糖鎖捕捉物質を含むタブレットおよびその用途
【課題】簡便な操作にて所定量の糖鎖捕捉物質を導入することを容易にし、たとえハイスループットアッセイにおいても糖鎖捕捉物質の導入に際して煩雑な操作を必要としないような、タブレットおよびその用途を提供する。
【解決手段】本発明は、下記（式１）で表される糖鎖捕捉物質と、塩とを含むタブレット。
【化１】
（担体はポリマーマトリックス、Ｒは−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖を示す。）
【解決手段】本発明は、下記（式１）で表される糖鎖捕捉物質と、塩とを含むタブレット。
【化１】
（担体はポリマーマトリックス、Ｒは−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖を示す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所定の糖鎖捕捉物質を含み、かつ、水に溶解させて一定濃度の糖鎖捕捉物質の溶液とするためのタブレット、およびこのタブレットの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
血清、細胞破砕液、組織などの混合物から、糖鎖などの特定の生体高分子を精製抽出する手段として、これらの分子と特異的に作用する固相担体を用いる方法がある。例えば、特許文献１には、ヒドラジド基含有ポリマービーズなどの糖鎖捕捉用の固相担体（糖鎖捕捉物質）を用いて、糖鎖を精製抽出することができる旨記載されている。また、非特許文献１には、実際に表面に捕捉物質を固定化した固相ビーズを用いて、タンパク質を精製する技術が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００８／０１８１７０号パンフレット
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】実験医学別冊 タンパク質実験ハンドブック、４７−５２頁、羊土社、２００３年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、近年において、同時に複数のアッセイを行うためのマルチウェルタイプ、特に９６穴、３８４穴などのハイスループットタイプのマイクロタイタープレートなどが開発され、アッセイ技術の向上が図られている。また、糖鎖の精製抽出も、迅速化ならびに少量サンプルでの実施の要請から、このようなマイクロタイタープレートを用いて行うことが要望されるようになってきている。
【０００６】
そこで、特許文献１に記載されているような糖鎖捕捉物質を用いて、マイクロタイタープレートにて糖鎖の精製抽出を行う場合には、マイクロタイタープレートの各ウェルにおいて糖鎖捕捉物質を一定量とする必要がある。このような用途では、糖鎖捕捉物質は通常微粒子の形態のものが使用され、一般的に微粒子は乾燥粉末の状態で提供されることが多い。
【０００７】
このような場合、各ウェルにおいて糖鎖捕捉物質を一定量とするために、使用するウェルの数だけ糖鎖捕捉物質の乾燥粉末を秤量して、ウェルごとに分散液を作製する方法がある。この場合、ミリグラムまたはマイクログラムのオーダーで秤量する必要があることから秤量誤差が無視できないという点、およびその秤量誤差が各ウェルについて発生する点、ならびにウェルの数が非常に多いハイスループットアッセイには秤量回数が非常に多くなるという点などから現実的なアプローチとは言えない。
【０００８】
一方で、秤量誤差をおよび秤量回数の低減の観点から、一度に大容量の分散液を作製し、その分散液をマイクロタイタープレートの各ウェルに分注するという操作を行う方法が考えられる。しかしながら、ハイスループットアッセイにおいては、分注の回数が非常に多くなり、操作も煩雑になる。また、分注の操作中に分散液中で微粒子が沈殿し、分散液中で糖鎖捕捉物質の分布ができてしまうため、各ウェルに一定量の糖鎖捕捉物質を導入することが困難であり、これが分注操作時の誤差となる。このような分注操作持の誤差は、各ウェルでのアッセイの評価を困難にし、特にスクリーニング用途でのマイクロタイタープレートでのアッセイでは望ましくない。
【０００９】
分散液の入った容器を振とう、あるいは、分散液をスターラー等で撹拌させながら、各ウェルへの分注操作を行うことにより、分注操作時の誤差を低減することは可能である。しかしながら、分注操作の回数を低減させることは困難であり、このような煩雑な操作は、分注操作を含めた全操作の自動化を実現することを困難にしている。
【００１０】
このため、マイクロタイタープレートを用いて同時に多くのアッセイを行うことが可能であったとしても、分注操作を含めた全操作の自動化が困難であることから、ハイスループットアッセイを行うことの利点が活かし切れていなかった。
【００１１】
そこで、本発明は、簡便な操作にて所定量の糖鎖捕捉物質を導入することを容易にし、たとえハイスループットアッセイにおいても糖鎖捕捉物質の導入に際して煩雑な操作を必要としないような、タブレットおよびその用途を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、
（１）下記（式１）で表される糖鎖捕捉物質と、塩とを含むタブレット。
【００１３】
【化１】
【００１４】
（担体はポリマーマトリックス、Ｒは−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖を示す。）
（２）前記糖鎖捕捉物質が下記の（式２）で表される架橋型ポリマー構造を有する（１）記載のタブレット。
【００１５】
【化２】
【００１６】
（Ｒ1，Ｒ2は−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5はＨ，ＣＨ3，または炭素数２〜５の炭化水素鎖を示す。ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）
（３）前記糖鎖捕捉物質が下記の（式３）で表される架橋型ポリマー構造を有する（２）記載のタブレット。
【００１７】
【化３】
【００１８】
（ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）
（４）前記糖鎖捕捉物質が平均粒径０．１μｍ以上５００μｍ以下のポリマー粒子である（１）〜（３）のいずれかに記載のタブレット。
（５）前記糖鎖捕捉物質が乾燥重量１ｍｇ当り１００ｎｍｏｌ以上のヒドラジド基を有するポリマー粒子である（１）〜（４）のいずれかに記載のタブレット。
（６）前記糖鎖捕捉物質がｐＨ３〜８で安定である（１）〜（５）のいずれかに記載のタブレット。
（７）前記糖鎖捕捉物質が少なくとも１ＭＰａ以下の圧力下で安定である（１）〜（５）のいずれかに記載のタブレット。
（８）（１）〜（７）のいずれかに記載のタブレットを水に溶解させて糖鎖捕捉物質の分散液とし、
当該分散液に糖鎖および／または糖の誘導体を含有する試料を導入し、前記糖鎖捕捉物質と前記糖鎖および／または糖の誘導体との間で複合体を形成させる、試料調製方法。
（９）マルチウェルタイプのマイクロタイタープレートにて試料調製を行う試料調製方法であって、
前記各ウェルに、（１）〜（７）のいずれかに記載のタブレットを投入し、
当該各ウェルに水を導入してタブレットを溶解させて糖鎖捕捉物質の分散液とし、
前記各ウェルに糖鎖および／または糖の誘導体を含有する試料を導入し、前記糖鎖捕捉物質と前記糖鎖および／または糖の誘導体との間で複合体を形成させる、試料調製方法。
（１０）（８）または（９）記載の試料調製方法において、
前記複合体を酸性条件で処理して、糖鎖および／または糖の誘導体を遊離させる、試料調製方法。
（１１）（１０）記載の試料調製方法において、
前記遊離させた糖鎖および／または糖の誘導体を、さらにラベル化する、試料調製方法。
（１２）（１１）記載の試料調製方法において、
前記ラベル化が２−アミノベンズアミド、または、２−アミノピリジンによる蛍光ラベル化である、試料調製方法。
を提供する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、簡便な操作にて所定量の糖鎖捕捉物質を導入することを容易にし、たとえハイスループットアッセイにおいても糖鎖捕捉物質の導入に際して煩雑な操作を必要としないタブレットが提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の実施形態について説明する。
一つの観点から、本発明は、下記（式１）で表される糖鎖捕捉物質と、塩とを含むタブレットを提供する。
【００２１】
【化４】
【００２２】
（担体はポリマーマトリックス、Ｒは−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖を示す。）
ここで、「糖鎖捕捉物質」とは、以下の糖鎖捕捉反応に関与する物質をいう。
【００２３】
【化５】
【００２４】
式１において、担体は、無機物質または有機高分子物質からなる粒子状のポリマーマトリックスである。
【００２５】
ここで、担体として用いることができる無機物質としては、粒子状のものであればよく、例えばシリカ粒子、アルミナ粒子、ガラス粒子、金属粒子などが挙げられる。
【００２６】
また、有機高分子物質としては、アガロース、セファロースに代表される多糖類ゲル、ビニル化合物の重合体であるポリマーを粒子状にしたものが挙げられる。
【００２７】
また、粒子の形状は球であることが好ましく、平均粒径０．１μｍ以上５００μｍ以下のポリマー粒子である。このような範囲の粒径を有する担体の粒子は、遠心分離，フィルタなどによる回収が容易であり、かつ、充分な表面積を有しているために糖鎖との反応効率も高いと考えられる。粒径が上記の範囲よりも大幅に大きい場合、表面積が小さくなるために糖鎖との反応効率が低くなることがある。また、粒径が上記の範囲よりも大幅に小さい場合、特にフィルタによる粒子の回収が難しくなることがある。さらに、粒子をカラムに充填して用いる場合、粒径が過小であると通液の際の圧力損失が大きくなってしまうことがある。
【００２８】
Ｒは、−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖を示し、例えば下記のものを挙げることができる。下記式中、ａ、ｂ、ｄは１から５の整数を表し、ｃは１から１０の整数を表す。
【００２９】
【化６】
【００３０】
また、上記（式１）で表される糖鎖捕捉物質は、特許文献１に記載されているように、重合性基を含むカルボン酸エステルモノマーを含む原料を架橋剤存在下で重合させてカルボン酸エステル含有ポリマー粒子を得た後、当該カルボン酸エステル含有ポリマー粒子を１０体積パーセント以上の濃度のヒドラジン溶液で処理することにより得ることができる。
【００３１】
ここで、カルボン酸エステルモノマーとしては、カルボン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボン酸メチルエステルが挙げられる。
【００３２】
また、架橋剤としては、多官能の化合物であって、カルボン酸エステルモノマーと共重合を行う化合物を好適に用いることができ、例えば（１）ポリオールのジまたはトリ（メタ）アクリル酸エステル類、例えばポリオールがエチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチロールプロパン、グリセリン、ポリオキシエチレングリコール、ポリオキシプロピレングリコール、ポリグリセリン等であるもの、（２）上記（１）において、不飽和酸が（メタ）アクリル酸以外のもの、例えばマレイン酸、フマル酸などであるもの、（３）ビスアクリルアミド類、例えばＮ，Ｎ'−メチレンビスアクリルアミドなど、（４）ポリエポキシドと（メタ）アクリル酸を反応させて得られるジまたはトリ（メタ）アクリル酸エステル類、（５）ポリイソシアネートと（メタ）アクリル酸ヒドロキシエステルを反応させて得られるジ（メタ）アクリル酸カルバミルエステル類、例えばポリイソシアネートがトリレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネートなどであるもの、（６）多価アリル化合物、例えばアリル化デンプン、アリル化セルロース、ジアリルフタレート、テトラアリロキシエタン、ペンタエリストールトリアリルエーテル、トリメチロールプロパントリアリルエーテル、ジエチレングリコールジアリルエーテル、トリアリルトリメリテート等が挙げられる。これらの中でも本発明では、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ'−メチレンビス（メタ）アクリルアミド等が好ましい。
【００３３】
すなわち、（式１）で表される糖鎖捕捉物質は、下記のような構造をとるものを用いることができる。
−(ヒドラジド基含有化合物成分)m−(架橋剤成分)n−
このような構造を有する糖鎖捕捉物質としては、下記の（式２）で表される架橋型ポリマー構造を有するものが挙げられる。
【００３４】
【化７】
【００３５】
（Ｒ1，Ｒ2は−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5はＨ，ＣＨ3，または炭素数２〜５の炭化水素鎖を示す。ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）
【００３６】
Ｒ1は、−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖を示し、例えば前記Ｒと同様のものを挙げることができる。
【００３７】
Ｒ2は、−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖を示し、例えば下記のものを挙げることができる。下記式中、ｅ、ｆは１から５の整数を表し、ｇは１から１０の整数を表す。
【００３８】
【化８】
【００３９】
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5は、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、Ｈ，ＣＨ3，または炭素数２〜５の炭化水素鎖を示し、例えば下記のものを挙げることができる。下記式中、ｈは１から４の整数を表す。
【００４０】
【化９】
【００４１】
また、このような（式２）のうち、特に好適な物質Ａとしては、下記の（式３）で表される架橋型ポリマー構造を有するものが挙げられる。
【００４２】
【化１０】
【００４３】
（ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）
【００４４】
本発明で用いられる糖鎖捕捉物質は、乾燥重量１ｍｇ当り１００ｎｍｏｌ以上、好ましくは０．５μｍｏｌ以上のヒドラジド基を有するポリマー粒子である。また、ｐＨ３〜８で安定であり、少なくとも１ＭＰａ以下の圧力下で安定であることが、粒子の形状を保ち、かつ、活性なヒドラジド基の含有量が実質的に変化しないという観点から好ましい。また、架橋剤と共重合した粒子なので、溶媒への溶解性が低くなり、さらに物理的強度が十分得られる。さらには、ｐＨ３〜８で切断される部位がない。
【００４５】
このような糖鎖捕捉物質を用いた糖鎖捕捉反応、すなわち糖鎖捕捉物質と、糖鎖および／または糖の誘導体との反応は、糖鎖および／または糖の誘導体を含む試料に、糖鎖捕捉物質を導入して、ｐＨが４〜８の条件にて、また反応温度が４〜９０℃、好ましくは２５〜９０℃、より好ましくは４０〜９０℃の条件における反応系で、１０分間〜２４時間、好ましくは１０分間〜８時間、より好ましくは１０分間〜２時間行われる。
【００４６】
本発明のタブレットに用いられる塩としては、結晶化しやすい塩であればよく、例えばリン酸塩、臭化カリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウムなどの無機塩、デンプンなどの糖類、ゼラチンなどの水溶性の賦形剤、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールなどの水溶性の合成ポリマーなどが挙げられる。特に、リン酸塩は乾燥すると固化しやすいため、好ましい。
【００４７】
本発明のタブレットは、例えば以下のようにして作製することができる。
糖鎖捕捉物質をサンプルチューブにて秤量し、そこに所定濃度の緩衝剤を所定量だけ導入して分散液を作製する。作製した分散液を、例えばマイクロタイタープレートのウェルに分注し、その後プレートごと加熱乾燥させて、糖鎖捕捉物質と一緒に塩を固めてタブレットを得ることができる。また、加熱乾燥に換えて、自然乾燥（風乾）や凍結真空乾燥によりタブレットを形成することも可能である。
【００４８】
また、このとき、糖鎖捕捉物質の量、緩衝剤の濃度および導入量、緩衝剤の種類は、想定される実験系を考慮して適宜設定することができる。すなわち、タブレットに含有される糖鎖捕捉物質および塩の量は、水を添加して所定の容積の溶液としたとき、所定の濃度となるように調整される。
【００４９】
また、別の観点から、本発明は前述のタブレットの用途として、試料調製方法を提供する。
すなわち、当該試料調製方法の一態様は、前述のタブレットを水に溶解させて糖鎖捕捉物質の分散液とし、当該分散液に糖鎖および／または糖の誘導体を含有する試料を導入し、前記糖鎖捕捉物質と前記糖鎖および／または糖の誘導体との間で複合体を形成させるものである。
【００５０】
この試料調製方法によれば、前述のタブレットが、水に溶解させたときに所定濃度の糖鎖捕捉物質および塩になるように調整されているため、所定量の糖鎖捕捉物質を導入することが容易となり、従来の粉末形態で提供されていたときに生じ得た、秤量誤差などの影響を受けない。
【００５１】
また、試料調製方法の他の態様は、マルチウェルタイプのマイクロタイタープレートにて試料調製を行う試料調製方法であって、前記各ウェルに、前述のタブレットを投入し、当該各ウェルに水を導入してタブレットを溶解させて糖鎖捕捉物質の分散液とし、前記各ウェルに糖鎖および／または糖の誘導体を含有する試料を導入し、前記糖鎖捕捉物質と前記糖鎖および／または糖の誘導体との間で複合体を形成させるものである。
【００５２】
この試料調製方法によれば、前述したように、所定量の固相担体を導入することが容易になる上に、特にマイクロタイタープレートのような一度に多くのウェルに一定量の糖鎖捕捉物質を含む分散液を導入する際に、分注操作などの煩雑な操作を行うことなく、タブレットを各ウェルに投入し、一定量の水を導入するといった簡便な操作だけでよく、従来行ってきた分注操作による誤差を低減することを可能にすることができる。
【００５３】
さらに、本発明の試料調製方法において、糖鎖捕捉物質と糖鎖および／または糖の誘導体との間で形成された複合体を酸性条件下で処理して、糖鎖および／または糖の誘導体を遊離させてもよい。
【００５４】
このときの酸性条件での処理は、０．０１〜１０体積パーセントの酢酸溶液による処理であり、好ましくは０．０１〜１体積パーセントの酢酸溶液にて、２５〜８０℃で５〜６０分間行われる。
【００５５】
このようにして得られる糖鎖サンプルからなる分析試料は、標識化されていないものであり、標識しなくてもよい用途に有用である。
【００５６】
このようにして、糖鎖および／または糖の誘導体を含む生体試料より分析試料のための糖鎖および／または糖の誘導体を、簡単な操作で分離精製することが可能になる。さらなる観点から、本発明は、この分析試料方法により得られる分析試料を提供する。
【００５７】
また、この試料調製方法において、遊離させた糖鎖および／または糖の誘導体を、さらにラベル化してもよく、このようなラベル化としては、２−アミノベンズアミド、または、２−アミノピリジンによる蛍光ラベル化が挙げられる。
【００５８】
さらに、本発明の試料調製方法において、糖鎖捕捉物質と糖鎖および／または糖の誘導体との間で形成された複合体における、糖鎖および／または糖の誘導体に対して結合性または親和性を有する物質を含む第二の試料を接触させて、当該糖鎖および／または糖の誘導体に対して結合性または親和性を有する物質を捕集することもできる。
【００５９】
本実施形態においては、まず、糖鎖捕捉物質と、糖鎖および／または糖の誘導体とを反応させて複合体とした後、この複合体に対して、診断または検査を行うための検体から採取した試料（以下、「検体試料」という）を作用させて、この検体試料に含まれる糖鎖および／または糖の誘導体に対して結合性または親和性を有する物質、例えばレクチンなどの糖結合性タンパク質を捕集させる。
【００６０】
また、捕集された物質を、検出、定量化することにより、糖鎖と検体細胞の分化増殖、細胞接着、免疫、および細胞の癌化との関係について、より高度な解析を行うことができる。
【実施例】
【００６１】
以下の実験例にて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実験例に限定されることはない。
【００６２】
（製造例）
特許文献１に記載されているように、以下の１〜４の手順にしたがって、ヒドラジド基含有ポリマービーズを作製し、実施例、比較例において糖鎖捕捉ビーズとして用いた。
１．メチルエステル含有モノマーの合成
以下のスキーム１に示すルートでメチルエステル含有モノマーを合成した。
【００６３】
【化１１】
【００６４】
（１）化合物（ｃ）の合成
無水メタクリル酸（ＭＡＨ：５ｇ，０．０３ｍｏｌ）（ｂ）を１００ｍｌのクロロホルムに溶解させた溶液を、２５ｇの（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（ＥＤＢＥＡ：２５ｇ，０．１７ｍｏｌ）（ａ）を１００ｍｌのクロロホルムに溶解させた溶液に氷浴上で滴下投入した。そこへ窒素を封入し、終夜攪拌させた。得られた反応溶液から溶媒を蒸発させて得た残留物を、シリカゲルカラム（展開溶媒：クロロホルム９０容／メタノール１０容の混合溶媒）にかけて所定のフラクションを分取して、このフラクションから溶媒を蒸発させて化合物（ｃ）を得た。
【００６５】
（２）化合物（ｅ）の合成
５ｇの化合物（ｃ）（０．０２３ｍｏｌ）を１００ｍｌのクロロホルムに溶解させた溶液に、１．５当量のコハク酸モノメチル（ｄ）および１．５当量の水溶性カルボジイミド化合物（ＷＳＣ）である１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを加えて、密栓した。そこへ窒素を封入し、終夜攪拌させた。得られた反応溶液から溶媒を蒸発させて得た残留物を、シリカゲルカラム（展開溶媒：クロロホルム９０容／メタノール１０容の混合溶媒）にかけて所定のフラクションを分取して、このフラクションから溶媒を蒸発させて化合物（ｅ）を得た。
また、得られた物質は、ＮＭＲ、マトリックス支援レーザイオン化−飛行時間型質量分析器（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）により化合物（ｅ）であることを確認した。
【００６６】
２．メチルエステル含有ポリマーの合成
以下のスキーム２に示すルートでメチルエステル含有ポリマー粒子を合成した。
【００６７】
【化１２】
【００６８】
三口フラスコに２５ｍｌの５％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）水溶液を装入し、そこへ窒素をパージした。１ｇの化合物（ｅ）（２．６ｍｍｏｌ）、エチレングリコールジメタクリレート（ｆ）（ＥＧＤＭＡ：（ｅ）に対して５ｍｏｌ％）および１ｍｌのクロロホルムからなる混合物を、前記三口フラスコに導入し、６０℃に保ちながら攪拌して、混合物に含まれるモノマーとしての化合物（ｅ）およびＥＧＤＭＡをＰＶＡ水溶液中に分散させた。続いて、モノマーに対して３重量％の重合開始剤としてのアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を加えて重合を開始させた。６０℃で１６時間反応させた後、生成したポリマー粒子を遠心分離により回収し、メタノールと水とで洗浄した。
【００６９】
３．ヒドラジド基の導入
ポリマー粒子４００ｍｇを容器にとり、ヒドラジン１水和物４ｍｌを加えて攪拌し、室温で２時間静置した。反応後、ヒドラジン１水和物を除去し、メタノールで洗浄したのち、１Ｍ塩酸でリンスした。その後さらに純水で洗浄した。
【００７０】
４．官能基量の定量
ポリマー粒子１ｍｇを容器にとり、Ｎ−アセチル−Ｄ−ラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ）１μｍｏｌを添加し、さらに、２％酢酸を含むアセトニトリル１８０μｌを加えた。これを８０℃で４５分間加熱することによりＬａｃＮＡｃとビーズ上のヒドラジド基を反応させた。純水でビーズをリンスして未反応の糖鎖を回収し、それをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定により定量（内部標準法）し、ビーズへのＬａｃＮＡｃ結合量を求めた。ビーズ１ｍｇあたり０．８６μｍｏｌ（８６０ｎｍｏｌ）のＬａｃＮＡｃが結合することが分かった。
【００７１】
（実施例１）
９．６ｇのダルベッコＰＢＳ（−）粉末（日水製薬（株）製）を１リットルの純水に溶解して、ＰＢＳ溶液を得た。製造例で得られた糖鎖捕捉ビーズを５０ｍｇ、サンプルチューブに量り取り、そこに５００μｌのＰＢＳ溶液を加えて、分散液を作製した。この分散液を５０μｌ、ピペットで量り取り、フッ素系樹脂で成形したＵ底マイクロプレート（（株）フロンケミカル製のフッ素系樹脂で成形したカルチャープレート）の１０箇所のウェルにそれぞれ分注した。その後、マイクロプレートを８０℃のオーブン内に１時間静置して、ウェル内の分散液を乾燥させた。乾燥後、各ウェルにタブレット状に固められたビーズを取り出し、合計１０個のタブレットが得られた。
【００７２】
得られたタブレットの一つをサンプルチューブに投入し、純水１００μｌを注入したところ、素早く良好な状態で分散した。
【００７３】
（実施例２）
実施例１で調製した９個のタブレットを、９本のサンプルチューブにそれぞれ投入した。各サンプルチューブに純水１００μｌを注入し、分散状態にした後、遠心してビーズを沈殿させて上澄みを除去した。この操作を３回繰り返した後、真空乾燥してビーズを乾燥させ、サンプルチューブごとに、残ったビーズの総乾燥重量をそれぞれ測定した。この測定の結果を表１に示した。
【００７４】
（比較例１）
製造例で得られた糖鎖捕捉ビーズを５０ｍｇ、サンプルチューブに量り取り、そこに５００μｌの純水を加えて、分散液を作製した。この分散液を９本のサンプルチューブに５０μｌずつ分注した。チューブを遠心してビーズを沈殿させ、上澄みを除去した後、真空乾燥してビーズを乾燥させ、サンプルチューブごとに、残ったビーズの総乾燥重量をそれぞれ測定した。この測定の結果を表１に示した。
【００７５】
【表１】
【００７６】
表１によれば、実施例２のアッセイの方が、比較例１のアッセイよりも、標準偏差／平均値で得られるＣＶ値が理想であるゼロに近い値となった。また、実施例２のアッセイの方が短時間で行うことができた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所定の糖鎖捕捉物質を含み、かつ、水に溶解させて一定濃度の糖鎖捕捉物質の溶液とするためのタブレット、およびこのタブレットの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
血清、細胞破砕液、組織などの混合物から、糖鎖などの特定の生体高分子を精製抽出する手段として、これらの分子と特異的に作用する固相担体を用いる方法がある。例えば、特許文献１には、ヒドラジド基含有ポリマービーズなどの糖鎖捕捉用の固相担体（糖鎖捕捉物質）を用いて、糖鎖を精製抽出することができる旨記載されている。また、非特許文献１には、実際に表面に捕捉物質を固定化した固相ビーズを用いて、タンパク質を精製する技術が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００８／０１８１７０号パンフレット
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】実験医学別冊 タンパク質実験ハンドブック、４７−５２頁、羊土社、２００３年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、近年において、同時に複数のアッセイを行うためのマルチウェルタイプ、特に９６穴、３８４穴などのハイスループットタイプのマイクロタイタープレートなどが開発され、アッセイ技術の向上が図られている。また、糖鎖の精製抽出も、迅速化ならびに少量サンプルでの実施の要請から、このようなマイクロタイタープレートを用いて行うことが要望されるようになってきている。
【０００６】
そこで、特許文献１に記載されているような糖鎖捕捉物質を用いて、マイクロタイタープレートにて糖鎖の精製抽出を行う場合には、マイクロタイタープレートの各ウェルにおいて糖鎖捕捉物質を一定量とする必要がある。このような用途では、糖鎖捕捉物質は通常微粒子の形態のものが使用され、一般的に微粒子は乾燥粉末の状態で提供されることが多い。
【０００７】
このような場合、各ウェルにおいて糖鎖捕捉物質を一定量とするために、使用するウェルの数だけ糖鎖捕捉物質の乾燥粉末を秤量して、ウェルごとに分散液を作製する方法がある。この場合、ミリグラムまたはマイクログラムのオーダーで秤量する必要があることから秤量誤差が無視できないという点、およびその秤量誤差が各ウェルについて発生する点、ならびにウェルの数が非常に多いハイスループットアッセイには秤量回数が非常に多くなるという点などから現実的なアプローチとは言えない。
【０００８】
一方で、秤量誤差をおよび秤量回数の低減の観点から、一度に大容量の分散液を作製し、その分散液をマイクロタイタープレートの各ウェルに分注するという操作を行う方法が考えられる。しかしながら、ハイスループットアッセイにおいては、分注の回数が非常に多くなり、操作も煩雑になる。また、分注の操作中に分散液中で微粒子が沈殿し、分散液中で糖鎖捕捉物質の分布ができてしまうため、各ウェルに一定量の糖鎖捕捉物質を導入することが困難であり、これが分注操作時の誤差となる。このような分注操作持の誤差は、各ウェルでのアッセイの評価を困難にし、特にスクリーニング用途でのマイクロタイタープレートでのアッセイでは望ましくない。
【０００９】
分散液の入った容器を振とう、あるいは、分散液をスターラー等で撹拌させながら、各ウェルへの分注操作を行うことにより、分注操作時の誤差を低減することは可能である。しかしながら、分注操作の回数を低減させることは困難であり、このような煩雑な操作は、分注操作を含めた全操作の自動化を実現することを困難にしている。
【００１０】
このため、マイクロタイタープレートを用いて同時に多くのアッセイを行うことが可能であったとしても、分注操作を含めた全操作の自動化が困難であることから、ハイスループットアッセイを行うことの利点が活かし切れていなかった。
【００１１】
そこで、本発明は、簡便な操作にて所定量の糖鎖捕捉物質を導入することを容易にし、たとえハイスループットアッセイにおいても糖鎖捕捉物質の導入に際して煩雑な操作を必要としないような、タブレットおよびその用途を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、
（１）下記（式１）で表される糖鎖捕捉物質と、塩とを含むタブレット。
【００１３】
【化１】
【００１４】
（担体はポリマーマトリックス、Ｒは−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖を示す。）
（２）前記糖鎖捕捉物質が下記の（式２）で表される架橋型ポリマー構造を有する（１）記載のタブレット。
【００１５】
【化２】
【００１６】
（Ｒ1，Ｒ2は−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5はＨ，ＣＨ3，または炭素数２〜５の炭化水素鎖を示す。ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）
（３）前記糖鎖捕捉物質が下記の（式３）で表される架橋型ポリマー構造を有する（２）記載のタブレット。
【００１７】
【化３】
【００１８】
（ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）
（４）前記糖鎖捕捉物質が平均粒径０．１μｍ以上５００μｍ以下のポリマー粒子である（１）〜（３）のいずれかに記載のタブレット。
（５）前記糖鎖捕捉物質が乾燥重量１ｍｇ当り１００ｎｍｏｌ以上のヒドラジド基を有するポリマー粒子である（１）〜（４）のいずれかに記載のタブレット。
（６）前記糖鎖捕捉物質がｐＨ３〜８で安定である（１）〜（５）のいずれかに記載のタブレット。
（７）前記糖鎖捕捉物質が少なくとも１ＭＰａ以下の圧力下で安定である（１）〜（５）のいずれかに記載のタブレット。
（８）（１）〜（７）のいずれかに記載のタブレットを水に溶解させて糖鎖捕捉物質の分散液とし、
当該分散液に糖鎖および／または糖の誘導体を含有する試料を導入し、前記糖鎖捕捉物質と前記糖鎖および／または糖の誘導体との間で複合体を形成させる、試料調製方法。
（９）マルチウェルタイプのマイクロタイタープレートにて試料調製を行う試料調製方法であって、
前記各ウェルに、（１）〜（７）のいずれかに記載のタブレットを投入し、
当該各ウェルに水を導入してタブレットを溶解させて糖鎖捕捉物質の分散液とし、
前記各ウェルに糖鎖および／または糖の誘導体を含有する試料を導入し、前記糖鎖捕捉物質と前記糖鎖および／または糖の誘導体との間で複合体を形成させる、試料調製方法。
（１０）（８）または（９）記載の試料調製方法において、
前記複合体を酸性条件で処理して、糖鎖および／または糖の誘導体を遊離させる、試料調製方法。
（１１）（１０）記載の試料調製方法において、
前記遊離させた糖鎖および／または糖の誘導体を、さらにラベル化する、試料調製方法。
（１２）（１１）記載の試料調製方法において、
前記ラベル化が２−アミノベンズアミド、または、２−アミノピリジンによる蛍光ラベル化である、試料調製方法。
を提供する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、簡便な操作にて所定量の糖鎖捕捉物質を導入することを容易にし、たとえハイスループットアッセイにおいても糖鎖捕捉物質の導入に際して煩雑な操作を必要としないタブレットが提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の実施形態について説明する。
一つの観点から、本発明は、下記（式１）で表される糖鎖捕捉物質と、塩とを含むタブレットを提供する。
【００２１】
【化４】
【００２２】
（担体はポリマーマトリックス、Ｒは−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖を示す。）
ここで、「糖鎖捕捉物質」とは、以下の糖鎖捕捉反応に関与する物質をいう。
【００２３】
【化５】
【００２４】
式１において、担体は、無機物質または有機高分子物質からなる粒子状のポリマーマトリックスである。
【００２５】
ここで、担体として用いることができる無機物質としては、粒子状のものであればよく、例えばシリカ粒子、アルミナ粒子、ガラス粒子、金属粒子などが挙げられる。
【００２６】
また、有機高分子物質としては、アガロース、セファロースに代表される多糖類ゲル、ビニル化合物の重合体であるポリマーを粒子状にしたものが挙げられる。
【００２７】
また、粒子の形状は球であることが好ましく、平均粒径０．１μｍ以上５００μｍ以下のポリマー粒子である。このような範囲の粒径を有する担体の粒子は、遠心分離，フィルタなどによる回収が容易であり、かつ、充分な表面積を有しているために糖鎖との反応効率も高いと考えられる。粒径が上記の範囲よりも大幅に大きい場合、表面積が小さくなるために糖鎖との反応効率が低くなることがある。また、粒径が上記の範囲よりも大幅に小さい場合、特にフィルタによる粒子の回収が難しくなることがある。さらに、粒子をカラムに充填して用いる場合、粒径が過小であると通液の際の圧力損失が大きくなってしまうことがある。
【００２８】
Ｒは、−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖を示し、例えば下記のものを挙げることができる。下記式中、ａ、ｂ、ｄは１から５の整数を表し、ｃは１から１０の整数を表す。
【００２９】
【化６】
【００３０】
また、上記（式１）で表される糖鎖捕捉物質は、特許文献１に記載されているように、重合性基を含むカルボン酸エステルモノマーを含む原料を架橋剤存在下で重合させてカルボン酸エステル含有ポリマー粒子を得た後、当該カルボン酸エステル含有ポリマー粒子を１０体積パーセント以上の濃度のヒドラジン溶液で処理することにより得ることができる。
【００３１】
ここで、カルボン酸エステルモノマーとしては、カルボン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボン酸メチルエステルが挙げられる。
【００３２】
また、架橋剤としては、多官能の化合物であって、カルボン酸エステルモノマーと共重合を行う化合物を好適に用いることができ、例えば（１）ポリオールのジまたはトリ（メタ）アクリル酸エステル類、例えばポリオールがエチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチロールプロパン、グリセリン、ポリオキシエチレングリコール、ポリオキシプロピレングリコール、ポリグリセリン等であるもの、（２）上記（１）において、不飽和酸が（メタ）アクリル酸以外のもの、例えばマレイン酸、フマル酸などであるもの、（３）ビスアクリルアミド類、例えばＮ，Ｎ'−メチレンビスアクリルアミドなど、（４）ポリエポキシドと（メタ）アクリル酸を反応させて得られるジまたはトリ（メタ）アクリル酸エステル類、（５）ポリイソシアネートと（メタ）アクリル酸ヒドロキシエステルを反応させて得られるジ（メタ）アクリル酸カルバミルエステル類、例えばポリイソシアネートがトリレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネートなどであるもの、（６）多価アリル化合物、例えばアリル化デンプン、アリル化セルロース、ジアリルフタレート、テトラアリロキシエタン、ペンタエリストールトリアリルエーテル、トリメチロールプロパントリアリルエーテル、ジエチレングリコールジアリルエーテル、トリアリルトリメリテート等が挙げられる。これらの中でも本発明では、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ'−メチレンビス（メタ）アクリルアミド等が好ましい。
【００３３】
すなわち、（式１）で表される糖鎖捕捉物質は、下記のような構造をとるものを用いることができる。
−(ヒドラジド基含有化合物成分)m−(架橋剤成分)n−
このような構造を有する糖鎖捕捉物質としては、下記の（式２）で表される架橋型ポリマー構造を有するものが挙げられる。
【００３４】
【化７】
【００３５】
（Ｒ1，Ｒ2は−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5はＨ，ＣＨ3，または炭素数２〜５の炭化水素鎖を示す。ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）
【００３６】
Ｒ1は、−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖を示し、例えば前記Ｒと同様のものを挙げることができる。
【００３７】
Ｒ2は、−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖を示し、例えば下記のものを挙げることができる。下記式中、ｅ、ｆは１から５の整数を表し、ｇは１から１０の整数を表す。
【００３８】
【化８】
【００３９】
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5は、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、Ｈ，ＣＨ3，または炭素数２〜５の炭化水素鎖を示し、例えば下記のものを挙げることができる。下記式中、ｈは１から４の整数を表す。
【００４０】
【化９】
【００４１】
また、このような（式２）のうち、特に好適な物質Ａとしては、下記の（式３）で表される架橋型ポリマー構造を有するものが挙げられる。
【００４２】
【化１０】
【００４３】
（ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）
【００４４】
本発明で用いられる糖鎖捕捉物質は、乾燥重量１ｍｇ当り１００ｎｍｏｌ以上、好ましくは０．５μｍｏｌ以上のヒドラジド基を有するポリマー粒子である。また、ｐＨ３〜８で安定であり、少なくとも１ＭＰａ以下の圧力下で安定であることが、粒子の形状を保ち、かつ、活性なヒドラジド基の含有量が実質的に変化しないという観点から好ましい。また、架橋剤と共重合した粒子なので、溶媒への溶解性が低くなり、さらに物理的強度が十分得られる。さらには、ｐＨ３〜８で切断される部位がない。
【００４５】
このような糖鎖捕捉物質を用いた糖鎖捕捉反応、すなわち糖鎖捕捉物質と、糖鎖および／または糖の誘導体との反応は、糖鎖および／または糖の誘導体を含む試料に、糖鎖捕捉物質を導入して、ｐＨが４〜８の条件にて、また反応温度が４〜９０℃、好ましくは２５〜９０℃、より好ましくは４０〜９０℃の条件における反応系で、１０分間〜２４時間、好ましくは１０分間〜８時間、より好ましくは１０分間〜２時間行われる。
【００４６】
本発明のタブレットに用いられる塩としては、結晶化しやすい塩であればよく、例えばリン酸塩、臭化カリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウムなどの無機塩、デンプンなどの糖類、ゼラチンなどの水溶性の賦形剤、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールなどの水溶性の合成ポリマーなどが挙げられる。特に、リン酸塩は乾燥すると固化しやすいため、好ましい。
【００４７】
本発明のタブレットは、例えば以下のようにして作製することができる。
糖鎖捕捉物質をサンプルチューブにて秤量し、そこに所定濃度の緩衝剤を所定量だけ導入して分散液を作製する。作製した分散液を、例えばマイクロタイタープレートのウェルに分注し、その後プレートごと加熱乾燥させて、糖鎖捕捉物質と一緒に塩を固めてタブレットを得ることができる。また、加熱乾燥に換えて、自然乾燥（風乾）や凍結真空乾燥によりタブレットを形成することも可能である。
【００４８】
また、このとき、糖鎖捕捉物質の量、緩衝剤の濃度および導入量、緩衝剤の種類は、想定される実験系を考慮して適宜設定することができる。すなわち、タブレットに含有される糖鎖捕捉物質および塩の量は、水を添加して所定の容積の溶液としたとき、所定の濃度となるように調整される。
【００４９】
また、別の観点から、本発明は前述のタブレットの用途として、試料調製方法を提供する。
すなわち、当該試料調製方法の一態様は、前述のタブレットを水に溶解させて糖鎖捕捉物質の分散液とし、当該分散液に糖鎖および／または糖の誘導体を含有する試料を導入し、前記糖鎖捕捉物質と前記糖鎖および／または糖の誘導体との間で複合体を形成させるものである。
【００５０】
この試料調製方法によれば、前述のタブレットが、水に溶解させたときに所定濃度の糖鎖捕捉物質および塩になるように調整されているため、所定量の糖鎖捕捉物質を導入することが容易となり、従来の粉末形態で提供されていたときに生じ得た、秤量誤差などの影響を受けない。
【００５１】
また、試料調製方法の他の態様は、マルチウェルタイプのマイクロタイタープレートにて試料調製を行う試料調製方法であって、前記各ウェルに、前述のタブレットを投入し、当該各ウェルに水を導入してタブレットを溶解させて糖鎖捕捉物質の分散液とし、前記各ウェルに糖鎖および／または糖の誘導体を含有する試料を導入し、前記糖鎖捕捉物質と前記糖鎖および／または糖の誘導体との間で複合体を形成させるものである。
【００５２】
この試料調製方法によれば、前述したように、所定量の固相担体を導入することが容易になる上に、特にマイクロタイタープレートのような一度に多くのウェルに一定量の糖鎖捕捉物質を含む分散液を導入する際に、分注操作などの煩雑な操作を行うことなく、タブレットを各ウェルに投入し、一定量の水を導入するといった簡便な操作だけでよく、従来行ってきた分注操作による誤差を低減することを可能にすることができる。
【００５３】
さらに、本発明の試料調製方法において、糖鎖捕捉物質と糖鎖および／または糖の誘導体との間で形成された複合体を酸性条件下で処理して、糖鎖および／または糖の誘導体を遊離させてもよい。
【００５４】
このときの酸性条件での処理は、０．０１〜１０体積パーセントの酢酸溶液による処理であり、好ましくは０．０１〜１体積パーセントの酢酸溶液にて、２５〜８０℃で５〜６０分間行われる。
【００５５】
このようにして得られる糖鎖サンプルからなる分析試料は、標識化されていないものであり、標識しなくてもよい用途に有用である。
【００５６】
このようにして、糖鎖および／または糖の誘導体を含む生体試料より分析試料のための糖鎖および／または糖の誘導体を、簡単な操作で分離精製することが可能になる。さらなる観点から、本発明は、この分析試料方法により得られる分析試料を提供する。
【００５７】
また、この試料調製方法において、遊離させた糖鎖および／または糖の誘導体を、さらにラベル化してもよく、このようなラベル化としては、２−アミノベンズアミド、または、２−アミノピリジンによる蛍光ラベル化が挙げられる。
【００５８】
さらに、本発明の試料調製方法において、糖鎖捕捉物質と糖鎖および／または糖の誘導体との間で形成された複合体における、糖鎖および／または糖の誘導体に対して結合性または親和性を有する物質を含む第二の試料を接触させて、当該糖鎖および／または糖の誘導体に対して結合性または親和性を有する物質を捕集することもできる。
【００５９】
本実施形態においては、まず、糖鎖捕捉物質と、糖鎖および／または糖の誘導体とを反応させて複合体とした後、この複合体に対して、診断または検査を行うための検体から採取した試料（以下、「検体試料」という）を作用させて、この検体試料に含まれる糖鎖および／または糖の誘導体に対して結合性または親和性を有する物質、例えばレクチンなどの糖結合性タンパク質を捕集させる。
【００６０】
また、捕集された物質を、検出、定量化することにより、糖鎖と検体細胞の分化増殖、細胞接着、免疫、および細胞の癌化との関係について、より高度な解析を行うことができる。
【実施例】
【００６１】
以下の実験例にて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実験例に限定されることはない。
【００６２】
（製造例）
特許文献１に記載されているように、以下の１〜４の手順にしたがって、ヒドラジド基含有ポリマービーズを作製し、実施例、比較例において糖鎖捕捉ビーズとして用いた。
１．メチルエステル含有モノマーの合成
以下のスキーム１に示すルートでメチルエステル含有モノマーを合成した。
【００６３】
【化１１】
【００６４】
（１）化合物（ｃ）の合成
無水メタクリル酸（ＭＡＨ：５ｇ，０．０３ｍｏｌ）（ｂ）を１００ｍｌのクロロホルムに溶解させた溶液を、２５ｇの（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（ＥＤＢＥＡ：２５ｇ，０．１７ｍｏｌ）（ａ）を１００ｍｌのクロロホルムに溶解させた溶液に氷浴上で滴下投入した。そこへ窒素を封入し、終夜攪拌させた。得られた反応溶液から溶媒を蒸発させて得た残留物を、シリカゲルカラム（展開溶媒：クロロホルム９０容／メタノール１０容の混合溶媒）にかけて所定のフラクションを分取して、このフラクションから溶媒を蒸発させて化合物（ｃ）を得た。
【００６５】
（２）化合物（ｅ）の合成
５ｇの化合物（ｃ）（０．０２３ｍｏｌ）を１００ｍｌのクロロホルムに溶解させた溶液に、１．５当量のコハク酸モノメチル（ｄ）および１．５当量の水溶性カルボジイミド化合物（ＷＳＣ）である１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを加えて、密栓した。そこへ窒素を封入し、終夜攪拌させた。得られた反応溶液から溶媒を蒸発させて得た残留物を、シリカゲルカラム（展開溶媒：クロロホルム９０容／メタノール１０容の混合溶媒）にかけて所定のフラクションを分取して、このフラクションから溶媒を蒸発させて化合物（ｅ）を得た。
また、得られた物質は、ＮＭＲ、マトリックス支援レーザイオン化−飛行時間型質量分析器（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）により化合物（ｅ）であることを確認した。
【００６６】
２．メチルエステル含有ポリマーの合成
以下のスキーム２に示すルートでメチルエステル含有ポリマー粒子を合成した。
【００６７】
【化１２】
【００６８】
三口フラスコに２５ｍｌの５％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）水溶液を装入し、そこへ窒素をパージした。１ｇの化合物（ｅ）（２．６ｍｍｏｌ）、エチレングリコールジメタクリレート（ｆ）（ＥＧＤＭＡ：（ｅ）に対して５ｍｏｌ％）および１ｍｌのクロロホルムからなる混合物を、前記三口フラスコに導入し、６０℃に保ちながら攪拌して、混合物に含まれるモノマーとしての化合物（ｅ）およびＥＧＤＭＡをＰＶＡ水溶液中に分散させた。続いて、モノマーに対して３重量％の重合開始剤としてのアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を加えて重合を開始させた。６０℃で１６時間反応させた後、生成したポリマー粒子を遠心分離により回収し、メタノールと水とで洗浄した。
【００６９】
３．ヒドラジド基の導入
ポリマー粒子４００ｍｇを容器にとり、ヒドラジン１水和物４ｍｌを加えて攪拌し、室温で２時間静置した。反応後、ヒドラジン１水和物を除去し、メタノールで洗浄したのち、１Ｍ塩酸でリンスした。その後さらに純水で洗浄した。
【００７０】
４．官能基量の定量
ポリマー粒子１ｍｇを容器にとり、Ｎ−アセチル−Ｄ−ラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ）１μｍｏｌを添加し、さらに、２％酢酸を含むアセトニトリル１８０μｌを加えた。これを８０℃で４５分間加熱することによりＬａｃＮＡｃとビーズ上のヒドラジド基を反応させた。純水でビーズをリンスして未反応の糖鎖を回収し、それをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定により定量（内部標準法）し、ビーズへのＬａｃＮＡｃ結合量を求めた。ビーズ１ｍｇあたり０．８６μｍｏｌ（８６０ｎｍｏｌ）のＬａｃＮＡｃが結合することが分かった。
【００７１】
（実施例１）
９．６ｇのダルベッコＰＢＳ（−）粉末（日水製薬（株）製）を１リットルの純水に溶解して、ＰＢＳ溶液を得た。製造例で得られた糖鎖捕捉ビーズを５０ｍｇ、サンプルチューブに量り取り、そこに５００μｌのＰＢＳ溶液を加えて、分散液を作製した。この分散液を５０μｌ、ピペットで量り取り、フッ素系樹脂で成形したＵ底マイクロプレート（（株）フロンケミカル製のフッ素系樹脂で成形したカルチャープレート）の１０箇所のウェルにそれぞれ分注した。その後、マイクロプレートを８０℃のオーブン内に１時間静置して、ウェル内の分散液を乾燥させた。乾燥後、各ウェルにタブレット状に固められたビーズを取り出し、合計１０個のタブレットが得られた。
【００７２】
得られたタブレットの一つをサンプルチューブに投入し、純水１００μｌを注入したところ、素早く良好な状態で分散した。
【００７３】
（実施例２）
実施例１で調製した９個のタブレットを、９本のサンプルチューブにそれぞれ投入した。各サンプルチューブに純水１００μｌを注入し、分散状態にした後、遠心してビーズを沈殿させて上澄みを除去した。この操作を３回繰り返した後、真空乾燥してビーズを乾燥させ、サンプルチューブごとに、残ったビーズの総乾燥重量をそれぞれ測定した。この測定の結果を表１に示した。
【００７４】
（比較例１）
製造例で得られた糖鎖捕捉ビーズを５０ｍｇ、サンプルチューブに量り取り、そこに５００μｌの純水を加えて、分散液を作製した。この分散液を９本のサンプルチューブに５０μｌずつ分注した。チューブを遠心してビーズを沈殿させ、上澄みを除去した後、真空乾燥してビーズを乾燥させ、サンプルチューブごとに、残ったビーズの総乾燥重量をそれぞれ測定した。この測定の結果を表１に示した。
【００７５】
【表１】
【００７６】
表１によれば、実施例２のアッセイの方が、比較例１のアッセイよりも、標準偏差／平均値で得られるＣＶ値が理想であるゼロに近い値となった。また、実施例２のアッセイの方が短時間で行うことができた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（式１）で表される糖鎖捕捉物質と、塩とを含むタブレット。
【化１】
（担体はポリマーマトリックス、Ｒは−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖を示す。）
【請求項２】
前記糖鎖捕捉物質が下記の（式２）で表される架橋型ポリマー構造を有する請求項１記載のタブレット。
【化２】
（Ｒ1，Ｒ2は−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5はＨ，ＣＨ3，または炭素数２〜５の炭化水素鎖を示す。ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）
【請求項３】
前記糖鎖捕捉物質が下記の（式３）で表される架橋型ポリマー構造を有する請求項２記載のタブレット。
【化３】
（ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）
【請求項４】
前記糖鎖捕捉物質が平均粒径０．１μｍ以上５００μｍ以下のポリマー粒子である請求項１〜３のいずれか一項に記載のタブレット。
【請求項５】
前記糖鎖捕捉物質が乾燥重量１ｍｇ当り１００ｎｍｏｌ以上のヒドラジド基を有するポリマー粒子である請求項１〜４のいずれか一項に記載のタブレット。
【請求項６】
前記糖鎖捕捉物質がｐＨ３〜８で安定である請求項１〜５のいずれか一項に記載のタブレット。
【請求項７】
前記糖鎖捕捉物質が少なくとも１ＭＰａ以下の圧力下で安定である請求項１〜５のいずれか一項に記載のタブレット。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のタブレットを水に溶解させて糖鎖捕捉物質の分散液とし、
当該分散液に糖鎖および／または糖の誘導体を含有する試料を導入し、前記糖鎖捕捉物質と前記糖鎖および／または糖の誘導体との間で複合体を形成させる、試料調製方法。
【請求項９】
マルチウェルタイプのマイクロタイタープレートにて試料調製を行う試料調製方法であって、
前記各ウェルに、請求項１〜７のいずれか一項に記載のタブレットを投入し、
当該各ウェルに水を導入してタブレットを溶解させて糖鎖捕捉物質の分散液とし、
前記各ウェルに糖鎖および／または糖の誘導体を含有する試料を導入し、前記糖鎖捕捉物質と前記糖鎖および／または糖の誘導体との間で複合体を形成させる、試料調製方法。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の試料調製方法において、
前記複合体を酸性条件で処理して、糖鎖および／または糖の誘導体を遊離させる、試料調製方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の試料調製方法において、
前記遊離させた糖鎖および／または糖の誘導体を、さらにラベル化する、試料調製方法。
【請求項１２】
請求項１１記載の試料調製方法において、
前記ラベル化が２−アミノベンズアミド、または、２−アミノピリジンによる蛍光ラベル化である、試料調製方法。
【請求項１】
下記（式１）で表される糖鎖捕捉物質と、塩とを含むタブレット。
【化１】
（担体はポリマーマトリックス、Ｒは−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖を示す。）
【請求項２】
前記糖鎖捕捉物質が下記の（式２）で表される架橋型ポリマー構造を有する請求項１記載のタブレット。
【化２】
（Ｒ1，Ｒ2は−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5はＨ，ＣＨ3，または炭素数２〜５の炭化水素鎖を示す。ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）
【請求項３】
前記糖鎖捕捉物質が下記の（式３）で表される架橋型ポリマー構造を有する請求項２記載のタブレット。
【化３】
（ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）
【請求項４】
前記糖鎖捕捉物質が平均粒径０．１μｍ以上５００μｍ以下のポリマー粒子である請求項１〜３のいずれか一項に記載のタブレット。
【請求項５】
前記糖鎖捕捉物質が乾燥重量１ｍｇ当り１００ｎｍｏｌ以上のヒドラジド基を有するポリマー粒子である請求項１〜４のいずれか一項に記載のタブレット。
【請求項６】
前記糖鎖捕捉物質がｐＨ３〜８で安定である請求項１〜５のいずれか一項に記載のタブレット。
【請求項７】
前記糖鎖捕捉物質が少なくとも１ＭＰａ以下の圧力下で安定である請求項１〜５のいずれか一項に記載のタブレット。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のタブレットを水に溶解させて糖鎖捕捉物質の分散液とし、
当該分散液に糖鎖および／または糖の誘導体を含有する試料を導入し、前記糖鎖捕捉物質と前記糖鎖および／または糖の誘導体との間で複合体を形成させる、試料調製方法。
【請求項９】
マルチウェルタイプのマイクロタイタープレートにて試料調製を行う試料調製方法であって、
前記各ウェルに、請求項１〜７のいずれか一項に記載のタブレットを投入し、
当該各ウェルに水を導入してタブレットを溶解させて糖鎖捕捉物質の分散液とし、
前記各ウェルに糖鎖および／または糖の誘導体を含有する試料を導入し、前記糖鎖捕捉物質と前記糖鎖および／または糖の誘導体との間で複合体を形成させる、試料調製方法。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の試料調製方法において、
前記複合体を酸性条件で処理して、糖鎖および／または糖の誘導体を遊離させる、試料調製方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の試料調製方法において、
前記遊離させた糖鎖および／または糖の誘導体を、さらにラベル化する、試料調製方法。
【請求項１２】
請求項１１記載の試料調製方法において、
前記ラベル化が２−アミノベンズアミド、または、２−アミノピリジンによる蛍光ラベル化である、試料調製方法。
【公開番号】特開２０１１−７２９７０（Ｐ２０１１−７２９７０Ａ）
【公開日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２２９８７９（Ｐ２００９−２２９８７９）
【出願日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【出願人】（０００００２１４１）住友ベークライト株式会社 (2,927)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【出願人】（０００００２１４１）住友ベークライト株式会社 (2,927)
【Ｆターム（参考）】
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