組み換えヒト顆粒球コロニー刺激因子の精製のための方法
本発明は、タンパク質が封入体として発現される、微生物細胞からの治療等級の組み換えヒトＧＣＳＦの大規模精製のための新規な方法を記載する。封入体は、酸化還元条件下で可溶化され、かつ再折り畳みされる。酸化還元条件は、アスコルビン酸、デヒドロアスコルビン酸および還元グルタチオンを用いることによって提供される。この方法は、変性剤の除去後に再折り畳みされたＧＣＳＦを精製するための水性二相抽出工程の新規の使用を含む。この工程の後、ＧＣＳＦをさらに、関連する不純物を除去するためにクロマトグラフィー技術を用いて精製する。得られたＧＣＳＦは、製造規模の方法にとって必須である、良好な純度および収率を有する。タンパク質、ＤＮＡおよび内毒素のような、宿主細胞に関連する混入物が、本発明の精製方法を用いて減少する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水性二相抽出方法の少なくとも１つの工程を用いるコロニー刺激因子の精製のための方法に関する。特に、本発明は、水性二相抽出方法を用いる組み換えヒトＧＣＳＦの精製のための方法に関する。本発明はまた、酸化型、内毒素（エンドトキシン）および宿主細胞タンパク質がより少ない、本発明の方法によって産生される精製組み換えヒトＧＣＳＦに関する。
【背景技術】
【０００２】
コロニー刺激因子類（ＣＳＦ類）は、造血幹細胞の表面上のレセプタータンパク質に結合し、それによって、細胞を増殖させ、かつ特定の種類の血球に分化させ得る細胞内のシグナル伝達経路を活性化する、分泌型の糖タンパク質である。ヒト顆粒球−コロニー刺激因子（ｈ−ＧＣＳＦ）およびヒトマクロファージ顆粒球−コロニー刺激因子（ｈ−ＧＭ−ＣＳＦ）は、造血前駆細胞の分化および増殖、ならびに成熟好中球の活性化を刺激するのに重要な役割を果たす、一群のコロニー刺激因子に属する。ＧＣＳＦは、インビトロおよびインビボで好中球増殖を支持し得る。ＧＣＳＦタンパク質は、トレオニン１３３にＯ−グリコシル化部位をわずかに１つしか有さず；この残基でのグリコシル化がないことが、このタンパク質の安定性に影響するとは見出されなかった。タンパク質のグリコシル化が安定性に影響することが公知である多くのタンパク質治療剤に関しては、適切な発現ベクターを用いて、酵母または哺乳動物細胞におけるクローニングおよび発現に取り組むことが必須である。ＧＣＳＦの場合、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現される組み換えタンパク質は、天然のタンパク質と同じ比活性を有することが見出された（Ｏｈ−ｅｄａら、１９９０ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６，１１４３２〜１１４３５，Ｈｉｌｌら、１９９３ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０．５１６７−５１７１、およびＡｒａｋａｗａら、１９９３ Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．１２，５２５〜５３１）。ヒトＧＣＳＦは、その天然に存在する形態で約２０，０００ダルトンの分子量および５つのシステイン残基を有する糖タンパク質である。これらの残基のうち４つが、このタンパク質の活性にとって本質的に重要である２つの分子内ジスルフィド架橋を形成する。ＧＣＳＦは、その天然の供給源から少量しか利用できないので、主に、組み換え型のＧＣＳＦが医薬品を製造するために用いられる。組み換え型のＧＣＳＦは、例えば、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞のような哺乳動物細胞、またはＥ．ｃｏｌｉのような原核生物細胞における発現によって入手可能である。哺乳動物細胞で発現させた組み換えタンパク質は、異なるグリコシル化パターンを有するという点で、天然に存在するＧＣＳＦとは異なるのであるが、細菌での発現の結果として追加のＮ末端メチオニン残基を有し得るＥ．ｃｏｌｉ中で発現されるタンパク質では、グリコシル化は全く存在しない。ヒトＧＣＳＦをコードするｃＤＮＡのクローニングおよび発現は、２つのグループによって記載された（Ｎａｇａｔａ，Ｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３１９，４１５〜４１８（１９８６）；Ｓｏｕｚａ，Ｌ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２，６１〜６５（１９８６））。
【０００３】
ＧＣＳＦの組み換え産生は、１９８７年に、ＷＯ８７／０１１３２（Ａ１）で初めて特許文献に記載された。最初の市販のＧＣＳＦは、Ａｍｇｅｎ（アムジェン）から、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）という商品名で製造および販売されている。原核生物細胞におけるＧＣＳＦの産生は、哺乳動物細胞中の産生と比較して好ましい。より簡易な発現系および培養条件の使用が可能だからである。しかし、原核生物細胞における組み換えタンパク質の産生において、高頻度に生じる問題とは、封入体と呼ばれる、発現されたタンパク質の変性型の難溶性細胞内凝集体を形成することであり、この細胞内凝集体は、部分的に二次構造を有し、かつ細菌細胞の細胞質に見出され得る。このような封入体の形成の結果、タンパク質の活性な構造を維持するための適切な手段の補助を伴った、緩やかな速度での遠心分離による封入体の単離に続いて、タンパク質の可溶化および再生が必要となる。ここで、変性したタンパク質の正しい折り畳みの中間体への移行と、いくつかのタンパク質分子の凝集との間の競合的な反応は、再生されたタンパク質の収量を制限する本質的な要因である。
【０００４】
多くの初期の特許では、細菌の細胞から酵母および哺乳動物の細胞にまでおよぶ種々の発現系からのＧＣＳＦタンパク質の組み換え発現および精製の様々な態様が記載されている。記載される方法のうちいくつかは、精製方法の終わりでの収率の損失が著しくなり得る多段階の方法である。以下の米国特許第４，８１０，６４３号；同第４，９９９，２９１号；同第５，５８２，８２３号；同第５，５８０，７５５号；および同第５，８３０，７０５号およびＰＣＴ公開ＷＯ８７／０３６８９、ＷＯ８７／０２０６０、ＷＯ８６／０４６０５およびＷＯ８６／０４５０６は、細菌の細胞から酵母および哺乳動物の細胞にまでおよぶ種々の発現系からのｈ−ＧＣＳＦタンパク質の組み換え発現および精製の様々な態様を記載している。
【０００５】
Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母またはＣＨＯ細胞で発現されるＧＣＳＦの精製に関しては様々な他の方法が科学文献中で報告された。ＧＣＳＦを構成的に産生することが知られている、ＣＨＵ−２（ヒト口腔癌細胞株）馴化培地からのＧＣＳＦの精製の方法は、Ｎｏｍｕｒａら（ＥＭＢＯ Ｊ．ｖｏｌ ５,８７１，１９８６）によって開発された。この方法は、馴化培地の濃縮および限外濾過後の３段階のクロマトグラフィー手順の使用を記載している。ＷＯ８７／０１１３２（Ａ１）は、ＧＣＳＦの陽イオン交換クロマトグラフィー精製について記載している。
【０００６】
細菌系におけるＧＣＳＦの精製は、米国特許第４，８１０，６４３号および同第４，９９９，２９１号に開示されている。ＧＣＳＦのいくつかのクロマトグラフィーに基づく精製は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０３／０５１９２２（Ａ１）、ＷＯ０１／０４１５４（Ａ１）などの先行技術において記載されている。
【０００７】
米国特許第５，０５５，５５５号は、真核生物細胞から発現される組み換えｈＧＣＳＦの精製についての簡略化された方法を記載している。イオン交換クロマトグラフィーの後、タンパク質は、塩化ナトリウムを用いる塩析によって沈殿される。しかし、細菌で発現される封入体からのＧＣＳＦの回収に関して、塩化ナトリウム塩によるタンパク質の沈殿は、凝集状態を増大させ、これが収率および活性の損失を生じさせる。
【０００８】
上記の特許で考察される種々の精製プロトコールは、ＧＣＳＦの精製のための複数のクロマトグラフィーおよび他の工程に言及している。上述の文献のうち、産業的な規模での医薬等級のＧＣＳＦの産生のための簡易かつ利用可能な処理方法を開示したものはない。
【０００９】
水性二相抽出として公知の精製技術は、細胞粒子およびタンパク質の両方について、出願によって１９５６〜１９５８年に紹介された。それ以来、この技術は、植物および動物の細胞、微生物、ウイルス、葉緑体、ミトコンドリア、膜小胞、タンパク質および核酸などの異なる構成要素の宿主に対して適用されている。二相系による抽出のための基礎は、相間の物質の選択的分配である。可溶性物質に関して、分配は、主に２つのバルク相の間で生じ、この抽出は、分配係数（上部の相の中の分配物質の濃度を下部の相の中の分配物質の濃度で割ったものと規定する）によって特徴付けられる。理想的には、分配係数は、相の全体の濃度および容量の比とは独立している。これは主に二相の特性、分配物質および温度の関数である。二相系は、二相の非相溶性のポリマー溶液を混合することによって、ポリマー溶液と塩溶液とを混合することによって、または塩溶液とわずかに無極性の溶媒とを混合することによって産生され得る。これらの種類の系は、タンパク質および核酸、細胞粒子並びにインタクトな細胞などの高分子を分離するための水性二相抽出方法とともに、文献中に、例えば、Ａｌｂｅｒｔｓｓｏｎ，Ｐａｒｔｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，第３版（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８６）；Ｗａｌｔｅｒら、Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ｉｎ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｔｗｏ−Ｐｈａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ：Ｔｈｅｏｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｕｓｅｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｌｏｎｄｏｎ，１９８５）に記載されている。
【００１０】
タンパク質分離を大規模で取り扱うことが可能な、いくつかの低コスト二相系が公知である。これらの系は、上部相形成性のポリマーとしてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を、および下部相形成性のポリマーとして粗デキストラン（例えば、Ｋｒｏｎｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２４：１０１５〜１０４５［１９８２］）、濃縮塩溶液（例えば、Ｋｕｌａら、Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２４：７３〜１１８［１９８２］）、またはヒドロキシプロピルデンプン（Ｔｊｅｒｎｅｌｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３．０：８０９〜８１６［１９８７］）を用いる。
【００１１】
二相の水性ポリマー系は文献中で広く考察されている。例えば、Ｂａｓｋｉｒら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０：１３００〜１３１１（１９８７）；Ｂｉｒｋｅｎｍｅｉｅｒら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，３６０：１９３〜２０１（１９８６）；ＢｉｒｋｅｎｍｅｉｅｒおよびＫｏｐｐｅｒｓｃｈｌａｅｇｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１：９３〜１０８（１９９１）；ＢｌｏｍｑｕｉｓｔおよびＡｌｂｅｒｔｓｓｏｎ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，７３：１２５〜１３３（１９７２）；Ｂｌｏｍｑｕｉｓｔら、Ａｃｔａ Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．，２９：８３８〜８４２（１９７５）；Ｅｒｌａｎｓｏｎ−Ａｌｂｅｒｔｓｓｏｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，６１７：３１７〜３８２（１９８０）；ＦｏｓｔｅｒおよびＨｅｒｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，４６：９８１〜９９０（１９９２）；ＧｌｏｓｓｍａｎｎおよびＧｉｐｓ，Ｎａｕｎｙｎ．Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｅｒｓ Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２８２：４３９〜４４４（１９７４）；ハットリ、およびイワサキ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（東京），８８：７２６〜７３６（１９８０）；Ｈａｙｎｅｓら、ＡＩＣＨＥ Ｊｏｕｒｎａｌ−Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ，３７：１４０１〜１４０９（１９９１）；Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，３３１：１１〜２１（１９８５）；ＫｅｓｓｅｌおよびＭｃＥｌｈｉｎｎｅｙ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１４：１１２１〜１１２９（１９７８）；ＫｏｗａｌｃｚｙｋおよびＢａｎｄｕｒｓｋｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，２７９：５０９〜５１４（１９９１）；Ｋｕら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，３３：１０８１〜１０８８（１９８９）；クボイら、化学工学論文集，１６：１０５３〜１０５９（１９９０）；クボイら、化学工学論文集，１６：７５５〜７６２（１９９０）；クボイら、化学工学論文集，１７：６７〜７４（１９９１）；クボイら、化学工学論文集，１６：７７２〜７７９（１９９０）；ＬｉｌｌｅｈｏｊおよびＭａｌｉｋ，Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４０：１９〜７１（１９８９）；ＭａｔｔｉａｓｓｏｎおよびＫａｕｌ，"Ｕｓｅ ｏｆ ａｑｕｅｏｕｓ ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ"（会議論文），３１４，Ｓｅｐａｒ．Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｐｕｒｉｆ．：Ｍａｔｈ．Ｍｏｄｅｌ．，７８〜９２（１９８６）；Ｏｈｌｓｓｏｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，５：５８３〜５９０（１９７８）；Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｊａｐａｎ，２５：１３４〜１３９（１９９２）；Ｚａｓｌａｖｓｋｉｉら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．，４３９：２６７〜２８１（１９８８）；Ｚａｓｌａｖｓｋｉｉら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｆａｒａｄａｙ Ｔｒａｎｓ．，８７：１４１〜１４５（１９９１）；米国特許第４，８７９，２３４号（１９８９年１１月７日発行）（欧州特許第２１０，５３２号に対応）；独国（旧東ドイツ）特許第２９８，４２４号（１９９２年２月２０日公開）；ＷＯ９２／０７８６８（１９９２年５月１４日公開）；ならびに米国特許第５，０９３，２５４号を参照のこと。また、Ｈｅｊｎａｅｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，５：７９７〜８０６（１９９２）も参照のこと。
【００１２】
水性二相抽出／単離の系は、独国特許第２８８，８３７号に記載されている。組み換えタンパク質の選択的な富化のためのこの方法では、タンパク質含有ホモジネートが、相非相溶性のポリマーとしてＰＥＧおよびポリビニルアルコールから構成される、水性二相系中に懸濁される。インターフェロンの精製は、独国特許第２，９４３，０１６号に開示されるような種々のＰＥＧ誘導体を用いる、水性のＰＥＧデキストラン系またはＰＥＧ−塩の系中の粗インターフェロン溶液の選択的分配によって達成された。
【００１３】
米国特許第５，６９５，９５８号は、水性の発酵ブロスのような非天然構造の外因性ポリペプチドを、細胞から単離するための方法を提供し、該ポリペプチドは、このポリペプチドとカオロトピック剤、好ましくは還元剤と、および相形成性の種とを接触させて複数の水相を形成する工程を含む方法で調製され、ここでこの相のうちの１つは、細胞由来のバイオマス固体や核酸が僅かに含まれるポリペプチドが富化されている。
【００１４】
米国特許第６，４３７，１０１号は、生物学的供給源から、ヒト成長ホルモン、成長ホルモンアンタゴニストまたはいずれかの相同体を単離するための方法を記載している。米国特許第６，４３７，１０１号に記載される方法は、多相抽出方法を用いる。
【００１５】
米国特許第７，０６０，６６９号は、水性二相抽出における目的のタンパク質の抽出のための方法であって、このようなタンパク質をこの相の１つの中に運ぶ能力を有する標的タンパク質に対して、このようなタンパク質を融合することによる方法を提供する。
【００１６】
この抽出技術の主な利点は、この方法が効率的であり、大規模化が容易であり、連続遠心分離機を用いる場合、迅速であり、比較的低コストであり、生体適合性を最大化するべく、水含量が高いということである。現在、タンパク質を精製するための水性二相系の産業上の適用は、比較的少ない。
【００１７】
ＧＣＳＦタンパク質を水性の二相抽出を用いてその天然型で、かつ変性剤の非存在下で精製することは、いままでのところ、記載されていない。
【発明の概要】
【００１８】
一態様では、本発明は、微生物細胞由来の封入体の形態で得られる組み換えヒトＧＣＳＦの精製のための方法であって、少なくとも１つの水性二相抽出工程を含む方法に関する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、微生物細胞から封入体の形態で得られる組み換えヒトＧＣＳＦの精製のための方法に関し、この方法は以下の工程：
ａ）ＧＣＳＦの封入体を可溶化する工程と；
ｂ）該可溶化されたＧＣＳＦタンパク質を再折り畳みする工程と；
ｃ）水性二相抽出を用いることにより再折り畳みされたＧＣＳＦを精製する工程と；
ｄ）必要に応じて、工程ｃで得られる天然のＧＣＳＦをさらに精製する工程と；
ｅ）純粋なＧＣＳＦを単離する工程と；
を含む。
【００２０】
別の態様では、本発明は、天然型のＧＣＳＦを単離するための水性二相抽出方法に関する。
【００２１】
本発明の別の態様は、水性二相抽出方法の少なくとも１つの工程を含む、本発明の方法によって得られる精製されたＧＣＳＦである。
【００２２】
さらなる態様では、本発明は、下側の相における再折り畳みされたタンパク質ＧＣＳＦから９５％を超える宿主細胞タンパク質、内毒素およびＤＮＡを分離するための水性二相抽出方法に関し、ここでこの再折り畳みされたタンパク質は、原生動物細胞において封入体の形態で発現される哺乳動物ポリペプチド（哺乳動物生物体にもともと由来したポリペプチド）である。この方法はまた、組織および血液サンプルなどの天然の供給源からのＧＣＳＦ精製に適用されてもよい。
【００２３】
別の態様では、本発明はまた、水性二相抽出方法の少なくとも１工程を含む、本発明の方法によって得られる生物学的に活性なＧＣＳＦの治療上有効な量を含む医薬組成物に関する。
【００２４】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、下の詳細な説明に示す。本発明の特徴、目的および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＧＣＳＦの精製のための水性二相抽出方法の模式的な説明。
【図２】精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイル
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本明細書において用いる場合、「還元剤」とは、分子内または分子間のジスルフィド結合が化学的に破壊されるように、水溶液中で適切な濃度で、スルフヒドリル基を維持する化合物を指す。適切な還元剤の代表的な例としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、βメルカプトエタノール（ＢＭＥ）、システイン、システアミン、チオグリコレート、グルタチオンおよび水素化ホウ素ナトリウムが挙げられる。
【００２７】
本明細書において用いる場合、「カオトロピック剤」とは、水溶液中で適切な濃度で、ポリペプチドの表面での変化を通じてそのポリペプチドの空間的な立体配置または構造を変化させ、それによってこの水性媒体中でこのポリペプチドを可溶性にさせる化合物を指す。この変化は、例えば、水和の状態、溶媒環境または溶媒−表面の相互作用を変化させることによって生じ得る。カオトロピック剤の濃度は、その強度および有効性に直接影響する。強力に変性させるカオトロピック溶液は、カオトロピック剤を高濃度で含み、溶液中に存在するポリペプチドを効率的に溶液中で解く。この解きは比較的広範であるが可逆的である。穏やかに変性させるカオトロピック溶液は、カオトロピック剤を含み、これは溶液中で十分な濃度で、溶液中の可溶性中間体を介すると考えられている、ポリペプチドの持つどんな捩れ構造も、内因性または相同な生理的条件下、その活性型で取り扱う場合にペプチド自身が見出す空間的な構造への、ポリペプチドの部分的な折り畳みを可能にする。カオトロピック剤の例としては、塩酸グアニジン、尿素、および水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムのような水酸化物が挙げられる。カオトロピック剤としては、これらの試薬の組み合わせ、例えば、塩基と尿素または塩酸グアニジンとの混合物が挙げられる。
【００２８】
本明細書において用いる場合、「封入体」という用語は、凝集した目的のポリペプチドの高密度の細胞内塊を指し、これは全細胞成分を含めた、総細胞タンパク質のかなりの部分を構成する。これらの凝集したポリペプチドは、不正確に折り畳まれるタンパク質である場合もあるし、または部分的に正確に折り畳まれるタンパク質である場合もある。全ての場合ではないが、いくつかの場合には、ポリペプチドのこれらの凝集体は、位相差顕微鏡下で１０００倍未満の倍率で、細胞内容物内で可視の明るいスポットとして認識され得る。
【００２９】
本明細書において用いる「治療上有効な量」という用語は、生物学的に活性なＧ−ＣＳＦの治療効果を有する、生物学的に活性なＧ−ＣＳＦの量を指す。
【００３０】
本明細書において用いる「生物学的に活性なＧ−ＣＳＦ」という用語は、造血系前駆体細胞の分化および増殖、ならびに造血系の成熟細胞の活性化を促進し得るＧ−ＣＳＦを指す。
【００３１】
ある実施形態では、本発明は、微生物細胞から得られる天然型の組み換えＧＣＳＦの大規模精製のための方法を提供する。
【００３２】
本発明による方法は以下の工程：
ａ）ＧＣＳＦの封入体を可溶化する工程と；
ｂ）該可溶化されたＧＣＳＦタンパク質を再折り畳みする工程と；
ｃ）水性二相抽出を用いることによりこの再折り畳みされたＧＣＳＦを精製する工程と；
ｄ）必要に応じて、工程ｃで得られる天然のＧＣＳＦをさらに精製する工程と；
ｅ）純粋なＧＣＳＦを単離する工程と；
を含む。
【００３３】
本発明の一実施形態によれば、この封入体は、適切な可溶化緩衝液および適切なカオトロピック剤中に、７〜１２の範囲のｐＨで溶解される。適切な緩衝液としては限定するものではないが、Ｔｒｉｓ（塩化物／マレイン酸塩）緩衝液、リン酸塩（ナトリウムおよびカリウム）緩衝液、グリシン水酸化ナトリウム緩衝液、ホウ酸−ホウ砂緩衝液、ホウ砂−水酸化ナトリウム緩衝液、炭酸−重炭酸緩衝液などが挙げられる。
【００３４】
適切なカオトロピック剤としては、尿素およびグアニジンまたはチオシアン酸の塩、好ましくは尿素、塩酸グアニジンまたはチオシアン酸ナトリウムが挙げられる。緩衝液中に存在することが必要なカオトロピック剤の量は、例えば、存在するカオトロピック剤およびポリペプチドの種類に依存する。必要なカオトロピック剤の量は、溶液に存在するポリペプチドを解くのに十分でなければならない。溶液のｐＨは、カオトロピック剤に依存し、尿素については、溶液のｐＨは、９〜１２の範囲で維持され、塩酸グアニジンについては、このｐＨは７〜９の範囲である。溶液のＯＤは、約２〜約１２の範囲である。
【００３５】
微生物の封入体を可溶化するために用いられ得る界面活性剤および他の試薬としては、ＳＤＳ、ＣＴＡＢ、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、Ｓａｒｃｏｓｙｌ、オクチル・ベータグルコシド（Ｏｃｔｙｌ ｂｅｔａｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、ドデシル・マルトシド、ＮＤＳＢが挙げられる。（以下の引用文献による：Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｓｃａｌｅ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｙ，編集Ａｂｈｉｎａｖ Ａ Ｓｈｕｋｌａ、Ｍａｒｋ Ｒ ＥｔｚｅｌおよびＳｈｉｓｈｉｒ Ｇａｄａｍ，Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓ，２００７ 第１２９頁、（これはその全体が参照によって本明細書に援用される）。
【００３６】
可溶化された封入体を含む溶液は、１０〜３０℃の範囲の温度で還元剤によって処理される。還元剤としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、βメルカプトエタノール（ＢＭＥ）；システイン、チオグリコレートおよび水酸化ホウ素ナトリウムから１つ以上が挙げられる。緩衝液中に存在すべき還元剤の量は主に、還元剤およびカオトロピック剤の種類、使用される緩衝液の種類およびｐＨ、ならびに緩衝液中のポリペプチドの種類および濃度に依存する。還元剤の有効量とは、細胞内ジスルフィド媒介性凝集を排除するために十分な量である。好ましい還元剤はＤＴＴである。
【００３７】
本発明のある実施形態では、タンパク質ＧＣＳＦは、再折り畳み緩衝液中で可溶化されたＧＣＳＦを再折り畳みすることによって天然型で得られる。典型的には、再折り畳み緩衝液は、適切な緩衝液、アルギニンまたはプロリンのようなアミノ酸、スクロース、ＥＤＴＡ、アスコルビン酸ナトリウム、尿素を含んでもよい。アスコルビン酸ナトリウムが再折り畳み緩衝液中で用いられる場合、再折り畳みの間の酸化還元条件を得るべく、デヒドロアスコルビン酸および還元グルタチオンも、再折り畳み緩衝液に添加される。あるいは、システイン／シスチンのような、オキシドシャッフリング（ｏｘｉｄｏ−ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）剤、または酸化および還元されたグルタチオンもまた用いられてもよい。
【００３８】
再折り畳みは、５〜２０℃の範囲の温度、好ましくは６〜１０℃の温度で行われる。再折り畳みのために必要な時間は、約６〜２４時間、好ましくは１５〜２０時間かかってもよい。
【００３９】
タンパク質の再折り畳みが終了した後、ダイアフィルトレーションを行ってもよい。変性剤の除去のために、緩衝液の交換は、スクロースまたはソルビトールを有するＴｒｉｓ緩衝液を用いることによって行われてもよい。
【００４０】
本発明のある実施形態では、タンパク質ＧＣＳＦは、水性二相抽出を用いることによってさらに単離され、かつ精製される。再折り畳みされたＧＣＳＦタンパク質を含むダイアフィルトレーションされた溶液に、相形成性のポリマー−塩の組み合わせを添加する。相形成性剤、相形成性剤の組み合わせおよび適切な相形成性剤を選択するのに考慮するパラメーターの例は、Ｄｉａｍｏｎｄら、１９９２（前出）、およびＡｂｂｏｔｔら、１９９０，Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ １：１９１〜２２５（その両方ともその全体が参照によって本明細書に援用される）に考察される。ポリマーおよび塩は、二相系が形成されるような条件下および濃度で用いられる。
【００４１】
適切なポリマーの例としては限定するものではないが、例えば、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ６０００およびＰＥＧ８０００のような、約２０００〜８０００の分子量を有する、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはその誘導体類が挙げられる。
【００４２】
相形成性の塩としては、無機または有機の塩が挙げられ、これらは、好ましくは、ポリペプチドを沈殿させるようには作用しない。陰イオンは、水性多相系を形成する能力を有する陰イオンが選択される。例としては、硫酸アンモニウム、リン酸二ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸アンモニウム、クエン酸カリウム、リン酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸アンモニウム、硫酸マンガン、リン酸マンガンなどが挙げられる。二相性の水系を形成するのに有用な塩の種類は、その全体が参照によって本明細書に援用されるＺａｓｌａｖｓｋｉｉら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．，４３９：２６７−２８１（１９８８）でさらに詳細に評価されている。相形成のために好ましい塩は、硫酸ナトリウム、硫酸カリウムおよび硫酸アンモニウムである。
【００４３】
本発明のある実施形態では、相形成性剤の濃度は多様であってもよい。重量／容量で表される相形成性のポリマーの濃度は、約４％〜約１８％の範囲、好ましくは約８％〜約１２％である。さらに別の実施形態では、重量／容量で表される相形成性の塩の濃度は、約４％〜約１８％、好ましくは約６％〜約１２％の範囲にある。
【００４４】
得られた抽出混合物は、別個の相を形成するために処理され、その１つは、天然型のタンパク質ＧＣＳＦを豊富に含む。このような処理は、例えば、抽出混合物を遠心分離することによって、または数時間の間その混合物を静置させる（１×Ｇで沈降または合体させる）ことによって成され得る。さらなる態様では、一旦別個の相が形成されれば、タンパク質ＧＣＳＦを豊富に含む相、すなわち通常、上部の軽い相が除去されうる。
【００４５】
必要に応じて、タンパク質ＧＣＳＦを含む相の除去後、タンパク質ＧＣＳＦを含まない相を再抽出してもよい（「二段階抽出」）。再抽出は、第二の軽い相を形成し得る相形成性剤を含有する溶液を添加することによって成されてもよく、その結果、これによって、再抽出においてタンパク質ＧＣＳＦが富化されている相が形成される。別の態様では、二段階抽出の間、相形成性剤を溶解し、この系を徹底的に混合するべく、抽出混合物が攪拌される。得られた再抽出混合物は、別個の相を形成し、そのうちの１つは、タンパク質ＧＣＳＦが富化されているように、処理される。
【００４６】
抽出精製後、タンパク質ＧＣＳＦは、抽出系から取り出された相中で検出され得る。例えば、このタンパク質は、種々の方法、限定するものではないが、バイオアッセイ、ＨＰＬＣ、アミノ酸決定または免疫学的アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、抗体結合を用いるウエスタンブロット、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを含めて様々な方法によって検出され得る。このような抗体としては限定するものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラグメント、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられる。精製されたタンパク質の量およびそれらの純度のレベルは、当該分野で周知の方法によって決定され得る。
【００４７】
本発明の方法を用いて得られるタンパク質は、例えば、高純度のタンパク質またはポリペプチドを得るためにさらに処理されてもよい。関連の不純物を除去するために、さらなる精製が必須である場合がある。不純物としては、酸化型、脱アミノ型、凝集されたＧＣＳＦ、およびまた分解型、例えば、生物学的に不活性なモノマー型、不正確に折り畳まれたＧ−ＣＳＦ分子、Ｇ−ＣＳＦの変性型、宿主細胞タンパク質、宿主細胞物質、例えば、ＤＮＡ、（リポ）ポリサッカライドなどおよびＧ−ＣＳＦの調製および処理に用いられた添加物を挙げることができる。このようなより高い純度が、そのタンパク質またはポリペプチドが意図する用途次第で必要である場合がある。例えば、タンパク質の治療的な使用は通常、本発明の抽出方法後のさらなる精製を要する。当業者に公知の全てのタンパク質精製方法が、さらなる精製のために用いられ得る。このような技術は、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１５２巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９８７）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ａｌｌ Ｖｉｏｌｓ．，１９８９，ならびにその定期更新）；Ｎｅｗ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．編集，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．，１９８８；ならびにＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，第３版，Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．Ｋ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ− Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８７に詳細に記載されており、これらは、その全体が参照によって本明細書に援用される。一般には、限定するものではないが、硫酸アンモニウム沈殿、遠心分離、イオン交換、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む技術がタンパク質の更なる精製に用いられて良い。
【００４８】
好ましい実施形態では、ＧＣＳＦタンパク質を含む上部相を希釈して、３〜６ｍＳ／ｃｍの範囲に、好ましくは４〜５ｍＳ／ｃｍの範囲に伝導率を調整する。ｐＨはまた、３〜５．５の範囲で、好ましくは４〜５の範囲で調整する。関連の不純物とともにＧＣＳＦを含んでいる得られた溶液を、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いることによって、さらに精製して、関連の不純物を除去してもよい。別の選択肢では、上部の相をまた、適切な塩の添加により疎水性相互作用クロマトグラフィーに供してもよい。
【００４９】
本発明の方法によって得られる純粋タンパク質ＧＣＳＦの収率は、４０〜５０％の範囲にある。
【００５０】
本発明の一実施形態によれば、水性二相抽出は、９５％より多くの宿主タンパク質、内毒素およびＤＮＡを再折り畳みされたタンパク質ＧＣＳＦから分離するために有用である。本発明の方法によって得られたタンパク質ＧＣＳＦは、９９％以上の純度を有する。本発明の方法によって得られるＧＣＳＦが含む酸化不純物は極めて低い。本発明の方法によって得られる純粋なＧＣＳＦに存在する内毒素は２ＩＵ／ｍｌ未満である。純粋ＧＣＳＦ中の宿主細胞タンパク質の含量は２０ｐｐｍ未満である。
【００５１】
本発明による水性二相抽出方法の少なくとも１つの工程を含む、天然型のＧＣＳＦの精製は、哺乳動物の組織および血液のような任意の天然の供給源から得られる天然のＧＣＳＦに用いてもよい。記載される方法はＧＣＳＦの工業的製造のために特に適している。
【００５２】
本明細書に記載されるような純粋なＧＣＳＦを得る方法はさらに、純粋なＧＣＳＦを臨床用途のための完成した剤形に形成する工程を含む。
【００５３】
本発明の精製および／または単離のための全方法によって得られる生物学的に活性なＧ−ＣＳＦは、治療上有効な量の生物学的に活性なＧ−ＣＳＦおよび１つ以上の医薬賦形剤を含む、医薬組成物の調製に適し、かつ臨床の用途に適している。短時間の精製および単離の方法において活性型のＧ−ＣＳＦを維持する能力は、収率の改善に寄与するだけでなく、生物学的に活性なＧ−ＣＳＦおよびそれを含有する医薬組成物の純度および有効性の改善にも寄与する。
【００５４】
適切な医薬上許容される賦形剤としては、限定するものではないが、Ｇ−ＣＳＦ療法において有用な、適切な希釈剤、アジュバントおよび／または担体が挙げられる。
【００５５】
さらに別の実施形態では、本発明は、本発明によって得られるＧＣＳＦを含む医薬組成物に関する。得られたＧＣＳＦは、凍結乾燥型または液体型のいずれで貯蔵されてもよい。これは、皮下または静脈内のいずれかに投与される。組み換え発現されるＧＣＳＦの処方物中の適切なアジュバントは、例えば、糖および糖アルコールのような安定化剤、アミノ酸およびポリソルベート２０／８０のような界面活性剤ならびに適切な緩衝物質である。処方物の例は、欧州特許第０６７４５２５号、欧州特許第０３７３６７９号および欧州特許第０３０６８２４号に記載されており、その両方ともが全体として参照によって本明細書に援用される。
【００５６】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するために示しているが、決して本発明の範囲を限定するために示すものではない。
【００５７】
実施例１：純粋なＧＣＳＦを得るための一般的方法
工程Ａ：ＧＣＳＦの封入体を、１００ｍＭのＴｒｉｓ ６Ｍ ＧｕＨＣｌ ｐＨ８．０を含有する緩衝液に可溶化する。可溶化には約４５分かかる。可溶化された封入体のＯＤを、可溶化緩衝液を用いて８．０に調整する（通常は１ｇの封入体あたり、４５ｍｌの可溶化緩衝液を用いる）。この溶液を０．４５μｍのフィルターを通して濾過する。ＤＴＴを、最大５ｍＭまで添加して、タンパク質を還元する。還元は、室温（２５℃）で３０分間行う。
【００５８】
工程Ｂ：可溶化されたＧＣＳＦを、３０〜４５分の期間中、撹拌しながら、再折り畳み緩衝液に添加する。再折り畳み緩衝液は、７５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．８）、０．１ＭのＬ−アルギニン、１０％のスクロース、２ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム、２Ｍの尿素を含む。１ｇの封入体に対しては、１リットルの再折り畳み緩衝液を用いる。緩衝液の温度は、約８．０℃で維持される。再折り畳みは、１５〜２０時間行われる。アスコルビン酸ナトリウムを、再折り畳み緩衝液中で用いる場合、再折り畳みの間、酸化還元条件を与えるべく、デヒドロアスコルビン酸および還元グルタチオンも再折り畳み緩衝液に添加する。あるいは、システイン／シスチンのようなオキシド−シャッフリング（ｏｘｉｄｏ−ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）剤、または酸化および還元されたグルタチオンもまた用いてもよい。
【００５９】
再折り畳みの終了後、再折り畳みされたタンパク質の緩衝液交換を、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、５％スクロースまたは５％Ｄ＋ソルビトール中で行い、変性剤を除去する。
【００６０】
工程Ｃ：タンパク質を含有するダイアフィルトレーションした溶液に、最終溶液中のＰＥＧ４０００濃度が１０％（ｗ／ｗ）になるように、ＰＥＧ４０００を添加する。ＰＥＧを溶解した後、塩（硫酸ナトリウム）を、最終溶液中でのその濃度が８％（ｗ／ｗ）になるように添加する。塩が溶解した後、相の形成が生じるように、その溶液を撹拌することなく静置する。二相が形成され、すなわち、塩の相およびＰＥＧ相が形成される。ＧＣＳＦは、上部の相（ＰＥＧ相）に入る。下部の相を廃棄し、ここで不純物を除去する。上部の相を純度についてチェックする。ＧＣＳＦタンパク質を含む上部相のｐＨを４．５に調整し、次いで、ダイアフィルトレーションまたは希釈して、伝導率を約４〜６ｍＳ／ｃｍにする。
【００６１】
工程Ｄ：次いで、この溶液を、ｐＨ４．５で陽イオン交換体（ＳＰ ＦＦセファロース）にロードする。カラムは、２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で事前に平衡化している。ロードが終わった後、カラムを２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）緩衝液で洗浄する。洗浄が終わった後、結合したタンパク質を、２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）緩衝液中ＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出する。
【００６２】
工程Ｅ：次いで、精製されたＧＣＳＦを製剤緩衝液（１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、５％ソルビトール、０．００４％のＴｗｅｅｎ８０）へ緩衝液交換した。
【００６３】
精製されたＧＣＳＦタンパク質は、市販のＧＣＳＦ製品と同様のインビトロの生物活性である。
【００６４】
実施例２：
２ｇの封入体を、１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、６Ｍの塩酸グアニジン緩衝液中に可溶化した。可溶化は、２５℃で４５分間行った。可溶化された封入体溶液を０．４５ミクロンのポリエーテルスルホンフィルターを通して濾過した。濾過された溶液の２８０ｎｍでのＯＤをチェックして、必要量の可溶化緩衝液を添加することによって８．０に調整した。９０ｍｌの可溶化された封入体溶液に、ＤＴＴを、最終濃度が５ｍＭになるように添加した。還元は、３０分間行った。還元後、封入体溶液を、以下の組成に従う２０００ｍｌの再折り畳み緩衝液に緩徐に添加した：７５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．８）、１０％スクロース、２Ｍ尿素、０．１Ｍ Ｌ−アルギニン、２ｍＭのＥＤＴＡ。温度は８〜１０℃で維持した。封入体溶液を添加した後、シスチンおよびシステインを、それぞれの最終濃度が１ｍＭおよび４ｍＭになるように添加する。再折り畳みは、１０℃で１５時間行った。
【００６５】
再折り畳みが終了した後、この再折り畳みされたタンパク質を、１リットルに濃縮し、タンジェント流濾過（ＴＦＦ）を用いて２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、５％ソルビトールの３ダイアフィルトレーション容量に対してダイアフィルトレーションした。このダイアフィルトレーションされた溶液に１２２ｇのＰＥＧ４０００を添加した。ＰＥＧを溶解した後、９７．６ｇの硫酸ナトリウムを添加した。次いで、この溶液を重力沈降のために静置した。次いで上部相を回収して、２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）、５％ソルビトールで希釈して、ｐＨを４．５に、そして伝導率を５．５ｍＳ／ｃｍに調整した。次いで、この希釈溶液を、２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）、５％ソルビトールで平衡にしたＳＰセファロースカラム上にロードした。ロードおよび２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）５％ソルビトール緩衝液での洗浄後、さらに２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）５％ソルビトール緩衝液での洗浄を行う。次いで結合したタンパク質を、直線濃度勾配の２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）５％ソルビトール、１ＭのＮａＣｌを用いて、７０ＣＶで溶出した。ＲＰ−ＨＰＬＣにより９９％を超える純度の溶出画分をプールした。次いで、このプールした画分を１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、５％ソルビトール、０．００４％のＴｗｅｅｎ８０に対して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５媒体ゲル濾過カラム（ｍｅｄｉｕｍ ｇｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃｏｌｕｍｎ）を用いて緩衝液交換した。２００ｍｇの治療等級の純粋なＧＣＳＦを、上記の方法から得た。図２は、精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルを示す。上部相は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより９９％を超える純度を示す。イオン交換後の最終精製されたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより９９％を超え、そしてＲＰ−ＨＰＬＣにより９８．５％を超える純度を示す。得られた収率は４５％であった。
【００６６】
本発明はその特定の実施形態に関して記載してきたが、特定の改変および等価物は、当業者に明白であり、かつ本発明の範囲内に含まれるものとする。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水性二相抽出方法の少なくとも１つの工程を用いるコロニー刺激因子の精製のための方法に関する。特に、本発明は、水性二相抽出方法を用いる組み換えヒトＧＣＳＦの精製のための方法に関する。本発明はまた、酸化型、内毒素（エンドトキシン）および宿主細胞タンパク質がより少ない、本発明の方法によって産生される精製組み換えヒトＧＣＳＦに関する。
【背景技術】
【０００２】
コロニー刺激因子類（ＣＳＦ類）は、造血幹細胞の表面上のレセプタータンパク質に結合し、それによって、細胞を増殖させ、かつ特定の種類の血球に分化させ得る細胞内のシグナル伝達経路を活性化する、分泌型の糖タンパク質である。ヒト顆粒球−コロニー刺激因子（ｈ−ＧＣＳＦ）およびヒトマクロファージ顆粒球−コロニー刺激因子（ｈ−ＧＭ−ＣＳＦ）は、造血前駆細胞の分化および増殖、ならびに成熟好中球の活性化を刺激するのに重要な役割を果たす、一群のコロニー刺激因子に属する。ＧＣＳＦは、インビトロおよびインビボで好中球増殖を支持し得る。ＧＣＳＦタンパク質は、トレオニン１３３にＯ−グリコシル化部位をわずかに１つしか有さず；この残基でのグリコシル化がないことが、このタンパク質の安定性に影響するとは見出されなかった。タンパク質のグリコシル化が安定性に影響することが公知である多くのタンパク質治療剤に関しては、適切な発現ベクターを用いて、酵母または哺乳動物細胞におけるクローニングおよび発現に取り組むことが必須である。ＧＣＳＦの場合、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現される組み換えタンパク質は、天然のタンパク質と同じ比活性を有することが見出された（Ｏｈ−ｅｄａら、１９９０ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６，１１４３２〜１１４３５，Ｈｉｌｌら、１９９３ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０．５１６７−５１７１、およびＡｒａｋａｗａら、１９９３ Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．１２，５２５〜５３１）。ヒトＧＣＳＦは、その天然に存在する形態で約２０，０００ダルトンの分子量および５つのシステイン残基を有する糖タンパク質である。これらの残基のうち４つが、このタンパク質の活性にとって本質的に重要である２つの分子内ジスルフィド架橋を形成する。ＧＣＳＦは、その天然の供給源から少量しか利用できないので、主に、組み換え型のＧＣＳＦが医薬品を製造するために用いられる。組み換え型のＧＣＳＦは、例えば、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞のような哺乳動物細胞、またはＥ．ｃｏｌｉのような原核生物細胞における発現によって入手可能である。哺乳動物細胞で発現させた組み換えタンパク質は、異なるグリコシル化パターンを有するという点で、天然に存在するＧＣＳＦとは異なるのであるが、細菌での発現の結果として追加のＮ末端メチオニン残基を有し得るＥ．ｃｏｌｉ中で発現されるタンパク質では、グリコシル化は全く存在しない。ヒトＧＣＳＦをコードするｃＤＮＡのクローニングおよび発現は、２つのグループによって記載された（Ｎａｇａｔａ，Ｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３１９，４１５〜４１８（１９８６）；Ｓｏｕｚａ，Ｌ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２，６１〜６５（１９８６））。
【０００３】
ＧＣＳＦの組み換え産生は、１９８７年に、ＷＯ８７／０１１３２（Ａ１）で初めて特許文献に記載された。最初の市販のＧＣＳＦは、Ａｍｇｅｎ（アムジェン）から、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）という商品名で製造および販売されている。原核生物細胞におけるＧＣＳＦの産生は、哺乳動物細胞中の産生と比較して好ましい。より簡易な発現系および培養条件の使用が可能だからである。しかし、原核生物細胞における組み換えタンパク質の産生において、高頻度に生じる問題とは、封入体と呼ばれる、発現されたタンパク質の変性型の難溶性細胞内凝集体を形成することであり、この細胞内凝集体は、部分的に二次構造を有し、かつ細菌細胞の細胞質に見出され得る。このような封入体の形成の結果、タンパク質の活性な構造を維持するための適切な手段の補助を伴った、緩やかな速度での遠心分離による封入体の単離に続いて、タンパク質の可溶化および再生が必要となる。ここで、変性したタンパク質の正しい折り畳みの中間体への移行と、いくつかのタンパク質分子の凝集との間の競合的な反応は、再生されたタンパク質の収量を制限する本質的な要因である。
【０００４】
多くの初期の特許では、細菌の細胞から酵母および哺乳動物の細胞にまでおよぶ種々の発現系からのＧＣＳＦタンパク質の組み換え発現および精製の様々な態様が記載されている。記載される方法のうちいくつかは、精製方法の終わりでの収率の損失が著しくなり得る多段階の方法である。以下の米国特許第４，８１０，６４３号；同第４，９９９，２９１号；同第５，５８２，８２３号；同第５，５８０，７５５号；および同第５，８３０，７０５号およびＰＣＴ公開ＷＯ８７／０３６８９、ＷＯ８７／０２０６０、ＷＯ８６／０４６０５およびＷＯ８６／０４５０６は、細菌の細胞から酵母および哺乳動物の細胞にまでおよぶ種々の発現系からのｈ−ＧＣＳＦタンパク質の組み換え発現および精製の様々な態様を記載している。
【０００５】
Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母またはＣＨＯ細胞で発現されるＧＣＳＦの精製に関しては様々な他の方法が科学文献中で報告された。ＧＣＳＦを構成的に産生することが知られている、ＣＨＵ−２（ヒト口腔癌細胞株）馴化培地からのＧＣＳＦの精製の方法は、Ｎｏｍｕｒａら（ＥＭＢＯ Ｊ．ｖｏｌ ５,８７１，１９８６）によって開発された。この方法は、馴化培地の濃縮および限外濾過後の３段階のクロマトグラフィー手順の使用を記載している。ＷＯ８７／０１１３２（Ａ１）は、ＧＣＳＦの陽イオン交換クロマトグラフィー精製について記載している。
【０００６】
細菌系におけるＧＣＳＦの精製は、米国特許第４，８１０，６４３号および同第４，９９９，２９１号に開示されている。ＧＣＳＦのいくつかのクロマトグラフィーに基づく精製は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０３／０５１９２２（Ａ１）、ＷＯ０１／０４１５４（Ａ１）などの先行技術において記載されている。
【０００７】
米国特許第５，０５５，５５５号は、真核生物細胞から発現される組み換えｈＧＣＳＦの精製についての簡略化された方法を記載している。イオン交換クロマトグラフィーの後、タンパク質は、塩化ナトリウムを用いる塩析によって沈殿される。しかし、細菌で発現される封入体からのＧＣＳＦの回収に関して、塩化ナトリウム塩によるタンパク質の沈殿は、凝集状態を増大させ、これが収率および活性の損失を生じさせる。
【０００８】
上記の特許で考察される種々の精製プロトコールは、ＧＣＳＦの精製のための複数のクロマトグラフィーおよび他の工程に言及している。上述の文献のうち、産業的な規模での医薬等級のＧＣＳＦの産生のための簡易かつ利用可能な処理方法を開示したものはない。
【０００９】
水性二相抽出として公知の精製技術は、細胞粒子およびタンパク質の両方について、出願によって１９５６〜１９５８年に紹介された。それ以来、この技術は、植物および動物の細胞、微生物、ウイルス、葉緑体、ミトコンドリア、膜小胞、タンパク質および核酸などの異なる構成要素の宿主に対して適用されている。二相系による抽出のための基礎は、相間の物質の選択的分配である。可溶性物質に関して、分配は、主に２つのバルク相の間で生じ、この抽出は、分配係数（上部の相の中の分配物質の濃度を下部の相の中の分配物質の濃度で割ったものと規定する）によって特徴付けられる。理想的には、分配係数は、相の全体の濃度および容量の比とは独立している。これは主に二相の特性、分配物質および温度の関数である。二相系は、二相の非相溶性のポリマー溶液を混合することによって、ポリマー溶液と塩溶液とを混合することによって、または塩溶液とわずかに無極性の溶媒とを混合することによって産生され得る。これらの種類の系は、タンパク質および核酸、細胞粒子並びにインタクトな細胞などの高分子を分離するための水性二相抽出方法とともに、文献中に、例えば、Ａｌｂｅｒｔｓｓｏｎ，Ｐａｒｔｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，第３版（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８６）；Ｗａｌｔｅｒら、Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ｉｎ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｔｗｏ−Ｐｈａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ：Ｔｈｅｏｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｕｓｅｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｌｏｎｄｏｎ，１９８５）に記載されている。
【００１０】
タンパク質分離を大規模で取り扱うことが可能な、いくつかの低コスト二相系が公知である。これらの系は、上部相形成性のポリマーとしてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を、および下部相形成性のポリマーとして粗デキストラン（例えば、Ｋｒｏｎｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２４：１０１５〜１０４５［１９８２］）、濃縮塩溶液（例えば、Ｋｕｌａら、Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２４：７３〜１１８［１９８２］）、またはヒドロキシプロピルデンプン（Ｔｊｅｒｎｅｌｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３．０：８０９〜８１６［１９８７］）を用いる。
【００１１】
二相の水性ポリマー系は文献中で広く考察されている。例えば、Ｂａｓｋｉｒら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０：１３００〜１３１１（１９８７）；Ｂｉｒｋｅｎｍｅｉｅｒら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，３６０：１９３〜２０１（１９８６）；ＢｉｒｋｅｎｍｅｉｅｒおよびＫｏｐｐｅｒｓｃｈｌａｅｇｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１：９３〜１０８（１９９１）；ＢｌｏｍｑｕｉｓｔおよびＡｌｂｅｒｔｓｓｏｎ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，７３：１２５〜１３３（１９７２）；Ｂｌｏｍｑｕｉｓｔら、Ａｃｔａ Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．，２９：８３８〜８４２（１９７５）；Ｅｒｌａｎｓｏｎ−Ａｌｂｅｒｔｓｓｏｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，６１７：３１７〜３８２（１９８０）；ＦｏｓｔｅｒおよびＨｅｒｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，４６：９８１〜９９０（１９９２）；ＧｌｏｓｓｍａｎｎおよびＧｉｐｓ，Ｎａｕｎｙｎ．Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｅｒｓ Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２８２：４３９〜４４４（１９７４）；ハットリ、およびイワサキ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（東京），８８：７２６〜７３６（１９８０）；Ｈａｙｎｅｓら、ＡＩＣＨＥ Ｊｏｕｒｎａｌ−Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ，３７：１４０１〜１４０９（１９９１）；Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，３３１：１１〜２１（１９８５）；ＫｅｓｓｅｌおよびＭｃＥｌｈｉｎｎｅｙ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１４：１１２１〜１１２９（１９７８）；ＫｏｗａｌｃｚｙｋおよびＢａｎｄｕｒｓｋｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，２７９：５０９〜５１４（１９９１）；Ｋｕら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，３３：１０８１〜１０８８（１９８９）；クボイら、化学工学論文集，１６：１０５３〜１０５９（１９９０）；クボイら、化学工学論文集，１６：７５５〜７６２（１９９０）；クボイら、化学工学論文集，１７：６７〜７４（１９９１）；クボイら、化学工学論文集，１６：７７２〜７７９（１９９０）；ＬｉｌｌｅｈｏｊおよびＭａｌｉｋ，Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４０：１９〜７１（１９８９）；ＭａｔｔｉａｓｓｏｎおよびＫａｕｌ，"Ｕｓｅ ｏｆ ａｑｕｅｏｕｓ ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ"（会議論文），３１４，Ｓｅｐａｒ．Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｐｕｒｉｆ．：Ｍａｔｈ．Ｍｏｄｅｌ．，７８〜９２（１９８６）；Ｏｈｌｓｓｏｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，５：５８３〜５９０（１９７８）；Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｊａｐａｎ，２５：１３４〜１３９（１９９２）；Ｚａｓｌａｖｓｋｉｉら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．，４３９：２６７〜２８１（１９８８）；Ｚａｓｌａｖｓｋｉｉら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｆａｒａｄａｙ Ｔｒａｎｓ．，８７：１４１〜１４５（１９９１）；米国特許第４，８７９，２３４号（１９８９年１１月７日発行）（欧州特許第２１０，５３２号に対応）；独国（旧東ドイツ）特許第２９８，４２４号（１９９２年２月２０日公開）；ＷＯ９２／０７８６８（１９９２年５月１４日公開）；ならびに米国特許第５，０９３，２５４号を参照のこと。また、Ｈｅｊｎａｅｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，５：７９７〜８０６（１９９２）も参照のこと。
【００１２】
水性二相抽出／単離の系は、独国特許第２８８，８３７号に記載されている。組み換えタンパク質の選択的な富化のためのこの方法では、タンパク質含有ホモジネートが、相非相溶性のポリマーとしてＰＥＧおよびポリビニルアルコールから構成される、水性二相系中に懸濁される。インターフェロンの精製は、独国特許第２，９４３，０１６号に開示されるような種々のＰＥＧ誘導体を用いる、水性のＰＥＧデキストラン系またはＰＥＧ−塩の系中の粗インターフェロン溶液の選択的分配によって達成された。
【００１３】
米国特許第５，６９５，９５８号は、水性の発酵ブロスのような非天然構造の外因性ポリペプチドを、細胞から単離するための方法を提供し、該ポリペプチドは、このポリペプチドとカオロトピック剤、好ましくは還元剤と、および相形成性の種とを接触させて複数の水相を形成する工程を含む方法で調製され、ここでこの相のうちの１つは、細胞由来のバイオマス固体や核酸が僅かに含まれるポリペプチドが富化されている。
【００１４】
米国特許第６，４３７，１０１号は、生物学的供給源から、ヒト成長ホルモン、成長ホルモンアンタゴニストまたはいずれかの相同体を単離するための方法を記載している。米国特許第６，４３７，１０１号に記載される方法は、多相抽出方法を用いる。
【００１５】
米国特許第７，０６０，６６９号は、水性二相抽出における目的のタンパク質の抽出のための方法であって、このようなタンパク質をこの相の１つの中に運ぶ能力を有する標的タンパク質に対して、このようなタンパク質を融合することによる方法を提供する。
【００１６】
この抽出技術の主な利点は、この方法が効率的であり、大規模化が容易であり、連続遠心分離機を用いる場合、迅速であり、比較的低コストであり、生体適合性を最大化するべく、水含量が高いということである。現在、タンパク質を精製するための水性二相系の産業上の適用は、比較的少ない。
【００１７】
ＧＣＳＦタンパク質を水性の二相抽出を用いてその天然型で、かつ変性剤の非存在下で精製することは、いままでのところ、記載されていない。
【発明の概要】
【００１８】
一態様では、本発明は、微生物細胞由来の封入体の形態で得られる組み換えヒトＧＣＳＦの精製のための方法であって、少なくとも１つの水性二相抽出工程を含む方法に関する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、微生物細胞から封入体の形態で得られる組み換えヒトＧＣＳＦの精製のための方法に関し、この方法は以下の工程：
ａ）ＧＣＳＦの封入体を可溶化する工程と；
ｂ）該可溶化されたＧＣＳＦタンパク質を再折り畳みする工程と；
ｃ）水性二相抽出を用いることにより再折り畳みされたＧＣＳＦを精製する工程と；
ｄ）必要に応じて、工程ｃで得られる天然のＧＣＳＦをさらに精製する工程と；
ｅ）純粋なＧＣＳＦを単離する工程と；
を含む。
【００２０】
別の態様では、本発明は、天然型のＧＣＳＦを単離するための水性二相抽出方法に関する。
【００２１】
本発明の別の態様は、水性二相抽出方法の少なくとも１つの工程を含む、本発明の方法によって得られる精製されたＧＣＳＦである。
【００２２】
さらなる態様では、本発明は、下側の相における再折り畳みされたタンパク質ＧＣＳＦから９５％を超える宿主細胞タンパク質、内毒素およびＤＮＡを分離するための水性二相抽出方法に関し、ここでこの再折り畳みされたタンパク質は、原生動物細胞において封入体の形態で発現される哺乳動物ポリペプチド（哺乳動物生物体にもともと由来したポリペプチド）である。この方法はまた、組織および血液サンプルなどの天然の供給源からのＧＣＳＦ精製に適用されてもよい。
【００２３】
別の態様では、本発明はまた、水性二相抽出方法の少なくとも１工程を含む、本発明の方法によって得られる生物学的に活性なＧＣＳＦの治療上有効な量を含む医薬組成物に関する。
【００２４】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、下の詳細な説明に示す。本発明の特徴、目的および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＧＣＳＦの精製のための水性二相抽出方法の模式的な説明。
【図２】精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイル
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本明細書において用いる場合、「還元剤」とは、分子内または分子間のジスルフィド結合が化学的に破壊されるように、水溶液中で適切な濃度で、スルフヒドリル基を維持する化合物を指す。適切な還元剤の代表的な例としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、βメルカプトエタノール（ＢＭＥ）、システイン、システアミン、チオグリコレート、グルタチオンおよび水素化ホウ素ナトリウムが挙げられる。
【００２７】
本明細書において用いる場合、「カオトロピック剤」とは、水溶液中で適切な濃度で、ポリペプチドの表面での変化を通じてそのポリペプチドの空間的な立体配置または構造を変化させ、それによってこの水性媒体中でこのポリペプチドを可溶性にさせる化合物を指す。この変化は、例えば、水和の状態、溶媒環境または溶媒−表面の相互作用を変化させることによって生じ得る。カオトロピック剤の濃度は、その強度および有効性に直接影響する。強力に変性させるカオトロピック溶液は、カオトロピック剤を高濃度で含み、溶液中に存在するポリペプチドを効率的に溶液中で解く。この解きは比較的広範であるが可逆的である。穏やかに変性させるカオトロピック溶液は、カオトロピック剤を含み、これは溶液中で十分な濃度で、溶液中の可溶性中間体を介すると考えられている、ポリペプチドの持つどんな捩れ構造も、内因性または相同な生理的条件下、その活性型で取り扱う場合にペプチド自身が見出す空間的な構造への、ポリペプチドの部分的な折り畳みを可能にする。カオトロピック剤の例としては、塩酸グアニジン、尿素、および水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムのような水酸化物が挙げられる。カオトロピック剤としては、これらの試薬の組み合わせ、例えば、塩基と尿素または塩酸グアニジンとの混合物が挙げられる。
【００２８】
本明細書において用いる場合、「封入体」という用語は、凝集した目的のポリペプチドの高密度の細胞内塊を指し、これは全細胞成分を含めた、総細胞タンパク質のかなりの部分を構成する。これらの凝集したポリペプチドは、不正確に折り畳まれるタンパク質である場合もあるし、または部分的に正確に折り畳まれるタンパク質である場合もある。全ての場合ではないが、いくつかの場合には、ポリペプチドのこれらの凝集体は、位相差顕微鏡下で１０００倍未満の倍率で、細胞内容物内で可視の明るいスポットとして認識され得る。
【００２９】
本明細書において用いる「治療上有効な量」という用語は、生物学的に活性なＧ−ＣＳＦの治療効果を有する、生物学的に活性なＧ−ＣＳＦの量を指す。
【００３０】
本明細書において用いる「生物学的に活性なＧ−ＣＳＦ」という用語は、造血系前駆体細胞の分化および増殖、ならびに造血系の成熟細胞の活性化を促進し得るＧ−ＣＳＦを指す。
【００３１】
ある実施形態では、本発明は、微生物細胞から得られる天然型の組み換えＧＣＳＦの大規模精製のための方法を提供する。
【００３２】
本発明による方法は以下の工程：
ａ）ＧＣＳＦの封入体を可溶化する工程と；
ｂ）該可溶化されたＧＣＳＦタンパク質を再折り畳みする工程と；
ｃ）水性二相抽出を用いることによりこの再折り畳みされたＧＣＳＦを精製する工程と；
ｄ）必要に応じて、工程ｃで得られる天然のＧＣＳＦをさらに精製する工程と；
ｅ）純粋なＧＣＳＦを単離する工程と；
を含む。
【００３３】
本発明の一実施形態によれば、この封入体は、適切な可溶化緩衝液および適切なカオトロピック剤中に、７〜１２の範囲のｐＨで溶解される。適切な緩衝液としては限定するものではないが、Ｔｒｉｓ（塩化物／マレイン酸塩）緩衝液、リン酸塩（ナトリウムおよびカリウム）緩衝液、グリシン水酸化ナトリウム緩衝液、ホウ酸−ホウ砂緩衝液、ホウ砂−水酸化ナトリウム緩衝液、炭酸−重炭酸緩衝液などが挙げられる。
【００３４】
適切なカオトロピック剤としては、尿素およびグアニジンまたはチオシアン酸の塩、好ましくは尿素、塩酸グアニジンまたはチオシアン酸ナトリウムが挙げられる。緩衝液中に存在することが必要なカオトロピック剤の量は、例えば、存在するカオトロピック剤およびポリペプチドの種類に依存する。必要なカオトロピック剤の量は、溶液に存在するポリペプチドを解くのに十分でなければならない。溶液のｐＨは、カオトロピック剤に依存し、尿素については、溶液のｐＨは、９〜１２の範囲で維持され、塩酸グアニジンについては、このｐＨは７〜９の範囲である。溶液のＯＤは、約２〜約１２の範囲である。
【００３５】
微生物の封入体を可溶化するために用いられ得る界面活性剤および他の試薬としては、ＳＤＳ、ＣＴＡＢ、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、Ｓａｒｃｏｓｙｌ、オクチル・ベータグルコシド（Ｏｃｔｙｌ ｂｅｔａｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、ドデシル・マルトシド、ＮＤＳＢが挙げられる。（以下の引用文献による：Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｓｃａｌｅ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｙ，編集Ａｂｈｉｎａｖ Ａ Ｓｈｕｋｌａ、Ｍａｒｋ Ｒ ＥｔｚｅｌおよびＳｈｉｓｈｉｒ Ｇａｄａｍ，Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓ，２００７ 第１２９頁、（これはその全体が参照によって本明細書に援用される）。
【００３６】
可溶化された封入体を含む溶液は、１０〜３０℃の範囲の温度で還元剤によって処理される。還元剤としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、βメルカプトエタノール（ＢＭＥ）；システイン、チオグリコレートおよび水酸化ホウ素ナトリウムから１つ以上が挙げられる。緩衝液中に存在すべき還元剤の量は主に、還元剤およびカオトロピック剤の種類、使用される緩衝液の種類およびｐＨ、ならびに緩衝液中のポリペプチドの種類および濃度に依存する。還元剤の有効量とは、細胞内ジスルフィド媒介性凝集を排除するために十分な量である。好ましい還元剤はＤＴＴである。
【００３７】
本発明のある実施形態では、タンパク質ＧＣＳＦは、再折り畳み緩衝液中で可溶化されたＧＣＳＦを再折り畳みすることによって天然型で得られる。典型的には、再折り畳み緩衝液は、適切な緩衝液、アルギニンまたはプロリンのようなアミノ酸、スクロース、ＥＤＴＡ、アスコルビン酸ナトリウム、尿素を含んでもよい。アスコルビン酸ナトリウムが再折り畳み緩衝液中で用いられる場合、再折り畳みの間の酸化還元条件を得るべく、デヒドロアスコルビン酸および還元グルタチオンも、再折り畳み緩衝液に添加される。あるいは、システイン／シスチンのような、オキシドシャッフリング（ｏｘｉｄｏ−ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）剤、または酸化および還元されたグルタチオンもまた用いられてもよい。
【００３８】
再折り畳みは、５〜２０℃の範囲の温度、好ましくは６〜１０℃の温度で行われる。再折り畳みのために必要な時間は、約６〜２４時間、好ましくは１５〜２０時間かかってもよい。
【００３９】
タンパク質の再折り畳みが終了した後、ダイアフィルトレーションを行ってもよい。変性剤の除去のために、緩衝液の交換は、スクロースまたはソルビトールを有するＴｒｉｓ緩衝液を用いることによって行われてもよい。
【００４０】
本発明のある実施形態では、タンパク質ＧＣＳＦは、水性二相抽出を用いることによってさらに単離され、かつ精製される。再折り畳みされたＧＣＳＦタンパク質を含むダイアフィルトレーションされた溶液に、相形成性のポリマー−塩の組み合わせを添加する。相形成性剤、相形成性剤の組み合わせおよび適切な相形成性剤を選択するのに考慮するパラメーターの例は、Ｄｉａｍｏｎｄら、１９９２（前出）、およびＡｂｂｏｔｔら、１９９０，Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ １：１９１〜２２５（その両方ともその全体が参照によって本明細書に援用される）に考察される。ポリマーおよび塩は、二相系が形成されるような条件下および濃度で用いられる。
【００４１】
適切なポリマーの例としては限定するものではないが、例えば、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ６０００およびＰＥＧ８０００のような、約２０００〜８０００の分子量を有する、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはその誘導体類が挙げられる。
【００４２】
相形成性の塩としては、無機または有機の塩が挙げられ、これらは、好ましくは、ポリペプチドを沈殿させるようには作用しない。陰イオンは、水性多相系を形成する能力を有する陰イオンが選択される。例としては、硫酸アンモニウム、リン酸二ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸アンモニウム、クエン酸カリウム、リン酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸アンモニウム、硫酸マンガン、リン酸マンガンなどが挙げられる。二相性の水系を形成するのに有用な塩の種類は、その全体が参照によって本明細書に援用されるＺａｓｌａｖｓｋｉｉら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．，４３９：２６７−２８１（１９８８）でさらに詳細に評価されている。相形成のために好ましい塩は、硫酸ナトリウム、硫酸カリウムおよび硫酸アンモニウムである。
【００４３】
本発明のある実施形態では、相形成性剤の濃度は多様であってもよい。重量／容量で表される相形成性のポリマーの濃度は、約４％〜約１８％の範囲、好ましくは約８％〜約１２％である。さらに別の実施形態では、重量／容量で表される相形成性の塩の濃度は、約４％〜約１８％、好ましくは約６％〜約１２％の範囲にある。
【００４４】
得られた抽出混合物は、別個の相を形成するために処理され、その１つは、天然型のタンパク質ＧＣＳＦを豊富に含む。このような処理は、例えば、抽出混合物を遠心分離することによって、または数時間の間その混合物を静置させる（１×Ｇで沈降または合体させる）ことによって成され得る。さらなる態様では、一旦別個の相が形成されれば、タンパク質ＧＣＳＦを豊富に含む相、すなわち通常、上部の軽い相が除去されうる。
【００４５】
必要に応じて、タンパク質ＧＣＳＦを含む相の除去後、タンパク質ＧＣＳＦを含まない相を再抽出してもよい（「二段階抽出」）。再抽出は、第二の軽い相を形成し得る相形成性剤を含有する溶液を添加することによって成されてもよく、その結果、これによって、再抽出においてタンパク質ＧＣＳＦが富化されている相が形成される。別の態様では、二段階抽出の間、相形成性剤を溶解し、この系を徹底的に混合するべく、抽出混合物が攪拌される。得られた再抽出混合物は、別個の相を形成し、そのうちの１つは、タンパク質ＧＣＳＦが富化されているように、処理される。
【００４６】
抽出精製後、タンパク質ＧＣＳＦは、抽出系から取り出された相中で検出され得る。例えば、このタンパク質は、種々の方法、限定するものではないが、バイオアッセイ、ＨＰＬＣ、アミノ酸決定または免疫学的アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、抗体結合を用いるウエスタンブロット、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを含めて様々な方法によって検出され得る。このような抗体としては限定するものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラグメント、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられる。精製されたタンパク質の量およびそれらの純度のレベルは、当該分野で周知の方法によって決定され得る。
【００４７】
本発明の方法を用いて得られるタンパク質は、例えば、高純度のタンパク質またはポリペプチドを得るためにさらに処理されてもよい。関連の不純物を除去するために、さらなる精製が必須である場合がある。不純物としては、酸化型、脱アミノ型、凝集されたＧＣＳＦ、およびまた分解型、例えば、生物学的に不活性なモノマー型、不正確に折り畳まれたＧ−ＣＳＦ分子、Ｇ−ＣＳＦの変性型、宿主細胞タンパク質、宿主細胞物質、例えば、ＤＮＡ、（リポ）ポリサッカライドなどおよびＧ−ＣＳＦの調製および処理に用いられた添加物を挙げることができる。このようなより高い純度が、そのタンパク質またはポリペプチドが意図する用途次第で必要である場合がある。例えば、タンパク質の治療的な使用は通常、本発明の抽出方法後のさらなる精製を要する。当業者に公知の全てのタンパク質精製方法が、さらなる精製のために用いられ得る。このような技術は、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１５２巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９８７）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ａｌｌ Ｖｉｏｌｓ．，１９８９，ならびにその定期更新）；Ｎｅｗ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．編集，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．，１９８８；ならびにＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，第３版，Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．Ｋ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ− Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８７に詳細に記載されており、これらは、その全体が参照によって本明細書に援用される。一般には、限定するものではないが、硫酸アンモニウム沈殿、遠心分離、イオン交換、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む技術がタンパク質の更なる精製に用いられて良い。
【００４８】
好ましい実施形態では、ＧＣＳＦタンパク質を含む上部相を希釈して、３〜６ｍＳ／ｃｍの範囲に、好ましくは４〜５ｍＳ／ｃｍの範囲に伝導率を調整する。ｐＨはまた、３〜５．５の範囲で、好ましくは４〜５の範囲で調整する。関連の不純物とともにＧＣＳＦを含んでいる得られた溶液を、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いることによって、さらに精製して、関連の不純物を除去してもよい。別の選択肢では、上部の相をまた、適切な塩の添加により疎水性相互作用クロマトグラフィーに供してもよい。
【００４９】
本発明の方法によって得られる純粋タンパク質ＧＣＳＦの収率は、４０〜５０％の範囲にある。
【００５０】
本発明の一実施形態によれば、水性二相抽出は、９５％より多くの宿主タンパク質、内毒素およびＤＮＡを再折り畳みされたタンパク質ＧＣＳＦから分離するために有用である。本発明の方法によって得られたタンパク質ＧＣＳＦは、９９％以上の純度を有する。本発明の方法によって得られるＧＣＳＦが含む酸化不純物は極めて低い。本発明の方法によって得られる純粋なＧＣＳＦに存在する内毒素は２ＩＵ／ｍｌ未満である。純粋ＧＣＳＦ中の宿主細胞タンパク質の含量は２０ｐｐｍ未満である。
【００５１】
本発明による水性二相抽出方法の少なくとも１つの工程を含む、天然型のＧＣＳＦの精製は、哺乳動物の組織および血液のような任意の天然の供給源から得られる天然のＧＣＳＦに用いてもよい。記載される方法はＧＣＳＦの工業的製造のために特に適している。
【００５２】
本明細書に記載されるような純粋なＧＣＳＦを得る方法はさらに、純粋なＧＣＳＦを臨床用途のための完成した剤形に形成する工程を含む。
【００５３】
本発明の精製および／または単離のための全方法によって得られる生物学的に活性なＧ−ＣＳＦは、治療上有効な量の生物学的に活性なＧ−ＣＳＦおよび１つ以上の医薬賦形剤を含む、医薬組成物の調製に適し、かつ臨床の用途に適している。短時間の精製および単離の方法において活性型のＧ−ＣＳＦを維持する能力は、収率の改善に寄与するだけでなく、生物学的に活性なＧ−ＣＳＦおよびそれを含有する医薬組成物の純度および有効性の改善にも寄与する。
【００５４】
適切な医薬上許容される賦形剤としては、限定するものではないが、Ｇ−ＣＳＦ療法において有用な、適切な希釈剤、アジュバントおよび／または担体が挙げられる。
【００５５】
さらに別の実施形態では、本発明は、本発明によって得られるＧＣＳＦを含む医薬組成物に関する。得られたＧＣＳＦは、凍結乾燥型または液体型のいずれで貯蔵されてもよい。これは、皮下または静脈内のいずれかに投与される。組み換え発現されるＧＣＳＦの処方物中の適切なアジュバントは、例えば、糖および糖アルコールのような安定化剤、アミノ酸およびポリソルベート２０／８０のような界面活性剤ならびに適切な緩衝物質である。処方物の例は、欧州特許第０６７４５２５号、欧州特許第０３７３６７９号および欧州特許第０３０６８２４号に記載されており、その両方ともが全体として参照によって本明細書に援用される。
【００５６】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するために示しているが、決して本発明の範囲を限定するために示すものではない。
【００５７】
実施例１：純粋なＧＣＳＦを得るための一般的方法
工程Ａ：ＧＣＳＦの封入体を、１００ｍＭのＴｒｉｓ ６Ｍ ＧｕＨＣｌ ｐＨ８．０を含有する緩衝液に可溶化する。可溶化には約４５分かかる。可溶化された封入体のＯＤを、可溶化緩衝液を用いて８．０に調整する（通常は１ｇの封入体あたり、４５ｍｌの可溶化緩衝液を用いる）。この溶液を０．４５μｍのフィルターを通して濾過する。ＤＴＴを、最大５ｍＭまで添加して、タンパク質を還元する。還元は、室温（２５℃）で３０分間行う。
【００５８】
工程Ｂ：可溶化されたＧＣＳＦを、３０〜４５分の期間中、撹拌しながら、再折り畳み緩衝液に添加する。再折り畳み緩衝液は、７５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．８）、０．１ＭのＬ−アルギニン、１０％のスクロース、２ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム、２Ｍの尿素を含む。１ｇの封入体に対しては、１リットルの再折り畳み緩衝液を用いる。緩衝液の温度は、約８．０℃で維持される。再折り畳みは、１５〜２０時間行われる。アスコルビン酸ナトリウムを、再折り畳み緩衝液中で用いる場合、再折り畳みの間、酸化還元条件を与えるべく、デヒドロアスコルビン酸および還元グルタチオンも再折り畳み緩衝液に添加する。あるいは、システイン／シスチンのようなオキシド−シャッフリング（ｏｘｉｄｏ−ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）剤、または酸化および還元されたグルタチオンもまた用いてもよい。
【００５９】
再折り畳みの終了後、再折り畳みされたタンパク質の緩衝液交換を、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、５％スクロースまたは５％Ｄ＋ソルビトール中で行い、変性剤を除去する。
【００６０】
工程Ｃ：タンパク質を含有するダイアフィルトレーションした溶液に、最終溶液中のＰＥＧ４０００濃度が１０％（ｗ／ｗ）になるように、ＰＥＧ４０００を添加する。ＰＥＧを溶解した後、塩（硫酸ナトリウム）を、最終溶液中でのその濃度が８％（ｗ／ｗ）になるように添加する。塩が溶解した後、相の形成が生じるように、その溶液を撹拌することなく静置する。二相が形成され、すなわち、塩の相およびＰＥＧ相が形成される。ＧＣＳＦは、上部の相（ＰＥＧ相）に入る。下部の相を廃棄し、ここで不純物を除去する。上部の相を純度についてチェックする。ＧＣＳＦタンパク質を含む上部相のｐＨを４．５に調整し、次いで、ダイアフィルトレーションまたは希釈して、伝導率を約４〜６ｍＳ／ｃｍにする。
【００６１】
工程Ｄ：次いで、この溶液を、ｐＨ４．５で陽イオン交換体（ＳＰ ＦＦセファロース）にロードする。カラムは、２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で事前に平衡化している。ロードが終わった後、カラムを２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）緩衝液で洗浄する。洗浄が終わった後、結合したタンパク質を、２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）緩衝液中ＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出する。
【００６２】
工程Ｅ：次いで、精製されたＧＣＳＦを製剤緩衝液（１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、５％ソルビトール、０．００４％のＴｗｅｅｎ８０）へ緩衝液交換した。
【００６３】
精製されたＧＣＳＦタンパク質は、市販のＧＣＳＦ製品と同様のインビトロの生物活性である。
【００６４】
実施例２：
２ｇの封入体を、１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、６Ｍの塩酸グアニジン緩衝液中に可溶化した。可溶化は、２５℃で４５分間行った。可溶化された封入体溶液を０．４５ミクロンのポリエーテルスルホンフィルターを通して濾過した。濾過された溶液の２８０ｎｍでのＯＤをチェックして、必要量の可溶化緩衝液を添加することによって８．０に調整した。９０ｍｌの可溶化された封入体溶液に、ＤＴＴを、最終濃度が５ｍＭになるように添加した。還元は、３０分間行った。還元後、封入体溶液を、以下の組成に従う２０００ｍｌの再折り畳み緩衝液に緩徐に添加した：７５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．８）、１０％スクロース、２Ｍ尿素、０．１Ｍ Ｌ−アルギニン、２ｍＭのＥＤＴＡ。温度は８〜１０℃で維持した。封入体溶液を添加した後、シスチンおよびシステインを、それぞれの最終濃度が１ｍＭおよび４ｍＭになるように添加する。再折り畳みは、１０℃で１５時間行った。
【００６５】
再折り畳みが終了した後、この再折り畳みされたタンパク質を、１リットルに濃縮し、タンジェント流濾過（ＴＦＦ）を用いて２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、５％ソルビトールの３ダイアフィルトレーション容量に対してダイアフィルトレーションした。このダイアフィルトレーションされた溶液に１２２ｇのＰＥＧ４０００を添加した。ＰＥＧを溶解した後、９７．６ｇの硫酸ナトリウムを添加した。次いで、この溶液を重力沈降のために静置した。次いで上部相を回収して、２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）、５％ソルビトールで希釈して、ｐＨを４．５に、そして伝導率を５．５ｍＳ／ｃｍに調整した。次いで、この希釈溶液を、２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）、５％ソルビトールで平衡にしたＳＰセファロースカラム上にロードした。ロードおよび２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）５％ソルビトール緩衝液での洗浄後、さらに２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）５％ソルビトール緩衝液での洗浄を行う。次いで結合したタンパク質を、直線濃度勾配の２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）５％ソルビトール、１ＭのＮａＣｌを用いて、７０ＣＶで溶出した。ＲＰ−ＨＰＬＣにより９９％を超える純度の溶出画分をプールした。次いで、このプールした画分を１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、５％ソルビトール、０．００４％のＴｗｅｅｎ８０に対して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５媒体ゲル濾過カラム（ｍｅｄｉｕｍ ｇｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃｏｌｕｍｎ）を用いて緩衝液交換した。２００ｍｇの治療等級の純粋なＧＣＳＦを、上記の方法から得た。図２は、精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルを示す。上部相は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより９９％を超える純度を示す。イオン交換後の最終精製されたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより９９％を超え、そしてＲＰ−ＨＰＬＣにより９８．５％を超える純度を示す。得られた収率は４５％であった。
【００６６】
本発明はその特定の実施形態に関して記載してきたが、特定の改変および等価物は、当業者に明白であり、かつ本発明の範囲内に含まれるものとする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物細胞から得られる純粋な組み換えヒトＧ−ＣＳＦの調製のための方法であって：
ａ）ＧＣＳＦの封入体を可溶化する工程と；
ｂ）該可溶化されたＧＣＳＦタンパク質を再折り畳みする工程と；
ｃ）水性二相抽出を用いることにより該再折り畳みされたＧＣＳＦを精製する工程と；
ｄ）必要に応じて、工程ｃで得られる天然のＧＣＳＦをさらに精製する工程と；
ｅ）純粋なＧＣＳＦを単離する工程と；
を含む方法。
【請求項２】
前記水性二相抽出系が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および塩の相を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＰＥＧが約２０００〜約８０００という分子量を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記塩の相が、硫酸ナトリウム、硫酸カリウムおよび硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、リン酸アンモニウムおよびリン酸カリウムのうちの１つ以上を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記相形成性ポリマーの濃度が約４％〜約１８％（ｗ／ｗ）の範囲内である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記相形成性の塩の濃度が約４％〜約１８％（ｗ／ｖ）の範囲内である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、工程（ｃ）で得られる天然のＧ−ＣＳＦが、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーのうちの１つ以上を含んでいる追加のクロマトグラフィー精製工程によってさらに精製される、方法。
【請求項８】
純粋なＧＣＳＦを完成した剤形に形成する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
２ＩＵ／ｍｌ未満の内毒素および２０ｐｐｍ未満の宿主細胞タンパク質を有する、９９％以上の純度を有する純粋Ｇ−ＣＳＦ。
【請求項１０】
水性二相抽出の少なくとも１つの工程を含む方法によって調製される、純粋ＧＣＳＦ．
【請求項１１】
水性二相抽出の少なくとも１つの工程を含む方法によって得られる生物学的に活性なＧＣＳＦの治療上有効な量、および１つ以上の医薬上に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１】
微生物細胞から得られる純粋な組み換えヒトＧ−ＣＳＦの調製のための方法であって：
ａ）ＧＣＳＦの封入体を可溶化する工程と；
ｂ）該可溶化されたＧＣＳＦタンパク質を再折り畳みする工程と；
ｃ）水性二相抽出を用いることにより該再折り畳みされたＧＣＳＦを精製する工程と；
ｄ）必要に応じて、工程ｃで得られる天然のＧＣＳＦをさらに精製する工程と；
ｅ）純粋なＧＣＳＦを単離する工程と；
を含む方法。
【請求項２】
前記水性二相抽出系が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および塩の相を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＰＥＧが約２０００〜約８０００という分子量を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記塩の相が、硫酸ナトリウム、硫酸カリウムおよび硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、リン酸アンモニウムおよびリン酸カリウムのうちの１つ以上を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記相形成性ポリマーの濃度が約４％〜約１８％（ｗ／ｗ）の範囲内である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記相形成性の塩の濃度が約４％〜約１８％（ｗ／ｖ）の範囲内である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、工程（ｃ）で得られる天然のＧ−ＣＳＦが、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーのうちの１つ以上を含んでいる追加のクロマトグラフィー精製工程によってさらに精製される、方法。
【請求項８】
純粋なＧＣＳＦを完成した剤形に形成する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
２ＩＵ／ｍｌ未満の内毒素および２０ｐｐｍ未満の宿主細胞タンパク質を有する、９９％以上の純度を有する純粋Ｇ−ＣＳＦ。
【請求項１０】
水性二相抽出の少なくとも１つの工程を含む方法によって調製される、純粋ＧＣＳＦ．
【請求項１１】
水性二相抽出の少なくとも１つの工程を含む方法によって得られる生物学的に活性なＧＣＳＦの治療上有効な量、および１つ以上の医薬上に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１２−５３０１３１（Ｐ２０１２−５３０１３１Ａ）
【公表日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１５６３０（Ｐ２０１２−５１５６３０）
【出願日】平成２２年６月７日（２０１０．６．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＮ２０１０／０００３７７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４６５９９
【国際公開日】平成２２年１２月２３日（２０１０．１２．２３）
【出願人】（５０２４２５９１６）ルピン・リミテッド (27)
【氏名又は名称原語表記】ＬＵＰＩＮ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月７日（２０１０．６．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＮ２０１０／０００３７７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４６５９９
【国際公開日】平成２２年１２月２３日（２０１０．１２．２３）
【出願人】（５０２４２５９１６）ルピン・リミテッド (27)
【氏名又は名称原語表記】ＬＵＰＩＮ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
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