細胞表面に連結され得る物質を連結するためのアダプター
本発明は、細胞表面に連結され得る物質を連結するアダプターに関する。特に本発明は、細胞表面にアデノウイルスファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質を連結させるためのアダプター、並びにそのアダプターをコードする核酸類、ウイルス類、およびそれらの使用方法に関する。さらに本発明は、コクサッキーアデノウイルス受容体を全くまたはわずかしか含有しない細胞表面への、アデノウイルス粒子のような物質類の連結の媒介法および／または改善法にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞表面に連結され得る物質を連結するためのアダプターに関する。細胞表面での通常の連結、即ちアダプター類が存在しない場合の連結では、細胞表面の特別な表面構造（通常は受容体）を必要とするが、本発明はそのような物質類の連結も可能にする。特に本発明は、細胞表面にアデノウイルス線維瘤(ファイバーノブ:Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質類を連結させるためのアダプター、並びにそのアダプターをコードする核酸類およびウイルス類、並びにそれらの使用法に関する。本発明は、コクサッキーアデノウイルス受容体をわずかしかまたは全く含まない細胞表面へのアデノウイルス粒子の連結のような、物質類の連結を媒介および／または改善するための物質類およびその方法類にも関する。
【背景技術】
【０００２】
真核細胞類内、特に哺乳類細胞内に非相同の核酸類を転移させるためには、遺伝子導入用アデノウイルス類がしばしば用いられている。それらはそのウイルス粒子表面にファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）と命名された蛋白質を搬送し、その結果、処理される細胞（標的細胞）の表面の一部に配置されたコクサッキーアデノウイルス受容体（ＣＡＲ（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｒｅｚｅｐｔｏｒ）；バージェルソン（Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ），Ｊ．Ｍ．ら、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ Ｂ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ ２ ａｎｄ５；サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２７５巻（１９９７）、ｐ．１３２０−１３２３）と呼ばれる受容体蛋白質を認識し、結合することができる。ＣＡＲにおけるこの線維瘤蛋白質の結合は、アデノウイルスの感染プロセスの律速段階とみなされている。このファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質へのコクサッキーアデノウイルス受容体の結合、およびそれに伴うその細胞表面でのウイルス粒子の連結後に、別のアデノウイルス外被蛋白質、即ちペントン蛋白質が細胞表面成分類、詳しくは一種または複数のインテグリン類に結合し、それによって標的細胞中へのウイルス粒子のエンドサイトーシスが誘発されると推察される。
【０００３】
標的細胞表面でのコクサッキーアデノウイルス受容体の存在によるアデノウイルス類の依存性は、真核細胞類における非相同核酸類の転移へのアデノウイルス類の有用性を限定するものである（キム（Ｋｉｍ），Ｍ．ら、癌遺伝子治療用アデノウイルスベクター類の治療効果は、腫瘍細胞類表面の低レベルの一次アデノウイルス受容体類で制限される（Ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｓ ｌｉｍｉｔｅｄ ｂｙ ａ ｌｏｗ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｏｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ）；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３８巻（２００２）、ｐ．１９１７−１９２６）。さらにＣＡＲの発現が細胞の分化度に依存することはすでに判明していた（ウォルターズ（Ｗａｌｔｅｒｓ），Ｒ．Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｆｉｂｅｒ ｄｉｓｒｕｐｔｓ ＣＡＲ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｌｌｏｗｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ｅｓｃａｐｅ；セル（Ｃｅｌｌ），１１０巻（２００２），ｐ．７８９−７９９）。それに応じて、腫瘍細胞類における非相同核酸類の、これまで達成され得たアデノウイルス類を用いる転移率は、満足できないほど小さいものである。
【０００４】
したがって、ファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質のＣＡＲ認識に決定的な部位を変化させて単なるコクサッキーアデノウイルス受容体類とは異なる細胞表面成分にそのウイルス類を連結させることを可能にし、それによってそのウイルス類の親和性を変えることが試みられている。しかしながら、そのためのコストが極めて高いため、ウイルスゲノムの改変が必須となる。さらに遺伝子改変のためのそのファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質の生産能は極めて制限されている（スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ），Ｋ．ら、Ａ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ ｓｈｏｗｓ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ；Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，７巻（２００１），ｐ．１２０−１２６）。
【０００５】
同様に、ファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）の認識任務を担うコクサッキーアデノウイルス受容体の細胞外ドメイン、およびその標的細胞表面に発現した受容体（標的受容体）によって認識されるリガンド部位を有する融合蛋白質類の調製も試みられている（ペレボエフ（Ｐｅｒｅｂｏｅｖ），Ａ．Ｖ．ら、Ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ−ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｆｕｓｅｄ ｔｏ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ４０ ｓｃＦｖ ｅｎｈａｎｃｅｓ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｎｄｔｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ；Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，９巻（２００２），ｐ．１１８９−１１９３）。これらの使用によって、コクサッキーアデノウイルス受容体を全くまたはわずかしか発現しないが少なくとも一種の別の受容体を発現するアデノウイルス類で、細胞類を感染させることが可能になる。しかしながら、標的受容体ごとにそれらを用いて新規の融合蛋白質を生産しなければならないこと、および標的受容体を発現するような標的細胞類における感染が依然として限定されたままであることは、不都合なことである（クリエル（Ｃｕｒｉｅｌ），Ｄ．Ｔ．，Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ；Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，６巻（１９９９）、ｐ．１４９７−１４９８）。このため特に感染および腫瘍類の治療では、この融合蛋白質類の有用性が制限されてしまう。融合蛋白質類の産生の時間推移とともに、腫瘍細胞類は遺伝子上の不安定性が増大し、それらによって発現した受容体類の原型を変え、それに応じて各々の腫瘍群類は、細胞表面受容体における特有のスペクトルを任意に持つことが可能になる。したがって腫瘍の治療には、全ての腫瘍細胞類によって発現した受容体類を決定してから対応する融合蛋白質を製造することが最小限、必要になるであろう。
【０００６】
Ｇｒａｔｔｏｎらの刊行物、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００３，ｐ．３５７−３６２から、アデノウイルスが介在した遺伝子転移の改善方法が知られている。それによると、アデノウイルス類を高濃度域（０．０５−５ｍＭ）のＡｎｔｐホメオドメインの第３α−ヘリックスと予め培養し、次に希釈して形質導入予定の細胞類に加える。尚、この処理の際に改善された形質導入は、ＣＡＲ不含のＣＯＳ−７細胞類によって観察された。ＣＯＳ−７細胞類をＡｎｔｐホメオドメインの第３α−ヘリックスと予め培養し、次にアデノウイルスを加える場合でも、またＣＯＳ−７細胞類をアデノウイルスと予め培養し、次にＡｎｔｐホメオドメインの第３α−ヘリックスを加える場合でも、形質導入率の著しい改善は観察されなかった。Ｇｒａｔｔｏｎらによる記載の処理方法で不都合なのは、予め形質導入用に用意したアデノウイルス類を、極めて高濃度域のＡｎｔｐホメオドメインの第３α−ヘリックスで予め処理しなければならないことである。そのことにより、使用されたアデノウイルス類の形質導入率の改善は持続的に達成されないが、そのかわりに予め処理したウイルス類の場合でのみ形質導入率が改善される。特に遺伝子治療で不都合なことは、Ｇｒａｔｔｏｎらによる予備処理アデノウイルス類で感染させた細胞類が、比較が可能な改善された形質導入能率を有するアデノウイルス類を産生できないことである。さらにその細胞類は、Ｇｒａｔｔｏｎらによる記載の高濃度域でＡｎｔｐホメオドメインの第３α−ヘリックスも発現することができるが、生理学的条件では起こり得ない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、したがって刊行物にある諸欠点を排除すること、およびアデノウイルス類に感染する細胞類（標的細胞類）の範囲を簡単な方法で拡大することを可能にする薬剤と方法とを主張することである。好適な場合、細胞表面にコクサッキーアデノウイルス受容体を全くまたはわずかしか発現しないような標的細胞類の感染も、妥当なまたは良好な率で可能になるであろう。その薬剤および方法は本研究の枠内のみならず、好ましくはさらに治療、特にたとえば腫瘍の治療を目的にするような遺伝子治療上および／または特に細胞培養物類の感染を目的とする非医療分野でも使用することができる。
【０００８】
そのほかに、可能な限り広い範囲の種々の細胞型から当然選択可能である標的細胞表面に、ある物質をできるだけ簡単な方法で連結させることができることも一般的に必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって本発明は、ある細胞表面に連結され得る物質を連結させるためのアダプターが主張し、そのアダプターは、
・連結され得る物質を認識して結合するための部位ａ、および
・一種または複数の負に荷電している細胞表面構造体類に親和性を有し、細胞表面にそのアダプターを配置するための組換え部位ｂ
を含むものである。
【００１０】
本発明によるあるアダプターは、同じく連結され得る物質を認識してそれに結合することができ、所望により細胞表面の別の構造体類およびエレメント類、特に別に分布した受容体類を介して、その細胞表面に配列可能である。したがって、選択された標的細胞の細胞型の各々に対して、それに特異的な受容体−発現型に適合した融合蛋白質をいちいち産生させなくともうまく済ませることができる。
【００１１】
本発明の枠内で「認識」とは、連結し得る物質（特にアデノウイルス線維瘤蛋白質）に対して、偶然別の蛋白質よりも平均して高い親和性で結合することに関するアダプターの能力と理解される。連結し得る物質への本発明のアダプターの認識および結合は、一般にはリガンド−受容体の相互作用とみなすことができるが、そのような機序に限定されるものではない。
【００１２】
本発明のアダプターの部位ｂは、このアダプターを標的細胞表面に配置させることができる。さらに標的細胞表面へのこのアダプターの配置は、細胞外面のアダプターとの単なる偶然および一時的ではない結合であると理解できる。本発明によるアダプターは、そのかわりに細胞表面、特に細胞表面外にも存在する蛋白質および炭水化物のような数種の細胞表面エレメント類に対して高い親和性を有するものである。また本アダプタ−は、すぐには標的細胞内には取り込まれず、細胞表面の外側に長時間配置されるか、および／または、本アダプターは細胞外空間において、連結され得る物質の認識および結合を任意に行うことができる。本アダプターは、細胞の取り込み速度が５ｐｍｏｌアダプター／時間以下、好ましくは３ｐｍｏｌアダプター／時間以下（３ｍｌＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中、１×１０6標的細胞でのアッセイ条件下）になるような、媒体非依存性の長い半減期を有するものが好ましい。
【００１３】
細胞表面での配置については、本発明によるアダプターが、種々の細胞型において分布するかまたは汎存する細胞表面エレメント類に連結することによってもたらされるものである。特にその細胞表面エレメント類は受容体類であり得る。初期の諸研究によって本発明によるアダプターの結合が推察され、細胞表面の負に荷電しているそれらエレメント類にはシグナル転送機能がないことが分かった。
【００１４】
好ましい実施形態では部位ｂは、全体で塩基性の特性を有し、および／または好ましくは正に荷電しているものである。塩基性の特性を有するペプチド類および正に荷電しているペプチド類は、細胞膜類での持続的な配置に特に好適であり、この配置にとっては細胞型に特異的な細胞表面エレメント類は必要ではない。さらに正に荷電しているペプチド類は、負に荷電している細胞表面構造体類によく付加する。
【００１５】
アダプターの部位ａおよびｂは、所望により結合性のある別の部位を介してともに共有結合しているものが好ましい。
【００１６】
好ましい実施形態ではアダプターは、部位ａによって、ウイルスまたは別の物質、好ましくはウイルス様物質、特にアデノウイルスを認識して結合するように調整され、さらにそのつど適する別の部位ａを用いてサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、レオウイルスおよび小水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を認識して結合するように調整されている。好ましくはアダプターは、特にその部位ａ）によって、結合され得る物質、特にウイルスごとに特異的な表面構造体（リンカー）を認識して結合するように調整されており、それによってそれぞれの表面構造体（リンカー）を含むウイルスまたはそれ以外の連結し得る物質を、選択的に標的細胞表面に配置させることが可能になる。これに関連して「特異的」という用語は、そのリンカーが連結され得る物質をそれ以外の別の物質と識別するという意味を有するものであって、通常は標的細胞に連結され得る物質を加える際に、共存する別の物質類と充分に識別することができるという意味であり、その諸条件下でアダプターは連結され得る物質を主として認識して結合し、それ以外の物質類を認識して結合することはほとんどないという意味である。
【００１７】
特に好ましい実施形態類では部位ａが、アデノウイルスのファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質を認識して結合する部位を含む。適合するアダプターは、同じく従来のアデノウイルスファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質に連結することができ、細胞表面の別の構造体およびエレメント類、または特に広く分布した受容体類、あるいは細胞表面の別のエレメント類を介することなく細胞表面に配置される。したがってアデノウイルス感染性細胞の範囲を拡大するために、アデノウイルス類自体を遺伝子改変しなければならないことはうまく避けられ、そのかわりに従来のアデノウイルス類を、これまで感染させることができないかまたは困難な標的細胞類の感染にも使用できるようになる。さらに本発明は、本発明による（組換え）アダプターを主張することで、多くの細胞型にとって必須なこと、即ち感染性細胞の各々の型に対してその天然型受容体−発現型に適合した融合蛋白質をいちいち生産しなければならないことが回避される。
【００１８】
特に好ましいのは、部位ａがコクサッキーアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）の細胞外ドメインの、ファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質を認識するための機能性部分を含む場合、またはそれと機能が同一である部分を含む場合である。
【００１９】
そのようなアダプター部位ａは、コクサッキーアデノウイルス受容体の細胞外ドメインの一部（所望により完全な細胞外ドメインでも良い）またはそれと機能が同一である部分を含むものである。さらに部位ａと機能が同一であるものとは、アデノウイルスファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質を認識して結合し、それによって本発明によるアダプターをファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質に連結させることができるものである。部位ａの選択には、当業者はコクサッキーアデノウイルス受容体の構造および機能に関係する既知文献類を用いれば、アダプターをファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質に連結させるのに適したアミノ酸配列を容易に見出すことができる。部位ａとして特に好ましいものは、コクサッキーアデノウイルス受容体（Ｐｕｂｍｅｄアクセッション番号：ＮＭ００１３３８；尚、以下の受け入れ番号は全て同じくＰｕｂｍｅｄ起源のものである）の１−２３５位のアミノ酸類である。
【００２０】
さらに当業者は、コクサッキーアデノウイルス受容体の細胞外ドメインの一部と併用して、またはその代替として、ファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質に本発明によるアダプターを連結でき、コクサッキーアデノウイルス受容体の細胞外ドメイン中のものとしては不含の部分を部位ａ中に想定することができる。特に当業者は、部位ａの機能を保ちつつ、しかも本発明によるアダプターをファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質に連結させることが可能なように、コクサッキーアデノウイルス受容体の細胞外ドメインの個々のアミノ酸を省略、追加および／または別のアミノ酸に置換することができる。
【００２１】
したがって本発明によるアダプターを用いると、詳細な予備知識がなくとも、標的細胞類によって発現した受容体類を介して、アデノウイルスのファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質に高親和性を有するアダプターを標的細胞表面に配置し、それによってその標的細胞類へのアデノウイルス粒子の連結を高感度化させることが始めて可能になる。本発明によるアダプターによれば、好ましい方法によって、広範囲の上皮細胞類、繊維芽細胞類、ニューロン細胞類、樹状細胞類、骨芽細胞類および筋細胞類、並びにそれらの細胞型類由来の変性細胞類を、アデノウイルス類に感染させることができる。
【００２２】
アダプターの部位ｂは好ましくは、
・構成アミノ酸の少なくとも半分がグアニジノ側鎖および／またはアミジノ側鎖を有するアミノ酸長が６またはそれ以上のペプチド、
・少なくとも６個のアルギニン側鎖を有するオリゴペプチド、
・ＨＩＶ ｔａｔ蛋白質の塩基性領域に対応するアミノ酸配列のペプチド、
・ホメオボックス蛋白質の第３ヘリックス、および
・細胞表面への固定に介在する単純ヘルペスウイルスＶＰ２２蛋白質部位
から選択されるものである。
【００２３】
特に好ましくは、このようなアダプターの部位ｂはさらに、
・ＨＩＶ ｔａｔ蛋白質の塩基性領域に対応するアミノ酸配列のペプチド、および
・細胞表面への固定に介在する単純ヘルペスウイルスＶＰ２２蛋白質部位
から選択されるものである。
【００２４】
これらのアダプター類は、多くの特に適した細胞型では、連結され得る物質の連結、特にアデノウイルスの連結のためには、上記以外に言及される部位ｂを有するアダプター類よりも優れていることが明確に証明された（この場合、アダプターの部位ａは、コクサッキーアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）の細胞外ドメインのファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質認識機能部分またはその機能が同一である部分を含むのが好ましい）。
【００２５】
典型的な好ましい種類のペプチド類が真核細胞類の表面に配置するのに適しているかどうかについては、確かにこれまで研究されている。しかしながら連結され得る物質、特にアデノウイルスファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質を認識して結合するための部位を有するペプチド類の提供は知られていない。さらにこの言及したペプチド類は、細胞類における巨大分子の輸送に適しているばかりでなく、アデノウイルス粒子を認識して結合する部位ａとの連合にも適しており、アデノウイルス類による感染を目的とする本発明によるアダプターを標的細胞類表面へ充分持続的に付加させておくことが可能であることが分かった。
【００２６】
米国特許第６４９５６６３号では、少なくとも５０％がグアニジノ側鎖またはアミジノ側鎖を有するサブユニット６−２５個から成る輸送ポリマーが開示されている。その輸送ポリマーは、それに付加した薬剤を、その薬剤単独の場合よりも高い割合で生物学的膜を通過させて輸送するのに適している。本発明によるアダプターをアレンジするためには、当業者は言及された米国特許明細書を見て、好ましい実施形態として明らかにされたのものが、特に本発明の枠内でも好ましいことを目的に合わせて知る。特に有用なものとしては、部位ｂが線状であってアミノ酸長が７−２０のものであり、そのアミノ酸類の各々には最大限１個のグアニジノ側鎖またはアミジノ側鎖が存在するものであることが判明した。
【００２７】
さらに米国特許第６３１６００３号では、ＨＩＶ ｔａｔ蛋白質あるいは一種または複数のそれらの断片類を用いた「運搬分子類」の細胞外供給のための輸送ポリペプチドが開示されている。その中で特に有用なものとしては、ｔａｔ蛋白質の塩基性領域、特にアミノ酸数４９−５７の断片類と理解されるものが記載されている。当業者は、本発明によるアダプターをアレンジするために、所望によりこの特許明細書を確認する。その中で好ましいものとして挙げられた実施例は、本発明によるアダプターの部位ｂをアレンジするのに、本発明にもかなった特に好ましいものである。それには特にＲＫＫＲＲＱＲＲＲのアミノ酸配列を有するペプチドがある。
【００２８】
さらに米国特許第５８８８７６２号では、生きている細胞内に巨大分子を導入するためのホメオボックスペプチドの第３ヘリックスの使用が開示されている。このため、当業者が当該特許に開示された４番目の形態をふまえ本発明によるアダプターを製造しようとする際は、上記特許明細書が役に立つ。米国特許第５８８７６２号において好ましいものとして記載されている実施形態も、特に本発明にかなった好ましいものである。本発明に特に好適なものとしては、ホメオドメインの４３−５８のアミノ酸類を有するホメオボックス蛋白質断片、特にアンテナペディアのホメオボックス蛋白質由来のものが挙げられており、同じくそれらに対応するホメオボックス蛋白質の断片類、エングレイルド−１、エングレイルド−２，ｈｏｘａ−５、ｈｏｘｃ−８およびフシ−タラズ（ｆｕｓｈｉ ｔａｒａｚｕ）も好ましい。特に好ましくは、本発明によるアダプターの部位ｂがＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫのアミノ酸配列を有するペプチド、即ち、ユープリマ・スコロペス（Ｅｕｐｒｙｍａ ｓｃｏｌｏｐｅｓ）のアンテナペディアのホメオドメイン蛋白質（アクセッション番号：ＡＹ０５２７５８）のアミノ酸４３−５８位のアミノ酸配列を含むものが挙げられる。
【００２９】
最後に、米国特許第６１８４０３８号では、輸送蛋白質としての単純ヘルペスウイルスＶＰ２２およびその相同体類の使用が開示されている。このため、当業者が当該特許に開示された最後の形態をふまえて本発明によるアダプターを製造しようとする際は、この特許明細書の開示を引用する。本発明にかない、本アダプターの部位ｂとして特に好ましいものとしては、ＶＰ２２蛋白質の３４個のＣ末端部のアミノ酸類および対応する類似ペプチド類および／または相同ペプチド類であって、細胞表面に蛋白質を配置することができるように媒介するものが挙げられる。
【００３０】
そのようなアダプター類としては、特に部位ｂにおいてＨＩＶ ｔａｔ蛋白質の塩基性領域および／または細胞表面での固定に介在する単純ヘルペスウイルスのＶＰ２２蛋白質断片、あるいはそれらのペプチド類の一部分を含み、由来が異なる細胞類の負に荷電しているエレメント類に付加することができるものが好適に挙げられる。特に上皮起源の細胞類の表面に付加すると、良好な成果が得られる。従来の諸研究に従って、細胞接着傾向が高い細胞類の表面に付加しても良好な成果が得られる。従って本発明にかなうものは、上皮起源の腫瘍類の抑制および／または細胞接着傾向が高い腫瘍類の抑制のための薬剤の製造に好適なアダプター類が特に好ましい。それは特に上皮性癌腫類、肉腫類、グリア芽腫類および星状細胞腫類に対して有効である。
【００３１】
本発明によるアダプター類に特に好適なものは、部位ｂにおいてＨＩＶ ｔａｔ蛋白質の塩基性領域および／または細胞表面での固定を媒介する単純ヘルペスウイルスＶＰ２２蛋白質の断片またはそれらのペプチド類の一部を含み、それによって多数の細胞型に対する、たとえばアデノウイルスの形質導入率を、比較的低濃度域でも明らかに改善することができるアダプターである。従って特に好ましくは、連結され得る物質に対するリンカーのモル濃度に関して、連結され得る物質よりもわずか５０００倍高い濃度で、本発明によるアダプターを用いることである。たとえば、アデノウイルス（または表面にファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質を有する物質に相応して）を連結させるためには、このアダプターを用いることでアダプターとアデノウイルスとは、ファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質に対するアダプター分子のモル比が５０００（アダプター）：１（ファイバーノブ蛋白質）以下で、混合する。背景技術から知られた方法に従うと、さらにかなり過剰量の補助物質類が必要になる。このため、たとえばＧｒａｔｔｏｎらによると、使用するＡｎｔＰ蛋白質を、ファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質に対するＡｎｔＰの比率が少なくとも２．５×１０7（ＡｎｔＰ）：１（ファイバーノブ蛋白質）になるように用いることではっきりしたわずかな効果が得られ、Ｇｒａｔｔｏｎらによる方法においては、２．５×１０9：１の比率で最高の効果が得られる。
【００３２】
通常、連結され得る物質類は、リンカー、つまりアダプターの部位ａによって認識される表面の構成成分（たとえば繊維瘤蛋白質のような）を有する。その場合、特に好ましくは、リンカーに対するアダプター比が少なくとも１０：１から１５００：１までであり、特に１００：１から５００：１が好ましい。たとえば、アデノウイルスは、本発明によるアダプターにおける濃度が、好ましくは０．１−１００ｎＭ、特に好ましくは０．５−５０ｎＭおよびさらに好ましくは１−１０ｎＭｎになるように標的細胞類表面に配置される必要がある（尚、あるアダプターでは、部位ｂにＨＩＶ ｔａｔ蛋白質の塩基性領域および／または単純ヘルペスウイルスのＶＰ２２蛋白質の細胞表面での固定を媒介する断片類またはそれらのペプチド類の一部を含む）。多数のＣＡＲ不含細胞型における、アデノウイルスの形質導入率の明らかな改善を達成するには、本発明のアダプターの低濃度域でほぼ充分である。
【００３３】
本発明によるアダプターが、その二量体、三量体および／またはオリゴマー類の形成のためにオリゴマー化部位もさらに含む場合も有益であることが判明した。このオリゴマー化部位を想定することによって、アデノウイルスのファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質または連結され得る物質に対する本発明によるアダプターの親和性は、簡単に持続的に増大させることができる。オリゴマー化部位としては、特にＧＣＮ４蛋白質のオリゴマー化ドメイン類および／またはロイシンジッパードメイン類が好ましい。
【００３４】
本発明によるアダプターの製造については、粗面小胞体内および好ましくは細胞外空間でもアダプターの合成を引き起こすリーダー配列をさらに含む場合に特に良好な結果となった。このようにすれば、本発明によるアダプター類を製造する真核細胞類から当該アダプターを容易に導出させることができる。リーダー配列としては、コクサッキーアデノウイルス受容体の天然型リーダー配列が特に好ましい。合目的的には、本発明によるアダプター類は、コクサッキーアデノウイルス受容体の膜貫通ドメイン類を持たないものが良い。これらの膜貫通ドメイン類がないことによって、本発明によるアダプターの、発現性真核細胞類から細胞外空間への放出がさらに簡略化される。
【００３５】
本明細書に記載の考え方には、アダプターをコードする核酸類も本発明に従い、その一部として主張されている。そのような核酸は、宿主細胞類または生産細胞類におけるアダプターの製造を簡略化する。
【００３６】
そのアダプターをコードする核酸は、特にウイルスゲノムの一部であり得、その中でも発現ユニットの形で存在するものが好ましい。それに応じて、真核細胞類、特にヒトおよび／または動物の細胞類の培養において、野生型よりも改善された分布拡大諸特性を有する組換えウイルスも、本発明で主張されている。そのウイルスは、野生型のものよりも改善された腫瘍溶解諸特性も有する可能性がある。
【００３７】
本明細書に記載の考え方では、アダプターを発現させるためのウイルスは、好ましい実施形態では、少なくともウイルスの増殖段階でウイルス外殻(Virus-Hulle)を有するものであり、そのウイルスは、
・直前に記載したような核酸、および
・アダプターの部位ａに連結可能なウイルス外殻蛋白質発現のための核酸断片
を含むものである。
【００３８】
さらにウイルスについては、その核酸が宿主細胞内で増殖可能であって、その際、その核酸が所望により複数のユニットから構成される粒子（ウイルス粒子）の中に被包化され得、さらに所望によりウイルス粒子内に被包化された核酸が（たとえばその宿主細胞類が死んだ場合に）別の宿主細胞内にも侵入するために、その宿主細胞類から遊離可能である核酸含有ユニットであると解釈されるものである。本発明によるウイルスの例としては、部位ａがアデノウイルスファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質を認識して結合する部分を含む本発明によるアダプターを発現するための核酸を有し、２型および５型のアデノウイルスから誘導されたウイルス類が挙げられる。
【００３９】
アデノウイルス粒子（本明細書の記載では時には「ウイルス粒子」とも略語化される）については、核酸を包み込むかまたは別な方法でそれに連結しており、その核酸が発現すると自身の産生を引き起こし、少なくとも１個のアデノウイルスファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質を有する各本体であると解釈されるものである。特に従来のアデノウイルス類のウイルス粒子は、本発明の諸目的におけるアデノウイルス粒子である。さらに特に好ましくは、そのアデノウイルス粒子が直前に記載したような本発明によるウイルスのウイルス粒子である場合である。
【００４０】
本発明によるウイルス粒子は、宿主細胞内での本発明によるアダプターの製造も、あるいは本発明によるアダプターによって認識され結合され得るウイルス外殻またはウイルス粒子の産生も、容易に可能にするものである。さらに本発明によるウイルスは、標的細胞類の培養において、標的細胞類にウイルスを連結させるための特別な受容体類をわざわざ使用しなくとも拡がることができる。最初の標的細胞類が、そのウイルスに感染して本発明によるアダプターの産生が開始されると、すぐにアダプターはその最初の標的細胞類から遊離して別の標的細胞類の表面に配置される。最初の標的細胞類から遊離した本発明によるウイルス類は、次に上記のようにして変化を受けた別の標的細胞類に、本発明によるアダプターを介して連結し、別の標的細胞類に感染することができる。
【００４１】
特に好適には、組織特異的に増殖が調節されるウイルスが挙げられる。この場合、本発明によるウイルス類の拡がりは、指定された組織類（標的組織類）、たとえば腫瘍組織類に主として限られる。好ましくは、ウイルス増殖を組織特異的に調節するために使用可能なプロモーター類、たとえばＡＦＰ−（α−フェトプロテイン）腫瘍マーカー用プロモーター類、前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）用プロモーター類、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）蛋白サブユニット用プロモーター類および転写因子類によって調節されるプロモーター類、特にｍｙｃ、ｍｙｂ、Ｅ２Ｆなどの、マイトジェンシグナルの結果、活性化および／または増強される転写因子類によって調節されるプロモーター類、が挙げられる。
【００４２】
それと同様にまたは代替としては、本発明によるアダプター類をコードする核酸部位が組織特異的に調節されるウイルスが好ましい。この場合、本発明によるアダプターの発現は、主として標的組織に限定され得る。組織特異的に調節するためには、前段落に記載のプロモーター類も用いることができる。
【００４３】
同じく好ましいものとしては、細胞死誘発性物質をコードする核酸をさらに含むようなウイルス類が挙げられ、特に好ましくはその核酸が備わると細胞死誘発性物質が組織特異的に発現するものが挙げられる。それにふさわしい核酸には、特に本発明によるアダプターをコードする部位を含む核酸断片があり得る。本発明による核酸がコード化可能な好ましい細胞死誘発性物質としては、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼおよびシトシンデアミナーゼが挙げられる。特に好ましくは、そのウイルスが腫瘍溶解性である場合のものである。
【００４４】
本発明によるアダプターが細胞表面よりも、または細胞表面へのアダプター配置を媒介し得る細胞表面エレメント類よりも、ウイルス粒子、特にファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質に対して高い親和性を有する場合、ウイルス粒子は、細胞表面に付加される前に多数の本発明にアダプターで通常、すぐに被覆される。
【００４５】
さらに本発明によると、ある物質、特にアデノウイルス粒子の細胞表面への連結を、非医療領域で、媒介および／または改善するために、本発明によるアダプターを用いることも明示される。本開示に記載されているように、本発明によるアダプターは、本質的に天然型の受容体類に依存せずに、あるいは宿主細胞の広く分布した細胞表面エレメント類の媒介のもとで、アデノウイルス粒子で感染させるかまたは別の連結され得る物質を連結させるのを容易にできる。このようにして、たとえば真核細胞培養物の感染におけるような、形質転換効率は、好適に容易に改善され得る。
【００４６】
本発明によるアダプター類は、特にアデノウイルス類による固形腫瘍類の感染率を高めるのに好適である。このようにすると、感染に必要とされるウイルス力価を低下させることができ、それによって動物モデル、またはヒトにおいても、アデノウイルス含有の医薬品または製剤の肝毒性を低下させることができる。
【００４７】
本発明によると、ある物質、特にアデノウイルス粒子を、細胞表面に非医療分野で、連結させるための方法も主張されており、以下の諸工程を含むものである。
ａ）連結し得る物質（特にアデノウイルス粒子）を、本発明によるアダプターに曝露してその物質をアダプターに備え付ける工程、および
ｂ）アダプターを備えたその連結され得る物質に細胞表面を曝露する工程。
【００４８】
工程ａにおいては、特にアデノウイルス粒子を本発明によるアダプターに備えることができる。この場合、ウイルス粒子を多くの本発明によるアダプターにあてがってウイルス粒子を本発明によるアダプターで被覆するのが好ましい。第二の工程では、そのように処理されたアデノウイルス粒子類の一用量分（すくなくとも１粒子）に標的細胞類をあてがって本発明によるアダプターを介して細胞表面に少なくとも１個の粒子の連結を可能にする。このようにすると、その細胞表面ではコクサッキーアデノウイルス受容体は全くまたはごくわずかな量しか発現せず、これまでアデノウイルス類で感染させるには不適であった標的細胞類に、アデノウイルス類を効果的に連結させることがはじめて可能になる。本発明による方法を用いると、たとえばストローマ線維芽細胞類を満足すべき効率で感染させることがはじめて可能になる。
【００４９】
同じく、ある治療方法では、本発明によるあるアダプターを用いて、ある物質、特にアデノウイルス粒子、のある細胞表面への連結を仲介および／または改善することができる。最終的には、アデノウイルス類および／またはそれから導出されるウイルス類を用いる遺伝子治療類、たとえば腫瘍治療、の枠内で特に有利であることが挙げられる。ある治療法においても、最初に本発明によるアダプターにウイルス粒子を備え付け（特に被覆させ）、つづいてそのように処理されたウイルス粒子に標的細胞を曝露するのが好ましい。
【００５０】
従って、ある物質、特にアデノウイルス粒子をある細胞表面に連結させることを媒介および／または改善する薬剤を製造するために、本発明による核酸および／または本発明によるウイルスを用いることは好ましいことであり、特に好ましくは本発明によるウイルスを用いることである。そのような薬剤を用いると、直前に記載してある本発明によるアダプター類およびウイルス類の医療上の使用が、達成しやすく、特に容易に実現され得る。特に、これまでアデノウイルス類に感染させることができないかまたは困難な細胞類、特に腫瘍細胞類およびストローマ線維芽細胞類でも、適切な薬剤を用いることで、医療上の諸目的に充分な程度に感染させることがはじめて可能になる。線維芽細胞類には、増殖性の腫瘍類に栄養を供給するための本質的な役割があり、従ってこの易感染性を改善することは、腫瘍治療における著しい進歩を意味するものである。
【００５１】
ある細胞表面へのある物質（特にアデノウイルス粒子）の連結を仲介および／または改善するための本発明による薬剤は、従って
・本発明によるあるアダプターおよび／または本発明によるウイルス、および
・医薬適合性のある担体
を含むものである。
【００５２】
実用的には、その薬剤については、一方の部分が本発明によるアダプターを含み、もう一方の部分が本発明によるウイルスを含む、２個の分離した部分から成る製剤が重要であり得る。この製剤は、アデノウイルス粒子の連結を媒介および／または改善するのに当然有用なものであり、従って患者に投与する前にその製剤の両方の部分を混合してアデノウイルスファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質を、本発明によるアダプターに連結するのが好ましく、そのような適切なアダプター装填性ウイルス類は、本質的に任意の組織類、特にコクサッキーアデノウイルス受容体を全くまたはわずかな量しか発現しないような組織類においても、感染させるのに特に適している。
【００５３】
本開示に記載されている本発明による方法類および諸使用は、特にヒト起源の細胞類に関連して、用いることができるものである。しかしながらアダプターを標的細胞類の表面に配置できるようにアダプターの部位ｂを選択することで、本発明によるアダプター類は、そのほかの起源の標的細胞類表面へ、アデノウイルスファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質（この蛋白質を含有するウイルス粒子を含めて）のような物質を配置させるのにも適するものとなる。そのほかの起源の標的細胞類には、特にサルまたはイヌ由来の、またはその体内の、標的細胞類とすることができる。
【００５４】
本発明によるアダプター類およびウイルス類は、完全な組織類および少なくとも特殊な完全生物体類、特に動物類の形質導入にも好適である。従ってそれらはヒトまたは動物、特にマウス、ラット、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウサギでの遺伝子治療法において、および生殖系列に登録可能な遺伝子改変動物、特にマウス、ラット、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウサギの製造に好ましく、有用なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
図１は、４種類の本発明によるアダプター蛋白質類の１次構造における構造を図によって示すものである。全てのアダプター類は、Ｎ−末端部にコクサッキーアデノウイルス受容体のリーダー配列を有する。そのリーダー配列は、そのアダプターを発現する宿主細胞類の小胞体中で、本発明によるアダプターの合成を引き起こす。そのリーダー配列には、コクサッキーアデノウイルス受容体の細胞外ドメイン類が接続しており、それは本発明による部位ａ）に相当する。その細胞外ドメイン類の後に、本発明によるアダプターの部位ｂ）が、Ｃ末端方向に続いている。このことは４種の標示アダプター類（上から下へ）において、単純ヘルペスウイルスＶＰ２２蛋白質、ＨＩＶ ｔａｔ蛋白質の塩基性領域、９個のアルギニン残基類含有オリゴアルギニンペプチドおよびホメオボックス第３ヘリックスの、細胞表面への固定に介在する部位として各々、示してある。部位ａ）とｂ）との間には、図示されているように、二量化支援ドメイン（ここではＧＣＮ４由来のロイシンジッパー）を配置することができ、それはファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質に対する本発明によるアダプターの親和性を高めることができるものである。
【００５６】
図２は、本発明によるベクター類を使用してアデノウイルス類に感染したＮＩＨ３Ｔ３細胞類の細胞培養物の写真を示すものである。対照（左上に示す）としては、本発明によるベクターを用いずにアデノウイルスに曝露したＮＩＨ３Ｔ３細胞類の培養物を用いた。ＮＩＨ３Ｔ３細胞類の感染前に、本発明によるアダプター類は２９３−細胞内で発現され、細胞上清中に分泌した。本発明によるアダプター類を各々コード化する核酸で２９３−細胞類をトランスフェクトし、３６時間後にその細胞上清を取り出し、ＬａｃＺをコードしているアデノウイルス類と混合した。本発明による各々のアダプターをそのように装備しているアデノウイルス類を、ＮＩＨ３Ｔ３細胞類培養物に加えて感染させた。感染多重度（ＭＯＩ）は１０であった。４８時間後に細胞培養物類を、Ｘｇａｌ青染色によってβ−ガラクトシダーゼ発現について試験した。その際、アデノウイルスに感染した細胞類は青く着色した。感染については、ＨＩＶ ｔａｔ蛋白質の塩基性領域（右上に示す“ＣＡＲ−Ｔａｔ”）、あるいは単純ヘルペスウイルスＶＰ２２蛋白質の細胞表面への結合を仲介する部位（右下に示す“ＣＡＴ−ＶＰ２２”）のいずれかを部位ｂ）に有するような本発明によるアダプターで最高の状態であった。しかしながら、部位ｂ）にＡｎｔＰ−ホメオボックス蛋白質第３ヘリックスを有する本発明によるアダプターでも、対照例に対してわずかに改善された感染率に至った（左下に示す“ＣＡＲ−ＡｎｔＰ”）。
【００５７】
図３は、本発明によるアダプター類の作用方式を図示するものである。アデノウイルス粒子類は、ＣＡＲ不含細胞類に全くまたはわずかしか感染できない（左上に示す）。感染率については、感染され得る細胞類がその表面にコクサッキーアデノウイルス受容体を発現する場合に、明らかに増大する（左下に示す）。本発明によるあるアダプターは、ＣＡＲ不含細胞類へのアデノウイルス粒子の停留を仲介する（右中央に示す）。さらに本発明によるアダプターは、その部位ａでアデノウイルスの線維瘤蛋白質に結合する。その部位ｂは、標的細胞類の細胞表面、特に細胞型において細胞表面に広く分布したエレメント類、に対する高い親和性を有する。本発明によるアダプターは、高い親和性を有する細胞表面または細胞表面エレメント類とアデノウイルス粒子との接触を仲介する。その接触の成立後、アデノウイルスは内部化され、標的細胞類の感染が起こる。
【００５８】
図４は、本発明によるあるアダプターをコードしているアデノウイルス類に部分的に感染している細胞培養物を図示するものである（左外側および右中央の細胞）。その感染細胞類は、本発明によるアダプター類も発現し、それらを細胞外空間に遊離させる。しかしながらその感染細胞類は、新たなウイルス粒子類も産生し、それらは細胞溶解の際（中央下に示す）に遊離し、細胞外空間に存在する本発明によるアダプター類によって部分的に被覆される。そのように（少なくとも部分的に）被覆されたアデノウイルスはさらに別の細胞に感染することができ（中央左、中央上および右下に示す）、本発明によるアダプター類も新たなアデノウイルス粒子もそこで製造することができる。細胞培養物の感染はそのように自己拡大する。
【００５９】
図５は、異なる細胞型類に対するいくつかの、一部は本発明によるアダプター類の形質導入能率の改善の比較を示すものである。その際、２９３−細胞は、分割図類に各々挙げているアダプター蛋白質類をコード化する発現ベクター類でトランスフェクトされた。２９３−細胞のトランスフェクト３６時間後、この細胞培養上清をアデノウイルス類（Ａｄ−ＬａｃＺ）と混合し、分割図類に各々挙げている細胞培養物類を培養培地中に加えた。４時間後にその培地をウイルス不含培地と交換した。細胞培養物類を、通常の培養諸条件下でさらに４８時間培養した。形質導入率および感染度については、β−Ｇａｌアッセイによって測定した。レポーター遺伝子の発現が、アダプターを伴わない感染と比較して少なくとも５倍増大するため、本発明によるアダプター類、ＣＡＲｅｘ−ＶＰ２２またはＣＡＲｅｘ−Ｔａｔの使用による、試験した全ての細胞型類（ＲＴ−１０１、ＲＫＯ、ＢＮＬ、Ｔ３６２７４、ＭＣＦ−７、ＨＴ−１０８０、ＳＡＯＳ−２およびＳＫＬＵ １）における形質導入能率は改善されることが分かる。適した細胞型類（ＳＡＯＳ−２およびＳＫＬＵ １）では、ＣＡＲｅｘ−ＡｎｔＰの使用によっても、アダプター不含の感染に対する形質導入能率の改善が達成される。それ以外の試験したアダプター類は無効であった。
【００６０】
図６は、いくつかの、一部は本発明によるアダプター類の形質導入の別な比較を示すものである。ｈＣＡＲの全外部ドメインと塩基性ドメイン類とから成り、Ｔａｔ、ＶＰ２２およびＡｎｔＰによって導出した組換え型の可溶性アダプター蛋白質類は、ＣＡＲ不含のＳＫＬＵ−１細胞類のアデノウイルス感染を可能にする。この結果判定を確かめるために、凡例に示すようにアダプター蛋白質類および対照の蛋白質類に対する発現ベクター類で２９３−細胞をトランスフェクトした。産生細胞類の全細胞抽出物類（上）および対応する培地上清類（下）の試料類を、ウエスタンブロット法によってアダプターの発現に関して分析した。上清の分析が示すように（分割図Ａ）、ＣＡＲｅｘ−９ＸＡｒｇは、ＣＡＲｅｘ−Ｔａｔまたは−ＶＰ２２および−ＡｎｔＰとは異なり、上清中に検出できなかった。
【００６１】
分割図Ｂは、アダプター発現性２９３−細胞類の平衡化容量の上清で処理したＳＫＬＵ−１細胞類の試験結果類を示すものである（図５の対応する記載を参照）。ＡｄＬａｃＺは１０のＭＯＩで加え、感染は４時間実施した。４８時間後に感染細胞類をＸ−ｇａｌ染色法によって検出した。ＣＡＲｅｘ−ＶＰ２２または−Ｔａｔは、これらのＣＡＲ不含株化細胞類の効率的なアデノウイルス感染を可能にした。ＣＡＲｅｘ−ＡｎｔＰの場合では、わずかな上昇を認めるにすぎなかった。そのほかの全ての対照蛋白質類は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔでトランスフェクトした産生細胞類の上清を用いる陰性対照と同様に、細胞類の感染は起こらなかった。
【００６２】
図７は、上皮起源の腫瘍細胞類に対する、いくつかの本発明によるアダプター類の形質導入率の比較を示すものである。分割図Ａに結果類が示される試験では、異なる細胞型類には、アダプターの最終濃度２ｎＭで、ＣＡＲｅｘ−ＶＰ２２またはＣＡＲｅｘ−Ｔａｔを含有する培地を供給した。すぐにＡｄＬａｃＺ（ＭＯＩ １０）を加え、感染を４時間実施した。さらに培養４８時間後に、Ｘ−ｇａｌ染色法によって感染効率を評価した。アダプターで支援した感染類における形質導入率は、アダプター不含のそれぞれの対照類の場合よりも平均して少なくとも２０倍高いことが分かる。
【００６３】
分割図Ｂは、１μｇの組換え型ＣＡＲｅｘ−ＶＰ２２またはＣＡＲｅｘ−Ｔａｔを培地で希釈（各々、約４ｎＭまたは８ｎＭに相当）し、Ａｄ−ＧＦＰ（ＭＯＩ ３０）と混合し、掲げる標的細胞類に加えた試験結果を示すものである。感染は４時間行なった。４８時間培養後に、顕鏡して蛍光を観察し、ＦＡＣＳ分析法によって感染効率を算出した。それらの結果類から、取り上げたアダプター類が低濃度では非許容または弱許容細胞類を１００％近い効率で感染させることが示された。
【００６４】
図８では、非上皮起源の細胞類に対するいくつかの本発明によるアダプター類の形質導入率の比較が示されている。非上皮起源の細胞類（たとえば免疫細胞類、および神経系由来の細胞類）においても、ＣＡＲｅｘ−ＶＰ２２または−Ｔａｔの適用によってアデノウイルス感染が増大することが分かる。
【００６５】
分割図Ａは、ＲＡＷ２６４．７マクロファージ類およびＰ３８８Ｄ．１モノサイト類−マクロファージ類を、培地含有の２ｎＭ組換え型ＣＡＲｅｘ−ＶＰ２２またはＣＡＲｅｘ−Ｔａｔ、並びにＡｄＬａｃＺ（ＭＯＩ １０、感染時間４時間）で処理した試験結果類を示すものである。感染効率は、β−ＧａｌアッセイおよびＸ−ｇａｌ染色法で測定した。本発明によるアダプター類を用いることで、形質導入効率が２５倍上昇することが可能であることが分かる。
【００６６】
分割図Ｂを導く試験では、ＡｄＧＦＰを（ＭＯＩ ３０）、ＣＡＲｅｘ−ＶＰ２２またはＣＡＲｅｘ−Ｔａｔ（各々、最終濃度が４ｎＭまたは８ｎＭ）と共にＲＡＷ２６４．７およびｐ３８８Ｄ．１標的細胞類に加えた。感染効率を蛍光顕鏡およびＦＡＣＳによって測定した。本発明によるアダプター類を用いることで、細胞培養物の細胞類の８８％またはそれ以上が形質導入され、一方、アダプターを用いない対照では細胞類の１％のみが形質導入されたことが分かる。
【００６７】
分割図Ｃは、２ｎＭのＣＡＲｅｘ−ＶＰ２２またはＣＡＲｅｘ−Ｔａｔと共にＡｄＬａｃＺでＤＣ２．４樹状細胞類をＭＯＩ ５０で処理し、感染時間を３０分とした試験結果類を示すものである。その定量は、β−ＧａｌアッセイおよびＦＡＣＳ分析類（ＡｄＧＦＰを比較可能なように用いた）によって行なった。また本発明によるアダプター類を用いると、発現率は対照と比較して少なくとも５倍になることが分かる。
【００６８】
分割図Ｄにおいては、不死化シュワン細胞類（ＩＳＣ）を、分割図Ａの説明の項の記載と同様に処理した。その感染度をＸ−Ｇａｌ染色法によって視覚化した。本発明によるアダプター類を用いると、使用した細胞培養物の充分な移入が達成できたことが分かる。
【００６９】
図９は、適する細胞類の形質導入のために条件複製性のウイルス類を用いる可能性を検証する試験の結果類を示すものである。この図からは、条件複製性の、および構成的複製性のアデノウイルスベクター類による主要細胞類のウイルス溶解が増大する受容体非依存性感染を、ＣＡＲｅｘ−ＶＰ２２または−Ｔａｔが仲介したと読み取ることができる。腫瘍細胞の被膜類を、ｈＴｅｒｔ−Ａｄ（条件複製性ベクター）、Ａｄ−ｗｔ（構成的複製性ベクター）およびＡｄＧＦＰ（非複製性対照ベクター）で、凡例に記載されているようなＭＯＩで感染させた。さらに細胞類を、非複製性発現ベクター類、ＡｄＣＡＲｅｘ−ＶＰ２２、ＡｄＣＡＲｅｘ−ＴａｔおよびＡｄＧＦＰ（対照）で、ＭＯＩ ２５（低許容細胞類、ＳＡＯＳ−２、ＨＴ１０８０およびＭＣＦ−７に有効、Ａに参照されるように）またはＭＯＩ ２（許容株化細胞類、Ｈｕｈ７およびＨｅｐＧ２に有効、Ｂを参照）で処理した。複製６日後に、ウイルスの複製と溶解との結果としての細胞被膜の破壊を、クリスタルバイオレット染色法によって視覚化した。
【００７０】
図１０は、いくつかの本発明によるアダプター類を伴う、アデノウイルス類の装填持続性を測定するための試験結果を示す。ＡｄＧＦＰをＤＭＥＭに対して透析し、ＡｄＧＦＰの提供されたアデノウイルス−ファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）分子類に対して１０倍の過剰な分子数の組換え型ＣＡＲｅｘ−ＶＰ２２またはＣＡＲｅｘ−Ｔａｔで処理した。対照としては、非処理ＡｄＧＦＰを使用した。このように処理したウイルス調製物をＣｓＣｌ密度勾配類上に装填し、超遠心処理して蛋白質の過剰分を分離した。観察されたウイルスの帯域類をそのグラジエントから抽出し、ＤＭＥＭに対して透析し、ＯＤ２６０の測定によって定量した。次にＳＫＬＵ−１細胞類をＭＯＩ ５０で４時間感染させた。高い感染率を証明することができた。それらの結果類から、ＣＡＲｅｘ−ＶＰ２２または−Ｔａｔはアデノウイルスベクター類と安定な複合体類を形成することが示される。
【００７１】
図１１は、いくつかの、一部は本発明によるアダプター類の形質導入効率に対する培地のｐＨ値の影響の比較を示すものである。アダプター蛋白質類を、図５に記載してあるように製造し、対応する上清のｐＨ値を４．８−７．３に調節した。次に上清類を、各々に適した濃度類のＡｄ−ＬａｃＺと混合し、それをＮＩＨ３Ｔ３細胞類の感染に用いた（ウイルス含有上清類に細胞類を３０分曝露させ、次にその媒体を培地と交換する）。４８時間培養後、全細胞類の溶解物類のβ−ガラクトシダーゼアッセイによって感染効率を試験した。ｐＨ値が低いほどβ−ガラクトシダーゼの発現が高くなることが分かる。このことから、本発明によるアダプター類が腫瘍瘤類内部での細胞類のトランスフェクションも、通常酸性媒体中で有利に改善するのに好適であるという結論が認められる。
【００７２】
図１２は、本発明によるアダプターの添加に対して好ましい、異なる標的細胞類に連結する物質の添加の影響を示すものである。ＣＡＲｅｘ−ＶＰ２２を、図５に記載しているように製造した。アダプター含有の上清は、標的細胞類（ＳＡＯＳ−２およびＳＫＬＵ−１）を培養して得た。Ｘ軸に挙げた時間の後に、Ａｄ−ＬａｃＺを添加した。細胞培養物を３０分培養し、次に媒体を、ウイルスおよびアダプター不含の通常の培地と交換した。４８時間培養後に、全細胞類の溶解物類のβ−ガラクトシダーゼアッセイによって感染効率を試験した。ＳＫＬＵ−１細胞類のβ−ガラクトシダーゼの発現は、アデノウイルスの添加が約３０分遅れると約半分になり、ＳＡＯＳ−２細胞類ではアデノウイルスの添加が１．５時間以上遅れると初めて半分になることが分かる。本発明によるＣＡＲｅｘ−ＶＰ２２アダプターは、細胞表面にアデノウイルスを連結させるのに培地内で長く使用するの適し得るものである。
【００７３】
実施例類および図面類をもとにして、本発明をさらに詳しく説明するが、図面類および実施例類は、本発明の対象を限定すべきものではない。以下に示す。
【実施例１】
【００７４】
ポリヌクレオチド類の製造
ＣＡＲ1-235ＶＰ２２融合蛋白質（本発明によるアダプター）を生成するのに必要なｃＤＮＡをＰＣＲによって生成した。鋳型としては、ＬＸＳＮ−ｈＣＡＲプラスミド（ＤｅＧｒｅｇｏｒｉ博士、米国、デンバー市、の好意による譲渡）内に含まれるヒト・コクサッキーウイルスとアデノウイルス受容体とのｃＤＮＡ（ｈＣＡＲ）を用いた。５’−プライマーとしては、
【００７５】
【００７６】
オリゴヌクレオチド（イタリック体はｋｐｎ Ｉ断片部分、太字はｈＣＡＲの本来の開始コドン）を用い、３’−プライマーとしては、
【００７７】
【００７８】
オリゴヌクレオチド（イタリック体部分はＮｏｔＩ断片部分、太字はｈＣＡＲ（Ｅｎｔｒｅｚ Ｐｕｂｍｅｔ 受け入れ番号ＮＭ ００１３３８）の７７６−８０７位の塩基類の相補体）を用いた。この含有断片には、ｈＣＡＲのリーダー配列およびその細胞外ドメインが含まれる。ＰＣＲは、Ｐｆｕポリメラーゼを用いて、４９℃で５サイクルおよび５５℃で３０サイクルで行なった。そのＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で精製し、ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩで消化して両末端部分を平滑化した。次にこの断片をｐＶＰ２２ｍｙｃＨｉｓベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の対応する制限断片部位に挿入し、ｐＣＡＲ（ｅｘ）−ＶＰ２２プラスミドを得た。ＨＩＶ−ＴＡＴ、ＡｎｔＰおよび９Ｘアルギニン配列（９ＸＡｒｇ）の細胞接着ドメイン類を有するｈＣＡＲの細胞外ドメイン融合蛋白質用のプラスミド類は、以下のようにクローニングした。
【００７９】
ｐＣＡＲ（ｅｘ）−ＴＡＴ48-57を生成するために、
【００８０】
【００８１】
オリゴヌクレオチド（センスオリゴヌクレオチド、太字はＴＡＴ蛋白質の４８−５７位のアミノ酸類（配列：ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）をコード化するＨＩＶゲノム（アクセッション番号：ＮＣ ００１８０２）の５５１８−５５４７位の塩基類に相当し、イタリック体はＮｏｔＩ／ＸｂａＩ断片部位に相当する）および対応する相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド（５’−ＴＴＴＣＴＡＧＡＣＣＴＣＴＴＣＧＴＣＧＣＴＧＴＣＴＣＣＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴ−３’）をハイブリダイズさせ、ＮｏｔＩとＸｂａＩとで消化し、ｐＣＡＲ（ｅｘ）−ＶＰ２２プラスミドの対応する制限サイトに挿入した。尚、これは予め制限酵素類、ＮｏｔＩとＸｂａＩとで切断し、アガロースゲル電気泳動によってＶＰ２２をコード化するｃＤＮＡを分離したものである。
【００８２】
ＡｎｔＰおよび９ＸＡｒｇの変異体類の生成は、同様な工程によって実施した。
【００８３】
９ＸＡｒｇをコード化するＤＮＡには、
【００８４】
【００８５】
オリゴヌクレオチド（センスオリゴヌクレオチド、太字はＲＲＲＲＲＲＲＲＲのアミノ酸配列をコード化するＤＮＡに相当し、イタリック体はＮｏｔＩ／ＸｂａＩ断片部位に相当する）および対応する相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド（５’−ＴＴＴＣＴＡＧＡＣＣＴＣＴＡＣＧＴＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＧＴＣＧＧＣＧＡＣＧＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴ−３’）を用いた。得られたプラスミドの名前はｐＣＡＲ（ｅｘ）−９ＸＡｒｇである。
【００８６】
Ａｎｐをコード化するＤＮＡには、
【００８７】
【００８８】
オリゴヌクレオチド（センスオリゴヌクレオチド、太字はユープリムナ・スコロペス（Ｅｕｐｒｙｍｎａ ｓｃｏｌｏｐｅｓ）のアンテナペディアのホメオドメイン蛋白質（アクセッション番号：ＡＹ０５２２７５８）に対する部分的ｃｄｓの１８４−２３１位の塩基類に相当し、６２−７７位のアミノ酸類、即ちＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫの配列、をコード化するものであり、イタリック体はＮｏｔ Ｉ／Ｘｂａ Ｉ断片部位に相当する）および対応する相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド（５’−ＴＴＴＣＴＡＧＡＣＣＴＴＴＣＴＴＣＣＡＴＴＴＣＡＴＧＣＧＣＣＧＧＴＴＴＴＧＧＡＡＣＣＡＴＡＴＴＴＴＧＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴ−３’）を用いた。得られたプラスミドの名前は、ｐＣＡＲ（ｅｘ）−ＡｎｔＰ62-77である。
【００８９】
用いた全てのオリゴヌクレオチド類は、さらに細胞接着ドメインの５’−方向で、複数のグリシン／セリン残基類を任意に有することができ、そのドメインをＣＡＲドメインから空間的に分離する。
【００９０】
これらの開示したプラスミド類の配列を決定し、Ｑｉａｇｅｎ Ｅｎｄｏｆｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐ キットを用いて調製した。ＣＡＲ融合蛋白質の分析に必要な量の製造は、カルシウム沈殿法またはリポソーム形成によって２９３−細胞にトランスフェクトして行った。トランスフェクト後２４−４８時間に、細胞培養物上清中に含有する融合蛋白質類を分析のためにさらに用いることができた。
【実施例２】
【００９１】
感染細胞培養物類から蛋白質の調製を行なうための、ＣＡＲ（ｅｘ）融合蛋白質類をコード化するアデノウイルス類の製造
ＣＡＲ1-235に対する発現ユニットを含むアデノウイルスの生成は、ＭｉｚｏｇｕｃｈｉおよびＫａｙによるクローニング系（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９８，９（１７），ｐ．２５７７−２５８３）を用いて行なった。シャトルベクターのための起点のベクターとしては、ｐＨＭ３のＭＣＳの中にｐＢＫ−ＣＭＶベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）の完全発現カセット（ＣＭＶ−プロモーター／ＭＣＳ／ＳＶ４０−ポリアデニル化シグナル）を含むｐＨＭ３ベクター改変体（ｐＨＭ３／ｐＢＫ−ＣＭＶ）を用いた。ＣＡＲ1-235−ＶＰ２２用のｃＤＮＡは、ｐＣＡＲ（ｅＸ）−ＶＰ２２プラスミドをもとに、Ｈｉｎｄ ＩＩＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗ断片で処理し、次にＰｍｅ Ｉで消化して調製し、ｐＨＭ３／ｐＢＫ−ＣＭＶベクターのＳｍａＩサイトに挿入した。得られた構成体（ｐ４６２２）の正しい方向性は、ＫｐｎＩによる消化によって検査した。アデノウイルス性プラスミドのクローニングは、ｐ４６２２由来のＰＩ−Ｓｃｅ／Ｉ−Ｃｅｕ断片を単離し、それをｐＡｄＨＭ４アデノウイルスベクターの対応する断片位内に連結して行なった。その連結によってｐＡｄ４６７９構成体を得た。そのベクターのＰａｃＩで線状化した調製物を、２９３−細胞に感染させて感染粒子体を生成させた。細胞変性効果の出現後に細胞類を収集し、３回の凍結・解凍処理によって感染粒子体を遊離させた。細胞の死骸を遠心法で分離し、上清を高力価ウイルス調製物の製造に用いた（得られたアデノウイルスをＡｄ４６７９と表示する）。高力価の組換えウイルス類の獲得は、同じく２９３−細胞類で行ない、ＣｓＣｌ濃度勾配超遠心法によってウイルス含有溶解物をさらに精製した。
【００９２】
ＣＡＲ1-235−ＴＡＴ48-57用の発現カセットを有するアデノウイルスの生成は、ＨｅおよびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎの組換え系（Ｈｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８，ｖｏｌ．９５，ｐ．２５０９−２５１４）を用いて行なった。ＣＡＲ1-235−ＴＡＴ48-57をコード化するｃＤＮＡを、Ｈｉｎｄ ＩＩＩとＰｍｅＩとの消化によってｐＣＡＲ（ｅｘ）−ＴＡＴプラスミドから単離し、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶベクターのＨｉｎｄ ＩＩＩ／ＥｃｏＲＶサイトに配置した。連結してｐ４９２３構成体を得た。この構成体ｐ４９２３をＰｍｅＩで線状化し、次にＡｄＥａｓｙ １アデノウイルス性ベクターと混合した。この沈降物で組換え大腸菌ＢＪ５１８３株を電気穿孔処理した。それによって生成した組換えアデノウイルスプラスミドを、ｐ５０９１と呼んだ。Ｐａｃ Ｉで消化したこのベクター調製物を用いて、２９３個の細胞の移入処理を行ない感染性粒子を生成させた。細胞変性効果の出現後に、その細胞類を収集し、３回の凍結・解凍処理によって感染性粒子を遊離させた。細胞の死骸を遠心法で除去し、その上清を高力価ウイルス調製物類の製造に用いた（得られたアデノウイルスはＡｄ５０９１と呼ぶ）。
【実施例３】
【００９３】
アデノウイルス感染細胞類の上清類からの組換えＣＡＲ融合蛋白質の製造
その組換えＣＡＲ（ｅｘ）融合蛋白質類は、Ｃ末端で任意の６Ｘヒスチジンの動きを取ることができ、プラスに荷電したＮｉイオン類と複合体を形成することができる。このようにして、固相結合化ニッケルイオン類を用いて複合性蛋白質混合物類から融合蛋白質類を精製することができる。
【００９４】
前述のアデノウイルス類Ａｄ４６７９およびＡｄ５０９１を、ＣＡＲ融合蛋白質類の生産用のベクター類として感染宿主細胞類に用いた。
【００９５】
組換え蛋白質類の生産用の株化細胞類としては、ＣＯＳ−１、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ ７等のような全ての接着化し、アデノウイルスに感染可能な細胞型類が原則として適している。感染したＣＯＳ−１細胞類は、その上清で大量の活性化ＣＡＲ融合蛋白質類を産生したため、使用に好適であった。ＣＯＳ−１細胞類は、ＤＭＥＭ（２％ウシ胎児血清補充）中、１０−５０のＭＯＩ（感染多重度）でＡｄ４６７６またはＡｄ５０９１と８０−９０％の融合率で感染させ、３７℃で４８時間、５％ＣＯ2中で培養した。４８時間後に感染細胞を、１／１０容量の１０×被覆緩衝液（５００ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、３Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ イミダゾール）と混合し、インキュベータ中でさらに１分間培養した。その後、細胞上清を採取して以下のカラムクロマトグラフィーによる精製を行なった（尚、感染細胞類は、培養期間中にさらに培地と混合して再度４８時間培養した）。得られた上清を集め、所望により紛れ込んだ細胞類を１０００×ｇで１０分間遠心分離し、孔径０．２２μｍのフィルターで無菌ろ過して取り除いた。その後、カラムクロマトグラフィーを実施した。そのために、Ｎｉ−ＮＴＡ−アガロース（Ｑｉａｇｅｎ社製）を被覆緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール）で平衡化し、前述の細胞培養上清を適用した。次に洗浄緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、３００ｍＭ ＮａＣｌ．２０ｍＭイミダゾール）でカラムを洗浄した。ＣＡＲ融合蛋白質類の溶離は、溶離緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｌ−ヒスチジン）を用いて行なった。溶離液中のＣＡＲ融合蛋白質類の濃度および機能については、ＢｉｏＲａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ、Ｓｙｐｒｏ−Ｏｒａｎｇｅ染色ＳＤＳゲル電気泳動類、および感染発現類によって確認した。充分に濃縮された溶離液類を２５％グリセリン含有ＤＭＥＭ培養液に対して透析し、液体窒素中で急速凍結させ、−８０℃で貯蔵した。
【００９６】
ウイルス会合化した線維瘤の量に対する、用いられるアダプター蛋白質の関係の決定については、以下に記載する。
【００９７】
ウイルス含有度は通常の力価測定法類で算出した。その実施は、たとえばウイルス粒子類に関する全含有度の確認のためのＯＤ260測定、１ＯＤは１×１０12アデノウイルス粒子類／ｍｌに相当、による分光光学的なものが挙げられる。感染性粒子の含有度は、プラークアッセイ法、Ｒａｐｉｄ Ｔｉｔｅｒ Ａｓｓａｙ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）によるか、または限界希釈およびその後の統計学的計算によって確認した。
【００９８】
アフィニティクロマトグラフィーによる調製物類中のアダプター蛋白質濃度の確認については、ＣＡＲｅｘ−ＶＰ２２の分子量が約６８ｋＤａであり、ＣＡＲｅｘ−Ｔａｔの分子量が約３８ｋＤａであることを考慮して、通常の蛋白質測定法類（ＢｉｏＲａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｃｒｏａｓｓａｙ、Ｌｏｗｒｙら、ＯＤ２３０／２６０）によって行なった。以下の計算は、アデノウイルス中、１００％がインタクトの線維瘤蛋白質であるという仮定に簡略化して基づくものである。
【００９９】
約２５０ｎｇのＣＡＲ−Ｔａｔまたは５００ｎｇのＣＡＲ−ＶＰ２２（約２ｎＭの濃度に相当する以下の算定において）は、Ａｄ−ＬａｃＺを有する１Ｘ１０6の非許容標的細胞類（たとえばＳＫＬＵ−１またはＮＩＨ３Ｔ３）の、ＭＯＩ（感染多重度）２５、感染容量３ｍｌでのほぼ１００％の感染を仲介するのに充分な量である。
【０１００】
２５のＭＯＩとは、２．５×１０7の感染性粒子数に相当する。従って、ＡｄＬａｃＺ調製物類においては通常、各々、約１／１０の粒子類が感染性であり、それは２．５×１０8の全粒子数に相当する。アデノウイルス粒子は、各々で１２個の線維瘤分子を有し、それは１×１０9／ｍｌないし１×１０12／ｍｌの線維瘤濃度に相当する。アダプター蛋白質は２ｎＭ、即ち１．２×１０15／ｍｌの濃度で使用した。理論的線維瘤数に対するアダプター蛋白質（１００％の機能性蛋白質と仮定して）の望ましいモル比は、従って特に１２００である。１２００という分子過剰は、解離平衡のような因子類の調整、標的細胞類によるアダプターの受け入れ、および非機能的アダプター蛋白質への関与に役立つ。より少ない予備培養容量域または感染容量域では、より少ない過剰分、たとえば１００−１５０程度でも充分であると予想される。これはインビボでの感染類（マウス、尾静脈内投与）でも、アダプター／線維瘤の関係は、３００μｌの感染容量中の計算されたアダプター量に必要なウイルス量（たとえばマウス体重２０ｇ当り、１×１０10）の予備培養において充分である。非結合のアダプターの量は、密度勾配遠心法（ＣｓＣｌグラジエント）によって予め分離することができる。
【０１０１】
Ｇｒａｔｔｏｎは、著しい形質導入の改善の達成のためには、連結され得るアデノウイルスの１×１０6個の感染性粒子類を用いて、溶液量１００μｌ中、濃度域が５０μＭから５ｍＭであることを言及している。
【０１０２】
この点においては５０μＭが、３×１０15個のＡｎｔＰ分子類の量に対応して、５ｎｍｏｌのＡｎｔＰの絶対使用量に相当する。この場合、リンカー分子類（線維瘤）の数は１．２×１０8であり、また用いられたウイルスの各々１０個の粒子が実際に感染性があって１個のアデノウイルス粒子が１２個の線維瘤分子類を有するとここでは想定されるものである。従って、リンカー（線維瘤）に対するアダプター（ＡｎｔＰ）の計算された関係は、３×１０15／１．２×１０8＝２．５×１０7、ないしはＧｒａｔｔｏｎによる好ましい全使用領域では５０μＭ−５ｍＭ、即ち２．５×１０7−２．５×１０9個と計算されるのに類似している。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】本発明によるアダプターの図解による構成を示す。
【図２】本発明によるアダプターで被覆されたアデノウイルスに感染した細胞培養物の写真である。
【図３】本発明によるアダプターの作用方式の図説を示す。
【図４】本発明によるアダプターの作用方式の別の図説を示す。
【図５】異なる細胞型に対するいくつかの、一部は本発明によるアダプターの形質導入能率の改善の比較を示す。
【図６】いくつかの、一部は本発明によるアダプター類の形質導入能率の別な比較を示す。
【図７】上皮細胞起源の腫瘍細胞類に対するいくつかの本発明によるアダプター類の形質導入率の比較を示す。
【図８】非上皮細胞起源の細胞類に対するいくつかの本発明によるアダプター類の形質導入率の比較を示す。
【図９】形質導入に適する細胞類に対して条件複製性ウイルス類を用いる可能性を証明するための研究結果を示す。
【図１０】いくつかの本発明によるアダプター類を用いるアデノウイルス装填の持続性を決定するための研究結果を示す。
【図１１】いくつかの、一部は本発明によるアダプター類の形質導入効率に対する培地ｐＨ値の影響の比較を示す。
【図１２】本発明によるアダプターの添加に対して遅らせた、異なる標的細胞類への連結され得る物質の添加の影響の図示である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞表面に連結され得る物質を連結するためのアダプターに関する。細胞表面での通常の連結、即ちアダプター類が存在しない場合の連結では、細胞表面の特別な表面構造（通常は受容体）を必要とするが、本発明はそのような物質類の連結も可能にする。特に本発明は、細胞表面にアデノウイルス線維瘤(ファイバーノブ:Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質類を連結させるためのアダプター、並びにそのアダプターをコードする核酸類およびウイルス類、並びにそれらの使用法に関する。本発明は、コクサッキーアデノウイルス受容体をわずかしかまたは全く含まない細胞表面へのアデノウイルス粒子の連結のような、物質類の連結を媒介および／または改善するための物質類およびその方法類にも関する。
【背景技術】
【０００２】
真核細胞類内、特に哺乳類細胞内に非相同の核酸類を転移させるためには、遺伝子導入用アデノウイルス類がしばしば用いられている。それらはそのウイルス粒子表面にファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）と命名された蛋白質を搬送し、その結果、処理される細胞（標的細胞）の表面の一部に配置されたコクサッキーアデノウイルス受容体（ＣＡＲ（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｒｅｚｅｐｔｏｒ）；バージェルソン（Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ），Ｊ．Ｍ．ら、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ Ｂ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ ２ ａｎｄ５；サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２７５巻（１９９７）、ｐ．１３２０−１３２３）と呼ばれる受容体蛋白質を認識し、結合することができる。ＣＡＲにおけるこの線維瘤蛋白質の結合は、アデノウイルスの感染プロセスの律速段階とみなされている。このファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質へのコクサッキーアデノウイルス受容体の結合、およびそれに伴うその細胞表面でのウイルス粒子の連結後に、別のアデノウイルス外被蛋白質、即ちペントン蛋白質が細胞表面成分類、詳しくは一種または複数のインテグリン類に結合し、それによって標的細胞中へのウイルス粒子のエンドサイトーシスが誘発されると推察される。
【０００３】
標的細胞表面でのコクサッキーアデノウイルス受容体の存在によるアデノウイルス類の依存性は、真核細胞類における非相同核酸類の転移へのアデノウイルス類の有用性を限定するものである（キム（Ｋｉｍ），Ｍ．ら、癌遺伝子治療用アデノウイルスベクター類の治療効果は、腫瘍細胞類表面の低レベルの一次アデノウイルス受容体類で制限される（Ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｓ ｌｉｍｉｔｅｄ ｂｙ ａ ｌｏｗ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｏｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ）；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３８巻（２００２）、ｐ．１９１７−１９２６）。さらにＣＡＲの発現が細胞の分化度に依存することはすでに判明していた（ウォルターズ（Ｗａｌｔｅｒｓ），Ｒ．Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｆｉｂｅｒ ｄｉｓｒｕｐｔｓ ＣＡＲ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｌｌｏｗｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ｅｓｃａｐｅ；セル（Ｃｅｌｌ），１１０巻（２００２），ｐ．７８９−７９９）。それに応じて、腫瘍細胞類における非相同核酸類の、これまで達成され得たアデノウイルス類を用いる転移率は、満足できないほど小さいものである。
【０００４】
したがって、ファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質のＣＡＲ認識に決定的な部位を変化させて単なるコクサッキーアデノウイルス受容体類とは異なる細胞表面成分にそのウイルス類を連結させることを可能にし、それによってそのウイルス類の親和性を変えることが試みられている。しかしながら、そのためのコストが極めて高いため、ウイルスゲノムの改変が必須となる。さらに遺伝子改変のためのそのファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質の生産能は極めて制限されている（スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ），Ｋ．ら、Ａ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ ｓｈｏｗｓ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ；Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，７巻（２００１），ｐ．１２０−１２６）。
【０００５】
同様に、ファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）の認識任務を担うコクサッキーアデノウイルス受容体の細胞外ドメイン、およびその標的細胞表面に発現した受容体（標的受容体）によって認識されるリガンド部位を有する融合蛋白質類の調製も試みられている（ペレボエフ（Ｐｅｒｅｂｏｅｖ），Ａ．Ｖ．ら、Ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ−ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｆｕｓｅｄ ｔｏ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ４０ ｓｃＦｖ ｅｎｈａｎｃｅｓ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｎｄｔｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ；Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，９巻（２００２），ｐ．１１８９−１１９３）。これらの使用によって、コクサッキーアデノウイルス受容体を全くまたはわずかしか発現しないが少なくとも一種の別の受容体を発現するアデノウイルス類で、細胞類を感染させることが可能になる。しかしながら、標的受容体ごとにそれらを用いて新規の融合蛋白質を生産しなければならないこと、および標的受容体を発現するような標的細胞類における感染が依然として限定されたままであることは、不都合なことである（クリエル（Ｃｕｒｉｅｌ），Ｄ．Ｔ．，Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ；Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，６巻（１９９９）、ｐ．１４９７−１４９８）。このため特に感染および腫瘍類の治療では、この融合蛋白質類の有用性が制限されてしまう。融合蛋白質類の産生の時間推移とともに、腫瘍細胞類は遺伝子上の不安定性が増大し、それらによって発現した受容体類の原型を変え、それに応じて各々の腫瘍群類は、細胞表面受容体における特有のスペクトルを任意に持つことが可能になる。したがって腫瘍の治療には、全ての腫瘍細胞類によって発現した受容体類を決定してから対応する融合蛋白質を製造することが最小限、必要になるであろう。
【０００６】
Ｇｒａｔｔｏｎらの刊行物、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００３，ｐ．３５７−３６２から、アデノウイルスが介在した遺伝子転移の改善方法が知られている。それによると、アデノウイルス類を高濃度域（０．０５−５ｍＭ）のＡｎｔｐホメオドメインの第３α−ヘリックスと予め培養し、次に希釈して形質導入予定の細胞類に加える。尚、この処理の際に改善された形質導入は、ＣＡＲ不含のＣＯＳ−７細胞類によって観察された。ＣＯＳ−７細胞類をＡｎｔｐホメオドメインの第３α−ヘリックスと予め培養し、次にアデノウイルスを加える場合でも、またＣＯＳ−７細胞類をアデノウイルスと予め培養し、次にＡｎｔｐホメオドメインの第３α−ヘリックスを加える場合でも、形質導入率の著しい改善は観察されなかった。Ｇｒａｔｔｏｎらによる記載の処理方法で不都合なのは、予め形質導入用に用意したアデノウイルス類を、極めて高濃度域のＡｎｔｐホメオドメインの第３α−ヘリックスで予め処理しなければならないことである。そのことにより、使用されたアデノウイルス類の形質導入率の改善は持続的に達成されないが、そのかわりに予め処理したウイルス類の場合でのみ形質導入率が改善される。特に遺伝子治療で不都合なことは、Ｇｒａｔｔｏｎらによる予備処理アデノウイルス類で感染させた細胞類が、比較が可能な改善された形質導入能率を有するアデノウイルス類を産生できないことである。さらにその細胞類は、Ｇｒａｔｔｏｎらによる記載の高濃度域でＡｎｔｐホメオドメインの第３α−ヘリックスも発現することができるが、生理学的条件では起こり得ない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、したがって刊行物にある諸欠点を排除すること、およびアデノウイルス類に感染する細胞類（標的細胞類）の範囲を簡単な方法で拡大することを可能にする薬剤と方法とを主張することである。好適な場合、細胞表面にコクサッキーアデノウイルス受容体を全くまたはわずかしか発現しないような標的細胞類の感染も、妥当なまたは良好な率で可能になるであろう。その薬剤および方法は本研究の枠内のみならず、好ましくはさらに治療、特にたとえば腫瘍の治療を目的にするような遺伝子治療上および／または特に細胞培養物類の感染を目的とする非医療分野でも使用することができる。
【０００８】
そのほかに、可能な限り広い範囲の種々の細胞型から当然選択可能である標的細胞表面に、ある物質をできるだけ簡単な方法で連結させることができることも一般的に必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって本発明は、ある細胞表面に連結され得る物質を連結させるためのアダプターが主張し、そのアダプターは、
・連結され得る物質を認識して結合するための部位ａ、および
・一種または複数の負に荷電している細胞表面構造体類に親和性を有し、細胞表面にそのアダプターを配置するための組換え部位ｂ
を含むものである。
【００１０】
本発明によるあるアダプターは、同じく連結され得る物質を認識してそれに結合することができ、所望により細胞表面の別の構造体類およびエレメント類、特に別に分布した受容体類を介して、その細胞表面に配列可能である。したがって、選択された標的細胞の細胞型の各々に対して、それに特異的な受容体−発現型に適合した融合蛋白質をいちいち産生させなくともうまく済ませることができる。
【００１１】
本発明の枠内で「認識」とは、連結し得る物質（特にアデノウイルス線維瘤蛋白質）に対して、偶然別の蛋白質よりも平均して高い親和性で結合することに関するアダプターの能力と理解される。連結し得る物質への本発明のアダプターの認識および結合は、一般にはリガンド−受容体の相互作用とみなすことができるが、そのような機序に限定されるものではない。
【００１２】
本発明のアダプターの部位ｂは、このアダプターを標的細胞表面に配置させることができる。さらに標的細胞表面へのこのアダプターの配置は、細胞外面のアダプターとの単なる偶然および一時的ではない結合であると理解できる。本発明によるアダプターは、そのかわりに細胞表面、特に細胞表面外にも存在する蛋白質および炭水化物のような数種の細胞表面エレメント類に対して高い親和性を有するものである。また本アダプタ−は、すぐには標的細胞内には取り込まれず、細胞表面の外側に長時間配置されるか、および／または、本アダプターは細胞外空間において、連結され得る物質の認識および結合を任意に行うことができる。本アダプターは、細胞の取り込み速度が５ｐｍｏｌアダプター／時間以下、好ましくは３ｐｍｏｌアダプター／時間以下（３ｍｌＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中、１×１０6標的細胞でのアッセイ条件下）になるような、媒体非依存性の長い半減期を有するものが好ましい。
【００１３】
細胞表面での配置については、本発明によるアダプターが、種々の細胞型において分布するかまたは汎存する細胞表面エレメント類に連結することによってもたらされるものである。特にその細胞表面エレメント類は受容体類であり得る。初期の諸研究によって本発明によるアダプターの結合が推察され、細胞表面の負に荷電しているそれらエレメント類にはシグナル転送機能がないことが分かった。
【００１４】
好ましい実施形態では部位ｂは、全体で塩基性の特性を有し、および／または好ましくは正に荷電しているものである。塩基性の特性を有するペプチド類および正に荷電しているペプチド類は、細胞膜類での持続的な配置に特に好適であり、この配置にとっては細胞型に特異的な細胞表面エレメント類は必要ではない。さらに正に荷電しているペプチド類は、負に荷電している細胞表面構造体類によく付加する。
【００１５】
アダプターの部位ａおよびｂは、所望により結合性のある別の部位を介してともに共有結合しているものが好ましい。
【００１６】
好ましい実施形態ではアダプターは、部位ａによって、ウイルスまたは別の物質、好ましくはウイルス様物質、特にアデノウイルスを認識して結合するように調整され、さらにそのつど適する別の部位ａを用いてサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、レオウイルスおよび小水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を認識して結合するように調整されている。好ましくはアダプターは、特にその部位ａ）によって、結合され得る物質、特にウイルスごとに特異的な表面構造体（リンカー）を認識して結合するように調整されており、それによってそれぞれの表面構造体（リンカー）を含むウイルスまたはそれ以外の連結し得る物質を、選択的に標的細胞表面に配置させることが可能になる。これに関連して「特異的」という用語は、そのリンカーが連結され得る物質をそれ以外の別の物質と識別するという意味を有するものであって、通常は標的細胞に連結され得る物質を加える際に、共存する別の物質類と充分に識別することができるという意味であり、その諸条件下でアダプターは連結され得る物質を主として認識して結合し、それ以外の物質類を認識して結合することはほとんどないという意味である。
【００１７】
特に好ましい実施形態類では部位ａが、アデノウイルスのファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質を認識して結合する部位を含む。適合するアダプターは、同じく従来のアデノウイルスファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質に連結することができ、細胞表面の別の構造体およびエレメント類、または特に広く分布した受容体類、あるいは細胞表面の別のエレメント類を介することなく細胞表面に配置される。したがってアデノウイルス感染性細胞の範囲を拡大するために、アデノウイルス類自体を遺伝子改変しなければならないことはうまく避けられ、そのかわりに従来のアデノウイルス類を、これまで感染させることができないかまたは困難な標的細胞類の感染にも使用できるようになる。さらに本発明は、本発明による（組換え）アダプターを主張することで、多くの細胞型にとって必須なこと、即ち感染性細胞の各々の型に対してその天然型受容体−発現型に適合した融合蛋白質をいちいち生産しなければならないことが回避される。
【００１８】
特に好ましいのは、部位ａがコクサッキーアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）の細胞外ドメインの、ファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質を認識するための機能性部分を含む場合、またはそれと機能が同一である部分を含む場合である。
【００１９】
そのようなアダプター部位ａは、コクサッキーアデノウイルス受容体の細胞外ドメインの一部（所望により完全な細胞外ドメインでも良い）またはそれと機能が同一である部分を含むものである。さらに部位ａと機能が同一であるものとは、アデノウイルスファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質を認識して結合し、それによって本発明によるアダプターをファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質に連結させることができるものである。部位ａの選択には、当業者はコクサッキーアデノウイルス受容体の構造および機能に関係する既知文献類を用いれば、アダプターをファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質に連結させるのに適したアミノ酸配列を容易に見出すことができる。部位ａとして特に好ましいものは、コクサッキーアデノウイルス受容体（Ｐｕｂｍｅｄアクセッション番号：ＮＭ００１３３８；尚、以下の受け入れ番号は全て同じくＰｕｂｍｅｄ起源のものである）の１−２３５位のアミノ酸類である。
【００２０】
さらに当業者は、コクサッキーアデノウイルス受容体の細胞外ドメインの一部と併用して、またはその代替として、ファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質に本発明によるアダプターを連結でき、コクサッキーアデノウイルス受容体の細胞外ドメイン中のものとしては不含の部分を部位ａ中に想定することができる。特に当業者は、部位ａの機能を保ちつつ、しかも本発明によるアダプターをファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質に連結させることが可能なように、コクサッキーアデノウイルス受容体の細胞外ドメインの個々のアミノ酸を省略、追加および／または別のアミノ酸に置換することができる。
【００２１】
したがって本発明によるアダプターを用いると、詳細な予備知識がなくとも、標的細胞類によって発現した受容体類を介して、アデノウイルスのファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質に高親和性を有するアダプターを標的細胞表面に配置し、それによってその標的細胞類へのアデノウイルス粒子の連結を高感度化させることが始めて可能になる。本発明によるアダプターによれば、好ましい方法によって、広範囲の上皮細胞類、繊維芽細胞類、ニューロン細胞類、樹状細胞類、骨芽細胞類および筋細胞類、並びにそれらの細胞型類由来の変性細胞類を、アデノウイルス類に感染させることができる。
【００２２】
アダプターの部位ｂは好ましくは、
・構成アミノ酸の少なくとも半分がグアニジノ側鎖および／またはアミジノ側鎖を有するアミノ酸長が６またはそれ以上のペプチド、
・少なくとも６個のアルギニン側鎖を有するオリゴペプチド、
・ＨＩＶ ｔａｔ蛋白質の塩基性領域に対応するアミノ酸配列のペプチド、
・ホメオボックス蛋白質の第３ヘリックス、および
・細胞表面への固定に介在する単純ヘルペスウイルスＶＰ２２蛋白質部位
から選択されるものである。
【００２３】
特に好ましくは、このようなアダプターの部位ｂはさらに、
・ＨＩＶ ｔａｔ蛋白質の塩基性領域に対応するアミノ酸配列のペプチド、および
・細胞表面への固定に介在する単純ヘルペスウイルスＶＰ２２蛋白質部位
から選択されるものである。
【００２４】
これらのアダプター類は、多くの特に適した細胞型では、連結され得る物質の連結、特にアデノウイルスの連結のためには、上記以外に言及される部位ｂを有するアダプター類よりも優れていることが明確に証明された（この場合、アダプターの部位ａは、コクサッキーアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）の細胞外ドメインのファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質認識機能部分またはその機能が同一である部分を含むのが好ましい）。
【００２５】
典型的な好ましい種類のペプチド類が真核細胞類の表面に配置するのに適しているかどうかについては、確かにこれまで研究されている。しかしながら連結され得る物質、特にアデノウイルスファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質を認識して結合するための部位を有するペプチド類の提供は知られていない。さらにこの言及したペプチド類は、細胞類における巨大分子の輸送に適しているばかりでなく、アデノウイルス粒子を認識して結合する部位ａとの連合にも適しており、アデノウイルス類による感染を目的とする本発明によるアダプターを標的細胞類表面へ充分持続的に付加させておくことが可能であることが分かった。
【００２６】
米国特許第６４９５６６３号では、少なくとも５０％がグアニジノ側鎖またはアミジノ側鎖を有するサブユニット６−２５個から成る輸送ポリマーが開示されている。その輸送ポリマーは、それに付加した薬剤を、その薬剤単独の場合よりも高い割合で生物学的膜を通過させて輸送するのに適している。本発明によるアダプターをアレンジするためには、当業者は言及された米国特許明細書を見て、好ましい実施形態として明らかにされたのものが、特に本発明の枠内でも好ましいことを目的に合わせて知る。特に有用なものとしては、部位ｂが線状であってアミノ酸長が７−２０のものであり、そのアミノ酸類の各々には最大限１個のグアニジノ側鎖またはアミジノ側鎖が存在するものであることが判明した。
【００２７】
さらに米国特許第６３１６００３号では、ＨＩＶ ｔａｔ蛋白質あるいは一種または複数のそれらの断片類を用いた「運搬分子類」の細胞外供給のための輸送ポリペプチドが開示されている。その中で特に有用なものとしては、ｔａｔ蛋白質の塩基性領域、特にアミノ酸数４９−５７の断片類と理解されるものが記載されている。当業者は、本発明によるアダプターをアレンジするために、所望によりこの特許明細書を確認する。その中で好ましいものとして挙げられた実施例は、本発明によるアダプターの部位ｂをアレンジするのに、本発明にもかなった特に好ましいものである。それには特にＲＫＫＲＲＱＲＲＲのアミノ酸配列を有するペプチドがある。
【００２８】
さらに米国特許第５８８８７６２号では、生きている細胞内に巨大分子を導入するためのホメオボックスペプチドの第３ヘリックスの使用が開示されている。このため、当業者が当該特許に開示された４番目の形態をふまえ本発明によるアダプターを製造しようとする際は、上記特許明細書が役に立つ。米国特許第５８８７６２号において好ましいものとして記載されている実施形態も、特に本発明にかなった好ましいものである。本発明に特に好適なものとしては、ホメオドメインの４３−５８のアミノ酸類を有するホメオボックス蛋白質断片、特にアンテナペディアのホメオボックス蛋白質由来のものが挙げられており、同じくそれらに対応するホメオボックス蛋白質の断片類、エングレイルド−１、エングレイルド−２，ｈｏｘａ−５、ｈｏｘｃ−８およびフシ−タラズ（ｆｕｓｈｉ ｔａｒａｚｕ）も好ましい。特に好ましくは、本発明によるアダプターの部位ｂがＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫのアミノ酸配列を有するペプチド、即ち、ユープリマ・スコロペス（Ｅｕｐｒｙｍａ ｓｃｏｌｏｐｅｓ）のアンテナペディアのホメオドメイン蛋白質（アクセッション番号：ＡＹ０５２７５８）のアミノ酸４３−５８位のアミノ酸配列を含むものが挙げられる。
【００２９】
最後に、米国特許第６１８４０３８号では、輸送蛋白質としての単純ヘルペスウイルスＶＰ２２およびその相同体類の使用が開示されている。このため、当業者が当該特許に開示された最後の形態をふまえて本発明によるアダプターを製造しようとする際は、この特許明細書の開示を引用する。本発明にかない、本アダプターの部位ｂとして特に好ましいものとしては、ＶＰ２２蛋白質の３４個のＣ末端部のアミノ酸類および対応する類似ペプチド類および／または相同ペプチド類であって、細胞表面に蛋白質を配置することができるように媒介するものが挙げられる。
【００３０】
そのようなアダプター類としては、特に部位ｂにおいてＨＩＶ ｔａｔ蛋白質の塩基性領域および／または細胞表面での固定に介在する単純ヘルペスウイルスのＶＰ２２蛋白質断片、あるいはそれらのペプチド類の一部分を含み、由来が異なる細胞類の負に荷電しているエレメント類に付加することができるものが好適に挙げられる。特に上皮起源の細胞類の表面に付加すると、良好な成果が得られる。従来の諸研究に従って、細胞接着傾向が高い細胞類の表面に付加しても良好な成果が得られる。従って本発明にかなうものは、上皮起源の腫瘍類の抑制および／または細胞接着傾向が高い腫瘍類の抑制のための薬剤の製造に好適なアダプター類が特に好ましい。それは特に上皮性癌腫類、肉腫類、グリア芽腫類および星状細胞腫類に対して有効である。
【００３１】
本発明によるアダプター類に特に好適なものは、部位ｂにおいてＨＩＶ ｔａｔ蛋白質の塩基性領域および／または細胞表面での固定を媒介する単純ヘルペスウイルスＶＰ２２蛋白質の断片またはそれらのペプチド類の一部を含み、それによって多数の細胞型に対する、たとえばアデノウイルスの形質導入率を、比較的低濃度域でも明らかに改善することができるアダプターである。従って特に好ましくは、連結され得る物質に対するリンカーのモル濃度に関して、連結され得る物質よりもわずか５０００倍高い濃度で、本発明によるアダプターを用いることである。たとえば、アデノウイルス（または表面にファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質を有する物質に相応して）を連結させるためには、このアダプターを用いることでアダプターとアデノウイルスとは、ファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質に対するアダプター分子のモル比が５０００（アダプター）：１（ファイバーノブ蛋白質）以下で、混合する。背景技術から知られた方法に従うと、さらにかなり過剰量の補助物質類が必要になる。このため、たとえばＧｒａｔｔｏｎらによると、使用するＡｎｔＰ蛋白質を、ファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質に対するＡｎｔＰの比率が少なくとも２．５×１０7（ＡｎｔＰ）：１（ファイバーノブ蛋白質）になるように用いることではっきりしたわずかな効果が得られ、Ｇｒａｔｔｏｎらによる方法においては、２．５×１０9：１の比率で最高の効果が得られる。
【００３２】
通常、連結され得る物質類は、リンカー、つまりアダプターの部位ａによって認識される表面の構成成分（たとえば繊維瘤蛋白質のような）を有する。その場合、特に好ましくは、リンカーに対するアダプター比が少なくとも１０：１から１５００：１までであり、特に１００：１から５００：１が好ましい。たとえば、アデノウイルスは、本発明によるアダプターにおける濃度が、好ましくは０．１−１００ｎＭ、特に好ましくは０．５−５０ｎＭおよびさらに好ましくは１−１０ｎＭｎになるように標的細胞類表面に配置される必要がある（尚、あるアダプターでは、部位ｂにＨＩＶ ｔａｔ蛋白質の塩基性領域および／または単純ヘルペスウイルスのＶＰ２２蛋白質の細胞表面での固定を媒介する断片類またはそれらのペプチド類の一部を含む）。多数のＣＡＲ不含細胞型における、アデノウイルスの形質導入率の明らかな改善を達成するには、本発明のアダプターの低濃度域でほぼ充分である。
【００３３】
本発明によるアダプターが、その二量体、三量体および／またはオリゴマー類の形成のためにオリゴマー化部位もさらに含む場合も有益であることが判明した。このオリゴマー化部位を想定することによって、アデノウイルスのファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質または連結され得る物質に対する本発明によるアダプターの親和性は、簡単に持続的に増大させることができる。オリゴマー化部位としては、特にＧＣＮ４蛋白質のオリゴマー化ドメイン類および／またはロイシンジッパードメイン類が好ましい。
【００３４】
本発明によるアダプターの製造については、粗面小胞体内および好ましくは細胞外空間でもアダプターの合成を引き起こすリーダー配列をさらに含む場合に特に良好な結果となった。このようにすれば、本発明によるアダプター類を製造する真核細胞類から当該アダプターを容易に導出させることができる。リーダー配列としては、コクサッキーアデノウイルス受容体の天然型リーダー配列が特に好ましい。合目的的には、本発明によるアダプター類は、コクサッキーアデノウイルス受容体の膜貫通ドメイン類を持たないものが良い。これらの膜貫通ドメイン類がないことによって、本発明によるアダプターの、発現性真核細胞類から細胞外空間への放出がさらに簡略化される。
【００３５】
本明細書に記載の考え方には、アダプターをコードする核酸類も本発明に従い、その一部として主張されている。そのような核酸は、宿主細胞類または生産細胞類におけるアダプターの製造を簡略化する。
【００３６】
そのアダプターをコードする核酸は、特にウイルスゲノムの一部であり得、その中でも発現ユニットの形で存在するものが好ましい。それに応じて、真核細胞類、特にヒトおよび／または動物の細胞類の培養において、野生型よりも改善された分布拡大諸特性を有する組換えウイルスも、本発明で主張されている。そのウイルスは、野生型のものよりも改善された腫瘍溶解諸特性も有する可能性がある。
【００３７】
本明細書に記載の考え方では、アダプターを発現させるためのウイルスは、好ましい実施形態では、少なくともウイルスの増殖段階でウイルス外殻(Virus-Hulle)を有するものであり、そのウイルスは、
・直前に記載したような核酸、および
・アダプターの部位ａに連結可能なウイルス外殻蛋白質発現のための核酸断片
を含むものである。
【００３８】
さらにウイルスについては、その核酸が宿主細胞内で増殖可能であって、その際、その核酸が所望により複数のユニットから構成される粒子（ウイルス粒子）の中に被包化され得、さらに所望によりウイルス粒子内に被包化された核酸が（たとえばその宿主細胞類が死んだ場合に）別の宿主細胞内にも侵入するために、その宿主細胞類から遊離可能である核酸含有ユニットであると解釈されるものである。本発明によるウイルスの例としては、部位ａがアデノウイルスファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質を認識して結合する部分を含む本発明によるアダプターを発現するための核酸を有し、２型および５型のアデノウイルスから誘導されたウイルス類が挙げられる。
【００３９】
アデノウイルス粒子（本明細書の記載では時には「ウイルス粒子」とも略語化される）については、核酸を包み込むかまたは別な方法でそれに連結しており、その核酸が発現すると自身の産生を引き起こし、少なくとも１個のアデノウイルスファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質を有する各本体であると解釈されるものである。特に従来のアデノウイルス類のウイルス粒子は、本発明の諸目的におけるアデノウイルス粒子である。さらに特に好ましくは、そのアデノウイルス粒子が直前に記載したような本発明によるウイルスのウイルス粒子である場合である。
【００４０】
本発明によるウイルス粒子は、宿主細胞内での本発明によるアダプターの製造も、あるいは本発明によるアダプターによって認識され結合され得るウイルス外殻またはウイルス粒子の産生も、容易に可能にするものである。さらに本発明によるウイルスは、標的細胞類の培養において、標的細胞類にウイルスを連結させるための特別な受容体類をわざわざ使用しなくとも拡がることができる。最初の標的細胞類が、そのウイルスに感染して本発明によるアダプターの産生が開始されると、すぐにアダプターはその最初の標的細胞類から遊離して別の標的細胞類の表面に配置される。最初の標的細胞類から遊離した本発明によるウイルス類は、次に上記のようにして変化を受けた別の標的細胞類に、本発明によるアダプターを介して連結し、別の標的細胞類に感染することができる。
【００４１】
特に好適には、組織特異的に増殖が調節されるウイルスが挙げられる。この場合、本発明によるウイルス類の拡がりは、指定された組織類（標的組織類）、たとえば腫瘍組織類に主として限られる。好ましくは、ウイルス増殖を組織特異的に調節するために使用可能なプロモーター類、たとえばＡＦＰ−（α−フェトプロテイン）腫瘍マーカー用プロモーター類、前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）用プロモーター類、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）蛋白サブユニット用プロモーター類および転写因子類によって調節されるプロモーター類、特にｍｙｃ、ｍｙｂ、Ｅ２Ｆなどの、マイトジェンシグナルの結果、活性化および／または増強される転写因子類によって調節されるプロモーター類、が挙げられる。
【００４２】
それと同様にまたは代替としては、本発明によるアダプター類をコードする核酸部位が組織特異的に調節されるウイルスが好ましい。この場合、本発明によるアダプターの発現は、主として標的組織に限定され得る。組織特異的に調節するためには、前段落に記載のプロモーター類も用いることができる。
【００４３】
同じく好ましいものとしては、細胞死誘発性物質をコードする核酸をさらに含むようなウイルス類が挙げられ、特に好ましくはその核酸が備わると細胞死誘発性物質が組織特異的に発現するものが挙げられる。それにふさわしい核酸には、特に本発明によるアダプターをコードする部位を含む核酸断片があり得る。本発明による核酸がコード化可能な好ましい細胞死誘発性物質としては、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼおよびシトシンデアミナーゼが挙げられる。特に好ましくは、そのウイルスが腫瘍溶解性である場合のものである。
【００４４】
本発明によるアダプターが細胞表面よりも、または細胞表面へのアダプター配置を媒介し得る細胞表面エレメント類よりも、ウイルス粒子、特にファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質に対して高い親和性を有する場合、ウイルス粒子は、細胞表面に付加される前に多数の本発明にアダプターで通常、すぐに被覆される。
【００４５】
さらに本発明によると、ある物質、特にアデノウイルス粒子の細胞表面への連結を、非医療領域で、媒介および／または改善するために、本発明によるアダプターを用いることも明示される。本開示に記載されているように、本発明によるアダプターは、本質的に天然型の受容体類に依存せずに、あるいは宿主細胞の広く分布した細胞表面エレメント類の媒介のもとで、アデノウイルス粒子で感染させるかまたは別の連結され得る物質を連結させるのを容易にできる。このようにして、たとえば真核細胞培養物の感染におけるような、形質転換効率は、好適に容易に改善され得る。
【００４６】
本発明によるアダプター類は、特にアデノウイルス類による固形腫瘍類の感染率を高めるのに好適である。このようにすると、感染に必要とされるウイルス力価を低下させることができ、それによって動物モデル、またはヒトにおいても、アデノウイルス含有の医薬品または製剤の肝毒性を低下させることができる。
【００４７】
本発明によると、ある物質、特にアデノウイルス粒子を、細胞表面に非医療分野で、連結させるための方法も主張されており、以下の諸工程を含むものである。
ａ）連結し得る物質（特にアデノウイルス粒子）を、本発明によるアダプターに曝露してその物質をアダプターに備え付ける工程、および
ｂ）アダプターを備えたその連結され得る物質に細胞表面を曝露する工程。
【００４８】
工程ａにおいては、特にアデノウイルス粒子を本発明によるアダプターに備えることができる。この場合、ウイルス粒子を多くの本発明によるアダプターにあてがってウイルス粒子を本発明によるアダプターで被覆するのが好ましい。第二の工程では、そのように処理されたアデノウイルス粒子類の一用量分（すくなくとも１粒子）に標的細胞類をあてがって本発明によるアダプターを介して細胞表面に少なくとも１個の粒子の連結を可能にする。このようにすると、その細胞表面ではコクサッキーアデノウイルス受容体は全くまたはごくわずかな量しか発現せず、これまでアデノウイルス類で感染させるには不適であった標的細胞類に、アデノウイルス類を効果的に連結させることがはじめて可能になる。本発明による方法を用いると、たとえばストローマ線維芽細胞類を満足すべき効率で感染させることがはじめて可能になる。
【００４９】
同じく、ある治療方法では、本発明によるあるアダプターを用いて、ある物質、特にアデノウイルス粒子、のある細胞表面への連結を仲介および／または改善することができる。最終的には、アデノウイルス類および／またはそれから導出されるウイルス類を用いる遺伝子治療類、たとえば腫瘍治療、の枠内で特に有利であることが挙げられる。ある治療法においても、最初に本発明によるアダプターにウイルス粒子を備え付け（特に被覆させ）、つづいてそのように処理されたウイルス粒子に標的細胞を曝露するのが好ましい。
【００５０】
従って、ある物質、特にアデノウイルス粒子をある細胞表面に連結させることを媒介および／または改善する薬剤を製造するために、本発明による核酸および／または本発明によるウイルスを用いることは好ましいことであり、特に好ましくは本発明によるウイルスを用いることである。そのような薬剤を用いると、直前に記載してある本発明によるアダプター類およびウイルス類の医療上の使用が、達成しやすく、特に容易に実現され得る。特に、これまでアデノウイルス類に感染させることができないかまたは困難な細胞類、特に腫瘍細胞類およびストローマ線維芽細胞類でも、適切な薬剤を用いることで、医療上の諸目的に充分な程度に感染させることがはじめて可能になる。線維芽細胞類には、増殖性の腫瘍類に栄養を供給するための本質的な役割があり、従ってこの易感染性を改善することは、腫瘍治療における著しい進歩を意味するものである。
【００５１】
ある細胞表面へのある物質（特にアデノウイルス粒子）の連結を仲介および／または改善するための本発明による薬剤は、従って
・本発明によるあるアダプターおよび／または本発明によるウイルス、および
・医薬適合性のある担体
を含むものである。
【００５２】
実用的には、その薬剤については、一方の部分が本発明によるアダプターを含み、もう一方の部分が本発明によるウイルスを含む、２個の分離した部分から成る製剤が重要であり得る。この製剤は、アデノウイルス粒子の連結を媒介および／または改善するのに当然有用なものであり、従って患者に投与する前にその製剤の両方の部分を混合してアデノウイルスファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質を、本発明によるアダプターに連結するのが好ましく、そのような適切なアダプター装填性ウイルス類は、本質的に任意の組織類、特にコクサッキーアデノウイルス受容体を全くまたはわずかな量しか発現しないような組織類においても、感染させるのに特に適している。
【００５３】
本開示に記載されている本発明による方法類および諸使用は、特にヒト起源の細胞類に関連して、用いることができるものである。しかしながらアダプターを標的細胞類の表面に配置できるようにアダプターの部位ｂを選択することで、本発明によるアダプター類は、そのほかの起源の標的細胞類表面へ、アデノウイルスファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質（この蛋白質を含有するウイルス粒子を含めて）のような物質を配置させるのにも適するものとなる。そのほかの起源の標的細胞類には、特にサルまたはイヌ由来の、またはその体内の、標的細胞類とすることができる。
【００５４】
本発明によるアダプター類およびウイルス類は、完全な組織類および少なくとも特殊な完全生物体類、特に動物類の形質導入にも好適である。従ってそれらはヒトまたは動物、特にマウス、ラット、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウサギでの遺伝子治療法において、および生殖系列に登録可能な遺伝子改変動物、特にマウス、ラット、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウサギの製造に好ましく、有用なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
図１は、４種類の本発明によるアダプター蛋白質類の１次構造における構造を図によって示すものである。全てのアダプター類は、Ｎ−末端部にコクサッキーアデノウイルス受容体のリーダー配列を有する。そのリーダー配列は、そのアダプターを発現する宿主細胞類の小胞体中で、本発明によるアダプターの合成を引き起こす。そのリーダー配列には、コクサッキーアデノウイルス受容体の細胞外ドメイン類が接続しており、それは本発明による部位ａ）に相当する。その細胞外ドメイン類の後に、本発明によるアダプターの部位ｂ）が、Ｃ末端方向に続いている。このことは４種の標示アダプター類（上から下へ）において、単純ヘルペスウイルスＶＰ２２蛋白質、ＨＩＶ ｔａｔ蛋白質の塩基性領域、９個のアルギニン残基類含有オリゴアルギニンペプチドおよびホメオボックス第３ヘリックスの、細胞表面への固定に介在する部位として各々、示してある。部位ａ）とｂ）との間には、図示されているように、二量化支援ドメイン（ここではＧＣＮ４由来のロイシンジッパー）を配置することができ、それはファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質に対する本発明によるアダプターの親和性を高めることができるものである。
【００５６】
図２は、本発明によるベクター類を使用してアデノウイルス類に感染したＮＩＨ３Ｔ３細胞類の細胞培養物の写真を示すものである。対照（左上に示す）としては、本発明によるベクターを用いずにアデノウイルスに曝露したＮＩＨ３Ｔ３細胞類の培養物を用いた。ＮＩＨ３Ｔ３細胞類の感染前に、本発明によるアダプター類は２９３−細胞内で発現され、細胞上清中に分泌した。本発明によるアダプター類を各々コード化する核酸で２９３−細胞類をトランスフェクトし、３６時間後にその細胞上清を取り出し、ＬａｃＺをコードしているアデノウイルス類と混合した。本発明による各々のアダプターをそのように装備しているアデノウイルス類を、ＮＩＨ３Ｔ３細胞類培養物に加えて感染させた。感染多重度（ＭＯＩ）は１０であった。４８時間後に細胞培養物類を、Ｘｇａｌ青染色によってβ−ガラクトシダーゼ発現について試験した。その際、アデノウイルスに感染した細胞類は青く着色した。感染については、ＨＩＶ ｔａｔ蛋白質の塩基性領域（右上に示す“ＣＡＲ−Ｔａｔ”）、あるいは単純ヘルペスウイルスＶＰ２２蛋白質の細胞表面への結合を仲介する部位（右下に示す“ＣＡＴ−ＶＰ２２”）のいずれかを部位ｂ）に有するような本発明によるアダプターで最高の状態であった。しかしながら、部位ｂ）にＡｎｔＰ−ホメオボックス蛋白質第３ヘリックスを有する本発明によるアダプターでも、対照例に対してわずかに改善された感染率に至った（左下に示す“ＣＡＲ−ＡｎｔＰ”）。
【００５７】
図３は、本発明によるアダプター類の作用方式を図示するものである。アデノウイルス粒子類は、ＣＡＲ不含細胞類に全くまたはわずかしか感染できない（左上に示す）。感染率については、感染され得る細胞類がその表面にコクサッキーアデノウイルス受容体を発現する場合に、明らかに増大する（左下に示す）。本発明によるあるアダプターは、ＣＡＲ不含細胞類へのアデノウイルス粒子の停留を仲介する（右中央に示す）。さらに本発明によるアダプターは、その部位ａでアデノウイルスの線維瘤蛋白質に結合する。その部位ｂは、標的細胞類の細胞表面、特に細胞型において細胞表面に広く分布したエレメント類、に対する高い親和性を有する。本発明によるアダプターは、高い親和性を有する細胞表面または細胞表面エレメント類とアデノウイルス粒子との接触を仲介する。その接触の成立後、アデノウイルスは内部化され、標的細胞類の感染が起こる。
【００５８】
図４は、本発明によるあるアダプターをコードしているアデノウイルス類に部分的に感染している細胞培養物を図示するものである（左外側および右中央の細胞）。その感染細胞類は、本発明によるアダプター類も発現し、それらを細胞外空間に遊離させる。しかしながらその感染細胞類は、新たなウイルス粒子類も産生し、それらは細胞溶解の際（中央下に示す）に遊離し、細胞外空間に存在する本発明によるアダプター類によって部分的に被覆される。そのように（少なくとも部分的に）被覆されたアデノウイルスはさらに別の細胞に感染することができ（中央左、中央上および右下に示す）、本発明によるアダプター類も新たなアデノウイルス粒子もそこで製造することができる。細胞培養物の感染はそのように自己拡大する。
【００５９】
図５は、異なる細胞型類に対するいくつかの、一部は本発明によるアダプター類の形質導入能率の改善の比較を示すものである。その際、２９３−細胞は、分割図類に各々挙げているアダプター蛋白質類をコード化する発現ベクター類でトランスフェクトされた。２９３−細胞のトランスフェクト３６時間後、この細胞培養上清をアデノウイルス類（Ａｄ−ＬａｃＺ）と混合し、分割図類に各々挙げている細胞培養物類を培養培地中に加えた。４時間後にその培地をウイルス不含培地と交換した。細胞培養物類を、通常の培養諸条件下でさらに４８時間培養した。形質導入率および感染度については、β−Ｇａｌアッセイによって測定した。レポーター遺伝子の発現が、アダプターを伴わない感染と比較して少なくとも５倍増大するため、本発明によるアダプター類、ＣＡＲｅｘ−ＶＰ２２またはＣＡＲｅｘ−Ｔａｔの使用による、試験した全ての細胞型類（ＲＴ−１０１、ＲＫＯ、ＢＮＬ、Ｔ３６２７４、ＭＣＦ−７、ＨＴ−１０８０、ＳＡＯＳ−２およびＳＫＬＵ １）における形質導入能率は改善されることが分かる。適した細胞型類（ＳＡＯＳ−２およびＳＫＬＵ １）では、ＣＡＲｅｘ−ＡｎｔＰの使用によっても、アダプター不含の感染に対する形質導入能率の改善が達成される。それ以外の試験したアダプター類は無効であった。
【００６０】
図６は、いくつかの、一部は本発明によるアダプター類の形質導入の別な比較を示すものである。ｈＣＡＲの全外部ドメインと塩基性ドメイン類とから成り、Ｔａｔ、ＶＰ２２およびＡｎｔＰによって導出した組換え型の可溶性アダプター蛋白質類は、ＣＡＲ不含のＳＫＬＵ−１細胞類のアデノウイルス感染を可能にする。この結果判定を確かめるために、凡例に示すようにアダプター蛋白質類および対照の蛋白質類に対する発現ベクター類で２９３−細胞をトランスフェクトした。産生細胞類の全細胞抽出物類（上）および対応する培地上清類（下）の試料類を、ウエスタンブロット法によってアダプターの発現に関して分析した。上清の分析が示すように（分割図Ａ）、ＣＡＲｅｘ−９ＸＡｒｇは、ＣＡＲｅｘ−Ｔａｔまたは−ＶＰ２２および−ＡｎｔＰとは異なり、上清中に検出できなかった。
【００６１】
分割図Ｂは、アダプター発現性２９３−細胞類の平衡化容量の上清で処理したＳＫＬＵ−１細胞類の試験結果類を示すものである（図５の対応する記載を参照）。ＡｄＬａｃＺは１０のＭＯＩで加え、感染は４時間実施した。４８時間後に感染細胞類をＸ−ｇａｌ染色法によって検出した。ＣＡＲｅｘ−ＶＰ２２または−Ｔａｔは、これらのＣＡＲ不含株化細胞類の効率的なアデノウイルス感染を可能にした。ＣＡＲｅｘ−ＡｎｔＰの場合では、わずかな上昇を認めるにすぎなかった。そのほかの全ての対照蛋白質類は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔでトランスフェクトした産生細胞類の上清を用いる陰性対照と同様に、細胞類の感染は起こらなかった。
【００６２】
図７は、上皮起源の腫瘍細胞類に対する、いくつかの本発明によるアダプター類の形質導入率の比較を示すものである。分割図Ａに結果類が示される試験では、異なる細胞型類には、アダプターの最終濃度２ｎＭで、ＣＡＲｅｘ−ＶＰ２２またはＣＡＲｅｘ−Ｔａｔを含有する培地を供給した。すぐにＡｄＬａｃＺ（ＭＯＩ １０）を加え、感染を４時間実施した。さらに培養４８時間後に、Ｘ−ｇａｌ染色法によって感染効率を評価した。アダプターで支援した感染類における形質導入率は、アダプター不含のそれぞれの対照類の場合よりも平均して少なくとも２０倍高いことが分かる。
【００６３】
分割図Ｂは、１μｇの組換え型ＣＡＲｅｘ−ＶＰ２２またはＣＡＲｅｘ−Ｔａｔを培地で希釈（各々、約４ｎＭまたは８ｎＭに相当）し、Ａｄ−ＧＦＰ（ＭＯＩ ３０）と混合し、掲げる標的細胞類に加えた試験結果を示すものである。感染は４時間行なった。４８時間培養後に、顕鏡して蛍光を観察し、ＦＡＣＳ分析法によって感染効率を算出した。それらの結果類から、取り上げたアダプター類が低濃度では非許容または弱許容細胞類を１００％近い効率で感染させることが示された。
【００６４】
図８では、非上皮起源の細胞類に対するいくつかの本発明によるアダプター類の形質導入率の比較が示されている。非上皮起源の細胞類（たとえば免疫細胞類、および神経系由来の細胞類）においても、ＣＡＲｅｘ−ＶＰ２２または−Ｔａｔの適用によってアデノウイルス感染が増大することが分かる。
【００６５】
分割図Ａは、ＲＡＷ２６４．７マクロファージ類およびＰ３８８Ｄ．１モノサイト類−マクロファージ類を、培地含有の２ｎＭ組換え型ＣＡＲｅｘ−ＶＰ２２またはＣＡＲｅｘ−Ｔａｔ、並びにＡｄＬａｃＺ（ＭＯＩ １０、感染時間４時間）で処理した試験結果類を示すものである。感染効率は、β−ＧａｌアッセイおよびＸ−ｇａｌ染色法で測定した。本発明によるアダプター類を用いることで、形質導入効率が２５倍上昇することが可能であることが分かる。
【００６６】
分割図Ｂを導く試験では、ＡｄＧＦＰを（ＭＯＩ ３０）、ＣＡＲｅｘ−ＶＰ２２またはＣＡＲｅｘ−Ｔａｔ（各々、最終濃度が４ｎＭまたは８ｎＭ）と共にＲＡＷ２６４．７およびｐ３８８Ｄ．１標的細胞類に加えた。感染効率を蛍光顕鏡およびＦＡＣＳによって測定した。本発明によるアダプター類を用いることで、細胞培養物の細胞類の８８％またはそれ以上が形質導入され、一方、アダプターを用いない対照では細胞類の１％のみが形質導入されたことが分かる。
【００６７】
分割図Ｃは、２ｎＭのＣＡＲｅｘ−ＶＰ２２またはＣＡＲｅｘ−Ｔａｔと共にＡｄＬａｃＺでＤＣ２．４樹状細胞類をＭＯＩ ５０で処理し、感染時間を３０分とした試験結果類を示すものである。その定量は、β−ＧａｌアッセイおよびＦＡＣＳ分析類（ＡｄＧＦＰを比較可能なように用いた）によって行なった。また本発明によるアダプター類を用いると、発現率は対照と比較して少なくとも５倍になることが分かる。
【００６８】
分割図Ｄにおいては、不死化シュワン細胞類（ＩＳＣ）を、分割図Ａの説明の項の記載と同様に処理した。その感染度をＸ−Ｇａｌ染色法によって視覚化した。本発明によるアダプター類を用いると、使用した細胞培養物の充分な移入が達成できたことが分かる。
【００６９】
図９は、適する細胞類の形質導入のために条件複製性のウイルス類を用いる可能性を検証する試験の結果類を示すものである。この図からは、条件複製性の、および構成的複製性のアデノウイルスベクター類による主要細胞類のウイルス溶解が増大する受容体非依存性感染を、ＣＡＲｅｘ−ＶＰ２２または−Ｔａｔが仲介したと読み取ることができる。腫瘍細胞の被膜類を、ｈＴｅｒｔ−Ａｄ（条件複製性ベクター）、Ａｄ−ｗｔ（構成的複製性ベクター）およびＡｄＧＦＰ（非複製性対照ベクター）で、凡例に記載されているようなＭＯＩで感染させた。さらに細胞類を、非複製性発現ベクター類、ＡｄＣＡＲｅｘ−ＶＰ２２、ＡｄＣＡＲｅｘ−ＴａｔおよびＡｄＧＦＰ（対照）で、ＭＯＩ ２５（低許容細胞類、ＳＡＯＳ−２、ＨＴ１０８０およびＭＣＦ−７に有効、Ａに参照されるように）またはＭＯＩ ２（許容株化細胞類、Ｈｕｈ７およびＨｅｐＧ２に有効、Ｂを参照）で処理した。複製６日後に、ウイルスの複製と溶解との結果としての細胞被膜の破壊を、クリスタルバイオレット染色法によって視覚化した。
【００７０】
図１０は、いくつかの本発明によるアダプター類を伴う、アデノウイルス類の装填持続性を測定するための試験結果を示す。ＡｄＧＦＰをＤＭＥＭに対して透析し、ＡｄＧＦＰの提供されたアデノウイルス−ファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）分子類に対して１０倍の過剰な分子数の組換え型ＣＡＲｅｘ−ＶＰ２２またはＣＡＲｅｘ−Ｔａｔで処理した。対照としては、非処理ＡｄＧＦＰを使用した。このように処理したウイルス調製物をＣｓＣｌ密度勾配類上に装填し、超遠心処理して蛋白質の過剰分を分離した。観察されたウイルスの帯域類をそのグラジエントから抽出し、ＤＭＥＭに対して透析し、ＯＤ２６０の測定によって定量した。次にＳＫＬＵ−１細胞類をＭＯＩ ５０で４時間感染させた。高い感染率を証明することができた。それらの結果類から、ＣＡＲｅｘ−ＶＰ２２または−Ｔａｔはアデノウイルスベクター類と安定な複合体類を形成することが示される。
【００７１】
図１１は、いくつかの、一部は本発明によるアダプター類の形質導入効率に対する培地のｐＨ値の影響の比較を示すものである。アダプター蛋白質類を、図５に記載してあるように製造し、対応する上清のｐＨ値を４．８−７．３に調節した。次に上清類を、各々に適した濃度類のＡｄ−ＬａｃＺと混合し、それをＮＩＨ３Ｔ３細胞類の感染に用いた（ウイルス含有上清類に細胞類を３０分曝露させ、次にその媒体を培地と交換する）。４８時間培養後、全細胞類の溶解物類のβ−ガラクトシダーゼアッセイによって感染効率を試験した。ｐＨ値が低いほどβ−ガラクトシダーゼの発現が高くなることが分かる。このことから、本発明によるアダプター類が腫瘍瘤類内部での細胞類のトランスフェクションも、通常酸性媒体中で有利に改善するのに好適であるという結論が認められる。
【００７２】
図１２は、本発明によるアダプターの添加に対して好ましい、異なる標的細胞類に連結する物質の添加の影響を示すものである。ＣＡＲｅｘ−ＶＰ２２を、図５に記載しているように製造した。アダプター含有の上清は、標的細胞類（ＳＡＯＳ−２およびＳＫＬＵ−１）を培養して得た。Ｘ軸に挙げた時間の後に、Ａｄ−ＬａｃＺを添加した。細胞培養物を３０分培養し、次に媒体を、ウイルスおよびアダプター不含の通常の培地と交換した。４８時間培養後に、全細胞類の溶解物類のβ−ガラクトシダーゼアッセイによって感染効率を試験した。ＳＫＬＵ−１細胞類のβ−ガラクトシダーゼの発現は、アデノウイルスの添加が約３０分遅れると約半分になり、ＳＡＯＳ−２細胞類ではアデノウイルスの添加が１．５時間以上遅れると初めて半分になることが分かる。本発明によるＣＡＲｅｘ−ＶＰ２２アダプターは、細胞表面にアデノウイルスを連結させるのに培地内で長く使用するの適し得るものである。
【００７３】
実施例類および図面類をもとにして、本発明をさらに詳しく説明するが、図面類および実施例類は、本発明の対象を限定すべきものではない。以下に示す。
【実施例１】
【００７４】
ポリヌクレオチド類の製造
ＣＡＲ1-235ＶＰ２２融合蛋白質（本発明によるアダプター）を生成するのに必要なｃＤＮＡをＰＣＲによって生成した。鋳型としては、ＬＸＳＮ−ｈＣＡＲプラスミド（ＤｅＧｒｅｇｏｒｉ博士、米国、デンバー市、の好意による譲渡）内に含まれるヒト・コクサッキーウイルスとアデノウイルス受容体とのｃＤＮＡ（ｈＣＡＲ）を用いた。５’−プライマーとしては、
【００７５】
【００７６】
オリゴヌクレオチド（イタリック体はｋｐｎ Ｉ断片部分、太字はｈＣＡＲの本来の開始コドン）を用い、３’−プライマーとしては、
【００７７】
【００７８】
オリゴヌクレオチド（イタリック体部分はＮｏｔＩ断片部分、太字はｈＣＡＲ（Ｅｎｔｒｅｚ Ｐｕｂｍｅｔ 受け入れ番号ＮＭ ００１３３８）の７７６−８０７位の塩基類の相補体）を用いた。この含有断片には、ｈＣＡＲのリーダー配列およびその細胞外ドメインが含まれる。ＰＣＲは、Ｐｆｕポリメラーゼを用いて、４９℃で５サイクルおよび５５℃で３０サイクルで行なった。そのＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で精製し、ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩで消化して両末端部分を平滑化した。次にこの断片をｐＶＰ２２ｍｙｃＨｉｓベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の対応する制限断片部位に挿入し、ｐＣＡＲ（ｅｘ）−ＶＰ２２プラスミドを得た。ＨＩＶ−ＴＡＴ、ＡｎｔＰおよび９Ｘアルギニン配列（９ＸＡｒｇ）の細胞接着ドメイン類を有するｈＣＡＲの細胞外ドメイン融合蛋白質用のプラスミド類は、以下のようにクローニングした。
【００７９】
ｐＣＡＲ（ｅｘ）−ＴＡＴ48-57を生成するために、
【００８０】
【００８１】
オリゴヌクレオチド（センスオリゴヌクレオチド、太字はＴＡＴ蛋白質の４８−５７位のアミノ酸類（配列：ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）をコード化するＨＩＶゲノム（アクセッション番号：ＮＣ ００１８０２）の５５１８−５５４７位の塩基類に相当し、イタリック体はＮｏｔＩ／ＸｂａＩ断片部位に相当する）および対応する相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド（５’−ＴＴＴＣＴＡＧＡＣＣＴＣＴＴＣＧＴＣＧＣＴＧＴＣＴＣＣＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴ−３’）をハイブリダイズさせ、ＮｏｔＩとＸｂａＩとで消化し、ｐＣＡＲ（ｅｘ）−ＶＰ２２プラスミドの対応する制限サイトに挿入した。尚、これは予め制限酵素類、ＮｏｔＩとＸｂａＩとで切断し、アガロースゲル電気泳動によってＶＰ２２をコード化するｃＤＮＡを分離したものである。
【００８２】
ＡｎｔＰおよび９ＸＡｒｇの変異体類の生成は、同様な工程によって実施した。
【００８３】
９ＸＡｒｇをコード化するＤＮＡには、
【００８４】
【００８５】
オリゴヌクレオチド（センスオリゴヌクレオチド、太字はＲＲＲＲＲＲＲＲＲのアミノ酸配列をコード化するＤＮＡに相当し、イタリック体はＮｏｔＩ／ＸｂａＩ断片部位に相当する）および対応する相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド（５’−ＴＴＴＣＴＡＧＡＣＣＴＣＴＡＣＧＴＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＧＴＣＧＧＣＧＡＣＧＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴ−３’）を用いた。得られたプラスミドの名前はｐＣＡＲ（ｅｘ）−９ＸＡｒｇである。
【００８６】
Ａｎｐをコード化するＤＮＡには、
【００８７】
【００８８】
オリゴヌクレオチド（センスオリゴヌクレオチド、太字はユープリムナ・スコロペス（Ｅｕｐｒｙｍｎａ ｓｃｏｌｏｐｅｓ）のアンテナペディアのホメオドメイン蛋白質（アクセッション番号：ＡＹ０５２２７５８）に対する部分的ｃｄｓの１８４−２３１位の塩基類に相当し、６２−７７位のアミノ酸類、即ちＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫの配列、をコード化するものであり、イタリック体はＮｏｔ Ｉ／Ｘｂａ Ｉ断片部位に相当する）および対応する相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド（５’−ＴＴＴＣＴＡＧＡＣＣＴＴＴＣＴＴＣＣＡＴＴＴＣＡＴＧＣＧＣＣＧＧＴＴＴＴＧＧＡＡＣＣＡＴＡＴＴＴＴＧＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴ−３’）を用いた。得られたプラスミドの名前は、ｐＣＡＲ（ｅｘ）−ＡｎｔＰ62-77である。
【００８９】
用いた全てのオリゴヌクレオチド類は、さらに細胞接着ドメインの５’−方向で、複数のグリシン／セリン残基類を任意に有することができ、そのドメインをＣＡＲドメインから空間的に分離する。
【００９０】
これらの開示したプラスミド類の配列を決定し、Ｑｉａｇｅｎ Ｅｎｄｏｆｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐ キットを用いて調製した。ＣＡＲ融合蛋白質の分析に必要な量の製造は、カルシウム沈殿法またはリポソーム形成によって２９３−細胞にトランスフェクトして行った。トランスフェクト後２４−４８時間に、細胞培養物上清中に含有する融合蛋白質類を分析のためにさらに用いることができた。
【実施例２】
【００９１】
感染細胞培養物類から蛋白質の調製を行なうための、ＣＡＲ（ｅｘ）融合蛋白質類をコード化するアデノウイルス類の製造
ＣＡＲ1-235に対する発現ユニットを含むアデノウイルスの生成は、ＭｉｚｏｇｕｃｈｉおよびＫａｙによるクローニング系（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９８，９（１７），ｐ．２５７７−２５８３）を用いて行なった。シャトルベクターのための起点のベクターとしては、ｐＨＭ３のＭＣＳの中にｐＢＫ−ＣＭＶベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）の完全発現カセット（ＣＭＶ−プロモーター／ＭＣＳ／ＳＶ４０−ポリアデニル化シグナル）を含むｐＨＭ３ベクター改変体（ｐＨＭ３／ｐＢＫ−ＣＭＶ）を用いた。ＣＡＲ1-235−ＶＰ２２用のｃＤＮＡは、ｐＣＡＲ（ｅＸ）−ＶＰ２２プラスミドをもとに、Ｈｉｎｄ ＩＩＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗ断片で処理し、次にＰｍｅ Ｉで消化して調製し、ｐＨＭ３／ｐＢＫ−ＣＭＶベクターのＳｍａＩサイトに挿入した。得られた構成体（ｐ４６２２）の正しい方向性は、ＫｐｎＩによる消化によって検査した。アデノウイルス性プラスミドのクローニングは、ｐ４６２２由来のＰＩ−Ｓｃｅ／Ｉ−Ｃｅｕ断片を単離し、それをｐＡｄＨＭ４アデノウイルスベクターの対応する断片位内に連結して行なった。その連結によってｐＡｄ４６７９構成体を得た。そのベクターのＰａｃＩで線状化した調製物を、２９３−細胞に感染させて感染粒子体を生成させた。細胞変性効果の出現後に細胞類を収集し、３回の凍結・解凍処理によって感染粒子体を遊離させた。細胞の死骸を遠心法で分離し、上清を高力価ウイルス調製物の製造に用いた（得られたアデノウイルスをＡｄ４６７９と表示する）。高力価の組換えウイルス類の獲得は、同じく２９３−細胞類で行ない、ＣｓＣｌ濃度勾配超遠心法によってウイルス含有溶解物をさらに精製した。
【００９２】
ＣＡＲ1-235−ＴＡＴ48-57用の発現カセットを有するアデノウイルスの生成は、ＨｅおよびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎの組換え系（Ｈｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８，ｖｏｌ．９５，ｐ．２５０９−２５１４）を用いて行なった。ＣＡＲ1-235−ＴＡＴ48-57をコード化するｃＤＮＡを、Ｈｉｎｄ ＩＩＩとＰｍｅＩとの消化によってｐＣＡＲ（ｅｘ）−ＴＡＴプラスミドから単離し、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶベクターのＨｉｎｄ ＩＩＩ／ＥｃｏＲＶサイトに配置した。連結してｐ４９２３構成体を得た。この構成体ｐ４９２３をＰｍｅＩで線状化し、次にＡｄＥａｓｙ １アデノウイルス性ベクターと混合した。この沈降物で組換え大腸菌ＢＪ５１８３株を電気穿孔処理した。それによって生成した組換えアデノウイルスプラスミドを、ｐ５０９１と呼んだ。Ｐａｃ Ｉで消化したこのベクター調製物を用いて、２９３個の細胞の移入処理を行ない感染性粒子を生成させた。細胞変性効果の出現後に、その細胞類を収集し、３回の凍結・解凍処理によって感染性粒子を遊離させた。細胞の死骸を遠心法で除去し、その上清を高力価ウイルス調製物類の製造に用いた（得られたアデノウイルスはＡｄ５０９１と呼ぶ）。
【実施例３】
【００９３】
アデノウイルス感染細胞類の上清類からの組換えＣＡＲ融合蛋白質の製造
その組換えＣＡＲ（ｅｘ）融合蛋白質類は、Ｃ末端で任意の６Ｘヒスチジンの動きを取ることができ、プラスに荷電したＮｉイオン類と複合体を形成することができる。このようにして、固相結合化ニッケルイオン類を用いて複合性蛋白質混合物類から融合蛋白質類を精製することができる。
【００９４】
前述のアデノウイルス類Ａｄ４６７９およびＡｄ５０９１を、ＣＡＲ融合蛋白質類の生産用のベクター類として感染宿主細胞類に用いた。
【００９５】
組換え蛋白質類の生産用の株化細胞類としては、ＣＯＳ−１、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ ７等のような全ての接着化し、アデノウイルスに感染可能な細胞型類が原則として適している。感染したＣＯＳ−１細胞類は、その上清で大量の活性化ＣＡＲ融合蛋白質類を産生したため、使用に好適であった。ＣＯＳ−１細胞類は、ＤＭＥＭ（２％ウシ胎児血清補充）中、１０−５０のＭＯＩ（感染多重度）でＡｄ４６７６またはＡｄ５０９１と８０−９０％の融合率で感染させ、３７℃で４８時間、５％ＣＯ2中で培養した。４８時間後に感染細胞を、１／１０容量の１０×被覆緩衝液（５００ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、３Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ イミダゾール）と混合し、インキュベータ中でさらに１分間培養した。その後、細胞上清を採取して以下のカラムクロマトグラフィーによる精製を行なった（尚、感染細胞類は、培養期間中にさらに培地と混合して再度４８時間培養した）。得られた上清を集め、所望により紛れ込んだ細胞類を１０００×ｇで１０分間遠心分離し、孔径０．２２μｍのフィルターで無菌ろ過して取り除いた。その後、カラムクロマトグラフィーを実施した。そのために、Ｎｉ−ＮＴＡ−アガロース（Ｑｉａｇｅｎ社製）を被覆緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール）で平衡化し、前述の細胞培養上清を適用した。次に洗浄緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、３００ｍＭ ＮａＣｌ．２０ｍＭイミダゾール）でカラムを洗浄した。ＣＡＲ融合蛋白質類の溶離は、溶離緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｌ−ヒスチジン）を用いて行なった。溶離液中のＣＡＲ融合蛋白質類の濃度および機能については、ＢｉｏＲａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ、Ｓｙｐｒｏ−Ｏｒａｎｇｅ染色ＳＤＳゲル電気泳動類、および感染発現類によって確認した。充分に濃縮された溶離液類を２５％グリセリン含有ＤＭＥＭ培養液に対して透析し、液体窒素中で急速凍結させ、−８０℃で貯蔵した。
【００９６】
ウイルス会合化した線維瘤の量に対する、用いられるアダプター蛋白質の関係の決定については、以下に記載する。
【００９７】
ウイルス含有度は通常の力価測定法類で算出した。その実施は、たとえばウイルス粒子類に関する全含有度の確認のためのＯＤ260測定、１ＯＤは１×１０12アデノウイルス粒子類／ｍｌに相当、による分光光学的なものが挙げられる。感染性粒子の含有度は、プラークアッセイ法、Ｒａｐｉｄ Ｔｉｔｅｒ Ａｓｓａｙ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）によるか、または限界希釈およびその後の統計学的計算によって確認した。
【００９８】
アフィニティクロマトグラフィーによる調製物類中のアダプター蛋白質濃度の確認については、ＣＡＲｅｘ−ＶＰ２２の分子量が約６８ｋＤａであり、ＣＡＲｅｘ−Ｔａｔの分子量が約３８ｋＤａであることを考慮して、通常の蛋白質測定法類（ＢｉｏＲａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｃｒｏａｓｓａｙ、Ｌｏｗｒｙら、ＯＤ２３０／２６０）によって行なった。以下の計算は、アデノウイルス中、１００％がインタクトの線維瘤蛋白質であるという仮定に簡略化して基づくものである。
【００９９】
約２５０ｎｇのＣＡＲ−Ｔａｔまたは５００ｎｇのＣＡＲ−ＶＰ２２（約２ｎＭの濃度に相当する以下の算定において）は、Ａｄ−ＬａｃＺを有する１Ｘ１０6の非許容標的細胞類（たとえばＳＫＬＵ−１またはＮＩＨ３Ｔ３）の、ＭＯＩ（感染多重度）２５、感染容量３ｍｌでのほぼ１００％の感染を仲介するのに充分な量である。
【０１００】
２５のＭＯＩとは、２．５×１０7の感染性粒子数に相当する。従って、ＡｄＬａｃＺ調製物類においては通常、各々、約１／１０の粒子類が感染性であり、それは２．５×１０8の全粒子数に相当する。アデノウイルス粒子は、各々で１２個の線維瘤分子を有し、それは１×１０9／ｍｌないし１×１０12／ｍｌの線維瘤濃度に相当する。アダプター蛋白質は２ｎＭ、即ち１．２×１０15／ｍｌの濃度で使用した。理論的線維瘤数に対するアダプター蛋白質（１００％の機能性蛋白質と仮定して）の望ましいモル比は、従って特に１２００である。１２００という分子過剰は、解離平衡のような因子類の調整、標的細胞類によるアダプターの受け入れ、および非機能的アダプター蛋白質への関与に役立つ。より少ない予備培養容量域または感染容量域では、より少ない過剰分、たとえば１００−１５０程度でも充分であると予想される。これはインビボでの感染類（マウス、尾静脈内投与）でも、アダプター／線維瘤の関係は、３００μｌの感染容量中の計算されたアダプター量に必要なウイルス量（たとえばマウス体重２０ｇ当り、１×１０10）の予備培養において充分である。非結合のアダプターの量は、密度勾配遠心法（ＣｓＣｌグラジエント）によって予め分離することができる。
【０１０１】
Ｇｒａｔｔｏｎは、著しい形質導入の改善の達成のためには、連結され得るアデノウイルスの１×１０6個の感染性粒子類を用いて、溶液量１００μｌ中、濃度域が５０μＭから５ｍＭであることを言及している。
【０１０２】
この点においては５０μＭが、３×１０15個のＡｎｔＰ分子類の量に対応して、５ｎｍｏｌのＡｎｔＰの絶対使用量に相当する。この場合、リンカー分子類（線維瘤）の数は１．２×１０8であり、また用いられたウイルスの各々１０個の粒子が実際に感染性があって１個のアデノウイルス粒子が１２個の線維瘤分子類を有するとここでは想定されるものである。従って、リンカー（線維瘤）に対するアダプター（ＡｎｔＰ）の計算された関係は、３×１０15／１．２×１０8＝２．５×１０7、ないしはＧｒａｔｔｏｎによる好ましい全使用領域では５０μＭ−５ｍＭ、即ち２．５×１０7−２．５×１０9個と計算されるのに類似している。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】本発明によるアダプターの図解による構成を示す。
【図２】本発明によるアダプターで被覆されたアデノウイルスに感染した細胞培養物の写真である。
【図３】本発明によるアダプターの作用方式の図説を示す。
【図４】本発明によるアダプターの作用方式の別の図説を示す。
【図５】異なる細胞型に対するいくつかの、一部は本発明によるアダプターの形質導入能率の改善の比較を示す。
【図６】いくつかの、一部は本発明によるアダプター類の形質導入能率の別な比較を示す。
【図７】上皮細胞起源の腫瘍細胞類に対するいくつかの本発明によるアダプター類の形質導入率の比較を示す。
【図８】非上皮細胞起源の細胞類に対するいくつかの本発明によるアダプター類の形質導入率の比較を示す。
【図９】形質導入に適する細胞類に対して条件複製性ウイルス類を用いる可能性を証明するための研究結果を示す。
【図１０】いくつかの本発明によるアダプター類を用いるアデノウイルス装填の持続性を決定するための研究結果を示す。
【図１１】いくつかの、一部は本発明によるアダプター類の形質導入効率に対する培地ｐＨ値の影響の比較を示す。
【図１２】本発明によるアダプターの添加に対して遅らせた、異なる標的細胞類への連結され得る物質の添加の影響の図示である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞表面に連結され得る物質を連結するためのアダプターであって、
・前記細胞表面に連結し得る物質を認識してそれに結合するための部位ａ、および
・一または複数の負に荷電している細胞表面構造体に親和性を有し、前記細胞表面にアダプターを配置するための組換え部位ｂ
を含む前記アダプター。
【請求項２】
部位ａとして、コクサッキーアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）の細胞外ドメインの一部または機能的に同一の部分を含み、アデノウイルスファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質を認識してそれに結合する部位を含む、請求項１に記載のアダプター。
【請求項３】
部位ｂが、
・構成アミノ酸の少なくとも半分がグアジニノ側鎖および／またはアミジノ側鎖を有する、アミノ酸長が６またはそれ以上のペプチド、
・少なくとも６個のアルギニン側鎖を有するオリゴペプチド、
・ＨＩＶ ｔａｔ蛋白質の塩基性領域に対応するアミノ酸配列のペプチド
・ホメオボックス蛋白質の第３ヘリックス、および
・細胞表面への固定に介在する単純ヘルペスウイルスＶＰ２２蛋白質部位
から選択される、請求項１または２に記載のアダプター。
【請求項４】
アダプターの二量体、三量体および／またはオリゴマーを形成するためのオリゴマー化部位をさらに有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアダプター。
【請求項５】
粗面小胞体内でアダプターを合成させるためのリーダー配列をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアダプター。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のアダプターをコードする部位を有する核酸。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のアダプターを発現するためのウイルスであって、
・請求項６に記載の核酸、および
・アダプターの部位ａに連結可能なウイルス外殻蛋白質を発現させるための核酸部位
を有し、増殖期にウイルス外殻を有する前記ウイルス。
【請求項８】
細胞表面への物質の連結を非医療分野で媒介および／または改善することへの、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアダプターの使用。
【請求項９】
非医療分野における、細胞表面への物質の連結方法であって、
ａ）連結され得る物質を請求項１〜５のいずれか１項に記載のアダプターに供給するために、前記アダプターに前記物質を曝露させる工程、および
ｂ）連結され得る物質が供給された前記アダプターに対して前記細胞表面を曝露させる工程
を含む、前記連結方法。
【請求項１０】
細胞表面への物質の連結を媒介および／または改善する医薬品の製造への、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアダプターの使用。
【請求項１１】
細胞表面への物質の連結を媒介および／または改善する医薬品の製造への、請求項７に記載のウイルスの使用。
【請求項１２】
・請求項１〜５のいずれか１項に記載のアダプターおよび／または請求項７に記載のウイルス、および
・医薬適合性のある担体
を含む、細胞表面への物質の連結を媒介および／または改善する医薬品。
【請求項１】
細胞表面に連結され得る物質を連結するためのアダプターであって、
・前記細胞表面に連結し得る物質を認識してそれに結合するための部位ａ、および
・一または複数の負に荷電している細胞表面構造体に親和性を有し、前記細胞表面にアダプターを配置するための組換え部位ｂ
を含む前記アダプター。
【請求項２】
部位ａとして、コクサッキーアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）の細胞外ドメインの一部または機能的に同一の部分を含み、アデノウイルスファイバーノブ（Ｆｉｂｅｒｋｎｏｂ）蛋白質を認識してそれに結合する部位を含む、請求項１に記載のアダプター。
【請求項３】
部位ｂが、
・構成アミノ酸の少なくとも半分がグアジニノ側鎖および／またはアミジノ側鎖を有する、アミノ酸長が６またはそれ以上のペプチド、
・少なくとも６個のアルギニン側鎖を有するオリゴペプチド、
・ＨＩＶ ｔａｔ蛋白質の塩基性領域に対応するアミノ酸配列のペプチド
・ホメオボックス蛋白質の第３ヘリックス、および
・細胞表面への固定に介在する単純ヘルペスウイルスＶＰ２２蛋白質部位
から選択される、請求項１または２に記載のアダプター。
【請求項４】
アダプターの二量体、三量体および／またはオリゴマーを形成するためのオリゴマー化部位をさらに有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアダプター。
【請求項５】
粗面小胞体内でアダプターを合成させるためのリーダー配列をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアダプター。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のアダプターをコードする部位を有する核酸。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のアダプターを発現するためのウイルスであって、
・請求項６に記載の核酸、および
・アダプターの部位ａに連結可能なウイルス外殻蛋白質を発現させるための核酸部位
を有し、増殖期にウイルス外殻を有する前記ウイルス。
【請求項８】
細胞表面への物質の連結を非医療分野で媒介および／または改善することへの、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアダプターの使用。
【請求項９】
非医療分野における、細胞表面への物質の連結方法であって、
ａ）連結され得る物質を請求項１〜５のいずれか１項に記載のアダプターに供給するために、前記アダプターに前記物質を曝露させる工程、および
ｂ）連結され得る物質が供給された前記アダプターに対して前記細胞表面を曝露させる工程
を含む、前記連結方法。
【請求項１０】
細胞表面への物質の連結を媒介および／または改善する医薬品の製造への、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアダプターの使用。
【請求項１１】
細胞表面への物質の連結を媒介および／または改善する医薬品の製造への、請求項７に記載のウイルスの使用。
【請求項１２】
・請求項１〜５のいずれか１項に記載のアダプターおよび／または請求項７に記載のウイルス、および
・医薬適合性のある担体
を含む、細胞表面への物質の連結を媒介および／または改善する医薬品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２００７−５１４４２９（Ｐ２００７−５１４４２９Ａ）
【公表日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４４３６０（Ｐ２００６−５４４３６０）
【出願日】平成１６年１２月１７日（２００４．１２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１４４１９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５９１２９
【国際公開日】平成１７年６月３０日（２００５．６．３０）
【出願人】（５０６２１０２６６）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月１７日（２００４．１２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１４４１９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５９１２９
【国際公開日】平成１７年６月３０日（２００５．６．３０）
【出願人】（５０６２１０２６６）
【Ｆターム（参考）】
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