線維性疾患または病態を治療するための組成物
患者の線維性疾患または病態を治療する方法であって、該患者にノスカピンおよび医薬担体を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本発明は、２００８年６月２０日に出願された、米国特許仮出願第６１／０７４，４９２号に対して、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく優先権の利益を主張し、当該出願は、参照によりその全体が組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
線維症は、長期に及ぶ損傷に対して、多くの異なる組織内に生じる可能性のある複雑な障害である。線維症は、一般的に、線維芽細胞および筋線維芽細胞の増殖における異常な増加、ならびにコラーゲンおよび他の細胞外基質（ＥＣＭ）成分の過剰沈着を特徴とする。最終的に、これらの変化は、肝硬変、肺間質性線維症（ＩＰＦ）、皮膚および他の臓器の全身硬化症（強皮症）、移植拒絶反応、心臓の鬱血性腎不全、および多くの他の疾患において生じ得るように、罹患臓器の正常構造および機能を破壊し得える。コルチコステロイドおよび免疫抑制剤の使用を伴う従来の治療は、線維症の進行の逆転、または阻止に対して、ほとんど、または全く効果がない（Ｗｙｎｎ、２００７）。
【０００３】
根本的な病因の複雑性から、様々な治療介入が提案されてきた。コラーゲン線維の合成、排泄、または重合を低減することは、線維成長を鈍化させる上で有効であり得ることが示唆されている。別の一連の攻撃は、過剰なＥＣＭを破壊する目的で、コラゲナーゼ活性を亢進させることであり、一方他の者は、コラーゲン合成を刺激する、形成転換成長因子β（「ＴＧＦ−β」）等のサイトカインを中和するか、またはそれに拮抗する戦略を示唆している。いくつか想定される抗線維化剤が臨床治験で試験されているが、線維症の遅延における実質的な有効性を証明できていない。
【０００４】
線維症の開始および進行に関与する要因のなかで、創部へのリンパ球および線維芽細胞／筋線維芽細胞の動員（Ｈｉｎｚ ｅｔ ａｌ，２００７）およびＴＧＦ−βの誘導（Ｗｅｌｌｓ ２０００、Ｖｅｒｒｅｃｃｈｉａ ａｎｄ Ｍａｕｖｉｅｌ，２００７）が、重要であると見なされる。したがって、創部組織内への線維芽細胞および筋線維芽細胞の移動を正常化する、および／またはＴＧＦ−βの機能を調節することができる薬剤は、線維症を治療する上で特に有用であり得る。
【発明の概要】
【０００５】
したがって、一態様において、本発明は、患者の線維性疾患または病態を治療する方法を提供し、この方法は、患者にノスカピンおよび医薬担体を投与することを含む。いくつかの実施形態において、線維性疾患または病態が遅延され、いくつかの実施形態において、線維性疾患または病態が低減される。
【０００６】
さらなる態様において、本発明は、線維性疾患を治療する方法を提供し、この方法は、ノスカピン（その変異体を含む）を含む医薬組成物、ならびにＡＣＥ阻害剤、抗炎症剤、パーフェニドン、グリーベック、およびボセンタンが挙げられるが、これらに限定されない１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の抗線維化剤を投与することを含む。医薬組成物は、医薬担体をさらに含み得る。かかる治療は、線維性疾患の症状の発症の遅延、または線維性疾患の症状の重症度の低減をもたらし得る。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ブレオマイシンの単回投与（１．５Ｕ／ｋｇ、経口）後２週間の新規コラーゲンの合成（標識ヒドロキシプロリン（ＯＨＰ）または「ｆ」の割合）を示す。ノスカピン（ｉｐ）投与は、ブレオマイシンと同一日に開始し、２週間継続した。Ｎ＝４／グループ；データを平均＋ＳＤとして表す；＊ｐ＜０．０５ＡＮＯＶＡ、その後のダネット検定で、ブレオマイシン／媒体と比較。
【図２】クロラミン−ｔ分析によって測定された、ブレオマイシンの単回投与（１．５Ｕ／ｋｇ、経口）の２週間後の肺当たりのＯＨＰの絶対量を示す。ノスカピン投与を、ブレオマイシンと同一日に開始し、２週間継続した。Ｎ＝４〜５／グループ；データを平均＋ＳＤとして表す；＊ｐ＜０．０５の一元配置ＡＮＯＶＡ、ダネット検定で、ブレオマイシン／媒体対照グループまたはノスカピン治療（３０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇ）グループと比較。
【図３】ブレオマイシンの単回投与（１．５Ｕ／ｋｇ、経口）の２週間後の肺当たりの新たに合成されたコラーゲンの絶対量（ｆ×［ＯＨＰ］として計算）を示す。ブレオマイシンは、媒体対照またはノスカピン治療グループに対して、肺内の新たに合成されたコラーゲンの絶対量を増加させた。Ｎ＝４〜５／グループ；データを平均＋ＳＤとして表す；＊ｐ＜０．０５のＡＮＯＶＡ、その後のダネット検定でブレオマイシン／媒体対照と比較。
【図４】ブレオマイシン（１．５Ｕ／ｋｇ；経口；上記の図１〜３と同一の動物）の単回投与の２週間後のマウスの肺から得たα−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）陽性肺細胞の代表的スライドおよび判定量分析を示す。ブレオマイシンは、肺内に存在する活性α−ＳＭＡ含有筋線維芽細胞の数を有意に増加させた。ノスカピンは、ブレオマイシンによって活性化された筋線維芽細胞の数を有意に減少させた。Ｎ＝４〜５／グループ；データを平均＋ＳＤとして表す；＊ｐ＜０．０５のＡＮＯＶＡ、その後のダネット検定で、ブレオマイシン／媒体対照と比較。
【図５】ブレオマイシンの単回投与（１．５Ｕ、経口Ｕ）の２週間後の新規コラーゲン（標識ＯＨＰまたは「ｆ」の割合）の合成を示す。３００ｍｇ／ｋｇのノスカピン（ｐｏ）の投与をブレオマイシンと同一日に開始し、２週間継続した。Ｎ＝１０／グループ；データを平均＋Ｓ．Ｄ．として表す；＊ｐ＜０．０５の一元配置ＡＮＯＶＡ、ダネットで、ブレオマイシン／媒体を比較。
【図６】ブレオマイシンの単回投与（１．５Ｕ、経口）の２週間後の新規コラーゲン（標識ＯＨＰまたは「ｆ」の割合）の合成を示す。ノスカピンをブレオマイシンと同一日に開始して、３００ｍｇ／ｋｇの概算投与量になる濃度で食餌中に投与し、２週間継続した。ノスカピンは、新規ＯＨ−Ｐの％を減少する傾向があるが、効果は、統計的に有意ではなかった。Ｎ＝５／グループ；データを平均＋Ｓ．Ｄ．として表す。
【図７】ＡＮＩＴのみか、またはノスカピン（ｐｏ）との組み合わせの投与後の肝臓内の新規コラーゲン（標識ＯＨＰまたは「ｆ」の割合）の合成を示す。３０および１００ｍｇ／ｋｇで、ノスカピンは、ＯＨＰのＡＮＩＴ誘導による上昇を有意に低減した。Ｎ＝５／グループ；データは、平均＋ＳＤである；＊ｐ＜０．０５のＡＮＯＶＡ、その後のダネット検定で、ＡＮＩＴ／媒体と多重比較。
【図８】ＡＮＩＴのみか、またはノスカピン（ｐｏ）との組み合わせの投与後の肝臓内のＯＨＰの絶対量を示す。ノスカピンは、ＯＨＰ含有量のＡＮＩＴ誘導による上昇を有意に低減した。Ｎ＝５グループ；データは、平均＋ＳＤである；＊ｐ＜０．０５のＡＮＯＶＡ、その後のダネット検定で、ＡＮＩＴ／媒体対照と多重比較。
【図９】通常の固形試料の投与と比較した、ＡＮＩＴのみか、またはノスカピン（ｐｏ）との組み合わせの投与後の肝臓内に新たに合成されたコラーゲン（ｆ×［ＯＨＰ］として計算）の絶対量を示す。３０および１００ｍｇ／ｋｇのｐｏで、ノスカピンは、コラーゲン合成のＡＮＩＴ誘導による上昇を有意に減少させた。Ｎ＝５／グループ；データは、平均＋ＳＤである。＊ｐ＜０．０５のＡＮＯＶＡ、その後のダネット検定で、ＡＮＩＴ／媒体対照と比較。
【図１０】図７、８、および９と同一の動物からの組織学的に決定されたコラーゲン含有量（マッソントリクローム染色）の代表的なスライドおよび判定量分析を示す。ノスカピンは、ＡＮＩＴ誘導によるコラーゲン含有量を有意に減少させた。データは、平均＋ＳＤである；＊ｐ＜０．０５のＡＮＯＶＡ、その後のダネット検定で、ＡＮＩＴ／媒体対照と比較。
【図１１】肝臓内のコラーゲンの合成のＡＮＩＴ誘導による増加へのノスカピンの影響を示す。３００ｍｇ／ｋｇの概算投与量を得るために、２０ｇのマウスが３ｇ／日の食餌を食べることを仮定して、ノスカピンを２ｇ／ｋｇの濃度で食餌中に投与した。Ｎ＝５／グループ；データは、平均＋ＳＤである。＊ｐ＜０．０５のＡＮＯＶＡ、その後のダネット検定で、ＡＮＩＴ／媒体対照と比較。
【図１２】肝臓内のコラーゲン合成におけるＡＮＩＴ誘導による上昇へのノスカピンの影響を示す。ノスカピンを３００ｍｇ／ｋｇで１日１回、強制経口によって投与した；Ｎ＝５／グループ；データを平均＋ＳＤとして表す。
【図１３】ノスカピンおよびノスカピン類似体の構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
特記しない限り、本発明の実施は、当該技術分野の技術範囲内である分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技術を用いる。かかる技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９９３−８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）：ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）、およびＭａｓｓ ｉｓｏｔｏｐｏｍｅｒ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｔ ｅｉｇｈｔ ｙｅａｒｓ：ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ，ａｎａｌｙｔｉｃ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｂｙ Ｈｅｌｌｅｒｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｎｅｅｓｅ（Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２７６（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．３９）Ｅ１１４６−Ｅ１１６２，１９９９）等の文献に十分に説明されており、それらのすべては、必要な技術のための参照により組み込まれる。さらに、市販されている分析キットおよび試薬を用いる手順は、典型的には、特に注記しないかぎり、製造者が定義したプロトコルに従って使用される。
【０００９】
近年のインビトロ研究は、微小管（ＭＴ）動態が、線維成長において以前に認識されていない役割を担い得ることを示唆している。ＭＴは、すべての細胞の運動性に必要ではないが、ＭＴの適切な機能は、線維芽細胞等の大細胞の定方向の転座に必要であると思われる。ＭＴ動態を阻害する化合物の極低濃度は、大細胞が罹患領域内に移動することができる比率を大幅に低下させる（Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ，１９９５）。これは、損傷組織内への線維芽細胞／筋線維芽細胞の動員において重要な要因であり得る。さらに、ＭＴは、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、およびＳｍａｄ４との複合体を形成し、したがって、ｒＳｍａｄをＴＧＦ−β受容体から離して封鎖することによって、ＴＧＦ−β／Ｓｍａｄシグナル伝達において負のフィードバックループを提供する（Ｄｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ，２０００）。線維症の誘導におけるＴＧＦ−βシグナル伝達カスケードおよびその重要性は、多くの発行物において検討されている（Ｗｅｌｌｓ２０００；Ｖｅｒｒｅｃｃｈｉａ ａｎｄ Ｍａｕｖｉｅｌ，２００７）。
【００１０】
ノスカピンは、チューブリンに結合し、その配座を変更し、それによって、ＭＴの分解／再組立サイクル（すなわち、動態）の比率を変更する、経口で有効な薬剤であり（Ｙｅ ｅｔ ａｌ．１９９８）、チューブリンの全ポリマー質量に影響を及ぼすか、または総ＭＴ変形を引き起こすことはない（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．２００２）。元々鎮咳薬として使用されていた（Ｅｍｐｅｙ ｅｔ ａｌ．１９７９）、ノスカピンは、近年、正常な組織に対して毒性が少ないか、または免疫反応の抑制を有する有効な抗癌剤であると報告されている（Ｋｅ ｅｔ ａｌ．２０００、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．２００３）。ノスカピンは、おそらく、そのブラジキニン活性を遮断する能力により、脳卒中の治療において有益であることが分かっている（Ｍａｈｍｏｕｄｉａｎ ｅｔ ａｌ．２００３）。ノスカピンは、アヘンから派生する非麻薬性フタリドイソキノリンアルカロイドである。しかしながら、ノスカピンは、鎮痛特性、鎮静特性、および呼吸機能抑制薬特性が欠如し、幸福感または依存性のいずれかを誘発しない。臨床治験において、ノスカピンは、良好な容認性を示すと考えられる（Ｍａｈｍｏｕｄｉａｎ ｅｔ ａｌ．２００３）。また、本開示において、ノスカピンは、線維性疾患または病態の有効な治療であると認められている。したがって、本開示は、線維性疾患または病態の治療のための製剤および方法を提供する。
【００１１】
本発明は、様々な線維性疾患または病態の治療のための方法および組成物を対象とする。この内容において「治療」は、症状の発症または重症度の遅延、死亡の遅延、および症状の軽減を含む。
【００１２】
一実施形態において、本発明は、線維性疾患または病態を治療する方法を提供し、方法は、ノスカピンまたはその塩を含む医薬組成物を、治療を必要とする患者に投与することを含む。「線維性疾患」とは、罹患していない対照に対するコラーゲンまたは他の細胞外基質（ＥＣＭ）成分の増加等の臓器または組織内の線維性結合組織の増加を特徴とする、疾患または障害を意味する。「線維性疾患」または「病態」としては、肝硬変、鬱血性心不全、線維性肺病、紫外線による老化、すい臓および肺の嚢腫性線維症、注入線維症が挙げられるが、それらに限定されず、それらは、筋肉内注入、心内膜心筋線維症、特発性肺線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性塊状線維症（炭鉱労働者の塵肺の合併症）、腎性全身性線維症、強皮症、腎線維症、臓器移植、傷、火傷等に関連する線維症の合併症として生じる可能性がある（米国特許第７，４４９，１７１号のｆｉｂｒｏｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓの考察および米国特許第１１／０６４，１９７号も参照されたく、それらの両方は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００１３】
下記にさらに説明するように、一実施形態は、治療のために薬剤としてノスカピンを用いる。ノスカピンの構造を図１３に示す。「ノスカピン」は、例えば、米国特許第６，３７６，５１６号に概説されるスカピン類似体および／または誘導体を含み、スカピン類似体およびそれを作製する方法に関連する、その特定の開示のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。好ましいノスカピン類似体は、図１３で確認できる。
【００１４】
別の実施形態において、本明細書に開示する方法に従い、他の薬剤、好ましくは、他の抗線維化剤と共にノスカピンを使用する。好ましい薬剤としては、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、抗炎症剤、パーフェニドン、グリーベック、またはボセンタンが挙げられるが、それらに限定されない。
【００１５】
ＡＣＥ阻害剤は、それらの分子構造に基づき、カプトプリル（商標カプトテン）およびゾフェノプリル等のスルフヒドリル含有剤の３つのグループに分割することができる。他の薬剤としては、ジカルボン酸含有剤が挙げられる。これは、エナラプリル（バソテック／レニテック）、ラミプリル（アルテース／トリテース／ラマース（Ｒａｍａｃｅ）／ラミウィン）、キナプリル（アキュプリル）、ペリンドプリル（コバシル／アセオン）、リシノプリル（リソジュール（Ｌｉｓｏｄｕｒ）／ロプリル／ノバテック／プリニビル／ゼストリル）、ベナゼプリル（ロテンシン）を含む最大のグループである。最後に、他のＡＣＥ阻害剤としては、フォシノプリル（モノプリル）等のホスホン酸含有剤が挙げられる。
【００１６】
抗炎症剤としては、ステロイドまたは非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤＳ）が挙げられる。好ましい抗炎症剤としては、グルココルチコイド、アスピリン、イブプロフェン、およびナプロキセンが挙げられるが、それらに限定されない。
【００１７】
製剤
【００１８】
線維性疾患または病態の治療のための治療上の使用において、本発明の医薬方法に用いられる化合物を、治療効果を達成するのに適した投与量レベルで、線維性疾患または病態と診断された患者、または線維性疾患または病態を発症するリスクのある患者に投与する。「治療効果」とは、化合物の投与が経時的に患者に対して有益な効果につながることを意味する。
【００１９】
ヒトへの投与に好適な初期投与量は、インビトロ分析または動物モデルから決定し得る。例えば、初期投与量は、インビトロ分析において測定されるように、投与される化合物の特定の代謝的活性剤のＩＣ５０を含む血清濃度を達成するように調剤し得る。あるいは、ヒトの初期投与量は、ブレオマイシン誘導型肺線維症マウスモデル等の線維性疾患または病態の動物モデルにおいて有効であることが分かっている投与量に基づき得る。一例として、本明細書に概説する医薬組成物のそれぞれの成分の初期投与量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約３０００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であり得るか、または約０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜約２０００ｍｇ／ｋｇ／日、または、約１ｍｇ／ｋｇ／日〜約２０００ｍｇ／ｋｇ／日、または約１０ｍｇ／ｋｇ／日〜約２０００ｍｇ／ｋｇ／日、または約１００ｍｇ／ｋｇ／日〜約２０００ｍｇ／ｋｇ／日、または約１０００ｍｇ／ｋｇ／日〜約２０００ｍｇ／ｋｇ／日も使用することができる。しかしながら、投与量は、患者の要求、治療される病態の重症性、および用いられる化合物によって異なり得る。用量はまた、特定の患者において特定の化合物の投与に伴う任意の薬物副作用の存在、性質、および範囲によって決定される。特定条件のための適切な投与量の決定は、施術者の技術範囲内である。一般的に、治療は、適量未満で化合物のより少量の投与量で開始する。その後、その状況下で最適な効果が達成されるまで、投与量を少しずつ増量する。便宜上、必要に応じて、１日の総投与量を分割し、１日に分割して投与し得る。
【００２０】
薬物組成物内の活性化合物の濃度は、薬物の吸収率、分布率、不活化率、および排泄率、ならびに当業者に知られる他の要因によって異なる。投与量値はまた、緩和される病態の重症度で異なることも留意するものとする。任意の特定の対象において、特定の投薬計画が個人のニーズ、および組成物の投与を投与するか、または管理する者の専門的な判断にしたがって経時的に調節されるべきであり、本明細書に示す濃度範囲は、例示のみであり、主張する組成物の範囲または実施を制限することを意図しないことをさらに理解するものとする。活性成分を一度に投与し得るか、または異なる時間間隔で投与される、いくつかの少ない用量に分割し得る。
【００２１】
経口投与に好適な製剤は、（ａ）水、生理食塩水、またはＰＥＧ４００等の希釈剤中に懸濁された有効量の化合物等の液体溶液、（ｂ）液体、固体、顆粒、またはゼラチンとして、それぞれ、規定量の活性成分を含むカプセル、サシェット、または錠剤、（ｃ）適切な液体内の懸濁液、および（ｄ）好適な乳液から成ることができる。錠剤形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、コーンスターチ、ポテトスターチ、微結晶セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ならびに他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤、芳香剤、染料、崩壊剤、および医薬的に適合性担体のうちの１つ以上を含むことができる。ドロップ形態は、風味のある活性成分、例えば、スクロースを含み、芳香錠は、活性成分の他に当該技術分野において知られる担体を含む、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシア乳液、ゲル等の不活性塩基中の活性成分を含むことができる。
【００２２】
経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤または食用担体を含む。それらは、ゼラチンカプセル内に封入されるか、または錠剤に圧縮され得る。経口の治療的投与の目的のために、活性化合物は、賦形剤と共に組み込まれ、錠剤、トローチ、またはカプセルに使用することができる。医薬的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント材料は、組成物の一部として含むことができる。
【００２３】
活性化合物またはその医薬的に許容される塩は、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハース、チューイングガム等の成分として投与することができる。シロップは、活性化合物の他に、甘味剤としてのスクロース、および特定の防腐剤、染料および着色料、ならびに香味料を含み得る。
【００２４】
活性化合物またはその医薬的に許容される塩はまた、所望の作用を害さない他の活性材料、または所望の作用を補完する材料と混合することもできる。
【００２５】
本明細書に使用される、医薬的に許容される塩という用語は、上記に特定した化合物の所望の生物学的活性を保持し、最小限の望ましくない毒性効果を呈するか、またはそれを全く呈さない塩を指す。かかる塩の例としては、無機酸を用いて形成された酸付加塩（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸等）、および酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息酸、タンニン酸、パモン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタリンスルホン酸、ナフタリンジスルホン酸、およびポリガラクツロン酸等の有機酸を用いて形成された塩が挙げられるが、それらに限定されない。化合物はまた、当業者に知られる医薬的に許容される第４級塩として投与することができ、それは、具体的に、式−−ＮＲ＋Ｚ−の第４級アンモニウム塩を含み、式中、Ｒは、水素、アルキル、またはベンジルであり、Ｚは、塩素物、臭化物、ヨウ化物、−−Ｏ−アルキル、トルエンスルホナート、メチルスルホナート、スルホナート、リン酸、またはカルボン酸（安息香酸、コハク酸、酢酸、グリコール酸、マレイン酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、アスコルビン酸、安息香酸、シンナモアート、マンデロエート、ベンジロエート、およびジフェニル酢酸等）を含む、対イオンである。
【００２６】
最適か、単独か、または他の好適な成分と組み合わせた化合物は、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤（すなわち、それらは「ネブライザー」であってもよい）に作製することができる。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の加圧可能な高圧ガス内に定置することができる。
【００２７】
直腸投与に好適な製剤としては、例えば、座薬基剤と共にパッケージ化された核酸から成る座薬が挙げられる。好適な座薬基剤としては、自然または合成のトリグリセリドまたはパラフィン炭化水素が挙げられる。また、例えば、液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール、およびパラフィン炭化水素を含む、塩基との最適な化合物の組み合わせから成るゼラチン状直腸カプセルの使用も可能である。
【００２８】
例えば、関節内（関節の中）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、および皮下経路等による非経口投与に好適な製剤としては、製剤に対象とする受容者の血液との等張性を与える、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および溶質を含むことができる、水性および非水性、等張性滅菌注射液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および防腐剤を含むことができる水性および非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。本発明の実践において、組成物は、例えば、静脈内注入、経口、局所、腹腔内、膀胱内または髄腔内によって投与することができる。非経口投与、経口投与、皮下投与、および静脈内投与は、好ましい投与方法である。好適な溶液製剤の具体的な例は、水中に、約０．１〜１００ｍｇ／ｍＬの化合物〜約１０００ｍｇ／ｍＬプロピレングリコールを含み得る。好適な溶液製剤の別の具体的な例は、水中に、約０．１または約０．２〜約１００ｍｇ／ｍＬの化合物、および約８００〜１０００ｍｇ／ｍＬのポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）を含み得る。
【００２９】
好適な懸濁液製剤の具体的な例は、水中に、約０．２〜３０ｍｇ／ｍＬの化合物、および約２００ｍｇ／ｍＬのエタノール、約１０００ｍｇ／ｍＬの植物油（例えば、トウモロコシ油）、約６００〜１０００ｍＬ／ｍＬの果汁（例えば、ブドウの果汁）、約４００〜８００ｍＬ／ｍＬの牛乳、約０．１ｍＬ／ｍＬのカルボキシメチルセルロース（または、微結晶セルロース）、約０．５ｍｇ／ｍＬのベンジルアルコール（または、ベンジルアルコールおよびベンザルコニウム塩素物の組み合わせ）、および約４０〜５０ｍＭの緩衝剤、ｐＨ７（例えば、リン酸塩緩衝剤、酢酸緩衝剤もしくはクエン酸緩衝剤、または、あるいは５％のブドウ糖を緩衝剤の代わりに使用し得る）からなる群から選択された、１つ以上の賦形剤を含み得る。
【００３０】
好適なリポソーム懸濁液製剤の具体的な例は、水中に、約０．５〜３０ｍｇ／ｍＬの化合物、約１００〜２００ｍｇ／ｍＬのレシチン（または、他のリン脂質またはリン脂質の混合物）、および任意に、約５ｍｇ／ｍＬのコレステロールを含み得る。化合物の皮下投与では、１００ｍｇ／ｍＬのレシチンを有する、水中に、５ｍｇ／ｍＬの化合物、ならびに１００ｍｇ／ｍＬのレシチンおよび５ｍｇ／ｍＬのコレステロールを有する、水中に、５ｍｇ／ｍＬ化合物を含むリポソーム懸濁液製剤は、良好の結果を提供する。
【００３１】
化合物の製剤は、アンプルおよびバイアル等の単位用量または多用量の密封容器で提供することができる。注射液および懸濁液は、前述の種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。
【００３２】
医薬調製物は、好ましくは、単回投与量形態である。かかる形態において、調製物は、適量の化合物を含む単位用量に細分される。単回投与量形態は、パッケージ化された調製物であってもよく、パッケージは、小袋の錠剤、カプセル、およびバイアルまたはアンプル内の粉末等の分離量の調製物を含む。また、単位用量形態は、カプセル、錠剤、カチェット、またはドロップ自体であってもよいか、または適切な数のパッケージ形態のこれらのいずれかであってもよい。必要に応じて、組成物はまた、他の適合性治療薬を含むことができ、下記にさらに詳細に説明する。
【００３３】
一実施形態において、活性化合物を、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む、制御放出製剤等の身体からの迅速排除から化合物を保護する担体を用いて調製する。エチレンビニル酢酸、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸等の生分解可能な生体適合性ポリマーを使用することができる。かかる製剤の調整方法は、当業者には明らかである。材料はまた、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＣＡ）およびＧｉｌｆｏｒｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）から市販されるものを入手することができる。リポソーム懸濁液はまた、医薬的に許容される担体であり得る。これらは、当業者に知られる方法、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号（それは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に説明される方法に従って調製し得る。例えば、リポソーム製剤は、適切な脂質（ステアロイルホスファジルエタノールアミン、ステアロイルホスファジルコリン、アラカドイルホスファジルコリン、およびコレステロール等）を無機溶媒中に溶解し、次いで蒸発させ、容器の表面上に薄層の乾燥脂質を残すことによって調製し得る。次いで、活性化合物またはその一リン酸塩、二リン酸塩、および／または三リン酸塩誘導体の水性溶液を容器内に導入する。次いで、脂質物質を容器の側面から遊離させ、かつ脂質会合体を分散するために手で容器を回転し、それによって、リポソーム懸濁液を形成する。
【００３４】
したがって、本明細書に説明する組成物は、線維性病態の治療上の使用に役立つ。損傷組織の修復は、生存に必要な基本的な生物学的プロセスである。しかしながら、損傷が繰り返されるか、または持続される場合、修復プロセスが異常になり得、ＥＣＭタンパク質は、病的レベルまで集積され得る。本明細書に説明する実験において、組織損傷は、様々な薬剤（肺内のブレオマイシンおよび肝臓内のＡＮＩＴ）によってもたらされた。これらのモデルは、共通して、刺激によって、組織コラーゲンの合成が未治療対照から得られるレベルを上回って著しく増加したという事実を有する。この影響は、総コラーゲン貯留および組織内で合成された新規コラーゲンの絶対値の増加に反映された。両方のモデルにおいて、ノスカピンは、用量依存的に、新規コラーゲンの合成、組織内に存在するコラーゲンの分割量および絶対量の双方、ならびにその総量の増加を阻止した。
【００３５】
ノスカピンは、これらの実験において対象関心である２つの主要な薬理活性を有する。ノスカピンは、ＭＴ修飾剤（Ｙｅ ｅｔ ａｌ．１９９８）、ならびにブラジキニン拮抗薬（Ｍａｈｍｏｕｄｉａｎ ｅｔ ａｌ．２００１）である。 理論に束縛されるものではないが、この活性の組み合わせは、ノスカピンを線維症治療のための特に興味深い新規薬剤にし得る。
【００３６】
通常の創部治癒プロセス中に、損傷上皮および／または内皮細胞は、線維芽細胞を活性化させるためにメディエータを放出する。それらが創部内に移動すると、線維芽細胞は、病理学的組織改造の重要な役割を担う、α−ＳＭＡ発現筋線維芽細胞へと変形する（Ｈｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００７再考）。ＭＴの動態特性は、大細胞が移動するときにＭＴネットワークの再配向を可能にする。 理論に束縛されるものではないが、ノスカピンがＭＴの動態を減少させるため、創部領域内への線維芽細胞等の細胞の動作を減少することができると考えられる。Ｌｉａｏら（１９９５）は、生体内において、細胞内の実際のＭＴレベルではなく、ＭＴ動態を妨害するノコダゾール等の低濃度の物質が、線維芽細胞培養の創部領域内への線維芽細胞の移動運動速度を減少させることを発見した。しかしながら、ノスカピン等のＭＴ修飾剤の抗線維性影響は、以前、生体内で証明されていない。
【００３７】
ＭＴはまた、ＴＧＦ−Ｓｍａｄ信号伝達経路の負の調節において重要な役割を担い得る。生体内において、Ｌｉｕら（２００５）は、低濃度のＭＴ阻害剤（パクリタキセル）が、強皮症のヌードマウスモデルにおいてＴＧＦ−β信号伝達を有意に抑制したことを発見した。パクリタキセルは、Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３リン酸化反応を顕著に抑制し、かつＳＳｃ移植片におけるコラーゲン沈着を減少させた（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ，２００５）。ＴＧＦ−βＳｍａｄ信号伝達経路は、原因として線維症の誘導に関連付けられている（再考：Ｗｅｌｌｓ，２０００，Ｖｅｒｒｅｃｃｈｉａ ａｎｄ Ｍａｕｖｉｅｌ，２００７）。ＴＧＦ−βは、例えば、線維芽細胞に走化性であり、かつＥＣＭの酵素的分解を阻止するプロテアーゼ阻害剤の産生も増加させながら、ＥＣＭを合成するために線維芽細胞を誘導し、ＴＧＦ−βは、リンパ球機能を調節し、かつ平滑筋細胞アポトーシスを阻害しながら、内皮細胞アポトーシスを増加させる。
【００３８】
生体内の低濃度で、すべてのＭＴ阻害剤は、ＭＴ動態を分裂させるが、これらの薬剤は、異なる結合部位で微小管に作用し、それらに異なる影響を引き起こさせる（Ｊｏｒｄａｎ，２００２）。ＭＴ阻害は、ＭＴポリマー化を阻害するコルヒチン、ノコダゾール、およびビンカアルカロイド等の化合物、およびＭＴポリマー化を促進するタキソイド（例えば、パクリタキセル）等の化合物の２つの一般的な種類に分類される（Ｊｏｒｄａｎ，２００２）。痛風の治療に使用されている抗炎症剤であるコルヒチンは、タブリンを結合し、ＭＴポリマー化の破壊をもたらす。コルヒチンは、ＩＰＦの治療において、コルチコステロイドおよび／または免疫抑制薬の代替として試験されており（Ｄｏｕｇｌａｓ ｅｔ ａｌ １９９８）、より安全であるが、効果的ではない（すなわち、効果のない従来の療法よりも効果がない）ことが分かった。ノスカピンは、化学的にコルヒチンと同様であるが、それは、チューブリン上の異なる部位に結合する（Ｙｅ ｅｔ ａｌ，１９９８）。結合すると、ノスカピンは、ポリマー化を破壊するよりはむしろ、ポリマー化を促進するチューブリンおよびＭＴ構成の構造変化を誘導し、ＭＴ分解／再構成サイクルを遅くする一般的な方法で作用し得る。
【００３９】
トキソイド等の多くのＭＴ阻害剤は、それらの細胞増殖を制限する能力から、抗癌療法として開発されている。しかしながら、これらの薬剤の副作用プロファイルにより、それらが線維症の治療に不適切になり得る。実際、いくつかのこれらの薬剤によるＭＴネットワークの破壊は、ＴＧＦ−β応答性遺伝子の転写によるリガンド非依存性Ｓｍａｄ核内沈着につながり、ＴＧＦ−β誘導Ｓｍａｄ活性を増加させ、すべての活性は、線維形成の性質になる可能性が高い。パクリタキセル治療は、数名の患者の強皮症様症候群の発達に関連付けられている（例えば、Ｄｅ Ａｎｇｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ，２００３）。したがって、ノスカピンが線維性疾患または病態の動物モデルにおける生体内の線維化、抗線維性または中和作用を及ぼすかどうかは、予測不可能であった。
【００４０】
そのＭＴ調節作用の他に、ノスカピンはまた、その鎮咳活性のうちの少なくとも一部に関与する機構である（Ｅｂｒａｈｉｍｉ ｅｔ ａｌ，２００３）非競合的ブラジキニン拮抗薬として作用する（Ｍａｈｍｏｕｄｉａｎ ｅｔ ａｌ．２００１）。ブラジキニンは、低血圧、気管支収縮、腸および子宮収縮、気道内の上皮分泌、腸および外分泌腺、血管透過性、疼痛、結合組織増殖、サイトカイン放出、ならびにエイコサノイド形成の様々な生物学的影響を引き起こす（Ｓｔｅｒａｎｋａ ｅｔ ａｌ，１９８９）。ブラジキニンは、それとは反対の証拠が存在するが、線維症の誘発に関連し得る（例えば、Ｓａｎｃｈｏ−Ｂｒｕ ｅｔ ａｌ，２００７、Ｈｅｌｓｋｅ ｅｔ ａｌ，２００７）。線維芽細胞増殖を誘発、筋線維芽細胞への肺線維芽細胞の移行、およびコラーゲン産生の促進によって、ブラジキニンは、気管支の再構成および肺線維症に関与し得る（Ｖａｎｃｈｅｒｉ ｅｔ ａｌ，２００５）。ブラジキニンはまた、コラーゲンｍＲＮＡ、血管平滑筋細胞内のＴＩＭＰおよびＴＧＦ−βの分泌を増加させた（Ｄｏｕｉｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ，２０００）。ブラジキニン拮抗薬を用いる治療は、心筋再構成モデルにおいて、ブラジキニンの線維形成作用を阻止することができた（Ｋｏｉｋｅ ｅｔ ａｌ，２００５）。したがって、ブレオマイシン内のいくつかのノスカピンの抗線維性作用およびＡＮＩＴモデルは、そのＭＴ調節活性の他に、ブラジキニン拮抗薬活性によるものであり得る。
【００４１】
要約すると、ノスカピンは、様々な線維性病態を治療する可能性を有する新規抗線維化剤であると思われる。ノスカピンの抗線維性活性は、ＭＴ修飾剤および／またはブラジキニン拮抗薬として、その独自の薬理学的プロファイルに起因し得る。
【００４２】
以下の非制限的実施例は、本明細書に開示する発明をさらに解説する。
【実施例】
【００４３】
実施例１：ブレオマイシン誘導型肺線維症
【００４４】
特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、肺機能を害する広域な組織再構成をもたらすＥＣＭの過剰沈着を特徴とする、慢性、かつ、しばしば、致死性の疾患である。免疫抑制剤に伴う治療等の従来の治療は、疾患進行を制御するか、または予防する上で非効果的である。
【００４５】
げっ歯動物へのブレオマイシンの器官内投与は、ヒトの間質性肺線維症の標準的実験モデルとなった。ブレオマイシンの毒性（Ｓｌｅｉｊｆｅｒ，２００１再考）は、主に、肺および皮膚内で生じ、それは、これらの組織内の不活性酵素、ブレオマイシンヒドロラーゼの欠如によるものである。ブレオマイシンは、フリーラジカルの誘導を介して細胞毒性を誘導し、次いで、それは、ＤＮＡの切断を引き起こす。ＩＰＦの多くの組織学的変化は、ブレオマイシンの投与によって再産生され（Ｇｒａｎｄｅ ｅｔ ａｌ．１９９８において再考）、肺胞の歪み、毛細血管の再構成、およびＥＣＭ、特にコラーゲンの過剰沈着を特徴とする。ブレオマイシンモデル、ならびにＩＰＦにおいて、ＴＧＦ−βは、線維芽細胞増殖および増加したコラーゲン合成の主な分子メディエータである。
【００４６】
ブレオマイシン投与は、ＧＣ／ＭＳによって測定されるように、ＯＨＰの分別合成の少なくとも３倍の増加を誘発する。線維性反応の阻害または反転は、ブレオマイシン／媒体対照と比較するときに、ＯＨＰ合成の減少によって決定される。
【００４７】
方法
【００４８】
動物：研究開始時に生後１０週間のメスのＣ５７ＢＬ／６マウスを使用した。餌および水は、研究期間、その場で入手可能であった。研究グループは、表１に記載するとおりである。
【００４９】
表１：ブレオマイシン誘発型線維症の実験グループの概要
【表１】
【００５０】
プロトコル：ブレオマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、１．０５Ｕ／ｍＬの濃度の滅菌生理食塩水中で溶解した。１．５Ｕ／ｋｇのブレオマイシンの用量を得るために、経口投与によって、３０μＬのブレオマイシン溶液または同一容量の媒体（擬似対照）をメスのＣ５７Ｂｌ／６マウスの器官内に設置した。同一日に、８％２Ｈ２Ｏを用いてマウスを標識し、ノスカピンの投与を開始した。標識（飲料水内の８％２Ｈ２Ｏ）および薬物投与を２週間の研究期間、継続した。ノスカピンの用量および投与経路は、表１に示すとおりである（ｐｏは、強制経口、ｉｐは、腹腔内を表す）。
【００５１】
最終の薬物投与の翌日に、マウスを強い麻酔化に置き、心穿刺を介して血液を収集した。等張性生理食塩水を用いて肺を還流し、除去し、計量した。肺を、ＭｉｎｉＢｅａｄｂｅａｔｅｒ−９６（登録商標）（Ｂｉｏｓｐｅｃ，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，ＯＫ）ビーズ式破砕機を用いて均質化し、全ホモジネート量を決定した。ホモジネートを、ＯＨＰ評価のための総組織タンパク質を得るために、アセトン沈殿を施した。タンパク質を、ＨＣｌ中の培養によって加水分解し、真空下で乾燥させ、次いで、培養前に、５０％のアセトニトリル、５０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、およびペンタフルオロベンジル臭化物の溶液中で懸濁した。誘導体をエチル酢酸内に抽出し、上層を除去し、真空遠心分離によって乾燥させた。ヒドロキシプロリンのヒドロキシル部分をアセチル化するために、サンプルをアセトニトリル、Ｎ−メチル−Ｎ−［タート−ブチルジメチル−シリル］トリフルオロアセトアミド（ＭＴＢＳＴＦＡ）およびメチルイミジゾールの溶液を用いて培養した。この材料を石油エーテル内で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４を用いて乾燥させた。誘導体化ＯＨＰを、負化学イオン化モードで実施したＧＣ／ＭＳによって分析した。選択イオンモニタリングを、４４５、４４６、および４４７の質量対電荷比（ｍ／ｚ）を有するイオンで実施し、それらは、ＯＨＰからの炭素−水素結合のすべてを含む。ＯＨＰへの２Ｈの組み込みを、天然依存度分率（ＥＭ１）を上回る１つの過剰質量を有する分子のモル分率として計算した。コラーゲンの分別合成（ｆ）を、現在の身体２Ｈ２Ｏ濃縮で可能な最大値までのタンパク質結合ＯＨＰ内のＥＭ１値の比率として計算した。
【００５２】
ＧＣ／ＭＳ分析の他に、サンプル中のコラーゲンの絶対量を、ＯＨＰ含有量を決定するための確立されている比色分析法である、総ＯＨＰのクロラミン−ｔ分析によって決定した。本来のホモジネート（４００μＬ）のサンプルを加水分解し、（ＨＣｌ、５００μＬ）、乾燥させ、１ｍＬの分析緩衝剤中で再懸濁し、一晩、培養した。１５０μＬの懸濁液を９６ウェルプレートのウェル内にピペットで入れた。７５μＬのクロラミン−ｔをウェルに添加し、プレートを室温で２０分間培養した。次いで、ジメチルアミノベンズアルデヒド（７５μＬ）をそれぞれのウェルに添加した。プレートを、５４０ｎｍのマイクロクァント（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．ＭＱＸ２００）上で読み込まれる前に、６０℃で１５分間、培養した。ＯＨＰ標準を調製し、サンプルを用いて分析した。標準曲線からの値を補間するために、グラフパッドプリズムを使用して結果を分析した。
【００５３】
α平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）を発現する、筋線維芽細胞内への線維芽細胞の分化は、線維症の発達の主なプロセスである。α−ＳＭＡは、活性化筋線維芽細胞の周知の指標である。肺の小さなサンプル（５〜２０ｍｇ）を、左葉の中央から切除し、即座にホルマリン中に固定し、組織学的検査に送った（Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＬＬＣ，Ｌｏｎｇｍｏｎｔ Ｃｏ，ＵＳＡ）。つまり、パラフィン組み込みスライドを、ホルマリン固定された組織から調製し、次いで、αＳＭＡの抗体を使用して染色した。調製されたスライドをスキャンし、撮影し、その後、ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅソフトウエア（Ａｐｅｒｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｖｉｓｔａ Ｃａ）を使用して、αＳＭＡ陽性細胞の存在を分析した。
【００５４】
統計：薬物媒体／ブレオマイシン対照との比較のためのダネット検定後の分散分析を使用して、データを分析した（ＳｉｇｍａＳｔａｔ）。データをｐ＜０．０５で有意と見なした。
【００５５】
結果：
【００５６】
ブレオマイシンは、コラーゲンの分別合成の有意な増加を誘発した（図１、５および６）。ノスカピンは、腹腔内（ｉｐ）注入されたか（図１）、または強制経口（ｐｏ）によって投与（図５）されたかどうかに関わらず、ブレオマイシン誘発のコラーゲン合成の増加を阻止した。ノスカピンはまた、食餌中に投与されたときに、新たに合成されたコラーゲンの割合を低減する傾向があった（図６）。
【００５７】
ブレオマイシンはまた、クロラミン−ｔ分析によって評価されるように、肺の総コラーゲン（ＯＨＰ）含有量を増加させた。この影響は、用量依存的方法で、ノスカピンによって阻止された（図２）。
【００５８】
肺内の新たに合成されたコラーゲンの絶対量（合成（ｆ）ｘ総ＯＨＰ含有量として計算）は、ノスカピンによって有意に減少した（図３）。
【００５９】
ノスカピンは、媒体＋ブレオマイシン対照グループに対して、α平滑筋アクチン（αＳＭＡ）陽性細胞の数を有意に減少させた（図４）。
【００６０】
実施例ＩＩ：ＡＮＩＴ誘発型肝臓線維症
【００６１】
α−ナフチルイソチオシアネート（ＡＮＩＴ）は、胆管細胞および肝細胞を損傷する肝毒物である。ＡＮＩＴへの長期の曝露は、胆管過形成、胆管線維症、ならびに肝臓損傷を誘発する。ＡＮＩＴは、グルタチオンに抱合され、胆汁に分泌される（Ｘｕ，２００４において再考）。しかしながら、ＡＮＩＴ−グルタチオン錯体は、不安定であり、胆汁を迅速に解離させ、それによって、肝細胞の薬物の再摂取を引き起こす。再利用を多くの周期で継続することができ、ＡＮＩＴ排除を遅延し、グルタチオンを枯渇させる。その直接の細胞毒性効果の他に、ＡＮＩＴはまた、組織損傷の一因となる肝炎反応を誘発する。げっ歯動物へのＡＮＩＴの慢性投与は、肝臓コラーゲンの有意な増加をもたらし、肝臓線維症の動物モデルとして使用される（Ｘｕ ｅｔ ａｌ，２００４）。ＫｉｎｅＭｅｄの重水標識化およびＧＣ／ＭＳ技術を使用して、ＡＮＩＴ投与は、コラーゲンの分別合成の少なくとも３倍の増加を誘発することが発見されている。線維性反応の阻害または反転は、ＡＮＩＴ媒体対照と比較したときのコラーゲン合成の減少によって決定される。
【００６２】
方法：
【００６３】
対象：研究開始時に生後１０週間のメスのＣ５７ＢＬ／６マウスを使用した。動物を、標準的実験室環境下で、その場で入手可能な餌および水で、５匹のグループに収容した。研究グループは、表２に示すとおりである（ｐｏは、強制経口を表す）。
【００６４】
表２ ＡＮＩＴ誘導型肝臓線維症の実験グループの概要
【表２】
【００６５】
プロトコル：
【００６６】
マウスに、肝臓内に繊維性反応を誘発させるために、２週間、０．０５％（ｗ／ｗ）のＡＮＩＴを混ぜた食餌、または対照の食餌を与えた。マウスを、ＡＮＩＴ投与が開示した日から、８％２Ｈ２Ｏ（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｓｔａｂｌｅ Ｉｓｏｔｏｐｅｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）で標識した。同一日に、表２に記載するように、ノスカピンＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）投与を開始した。ＡＮＩＴ、標識、ノスカピン投与を２週間、継続した。
【００６７】
最終薬物投与の翌日に、マウスを強い麻酔下に置き、肝臓を還流して、除去した。肝臓組織を、ＭｉｎｉＢｅａｄｂｅａｔｅｒ−９６（登録商標）ビーズ式破砕機（Ｂｉｏｓｐｅｃ，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，ＯＫ）を用いて均質化し、その後、アセトン沈殿および真空乾燥を行った。タンパク質を、６ＮＨＣｌ（１１０℃、１６時間）中で加水分解し、真空下で乾燥させ、１ｍＬの５０％のアセトニトリル、５０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、ｐＨ１１中で懸濁した。ペンタフルオロベンジル臭化物を、密封された混合物が培養される（１００℃、１時間）前に添加し、エチル酢酸内に抽出した。上層を除去し、真空遠心分離後に固体のＮａ２ＳＯ４の添加によって乾燥させた。サンプルを、５０μＬのメチルイミダゾールおよび１００μＬのＭＴＢＳＴＦＡで培養した（１００℃、３０分間）。誘導体を水／石油エーテル内で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４を用いて乾燥させた。選択イオンモニタリングは、ＯＨ−プロリン誘導体では、４４５、４４６、および４４７の質量対電荷比（ｍ／ｚ）であった。モル％の過剰なＭ１濃縮（ＥＭ１）および分別合成（ｆ）を計算する。
【００６８】
ＧＣ／ＭＳ分析の他に、ブレオマイシン研究に対して上述のように、試料中のＯＨＰの絶対量をクロラミン−ｔ分析によって決定した。
【００６９】
コラーゲン含有量のＡＮＩＴ誘発による変化へのノスカピンの影響を組織学的に確認した。肝臓の小さなサンプル（７５〜８０ｍｇ）を右側葉から切除し、即座に、ホルマリン中に固定させ、組織学的検査に送った（Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＬＬＣ，Ｌｏｎｇｍｏｎｔ Ｃｏ，ＵＳＡ）。つまり、パラフィン組み込みスライドを、ホルマリン固定された組織から調製し、次いで、コラーゲン分布のためのＭａｓｓｏｎの三重染色を用いて処理した。調製されたスライドをスキャンし、撮影し、その後、ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅソフトウエア（Ａｐｅｒｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｖｉｓｔａ Ｃａ）を使用してコラーゲン含有量を分析した。
【００７０】
統計：ＡＮＩＴ／媒体対照との比較のためのダネット検定後の分散分析を使用して、データを分析した（ＳｉｇｍａＳｔａｔ）。データをｐ＜０．０５で有意と見なした。
【００７１】
結果：
【００７２】
２週間にわたる食餌中の０．０５％のＡＮＩＴの投与は、肝臓内に新たに合成されたヒドロキシプロリン（ＯＨＰ）の割合において有意な増加をもたらした（図７、１１および１２）。肝臓内の新規および総ＯＨＰの絶対値（クロラミン−ｔ試験によって測定される）はまた、ＡＮＩＴを投与することによって有意に増加した。（図８および９）。強制経口（ｐｏ）によって投与されるとき、ノスカピン用量は、新たに合成されたコラーゲンの割合を用量依存的に減少させた（図７）。全肝臓内のＯＨＰの総量および新たに合成されたコラーゲンの量はまた、ＡＮＩＴと媒体対照グループと比較すると、有意に減少した。（図８および９）。ノスカピンがＡＮＩＴと共に投与されるときのコラーゲン含有量の有意な減少を組織学的に確認した（図１０）。個別の研究において、食餌中（図１１）か、または強制経口（図１２）のいずれかで投与された、３００ｍｇ／ｋｇの用量のノスカピンはまた、新たに合成されたコラーゲンの量を減少させる傾向があった。
【００７３】
前述の発明を、明確な理解を目的として図示および実施例によって詳細に説明したが、特定の変更および修正が本発明の精神および範囲から逸脱することなく実施し得ることは、当業者には明らかであろう。したがって、説明は、添付の請求項によって詳しく記述する、本発明の範囲を制限すると解釈されてはならない。
【００７４】
本明細書に引用したすべての発行物、特許、特許出願は、個々の発行物、特許、または特許出願のそれぞれが、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同一程度において、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７５】
引用した参照文献：
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Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｂｙ ｗｈｉｃｈ ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ：ｒｏｌｅ ｏｆ ＴＧＦ−ｂｅｔａ ａｎｄ ＭＡＰＫ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０００ Ｄｅｃ；２７９（６）：Ｈ２８２９−３７。
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Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００４ Ｓｅｐ；２８７（３）：Ｇ７３４−４１。
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Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００２ Ｍａｙ １０；２７７（１９）：１７２００−８。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本発明は、２００８年６月２０日に出願された、米国特許仮出願第６１／０７４，４９２号に対して、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく優先権の利益を主張し、当該出願は、参照によりその全体が組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
線維症は、長期に及ぶ損傷に対して、多くの異なる組織内に生じる可能性のある複雑な障害である。線維症は、一般的に、線維芽細胞および筋線維芽細胞の増殖における異常な増加、ならびにコラーゲンおよび他の細胞外基質（ＥＣＭ）成分の過剰沈着を特徴とする。最終的に、これらの変化は、肝硬変、肺間質性線維症（ＩＰＦ）、皮膚および他の臓器の全身硬化症（強皮症）、移植拒絶反応、心臓の鬱血性腎不全、および多くの他の疾患において生じ得るように、罹患臓器の正常構造および機能を破壊し得える。コルチコステロイドおよび免疫抑制剤の使用を伴う従来の治療は、線維症の進行の逆転、または阻止に対して、ほとんど、または全く効果がない（Ｗｙｎｎ、２００７）。
【０００３】
根本的な病因の複雑性から、様々な治療介入が提案されてきた。コラーゲン線維の合成、排泄、または重合を低減することは、線維成長を鈍化させる上で有効であり得ることが示唆されている。別の一連の攻撃は、過剰なＥＣＭを破壊する目的で、コラゲナーゼ活性を亢進させることであり、一方他の者は、コラーゲン合成を刺激する、形成転換成長因子β（「ＴＧＦ−β」）等のサイトカインを中和するか、またはそれに拮抗する戦略を示唆している。いくつか想定される抗線維化剤が臨床治験で試験されているが、線維症の遅延における実質的な有効性を証明できていない。
【０００４】
線維症の開始および進行に関与する要因のなかで、創部へのリンパ球および線維芽細胞／筋線維芽細胞の動員（Ｈｉｎｚ ｅｔ ａｌ，２００７）およびＴＧＦ−βの誘導（Ｗｅｌｌｓ ２０００、Ｖｅｒｒｅｃｃｈｉａ ａｎｄ Ｍａｕｖｉｅｌ，２００７）が、重要であると見なされる。したがって、創部組織内への線維芽細胞および筋線維芽細胞の移動を正常化する、および／またはＴＧＦ−βの機能を調節することができる薬剤は、線維症を治療する上で特に有用であり得る。
【発明の概要】
【０００５】
したがって、一態様において、本発明は、患者の線維性疾患または病態を治療する方法を提供し、この方法は、患者にノスカピンおよび医薬担体を投与することを含む。いくつかの実施形態において、線維性疾患または病態が遅延され、いくつかの実施形態において、線維性疾患または病態が低減される。
【０００６】
さらなる態様において、本発明は、線維性疾患を治療する方法を提供し、この方法は、ノスカピン（その変異体を含む）を含む医薬組成物、ならびにＡＣＥ阻害剤、抗炎症剤、パーフェニドン、グリーベック、およびボセンタンが挙げられるが、これらに限定されない１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の抗線維化剤を投与することを含む。医薬組成物は、医薬担体をさらに含み得る。かかる治療は、線維性疾患の症状の発症の遅延、または線維性疾患の症状の重症度の低減をもたらし得る。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ブレオマイシンの単回投与（１．５Ｕ／ｋｇ、経口）後２週間の新規コラーゲンの合成（標識ヒドロキシプロリン（ＯＨＰ）または「ｆ」の割合）を示す。ノスカピン（ｉｐ）投与は、ブレオマイシンと同一日に開始し、２週間継続した。Ｎ＝４／グループ；データを平均＋ＳＤとして表す；＊ｐ＜０．０５ＡＮＯＶＡ、その後のダネット検定で、ブレオマイシン／媒体と比較。
【図２】クロラミン−ｔ分析によって測定された、ブレオマイシンの単回投与（１．５Ｕ／ｋｇ、経口）の２週間後の肺当たりのＯＨＰの絶対量を示す。ノスカピン投与を、ブレオマイシンと同一日に開始し、２週間継続した。Ｎ＝４〜５／グループ；データを平均＋ＳＤとして表す；＊ｐ＜０．０５の一元配置ＡＮＯＶＡ、ダネット検定で、ブレオマイシン／媒体対照グループまたはノスカピン治療（３０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇ）グループと比較。
【図３】ブレオマイシンの単回投与（１．５Ｕ／ｋｇ、経口）の２週間後の肺当たりの新たに合成されたコラーゲンの絶対量（ｆ×［ＯＨＰ］として計算）を示す。ブレオマイシンは、媒体対照またはノスカピン治療グループに対して、肺内の新たに合成されたコラーゲンの絶対量を増加させた。Ｎ＝４〜５／グループ；データを平均＋ＳＤとして表す；＊ｐ＜０．０５のＡＮＯＶＡ、その後のダネット検定でブレオマイシン／媒体対照と比較。
【図４】ブレオマイシン（１．５Ｕ／ｋｇ；経口；上記の図１〜３と同一の動物）の単回投与の２週間後のマウスの肺から得たα−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）陽性肺細胞の代表的スライドおよび判定量分析を示す。ブレオマイシンは、肺内に存在する活性α−ＳＭＡ含有筋線維芽細胞の数を有意に増加させた。ノスカピンは、ブレオマイシンによって活性化された筋線維芽細胞の数を有意に減少させた。Ｎ＝４〜５／グループ；データを平均＋ＳＤとして表す；＊ｐ＜０．０５のＡＮＯＶＡ、その後のダネット検定で、ブレオマイシン／媒体対照と比較。
【図５】ブレオマイシンの単回投与（１．５Ｕ、経口Ｕ）の２週間後の新規コラーゲン（標識ＯＨＰまたは「ｆ」の割合）の合成を示す。３００ｍｇ／ｋｇのノスカピン（ｐｏ）の投与をブレオマイシンと同一日に開始し、２週間継続した。Ｎ＝１０／グループ；データを平均＋Ｓ．Ｄ．として表す；＊ｐ＜０．０５の一元配置ＡＮＯＶＡ、ダネットで、ブレオマイシン／媒体を比較。
【図６】ブレオマイシンの単回投与（１．５Ｕ、経口）の２週間後の新規コラーゲン（標識ＯＨＰまたは「ｆ」の割合）の合成を示す。ノスカピンをブレオマイシンと同一日に開始して、３００ｍｇ／ｋｇの概算投与量になる濃度で食餌中に投与し、２週間継続した。ノスカピンは、新規ＯＨ−Ｐの％を減少する傾向があるが、効果は、統計的に有意ではなかった。Ｎ＝５／グループ；データを平均＋Ｓ．Ｄ．として表す。
【図７】ＡＮＩＴのみか、またはノスカピン（ｐｏ）との組み合わせの投与後の肝臓内の新規コラーゲン（標識ＯＨＰまたは「ｆ」の割合）の合成を示す。３０および１００ｍｇ／ｋｇで、ノスカピンは、ＯＨＰのＡＮＩＴ誘導による上昇を有意に低減した。Ｎ＝５／グループ；データは、平均＋ＳＤである；＊ｐ＜０．０５のＡＮＯＶＡ、その後のダネット検定で、ＡＮＩＴ／媒体と多重比較。
【図８】ＡＮＩＴのみか、またはノスカピン（ｐｏ）との組み合わせの投与後の肝臓内のＯＨＰの絶対量を示す。ノスカピンは、ＯＨＰ含有量のＡＮＩＴ誘導による上昇を有意に低減した。Ｎ＝５グループ；データは、平均＋ＳＤである；＊ｐ＜０．０５のＡＮＯＶＡ、その後のダネット検定で、ＡＮＩＴ／媒体対照と多重比較。
【図９】通常の固形試料の投与と比較した、ＡＮＩＴのみか、またはノスカピン（ｐｏ）との組み合わせの投与後の肝臓内に新たに合成されたコラーゲン（ｆ×［ＯＨＰ］として計算）の絶対量を示す。３０および１００ｍｇ／ｋｇのｐｏで、ノスカピンは、コラーゲン合成のＡＮＩＴ誘導による上昇を有意に減少させた。Ｎ＝５／グループ；データは、平均＋ＳＤである。＊ｐ＜０．０５のＡＮＯＶＡ、その後のダネット検定で、ＡＮＩＴ／媒体対照と比較。
【図１０】図７、８、および９と同一の動物からの組織学的に決定されたコラーゲン含有量（マッソントリクローム染色）の代表的なスライドおよび判定量分析を示す。ノスカピンは、ＡＮＩＴ誘導によるコラーゲン含有量を有意に減少させた。データは、平均＋ＳＤである；＊ｐ＜０．０５のＡＮＯＶＡ、その後のダネット検定で、ＡＮＩＴ／媒体対照と比較。
【図１１】肝臓内のコラーゲンの合成のＡＮＩＴ誘導による増加へのノスカピンの影響を示す。３００ｍｇ／ｋｇの概算投与量を得るために、２０ｇのマウスが３ｇ／日の食餌を食べることを仮定して、ノスカピンを２ｇ／ｋｇの濃度で食餌中に投与した。Ｎ＝５／グループ；データは、平均＋ＳＤである。＊ｐ＜０．０５のＡＮＯＶＡ、その後のダネット検定で、ＡＮＩＴ／媒体対照と比較。
【図１２】肝臓内のコラーゲン合成におけるＡＮＩＴ誘導による上昇へのノスカピンの影響を示す。ノスカピンを３００ｍｇ／ｋｇで１日１回、強制経口によって投与した；Ｎ＝５／グループ；データを平均＋ＳＤとして表す。
【図１３】ノスカピンおよびノスカピン類似体の構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
特記しない限り、本発明の実施は、当該技術分野の技術範囲内である分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技術を用いる。かかる技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９９３−８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）：ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）、およびＭａｓｓ ｉｓｏｔｏｐｏｍｅｒ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｔ ｅｉｇｈｔ ｙｅａｒｓ：ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ，ａｎａｌｙｔｉｃ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｂｙ Ｈｅｌｌｅｒｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｎｅｅｓｅ（Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２７６（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．３９）Ｅ１１４６−Ｅ１１６２，１９９９）等の文献に十分に説明されており、それらのすべては、必要な技術のための参照により組み込まれる。さらに、市販されている分析キットおよび試薬を用いる手順は、典型的には、特に注記しないかぎり、製造者が定義したプロトコルに従って使用される。
【０００９】
近年のインビトロ研究は、微小管（ＭＴ）動態が、線維成長において以前に認識されていない役割を担い得ることを示唆している。ＭＴは、すべての細胞の運動性に必要ではないが、ＭＴの適切な機能は、線維芽細胞等の大細胞の定方向の転座に必要であると思われる。ＭＴ動態を阻害する化合物の極低濃度は、大細胞が罹患領域内に移動することができる比率を大幅に低下させる（Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ，１９９５）。これは、損傷組織内への線維芽細胞／筋線維芽細胞の動員において重要な要因であり得る。さらに、ＭＴは、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、およびＳｍａｄ４との複合体を形成し、したがって、ｒＳｍａｄをＴＧＦ−β受容体から離して封鎖することによって、ＴＧＦ−β／Ｓｍａｄシグナル伝達において負のフィードバックループを提供する（Ｄｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ，２０００）。線維症の誘導におけるＴＧＦ−βシグナル伝達カスケードおよびその重要性は、多くの発行物において検討されている（Ｗｅｌｌｓ２０００；Ｖｅｒｒｅｃｃｈｉａ ａｎｄ Ｍａｕｖｉｅｌ，２００７）。
【００１０】
ノスカピンは、チューブリンに結合し、その配座を変更し、それによって、ＭＴの分解／再組立サイクル（すなわち、動態）の比率を変更する、経口で有効な薬剤であり（Ｙｅ ｅｔ ａｌ．１９９８）、チューブリンの全ポリマー質量に影響を及ぼすか、または総ＭＴ変形を引き起こすことはない（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．２００２）。元々鎮咳薬として使用されていた（Ｅｍｐｅｙ ｅｔ ａｌ．１９７９）、ノスカピンは、近年、正常な組織に対して毒性が少ないか、または免疫反応の抑制を有する有効な抗癌剤であると報告されている（Ｋｅ ｅｔ ａｌ．２０００、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．２００３）。ノスカピンは、おそらく、そのブラジキニン活性を遮断する能力により、脳卒中の治療において有益であることが分かっている（Ｍａｈｍｏｕｄｉａｎ ｅｔ ａｌ．２００３）。ノスカピンは、アヘンから派生する非麻薬性フタリドイソキノリンアルカロイドである。しかしながら、ノスカピンは、鎮痛特性、鎮静特性、および呼吸機能抑制薬特性が欠如し、幸福感または依存性のいずれかを誘発しない。臨床治験において、ノスカピンは、良好な容認性を示すと考えられる（Ｍａｈｍｏｕｄｉａｎ ｅｔ ａｌ．２００３）。また、本開示において、ノスカピンは、線維性疾患または病態の有効な治療であると認められている。したがって、本開示は、線維性疾患または病態の治療のための製剤および方法を提供する。
【００１１】
本発明は、様々な線維性疾患または病態の治療のための方法および組成物を対象とする。この内容において「治療」は、症状の発症または重症度の遅延、死亡の遅延、および症状の軽減を含む。
【００１２】
一実施形態において、本発明は、線維性疾患または病態を治療する方法を提供し、方法は、ノスカピンまたはその塩を含む医薬組成物を、治療を必要とする患者に投与することを含む。「線維性疾患」とは、罹患していない対照に対するコラーゲンまたは他の細胞外基質（ＥＣＭ）成分の増加等の臓器または組織内の線維性結合組織の増加を特徴とする、疾患または障害を意味する。「線維性疾患」または「病態」としては、肝硬変、鬱血性心不全、線維性肺病、紫外線による老化、すい臓および肺の嚢腫性線維症、注入線維症が挙げられるが、それらに限定されず、それらは、筋肉内注入、心内膜心筋線維症、特発性肺線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性塊状線維症（炭鉱労働者の塵肺の合併症）、腎性全身性線維症、強皮症、腎線維症、臓器移植、傷、火傷等に関連する線維症の合併症として生じる可能性がある（米国特許第７，４４９，１７１号のｆｉｂｒｏｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓの考察および米国特許第１１／０６４，１９７号も参照されたく、それらの両方は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００１３】
下記にさらに説明するように、一実施形態は、治療のために薬剤としてノスカピンを用いる。ノスカピンの構造を図１３に示す。「ノスカピン」は、例えば、米国特許第６，３７６，５１６号に概説されるスカピン類似体および／または誘導体を含み、スカピン類似体およびそれを作製する方法に関連する、その特定の開示のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。好ましいノスカピン類似体は、図１３で確認できる。
【００１４】
別の実施形態において、本明細書に開示する方法に従い、他の薬剤、好ましくは、他の抗線維化剤と共にノスカピンを使用する。好ましい薬剤としては、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、抗炎症剤、パーフェニドン、グリーベック、またはボセンタンが挙げられるが、それらに限定されない。
【００１５】
ＡＣＥ阻害剤は、それらの分子構造に基づき、カプトプリル（商標カプトテン）およびゾフェノプリル等のスルフヒドリル含有剤の３つのグループに分割することができる。他の薬剤としては、ジカルボン酸含有剤が挙げられる。これは、エナラプリル（バソテック／レニテック）、ラミプリル（アルテース／トリテース／ラマース（Ｒａｍａｃｅ）／ラミウィン）、キナプリル（アキュプリル）、ペリンドプリル（コバシル／アセオン）、リシノプリル（リソジュール（Ｌｉｓｏｄｕｒ）／ロプリル／ノバテック／プリニビル／ゼストリル）、ベナゼプリル（ロテンシン）を含む最大のグループである。最後に、他のＡＣＥ阻害剤としては、フォシノプリル（モノプリル）等のホスホン酸含有剤が挙げられる。
【００１６】
抗炎症剤としては、ステロイドまたは非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤＳ）が挙げられる。好ましい抗炎症剤としては、グルココルチコイド、アスピリン、イブプロフェン、およびナプロキセンが挙げられるが、それらに限定されない。
【００１７】
製剤
【００１８】
線維性疾患または病態の治療のための治療上の使用において、本発明の医薬方法に用いられる化合物を、治療効果を達成するのに適した投与量レベルで、線維性疾患または病態と診断された患者、または線維性疾患または病態を発症するリスクのある患者に投与する。「治療効果」とは、化合物の投与が経時的に患者に対して有益な効果につながることを意味する。
【００１９】
ヒトへの投与に好適な初期投与量は、インビトロ分析または動物モデルから決定し得る。例えば、初期投与量は、インビトロ分析において測定されるように、投与される化合物の特定の代謝的活性剤のＩＣ５０を含む血清濃度を達成するように調剤し得る。あるいは、ヒトの初期投与量は、ブレオマイシン誘導型肺線維症マウスモデル等の線維性疾患または病態の動物モデルにおいて有効であることが分かっている投与量に基づき得る。一例として、本明細書に概説する医薬組成物のそれぞれの成分の初期投与量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約３０００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であり得るか、または約０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜約２０００ｍｇ／ｋｇ／日、または、約１ｍｇ／ｋｇ／日〜約２０００ｍｇ／ｋｇ／日、または約１０ｍｇ／ｋｇ／日〜約２０００ｍｇ／ｋｇ／日、または約１００ｍｇ／ｋｇ／日〜約２０００ｍｇ／ｋｇ／日、または約１０００ｍｇ／ｋｇ／日〜約２０００ｍｇ／ｋｇ／日も使用することができる。しかしながら、投与量は、患者の要求、治療される病態の重症性、および用いられる化合物によって異なり得る。用量はまた、特定の患者において特定の化合物の投与に伴う任意の薬物副作用の存在、性質、および範囲によって決定される。特定条件のための適切な投与量の決定は、施術者の技術範囲内である。一般的に、治療は、適量未満で化合物のより少量の投与量で開始する。その後、その状況下で最適な効果が達成されるまで、投与量を少しずつ増量する。便宜上、必要に応じて、１日の総投与量を分割し、１日に分割して投与し得る。
【００２０】
薬物組成物内の活性化合物の濃度は、薬物の吸収率、分布率、不活化率、および排泄率、ならびに当業者に知られる他の要因によって異なる。投与量値はまた、緩和される病態の重症度で異なることも留意するものとする。任意の特定の対象において、特定の投薬計画が個人のニーズ、および組成物の投与を投与するか、または管理する者の専門的な判断にしたがって経時的に調節されるべきであり、本明細書に示す濃度範囲は、例示のみであり、主張する組成物の範囲または実施を制限することを意図しないことをさらに理解するものとする。活性成分を一度に投与し得るか、または異なる時間間隔で投与される、いくつかの少ない用量に分割し得る。
【００２１】
経口投与に好適な製剤は、（ａ）水、生理食塩水、またはＰＥＧ４００等の希釈剤中に懸濁された有効量の化合物等の液体溶液、（ｂ）液体、固体、顆粒、またはゼラチンとして、それぞれ、規定量の活性成分を含むカプセル、サシェット、または錠剤、（ｃ）適切な液体内の懸濁液、および（ｄ）好適な乳液から成ることができる。錠剤形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、コーンスターチ、ポテトスターチ、微結晶セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ならびに他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤、芳香剤、染料、崩壊剤、および医薬的に適合性担体のうちの１つ以上を含むことができる。ドロップ形態は、風味のある活性成分、例えば、スクロースを含み、芳香錠は、活性成分の他に当該技術分野において知られる担体を含む、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシア乳液、ゲル等の不活性塩基中の活性成分を含むことができる。
【００２２】
経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤または食用担体を含む。それらは、ゼラチンカプセル内に封入されるか、または錠剤に圧縮され得る。経口の治療的投与の目的のために、活性化合物は、賦形剤と共に組み込まれ、錠剤、トローチ、またはカプセルに使用することができる。医薬的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント材料は、組成物の一部として含むことができる。
【００２３】
活性化合物またはその医薬的に許容される塩は、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハース、チューイングガム等の成分として投与することができる。シロップは、活性化合物の他に、甘味剤としてのスクロース、および特定の防腐剤、染料および着色料、ならびに香味料を含み得る。
【００２４】
活性化合物またはその医薬的に許容される塩はまた、所望の作用を害さない他の活性材料、または所望の作用を補完する材料と混合することもできる。
【００２５】
本明細書に使用される、医薬的に許容される塩という用語は、上記に特定した化合物の所望の生物学的活性を保持し、最小限の望ましくない毒性効果を呈するか、またはそれを全く呈さない塩を指す。かかる塩の例としては、無機酸を用いて形成された酸付加塩（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸等）、および酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息酸、タンニン酸、パモン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタリンスルホン酸、ナフタリンジスルホン酸、およびポリガラクツロン酸等の有機酸を用いて形成された塩が挙げられるが、それらに限定されない。化合物はまた、当業者に知られる医薬的に許容される第４級塩として投与することができ、それは、具体的に、式−−ＮＲ＋Ｚ−の第４級アンモニウム塩を含み、式中、Ｒは、水素、アルキル、またはベンジルであり、Ｚは、塩素物、臭化物、ヨウ化物、−−Ｏ−アルキル、トルエンスルホナート、メチルスルホナート、スルホナート、リン酸、またはカルボン酸（安息香酸、コハク酸、酢酸、グリコール酸、マレイン酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、アスコルビン酸、安息香酸、シンナモアート、マンデロエート、ベンジロエート、およびジフェニル酢酸等）を含む、対イオンである。
【００２６】
最適か、単独か、または他の好適な成分と組み合わせた化合物は、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤（すなわち、それらは「ネブライザー」であってもよい）に作製することができる。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の加圧可能な高圧ガス内に定置することができる。
【００２７】
直腸投与に好適な製剤としては、例えば、座薬基剤と共にパッケージ化された核酸から成る座薬が挙げられる。好適な座薬基剤としては、自然または合成のトリグリセリドまたはパラフィン炭化水素が挙げられる。また、例えば、液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール、およびパラフィン炭化水素を含む、塩基との最適な化合物の組み合わせから成るゼラチン状直腸カプセルの使用も可能である。
【００２８】
例えば、関節内（関節の中）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、および皮下経路等による非経口投与に好適な製剤としては、製剤に対象とする受容者の血液との等張性を与える、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および溶質を含むことができる、水性および非水性、等張性滅菌注射液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および防腐剤を含むことができる水性および非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。本発明の実践において、組成物は、例えば、静脈内注入、経口、局所、腹腔内、膀胱内または髄腔内によって投与することができる。非経口投与、経口投与、皮下投与、および静脈内投与は、好ましい投与方法である。好適な溶液製剤の具体的な例は、水中に、約０．１〜１００ｍｇ／ｍＬの化合物〜約１０００ｍｇ／ｍＬプロピレングリコールを含み得る。好適な溶液製剤の別の具体的な例は、水中に、約０．１または約０．２〜約１００ｍｇ／ｍＬの化合物、および約８００〜１０００ｍｇ／ｍＬのポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）を含み得る。
【００２９】
好適な懸濁液製剤の具体的な例は、水中に、約０．２〜３０ｍｇ／ｍＬの化合物、および約２００ｍｇ／ｍＬのエタノール、約１０００ｍｇ／ｍＬの植物油（例えば、トウモロコシ油）、約６００〜１０００ｍＬ／ｍＬの果汁（例えば、ブドウの果汁）、約４００〜８００ｍＬ／ｍＬの牛乳、約０．１ｍＬ／ｍＬのカルボキシメチルセルロース（または、微結晶セルロース）、約０．５ｍｇ／ｍＬのベンジルアルコール（または、ベンジルアルコールおよびベンザルコニウム塩素物の組み合わせ）、および約４０〜５０ｍＭの緩衝剤、ｐＨ７（例えば、リン酸塩緩衝剤、酢酸緩衝剤もしくはクエン酸緩衝剤、または、あるいは５％のブドウ糖を緩衝剤の代わりに使用し得る）からなる群から選択された、１つ以上の賦形剤を含み得る。
【００３０】
好適なリポソーム懸濁液製剤の具体的な例は、水中に、約０．５〜３０ｍｇ／ｍＬの化合物、約１００〜２００ｍｇ／ｍＬのレシチン（または、他のリン脂質またはリン脂質の混合物）、および任意に、約５ｍｇ／ｍＬのコレステロールを含み得る。化合物の皮下投与では、１００ｍｇ／ｍＬのレシチンを有する、水中に、５ｍｇ／ｍＬの化合物、ならびに１００ｍｇ／ｍＬのレシチンおよび５ｍｇ／ｍＬのコレステロールを有する、水中に、５ｍｇ／ｍＬ化合物を含むリポソーム懸濁液製剤は、良好の結果を提供する。
【００３１】
化合物の製剤は、アンプルおよびバイアル等の単位用量または多用量の密封容器で提供することができる。注射液および懸濁液は、前述の種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。
【００３２】
医薬調製物は、好ましくは、単回投与量形態である。かかる形態において、調製物は、適量の化合物を含む単位用量に細分される。単回投与量形態は、パッケージ化された調製物であってもよく、パッケージは、小袋の錠剤、カプセル、およびバイアルまたはアンプル内の粉末等の分離量の調製物を含む。また、単位用量形態は、カプセル、錠剤、カチェット、またはドロップ自体であってもよいか、または適切な数のパッケージ形態のこれらのいずれかであってもよい。必要に応じて、組成物はまた、他の適合性治療薬を含むことができ、下記にさらに詳細に説明する。
【００３３】
一実施形態において、活性化合物を、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む、制御放出製剤等の身体からの迅速排除から化合物を保護する担体を用いて調製する。エチレンビニル酢酸、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸等の生分解可能な生体適合性ポリマーを使用することができる。かかる製剤の調整方法は、当業者には明らかである。材料はまた、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＣＡ）およびＧｉｌｆｏｒｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）から市販されるものを入手することができる。リポソーム懸濁液はまた、医薬的に許容される担体であり得る。これらは、当業者に知られる方法、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号（それは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に説明される方法に従って調製し得る。例えば、リポソーム製剤は、適切な脂質（ステアロイルホスファジルエタノールアミン、ステアロイルホスファジルコリン、アラカドイルホスファジルコリン、およびコレステロール等）を無機溶媒中に溶解し、次いで蒸発させ、容器の表面上に薄層の乾燥脂質を残すことによって調製し得る。次いで、活性化合物またはその一リン酸塩、二リン酸塩、および／または三リン酸塩誘導体の水性溶液を容器内に導入する。次いで、脂質物質を容器の側面から遊離させ、かつ脂質会合体を分散するために手で容器を回転し、それによって、リポソーム懸濁液を形成する。
【００３４】
したがって、本明細書に説明する組成物は、線維性病態の治療上の使用に役立つ。損傷組織の修復は、生存に必要な基本的な生物学的プロセスである。しかしながら、損傷が繰り返されるか、または持続される場合、修復プロセスが異常になり得、ＥＣＭタンパク質は、病的レベルまで集積され得る。本明細書に説明する実験において、組織損傷は、様々な薬剤（肺内のブレオマイシンおよび肝臓内のＡＮＩＴ）によってもたらされた。これらのモデルは、共通して、刺激によって、組織コラーゲンの合成が未治療対照から得られるレベルを上回って著しく増加したという事実を有する。この影響は、総コラーゲン貯留および組織内で合成された新規コラーゲンの絶対値の増加に反映された。両方のモデルにおいて、ノスカピンは、用量依存的に、新規コラーゲンの合成、組織内に存在するコラーゲンの分割量および絶対量の双方、ならびにその総量の増加を阻止した。
【００３５】
ノスカピンは、これらの実験において対象関心である２つの主要な薬理活性を有する。ノスカピンは、ＭＴ修飾剤（Ｙｅ ｅｔ ａｌ．１９９８）、ならびにブラジキニン拮抗薬（Ｍａｈｍｏｕｄｉａｎ ｅｔ ａｌ．２００１）である。 理論に束縛されるものではないが、この活性の組み合わせは、ノスカピンを線維症治療のための特に興味深い新規薬剤にし得る。
【００３６】
通常の創部治癒プロセス中に、損傷上皮および／または内皮細胞は、線維芽細胞を活性化させるためにメディエータを放出する。それらが創部内に移動すると、線維芽細胞は、病理学的組織改造の重要な役割を担う、α−ＳＭＡ発現筋線維芽細胞へと変形する（Ｈｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００７再考）。ＭＴの動態特性は、大細胞が移動するときにＭＴネットワークの再配向を可能にする。 理論に束縛されるものではないが、ノスカピンがＭＴの動態を減少させるため、創部領域内への線維芽細胞等の細胞の動作を減少することができると考えられる。Ｌｉａｏら（１９９５）は、生体内において、細胞内の実際のＭＴレベルではなく、ＭＴ動態を妨害するノコダゾール等の低濃度の物質が、線維芽細胞培養の創部領域内への線維芽細胞の移動運動速度を減少させることを発見した。しかしながら、ノスカピン等のＭＴ修飾剤の抗線維性影響は、以前、生体内で証明されていない。
【００３７】
ＭＴはまた、ＴＧＦ−Ｓｍａｄ信号伝達経路の負の調節において重要な役割を担い得る。生体内において、Ｌｉｕら（２００５）は、低濃度のＭＴ阻害剤（パクリタキセル）が、強皮症のヌードマウスモデルにおいてＴＧＦ−β信号伝達を有意に抑制したことを発見した。パクリタキセルは、Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３リン酸化反応を顕著に抑制し、かつＳＳｃ移植片におけるコラーゲン沈着を減少させた（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ，２００５）。ＴＧＦ−βＳｍａｄ信号伝達経路は、原因として線維症の誘導に関連付けられている（再考：Ｗｅｌｌｓ，２０００，Ｖｅｒｒｅｃｃｈｉａ ａｎｄ Ｍａｕｖｉｅｌ，２００７）。ＴＧＦ−βは、例えば、線維芽細胞に走化性であり、かつＥＣＭの酵素的分解を阻止するプロテアーゼ阻害剤の産生も増加させながら、ＥＣＭを合成するために線維芽細胞を誘導し、ＴＧＦ−βは、リンパ球機能を調節し、かつ平滑筋細胞アポトーシスを阻害しながら、内皮細胞アポトーシスを増加させる。
【００３８】
生体内の低濃度で、すべてのＭＴ阻害剤は、ＭＴ動態を分裂させるが、これらの薬剤は、異なる結合部位で微小管に作用し、それらに異なる影響を引き起こさせる（Ｊｏｒｄａｎ，２００２）。ＭＴ阻害は、ＭＴポリマー化を阻害するコルヒチン、ノコダゾール、およびビンカアルカロイド等の化合物、およびＭＴポリマー化を促進するタキソイド（例えば、パクリタキセル）等の化合物の２つの一般的な種類に分類される（Ｊｏｒｄａｎ，２００２）。痛風の治療に使用されている抗炎症剤であるコルヒチンは、タブリンを結合し、ＭＴポリマー化の破壊をもたらす。コルヒチンは、ＩＰＦの治療において、コルチコステロイドおよび／または免疫抑制薬の代替として試験されており（Ｄｏｕｇｌａｓ ｅｔ ａｌ １９９８）、より安全であるが、効果的ではない（すなわち、効果のない従来の療法よりも効果がない）ことが分かった。ノスカピンは、化学的にコルヒチンと同様であるが、それは、チューブリン上の異なる部位に結合する（Ｙｅ ｅｔ ａｌ，１９９８）。結合すると、ノスカピンは、ポリマー化を破壊するよりはむしろ、ポリマー化を促進するチューブリンおよびＭＴ構成の構造変化を誘導し、ＭＴ分解／再構成サイクルを遅くする一般的な方法で作用し得る。
【００３９】
トキソイド等の多くのＭＴ阻害剤は、それらの細胞増殖を制限する能力から、抗癌療法として開発されている。しかしながら、これらの薬剤の副作用プロファイルにより、それらが線維症の治療に不適切になり得る。実際、いくつかのこれらの薬剤によるＭＴネットワークの破壊は、ＴＧＦ−β応答性遺伝子の転写によるリガンド非依存性Ｓｍａｄ核内沈着につながり、ＴＧＦ−β誘導Ｓｍａｄ活性を増加させ、すべての活性は、線維形成の性質になる可能性が高い。パクリタキセル治療は、数名の患者の強皮症様症候群の発達に関連付けられている（例えば、Ｄｅ Ａｎｇｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ，２００３）。したがって、ノスカピンが線維性疾患または病態の動物モデルにおける生体内の線維化、抗線維性または中和作用を及ぼすかどうかは、予測不可能であった。
【００４０】
そのＭＴ調節作用の他に、ノスカピンはまた、その鎮咳活性のうちの少なくとも一部に関与する機構である（Ｅｂｒａｈｉｍｉ ｅｔ ａｌ，２００３）非競合的ブラジキニン拮抗薬として作用する（Ｍａｈｍｏｕｄｉａｎ ｅｔ ａｌ．２００１）。ブラジキニンは、低血圧、気管支収縮、腸および子宮収縮、気道内の上皮分泌、腸および外分泌腺、血管透過性、疼痛、結合組織増殖、サイトカイン放出、ならびにエイコサノイド形成の様々な生物学的影響を引き起こす（Ｓｔｅｒａｎｋａ ｅｔ ａｌ，１９８９）。ブラジキニンは、それとは反対の証拠が存在するが、線維症の誘発に関連し得る（例えば、Ｓａｎｃｈｏ−Ｂｒｕ ｅｔ ａｌ，２００７、Ｈｅｌｓｋｅ ｅｔ ａｌ，２００７）。線維芽細胞増殖を誘発、筋線維芽細胞への肺線維芽細胞の移行、およびコラーゲン産生の促進によって、ブラジキニンは、気管支の再構成および肺線維症に関与し得る（Ｖａｎｃｈｅｒｉ ｅｔ ａｌ，２００５）。ブラジキニンはまた、コラーゲンｍＲＮＡ、血管平滑筋細胞内のＴＩＭＰおよびＴＧＦ−βの分泌を増加させた（Ｄｏｕｉｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ，２０００）。ブラジキニン拮抗薬を用いる治療は、心筋再構成モデルにおいて、ブラジキニンの線維形成作用を阻止することができた（Ｋｏｉｋｅ ｅｔ ａｌ，２００５）。したがって、ブレオマイシン内のいくつかのノスカピンの抗線維性作用およびＡＮＩＴモデルは、そのＭＴ調節活性の他に、ブラジキニン拮抗薬活性によるものであり得る。
【００４１】
要約すると、ノスカピンは、様々な線維性病態を治療する可能性を有する新規抗線維化剤であると思われる。ノスカピンの抗線維性活性は、ＭＴ修飾剤および／またはブラジキニン拮抗薬として、その独自の薬理学的プロファイルに起因し得る。
【００４２】
以下の非制限的実施例は、本明細書に開示する発明をさらに解説する。
【実施例】
【００４３】
実施例１：ブレオマイシン誘導型肺線維症
【００４４】
特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、肺機能を害する広域な組織再構成をもたらすＥＣＭの過剰沈着を特徴とする、慢性、かつ、しばしば、致死性の疾患である。免疫抑制剤に伴う治療等の従来の治療は、疾患進行を制御するか、または予防する上で非効果的である。
【００４５】
げっ歯動物へのブレオマイシンの器官内投与は、ヒトの間質性肺線維症の標準的実験モデルとなった。ブレオマイシンの毒性（Ｓｌｅｉｊｆｅｒ，２００１再考）は、主に、肺および皮膚内で生じ、それは、これらの組織内の不活性酵素、ブレオマイシンヒドロラーゼの欠如によるものである。ブレオマイシンは、フリーラジカルの誘導を介して細胞毒性を誘導し、次いで、それは、ＤＮＡの切断を引き起こす。ＩＰＦの多くの組織学的変化は、ブレオマイシンの投与によって再産生され（Ｇｒａｎｄｅ ｅｔ ａｌ．１９９８において再考）、肺胞の歪み、毛細血管の再構成、およびＥＣＭ、特にコラーゲンの過剰沈着を特徴とする。ブレオマイシンモデル、ならびにＩＰＦにおいて、ＴＧＦ−βは、線維芽細胞増殖および増加したコラーゲン合成の主な分子メディエータである。
【００４６】
ブレオマイシン投与は、ＧＣ／ＭＳによって測定されるように、ＯＨＰの分別合成の少なくとも３倍の増加を誘発する。線維性反応の阻害または反転は、ブレオマイシン／媒体対照と比較するときに、ＯＨＰ合成の減少によって決定される。
【００４７】
方法
【００４８】
動物：研究開始時に生後１０週間のメスのＣ５７ＢＬ／６マウスを使用した。餌および水は、研究期間、その場で入手可能であった。研究グループは、表１に記載するとおりである。
【００４９】
表１：ブレオマイシン誘発型線維症の実験グループの概要
【表１】
【００５０】
プロトコル：ブレオマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、１．０５Ｕ／ｍＬの濃度の滅菌生理食塩水中で溶解した。１．５Ｕ／ｋｇのブレオマイシンの用量を得るために、経口投与によって、３０μＬのブレオマイシン溶液または同一容量の媒体（擬似対照）をメスのＣ５７Ｂｌ／６マウスの器官内に設置した。同一日に、８％２Ｈ２Ｏを用いてマウスを標識し、ノスカピンの投与を開始した。標識（飲料水内の８％２Ｈ２Ｏ）および薬物投与を２週間の研究期間、継続した。ノスカピンの用量および投与経路は、表１に示すとおりである（ｐｏは、強制経口、ｉｐは、腹腔内を表す）。
【００５１】
最終の薬物投与の翌日に、マウスを強い麻酔化に置き、心穿刺を介して血液を収集した。等張性生理食塩水を用いて肺を還流し、除去し、計量した。肺を、ＭｉｎｉＢｅａｄｂｅａｔｅｒ−９６（登録商標）（Ｂｉｏｓｐｅｃ，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，ＯＫ）ビーズ式破砕機を用いて均質化し、全ホモジネート量を決定した。ホモジネートを、ＯＨＰ評価のための総組織タンパク質を得るために、アセトン沈殿を施した。タンパク質を、ＨＣｌ中の培養によって加水分解し、真空下で乾燥させ、次いで、培養前に、５０％のアセトニトリル、５０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、およびペンタフルオロベンジル臭化物の溶液中で懸濁した。誘導体をエチル酢酸内に抽出し、上層を除去し、真空遠心分離によって乾燥させた。ヒドロキシプロリンのヒドロキシル部分をアセチル化するために、サンプルをアセトニトリル、Ｎ−メチル−Ｎ−［タート−ブチルジメチル−シリル］トリフルオロアセトアミド（ＭＴＢＳＴＦＡ）およびメチルイミジゾールの溶液を用いて培養した。この材料を石油エーテル内で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４を用いて乾燥させた。誘導体化ＯＨＰを、負化学イオン化モードで実施したＧＣ／ＭＳによって分析した。選択イオンモニタリングを、４４５、４４６、および４４７の質量対電荷比（ｍ／ｚ）を有するイオンで実施し、それらは、ＯＨＰからの炭素−水素結合のすべてを含む。ＯＨＰへの２Ｈの組み込みを、天然依存度分率（ＥＭ１）を上回る１つの過剰質量を有する分子のモル分率として計算した。コラーゲンの分別合成（ｆ）を、現在の身体２Ｈ２Ｏ濃縮で可能な最大値までのタンパク質結合ＯＨＰ内のＥＭ１値の比率として計算した。
【００５２】
ＧＣ／ＭＳ分析の他に、サンプル中のコラーゲンの絶対量を、ＯＨＰ含有量を決定するための確立されている比色分析法である、総ＯＨＰのクロラミン−ｔ分析によって決定した。本来のホモジネート（４００μＬ）のサンプルを加水分解し、（ＨＣｌ、５００μＬ）、乾燥させ、１ｍＬの分析緩衝剤中で再懸濁し、一晩、培養した。１５０μＬの懸濁液を９６ウェルプレートのウェル内にピペットで入れた。７５μＬのクロラミン−ｔをウェルに添加し、プレートを室温で２０分間培養した。次いで、ジメチルアミノベンズアルデヒド（７５μＬ）をそれぞれのウェルに添加した。プレートを、５４０ｎｍのマイクロクァント（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．ＭＱＸ２００）上で読み込まれる前に、６０℃で１５分間、培養した。ＯＨＰ標準を調製し、サンプルを用いて分析した。標準曲線からの値を補間するために、グラフパッドプリズムを使用して結果を分析した。
【００５３】
α平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）を発現する、筋線維芽細胞内への線維芽細胞の分化は、線維症の発達の主なプロセスである。α−ＳＭＡは、活性化筋線維芽細胞の周知の指標である。肺の小さなサンプル（５〜２０ｍｇ）を、左葉の中央から切除し、即座にホルマリン中に固定し、組織学的検査に送った（Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＬＬＣ，Ｌｏｎｇｍｏｎｔ Ｃｏ，ＵＳＡ）。つまり、パラフィン組み込みスライドを、ホルマリン固定された組織から調製し、次いで、αＳＭＡの抗体を使用して染色した。調製されたスライドをスキャンし、撮影し、その後、ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅソフトウエア（Ａｐｅｒｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｖｉｓｔａ Ｃａ）を使用して、αＳＭＡ陽性細胞の存在を分析した。
【００５４】
統計：薬物媒体／ブレオマイシン対照との比較のためのダネット検定後の分散分析を使用して、データを分析した（ＳｉｇｍａＳｔａｔ）。データをｐ＜０．０５で有意と見なした。
【００５５】
結果：
【００５６】
ブレオマイシンは、コラーゲンの分別合成の有意な増加を誘発した（図１、５および６）。ノスカピンは、腹腔内（ｉｐ）注入されたか（図１）、または強制経口（ｐｏ）によって投与（図５）されたかどうかに関わらず、ブレオマイシン誘発のコラーゲン合成の増加を阻止した。ノスカピンはまた、食餌中に投与されたときに、新たに合成されたコラーゲンの割合を低減する傾向があった（図６）。
【００５７】
ブレオマイシンはまた、クロラミン−ｔ分析によって評価されるように、肺の総コラーゲン（ＯＨＰ）含有量を増加させた。この影響は、用量依存的方法で、ノスカピンによって阻止された（図２）。
【００５８】
肺内の新たに合成されたコラーゲンの絶対量（合成（ｆ）ｘ総ＯＨＰ含有量として計算）は、ノスカピンによって有意に減少した（図３）。
【００５９】
ノスカピンは、媒体＋ブレオマイシン対照グループに対して、α平滑筋アクチン（αＳＭＡ）陽性細胞の数を有意に減少させた（図４）。
【００６０】
実施例ＩＩ：ＡＮＩＴ誘発型肝臓線維症
【００６１】
α−ナフチルイソチオシアネート（ＡＮＩＴ）は、胆管細胞および肝細胞を損傷する肝毒物である。ＡＮＩＴへの長期の曝露は、胆管過形成、胆管線維症、ならびに肝臓損傷を誘発する。ＡＮＩＴは、グルタチオンに抱合され、胆汁に分泌される（Ｘｕ，２００４において再考）。しかしながら、ＡＮＩＴ−グルタチオン錯体は、不安定であり、胆汁を迅速に解離させ、それによって、肝細胞の薬物の再摂取を引き起こす。再利用を多くの周期で継続することができ、ＡＮＩＴ排除を遅延し、グルタチオンを枯渇させる。その直接の細胞毒性効果の他に、ＡＮＩＴはまた、組織損傷の一因となる肝炎反応を誘発する。げっ歯動物へのＡＮＩＴの慢性投与は、肝臓コラーゲンの有意な増加をもたらし、肝臓線維症の動物モデルとして使用される（Ｘｕ ｅｔ ａｌ，２００４）。ＫｉｎｅＭｅｄの重水標識化およびＧＣ／ＭＳ技術を使用して、ＡＮＩＴ投与は、コラーゲンの分別合成の少なくとも３倍の増加を誘発することが発見されている。線維性反応の阻害または反転は、ＡＮＩＴ媒体対照と比較したときのコラーゲン合成の減少によって決定される。
【００６２】
方法：
【００６３】
対象：研究開始時に生後１０週間のメスのＣ５７ＢＬ／６マウスを使用した。動物を、標準的実験室環境下で、その場で入手可能な餌および水で、５匹のグループに収容した。研究グループは、表２に示すとおりである（ｐｏは、強制経口を表す）。
【００６４】
表２ ＡＮＩＴ誘導型肝臓線維症の実験グループの概要
【表２】
【００６５】
プロトコル：
【００６６】
マウスに、肝臓内に繊維性反応を誘発させるために、２週間、０．０５％（ｗ／ｗ）のＡＮＩＴを混ぜた食餌、または対照の食餌を与えた。マウスを、ＡＮＩＴ投与が開示した日から、８％２Ｈ２Ｏ（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｓｔａｂｌｅ Ｉｓｏｔｏｐｅｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）で標識した。同一日に、表２に記載するように、ノスカピンＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）投与を開始した。ＡＮＩＴ、標識、ノスカピン投与を２週間、継続した。
【００６７】
最終薬物投与の翌日に、マウスを強い麻酔下に置き、肝臓を還流して、除去した。肝臓組織を、ＭｉｎｉＢｅａｄｂｅａｔｅｒ−９６（登録商標）ビーズ式破砕機（Ｂｉｏｓｐｅｃ，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，ＯＫ）を用いて均質化し、その後、アセトン沈殿および真空乾燥を行った。タンパク質を、６ＮＨＣｌ（１１０℃、１６時間）中で加水分解し、真空下で乾燥させ、１ｍＬの５０％のアセトニトリル、５０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、ｐＨ１１中で懸濁した。ペンタフルオロベンジル臭化物を、密封された混合物が培養される（１００℃、１時間）前に添加し、エチル酢酸内に抽出した。上層を除去し、真空遠心分離後に固体のＮａ２ＳＯ４の添加によって乾燥させた。サンプルを、５０μＬのメチルイミダゾールおよび１００μＬのＭＴＢＳＴＦＡで培養した（１００℃、３０分間）。誘導体を水／石油エーテル内で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４を用いて乾燥させた。選択イオンモニタリングは、ＯＨ−プロリン誘導体では、４４５、４４６、および４４７の質量対電荷比（ｍ／ｚ）であった。モル％の過剰なＭ１濃縮（ＥＭ１）および分別合成（ｆ）を計算する。
【００６８】
ＧＣ／ＭＳ分析の他に、ブレオマイシン研究に対して上述のように、試料中のＯＨＰの絶対量をクロラミン−ｔ分析によって決定した。
【００６９】
コラーゲン含有量のＡＮＩＴ誘発による変化へのノスカピンの影響を組織学的に確認した。肝臓の小さなサンプル（７５〜８０ｍｇ）を右側葉から切除し、即座に、ホルマリン中に固定させ、組織学的検査に送った（Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＬＬＣ，Ｌｏｎｇｍｏｎｔ Ｃｏ，ＵＳＡ）。つまり、パラフィン組み込みスライドを、ホルマリン固定された組織から調製し、次いで、コラーゲン分布のためのＭａｓｓｏｎの三重染色を用いて処理した。調製されたスライドをスキャンし、撮影し、その後、ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅソフトウエア（Ａｐｅｒｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｖｉｓｔａ Ｃａ）を使用してコラーゲン含有量を分析した。
【００７０】
統計：ＡＮＩＴ／媒体対照との比較のためのダネット検定後の分散分析を使用して、データを分析した（ＳｉｇｍａＳｔａｔ）。データをｐ＜０．０５で有意と見なした。
【００７１】
結果：
【００７２】
２週間にわたる食餌中の０．０５％のＡＮＩＴの投与は、肝臓内に新たに合成されたヒドロキシプロリン（ＯＨＰ）の割合において有意な増加をもたらした（図７、１１および１２）。肝臓内の新規および総ＯＨＰの絶対値（クロラミン−ｔ試験によって測定される）はまた、ＡＮＩＴを投与することによって有意に増加した。（図８および９）。強制経口（ｐｏ）によって投与されるとき、ノスカピン用量は、新たに合成されたコラーゲンの割合を用量依存的に減少させた（図７）。全肝臓内のＯＨＰの総量および新たに合成されたコラーゲンの量はまた、ＡＮＩＴと媒体対照グループと比較すると、有意に減少した。（図８および９）。ノスカピンがＡＮＩＴと共に投与されるときのコラーゲン含有量の有意な減少を組織学的に確認した（図１０）。個別の研究において、食餌中（図１１）か、または強制経口（図１２）のいずれかで投与された、３００ｍｇ／ｋｇの用量のノスカピンはまた、新たに合成されたコラーゲンの量を減少させる傾向があった。
【００７３】
前述の発明を、明確な理解を目的として図示および実施例によって詳細に説明したが、特定の変更および修正が本発明の精神および範囲から逸脱することなく実施し得ることは、当業者には明らかであろう。したがって、説明は、添付の請求項によって詳しく記述する、本発明の範囲を制限すると解釈されてはならない。
【００７４】
本明細書に引用したすべての発行物、特許、特許出願は、個々の発行物、特許、または特許出願のそれぞれが、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同一程度において、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７５】
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Ｙｅ Ｋ，Ｋｅ Ｙ，Ｋｅｓｈａｖａ Ｎ，Ｓｈａｎｋｓ Ｊ，Ｋａｐｐ ＪＡ，Ｔｅｋｍａｌ ＲＲ，Ｐｅｔｒｏｓ Ｊ，Ｊｏｓｈｉ ＨＣ。
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Ｚｈｏｕ Ｊ，Ｐａｎｄａ Ｄ，Ｌａｎｄｅｎ ＪＷ，Ｗｉｌｓｏｎ Ｌ，Ｊｏｓｈｉ ＨＣ。
Ｍｉｎｏｒ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｃａｕｓｅｓ ｌｏｓｓ ｏｆ ｔｅｎｓｉｏｎ ａｃｒｏｓｓ ｋｉｎｅｔｏｃｈｏｒｅ ｐａｉｒｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｔｈｅ ｓｐｉｎｄｌｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ。
Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００２ Ｍａｙ １０；２７７（１９）：１７２００−８。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の線維性疾患または病態を治療する方法であって、前記患者にノスカピンおよび医薬担体を投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記線維性疾患または病態の発症を遅延させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記線維性疾患または病態の重症度を低減させる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記投与後に、細胞外基質タンパク質のレベルを前記投与前のレベルに対して減少させる、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項５】
細胞外基質タンパク質はコラーゲンである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ノスカピンは、ノスカピン類似体である、請求項１、２、３、４、または５に記載の方法。
【請求項７】
患者の線維性疾患または病態を治療する方法であって、前記患者に微小管修飾剤および医薬担体を投与することを含む、方法。
【請求項８】
前記方法は、ＡＣＥ阻害剤、抗線維化剤および抗炎症剤から成る群から選択された薬剤を投与することをさらに含む、請求項１、２、３、４、５、６、または７に記載の方法。
【請求項９】
前記投与は、経口投与、静脈内投与、皮下投与、皮内、局所、肛門座薬、エアロゾル、関節内、および筋肉内投与によるものである、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
患者の線維性疾患または病態を治療する方法であって、前記患者にノスカピンおよび医薬担体を投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記線維性疾患または病態の発症を遅延させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記線維性疾患または病態の重症度を低減させる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記投与後に、細胞外基質タンパク質のレベルを前記投与前のレベルに対して減少させる、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項５】
細胞外基質タンパク質はコラーゲンである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ノスカピンは、ノスカピン類似体である、請求項１、２、３、４、または５に記載の方法。
【請求項７】
患者の線維性疾患または病態を治療する方法であって、前記患者に微小管修飾剤および医薬担体を投与することを含む、方法。
【請求項８】
前記方法は、ＡＣＥ阻害剤、抗線維化剤および抗炎症剤から成る群から選択された薬剤を投与することをさらに含む、請求項１、２、３、４、５、６、または７に記載の方法。
【請求項９】
前記投与は、経口投与、静脈内投与、皮下投与、皮内、局所、肛門座薬、エアロゾル、関節内、および筋肉内投与によるものである、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４−１】
【図１４−２】
【図１４−３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４−１】
【図１４−２】
【図１４−３】
【公表番号】特表２０１１−５２５１９４（Ｐ２０１１−５２５１９４Ａ）
【公表日】平成２３年９月１５日（２０１１．９．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１４８９２（Ｐ２０１１−５１４８９２）
【出願日】平成２１年６月２２日（２００９．６．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４８１８５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５５６１１
【国際公開日】平成２１年１２月２３日（２００９．１２．２３）
【出願人】（５０４０１４３２５）キネメッド， インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年９月１５日（２０１１．９．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月２２日（２００９．６．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４８１８５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５５６１１
【国際公開日】平成２１年１２月２３日（２００９．１２．２３）
【出願人】（５０４０１４３２５）キネメッド， インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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