細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング用の二光子染料、その製造方法及びそれを利用した細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング方法
【課題】細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング用の二光子染料、その製造方法及びそれを利用した細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング方法の提供。
【解決手段】細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング用の二光子染料は、式１の構造を有し、
・・・（１）前記式で、Ｒは、ＨまたはＯＣＨ３である。二光子染料は、Ｚｎ２＋に対して高い選択性を有し、表面からより深く位置する細胞質内の自由Ｚｎ２＋に対して非常に効果的であり、長期間のモニタリングを可能にする。
【解決手段】細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング用の二光子染料は、式１の構造を有し、
・・・（１）前記式で、Ｒは、ＨまたはＯＣＨ３である。二光子染料は、Ｚｎ２＋に対して高い選択性を有し、表面からより深く位置する細胞質内の自由Ｚｎ２＋に対して非常に効果的であり、長期間のモニタリングを可能にする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング用の二光子染料、その製造方法及びそれを利用した細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング方法に係り、さらに具体的には、生きている細胞をより深く長期間探知することができる細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイム映像に適した二光子染料、その製造方法及びそれを利用した細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
亜鉛は、酵素及びタンパク質の必須要素であって、脳では、細胞質内遊離亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）の数ミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌｅ）がシナプス小胞内に貯蔵されており、シナプス駆動によって放出されて、呼吸神経伝達を調節すると知られている。亜鉛の生物学的役割を理解するために、キノリン（ＴＳＱ、Ｚｉｎｑｕｉｎ、及びＴＦＬＺｎ）及び蛍光体（ＦｌｕＺｎ−３、Ｚｎｐｙｒ、ＺｎＡＦなど）から誘導された多様な蛍光探針物質が開発されて来た。
【０００３】
しかし、これらの大部分はかなり短い励起波長を要求するか、ｐＨに敏感であるという限界があった。表面組成物質（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｒｔｉｆａｃｔ）の干渉なしに表面から一定深さ（特に＞８０μｍ）以上の生きている組職内部で生物学的活性を視覚化するためには、低い励起エネルギーを有する二光子を活用する二光子顕微鏡（ＴＰＭ）が非常に効果的である。特に、励起のために２個の近赤外線光子を採用するＴＰＭは、一光子顕微鏡に比べてさまざまな長所を提供することができるが、具体的に増加した透過深さ、局所化された励起、及び観測時間の増加などがまさにそれである。
【０００４】
しかし、このような長所をいずれも有し、Ｚｎ２＋を効果的にモニタリングできる二光子染料は、現在ほとんど開示されていない実情である。Ｚｎ２＋に対する幾つかのｐＨ−抵抗性を有するセンシング物質（ｓｅｎｓｏｒ）が報告はされているが、これも細胞質に適用するためには、微少注入せねばならない問題があり、また低水溶解度に起因してエタノールのような共溶媒を相当量使わなければならない問題がある。
【０００５】
したがって、亜鉛イオンに対して効果的な二光子染料として細胞を染色させるために、十分な水溶解度、亜鉛イオンに対する高い選択度、相当な二光子断面積（ｔｗｏ ｐｈｏｔｏｎ ｃｒｏｓｓ ｓｅｃｔｉｏｎ）、ｐＨ−抵抗性、及び高い光安定性などのような特性をいずれも満足する細胞質内の遊離亜鉛イオンモニタリング用の二光子染料は、現在全くない実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が果そうとする一番目の技術的課題は、生体内、特に細胞質内に存在する遊離亜鉛イオンをより効果的かつ選択的にモニタリングできる二光子染料を提供することである。
【０００７】
本発明が果そうとする二番目の技術的課題は、前記二光子染料の製造方法を提供することである。
【０００８】
また、本発明が果そうとする三番目の技術的課題は、前記二光子染料を利用した細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、前記一番目の技術的課題を果たすために、化学式１の細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング用の二光子染料を提供する：
【００１０】
【化１】
【００１１】
前記式１で、Ｒは、水素またはＯＣＨ３である。
【００１２】
前記二番目の課題を果たすために、本発明は、
（ａ）下記化学式２の化合物を有機溶媒に混入した後、撹拌して第１混合物を収得する段階と、
【００１３】
【化２】
【００１４】
（ｂ）前記収得された第１混合物に下記化学式３の化合物を添加、反応させて前記化学式１の化合物を合成する段階と、を含む細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング用の二光子染料の製造方法を提供する。
【００１５】
【化３】
【００１６】
本発明による二光子染料の製造方法は、前記三番目の課題を果たすために、前記（ｂ）段階後、前記（ｂ）段階の結果物から前記化学式１の混合物を分離する段階をさらに含み、前記分離は、抽出工程によって遂行される。また、本発明の一実施例で、前記有機溶媒は、１，３−ヒドロキシベンゾトリアゾール及び１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドを含む。
【００１７】
前記三番目の課題を果たすための本発明は、前記化学式１の二光子染料を観察対象となる細胞質内に注入した後、放出される二光子励起蛍光（ＴＰＥＦ）映像を観察する段階を含む細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング方法を提供する。前記二光子励起蛍光映像は、前記観察対象の表面から８０ないし１５０μｍの深さ以内に存在する細胞質から放出される。また、前記二光子蛍光映像の観察段階は、１０００秒以上進行することを特徴とする細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明による二光子染料は、Ｚｎ２＋に対して２４ないし５２倍のＴＰＥＦ増加効果を有し、それぞれ１．１±０．１及び０．５０±０．０４ｎＭの解離定数（ＫｄＴＰ）を有する。また、生物学的に連関したｐＨ範囲でｐＨ条件に影響を受けず、従来のＺｎ２＋を検出するための二光子染料であるＴＳＱ及びＦｌｕＺｉｎ−３などに比べて４ないし２４倍以上の増加した強度のＴＰＥＦを発生させる。また、本発明による二光子染料は、１０００秒以上の時間範囲で細胞内の自由Ｚｎ２＋を選択的な検出することができるが、これは従来の如何なる二光子染料より優れた特性である。さらに、本発明による二光子染料は、メンブレン結合二光子染料または他の金属イオンによる干渉や妨害を受けず、非常に効果的に細胞内の遊離亜鉛イオンのみを映像化して、モニタリング可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】図１Ａは、異なる濃度の二光子染料に対する蛍光強度を表わすグラフである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、異なる濃度の二光子染料に対する蛍光強度を表わすグラフである。
【図１Ｃ】図１Ｃは、異なる濃度の二光子染料に対する蛍光強度を表わすグラフである。
【図１Ｄ】図１Ｄは、異なる濃度の二光子染料に対する蛍光強度を表わすグラフである。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明の実施例２の二光子染料に対する一光子吸収及び発光スペクトルである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明の実施例２の二光子染料に対する一光子吸収及び発光スペクトルである。
【図２Ｃ】図２Ｃは、実施例１の二光子染料に対する一光子吸収及び発光スペクトルである。
【図２Ｄ】図２Ｄは、実施例１の二光子染料に対する一光子吸収及び発光スペクトルである。
【図３Ａ】図３Ａは、発明によるＭｇ２＋濃度変化による二光子染料の一光子または二光子吸光または発光スペクトルである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、発明によるＭｇ２＋濃度変化による二光子染料の一光子または二光子吸光または発光スペクトルである。
【図３Ｃ】図３Ｃは、発明によるＭｇ２＋濃度変化による二光子染料の一光子または二光子吸光または発光スペクトルである。
【図３Ｄ】図３Ｄは、発明によるＭｇ２＋濃度変化による二光子染料の一光子または二光子吸光または発光スペクトルである。
【図３Ｅ】図３Ｅは、発明によるＭｇ２＋濃度変化による二光子染料の一光子または二光子吸光または発光スペクトルである。
【図３Ｆ】図３Ｆは、発明によるＭｇ２＋濃度変化による二光子染料の一光子または二光子吸光または発光スペクトルである。
【図４Ａ】図４Ａは、それぞれＡＺｎ１及びＡＺｎ２と自由Ｚｎ２＋との錯化に対するヒルグラフである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、それぞれＡＺｎ１及びＡＺｎ２と自由Ｚｎ２＋との錯化に対するヒルグラフである。
【図５】Ｂ３ＬＹＰ／６−３１Ｇ＊レベルでＡＺｎ１−Ｚｎ２＋及びＡＺｎ２−Ｚｎ２＋の錯化合物の最適化された幾何学的構造を表わす立体図である。
【図６Ａ】図６Ａは、それぞれ実施例２の二光子染料（ＡＺｎ１）及び実施例１の二光子染料（ＡＺｎ２）の蛍光適正曲線を表わす。
【図６Ｂ】図６Ｂは、それぞれ実施例２の二光子染料（ＡＺｎ１）及び実施例１の二光子染料（ＡＺｎ２）の蛍光適正曲線を表わす。
【図７Ａ】図７Ａは、それぞれ３０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝溶液（１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、ｐＨ７．２）とＮａ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋；１０μＭのＭｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋、Ｃｄ２＋及び１μＭのＺｎ２＋を添加した場合、１μＭのＡＺｎ１及びＡＺｎ２の相対的蛍光強度を表わすグラフである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、それぞれ３０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝溶液（１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、ｐＨ７．２）とＮａ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋；１０μＭのＭｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋、Ｃｄ２＋及び１μＭのＺｎ２＋を添加した場合、１μＭのＡＺｎ１及びＡＺｎ２の相対的蛍光強度を表わすグラフである。
【図８Ａ】図８Ａは、３０ｍＭのＭＯＰＳ及び１００ｍＭのＫＣｌ混合溶液で自由Ｚｎ２＋が０．０（白丸）及び１μＭ（黒四角）である時、１μＭのＡＺｎ１及びＡＺｎ２のｐＨ変化による一光子蛍光強度を表わす。
【図８Ｂ】図８Ｂは、３０ｍＭのＭＯＰＳ及び１００ｍＭのＫＣｌ混合溶液で自由Ｚｎ２＋が０．０（白丸）及び１μＭ（黒四角）である時、１μＭのＡＺｎ１及びＡＺｎ２のｐＨ変化による一光子蛍光強度を表わす。
【図９】１．８μＭ自由Ｚｎ２＋の条件でＡＺｎ１（白四角）、ＡＺｎ２（黒丸）、ＦｌｕＺｉｎ（黒三角）及びＴＳＱ（白逆三角）に対する二光子動作スペクトルを表わす。
【図１０】２μＭ ＡＺｎ２−標識化２９３細胞の二光子顕微鏡（ＴＰＭ）映像である。
【図１１】２μＭ ＡＺｎ１−標識化２９３細胞のＴＰＭ映像である。
【図１２】ＡＺｎ２及びＬＴＲ−標識化された（２μＭ）２９３細胞に対するＴＰＭ映像である。
【図１３】ＡＺｎ１及びＬＴＲ−標識化（２μＭ）２９３細胞のＴＰＭ映像である。
【図１４】１０ｍＭのＳ−ニトロソシステイン（ＳＮＯＣ）を添加したＡＺｎ２−標識化２９３細胞のＴＰＥＦのスペクトルである。
【図１５】マウス海馬状突起の微細薄片に対するＴＰＭ映像である。
【図１６】１０μＭのＡＺｎ２で染色されたマウス海馬状突起の微細薄片の歯状回の肺門に対するＴＰＭ映像である。
【図１７】マウス海馬状突起の微細薄片の歯状回の肺門に対する相対的二光子蛍光強度を表わすグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、添付図面及び実施例を参照して、本発明をより詳しく説明する。
【００２１】
本発明は、前記化学式１の構造を有する化合物を細胞質内遊離亜鉛モニタリング用の二光子染料として提供する。本発明による二光子染料は、前記蛍光部位（発光端）にアセチル−６−（ジメチルアミノ）ナフタレン（アセタン）、亜鉛イオンのキレート基として、Ｎ，Ｎ−ジ−（２−ピコリル）エチレンジアミン（ＤＰＥＮ）の誘導体が結合した構造を有する。特に、本発明は、前記構造の二光子染料を遊離亜鉛イオンの二光子染料として使う場合、細胞質内の遊離亜鉛イオンを長期間映像化することが可能であり、さらに、特に呉標的化または光ブリーチイングのような問題なしに８０μｍ以上の深さでも、遊離亜鉛の映像化を可能にする。
【００２２】
以下、本発明による細胞質内遊離亜鉛イオンの二光子染料の製造方法を説明し、前記二光子染料が有する優れた特性は、下記実験例を通じて説明する。
【００２３】
＜実施例１＞
Ｎ−（４−（２−（ビス（（ピリジン−２−イル）メチル）アミノ）エチルアミノ）−３−メトキシフェニル）−２−（Ｎ−（２−アセチルナフタレン−６−イル）−Ｎ−メチルアミノ）アセトアミドの合成
【００２４】
＜実施例１−１＞
Ｎ−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）エチレンジアミンの合成
２−クロロ−５−ニトロアニソール（３．０ｇ、１６．０ｍｍｏｌ）及びエチレンジアミン（７．７ｇ、８．６ｍＬ、０．１３ｍｏｌ）を水（１８０ｍＬ）に混入させた後、１１０℃の温度で７２時間撹拌した。撹拌後、得られた混合物をエチルアセテートを利用、抽出した後、ＭｇＳＯ４を利用、乾燥させ、真空条件で濾過、濃縮させた。以後、クロロホルム／メタノール（５：１）を溶離液とするフラッシュカラムクロマトグラフィーを用いて前記濃縮後、得られた未精製生成物を精製し、エタノールから再結晶化を通じてさらに精製した。これにより、下記化学式４の化合物を得た。
【００２５】
【化４】
【００２６】
収得２．０ｇ（６０％）；ｍｐ１８３℃；ＩＲ（ＫＢｒ）：３４４０、２９６０、２８９０ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．９１（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．９、Ｊ＝２．１Ｈｚ）、７．６３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．１Ｈｚ）、６．５２（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．９Ｈｚ）、５．４１（ｂｒ ｓ、１Ｈ）、３．９４（ｓ、３Ｈ）、３．３１（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝５．４Ｈｚ）、３．０３（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝５．４Ｈｚ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１７１．８、１４５．４、１４４．４、１２０．１、１０６．６、１０４．９、５６．２、４３．４、３９．１ｐｐｍ；Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ９Ｈ１３Ｎ３Ｏ３：Ｃ、５１．７３；Ｈ、６．５１；Ｎ、１９．４４．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、５１．３８；Ｈ、６．２０；Ｎ、１９．２９。
【００２７】
＜実施例１−２＞
Ｎ−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−Ｎ’，Ｎ’−［ビス（２−ピリジルメチル）］エチレンジアミンの合成
前記実験例１−１の化合物、２−（クロロメチル）ピリジン塩酸塩（２．９ｇ、１７．５ｍｍｏｌ）、ＫＩ（０．５２ｇ、３．０ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２０ｇ、２７ｍＬ、０．１６ｍｏｌ）をアセトニトリル（５０ｍＬ）に混入させた後、窒素条件下で１６時間還流させた。還流後、得られた混合物をエチルアセテートを利用、抽出し、ＭｇＳＯ４を利用、乾燥させた後、真空条件で濾過、濃縮させた。以後、クロロホルム／メタノール（４：１ないし１：１）を溶離液とするフラッシュカラムクロマトグラフィーを用いて前記濃縮後、得られた未精製生成物を精製して、下記化学式５の化合物を精製した。
【００２８】
【化５】
【００２９】
収得２．２ｇ（９０％）；ＩＲ（ＫＢｒ）：３４２８ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．５５（ｄｄ、２Ｈ、Ｊ＝５．０、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、７．８５（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９．０、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、７．６４（ｔｄ、２Ｈ、Ｊ＝７．５、２．０Ｈｚ）、７．６２（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、７．４４（ｄｄ、２Ｈ、Ｊ＝７．５、１．０Ｈｚ）、７．１７（ｄｄｄ、２Ｈ、Ｊ＝７．５、５．０、１．０Ｈｚ）、６．３６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９．０Ｈｚ）、６．１０（ｂｒ ｓ、１Ｈ）、３．９９（ｓ、３Ｈ）、３．９２（ｓ、４Ｈ）、３．２９（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝５．４Ｈｚ）、２．９３（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝５．４Ｈｚ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１７０．５、１５９．０、１４９．２、１４５．５、１４４．５、１３７．０、１２３．７、１２２．６、１２０．１、１０６．７、１０４．９、６０．１、５２．９、３７．６、２３．３ｐｐｍ；Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２１Ｈ２３Ｎ５Ｏ３：Ｃ、６４．２８；Ｈ、５．９９；Ｎ、１７．２４．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、６４．１１；Ｈ、５．８９；Ｎ、１７．８０。
【００３０】
＜実施例１−３＞
Ｎ−（４−アミノ−２−メトキシフェニル）−Ｎ’，Ｎ’−［ビス（２−ピリジルメチル）］エチレンジアミンの合成
実施例１−２の混合物（１．２ｇ、３．００ｍｍｏｌ）及びＳｎＣｌ２・Ｈ２Ｏ（７．４ｇ、３３ｍｍｏｌ）の混合物をアセトニトリル（５０ｍＬ）及び無水エタノール（４０ｍＬ）で１２時間還流させた後、１００ｍＬの飽和炭酸ナトリウム１００ｍＬで中和させ、ジクロロメタンで抽出した。以後、クロロホルム／メタノール（２０：３）を溶離液とするフラッシュカラムクロマトグラフィーを用いて前記得られた未精製生成物を精製して、下記化学式６の化合物を得た。
【００３１】
【化６】
【００３２】
収得０．９ｇ（８０％）；ＩＲ（ＫＢｒ）：３４１９ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．５０（ｄｄ、２Ｈ、Ｊ＝Ｊ＝５．０、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、７．６３（ｔｄ、２Ｈ、Ｊ＝７．５、２．０Ｈｚ）、７．５３（ｄｄ、２Ｈ、Ｊ＝７．５、１．０Ｈｚ）、７．１３（ｄｄｄ、２Ｈ、Ｊ＝７．５、５．０、１．０Ｈｚ）、６．３９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９．０Ｈｚ）、６．２７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、６．２２（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９．０、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、３．８６（ｓ、４Ｈ）、３．８４（ｓ、３Ｈ）、３．１５（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝５．４Ｈｚ）、２．８８（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝５．４Ｈｚ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５９．６、１４９．１、１４８．４、１３７．６、１３６．７、１３１．２、１２３．２、１２２．３、１１２．０、１０７．９、１００．１、６０．５、５５．７、５３．４、４２．３ｐｐｍ；Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２１Ｈ２５Ｎ５Ｏ：Ｃ、６９．５５；Ｈ、６．８９；Ｎ、１８．９８．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、６９．４０；Ｈ、６．９３；Ｎ、１９．２７。
【００３３】
＜実施例１−４＞
遊離亜鉛イオンモニタリング用の二光子染料（ＡＺｎ２）の合成
６−アシル−２−［Ｎ−メチル−Ｎ−（カルボキシメチル）アミノ］ナフタレン（０．０７ｇ、０．２７ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（０．０３７ｇ、０．２７ｍｍｏｌ）、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．０５７ｇ、０．２８ｍｍｏｌ）をジクロロメタンに混入させた後、３０分間撹拌した。以後、前記実施例１−４で得られた化学式６の化合物を添加した後、窒素条件下で１２時間撹拌し、得られた生成物をジクロロメタンで抽出し、ＭｇＳＯ４を利用、乾燥させた後、溶媒は真空条件で除去した。以後、クロロホルム／メタノール（２０：１）を溶離液とするフラッシュカラムクロマトグラフィーを用いて前記得られた未精製生成物を精製して、下記化学式７の遊離亜鉛イオンモニタリング用の二光子染料を合成した。
【００３４】
【化７】
【００３５】
＜実施例２＞
遊離亜鉛イオンモニタリング用の二光子染料（ＡＺｎ１）の合成
実施例１−３の化学式６の化合物の代わりに、下記化学式８の化合物を使ったものを除いては、実施例１−４と同じ方法で化学式９の二光子染料を合成した。
【００３６】
【化８】
【００３７】
【化９】
【００３８】
＜実験例１＞
水溶解度の測定
本発明による実施例１及び実施例２の二光子染料（ＡＺｎ２及びＡＺｎ１）少量をＤＭＳＯに溶解させてストック溶液（１．０ｘ１０−３Ｍ）を準備した。以後、前記溶液を（６．０ｘ１０−３ないし６．０ｘ１０−５）Ｍで希釈させてマイクロ注射器を利用、３．０ｍＬの水を含有するキュベットに添加した。あらゆる場合、水でＤＭＳＯ濃度は０．２％を保持した。
【００３９】
図１Ａないし図１Ｄは、異なる濃度の二光子染料に対する蛍光強度を表わすグラフである。
【００４０】
それぞれＡＺｎ２及びＡＺｎ１に対する濃度対比蛍光強度を表わす図１Ｂ及び図１Ｄを説明すれば、染料濃度に対する蛍光強度のグラフは、低濃度で線形を表わすが、高濃度に行くほど下側に落ちる。この場合、染料の水溶解度は、線形パターンを表わす最高濃度で決定され、本発明による二つの染料いずれも３．０μＭの水溶解度を表わした。
【００４１】
したがって、本発明による二光子染料が有する３．０μＭ以上の水溶解度は、細胞の染色において非常に効果的であるということを表わす。
【００４２】
＜実験例２＞
吸光スペクトルの測定
本発明による二光子染料の吸光スペクトルをＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ８４５３ダイオード整列スペクトロメーター上で測定し、蛍光スペクトルを１ｃｍ標準石英セルを備えたＡｍｉｃｏ−Ｂｏｗｍａｎ ｓｅｒｉｅｓ２発光スペクトロメーターを使って測定した。蛍光量子収率は、参考文献の従来文献に開示したことによってクマリン（Ｃｏｕｍａｒｉｎ）３０７を使って測定した。
【００４３】
図２Ａ及び図２Ｂは、本発明による二光子染料であるＡＺｎ１の一光子吸収及び発光スペクトルであり、図２Ｃ及び図２Ｄは、本発明による二光子染料であるＡＺｎ２に対する一光子吸収及び発光スペクトルである。
【００４４】
また、下記表１は、多様な溶媒条件で本発明に実施例２及び実施例１の二光子染料（ＡＺｎ１及びＡＺｎ２）が有する最大発光波長（λｍａｘ（ｌ））、最大蛍光波長（λｍａｘｆｌ）及び蛍光量子収率を表わす。
【００４５】
【表１】
【００４６】
＊：カッコ内の数値は、溶媒極性に対する正規化された経験的パラメータである。λｍａｘはｎｍ単位であり、また蛍光量子収率±１５％。
【００４７】
図２Ａないし図２Ｄ及び前記表１を参照すれば、１，４−ジオキサン（ｄｉｏｘａｎｅ）＜ＤＭＦ＜ＥｔＯＨ＜Ｈ２Ｏの順序で溶媒極性が増加するにつれて大きな赤色移動（ｂａｔｈｏｃｈｒｏｍｉｃ ｓｈｉｆｔ）が観察されるという点は、本発明による二光子染料が極性探針子として非常に有用であるということを表わす。
【００４８】
＜実験例３＞
Ｚｎ２＋濃度変化による吸光度の変化測定
本発明によるＺｍ２＋濃度変化による二光子染料（ＡＺｎ２、ＡＺｎ１）の一光子または二光子吸光または発光スペクトルを測定し、これを図３Ａないし図３Ｆに示した。
【００４９】
図３Ａないし図３Ｆから分かるように、ＭＯＰＳバッファ溶液中の実施例１及び実施例２の二光子染料（ＡＺｎ２、ＡＺｎ１）（３０ｍＭ、ｐＨ７．２、Ｉ−＝０．１０）にＺｎ２＋を微細に増分しながら添加した時、二光子励起蛍光（発光）強度及び一光子励起蛍光強度は徐々に増加するが、吸収スペクトルには如何なる影響がなかった。これは、Ｚｎ２＋との錯化（ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ）による光誘導電子−伝達（ｐｈｏｔｏｉｎｄｕｃｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＰＥＴ）過程の遮断に起因したと推測される。
【００５０】
＜実験例４＞
常用探針との二光子スペクトルの特性比較
一光子蛍光及び二光子蛍光方法のうち、実施例１の二光子染料（ＡＺｎ２）が有する蛍光増加因子（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｆａｃｔｏｒ）［ＦＥＦ＝（Ｆ−Ｆｍｉｎ）／Ｆｍｉｎ］は、実施例２の二光子染料（ＡＺｎ１）が有する蛍光強化因子より２．５倍以上大きいが、これは、過剰のＺｎ２＋がない場合、実施例１の二光子染料が実施例２の二光子染料よりさらに低い蛍光量子収率（Φ）を有するのに比べて、過剰のＺｎ２＋が存在する場合、実施例１の二光子染料（ＡＺｎ２）が実施例２の二光子染料（ＡＺｎ１）よりさらに大きな量子収率（Φ）を有するためである。
【００５１】
このような分析結果は、下記表３の測定結果からより容易に理解されうる。
【００５２】
【表２】
【００５３】
前記測定結果は、いずれも２０ｍＭ ＭＯＰＳ、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、ｐＨ７．２の条件下でＺｎ２＋を添加するか、添加しない場合に分けて測定した。また、λｍａｘはｎｍ単位であって、一光子吸光及び発光スペクトルであり、Ｚｎ２＋の解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ）は、一光子（ＫｄＯＰ）及び二光子方法（ＫｄＴＰ）によって測定し、蛍光増加因子も一光子方法（ＯＰ）及び二光子方法によって測定した。λｍａｘ（２）は、ｎｍ単位の二光子励起スペクトルを意味し、δは、光子当たりピーク二光子断面積で１０−５ｃｍ４ｓの単位を有し、Φδは、二光子動作断面積（ｔｗｏｐｈｏｔｏｎ ａｃｔｉｏｎ ｃｒｏｓｓ−ｓｅｃｔｉｏｎ）を表わす。前記測定結果のうち、二光子励起蛍光強度はあまりにも弱くて断面積を正確に測定できなかったために、これをｎｄで表わし、ＴＳＱ＋Ｚｎ２＋の測定結果は、メタノールでＺｎ２＋の存在下で得られた数値である。
【００５４】
＜実験例５＞
コンピュータ分析
Ｎ，Ｎ−ジ−２−ピコリルエチレンジアミン（ＤＰＥＮ、Ｒ１）、２−メトキシ−ＤＰＥＮ（Ｒ２）及びＡＺｎ１とＡＺｎ２とのＺｎ錯化合物（ＡＺｎ１−Ｚｎ２＋、ＡＺｎ２−Ｚ２＋）の幾何学的構成をガウス０３プログラムで実行される密度機能理論（ＤＦＴ）でＢ３ＬＹＰ／６−３１Ｇレベルを利用、最適化した。計算されたＨＯＭＯ及びＬＵＭＯエネルギーを下記表３に表わした。
【００５５】
【表３】
【００５６】
表３を参照すれば、あらゆる場合、ＣＨ３Ｏ基は、ＨＯＭＯエネルギーレベルを上昇させることが分かる。このような傾向性は、分子がより複雑になる場合、すなわち、Ｒ＞ＡＺｎ＞ＡＺｎ−Ｚｎ２＋に行くほど弱化される。これは、Ｒ２のＨＯＭＯからＡＺｎ２への電子移動は、Ｒ１からＡＺｎ１に進行する場合よりさらに大きなエネルギー、すなわち、さらに大きな熱を発散することを意味する（発熱反応）。また、ＤＰＥＮ（Ｒ１）、２−メトキシ−ＤＰＥＮ（Ｒ２）、ＡＺｎ１及びＡＺｎ２のＨＯＭＯエネルギーは、それぞれ−４．９４８、−４．２４６、−８．７６２及び８．７３３ｅＶということが分かるが、これは、結局Ｒ２からＡＺｎ２へのＰＥＴは、熱力学的観点でさらに効果的に起き、その結果、Φを落とす。一方、ＡＺｎ２−Ｚｎ２＋のさらに大きなΦ（表２参照）は、さらに強い結合からその理由を捜すことができるが、強い結合は振動緩和経路を減少させるためである。
【００５７】
図４Ａ及び図４Ｂは、それぞれＡＺｎ１及びＡＺｎ２と自由Ｚｎ２＋との錯体に対するヒルグラフ（Ｈｉｌｌ ｐｌｏｔ）である。
【００５８】
前記図４Ａ及び図４Ｂを参照すれば、傾きが１である直線で表われたヒルグラフは、Ｚｎ２＋と本発明による二光子染料とは１：１で錯化合物を形成することを表わす。
【００５９】
さらに、最適化されたＡＺｎ１−Ｚｎ２＋及びＡＺｎ２−Ｚｎ２＋錯体の幾何学的構造は、三角状の二重ピラミッド構造であり、ここで、Ｚｎ２＋イオンは、４個の窒素原子及び一つの水分子によって配位され、これは、Ｂ３ＬＹＰ／６−３１Ｇ＊レベルでＡＺｎ１−Ｚｎ２＋及びＡＺｎ２−Ｚｎ２＋の錯化合物の最適化された幾何学的構造を表わした図５を通じても分かる。
【００６０】
また、ＡＺｎ１−Ｚｎ２＋とＡＺｎ２−Ｚｎ２＋複合体の結合長と結合角とをＢ３ＬＹＰ／６−３１Ｇ＊＊レベルで計算して、下記表４に表わした。
【００６１】
【表４】
【００６２】
＜実施例６＞
解離定数（ＫｄＯＰ及びＫｄＴＰ）の決定
多様な量のＺｎＳＯ４及び１０ｍＭのＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）を含有するＭＯＰＳ（４−モルホリンプロパンスルホン酸）緩衝溶液（３０ｍＭ、ｐＨ７．２、０．１Ｍ ＫＣｌ）を準備した。
【００６３】
自由Ｚｎ２＋の濃度（［Ｚｎ２＋］ｆｒｅｅ）を下記数式１を用いてＫＺｎ−ＥＧＴＡａｐｐ，［ＥＧＴＡ］ｔｏｔａｌ及び［Ｚｎ２＋］ｔｏｔａｌから計算した。
【００６４】
【数１】
【００６５】
ここで、
【００６６】
【数２】
【００６７】
及び、
【００６８】
【数３】
【００６９】
である。
【００７０】
したがって、
【００７１】
【数４】
【００７２】
になる。
【００７３】
以後、ＥＧＴＡ（ＫＺｎ−ＥＧＴＡ）のＺｎ２＋錯体の安定性定数を公知された方法によって得て、したがって、ＥＧＴＡ（ｐＨ７．２、０．１Ｍ ＫＣｌ、２５℃）に対して、ｐＫ１＝９．４０、ｐＫ２＝８．７９、ｐＫ３＝２．７０、ｌｏｇＫＺｎ−ＥＧＴＡ＝１２．６が得られる。
【００７４】
０．１Ｍイオン強度でワークアウトされる時、すべての陽性子化定数は０．１１ほど上側に補正され、［ＥＧＴＡ］ｔｏｔａｌは１０ｍＭで固定され、［Ｚｎ２＋］ｔｏｔａｌは０ないし９．５ｍＭの範囲である。
【００７５】
各溶液に対する計算された［Ｚｎ２＋］ｆｒｅｅ濃度は、下記表５のようである。
【００７６】
【表５】
【００７７】
二光子染料に対する明確な解離定数を決定するために、前記図３Ｂ及び図３Ｅから下記数式５を用いて蛍光適正曲線を求めた。
【００７８】
【数５】
【００７９】
ここで、Ｆは蛍光強度、Ｆｍａｘは最高蛍光強度であり、ＦｏはＺｎ２＋がない条件での蛍光強度、［Ｚｎ２＋］ｆｒｅｅは自由Ｚｎ２＋濃度を表わす。
【００８０】
図６Ａ及び図６Ｂは、それぞれ実施例２の二光子染料（ＡＺｎ１）及び実施例１の二光子染料（ＡＺｎ２）の蛍光適正曲線を表わす。
【００８１】
数式５による適正曲線（図２Ｃ）に最もよく符合されるＫｄ数値を商用アクセルプログラムを使って計算した。また、二光子過程でのＫｄ数値を決定するために、７８０ｎｍの波長及び１１８０ｍＷの出力にセッティングされ（焦点平面からおおよそ１０ｍＷに該当）、モードロックされたチタン−サファイアレーザ光源（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ、９０ＭＨｚ、２００ｆｓ）によって励起されるＤＭ ＩＲＥ２ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｌｅｉｃａ）を使ってＴＰＥＦスペクトルを得た。ＴＰＥＦ適正曲線（図３Ａ及び図３Ｄ）を得て、これを前記数式５にフィッティングさせた（図６Ａ及び図６Ｂ）。
【００８２】
図６Ａ及び図６Ｄを参照すれば、一光子蛍光適正曲線及び二光子蛍光適正曲線から計算されたＡＺｎ１及びＡＺｎ２の解離定数ＫｄＯＰ及びＫｄＴＰは、それぞれ１．１±０．１及び０．５０±０．０４ｎＭである（前記表２参照）。この際、これら二光子染料の検出限界は、ｎＭ範囲以下である。特に、ここで注目しなければならない点は、ＡＺｎ２のＫｄＴＰ値がさらに小さいということであるが、これは前述したように、ＡＺｎ２及びＺｎ２＋間のより強い結合（前記表３及び図５参照）を意味する。
【００８３】
＜実施例７＞
金属陽イオンに対する選択性の測定
図７Ａ及び図７Ｂは、それぞれ３０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝溶液（１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、ｐＨ７．２）とＮａ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋；１０μＭのＭｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋、Ｃｄ２＋及び１μＭのＺｎ２＋を添加した場合、１μＭのＡＺｎ１及びＡＺｎ２の相対的蛍光強度を表わすグラフである。グラフのうち、内部が満たされた棒はＺｎ２＋が添加された場合であり、内部が満たされていない棒はＺｎ２＋が添加されていない場合である。
【００８４】
図７Ａ及び図７Ｂを参照すれば、本発明による二光子染料は、Ｎａ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋；１０μＭのＭｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋、Ｃｄ２＋と比べてＺｎ２＋に対する高い選択度を示す。
【００８５】
図８Ａ及び図８Ｂは、３０ｍＭのＭＯＰＳ及び１００ｍＭのＫＣｌ混合溶液で自由Ｚｎ２＋が０．０（白丸）及び１μＭ（黒四角）である時、１μＭのＡＺｎ１及びＡＺｎ２のｐＨ変化による一光子蛍光強度を表わす。
【００８６】
図８Ａ及び図８Ｂを参照すれば、本発明による二光子染料は、生物学的に連関したｐＨ条件で高い蛍光強度を表わし、ｐＨ条件によって影響を受けないということが分かる。
【００８７】
以上の結果から本発明による二光子染料は、Ｚｎ２＋で非常に高い選択性を有し、さらに生体内のｐＨ条件に敏感ではなく、生体内亜鉛イオンに対する二光子染料として非常に有用であるということが分かる。
【００８８】
＜実施例８＞
二光子断面積及び動作スペクトルの測定
二光子断面積（δ）をフェムト秒（ｆｓ）蛍光測定技術を使って測定した。
【００８９】
ＡＺｎ１、ＡＺｎ２、ＦｌｕＺｉｎ及びＴＳＱを３０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝溶液（１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、ｐＨ７．２）で５．０×１０−６Ｍの濃度で溶解させた後、二光子染料の特性が文献上によく知られたフルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）を対照物質として７４０−９４０ｎｍで二光子誘導蛍光強度を測定した。対照物質及びサンプルの二光子誘導蛍光スペクトルの強度を測定し、ＴＰＡ断面積は、下記数式６によって計算した。
【００９０】
【数６】
【００９１】
図９は、１．８μＭ自由Ｚｎ２＋の条件でＡＺｎ１（白四角）、ＡＺｎ２（黒丸）、ＦｌｕＺｉｎ（黒三角）及びＴＳＱ（白逆三角）に対する二光子動作スペクトルを表わす。
【００９２】
図９を参照すれば、緩衝溶液でＡＺｎ１及びＡＺｎ２とＺｎ２＋との錯化合物に対するＴＰ動作スペクトルは、７８０ｎｍで〜９０ＧＭのΦδ値を表わし、これは、ＴＳＱ及びＦｌｕＺｉｎ−３より４ないし２４倍以上大きな数値である。したがって、以上の結果は、本発明による二光子染料によって染色されたサンプルは、従来の二光子染料（ＴＳＱ及びＦｌｕＺｉｎ−３）に比べて顕著に明るい映像を表わすことを意味する。このような結果は、前記表２の結果値からも明確に分かる。
【００９３】
＜実施例９＞
本発明による二光子染料を利用した細胞観察
１０％ＦＢＳ（ＷｅｌＧｅｎｅ）、ペニシリン（１００ユニット／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭ（ＷｅｌＧｅｎｅ）で２９３細胞を培養した。
【００９４】
映像化の二日前に細胞をガラス底皿（Ｇｌａｓｓ−ｂｏｔｔｏｍｅｄ ｄｉｓｈ、ＭａｔＴｅｋ）上に移した後、プレーティングした。標識化のために成長培地を除去し、無ＦＢＳ ＤＭＥＭに取り替えた。細胞を処理した後、５％二酸化炭素下で３０分間３７℃で２μＭセンサーを用いてインキュベーションし、細胞をホスフェート緩衝サリーネ（ＰＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）で３回洗浄した後、無色の無血清培地で１５分間さらにインキュベーションした。生後１日になったラットの大脳皮質（Ｓｐａｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ；ＳＤ）から主要皮質（ｐｒｉｍａｒｙ ｃｏｒｔｉｃａｌ）細胞培養物を取った。１Ｕ／ｍｌのパパイン（ｐａｐａｉｎ、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＮＪ、アメリカ）を含有するＨａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）に大脳皮質を解離させた後、ポリ−Ｄ−リシン及びラミニンコーティングガラスカバースリープ上に１００ないし２００ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２の条件でプレーティングした後、ＣＯ２インキュベーターで２％Ｂ−２７（Ｇｉｂｃｏ）及びペニシリン／ストレプトマイシンを添加した無血清培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｇｉｂｃｏ）の条件で３７℃に保持した。試験管内で７ないし１５日経過後、皮質細胞培養物をＰＢＳで３回洗浄した後、３７℃の温度下で３０分間ＰＢＳから２μＭ ＡＺｎ２でインキュベーションした。
【００９５】
×１００オイル物体、穿孔数（ＮＡ）＝１．３０のスペクトル共焦点及び多光子顕微鏡（ｓｐｅｃｔｒａｌ ｃｏｎｆｏｃａｌ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｈｏｔｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｓ）（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ２）を使ってＡＺｎ２に標識された細胞及び組職の二光子蛍光顕微鏡映像を得た。前記二光子蛍光顕微鏡映像は、モードロックされたチタン−サファイアレーザ光源（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ、９０ＭＨｚ、２００ｆｓ）で波長７８０ｎｍ、出力電力１２３０ｍＷ（これは、焦点面からおおよそ１０ｍＷの平均電力に対応する）で探針（二光子染料）を励起させることで得た。映像をそれぞれ３６０−４６０ｎｍ及び５００−６２０ｎｍ領域の波長で得るために、信号を４００Ｈｚスキャン速度で８ビット未標識された５１２×５１２ピクセルで収集するために内部ＰＭＴが使われた。
【００９６】
図１０Ａないし図１０Ｅは、２μＭ ＡＺｎ２−標識化２９３細胞のＴＰＭ映像であって、それぞれ明るい領域の映像、映像化溶液に１０ｍＭ ＳＮＯＣを添加する前に３６０ないし４６０ｎｍで収集された映像、映像化溶液に１０ｍＭ ＳＮＯＣを添加する前に５００ないし６２０ｎｍで収集された映像、映像化溶液に１０ｍＭ ＳＮＯＣを添加した後に３６０ないし４６０ｎｍで収集された映像、映像化溶液に１０ｍＭ ＳＮＯＣを添加した後に５００ないし６２０ｎｍで収集された映像である。
【００９７】
また、図１１Ａないし図１１Ｅは、２μＭ ＡＺｎ１−標識化２９３細胞のＴＰＭ映像であって、それぞれ明るい領域の映像、映像化溶液に１０ｍＭ ＳＮＯＣを添加する前に３６０ないし４６０ｎｍで収集された映像、映像化溶液に１０ｍＭ ＳＮＯＣを添加する前に５００ないし６２０ｎｍで収集された映像、映像化溶液に１０ｍＭ ＳＮＯＣを添加した後に３６０ないし４６０ｎｍで収集された映像、映像化溶液に１０ｍＭ ＳＮＯＣを添加した後に５００ないし６２０ｎｍで収集された映像である。
図１０Ｂ及び図１１Ｂを参照すれば、本発明による二光子染料（ＡＺｎ１、ＡＺｎ２）に標識化された２９３細胞は、３６０ないし４６０ｎｍでＴＰＥＦ（二光子放出蛍光）を放出しないということが分かる。しかし、図１０Ｃ及び図１１Ｃを参照すれば、５００ないし６２０ｎｍでは相当なＴＰＥＦが放出されることが分かる。
【００９８】
比較例として、Ｍｇ２＋及びＣａ２＋用のアセタン（ａｃｅｄａｎｅ）−誘導ＴＰ二光子染料に標識化された細胞のＴＰＭ映像は、それぞれ３６０ないし４６０ｎｍ及び５００ないし６２０ｎｍでいずれもＴＰＥＦを放出し、これは、それぞれサイトゾル及びメンブレンと結合した二光子染料に起因する（Ｈ．Ｍ．Ｋｉｍ，Ｂ．Ｒ．Ｋｉｍ，Ｊ．Ｈ．Ｈｏｎｇ，Ｊ．−Ｓ．Ｐａｒｋ，Ｋ．Ｊ．Ｌｅｅ，Ｂ．Ｒ．Ｃｈｏ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．２００７，１１９，７５８９−７５９２；Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００７，４６，７４４５−７４４８参照）。
【００９９】
したがって、本発明によるＡＺｎ２は、主にサイトゾル分画構造に位置すると判断され、これは、低い分子量に起因すると推定される。したがって、メンブレン付着探針からの如何なる干渉なしに生体内細胞の［Ｚｎ２＋］ｉを検出することができる。
【０１００】
しかし、さらに本発明による二光子染料は、ｐＨ＜４の条件で蛍光強度が少しずつ増加するために（図８Ａ及び図８Ｂ参照）、酸性小胞体内の二光子染料がＴＰＭ映像化に寄与すると判断することができる余地がある。したがって、このような余地または可能性を排除するために、２９３細胞及び主要皮質培養物を同時にＡＺｎ２及び酸性小胞体用のよく知られた一光子染料ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ（ＬＴＲ）で染色し、これにより得られた映像を同様に位置させた後、図１２及び図１３に表わした。
【０１０１】
図１２は、ＡＺｎ２及びＬＴＲ−標識化された（２μＭ）２９３細胞に対する映像であって、（ａ−ｅ）は、映像化溶液に１００μＭ ＴＰＥ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（２−ピリジル）エチレンジアミン）を添加する前、（ｆ−ｊ）は、添加した後の映像である。より具体的に説明すれば、（ａ、ｆ）は、明るい領域の映像であり、（ｂ、ｇ）及び（ｃ、ｈ）は、それぞれ３６０−４６０ｎｍ及び５００−５８０ｎｍで収集されたＡＺｎ２に標識化された２３９細胞の擬似（ｐｓｅｕｄｏ）色彩化された映像である。また、（ｄ、ｉ）は、６００−６５０ｎｍで収集されたＬＴＲに標識化された２９３細胞のＯＰＭ映像であり、（ｅ、ｊ）は、得られた映像を同様に位置させた（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚｅ）映像である。ここで、一光子及び二光子励起は、それぞれ５４３ｎｍ及び７８０ｎｍであり、スケール棒は３０μｍであり、また表われた細胞は、重複された実験（ｎ＝５）からの代表映像である。
【０１０２】
また、図１３は、ＡＺｎ１及びＬＴＲ−標識化（２μＭ）２９３細胞の映像であって、（ａ−ｅ）は、映像化溶液に１００μＭ ＴＰＥＮ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（２−ピリジル）エチレンジアミン）を添加する前、（ｆ−ｊ）は、添加した後の映像である。より具体的に説明すれば、（ａ、ｆ）は、明るい領域の映像であり、（ｂ、ｇ）及び（ｃ、ｈ）は、それぞれ３６０−４６０ｎｍ及び５００−５８０ｎｍで収集されたＡＺｎ１に標識化された２３９細胞の擬似色彩化された映像である。また、（ｄ、ｉ）は、ＬＴＲに標識化された２９３細胞の６００−６５０ｎｍで収集されたＯＰＭ映像であり、（ｅ、ｊ）は、得られた映像を同様に位置させた（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚｅｄ）映像である。ここで、一光子及び二光子励起は、それぞれ５４３ｎｍ及び７８０ｎｍであり、スケール棒は３０μｍであり、また表われた細胞は、重複された実験（ｎ＝５）からの代表映像である。
【０１０３】
図１２及び図１３を参照すれば、同様に位置させた二つの映像は併合されず、さらに１００μＭのＴＰＥＮ（これは、メンブレン透過性のＺｎ２＋キレート化剤としてＺｎ２＋を効果的に除去することができる）で処理した後のＴＰＭ映像はＴＰＥＦをほとんど放出せず、ＴＰＥＮに処理される前、後のＯＰＭ映像がほぼ同一であるということが分かる（図１２、図１３の（ｄ）、（ｉ）参照））。したがって、このような結果は、本発明による二光子染料が酸性小胞体と結合した探針（二光子染料）からの如何なる干渉や妨害なしにＴＰＭによってニューロン内の［Ｚｎ２＋］ｉのみを選択的に検出できるということを表わす。
【０１０４】
＜実験例１０＞
二光子励起蛍光（ＴＰＥＦ）の分析
本発明の二光子染料が有する有用性を表わすために、Ｚｎ２＋の放出を誘導できるように内分泌性ＮＯ供与体である１０ｍＭのＳ−ニトロソシステイン（ＳＮＯＣ）を添加したＡＺｎ２−標識化２９３細胞のＴＰＥＦをモニタリングした後、これを図１４に表わした。
【０１０５】
図１４を参照すれば、ＳＮＯＣ添加後、Ｚｎ２＋の放出によって本発明による二光子染料に標識化された細胞のＴＰＥＦ強度は徐々に増加することが分かる。また、反対にメンブレン透過性のＺｎ２＋キレート化剤としてＺｎ２＋を非常に効果的に除去することができるＴＰＥＮ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（２−ピリジル）エチレンジアミン）０．１ｍＭを添加するによって蛍光強度が急激に落ちることが分かる。本発明によるまた他の二光子染料であるＡＺｎ１のさらに大きなＫｄのために反応程度が相対的に小さなものを除いては、図１３と類似したパターンを表わす。
【０１０６】
以上の実験結果は、また本発明による二光子染料が１０００秒以上の時間の間に生体細胞で［Ｚｎ２＋］ｉを明確に検出できるということを表わす。
【０１０７】
＜実験例１２＞
マウス海馬状突起の微細薄片のモニタリング
組職内細胞の映像化において、本発明の二光子染料が有する有用性を証明するために、マウス海馬状突起の微細薄片をモニタリングしたが、本実験例では、１０μＭのＡＺｎ２で３０分間３７℃でインキュベーションされたマウス海馬状突起の微細薄片に対する二光子顕微鏡映像を得た。生後１４日のラットの薄片は、あまりにも大きくて一つの映像のみを表わしにくいので、〜１２０μｍの厚さに同一平面で得られた複数のＴＰＭ映像を得て、これを結合した。
【０１０８】
図１５は、本実験例によるＴＰＭ映像であり、これをより詳しく説明すれば、（ａ）は、１０ｘ倍率で〜１２０μｍの深さで得られたＴＰＭ映像、（ｂ、ｃ）は、それぞれ２００μＭのＴＰＥＮを添加する前、後のＣＡ３領域の透明層（ｓｔｒａｔｕｍ ｌｕｃｉｄｕｍ）で１００ｘ倍率映像、（ｄ−ｆ）は、〜１００μｍ厚さの歯状回（ｄｅｎｔａｔｅ ｇｙｒｕｓ）の肺門（ｈｉｌｕｓ）でのＴＰＭ映像に、（ｄ、ｅ）は、それぞれ映像化溶液に５０ｍＭのＫＣｌを添加する前、後の映像であり、（ｆ）は、（ｅ）に２００μＭのＴＰＥＮを添加した後の映像である。
【０１０９】
図１５を参照すれば、ＣＡ３の透明層及び歯状回の肺門で強い蛍光強度を表わした（（ａ）の黄色ボックス参照）。より高い倍率で得られた映像は、明確に［Ｚｎ２＋］ｉがＣＡ３領域のピラミッド神経の末端部の苔状線維軸索（ｍｏｓｓｙ ｆｉｂｅｒ ａｘｏｎ）に濃縮されたことを明確に示す（（ｂ）参照）。また、［Ｚｎ２＋］ｉを効果的に除去するＴＰＥＮ添加後、事実上映像でＴＰＥＦが消えることは、前記観察結果を明確に証明する（（ｃ）参照）。
【０１１０】
図１６は、１０μＭのＡＺｎ２で染色されたマウス海馬状突起の微細薄片の歯状回の肺門を表わすｘ２０倍率の二光子顕微鏡映像であって、厚みの深さの変化による二光子顕微鏡映像を表わす。
【０１１１】
図１６を参照すれば、８０−１５０μｍの深さで得られたＴＰＭ（二光子顕微鏡）映像は、ｚ軸深さ（すなわち、厚さ）によって肺門近くに位置する歯状回神経の苔状線維に存在する［Ｚｎ２＋］ｉ分布を明確に示す。また、メンブレンの極性を無くすことで、Ｚｎ２＋の放出を誘導するＫＣｌを５０ｍＭ添加した時、ＴＰＥＦの強度は増加し、ＴＰＥＮで処理した時は減少する。これは、図１５の（ｄ）ないし（ｆ）の結果からも分かり、またマウス海馬状突起の微細薄片の歯状回の肺門に対する相対的二光子蛍光強度を表わす図１７を通じても、ＴＰＥＦ添加によるＴＰＥＦ減少効果を明確に分かる。
【０１１２】
以上の実験結果は、本発明による二光子染料が生体組職の細胞内に存在する自由Ｚｎ２＋を８０ないし１５０μｍの厚さまで非常に効果的に検出できるということを表わす。
【０１１３】
結論的に、本発明による二光子染料は、Ｚｎ２＋に対して２４ないし５２倍のＴＰＥＦ増加効果を有し、それぞれ１．１±０．１及び０．５０±０．０４ｎＭの解離定数（ＫｄＴＰ）を有する。また、生物学的に連関したｐＨ条件でｐＨに影響を受けず、従来のＺｎ２＋を検出するための二光子染料であるＴＳＱ及びＦｌｕＺｉｎ−３に比べて４ないし２４倍以上の強いＴＰＥＦを発生させる。また、本発明による二光子染料は、１０００秒以上の時間範囲で細胞内の自由Ｚｎ２＋を選択的な検出することができるが、これは、従来の如何なる二光子染料より優れた特性である。さらに、本発明による二光子染料は、メンブレン結合二光子染料または他の金属イオンによる干渉や妨害を受けず、非常に効果的に細胞内の遊離亜鉛イオンのみを映像化して、モニタリング可能にする。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
本発明は、細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング用の二光子染料、その製造方法及びそれを利用した細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング方法に関連する分野に適用されうる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング用の二光子染料、その製造方法及びそれを利用した細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング方法に係り、さらに具体的には、生きている細胞をより深く長期間探知することができる細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイム映像に適した二光子染料、その製造方法及びそれを利用した細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
亜鉛は、酵素及びタンパク質の必須要素であって、脳では、細胞質内遊離亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）の数ミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌｅ）がシナプス小胞内に貯蔵されており、シナプス駆動によって放出されて、呼吸神経伝達を調節すると知られている。亜鉛の生物学的役割を理解するために、キノリン（ＴＳＱ、Ｚｉｎｑｕｉｎ、及びＴＦＬＺｎ）及び蛍光体（ＦｌｕＺｎ−３、Ｚｎｐｙｒ、ＺｎＡＦなど）から誘導された多様な蛍光探針物質が開発されて来た。
【０００３】
しかし、これらの大部分はかなり短い励起波長を要求するか、ｐＨに敏感であるという限界があった。表面組成物質（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｒｔｉｆａｃｔ）の干渉なしに表面から一定深さ（特に＞８０μｍ）以上の生きている組職内部で生物学的活性を視覚化するためには、低い励起エネルギーを有する二光子を活用する二光子顕微鏡（ＴＰＭ）が非常に効果的である。特に、励起のために２個の近赤外線光子を採用するＴＰＭは、一光子顕微鏡に比べてさまざまな長所を提供することができるが、具体的に増加した透過深さ、局所化された励起、及び観測時間の増加などがまさにそれである。
【０００４】
しかし、このような長所をいずれも有し、Ｚｎ２＋を効果的にモニタリングできる二光子染料は、現在ほとんど開示されていない実情である。Ｚｎ２＋に対する幾つかのｐＨ−抵抗性を有するセンシング物質（ｓｅｎｓｏｒ）が報告はされているが、これも細胞質に適用するためには、微少注入せねばならない問題があり、また低水溶解度に起因してエタノールのような共溶媒を相当量使わなければならない問題がある。
【０００５】
したがって、亜鉛イオンに対して効果的な二光子染料として細胞を染色させるために、十分な水溶解度、亜鉛イオンに対する高い選択度、相当な二光子断面積（ｔｗｏ ｐｈｏｔｏｎ ｃｒｏｓｓ ｓｅｃｔｉｏｎ）、ｐＨ−抵抗性、及び高い光安定性などのような特性をいずれも満足する細胞質内の遊離亜鉛イオンモニタリング用の二光子染料は、現在全くない実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が果そうとする一番目の技術的課題は、生体内、特に細胞質内に存在する遊離亜鉛イオンをより効果的かつ選択的にモニタリングできる二光子染料を提供することである。
【０００７】
本発明が果そうとする二番目の技術的課題は、前記二光子染料の製造方法を提供することである。
【０００８】
また、本発明が果そうとする三番目の技術的課題は、前記二光子染料を利用した細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、前記一番目の技術的課題を果たすために、化学式１の細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング用の二光子染料を提供する：
【００１０】
【化１】
【００１１】
前記式１で、Ｒは、水素またはＯＣＨ３である。
【００１２】
前記二番目の課題を果たすために、本発明は、
（ａ）下記化学式２の化合物を有機溶媒に混入した後、撹拌して第１混合物を収得する段階と、
【００１３】
【化２】
【００１４】
（ｂ）前記収得された第１混合物に下記化学式３の化合物を添加、反応させて前記化学式１の化合物を合成する段階と、を含む細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング用の二光子染料の製造方法を提供する。
【００１５】
【化３】
【００１６】
本発明による二光子染料の製造方法は、前記三番目の課題を果たすために、前記（ｂ）段階後、前記（ｂ）段階の結果物から前記化学式１の混合物を分離する段階をさらに含み、前記分離は、抽出工程によって遂行される。また、本発明の一実施例で、前記有機溶媒は、１，３−ヒドロキシベンゾトリアゾール及び１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドを含む。
【００１７】
前記三番目の課題を果たすための本発明は、前記化学式１の二光子染料を観察対象となる細胞質内に注入した後、放出される二光子励起蛍光（ＴＰＥＦ）映像を観察する段階を含む細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング方法を提供する。前記二光子励起蛍光映像は、前記観察対象の表面から８０ないし１５０μｍの深さ以内に存在する細胞質から放出される。また、前記二光子蛍光映像の観察段階は、１０００秒以上進行することを特徴とする細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明による二光子染料は、Ｚｎ２＋に対して２４ないし５２倍のＴＰＥＦ増加効果を有し、それぞれ１．１±０．１及び０．５０±０．０４ｎＭの解離定数（ＫｄＴＰ）を有する。また、生物学的に連関したｐＨ範囲でｐＨ条件に影響を受けず、従来のＺｎ２＋を検出するための二光子染料であるＴＳＱ及びＦｌｕＺｉｎ−３などに比べて４ないし２４倍以上の増加した強度のＴＰＥＦを発生させる。また、本発明による二光子染料は、１０００秒以上の時間範囲で細胞内の自由Ｚｎ２＋を選択的な検出することができるが、これは従来の如何なる二光子染料より優れた特性である。さらに、本発明による二光子染料は、メンブレン結合二光子染料または他の金属イオンによる干渉や妨害を受けず、非常に効果的に細胞内の遊離亜鉛イオンのみを映像化して、モニタリング可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】図１Ａは、異なる濃度の二光子染料に対する蛍光強度を表わすグラフである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、異なる濃度の二光子染料に対する蛍光強度を表わすグラフである。
【図１Ｃ】図１Ｃは、異なる濃度の二光子染料に対する蛍光強度を表わすグラフである。
【図１Ｄ】図１Ｄは、異なる濃度の二光子染料に対する蛍光強度を表わすグラフである。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明の実施例２の二光子染料に対する一光子吸収及び発光スペクトルである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明の実施例２の二光子染料に対する一光子吸収及び発光スペクトルである。
【図２Ｃ】図２Ｃは、実施例１の二光子染料に対する一光子吸収及び発光スペクトルである。
【図２Ｄ】図２Ｄは、実施例１の二光子染料に対する一光子吸収及び発光スペクトルである。
【図３Ａ】図３Ａは、発明によるＭｇ２＋濃度変化による二光子染料の一光子または二光子吸光または発光スペクトルである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、発明によるＭｇ２＋濃度変化による二光子染料の一光子または二光子吸光または発光スペクトルである。
【図３Ｃ】図３Ｃは、発明によるＭｇ２＋濃度変化による二光子染料の一光子または二光子吸光または発光スペクトルである。
【図３Ｄ】図３Ｄは、発明によるＭｇ２＋濃度変化による二光子染料の一光子または二光子吸光または発光スペクトルである。
【図３Ｅ】図３Ｅは、発明によるＭｇ２＋濃度変化による二光子染料の一光子または二光子吸光または発光スペクトルである。
【図３Ｆ】図３Ｆは、発明によるＭｇ２＋濃度変化による二光子染料の一光子または二光子吸光または発光スペクトルである。
【図４Ａ】図４Ａは、それぞれＡＺｎ１及びＡＺｎ２と自由Ｚｎ２＋との錯化に対するヒルグラフである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、それぞれＡＺｎ１及びＡＺｎ２と自由Ｚｎ２＋との錯化に対するヒルグラフである。
【図５】Ｂ３ＬＹＰ／６−３１Ｇ＊レベルでＡＺｎ１−Ｚｎ２＋及びＡＺｎ２−Ｚｎ２＋の錯化合物の最適化された幾何学的構造を表わす立体図である。
【図６Ａ】図６Ａは、それぞれ実施例２の二光子染料（ＡＺｎ１）及び実施例１の二光子染料（ＡＺｎ２）の蛍光適正曲線を表わす。
【図６Ｂ】図６Ｂは、それぞれ実施例２の二光子染料（ＡＺｎ１）及び実施例１の二光子染料（ＡＺｎ２）の蛍光適正曲線を表わす。
【図７Ａ】図７Ａは、それぞれ３０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝溶液（１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、ｐＨ７．２）とＮａ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋；１０μＭのＭｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋、Ｃｄ２＋及び１μＭのＺｎ２＋を添加した場合、１μＭのＡＺｎ１及びＡＺｎ２の相対的蛍光強度を表わすグラフである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、それぞれ３０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝溶液（１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、ｐＨ７．２）とＮａ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋；１０μＭのＭｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋、Ｃｄ２＋及び１μＭのＺｎ２＋を添加した場合、１μＭのＡＺｎ１及びＡＺｎ２の相対的蛍光強度を表わすグラフである。
【図８Ａ】図８Ａは、３０ｍＭのＭＯＰＳ及び１００ｍＭのＫＣｌ混合溶液で自由Ｚｎ２＋が０．０（白丸）及び１μＭ（黒四角）である時、１μＭのＡＺｎ１及びＡＺｎ２のｐＨ変化による一光子蛍光強度を表わす。
【図８Ｂ】図８Ｂは、３０ｍＭのＭＯＰＳ及び１００ｍＭのＫＣｌ混合溶液で自由Ｚｎ２＋が０．０（白丸）及び１μＭ（黒四角）である時、１μＭのＡＺｎ１及びＡＺｎ２のｐＨ変化による一光子蛍光強度を表わす。
【図９】１．８μＭ自由Ｚｎ２＋の条件でＡＺｎ１（白四角）、ＡＺｎ２（黒丸）、ＦｌｕＺｉｎ（黒三角）及びＴＳＱ（白逆三角）に対する二光子動作スペクトルを表わす。
【図１０】２μＭ ＡＺｎ２−標識化２９３細胞の二光子顕微鏡（ＴＰＭ）映像である。
【図１１】２μＭ ＡＺｎ１−標識化２９３細胞のＴＰＭ映像である。
【図１２】ＡＺｎ２及びＬＴＲ−標識化された（２μＭ）２９３細胞に対するＴＰＭ映像である。
【図１３】ＡＺｎ１及びＬＴＲ−標識化（２μＭ）２９３細胞のＴＰＭ映像である。
【図１４】１０ｍＭのＳ−ニトロソシステイン（ＳＮＯＣ）を添加したＡＺｎ２−標識化２９３細胞のＴＰＥＦのスペクトルである。
【図１５】マウス海馬状突起の微細薄片に対するＴＰＭ映像である。
【図１６】１０μＭのＡＺｎ２で染色されたマウス海馬状突起の微細薄片の歯状回の肺門に対するＴＰＭ映像である。
【図１７】マウス海馬状突起の微細薄片の歯状回の肺門に対する相対的二光子蛍光強度を表わすグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、添付図面及び実施例を参照して、本発明をより詳しく説明する。
【００２１】
本発明は、前記化学式１の構造を有する化合物を細胞質内遊離亜鉛モニタリング用の二光子染料として提供する。本発明による二光子染料は、前記蛍光部位（発光端）にアセチル−６−（ジメチルアミノ）ナフタレン（アセタン）、亜鉛イオンのキレート基として、Ｎ，Ｎ−ジ−（２−ピコリル）エチレンジアミン（ＤＰＥＮ）の誘導体が結合した構造を有する。特に、本発明は、前記構造の二光子染料を遊離亜鉛イオンの二光子染料として使う場合、細胞質内の遊離亜鉛イオンを長期間映像化することが可能であり、さらに、特に呉標的化または光ブリーチイングのような問題なしに８０μｍ以上の深さでも、遊離亜鉛の映像化を可能にする。
【００２２】
以下、本発明による細胞質内遊離亜鉛イオンの二光子染料の製造方法を説明し、前記二光子染料が有する優れた特性は、下記実験例を通じて説明する。
【００２３】
＜実施例１＞
Ｎ−（４−（２−（ビス（（ピリジン−２−イル）メチル）アミノ）エチルアミノ）−３−メトキシフェニル）−２−（Ｎ−（２−アセチルナフタレン−６−イル）−Ｎ−メチルアミノ）アセトアミドの合成
【００２４】
＜実施例１−１＞
Ｎ−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）エチレンジアミンの合成
２−クロロ−５−ニトロアニソール（３．０ｇ、１６．０ｍｍｏｌ）及びエチレンジアミン（７．７ｇ、８．６ｍＬ、０．１３ｍｏｌ）を水（１８０ｍＬ）に混入させた後、１１０℃の温度で７２時間撹拌した。撹拌後、得られた混合物をエチルアセテートを利用、抽出した後、ＭｇＳＯ４を利用、乾燥させ、真空条件で濾過、濃縮させた。以後、クロロホルム／メタノール（５：１）を溶離液とするフラッシュカラムクロマトグラフィーを用いて前記濃縮後、得られた未精製生成物を精製し、エタノールから再結晶化を通じてさらに精製した。これにより、下記化学式４の化合物を得た。
【００２５】
【化４】
【００２６】
収得２．０ｇ（６０％）；ｍｐ１８３℃；ＩＲ（ＫＢｒ）：３４４０、２９６０、２８９０ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．９１（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．９、Ｊ＝２．１Ｈｚ）、７．６３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．１Ｈｚ）、６．５２（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．９Ｈｚ）、５．４１（ｂｒ ｓ、１Ｈ）、３．９４（ｓ、３Ｈ）、３．３１（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝５．４Ｈｚ）、３．０３（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝５．４Ｈｚ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１７１．８、１４５．４、１４４．４、１２０．１、１０６．６、１０４．９、５６．２、４３．４、３９．１ｐｐｍ；Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ９Ｈ１３Ｎ３Ｏ３：Ｃ、５１．７３；Ｈ、６．５１；Ｎ、１９．４４．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、５１．３８；Ｈ、６．２０；Ｎ、１９．２９。
【００２７】
＜実施例１−２＞
Ｎ−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−Ｎ’，Ｎ’−［ビス（２−ピリジルメチル）］エチレンジアミンの合成
前記実験例１−１の化合物、２−（クロロメチル）ピリジン塩酸塩（２．９ｇ、１７．５ｍｍｏｌ）、ＫＩ（０．５２ｇ、３．０ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２０ｇ、２７ｍＬ、０．１６ｍｏｌ）をアセトニトリル（５０ｍＬ）に混入させた後、窒素条件下で１６時間還流させた。還流後、得られた混合物をエチルアセテートを利用、抽出し、ＭｇＳＯ４を利用、乾燥させた後、真空条件で濾過、濃縮させた。以後、クロロホルム／メタノール（４：１ないし１：１）を溶離液とするフラッシュカラムクロマトグラフィーを用いて前記濃縮後、得られた未精製生成物を精製して、下記化学式５の化合物を精製した。
【００２８】
【化５】
【００２９】
収得２．２ｇ（９０％）；ＩＲ（ＫＢｒ）：３４２８ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．５５（ｄｄ、２Ｈ、Ｊ＝５．０、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、７．８５（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９．０、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、７．６４（ｔｄ、２Ｈ、Ｊ＝７．５、２．０Ｈｚ）、７．６２（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、７．４４（ｄｄ、２Ｈ、Ｊ＝７．５、１．０Ｈｚ）、７．１７（ｄｄｄ、２Ｈ、Ｊ＝７．５、５．０、１．０Ｈｚ）、６．３６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９．０Ｈｚ）、６．１０（ｂｒ ｓ、１Ｈ）、３．９９（ｓ、３Ｈ）、３．９２（ｓ、４Ｈ）、３．２９（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝５．４Ｈｚ）、２．９３（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝５．４Ｈｚ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１７０．５、１５９．０、１４９．２、１４５．５、１４４．５、１３７．０、１２３．７、１２２．６、１２０．１、１０６．７、１０４．９、６０．１、５２．９、３７．６、２３．３ｐｐｍ；Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２１Ｈ２３Ｎ５Ｏ３：Ｃ、６４．２８；Ｈ、５．９９；Ｎ、１７．２４．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、６４．１１；Ｈ、５．８９；Ｎ、１７．８０。
【００３０】
＜実施例１−３＞
Ｎ−（４−アミノ−２−メトキシフェニル）−Ｎ’，Ｎ’−［ビス（２−ピリジルメチル）］エチレンジアミンの合成
実施例１−２の混合物（１．２ｇ、３．００ｍｍｏｌ）及びＳｎＣｌ２・Ｈ２Ｏ（７．４ｇ、３３ｍｍｏｌ）の混合物をアセトニトリル（５０ｍＬ）及び無水エタノール（４０ｍＬ）で１２時間還流させた後、１００ｍＬの飽和炭酸ナトリウム１００ｍＬで中和させ、ジクロロメタンで抽出した。以後、クロロホルム／メタノール（２０：３）を溶離液とするフラッシュカラムクロマトグラフィーを用いて前記得られた未精製生成物を精製して、下記化学式６の化合物を得た。
【００３１】
【化６】
【００３２】
収得０．９ｇ（８０％）；ＩＲ（ＫＢｒ）：３４１９ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．５０（ｄｄ、２Ｈ、Ｊ＝Ｊ＝５．０、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、７．６３（ｔｄ、２Ｈ、Ｊ＝７．５、２．０Ｈｚ）、７．５３（ｄｄ、２Ｈ、Ｊ＝７．５、１．０Ｈｚ）、７．１３（ｄｄｄ、２Ｈ、Ｊ＝７．５、５．０、１．０Ｈｚ）、６．３９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９．０Ｈｚ）、６．２７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、６．２２（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９．０、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、３．８６（ｓ、４Ｈ）、３．８４（ｓ、３Ｈ）、３．１５（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝５．４Ｈｚ）、２．８８（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝５．４Ｈｚ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５９．６、１４９．１、１４８．４、１３７．６、１３６．７、１３１．２、１２３．２、１２２．３、１１２．０、１０７．９、１００．１、６０．５、５５．７、５３．４、４２．３ｐｐｍ；Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２１Ｈ２５Ｎ５Ｏ：Ｃ、６９．５５；Ｈ、６．８９；Ｎ、１８．９８．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、６９．４０；Ｈ、６．９３；Ｎ、１９．２７。
【００３３】
＜実施例１−４＞
遊離亜鉛イオンモニタリング用の二光子染料（ＡＺｎ２）の合成
６−アシル−２−［Ｎ−メチル−Ｎ−（カルボキシメチル）アミノ］ナフタレン（０．０７ｇ、０．２７ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（０．０３７ｇ、０．２７ｍｍｏｌ）、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．０５７ｇ、０．２８ｍｍｏｌ）をジクロロメタンに混入させた後、３０分間撹拌した。以後、前記実施例１−４で得られた化学式６の化合物を添加した後、窒素条件下で１２時間撹拌し、得られた生成物をジクロロメタンで抽出し、ＭｇＳＯ４を利用、乾燥させた後、溶媒は真空条件で除去した。以後、クロロホルム／メタノール（２０：１）を溶離液とするフラッシュカラムクロマトグラフィーを用いて前記得られた未精製生成物を精製して、下記化学式７の遊離亜鉛イオンモニタリング用の二光子染料を合成した。
【００３４】
【化７】
【００３５】
＜実施例２＞
遊離亜鉛イオンモニタリング用の二光子染料（ＡＺｎ１）の合成
実施例１−３の化学式６の化合物の代わりに、下記化学式８の化合物を使ったものを除いては、実施例１−４と同じ方法で化学式９の二光子染料を合成した。
【００３６】
【化８】
【００３７】
【化９】
【００３８】
＜実験例１＞
水溶解度の測定
本発明による実施例１及び実施例２の二光子染料（ＡＺｎ２及びＡＺｎ１）少量をＤＭＳＯに溶解させてストック溶液（１．０ｘ１０−３Ｍ）を準備した。以後、前記溶液を（６．０ｘ１０−３ないし６．０ｘ１０−５）Ｍで希釈させてマイクロ注射器を利用、３．０ｍＬの水を含有するキュベットに添加した。あらゆる場合、水でＤＭＳＯ濃度は０．２％を保持した。
【００３９】
図１Ａないし図１Ｄは、異なる濃度の二光子染料に対する蛍光強度を表わすグラフである。
【００４０】
それぞれＡＺｎ２及びＡＺｎ１に対する濃度対比蛍光強度を表わす図１Ｂ及び図１Ｄを説明すれば、染料濃度に対する蛍光強度のグラフは、低濃度で線形を表わすが、高濃度に行くほど下側に落ちる。この場合、染料の水溶解度は、線形パターンを表わす最高濃度で決定され、本発明による二つの染料いずれも３．０μＭの水溶解度を表わした。
【００４１】
したがって、本発明による二光子染料が有する３．０μＭ以上の水溶解度は、細胞の染色において非常に効果的であるということを表わす。
【００４２】
＜実験例２＞
吸光スペクトルの測定
本発明による二光子染料の吸光スペクトルをＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ８４５３ダイオード整列スペクトロメーター上で測定し、蛍光スペクトルを１ｃｍ標準石英セルを備えたＡｍｉｃｏ−Ｂｏｗｍａｎ ｓｅｒｉｅｓ２発光スペクトロメーターを使って測定した。蛍光量子収率は、参考文献の従来文献に開示したことによってクマリン（Ｃｏｕｍａｒｉｎ）３０７を使って測定した。
【００４３】
図２Ａ及び図２Ｂは、本発明による二光子染料であるＡＺｎ１の一光子吸収及び発光スペクトルであり、図２Ｃ及び図２Ｄは、本発明による二光子染料であるＡＺｎ２に対する一光子吸収及び発光スペクトルである。
【００４４】
また、下記表１は、多様な溶媒条件で本発明に実施例２及び実施例１の二光子染料（ＡＺｎ１及びＡＺｎ２）が有する最大発光波長（λｍａｘ（ｌ））、最大蛍光波長（λｍａｘｆｌ）及び蛍光量子収率を表わす。
【００４５】
【表１】
【００４６】
＊：カッコ内の数値は、溶媒極性に対する正規化された経験的パラメータである。λｍａｘはｎｍ単位であり、また蛍光量子収率±１５％。
【００４７】
図２Ａないし図２Ｄ及び前記表１を参照すれば、１，４−ジオキサン（ｄｉｏｘａｎｅ）＜ＤＭＦ＜ＥｔＯＨ＜Ｈ２Ｏの順序で溶媒極性が増加するにつれて大きな赤色移動（ｂａｔｈｏｃｈｒｏｍｉｃ ｓｈｉｆｔ）が観察されるという点は、本発明による二光子染料が極性探針子として非常に有用であるということを表わす。
【００４８】
＜実験例３＞
Ｚｎ２＋濃度変化による吸光度の変化測定
本発明によるＺｍ２＋濃度変化による二光子染料（ＡＺｎ２、ＡＺｎ１）の一光子または二光子吸光または発光スペクトルを測定し、これを図３Ａないし図３Ｆに示した。
【００４９】
図３Ａないし図３Ｆから分かるように、ＭＯＰＳバッファ溶液中の実施例１及び実施例２の二光子染料（ＡＺｎ２、ＡＺｎ１）（３０ｍＭ、ｐＨ７．２、Ｉ−＝０．１０）にＺｎ２＋を微細に増分しながら添加した時、二光子励起蛍光（発光）強度及び一光子励起蛍光強度は徐々に増加するが、吸収スペクトルには如何なる影響がなかった。これは、Ｚｎ２＋との錯化（ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ）による光誘導電子−伝達（ｐｈｏｔｏｉｎｄｕｃｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＰＥＴ）過程の遮断に起因したと推測される。
【００５０】
＜実験例４＞
常用探針との二光子スペクトルの特性比較
一光子蛍光及び二光子蛍光方法のうち、実施例１の二光子染料（ＡＺｎ２）が有する蛍光増加因子（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｆａｃｔｏｒ）［ＦＥＦ＝（Ｆ−Ｆｍｉｎ）／Ｆｍｉｎ］は、実施例２の二光子染料（ＡＺｎ１）が有する蛍光強化因子より２．５倍以上大きいが、これは、過剰のＺｎ２＋がない場合、実施例１の二光子染料が実施例２の二光子染料よりさらに低い蛍光量子収率（Φ）を有するのに比べて、過剰のＺｎ２＋が存在する場合、実施例１の二光子染料（ＡＺｎ２）が実施例２の二光子染料（ＡＺｎ１）よりさらに大きな量子収率（Φ）を有するためである。
【００５１】
このような分析結果は、下記表３の測定結果からより容易に理解されうる。
【００５２】
【表２】
【００５３】
前記測定結果は、いずれも２０ｍＭ ＭＯＰＳ、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、ｐＨ７．２の条件下でＺｎ２＋を添加するか、添加しない場合に分けて測定した。また、λｍａｘはｎｍ単位であって、一光子吸光及び発光スペクトルであり、Ｚｎ２＋の解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ）は、一光子（ＫｄＯＰ）及び二光子方法（ＫｄＴＰ）によって測定し、蛍光増加因子も一光子方法（ＯＰ）及び二光子方法によって測定した。λｍａｘ（２）は、ｎｍ単位の二光子励起スペクトルを意味し、δは、光子当たりピーク二光子断面積で１０−５ｃｍ４ｓの単位を有し、Φδは、二光子動作断面積（ｔｗｏｐｈｏｔｏｎ ａｃｔｉｏｎ ｃｒｏｓｓ−ｓｅｃｔｉｏｎ）を表わす。前記測定結果のうち、二光子励起蛍光強度はあまりにも弱くて断面積を正確に測定できなかったために、これをｎｄで表わし、ＴＳＱ＋Ｚｎ２＋の測定結果は、メタノールでＺｎ２＋の存在下で得られた数値である。
【００５４】
＜実験例５＞
コンピュータ分析
Ｎ，Ｎ−ジ−２−ピコリルエチレンジアミン（ＤＰＥＮ、Ｒ１）、２−メトキシ−ＤＰＥＮ（Ｒ２）及びＡＺｎ１とＡＺｎ２とのＺｎ錯化合物（ＡＺｎ１−Ｚｎ２＋、ＡＺｎ２−Ｚ２＋）の幾何学的構成をガウス０３プログラムで実行される密度機能理論（ＤＦＴ）でＢ３ＬＹＰ／６−３１Ｇレベルを利用、最適化した。計算されたＨＯＭＯ及びＬＵＭＯエネルギーを下記表３に表わした。
【００５５】
【表３】
【００５６】
表３を参照すれば、あらゆる場合、ＣＨ３Ｏ基は、ＨＯＭＯエネルギーレベルを上昇させることが分かる。このような傾向性は、分子がより複雑になる場合、すなわち、Ｒ＞ＡＺｎ＞ＡＺｎ−Ｚｎ２＋に行くほど弱化される。これは、Ｒ２のＨＯＭＯからＡＺｎ２への電子移動は、Ｒ１からＡＺｎ１に進行する場合よりさらに大きなエネルギー、すなわち、さらに大きな熱を発散することを意味する（発熱反応）。また、ＤＰＥＮ（Ｒ１）、２−メトキシ−ＤＰＥＮ（Ｒ２）、ＡＺｎ１及びＡＺｎ２のＨＯＭＯエネルギーは、それぞれ−４．９４８、−４．２４６、−８．７６２及び８．７３３ｅＶということが分かるが、これは、結局Ｒ２からＡＺｎ２へのＰＥＴは、熱力学的観点でさらに効果的に起き、その結果、Φを落とす。一方、ＡＺｎ２−Ｚｎ２＋のさらに大きなΦ（表２参照）は、さらに強い結合からその理由を捜すことができるが、強い結合は振動緩和経路を減少させるためである。
【００５７】
図４Ａ及び図４Ｂは、それぞれＡＺｎ１及びＡＺｎ２と自由Ｚｎ２＋との錯体に対するヒルグラフ（Ｈｉｌｌ ｐｌｏｔ）である。
【００５８】
前記図４Ａ及び図４Ｂを参照すれば、傾きが１である直線で表われたヒルグラフは、Ｚｎ２＋と本発明による二光子染料とは１：１で錯化合物を形成することを表わす。
【００５９】
さらに、最適化されたＡＺｎ１−Ｚｎ２＋及びＡＺｎ２−Ｚｎ２＋錯体の幾何学的構造は、三角状の二重ピラミッド構造であり、ここで、Ｚｎ２＋イオンは、４個の窒素原子及び一つの水分子によって配位され、これは、Ｂ３ＬＹＰ／６−３１Ｇ＊レベルでＡＺｎ１−Ｚｎ２＋及びＡＺｎ２−Ｚｎ２＋の錯化合物の最適化された幾何学的構造を表わした図５を通じても分かる。
【００６０】
また、ＡＺｎ１−Ｚｎ２＋とＡＺｎ２−Ｚｎ２＋複合体の結合長と結合角とをＢ３ＬＹＰ／６−３１Ｇ＊＊レベルで計算して、下記表４に表わした。
【００６１】
【表４】
【００６２】
＜実施例６＞
解離定数（ＫｄＯＰ及びＫｄＴＰ）の決定
多様な量のＺｎＳＯ４及び１０ｍＭのＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）を含有するＭＯＰＳ（４−モルホリンプロパンスルホン酸）緩衝溶液（３０ｍＭ、ｐＨ７．２、０．１Ｍ ＫＣｌ）を準備した。
【００６３】
自由Ｚｎ２＋の濃度（［Ｚｎ２＋］ｆｒｅｅ）を下記数式１を用いてＫＺｎ−ＥＧＴＡａｐｐ，［ＥＧＴＡ］ｔｏｔａｌ及び［Ｚｎ２＋］ｔｏｔａｌから計算した。
【００６４】
【数１】
【００６５】
ここで、
【００６６】
【数２】
【００６７】
及び、
【００６８】
【数３】
【００６９】
である。
【００７０】
したがって、
【００７１】
【数４】
【００７２】
になる。
【００７３】
以後、ＥＧＴＡ（ＫＺｎ−ＥＧＴＡ）のＺｎ２＋錯体の安定性定数を公知された方法によって得て、したがって、ＥＧＴＡ（ｐＨ７．２、０．１Ｍ ＫＣｌ、２５℃）に対して、ｐＫ１＝９．４０、ｐＫ２＝８．７９、ｐＫ３＝２．７０、ｌｏｇＫＺｎ−ＥＧＴＡ＝１２．６が得られる。
【００７４】
０．１Ｍイオン強度でワークアウトされる時、すべての陽性子化定数は０．１１ほど上側に補正され、［ＥＧＴＡ］ｔｏｔａｌは１０ｍＭで固定され、［Ｚｎ２＋］ｔｏｔａｌは０ないし９．５ｍＭの範囲である。
【００７５】
各溶液に対する計算された［Ｚｎ２＋］ｆｒｅｅ濃度は、下記表５のようである。
【００７６】
【表５】
【００７７】
二光子染料に対する明確な解離定数を決定するために、前記図３Ｂ及び図３Ｅから下記数式５を用いて蛍光適正曲線を求めた。
【００７８】
【数５】
【００７９】
ここで、Ｆは蛍光強度、Ｆｍａｘは最高蛍光強度であり、ＦｏはＺｎ２＋がない条件での蛍光強度、［Ｚｎ２＋］ｆｒｅｅは自由Ｚｎ２＋濃度を表わす。
【００８０】
図６Ａ及び図６Ｂは、それぞれ実施例２の二光子染料（ＡＺｎ１）及び実施例１の二光子染料（ＡＺｎ２）の蛍光適正曲線を表わす。
【００８１】
数式５による適正曲線（図２Ｃ）に最もよく符合されるＫｄ数値を商用アクセルプログラムを使って計算した。また、二光子過程でのＫｄ数値を決定するために、７８０ｎｍの波長及び１１８０ｍＷの出力にセッティングされ（焦点平面からおおよそ１０ｍＷに該当）、モードロックされたチタン−サファイアレーザ光源（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ、９０ＭＨｚ、２００ｆｓ）によって励起されるＤＭ ＩＲＥ２ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｌｅｉｃａ）を使ってＴＰＥＦスペクトルを得た。ＴＰＥＦ適正曲線（図３Ａ及び図３Ｄ）を得て、これを前記数式５にフィッティングさせた（図６Ａ及び図６Ｂ）。
【００８２】
図６Ａ及び図６Ｄを参照すれば、一光子蛍光適正曲線及び二光子蛍光適正曲線から計算されたＡＺｎ１及びＡＺｎ２の解離定数ＫｄＯＰ及びＫｄＴＰは、それぞれ１．１±０．１及び０．５０±０．０４ｎＭである（前記表２参照）。この際、これら二光子染料の検出限界は、ｎＭ範囲以下である。特に、ここで注目しなければならない点は、ＡＺｎ２のＫｄＴＰ値がさらに小さいということであるが、これは前述したように、ＡＺｎ２及びＺｎ２＋間のより強い結合（前記表３及び図５参照）を意味する。
【００８３】
＜実施例７＞
金属陽イオンに対する選択性の測定
図７Ａ及び図７Ｂは、それぞれ３０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝溶液（１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、ｐＨ７．２）とＮａ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋；１０μＭのＭｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋、Ｃｄ２＋及び１μＭのＺｎ２＋を添加した場合、１μＭのＡＺｎ１及びＡＺｎ２の相対的蛍光強度を表わすグラフである。グラフのうち、内部が満たされた棒はＺｎ２＋が添加された場合であり、内部が満たされていない棒はＺｎ２＋が添加されていない場合である。
【００８４】
図７Ａ及び図７Ｂを参照すれば、本発明による二光子染料は、Ｎａ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋；１０μＭのＭｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋、Ｃｄ２＋と比べてＺｎ２＋に対する高い選択度を示す。
【００８５】
図８Ａ及び図８Ｂは、３０ｍＭのＭＯＰＳ及び１００ｍＭのＫＣｌ混合溶液で自由Ｚｎ２＋が０．０（白丸）及び１μＭ（黒四角）である時、１μＭのＡＺｎ１及びＡＺｎ２のｐＨ変化による一光子蛍光強度を表わす。
【００８６】
図８Ａ及び図８Ｂを参照すれば、本発明による二光子染料は、生物学的に連関したｐＨ条件で高い蛍光強度を表わし、ｐＨ条件によって影響を受けないということが分かる。
【００８７】
以上の結果から本発明による二光子染料は、Ｚｎ２＋で非常に高い選択性を有し、さらに生体内のｐＨ条件に敏感ではなく、生体内亜鉛イオンに対する二光子染料として非常に有用であるということが分かる。
【００８８】
＜実施例８＞
二光子断面積及び動作スペクトルの測定
二光子断面積（δ）をフェムト秒（ｆｓ）蛍光測定技術を使って測定した。
【００８９】
ＡＺｎ１、ＡＺｎ２、ＦｌｕＺｉｎ及びＴＳＱを３０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝溶液（１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、ｐＨ７．２）で５．０×１０−６Ｍの濃度で溶解させた後、二光子染料の特性が文献上によく知られたフルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）を対照物質として７４０−９４０ｎｍで二光子誘導蛍光強度を測定した。対照物質及びサンプルの二光子誘導蛍光スペクトルの強度を測定し、ＴＰＡ断面積は、下記数式６によって計算した。
【００９０】
【数６】
【００９１】
図９は、１．８μＭ自由Ｚｎ２＋の条件でＡＺｎ１（白四角）、ＡＺｎ２（黒丸）、ＦｌｕＺｉｎ（黒三角）及びＴＳＱ（白逆三角）に対する二光子動作スペクトルを表わす。
【００９２】
図９を参照すれば、緩衝溶液でＡＺｎ１及びＡＺｎ２とＺｎ２＋との錯化合物に対するＴＰ動作スペクトルは、７８０ｎｍで〜９０ＧＭのΦδ値を表わし、これは、ＴＳＱ及びＦｌｕＺｉｎ−３より４ないし２４倍以上大きな数値である。したがって、以上の結果は、本発明による二光子染料によって染色されたサンプルは、従来の二光子染料（ＴＳＱ及びＦｌｕＺｉｎ−３）に比べて顕著に明るい映像を表わすことを意味する。このような結果は、前記表２の結果値からも明確に分かる。
【００９３】
＜実施例９＞
本発明による二光子染料を利用した細胞観察
１０％ＦＢＳ（ＷｅｌＧｅｎｅ）、ペニシリン（１００ユニット／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭ（ＷｅｌＧｅｎｅ）で２９３細胞を培養した。
【００９４】
映像化の二日前に細胞をガラス底皿（Ｇｌａｓｓ−ｂｏｔｔｏｍｅｄ ｄｉｓｈ、ＭａｔＴｅｋ）上に移した後、プレーティングした。標識化のために成長培地を除去し、無ＦＢＳ ＤＭＥＭに取り替えた。細胞を処理した後、５％二酸化炭素下で３０分間３７℃で２μＭセンサーを用いてインキュベーションし、細胞をホスフェート緩衝サリーネ（ＰＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）で３回洗浄した後、無色の無血清培地で１５分間さらにインキュベーションした。生後１日になったラットの大脳皮質（Ｓｐａｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ；ＳＤ）から主要皮質（ｐｒｉｍａｒｙ ｃｏｒｔｉｃａｌ）細胞培養物を取った。１Ｕ／ｍｌのパパイン（ｐａｐａｉｎ、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＮＪ、アメリカ）を含有するＨａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）に大脳皮質を解離させた後、ポリ−Ｄ−リシン及びラミニンコーティングガラスカバースリープ上に１００ないし２００ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２の条件でプレーティングした後、ＣＯ２インキュベーターで２％Ｂ−２７（Ｇｉｂｃｏ）及びペニシリン／ストレプトマイシンを添加した無血清培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｇｉｂｃｏ）の条件で３７℃に保持した。試験管内で７ないし１５日経過後、皮質細胞培養物をＰＢＳで３回洗浄した後、３７℃の温度下で３０分間ＰＢＳから２μＭ ＡＺｎ２でインキュベーションした。
【００９５】
×１００オイル物体、穿孔数（ＮＡ）＝１．３０のスペクトル共焦点及び多光子顕微鏡（ｓｐｅｃｔｒａｌ ｃｏｎｆｏｃａｌ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｈｏｔｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｓ）（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ２）を使ってＡＺｎ２に標識された細胞及び組職の二光子蛍光顕微鏡映像を得た。前記二光子蛍光顕微鏡映像は、モードロックされたチタン−サファイアレーザ光源（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ、９０ＭＨｚ、２００ｆｓ）で波長７８０ｎｍ、出力電力１２３０ｍＷ（これは、焦点面からおおよそ１０ｍＷの平均電力に対応する）で探針（二光子染料）を励起させることで得た。映像をそれぞれ３６０−４６０ｎｍ及び５００−６２０ｎｍ領域の波長で得るために、信号を４００Ｈｚスキャン速度で８ビット未標識された５１２×５１２ピクセルで収集するために内部ＰＭＴが使われた。
【００９６】
図１０Ａないし図１０Ｅは、２μＭ ＡＺｎ２−標識化２９３細胞のＴＰＭ映像であって、それぞれ明るい領域の映像、映像化溶液に１０ｍＭ ＳＮＯＣを添加する前に３６０ないし４６０ｎｍで収集された映像、映像化溶液に１０ｍＭ ＳＮＯＣを添加する前に５００ないし６２０ｎｍで収集された映像、映像化溶液に１０ｍＭ ＳＮＯＣを添加した後に３６０ないし４６０ｎｍで収集された映像、映像化溶液に１０ｍＭ ＳＮＯＣを添加した後に５００ないし６２０ｎｍで収集された映像である。
【００９７】
また、図１１Ａないし図１１Ｅは、２μＭ ＡＺｎ１−標識化２９３細胞のＴＰＭ映像であって、それぞれ明るい領域の映像、映像化溶液に１０ｍＭ ＳＮＯＣを添加する前に３６０ないし４６０ｎｍで収集された映像、映像化溶液に１０ｍＭ ＳＮＯＣを添加する前に５００ないし６２０ｎｍで収集された映像、映像化溶液に１０ｍＭ ＳＮＯＣを添加した後に３６０ないし４６０ｎｍで収集された映像、映像化溶液に１０ｍＭ ＳＮＯＣを添加した後に５００ないし６２０ｎｍで収集された映像である。
図１０Ｂ及び図１１Ｂを参照すれば、本発明による二光子染料（ＡＺｎ１、ＡＺｎ２）に標識化された２９３細胞は、３６０ないし４６０ｎｍでＴＰＥＦ（二光子放出蛍光）を放出しないということが分かる。しかし、図１０Ｃ及び図１１Ｃを参照すれば、５００ないし６２０ｎｍでは相当なＴＰＥＦが放出されることが分かる。
【００９８】
比較例として、Ｍｇ２＋及びＣａ２＋用のアセタン（ａｃｅｄａｎｅ）−誘導ＴＰ二光子染料に標識化された細胞のＴＰＭ映像は、それぞれ３６０ないし４６０ｎｍ及び５００ないし６２０ｎｍでいずれもＴＰＥＦを放出し、これは、それぞれサイトゾル及びメンブレンと結合した二光子染料に起因する（Ｈ．Ｍ．Ｋｉｍ，Ｂ．Ｒ．Ｋｉｍ，Ｊ．Ｈ．Ｈｏｎｇ，Ｊ．−Ｓ．Ｐａｒｋ，Ｋ．Ｊ．Ｌｅｅ，Ｂ．Ｒ．Ｃｈｏ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．２００７，１１９，７５８９−７５９２；Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００７，４６，７４４５−７４４８参照）。
【００９９】
したがって、本発明によるＡＺｎ２は、主にサイトゾル分画構造に位置すると判断され、これは、低い分子量に起因すると推定される。したがって、メンブレン付着探針からの如何なる干渉なしに生体内細胞の［Ｚｎ２＋］ｉを検出することができる。
【０１００】
しかし、さらに本発明による二光子染料は、ｐＨ＜４の条件で蛍光強度が少しずつ増加するために（図８Ａ及び図８Ｂ参照）、酸性小胞体内の二光子染料がＴＰＭ映像化に寄与すると判断することができる余地がある。したがって、このような余地または可能性を排除するために、２９３細胞及び主要皮質培養物を同時にＡＺｎ２及び酸性小胞体用のよく知られた一光子染料ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ（ＬＴＲ）で染色し、これにより得られた映像を同様に位置させた後、図１２及び図１３に表わした。
【０１０１】
図１２は、ＡＺｎ２及びＬＴＲ−標識化された（２μＭ）２９３細胞に対する映像であって、（ａ−ｅ）は、映像化溶液に１００μＭ ＴＰＥ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（２−ピリジル）エチレンジアミン）を添加する前、（ｆ−ｊ）は、添加した後の映像である。より具体的に説明すれば、（ａ、ｆ）は、明るい領域の映像であり、（ｂ、ｇ）及び（ｃ、ｈ）は、それぞれ３６０−４６０ｎｍ及び５００−５８０ｎｍで収集されたＡＺｎ２に標識化された２３９細胞の擬似（ｐｓｅｕｄｏ）色彩化された映像である。また、（ｄ、ｉ）は、６００−６５０ｎｍで収集されたＬＴＲに標識化された２９３細胞のＯＰＭ映像であり、（ｅ、ｊ）は、得られた映像を同様に位置させた（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚｅ）映像である。ここで、一光子及び二光子励起は、それぞれ５４３ｎｍ及び７８０ｎｍであり、スケール棒は３０μｍであり、また表われた細胞は、重複された実験（ｎ＝５）からの代表映像である。
【０１０２】
また、図１３は、ＡＺｎ１及びＬＴＲ−標識化（２μＭ）２９３細胞の映像であって、（ａ−ｅ）は、映像化溶液に１００μＭ ＴＰＥＮ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（２−ピリジル）エチレンジアミン）を添加する前、（ｆ−ｊ）は、添加した後の映像である。より具体的に説明すれば、（ａ、ｆ）は、明るい領域の映像であり、（ｂ、ｇ）及び（ｃ、ｈ）は、それぞれ３６０−４６０ｎｍ及び５００−５８０ｎｍで収集されたＡＺｎ１に標識化された２３９細胞の擬似色彩化された映像である。また、（ｄ、ｉ）は、ＬＴＲに標識化された２９３細胞の６００−６５０ｎｍで収集されたＯＰＭ映像であり、（ｅ、ｊ）は、得られた映像を同様に位置させた（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚｅｄ）映像である。ここで、一光子及び二光子励起は、それぞれ５４３ｎｍ及び７８０ｎｍであり、スケール棒は３０μｍであり、また表われた細胞は、重複された実験（ｎ＝５）からの代表映像である。
【０１０３】
図１２及び図１３を参照すれば、同様に位置させた二つの映像は併合されず、さらに１００μＭのＴＰＥＮ（これは、メンブレン透過性のＺｎ２＋キレート化剤としてＺｎ２＋を効果的に除去することができる）で処理した後のＴＰＭ映像はＴＰＥＦをほとんど放出せず、ＴＰＥＮに処理される前、後のＯＰＭ映像がほぼ同一であるということが分かる（図１２、図１３の（ｄ）、（ｉ）参照））。したがって、このような結果は、本発明による二光子染料が酸性小胞体と結合した探針（二光子染料）からの如何なる干渉や妨害なしにＴＰＭによってニューロン内の［Ｚｎ２＋］ｉのみを選択的に検出できるということを表わす。
【０１０４】
＜実験例１０＞
二光子励起蛍光（ＴＰＥＦ）の分析
本発明の二光子染料が有する有用性を表わすために、Ｚｎ２＋の放出を誘導できるように内分泌性ＮＯ供与体である１０ｍＭのＳ−ニトロソシステイン（ＳＮＯＣ）を添加したＡＺｎ２−標識化２９３細胞のＴＰＥＦをモニタリングした後、これを図１４に表わした。
【０１０５】
図１４を参照すれば、ＳＮＯＣ添加後、Ｚｎ２＋の放出によって本発明による二光子染料に標識化された細胞のＴＰＥＦ強度は徐々に増加することが分かる。また、反対にメンブレン透過性のＺｎ２＋キレート化剤としてＺｎ２＋を非常に効果的に除去することができるＴＰＥＮ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（２−ピリジル）エチレンジアミン）０．１ｍＭを添加するによって蛍光強度が急激に落ちることが分かる。本発明によるまた他の二光子染料であるＡＺｎ１のさらに大きなＫｄのために反応程度が相対的に小さなものを除いては、図１３と類似したパターンを表わす。
【０１０６】
以上の実験結果は、また本発明による二光子染料が１０００秒以上の時間の間に生体細胞で［Ｚｎ２＋］ｉを明確に検出できるということを表わす。
【０１０７】
＜実験例１２＞
マウス海馬状突起の微細薄片のモニタリング
組職内細胞の映像化において、本発明の二光子染料が有する有用性を証明するために、マウス海馬状突起の微細薄片をモニタリングしたが、本実験例では、１０μＭのＡＺｎ２で３０分間３７℃でインキュベーションされたマウス海馬状突起の微細薄片に対する二光子顕微鏡映像を得た。生後１４日のラットの薄片は、あまりにも大きくて一つの映像のみを表わしにくいので、〜１２０μｍの厚さに同一平面で得られた複数のＴＰＭ映像を得て、これを結合した。
【０１０８】
図１５は、本実験例によるＴＰＭ映像であり、これをより詳しく説明すれば、（ａ）は、１０ｘ倍率で〜１２０μｍの深さで得られたＴＰＭ映像、（ｂ、ｃ）は、それぞれ２００μＭのＴＰＥＮを添加する前、後のＣＡ３領域の透明層（ｓｔｒａｔｕｍ ｌｕｃｉｄｕｍ）で１００ｘ倍率映像、（ｄ−ｆ）は、〜１００μｍ厚さの歯状回（ｄｅｎｔａｔｅ ｇｙｒｕｓ）の肺門（ｈｉｌｕｓ）でのＴＰＭ映像に、（ｄ、ｅ）は、それぞれ映像化溶液に５０ｍＭのＫＣｌを添加する前、後の映像であり、（ｆ）は、（ｅ）に２００μＭのＴＰＥＮを添加した後の映像である。
【０１０９】
図１５を参照すれば、ＣＡ３の透明層及び歯状回の肺門で強い蛍光強度を表わした（（ａ）の黄色ボックス参照）。より高い倍率で得られた映像は、明確に［Ｚｎ２＋］ｉがＣＡ３領域のピラミッド神経の末端部の苔状線維軸索（ｍｏｓｓｙ ｆｉｂｅｒ ａｘｏｎ）に濃縮されたことを明確に示す（（ｂ）参照）。また、［Ｚｎ２＋］ｉを効果的に除去するＴＰＥＮ添加後、事実上映像でＴＰＥＦが消えることは、前記観察結果を明確に証明する（（ｃ）参照）。
【０１１０】
図１６は、１０μＭのＡＺｎ２で染色されたマウス海馬状突起の微細薄片の歯状回の肺門を表わすｘ２０倍率の二光子顕微鏡映像であって、厚みの深さの変化による二光子顕微鏡映像を表わす。
【０１１１】
図１６を参照すれば、８０−１５０μｍの深さで得られたＴＰＭ（二光子顕微鏡）映像は、ｚ軸深さ（すなわち、厚さ）によって肺門近くに位置する歯状回神経の苔状線維に存在する［Ｚｎ２＋］ｉ分布を明確に示す。また、メンブレンの極性を無くすことで、Ｚｎ２＋の放出を誘導するＫＣｌを５０ｍＭ添加した時、ＴＰＥＦの強度は増加し、ＴＰＥＮで処理した時は減少する。これは、図１５の（ｄ）ないし（ｆ）の結果からも分かり、またマウス海馬状突起の微細薄片の歯状回の肺門に対する相対的二光子蛍光強度を表わす図１７を通じても、ＴＰＥＦ添加によるＴＰＥＦ減少効果を明確に分かる。
【０１１２】
以上の実験結果は、本発明による二光子染料が生体組職の細胞内に存在する自由Ｚｎ２＋を８０ないし１５０μｍの厚さまで非常に効果的に検出できるということを表わす。
【０１１３】
結論的に、本発明による二光子染料は、Ｚｎ２＋に対して２４ないし５２倍のＴＰＥＦ増加効果を有し、それぞれ１．１±０．１及び０．５０±０．０４ｎＭの解離定数（ＫｄＴＰ）を有する。また、生物学的に連関したｐＨ条件でｐＨに影響を受けず、従来のＺｎ２＋を検出するための二光子染料であるＴＳＱ及びＦｌｕＺｉｎ−３に比べて４ないし２４倍以上の強いＴＰＥＦを発生させる。また、本発明による二光子染料は、１０００秒以上の時間範囲で細胞内の自由Ｚｎ２＋を選択的な検出することができるが、これは、従来の如何なる二光子染料より優れた特性である。さらに、本発明による二光子染料は、メンブレン結合二光子染料または他の金属イオンによる干渉や妨害を受けず、非常に効果的に細胞内の遊離亜鉛イオンのみを映像化して、モニタリング可能にする。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
本発明は、細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング用の二光子染料、その製造方法及びそれを利用した細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング方法に関連する分野に適用されうる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式１の構造を有することを特徴とする細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング用の二光子染料：
【化１】
・・・（１）
（前記式で、Ｒは、ＨまたはＯＣＨ３である）。
【請求項２】
（ａ）下記式２の化合物を有機溶媒に混入した後、撹拌して第１混合物を収得する段階と、
【化２】
・・・（２）
（ｂ）前記収得された第１混合物に下記式３の化合物を添加、反応させて式１の化合物を合成する段階と、を含むことを特徴とする細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング用の二光子染料の製造方法：
【化３】
・・・（３）
【化４】
・・・（１）
（前記式で、Ｒは、水素またはＯＣＨ３である）。
【請求項３】
前記（ｂ）段階後、前記（ｂ）段階の結果物から前記式１の化合物を分離する段階をさらに含むことを特徴とする請求項２に記載の細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング用の二光子染料の製造方法。
【請求項４】
前記（ａ）段階の前記有機溶媒は、
１，３−ヒドロキシベンゾトリアゾール及び１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドを含むことを特徴とする請求項２に記載の細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング用の二光子染料の製造方法。
【請求項５】
前記分離は、
抽出工程によって遂行されることを特徴とする請求項３に記載の細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング用の二光子染料の製造方法。
【請求項６】
請求項１に記載の二光子染料を観察対象となる細胞質内に注入した後、放出される二光子励起蛍光映像を観察する段階を含むことを特徴とする細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング方法。
【請求項７】
前記二光子励起蛍光映像は、
前記観察対象の表面から８０ないし１５０μｍの深さ以内に存在する細胞質から放出されることを特徴とする請求項６に記載の細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング方法。
【請求項８】
前記二光子蛍光映像の観察段階は、
１０００秒以上進行することを特徴とする請求項６に記載の細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング方法。
【請求項１】
下記式１の構造を有することを特徴とする細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング用の二光子染料：
【化１】
・・・（１）
（前記式で、Ｒは、ＨまたはＯＣＨ３である）。
【請求項２】
（ａ）下記式２の化合物を有機溶媒に混入した後、撹拌して第１混合物を収得する段階と、
【化２】
・・・（２）
（ｂ）前記収得された第１混合物に下記式３の化合物を添加、反応させて式１の化合物を合成する段階と、を含むことを特徴とする細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング用の二光子染料の製造方法：
【化３】
・・・（３）
【化４】
・・・（１）
（前記式で、Ｒは、水素またはＯＣＨ３である）。
【請求項３】
前記（ｂ）段階後、前記（ｂ）段階の結果物から前記式１の化合物を分離する段階をさらに含むことを特徴とする請求項２に記載の細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング用の二光子染料の製造方法。
【請求項４】
前記（ａ）段階の前記有機溶媒は、
１，３−ヒドロキシベンゾトリアゾール及び１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドを含むことを特徴とする請求項２に記載の細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング用の二光子染料の製造方法。
【請求項５】
前記分離は、
抽出工程によって遂行されることを特徴とする請求項３に記載の細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング用の二光子染料の製造方法。
【請求項６】
請求項１に記載の二光子染料を観察対象となる細胞質内に注入した後、放出される二光子励起蛍光映像を観察する段階を含むことを特徴とする細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング方法。
【請求項７】
前記二光子励起蛍光映像は、
前記観察対象の表面から８０ないし１５０μｍの深さ以内に存在する細胞質から放出されることを特徴とする請求項６に記載の細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング方法。
【請求項８】
前記二光子蛍光映像の観察段階は、
１０００秒以上進行することを特徴とする請求項６に記載の細胞質内遊離亜鉛イオンのリアルタイムモニタリング方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公開番号】特開２００９−２８０８１１（Ｐ２００９−２８０８１１Ａ）
【公開日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１１５７４７（Ｐ２００９−１１５７４７）
【出願日】平成２１年５月１２日（２００９．５．１２）
【出願人】（５０５１７６５５６）コリア ユニバーシティ インダストリアル アンド アカデミック コラボレイション ファウンデーション (29)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月１２日（２００９．５．１２）
【出願人】（５０５１７６５５６）コリア ユニバーシティ インダストリアル アンド アカデミック コラボレイション ファウンデーション (29)
【Ｆターム（参考）】
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