパラギンは、例えば生体組織中の糖類の受容体の研究、レクチンの糖結合特異性の研究に有用である。
【技術分野】
本発明はビオチン化糖鎖アスパラギン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）化糖鎖アスパラギン、それらの製造方法及びその用途に関する。
【背景技術】
近年、核酸（ＤＮＡ）、タンパク質に続く第三の鎖状生命分子として、糖鎖分子が注目されてきている。ヒトの体は、約６０兆個の細胞から成っている一大細胞社会であり、全ての細胞表面は糖鎖分子によって覆われている。例えば、ＡＢＯ式血液型は細胞表面の糖鎖の違いにより決定されている。
糖鎖は、細胞間の認識や相互作用に関わる働きをもち、細胞社会を成り立たせる要となっている。細胞社会の乱れは、癌、慢性疾患、感染症、老化などにつながる。
例えば、細胞が癌化すると糖鎖の構造変化が起こることが分かっている。また、コレラ菌やインフルエンザウイルスなどは、ある特定の糖鎖を認識し結合することにより、細胞に侵入し感染することが知られている。
糖鎖は単糖の配列、結合様式・部位、鎖の長さ・分岐様式、全体の高次構造などの多様性から、核酸やタンパク質の構造と比べると非常に複雑な構造である。従って、その構造に由来する生物学的な情報は核酸やタンパク質に比べて多種多様である。糖鎖は、研究の重要性を認識されながらも、その構造の複雑さや多様性により、核酸やタンパク質に比べて研究の推進が遅れている状況にある。
上述のようにある特定の糖鎖とタンパク質とが認識し結合能を有しているかを解明することにより、新しい原理に基づく医薬品や食品の開発などをもたらし、病気の予防、治療に貢献するなど、幅広い応用が期待されている。
そこで、ビオチン・アビジンの結合特異性を利用し、ビオチン化した複数の糖鎖をアビジン化されたマイクロプレート上で反応させるだけで簡単に糖鎖マイクロチップを製造することができる。これにより、特定の糖鎖と結合能を有するタンパク質を解明することができる。
また、ある特定のタンパク質を分離精製する目的で、アビジン化したアフィニティーカラムに特定のビオチン化した糖鎖を結合し固定化し、そこに、ビオチン化した糖鎖と特異的結合能を有するタンパク質を含む混合物を通すことにより目的とするタンパク質のみを単離することができる。
またＦＩＴＣ化した糖鎖アスパラギンは、キャピラリー電気泳動法等により微量であっても単離することができる。更にそれからＦＩＴＣをはずして糖鎖アスパラギン自身を単離することもできる。
本発明の課題は、アスパラギンのアミノ基窒素をビオチン化又はＦＩＴＣ化した糖鎖アスパラギン、その製造方法及びその用途を提供することにある。
【発明の開示】
本発明は、下記の発明に係る。
１．下記式（１）で表される１１〜３糖を有する糖鎖アスパラギン誘導体。
〔式中、Ｒ１およびＲ２は、水素原子、式（２）〜（６）で示される基であり、同一でも異なっていてもよい。Ｑはビオチン基又はＦＩＴＣ基を示す。〕
２．ビオチン基又はＦＩＴＣ基でアスパラギンのアミノ基窒素が修飾された糖鎖アスパラギンの非還元末端側のＮ−アセチルグルコサミンに少なくとも１個以上のフコースを含む糖鎖アスパラギン誘導体。
３．式（９）で表される１１〜３糖を有する糖鎖アスパラギンをビオチン化することを特徴とするビオチン化糖鎖アスパラギンの製造方法。
〔式中、Ｒ１およびＲ２は上記に同じ。〕
４．式（９）で表される１１〜３糖を有する糖鎖アスパラギンをフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）化することを特徴とするＦＩＴＣ化糖鎖アスパラギンの製造方法。
５．上記のビオチン化糖鎖アスパラギンを結合させたマイクロプレート。
６．上記のビオチン化糖鎖アスパラギンを結合させたアフィニティーカラム。
本発明者は、先に特願２００１−１８５６８５号（以下、先願という）において、種々の単離された糖鎖アスパラギン誘導体を従来に比べて非常に容易かつ大量に得ることができる、糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギン、糖鎖の製造方法、更には糖残基が任意に欠失した糖鎖が結合した新規な糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギン、糖鎖を開発した。
この先願の方法は例えば
（１） （ａ）１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程、
ならびに
（ｂ）該糖鎖アスパラギン誘導体混合物または該糖鎖アスパラギン誘導体混合物に含まれる糖鎖アスパラギン誘導体を加水分解して得られる混合物をクロマトグラフィーに供して各糖鎖アスパラギン誘導体を分離する工程、
を含む、糖鎖アスパラギン由来の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法、
（２） （ｂ’）工程（ｂ）で分離された糖鎖アスパラギン誘導体を糖加水分解酵素を用いて加水分解する工程をさらに含む前記（１）記載の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法、
（３） １種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物が、下記式（Ａ）の化合物および／または該化合物において１以上の糖残基が欠失した化合物を含むものである、前記（１）または（２）記載の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法、
（４） 脂溶性の保護基がフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基である前記（１）〜（３）いずれか記載の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法、
（５） 工程（ａ）が、非還元末端にシアル酸残基を有する１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖アスパラギンにＦｍｏｃ基を導入し、かつシアル酸残基にベンジル基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程である、前記（１）〜（３）いずれか記載の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法、
（６） （ａ）１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程、
（ｂ）該糖鎖アスパラギン誘導体混合物または該糖鎖アスパラギン誘導体混合物に含まれる糖鎖アスパラギン誘導体を加水分解して得られる混合物をクロマトグラフィーに供して各糖鎖アスパラギン誘導体を分離する工程、ならびに
（ｃ）工程（ｂ）で分離された糖鎖アスパラギン誘導体の保護基を除去して糖鎖アスパラギンを得る工程、
を含む、糖鎖アスパラギンの製造方法、
（７） （ｂ’）工程（ｂ）で分離された糖鎖アスパラギン誘導体を糖加水分解酵素を用いて加水分解する工程、および／または
（ｃ’）工程（ｃ）で得られた糖鎖アスパラギンを糖加水分解酵素を用いて加水分解する工程、
をさらに含む、前記（６）記載の糖鎖アスパラギンの製造方法、
（８） １種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物が、下記式（Ａ）の化合物および／または該化合物において１以上の糖残基が欠失した化合物を含むものである、前記（６）または（７）記載の糖鎖アスパラギンの製造方法、
（９） 脂溶性の保護基がＦｍｏｃ基である前記（６）〜（８）いずれか記載の糖鎖アスパラギンの製造方法、
（１０） 工程（ａ）が、非還元末端にシアル酸残基を有する１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖アスパラギンにＦｍｏｃ基を導入し、かつシアル酸残基にベンジル基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程である、前記（６）〜（８）いずれか記載の糖鎖アスパラギンの製造方法などである。
これら糖鎖アスパラギン誘導体及び糖鎖アスパラギンの製造についての詳細は、上記先願に述べられているので、これを引用する。しかし若干先願の内容について述べると、先願の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法は、たとえば、天然の糖タンパク質に由来する糖鎖アスパラギン、好ましくはアスパラギン結合型糖鎖から得られる糖鎖アスパラギンの混合物に含まれる当該糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入（結合）して糖鎖アスパラギン誘導体の混合物を得た後に当該混合物を各糖鎖アスパラギン誘導体に分離することを１つの大きな特徴とする。なお、本明細書において、「糖鎖アスパラギン」とはアスパラギンが結合した状態の糖鎖をいう。また、「アスパラギン結合型糖鎖」とはタンパク質のポリペプチド中のアスパラギン（Ａｓｎ）の酸アミノ基に、還元末端に存在するＮ−アセチルグルコサミンがＮ−グリコシド結合した糖鎖群であって、Ｍａｎ（β１−４），ＧｌｃＮａｃ（β１−４）ＧｌｃＮａｃを母核とする糖鎖群をいう。「糖鎖アスパラギン誘導体」とはアスパラギン残基に脂溶性の保護基が結合した状態の糖鎖アスパラギンをいう。また、化合物の構造式中、「ＡｃＨＮ」はアセトアミド基を示す。
前記するように、天然の糖タンパク質に由来する糖鎖は非還元末端の糖残基がランダムに欠失した糖鎖の混合物である。本発明者らは、意外にも天然の糖タンパク質に由来する糖鎖、具体的には糖鎖アスパラギンの混合物に含まれる当該糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入することで、当該保護基が導入された糖鎖アスパラギン誘導体の混合物を公知のクロマトグラフィーの手法を用いて容易に個々の糖鎖アスパラギン誘導体に分離することができることを見出した。それにより、種々の構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体をそれぞれ大量に調製することが可能となった。たとえば、従来分離が困難であった類似構造の糖鎖アスパラギン誘導体同士の分離が可能となり、それらの化合物を各々、容易かつ大量に調製することができる。また、得られた糖鎖アスパラギン誘導体を元に、たとえば、糖加水分解酵素を順次作用させて糖残基を除去することにより、さらに様々な糖鎖アスパラギン誘導体を合成することもできる。
このように、糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入して誘導体化することにより個々の糖鎖アスパラギン誘導体の分離が可能となったが、これは、脂溶性の保護基を導入したことにより糖鎖アスパラギン誘導体の全体の脂溶性が高まり、たとえば、好適に使用される逆相系カラムとの相互作用が格段に向上し、その結果、より鋭敏に糖鎖構造の差を反映して個々の糖鎖アスパラギン誘導体が分離されるようになったことによると考えられる。
さらに、先願によれば、得られた糖鎖アスパラギン誘導体の保護基を除去することにより種々の糖鎖アスパラギンを、人工的に容易かつ大量に得ることができる。
上記先願で得られる糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギン及び糖鎖はいずれもα２，６結合体のものであった。
また、上記先願で得られる糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギン及び糖鎖はいずれもフコースが結合していない糖鎖アスパラギン誘導体であった。
ここで、α２，３結合体とα２，６結合体の相異について以下に説明する。
α２，３結合体、α２，６結合体とは、シアル酸とガラクトースとの結合様式を表わすものである。前者は、シアル酸の２位の炭素と、ガラクトースの３位の炭素がα結合しているものをいい、後者は、シアル酸の２位の炭素と、ガラクトースの６位の炭素がα結合しているものをいう。これらは、ガラクトースとの結合炭素の違いではある。
本発明の方法においては先ず、出発化合物である脂溶性の保護基で保護された糖鎖アスパラギン（９糖−Ａｓｎ−Ｆｍｏｃ）をシアル酸転移酵素を用いてシアル酸あるいはシアル酸の誘導体を転移させ、得られた脂溶性の保護基で保護された糖鎖アスパラギンをクロマトグラフィーに供することにより分離し、脂溶性の保護基で保護されたジシアロ糖鎖アスパラギン誘導体および２種のモノシアロ糖鎖アスパラギン誘導体が得られる。
次いで、得られたジシアロ糖鎖アスパラギン誘導体および２種のモノシアロ糖鎖アスパラギン誘導体を糖加水分解することにより、シアル酸あるいはシアル酸誘導体を有する９〜７糖鎖アスパラギン誘導体が得られる。
また、上記で得られた１１〜７糖鎖アスパラギン誘導体やジシアロ糖鎖アスパラギン（α２，６−１１糖−Ａｓｎ−Ｆｍｏｃ）を出発原料としそれを糖加水分解することにより得られる１０〜６糖鎖アスパラギン誘導体に、糖転移酵素によりフコースを転移することによりフコースを含む１３〜７糖鎖アスパラギン誘導体が得られる。
当該保護基としては特に限定されるものではなく、例えば、Ｆｍｏｃ基やｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジル基、アリル基、アリルオキシカルボニル基、アセチル基等の、カーボネート系またはアミド系の保護基等を使用することができる。得られた糖鎖アスパラギン誘導体を直ちに所望の糖ペプチドの合成に使用できるという観点から、当該保護基としては、Ｆｍｏｃ基またはＢｏｃ基などが好ましく、Ｆｍｏｃ基がより好ましい。Ｆｍｏｃ基はシアル酸等比較的酸性条件に不安定な糖が糖鎖に存在する場合に特に有効である。また、保護基の導入は公知の方法（たとえば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ ＩＮＣ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９１，ＩＳＢＮ ０−４７１−６２３０１−６を参照）に従って行えばよい。
たとえば、Ｆｍｏｃ基を用いる場合、糖鎖アスパラギンに対しアセトンを適量加えた後、さらに９−フルオレニルメチル−Ｎ−スクシニミヂルカーボネートと炭酸水素ナトリウムを加えて溶解し、２５℃にてアスパラギン残基へのＦｍｏｃ基の結合反応を行うことにより、当該糖鎖アスパラギンのアスパラギン残基にＦｍｏｃ基を導入することができる。
以上の操作により、脂溶性の保護基が導入された糖鎖アスパラギン誘導体が得られる。
シアル酸としては、一般に市販されているシアル酸あるいは化学合成したものを用いることができる。
シアル酸の誘導体としては、一般に市販されているシアル酸の誘導体あるいは化学合成したものを用いることができる。具体的には、シアル酸の７位、８位あるいは９位の炭素に結合している水酸基を水素原子あるいはハロゲン原子で置換したものを挙げることができる。ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素等を挙げることができるが、好ましくはフッ素がよい。
シアル酸転移酵素としては、一般に市販されているもの、天然由来のもの、遺伝子組換えにより生産されたものを用いることができ、転移させるシアル酸あるいはシアル酸の誘導体の種類により適宜選択することができる。具体的には、α２，３転移酵素であるＲａｔ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来のもの、α２，６転移酵素であるＲａｔ Ｌｉｖｅｒ由来のものを挙げることができる。また、シアリターゼをもちいてｐＨ調整等により平衡をずらすことにより、シアル酸あるいはシアル酸の誘導体を転移させてもよい。
上記糖鎖アスパラギン誘導体のクロマトグラフィーによる分離は、適宜、公知のクロマトグラフィーを単独でまたは複数組み合わせて用いることにより行うことができる。
たとえば、得られた糖鎖アスパラギン誘導体混合物をゲル濾過カラムクロマトグラフィーで精製後、ＨＰＬＣを用いて精製する。ＨＰＬＣにおいて用い得るカラムとしては逆相系のカラムが好適であり、たとえば、ＯＤＳ、Ｐｈｅｎｙｌ系、ニトリル系や、陰イオン交換系のカラム、具体的には、たとえば、ファルマシア社製モノＱカラム、イヤトロン社製イアトロビーズカラムなどが利用可能である。分離条件等は適宜、公知の条件を参照して調整すればよい。以上の操作により、糖鎖アスパラギン誘導体混合物から所望の各糖鎖アスパラギン誘導体を得ることができる。
次に、上記で分離された糖鎖アスパラギン誘導体を加水分解することにより、所望の糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体を効率的に得ることができる。たとえば、糖鎖アスパラギン誘導体を分離する段階においては混合物に含まれる糖鎖アスパラギン誘導体の種類を制限して糖鎖アスパラギン誘導体を大まかに分離し、次いで加水分解、たとえば、糖加水分解酵素を用いて加水分解することにより所望の糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体を効率的に得ることができる。なお、加水分解は前記と同様にして行うことができる。特に、所望の糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体をより効率的に得る観点から、糖残基の切断様式が明確な糖加水分解酵素を用いて加水分解するのが好ましい。
たとえば、ガラクトース残基の除去は、加水分解される化合物を緩衝液（たとえば、リン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、グッド緩衝溶液など）に溶かし、公知の条件に従ってガラクトース加水分解酵素を用いてガラクトース残基の切断反応を行うことにより成し得る。なお、加水分解される化合物は各々単離されたものであっても混合物であってもよい。この反応で用いるガラクトース加水分解酵素は市販されている公知のエキソ型の酵素を利用するのが好ましい。また、同様の活性を有するものであれば、新たに単離された酵素、遺伝子工学的に創製された酵素であってもよい。次いで、前記と同様にして、反応後に得られる反応液（糖残基が切断された糖鎖アスパラギン誘導体の混合物）をクロマトグラフィーに供し、各糖鎖アスパラギン誘導体を得ればよい。たとえば、分離はＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８２：１８）で行うのが好ましい。
Ｎ−アセチルグルコサミン残基の除去は、加水分解される化合物を緩衝液（たとえば、リン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、グッド緩衝溶液など）に溶かし、公知の条件に従ってＮ−アセチルグルコサミン加水分解酵素を用いてＮ−アセチルグルコサミン残基の切断反応を行うことにより成し得る。また、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ加水分解酵素を用いてもよい。なお、加水分解される化合物は各々単離されたものであっても混合物であってもよい。この反応で用いる各酵素は市販されているエキソ型の酵素を利用するのが好ましい。また、同様の活性を有するものであれば、新たに単離された酵素、遺伝子工学的に創製された酵素であってもよい。次いで、前記と同様にして、反応後に得られる反応液（糖残基が切断された糖鎖アスパラギン誘導体の混合物）をクロマトグラフィーに供し、各糖鎖アスパラギン誘導体を得ればよい。たとえば、分離はＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：メタノール＝６５：３５または５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８２：１８）で行うのが好ましい。
マンノース残基の除去は、加水分解される化合物を緩衝液（たとえば、リン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、グッド緩衝溶液など）に溶かし、公知の条件に従ってマンノース加水分解酵素を用いてマンノース残基の切断反応を行うことにより成し得る。なお、加水分解される化合物は各々単離されたものであっても混合物であってもよい。この反応で用いるマンノース加水分解酵素は市販されているエキソ型の酵素を利用するのが好ましい。また、同様の活性を有するものであれば、新たに単離された酵素、遺伝子工学的に創製された酵素であってもよい。次いで、前記と同様にして、反応後に得られる反応液（糖残基が切断された糖鎖アスパラギン誘導体の混合物）をクロマトグラフィーに供し、各糖鎖アスパラギン誘導体を得ればよい。たとえば、分離はＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、展開溶媒は、１０〜２００ｍＭ程度の酢酸アンモニウムなどの緩衝溶液とアセトニトリル、あるいはエタノール、あるいはメタノール、あるいはブタノール、あるいはプロパノールなどの脂溶性のある水溶性有機溶剤を適宜混ぜて用いることができる。ここに例示する場合、展開溶媒としては５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８２：１８が好適である）で行うのが好ましい。
このようにして得られた各糖鎖アスパラギン誘導体を得た後、フコースを転移させることにより本発明の脂溶性の保護基でアスパラギンのアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンの非還元末端側のＮ−アセチルグルコサミンに少なくとも１個以上のフコースを含む新規な糖鎖アスパラギン誘導体を製造することができる。
フコースとしては、一般に市販されているフコースあるいは化学合成したものを用いることができる。
フコース転移酵素としては、一般に市販されているもの、天然由来のもの、遺伝子組換えにより生産されたものを用いることができ、転移させるフコースの種類により適宜選択することができる。具体的には、糖鎖アスパラギンの非還元末端側のＮ−アセチルグルコサミンにフコースを転移させる酵素であるＦｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｖ（Ｈｕｍａｎ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、血漿由来、血清由来、乳汁由来、肝臓由来）などを挙げることができる。また、フコース加水分解酵素を用いてｐＨ調整等により平衡ずらすことにより、フコースを転移させてもよい。
上記糖鎖アスパラギン誘導体のクロマトグラフィーによる分離は、適宜、公知のクロマトグラフィーを単独でまたは複数組合せて用いることにより行うことができる。
たとえば、得られた糖鎖アスパラギン誘導体混合物をゲル濾過カラムクロマトグラフィーで精製後、ＨＰＬＣを用いて精製する。ＨＰＬＣにおいて用い得るカラムとしては逆相系のカラムが好適であり、たとえば、ＯＤＳ、Ｐｈｅｎｙｌ系、ニトリル系や、陰イオン交換系のカラム、具体的には、たとえば、ファルマシア社製モノＱカラム、イヤトロン社製イアトロビーズカラムなどが利用可能である。分離条件等は適宜、公知の条件を参照して調整すればよい。以上の操作により、糖鎖アスパラギン誘導体混合物から所望の各糖鎖アスパラギン誘導体を得ることができる。
このように、各糖鎖アスパラギン誘導体を得た後、さらに各種糖加水分解酵素等を用いて当該誘導体を加水分解し、糖鎖の非還元末端の糖残基を除去することにより、たとえば、糖鎖の末端の分岐構造が不均一な様々な糖鎖アスパラギン誘導体をそれぞれ単一化合物として得ることができる。また、種々の糖加水分解酵素を用い、加水分解する順番やその種類を変えることで、より多くの種類の糖鎖アスパラギン誘導体を製造することができる。
従来の方法によれば、極限られた糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体を分析スケールで得るのにさえ膨大な時間とコストが必要であったが、本発明によれば、特別の装置や試薬を必要とすることなく、慣用のゲルろ過カラム、ＨＰＬＣカラムや、少なくとも３種類の糖加水分解酵素（たとえば、ガラクトース加水分解酵素、マンノース加水分解酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン加水分解酵素）等を使って、２週間程度で所望の糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体を１グラム程度調製することが可能である。
本発明では、上記先願で得られた各種の糖鎖アスパラギン、上記先願に記載のないα２，３結合体の糖鎖アスパラギン、並びに（α２，３）（α２，６）結合体の糖鎖アスパラギン、更にはこれらのフコース結合体の糖鎖アスパラギンを用いて、目的とするビオチン化又はＦＩＴＣ化した糖鎖アスパラギン誘導体を得るものである。
本発明は、糖鎖アスパラギンのアミノ基窒素をビオチン化又はＦＩＴＣ化した糖鎖アスパラギンである。
本発明のビオチン化糖鎖アスパラギンとしては、例えば、下記式で表される化合物を挙げることができる。
〔式中、Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、又は式（２）〜（６）で示される基であり、同一でも異なっていてもよい。〕
本発明のＦＩＴＣ化糖鎖アスパラギンとしては、例えば、下記式で表される化合物を挙げることができる。
〔式中、Ｒ１およびＲ２は上記と同じである。〕
また、本発明は、糖鎖アスパラギンのアミノ基窒素をビオチン化又はＦＩＴＣ化したビオチン化又はＦＩＴＣ化糖鎖アスパラギンの製造方法である。
本発明のビオチン化又はＦＩＴＣ化糖鎖アスパラギンの製造方法としては、例えば、上記に示した種々の単離された糖鎖アスパラギンのアスパラギンのアミノ基窒素をビオチン化又はＦＩＴＣ化することにより得ることができる。
本発明で使用される糖鎖アスパラギンとしては、例えば、式（７）で表される化合物を挙げることができる。
（式中、Ｒ１およびＲ２は上記に同じ。）
具体的な糖鎖アスパラギンとしては、先願に記載された化合物を挙げることができる。即ち、先願の第３〜４図に示されたα２，６化合物を同様に用いることができ、記号化したこれら化合物を本発明の表１〜３に示す。
また上記糖鎖アスパラギンを合成するために用いられた糖鎖アスパラギン誘導体としても、先願に記載されたα２，６化合物を挙げることができる。即ち、先願の第１〜２図に示された化合物を同様に用いることができ、記号化したこれら化合物を本発明の表４〜６に示す。
また上記先願に記載された糖鎖アスパラギン以外に、α２，３結合体の糖鎖アスパラギン、並びに（α２，３）（α２，６）結合体の糖鎖アスパラギン、更にはこれらのフコース結合体の糖鎖アスパラギンを用いることができる。
本発明のビオチン化としては、公知の方法に従って行うことができる。例えば、糖鎖アスパラギンを水に溶かし重炭酸ナトリウムを加え、ここに、Ｄ−（＋）−ビオチニルスクシンイミドを溶かしたジメチルホルムアミドを加え、室温で２０分反応させ、ゲルろ過カラム等で精製し、ビオチン化糖鎖アスパラギンを得ることができる。
本発明のビオチン化糖鎖アスパラギンを結合させたマイクロプレートは、市販のアビジン化したマイクロプレート（例えば、ピアス社製）に、ビオチン化した糖鎖アスパラギンを反応させることにより製造することができる。
また、本発明のビオチン化糖鎖アスパラギンを結合させたアフィニティーカラムは、市販のアビジン化したアフィニティーカラムに、ビオチン化した糖鎖アスパラギンを反応させることにより製造することができる。
本発明のＦＩＴＣ化としては、公知の方法に従って行うことができる。例えば、糖鎖アスパラギンを水に溶かし、アセトン、重炭酸ナトリウムを加え、ここに、フルオレセインイソチオシアネートを加え、室温で２時間反応させ、ゲルろ過カラム等で精製し、ＦＩＴＣ化糖鎖アスパラギンを得ることができる。
本発明で得られたＦＩＴＣ化糖鎖アスパラギンは、例えば生体組織中の糖類の受容体の研究、レクチンの糖結合特異性の研究に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下に実施例を挙げて説明するが、本発明は何らこれら実施例に限定されるものではない。なお、１Ｈ−ＮＭＲのデータは、実施例１〜７及び参考例４５については３０℃でＨＯＤを４．８ｐｐｍとして、参考例１〜４４については３０℃で内部標準としてアセトンのメチル基のシグナルを２．２２５ｐｐｍ、ＨＯＤを４．７１８ｐｐｍとして測定して得られた値である。また、Ｆｍｏｃ基が除去された化合物については測定溶媒中に５０ｍＭの炭酸水素アンモニウムを共存させて測定した。
参考例１ ジシアロ糖鎖アスパラギン（化合物２４）の合成
卵由来粗精製ＳＧＰ（シアリルグリコペプチド）２．６ｇをトリス−塩酸・塩化カルシウム緩衝溶液（ＴＲＩＺＭＡ ＢＡＳＥ ０．０５ｍｏｌ／ｌ、塩化カルシウム０．０１ｍｏｌ／ｌ、ｐＨ７．５）１００ｍｌに溶解させた。これにアジ化ナトリウム５８ｍｇ（７７２μｍｏｌ）とアクチナーゼ−Ｅ（科研製薬社製）５２６ｍｇを加え、３７℃で静置した。６５時間後、再びアクチナーゼ−Ｅを２６３ｍｇ加え、更に３７℃で２４時間静置した。この溶液を凍結乾燥した後、残留物をゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、２．５φ×１ｍ、展開溶媒は水、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎ・）で２回精製し、化合物２４を１．３ｇ（５５５μｍｏｌ）得た。
得られた化合物２４の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
５．１５（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０６（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９５（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８２（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６９（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．６７（２Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ１），４．５３（２Ｈ，ｄ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ１），４．３４（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２７（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），４．１９（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），３．０３（１Ｈ，ｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），３．００（１Ｈ，ｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７６（２Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ｅｑ），２．１５（１８Ｈ，ｓ×６，−Ａｃ），１．７９（２Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ａｘ）
参考例２ 化合物１、２、６および１０の合成
参考例１で得られた化合物２４（６０９ｍｇ，２６１μｍｏｌ）を水２０．７ｍｌに溶解させ、さらに０．１規定塩酸１３．８ｍｌを加えた。この溶液を７０℃で３５分間加熱した後速やかに氷冷し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えｐＨ７とした。これを凍結乾燥した後、残留物をゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、２．５φ×１ｍ、展開溶媒は水、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎ・）で精製したところ、化合物２４、化合物２５および２９、化合物３３の混合物５３４ｍｇを得た。この４成分はそれぞれを単離することなく次の工程に進めた。
なお、得られた糖鎖混合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
５．１３（ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．１２（ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０１（ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９４（ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．９３（ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８２（ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６０（ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．５８（ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ１），４．４７（ｄｄ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ１），４．４４（ｄ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ１），４．２４（ｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．１９（ｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），４．１１（ｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），２．９７（ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７２（ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．６４（ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１５（ｓ×５，−Ａｃ），１．７９（ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ３ａｘ）
得られた糖鎖の混合物４２９ｍｇをアセトン１６．３ｍｌと水１１．２ｍｌに溶解させた。ここに９−フルオレニルメチル−Ｎ−スクシニミヂルカーボネート（１５５．７ｍｇ，４６１．７μｍｏｌ）と炭酸水素ナトリウム（８０．４ｍｇ，９５７μｍｏｌ）を加え、室温で２時間攪拌した。この溶液をエバポレーターに供してアセトンを除き、残りの溶液をゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、２．５φ×１ｍ、展開溶媒は水、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎ・）で精製したところ、化合物１、化合物２および６、化合物１０の混合物３０９ｍｇが得られた。この混合物をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：メタノール＝６５：３５、２．０φ×２５ｃｍ、流速３ｍｌ／ｍｉｎ）を用いて精製したところ、５１分後に化合物１が、６７分後に化合物２および６の混合物が、９３分後に化合物１０が溶出した。それぞれを取り分け凍結乾燥を行った後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、２．５φ×３０ｃｍ、展開溶媒は水、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎ・）で脱塩することで目的の化合物２および６の混合物１５０ｍｇを得た。
なお、得られた化合物１の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
７．９９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５５（４Ｈ，ｍ，Ｆｍｏｃ），５．１５（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０６（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９５（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８２（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６９（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．６７（２Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ１），４．５３（２Ｈ，ｄ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ１），４．３４（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２７（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），４．１９（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），３．０３（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），３．００（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７６（２Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ｅｑ），２．１５（１８Ｈ，ｓ×６，−Ａｃ），１．７９（２Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ａｘ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１０３Ｈ１５４Ｎ８ＮａＯ６６［Ｍ＋Ｎａ＋］２５８１．８８３８，ｆｏｕｎｄ，２５８１．８８２１
上記の糖鎖の構造を記号化すると次のようになる。ここで
ＮｅｕＡｃ：シアル酸 Ｇａｌ：Ｄ−ガラクトース ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン Ｍａｎ：Ｄ−マンノース Ａｓｎ：アスパラギン
を示す。
また、得られた化合物２および６の混合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
７．９９（ｄ，Ｆｍｏｃ），７．７９（ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５５（ｍ，Ｆｍｏｃ），５．１４（ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．１２（ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ），５．００（ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９４（ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．９３（ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８２（ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６０（ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．５８（ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ１），４．４６（ｄｄ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ１），４．４４（ｄ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ１），４．２４（ｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．１９（ｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），４．１１（ｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），２．９７（ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７２（ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．６４（ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１５（ｓ×５，−Ａｃ），１．７９（ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ３ａｘ）
また、得られた化合物１０の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
７．９９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５５（４Ｈ，ｍ，Ｆｍｏｃ），５．１２（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０６（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９３（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８２（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６９（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．６７（２Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ１），４．５３（２Ｈ，ｄ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ１），４．３４（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２７（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），４．１９（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），３．０３（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），３．００（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１５（１２Ｈ，ｓ×４，−Ａｃ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ８１Ｈ１２０Ｎ６ＮａＯ５０［Ｍ＋Ｎａ＋］１９９９．６９３０，ｆｏｕｎｄ，１９９９．６９３９
参考例３ 化合物３および７の合成
参考例２で得られた化合物２および６の混合物（２２４ｍｇ，９７μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン２４ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ６．０）２２ｍｌに溶解させ、さらにＤｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来β−ガラクトシダーゼ（１．３５Ｕ）を加えた。この溶液を３７℃で１５時間静置した後、凍結乾燥を行った。残留物をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８５：１５、流速３ｍｌ／ｍｉｎ）で精製したところ、１２９分後に化合物３が、１３４分後に化合物７が溶出した。それぞれを取り分け、凍結乾燥を行った。続いてＨＰＬＣ〔ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は最初の１５分間が水、１６分後から３０分後までは水：アセトニトリル（容量比）＝１０：０から８５：１５、３１分後から４５分後までは水：アセトニトリル＝８５：１５から８０：２０になるようにグラジエントを掛けた。流速は３．０ｍｌ／ｍｉｎ・〕を用いて脱塩処理を行ったところ、目的とする化合物３が８１ｍｇ、化合物７が７５ｍｇ得られた。
なお、得られた化合物３の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
７．９９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５５（４Ｈ，ｍ，Ｆｍｏｃ），５．１５（１Ｈ，Ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０６（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９５（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８２（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６９（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．６７（２Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ１），４．５３（１Ｈ，ｄ，Ｇａｌ６’−Ｈ１），４．３４（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２７（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），４．１９（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），２．９７（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７６（１Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ３ｅｑ），２．６１（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１５（１５Ｈ，ｓ×５，−Ａｃ），１．７９（１Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ３ａｘ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ８６Ｈ１２７Ｎ７ＮａＯ５３［Ｍ＋Ｎａ＋］２１２８．７３５６，ｆｏｕｎｄ，２１２８．７３６３
また、得られた化合物７の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
７．９９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５５（４Ｈ，ｍ，Ｆｍｏｃ），５．１５（１Ｈ，Ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０６（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９５（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８２（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６９（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．６７（２Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ１），４．５３（１Ｈ，ｄ，Ｇａｌ６−Ｈ１），４．３４（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２７（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），４．１９（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），２．９７（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７６（１Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．６０（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１５（１５Ｈ，ｓ×５，−Ａｃ），１．７９（１Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ８６Ｈ１２５Ｎ７Ｎａ３Ｏ５３［Ｍ＋Ｎａ＋］２１７２．６９９５，ｆｏｕｎｄ，２１７２．７０８４
参考例４ 化合物４および８の合成
参考例３で得られた化合物３および７の混合物（９０ｍｇ，４７．３μｍｏｌ）をそれぞれ分離することなく、ウシ血清アルブミン８ｍｇと共にＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ６．０）８．１ｍｌに溶解させ、さらにＢｏｖｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ由来β−グルコサミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｂｏｖｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ）を２．８８Ｕ加えた。この溶液を３７℃で１８時間静置した後凍結乾燥し、残留物をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：メタノール＝６５：３５、流速３ｍｌ／ｍｉｎ）で精製したところ、１１７分後に化合物４が、１２７分後に化合物８が溶出した。それぞれを取り分け、凍結乾燥を行った。続いてＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は最初の１５分間が水、１６分後から３０分後までは水：アセトニトリル＝１０：０から８５：１５、３１分後から４５分後までは水：アセトニトリル＝８５：１５から８０：２０になるようにグラジエントを掛けた。流速は３．０ｍｌ／ｍｉｎ・）を用いて脱塩処理を行ったところ、目的とする化合物４が４０ｍｇ、化合物８が３７ｍｇ得られた。
なお、得られた化合物４の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
８．０１（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．８０（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５６（４Ｈ，ｍ，Ｆｍｏｃ），５．２２（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０８（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９４（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８４（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６９（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．６７（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５−Ｈ１），４．５５（１Ｈ，ｄ，Ｇａｌ６−Ｈ１），４．３３（１Ｈ，ｄｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２０（１Ｈ，ｄｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．１５（１Ｈ，ｄｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），２．９７（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７６（２Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ｅｑ），２．６２（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１５（１２Ｈ，ｓ×４，−Ａｃ），１．７９（２Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ａｘ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ７８Ｈ１１４Ｎ６ＮａＯ４８［Ｍ＋Ｎａ＋］１９２５．６５６２，ｆｏｕｎｄ，１９２５．６５３９
また、得られた化合物８の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
７．９９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５５（４Ｈ，ｍ，Ｆｍｏｃ），５．１５（１Ｈ，Ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０６（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９５（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８２（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６９（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．６７（２Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ１），４．５３（２Ｈ，ｄ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ１），４．３４（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２７（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），２．９７（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ２），２．７６（１Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ３ｅｑ），２．６１（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ２），２．１５（１２Ｈ，ｓ×４，−Ａｃ），１．７９（１Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ３ａｘ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ７８Ｈ１１４Ｎ６ＮａＯ４８［Ｍ＋Ｎａ＋］１９２５．６５６２，ｆｏｕｎｄ，１９２５．６５３３
参考例５ 化合物５の合成
参考例４で得られた化合物４（３０ｍｇ，４７３μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン３ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ６．０）６ｍｌに溶解させ、さらにＪａｃｋ Ｂｅａｎｓ由来α−マンノシダーゼを１０Ｕ加えた。この溶液を３７℃で２１時間静置した後凍結乾燥し、続いてＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は最初の１５分間が水、１６分後から３０分後までは水：アセトニトリル＝１０：０から８５：１５、３１分後から４５分後までは水：アセトニトリル＝８５：１５から８０：２０になるようにグラジエントを掛けた。流速は３．０ｍｌ／ｍｉｎ・）を用いて精製したところ、目的とする化合物５が２０ｍｇ得られた。
なお、得られた化合物５の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
８．０１（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．８０（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５６（４Ｈ，ｍ，Ｆｍｏｃ），５．００（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９５（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８４（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６７（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．５６（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５−Ｈ１），４．４４（１Ｈ，ｄ，Ｇａｌ６−Ｈ１），４．１１（１Ｈ，ｄｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），４．０７（１Ｈ，ｄｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），２．９７（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７６（１Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ３ｅｑ），２．６２（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１５（１２Ｈ，ｓ×４，−Ａｃ），１．７９（２Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ３ａｘ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ７２Ｈ１０４Ｎ６ＮａＯ４３［Ｍ＋Ｎａ＋］１７６３．６０３４，ｆｏｕｎｄ，１７６３．６０７４
参考例６ 化合物９の合成
参考例４で得られた化合物８（４０ｍｇ，６３０μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン５ｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ６．０）７．８ｍｌに溶解させ、Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ由来α−マンノシダーゼを３８Ｕ加えた。この溶液を３７℃で６３時間静置した後凍結乾燥し、続いてＨＰＬＣＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は最初の１５分間が水、１６分後から３０分後までは水：アセトニトリル＝１０：０から８５：１５、３１分後から４５分後までは８５：１５から８０：２０になるようにグラジエントを掛けた。流速は３．０ｍｌ／ｍｉｎ）を用いて精製したところ、目的とする化合物９が３０ｍｇ得られた。
なお、得られた化合物９の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
８．０１（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．８０（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５６（４Ｈ，ｍ，Ｆｍｏｃ），５．２３（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０８（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．５３（１Ｈ，ｄ，Ｇａｌ６−Ｈ１），４．３２（１Ｈ，ｄｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２８（１Ｈ，ｄｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），２．８１（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７６（１Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．５９（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１３（１２Ｈ，ｓ×４，−Ａｃ），１．８０（１Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７Ｈ３ａｘ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ７２Ｈ１０４Ｎ６ＮａＯ４３［Ｍ＋Ｎａ＋］１７６３．６０３４，ｆｏｕｎｄ，１７６３．６０４１
参考例７ Ｆｍｏｃ基の脱保護（化合物３３の合成）
参考例２で得られた化合物１０（１０．５ｍｇ，５．２７μｍｏｌ）を５０％モルホリン／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液１．４ｍｌに溶解させ、室温・アルゴン雰囲気下で２時間反応させた。この溶液にトルエン３ｍｌを加え、３５℃でエバポレーターに供した。この操作を三回繰り返し、反応溶媒を取り除いた。残留物をゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、２．５φ×３０ｃｍ、展開溶媒は水、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎ・）で精製したところ、目的とする化合物３３が７ｍｇ得られた（収率は７６％）。なお、得られた化合物の構造は、参考例２から得られる化合物３３と１Ｈ−ＮＭＲスペクトルが一致したことから確認した。
化合物３３の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．１２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ−１），４．５８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ−１），４．４７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ−１），４．２４（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１９（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１．４Ｈｚ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），４．１２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１．４Ｈｚ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．９３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，１７．０Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．９３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１７．０Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），２．０５（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），２．０１（ｓ，３Ｈ，Ａｃ）
参考例８ 化合物１４の合成
化合物３（２８ｍｇ，２１．３μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１．０ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，４５４μＬ）に溶解させ、ノイラミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｖｉｂｌｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ，１９８ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で２０時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。反応溶液をＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物１４（１７ｍｇ，収率７０％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ７．９１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．７１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．５１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．１２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），４．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．５８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ−１），４．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ５’−Ｈ−１），４．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｇａｌ６’−Ｈ−１），４．３４（ｔ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２４（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１８（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，３．３Ｈｚ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），４．１１（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，３．５Ｈｚ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），２．７２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１５．７Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．５２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１５．７Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０６，２．０５，２．０４，１．８９（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ７５Ｈ１１０Ｎ６ＮａＯ４５［Ｍ＋Ｎａ＋］１８３７．６４０２，ｆｏｕｎｄ １８３７．６４７１
参考例９ 化合物１９の合成
化合物７（２０ｍｇ，９．４μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１．６ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，３２３μＬ）に溶解させ、ノイラミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｖｉｂｌｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ，１４１ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で１８時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。続いてＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物１９（１３ｍｇ，収率７６％）を得た。得られた化合物の構造は１Ｈ−ＮＭＲが標品と一致したことから確認した。
参考例１０ 化合物１５の合成
化合物４（４５ｍｇ，２４μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１．７ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，８２０μＬ）に溶解させ、ノイラミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｖｉｂｌｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ，１３４ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で１４時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。続いて、反応溶液をＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物１５（２８ｍｇ，収率７４％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ７．９２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．７１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．５１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４４（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．１０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），４．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．５８（ｄ，２Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５’−Ｈ−１），４．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｇａｌ６’−Ｈ−１），４．３５（ｔ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２４（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１１（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），４．０７（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．７２（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．５２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０６，２．０４，１．８９（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ６７Ｈ９７Ｎ５ＮａＯ４０［Ｍ＋Ｎａ＋ １６３４．５６０８，ｆｏｕｎｄ，１６３４．５５６４
参考例１１ 化合物７０の合成
化合物１５（１１ｍｇ，６．８μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１．５ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，２６９μＬ）に溶解させ、β−ガラクトシダーゼ（生化学工業社製、ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ，１１μＬ，２７５ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で１４時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。反応溶液をＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物７０（６．３ｍｇ，収率６４％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ７．９１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．７０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．５０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．１０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），４．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．５５（ｄ，２Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５’−Ｈ−１），４．３２（ｔ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２４（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１０（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），４．０６（ｂｓ，１Ｈ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），２．７２（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．０Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．５２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，１４．８Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０６，２．０５，１．８９（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ６１Ｈ８８Ｎ５Ｏ３５［Ｍ＋Ｈ＋］１４５０．５，ｆｏｕｎｄ，１４５０．４
参考例１２ 化合物２０の合成
化合物８（４７ｍｇ，２５μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１．９ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，８４０μＬ）に溶解させ、ノイラミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｖｉｂｌｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ，３６９ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で３７時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。反応溶液を凍結乾燥し、続いてＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物２０（２６ｍｇ，収率６５％）を得た。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ７．９２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．７１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．５１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．１２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），４．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．５７（ｂｄ，２Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５’−Ｈ−１），４．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｇａｌ６’−Ｈ−１），４．３４（ｔ，３Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２４（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），４．１９（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．７２（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．５２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０６，２．０５，１．８９（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ６７Ｈ９７Ｎ５ＮａＯ４０［Ｍ＋Ｎａ＋］１６３４．５６０８，ｆｏｕｎｄ，１６３４．５６４４
参考例１３ 化合物７１の合成
化合物２０（１２ｍｇ，７．４μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１．０ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，３３０μＬ）に溶解させ、β−ガラクトシダーゼ（生化学工業社製、ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ，１２μＬ，２９７ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で４６時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。反応溶液をＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ。最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物７１（６．６ｍｇ，収率６１％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ７．９０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．７０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４９（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４２（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．１１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），４．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．５５（ｄ，２Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５−Ｈ−１），４．３１（ｂ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２４（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１８（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），３．９７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，３．３Ｈｚ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），２．７２（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．５２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−ββＣＨ），２．０６，２．０５，１．８８（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ６１Ｈ８８Ｎ５Ｏ３５［Ｍ＋Ｈ＋］１４５０．５，ｆｏｕｎｄ，１４５０．３
参考例１４ 化合物１６の合成
化合物５（３２ｍｇ，１８．４μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン２．５ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，７１３μＬ）に溶解させ、ノイラミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｖｉｂｌｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ，１３４ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で１７時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。続いて、反応溶液をＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物１６（１３ｍｇ，収率５２％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ７．９２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．７１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．５１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４４（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７５（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．５８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２，５’−Ｈ−１），４．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｇａｌ６’−Ｈ−１），４．３４（ｔ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．１０（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．０７（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），２．７２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．５２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０７，２．０５，１．８９（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ６１Ｈ８８Ｎ５Ｏ３５［Ｍ＋Ｈ＋］１４５０．５，ｆｏｕｎｄ，１４５０．３
参考例１５ 化合物１７の合成
化合物１６（９ｍｇ，６．２μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１．６ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，６１３μＬ）に溶解させ、β−ガラクトシダーゼ（生化学工業社製、ｆｒｏｍ−Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ，１８６ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で３２時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。反応溶液をＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物１７（５．４ｍｇ，収率６８％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ７．８９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．６８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４９（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４２（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），４．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２，５’−Ｈ−１），４．０９，４．０７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２，Ｍａｎ３−Ｈ−２），２．７２（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．５６（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０７，２．０５，１．８９（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ５５Ｈ７７Ｎ５ＮａＯ３０［Ｍ＋Ｎａ＋］１３１０．５，ｆｏｕｎｄ，１３１０．２
参考例１６ 化合物１８の合成
化合物１７（３．４ｍｇ，２．６μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１．１ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，２５７μＬ）に溶解させ、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（シグマアルドリッチ ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ，１４４ｍＵ），加えた。この溶液を３７℃で２４時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。反応溶液をＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ。最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物１８（２．１ｍｇ，収率７５％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ７．９１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．７１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．５１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．５８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ−１），４．３４（ｔ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），３．９７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，３．７Ｈｚ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），２．７２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１５．１Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．５２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１５．１Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０７，１．８９（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４７Ｈ６５Ｎ４Ｏ２５［Ｍ＋Ｎａ＋］１０８５．４，ｆｏｕｎｄ，１０８５．３
参考例１７ 化合物２１の合成
化合物９（２８ｍｇ，１６μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１．７ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，６２４μＬ）に溶解させ、ノイラミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｖｉｂｌｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ，１１７ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で１７時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。続いて、反応溶液をＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ。最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物２１（１４．６ｍｇ，収率６８％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ７．９２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．７１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．５０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．１２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），４．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．７７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．５７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ−１），４．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｇａｌ６−Ｈ−１），４．３４（ｔ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２２（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１９（ｂ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．７２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．５２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０５（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），１．８９（ｓ，３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ６１Ｈ８８Ｎ５Ｏ３５［Ｍ＋Ｈ＋］１４５０．５，ｆｏｕｎｄ，１４５０．３
参考例１８ 化合物２２の合成
化合物２１（１０ｍｇ，６．９μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１．６ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，６７２μＬ）に溶解させ、β−ガラクトシダーゼ（生化学工業社製、ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ，２０５ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で２０時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。反応溶液をＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物２２（５．６ｍｇ，収率６４％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ７．８７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．６７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４８（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．１２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），４．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．７６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．５５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２，５−Ｈ−１），４．２６（ｔ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１８（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，３．３Ｈｚ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．７２（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．５４（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０５（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），１．８８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ５５Ｈ７８Ｎ５Ｏ３０［Ｍ＋Ｈ＋］１２８８．５，ｆｏｕｎｄ，１２８８．３
参考例１９ 化合物２３の合成
化合物２２（３．６ｍｇ，２．８μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１．２ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，２７７μＬ）に溶解させ、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（シグマアルドリッチ ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ，１９５ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で２４時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。反応溶液をＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物２３（２．３ｍｇ，収率７７％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ７．９１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．７０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．５０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．１１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），４．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．７７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．５７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ−Ｈ−１），４．３３（ｔ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．０７（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．７２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．５２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０５，１．８９（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４７Ｈ６５Ｎ４Ｏ２５［Ｍ＋Ｈ＋］１０８５．４，ｆｏｕｎｄ，１０８５．３
参考例２０ 化合物１１の合成
化合物１０（１２３ｍｇ，６２μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン（１．１ｍｇ）をＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，２．５ｍＬ）に溶解させ、β−ガラクトシダーゼ（生化学工業社製、ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ，２４μＬ，６１２ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で６１時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。反応溶液を凍結乾燥し、続いてＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速３．５ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ。最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物１１（７１ｍｇ，収率７０％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ７．９１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．７１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．５０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．１１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），４．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．５５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２，５−Ｈ−１），４．３４（ｔ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２４（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１８（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），４．１０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），２．７２（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．５１（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０６（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），２．０５（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），１．８８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ６９Ｈ１００Ｎ６ＮａＯ４０［Ｍ＋Ｎａ＋］１６７５．５８７３，ｆｏｕｎｄ，１６７５．５８４１
参考例２１ 化合物１２の合成
化合物１１（５０ｍｇ，３０μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン２．０ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，９２０μＬ）に溶解させ、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ，２．１Ｕ）を加えた。この溶液を３７℃で４８時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。反応溶液をＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製し、凍結乾燥を行った。この残留物をＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物１２（２５ｍｇ，収率６６％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ７．９１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．７０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．５０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．１０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），４．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９１（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．５８〜４．５２（ｂ，１Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ−１），４．３３（ｔ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２４（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．０６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，３．２Ｈｚ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），３．９７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，３．５Ｈｚ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），２．７２（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．５３（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０５，１．８８（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ），
参考例２２ 化合物１３の合成
化合物１２（１０ｍｇ，１１μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン０．９ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，４４０μＬ）に溶解させ、α−マンノシダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ，３０μＬ，３．２Ｕ）を加えた。この溶液を３７℃で２１時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。続いてＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製を行った。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物１３（３ｍｇ，収率４３％）を得た。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ７．９２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．７１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．５１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），４．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．７６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．５７（１Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ−１），４．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），２．７２（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．５２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１５．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０５，１．８９（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ），
（糖鎖アスパラギン誘導体のＦｍｏｃ基の脱保護）
全ての糖鎖アスパラギン誘導体において、以下の手順でＦｍｏｃ基の脱保護を行った。まず、糖鎖アスパラギンＦｍｏｃ体１μｍｏｌあたりに２４０μＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、１６０μＬのモルホリンを加え、室温・アルゴン雰囲気下で反応させた。ＴＬＣ（展開溶媒として１Ｍ 酢酸アンモニウム：イソプロパノール＝８：５を用いた）にて反応終了を確認した後、氷水で冷却した。ここにジエチルエーテルを反応溶液の１０倍量加えて１５分間攪拌した後、析出した沈殿物をろ別した。得られた残渣を水に溶解させ、３５℃でエバポレートした。更にトルエンを３ｍＬ加えエバポレートするという操作を三回繰り返した。残留物を逆相カラムクロマトグラフィー（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、展開溶媒は水）により精製した。
参考例２３ 化合物３３の合成
化合物１０（１０．５ｍｇ，５．３μｍｏｌ）を上記の操作で７時間反応させたところ、目的とする化合物３３（７ｍｇ，収率７６％）が得られた。得られた化合物は１Ｈ−ＮＭＲが標品と一致したことから確認した。
参考例２４ 化合物２６の合成
化合物３（８．０ｍｇ，３．８μｍｏｌ）を上記の操作で２１時間反応させたところ、目的とする化合物２６（６．３ｍｇ，収率８８％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．１３（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９５（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７８（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６２（２Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５’−Ｈ−１），４．５６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ５−Ｈ−１），４．５２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｇａｌ６’−Ｈ−１），４．２５（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１９（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），４．１２（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．９４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，１７．０Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．８５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１７．０Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．６８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１２．４Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ−３ｅｑ），２．０８，２．０７，２．０６，２．０４，２．０２（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ），１．７２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ，１２．１Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ−３ａｘ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ７１Ｈ１１８Ｎ７Ｏ５１［Ｍ＋Ｈ＋］１８８４．７，ｆｏｕｎｄ，１８８４．５
参考例２５ 化合物２７の合成
化合物４（１１．０ｍｇ，５．８μｍｏｌ）を上記の操作で２３時間反応させたところ、目的とする化合物２７（８．５ｍｇ，収率８８％）で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．１１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９５（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７８（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６２（ｄ，２Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５’−Ｈ−１），４．４５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｇａｌ６’−Ｈ−１），４．２６（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１２（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），４．０８（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，３．３Ｈｚ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．９４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１７．２Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．８５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１７．２Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．６８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，１２．１Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ−３ｅｑ），２．０９，２．０７，２．０４，２．０２（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ），１．７２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ，１２．１Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ−３ａｘ），；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ６３Ｈ１０４Ｎ６ＮａＯ４６［Ｍ＋Ｎａ＋］１７０３．６，ｆｏｕｎｄ，１７０３．１
参考例２６ 化合物２８の合成
化合物５（７．０ｍｇ，４．０μｍｏｌ）を上記の操作で２１時間反応させたところ、目的とする化合物２８（５．３ｍｇ，収率８７％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９４（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６１，４．５９（ｅａｃｈ ｄ，ｅａｃｈ １Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５’−Ｈ−１），４．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｇａｌ６’−Ｈ−１），４．１０，４．０７（ｅａｃｈ １Ｈ，Ｍａｎ４’，３−Ｈ−２），２．９３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１７．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．８５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１７．５Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．６７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１２．２Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ−３ｅｑ），２．０８，２．０６，２．０２，２．０１（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ），１．７１（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ，１２．２Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ−３ａｘ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ５７Ｈ９４Ｎ６ＮａＯ４１［Ｍ＋Ｎａ＋］１５４１．５，ｆｏｕｎｄ，１５４１．３
参考例２７ 化合物３０の合成
化合物７（１３．９ｍｇ，６．６μｍｏｌ）を上記の操作で７時間反応させたところ、目的とする化合物３０（８．０ｍｇ，収率６４％）を得た。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．１３（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’―Ｈ−１），４．７７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６１，４．６０（ｅａｃｈ ｄ，ｅａｃｈ １Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２，５−Ｈ−１），４．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ５’−Ｈ−１），４．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｇａｌ６−Ｈ−１），４．２４（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１９（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，３．２Ｈｚ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），４．１０（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，３．２Ｈｚ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．９０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，１６．７Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．８０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１６．７Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．６６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１２．４Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ−３ｅｑ），２．０７，２．０６，２．０５，２．０２，２．０１（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ），１．７１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，１２．４Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ−３ａｘ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ７１Ｈ１１７Ｎ７ＮａＯ５１［Ｍ＋Ｎａ＋］１９０６．７，ｆｏｕｎｄ，１９０６．１
参考例２８ 化合物３１の合成
化合物８（８．０ｍｇ，４．２μｍｏｌ）を上記の操作で１２時間反応させたところ、目的とする化合物３１（６．０ｍｇ，収率８６％）を得た。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．１２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６１，４．５９（ｅａｃｈ ｄ，ｅａｃｈ １Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５−Ｈ−１），４．４３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｇａｌ６−Ｈ−１），４．２４（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１８（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），２．９１（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝１７．０Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．８１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１７．０Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．６６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１２．６Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ−３ｅｑ），２．０６，２．０６，２．０２，２．００（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ），１．７０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．６Ｈｚ，１２．６Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ−３ａｘ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ６３Ｈ１０４Ｎ６ＮａＯ４６［Ｍ＋Ｎａ＋］１７０３．６，ｆｏｕｎｄ，１７０３．０
参考例２９ 化合物３２の合成
化合物９（７．７ｍｇ，４．４μｍｏｌ）を上記の操作で２３時間反応させたところ、目的とする化合物３２（５．２ｍｇ，収率７８％）で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．１４（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．７８（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６１，４，６０（ｅａｃｈ ｄ，ｅａｃｈ １Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５−Ｈ−１），４．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｇａｌ６−Ｈ−１），４．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１９（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，２．９Ｈｚ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．９２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，１７．２Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１２．７Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．６７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１２．７Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ−３ｅｑ），２．０６（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），２．０３，２．０１（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ），１．７１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ，１２．７Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ−３ａｘ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ５７Ｈ９４Ｎ６ＮａＯ４１［Ｍ＋Ｎａ＋］１５４１．５，ｆｏｕｎｄ，１５４１．２
参考例３０ 化合物３７の合成
化合物１４（９．１ｍｇ，５．０μｍｏｌ）を上記の操作で１３時間反応させたところ、目的とする化合物３７（６．５ｍｇ，収率７７％）で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．１１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７５（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６１，４．５７，４．５５（ｅａｃｈ ｄ，ｅａｃｈ １Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２，５，５’−Ｈ−１），４．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，Ｇａｌ６’−Ｈ−１），４．２３（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１８（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），４．１０（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．８７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１７．０Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１７．０Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０７（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），２．０４（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），２．００（ｓ，３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ６０Ｈ１００Ｎ６ＮａＯ４３［Ｍ＋Ｎａ＋］１６１５．６，ｆｏｕｎｄ，１６１５．０
参考例３１ 化合物４２の合成
化合物１９（９．８ｍｇ，５．４μｍｏｌ）を上記の操作で１３時間反応させたところ、目的とする化合物４２（８．０ｍｇ，収率８８％）で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．１１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６０，４．５７，４．５５（ｅａｃｈ ｄ，ｅａｃｈ １Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５，５’−Ｈ−１），４．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｇａｌ６−Ｈ−１），４．２８（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１８（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），４．１０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．８８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１６．６Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１６．６Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０７（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），２．０４（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），２．００（ｓ，３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ６０Ｈ１０１Ｎ６Ｏ４３［Ｍ＋Ｈ＋］１５９３．６，ｆｏｕｎｄ，１５９３．８
参考例３２ 化合物３８の合成
化合物１５（５．１ｍｇ，３．２μｍｏｌ）を上記の操作で１１時間反応させたところ、目的とする化合物３８（４．０ｍｇ，収率９１％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．１０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６１，４．５７（ｅａｃｈ ｄ，ｅａｃｈ １Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２，５’−Ｈ−１），４．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｇａｌ６’−Ｈ−１），４．２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１０，４．０６（ｅａｃｈ ｂｄ，ｅａｃｈ １Ｈ，Ｍａｎ４’，４−Ｈ−２），２．９０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，１６．８Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．８１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１６．８Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０７，２．０４，２．０１（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ５２Ｈ８８Ｎ５Ｏ３８［Ｍ＋Ｈ＋］１３９０．５，ｆｏｕｎｄ，１３９０．１
参考例３３ 化合物７２の合成
化合物７０（４．０ｍｇ，２．８μｍｏｌ）を上記の操作で１３時間反応させたところ、目的とする化合物７２（２．９ｍｇ，収率８５％）で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．０９（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６１，４．５４（ｅａｃｈ ｄ，ｅａｃｈ １Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５−Ｈ−１），４．２４（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１０，４．０６（ｅａｃｈ ｂｓ，ｅａｃｈ １Ｈ，Ｍａｎ４，４’−Ｈ−２），２．８７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１７．２Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１７．２Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０７，２．０４，２．００（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４６Ｈ７８Ｎ５Ｏ３３［Ｍ＋Ｈ＋］１２２８．５，ｆｏｕｎｄ，１２２８．３
参考例３４ 化合物４３の合成
化合物２０（５．４ｍｇ，３．３μｍｏｌ）を上記の操作で１１時間反応させたところ、目的とする化合物４３（４．１ｍｇ，収率８７％）で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．１１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６１，４．５７（ｅａｃｈ ｄ，ｅａｃｈ １Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５−Ｈ−１），４．４６（ｄ，１Ｈ，Ｇａｌ６−Ｈ−１），４．２４（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１８（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．９０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１７．０Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．８０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１７．０Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０７，２．０４，２．０１（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ５２Ｈ８８Ｎ５Ｏ３８［Ｍ＋Ｈ＋］１３９０．５，ｆｏｕｎｄ，１３９０．２
参考例３５ 化合物７３の合成
化合物７１（４．０ｍｇ，２．８μｍｏｌ）を上記の操作で１３時間反応させたところ、目的とする化合物７３（２．９ｍｇ，収率８５％）で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．１１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６０，４．５４（ｅａｃｈ ｄ，ｅａｃｈ １Ｈ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２，５−Ｈ−１），４．２４（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１．６Ｈｚ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），３．９６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１．６Ｈｚ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．８８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，１６．８Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１６．８Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０６，２．０４，２．００（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４６Ｈ７８Ｎ５Ｏ３３［Ｍ＋Ｈ＋］１２２８．５，ｆｏｕｎｄ，１２２８．３
参考例３６ 化合物３９の合成
化合物１６（２．２ｍｇ，１．５μｍｏｌ）を上記の操作で７時間反応させたところ、目的とする化合物３９（１．６ｍｇ，収率８４％）で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７５（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６２，４．５８（ｅａｃｈ ｄ，ｅａｃｈ １Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５−Ｈ−１），４．０９，４．０８（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ １Ｈ，Ｍａｎ３，４’−Ｈ−２），２．９１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，１６．９Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．８１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１６．９Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０８，２．０４，２．０１（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４６Ｈ７７Ｎ５ＮａＯ３３［Ｍ＋Ｎａ＋］１２５０．４，ｆｏｕｎｄ，１２５０．３
参考例３７ 化合物４０の合成
化合物１７（１．５ｍｇ，１．２μｍｏｌ）を上記の操作で１４時間反応させたところ、目的とする化合物４０（１．１ｍｇ，収率８９％）で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６２，４．５５（ｅａｃｈ ｄ，ｅａｃｈ １Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５−Ｈ−１），４．１０，４．０７（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ １Ｈ，Ｍａｎ４’，３−Ｈ−２），２．８９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１７．０Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１７．０Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０７，２．０５，２．０１（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４０Ｈ６７Ｎ５ＮａＯ２８［Ｍ＋Ｎａ＋］１０８８．４，ｆｏｕｎｄ，１０８８．２
参考例３８ 化合物４１の合成
化合物１８（１．３ｍｇ，１．２μｍｏｌ）を上記の操作で１４時間反応させたところ、目的とする化合物４１（０．８ｍｇ，収率８０％）で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ−１），４．０８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），２．９２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，１７．３Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１７．３Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０７，２．０１（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３２Ｈ５５Ｎ４Ｏ２７［Ｍ＋Ｈ＋］８６３．３，ｆｏｕｎｄ ８６３．２
参考例３９ 化合物４４の合成
化合物２１（２．３ｍｇ，１．６μｍｏｌ）を上記の操作で７時間反応させたところ、目的とする化合物４４（１．６ｍｇ，収率８４％）で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．１１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．７７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６１，４．５７（ｅａｃｈ ｄ，ｅａｃｈ １Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５−Ｈ−１），４．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｇａｌ−Ｈ−１），４．２２，４．１８（ｅａｃｈ ｂｓ，ｅａｃｈ １Ｈ，Ｍａｎ３，４−Ｈ−２），２．９１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，１７．３Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．８２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１７．３Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０５，２．０４，２．０１（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４６Ｈ７８Ｎ５Ｏ３３［Ｍ＋Ｈ＋］１２２８．５，ｆｏｕｎｄ，１２２８．３
参考例４０ 化合物４５の合成
化合物２２（１．６ｍｇ，１．３μｍｏｌ）を上記の操作で１４時間反応させたところ、目的とする化合物４５（１．１ｍｇ，収率８５％）で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．１２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．７７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６１，４．５４（ｅａｃｈ ｄ，ｅａｃｈ １Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５−Ｈ−１），４．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，３．０Ｈｚ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），２．８９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，１６．９Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１６．９Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０６，２．０５，２．０１（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４０Ｈ６７Ｎ５ＮａＯ２８［Ｍ＋Ｎａ＋］１０８８．４，ｆｏｕｎｄ，１０８８．３
参考例４１ 化合物４６の合成
化合物２３（１．６ｍｇ，１．５μｍｏｌ）を上記の操作で１４時間反応させたところ、目的とする化合物４６（１．１ｍｇ，６．４μｍｏｌ，収率８５％）で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．１０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．７７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ−１），４．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．０７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，３．０Ｈｚ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），２．９０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，１７．０Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．８０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１７．２Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０５，２．０１（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３２Ｈ５５Ｎ４Ｏ２３［Ｍ＋Ｈ＋］８６３．３，ｆｏｕｎｄ ８６３．３
参考例４２ 化合物３４の合成
化合物１１（１２．４ｍｇ，７．５μｍｏｌ）を上記の操作で１１時間反応させたところ、目的とする化合物３４（９．２ｍｇ，収率８６％）で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．１１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ−１），４．５５（ｄ，２Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ−１），４．２４（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１８（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），４．１０（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．８０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．８Ｈｚ，１５．６Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．６３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１５．６Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０７（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），２．０５（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），２．０１（ｓ，３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ５４Ｈ９０Ｎ６ＮａＯ３８［Ｍ＋Ｎａ＋］１４５３．５，ｆｏｕｎｄ，１４５３．２
参考例４３ 化合物３５の合成
化合物１２（１２．０ｍｇ，８．４μｍｏｌ）を上記の操作で１１時間反応させたところ、目的とする化合物３５（７．０ｍｇ，収率８１％）で得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ５．１０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７８（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ−１），４．２５（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．０６（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），３．９７（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．７９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１７．０Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．６１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１７．０Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０７，２．０１（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３８Ｈ６５Ｎ４Ｏ２８［Ｍ＋Ｈ＋］１０２５．４，ｆｏｕｎｄ，１０２５．２
参考例４４ 化合物３６の合成
化合物１３（８．４μｍｏｌ）を上記の操作で１１時間反応させたところ、目的とする化合物３６で得られた。
参考例４５ 化合物７６、７７の合成および単離
化合物２及び化合物６の混合物（５．０ｍｇ，２．２μｍｏｌ）を２２０μＬの水に溶解させ、２２ｍＭの炭酸セシウム水溶液を１００μＬ加え、ｐＨ７．０とした。この溶液を凍結乾燥した。乾燥後の固形物にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを４３０μＬ加え、更に６．６μｍｏｌのベンジルブロマイド／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液を２０μＬ加えた。この溶液をアルゴン雰囲気下で攪拌した。４８時間後、ＴＬＣ（展開溶媒は１Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ：イソプロパノール＝１：２を用いた）にて原料の消失を確認した後、４．４ｍＬのジエチルエーテルを加えて化合物を沈殿させた。沈殿した糖鎖を濾過し、残った糖鎖を水に溶解させ凍結乾燥した。凍結乾燥後の残留物を分取ＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝７８：２２、流速４．０ｍＬ／ｍｉｎ）で精製したところ、８８分後に化合物７７が、９１分後に化合物７６が溶出した。それぞれを取り分け、更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、化合物２のベンジル体が１．６ｍｇ、化合物６のベンジル体が１．８ｍｇ得られた。
化合物２のベンジル体（１０糖、１３．６ｍｇ、５．８ｍｍｏｌ）を、氷冷下にＮａＯＨａｑ．（ｐＨ＝１２）１．４ｍｌに溶解させた。反応をＨＰＬＣでモニターしながら約８時間撹拌した。反応の進行が終了した時点で、反応液を４０ｍＭ ＨＣｌにてｐＨ＝７．０に調整した。中和後の液を、メンブランフィルターで濾過した後、濃縮、次いでＨＰＬＣ（ＹＭＣ− Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＭ，ＳＨ−３４３−５ＡＭ，２０×２５０ｍｍ，ＡＮ／２５ｍＭ ＡｃＯＮＨ４ ｂｕｆｆｅｒ＝２０／８０，７．０ｍｌ／ｍｉｎ．，ｗａｖｅ ｌｅｎｇｔｈ；２７４ｎｍ）にて分取・精製を行った。分取した液を濃縮後、ＯＤＳカラム（コスモシール ７５Ｃ１８−ＯＰＮ，ナカライテスク社製）にて脱塩処理を行い、濃縮、凍結乾燥を行うと、化合物２の単品（６．２ｍｇ，４７．４％）が得られた。
得られた化合物２（４．０ｍｇ，１．７６ｍｍｏｌ）に、ＤＭＳＯ２８２ｍｌを加え溶解させた。この反応液に、モルホリン２８２ｍｌを加えて室温下に撹拌を行った。反応を、ＴＬＣにてモニターしながら約１時間反応を行った。原料が消失したことを確認した後、反応液にアセトン／ジイソプロピルエーテル（ＩＰＥ）＝１／１の溶液５ｍｌを加える。このスラリーを、メンブランフィルターにてろ過を行った後、残渣を精製水で溶出させた。水層を濃縮後、ゲルカラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５，Ｈ２Ｏ）にて精製を行った。目的物の含まれる分画を集め濃縮後、凍結乾燥を行うと、目的とするモノシアロ糖鎖アスパラギン（化合物７６）（３．３ｍｇ，９１．５％ｙｉｅｌｄ）が得られた。化合物７６のＮＭＲデータを以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ５．２２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．０１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．８５（ｓ，１Ｈ），４．６５−４．７５（ｍ，３Ｈ），４．５４（ｄｄ，２Ｈ，Ｊａ＝１０．８，Ｊｂ＝７．６），４．３３（ｓ，１Ｈ），４．２７（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．１９（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４），２．９５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１６．８，Ｊｂ＝４．４，Ａｓｎ−βＣＨ），２．８２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１６．８，Ｊｂ＝７．２，Ａｓｎ−βＣＨ）２．７４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．４，Ｊｂ＝４．４，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．１６，２．１５，２．１３，２．１１，２．０９（ｅａｃｈｓ，１５Ｈ，Ａｃｘ５），１．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．４，Ｊｂ＝１２．０，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
化合物６のベンジル体（１０糖、５．０ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ）を、氷冷下にＮａＯＨａｑ．（ｐＨ＝１２）２．０ｍｌに溶解させた。反応をＨＰＬＣでモニターしながら約５時間撹拌した。反応の進行が終了した時点で、反応液を４０ｍＭ ＨＣｌにてｐＨ＝７．０に調整した。中和後の液を、メンブランフィルターで濾過した後、濃縮、次いでＨＰＬＣ（ＹＭＣ− Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＭ，ＳＨ−３４３−５ＡＭ，２０×２５０ｍｍ，ＡＮ／２５ｍＭ ＡｃＯＮＨ４ ｂｕｆｆｅｒ＝２０／８０，７．０ｍｌ／ｍｉｎ．，ｗａｖｅ ｌｅｎｇｔｈ；２７４ｎｍ）にて分取・精製を行った。分取した液を濃縮後、ＯＤＳカラム（コスモシール ７５Ｃ１８−ＯＰＮ，ナカライテスク社製）にて脱塩処理を行い、濃縮、凍結乾燥を行うと、化合物６の単品（２．５ｍｇ，５２．０％）が得られた。
得られた化合物６（１．５ｍｇ，０．６７ｍｍｏｌ）に、ＤＭＳＯ１０５ｍｌを加え溶解させた。この反応液に、モルホリン１０５ｍｌを加えて室温下に撹拌を行った。反応を、ＴＬＣにてモニターしながら約１時間反応を行った。原料が消失したことを確認した後、反応液にアセトン／ジイソプロピルエーテル（ＩＰＥ）＝１／１の溶液５ｍｌを加えた。このスラリーを、メンブランフィルターにてろ過を行った後、残渣を精製水で溶出させた。水層を濃縮後、ゲルカラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５，Ｈ２Ｏ）にて精製を行った。目的物の含まれる分画を集め濃縮後、凍結乾燥を行うと、目的とするモノシアロ糖鎖アスパラギン（化合物７７）（１．４ｍｇ，９９％ｙｉｅｌｄ）が得られた。
化合物７７のＮＭＲデータを以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ５．２０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．６，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．０２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．８５（ｓ，１Ｈ），４．６３−４．７３（ｍ，３Ｈ），４．５３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊａ＝７．６，Ｊｂ＝７．２），４．３３（ｓ，１Ｈ），４．２７（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．１９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０），２．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１６．０，Ｊｂ＝４．０，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．４，Ｊｂ＝４．８，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ）２．６２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１６．０Ｊｂ＝８．０，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１６，２．１４，２．１３，２．１１，２．０９（ｅａｃｈｓ，１５Ｈ，Ａｃｘ５），１．７９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．４，Ｊｂ＝１１．６，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
【実施例１】
参考例１で得られた化合物２４（６ｍｇ，２．５８ｍｍｏｌ）を水（３００ｍＬ）溶かし重炭酸ナトリウム（２．１ｍｇ，２４．９ｍｍｏｌ）を加えた。ここに、Ｄ−（＋）−ビオチニルスクシンイミド（４．２ｍｇ，１２．３ｍｍｏｌ）を溶かしたジメチルホルムアミド（３００ｍＬ）を加え、室温で２０分反応させた。原料消失をＴＬＣ（イソプロパノール：１Ｍ 酢酸アンモニウム水溶液＝３：２）で確認後、エバポレーターを用いて濃縮した。残渣をゲルろ過カラム（ｆ２０ｍｍ×３００ｍｍ，Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５，水）で精製し、目的とする化合物（６．２ｍｇ，９４％）を得た。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ｍＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
ｄ５．２２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．１４（ｄ，１Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．０３（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．５９（ｄｄ，１Ｈ），４．８６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．７４−４．６６（ｍ，３Ｈ，，ＧｌｃＮＡｃ２，５，５’−Ｈ１），４．５３（ｄ，２Ｈ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ１），４．３４（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２８（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．１９（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），３．０９（ｄｄ，２Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ｅｑ），２．９４−２．８６（ｍ，２Ｈ，ｂｉｏｔｉｎ），２．７８−２．７１（ｍ，２Ｈ，ｂｉｏｔｉｎ），２．３７（ｔ，１Ｈ，ｂｉｏｔｉｎ），２．１７，２．１６，２．１３，２．１１（ｅａｃｈ ｓ，Ａｃ），１．８０（ｄｄ，２Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ａｘ），１．８０−１．６７（ｍ，ｂｉｏｔｉｎ），１．５２−１．４７（ｍ，ｂｉｏｔｉｎ），１．３２（ｄｄ，ｂｉｏｔｉｎ）
【実施例２】
参考例４５で得られた化合物７６を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例３】
参考例４５で得られた化合物７７を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例４】
参考例７で得られた化合物３３を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例５】
参考例２４で得られた化合物２６を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例６】
参考例２５で得られた化合物２７を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例７】
参考例２６で得られた化合物２８を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例８】
参考例２７で得られた化合物３０を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例９】
参考例２８で得られた化合物３１を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例１０】
参考例２９で得られた化合物３２を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例１１】
参考例３０で得られた化合物３７を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例１２】
参考例３１で得られた化合物４２を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例１３】
参考例３２で得られた化合物３８を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例１４】
参考例３３で得られた化合物７２を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例１５】
参考例３４で得られた化合物４３を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例１６】
参考例３５で得られた化合物７３を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例１７】
参考例３６で得られた化合物３９を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例１８】
参考例３７で得られた化合物４０を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例１９】
参考例３８で得られた化合物４１を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例２０】
参考例３９で得られた化合物４４を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例２１】
参考例４０で得られた化合物４５を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例２２】
参考例４１で得られた化合物４６を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例２３】
参考例４２で得られた化合物３４を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例２４】
参考例４３で得られた化合物３５を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例２５】
参考例４４で得られた化合物３６を使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
実施例２６ Ｆｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したジシアロα２，３糖鎖アスパラギン（Ｃ１−１）およびＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護した２種のモノシアロα２，３糖鎖アスパラギン（Ｃ１−２及びＣ１−３）の合成
参考例２で得られたＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したアシアロ糖鎖アスパラギンにシアル酸転移酵素を用いてＣＭＰ−シアル酸を転移させた。
シアル酸転移酵素としてα２，３転移酵素である市販のＲａｔ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来のものを用いた。
参考例２で得られたアシアロ９糖（２０ｍｇ，１０．１μｍｏｌ）を５０ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ＝６．０，５ｍｌ）に溶解させた後、牛血清アルブミン（ＢＳＡ，５ｍｇ）を加える。これに、ＣＭＰ−シアル酸（２６ｍｇ，４０．４μｍｏｌ）、Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（５μｌ，１２５ｕｎｉｔ）を加え均一化する。最後に、α２，３−Ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製、１００μｌ）を加え３７℃で４８時間静置させる。ＨＰＬＣで反応をモニターしながら原料が目的量まで減少した時点で反応を終了させ、反応液をメンブランフィルターにて濾過する。濾液を濃縮し液量を減じた後、ＨＰＬＣ分取カラムにて精製した（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｒ＆Ｄ ＯＤＳ，Ｄ−ＯＤＳ−５−Ａ，２０×２５０ｍｍ，ＡＮ／２５ｍＭ ＡｃＯＮＨ４ ｂｕｆｆｅｒ＝１８／８２，７．５ｍｌ／ｍｉｎ．，ｗａｖｅ ｌｅｎｇｔｈ；２７４ｎｍ）ところ、２５分後にジシアロ１１糖 化合物（Ｃ１−１）が、それぞれ３０分後、３４分後に各モノシアロ１０糖 化合物（Ｃ１−２）及び（Ｃ１−３）が溶出してきた。それぞれを分取した後、脱塩処理、次いで凍結乾燥を行うと、各化合物１、２、３がそれぞれ０．７ｍｇ（２．７％）、１．９ｍｇ（８．３％）、３．５ｍｇ（１５．３％）得られた。各化合物のＮＭＲデータは以下のとおりである。
化合物（Ｃ１−１）
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ７．９０（ｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．６９（ｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．４９（ｄｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．４２（ｄｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），５．１０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），４．９７（ｄ，１Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．５０−４．６０（ｍ，４Ｈ），４．３４（１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２４（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．１８（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．１０（ｍ，２Ｈ），２．７４（ｍ，３Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ｅｑ），２．４０−２．６０（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０５，２．０３，２．０２（ｅａｃｈ ｓ，Ａｃ），１．７７（ｄｄ，２Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ａｘ）．
化合物（Ｃ１−２）
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ７．９０（ｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．６９（ｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．４９（ｄｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．４２（ｄｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），５．１０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），４．９７（ｄ，１Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．４７−４．６０（ｍ），４．４３（ｄ，１Ｈ），４．３２（１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２２（ｂｓ，２Ｈ），４．１７（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．０６−４．１３（ｍ，２Ｈ），２．７２（ｍ，２Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．５０−２．６０（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０５，２．０３，２．０１（ｅａｃｈ ｓ，Ａｃ），１．７７（ｄｄ，１Ｈ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
化合物（Ｃ１−３）
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ７．９０（ｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．６９（ｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．４９（ｄｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．４２（ｄｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），５．１０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），４．９７（ｄ，１Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．５０−４．６０（ｍ），４．４５（ｄ，１Ｈ），４．３３（１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２２（ｍ，２Ｈ），４．１７（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．０９（ｍ，２Ｈ），２．７４（ｍ，２Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．４５−２．６０（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０５，２．０３，２．０２，２．００（ｅａｃｈ ｓ，Ａｃ），１．７７（ｄｄ，１Ｈ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）
得られた（Ｃ−１）〜（Ｃ−３）の各化合物を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例２７】
実施例２６で得られた化合物（Ｃ１−２）（２ｍｇ，０．８８μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０）１００μｌに溶解させ、さらにβ−ガラクトシダーゼ（生化学工業社製、ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ，５μＬ，１００ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で１５時間静置した後、メンブランフィルターでろ過を行った。ろ液をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８２：１８、流速７．５ｍｌ／ｍｉｎ）で精製した後、溶媒を濃縮、次いで凍結乾燥を行った。残留物を水２００μｌに溶解させＯＤＳ−カラムクロマトグラフィー（コスモシール７５Ｃ１８−ｏｐｎ、最初に水で洗浄を行い、次いで２５％アセトニトリル水溶液で溶出させる）を用いて脱塩処理を行ったところ、目的とする化合物（Ｃ２）が０．５μｇ得られた。ＮＭＲデータは以下のとおりである。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ７．９０（ｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．６９（ｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．４９（ｄｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．４２（ｄｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），５．１０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），４．９８（ｄ，１Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．５０−４．６０（ｍ），４．３３（１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２２（ｍ，２Ｈ），４．１７（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．１０（ｍ，２Ｈ），２．７４（ｍ，２Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．４５−２．６０（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０５，２．０３，２．０１（ｅａｃｈ ｓ，Ａｃ），１．７８（ｄｄ，１Ｈ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）
得られた（Ｃ２）の化合物を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例２８】
実施例２７で得られた化合物（Ｃ２）（１．８ｍｇ，０．８６μｍｏｌ）を、ウシ血清アルブミン１ｍｇと共にＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０）９０μｌに溶解させ、さらにＮ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ）を４μｌ（２５０ｍＵ）加えた。この溶液を３７℃で２４時間静置した後、メンブランフィルターでろ過を行った。ろ液をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８２：１８、流速７．５ｍｌ／ｍｉｎ）で精製した後、溶媒を濃縮、次いで凍結乾燥を行った。残留物を水２００μｌに溶解させＯＤＳ−カラムクロマトグラフィー（コスモシール７５Ｃ１８−ｏｐｎ、最初に水で洗浄を行い、次いで２５％アセトニトリル水溶液で溶出させる）を用いて脱塩処理を行ったところ、目的とする化合物（Ｃ３）が０．９μｇ得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ８．０１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．８０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．６０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．５３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），５．２１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．００（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．８７（ｓ，１Ｈ），４．６０−４．７８（ｍ，５Ｈ），４．４０−４．５０（ｂｍ，２Ｈ），４．３４（ｓ，１Ｈ），４．２８（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．２０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝３．０，Ｊｂ＝９．９），２．８０−２．９５（ｍ，２Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．６５−２．７５（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１６，２．１４，２．１２（ｅａｃｈ ｓ，Ａｃｘ３），１．９８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．８９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．１，Ｊｂ＝１１．９，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
得られた（Ｃ３）の化合物を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例２９】
実施例２８で得られた化合物（Ｃ３）（０．８ｍｇ，０．４２μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０）５０μｌに溶解させ、α−マンノシダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ）３０μｌ（２．９Ｕ）加えた。この溶液を３７℃で６３時間静置した後、メンブランフィルターでろ過を行った。ろ液をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速７．５ｍｌ／ｍｉｎ）で精製した後、溶媒を濃縮、次いで凍結乾燥を行った。残留物を水２００μｌに溶解させＯＤＳ−カラムクロマトグラフィー（コスモシール７５Ｃ１８−ｏｐｎ、最初に水で洗浄を行い、次いで２５％アセトニトリル水溶液で溶出させる）を用いて脱塩処理を行ったところ、目的とする化合物（Ｃ４）が０．６μｇ得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０ｏＣ，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ８．００（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．７９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．５９（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．５２（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），５．２１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．６０−４．７５（ｍ，），４．４０−４．５０（ｍ，２Ｈ），４．３２（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３），４．２８（ｂｓ，１Ｈ），４．２２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝９．７，Ｊｂ＝２．８，Ｍａｎ４−Ｈ２），２．８０−２．９５（ｍ，２Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．６０−２．７５（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１４，２．１４，２．１２（ｅａｃｈｓ，Ａｃｘ３），１．９８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．８８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．１，Ｊｂ＝１２．０，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
得られた（Ｃ４）の化合物を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例３０】
実施例２６で得られた化合物（Ｃ１−３）（１ｍｇ，０．４４μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０）５０μｌに溶解させ、さらにβ−ガラクトシダーゼ（生化学工業社製、ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ，５μＬ，１００ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で１５時間静置した後、メンブランフィルターでろ過を行った。ろ液をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８２：１８、流速７．５ｍｌ／ｍｉｎ）で精製した後、溶媒を濃縮、次いで凍結乾燥を行った。残留物を水２００μｌに溶解させＯＤＳ−カラムクロマトグラフィー（コスモシール７５Ｃ１８−ｏｐｎ、最初に水で洗浄を行い、次いで２５％アセトニトリル水溶液で溶出させる）を用いて脱塩処理を行ったところ、目的とする化合物（Ｃ５）が０．３μｇ得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ８．０１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．８１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．６０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．５３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），５．２１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．６，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．０２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．５５−４．７０（ｍ），４．４４（１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．３０−４．３８（ｂｍ，２Ｈ），４．２８（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．１７−４．２５（ｍ，２Ｈ），２．７８−２．９５（ｍ，２Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．５５−２．７０（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１６，２．１５，２．１４，２．１２（ｅａｃｈｓ，１２Ｈ，Ａｃｘ４），１．９８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．８９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．２，Ｊｂ＝１２．０，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
得られた（Ｃ５）の化合物を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例３１】
実施例３０で得られた化合物（Ｃ５）（１．０ｍｇ，０．４８μｍｏｌ）を、ウシ血清アルブミン１ｍｇと共にＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０）５０μｌに溶解させ、さらにＮ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ）を４μｌ（２５０ｍＵ）加えた。この溶液を３７℃で２２時間静置した後、メンブランフィルターでろ過を行った。ろ液をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８２：１８、流速７．５ｍｌ／ｍｉｎ）で精製した後、溶媒を濃縮、次いで凍結乾燥を行った。残留物を水２００μｌに溶解させＯＤＳ−カラムクロマトグラフィー（コスモシール７５Ｃ１８−ｏｐｎ、最初に水で洗浄を行い、次いで２５％アセトニトリル水溶液で溶出させる）を用いて脱塩処理を行ったところ、目的とする化合物（Ｃ６）が０．６μｇ得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ８．０１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．８０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．６０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．５３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），５．１９（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．０２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．８５（ｓ，１Ｈ）４．５８−４．７５（ｍ，５Ｈ），４．３８−４．４８（ｍ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．４０（ｂｄ，Ｊ＝２．４，１Ｈ），４．１８−４．２５（ｍ，２Ｈ），４．１５（ｍ，１Ｈ），２．８０−２．９５（ｍ，２Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．６５−２．７５（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１６，２．１３，２．１２（ｅａｃｈｓ，９Ｈ，Ａｃｘ３），１．９８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．８９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．２，Ｊｂ＝１２．０，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
得られた（Ｃ６）の化合物を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例３２】
実施例３１で得られた化合物（Ｃ６）（１．０ｍｇ，０．５３μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０）５０μｌに溶解させ、α−マンノシダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ）１０μｌ（０．９Ｕ）加えた。この溶液を３７℃で２０時間静置した後、メンブランフィルターでろ過を行った。ろ液をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速７．５ｍｌ／ｍｉｎ）で精製した後、溶媒を濃縮、次いで凍結乾燥を行った。残留物を水２００μｌに溶解させＯＤＳ−カラムクロマトグラフィー（コスモシール７５Ｃ１８−ｏｐｎ、最初に水で洗浄を行い、次いで２５％アセトニトリル水溶液で溶出させる）を用いて脱塩処理を行ったところ、目的とする化合物（Ｃ７）が０．５μｇ得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ８．０１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．８１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．６０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．５３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），５．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．０１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．８４（ｓ，１Ｈ），４．５５−４．７０（ｍ，５Ｈ），４．４４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．０，Ｆｍｏｃ），４．３０−４．３８（ｂｓ，１Ｈ），４．１５−４．２５（ｍ，２Ｈ），４．１７（ｓ，１Ｈ），２．８０−２．９５（ｍ，２Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．５５−２．７０（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１６，２．１３，２．１２（ｅａｃｈｓ，Ａｃｘ３），１．９８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ）１．８９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．２，Ｊｂ＝１２．３，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
得られた（Ｃ７）の化合物を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例３３】
Ｆｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したジシアロ（α２，６）（α２，３）糖鎖アスパラギンの合成
参考例４５で得られたＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したモノシアロ糖鎖アスパラギン（化合物２）にシアル酸転移酵素を用いてＣＭＰ−シアル酸を転移させた。
シアル酸転移酵素としてα２，３転移酵素である市販のＲａｔ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来のものを用いた。
参考例４５で得られた化合物２（１．７ｍｇ，０．７５μｍｏｌ）を５０ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ＝５．０，８５μｌ）に溶解させた後、牛血清アルブミン（ＢＳＡ，１ｍｇ）を加える。これに、ＣＭＰ−シアル酸（４．８ｍｇ，７．５μｍｏｌ）、Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（１μｌ，７５ｕｎｉｔ）を加え均一化する。最後に、α２，３−Ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製、７５μｌ，３４ｍＵ）を加え３７℃で３．５時間静置させる。ＨＰＬＣで反応をモニターしながら原料が消失した時点で反応を終了させ、反応液をメンブランフィルターにて濾過する。濾液を濃縮し液量を減じた後、ＨＰＬＣ分取カラムにて精製した（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｒ＆Ｄ ＯＤＳ，Ｄ−ＯＤＳ−５−Ａ，２０×２５０ｍｍ，ＡＮ／２５ｍＭ ＡｃＯＮＨ４ ｂｕｆｆｅｒ＝１８／８２，７．５ｍｌ／ｍｉｎ．，ｗａｖｅ ｌｅｎｇｔｈ；２７４ｎｍ）ところ、２５分後に化合物（Ｃ７Ａ）が溶出してきた。分取した後、脱塩処理、次いで凍結乾燥を行うと、化合物（Ｃ７Ａ）が１．３ｍｇ（６７．８％）得られた。化合物のＮＭＲデータは以下のとおりである。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ８．００（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．７９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．６０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．５２（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），５．２１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．０３（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．８６（ｓ，１Ｈ），４．５８−４．７２（ｍ，５Ｈ），４．５４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０），４．３８−４．４８（ｍ，２Ｈ）４．３４（ｂｓ，１Ｈ），４．２８（ｂｓ，１Ｈ），４．１５−４．２５（ｍ，２Ｈ），２．８０−２．８６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝４．４，Ｊｂ＝１２．４，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．７３−２．８３（ｍ，ｄｄ，３Ｈ，Ｊａ＝４．４，Ｊｂ＝１２．４，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．６０−２．７２（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１６，２．１５，２．１４，２．１２（ｅａｃｈ ｓ，Ａｃ ｘ５），１．９８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．８９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．４，Ｊｂ＝１２．０，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ），１．８１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．４，Ｊｂ＝１２．０，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
得られた（Ｃ７Ａ）の化合物を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例３４】
Ｆｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したジシアロ（α２，３）（α２，６）糖鎖アスパラギンの合成
参考例４５で得られたＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したモノシアロ糖鎖アスパラギン（化合物６）にシアル酸転移酵素を用いてＣＭＰ−シアル酸を転移させた。
シアル酸転移酵素としてα２，３転移酵素である市販のＲａｔ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来のものを用いた。
参考例４５で得られた化合物６（１．２ｍｇ，０．５３μｍｏｌ）を５０ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ＝５．０，６０μｌ）に溶解させた後、牛血清アルブミン（ＢＳＡ，１ｍｇ）を加える。これに、ＣＭＰ−シアル酸（３．４ｍｇ，５．３μｍｏｌ）、Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（１μｌ，７５ｕｎｉｔ）を加え均一化する。最後に、α２，３−Ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製、５２．９μｌ，２４ｍＵ）を加え３７℃で３時間静置させる。ＨＰＬＣで反応をモニターしながら原料が全て消費された時点で反応を終了させ、反応液をメンブランフィルターにて濾過する。濾液を濃縮し液量を減じた後、ＨＰＬＣ分取カラムにて精製した（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｒ＆Ｄ ＯＤＳ，Ｄ−ＯＤＳ−５−Ａ，２０×２５０ｍｍ，ＡＮ／２５ｍＭ ＡｃＯＮＨ４ ｂｕｆｆｅｒ＝１８／８２，７．５ｍｌ／ｍｉｎ．，ｗａｖｅ ｌｅｎｇｔｈ；２７４ｎｍ）ところ、２３分後に化合物（Ｃ７Ｂ）が溶出してきた。分取した後、脱塩処理、次いで凍結乾燥を行うと、各化合物（Ｃ７Ｂ）が１．１ｍｇ（８１．２％）得られた。各化合物のＮＭＲデータは以下のとおりである。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ８．００（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．７９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．５９（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．５１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），５．２１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．００（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．８４（ｓ，１Ｈ），４．６０−４．７２（ｍ，５Ｈ），４．５２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６），４．３５−４．４５（ｍ，２Ｈ），４．３３（ｂｓ，１Ｈ），４．２７（ｂｓ，１Ｈ），４．１５−４．２５（ｍ，２Ｈ），２．８０−２．８６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝４．８，Ｊｂ＝１２．４，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．７３−２．８３（ｂｓ，ｄｄ，３Ｈ，Ｊａ＝４．８，Ｊｂ＝１２．４，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．６０−２．７２（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１５，２．１２，２．１０（ｅａｃｈ ｓ，Ａｃ ｘ５），１．９７（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．８８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．４，Ｊｂ＝１２．４，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ），１．８０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．４，Ｊｂ＝１２．４，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
得られた（Ｃ７Ｂ）の化合物を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。
【実施例３５〜５２】
参考例２、８〜１０、１２、１４、１７、４５、実施例２６〜３２で製造した各Ｆｍｏｃ−糖鎖アスパラギン ２ｎｍｏｌを、トリス塩酸緩衝液 約１０ｍｌに溶解させた。このものに、ＧＤＰ−フコース２００ｎｍｏｌ、Ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｖ（Ｈｕｍａｎ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）０．５ｍＵを加え、３７℃で約２時間静置、反応させた。反応液を超純水２０ｍｌで希釈したのち、キャピラリー電気泳動（ｆｕｓｅｄ ｓｉｌｉｃａ ｃａｐｉｌｌａｒｙ，５０ｍｍ ｉ．ｄ．，６０ｃｍ，ｂｕｆｆｅｒ；１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ｂｏｒａｔｅ，ｐＨ＝８．３，１００ｍＭ Ｈｅｐｔａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ，印加電圧２７ｋＶ，温度２５℃，２１４ｍｍ）で分離を行いフコースを含む糖鎖アスパラギン誘導体を得た。得られた上記糖鎖アスパラギン誘導体を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例１と同様にビオチン化を行った。得られたビオチン化糖鎖アスパラギンを以下に示す。
【実施例３５】
【実施例３６】
【実施例３７】
【実施例３８】
【実施例３９】
【実施例４０】
【実施例４１】
【実施例４２】
【実施例４３】
【実施例４４】
【実施例４５】
【実施例４６】
【実施例４７】
【実施例４８】
【実施例４９】
【実施例５０】
【実施例５１】
【実施例５２】
【実施例５３】
ジシアロ糖鎖アスパラギン（化合物２４）（１１糖、１．４ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）を、精製水 ７０ｍｌに溶解させた。このものにアセトン７０ｍｌ、ＮａＨＣＯ３（０．７６ｍｇ，９ｍｍｏｌ）を加え、室温下に撹拌した後、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ，０．９５ｍｇ，２．４ｍｍｏｌ，Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を加え約２時間撹拌した。２時間後、ＴＬＣにて反応の終了を確認した後、アセトンを減圧下に留去させ、残った水溶液をゲルカラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５，Ｈ２Ｏ）にて精製し目的物の含まれる分画を集めた。集めた分画を濃縮後、ＨＰＬＣ（ＹＭＣ− Ｐａｃｋ ＯＤＳ＝ＡＭ，ＳＨ−３４３−５ＡＭ，２０×２５０ｍｍ，ＡＮ／２５ｍＭ ＡｃＯＮＨ４ ｂｕｆｆｅｒ＝１０／９０，７．５ｍｌ／ｍｉｎ．，ｗａｖｅ ｌｅｎｇｔｈ；２７４ｎｍ）で分取した後、ゲルカラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５，Ｈ２Ｏ）にて脱塩処理を行った。目的物の含まれる分画を集め、濃縮後、凍結乾燥を行うと目的とするＦＩＴＣ化されたジシアロ糖鎖誘導体（１．２ｍｇ，７３．５％ ｙｉｅｌｄ）が得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ７．８６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０，ＦＩＴＣ），７．７５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝８．０，Ｊｂ＝２．０，ＦＩＴＣ），７．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０，ＦＩＴＣ），７．４１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．６，ＦＩＴＣ），６．７１−６．８３（ｂｍ，４Ｈ，ＦＩＴＣ），５．２２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．１０−５．２０（ｂｍ，２Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．０３（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７０−４．８０（ｍ，３Ｈ），４．５３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０），４．３３（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．２７（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），４．１８（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．９０−３．００（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．８５−２．９５（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７５（ｄｄ，２Ｈ，Ｊａ＝１２．０，Ｊｂ＝２．８，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｘ），２．１５，２．１４，２．１２，２．０９（ｅａｃｈｓ，１８Ｈ，Ａｃｘ６），１．８０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊａ＝１２．０，Ｊｂ＝１２．０，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
【実施例５４】
化合物２４の代わりに、化合物７６を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例５５】
化合物２４の代わりに、化合物７７を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例５６】
化合物２４の代わりに、化合物３３を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
得られたＦＩＴＣ化糖鎖アスパラギンのＮＭＲデータを以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ７．８８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０，ＦＩＴＣ），７．７６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝８．０，Ｊｂ＝２．０，ＦＩＴＣ），７．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０，ＦＬＴＣ），７．４５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８，ＦＩＴＣ），６．８５−６．９３（ｍ，４Ｈ，ＦＩＴＣ），５．２１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０５−５．２０（ｂｄ，２Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．０１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．６７（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．６），４．５５（ｄ，２Ｈ），４．３４（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．２８（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），４．２０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），３．００−３．１０（ｂｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．９０−３．００（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７５（ｄｄ，２Ｈ，Ｊａ＝１２．０，Ｊｂ＝２．８，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｘ），２．１４，２．１３，２．１２，２．０８（ｅａｃｈｓ，１２Ｈ，Ａｃｘ４）．
【実施例５７】
化合物２４の代わりに、化合物２６を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例５８】
化合物２４の代わりに、化合物２７を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例５９】
化合物２４の代わりに、化合物２８を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例６０】
化合物２４の代わりに、化合物３０を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例６１】
化合物２４の代わりに、化合物３１を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例６２】
化合物２４の代わりに、化合物３２を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例６３】
化合物２４の代わりに、化合物３７を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例６４】
化合物２４の代わりに、化合物４２を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例６５】
化合物２４の代わりに、化合物３８を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例６６】
化合物２４の代わりに、化合物７２を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例６７】
化合物２４の代わりに、化合物４３を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例６８】
化合物２４の代わりに、化合物７３を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例６９】
化合物２４の代わりに、化合物３９を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例７０】
化合物２４の代わりに、化合物４０を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例７１】
化合物２４の代わりに、化合物４１を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例７２】
化合物２４の代わりに、化合物４４を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例７３】
化合物２４の代わりに、化合物４５を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例７４】
化合物２４の代わりに、化合物４６を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例７５】
化合物２４の代わりに、化合物３４を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例７６】
化合物２４の代わりに、化合物３５を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例７７】
化合物２４の代わりに、化合物３６を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例７８】
実施例２６で得られた（Ｃ−１）〜（Ｃ−３）の各化合物を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例５３と同様にＦＩＴＣ化を行った。
【実施例７９】
実施例２７で得られた（Ｃ２）の各化合物を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例５３と同様にＦＩＴＣ化を行った。
【実施例８０】
実施例２８で得られた（Ｃ３）の各化合物を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例５３と同様にＦＩＴＣ化を行った。
【実施例８１】
実施例２９で得られた（Ｃ４）の各化合物を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例５３と同様にＦＩＴＣ化を行った。
【実施例８２】
実施例３０で得られた（Ｃ５）の各化合物を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例５３と同様にＦＩＴＣ化を行った。
【実施例８３】
実施例３１で得られた（Ｃ６）の各化合物を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例５３と同様にＦＩＴＣ化を行った。
【実施例８４】
実施例３２で得られた（Ｃ７）の各化合物を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例５３と同様にＦＩＴＣ化を行った。
【実施例８５】
実施例３３で得られた（Ｃ７Ａ）の各化合物を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例５３と同様にＦＩＴＣ化を行った。
【実施例８６】
実施例３４で得られた（Ｃ７Ｂ）の各化合物を参考例７と同様に処理してＦｍｏｃ基を脱保護して糖鎖アスパラギンを得た。得られた糖鎖アスパラギンを使用した以外は実施例５３と同様にＦＩＴＣ化を行った。
【実施例８７〜１０４】
実施例３５〜５２で得られたフコースを含む糖鎖アスパラギン誘導体を用いて実施例５３と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【実施例８７】
【実施例８８】
【実施例８９】
【実施例９０】
【実施例９１】
【実施例９２】
【実施例９３】
【実施例９４】
【実施例９５】
【実施例９６】
【実施例９７】
【実施例９８】
【実施例９９】
【実施例１００】
【実施例１０１】
【実施例１０２】
【実施例１０３】
【実施例１０４】
実施例１０５（マイクロプレートの製造）
９６穴ＢＤバイオコートストレプトアビジン（ＢＤバイオサイエンス社製：バイオアッセイ用、結合能：５ｎｇ／１穴）に、実施例１のビオチン化糖鎖アスパラギン１００μｇ（ビオチン結合能の約１０倍相当量）を蒸留水に溶かし１０００μｌとした。この調整溶液を１穴当り１０μｌとなるように各ウェルに加え、蒸留水で３回洗浄し、マイクロプレートを製造した。各ビオチン化糖鎖アスパラギンの結合収率は９５％以上であった。固定化率の確認は、洗い出された非固定化糖鎖残量より算出した。
実施例１０６（アフィニティーカラムの製造）
アビジンコートビーズ（日立ソフトウェアーエンジニアリング社製、ｘＭＡＰ ＬｕｍＡｖｉｄｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ １ｍｌ）１０ｍｌと実施例１のビオチン化糖鎖アスパラギン３０ｍｇをスラリー状態で撹拌し、ビーズをろ過、洗浄した。洗浄は、ビーズ体積の２倍量の蒸留水を使用して、３回ろ紙上で洗浄した。固定化の確認は、洗浄回収されたビオチン化糖鎖アスパラギンの残量により確認した。次に上記のビオチン化糖鎖アスパラギン固定ビーズ１０ｍｌを３０ｍｌの蒸留水でスラリー状態のまま、ガラス製のオープンクロマトカラム（φ２０ｍｍ、長さ３００ｍｍ）に充填し、アフィニティーカラムを製造した。
【産業上の利用可能性】
本発明によれば、アスパラギンのアミノ基窒素をビオチン化又はＦＩＴＣ化した糖鎖アスパラギンが得られる。
更に本発明によれば、ビオチン・アビジンの結合特異性を利用し、ビオチン化した複数の糖鎖をアビジン化されたマイクロプレート上で反応させるだけで簡単に糖鎖マイクロチップを製造することができる。これにより、特定の糖鎖と結合能を有するタンパク質を解明することができる。
また、ある特定のタンパク質を分離精製する目的で、アビジン化したアフィニティーカラムに特定のビオチン化した糖鎖を結合し固定化し、そこに、ビオチン化した糖鎖と特異的結合能を有するタンパク質を含む混合物を通すことにより目的とするタンパク質のみを単離することができる。
更に本発明で得られたＦＩＴＣ化糖鎖アスパラギンは、例えば生体組織中の糖類の受容体の研究、レクチンの糖結合特異性の研究に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される１１〜３糖を有する糖鎖アスパラギン誘導体。
〔式中、Ｒ１およびＲ２は、水素原子、式（２）〜（６）で示される基であり、同一でも異なっていてもよい。Ｑはビオチン基又はＦＩＴＣ基を示す。〕
【請求項２】
式（１）において、Ｒ１およびＲ２の一方は必ず式（２）又は式（３）で示される基である１１〜７糖を有する（α２，３）又は（α２，６）糖鎖アスパラギン誘導体。
【請求項３】
式（１）において、Ｒ１は式（２）で示される基であり、Ｒ２は式（３）で示される基である１１糖を有する（α２，３）（α２，６）糖鎖アスパラギン誘導体。
【請求項４】
式（１）において、Ｒ１は式（３）で示される基であり、Ｒ２は式（２）で示される基である１１糖を有する（α２，３）（α２，６）糖鎖アスパラギン誘導体。
【請求項５】
ビオチン基又はＦＩＴＣ基でアスパラギンのアミノ基窒素が修飾された糖鎖アスパラギンの非還元末端側のＮ−アセチルグルコサミンに少なくとも１個以上のフコースを含む糖鎖アスパラギン誘導体。
【請求項６】
ビオチン基又はＦＩＴＣ基でアスパラギンのアミノ基窒素が修飾された糖鎖アスパラギンが、式（１）で表される１１〜３糖を有する糖鎖アスパラギン誘導体である請求項５に記載のフコースを含む糖鎖アスパラギン誘導体。
【請求項７】
ビオチン基又はＦＩＴＣ基でアスパラギンのアミノ基窒素が修飾された糖鎖アスパラギンが、請求の範囲第３項の１１糖を有する（α２，３）（α２，６）糖鎖アスパラギン誘導体である請求項５に記載のフコースを含む糖鎖アスパラギン誘導体。
【請求項８】
ビオチン基又はＦＩＴＣ基でアスパラギンのアミノ基窒素が修飾された糖鎖アスパラギンが、請求の範囲第４項の１１糖を有する（α２，３）（α２，６）糖鎖アスパラギン誘導体である請求項５に記載のフコースを含む糖鎖アスパラギン誘導体。
【請求項９】
ビオチン基又はＦＩＴＣ基でアスパラギンのアミノ基窒素が修飾された糖鎖アスパラギンが、式（１）においてＲ１およびＲ２は、水素原子、式（２）で示される基、または式（４）〜（６）で示される基であり、Ｒ１およびＲ２の一方は必ず式（２）又は式（４）で示される基である、１１〜６糖を有するα２，３糖鎖アスパラギン誘導体である請求項５に記載のフコースを含む糖鎖アスパラギン誘導体。
【請求項１０】
ビオチン基又はＦＩＴＣ基でアスパラギンのアミノ基窒素が修飾された糖鎖アスパラギンが、式（１）においてＲ１およびＲ２は、水素原子、式（３）で示される基、または式（４）〜（６）で示される基であり、Ｒ１およびＲ２の一方は必ず式（３）又は式（４）で示される基である、１１〜６糖を有するα２，６糖鎖アスパラギン誘導体である請求項５に記載のフコースを含む糖鎖アスパラギン誘導体。
【請求項１１】
式（７）で表される１１〜３糖を有する糖鎖アスパラギンをビオチン化することを特徴とするビオチン化糖鎖アスパラギンの製造方法。
〔式中、Ｒ１及びＲ２は上記に同じ。〕
【請求項１２】
式（７）で表される１１〜３糖を有する糖鎖アスパラギンをフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）化することを特徴とするＦＩＴＣ化糖鎖アスパラギンの製造方法。
【請求項１３】
請求の範囲１〜１０項に記載のビオチン化糖鎖アスパラギンを結合させたマイクロプレート。
【請求項１４】
請求の範囲１〜１０項に記載のビオチン化糖鎖アスパラギンを結合させたアフィニティーカラム。
【請求項１】
下記式（１）で表される１１〜３糖を有する糖鎖アスパラギン誘導体。
〔式中、Ｒ１およびＲ２は、水素原子、式（２）〜（６）で示される基であり、同一でも異なっていてもよい。Ｑはビオチン基又はＦＩＴＣ基を示す。〕
【請求項２】
式（１）において、Ｒ１およびＲ２の一方は必ず式（２）又は式（３）で示される基である１１〜７糖を有する（α２，３）又は（α２，６）糖鎖アスパラギン誘導体。
【請求項３】
式（１）において、Ｒ１は式（２）で示される基であり、Ｒ２は式（３）で示される基である１１糖を有する（α２，３）（α２，６）糖鎖アスパラギン誘導体。
【請求項４】
式（１）において、Ｒ１は式（３）で示される基であり、Ｒ２は式（２）で示される基である１１糖を有する（α２，３）（α２，６）糖鎖アスパラギン誘導体。
【請求項５】
ビオチン基又はＦＩＴＣ基でアスパラギンのアミノ基窒素が修飾された糖鎖アスパラギンの非還元末端側のＮ−アセチルグルコサミンに少なくとも１個以上のフコースを含む糖鎖アスパラギン誘導体。
【請求項６】
ビオチン基又はＦＩＴＣ基でアスパラギンのアミノ基窒素が修飾された糖鎖アスパラギンが、式（１）で表される１１〜３糖を有する糖鎖アスパラギン誘導体である請求項５に記載のフコースを含む糖鎖アスパラギン誘導体。
【請求項７】
ビオチン基又はＦＩＴＣ基でアスパラギンのアミノ基窒素が修飾された糖鎖アスパラギンが、請求の範囲第３項の１１糖を有する（α２，３）（α２，６）糖鎖アスパラギン誘導体である請求項５に記載のフコースを含む糖鎖アスパラギン誘導体。
【請求項８】
ビオチン基又はＦＩＴＣ基でアスパラギンのアミノ基窒素が修飾された糖鎖アスパラギンが、請求の範囲第４項の１１糖を有する（α２，３）（α２，６）糖鎖アスパラギン誘導体である請求項５に記載のフコースを含む糖鎖アスパラギン誘導体。
【請求項９】
ビオチン基又はＦＩＴＣ基でアスパラギンのアミノ基窒素が修飾された糖鎖アスパラギンが、式（１）においてＲ１およびＲ２は、水素原子、式（２）で示される基、または式（４）〜（６）で示される基であり、Ｒ１およびＲ２の一方は必ず式（２）又は式（４）で示される基である、１１〜６糖を有するα２，３糖鎖アスパラギン誘導体である請求項５に記載のフコースを含む糖鎖アスパラギン誘導体。
【請求項１０】
ビオチン基又はＦＩＴＣ基でアスパラギンのアミノ基窒素が修飾された糖鎖アスパラギンが、式（１）においてＲ１およびＲ２は、水素原子、式（３）で示される基、または式（４）〜（６）で示される基であり、Ｒ１およびＲ２の一方は必ず式（３）又は式（４）で示される基である、１１〜６糖を有するα２，６糖鎖アスパラギン誘導体である請求項５に記載のフコースを含む糖鎖アスパラギン誘導体。
【請求項１１】
式（７）で表される１１〜３糖を有する糖鎖アスパラギンをビオチン化することを特徴とするビオチン化糖鎖アスパラギンの製造方法。
〔式中、Ｒ１及びＲ２は上記に同じ。〕
【請求項１２】
式（７）で表される１１〜３糖を有する糖鎖アスパラギンをフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）化することを特徴とするＦＩＴＣ化糖鎖アスパラギンの製造方法。
【請求項１３】
請求の範囲１〜１０項に記載のビオチン化糖鎖アスパラギンを結合させたマイクロプレート。
【請求項１４】
請求の範囲１〜１０項に記載のビオチン化糖鎖アスパラギンを結合させたアフィニティーカラム。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５８７８９
【国際公開日】平成１６年７月１５日（２００４．７．１５）
【発行日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５６２９３５（Ｐ２００４−５６２９３５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１６６８２
【国際出願日】平成１５年１２月２５日（２００３．１２．２５）
【出願人】（５０２２４４２５８）
【出願人】（３０２０６０３０６）大塚化学株式会社 (88)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年７月１５日（２００４．７．１５）
【発行日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１６６８２
【国際出願日】平成１５年１２月２５日（２００３．１２．２５）
【出願人】（５０２２４４２５８）
【出願人】（３０２０６０３０６）大塚化学株式会社 (88)
【Ｆターム（参考）】
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