組成物と治療用抗腫瘍ワクチン
本発明は、宿主において、抗原を発現する細胞、特に腫瘍細胞に対する細胞障害性細胞応答を誘導し、かつ該抗原を含有する赤血球を含む組成物に関する。これらの赤血球は、樹状細胞による該赤血球の貪食を促進するように、赤血球の表面上のエピトープを認識する免疫グロブリン、特にＩｇＧとの免疫複合体の形でもよく、及び／又は熱処理もしくは化学処理される。変更態様として、赤血球は異種赤血球でもよい。本発明はまた、治療薬、特にこのような組成物を含有する抗腫瘍ワクチンに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第６０／９５４，９１７号（２００７年８月９日出願）、およびフランス国特許出願第ＦＲ０７０５７６７号（２００７年８月８日出願）（いずれも参照することにより本明細書に組み込まれる）の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、宿主において抗腫瘍目的の細胞障害性応答を誘導する組成物に、及びまたこの組成物を含有する治療用抗腫瘍ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００３】
腫瘍抗原に対する自然の免疫応答は余り有効ではなく、腫瘍が抗腫瘍免疫応答を逃れる種々の機構が証明されている。通常のワクチンによるアプローチは体液性応答を発生するが、これは不充分であることが証明されている。
【０００４】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）に基づいて（特に樹状細胞に基づく）細胞障害性応答を発生させることを目的とする方法が研究されている。この原理は、患者自身の免疫防御機構を刺激して患者の癌細胞を特異的に破壊することである。
【０００５】
樹状細胞は、腫瘍細胞に特異的な細胞障害性エフェクターを生成するのに非常に有効な抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。これは、腫瘍細胞から生じるアポトーシス細胞又はアポトーシス小体を貪食し、次にＭＨＣクラスＩ及びクラスII分子とともに腫瘍抗原をＴリンパ球に提示することができる。すなわち樹状細胞は、特異的細胞障害性Ｔリンパ球のクローンの増殖と生成を開始させることができる。この反応の最後で、こうして分化したキラーリンパ球は、リンパ球コンパートメントから離れて、生体中を循環し、腫瘍中で結合する。次に腫瘍により発現される抗原の認識が、溶解シグナルを誘導し、腫瘍細胞の破壊をもたらす。
【０００６】
樹状細胞を標的とするいくつかの抗癌ワクチン法が研究されている（Eymard JC, Bernard J, Bull Cancer, 2003, 90(8-9): 734-43）。これらのいくつかはインビトロで樹状細胞を操作することに基づき、別の方法は、インビボで樹状細胞を刺激することに基づく。最初のケースでは、患者から採取した血液細胞から樹状細胞を分化させる：これは培養され、成熟され、「パルス」され、すなわちエクスビボで腫瘍ペプチド、腫瘍溶解物、アポトーシス性腫瘍細胞、又は自己由来腫瘍から抽出した熱ショックタンパク質で刺激され、最後に患者に再注入される。第２のケースでは、樹状細胞を標的とするペプチド、タンパク質、放射線照射腫瘍細胞、又は抗原性ペプチドを含有するウイルスを患者に注入後、樹状細胞の刺激が行われる。しかし得られる細胞障害性応答は、あまり臨床的効力は無い。樹状細胞の活性化は、細胞障害性Ｔリンパ球を有効に活性化するその能力を「調整」する。樹状細胞の活性化レベルは、このワクチン法の難しい点である。
【０００７】
抗腫瘍ワクチンを得るためのエクスビボの樹状細胞の使用には、いくつかの問題（２次リンパ器官に遊走し、有効な細胞障害性Ｔ応答を誘導できる樹状細胞を生成するための、樹状細胞の成熟状態、注入される細胞の数、注入経路、部位、及び頻度）が生じる（Banchereau J, Schuler-Thurner B, Palucka AK, Schuler G. [Dendritic cells as vectors for therapy] Cell. 2001, 10, 106(3): 271-4）。
【０００８】
インビボでの樹状細胞の活性化は、腫瘍抗原の弱い免疫原性と、樹状細胞を充分なレベルに活性化する困難さにより限定される。
赤血球中に封入されているか又はその表面に結合してＡＰＣに送られる抗原を運搬するための担体としての赤血球の使用は、いくつかの文献で企図されている。引き起こされた免疫応答は、インビトロとインビボで研究されている。
【０００９】
Hamidiらは最近、ヒト赤血球中の抗原のモデルとしてＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）の封入を記載した（Hamidi M et al., Drug Deliv., 2007;14(5): 295-300、及びInt J Pharm., 2007, 29, 338(1-2): 70-8）。著者らは、網内系（ＲＥＳ）ＡＰＣへの抗原提示のためのベクターとして、赤血球の使用を示唆した。Hamidoらにより発表された別の総説（J. Control. Release, 2007, 118(2): 145-60）では、著者らは、ＲＥＳのターゲティング（このターゲティングは、赤血球の老化により促進され、こうしてこれらを取り込み溶解する）を促進するために、いくつかの方法が研究されていることを示した。安定化剤（特に架橋剤）への赤血球の曝露、脾臓を標的とするＩｇＧ型の又は肝臓を標的とするＩｇＭ型の抗ＲＨ抗体による赤血球の被覆、熱ショック、又は酸化剤、酵素、もしくは抗生物質への曝露などの他の経路が言及されている。
【００１０】
体液性免疫応答は、抗原装填赤血球で免疫後にインビボで得ることができる。Murrayらにより行われた試験は、以下の４つの抗原［ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＣＴＢ（コレラ毒素ｂサブユニット）、及びＡＤＡ（ウシアデノシンデアミナーゼ）］の１つを装填したマウス赤血球の静脈内注射後に、マウスでＩｇＧ免疫グロブリンを検出することを可能にした。ＩｇＧ１とＩｇＧ３（これらは、Ｔｈ２応答中の主要な免疫グロブリンイソタイプである）およびＩｇＧ２（Ｔｈ１応答のマーカーである免疫グロブリンイソタイプ）の検出は、両方のタイプの免疫応答（体液性応答と細胞性応答）の関与を示唆するであろう（Murray AM et al., Vaccine., 2006 28, 24(35-36): 6129-39）。
【００１１】
赤血球で使用される別の処方の抗原が、Dominiciらにより試験された。ＨＩＶ−１ウイルスのＴａｔタンパク質が、アビジン／ビオチン結合を用いてマウス赤血球の表面に固定された。樹状細胞によりインターナリゼーションされたこの処方の抗原を腹腔内注射してマウスを免疫すると、インビボで体液性免疫応答が誘発された。検出された免疫グロブリンのイソタイプの解析は、Ｔｈ１応答とＴｈ２応答の誘導を示す。抗原に結合した赤血球で処理したマウスについて、通常のクロム放出法により、インビトロで抗Ｔａｔ細胞障害活性が証明された（Dominici S et al., Vaccine., 2003 16, 21(17-18): 2073-81）。
【００１２】
同じ処方を用いてCorintiらによりインビトロで、細胞性応答が証明された。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋応答の誘導と同様に、ヒト単核細胞から得られた細胞死滅によりＴａｔタンパク質と結合した赤血球の貪食が証明された。さらにインターフェロンガンマの存在下で樹状細胞を成熟させると、Ｉ型免疫応答が促進された（Corinti S. et al., Leukoc. Biol. 2002, 71(4): 652-8）。
【００１３】
Bobergらは、アビジン／ビオチン系を用いてマウス赤血球の表面に固定したＨＩＶ−１プロテアーゼから得られたペプチドからなるワクチンを、マウスに腹腔内注射した。彼らは、ＡＰＣによりその認識を促進する目的で、赤血球を化学的に修飾したが、弱い免疫応答が得られた。彼らは、抗原性ペプチドによる赤血球の限定された装填と注入された血液容量のために、供給された少量の抗原は、ＡＰＣによる抗原認識を促進するはずの担体の化学的修飾により補償されなかったと、結論付けた（Boberg A. et al., Infect. Agents Cancer., 2007, 182: 9）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、免疫療法アプローチに従って、癌の治療に使用できる組成物とワクチンとを提供することを目的とする。
【００１５】
従って本発明の目的は、宿主において腫瘍細胞に対する細胞障害性細胞応答を誘導し、かつ腫瘍抗原を含有する赤血球を含む組成物である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】脾臓樹状細胞による、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理された「抗原装填」赤血球の貪食のインビトロでの測定。
【図２】脾臓マクロファージ及び樹状細胞による、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理されたか又は熱処理された「抗原装填」赤血球の貪食のインビボでの測定。
【図３】マウスに注射後３日目のオバルブミン特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の増殖と活性化を示すグラフ。（Ａ）細胞分裂はＣＦＳＥ蛍光強度の低下を誘導する。各分裂により、ＯＶＡ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞はその蛍光物質の半分を失う。バッチ４で観察されるピークは、多量のＣＦＳＥを含有する非分裂細胞を示す。他のすべてのピークは、１、２、３、４、５、６、又は７回の細胞分裂を受けた細胞を示す。細胞が８回より多く分裂すると、細胞のＣＦＳＥ含量は実質的にゼロになる。（Ｂ）ＣＤ４４細胞活性化マーカーの発現は、分裂が起きる回数の関数として表される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
「宿主」という用語は、好ましくはヒトを示すが、動物、特にペット（特にイヌ又はネコ）やスポーツ用の動物（特にウマ）も示す。
本発明において赤血球は、抗原を含有すなわち封入し、これは、抗原が赤血球内にあるか又は基本的にあることを意味する。
【００１８】
赤血球は好ましくは、ＡＰＣによる、特に樹状細胞によるその貪食を促進するように設計、選択、又は修飾される。特に該赤血球は、脾臓及び肝臓中でその貪食を促進するように設計、選択、又は修飾され、基本的な目的は、脾臓のＡＰＣを標的とすることである。
【００１９】
好適な実施態様において本発明の組成物は、抗原を含有し脾臓を標的とする赤血球を含む。この組成物は、脾臓中のＡＰＣ、特に樹状細胞によるこれらの赤血球の貪食を促進する。
【００２０】
第１の実施態様において赤血球は腫瘍抗原を含有し、かつ特に樹状細胞による該赤血球の貪食を促進するように、赤血球の表面のエピトープを認識する免疫グロブリンとの免疫複合体の形である。この組成物はまた、マクロファージによる貪食を促進することを可能にする。好ましくは免疫グロブリンは免疫グロブリンＧである。
【００２１】
免疫複合体の生成には、赤血球と少なくとも１つの抗体、好ましくはＩｇＧサブタイプの抗体が関与する。樹状細胞はその表面に、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の定常Ｆｃ領域の受容体を有する。これらの受容体は、こうして生成された抗原−ＩｇＧ免疫複合体の貪食又はインターナリゼーションを開始することができ、かつＭＨＣクラスＩ及びII分子による抗原提示を促進して、ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球及び特にＣＤ８＋細胞障害性リンパ球の生成を引き起こすことができる（A. Regnault et al., J. Exp. Med., Janvier 1999, 189(2): 371-80）。
【００２２】
適切な抗体として、抗アカゲザル抗体、抗グリコホリンＡ抗体、及び抗ＣＲ１抗体（ＣＲ１＝補体受容体Ｉ型）が言及される。抗グリコホリンＡ抗体（A. Bigbee et al., Mol. Immunol., December 1983, 20(12): 1353-62）が好適である。
【００２３】
好ましくは免疫複合体を形成するのに使用されるヒト起源の赤血球は、ドナーに由来する異種赤血球である。
【００２４】
第２の実施態様において、特に樹状細胞による赤血球の貪食を促進するように、赤血球は腫瘍抗原を含有しかつ熱もしくは化学修飾される。この組成物はまた、マクロファージによる貪食を促進することを可能にする。
【００２５】
熱処理は特に以下の条件下で行われる：赤血球を、約４２〜約５５℃、好ましくは約４７〜５１℃の温度で、約１５〜約９０分、好ましくは約２５〜約５０分加熱。典型的には赤血球は、約４８〜約５０℃で、例えば約４８℃で、約３０分加熱される。
【００２６】
化学処理は、赤血球の表面を修飾する物質を使用して、特にブリッジング剤もしくは架橋剤、例えばビス（スルホスクシニミジル）スベリン酸（ＢＳ３又はＢＳ3）、グルタルアルデヒド、又はノイラミニダーゼを使用して行われる。
【００２７】
具体的な実施態様において、少なくとも２つのターゲティング法が組合わされ、例えば組成物は、免疫複合体の形の抗原含有赤血球を含み、脾臓及び／又は肝臓、特に脾臓でのその取り込みと、ＡＰＣ特に樹状細胞による貪食を促進するように、熱処理又は化学処理される。
【００２８】
第３の実施態様において、抗原含有赤血球は異種である。異種赤血球をヒトに注射すると、注射された赤血球に患者の自然の抗体が結合する。こうして形成された免疫複合体は、ＡＰＣ特に樹状細胞による貪食を促進する。好ましくは該赤血球はブタ起源である。
【００２９】
具体的な実施態様において、異種赤血球は、その貪食を促進するように熱で又は化学的に修飾される。
【００３０】
本発明の組成物は、１つ又はそれ以上の腫瘍抗原を含んでよい。数個の腫瘍抗原がある時、該腫瘍抗原は好ましくは、１つのタイプの腫瘍又は腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導するように選択される。
【００３１】
この組成物は好ましくは、処理される腫瘍を代表する少なくとも２つの腫瘍抗原を含む。この目的は、より有効な免疫応答を生成するように、それぞれが特異的抗原性ペプチドを認識する細胞障害性Ｔリンパ球の数個のクローンを生成することである。
【００３２】
具体的な実施態様においてこの組成物は、それぞれが異なる抗原を封入している少なくとも２つの赤血球集団を含む。
【００３３】
本明細書で使用可能な最も良く知られた抗原を、以下の表に分類して示す。
【００３４】
【表１】
【００３５】
【表２】
【００３６】
【表３】
【００３７】
【表４】
【００３８】
Van der Bruggenらは、Ｔリンパ球により認識され、本発明の癌免疫療法アプローチで使用できるすべてのヒト腫瘍抗原を参照するデータベースを作成した：http://www.cancerimmunity.org/peptidedatabase/Tcellepitopes.htm。
【００３９】
他の抗原が本発明で使用され、例えばガストリン１７、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、ＥＧＦＲvIII、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、Ｐ５０１、グアニリルシクラーゼＣ、ＰＡＰがある。
【００４０】
抗原という用語は、抗原が適切な免疫応答を開始できる限り、天然のもしくは合成もしくは人工起源の抗原、治療される患者由来の抗原、抗原断片、誘導体もしくは変種を包含する。抗原は、例えば抽出されるか、化学合成されるか、又は遺伝子操作により産生される。
【００４１】
有効な免疫応答を生成するために、樹状細胞は活性で成熟しており、サイトカイン及びケモカインを産生でき、Ｔリンパ球の動員と活性化に必要な共同刺激分子を発現できなければならない。
【００４２】
ＡＰＣ特に樹状細胞を刺激するために、種々のタイプのアジュバントを使用することができる。細菌もしくはウイルスＲＮＡもしくはＤＮＡ、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、糖、免疫複合体、及びサイトカインは、特異的受容体（Ｔｏｌｌ様受容体ＴＬＲ、マンノース受容体）の刺激を介してＡＰＣ成熟特に樹状細胞成熟を誘導する種々の因子である。マクロファージ及び樹状細胞はすべてが、その表面上に同じ受容体を発現するわけではない。従ってアジュバントの選択は、ヒトで細胞障害性免疫応答を生成することができる分子であって、本発明の赤血球を取り込む細胞の表面（従って特に樹状細胞の表面）にその受容体が存在する分子に関する。
【００４３】
ある実施態様においてアジュバントは、赤血球内に封入されているか、又は赤血球の表面に結合している分子である。これらは好ましくは、抗原を含有する赤血球である。
【００４４】
あるいはアジュバントは、別に処理される他の赤血球内に封入されるか、又はその表面に結合する。これらの赤血球はまた、ＡＰＣ特に樹状細胞によるその貪食を促進するように修飾又は選択される。従ってこれらは、上記したように、免疫複合体の形であるか、又は熱でもしくは化学的に修飾されるか、又は異種である。
【００４５】
別の実施態様においてアジュバントは、別のアジュバント組成物であり、これは、抗原を含有する赤血球と同時に又は別に投与することができる。
【００４６】
言うまでもないが、アジュバントが別の組成物（赤血球組成物またはアジュバント組成物）中にある限り、アジュバントは、抗原を含有する赤血球と、別の投与として又は混合物の形で同時に投与されるか、又は別に、例えば抗原を含む赤血球の投与後に、特に数時間もしくは数日間離れて投与することができる。
【００４７】
使用可能なアジュバントの中で、まず以下の好適なアジュバントが言及される。
− ＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）リガンド、特にイミダゾキノロン類、例えば好ましくは、イミダゾキノリン、例えばイミダゾキノリンＣＬ０９７、イミキモド、レシキモド；ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド；ＬＰＳ（リポ多糖）；ポリ（イノシン酸）−（ポリシチジル酸ポリ（Ｉ：Ｃ））；
− サイトカイン、特にインターフェロンアルファ、ＩＬ−２（インターロイキン２）、ＩＦＮγ（インターフェロンガンマ）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球モノサイト−コロニー刺激因子）、ＩＬ−１２（インターロイキン１２）、ＴＮＦα（腫瘍壊死因子アルファ）。
【００４８】
使用可能な他のアジュバントの中で、特に以下のものが言及される：
− 細菌成分、特にＢＣＧ（バシルスカルメットゲラン）、ＭＤＰ（ムラミルジペプチド）、ＴＤＭ（トレハロースジミコレート）、ＬＰＳ（リポ多糖）、ＭＰＬ（モノホスホリル脂質Ａ）；
− ミネラルアジュバント、特に：水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カリウム、及びリン酸カルシウム；
− 細菌毒素、特に：ＣＴ（ビブリオ・コレラ（Vibrio cholera）のコレラ毒素）、ＣＴＢ（ビブリオ・コレラ（Vibrio cholera）のコレラ毒素）、ＰＴ（百日咳菌（Bordetella pertussis）の百日咳毒素）、ＬＴ（大腸菌（Escherichia coli）の熱不安定性リンホトキシン）；
− ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）。
【００４９】
赤血球中に活性成分を封入する技術は公知であり、本発明に好適な溶解−再封鎖による基本的方法は、当業者が参照する特許ＥＰ−Ａ−１０１３４１号及びＥＰ−Ａ−６７９１０１号に記載されている。この方法では、透析要素の一次コンパートメント（例えば、透析チューブ又は透析カートリッジ）に赤血球懸濁物が連続的に供給され、一方２次コンパートメントは、赤血球を溶解するために赤血球懸濁物に対して低張である水溶液を含む；次に、再封鎖ユニットでは、浸透圧及び／又はコロイド浸透圧を上昇させることにより、腫瘍抗原の存在下で赤血球の再封鎖が誘導され、次に腫瘍抗原を含有する赤血球の懸濁物が採取される。
【００５０】
現在までに記載されている変更態様の中では、フランス国特許出願第０４０８６６７号が好ましく、これは、腫瘍抗原を効率的に、再現性良く、安全かつ安定に封入することを可能にする。この方法は以下の工程を含む：
【００５１】
１． ６５％又はそれ以上のヘマトクリットレベルで、＋１〜＋８℃に冷却しながら、等張溶液中に赤血球ペレットを懸濁、
２． 該赤血球ペレットからの赤血球の試料を使用して、浸透圧脆弱性を測定するが、工程１と２は任意の順序で実施可能である（並行して行ってもよい）、
３． ６５％又はそれ以上のヘマトクリットレベルの赤血球の懸濁液と、＋１〜＋８℃に冷却した低張溶解溶液とを、透析カートリッジ中を通過させることを含んでなる、＋１〜＋８℃で一定温度を維持した同じチャンバー内での腫瘍抗原の溶解とインターナリゼーションプロセス；溶解パラメータは、あらかじめ測定した浸透圧脆弱性に従って調整される；及び
４． 温度は＋３０〜＋４０℃で、かつ高張溶液の存在下で、第２のチャンバー中で再封鎖プロセスを行う。
【００５２】
「インターナリゼーション」とは、赤血球内への腫瘍抗原の浸透を意味する。
特に透析において、赤血球ペレットは、６５％又はそれ以上、好ましくは７０％又はそれ以上の高いヘマトクリットレベルで、等張溶液に懸濁され、この懸濁物は＋１〜＋８℃、好ましくは＋２〜６℃、典型的には＋４℃の範囲に冷却される。具体例では、ヘマトクリットレベルは６５％〜８０％、好ましくは７０％〜８０％である。
【００５３】
浸透圧脆弱性は有利には、溶解工程の直前に赤血球で測定する。赤血球又はこれらを含有する懸濁物は有利には、溶解のために選択された温度に近いか又はこれと同じ温度である。本発明の別の有利な特徴では、浸透圧脆弱性の測定は迅速に行われ、すなわち溶解工程は試料を採取後短時間で行われる。好ましくは、試料採取と溶解開始との間の時間は、３０分又はそれ以下、さらに好ましくは２５分又はそれ以下、さらには２０分又はそれ以下である。
【００５４】
浸透圧脆弱性が測定され考慮される溶解−再封鎖プロセスが行われる方法において、当業者は、さらなる詳細についてフランス国特許出願第０４０８６６７号を参照することができる。
【００５５】
本発明の１つの特徴において本発明の組成物は、最終的に約４０％〜約７０％、好ましくは約４５％〜約５５％、さらには約５０％のヘマトクリットレベルの赤血球懸濁液を含む。これは好ましくは、約１０〜約２５０mlの容量でパッケージされる。パッケージングは好ましくは、輸血に適したタイプの血液バッグに行われる。処方に対応する封入腫瘍抗原の量は、好ましくは完全に血液バッグ内に含有される。
【００５６】
本発明の目的はまた、本発明の１つ又はそれ以上の組成物の有効量を含む治療用抗腫瘍ワクチンである。すなわちこのワクチンは、封入もしくは非封入アジュバントの存在下もしくは非存在下で、１つ又はそれ以上の腫瘍抗原を封入する赤血球の集団を含む本発明の組成物を含むか、又は封入もしくは非封入アジュバントの存在下で、１つ又はそれ以上の腫瘍抗原を封入する赤血球の異なる集団を含む本発明の少なくとも２つの組成物を含む。
【００５７】
本発明の目的はまた、患者で腫瘍細胞又は腫瘍に対する細胞障害性細胞応答を誘導する方法である。この方法は、本発明の組成物の有効量を、特に静脈内に、注射又は点滴により、好ましくは点滴により、投与することを含む。この方法は特に、患者の樹状細胞及びＣＤ８＋細胞障害性細胞応答の活性化を誘導することが目的である。上記したように、特異的ＣＤ４＋ヘルパー及びＣＤ８＋細胞障害性応答が得られる。
【００５８】
本発明の目的はまた、患者で、腫瘍細胞又は腫瘍に対して上記の細胞障害性細胞応答を誘導するための抗癌療法である。この方法は、患者に、本発明の抗腫瘍ワクチンの有効量を、特に静脈内に、注射又は点滴により、好ましくは点滴により、投与することを含む。
【００５９】
本発明の１つの特徴では、ヘマトクリットレベルが約４０％〜約７０％、好ましくは約４５％〜約５５％、さらには約５０％である、約１０〜約２５０mlの赤血球懸濁液が投与される。
【００６０】
本発明の目的はまた、治療用抗腫瘍ワクチンの製造のための、本発明の組成物の使用である。
本発明の目的はまた、樹状細胞により仲介され、腫瘍細胞又は腫瘍に対する細胞障害性細胞応答を宿主で誘導するための、本発明の組成物の使用である。
本発明の別の目的は、治療用抗腫瘍ワクチンとして使用される本発明の組成物である。
【００６１】
本発明は、非限定例により及び添付図面を参照して、実施態様で詳細に説明される。
【実施例】
【００６２】
実施例１．マウス及びヒト赤血球およびブタ赤血球へのオバルブミン封入法
変更態様１：
低張透析法により透析チューブで、オバルブミン（タンパク質４５kDa、雌鳥卵のオバルブミン）をマウス赤血球（ＯＦ１マウス又はＣ５７Ｂｌ／６マウス）に封入した。赤血球懸濁液を数回洗浄後、透析のためにヘマトクリットを７０％とする。透析チューブ中で低浸透圧の溶解緩衝液中で、約１時間又は３０分間透析を行い、ここで熱処理後に透析が起きる。次に赤血球を、高浸透圧溶液を用いて３０分間再封鎖する。数回洗浄後、最終生成物を緩衝液（Ｓａｇ−マンニトール）に取り、ヘマトクリットを５０％にする。
【００６３】
実施例１の変更態様２：
透析カラムで低張透析法により、マウス赤血球中にオバルブミンを封入する。赤血球懸濁液を数回洗浄後、透析のためにヘマトクリットを７０％とする。透析カラム中で低浸透圧の溶解緩衝液中で約１０分間、透析を行う。赤血球がカラムを出たら、高浸透圧溶液を用いて赤血球を３７℃で３０分間再封鎖する。数回洗浄後、最終生成物をグルコースＳＡＧマンニトール又は脱補体血漿を含有するＮａＣｌ緩衝液に取り、ヘマトクリットを５０％に戻す。
【００６４】
実施例２．赤血球の熱処理
実施例１の変更態様１に従って封入を行う時、透析法の前に熱処理を行う。実施例１の変更態様２に従って封入を行う時、透析と再封鎖の後でかつ洗浄工程とＮａＣｌグルコース緩衝液の添加前に、熱処理が行われる。
【００６５】
赤血球を数回洗浄後、ヘマトクリットを１０％にする。次にこれらを４８℃で３０分間加熱する。
【００６６】
実施例３．オバルブミンを含有する赤血球の抗体処理
オバルブミンを含有する赤血球の懸濁液を数回洗浄後、インビボ試験用に１０9細胞／mlに、インビトロ試験用に１０8細胞／mlにする。これを抗ＴＥＲ１１９抗体（インビトロ試験用に１０μg/ml、インビボ試験用に２３μg/ml又は５μg/ml）とともに４℃で３０分間インキュベートする。数回洗浄後、注射可能な品質の緩衝液中に最終生成物を取り、ヘマトクリットを５０％にする。
【００６７】
実施例４．オバルブミンを含有する赤血球のビス（スルホスクシニミジル）スベリン酸（ＢＳ３）による化学処理
オバルブミンを含有する赤血球の懸濁液を数回洗浄後、ＰＢＳで１．７×１０6細胞／μlとし、１容量の２mM ＢＳ３（グルコースとリン酸緩衝液を含むＢＳ３溶液、ｐＨ７．４）と混合し、１mMのＢＳ３最終濃度を得る。細胞を室温で３０分間インキュベートする。１容量の２０mMトリス塩酸を加えて、反応をクエンチする。室温で５分間インキュベーション後、混合物を８００ｇで４℃で５分間遠心分離する。次に細胞を、グルコースを含有するＰＢＳで２回洗浄（８００ｇで遠心分離）し、ＳＡＧ−マンニトールで１回１０分間洗浄（１０００ｇで遠心分離）し、次に最終生成物を構成する。
【００６８】
実施例５．樹状細胞によるオバルブミン含有赤血球の貪食のインビトロの測定
樹状細胞による、実施例１の変更態様１で得られた赤血球の貪食効率に対する種々の処理（熱及び抗体）の効果をインビトロで測定する。赤血球を蛍光標識物であるＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシニミジルエステル）で、４℃で２０分間標識する。ＣＦＳＥは、細胞膜中を拡散する非蛍光性染料である。いったん細胞内に入ると、この分子は細胞内エステラーゼにより切断されて蛍光性になる。
【００６９】
樹状細胞は、磁性ビーズを使用してＣ５７Ｂｌ／６マウスの脾臓から単離される。これらのビーズは、ＣＤ１１ｃマーカーを認識する抗体を有し、こうしてＣＤ１１ｃ+樹状細胞画分を単離することができる。
【００７０】
次にＣＦＳＥ標識又は非標識赤血球を樹状細胞（１０×１０6細胞／ml）と２０：１の比率で、丸底９６ウェル培養プレートのウェル当たり２００μlの容量で、３７℃、５％ＣＯ2で４時間インキュベートする。４時間培養後、樹状細胞により摂取されなかった赤血球をＮＨ4Ｃｌで溶解し、数回洗浄する。次に樹状細胞によるＣＦＳＥ蛍光色素の捕捉をフローサイトメトリーにより測定する（R. Segura et al., J. Immunol., January 2006, 176(1): 441-50）。
【００７１】
赤血球の３つの集団を試験した：
（Ａ）オバルブミンが装填され、ＣＦＳＥ蛍光色素で標識していない赤血球、
（Ｂ）オバルブミンが装填され、ＣＦＳＥで標識された赤血球、
（Ｃ）オバルブミンが装填され、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理し、ＣＦＳＥで標識した赤血球。
【００７２】
結果
【００７３】
【表５】
【００７４】
オバルブミンが装填され抗ＴＥＲ１１９抗体で処理されたマウス赤血球は、４時間の同時培養後、脾臓から単離した樹状細胞により、インビトロで未処理赤血球より効率的に貪食された（図１、それぞれＣとＢ）。樹状細胞の３６％は、抗体を運搬する赤血球を貪食し、一方抗体の非存在下ではわずかに２７％であった。ＣＤ１１ｃ樹状細胞マーカーを発現しない集団による抗体処理赤血球の貪食も観察された（１０．９％；図１、Ｃ）。
【００７５】
実施例６．マウスの脾臓及び肝臓のマクロファージ及び樹状細胞によるオバルブミン含有赤血球の貪食のインビボの測定
この試験は、オバルブミンを含有するＯＦ１マウス赤血球が同族ではないＣ５７Ｂｌ／６マウスに注射されるため、同種異系試験である。
【００７６】
熱処理した、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理した（それぞれ実施例２と３に記載されている）、又は処理されていない、オバルブミンを装填した（実施例１の変更態様１）、ＯＦ１マウスからの７４×１０7個の赤血球の３つのバッチを調製した。これらのバッチを以下の方法で分割した：
【００７７】
バッチ１：熱処理も抗体処理も無し（図２、ＡとＤ）
バッチ２：熱処理した（図２、ＢとＥ）
バッチ３：抗ＴＥＲ１１９抗体で処理した（図２、ＣとＦ）
【００７８】
各バッチはＣＦＳＥで標識され、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに静脈内注射される。注射の３時間後、マウスの血液、脾臓、及び肝臓を取り出す。マウスの血液中を循環している蛍光赤血球の割合をフローサイトメトリーにより測定する。Ｆ４／８０マーカーを発現する脾臓マクロファージ中（図２、Ａ、Ｂ、Ｃ）に、Ｆ４／８０マーカーを発現する肝臓マクロファージ中に、そしてＣＤ１１ｃマーカーを発現する脾臓樹状細胞中（図２、Ｄ、Ｅ、Ｆ）に取り込まれた蛍光を、フローサイトメトリーにより測定する。
【００７９】
結果
【００８０】
【表６】
【００８１】
オバルブミンを装填しかつ熱処理されたか又は抗ＴＥＲ１１９抗体で処理されたマウス赤血球は、注射の３時間後、マウスの血液中にほとんど存在せず（１．６％と１％）、一方、未処理のオバルブミン装填赤血球はマウスの血液中にまだ存在する（４．６％）。
【００８２】
熱処理されたか又は抗ＴＥＲ１１９抗体で処理された赤血球は、脾臓のＦ４／８０マクロファージおよびＣＤ１１ｃ樹状細胞により貪食される（図２）。
【００８３】
抗ＴＥＲ１１９抗体で処理された赤血球は、熱処理赤血球又は未処理赤血球より効率的に、脾臓のＦ４／８０マクロファージにより貪食された（図２、Ａ、Ｂ、Ｃ）。脾臓マクロファージの８２％は抗体処理赤血球を貪食したが、熱処理赤血球を貪食したマクロファージは６８％であり、未処理バッチ中ではわずかに２８％であった（表２）。
【００８４】
熱処理又は抗体処理赤血球もまた、未処理赤血球より効率的に、ＣＤ１１ｃ樹状細胞により貪食された（図２）。それぞれ２２％と１９％の樹状細胞は抗体処理赤血球及び熱処理赤血球を貪食し、未処理赤血球の場合はわずかに５％であった（表２）。
【００８５】
ＣＤ１１ｃ樹状細胞マーカーもＦ４／８０マクロファージマーカーも発現しない脾臓からの集団による抗体処理赤血球の貪食も観察された（１１．９％と１２．８％、図２）。
【００８６】
【表７】
【００８７】
熱処理赤血球又は抗ＴＥＲ１１９抗体で処理した赤血球は、肝臓のＦ４／８０マクロファージにより貪食される。
【００８８】
抗ＴＥＲ１１９抗体で処理された赤血球は、熱処理赤血球又は未処理赤血球より効率的に、肝臓のＦ４／８０マクロファージにより貪食された。肝臓マクロファージの５０％は抗体処理赤血球を貪食し、一方マクロファージの４０％は熱処理赤血球を貪食し、未処理バッチ中ではわずかに２４％であった（表３）。
【００８９】
結論として、赤血球への抗体の結合及び熱処理は、脾臓や肝臓中の赤血球の効率的なターゲティングを可能にし、これらの赤血球を貪食できる樹状細胞やマクロファージの割合を大きく上昇させた。
【００９０】
実施例７．骨髄マクロファージ及び樹状細胞による、蛍光性オバルブミンを含有するマウス赤血球の貪食のインビボの測定
ＯＦ１マウス赤血球がＯＦ１マウスに注射されるため、この試験は自家試験である。
【００９１】
実施例１の変更態様２を使用して調製した蛍光性オバルブミン（Serlabo Technologies, ref WO-LS003054）を装填した、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理、熱処理、又はＢＳ３で処理（それぞれ、実施例３、２、４に記載）したか、又は処理していない、４つのバッチの１３２×１０7個のＯＦ１マウス赤血球を調製した。各バッチの赤血球を２匹のマウスに静脈内注射した。注射の１時間半後、マウスを屠殺し、マウスの大腿を取り出す。Ｆ４／８０マクロファージもしくはＣＤ１１ｃマーカーを発現するマクロファージ中に、Ｇｒ１マーカーを発現する顆粒球中に、ＣＤ１１ｃマーカーとＣＤ１１ｂマーカーを発現する骨髄樹状細胞中に、及びＣＤ１１ｃマーカーとＣＤ８マーカーを発現する形質細胞様樹状細胞中に取り込まれた蛍光を、フローサイトメトリーにより測定する。
【００９２】
バッチ１：オバルブミン装填赤血球、ＢＳ３で処理
バッチ２：オバルブミン装填赤血球、熱処理
バッチ３：オバルブミン装填赤血球、抗ＴＥＲ１１９抗体処理
バッチ４：オバルブミン装填赤血球
バッチ５：ＮａＣｌグルコース
【００９３】
結果
【００９４】
【表８】
【００９５】
注射の１時間半後、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理されたオバルブミン装填赤血球は、骨髄のＦ４／８０マクロファージ、顆粒球、及び樹状細胞により効率的に貪食された。骨髄樹状細胞は、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理されたオバルブミン装填赤血球の貪食に最も関与している細胞である。
【００９６】
結論として、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理された赤血球の使用は、骨髄内の免疫細胞による赤血球の最適のターゲティングと貪食とを可能にする。
【００９７】
実施例８．オバルブミン装填赤血球及びポリ（Ｉ：Ｃ）アジュバントの１回注射後のオバルブミン特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答の測定
ＯＶＡ（オバルブミン）特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答の評価は、ＯＶＡ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の割合、これらの細胞の増殖、これらの細胞の活性化レベル、及びＩＦＮｇ（ｇ＝ガンマ）の産生を測定することからなる。
【００９８】
ＣＤ４ Ｔ細胞応答の評価は、Russo V. et al., The Journal of Clinical Investigation, 2007, 117: 3087-3096；Stoitzner P. et al., The Journal of Immunology 2008, 180: 1991-1998に記載の方法を応用して行われる。ＯＴ−IIトランスジェニックマウス（Charles River, ref C57BL/6-Tg (TcraTcrb425Cbn/Crl)）のＣＤ４ Ｔ細胞を使用して、ＯＶＡ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答を測定する。ＯＴ−IIマウスは、主要組織適合遺伝子複合体クラスII分子に関連するオバルブミンペプチド３２３〜３３９を認識するＣＤ４ Ｔ細胞のみを発現するマウスである。
【００９９】
ＯＴ−IIトランスジェニックＣＤ４ Ｔ細胞はＯＴ−IIマウスの脾臓から単離され、ＣＦＳＥで標識された後、Ｌｙ５．１マウスに静脈内注射される。ＯＴ−IIマウスとＬｙ５．１マウスは同じ遺伝的背景を有するが、両方のタイプのマウスの細胞は、ＣＤ４５マーカーにより区別することができる。これは、ＯＴ−IIマウスの細胞はＣＤ４５．２マーカーを発現し、一方Ｌｙ５．１マウスはＣＤ４５．１マーカーを発現するためである。
【０１００】
トランスジェニックマウスＣＤ４ Ｔ細胞の注射の２０時間後、Ｌｙ５．１マウスに以下のバッチを静脈内注射する。３匹のマウスに、赤血球を含むバッチを注射し、２匹のマウスに遊離ＯＶＡ又は対照を含むバッチを注射する。
【０１０１】
実施例１の変更態様２を使用して調製したオバルブミン（Serlabo Technologies, ref WO-LS003054）を装填した、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理（実施例３に記載）したか又は処理していない２つのバッチの１８３×１０7個のＣ５７Ｂｌ／６マウス赤血球を調製する。これらのバッチにならびにオバルブミンを含むバッチに、アジュバントであるポリ（Ｉ：Ｃ）（Invitrogen, ref tlrl-pic）を加える。マウス１匹に注入したポリ（Ｉ：Ｃ）の量は２５μgである。マウスに注射したＯＶＡの量を表５に示す。
【０１０２】
オバルブミン装填Ｃ５７Ｂｌ／６マウス赤血球がＬｙ５．１マウスに注射されるため、この試験は自家試験である。Ｃ５７Ｂｌ／６、Ｌｙ５．１、及びＯＴ−IIマウスは同じ遺伝的背景を有する。
【０１０３】
バッチ１：ポリ（Ｉ：Ｃ）及び抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したオバルブミン装填赤血球
バッチ２：ポリ（Ｉ：Ｃ）及びオバルブミン装填赤血球
バッチ３：ポリ（Ｉ：Ｃ）及び遊離オバルブミン
バッチ４：血漿
【０１０４】
バッチ注射の３日後、マウスを屠殺し、マウスの脾臓を取り出す。マウスの脾臓中のＯＶＡ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の割合を、ＣＤ４マーカーとＣＤ４５．２マーカーを使用してフローサイトメトリーにより測定する（表５）。ＯＶＡ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の数は、ＯＶＡ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の割合とトリパンブルー（Invitrogen, ref 15250061）で計測した総リンパ球の数から計算する（表５）。
【０１０５】
マウスの脾臓中のＯＶＡ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の増殖と活性化は、ＣＤ４、ＣＤ４４、及びＣＤ４５．２マーカーを使用して、かつＣＦＳＥを使用してフローサイトメトリーにより測定する（表６と７）。各細胞分裂で、ＯＶＡ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞中に含まれるＣＦＳＥの量を２で割ると、これはフローサイトメトリーにより細胞分裂の数を測定することを可能にする（図３）。
【０１０６】
マウス脾細胞によるＩＦＮｇの産生は、１０μg/mlのオバルブミンペプチド３２３〜３３９（Neomps, ref）の存在下で３日間インビトロ刺激した培養上清で、ＥＬＩＳＡアッセイにより測定する。
【０１０７】
結果
【０１０８】
【表９】
【０１０９】
バッチ注射の３日後、ポリ（Ｉ：Ｃ）と、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したか又は処理していないオバルブミン装填赤血球とを注射したマウスは、遊離ＯＶＡとポリ（Ｉ：Ｃ）とを注入したマウスより、有意に高い割合と数のＯＶＡ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞を有する（スチューデント検定 *ｐ＝０．０１、**ｐ＝０．０２）。
【０１１０】
さらに抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したオバルブミン装填赤血球を含有するバッチは、ＯＶＡ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の数の上昇を誘導するのに、未処理のオバルブミン装填赤血球を含むバッチより有効である（スチューデント検定 ｐ＝０．０４）。
【０１１１】
【表１０】
【０１１２】
これらの観察結果は、インビボの細胞増殖結果により確認される（表６と図３）。細胞分裂はＣＦＳＥ蛍光強度の低下を誘導する（各分裂で蛍光物質の半分の分離）（図３Ａ）。ＯＶＡ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞は、ポリ（Ｉ：Ｃ）と抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したオバルブミン装填赤血球とを注射したマウス（６〜７回分裂）では、遊離ＯＶＡとポリ（Ｉ：Ｃ）とを注射したマウス（３〜４回分裂）に比較して、より迅速に分裂する。さらに抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したオバルブミン装填赤血球を含むバッチは、細胞増殖を誘導するのに、未処理のオバルブミン装填赤血球を含むバッチより、有効なようである。
【０１１３】
【表１１】
【０１１４】
細胞活性化レベル（ＣＤ４４マーカーの発現レベルにより解析される）の結果は、すべての分裂するＯＶＡ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞が高い細胞活性化レベルを有することを示す（表７と図３）。さらにＯＶＡ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の活性化レベルはこれらの細胞の分裂回数に関連付けることができる：細胞が分裂すればするほどかつそのＣＦＳＥマーカー含量を失うほど、細胞は高レベルの活性化マーカーを発現する（図３Ｂ）。
【０１１５】
【表１２】
【０１１６】
脾細胞によるＩＦＮｇ産生の結果は、ポリ（Ｉ：Ｃ）と、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したか又は処理していないオバルブミン装填赤血球とを注入されたマウスの脾細胞によるＩＦＮｇの強い産生を示す。
【０１１７】
結論としてこれらの結果は、ＩＦＮｇを産生できるＯＶＡ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の活性化と増殖に対する、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したか又は処理していないオバルブミン装填赤血球の優位性を証明する。
【０１１８】
実施例９．オバルブミン装填赤血球及びポリ（Ｉ：Ｃ）アジュバントの１回注射後のオバルブミン特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答の測定
ＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答の評価は、ＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の割合、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ分子に関連するオバルブミンペプチド２５７〜２６４を提示する細胞のインビボでのＩＦＮｇの産生と細胞溶解を測定することからなる。ＯＦ１マウスからのオバルブミン装填赤血球が同族ではないＣ５７Ｂｌ／６マウスに注射されるため、この試験は同種異系試験である。
【０１１９】
実施例１の変更態様２を使用して調製したオバルブミン装填した、抗ＴＥＲ１１９抗体（実施例３に記載）で処理したか又は処理していない２つのバッチの１６７×１０7個のオバルブミン装填ＯＦ１マウス赤血球を調製する。これらのバッチにアジュバントであるポリ（Ｉ：Ｃ）を加え、また遊離オバルブミンを含有するバッチにも加える。マウス１匹当たりに注射したポリ（Ｉ：Ｃ）の量は２５μgである。マウスに注入されたＯＶＡの量を表９に示す。
【０１２０】
バッチをＣ５７Ｂｌ／６マウスに静脈内注射する。特定のバッチを少なくとも４匹のマウスに注射する。Hervas-Stubbs S. et al., Blood 2007, 109: 5318-5326に記載された方法を応用して、インビボの細胞溶解を測定する。主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ分子に関連するオバルブミンペプチド２５７〜２６４を提示する細胞を、免疫マウスに注射する。簡単に説明すると、注射の６日後、オバルブミン２５７〜２６４ペプチド（Neomps, ref SC1302）を提示し適度な濃度のＣＦＳＥで標識した０．５×１０6個の脾細胞をマウスに注射し、ペプチドを提示せず高濃度のＣＦＳＥで標識した０．５×１０6個の脾細胞を注射する（細胞溶解対照）。
【０１２１】
オバルブミンペプチド２５７〜２６４（ＢＯＶＡｐ）に結合したラテックスビーズとポリ（Ｉ：Ｃ）を陽性対照として使用して、オバルブミンに対するＣＤ８ Ｔ免疫応答を誘導する。ＢＯＶＡｐとポリ（Ｉ：Ｃ）の注射は、オバルブミン特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の割合の上昇とインビボのＯＶＡ２５７−１６４ペプチドを提示する細胞の破壊を誘導することが証明されている（Herva-Stubbs）。
【０１２２】
バッチ１：ポリ（Ｉ：Ｃ）と、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したオバルブミン装填赤血球
バッチ２：ポリ（Ｉ：Ｃ）とオバルブミン装填赤血球
バッチ３：オバルブミンペプチド２５７〜２６４に結合したラテックスビーズ
バッチ４：ポリ（Ｉ：Ｃ）とオバルブミンペプチド２５７〜２６４に結合したラテックスビーズ
バッチ５：ポリ（Ｉ：Ｃ）と遊離オバルブミン
バッチ６：ＮａＣｌグルコース＋血漿
【０１２３】
脾細胞注射の１６時間後、マウスを屠殺し、マウスの脾臓を取り出す。マウスの脾臓中のＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の割合を、テトラマーとＣＤ８マーカーを使用してフローサイトメトリーにより測定する（表９）。０．１μg/mlのオバルブミンペプチド２５７〜２６４の存在下で４時間インビトロ刺激後、ＣＤ８ Ｔ細胞によるＩＦＮｇ産生と脱顆粒に関連したマーカー（ＣＤ１０７）の発現をフローサイトメトリーにより測定した。インビボ細胞溶解は、ＣＦＳＥを使用してフローサイトメトリーにより測定した（表１１）。
【０１２４】
結果
【０１２５】
【表１３】
【０１２６】
ポリ（Ｉ：Ｃ）と、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したか又は処理していないオバルブミン装填赤血球とを注射したマウスは、遊離ＯＶＡとポリ（Ｉ：Ｃ）とを注射したマウス、又はポリ（Ｉ：Ｃ）とＢＯＶＡｐとを注射したマウスより、ＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の割合が有意に高かった（スチューデント検定： *ｐ＝０．００１、**ｐ＝０．０１）。
【０１２７】
【表１４】
【０１２８】
作成されたＣＤ８ Ｔ細胞は、オバルブミンペプチドによる刺激に応答してＩＦＮｇを産生しＣＤ１０７マーカーを発現するため、有効であり細胞障害性である（表１０）。ＩＦＮｇを産生しＣＤ１０７マーカーを発現するＣＤ８ Ｔ細胞の割合は、遊離ＯＶＡとポリ（Ｉ：Ｃ）、又はポリ（Ｉ：Ｃ）とＢＯＶＡｐとを注射したマウスより、ポリ（Ｉ：Ｃ）と、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したか又は処理していないオバルブミン装填赤血球とを注射したマウスで、有意に高かった（スチューデント検定、ｐ＜０．００８）。
【０１２９】
【表１５】
【０１３０】
細胞溶解結果は、脱顆粒に関連するマーカーの発現と相関する（表１０と１１）。ポリ（Ｉ：Ｃ）と、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したか又は処理していないオバルブミン装填赤血球との注射は、ポリ（Ｉ：Ｃ）と遊離オバルブミンとの注射より有効に、オバルブミンペプチド２５７〜２６４を表示する細胞の溶解を誘導した（表１０）。
【０１３１】
結論としてこれらの結果は、ＩＦＮｇを産生し、脱顆粒し、かつオバルブミンペプチド２５７〜２６４を表示する細胞を溶解することができる細胞障害性ＣＤ８ Ｔ細胞の活性化と増殖において、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したか又は処理していないオバルブミン装填赤血球の優位性を証明する。
【０１３２】
実施例１０．オバルブミン装填赤血球とアジュバントであるポリ（Ｉ：Ｃ）の１回注射後３０日目のオバルブミン特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答の維持の測定
ＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答の維持の評価は、１回注射の３４日後のＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の割合と細胞溶解を測定することからなった。
【０１３３】
ＯＦ１マウスオバルブミンを装填した赤血球が同族ではないＣ５７Ｂｌ／６マウスに注射されるため、この試験は同種異系試験である。
【０１３４】
実施例１の変更態様２に従って得られた、抗ＴＥＲ１１９抗体（実施例３に記載）で処理したか又は処理していない１５０×１０7個のオバルブミン装填ＯＦ１マウス赤血球の２つのバッチを調製した。アジュバントであるポリ（Ｉ：Ｃ）を、これらのバッチに加え、また遊離オバルブミンもしくはＢＯＶＡｐを含有するバッチにも加えた。マウス１匹当たりに注射したポリ（Ｉ：Ｃ）の量は２５μgである。マウスに注射したＯＶＡの量を表１２に示す。
【０１３５】
バッチをＣ５７Ｂｌ／６マウスに静脈内注射する。特定のバッチを少なくとも３匹のマウスに注射する。インビボで細胞溶解を測定するために、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ分子に関連するオバルブミンペプチド２５７〜２６４を表示する細胞を、免疫マウスに注射する。注射の３３日後、オバルブミン２５７〜２６４ペプチド（Neomps, ref SC1302）を表示し、適度な濃度のＣＦＳＥで標識した０．５×１０6個の脾細胞をマウスに注射し、ペプチドを表示せず高濃度のＣＦＳＥで標識した０．５×１０6個の脾細胞をマウス注射した（細胞溶解アッセイ）。
【０１３６】
バッチ１：ポリ（Ｉ：Ｃ）と、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したオバルブミン装填赤血球
バッチ２：ポリ（Ｉ：Ｃ）とオバルブミン装填赤血球
バッチ３：オバルブミンペプチド２５７〜２６４に結合したラテックスビーズ：ＢＯＶＡｐ
バッチ４：ポリ（Ｉ：Ｃ）とＢＯＶＡｐ
バッチ５：ポリ（Ｉ：Ｃ）と遊離オバルブミン
バッチ６：ＮａＣｌグルコース＋血漿
【０１３７】
脾細胞注射の１６時間後、マウスを安楽死させ、その脾臓を取り出した。マウスの脾臓中のＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の割合を、テトラマーとＣＤ８マーカー（表１２）を使用してフローサイトメトリーにより測定した（表９）。インビボ細胞溶解は、ＣＦＳＥを使用してフローサイトメトリーにより測定した（表１３）。
【０１３８】
【表１６】
【０１３９】
バッチ注射の３４日後に、ＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の割合は各群で同等であった（表１２）。ピークのＣＤ８ Ｔ細胞増殖はほぼ７日目であり、その後収縮期が続いたため、この結果は驚くべきものではない（Hervas-Stubbs S. et al., Blood 2007, 109: 5318-5326）。
【０１４０】
【表１７】
【０１４１】
注射の３４日後に、ＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞はまだ、オバルブミンペプチド２５７〜２６４を表示する細胞を溶解することができた（表１３）。ポリ（Ｉ：Ｃ）と、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したオバルブミン装填赤血球との注射は、ポリ（Ｉ：Ｃ）とＢＯＶＡｐの注射より有効に、細胞溶解を誘導した（スチューデント検定： ｐ＜０．０４）。
【０１４２】
結論としてこれらの結果は、オバルブミン装填赤血球が、細胞障害性ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化と増殖についてのみでなく、オバルブミンペプチド２５７〜２６４を表示する細胞を溶解することができるこれらのＴ細胞の維持／生存についても、オバルブミン装填赤血球が優れていることを証明する。
【０１４３】
実施例１１．化学処理したオバルブミン装填赤血球とポリ（Ｉ：Ｃ）アジュバントの１回注射後のオボアルブミン特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答の測定
ＯＦ１マウスのオバルブミンを装填した赤血球が同族ではないＣ５７Ｂｌ／６マウスに注射されるため、この試験は同種異系試験である。
【０１４４】
実施例１の変更態様２に使用して調製し、１mMのＢＳ３（実施例４に記載）で化学処理した１３２×１０7個のオバルブミン装填ＯＦ１マウス赤血球のバッチを調製する。アジュバントであるポリ（Ｉ：Ｃ）をこのバッチと、及び遊離オバルブミンを含むバッチとに加える。マウス１匹当たりに注射したポリ（Ｉ：Ｃ）の量は２５μgである。マウスに注射したＯＶＡの量を表１４に示す。
【０１４５】
バッチ１：ポリ（Ｉ：Ｃ）と、１mM ＢＳ３で処理したオバルブミン装填赤血球
バッチ２：ポリ（Ｉ：Ｃ）と遊離オバルブミン
バッチ３：ポリ（Ｉ：Ｃ）
バッチ４：グルコース含有ＮａＣｌ
【０１４６】
バッチをＣ５７Ｂｌ／６マウスに静脈内注射する。特定のバッチを少なくとも３匹のマウスに注射する。注射の７日後、マウスを屠殺し、マウスの脾臓を取り出す。マウスの脾臓中のＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の割合をテトラマーとＣＤ８マーカーを使用してフローサイトメトリーにより測定する（表１４）。
【０１４７】
【表１８】
【０１４８】
ポリ（Ｉ：Ｃ）と、ＢＳ３で処理したオバルブミン装填赤血球とを注射したマウスは、遊離ＯＶＡとポリ（Ｉ：Ｃ）とを注射したマウスや、ポリ（Ｉ：Ｃ）を注射したマウスより、高い割合のＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞を有する。これらの結果は統計的に差は無いが、注射した遊離ＯＶＡの量は、ＯＶＡ装填赤血球を含むバッチで注入したＯＶＡの量より３倍多いことに注意されたい。
【０１４９】
結論としてこれらの結果は、ＢＳ３で処理したオバルブミン装填赤血球はまた、ＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞を生成することができることを示す。
【０１５０】
実施例１２．オバルブミン装填赤血球及びＣＬ−０９７アジュバントの１回注射後のオバルブミン特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答の測定
ＯＦ１マウスのオバルブミン装填赤血球が同族ではないＣ５７Ｂｌ／６マウスに注射されるため、この試験は同種異系試験である。
【０１５１】
実施例１の変更態様１を使用して調製し、抗ＴＥＲ１１９抗体（実施例３に記載）で処理したか又は処理しなかった１１９×１０7個のオバルブミン装填ＯＦ１マウス赤血球のバッチを調製する。アジュバントであるＣＬ０９７（Invitrogen, ref tlrl-c97）をこれらのバッチに加えるか又は加えない。マウス１匹当たりに注射したＣＬ０９７の量は０．１５μgである。マウスに注射したＯＶＡの量を表１５に示す。
【０１５２】
バッチ１：ＣＬ０９７と、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したオバルブミン装填赤血球
バッチ２：抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したオバルブミン装填赤血球
バッチ３：ＣＬ０９７と、オバルブミン装填赤血球
バッチ４：オバルブミン装填赤血球
バッチ５：グルコース含有ＮａＣｌ
【０１５３】
バッチをＣ５７Ｂｌ／６マウスに静脈内注射する。注射の４日後、マウスを屠殺し、マウスの脾臓を取り出す。種々のバッチを注射したマウスの脾臓によるＩＦＮｇ産生を、０．１μg/mlのオバルブミンペプチド２５７〜２６４の存在下で３日間インビトロ刺激後の培養上清中で、ＥＬＩＳＡアッセイにより測定する。
【０１５４】
結果
【０１５５】
【表１９】
【０１５６】
脾細胞によるＩＦＮｇ産生の結果は、ＣＬ０９７アジュバントと、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したか又は処理しなかったオバルブミン装填赤血球との両方をマウスに注射する時の、顕著なＩＦＮｇ産生を示す。
【０１５７】
結論としてＣＬ０９７アジュバントはまた、オバルブミン装填赤血球の注射により誘導されるＩＦＮｇ応答を強化する。
【０１５８】
実施例１３．アジュバントであるポリ（Ｉ：Ｃ）と処理又は未処理オバルブミン装填赤血球を１回注射後のマウスの腫瘍増殖の測定
この試験の目的は、ポリ（Ｉ：Ｃ）と処理又は未処理オバルブミン装填赤血球を１回注射後の、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス中のＥＧ．７細胞株の腫瘍増殖の測定することである。ＥＧ．７腫瘍細胞はＡＴＣＣから得た（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−２１１３）。ＥＧ．７細胞はＥＬ．４細胞株起源であり、これはＯＶＡを構成性に合成し分泌する。
【０１５９】
ＯＦ１マウスのオバルブミン装填赤血球がＣ５７Ｂｌ／６マウスに注射されるため、これは同種異系試験である。この実験のモデルは予防モデルである。
【０１６０】
ＯＦ１マウスからの１６５×１０7個の抗体処理又は未処理オバルブミン装填赤血球の２つのバッチを、実施例１の変更態様２に従って調製する。アジュバントであるポリ（Ｉ：Ｃ）をこれらのバッチに加える。１匹のマウス当たり２５μgのポリ（Ｉ：Ｃ）を注射する。陰性対照は非装填赤血球の懸濁物である。マウスに注射したＯＶＡ量は表１６に示す。
【０１６１】
バッチ１：ポリ（Ｉ：Ｃ）と抗体処理オバルブミン装填赤血球
バッチ２：ポリ（Ｉ：Ｃ）とオバルブミン装填赤血球
バッチ３：非装填赤血球
【０１６２】
バッチをＣ５７Ｂｌ／６マウス（１群１０匹）に静脈内注射する。バッチ注射の７日後、マウス１匹当たり２．２×１０6個のＥＧ．７細胞を皮下注射する。腫瘍増殖についてマウスを追跡する。腫瘍増殖は、腫瘍の直径（cm）を測定することにより評価する（２つの直交する直径の測定値の平均として記録する）。腫瘍サイズは、２日の間隔を空けて週に３回で１４日間測定する。直径が２．０cmより大きい腫瘍を有するマウスを屠殺する。
【０１６３】
【表２０】
【０１６４】
【表２１】
【０１６５】
ＥＧ．７注射の７日後、非装填赤血球をあらかじめ注射したマウスのわき腹で腫瘍のサイズは測定可能であり、試験の最後まで腫瘍は増殖を続ける。一方、ポリ（Ｉ：Ｃ）と、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したか又は処理していないオバルブミン装填赤血球とを注射したマウスのわき腹では、腫瘍は観察されない。マウスの観察はまた続いている。
【０１６６】
結論としてこれらの結果は、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したか又は処理しなかったオバルブミン装填赤血球は、ＯＶＡ発現腫瘍細胞の増殖を阻止するのに効率的であることを示す。
【０１６７】
実施例１４．マクロファージと樹状細胞によるブタ赤血球の貪食のインビボ測定
ブタ赤血球がＣ５７Ｂｌ／６マウスに注射されるため、この試験は異種試験である。
【０１６８】
ブタ赤血球をグルコースを含有するＮａＣｌで３回洗浄後、上記したようにＣＦＳＥで標識する。赤血球を再度グルコース含有ＮａＣｌで３回洗浄し、次にヘマトクリットを５０％に戻す。１４２×１０7個のブタ赤血球のバッチを、３匹のＣ５７Ｂｌ／６マウスに静脈内注射する。注射の１時間後、マウスを屠殺し、マウスの脾臓、肝臓、及び大腿を取り出す。Ｆ４／８０マーカー又はＣＤ１１ｂマーカーを発現するマクロファージ、ＣＤ１１ｃ及びＣＤ１１ｂマーカーを発現する骨髄樹状細胞、ならびにＣＤ１１ｃ及びＣＤ８マーカーを発現する形質細胞様樹状細胞中に取り込まれた蛍光を、フローサイトメトリーにより測定する。
【０１６９】
バッチ１：ブタ赤血球
バッチ２：グルコース含有ＮａＣｌ
【０１７０】
結果
【０１７１】
【表２２】
【０１７２】
【表２３】
【０１７３】
【表２４】
【０１７４】
注射の１時間後にブタ赤血球は、脾臓のＦ４／８０マクロファージと樹状細胞により効率的に貪食された（表１８）。脾臓の形質細胞様樹状細胞は、ブタ赤血球の貪食に最も関与していた。骨髄と肝臓では、マクロファージと樹状細胞は蛍光性赤血球を貪食しなかった（表１９と２０）。
【０１７５】
結論としてブタ赤血球の使用は、免疫応答の発生に関与する脾臓細胞による赤血球のターゲティングと貪食とを可能にする（Lou Y., 2007, J of Immunol, 178: 1534-1541）。
【０１７６】
実施例１５．オバルブミンを含有するブタ赤血球の性状解析
オバルブミン（実施例１の変更態様２に従って得られる）を装填したか又は装填していないブタ赤血球の２つのバッチを調製した。
【０１７７】
バッチ１：ＯＶＡを装填したブタ赤血球
バッチ２：ＯＶＡを装填していないブタ赤血球
【０１７８】
出発物質からのバッチを、作成の最後と作成の１８時間後に解析した。平均球状容量、平均血球ヘモグロビン、及び赤血球の濃度を、ＡＢＸセルカウンターを使用して測定した。赤血球の５０％溶血を誘導するＮａＣｌの濃度に対応する浸透圧脆弱性を、Osmocells装置（SD Medical）を使用して測定した。細胞外ヘモグロビンを分光光度計により測定した。オバルブミンの血球濃度、オバルブミンの細胞外濃度、及びオバルブミンの平均球状容量は、ＥＬＩＳＡ試験を使用して測定した。
【０１７９】
【表２５】
【０１８０】
予測されるように、透析法は、球状容量と血球ヘモグロビンの低下を引き起こした。さらにバッチの浸透圧脆弱性は、初期血液の赤血球より低かった（表２１）。オバルブミンを含むバッチ（バッチ１）と含まないバッチ（バッチ２）との間で大きな差は観察されなかった。
【０１８１】
バッチ１について細胞外オバルブミンの量は、封入オバルブミンの量と比較して比較的少なく、生成の１８時間後に上昇しておらず、オバルブミンを封入した赤血球の安定性を示している。
【０１８２】
すなわちブタ赤血球にオバルブミンを封入することが可能である。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第６０／９５４，９１７号（２００７年８月９日出願）、およびフランス国特許出願第ＦＲ０７０５７６７号（２００７年８月８日出願）（いずれも参照することにより本明細書に組み込まれる）の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、宿主において抗腫瘍目的の細胞障害性応答を誘導する組成物に、及びまたこの組成物を含有する治療用抗腫瘍ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００３】
腫瘍抗原に対する自然の免疫応答は余り有効ではなく、腫瘍が抗腫瘍免疫応答を逃れる種々の機構が証明されている。通常のワクチンによるアプローチは体液性応答を発生するが、これは不充分であることが証明されている。
【０００４】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）に基づいて（特に樹状細胞に基づく）細胞障害性応答を発生させることを目的とする方法が研究されている。この原理は、患者自身の免疫防御機構を刺激して患者の癌細胞を特異的に破壊することである。
【０００５】
樹状細胞は、腫瘍細胞に特異的な細胞障害性エフェクターを生成するのに非常に有効な抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。これは、腫瘍細胞から生じるアポトーシス細胞又はアポトーシス小体を貪食し、次にＭＨＣクラスＩ及びクラスII分子とともに腫瘍抗原をＴリンパ球に提示することができる。すなわち樹状細胞は、特異的細胞障害性Ｔリンパ球のクローンの増殖と生成を開始させることができる。この反応の最後で、こうして分化したキラーリンパ球は、リンパ球コンパートメントから離れて、生体中を循環し、腫瘍中で結合する。次に腫瘍により発現される抗原の認識が、溶解シグナルを誘導し、腫瘍細胞の破壊をもたらす。
【０００６】
樹状細胞を標的とするいくつかの抗癌ワクチン法が研究されている（Eymard JC, Bernard J, Bull Cancer, 2003, 90(8-9): 734-43）。これらのいくつかはインビトロで樹状細胞を操作することに基づき、別の方法は、インビボで樹状細胞を刺激することに基づく。最初のケースでは、患者から採取した血液細胞から樹状細胞を分化させる：これは培養され、成熟され、「パルス」され、すなわちエクスビボで腫瘍ペプチド、腫瘍溶解物、アポトーシス性腫瘍細胞、又は自己由来腫瘍から抽出した熱ショックタンパク質で刺激され、最後に患者に再注入される。第２のケースでは、樹状細胞を標的とするペプチド、タンパク質、放射線照射腫瘍細胞、又は抗原性ペプチドを含有するウイルスを患者に注入後、樹状細胞の刺激が行われる。しかし得られる細胞障害性応答は、あまり臨床的効力は無い。樹状細胞の活性化は、細胞障害性Ｔリンパ球を有効に活性化するその能力を「調整」する。樹状細胞の活性化レベルは、このワクチン法の難しい点である。
【０００７】
抗腫瘍ワクチンを得るためのエクスビボの樹状細胞の使用には、いくつかの問題（２次リンパ器官に遊走し、有効な細胞障害性Ｔ応答を誘導できる樹状細胞を生成するための、樹状細胞の成熟状態、注入される細胞の数、注入経路、部位、及び頻度）が生じる（Banchereau J, Schuler-Thurner B, Palucka AK, Schuler G. [Dendritic cells as vectors for therapy] Cell. 2001, 10, 106(3): 271-4）。
【０００８】
インビボでの樹状細胞の活性化は、腫瘍抗原の弱い免疫原性と、樹状細胞を充分なレベルに活性化する困難さにより限定される。
赤血球中に封入されているか又はその表面に結合してＡＰＣに送られる抗原を運搬するための担体としての赤血球の使用は、いくつかの文献で企図されている。引き起こされた免疫応答は、インビトロとインビボで研究されている。
【０００９】
Hamidiらは最近、ヒト赤血球中の抗原のモデルとしてＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）の封入を記載した（Hamidi M et al., Drug Deliv., 2007;14(5): 295-300、及びInt J Pharm., 2007, 29, 338(1-2): 70-8）。著者らは、網内系（ＲＥＳ）ＡＰＣへの抗原提示のためのベクターとして、赤血球の使用を示唆した。Hamidoらにより発表された別の総説（J. Control. Release, 2007, 118(2): 145-60）では、著者らは、ＲＥＳのターゲティング（このターゲティングは、赤血球の老化により促進され、こうしてこれらを取り込み溶解する）を促進するために、いくつかの方法が研究されていることを示した。安定化剤（特に架橋剤）への赤血球の曝露、脾臓を標的とするＩｇＧ型の又は肝臓を標的とするＩｇＭ型の抗ＲＨ抗体による赤血球の被覆、熱ショック、又は酸化剤、酵素、もしくは抗生物質への曝露などの他の経路が言及されている。
【００１０】
体液性免疫応答は、抗原装填赤血球で免疫後にインビボで得ることができる。Murrayらにより行われた試験は、以下の４つの抗原［ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＣＴＢ（コレラ毒素ｂサブユニット）、及びＡＤＡ（ウシアデノシンデアミナーゼ）］の１つを装填したマウス赤血球の静脈内注射後に、マウスでＩｇＧ免疫グロブリンを検出することを可能にした。ＩｇＧ１とＩｇＧ３（これらは、Ｔｈ２応答中の主要な免疫グロブリンイソタイプである）およびＩｇＧ２（Ｔｈ１応答のマーカーである免疫グロブリンイソタイプ）の検出は、両方のタイプの免疫応答（体液性応答と細胞性応答）の関与を示唆するであろう（Murray AM et al., Vaccine., 2006 28, 24(35-36): 6129-39）。
【００１１】
赤血球で使用される別の処方の抗原が、Dominiciらにより試験された。ＨＩＶ−１ウイルスのＴａｔタンパク質が、アビジン／ビオチン結合を用いてマウス赤血球の表面に固定された。樹状細胞によりインターナリゼーションされたこの処方の抗原を腹腔内注射してマウスを免疫すると、インビボで体液性免疫応答が誘発された。検出された免疫グロブリンのイソタイプの解析は、Ｔｈ１応答とＴｈ２応答の誘導を示す。抗原に結合した赤血球で処理したマウスについて、通常のクロム放出法により、インビトロで抗Ｔａｔ細胞障害活性が証明された（Dominici S et al., Vaccine., 2003 16, 21(17-18): 2073-81）。
【００１２】
同じ処方を用いてCorintiらによりインビトロで、細胞性応答が証明された。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋応答の誘導と同様に、ヒト単核細胞から得られた細胞死滅によりＴａｔタンパク質と結合した赤血球の貪食が証明された。さらにインターフェロンガンマの存在下で樹状細胞を成熟させると、Ｉ型免疫応答が促進された（Corinti S. et al., Leukoc. Biol. 2002, 71(4): 652-8）。
【００１３】
Bobergらは、アビジン／ビオチン系を用いてマウス赤血球の表面に固定したＨＩＶ−１プロテアーゼから得られたペプチドからなるワクチンを、マウスに腹腔内注射した。彼らは、ＡＰＣによりその認識を促進する目的で、赤血球を化学的に修飾したが、弱い免疫応答が得られた。彼らは、抗原性ペプチドによる赤血球の限定された装填と注入された血液容量のために、供給された少量の抗原は、ＡＰＣによる抗原認識を促進するはずの担体の化学的修飾により補償されなかったと、結論付けた（Boberg A. et al., Infect. Agents Cancer., 2007, 182: 9）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、免疫療法アプローチに従って、癌の治療に使用できる組成物とワクチンとを提供することを目的とする。
【００１５】
従って本発明の目的は、宿主において腫瘍細胞に対する細胞障害性細胞応答を誘導し、かつ腫瘍抗原を含有する赤血球を含む組成物である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】脾臓樹状細胞による、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理された「抗原装填」赤血球の貪食のインビトロでの測定。
【図２】脾臓マクロファージ及び樹状細胞による、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理されたか又は熱処理された「抗原装填」赤血球の貪食のインビボでの測定。
【図３】マウスに注射後３日目のオバルブミン特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の増殖と活性化を示すグラフ。（Ａ）細胞分裂はＣＦＳＥ蛍光強度の低下を誘導する。各分裂により、ＯＶＡ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞はその蛍光物質の半分を失う。バッチ４で観察されるピークは、多量のＣＦＳＥを含有する非分裂細胞を示す。他のすべてのピークは、１、２、３、４、５、６、又は７回の細胞分裂を受けた細胞を示す。細胞が８回より多く分裂すると、細胞のＣＦＳＥ含量は実質的にゼロになる。（Ｂ）ＣＤ４４細胞活性化マーカーの発現は、分裂が起きる回数の関数として表される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
「宿主」という用語は、好ましくはヒトを示すが、動物、特にペット（特にイヌ又はネコ）やスポーツ用の動物（特にウマ）も示す。
本発明において赤血球は、抗原を含有すなわち封入し、これは、抗原が赤血球内にあるか又は基本的にあることを意味する。
【００１８】
赤血球は好ましくは、ＡＰＣによる、特に樹状細胞によるその貪食を促進するように設計、選択、又は修飾される。特に該赤血球は、脾臓及び肝臓中でその貪食を促進するように設計、選択、又は修飾され、基本的な目的は、脾臓のＡＰＣを標的とすることである。
【００１９】
好適な実施態様において本発明の組成物は、抗原を含有し脾臓を標的とする赤血球を含む。この組成物は、脾臓中のＡＰＣ、特に樹状細胞によるこれらの赤血球の貪食を促進する。
【００２０】
第１の実施態様において赤血球は腫瘍抗原を含有し、かつ特に樹状細胞による該赤血球の貪食を促進するように、赤血球の表面のエピトープを認識する免疫グロブリンとの免疫複合体の形である。この組成物はまた、マクロファージによる貪食を促進することを可能にする。好ましくは免疫グロブリンは免疫グロブリンＧである。
【００２１】
免疫複合体の生成には、赤血球と少なくとも１つの抗体、好ましくはＩｇＧサブタイプの抗体が関与する。樹状細胞はその表面に、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の定常Ｆｃ領域の受容体を有する。これらの受容体は、こうして生成された抗原−ＩｇＧ免疫複合体の貪食又はインターナリゼーションを開始することができ、かつＭＨＣクラスＩ及びII分子による抗原提示を促進して、ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球及び特にＣＤ８＋細胞障害性リンパ球の生成を引き起こすことができる（A. Regnault et al., J. Exp. Med., Janvier 1999, 189(2): 371-80）。
【００２２】
適切な抗体として、抗アカゲザル抗体、抗グリコホリンＡ抗体、及び抗ＣＲ１抗体（ＣＲ１＝補体受容体Ｉ型）が言及される。抗グリコホリンＡ抗体（A. Bigbee et al., Mol. Immunol., December 1983, 20(12): 1353-62）が好適である。
【００２３】
好ましくは免疫複合体を形成するのに使用されるヒト起源の赤血球は、ドナーに由来する異種赤血球である。
【００２４】
第２の実施態様において、特に樹状細胞による赤血球の貪食を促進するように、赤血球は腫瘍抗原を含有しかつ熱もしくは化学修飾される。この組成物はまた、マクロファージによる貪食を促進することを可能にする。
【００２５】
熱処理は特に以下の条件下で行われる：赤血球を、約４２〜約５５℃、好ましくは約４７〜５１℃の温度で、約１５〜約９０分、好ましくは約２５〜約５０分加熱。典型的には赤血球は、約４８〜約５０℃で、例えば約４８℃で、約３０分加熱される。
【００２６】
化学処理は、赤血球の表面を修飾する物質を使用して、特にブリッジング剤もしくは架橋剤、例えばビス（スルホスクシニミジル）スベリン酸（ＢＳ３又はＢＳ3）、グルタルアルデヒド、又はノイラミニダーゼを使用して行われる。
【００２７】
具体的な実施態様において、少なくとも２つのターゲティング法が組合わされ、例えば組成物は、免疫複合体の形の抗原含有赤血球を含み、脾臓及び／又は肝臓、特に脾臓でのその取り込みと、ＡＰＣ特に樹状細胞による貪食を促進するように、熱処理又は化学処理される。
【００２８】
第３の実施態様において、抗原含有赤血球は異種である。異種赤血球をヒトに注射すると、注射された赤血球に患者の自然の抗体が結合する。こうして形成された免疫複合体は、ＡＰＣ特に樹状細胞による貪食を促進する。好ましくは該赤血球はブタ起源である。
【００２９】
具体的な実施態様において、異種赤血球は、その貪食を促進するように熱で又は化学的に修飾される。
【００３０】
本発明の組成物は、１つ又はそれ以上の腫瘍抗原を含んでよい。数個の腫瘍抗原がある時、該腫瘍抗原は好ましくは、１つのタイプの腫瘍又は腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導するように選択される。
【００３１】
この組成物は好ましくは、処理される腫瘍を代表する少なくとも２つの腫瘍抗原を含む。この目的は、より有効な免疫応答を生成するように、それぞれが特異的抗原性ペプチドを認識する細胞障害性Ｔリンパ球の数個のクローンを生成することである。
【００３２】
具体的な実施態様においてこの組成物は、それぞれが異なる抗原を封入している少なくとも２つの赤血球集団を含む。
【００３３】
本明細書で使用可能な最も良く知られた抗原を、以下の表に分類して示す。
【００３４】
【表１】
【００３５】
【表２】
【００３６】
【表３】
【００３７】
【表４】
【００３８】
Van der Bruggenらは、Ｔリンパ球により認識され、本発明の癌免疫療法アプローチで使用できるすべてのヒト腫瘍抗原を参照するデータベースを作成した：http://www.cancerimmunity.org/peptidedatabase/Tcellepitopes.htm。
【００３９】
他の抗原が本発明で使用され、例えばガストリン１７、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、ＥＧＦＲvIII、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、Ｐ５０１、グアニリルシクラーゼＣ、ＰＡＰがある。
【００４０】
抗原という用語は、抗原が適切な免疫応答を開始できる限り、天然のもしくは合成もしくは人工起源の抗原、治療される患者由来の抗原、抗原断片、誘導体もしくは変種を包含する。抗原は、例えば抽出されるか、化学合成されるか、又は遺伝子操作により産生される。
【００４１】
有効な免疫応答を生成するために、樹状細胞は活性で成熟しており、サイトカイン及びケモカインを産生でき、Ｔリンパ球の動員と活性化に必要な共同刺激分子を発現できなければならない。
【００４２】
ＡＰＣ特に樹状細胞を刺激するために、種々のタイプのアジュバントを使用することができる。細菌もしくはウイルスＲＮＡもしくはＤＮＡ、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、糖、免疫複合体、及びサイトカインは、特異的受容体（Ｔｏｌｌ様受容体ＴＬＲ、マンノース受容体）の刺激を介してＡＰＣ成熟特に樹状細胞成熟を誘導する種々の因子である。マクロファージ及び樹状細胞はすべてが、その表面上に同じ受容体を発現するわけではない。従ってアジュバントの選択は、ヒトで細胞障害性免疫応答を生成することができる分子であって、本発明の赤血球を取り込む細胞の表面（従って特に樹状細胞の表面）にその受容体が存在する分子に関する。
【００４３】
ある実施態様においてアジュバントは、赤血球内に封入されているか、又は赤血球の表面に結合している分子である。これらは好ましくは、抗原を含有する赤血球である。
【００４４】
あるいはアジュバントは、別に処理される他の赤血球内に封入されるか、又はその表面に結合する。これらの赤血球はまた、ＡＰＣ特に樹状細胞によるその貪食を促進するように修飾又は選択される。従ってこれらは、上記したように、免疫複合体の形であるか、又は熱でもしくは化学的に修飾されるか、又は異種である。
【００４５】
別の実施態様においてアジュバントは、別のアジュバント組成物であり、これは、抗原を含有する赤血球と同時に又は別に投与することができる。
【００４６】
言うまでもないが、アジュバントが別の組成物（赤血球組成物またはアジュバント組成物）中にある限り、アジュバントは、抗原を含有する赤血球と、別の投与として又は混合物の形で同時に投与されるか、又は別に、例えば抗原を含む赤血球の投与後に、特に数時間もしくは数日間離れて投与することができる。
【００４７】
使用可能なアジュバントの中で、まず以下の好適なアジュバントが言及される。
− ＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）リガンド、特にイミダゾキノロン類、例えば好ましくは、イミダゾキノリン、例えばイミダゾキノリンＣＬ０９７、イミキモド、レシキモド；ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド；ＬＰＳ（リポ多糖）；ポリ（イノシン酸）−（ポリシチジル酸ポリ（Ｉ：Ｃ））；
− サイトカイン、特にインターフェロンアルファ、ＩＬ−２（インターロイキン２）、ＩＦＮγ（インターフェロンガンマ）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球モノサイト−コロニー刺激因子）、ＩＬ−１２（インターロイキン１２）、ＴＮＦα（腫瘍壊死因子アルファ）。
【００４８】
使用可能な他のアジュバントの中で、特に以下のものが言及される：
− 細菌成分、特にＢＣＧ（バシルスカルメットゲラン）、ＭＤＰ（ムラミルジペプチド）、ＴＤＭ（トレハロースジミコレート）、ＬＰＳ（リポ多糖）、ＭＰＬ（モノホスホリル脂質Ａ）；
− ミネラルアジュバント、特に：水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カリウム、及びリン酸カルシウム；
− 細菌毒素、特に：ＣＴ（ビブリオ・コレラ（Vibrio cholera）のコレラ毒素）、ＣＴＢ（ビブリオ・コレラ（Vibrio cholera）のコレラ毒素）、ＰＴ（百日咳菌（Bordetella pertussis）の百日咳毒素）、ＬＴ（大腸菌（Escherichia coli）の熱不安定性リンホトキシン）；
− ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）。
【００４９】
赤血球中に活性成分を封入する技術は公知であり、本発明に好適な溶解−再封鎖による基本的方法は、当業者が参照する特許ＥＰ−Ａ−１０１３４１号及びＥＰ−Ａ−６７９１０１号に記載されている。この方法では、透析要素の一次コンパートメント（例えば、透析チューブ又は透析カートリッジ）に赤血球懸濁物が連続的に供給され、一方２次コンパートメントは、赤血球を溶解するために赤血球懸濁物に対して低張である水溶液を含む；次に、再封鎖ユニットでは、浸透圧及び／又はコロイド浸透圧を上昇させることにより、腫瘍抗原の存在下で赤血球の再封鎖が誘導され、次に腫瘍抗原を含有する赤血球の懸濁物が採取される。
【００５０】
現在までに記載されている変更態様の中では、フランス国特許出願第０４０８６６７号が好ましく、これは、腫瘍抗原を効率的に、再現性良く、安全かつ安定に封入することを可能にする。この方法は以下の工程を含む：
【００５１】
１． ６５％又はそれ以上のヘマトクリットレベルで、＋１〜＋８℃に冷却しながら、等張溶液中に赤血球ペレットを懸濁、
２． 該赤血球ペレットからの赤血球の試料を使用して、浸透圧脆弱性を測定するが、工程１と２は任意の順序で実施可能である（並行して行ってもよい）、
３． ６５％又はそれ以上のヘマトクリットレベルの赤血球の懸濁液と、＋１〜＋８℃に冷却した低張溶解溶液とを、透析カートリッジ中を通過させることを含んでなる、＋１〜＋８℃で一定温度を維持した同じチャンバー内での腫瘍抗原の溶解とインターナリゼーションプロセス；溶解パラメータは、あらかじめ測定した浸透圧脆弱性に従って調整される；及び
４． 温度は＋３０〜＋４０℃で、かつ高張溶液の存在下で、第２のチャンバー中で再封鎖プロセスを行う。
【００５２】
「インターナリゼーション」とは、赤血球内への腫瘍抗原の浸透を意味する。
特に透析において、赤血球ペレットは、６５％又はそれ以上、好ましくは７０％又はそれ以上の高いヘマトクリットレベルで、等張溶液に懸濁され、この懸濁物は＋１〜＋８℃、好ましくは＋２〜６℃、典型的には＋４℃の範囲に冷却される。具体例では、ヘマトクリットレベルは６５％〜８０％、好ましくは７０％〜８０％である。
【００５３】
浸透圧脆弱性は有利には、溶解工程の直前に赤血球で測定する。赤血球又はこれらを含有する懸濁物は有利には、溶解のために選択された温度に近いか又はこれと同じ温度である。本発明の別の有利な特徴では、浸透圧脆弱性の測定は迅速に行われ、すなわち溶解工程は試料を採取後短時間で行われる。好ましくは、試料採取と溶解開始との間の時間は、３０分又はそれ以下、さらに好ましくは２５分又はそれ以下、さらには２０分又はそれ以下である。
【００５４】
浸透圧脆弱性が測定され考慮される溶解−再封鎖プロセスが行われる方法において、当業者は、さらなる詳細についてフランス国特許出願第０４０８６６７号を参照することができる。
【００５５】
本発明の１つの特徴において本発明の組成物は、最終的に約４０％〜約７０％、好ましくは約４５％〜約５５％、さらには約５０％のヘマトクリットレベルの赤血球懸濁液を含む。これは好ましくは、約１０〜約２５０mlの容量でパッケージされる。パッケージングは好ましくは、輸血に適したタイプの血液バッグに行われる。処方に対応する封入腫瘍抗原の量は、好ましくは完全に血液バッグ内に含有される。
【００５６】
本発明の目的はまた、本発明の１つ又はそれ以上の組成物の有効量を含む治療用抗腫瘍ワクチンである。すなわちこのワクチンは、封入もしくは非封入アジュバントの存在下もしくは非存在下で、１つ又はそれ以上の腫瘍抗原を封入する赤血球の集団を含む本発明の組成物を含むか、又は封入もしくは非封入アジュバントの存在下で、１つ又はそれ以上の腫瘍抗原を封入する赤血球の異なる集団を含む本発明の少なくとも２つの組成物を含む。
【００５７】
本発明の目的はまた、患者で腫瘍細胞又は腫瘍に対する細胞障害性細胞応答を誘導する方法である。この方法は、本発明の組成物の有効量を、特に静脈内に、注射又は点滴により、好ましくは点滴により、投与することを含む。この方法は特に、患者の樹状細胞及びＣＤ８＋細胞障害性細胞応答の活性化を誘導することが目的である。上記したように、特異的ＣＤ４＋ヘルパー及びＣＤ８＋細胞障害性応答が得られる。
【００５８】
本発明の目的はまた、患者で、腫瘍細胞又は腫瘍に対して上記の細胞障害性細胞応答を誘導するための抗癌療法である。この方法は、患者に、本発明の抗腫瘍ワクチンの有効量を、特に静脈内に、注射又は点滴により、好ましくは点滴により、投与することを含む。
【００５９】
本発明の１つの特徴では、ヘマトクリットレベルが約４０％〜約７０％、好ましくは約４５％〜約５５％、さらには約５０％である、約１０〜約２５０mlの赤血球懸濁液が投与される。
【００６０】
本発明の目的はまた、治療用抗腫瘍ワクチンの製造のための、本発明の組成物の使用である。
本発明の目的はまた、樹状細胞により仲介され、腫瘍細胞又は腫瘍に対する細胞障害性細胞応答を宿主で誘導するための、本発明の組成物の使用である。
本発明の別の目的は、治療用抗腫瘍ワクチンとして使用される本発明の組成物である。
【００６１】
本発明は、非限定例により及び添付図面を参照して、実施態様で詳細に説明される。
【実施例】
【００６２】
実施例１．マウス及びヒト赤血球およびブタ赤血球へのオバルブミン封入法
変更態様１：
低張透析法により透析チューブで、オバルブミン（タンパク質４５kDa、雌鳥卵のオバルブミン）をマウス赤血球（ＯＦ１マウス又はＣ５７Ｂｌ／６マウス）に封入した。赤血球懸濁液を数回洗浄後、透析のためにヘマトクリットを７０％とする。透析チューブ中で低浸透圧の溶解緩衝液中で、約１時間又は３０分間透析を行い、ここで熱処理後に透析が起きる。次に赤血球を、高浸透圧溶液を用いて３０分間再封鎖する。数回洗浄後、最終生成物を緩衝液（Ｓａｇ−マンニトール）に取り、ヘマトクリットを５０％にする。
【００６３】
実施例１の変更態様２：
透析カラムで低張透析法により、マウス赤血球中にオバルブミンを封入する。赤血球懸濁液を数回洗浄後、透析のためにヘマトクリットを７０％とする。透析カラム中で低浸透圧の溶解緩衝液中で約１０分間、透析を行う。赤血球がカラムを出たら、高浸透圧溶液を用いて赤血球を３７℃で３０分間再封鎖する。数回洗浄後、最終生成物をグルコースＳＡＧマンニトール又は脱補体血漿を含有するＮａＣｌ緩衝液に取り、ヘマトクリットを５０％に戻す。
【００６４】
実施例２．赤血球の熱処理
実施例１の変更態様１に従って封入を行う時、透析法の前に熱処理を行う。実施例１の変更態様２に従って封入を行う時、透析と再封鎖の後でかつ洗浄工程とＮａＣｌグルコース緩衝液の添加前に、熱処理が行われる。
【００６５】
赤血球を数回洗浄後、ヘマトクリットを１０％にする。次にこれらを４８℃で３０分間加熱する。
【００６６】
実施例３．オバルブミンを含有する赤血球の抗体処理
オバルブミンを含有する赤血球の懸濁液を数回洗浄後、インビボ試験用に１０9細胞／mlに、インビトロ試験用に１０8細胞／mlにする。これを抗ＴＥＲ１１９抗体（インビトロ試験用に１０μg/ml、インビボ試験用に２３μg/ml又は５μg/ml）とともに４℃で３０分間インキュベートする。数回洗浄後、注射可能な品質の緩衝液中に最終生成物を取り、ヘマトクリットを５０％にする。
【００６７】
実施例４．オバルブミンを含有する赤血球のビス（スルホスクシニミジル）スベリン酸（ＢＳ３）による化学処理
オバルブミンを含有する赤血球の懸濁液を数回洗浄後、ＰＢＳで１．７×１０6細胞／μlとし、１容量の２mM ＢＳ３（グルコースとリン酸緩衝液を含むＢＳ３溶液、ｐＨ７．４）と混合し、１mMのＢＳ３最終濃度を得る。細胞を室温で３０分間インキュベートする。１容量の２０mMトリス塩酸を加えて、反応をクエンチする。室温で５分間インキュベーション後、混合物を８００ｇで４℃で５分間遠心分離する。次に細胞を、グルコースを含有するＰＢＳで２回洗浄（８００ｇで遠心分離）し、ＳＡＧ−マンニトールで１回１０分間洗浄（１０００ｇで遠心分離）し、次に最終生成物を構成する。
【００６８】
実施例５．樹状細胞によるオバルブミン含有赤血球の貪食のインビトロの測定
樹状細胞による、実施例１の変更態様１で得られた赤血球の貪食効率に対する種々の処理（熱及び抗体）の効果をインビトロで測定する。赤血球を蛍光標識物であるＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシニミジルエステル）で、４℃で２０分間標識する。ＣＦＳＥは、細胞膜中を拡散する非蛍光性染料である。いったん細胞内に入ると、この分子は細胞内エステラーゼにより切断されて蛍光性になる。
【００６９】
樹状細胞は、磁性ビーズを使用してＣ５７Ｂｌ／６マウスの脾臓から単離される。これらのビーズは、ＣＤ１１ｃマーカーを認識する抗体を有し、こうしてＣＤ１１ｃ+樹状細胞画分を単離することができる。
【００７０】
次にＣＦＳＥ標識又は非標識赤血球を樹状細胞（１０×１０6細胞／ml）と２０：１の比率で、丸底９６ウェル培養プレートのウェル当たり２００μlの容量で、３７℃、５％ＣＯ2で４時間インキュベートする。４時間培養後、樹状細胞により摂取されなかった赤血球をＮＨ4Ｃｌで溶解し、数回洗浄する。次に樹状細胞によるＣＦＳＥ蛍光色素の捕捉をフローサイトメトリーにより測定する（R. Segura et al., J. Immunol., January 2006, 176(1): 441-50）。
【００７１】
赤血球の３つの集団を試験した：
（Ａ）オバルブミンが装填され、ＣＦＳＥ蛍光色素で標識していない赤血球、
（Ｂ）オバルブミンが装填され、ＣＦＳＥで標識された赤血球、
（Ｃ）オバルブミンが装填され、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理し、ＣＦＳＥで標識した赤血球。
【００７２】
結果
【００７３】
【表５】
【００７４】
オバルブミンが装填され抗ＴＥＲ１１９抗体で処理されたマウス赤血球は、４時間の同時培養後、脾臓から単離した樹状細胞により、インビトロで未処理赤血球より効率的に貪食された（図１、それぞれＣとＢ）。樹状細胞の３６％は、抗体を運搬する赤血球を貪食し、一方抗体の非存在下ではわずかに２７％であった。ＣＤ１１ｃ樹状細胞マーカーを発現しない集団による抗体処理赤血球の貪食も観察された（１０．９％；図１、Ｃ）。
【００７５】
実施例６．マウスの脾臓及び肝臓のマクロファージ及び樹状細胞によるオバルブミン含有赤血球の貪食のインビボの測定
この試験は、オバルブミンを含有するＯＦ１マウス赤血球が同族ではないＣ５７Ｂｌ／６マウスに注射されるため、同種異系試験である。
【００７６】
熱処理した、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理した（それぞれ実施例２と３に記載されている）、又は処理されていない、オバルブミンを装填した（実施例１の変更態様１）、ＯＦ１マウスからの７４×１０7個の赤血球の３つのバッチを調製した。これらのバッチを以下の方法で分割した：
【００７７】
バッチ１：熱処理も抗体処理も無し（図２、ＡとＤ）
バッチ２：熱処理した（図２、ＢとＥ）
バッチ３：抗ＴＥＲ１１９抗体で処理した（図２、ＣとＦ）
【００７８】
各バッチはＣＦＳＥで標識され、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに静脈内注射される。注射の３時間後、マウスの血液、脾臓、及び肝臓を取り出す。マウスの血液中を循環している蛍光赤血球の割合をフローサイトメトリーにより測定する。Ｆ４／８０マーカーを発現する脾臓マクロファージ中（図２、Ａ、Ｂ、Ｃ）に、Ｆ４／８０マーカーを発現する肝臓マクロファージ中に、そしてＣＤ１１ｃマーカーを発現する脾臓樹状細胞中（図２、Ｄ、Ｅ、Ｆ）に取り込まれた蛍光を、フローサイトメトリーにより測定する。
【００７９】
結果
【００８０】
【表６】
【００８１】
オバルブミンを装填しかつ熱処理されたか又は抗ＴＥＲ１１９抗体で処理されたマウス赤血球は、注射の３時間後、マウスの血液中にほとんど存在せず（１．６％と１％）、一方、未処理のオバルブミン装填赤血球はマウスの血液中にまだ存在する（４．６％）。
【００８２】
熱処理されたか又は抗ＴＥＲ１１９抗体で処理された赤血球は、脾臓のＦ４／８０マクロファージおよびＣＤ１１ｃ樹状細胞により貪食される（図２）。
【００８３】
抗ＴＥＲ１１９抗体で処理された赤血球は、熱処理赤血球又は未処理赤血球より効率的に、脾臓のＦ４／８０マクロファージにより貪食された（図２、Ａ、Ｂ、Ｃ）。脾臓マクロファージの８２％は抗体処理赤血球を貪食したが、熱処理赤血球を貪食したマクロファージは６８％であり、未処理バッチ中ではわずかに２８％であった（表２）。
【００８４】
熱処理又は抗体処理赤血球もまた、未処理赤血球より効率的に、ＣＤ１１ｃ樹状細胞により貪食された（図２）。それぞれ２２％と１９％の樹状細胞は抗体処理赤血球及び熱処理赤血球を貪食し、未処理赤血球の場合はわずかに５％であった（表２）。
【００８５】
ＣＤ１１ｃ樹状細胞マーカーもＦ４／８０マクロファージマーカーも発現しない脾臓からの集団による抗体処理赤血球の貪食も観察された（１１．９％と１２．８％、図２）。
【００８６】
【表７】
【００８７】
熱処理赤血球又は抗ＴＥＲ１１９抗体で処理した赤血球は、肝臓のＦ４／８０マクロファージにより貪食される。
【００８８】
抗ＴＥＲ１１９抗体で処理された赤血球は、熱処理赤血球又は未処理赤血球より効率的に、肝臓のＦ４／８０マクロファージにより貪食された。肝臓マクロファージの５０％は抗体処理赤血球を貪食し、一方マクロファージの４０％は熱処理赤血球を貪食し、未処理バッチ中ではわずかに２４％であった（表３）。
【００８９】
結論として、赤血球への抗体の結合及び熱処理は、脾臓や肝臓中の赤血球の効率的なターゲティングを可能にし、これらの赤血球を貪食できる樹状細胞やマクロファージの割合を大きく上昇させた。
【００９０】
実施例７．骨髄マクロファージ及び樹状細胞による、蛍光性オバルブミンを含有するマウス赤血球の貪食のインビボの測定
ＯＦ１マウス赤血球がＯＦ１マウスに注射されるため、この試験は自家試験である。
【００９１】
実施例１の変更態様２を使用して調製した蛍光性オバルブミン（Serlabo Technologies, ref WO-LS003054）を装填した、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理、熱処理、又はＢＳ３で処理（それぞれ、実施例３、２、４に記載）したか、又は処理していない、４つのバッチの１３２×１０7個のＯＦ１マウス赤血球を調製した。各バッチの赤血球を２匹のマウスに静脈内注射した。注射の１時間半後、マウスを屠殺し、マウスの大腿を取り出す。Ｆ４／８０マクロファージもしくはＣＤ１１ｃマーカーを発現するマクロファージ中に、Ｇｒ１マーカーを発現する顆粒球中に、ＣＤ１１ｃマーカーとＣＤ１１ｂマーカーを発現する骨髄樹状細胞中に、及びＣＤ１１ｃマーカーとＣＤ８マーカーを発現する形質細胞様樹状細胞中に取り込まれた蛍光を、フローサイトメトリーにより測定する。
【００９２】
バッチ１：オバルブミン装填赤血球、ＢＳ３で処理
バッチ２：オバルブミン装填赤血球、熱処理
バッチ３：オバルブミン装填赤血球、抗ＴＥＲ１１９抗体処理
バッチ４：オバルブミン装填赤血球
バッチ５：ＮａＣｌグルコース
【００９３】
結果
【００９４】
【表８】
【００９５】
注射の１時間半後、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理されたオバルブミン装填赤血球は、骨髄のＦ４／８０マクロファージ、顆粒球、及び樹状細胞により効率的に貪食された。骨髄樹状細胞は、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理されたオバルブミン装填赤血球の貪食に最も関与している細胞である。
【００９６】
結論として、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理された赤血球の使用は、骨髄内の免疫細胞による赤血球の最適のターゲティングと貪食とを可能にする。
【００９７】
実施例８．オバルブミン装填赤血球及びポリ（Ｉ：Ｃ）アジュバントの１回注射後のオバルブミン特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答の測定
ＯＶＡ（オバルブミン）特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答の評価は、ＯＶＡ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の割合、これらの細胞の増殖、これらの細胞の活性化レベル、及びＩＦＮｇ（ｇ＝ガンマ）の産生を測定することからなる。
【００９８】
ＣＤ４ Ｔ細胞応答の評価は、Russo V. et al., The Journal of Clinical Investigation, 2007, 117: 3087-3096；Stoitzner P. et al., The Journal of Immunology 2008, 180: 1991-1998に記載の方法を応用して行われる。ＯＴ−IIトランスジェニックマウス（Charles River, ref C57BL/6-Tg (TcraTcrb425Cbn/Crl)）のＣＤ４ Ｔ細胞を使用して、ＯＶＡ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答を測定する。ＯＴ−IIマウスは、主要組織適合遺伝子複合体クラスII分子に関連するオバルブミンペプチド３２３〜３３９を認識するＣＤ４ Ｔ細胞のみを発現するマウスである。
【００９９】
ＯＴ−IIトランスジェニックＣＤ４ Ｔ細胞はＯＴ−IIマウスの脾臓から単離され、ＣＦＳＥで標識された後、Ｌｙ５．１マウスに静脈内注射される。ＯＴ−IIマウスとＬｙ５．１マウスは同じ遺伝的背景を有するが、両方のタイプのマウスの細胞は、ＣＤ４５マーカーにより区別することができる。これは、ＯＴ−IIマウスの細胞はＣＤ４５．２マーカーを発現し、一方Ｌｙ５．１マウスはＣＤ４５．１マーカーを発現するためである。
【０１００】
トランスジェニックマウスＣＤ４ Ｔ細胞の注射の２０時間後、Ｌｙ５．１マウスに以下のバッチを静脈内注射する。３匹のマウスに、赤血球を含むバッチを注射し、２匹のマウスに遊離ＯＶＡ又は対照を含むバッチを注射する。
【０１０１】
実施例１の変更態様２を使用して調製したオバルブミン（Serlabo Technologies, ref WO-LS003054）を装填した、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理（実施例３に記載）したか又は処理していない２つのバッチの１８３×１０7個のＣ５７Ｂｌ／６マウス赤血球を調製する。これらのバッチにならびにオバルブミンを含むバッチに、アジュバントであるポリ（Ｉ：Ｃ）（Invitrogen, ref tlrl-pic）を加える。マウス１匹に注入したポリ（Ｉ：Ｃ）の量は２５μgである。マウスに注射したＯＶＡの量を表５に示す。
【０１０２】
オバルブミン装填Ｃ５７Ｂｌ／６マウス赤血球がＬｙ５．１マウスに注射されるため、この試験は自家試験である。Ｃ５７Ｂｌ／６、Ｌｙ５．１、及びＯＴ−IIマウスは同じ遺伝的背景を有する。
【０１０３】
バッチ１：ポリ（Ｉ：Ｃ）及び抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したオバルブミン装填赤血球
バッチ２：ポリ（Ｉ：Ｃ）及びオバルブミン装填赤血球
バッチ３：ポリ（Ｉ：Ｃ）及び遊離オバルブミン
バッチ４：血漿
【０１０４】
バッチ注射の３日後、マウスを屠殺し、マウスの脾臓を取り出す。マウスの脾臓中のＯＶＡ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の割合を、ＣＤ４マーカーとＣＤ４５．２マーカーを使用してフローサイトメトリーにより測定する（表５）。ＯＶＡ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の数は、ＯＶＡ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の割合とトリパンブルー（Invitrogen, ref 15250061）で計測した総リンパ球の数から計算する（表５）。
【０１０５】
マウスの脾臓中のＯＶＡ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の増殖と活性化は、ＣＤ４、ＣＤ４４、及びＣＤ４５．２マーカーを使用して、かつＣＦＳＥを使用してフローサイトメトリーにより測定する（表６と７）。各細胞分裂で、ＯＶＡ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞中に含まれるＣＦＳＥの量を２で割ると、これはフローサイトメトリーにより細胞分裂の数を測定することを可能にする（図３）。
【０１０６】
マウス脾細胞によるＩＦＮｇの産生は、１０μg/mlのオバルブミンペプチド３２３〜３３９（Neomps, ref）の存在下で３日間インビトロ刺激した培養上清で、ＥＬＩＳＡアッセイにより測定する。
【０１０７】
結果
【０１０８】
【表９】
【０１０９】
バッチ注射の３日後、ポリ（Ｉ：Ｃ）と、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したか又は処理していないオバルブミン装填赤血球とを注射したマウスは、遊離ＯＶＡとポリ（Ｉ：Ｃ）とを注入したマウスより、有意に高い割合と数のＯＶＡ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞を有する（スチューデント検定 *ｐ＝０．０１、**ｐ＝０．０２）。
【０１１０】
さらに抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したオバルブミン装填赤血球を含有するバッチは、ＯＶＡ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の数の上昇を誘導するのに、未処理のオバルブミン装填赤血球を含むバッチより有効である（スチューデント検定 ｐ＝０．０４）。
【０１１１】
【表１０】
【０１１２】
これらの観察結果は、インビボの細胞増殖結果により確認される（表６と図３）。細胞分裂はＣＦＳＥ蛍光強度の低下を誘導する（各分裂で蛍光物質の半分の分離）（図３Ａ）。ＯＶＡ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞は、ポリ（Ｉ：Ｃ）と抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したオバルブミン装填赤血球とを注射したマウス（６〜７回分裂）では、遊離ＯＶＡとポリ（Ｉ：Ｃ）とを注射したマウス（３〜４回分裂）に比較して、より迅速に分裂する。さらに抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したオバルブミン装填赤血球を含むバッチは、細胞増殖を誘導するのに、未処理のオバルブミン装填赤血球を含むバッチより、有効なようである。
【０１１３】
【表１１】
【０１１４】
細胞活性化レベル（ＣＤ４４マーカーの発現レベルにより解析される）の結果は、すべての分裂するＯＶＡ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞が高い細胞活性化レベルを有することを示す（表７と図３）。さらにＯＶＡ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の活性化レベルはこれらの細胞の分裂回数に関連付けることができる：細胞が分裂すればするほどかつそのＣＦＳＥマーカー含量を失うほど、細胞は高レベルの活性化マーカーを発現する（図３Ｂ）。
【０１１５】
【表１２】
【０１１６】
脾細胞によるＩＦＮｇ産生の結果は、ポリ（Ｉ：Ｃ）と、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したか又は処理していないオバルブミン装填赤血球とを注入されたマウスの脾細胞によるＩＦＮｇの強い産生を示す。
【０１１７】
結論としてこれらの結果は、ＩＦＮｇを産生できるＯＶＡ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の活性化と増殖に対する、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したか又は処理していないオバルブミン装填赤血球の優位性を証明する。
【０１１８】
実施例９．オバルブミン装填赤血球及びポリ（Ｉ：Ｃ）アジュバントの１回注射後のオバルブミン特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答の測定
ＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答の評価は、ＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の割合、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ分子に関連するオバルブミンペプチド２５７〜２６４を提示する細胞のインビボでのＩＦＮｇの産生と細胞溶解を測定することからなる。ＯＦ１マウスからのオバルブミン装填赤血球が同族ではないＣ５７Ｂｌ／６マウスに注射されるため、この試験は同種異系試験である。
【０１１９】
実施例１の変更態様２を使用して調製したオバルブミン装填した、抗ＴＥＲ１１９抗体（実施例３に記載）で処理したか又は処理していない２つのバッチの１６７×１０7個のオバルブミン装填ＯＦ１マウス赤血球を調製する。これらのバッチにアジュバントであるポリ（Ｉ：Ｃ）を加え、また遊離オバルブミンを含有するバッチにも加える。マウス１匹当たりに注射したポリ（Ｉ：Ｃ）の量は２５μgである。マウスに注入されたＯＶＡの量を表９に示す。
【０１２０】
バッチをＣ５７Ｂｌ／６マウスに静脈内注射する。特定のバッチを少なくとも４匹のマウスに注射する。Hervas-Stubbs S. et al., Blood 2007, 109: 5318-5326に記載された方法を応用して、インビボの細胞溶解を測定する。主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ分子に関連するオバルブミンペプチド２５７〜２６４を提示する細胞を、免疫マウスに注射する。簡単に説明すると、注射の６日後、オバルブミン２５７〜２６４ペプチド（Neomps, ref SC1302）を提示し適度な濃度のＣＦＳＥで標識した０．５×１０6個の脾細胞をマウスに注射し、ペプチドを提示せず高濃度のＣＦＳＥで標識した０．５×１０6個の脾細胞を注射する（細胞溶解対照）。
【０１２１】
オバルブミンペプチド２５７〜２６４（ＢＯＶＡｐ）に結合したラテックスビーズとポリ（Ｉ：Ｃ）を陽性対照として使用して、オバルブミンに対するＣＤ８ Ｔ免疫応答を誘導する。ＢＯＶＡｐとポリ（Ｉ：Ｃ）の注射は、オバルブミン特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の割合の上昇とインビボのＯＶＡ２５７−１６４ペプチドを提示する細胞の破壊を誘導することが証明されている（Herva-Stubbs）。
【０１２２】
バッチ１：ポリ（Ｉ：Ｃ）と、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したオバルブミン装填赤血球
バッチ２：ポリ（Ｉ：Ｃ）とオバルブミン装填赤血球
バッチ３：オバルブミンペプチド２５７〜２６４に結合したラテックスビーズ
バッチ４：ポリ（Ｉ：Ｃ）とオバルブミンペプチド２５７〜２６４に結合したラテックスビーズ
バッチ５：ポリ（Ｉ：Ｃ）と遊離オバルブミン
バッチ６：ＮａＣｌグルコース＋血漿
【０１２３】
脾細胞注射の１６時間後、マウスを屠殺し、マウスの脾臓を取り出す。マウスの脾臓中のＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の割合を、テトラマーとＣＤ８マーカーを使用してフローサイトメトリーにより測定する（表９）。０．１μg/mlのオバルブミンペプチド２５７〜２６４の存在下で４時間インビトロ刺激後、ＣＤ８ Ｔ細胞によるＩＦＮｇ産生と脱顆粒に関連したマーカー（ＣＤ１０７）の発現をフローサイトメトリーにより測定した。インビボ細胞溶解は、ＣＦＳＥを使用してフローサイトメトリーにより測定した（表１１）。
【０１２４】
結果
【０１２５】
【表１３】
【０１２６】
ポリ（Ｉ：Ｃ）と、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したか又は処理していないオバルブミン装填赤血球とを注射したマウスは、遊離ＯＶＡとポリ（Ｉ：Ｃ）とを注射したマウス、又はポリ（Ｉ：Ｃ）とＢＯＶＡｐとを注射したマウスより、ＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の割合が有意に高かった（スチューデント検定： *ｐ＝０．００１、**ｐ＝０．０１）。
【０１２７】
【表１４】
【０１２８】
作成されたＣＤ８ Ｔ細胞は、オバルブミンペプチドによる刺激に応答してＩＦＮｇを産生しＣＤ１０７マーカーを発現するため、有効であり細胞障害性である（表１０）。ＩＦＮｇを産生しＣＤ１０７マーカーを発現するＣＤ８ Ｔ細胞の割合は、遊離ＯＶＡとポリ（Ｉ：Ｃ）、又はポリ（Ｉ：Ｃ）とＢＯＶＡｐとを注射したマウスより、ポリ（Ｉ：Ｃ）と、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したか又は処理していないオバルブミン装填赤血球とを注射したマウスで、有意に高かった（スチューデント検定、ｐ＜０．００８）。
【０１２９】
【表１５】
【０１３０】
細胞溶解結果は、脱顆粒に関連するマーカーの発現と相関する（表１０と１１）。ポリ（Ｉ：Ｃ）と、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したか又は処理していないオバルブミン装填赤血球との注射は、ポリ（Ｉ：Ｃ）と遊離オバルブミンとの注射より有効に、オバルブミンペプチド２５７〜２６４を表示する細胞の溶解を誘導した（表１０）。
【０１３１】
結論としてこれらの結果は、ＩＦＮｇを産生し、脱顆粒し、かつオバルブミンペプチド２５７〜２６４を表示する細胞を溶解することができる細胞障害性ＣＤ８ Ｔ細胞の活性化と増殖において、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したか又は処理していないオバルブミン装填赤血球の優位性を証明する。
【０１３２】
実施例１０．オバルブミン装填赤血球とアジュバントであるポリ（Ｉ：Ｃ）の１回注射後３０日目のオバルブミン特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答の維持の測定
ＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答の維持の評価は、１回注射の３４日後のＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の割合と細胞溶解を測定することからなった。
【０１３３】
ＯＦ１マウスオバルブミンを装填した赤血球が同族ではないＣ５７Ｂｌ／６マウスに注射されるため、この試験は同種異系試験である。
【０１３４】
実施例１の変更態様２に従って得られた、抗ＴＥＲ１１９抗体（実施例３に記載）で処理したか又は処理していない１５０×１０7個のオバルブミン装填ＯＦ１マウス赤血球の２つのバッチを調製した。アジュバントであるポリ（Ｉ：Ｃ）を、これらのバッチに加え、また遊離オバルブミンもしくはＢＯＶＡｐを含有するバッチにも加えた。マウス１匹当たりに注射したポリ（Ｉ：Ｃ）の量は２５μgである。マウスに注射したＯＶＡの量を表１２に示す。
【０１３５】
バッチをＣ５７Ｂｌ／６マウスに静脈内注射する。特定のバッチを少なくとも３匹のマウスに注射する。インビボで細胞溶解を測定するために、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ分子に関連するオバルブミンペプチド２５７〜２６４を表示する細胞を、免疫マウスに注射する。注射の３３日後、オバルブミン２５７〜２６４ペプチド（Neomps, ref SC1302）を表示し、適度な濃度のＣＦＳＥで標識した０．５×１０6個の脾細胞をマウスに注射し、ペプチドを表示せず高濃度のＣＦＳＥで標識した０．５×１０6個の脾細胞をマウス注射した（細胞溶解アッセイ）。
【０１３６】
バッチ１：ポリ（Ｉ：Ｃ）と、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したオバルブミン装填赤血球
バッチ２：ポリ（Ｉ：Ｃ）とオバルブミン装填赤血球
バッチ３：オバルブミンペプチド２５７〜２６４に結合したラテックスビーズ：ＢＯＶＡｐ
バッチ４：ポリ（Ｉ：Ｃ）とＢＯＶＡｐ
バッチ５：ポリ（Ｉ：Ｃ）と遊離オバルブミン
バッチ６：ＮａＣｌグルコース＋血漿
【０１３７】
脾細胞注射の１６時間後、マウスを安楽死させ、その脾臓を取り出した。マウスの脾臓中のＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の割合を、テトラマーとＣＤ８マーカー（表１２）を使用してフローサイトメトリーにより測定した（表９）。インビボ細胞溶解は、ＣＦＳＥを使用してフローサイトメトリーにより測定した（表１３）。
【０１３８】
【表１６】
【０１３９】
バッチ注射の３４日後に、ＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の割合は各群で同等であった（表１２）。ピークのＣＤ８ Ｔ細胞増殖はほぼ７日目であり、その後収縮期が続いたため、この結果は驚くべきものではない（Hervas-Stubbs S. et al., Blood 2007, 109: 5318-5326）。
【０１４０】
【表１７】
【０１４１】
注射の３４日後に、ＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞はまだ、オバルブミンペプチド２５７〜２６４を表示する細胞を溶解することができた（表１３）。ポリ（Ｉ：Ｃ）と、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したオバルブミン装填赤血球との注射は、ポリ（Ｉ：Ｃ）とＢＯＶＡｐの注射より有効に、細胞溶解を誘導した（スチューデント検定： ｐ＜０．０４）。
【０１４２】
結論としてこれらの結果は、オバルブミン装填赤血球が、細胞障害性ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化と増殖についてのみでなく、オバルブミンペプチド２５７〜２６４を表示する細胞を溶解することができるこれらのＴ細胞の維持／生存についても、オバルブミン装填赤血球が優れていることを証明する。
【０１４３】
実施例１１．化学処理したオバルブミン装填赤血球とポリ（Ｉ：Ｃ）アジュバントの１回注射後のオボアルブミン特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答の測定
ＯＦ１マウスのオバルブミンを装填した赤血球が同族ではないＣ５７Ｂｌ／６マウスに注射されるため、この試験は同種異系試験である。
【０１４４】
実施例１の変更態様２に使用して調製し、１mMのＢＳ３（実施例４に記載）で化学処理した１３２×１０7個のオバルブミン装填ＯＦ１マウス赤血球のバッチを調製する。アジュバントであるポリ（Ｉ：Ｃ）をこのバッチと、及び遊離オバルブミンを含むバッチとに加える。マウス１匹当たりに注射したポリ（Ｉ：Ｃ）の量は２５μgである。マウスに注射したＯＶＡの量を表１４に示す。
【０１４５】
バッチ１：ポリ（Ｉ：Ｃ）と、１mM ＢＳ３で処理したオバルブミン装填赤血球
バッチ２：ポリ（Ｉ：Ｃ）と遊離オバルブミン
バッチ３：ポリ（Ｉ：Ｃ）
バッチ４：グルコース含有ＮａＣｌ
【０１４６】
バッチをＣ５７Ｂｌ／６マウスに静脈内注射する。特定のバッチを少なくとも３匹のマウスに注射する。注射の７日後、マウスを屠殺し、マウスの脾臓を取り出す。マウスの脾臓中のＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の割合をテトラマーとＣＤ８マーカーを使用してフローサイトメトリーにより測定する（表１４）。
【０１４７】
【表１８】
【０１４８】
ポリ（Ｉ：Ｃ）と、ＢＳ３で処理したオバルブミン装填赤血球とを注射したマウスは、遊離ＯＶＡとポリ（Ｉ：Ｃ）とを注射したマウスや、ポリ（Ｉ：Ｃ）を注射したマウスより、高い割合のＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞を有する。これらの結果は統計的に差は無いが、注射した遊離ＯＶＡの量は、ＯＶＡ装填赤血球を含むバッチで注入したＯＶＡの量より３倍多いことに注意されたい。
【０１４９】
結論としてこれらの結果は、ＢＳ３で処理したオバルブミン装填赤血球はまた、ＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞を生成することができることを示す。
【０１５０】
実施例１２．オバルブミン装填赤血球及びＣＬ−０９７アジュバントの１回注射後のオバルブミン特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答の測定
ＯＦ１マウスのオバルブミン装填赤血球が同族ではないＣ５７Ｂｌ／６マウスに注射されるため、この試験は同種異系試験である。
【０１５１】
実施例１の変更態様１を使用して調製し、抗ＴＥＲ１１９抗体（実施例３に記載）で処理したか又は処理しなかった１１９×１０7個のオバルブミン装填ＯＦ１マウス赤血球のバッチを調製する。アジュバントであるＣＬ０９７（Invitrogen, ref tlrl-c97）をこれらのバッチに加えるか又は加えない。マウス１匹当たりに注射したＣＬ０９７の量は０．１５μgである。マウスに注射したＯＶＡの量を表１５に示す。
【０１５２】
バッチ１：ＣＬ０９７と、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したオバルブミン装填赤血球
バッチ２：抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したオバルブミン装填赤血球
バッチ３：ＣＬ０９７と、オバルブミン装填赤血球
バッチ４：オバルブミン装填赤血球
バッチ５：グルコース含有ＮａＣｌ
【０１５３】
バッチをＣ５７Ｂｌ／６マウスに静脈内注射する。注射の４日後、マウスを屠殺し、マウスの脾臓を取り出す。種々のバッチを注射したマウスの脾臓によるＩＦＮｇ産生を、０．１μg/mlのオバルブミンペプチド２５７〜２６４の存在下で３日間インビトロ刺激後の培養上清中で、ＥＬＩＳＡアッセイにより測定する。
【０１５４】
結果
【０１５５】
【表１９】
【０１５６】
脾細胞によるＩＦＮｇ産生の結果は、ＣＬ０９７アジュバントと、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したか又は処理しなかったオバルブミン装填赤血球との両方をマウスに注射する時の、顕著なＩＦＮｇ産生を示す。
【０１５７】
結論としてＣＬ０９７アジュバントはまた、オバルブミン装填赤血球の注射により誘導されるＩＦＮｇ応答を強化する。
【０１５８】
実施例１３．アジュバントであるポリ（Ｉ：Ｃ）と処理又は未処理オバルブミン装填赤血球を１回注射後のマウスの腫瘍増殖の測定
この試験の目的は、ポリ（Ｉ：Ｃ）と処理又は未処理オバルブミン装填赤血球を１回注射後の、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス中のＥＧ．７細胞株の腫瘍増殖の測定することである。ＥＧ．７腫瘍細胞はＡＴＣＣから得た（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−２１１３）。ＥＧ．７細胞はＥＬ．４細胞株起源であり、これはＯＶＡを構成性に合成し分泌する。
【０１５９】
ＯＦ１マウスのオバルブミン装填赤血球がＣ５７Ｂｌ／６マウスに注射されるため、これは同種異系試験である。この実験のモデルは予防モデルである。
【０１６０】
ＯＦ１マウスからの１６５×１０7個の抗体処理又は未処理オバルブミン装填赤血球の２つのバッチを、実施例１の変更態様２に従って調製する。アジュバントであるポリ（Ｉ：Ｃ）をこれらのバッチに加える。１匹のマウス当たり２５μgのポリ（Ｉ：Ｃ）を注射する。陰性対照は非装填赤血球の懸濁物である。マウスに注射したＯＶＡ量は表１６に示す。
【０１６１】
バッチ１：ポリ（Ｉ：Ｃ）と抗体処理オバルブミン装填赤血球
バッチ２：ポリ（Ｉ：Ｃ）とオバルブミン装填赤血球
バッチ３：非装填赤血球
【０１６２】
バッチをＣ５７Ｂｌ／６マウス（１群１０匹）に静脈内注射する。バッチ注射の７日後、マウス１匹当たり２．２×１０6個のＥＧ．７細胞を皮下注射する。腫瘍増殖についてマウスを追跡する。腫瘍増殖は、腫瘍の直径（cm）を測定することにより評価する（２つの直交する直径の測定値の平均として記録する）。腫瘍サイズは、２日の間隔を空けて週に３回で１４日間測定する。直径が２．０cmより大きい腫瘍を有するマウスを屠殺する。
【０１６３】
【表２０】
【０１６４】
【表２１】
【０１６５】
ＥＧ．７注射の７日後、非装填赤血球をあらかじめ注射したマウスのわき腹で腫瘍のサイズは測定可能であり、試験の最後まで腫瘍は増殖を続ける。一方、ポリ（Ｉ：Ｃ）と、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したか又は処理していないオバルブミン装填赤血球とを注射したマウスのわき腹では、腫瘍は観察されない。マウスの観察はまた続いている。
【０１６６】
結論としてこれらの結果は、抗ＴＥＲ１１９抗体で処理したか又は処理しなかったオバルブミン装填赤血球は、ＯＶＡ発現腫瘍細胞の増殖を阻止するのに効率的であることを示す。
【０１６７】
実施例１４．マクロファージと樹状細胞によるブタ赤血球の貪食のインビボ測定
ブタ赤血球がＣ５７Ｂｌ／６マウスに注射されるため、この試験は異種試験である。
【０１６８】
ブタ赤血球をグルコースを含有するＮａＣｌで３回洗浄後、上記したようにＣＦＳＥで標識する。赤血球を再度グルコース含有ＮａＣｌで３回洗浄し、次にヘマトクリットを５０％に戻す。１４２×１０7個のブタ赤血球のバッチを、３匹のＣ５７Ｂｌ／６マウスに静脈内注射する。注射の１時間後、マウスを屠殺し、マウスの脾臓、肝臓、及び大腿を取り出す。Ｆ４／８０マーカー又はＣＤ１１ｂマーカーを発現するマクロファージ、ＣＤ１１ｃ及びＣＤ１１ｂマーカーを発現する骨髄樹状細胞、ならびにＣＤ１１ｃ及びＣＤ８マーカーを発現する形質細胞様樹状細胞中に取り込まれた蛍光を、フローサイトメトリーにより測定する。
【０１６９】
バッチ１：ブタ赤血球
バッチ２：グルコース含有ＮａＣｌ
【０１７０】
結果
【０１７１】
【表２２】
【０１７２】
【表２３】
【０１７３】
【表２４】
【０１７４】
注射の１時間後にブタ赤血球は、脾臓のＦ４／８０マクロファージと樹状細胞により効率的に貪食された（表１８）。脾臓の形質細胞様樹状細胞は、ブタ赤血球の貪食に最も関与していた。骨髄と肝臓では、マクロファージと樹状細胞は蛍光性赤血球を貪食しなかった（表１９と２０）。
【０１７５】
結論としてブタ赤血球の使用は、免疫応答の発生に関与する脾臓細胞による赤血球のターゲティングと貪食とを可能にする（Lou Y., 2007, J of Immunol, 178: 1534-1541）。
【０１７６】
実施例１５．オバルブミンを含有するブタ赤血球の性状解析
オバルブミン（実施例１の変更態様２に従って得られる）を装填したか又は装填していないブタ赤血球の２つのバッチを調製した。
【０１７７】
バッチ１：ＯＶＡを装填したブタ赤血球
バッチ２：ＯＶＡを装填していないブタ赤血球
【０１７８】
出発物質からのバッチを、作成の最後と作成の１８時間後に解析した。平均球状容量、平均血球ヘモグロビン、及び赤血球の濃度を、ＡＢＸセルカウンターを使用して測定した。赤血球の５０％溶血を誘導するＮａＣｌの濃度に対応する浸透圧脆弱性を、Osmocells装置（SD Medical）を使用して測定した。細胞外ヘモグロビンを分光光度計により測定した。オバルブミンの血球濃度、オバルブミンの細胞外濃度、及びオバルブミンの平均球状容量は、ＥＬＩＳＡ試験を使用して測定した。
【０１７９】
【表２５】
【０１８０】
予測されるように、透析法は、球状容量と血球ヘモグロビンの低下を引き起こした。さらにバッチの浸透圧脆弱性は、初期血液の赤血球より低かった（表２１）。オバルブミンを含むバッチ（バッチ１）と含まないバッチ（バッチ２）との間で大きな差は観察されなかった。
【０１８１】
バッチ１について細胞外オバルブミンの量は、封入オバルブミンの量と比較して比較的少なく、生成の１８時間後に上昇しておらず、オバルブミンを封入した赤血球の安定性を示している。
【０１８２】
すなわちブタ赤血球にオバルブミンを封入することが可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主において腫瘍細胞に対する細胞障害性細胞応答を誘導し、かつ腫瘍抗原を含有する赤血球を含む組成物。
【請求項２】
赤血球は、（１）抗原を含有し、かつ（２）樹状細胞による該赤血球の貪食を促進するように、該赤血球の表面のエピトープを認識する免疫グロブリンとの免疫複合体の形である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
赤血球は、抗アカゲザル抗体、抗グリコホリンＡ抗体、又は抗ＣＲ１抗体と免疫複合体を形成する、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
免疫グロブリンはＩｇＧである、請求項２又は３に記載の組成物。
【請求項５】
赤血球は、（１）抗原を含有し、かつ（２）樹状細胞による該赤血球の貪食を促進するように、熱処理又は化学処理される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
免疫複合体の形の赤血球は熱処理又は化学処理される、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
赤血球は異種赤血球である、請求項１、２、５、又は６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
樹状細胞成熟を活性化するためのアジュバントをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
アジュバントは赤血球中で、赤血球の表面及び／又はその外に存在する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
アジュバントはＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）リガンド又はサイトカインである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
ＴＬＲリガンドは、イミダゾキノリン、イミキモド、レシキモド、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、ＬＰＳ（リポ多糖）、又はポリ（イノシン酸）−（ポリシチジル酸）よりなる群に属する、イミダゾキノリン類から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
サイトカインは、インターフェロンアルファ、ＩＬ−２（インターロイキン２）、ＩＦＮγ（インターフェロンガンマ）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球モノサイト−コロニー刺激因子）、ＩＬ−１２（インターロイキン１２）、又はＴＮＦα（腫瘍壊死因子アルファ）よりなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
治療される腫瘍を代表する少なくとも２つの腫瘍抗原を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
腫瘍抗原は、以下の抗原：アルファ−アクチニン−４；ＡＲＴＣ１；ＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質（ｂ３ａ２）；Ｂ−ＲＡＦ；ＣＡＳＰ−５；ＣＡＳＰ−８；ベータ−カテニン；Ｃｄｃ２７；ＣＤＫ４；ＣＤＫＮ２Ａ；ＣＯＡ−１；ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質；ＥＦＴＵＤ２；伸長因子２；ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質；ＦＮ１；ＧＰＮＭＢ；ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質；ＨＬＡ−Ａ２ｄ；ＨＬＡ−Ａ１１ｄ；ｈｓｐ７０−２；ＫＩＡＡＯ２０５；ＭＡＲＴ２；ＭＥ１；ＭＵＭ−１ｆ；ＭＵＭ−２；ＭＵＭ−３；ｎｅｏ−ＰＡＰ；ミオシンクラスＩ；ＮＦＹＣ；ＯＧＴ；ＯＳ−９；ｐｍｌ−ＲＡＲアルファ−融合タンパク質；ＰＲＤＸ５；ＰＴＰＲＫ；Ｋ−ｒａｓ；Ｎ−ｒａｓ；ＲＢＡＦ６００；ＳＩＲＴ２；ＳＮＲＰＤ１；ＳＹＴ−ＳＳＸ１又は−ＳＳＸ２融合タンパク質；トリオースホスフェートイソメラーゼ；ＢＡＧＥ−１；ＧＡＧＥ−１，２，８；ＧＡＧＥ−３，４，５，６，７；ＧｎＴＶｆ；ＨＥＲＶ−Ｋ−ＭＥＬ；ＫＫ−ＬＣ−１；ＫＭ−ＨＮ−１；ＬＡＧＥ−１；ＭＡＧＥ−Ａ１；ＭＡＧＥ−Ａ２；ＭＡＧＥ−Ａ３；ＭＡＧＥ−Ａ４；ＭＡＧＥ−Ａ６；ＭＡＧＥ−Ａ９；ＭＡＧＥ−Ａ１０；ＭＡＧＥ−Ａ１２；ＭＡＧＥ−Ｃ２；ムチンｋ；ＮＡ−８８；ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２；ＳＡＧＥ；Ｓｐ１７；ＳＳＸ−２；ＳＳＸ−４；ＴＲＡＧ−３；ＴＲＰ２−ＩＮＴ２ｇ；ＣＥＡ；ｇｐ１００／Ｐｍｅｌ１７；カリクレイン４；ママグロビン−Ａ；メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１；ＮＹ−ＢＲ−１；ＯＡ１；ＰＳＡ；ＲＡＢ３８／ＮＹ−ＭＥＬ−１；ＴＲＰ−１／ｇｐ７５；ＴＲＰ−２；チロシナーゼ；アジポフィリン；ＡＩＭ−２；ＢＩＮＧ−４；ＣＰＳＦ；サイクリンＤ１；Ｅｐ−ＣＡＭ；ＥｐｈＡ３；ＦＧＦ５；Ｇ２５０／ＭＮ／ＣＡＩＸ；ＨＥＲ−２／ｎｅｕ；ＩＬ１３Ｒａｌｐｈａ２；小腸カルボキシルエステラーゼ；アルファフェトプロテイン；Ｍ−ＣＳＦ；ｍｄｍ−２；ＭＭＰ−２；ＭＵＣ１；ｐ５３；ＰＢＦ；ＰＲＡＭＥ；ＰＳＭＡ；ＲＡＧＥ−１；ＲＮＦ４３；ＲＵ２ＡＳ；セセルニン１；ＳＯＸ１０；ＳＴＥＡＰ１；スルビビン；テロメラーゼ；ＷＴ１；ＦＬＴ３−ＩＴＤ；ＢＣＬＸ（Ｌ）；ＤＫＫ１；ＥＮＡＨ（ｈＭｅｎａ）；ＭＣＳＰ；ＲＧＳ５；ガストリン−１７；ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、ＥＧＦＲｖIII、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、Ｐ５０１、グアニリルシクラーゼＣ、ＰＡＰよりなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項の組成物の有効量を含む、治療用抗腫瘍ワクチン。
【請求項１６】
治療用抗腫瘍ワクチンの製造のための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１７】
治療用抗腫瘍ワクチンとして使用するための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物の有効量を患者に投与することを含んでなる、患者で腫瘍細胞又は腫瘍に対する細胞障害性細胞応答を誘導する方法。
【請求項１９】
請求項１５に記載の抗腫瘍ワクチンの有効量を患者に投与することを含んでなる、患者で腫瘍細胞又は腫瘍に対する細胞障害性細胞性免疫応答を誘導するための抗癌療法。
【請求項１】
宿主において腫瘍細胞に対する細胞障害性細胞応答を誘導し、かつ腫瘍抗原を含有する赤血球を含む組成物。
【請求項２】
赤血球は、（１）抗原を含有し、かつ（２）樹状細胞による該赤血球の貪食を促進するように、該赤血球の表面のエピトープを認識する免疫グロブリンとの免疫複合体の形である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
赤血球は、抗アカゲザル抗体、抗グリコホリンＡ抗体、又は抗ＣＲ１抗体と免疫複合体を形成する、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
免疫グロブリンはＩｇＧである、請求項２又は３に記載の組成物。
【請求項５】
赤血球は、（１）抗原を含有し、かつ（２）樹状細胞による該赤血球の貪食を促進するように、熱処理又は化学処理される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
免疫複合体の形の赤血球は熱処理又は化学処理される、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
赤血球は異種赤血球である、請求項１、２、５、又は６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
樹状細胞成熟を活性化するためのアジュバントをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
アジュバントは赤血球中で、赤血球の表面及び／又はその外に存在する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
アジュバントはＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）リガンド又はサイトカインである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
ＴＬＲリガンドは、イミダゾキノリン、イミキモド、レシキモド、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、ＬＰＳ（リポ多糖）、又はポリ（イノシン酸）−（ポリシチジル酸）よりなる群に属する、イミダゾキノリン類から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
サイトカインは、インターフェロンアルファ、ＩＬ−２（インターロイキン２）、ＩＦＮγ（インターフェロンガンマ）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球モノサイト−コロニー刺激因子）、ＩＬ−１２（インターロイキン１２）、又はＴＮＦα（腫瘍壊死因子アルファ）よりなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
治療される腫瘍を代表する少なくとも２つの腫瘍抗原を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
腫瘍抗原は、以下の抗原：アルファ−アクチニン−４；ＡＲＴＣ１；ＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質（ｂ３ａ２）；Ｂ−ＲＡＦ；ＣＡＳＰ−５；ＣＡＳＰ−８；ベータ−カテニン；Ｃｄｃ２７；ＣＤＫ４；ＣＤＫＮ２Ａ；ＣＯＡ−１；ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質；ＥＦＴＵＤ２；伸長因子２；ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質；ＦＮ１；ＧＰＮＭＢ；ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質；ＨＬＡ−Ａ２ｄ；ＨＬＡ−Ａ１１ｄ；ｈｓｐ７０−２；ＫＩＡＡＯ２０５；ＭＡＲＴ２；ＭＥ１；ＭＵＭ−１ｆ；ＭＵＭ−２；ＭＵＭ−３；ｎｅｏ−ＰＡＰ；ミオシンクラスＩ；ＮＦＹＣ；ＯＧＴ；ＯＳ−９；ｐｍｌ−ＲＡＲアルファ−融合タンパク質；ＰＲＤＸ５；ＰＴＰＲＫ；Ｋ−ｒａｓ；Ｎ−ｒａｓ；ＲＢＡＦ６００；ＳＩＲＴ２；ＳＮＲＰＤ１；ＳＹＴ−ＳＳＸ１又は−ＳＳＸ２融合タンパク質；トリオースホスフェートイソメラーゼ；ＢＡＧＥ−１；ＧＡＧＥ−１，２，８；ＧＡＧＥ−３，４，５，６，７；ＧｎＴＶｆ；ＨＥＲＶ−Ｋ−ＭＥＬ；ＫＫ−ＬＣ−１；ＫＭ−ＨＮ−１；ＬＡＧＥ−１；ＭＡＧＥ−Ａ１；ＭＡＧＥ−Ａ２；ＭＡＧＥ−Ａ３；ＭＡＧＥ−Ａ４；ＭＡＧＥ−Ａ６；ＭＡＧＥ−Ａ９；ＭＡＧＥ−Ａ１０；ＭＡＧＥ−Ａ１２；ＭＡＧＥ−Ｃ２；ムチンｋ；ＮＡ−８８；ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２；ＳＡＧＥ；Ｓｐ１７；ＳＳＸ−２；ＳＳＸ−４；ＴＲＡＧ−３；ＴＲＰ２−ＩＮＴ２ｇ；ＣＥＡ；ｇｐ１００／Ｐｍｅｌ１７；カリクレイン４；ママグロビン−Ａ；メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１；ＮＹ−ＢＲ−１；ＯＡ１；ＰＳＡ；ＲＡＢ３８／ＮＹ−ＭＥＬ−１；ＴＲＰ−１／ｇｐ７５；ＴＲＰ−２；チロシナーゼ；アジポフィリン；ＡＩＭ−２；ＢＩＮＧ−４；ＣＰＳＦ；サイクリンＤ１；Ｅｐ−ＣＡＭ；ＥｐｈＡ３；ＦＧＦ５；Ｇ２５０／ＭＮ／ＣＡＩＸ；ＨＥＲ−２／ｎｅｕ；ＩＬ１３Ｒａｌｐｈａ２；小腸カルボキシルエステラーゼ；アルファフェトプロテイン；Ｍ−ＣＳＦ；ｍｄｍ−２；ＭＭＰ−２；ＭＵＣ１；ｐ５３；ＰＢＦ；ＰＲＡＭＥ；ＰＳＭＡ；ＲＡＧＥ−１；ＲＮＦ４３；ＲＵ２ＡＳ；セセルニン１；ＳＯＸ１０；ＳＴＥＡＰ１；スルビビン；テロメラーゼ；ＷＴ１；ＦＬＴ３−ＩＴＤ；ＢＣＬＸ（Ｌ）；ＤＫＫ１；ＥＮＡＨ（ｈＭｅｎａ）；ＭＣＳＰ；ＲＧＳ５；ガストリン−１７；ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、ＥＧＦＲｖIII、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、Ｐ５０１、グアニリルシクラーゼＣ、ＰＡＰよりなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項の組成物の有効量を含む、治療用抗腫瘍ワクチン。
【請求項１６】
治療用抗腫瘍ワクチンの製造のための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１７】
治療用抗腫瘍ワクチンとして使用するための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物の有効量を患者に投与することを含んでなる、患者で腫瘍細胞又は腫瘍に対する細胞障害性細胞応答を誘導する方法。
【請求項１９】
請求項１５に記載の抗腫瘍ワクチンの有効量を患者に投与することを含んでなる、患者で腫瘍細胞又は腫瘍に対する細胞障害性細胞性免疫応答を誘導するための抗癌療法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１０−５３５７４４（Ｐ２０１０−５３５７４４Ａ）
【公表日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１９４７６（Ｐ２０１０−５１９４７６）
【出願日】平成２０年８月８日（２００８．８．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６０４９２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１９３１７
【国際公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【出願人】（５０７０３５０４２）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月８日（２００８．８．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６０４９２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１９３１７
【国際公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【出願人】（５０７０３５０４２）
【Ｆターム（参考）】
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