繊毛虫宿主細胞におけるモノクローナル抗体の発現
本発明は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体の異種発現系であって、少なくとも１種の繊毛虫宿主細胞、及び上記繊毛虫宿主細胞に組み込まれる、上記モノクローナル抗体又はその断片若しくは誘導体をコードする少なくとも１種の異種核酸分子を含む、上記異種発現系に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、繊毛虫宿主細胞におけるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の異種発現系に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日、ヒト治療用モノクローナル抗体の適応症の主なものは、癌、自己免疫疾患、及び感染症である。
【０００３】
作用機構の１つは、腫瘍関連血管新生を促進する成長因子の情報伝達経路の遮断であり、このような遮断は、例えば、アバスチン（Avastin、ベバシズマブ（Bevacizumab））によってなされるが、アバスチンは血管内皮成長因子（Vascular Endothelial Growth Factor; ＶＥＧＦ）を標的とし、これにより腫瘍を餓死させるものである。その他の標的としては、例えば、胎盤成長因子（Placental growth factor;ＰＬＧＦ）が挙げられる。こうした目的のためには、抗体の軽鎖及び重鎖（ＶL及びＶH）の可変領域に位置する相補性決定領域（ＣＤＲ）によって生じる高い標的親和性が要求されるが、Ｆｃ領域により発揮される抗体エフェクター機能は重要ではない。これら目的には、Ｆｃ領域を欠いた抗体断片（ｓｃＦｖやＦａｂｓなど）を用いることができる。
【０００４】
その他の作用機構としては、ＴＮＦα等のサイトカインへの結合（ヒュミラ；Ｈｕｍｉｒａ）、ｅｒｂＢ−２等の成長因子受容体の遮断（アービタックス；Ｅｒｂｉｔｕｘ）、ＲＳＶ Ｆタンパク質等の細胞侵入に必要なウイルス表面抗原の遮断（シナジス；Synagis）、及びＲＢＣのＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体等の血液凝固の原因受容体の遮断（レオプロ；ＲｅｏＰｒｏ）がある。
【０００５】
しかしながら、モノクローナル抗体は、また、殺標的細胞用途、例えば癌細胞又は病原体の排除にも用いることができる。結合型抗体、即ち、特定の細胞毒を保有する人工抗体がこの目的で開発されてきたが、特定の細胞毒を欠いた未結合型抗体でもそれぞれの免疫応答を誘発することでこの目的に合致することができる。しかしながら、このような目的の場合には、機能性Ｆｃ領域が必要であり、機能性Ｆｃ領域はＩｇＧ、特にＩｇＧ１に備わっているのである。これに関して、基本的には、以下の４つの異なる機構が知られている。
【０００６】
・標的細胞結合抗体のＦｃ領域は、免疫エフェクター細胞表面のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ、特にＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ及び／又はＦｃγＲＩＩＩ）に結合することができ、免疫エフェクターによる、標的細胞のＦｃγＲ媒介型標的細胞死滅を引き起こす（「抗体依存性細胞障害」すなわちＡＤＣＣ(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity)）。
・標的細胞結合抗体のＦｃ領域は、血中に見られる補体系の可溶性タンパク質（例えば、Ｃ１ｑ）に結合することができ、補体媒介型標的細胞溶解を引き起こす（「補体依存性細胞障害」、ＣＤＣ（Complement-Dependent Cytotoxicity））。
・標的分子への抗体の直接結合は、アポトーシス（抗体依存性アポトーシス）等の細胞死誘導機構を引き起したり、又は成長因子等の細胞生存因子の活動を遮断することが出来る。
・マクロファージ又は好中球の抗体媒介型結合による標的細胞のオプソニン化、及びそれに続く貪食。
【０００７】
ＡＤＣＣは、細胞性免疫の機構であり、これにより、免疫系のエフェクター細胞が、特定の抗体が結合している標的細胞を活発に溶解する。ＡＤＣＣは、抗体が、体液性免疫応答の一部として、感染を制限し封じ込めるように作用し得る機構の１つである。古典的なＡＤＣＣ媒介性エフェクター細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であるが、単球及び好酸球もＡＤＣＣを媒介し得る。ＡＤＣＣは、従前の抗体反応に依存するため、適応免疫応答の一部である。
【０００８】
標的細胞においてＡＤＣＣを誘発するのに用いられる治療用抗体には、上記エフェクター細胞のＦｃγ受容体によって認識されるために、Ｆｃ領域が必要である。そのような抗体の例として、ｅｒｂＢ−２を認識し、かつ好ましくはｅｒｂＢ−２を過剰発現する腫瘍細胞に結合するハーセプチン(Herceptin)、或いは悪性Ｂ細胞におけるＣＤ２０受容体に結合するリッキサン(Rituxan)が挙げられる。
【０００９】
その他可能性のある機構の１つは、即ち二重特異性又はそれ以上の多重特異性抗体構築物を用いることにより、２種以上の異なる要素を近接させることによるものである。これは、例えば腫瘍細胞が、例えばそれらのＭＨＣクラスＩ要素の変異又は喪失によって、或いはＴ細胞の活性化を抑制するメッセンジャー物質を分泌することにより、Ｔ細胞の攻撃を免れ得る場合に、腫瘍細胞に対してＴ細胞を再び向わせるのに有用である。１つの手法は、２つのｓｃＦｖ抗体を組合せることであり、これら２つのうちの一方は、Ｔ細胞受容体（例えば、ＣＤ３）に対するものであり、もう一方は腫瘍細胞抗原（例えばＥＧＦＲ）に対するものである。
【００１０】
別の手法は、腫瘍細胞（例えば、ＥＧＦＲ又はＥｐＣＡＭに結合するＦｖを用いて）、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ３等のＴ細胞受容体に結合する別のＦｖを用いて）、並びに単球、マクロファージ、又はナチュラルキラー細胞等のエフェクター細胞（このようなエフェクター細胞上にあるＦｃγ受容体により検出されるＦｃ領域を用いて）を、（両方のＦｖ鎖における２種の異なる相補性決定領域と、Ｆｃ領域とを含む融合分子を用いて）連結することである。この手法は、腫瘍細胞溶解及びアポトーシスを誘導するキラーＴ細胞の抗腫瘍効果と、Ｔ細胞活性をさらに刺激するサイトカインを放出する一方で、貪食又はアポトーシスにより腫瘍細胞を排除するエフェクター細胞の抗腫瘍効果と共にもたらす。
【００１１】
さらに別の手法は、２種の異なる抗原が１つの抗原結合部位により両方共に高い親和性で認識され得る抗体を設計することである。このような抗体は、将来的には、２種の異なる抗体を用いる併用療法に取って代わるかもしれない。さらに、このような抗体は、また、同一抗原、特に可溶性抗原の異なるエピトープに結合させ、結合親和性及びインビボ力価を上げるのにも用いられ得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
現在、治療用途のための抗体又はその断片若しくは誘導体は、エシェリキア・コリ（E. coli）、又はＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞のような哺乳細胞株の何れかで発現されている。これらの発現系では、ＡＤＣＣを増強したり、或いは多重特異性を有する抗体を提供することもできず、さらに幾つかのその他欠点もある。
【００１３】
エシェリキア・コリ（E. coli）で産生された抗体は、グリコシル化やその他翻訳後修飾を受けておらず、従ってＡＤＣＣに関連する能力が限られている。さらに、エシェリキア・コリ株はタンパク質を培地に分泌しないので、細胞を溶解させなければならず、抗体は徹底した精製が必要である。別の周知の問題として、タンパク質の誤った折り畳みがあるが、これは不溶性封入体の形成に繋がり得る。結果として、エシェリキア・コリは、血清半減期が短いＦａｂ断片及びｓｃＦｖ断片の産生にのみ適している。
【００１４】
真核生物発現系も、多くの欠点を抱えている。酵母菌発現系は、マンノースに富む過剰グリコシル化タンパク質を産生する傾向があり、この治療抗体を患者に投与した場合、望ましくない免疫反応を引き起こすことが多い。バキュロウイルス形質移入昆虫細胞の系は、低グリコシル化による問題を引き起こし、治療抗体のエフェクター機能に悪影響を及ぼすのである。さらに、大きな欠点として、感染性バキュロウイルスの触媒活性があり、これは完全なＩｇＧ産生の間口を狭める。
【００１５】
ＣＨＯ細胞及びＰｅｒ．Ｃ６細胞等の哺乳類細胞株及びヒト細胞株は、培養及び増殖が難しく、しかもスケールアップするに費用がかかる。さらに、こうした細胞は、培養液に関する要求性が高い。そのうえ、哺乳細胞株及びヒト細胞株は、ヒト又は動物起原の細菌及びウイルス感染の危険性をはらんでいる。
【００１６】
本発明の目的の一つは、上記の欠点を有さない、抗体又はその断片若しくは誘導体の発現系を提供することである。
【００１７】
本発明の他の目的は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、抗体依存性アポトーシス、又は抗体依存性オプソニン化が増強される、抗体又はその断片若しくは誘導体の製造を可能にする系を提供することである。
【００１８】
本発明の他の目的は、多重特異性を有する、抗体又はその断片若しくは誘導体の製造を可能にする系を提供することである。
【００１９】
本発明の他の目的は、血清半減期が延長された、抗体又はその断片若しくは誘導体の製造を可能にする系を提供することである。
【００２０】
これらの目的は、独立請求項に記載の系と合致する。幾つかの従属請求項には好ましい実施形態を記載される一方、その他独立請求項には変形実施形態及び／又は代替実施形態が記載される。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明によれば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体の異種発現系であって、以下を含む、上記異種発現系が提供される：
ａ）少なくとも１種の繊毛虫宿主細胞、及び
ｂ）上記繊毛虫宿主細胞に組み込まれる少なくとも１種の異種核酸分子であって、上記モノクローナル抗体又はその断片若しくは誘導体をコードする上記異種核酸分子。
【００２２】
本明細書において、「異種発現」という用語は、発現が生じる生物に対して外来のものである、遺伝子、核酸又はｃＤＮＡのタンパク質発現を指す。
【００２３】
本明細書において、「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）、ＰＮＡ、ＬＮＡ及び／又はモルホリノを含む、任意の一本鎖核酸分子又は二本鎖核酸分子を指すものと意図される。好ましくは、上記核酸分子は、モノクローナル抗体又はその断片若しくは誘導体をコードするｃＤＮＡを含む。
【００２４】
本明細書において、「ｃＤＮＡ」という用語は、発現されるべきタンパク質をコードし、かつイントロン等の如何なる非コード部分も欠くＤＮＡ分子を指す。多くの場合、ｃＤＮＡは、逆転写酵素及びオリゴｄＴプライマーを用いてＲＮＡ鋳型から直接合成されている。しかしながら、この用語は、合成の遺伝子及びそれ以外の方法で得られるコードＤＮＡを同じく含むものとする。
【００２５】
所定の標的に対する所定のモノクローナル抗体をコードする核酸配列は、文献から見つけることもできる。例えば、欧州特許第ＥＰ０５９００５８Ｂ１号には、ヒト化モノクローナル抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（トラスツズマブ；Trastuzumab）のＶLドメイン及びＶHドメインのアミノ酸配列が開示されている。他の参照文献には、完全ＩｇＧのアミノ酸配列さえも記載されている。この情報を用いて、当業者は、そうした抗体をコードするｃＤＮＡを設計し、それを本発明の目的のために用いることができる。
【００２６】
その他の情報源としては、例えば、大部分のモノクローナル抗体又はその断片若しくは誘導体について配列情報を提供する、公的なドラッグバンク（ＤｒｕｇＢａｎｋ）データベース（http://www.drugbank.ca）がある。
【００２７】
本明細書において、「モノクローナル抗体（ｍＡｂ）」という用語は、均一な抗体集団を有する抗体組成物、すなわち全免疫グロブリン又はその断片若しくは誘導体からなる均一集団を指す。特に好ましくは、そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ及び／若しくはＩｇＭ、又はそれら断片若しくは誘導体からなる群より選択される。
【００２８】
本明細書において、「断片」という用語は、場合によって、標的結合能力を保持した、上記のような抗体の断片を指し、例えば、以下のものである。
・ＣＤＲ（相補性決定領域）
・超可変領域
・可変領域（Ｆｖ）
・ＩｇＧ重鎖（ＶH領域、ＣH１領域、ヒンジ領域、ＣH２領域、及びＣH３領域からなる）
・ＩｇＧ軽鎖（ＶL領域及びＣL領域からなる）、並びに／又は
・Ｆａｂ及び／又はＦ（ａｂ）２。
【００２９】
本願明細書において、「誘導体」という用語は、構造的には異なる形状をしているが、依然として何らかの構造的関連性を有する、すなわち共通する抗体概念を有するタンパク質構築物を指し、例えばｓｃＦｖ、並びに二重特異性、三重特異性、又はそれより高次の多重特異性の抗体構築物が挙げられる。これらのものは全て以下に説明されている。
【００３０】
本明細書において、「宿主細胞」という用語は、２通りの異なる意味があり、それら２通りの意味は、それぞれの文脈に応じて理解され得る。異種タンパク質発現の文脈において、「宿主細胞」という用語は、発現宿主として用いられる遺伝子導入細胞を示す。したがって、当該細胞又はその前駆細胞は、発現されるべきタンパク質のｃＤＮＡを含む適切なベクターで形質移入されている。
【００３１】
本明細書において、「繊毛虫宿主細胞」という用語は、繊毛虫（Ｃｉｌｉｏｐｈｏｒａ）門（以前の繊毛虫類（Ｃｉｌｉａｔａ））由来の細胞、例えば、繊毛と呼ばれる毛様細胞小器官の存在及び核二形性を特徴とする原生動物由来の細胞を指す。
【００３２】
本明細書において、「組み込まれた」という用語は、上記核酸がすぐにタンパク質発現できるような様式で宿主細胞に入っているという事実を指す。そのような組み込みは、繊毛虫においては様々な様式を用いることができ、例えば「エピソーム組み込み」（例えばプラスミドなどの核酸分子が、細胞核に進入してはいないが、細胞質で複製され翻訳される。）、及び「統合型組み込み」（例えば核酸分子が細胞ゲノムに組み込まれている）がある。
【００３３】
繊毛虫は、それらを、モノクローナル抗体又はその断片若しくは誘導体の発現宿主として用いるのに適したものとする驚くべき幾つかの性質を有している。エシェリキア・コリ（大腸菌）とは対照的に、繊毛虫は、ｓｃＦｖ及びＦａｂを産生できるだけでなく、完全な免疫グロブリン（ＩｇＧ）も産生できる。さらに、産生される抗体は、培地に分泌されるので、細胞溶解及び細胞ペレットから抽出の必要がない。
【００３４】
哺乳細胞株と比較すると、繊毛虫は培養培地に関係する要求性がほとんど無く、しかも液体培養が可能であるので、抗体発現が非常に安価である。
【００３５】
さらに、本発明者らが知る限り、繊毛虫類については、細菌や高等真核生物と違って、これまで特定のウイルスが見つかっていない。特定のウイルスがいないのは、繊毛虫類に共通する核二形性が原因かもしれない。また、その別の理由としては、繊毛虫類における一般的では無いコドンの使い方及びＡＴリッチなゲノムが考えられる。このため、高等生物の病原性ウイルスは、ほとんどの繊毛虫で増幅することが出来ないと、本発明者らは考えている。今まで知られている限り繊毛虫類がウイルスに感染しないという事実は、驚くべき利点となる。この事実は、繊毛虫類を利用した製造方法において、外来ウイルスの増幅又は増殖が起こらないことを意味する。さらに、この事は、治療用途でタンパク質を産生させる場合に、ヒト及び動物細胞培養物を用いる工業プロセスで必要となるような費用のかかるウイルス除去手順を省略できることを意味する。
【００３６】
それだけではなく、繊毛虫の系には、モノクローナル抗体の発現に関して他にも幾つかの利点がある。これらの利点は以下に議論される。
【００３７】
上記のような利点にも関わらず、繊毛虫発現系はまだそれほど知られてはいないため、当業者は、可能性のある異種タンパク質発現系について尋ねられると、むしろエシェリキア・コリ（大腸菌）、酵母菌、昆虫細胞系（バキュロウイルス）、及び哺乳細胞株を考えるであろう。
【００３８】
本発明の背景において用いることができる、繊毛虫の形質転換法として、とりわけ、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、及び微粒子銃（パーティクル・ボンバードメント）が挙げられ、こうした方法は、例えば、トンドラビ及びヤオ（Tondravi & Yao）(1986)、ガトリグ及びゴロフスキー（Gaertig & Gorovsky）(1992)、並びにキャシディ‐ハンリーら（Cassidy-Hanley et al）(1997)に記載されている。
【００３９】
形質転換及び異種タンパク質発現の方法は、幾つかの原生生物については記載されている（ＷＯ００／５８４８３及びＷＯ００／４６３８１）。繊毛虫テトラヒメナ・サーモフィラ(Tetrahymena thermophila)の有糸分裂的に安定な形質転換体の作製は、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、又は微粒子銃（パーティクル・ボンバードメント）によって、体細胞巨核又は生殖微小核の何れかを形質移入して達成され得る。
【００４０】
形質転換体の選別は、ネオマイシン耐性（ウェイデ（Weide）ら、２００６、ＢＭＣ）や、安定なチミジン栄養要求性テトラヒメナ細胞が生じる、相同ＤＮＡ組換えによる異種遺伝子の組込み（ウェイデ（Weide）ら、２００６、ＢＭＣ）等、様々な選択マーカーを利用して実施することが出来る。加えて、ブラストサイジンＳ耐性（ウェイデ（Weide）ら、２００７、ＢＭＣ）やパクリタキセル耐性（ＷＯ００／４６３８１）の利用も考慮されている。
【００４１】
好ましくは、コード核酸は、繊毛虫発現宿主に最適化されたコドンである。本明細書で用いられる「最適化されたコドン」という用語は、発現されるべき異種タンパク質をコードするｃＤＮＡが、普遍的な遺伝コードスキームから派生する宿主特異的なコドン使用頻度に適合させられるプロセスを指す。繊毛虫は、ＡＴリッチなゲノムを有し、テトラヒメナのＤＮＡの場合はその約７５％がＡＴからなる（図９を参照）。コドン使用頻度は、異なる生物間で、特に所定のアミノ酸をコードするのにあるコドンがどのくらいの頻度で用いられるか（「コドン・バイアス」）において、異なるものである。異種タンパク質をコードする、最適化されていないｃＤＮＡが繊毛虫ではほとんど用いられないコドンを使用していると、タンパク質発現効率に強く影響が出る可能性がある。このことは、裏を返せば、研究中の遺伝子のコドン頻度が繊毛虫発現系のコドン頻度と一致する場合、異種タンパク質発現が劇的に向上され得ることを意味する。そのうえ、多くの繊毛虫、中でもテトラヒメナ属では、非標準のヌクレオチドコードが利用されており、ＵＡＡ及びＵＡＧのトリプレットでグルタミンをコードしているが、一方、大多数のその他生物では、これらのコドンは翻訳を終了する終止コドンとして用いられている。
【００４２】
このことは、ＵＡＡ及びＵＡＧのトリプレットを終止コドンとして保有する外来（非繊毛虫）遺伝子が正確に発現されないという事に繋がり得る。このために、繊毛虫宿主細胞を形質転換する前に、異種タンパク質をコードするｃＤＮＡは、ＵＡＡ及びＵＡＧのトリプレットがＵＡＡに修正されるようにコード最適化が行わなければならない。コード最適化は、例えば、部位特異的突然変異誘発により、又はデノボｃＤＮＡ合成により達成することができる。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態において、上記モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体は、本質的にフコースを含まないＮ−グリカン構造を有する。
【００４４】
真核生物発現系で発現したタンパク質は、グリコシル化を伴う翻訳後修飾プロセスを受ける。ＩｇＧ、及びＦｃ領域を含むその他モノクローナル抗体の産生のために今日確立されている真核生物発現系は、Ｎ−グリカンをポリペプチド鎖に付加する。ＩｇＧでは、最も重要なＮ−グリカンは、Ａｓｎ２９７で両方のＣH２鎖に結合しており（図１を参照）、このＮ−グリカンは、とりわけ、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、マンノース、及びフコースなどの残基を含む。
【００４５】
このことは、基本的に、形質転換植物発現系、並びに哺乳細胞株（図２を参照）、昆虫細胞株などにも当てはまる。これら全ての場合において、Ｎ−グリカンは、少なくとも１つのフコース残基を含み、このフコース残基は、ポリペプチド鎖のＡｓｎ残基に結合したＮ−アセチルグルコサミン残基に、α−３−グリコシド結合又はα−６−グリコシド結合の何れかで結合する。
【００４６】
これと対照的に、繊毛虫は、上記の発現系で産生されるグリコシル化パターンとは明らかに相違するＮ−グリカン構造を産生し、このＮ−グリカン構造体はフコースを含有しない。
【００４７】
本明細書において、「本質的にフコースを含まない」という用語は、１個以上のＮ−グリカン、好ましくはＡｓｎ２９７ Ｎ−グリカン中に１個以上のフコース残基を保有するモノクローナル抗体、又はその断片若しくは誘導体の占有率が、本発明による発現系で製造されたモノクローナル抗体、又はその断片若しくは誘導体の総量の１０％、好ましくは５％、より好ましくは１％、最も好ましくは０．１％を超えないことを意味する。
【００４８】
さらに、ヒト細胞株（ＰｅｒＣ６）、並びに一般的な哺乳細胞株における組換え抗体の産生は、培養条件によって、及び培養期間の経過に渡り変化する、グリコシル化プロファイルをもたらす。抗体グリコシル化パターンにおけるこのような精度の低下は、治療効果の低下をもたらし、副作用の危険性を高める（ジェフェリス（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ）、２００５）。対照的に、繊毛虫は、再現性の高い二分岐オリゴマンノースＮ−グリコシル化構造を有するタンパク質を分泌することが出来る（バンノ（Ｂａｎｎｏ）ら、１９９３）。同様に共通するグリコシル化パターンは、均一な血清半減期をもたらし、副作用の危険性を低下させ、均一かつ十分に操作し易い治療効果を実現にする。
【００４９】
別の好ましい実施形態においては、上記モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、又はその断片若しくは誘導体は、以下からなる群から選択される少なくとも１つの効果を有する：
・抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）の増強
・補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）の増強
・抗体依存性アポトーシスの増強、及び／又は
・抗体依存性オプソニン作用の増強。
【００５０】
最近の研究により、グリコシル化パターン中のフコースの量が減じられたモノクローナル抗体は、フコシル化抗体と比較して非常に高い抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）活性を示すことが示されている。繰り返しになるが、フコース残基の欠如がＡＤＣＣの増強をもたらすのは、基本的にＡｓｎ２９７の位置である。フコースが低いか、或いは皆無である抗体のＡＤＣＣが増強される背後にある機構は、そのように修飾されたＦｃ領域のＦｃγＲ〔例えば、ヒト免疫エフェクター細胞におけるＡＤＣＣに関する主要なＦｃ受容体であるＦｃγＩＩＩａ（ＣＤ１６）〕に対する親和性の増加によって媒介されているようである（シールズ（Ｓｈｉｅｌｄｓ）ら、２００２）。
【００５１】
ＡＤＣＣを誘発する、本発明による治療抗体の標的として可能性があるものを、以下の表に示すが、この表は、本出願の範囲を制限するものと解釈されるべきではない（標的の略称は一般的な文献から採用したものである。）。
【００５２】
【表１】
【００５３】
当業者は、上記抗体の製造手順及びアミノ酸配列を全て入手でき、従って本発明の教示を、例えば上記抗体により惹起されるＡＤＣＣを増強する目的で、上記抗体全てに適用できることを理解することが重要である。
【００５４】
米国企業のゼンコー（Xencor）社は、アミノ酸の選択的な改変のために抗体Ｆｃ領域を操作して、抗体要素のモジュラーセットを開発した。場合により、これらのＦｃは、１００倍を超えるＡＤＣＣの増強を示し、その結果のなかでも特に、低レベルでしか抗原を発現しない細胞株に対してさえもＡＤＣＣによる死滅がもたらされ、同じ細胞障害性効果を維持しながらｍＡｂの用量を減らすことができたと報告されている。しかしながら、この著者らは、ランダム変異／選択プロセスに基づくものと考えられる、それらの改変と、それにより得られる効果、すなわちＡＤＣＣの増強との間の因果関係を何も導きだしていない。この理由から、この概念は完全には再現できると言う訳ではなく、他の抗体に一般化できるのか否か不明である。
【００５５】
日系企業のバイオワ（BIOWA）社は、ＡＤＣＣが増強するｍＡｂを発現させるためのＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞株を開発した。この細胞株では、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（「ＦＵＴ８」）酵素をコードする遺伝子がノックアウトされている。したがって、翻訳後のグリコシル化の最中に、抗体のＮ−グリコシル化部位にフコース残基が付加され得ない。このようにして産生されたｍＡｂは増強されたＡＤＣＣ活性を示すとされている。この方法は、欧州特許第ＥＰ１１７６１９５号に記載されている。この手法の大きな欠点は、それが、１００％フコースを含まない産物を保証してはいないことである。非フコシル化は、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼの潜在的に残存する酵素活性に大きく依存することから、特にバッチ間比較においては、大きなバラツキが生じる。さらに、この系は、ＣＨＯ細胞（いわゆるＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ）でのみ利用可能であるが、このＣＨＯ細胞は、特定のｍＡｂ発現用途によっては不十分な発現宿主である。
【００５６】
米国企業のグリカート（Glycart）社は、ｍＡｂを産生するための細胞株であって、オリゴ糖修飾酵素であるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）をコードする異種遺伝子を保有する該細胞株を開発した。これらの細胞は、ｍＡｂをコードするＤＮＡで形質移入された後、ｍＡｂを産生するようになるが、産生されるｍＡｂは最初にフコース残基の組込みを含む通常のグリコシル化プロセスを受ける。第二の工程で、フコース残基はＧｎＴＩＩＩ酵素により開裂する。したがって得られるタンパク質は、おおよそ非フコシル化されており、ＡＤＣＣの増強を示す。この手法もまた、１００％フコースを含まない産物を保証しない。脱フコシル化は、上記ＧｎＴＩＩＩ酵素の活性に大きく依存するために、特にバッチ間の比較で大きなバラツキが生じる。
【００５７】
米国企業のユーリカ・セラペウティクス（Eureka Therapeutics）社は、治療用抗体でＡＤＣＣを増強する方法を開発し、この方法をＭＡＧＥ（グリコシル化操作によるＡＤＣＣ増幅；“Magnified ADCC through Glycosylation Engineering"）と名付けたと宣伝している。しかしながら、この方法の技術的な詳細は明らかにされていない。
【００５８】
驚くべきことに、本発明者らは、自らの実験において、ＡＤＣＣを誘導し得る抗体を、そのＮ−グリカン構造は哺乳細胞で発現される典型的な抗体とは異なるものの、繊毛虫が産生することを発見した。続いて、本発明者らは、自らの実験において、繊毛虫が、Ｆｃ領域に、フコースは含有しないＮ−グリカン構造を有する抗体を産生することを発見した。このことは、哺乳細胞において発現される抗体と比較してＡＤＣＣエフェクター機能が増強されることの説明となり得る。
【００５９】
したがって、本発明による系によれば、劇的にＡＤＣＣが増強され、したがって治療効果も大きく向上したモノクローナル抗体、又はその断片若しくは誘導体を産生するための、経済的、簡便、かつ信頼できる方法が提供される。
【００６０】
酵母菌を利用した発現系（例えば、サッカロミセス種(Saccharomyces sp.)又はピチア種(Pichia sp.)）もマンノースが豊富な非フコシル化Ｎ−グリカンを産生する（図２を参照）ことに触れておくのは重要である。こうした発現系は、特に抗体又はその断片若しくは誘導体の産生に関して、精力的に研究される対象ではあるものの（ウェイ（Wei）ら、２００８)、研究の主な焦点は、酵母菌を利用した発現系のグリコシル化パターンをヒトグリコシル化パターンと同様になるように改良することに向けられているようである（ジャーングロス（Gerngross）、２００４）。これは、裏を返すと、抗体又はその断片若しくは誘導体に有用であるだけでなく、他のバイオ医薬品の発現にも有用となるだろう。
【００６１】
現在、酵母菌株で産生される抗体、又はその断片若しくは誘導体が、ＡＤＣＣ、又はＣＤＣ、又は抗体依存性アポトーシスの増強を有することを示す報告も、フコシル化の欠如が特定のその他効果をもたらすことを示す報告も無い。この事もまた、フコシル化の欠如のみが、当業者に周知の事実、ＡＤＣＣの増強を自動的に意味しないことを示す。
【００６２】
さらに、本発明による系で製造される治療用抗体、又はその誘導体若しくは断片は、ＣＤＣも増強するようである。
【００６３】
そのうえに、本発明による系で製造される治療用抗体、又はその誘導体若しくは断片は、抗体依存性アポトーシス効果も増強するようである。
【００６４】
さらに、本発明による系で製造される治療用抗体、又はその誘導体若しくは断片は、抗体依存性オプソニン作用効果も増強するようである。
【００６５】
特に好ましい実施形態においては、追加のＮ−グリコシル化部位が、発現されるべき抗体又はその断片若しくは誘導体に導入されることが提供される。これは、例えば、部位特異的突然変異誘発により、又はアミノ酸残基の意図的な置換により、追加のＮ−グリコシル化モチーフ、すなわち、トリペプチド配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（Ｘは任意のアミノ酸であり得るが、Ｐｒｏ及びＡｓｐであることは稀である）を導入することでなされ得る。仮に、例えば、抗体又はその断片若しくは誘導体が、その鎖中のどこかに、「Ｇｌｙ−Ｘ−Ｓｅｒ」モチーフを有する場合、「Ｇｌｙ」を「Ａｓｎ」で置換することにより追加のＮ−グリコシル化部位を作製することができる。上記置換がタンパク質の重要な性質（標的親和性、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）結合など）に影響を及ぼさないことに留意が必要であることはもちろんである。
【００６６】
しかしながら、例外的なＮ−グリコシル化パターンは、一見すると、治療用抗体の発現系としてのテトラヒメナ・サーモフィラの使用を排除する。というのも、そのような異常なグリコシル化パターンは、そうして産生された抗体の免疫適合性に悪影響を及ぼすと当業者には思われるからである。しかしながら、本発明者らは、こうした推定が正しくないことを明らかにした。
【００６７】
さらに、繊毛虫発現系には、哺乳類細胞株のようなその他のタンパク質発現系と比較して他にも利点がある。それらについて以下で議論する。
【００６８】
さらに別の好ましい実施形態においては、上記モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体は、血清半減期が長い。
【００６９】
治療目的で用いられるモノクローナル抗体においては、血清半減期が長くなると投薬量及び／又は投与頻度を減らすのを助長し得るので、血清半減期は重要事項である。モノクローナル抗体は経口投与することはできないため、この事は、低用量のためコストを削減し、かつ投与方法に関連する危険性を最小限にしつつ、患者の服薬遵守の改善を助けるだろう。
【００７０】
血清から溶解したタンパク質を除去する主要な経路は、肝臓にけるアシアロ糖タンパク質受容体媒介クリアランスである。通常、哺乳類タンパク質は、２個以上の末端シアル酸残基（Ｎ−アセチルノイラミン酸）を有する二分岐Ｎ−グリカンでＮ−グリコシル化され、それら末端シアル酸残基はβ−ガラクトース残基で支持されている（図２を参照）。この事は、対象に固有のタンパク質にも、例えば、哺乳細胞株において異種発現され、かつ上記対象に投与されるタンパク質にも当てはまる。
【００７１】
タンパク質の存続期間の中で、末端シアル酸残基は、ガラクトース残基が露出するまで、偏在するノイラミニダーゼにより徐々にグリカン鎖から除去される。これらは、アシアロ糖タンパク質受容体により認識されるが、アシアロ糖タンパク質受容体は、肝臓に豊富に存在するレクチンであって、多くの脱シアル化血漿タンパク質のガラクトース残基と結合する当該レクチンである。当該タンパク質は、認識されると、エンドサイトーシスの対象となり、次いで肝臓で分解されることになる。
【００７２】
上記に示す通り、繊毛虫において異種発現されるタンパク質は、自由に浮遊するノイラミニダーゼにより除去され得る末端シアル酸残基も、アシアロ糖タンパク質受容体の標的となり得るガラクトース残基も有していない。このため、繊毛虫において異種発現されたモノクローナル抗体又はその断片若しくは誘導体は、アシアロ糖タンパク質受容体媒介クリアランスの対象ではなく、したがって、血清半減期が長い。繊毛虫の発現アプローチには、抗体血清半減期を延長するためのその他手法に勝る顕著な利点が複数あるが、その他手法は全て多かれ少なかれ基本の抗体概念の劇的な改変を伴っており、免疫原性等に関する結果を予測するのが難しい。これらの手法について以下に議論する。
【００７３】
米国企業のドマンティス（Domantis）社は、抗体に結合する抗アルブミン・ドメインを用いることにより、血清半減期を延ばそうと試み、一方、ジェネンテック社（Genentech Inc.）はＣＨ2−Ｎ−グリカンのガラクトース含量を増加させるという手法を開発している。ピーディーエル・バイオファーマ社（PDL BioPharma Inc.）は、Ｆｃ領域における幾つかのアミノ酸残基を他のものに置換することにより、血清半減期を延ばすという手法を開発した。また、ＰＥＧ化の概念は、タンパク質の血清半減期を延ばす目的で当業者に周知である。
【００７４】
本発明のさらなる別の好ましい実施形態においては、上記系はさらに、以下を含む。
ｃ）上記核酸分子に作動可能に連結したプロモーター、及び／又は
ｄ）上記核酸分子に作動可能に連結したシグナル配列であって、該シグナル配列は、上記核酸分子によってコードされるモノクローナル抗体又はその断片を細胞外培地に分泌させる原因となる。
【００７５】
本明細書において「作動可能に連結した」という用語は、遺伝子産物をコードし得るヌクレオチド配列が、適切な条件下においてプロモーターが該遺伝子産物の発現を調節するような様式で、該プロモーター及び／又はシグナル配列に連結されていることを意味する。
【００７６】
本明細書において、「プロモーター」という用語は、通常は遺伝子又はｃＤＮＡの上流（センス鎖の５'領域に向かって）に位置する調節領域を指し、当該調節領域は上記遺伝子又はｃＤＮＡの転写を可能とし、或いは増強さえする必須遺伝因子を含有する。
【００７７】
本明細書において、「シグナル配列」という用語は、特定の細胞小器官（核、ミトコンドリア基質、小胞体、葉緑体、アポプラスト、及びペルオキシソームなど）へのタンパク質の輸送を担うオリゴペプチド（「シグナルペプチド」又は「輸送ペプチド」）をコードする核酸配列を指す。小胞体に輸送されるタンパク質はほとんど全てが、Ｎ末端に５から１０個の疎水性アミノ酸からなる配列を有する。こうしたシグナルペプチドは、タンパク質が転写と同時に小胞体内腔に挿入された後、シグナルペプチダーゼによりタンパク質から切断される。その後、ほとんどのタンパク質は、ゴルジ体を介して分泌経路の下流へ輸送される。
【００７８】
繊毛虫において抗体を発現させるのに適したプロモーターは、例えば、ＷＯ２００７／００６８１２Ａ１に開示されているが、この出願も本発明の出願人に対して登録されており、その内容は本願において援用される。その出願には、熱誘導性プロモーター及びメタロチオネイン・プロモーターが開示されているが、それらは本発明の目的にも使用することができる。
【００７９】
適切なシグナル配列は、例えば、ＷＯ０３／０７８５６６Ａ１に開示されているが、この出願も本発明の出願人に対して登録されており、その内容は本願において援用される。その出願には、本発明に関連して特に好ましい２つのシグナルペプチド、いわゆる抗体の重鎖及び軽鎖の内因性シグナルペプチド、並びに繊毛虫リパーゼシグナルペプチドが開示されている。
【００８０】
さらに、繊毛虫宿主細胞の形質移入のためのベクターであって、該ベクターは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体をコードする少なくとも１つの核酸分子を含む、上記ベクターが提供される。
【００８１】
本明細書において、「ベクター」という用語は、外来の遺伝子材料を別の細胞に移すのに用いられる分子ビヒクル(molecular vehicle)を示す。ベクター自身は、一般に、挿入物（目的の配列）と、ベクターの「骨格」となるより大きな配列とからなるＤＮＡ配列である。遺伝情報を別の細胞に移すというベクターの目的は、典型的には、標的細胞において挿入物を単離、増幅、又は発現させることにある。
【００８２】
本明細書において、「プラスミド」という用語は、複製起点（「ＯＲＩ」）により適切な宿主中で自己複製が可能な、プラスミドベクター、すなわち環状ＤＮＡ配列を指す。さらに、プラスミドは、形質転換の成功、又は外来のＤＮＡを細胞及び複数クローニング部位（マルチプル・クローニング・サイト）（挿入物の挿入を可能にする複数の制限酵素コンセンサス部位を含む）に導入することを意図したその他手順の成功を示す選択マーカーを含み得る。クローニングベクター又はドナーベクターと称されるプラスミドベクターは、目的の配列のクローニングするのを容易にし、かつ増幅させるために用いられる。発現ベクター又はアクセプターベクターと称されるプラスミドベクターは、特に、指定された標的細胞で目的の遺伝子を発現させるのに特異的なものである。これらのプラスミドベクターは、一般に、プロモーター、導入遺伝子、及びターミネーター配列からなる発現カセットを示す。発現プラスミドは、異なる宿主細胞において繁殖及びセレクション（選択）を可能にする要素を含有するシャトルプラスミドであり得る。
【００８３】
本発明のさらなる別の実施形態においては、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体の異種発現系であって、当該異種発現系は、本発明による少なくとも２種の繊毛虫宿主細胞の接合により得られた繊毛虫宿主細胞を含む、上記異種発現系が提供される。
【００８４】
繊毛虫は全て、構造的にも機能的にも異なる２種類の核を伴う核の二形性を示す。大きい方の体細胞大核（ＭＡＣ）は、栄養増殖中に活発に発現する。ＭＡＣは、４５本の染色体コピーを含有し、無糸分裂する。小さい方の二倍体小核（ＭＩＣ）は、生殖系列にあり、５対の染色体を含有する。ＭＩＣは有性子孫のための遺伝情報を保有している。栄養期の間は、ＭＩＣは有糸分裂する。繊毛虫の生活環は、生殖系列に関して交互に現れる単相と複相とからなる。細胞の増殖は、全く無性的であり、複相でのみ起こる。
【００８５】
上記の手法は、繊毛虫宿主細胞に特有な特徴、すなわち接合により遺伝物質を交換できるという特徴を利用する。特定の条件下では、繊毛虫は、生活環の有性段階である接合のサイクルに入る。テトラヒメナ属(Tetrahymena)では、例えば、７種の異なる接合型のうちの少なくとも２種にそれぞれ属する細胞を混合し、適度に飢餓状態にすると、細胞の接合を誘導することができる。この有性段階では、２種の細胞は対になって一倍体の配偶子核を交換する。接合で核に起こる事象は、通常、減数分裂、配偶子核形成、受精、及び核の分化を含む。接合は、繊毛虫生活環の唯一の、それもごく短い、単相段階を含み、これに続いて減数分裂が起こり、すぐに受精して終わる。このプロセスは、繊毛虫の大部分で保存されている。
【００８６】
特許請求される手法は、繊毛虫宿主細胞に特有の特徴、即ち接合中の遺伝物質交換という特徴を利用する。接合プロセスの主な段階を図６に示す。
【００８７】
接合開始時には、対になった細胞の小核は、減数分裂して４つの一倍体前核を生成する。これらの一倍体前核のうち３つは破壊され、残った１つが分裂して２つの配偶子核、つまり移動前核（migratory pronucleus）と静止前核（stationary pronucleus）とを形成する。移動前核は、２つの細胞の一時的接合を通じて交換され、その後静止前核と融合して各細胞において接合体核を形成する。
【００８８】
接合体核は２回分裂して４つの遺伝的に同一な核を形成するが、古い大核は退化する。４つの接合体クローン（最初の産物(anterior products)）のうち２つは新たな大核になり、これら新たな大核は、染色体切断、プログラムされたＤＮＡ除去、及びテロメア付加を含む、多様なゲノム再編成を受ける。テトラヒメナ属では、これらのプロセスにより、約３００本の個々の大核染色体が生じる。次いで、各染色体は、４５個のコピーに増幅され、大核ゲノムの生成が完了する。
【００８９】
残る２つの接合体クローンのうち１つは退化すし、もう１つの新たな小核は、最初の無性生殖環の間に有糸分裂する。この分裂で、娘細胞はそれぞれ、１個の小核と１個の大核とを受け取り、栄養成長する繊毛虫細胞で見られる核の正常な相補体を産出する。
【００９０】
接合の原理は、原核生物発現系にも、酵母、昆虫細胞系（バキュロウイルス）、哺ＣＨＯ細胞等の哺乳類発現系、又は形質転換植物若しくは哺乳動物などの大部分のその他真核生物発現系にも存在しない。上記の系によって２種の異なる抗体を発現する細胞の接合を利用して二重特異性又はそれより高次の多重特異性抗体を組換え発現するのに用いられる繊毛虫宿主細胞は、以下、幾つかの必要条件を満たす必要がある。
ａ）少なくとも２種の繊毛虫細胞は、異なる接合型にに由来する必要があること。
ｂ）少なくとも２種の繊毛虫細胞は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体をコードする核酸分子が自身の小核に組み込まれている必要があること。
【００９１】
上記細胞を接合させることによって、両方の核酸分子の組合せを保有する細胞を産生することができ、したがって、例えば両方の抗原特異性を生じる、２種の親抗体の組合せからなる新規モノクローナル抗体、即ち抗体構築物、又はその断片若しくは誘導体を産生することが出来る。
【００９２】
以下の表は、本発明の範囲内となる、幾つかの想定される組合せについての概要を示す。モノクローナル抗体をコードする核酸をそれぞれ保有する２種の宿主細胞の接合により得られる、可能な組合せに係る抗体又はその断片若しくは誘導体を示す。このリストは、本発明の範囲を制限するものとして解釈してはならない。
【００９３】
【表２】
【００９４】
本発明の別の実施形態においては、本発明による少なくとも１種のベクターにより形質移入されたものであるか、又は本発明の少なくとも２種の繊毛虫宿主細胞の接合により得られたものである、繊毛虫宿主細胞が提供される。
【００９５】
さらに、本発明の別の実施形態によれば、本発明による少なくとも２種の繊毛虫宿主細胞又は本発明による少なくとも２種の発現系を含むライブラリであって、各宿主細胞には、抗体又はその断片若しくは誘導体をコードする少なくとも１種の異種核酸分子が、好ましくはベクターの形態で組み込まれており、かつ少なくとも２種の繊毛虫が、それらが互いに接合できるように選択される、上記ライブラリが提供される。
【００９６】
そのようなライブラリは、例えば、所定の標的（例えば表１〜３を参照）に対して特異的な抗体又はその断片若しくは誘導体（以下を参照）をコードする核酸分子をそれぞれ保有する安定に形質移入された繊毛虫宿主細胞を含む。所定の抗体又はその断片若しくは誘導体をコードすべきそれぞれの核酸について、少なくとも２種、好ましくはそれより多くの異なる種類の接合型の宿主細胞が利用可能とするべきである。二重特異性抗体構築物を構築しようとする場合、該構築物に必要な２種の抗体又はその断片若しくは誘導体をコードする核酸分子を保有する２種の宿主細胞がライブラリから選択され得る。上記宿主細胞は、接合させることを目的として、異なる接合型に由来するものであるべきである。
【００９７】
本発明による発現系、又は本発明による繊毛虫宿主細胞の好ましい実施形態においては、上記繊毛虫はテトラヒメナ科(Tetrahymenidae)に属するものである。
【００９８】
特に好ましい実施形態においては、上記遺伝子組換え繊毛虫はテトラヒメナ種(Tetrahymena sp.)（特にテトラヒメナ・サーモフィラ:Tetrahymena thermophila）である。テトラヒメナ属は、幾つかの研究室で発現宿主として確立されている、非病原性単細胞真核微生物である。テトラヒメナ属は、異種タンパク質発現に適したものとする、多数の利点を特徴としている。テトラヒメナ属は、幅広く調査されているモデル生物であり、５０年にわたる基礎研究において、ウイルス又は内部寄生体は全く観察されていない。指標細胞株を用いた調査から、ウイルスやマイコプラズマのような高等動物に感染可能な内在性感染因子は示されていない。
【００９９】
まず、繊毛虫におけるコドン使用頻度に関連する上記の考察は、テトラヒメナ属にも同様に当てはまる。さらに、テトラヒメナ属では、ミニ染色体ｒＤＮＡ由来の複製起点（ｏｒｉ）を含有するハイコピープラスミドが利用可能である。このミニ染色体ｒＤＮＡは、細胞１個あたり最大で９、０００個のコピーで存在する。その上、大核ＤＮＡへの安定な組込みが生じ得、その場合、全ての遺伝子が４５倍のコピー数で存在する。高い遺伝子量は、効率的なタンパク質生合成、つまり高い生産性に理想的な前提条件である。細菌とは対照的に、テトラヒメナ属の繊毛虫は、生物学的にタンパク質を上清に非常に効率的に分泌する。
【０１００】
テトラヒメナ属は、ジスルフィド架橋、ＧＰＩアンカー、リン酸化、アセチル化、及びグリコシル化等の翻訳後修飾をタンパク質に加えることが出来、このような翻訳語修飾は、酵母又はその他真核生物発現系で検出されるものよりも哺乳類細胞で検出されるものに類似する。
【０１０１】
哺乳細胞とは異なり、テトラヒメナ属は、世代交代時間が短く（１．５〜３時間）増殖しやすいことと、既知組成培地が使用可能であり成長因子等のペプチド又は血清成分が不要であることからコストが削減されることとを兼ね備えている。
【０１０２】
細胞密度が最大で２×１０7個／ｍＬ及び乾燥重量が最大で８０ｇ／Ｌまで、テトラヒメナをバッチ発酵、流加発酵(fed-batch)、及び連続発酵する方法はいずれも確立されており、製造規模拡大（スールアップ）は最大で１０００Ｌまで問題なく可能であることが実証されている。レポータータンパク質を用いた実施可能性試験では、１日あたり５０〜９０ｐｇ／細胞の空時収量が既に達成されている。同種発現での最初の実験では、１日あたり２００ｍｇ／Ｌを超える収量で分泌タンパク質が得られた。テトラヒメナ属は、微生物発現系（細菌又は酵母）用の従来の生産設備で発酵させることが出来る。この事は、既存の製造プラントに費用のかかる改良を施すことも生産設備の新規建設も必要ないことを意味する。
【０１０３】
本発明の別の好ましい実施形態においては、本発明による発現系で、本発明による繊毛虫宿主細胞で、及び／又は本発明による方法で製造されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体が提供される。
【０１０４】
好ましくは、本発明によるモノクローナル抗体又はその断片若しくは誘導体は、表１（ＡＤＣＣ）又は表３（非ＡＤＣＣ）に記載の標的の少なくとも１つに結合する。
【０１０５】
ＡＤＣＣに関与しない標的が以下の表に記載されているが、この表は例示にすぎず、本発明の範囲を制限するものとして理解してはならない。
【０１０６】
【表３】
【０１０７】
繰り返しになるが、当業者は、上記抗体の製造プロトコル及びアミノ酸配列を全て入手できること、及び従って本発明の教示を、例えば上記抗体の血清半減期を向上させる目的で、上記抗体全てに適用できることを理解することが重要である。
【０１０８】
さらに、本発明によるモノクローナル抗体又はその断片若しくは誘導体は、以下からなる群から選択される：
・マウスｍＡｂ、キメラｍＡｂ、ヒト化ｍＡｂ及び／又はヒトｍＡｂ、
・ＩｇＧ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ及び／又はＦ（ａｂ）２、
・修飾抗体形式。
【０１０９】
キメラｍＡｂ、ヒト化ｍＡｂ及び／又はヒトｍＡｂの製造及び／又は選択のための方法は、当該分野で既知である。例えば、ジェネンテック（Genentech）社の米国特許第６３３１４１５号は、キメラ抗体の産生について記載しており、メディカル・リサーチ・カウンシル（Medical Research Council）の米国特許第６５４８６４０号は、ＣＤＲグラフト移植法(CDR grafting techniques)を記載しており、セルテック（Celltech）社の米国特許第５８５９２０５号は、ヒト化抗体の産生について記載している。インビトロ抗体ライブラリについては、特に、モーフォシス(MorphoSys)の米国特許第６３０００６４号、及びエムアールシー（MRC）/スクリップス(Scripps)/ストラタジーン(Stratagene)の米国特許第６２４８５１６号に開示されている。ファージディスプレイ法は、例えば、ディアックス(Dyax)社の米国特許第５２２３４０９号に開示されている。遺伝子組換え哺乳動物のプラットフォームは、例えば、タコニック・アルテミス(Taconic Artemis)社の米国特許公開公報第２００３０２０４８６２１号に開示されている。
【０１１０】
ＩｇＧ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ及び／又はＦ（ａｂ）２は、当業者に周知の抗体形式である。実施可能とする関連技術は、各教科書から利用可能である。
【０１１１】
本明細書において、「Ｆａｂ」という用語は、抗原結合領域を含むＩｇＧ断片であって、抗体の各重鎖及び各軽鎖に由来する一の定常領域並びに位置の可変領域から成る当該断片に関連するものである。
【０１１２】
本明細書において、「Ｆ（ａｂ）２」という用語は、ジスルフィド結合により互いに連結した２つのＦａｂ断片からなるＩｇＧ断片に関連するものである。
【０１１３】
本明細書において、「ｓｃＦｖ」という用語は、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖それぞれの可変領域が短いリンカー（通常はセリン（Ｓ）又はグリシン（Ｇ））で互いに連結された融合物である、一本鎖可変断片に関連するものである。このキメラ分子は、定常領域が除去され、かつリンカーペプチドが導入されているにもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持している。
【０１１４】
修飾された抗体形式とは、例えば、（例えば、表２に示されるような）二重又は三重特異性抗体構築物、抗体に基づく融合タンパク質、抗体薬物複合体、免疫毒素等である。こうした抗体形式についていくつか以下の表に示すが、この表は本発明の範囲を制限するものとして理解してはならない。
【０１１５】
【表４】
【０１１６】
他の好ましい実施形態においては、本発明によるモノクローナル抗体又は断片若しくは誘導体は、以下かなる群から選択される少なくとも１つの特徴を有する：
・ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、及び／又は抗体依存性アポトーシスの増強、
・血清半減期の延長、及び／又は
・二重特異性、三重特異性、又は多重特異性。
【０１１７】
本明細書において、「ＡＤＣＣの増強」、「ＣＤＣの増強」、「抗体依存性アポトーシスの増強」、「抗体依存性オプソニン化の増強」、及び「血清半減期の延長」という用語は、従来の抗体発現系、例えば、哺乳細胞又はエシェリキア・コリ（大腸菌）で産生された抗体との比較に関連するものである。ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、抗体依存性アポトーシス、及び血清半減期は、市販の試験法で測定することが出来る。
【０１１８】
「二重特異性」、「三重特異性」、又は「多重特異性」という用語は、好ましくは少なくとも２種の異なる標的の、少なくとも２種の異なるエピトープに対して親和性を示す少なくとも２種の領域を有する抗体又はその断片若しくは誘導体を示す。そのような抗体又はその断片若しくは誘導体について例をいくつか表２及び図４に示す。
【０１１９】
そのような抗体又はその断片若しくは誘導体の目的は、２種以上の異なる要素を、いわゆる二重又はそれより高次の多重特異性抗体構築物を用いて、近接させることである。この事は、例えば腫瘍細胞のＭＨＣクラスＩ要素が変異又は喪失することによって、或いは腫瘍細胞がＴ細胞活性化を抑制するメッセンジャー物質を分泌することによって、Ｔ細胞の攻撃を逃れ得る場合に、腫瘍細胞にＴ細胞を再び向けさせるのに有用である。１つの手法として、Ｔ細胞受容体（例えばＣＤ３）に対するｓｃＦｖ抗体、及び腫瘍細胞抗原（例えばＥＧＦＲ）に対するｓｃＦｖ抗体の２つを組合せる手法がある。
【０１２０】
別の手法は、両方のＦｖ鎖それぞれにある２つの異なる相補性決定領域を用いてＦｃ領域により、腫瘍細胞（例えば、ＥＧＦＲに結合するＦｖを用いて）、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ３などのＴ細胞受容体に結合する別のＦｖを用いて）、及びエフェクター細胞、例えば、単球、マクロファージ、又はナチュラルキラー細胞（そのようなエフェクター細胞上にあるＦｃγ受容体により検出されるＦｃ領域を用いて）を連結させることである。この手法は、Ｔキラー細胞の抗腫瘍効果（腫瘍細胞の溶解及びアポトーシスを誘導する）と、エフェクター細胞の抗腫瘍効果（貪食又はアポトーシスにより腫瘍細胞を除去しながら、サイトカインを放出してＴ細胞の活性をさらに刺激する）を共にもたらす。
【０１２１】
以下の表に、二重特異性抗体（１列目及び２列目）及び三重特異性抗体（３列全て）における標的について幾つかの例の概要を示すが、この表は本発明の範囲を制限するものとして理解してはならない。その他の適切な標的エピトープは表１にまとめる。
【０１２２】
【表５】
【０１２３】
二重特異性抗体の幾つかの特徴について、可能性のある形式並びに標的も含めて、クーファー（Kufer）ら(2004)で検討されており、三重特異性抗体の特徴については、可能性のある形式並びに標的も含めて、例えば、ラフ及びリンドホーファー(Ruf and Lindhofer)(2001)で検討されている。
【０１２４】
さらに、繊毛虫宿主細胞において、少なくとも１種のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体を製造するための方法であって、以下の工程を含む、当該方法が提供される：
ａ）上記モノクローナル抗体又はその断片若しくは誘導体をコードする少なくとも１種の核酸分子を用いて、又は好ましくは本発明による少なくとも１種のベクターを用いて、少なくとも１種の繊毛虫宿主細胞を形質移入する工程、及び
ｂ）タンパク質の発現を可能にする条件下で上記宿主細胞を培養する工程。
【０１２５】
本発明の別の好ましい実施形態においては、繊毛虫宿主細胞において、少なくとも１種のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体を製造するための方法であって、以下の工程を含む当該方法が提供される：
ｃ）抗体又はその断片若しくは誘導体をコードする少なくとも１種の核酸分子を用いて、又は好ましくは本発明による少なくとも１種のベクターを用いて、少なくとも２種の異なる繊毛虫宿主細胞を形質移入する工程、
ｄ）上記２種の繊毛虫宿主細胞又はその子孫を接合させ、少なくとも２種の異なる抗体又はその断片若しくは誘導体をコードする、少なくとも２種の異なる核酸分子を保有する少なくとも１種の繊毛虫細胞を取得する工程、並びに
ｅ）上記の如く製造された繊毛虫細胞をタンパク質の発現を可能にする条件下で培養する工程。
【０１２６】
さらに、医薬組成物を製造するための方法であって、以下の工程を含む当該方法が提供される：
ａ）本発明による繊毛虫発現系において、本発明の抗体又はその断片若しくは誘導体タンパク質を発現させる工程、並びに
ｂ）上記の如く得られたタンパク質を単離及び／又は精製する工程。
【０１２７】
さらに、本発明による、及び／又は本発明による方法で製造された、抗体又はその断片若しくは誘導体を含む、医薬組成物が提供される。
【０１２８】
注意事項
過度に明細書を長文化することなく包括的な開示を提供するため、本出願人は、上記に参照される特許及び特許出願のそれぞれを本明細書において援用する。
上記の詳細な実施形態における構成要素及び特徴の具体的な組み合わせは例示にすぎない。即ち、本明細書における教示における相互の置換、並びに本明細書における教示と援用される特許／出願におけるその他教示との置換も、明確に意図されている。当業者が認識する通り、当業者は、特許請求される発明の要旨及び範囲から逸脱すること無く、本明細書に記載されるものの変形、修正、及びその他実施形態を想起し得る。従って、上記の説明は例示にすぎず、限定することを意図したものではない。本発明の範囲は、以下の請求項及びその均等範囲において定義される。さらに、説明及び請求項で使用される参照記号は、特許請求される発明の範囲を限定するものではない。
【０１２９】
実施例及び図面の簡単な説明
本発明の対象のさらなる詳細、特徴、特性、及び利点は、従属請求項、並びに以下に記載する図及び実施例のそれぞれに開示される。図及び実施例は、例示として、本発明の好適な実施形態を示す。しかしながら、これらの図面は、本発明の範囲を制限するものとしては決して理解されてはならない。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】図１は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の模式図を示す。
【図２】図２は、様々な分類群のＮ−グリカン構造の概要を示す。
【図３】図３は、ＩｇＧ並びにその断片及び誘導体の模式図を示す。
【図４】図４は、二重特異性及び三重特異性を作り出すことができる、抗体及び抗体断片の想定される組合せ模式図を示す。
【図５】図５Ａは、１つのプラスミド手法を表すものとして、繊毛虫テトラヒメナ・サーモフィラにおいて用いるための、抗体の重鎖と軽鎖とをコードする発現プラスミドを示す。図５Ｂ及び図５Ｃには、２つのプラスミド手法を表すものとして、繊毛虫テトラヒメナ・サーモフィラにおいて用いるための各発現プラスミドが示されている。
【図６】図６は、テトラヒメナ接合の各段階の概要を模式的に示す。
【図７】図７は、１つのエピソームプラスミドと、１つの組込み型発現プラスミドを用いたテトラヒメナ細胞の形質転換の模式図を示す。
【図８】図８は、テトラヒメナ・サーモフィラ(Tetrahymena thermophile)細胞において発現される抗ＣＤ４抗体Ｇｋ１．５及びその断片の代表的な免疫ブロットを示す。
【図９】図９は、テトラヒメナ・サーモフィラ(Tetrahymena thermophile)とホモ・サピエンス(Homo sapiens)との間においけるコドン使用頻度の比較を示す。
【図１０】図１０は、繊毛虫、特にテトラヒメナ属において用いられる遺伝コードを示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１３１】
１．発現ベクターの構築
抗体Ｇｋ１．５の重鎖及び軽鎖それぞれの合成遺伝子（配列番号１及び配列番号２を参照）をドナーベクターにクローニングした。Ｃｒｅ（クレ）依存性リコンビナーゼ・システムを用いて、全てのドナーベクターからの発現カセットをアクセプターベクターに移した（図５を参照）。
【０１３２】
２．野生型テトラヒメナの培養及び発現プラスミドによる形質転換
野生型テトラヒメナ・サーモフィラ株（例えば、Ｂ１８６８／４、Ｂ１８６８／７、及びＢ２０６８／１）を、脱脂乳培地、ＳＰＰ、又は既知組成培地で培養した。テトラヒメナ・サーモフィラ細胞の形質転換は、キャシディー・ハンリー(Cassidy-Hanley)ら、1997に既に記載される通り実施した。
【０１３３】
３．抗体Ｇｋ１．５の検出
形質転換したテトラヒメナ細胞は、震盪機において８０ｒｐｍで、３０℃の選択圧下で、ＳＰＰ培地で培養した。標的遺伝子発現は、対数増殖中の培養物に、４１℃で熱ショックを与える（ＨＳＰ−Ｐ）ことにより、又は２０ｎＭのＣｄ2+を添加する（ＭＴＴ１−Ｐ）ことにより誘導した。
【０１３４】
標的遺伝子発現を誘導してから２４時間後に、培養物のアリコートを採取した。その後、細胞及び細胞を含まない上清をそれぞれ得た。細胞を、氷冷したＲＩＰＡバッファーに溶解（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＳＤＳ、０．１％のＤＯＣ、１％のトリトンＸ１００、及び２．５μｇ／ｍｌのＥ６４、ｐＨ７．４に、５０００個細胞／μL）して、超音波処理機中で１５分間インキュベートした。常法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット解析を行った。簡単に説明すると、破壊した細胞（すなわち１００００個）又は細胞を含まない上清の何れかのアリコートを、ラエムリ（Laemmli）試料バッファー（１２５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％グリセロール、４％ＳＤＳ）に添加し、８〜１６％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。分離したタンパク質をニトロセルロース膜に移し、０．０５％のツイーン(Ｔｗｅｅｎ)２０及び５％のウシ血清アルブミン（ＰＢＳ／ＴＢＳＡ）を含有するＰＢＳでブロッキングした。形質転換した繊毛虫での抗体の組換え重鎖及び軽鎖の発現は、Ｈｒｐ結合抗ラット全ＩｇＧ抗体で検出した。洗浄後、スーパー・シグナル・ウェストピコ・ケモルミネセント・サブストレート(Super Signal West Pico Chemoluminescent Substrate)（ペルビオ(Perbio)、フィッシャー・サイエンティフィック(Fischer Scientific))を用いた化学発光に従来のＸ線フィルム現像を組み合わせてブロットを現像した。図８に、標的遺伝子発現を誘導した後各時間における形質転換細胞について細胞溶解物及び上清のウエスタンブロットを示す。
【０１３５】
４．抗体Ｇｋ１．５の製造
発酵には、標準的なマリーンインペラー(marine impellers)を備えたシックス・フォース・マルチ発酵槽（Sixforce multifermenter）（０．５リットル）を用いた。撹拌速度は９００ｒｐｍに制限した。ｐＯ２を２５％に設定し、かつｐＨは７．０に設定した。発酵は標準的な培地で実施した。
【０１３６】
図
図１は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の模式図を示す。ＩｇＧは、２本の同一の軽鎖（それぞれが、２つの領域、ＶLとＶHとからなる）と、２本の同一の重鎖（それぞれが、４つの領域、ＶH、ＣH１、ＣH２、及びＣH３からなる）とからなる。抗原結合表面は、重鎖及び軽鎖の可変領域により形成され、エフェクター機能（補体活性化及び細胞障害性細胞の結合など）は、抗体のＶｃ領域が媒介する。
【０１３７】
図２は、様々な分類群のＮ−グリカン構造の概要を示す。一般に、「Ｎ−グリコシル化」という用語は、アミノ酸残基アスパラギン（Ｎ）のグリコシル化を示す。ここでは、オリゴ糖鎖が、オリゴサッカリルトランスフェラーゼにより、トリペプチド配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（式中、ＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸であり得る）に現れるアスパラギン残基に結合される。原核生物は全くＮ−グリコシル化を有しないのに対し、繊毛虫類は、フコース側鎖を欠き、かつ、β−ガラクトース残基で支持される末端シアル酸残基（ｎ−アセチルノイラミン酸）も欠く、Ｎ−グリカン構造を特徴とすることは明らかである。図２ｂは、幾つかの繊毛虫種で上記パターンにおいて見込まれるバリエーションを示す。
【０１３８】
図３は、ＩｇＧ並びにその断片及び誘導体の模式図を示す。図３Ａは、全長ＩｇＧ抗体を示す。図３ＢにはＦ（ａｂ）2断片が、図３ＣにはＦａｂ断片が示されている（Ｆｃ断片の除去）。遺伝子操作されたロイシン・ジッパーを含んでいることにより、会合して二量体になることができる。組換え技術を用いることにより、より小さな抗体断片を生成することができる。一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ、図３Ｅ）は、ＶL領域とＶH領域とをフレキシブルな合成リンカー配列により繋いで組合せている。リンカー配列を短くすれば、二重特異性抗体（ダイアボディ；diabodies）（図３Ｆ）、及び三重特異性抗体（トライアボディ；triabodies）（図３Ｇ）、或いは四重特異性抗体（テトラボディ；tetrabodies）（不図示）さえも形成される。ｓｃＦｖ断片をさらに改変して、抗体の定常領域（ＣH３領域など）を含むようにすると、ミニボディ（minibodies）が作製される（図３Ｄ）。
【０１３９】
図４は、二重特異性及び三重特異性を作り出すことができる、抗体及び抗体断片の想定される組合せ模式図を示す。安定に形質移入されたテトラヒメナ細胞を接合させることにより、２種の異なる抗体（例えば、抗体ＡとＢ）を組合せると、図４Ａに示すとおり、複数種の想定される二重特異性抗体となる。図４Ｂには、様々な二重特異性Ｆ（ａｂ）2及び三重特異性Ｆ（ａｂ）2並びに二重特異性抗体及びミニボディとなる、抗体断片の想定される組合せが示されている。図４Ｃには、様々な三重以上の多重特異性抗体及び抗体断片となる、抗体（例えば抗体Ｃ）又は抗体断片と二重特異性抗体又は抗体断片との想定される組合せであって、安定に形質移入されたテトラヒメナ細胞を接合させることにより得られる組合せが示されている。
【０１４０】
図５Ａは、１つのプラスミド手法を表すものとして、繊毛虫テトラヒメナ・サーモフィラにおいて用いるための、抗体の重鎖と軽鎖とをコードする発現プラスミドを示す。このプラスミドは、大腸菌で選抜するためのアンピシリン耐性遺伝子（ＡｍｐＲ）及びクロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣｍＲ）と、テトラヒメナ・サーモフィラにおいてプラスミドを安定させるためのテトラヒメナ・サーモフィラ特異的複製起点（ｒＤＮＡ ｏｒｉ）と、形質転換された繊毛虫を同定するためのネオマイシンに基づく選抜カセット（ＮｅｏＲ）と、誘導性プロモーターの制御下にあり、かつ後ろにテトラヒメナ・サーモフィラのβ‐チューブリン‐２‐ターミネーター配列（ＢＴＵ２）が続く、標的遺伝子の２つのオープン・リーディング・フレーム（重鎖及び軽鎖）とを含有する。
【０１４１】
図５Ｂ及び図５Ｃには、２つのプラスミド手法を表すものとして、繊毛虫テトラヒメナ・サーモフィラにおいて用いるための各発現プラスミドが示されている。図５Ｂでは、プラスミドは、異種遺伝子の定方向組込みのためのテトラヒメナ遺伝子ＤＨＦＲの５'隣接領域と３'隣接領域と、大腸菌における選抜のためのアンピシリン耐性遺伝子（ＡｍｐＲ）及びクロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣｍＲ）と、形質転換された繊毛虫を同定するためのブラストサイジンＳ選抜カセット（ＢｓｄＲ）と、誘導性プロモーターの制御下にあり、かつ後ろにテトラヒメナ・サーモフィラのβ‐チューブリン‐２‐ターミネーター配列（ＢＴＵ２）が続く、所望の抗体の重鎖又は軽鎖の何れかのオープン・リーディング・フレームとを含有する。図５Ｃでは、抗体の対応する重鎖又は軽鎖をコードし、かつ図５Ａに記載されるものと同様の特徴を含む発現プラスミドが示されている。
【０１４２】
図６は、テトラヒメナ接合の各段階の概要を模式的に示す。接合プロセスは、一の遺伝子座において交互する対立遺伝子についてホモ接合性である細胞同士の対合により開始する。ＭＩＣ（小さい円）は、ＭＡＣ（大きな円）内に収まっているが、ＭＡＣと物理的に分離している。ＭＩＣは、減数分裂して４つの１倍性核を生じるが、そのうちの１つだけが機能を維持し（最初の減数分裂産物）、その他の３つは分解する。この段階で、減数分裂乗換えが起こり、その後、移動前核の相互交換が続き、移動前核は、受取側の細胞の静止前核と融合して、接合体核を形成する。接合体核は２回有糸分裂して、４つの別々の遺伝的に同一な二倍体核をもたらす。この段階で、古いＭＡＣは退化する。次いで、前の産物は分化して新しいＭＡＣとなるが、後の産物は二倍体ＭＩＣのままである。細胞は、分離し（今や接合完了体と呼ばれる）、最初の接合後細胞分裂を行い、４個のカリオナイド（karyonide）細胞を形成する。各カリオナイドは、独立して分化した新しいＭＡＣ及び機能性ＭＩＣの有糸分裂コピーを受けとる。それからカリオナイドは二分裂による栄養増殖を開始する。
【０１４３】
図７は、１つのエピソームプラスミドと、１つの組込み型発現プラスミドを用いたテトラヒメナ細胞の形質転換の模式図を示す。この２つのプラスミドを用いる手法は、全ＩｇＧを産生し、かつチミジン要求性を示す、安定形質移入テトラヒメナ細胞をもたらす。
【０１４４】
図８は、テトラヒメナ・サーモフィラ(Tetrahymena thermophile)細胞において発現される抗ＣＤ４抗体Ｇｋ１．５及びその断片の代表的な免疫ブロットを示す。図８Ａには、細胞ペレットにおける、並びに安定形質転換細胞の上清における、Ｇｋ１．５及びその断片の発現が、組換えタンパク質発現の誘導（ｐ．ｉ．）後、異なる時間について示されており、当該細胞は、マルチ発酵槽（０．５Ｌ、実験室規模）で培養した。イー・バイオサイエンス社（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）製の抗ＣＤ４抗体クローンＧｋ１．５を陽性対照として用いた。染色は、Ｈｒｐ結合抗ラットＩｇＧを用いて行った。図８Ｂには、タンパク質Ｇカラムを用いて、生成した上清を精製した後のテトラヒメナで発現された抗体Ｇｋ１．５及びその断片の代表的な免疫ブロットを示す。
【０１４５】
図９は、テトラヒメナ・サーモフィラ(Tetrahymena thermophile)とホモ・サピエンス(Homo sapiens)との間においけるコドン使用頻度の比較を示す。ホモ・サピエンスのものは、哺乳類細胞株で発現されるモノクローナル抗体又はその断片若しくは誘導体に応用できる。さらなる説明については本文を参照のこと。
【０１４６】
図１０は、繊毛虫、特にテトラヒメナ属において用いられる遺伝コードを示す。グルタミンをコードする、非標準ヌクレオチドコードであるＵＡＡ及びＵＡＧは太字で示してある。しかしながら、一般的な遺伝コードによれば、これらのトリプレットは終止コドンである（取消し線の引かれたトリプレットを参照）。「１ＬＣ」は「１文字コード」を表し、「３ＬＣ」は「３文字コード」を表す。
【０１４７】
参考文献
トンドラビ・エムエム(Tondravi,MM);ヤオ・エム−シー（Yao,M-C）(1986):リボソームＲＮＡ遺伝子のマイクロインジェクションによるテトラヒメナ・サーモフィラの形質転換(Transformation of Tetrahymena thermophila by microinjection of ribosomal RNA genes.) 米国科学アカデミー紀要(PNAS)83, 4369-4373.
【０１４８】
ガートリグ・ジェー(Gaertig,J);ゴロフスキー・エムエー(Gorovsky,MA)(1992):接合固体のエレクトロポレーションによるテトラヒメナ・サーモフィラの効率的な大量形質転換( Efficient mass transformation of Tetrahymena thermophila by electroporation of conjugants.)米国科学アカデミー紀要(PNAS)89, 9196-9200.
【０１４９】
キャシディ‐ハンリー・ディー（Cassidy-Hanley,D）;ボーウェン・ジェー（Bowen,J）;リー・ジェーエイチ（Lee,JH）;コール・イー（Cole,E）; バープランク・エルエー(VerPlank、LA); ガートリグ・ジェー(Gaertig,J); ゴロフスキー・エムエー(Gorovsky,MA);バーンズ・ピージェー（Bruns,PJ）(1997):パーティクル・ボンバードメントによる接合テトラヒメナ・サーモフィラの生殖細胞及び体細胞形質転換(Germline and somatic transformation of mating Tetrahymena thermophila by particle bombardment.)ジェネティクス(Genetics)146, 135-147.
【０１５０】
クーファー・ピー(Kufer,P);ラッタービューズ・アール(Lutterbuse,R);バエウーレ・ピーエー(Baeuerle,PA)(2004):二重特異性抗体のリバイバル（A revival of bispecific antibodies.）トレンズ・イン・バイオテクノロジー(Trends in Biotechnology),第２２巻(Volume 22),イシュー５（Issue 5）, 238-244,2004年５月１日(1 May 2004)
【０１５１】
ラフ・ピー(Ruf,P);リンドホーファー・エイチ(Lindhofer,H)(2001):三機能性二重特異性抗体による長期間持続抗腫瘍免疫性の導入(Induction of a long-lasting antitumor immunity by a trifunctional bispecific Antibody.)ブラッド(Blood),2001年10月15日(15 October 2001),第98巻(Vol. 98), 第８号(No. 8), pp.2526-2534
【０１５２】
シールズ・アールエル(Shields,RL)ら(2002):ヒトＩｇＧ１Ｎ結合型オリゴ糖のフコース欠如はヒトFc RIII及び抗体依存性細胞障害性を向上させる(Lack of Fucose on Human IgGl N-Linked Oligosaccharide Improves Binding to Human Fc RIII and Antibody-dependent Cellular Toxicity.)ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J Biol Chem)第277巻(Vol. 277),第３０号(No. 30), pp. 26733-26740
【０１５３】
ウェイ・ワイ(Wei,Y)ら (2008)酵母発現とインビトロ化学酵素グリコシル化の組合せを介したヒトIgG1‐Fcの糖工学(Glyco-engineering of human IgGl-Fc through combined yeast expression and in vitro chemo enzymatic glycosylation.)バイオケミストリー(Biochemistry)30; 47(39): 10294
【０１５４】
ジャーングロス(Gerngross)(2004):酵母及び糸状菌における治療効果のあるヒト蛋白質の製造における進歩（Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi.）ネイチャー・バイオテクノロジー(Nature Biotechnology)22 (11), 1409
【０１５５】
ウェイデ・ティー(Weide, T.);ボッカウ・ユー（Bockau, U.）;レイブ・エー(Rave, A.);ハーマン・エル(Herrmann, L.)及びハートマン・エム・ダブリュ・ダブリュ(Hartmann, M. W. W.):リコンビナーゼ・システムは繊毛虫テトラヒメナ・サーモフィラにおける発現カセットのクローニングを容易にする。（A recombinase system facilitates cloning of expression cassettes in the ciliate Tetrahymena thermophila.）ビー・エム・シー・マイクロバイオロジー(BMC Microbiol),第７巻（Vol. 7）, pp. 12, 2007
【０１５６】
ウェイデ・ティー(Weide, T.);ハーマン・エル(Herrmann, L.);ボッカウ・ユー(Bockau, U.);ニエバー・エヌ(Niebur, N.);アルダグ・アイ(Aldag, I.);ラロイ・ダブリュ(Laroy, W.);コントリラス・アール(Contreras, R.);ティートケ・エー(Tiedtke, A.)及びハートマン・エム・ダブリュ・ダブリュ(Hartmann, M. W. W.):テトラヒメナ・サーモフィラによる機能性ヒト酵素の分泌(Secretion of functional human enzymes by Tetrahymena thermophila.) ビー・エム・シー・バイオテクノロジー(BMC Biotechnol),第６巻(Vol. 6), pp. 19, 2006
【０１５７】
バンノ・ワイ(Banno, Y.),ヤノ・ケー(Yano, K.)及びノザワ・ワイ(Nozawa, Y.):テトラヒメナ・ピリフォルミス由来の分泌プロテアーゼの精製及び特性評価(Purification and characterization of a secreted protease from Tetrahymena pyriformis.)ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(Eur J Biochem),第１３２巻（Vol. 132）(3), pp. 563-8, 1983
【技術分野】
【０００１】
本発明は、繊毛虫宿主細胞におけるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の異種発現系に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日、ヒト治療用モノクローナル抗体の適応症の主なものは、癌、自己免疫疾患、及び感染症である。
【０００３】
作用機構の１つは、腫瘍関連血管新生を促進する成長因子の情報伝達経路の遮断であり、このような遮断は、例えば、アバスチン（Avastin、ベバシズマブ（Bevacizumab））によってなされるが、アバスチンは血管内皮成長因子（Vascular Endothelial Growth Factor; ＶＥＧＦ）を標的とし、これにより腫瘍を餓死させるものである。その他の標的としては、例えば、胎盤成長因子（Placental growth factor;ＰＬＧＦ）が挙げられる。こうした目的のためには、抗体の軽鎖及び重鎖（ＶL及びＶH）の可変領域に位置する相補性決定領域（ＣＤＲ）によって生じる高い標的親和性が要求されるが、Ｆｃ領域により発揮される抗体エフェクター機能は重要ではない。これら目的には、Ｆｃ領域を欠いた抗体断片（ｓｃＦｖやＦａｂｓなど）を用いることができる。
【０００４】
その他の作用機構としては、ＴＮＦα等のサイトカインへの結合（ヒュミラ；Ｈｕｍｉｒａ）、ｅｒｂＢ−２等の成長因子受容体の遮断（アービタックス；Ｅｒｂｉｔｕｘ）、ＲＳＶ Ｆタンパク質等の細胞侵入に必要なウイルス表面抗原の遮断（シナジス；Synagis）、及びＲＢＣのＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体等の血液凝固の原因受容体の遮断（レオプロ；ＲｅｏＰｒｏ）がある。
【０００５】
しかしながら、モノクローナル抗体は、また、殺標的細胞用途、例えば癌細胞又は病原体の排除にも用いることができる。結合型抗体、即ち、特定の細胞毒を保有する人工抗体がこの目的で開発されてきたが、特定の細胞毒を欠いた未結合型抗体でもそれぞれの免疫応答を誘発することでこの目的に合致することができる。しかしながら、このような目的の場合には、機能性Ｆｃ領域が必要であり、機能性Ｆｃ領域はＩｇＧ、特にＩｇＧ１に備わっているのである。これに関して、基本的には、以下の４つの異なる機構が知られている。
【０００６】
・標的細胞結合抗体のＦｃ領域は、免疫エフェクター細胞表面のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ、特にＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ及び／又はＦｃγＲＩＩＩ）に結合することができ、免疫エフェクターによる、標的細胞のＦｃγＲ媒介型標的細胞死滅を引き起こす（「抗体依存性細胞障害」すなわちＡＤＣＣ(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity)）。
・標的細胞結合抗体のＦｃ領域は、血中に見られる補体系の可溶性タンパク質（例えば、Ｃ１ｑ）に結合することができ、補体媒介型標的細胞溶解を引き起こす（「補体依存性細胞障害」、ＣＤＣ（Complement-Dependent Cytotoxicity））。
・標的分子への抗体の直接結合は、アポトーシス（抗体依存性アポトーシス）等の細胞死誘導機構を引き起したり、又は成長因子等の細胞生存因子の活動を遮断することが出来る。
・マクロファージ又は好中球の抗体媒介型結合による標的細胞のオプソニン化、及びそれに続く貪食。
【０００７】
ＡＤＣＣは、細胞性免疫の機構であり、これにより、免疫系のエフェクター細胞が、特定の抗体が結合している標的細胞を活発に溶解する。ＡＤＣＣは、抗体が、体液性免疫応答の一部として、感染を制限し封じ込めるように作用し得る機構の１つである。古典的なＡＤＣＣ媒介性エフェクター細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であるが、単球及び好酸球もＡＤＣＣを媒介し得る。ＡＤＣＣは、従前の抗体反応に依存するため、適応免疫応答の一部である。
【０００８】
標的細胞においてＡＤＣＣを誘発するのに用いられる治療用抗体には、上記エフェクター細胞のＦｃγ受容体によって認識されるために、Ｆｃ領域が必要である。そのような抗体の例として、ｅｒｂＢ−２を認識し、かつ好ましくはｅｒｂＢ−２を過剰発現する腫瘍細胞に結合するハーセプチン(Herceptin)、或いは悪性Ｂ細胞におけるＣＤ２０受容体に結合するリッキサン(Rituxan)が挙げられる。
【０００９】
その他可能性のある機構の１つは、即ち二重特異性又はそれ以上の多重特異性抗体構築物を用いることにより、２種以上の異なる要素を近接させることによるものである。これは、例えば腫瘍細胞が、例えばそれらのＭＨＣクラスＩ要素の変異又は喪失によって、或いはＴ細胞の活性化を抑制するメッセンジャー物質を分泌することにより、Ｔ細胞の攻撃を免れ得る場合に、腫瘍細胞に対してＴ細胞を再び向わせるのに有用である。１つの手法は、２つのｓｃＦｖ抗体を組合せることであり、これら２つのうちの一方は、Ｔ細胞受容体（例えば、ＣＤ３）に対するものであり、もう一方は腫瘍細胞抗原（例えばＥＧＦＲ）に対するものである。
【００１０】
別の手法は、腫瘍細胞（例えば、ＥＧＦＲ又はＥｐＣＡＭに結合するＦｖを用いて）、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ３等のＴ細胞受容体に結合する別のＦｖを用いて）、並びに単球、マクロファージ、又はナチュラルキラー細胞等のエフェクター細胞（このようなエフェクター細胞上にあるＦｃγ受容体により検出されるＦｃ領域を用いて）を、（両方のＦｖ鎖における２種の異なる相補性決定領域と、Ｆｃ領域とを含む融合分子を用いて）連結することである。この手法は、腫瘍細胞溶解及びアポトーシスを誘導するキラーＴ細胞の抗腫瘍効果と、Ｔ細胞活性をさらに刺激するサイトカインを放出する一方で、貪食又はアポトーシスにより腫瘍細胞を排除するエフェクター細胞の抗腫瘍効果と共にもたらす。
【００１１】
さらに別の手法は、２種の異なる抗原が１つの抗原結合部位により両方共に高い親和性で認識され得る抗体を設計することである。このような抗体は、将来的には、２種の異なる抗体を用いる併用療法に取って代わるかもしれない。さらに、このような抗体は、また、同一抗原、特に可溶性抗原の異なるエピトープに結合させ、結合親和性及びインビボ力価を上げるのにも用いられ得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
現在、治療用途のための抗体又はその断片若しくは誘導体は、エシェリキア・コリ（E. coli）、又はＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞のような哺乳細胞株の何れかで発現されている。これらの発現系では、ＡＤＣＣを増強したり、或いは多重特異性を有する抗体を提供することもできず、さらに幾つかのその他欠点もある。
【００１３】
エシェリキア・コリ（E. coli）で産生された抗体は、グリコシル化やその他翻訳後修飾を受けておらず、従ってＡＤＣＣに関連する能力が限られている。さらに、エシェリキア・コリ株はタンパク質を培地に分泌しないので、細胞を溶解させなければならず、抗体は徹底した精製が必要である。別の周知の問題として、タンパク質の誤った折り畳みがあるが、これは不溶性封入体の形成に繋がり得る。結果として、エシェリキア・コリは、血清半減期が短いＦａｂ断片及びｓｃＦｖ断片の産生にのみ適している。
【００１４】
真核生物発現系も、多くの欠点を抱えている。酵母菌発現系は、マンノースに富む過剰グリコシル化タンパク質を産生する傾向があり、この治療抗体を患者に投与した場合、望ましくない免疫反応を引き起こすことが多い。バキュロウイルス形質移入昆虫細胞の系は、低グリコシル化による問題を引き起こし、治療抗体のエフェクター機能に悪影響を及ぼすのである。さらに、大きな欠点として、感染性バキュロウイルスの触媒活性があり、これは完全なＩｇＧ産生の間口を狭める。
【００１５】
ＣＨＯ細胞及びＰｅｒ．Ｃ６細胞等の哺乳類細胞株及びヒト細胞株は、培養及び増殖が難しく、しかもスケールアップするに費用がかかる。さらに、こうした細胞は、培養液に関する要求性が高い。そのうえ、哺乳細胞株及びヒト細胞株は、ヒト又は動物起原の細菌及びウイルス感染の危険性をはらんでいる。
【００１６】
本発明の目的の一つは、上記の欠点を有さない、抗体又はその断片若しくは誘導体の発現系を提供することである。
【００１７】
本発明の他の目的は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、抗体依存性アポトーシス、又は抗体依存性オプソニン化が増強される、抗体又はその断片若しくは誘導体の製造を可能にする系を提供することである。
【００１８】
本発明の他の目的は、多重特異性を有する、抗体又はその断片若しくは誘導体の製造を可能にする系を提供することである。
【００１９】
本発明の他の目的は、血清半減期が延長された、抗体又はその断片若しくは誘導体の製造を可能にする系を提供することである。
【００２０】
これらの目的は、独立請求項に記載の系と合致する。幾つかの従属請求項には好ましい実施形態を記載される一方、その他独立請求項には変形実施形態及び／又は代替実施形態が記載される。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明によれば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体の異種発現系であって、以下を含む、上記異種発現系が提供される：
ａ）少なくとも１種の繊毛虫宿主細胞、及び
ｂ）上記繊毛虫宿主細胞に組み込まれる少なくとも１種の異種核酸分子であって、上記モノクローナル抗体又はその断片若しくは誘導体をコードする上記異種核酸分子。
【００２２】
本明細書において、「異種発現」という用語は、発現が生じる生物に対して外来のものである、遺伝子、核酸又はｃＤＮＡのタンパク質発現を指す。
【００２３】
本明細書において、「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）、ＰＮＡ、ＬＮＡ及び／又はモルホリノを含む、任意の一本鎖核酸分子又は二本鎖核酸分子を指すものと意図される。好ましくは、上記核酸分子は、モノクローナル抗体又はその断片若しくは誘導体をコードするｃＤＮＡを含む。
【００２４】
本明細書において、「ｃＤＮＡ」という用語は、発現されるべきタンパク質をコードし、かつイントロン等の如何なる非コード部分も欠くＤＮＡ分子を指す。多くの場合、ｃＤＮＡは、逆転写酵素及びオリゴｄＴプライマーを用いてＲＮＡ鋳型から直接合成されている。しかしながら、この用語は、合成の遺伝子及びそれ以外の方法で得られるコードＤＮＡを同じく含むものとする。
【００２５】
所定の標的に対する所定のモノクローナル抗体をコードする核酸配列は、文献から見つけることもできる。例えば、欧州特許第ＥＰ０５９００５８Ｂ１号には、ヒト化モノクローナル抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（トラスツズマブ；Trastuzumab）のＶLドメイン及びＶHドメインのアミノ酸配列が開示されている。他の参照文献には、完全ＩｇＧのアミノ酸配列さえも記載されている。この情報を用いて、当業者は、そうした抗体をコードするｃＤＮＡを設計し、それを本発明の目的のために用いることができる。
【００２６】
その他の情報源としては、例えば、大部分のモノクローナル抗体又はその断片若しくは誘導体について配列情報を提供する、公的なドラッグバンク（ＤｒｕｇＢａｎｋ）データベース（http://www.drugbank.ca）がある。
【００２７】
本明細書において、「モノクローナル抗体（ｍＡｂ）」という用語は、均一な抗体集団を有する抗体組成物、すなわち全免疫グロブリン又はその断片若しくは誘導体からなる均一集団を指す。特に好ましくは、そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ及び／若しくはＩｇＭ、又はそれら断片若しくは誘導体からなる群より選択される。
【００２８】
本明細書において、「断片」という用語は、場合によって、標的結合能力を保持した、上記のような抗体の断片を指し、例えば、以下のものである。
・ＣＤＲ（相補性決定領域）
・超可変領域
・可変領域（Ｆｖ）
・ＩｇＧ重鎖（ＶH領域、ＣH１領域、ヒンジ領域、ＣH２領域、及びＣH３領域からなる）
・ＩｇＧ軽鎖（ＶL領域及びＣL領域からなる）、並びに／又は
・Ｆａｂ及び／又はＦ（ａｂ）２。
【００２９】
本願明細書において、「誘導体」という用語は、構造的には異なる形状をしているが、依然として何らかの構造的関連性を有する、すなわち共通する抗体概念を有するタンパク質構築物を指し、例えばｓｃＦｖ、並びに二重特異性、三重特異性、又はそれより高次の多重特異性の抗体構築物が挙げられる。これらのものは全て以下に説明されている。
【００３０】
本明細書において、「宿主細胞」という用語は、２通りの異なる意味があり、それら２通りの意味は、それぞれの文脈に応じて理解され得る。異種タンパク質発現の文脈において、「宿主細胞」という用語は、発現宿主として用いられる遺伝子導入細胞を示す。したがって、当該細胞又はその前駆細胞は、発現されるべきタンパク質のｃＤＮＡを含む適切なベクターで形質移入されている。
【００３１】
本明細書において、「繊毛虫宿主細胞」という用語は、繊毛虫（Ｃｉｌｉｏｐｈｏｒａ）門（以前の繊毛虫類（Ｃｉｌｉａｔａ））由来の細胞、例えば、繊毛と呼ばれる毛様細胞小器官の存在及び核二形性を特徴とする原生動物由来の細胞を指す。
【００３２】
本明細書において、「組み込まれた」という用語は、上記核酸がすぐにタンパク質発現できるような様式で宿主細胞に入っているという事実を指す。そのような組み込みは、繊毛虫においては様々な様式を用いることができ、例えば「エピソーム組み込み」（例えばプラスミドなどの核酸分子が、細胞核に進入してはいないが、細胞質で複製され翻訳される。）、及び「統合型組み込み」（例えば核酸分子が細胞ゲノムに組み込まれている）がある。
【００３３】
繊毛虫は、それらを、モノクローナル抗体又はその断片若しくは誘導体の発現宿主として用いるのに適したものとする驚くべき幾つかの性質を有している。エシェリキア・コリ（大腸菌）とは対照的に、繊毛虫は、ｓｃＦｖ及びＦａｂを産生できるだけでなく、完全な免疫グロブリン（ＩｇＧ）も産生できる。さらに、産生される抗体は、培地に分泌されるので、細胞溶解及び細胞ペレットから抽出の必要がない。
【００３４】
哺乳細胞株と比較すると、繊毛虫は培養培地に関係する要求性がほとんど無く、しかも液体培養が可能であるので、抗体発現が非常に安価である。
【００３５】
さらに、本発明者らが知る限り、繊毛虫類については、細菌や高等真核生物と違って、これまで特定のウイルスが見つかっていない。特定のウイルスがいないのは、繊毛虫類に共通する核二形性が原因かもしれない。また、その別の理由としては、繊毛虫類における一般的では無いコドンの使い方及びＡＴリッチなゲノムが考えられる。このため、高等生物の病原性ウイルスは、ほとんどの繊毛虫で増幅することが出来ないと、本発明者らは考えている。今まで知られている限り繊毛虫類がウイルスに感染しないという事実は、驚くべき利点となる。この事実は、繊毛虫類を利用した製造方法において、外来ウイルスの増幅又は増殖が起こらないことを意味する。さらに、この事は、治療用途でタンパク質を産生させる場合に、ヒト及び動物細胞培養物を用いる工業プロセスで必要となるような費用のかかるウイルス除去手順を省略できることを意味する。
【００３６】
それだけではなく、繊毛虫の系には、モノクローナル抗体の発現に関して他にも幾つかの利点がある。これらの利点は以下に議論される。
【００３７】
上記のような利点にも関わらず、繊毛虫発現系はまだそれほど知られてはいないため、当業者は、可能性のある異種タンパク質発現系について尋ねられると、むしろエシェリキア・コリ（大腸菌）、酵母菌、昆虫細胞系（バキュロウイルス）、及び哺乳細胞株を考えるであろう。
【００３８】
本発明の背景において用いることができる、繊毛虫の形質転換法として、とりわけ、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、及び微粒子銃（パーティクル・ボンバードメント）が挙げられ、こうした方法は、例えば、トンドラビ及びヤオ（Tondravi & Yao）(1986)、ガトリグ及びゴロフスキー（Gaertig & Gorovsky）(1992)、並びにキャシディ‐ハンリーら（Cassidy-Hanley et al）(1997)に記載されている。
【００３９】
形質転換及び異種タンパク質発現の方法は、幾つかの原生生物については記載されている（ＷＯ００／５８４８３及びＷＯ００／４６３８１）。繊毛虫テトラヒメナ・サーモフィラ(Tetrahymena thermophila)の有糸分裂的に安定な形質転換体の作製は、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、又は微粒子銃（パーティクル・ボンバードメント）によって、体細胞巨核又は生殖微小核の何れかを形質移入して達成され得る。
【００４０】
形質転換体の選別は、ネオマイシン耐性（ウェイデ（Weide）ら、２００６、ＢＭＣ）や、安定なチミジン栄養要求性テトラヒメナ細胞が生じる、相同ＤＮＡ組換えによる異種遺伝子の組込み（ウェイデ（Weide）ら、２００６、ＢＭＣ）等、様々な選択マーカーを利用して実施することが出来る。加えて、ブラストサイジンＳ耐性（ウェイデ（Weide）ら、２００７、ＢＭＣ）やパクリタキセル耐性（ＷＯ００／４６３８１）の利用も考慮されている。
【００４１】
好ましくは、コード核酸は、繊毛虫発現宿主に最適化されたコドンである。本明細書で用いられる「最適化されたコドン」という用語は、発現されるべき異種タンパク質をコードするｃＤＮＡが、普遍的な遺伝コードスキームから派生する宿主特異的なコドン使用頻度に適合させられるプロセスを指す。繊毛虫は、ＡＴリッチなゲノムを有し、テトラヒメナのＤＮＡの場合はその約７５％がＡＴからなる（図９を参照）。コドン使用頻度は、異なる生物間で、特に所定のアミノ酸をコードするのにあるコドンがどのくらいの頻度で用いられるか（「コドン・バイアス」）において、異なるものである。異種タンパク質をコードする、最適化されていないｃＤＮＡが繊毛虫ではほとんど用いられないコドンを使用していると、タンパク質発現効率に強く影響が出る可能性がある。このことは、裏を返せば、研究中の遺伝子のコドン頻度が繊毛虫発現系のコドン頻度と一致する場合、異種タンパク質発現が劇的に向上され得ることを意味する。そのうえ、多くの繊毛虫、中でもテトラヒメナ属では、非標準のヌクレオチドコードが利用されており、ＵＡＡ及びＵＡＧのトリプレットでグルタミンをコードしているが、一方、大多数のその他生物では、これらのコドンは翻訳を終了する終止コドンとして用いられている。
【００４２】
このことは、ＵＡＡ及びＵＡＧのトリプレットを終止コドンとして保有する外来（非繊毛虫）遺伝子が正確に発現されないという事に繋がり得る。このために、繊毛虫宿主細胞を形質転換する前に、異種タンパク質をコードするｃＤＮＡは、ＵＡＡ及びＵＡＧのトリプレットがＵＡＡに修正されるようにコード最適化が行わなければならない。コード最適化は、例えば、部位特異的突然変異誘発により、又はデノボｃＤＮＡ合成により達成することができる。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態において、上記モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体は、本質的にフコースを含まないＮ−グリカン構造を有する。
【００４４】
真核生物発現系で発現したタンパク質は、グリコシル化を伴う翻訳後修飾プロセスを受ける。ＩｇＧ、及びＦｃ領域を含むその他モノクローナル抗体の産生のために今日確立されている真核生物発現系は、Ｎ−グリカンをポリペプチド鎖に付加する。ＩｇＧでは、最も重要なＮ−グリカンは、Ａｓｎ２９７で両方のＣH２鎖に結合しており（図１を参照）、このＮ−グリカンは、とりわけ、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、マンノース、及びフコースなどの残基を含む。
【００４５】
このことは、基本的に、形質転換植物発現系、並びに哺乳細胞株（図２を参照）、昆虫細胞株などにも当てはまる。これら全ての場合において、Ｎ−グリカンは、少なくとも１つのフコース残基を含み、このフコース残基は、ポリペプチド鎖のＡｓｎ残基に結合したＮ−アセチルグルコサミン残基に、α−３−グリコシド結合又はα−６−グリコシド結合の何れかで結合する。
【００４６】
これと対照的に、繊毛虫は、上記の発現系で産生されるグリコシル化パターンとは明らかに相違するＮ−グリカン構造を産生し、このＮ−グリカン構造体はフコースを含有しない。
【００４７】
本明細書において、「本質的にフコースを含まない」という用語は、１個以上のＮ−グリカン、好ましくはＡｓｎ２９７ Ｎ−グリカン中に１個以上のフコース残基を保有するモノクローナル抗体、又はその断片若しくは誘導体の占有率が、本発明による発現系で製造されたモノクローナル抗体、又はその断片若しくは誘導体の総量の１０％、好ましくは５％、より好ましくは１％、最も好ましくは０．１％を超えないことを意味する。
【００４８】
さらに、ヒト細胞株（ＰｅｒＣ６）、並びに一般的な哺乳細胞株における組換え抗体の産生は、培養条件によって、及び培養期間の経過に渡り変化する、グリコシル化プロファイルをもたらす。抗体グリコシル化パターンにおけるこのような精度の低下は、治療効果の低下をもたらし、副作用の危険性を高める（ジェフェリス（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ）、２００５）。対照的に、繊毛虫は、再現性の高い二分岐オリゴマンノースＮ−グリコシル化構造を有するタンパク質を分泌することが出来る（バンノ（Ｂａｎｎｏ）ら、１９９３）。同様に共通するグリコシル化パターンは、均一な血清半減期をもたらし、副作用の危険性を低下させ、均一かつ十分に操作し易い治療効果を実現にする。
【００４９】
別の好ましい実施形態においては、上記モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、又はその断片若しくは誘導体は、以下からなる群から選択される少なくとも１つの効果を有する：
・抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）の増強
・補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）の増強
・抗体依存性アポトーシスの増強、及び／又は
・抗体依存性オプソニン作用の増強。
【００５０】
最近の研究により、グリコシル化パターン中のフコースの量が減じられたモノクローナル抗体は、フコシル化抗体と比較して非常に高い抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）活性を示すことが示されている。繰り返しになるが、フコース残基の欠如がＡＤＣＣの増強をもたらすのは、基本的にＡｓｎ２９７の位置である。フコースが低いか、或いは皆無である抗体のＡＤＣＣが増強される背後にある機構は、そのように修飾されたＦｃ領域のＦｃγＲ〔例えば、ヒト免疫エフェクター細胞におけるＡＤＣＣに関する主要なＦｃ受容体であるＦｃγＩＩＩａ（ＣＤ１６）〕に対する親和性の増加によって媒介されているようである（シールズ（Ｓｈｉｅｌｄｓ）ら、２００２）。
【００５１】
ＡＤＣＣを誘発する、本発明による治療抗体の標的として可能性があるものを、以下の表に示すが、この表は、本出願の範囲を制限するものと解釈されるべきではない（標的の略称は一般的な文献から採用したものである。）。
【００５２】
【表１】
【００５３】
当業者は、上記抗体の製造手順及びアミノ酸配列を全て入手でき、従って本発明の教示を、例えば上記抗体により惹起されるＡＤＣＣを増強する目的で、上記抗体全てに適用できることを理解することが重要である。
【００５４】
米国企業のゼンコー（Xencor）社は、アミノ酸の選択的な改変のために抗体Ｆｃ領域を操作して、抗体要素のモジュラーセットを開発した。場合により、これらのＦｃは、１００倍を超えるＡＤＣＣの増強を示し、その結果のなかでも特に、低レベルでしか抗原を発現しない細胞株に対してさえもＡＤＣＣによる死滅がもたらされ、同じ細胞障害性効果を維持しながらｍＡｂの用量を減らすことができたと報告されている。しかしながら、この著者らは、ランダム変異／選択プロセスに基づくものと考えられる、それらの改変と、それにより得られる効果、すなわちＡＤＣＣの増強との間の因果関係を何も導きだしていない。この理由から、この概念は完全には再現できると言う訳ではなく、他の抗体に一般化できるのか否か不明である。
【００５５】
日系企業のバイオワ（BIOWA）社は、ＡＤＣＣが増強するｍＡｂを発現させるためのＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞株を開発した。この細胞株では、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（「ＦＵＴ８」）酵素をコードする遺伝子がノックアウトされている。したがって、翻訳後のグリコシル化の最中に、抗体のＮ−グリコシル化部位にフコース残基が付加され得ない。このようにして産生されたｍＡｂは増強されたＡＤＣＣ活性を示すとされている。この方法は、欧州特許第ＥＰ１１７６１９５号に記載されている。この手法の大きな欠点は、それが、１００％フコースを含まない産物を保証してはいないことである。非フコシル化は、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼの潜在的に残存する酵素活性に大きく依存することから、特にバッチ間比較においては、大きなバラツキが生じる。さらに、この系は、ＣＨＯ細胞（いわゆるＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ）でのみ利用可能であるが、このＣＨＯ細胞は、特定のｍＡｂ発現用途によっては不十分な発現宿主である。
【００５６】
米国企業のグリカート（Glycart）社は、ｍＡｂを産生するための細胞株であって、オリゴ糖修飾酵素であるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）をコードする異種遺伝子を保有する該細胞株を開発した。これらの細胞は、ｍＡｂをコードするＤＮＡで形質移入された後、ｍＡｂを産生するようになるが、産生されるｍＡｂは最初にフコース残基の組込みを含む通常のグリコシル化プロセスを受ける。第二の工程で、フコース残基はＧｎＴＩＩＩ酵素により開裂する。したがって得られるタンパク質は、おおよそ非フコシル化されており、ＡＤＣＣの増強を示す。この手法もまた、１００％フコースを含まない産物を保証しない。脱フコシル化は、上記ＧｎＴＩＩＩ酵素の活性に大きく依存するために、特にバッチ間の比較で大きなバラツキが生じる。
【００５７】
米国企業のユーリカ・セラペウティクス（Eureka Therapeutics）社は、治療用抗体でＡＤＣＣを増強する方法を開発し、この方法をＭＡＧＥ（グリコシル化操作によるＡＤＣＣ増幅；“Magnified ADCC through Glycosylation Engineering"）と名付けたと宣伝している。しかしながら、この方法の技術的な詳細は明らかにされていない。
【００５８】
驚くべきことに、本発明者らは、自らの実験において、ＡＤＣＣを誘導し得る抗体を、そのＮ−グリカン構造は哺乳細胞で発現される典型的な抗体とは異なるものの、繊毛虫が産生することを発見した。続いて、本発明者らは、自らの実験において、繊毛虫が、Ｆｃ領域に、フコースは含有しないＮ−グリカン構造を有する抗体を産生することを発見した。このことは、哺乳細胞において発現される抗体と比較してＡＤＣＣエフェクター機能が増強されることの説明となり得る。
【００５９】
したがって、本発明による系によれば、劇的にＡＤＣＣが増強され、したがって治療効果も大きく向上したモノクローナル抗体、又はその断片若しくは誘導体を産生するための、経済的、簡便、かつ信頼できる方法が提供される。
【００６０】
酵母菌を利用した発現系（例えば、サッカロミセス種(Saccharomyces sp.)又はピチア種(Pichia sp.)）もマンノースが豊富な非フコシル化Ｎ−グリカンを産生する（図２を参照）ことに触れておくのは重要である。こうした発現系は、特に抗体又はその断片若しくは誘導体の産生に関して、精力的に研究される対象ではあるものの（ウェイ（Wei）ら、２００８)、研究の主な焦点は、酵母菌を利用した発現系のグリコシル化パターンをヒトグリコシル化パターンと同様になるように改良することに向けられているようである（ジャーングロス（Gerngross）、２００４）。これは、裏を返すと、抗体又はその断片若しくは誘導体に有用であるだけでなく、他のバイオ医薬品の発現にも有用となるだろう。
【００６１】
現在、酵母菌株で産生される抗体、又はその断片若しくは誘導体が、ＡＤＣＣ、又はＣＤＣ、又は抗体依存性アポトーシスの増強を有することを示す報告も、フコシル化の欠如が特定のその他効果をもたらすことを示す報告も無い。この事もまた、フコシル化の欠如のみが、当業者に周知の事実、ＡＤＣＣの増強を自動的に意味しないことを示す。
【００６２】
さらに、本発明による系で製造される治療用抗体、又はその誘導体若しくは断片は、ＣＤＣも増強するようである。
【００６３】
そのうえに、本発明による系で製造される治療用抗体、又はその誘導体若しくは断片は、抗体依存性アポトーシス効果も増強するようである。
【００６４】
さらに、本発明による系で製造される治療用抗体、又はその誘導体若しくは断片は、抗体依存性オプソニン作用効果も増強するようである。
【００６５】
特に好ましい実施形態においては、追加のＮ−グリコシル化部位が、発現されるべき抗体又はその断片若しくは誘導体に導入されることが提供される。これは、例えば、部位特異的突然変異誘発により、又はアミノ酸残基の意図的な置換により、追加のＮ−グリコシル化モチーフ、すなわち、トリペプチド配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（Ｘは任意のアミノ酸であり得るが、Ｐｒｏ及びＡｓｐであることは稀である）を導入することでなされ得る。仮に、例えば、抗体又はその断片若しくは誘導体が、その鎖中のどこかに、「Ｇｌｙ−Ｘ−Ｓｅｒ」モチーフを有する場合、「Ｇｌｙ」を「Ａｓｎ」で置換することにより追加のＮ−グリコシル化部位を作製することができる。上記置換がタンパク質の重要な性質（標的親和性、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）結合など）に影響を及ぼさないことに留意が必要であることはもちろんである。
【００６６】
しかしながら、例外的なＮ−グリコシル化パターンは、一見すると、治療用抗体の発現系としてのテトラヒメナ・サーモフィラの使用を排除する。というのも、そのような異常なグリコシル化パターンは、そうして産生された抗体の免疫適合性に悪影響を及ぼすと当業者には思われるからである。しかしながら、本発明者らは、こうした推定が正しくないことを明らかにした。
【００６７】
さらに、繊毛虫発現系には、哺乳類細胞株のようなその他のタンパク質発現系と比較して他にも利点がある。それらについて以下で議論する。
【００６８】
さらに別の好ましい実施形態においては、上記モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体は、血清半減期が長い。
【００６９】
治療目的で用いられるモノクローナル抗体においては、血清半減期が長くなると投薬量及び／又は投与頻度を減らすのを助長し得るので、血清半減期は重要事項である。モノクローナル抗体は経口投与することはできないため、この事は、低用量のためコストを削減し、かつ投与方法に関連する危険性を最小限にしつつ、患者の服薬遵守の改善を助けるだろう。
【００７０】
血清から溶解したタンパク質を除去する主要な経路は、肝臓にけるアシアロ糖タンパク質受容体媒介クリアランスである。通常、哺乳類タンパク質は、２個以上の末端シアル酸残基（Ｎ−アセチルノイラミン酸）を有する二分岐Ｎ−グリカンでＮ−グリコシル化され、それら末端シアル酸残基はβ−ガラクトース残基で支持されている（図２を参照）。この事は、対象に固有のタンパク質にも、例えば、哺乳細胞株において異種発現され、かつ上記対象に投与されるタンパク質にも当てはまる。
【００７１】
タンパク質の存続期間の中で、末端シアル酸残基は、ガラクトース残基が露出するまで、偏在するノイラミニダーゼにより徐々にグリカン鎖から除去される。これらは、アシアロ糖タンパク質受容体により認識されるが、アシアロ糖タンパク質受容体は、肝臓に豊富に存在するレクチンであって、多くの脱シアル化血漿タンパク質のガラクトース残基と結合する当該レクチンである。当該タンパク質は、認識されると、エンドサイトーシスの対象となり、次いで肝臓で分解されることになる。
【００７２】
上記に示す通り、繊毛虫において異種発現されるタンパク質は、自由に浮遊するノイラミニダーゼにより除去され得る末端シアル酸残基も、アシアロ糖タンパク質受容体の標的となり得るガラクトース残基も有していない。このため、繊毛虫において異種発現されたモノクローナル抗体又はその断片若しくは誘導体は、アシアロ糖タンパク質受容体媒介クリアランスの対象ではなく、したがって、血清半減期が長い。繊毛虫の発現アプローチには、抗体血清半減期を延長するためのその他手法に勝る顕著な利点が複数あるが、その他手法は全て多かれ少なかれ基本の抗体概念の劇的な改変を伴っており、免疫原性等に関する結果を予測するのが難しい。これらの手法について以下に議論する。
【００７３】
米国企業のドマンティス（Domantis）社は、抗体に結合する抗アルブミン・ドメインを用いることにより、血清半減期を延ばそうと試み、一方、ジェネンテック社（Genentech Inc.）はＣＨ2−Ｎ−グリカンのガラクトース含量を増加させるという手法を開発している。ピーディーエル・バイオファーマ社（PDL BioPharma Inc.）は、Ｆｃ領域における幾つかのアミノ酸残基を他のものに置換することにより、血清半減期を延ばすという手法を開発した。また、ＰＥＧ化の概念は、タンパク質の血清半減期を延ばす目的で当業者に周知である。
【００７４】
本発明のさらなる別の好ましい実施形態においては、上記系はさらに、以下を含む。
ｃ）上記核酸分子に作動可能に連結したプロモーター、及び／又は
ｄ）上記核酸分子に作動可能に連結したシグナル配列であって、該シグナル配列は、上記核酸分子によってコードされるモノクローナル抗体又はその断片を細胞外培地に分泌させる原因となる。
【００７５】
本明細書において「作動可能に連結した」という用語は、遺伝子産物をコードし得るヌクレオチド配列が、適切な条件下においてプロモーターが該遺伝子産物の発現を調節するような様式で、該プロモーター及び／又はシグナル配列に連結されていることを意味する。
【００７６】
本明細書において、「プロモーター」という用語は、通常は遺伝子又はｃＤＮＡの上流（センス鎖の５'領域に向かって）に位置する調節領域を指し、当該調節領域は上記遺伝子又はｃＤＮＡの転写を可能とし、或いは増強さえする必須遺伝因子を含有する。
【００７７】
本明細書において、「シグナル配列」という用語は、特定の細胞小器官（核、ミトコンドリア基質、小胞体、葉緑体、アポプラスト、及びペルオキシソームなど）へのタンパク質の輸送を担うオリゴペプチド（「シグナルペプチド」又は「輸送ペプチド」）をコードする核酸配列を指す。小胞体に輸送されるタンパク質はほとんど全てが、Ｎ末端に５から１０個の疎水性アミノ酸からなる配列を有する。こうしたシグナルペプチドは、タンパク質が転写と同時に小胞体内腔に挿入された後、シグナルペプチダーゼによりタンパク質から切断される。その後、ほとんどのタンパク質は、ゴルジ体を介して分泌経路の下流へ輸送される。
【００７８】
繊毛虫において抗体を発現させるのに適したプロモーターは、例えば、ＷＯ２００７／００６８１２Ａ１に開示されているが、この出願も本発明の出願人に対して登録されており、その内容は本願において援用される。その出願には、熱誘導性プロモーター及びメタロチオネイン・プロモーターが開示されているが、それらは本発明の目的にも使用することができる。
【００７９】
適切なシグナル配列は、例えば、ＷＯ０３／０７８５６６Ａ１に開示されているが、この出願も本発明の出願人に対して登録されており、その内容は本願において援用される。その出願には、本発明に関連して特に好ましい２つのシグナルペプチド、いわゆる抗体の重鎖及び軽鎖の内因性シグナルペプチド、並びに繊毛虫リパーゼシグナルペプチドが開示されている。
【００８０】
さらに、繊毛虫宿主細胞の形質移入のためのベクターであって、該ベクターは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体をコードする少なくとも１つの核酸分子を含む、上記ベクターが提供される。
【００８１】
本明細書において、「ベクター」という用語は、外来の遺伝子材料を別の細胞に移すのに用いられる分子ビヒクル(molecular vehicle)を示す。ベクター自身は、一般に、挿入物（目的の配列）と、ベクターの「骨格」となるより大きな配列とからなるＤＮＡ配列である。遺伝情報を別の細胞に移すというベクターの目的は、典型的には、標的細胞において挿入物を単離、増幅、又は発現させることにある。
【００８２】
本明細書において、「プラスミド」という用語は、複製起点（「ＯＲＩ」）により適切な宿主中で自己複製が可能な、プラスミドベクター、すなわち環状ＤＮＡ配列を指す。さらに、プラスミドは、形質転換の成功、又は外来のＤＮＡを細胞及び複数クローニング部位（マルチプル・クローニング・サイト）（挿入物の挿入を可能にする複数の制限酵素コンセンサス部位を含む）に導入することを意図したその他手順の成功を示す選択マーカーを含み得る。クローニングベクター又はドナーベクターと称されるプラスミドベクターは、目的の配列のクローニングするのを容易にし、かつ増幅させるために用いられる。発現ベクター又はアクセプターベクターと称されるプラスミドベクターは、特に、指定された標的細胞で目的の遺伝子を発現させるのに特異的なものである。これらのプラスミドベクターは、一般に、プロモーター、導入遺伝子、及びターミネーター配列からなる発現カセットを示す。発現プラスミドは、異なる宿主細胞において繁殖及びセレクション（選択）を可能にする要素を含有するシャトルプラスミドであり得る。
【００８３】
本発明のさらなる別の実施形態においては、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体の異種発現系であって、当該異種発現系は、本発明による少なくとも２種の繊毛虫宿主細胞の接合により得られた繊毛虫宿主細胞を含む、上記異種発現系が提供される。
【００８４】
繊毛虫は全て、構造的にも機能的にも異なる２種類の核を伴う核の二形性を示す。大きい方の体細胞大核（ＭＡＣ）は、栄養増殖中に活発に発現する。ＭＡＣは、４５本の染色体コピーを含有し、無糸分裂する。小さい方の二倍体小核（ＭＩＣ）は、生殖系列にあり、５対の染色体を含有する。ＭＩＣは有性子孫のための遺伝情報を保有している。栄養期の間は、ＭＩＣは有糸分裂する。繊毛虫の生活環は、生殖系列に関して交互に現れる単相と複相とからなる。細胞の増殖は、全く無性的であり、複相でのみ起こる。
【００８５】
上記の手法は、繊毛虫宿主細胞に特有な特徴、すなわち接合により遺伝物質を交換できるという特徴を利用する。特定の条件下では、繊毛虫は、生活環の有性段階である接合のサイクルに入る。テトラヒメナ属(Tetrahymena)では、例えば、７種の異なる接合型のうちの少なくとも２種にそれぞれ属する細胞を混合し、適度に飢餓状態にすると、細胞の接合を誘導することができる。この有性段階では、２種の細胞は対になって一倍体の配偶子核を交換する。接合で核に起こる事象は、通常、減数分裂、配偶子核形成、受精、及び核の分化を含む。接合は、繊毛虫生活環の唯一の、それもごく短い、単相段階を含み、これに続いて減数分裂が起こり、すぐに受精して終わる。このプロセスは、繊毛虫の大部分で保存されている。
【００８６】
特許請求される手法は、繊毛虫宿主細胞に特有の特徴、即ち接合中の遺伝物質交換という特徴を利用する。接合プロセスの主な段階を図６に示す。
【００８７】
接合開始時には、対になった細胞の小核は、減数分裂して４つの一倍体前核を生成する。これらの一倍体前核のうち３つは破壊され、残った１つが分裂して２つの配偶子核、つまり移動前核（migratory pronucleus）と静止前核（stationary pronucleus）とを形成する。移動前核は、２つの細胞の一時的接合を通じて交換され、その後静止前核と融合して各細胞において接合体核を形成する。
【００８８】
接合体核は２回分裂して４つの遺伝的に同一な核を形成するが、古い大核は退化する。４つの接合体クローン（最初の産物(anterior products)）のうち２つは新たな大核になり、これら新たな大核は、染色体切断、プログラムされたＤＮＡ除去、及びテロメア付加を含む、多様なゲノム再編成を受ける。テトラヒメナ属では、これらのプロセスにより、約３００本の個々の大核染色体が生じる。次いで、各染色体は、４５個のコピーに増幅され、大核ゲノムの生成が完了する。
【００８９】
残る２つの接合体クローンのうち１つは退化すし、もう１つの新たな小核は、最初の無性生殖環の間に有糸分裂する。この分裂で、娘細胞はそれぞれ、１個の小核と１個の大核とを受け取り、栄養成長する繊毛虫細胞で見られる核の正常な相補体を産出する。
【００９０】
接合の原理は、原核生物発現系にも、酵母、昆虫細胞系（バキュロウイルス）、哺ＣＨＯ細胞等の哺乳類発現系、又は形質転換植物若しくは哺乳動物などの大部分のその他真核生物発現系にも存在しない。上記の系によって２種の異なる抗体を発現する細胞の接合を利用して二重特異性又はそれより高次の多重特異性抗体を組換え発現するのに用いられる繊毛虫宿主細胞は、以下、幾つかの必要条件を満たす必要がある。
ａ）少なくとも２種の繊毛虫細胞は、異なる接合型にに由来する必要があること。
ｂ）少なくとも２種の繊毛虫細胞は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体をコードする核酸分子が自身の小核に組み込まれている必要があること。
【００９１】
上記細胞を接合させることによって、両方の核酸分子の組合せを保有する細胞を産生することができ、したがって、例えば両方の抗原特異性を生じる、２種の親抗体の組合せからなる新規モノクローナル抗体、即ち抗体構築物、又はその断片若しくは誘導体を産生することが出来る。
【００９２】
以下の表は、本発明の範囲内となる、幾つかの想定される組合せについての概要を示す。モノクローナル抗体をコードする核酸をそれぞれ保有する２種の宿主細胞の接合により得られる、可能な組合せに係る抗体又はその断片若しくは誘導体を示す。このリストは、本発明の範囲を制限するものとして解釈してはならない。
【００９３】
【表２】
【００９４】
本発明の別の実施形態においては、本発明による少なくとも１種のベクターにより形質移入されたものであるか、又は本発明の少なくとも２種の繊毛虫宿主細胞の接合により得られたものである、繊毛虫宿主細胞が提供される。
【００９５】
さらに、本発明の別の実施形態によれば、本発明による少なくとも２種の繊毛虫宿主細胞又は本発明による少なくとも２種の発現系を含むライブラリであって、各宿主細胞には、抗体又はその断片若しくは誘導体をコードする少なくとも１種の異種核酸分子が、好ましくはベクターの形態で組み込まれており、かつ少なくとも２種の繊毛虫が、それらが互いに接合できるように選択される、上記ライブラリが提供される。
【００９６】
そのようなライブラリは、例えば、所定の標的（例えば表１〜３を参照）に対して特異的な抗体又はその断片若しくは誘導体（以下を参照）をコードする核酸分子をそれぞれ保有する安定に形質移入された繊毛虫宿主細胞を含む。所定の抗体又はその断片若しくは誘導体をコードすべきそれぞれの核酸について、少なくとも２種、好ましくはそれより多くの異なる種類の接合型の宿主細胞が利用可能とするべきである。二重特異性抗体構築物を構築しようとする場合、該構築物に必要な２種の抗体又はその断片若しくは誘導体をコードする核酸分子を保有する２種の宿主細胞がライブラリから選択され得る。上記宿主細胞は、接合させることを目的として、異なる接合型に由来するものであるべきである。
【００９７】
本発明による発現系、又は本発明による繊毛虫宿主細胞の好ましい実施形態においては、上記繊毛虫はテトラヒメナ科(Tetrahymenidae)に属するものである。
【００９８】
特に好ましい実施形態においては、上記遺伝子組換え繊毛虫はテトラヒメナ種(Tetrahymena sp.)（特にテトラヒメナ・サーモフィラ:Tetrahymena thermophila）である。テトラヒメナ属は、幾つかの研究室で発現宿主として確立されている、非病原性単細胞真核微生物である。テトラヒメナ属は、異種タンパク質発現に適したものとする、多数の利点を特徴としている。テトラヒメナ属は、幅広く調査されているモデル生物であり、５０年にわたる基礎研究において、ウイルス又は内部寄生体は全く観察されていない。指標細胞株を用いた調査から、ウイルスやマイコプラズマのような高等動物に感染可能な内在性感染因子は示されていない。
【００９９】
まず、繊毛虫におけるコドン使用頻度に関連する上記の考察は、テトラヒメナ属にも同様に当てはまる。さらに、テトラヒメナ属では、ミニ染色体ｒＤＮＡ由来の複製起点（ｏｒｉ）を含有するハイコピープラスミドが利用可能である。このミニ染色体ｒＤＮＡは、細胞１個あたり最大で９、０００個のコピーで存在する。その上、大核ＤＮＡへの安定な組込みが生じ得、その場合、全ての遺伝子が４５倍のコピー数で存在する。高い遺伝子量は、効率的なタンパク質生合成、つまり高い生産性に理想的な前提条件である。細菌とは対照的に、テトラヒメナ属の繊毛虫は、生物学的にタンパク質を上清に非常に効率的に分泌する。
【０１００】
テトラヒメナ属は、ジスルフィド架橋、ＧＰＩアンカー、リン酸化、アセチル化、及びグリコシル化等の翻訳後修飾をタンパク質に加えることが出来、このような翻訳語修飾は、酵母又はその他真核生物発現系で検出されるものよりも哺乳類細胞で検出されるものに類似する。
【０１０１】
哺乳細胞とは異なり、テトラヒメナ属は、世代交代時間が短く（１．５〜３時間）増殖しやすいことと、既知組成培地が使用可能であり成長因子等のペプチド又は血清成分が不要であることからコストが削減されることとを兼ね備えている。
【０１０２】
細胞密度が最大で２×１０7個／ｍＬ及び乾燥重量が最大で８０ｇ／Ｌまで、テトラヒメナをバッチ発酵、流加発酵(fed-batch)、及び連続発酵する方法はいずれも確立されており、製造規模拡大（スールアップ）は最大で１０００Ｌまで問題なく可能であることが実証されている。レポータータンパク質を用いた実施可能性試験では、１日あたり５０〜９０ｐｇ／細胞の空時収量が既に達成されている。同種発現での最初の実験では、１日あたり２００ｍｇ／Ｌを超える収量で分泌タンパク質が得られた。テトラヒメナ属は、微生物発現系（細菌又は酵母）用の従来の生産設備で発酵させることが出来る。この事は、既存の製造プラントに費用のかかる改良を施すことも生産設備の新規建設も必要ないことを意味する。
【０１０３】
本発明の別の好ましい実施形態においては、本発明による発現系で、本発明による繊毛虫宿主細胞で、及び／又は本発明による方法で製造されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体が提供される。
【０１０４】
好ましくは、本発明によるモノクローナル抗体又はその断片若しくは誘導体は、表１（ＡＤＣＣ）又は表３（非ＡＤＣＣ）に記載の標的の少なくとも１つに結合する。
【０１０５】
ＡＤＣＣに関与しない標的が以下の表に記載されているが、この表は例示にすぎず、本発明の範囲を制限するものとして理解してはならない。
【０１０６】
【表３】
【０１０７】
繰り返しになるが、当業者は、上記抗体の製造プロトコル及びアミノ酸配列を全て入手できること、及び従って本発明の教示を、例えば上記抗体の血清半減期を向上させる目的で、上記抗体全てに適用できることを理解することが重要である。
【０１０８】
さらに、本発明によるモノクローナル抗体又はその断片若しくは誘導体は、以下からなる群から選択される：
・マウスｍＡｂ、キメラｍＡｂ、ヒト化ｍＡｂ及び／又はヒトｍＡｂ、
・ＩｇＧ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ及び／又はＦ（ａｂ）２、
・修飾抗体形式。
【０１０９】
キメラｍＡｂ、ヒト化ｍＡｂ及び／又はヒトｍＡｂの製造及び／又は選択のための方法は、当該分野で既知である。例えば、ジェネンテック（Genentech）社の米国特許第６３３１４１５号は、キメラ抗体の産生について記載しており、メディカル・リサーチ・カウンシル（Medical Research Council）の米国特許第６５４８６４０号は、ＣＤＲグラフト移植法(CDR grafting techniques)を記載しており、セルテック（Celltech）社の米国特許第５８５９２０５号は、ヒト化抗体の産生について記載している。インビトロ抗体ライブラリについては、特に、モーフォシス(MorphoSys)の米国特許第６３０００６４号、及びエムアールシー（MRC）/スクリップス(Scripps)/ストラタジーン(Stratagene)の米国特許第６２４８５１６号に開示されている。ファージディスプレイ法は、例えば、ディアックス(Dyax)社の米国特許第５２２３４０９号に開示されている。遺伝子組換え哺乳動物のプラットフォームは、例えば、タコニック・アルテミス(Taconic Artemis)社の米国特許公開公報第２００３０２０４８６２１号に開示されている。
【０１１０】
ＩｇＧ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ及び／又はＦ（ａｂ）２は、当業者に周知の抗体形式である。実施可能とする関連技術は、各教科書から利用可能である。
【０１１１】
本明細書において、「Ｆａｂ」という用語は、抗原結合領域を含むＩｇＧ断片であって、抗体の各重鎖及び各軽鎖に由来する一の定常領域並びに位置の可変領域から成る当該断片に関連するものである。
【０１１２】
本明細書において、「Ｆ（ａｂ）２」という用語は、ジスルフィド結合により互いに連結した２つのＦａｂ断片からなるＩｇＧ断片に関連するものである。
【０１１３】
本明細書において、「ｓｃＦｖ」という用語は、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖それぞれの可変領域が短いリンカー（通常はセリン（Ｓ）又はグリシン（Ｇ））で互いに連結された融合物である、一本鎖可変断片に関連するものである。このキメラ分子は、定常領域が除去され、かつリンカーペプチドが導入されているにもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持している。
【０１１４】
修飾された抗体形式とは、例えば、（例えば、表２に示されるような）二重又は三重特異性抗体構築物、抗体に基づく融合タンパク質、抗体薬物複合体、免疫毒素等である。こうした抗体形式についていくつか以下の表に示すが、この表は本発明の範囲を制限するものとして理解してはならない。
【０１１５】
【表４】
【０１１６】
他の好ましい実施形態においては、本発明によるモノクローナル抗体又は断片若しくは誘導体は、以下かなる群から選択される少なくとも１つの特徴を有する：
・ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、及び／又は抗体依存性アポトーシスの増強、
・血清半減期の延長、及び／又は
・二重特異性、三重特異性、又は多重特異性。
【０１１７】
本明細書において、「ＡＤＣＣの増強」、「ＣＤＣの増強」、「抗体依存性アポトーシスの増強」、「抗体依存性オプソニン化の増強」、及び「血清半減期の延長」という用語は、従来の抗体発現系、例えば、哺乳細胞又はエシェリキア・コリ（大腸菌）で産生された抗体との比較に関連するものである。ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、抗体依存性アポトーシス、及び血清半減期は、市販の試験法で測定することが出来る。
【０１１８】
「二重特異性」、「三重特異性」、又は「多重特異性」という用語は、好ましくは少なくとも２種の異なる標的の、少なくとも２種の異なるエピトープに対して親和性を示す少なくとも２種の領域を有する抗体又はその断片若しくは誘導体を示す。そのような抗体又はその断片若しくは誘導体について例をいくつか表２及び図４に示す。
【０１１９】
そのような抗体又はその断片若しくは誘導体の目的は、２種以上の異なる要素を、いわゆる二重又はそれより高次の多重特異性抗体構築物を用いて、近接させることである。この事は、例えば腫瘍細胞のＭＨＣクラスＩ要素が変異又は喪失することによって、或いは腫瘍細胞がＴ細胞活性化を抑制するメッセンジャー物質を分泌することによって、Ｔ細胞の攻撃を逃れ得る場合に、腫瘍細胞にＴ細胞を再び向けさせるのに有用である。１つの手法として、Ｔ細胞受容体（例えばＣＤ３）に対するｓｃＦｖ抗体、及び腫瘍細胞抗原（例えばＥＧＦＲ）に対するｓｃＦｖ抗体の２つを組合せる手法がある。
【０１２０】
別の手法は、両方のＦｖ鎖それぞれにある２つの異なる相補性決定領域を用いてＦｃ領域により、腫瘍細胞（例えば、ＥＧＦＲに結合するＦｖを用いて）、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ３などのＴ細胞受容体に結合する別のＦｖを用いて）、及びエフェクター細胞、例えば、単球、マクロファージ、又はナチュラルキラー細胞（そのようなエフェクター細胞上にあるＦｃγ受容体により検出されるＦｃ領域を用いて）を連結させることである。この手法は、Ｔキラー細胞の抗腫瘍効果（腫瘍細胞の溶解及びアポトーシスを誘導する）と、エフェクター細胞の抗腫瘍効果（貪食又はアポトーシスにより腫瘍細胞を除去しながら、サイトカインを放出してＴ細胞の活性をさらに刺激する）を共にもたらす。
【０１２１】
以下の表に、二重特異性抗体（１列目及び２列目）及び三重特異性抗体（３列全て）における標的について幾つかの例の概要を示すが、この表は本発明の範囲を制限するものとして理解してはならない。その他の適切な標的エピトープは表１にまとめる。
【０１２２】
【表５】
【０１２３】
二重特異性抗体の幾つかの特徴について、可能性のある形式並びに標的も含めて、クーファー（Kufer）ら(2004)で検討されており、三重特異性抗体の特徴については、可能性のある形式並びに標的も含めて、例えば、ラフ及びリンドホーファー(Ruf and Lindhofer)(2001)で検討されている。
【０１２４】
さらに、繊毛虫宿主細胞において、少なくとも１種のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体を製造するための方法であって、以下の工程を含む、当該方法が提供される：
ａ）上記モノクローナル抗体又はその断片若しくは誘導体をコードする少なくとも１種の核酸分子を用いて、又は好ましくは本発明による少なくとも１種のベクターを用いて、少なくとも１種の繊毛虫宿主細胞を形質移入する工程、及び
ｂ）タンパク質の発現を可能にする条件下で上記宿主細胞を培養する工程。
【０１２５】
本発明の別の好ましい実施形態においては、繊毛虫宿主細胞において、少なくとも１種のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体を製造するための方法であって、以下の工程を含む当該方法が提供される：
ｃ）抗体又はその断片若しくは誘導体をコードする少なくとも１種の核酸分子を用いて、又は好ましくは本発明による少なくとも１種のベクターを用いて、少なくとも２種の異なる繊毛虫宿主細胞を形質移入する工程、
ｄ）上記２種の繊毛虫宿主細胞又はその子孫を接合させ、少なくとも２種の異なる抗体又はその断片若しくは誘導体をコードする、少なくとも２種の異なる核酸分子を保有する少なくとも１種の繊毛虫細胞を取得する工程、並びに
ｅ）上記の如く製造された繊毛虫細胞をタンパク質の発現を可能にする条件下で培養する工程。
【０１２６】
さらに、医薬組成物を製造するための方法であって、以下の工程を含む当該方法が提供される：
ａ）本発明による繊毛虫発現系において、本発明の抗体又はその断片若しくは誘導体タンパク質を発現させる工程、並びに
ｂ）上記の如く得られたタンパク質を単離及び／又は精製する工程。
【０１２７】
さらに、本発明による、及び／又は本発明による方法で製造された、抗体又はその断片若しくは誘導体を含む、医薬組成物が提供される。
【０１２８】
注意事項
過度に明細書を長文化することなく包括的な開示を提供するため、本出願人は、上記に参照される特許及び特許出願のそれぞれを本明細書において援用する。
上記の詳細な実施形態における構成要素及び特徴の具体的な組み合わせは例示にすぎない。即ち、本明細書における教示における相互の置換、並びに本明細書における教示と援用される特許／出願におけるその他教示との置換も、明確に意図されている。当業者が認識する通り、当業者は、特許請求される発明の要旨及び範囲から逸脱すること無く、本明細書に記載されるものの変形、修正、及びその他実施形態を想起し得る。従って、上記の説明は例示にすぎず、限定することを意図したものではない。本発明の範囲は、以下の請求項及びその均等範囲において定義される。さらに、説明及び請求項で使用される参照記号は、特許請求される発明の範囲を限定するものではない。
【０１２９】
実施例及び図面の簡単な説明
本発明の対象のさらなる詳細、特徴、特性、及び利点は、従属請求項、並びに以下に記載する図及び実施例のそれぞれに開示される。図及び実施例は、例示として、本発明の好適な実施形態を示す。しかしながら、これらの図面は、本発明の範囲を制限するものとしては決して理解されてはならない。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】図１は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の模式図を示す。
【図２】図２は、様々な分類群のＮ−グリカン構造の概要を示す。
【図３】図３は、ＩｇＧ並びにその断片及び誘導体の模式図を示す。
【図４】図４は、二重特異性及び三重特異性を作り出すことができる、抗体及び抗体断片の想定される組合せ模式図を示す。
【図５】図５Ａは、１つのプラスミド手法を表すものとして、繊毛虫テトラヒメナ・サーモフィラにおいて用いるための、抗体の重鎖と軽鎖とをコードする発現プラスミドを示す。図５Ｂ及び図５Ｃには、２つのプラスミド手法を表すものとして、繊毛虫テトラヒメナ・サーモフィラにおいて用いるための各発現プラスミドが示されている。
【図６】図６は、テトラヒメナ接合の各段階の概要を模式的に示す。
【図７】図７は、１つのエピソームプラスミドと、１つの組込み型発現プラスミドを用いたテトラヒメナ細胞の形質転換の模式図を示す。
【図８】図８は、テトラヒメナ・サーモフィラ(Tetrahymena thermophile)細胞において発現される抗ＣＤ４抗体Ｇｋ１．５及びその断片の代表的な免疫ブロットを示す。
【図９】図９は、テトラヒメナ・サーモフィラ(Tetrahymena thermophile)とホモ・サピエンス(Homo sapiens)との間においけるコドン使用頻度の比較を示す。
【図１０】図１０は、繊毛虫、特にテトラヒメナ属において用いられる遺伝コードを示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１３１】
１．発現ベクターの構築
抗体Ｇｋ１．５の重鎖及び軽鎖それぞれの合成遺伝子（配列番号１及び配列番号２を参照）をドナーベクターにクローニングした。Ｃｒｅ（クレ）依存性リコンビナーゼ・システムを用いて、全てのドナーベクターからの発現カセットをアクセプターベクターに移した（図５を参照）。
【０１３２】
２．野生型テトラヒメナの培養及び発現プラスミドによる形質転換
野生型テトラヒメナ・サーモフィラ株（例えば、Ｂ１８６８／４、Ｂ１８６８／７、及びＢ２０６８／１）を、脱脂乳培地、ＳＰＰ、又は既知組成培地で培養した。テトラヒメナ・サーモフィラ細胞の形質転換は、キャシディー・ハンリー(Cassidy-Hanley)ら、1997に既に記載される通り実施した。
【０１３３】
３．抗体Ｇｋ１．５の検出
形質転換したテトラヒメナ細胞は、震盪機において８０ｒｐｍで、３０℃の選択圧下で、ＳＰＰ培地で培養した。標的遺伝子発現は、対数増殖中の培養物に、４１℃で熱ショックを与える（ＨＳＰ−Ｐ）ことにより、又は２０ｎＭのＣｄ2+を添加する（ＭＴＴ１−Ｐ）ことにより誘導した。
【０１３４】
標的遺伝子発現を誘導してから２４時間後に、培養物のアリコートを採取した。その後、細胞及び細胞を含まない上清をそれぞれ得た。細胞を、氷冷したＲＩＰＡバッファーに溶解（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＳＤＳ、０．１％のＤＯＣ、１％のトリトンＸ１００、及び２．５μｇ／ｍｌのＥ６４、ｐＨ７．４に、５０００個細胞／μL）して、超音波処理機中で１５分間インキュベートした。常法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット解析を行った。簡単に説明すると、破壊した細胞（すなわち１００００個）又は細胞を含まない上清の何れかのアリコートを、ラエムリ（Laemmli）試料バッファー（１２５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％グリセロール、４％ＳＤＳ）に添加し、８〜１６％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。分離したタンパク質をニトロセルロース膜に移し、０．０５％のツイーン(Ｔｗｅｅｎ)２０及び５％のウシ血清アルブミン（ＰＢＳ／ＴＢＳＡ）を含有するＰＢＳでブロッキングした。形質転換した繊毛虫での抗体の組換え重鎖及び軽鎖の発現は、Ｈｒｐ結合抗ラット全ＩｇＧ抗体で検出した。洗浄後、スーパー・シグナル・ウェストピコ・ケモルミネセント・サブストレート(Super Signal West Pico Chemoluminescent Substrate)（ペルビオ(Perbio)、フィッシャー・サイエンティフィック(Fischer Scientific))を用いた化学発光に従来のＸ線フィルム現像を組み合わせてブロットを現像した。図８に、標的遺伝子発現を誘導した後各時間における形質転換細胞について細胞溶解物及び上清のウエスタンブロットを示す。
【０１３５】
４．抗体Ｇｋ１．５の製造
発酵には、標準的なマリーンインペラー(marine impellers)を備えたシックス・フォース・マルチ発酵槽（Sixforce multifermenter）（０．５リットル）を用いた。撹拌速度は９００ｒｐｍに制限した。ｐＯ２を２５％に設定し、かつｐＨは７．０に設定した。発酵は標準的な培地で実施した。
【０１３６】
図
図１は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の模式図を示す。ＩｇＧは、２本の同一の軽鎖（それぞれが、２つの領域、ＶLとＶHとからなる）と、２本の同一の重鎖（それぞれが、４つの領域、ＶH、ＣH１、ＣH２、及びＣH３からなる）とからなる。抗原結合表面は、重鎖及び軽鎖の可変領域により形成され、エフェクター機能（補体活性化及び細胞障害性細胞の結合など）は、抗体のＶｃ領域が媒介する。
【０１３７】
図２は、様々な分類群のＮ−グリカン構造の概要を示す。一般に、「Ｎ−グリコシル化」という用語は、アミノ酸残基アスパラギン（Ｎ）のグリコシル化を示す。ここでは、オリゴ糖鎖が、オリゴサッカリルトランスフェラーゼにより、トリペプチド配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（式中、ＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸であり得る）に現れるアスパラギン残基に結合される。原核生物は全くＮ−グリコシル化を有しないのに対し、繊毛虫類は、フコース側鎖を欠き、かつ、β−ガラクトース残基で支持される末端シアル酸残基（ｎ−アセチルノイラミン酸）も欠く、Ｎ−グリカン構造を特徴とすることは明らかである。図２ｂは、幾つかの繊毛虫種で上記パターンにおいて見込まれるバリエーションを示す。
【０１３８】
図３は、ＩｇＧ並びにその断片及び誘導体の模式図を示す。図３Ａは、全長ＩｇＧ抗体を示す。図３ＢにはＦ（ａｂ）2断片が、図３ＣにはＦａｂ断片が示されている（Ｆｃ断片の除去）。遺伝子操作されたロイシン・ジッパーを含んでいることにより、会合して二量体になることができる。組換え技術を用いることにより、より小さな抗体断片を生成することができる。一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ、図３Ｅ）は、ＶL領域とＶH領域とをフレキシブルな合成リンカー配列により繋いで組合せている。リンカー配列を短くすれば、二重特異性抗体（ダイアボディ；diabodies）（図３Ｆ）、及び三重特異性抗体（トライアボディ；triabodies）（図３Ｇ）、或いは四重特異性抗体（テトラボディ；tetrabodies）（不図示）さえも形成される。ｓｃＦｖ断片をさらに改変して、抗体の定常領域（ＣH３領域など）を含むようにすると、ミニボディ（minibodies）が作製される（図３Ｄ）。
【０１３９】
図４は、二重特異性及び三重特異性を作り出すことができる、抗体及び抗体断片の想定される組合せ模式図を示す。安定に形質移入されたテトラヒメナ細胞を接合させることにより、２種の異なる抗体（例えば、抗体ＡとＢ）を組合せると、図４Ａに示すとおり、複数種の想定される二重特異性抗体となる。図４Ｂには、様々な二重特異性Ｆ（ａｂ）2及び三重特異性Ｆ（ａｂ）2並びに二重特異性抗体及びミニボディとなる、抗体断片の想定される組合せが示されている。図４Ｃには、様々な三重以上の多重特異性抗体及び抗体断片となる、抗体（例えば抗体Ｃ）又は抗体断片と二重特異性抗体又は抗体断片との想定される組合せであって、安定に形質移入されたテトラヒメナ細胞を接合させることにより得られる組合せが示されている。
【０１４０】
図５Ａは、１つのプラスミド手法を表すものとして、繊毛虫テトラヒメナ・サーモフィラにおいて用いるための、抗体の重鎖と軽鎖とをコードする発現プラスミドを示す。このプラスミドは、大腸菌で選抜するためのアンピシリン耐性遺伝子（ＡｍｐＲ）及びクロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣｍＲ）と、テトラヒメナ・サーモフィラにおいてプラスミドを安定させるためのテトラヒメナ・サーモフィラ特異的複製起点（ｒＤＮＡ ｏｒｉ）と、形質転換された繊毛虫を同定するためのネオマイシンに基づく選抜カセット（ＮｅｏＲ）と、誘導性プロモーターの制御下にあり、かつ後ろにテトラヒメナ・サーモフィラのβ‐チューブリン‐２‐ターミネーター配列（ＢＴＵ２）が続く、標的遺伝子の２つのオープン・リーディング・フレーム（重鎖及び軽鎖）とを含有する。
【０１４１】
図５Ｂ及び図５Ｃには、２つのプラスミド手法を表すものとして、繊毛虫テトラヒメナ・サーモフィラにおいて用いるための各発現プラスミドが示されている。図５Ｂでは、プラスミドは、異種遺伝子の定方向組込みのためのテトラヒメナ遺伝子ＤＨＦＲの５'隣接領域と３'隣接領域と、大腸菌における選抜のためのアンピシリン耐性遺伝子（ＡｍｐＲ）及びクロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣｍＲ）と、形質転換された繊毛虫を同定するためのブラストサイジンＳ選抜カセット（ＢｓｄＲ）と、誘導性プロモーターの制御下にあり、かつ後ろにテトラヒメナ・サーモフィラのβ‐チューブリン‐２‐ターミネーター配列（ＢＴＵ２）が続く、所望の抗体の重鎖又は軽鎖の何れかのオープン・リーディング・フレームとを含有する。図５Ｃでは、抗体の対応する重鎖又は軽鎖をコードし、かつ図５Ａに記載されるものと同様の特徴を含む発現プラスミドが示されている。
【０１４２】
図６は、テトラヒメナ接合の各段階の概要を模式的に示す。接合プロセスは、一の遺伝子座において交互する対立遺伝子についてホモ接合性である細胞同士の対合により開始する。ＭＩＣ（小さい円）は、ＭＡＣ（大きな円）内に収まっているが、ＭＡＣと物理的に分離している。ＭＩＣは、減数分裂して４つの１倍性核を生じるが、そのうちの１つだけが機能を維持し（最初の減数分裂産物）、その他の３つは分解する。この段階で、減数分裂乗換えが起こり、その後、移動前核の相互交換が続き、移動前核は、受取側の細胞の静止前核と融合して、接合体核を形成する。接合体核は２回有糸分裂して、４つの別々の遺伝的に同一な二倍体核をもたらす。この段階で、古いＭＡＣは退化する。次いで、前の産物は分化して新しいＭＡＣとなるが、後の産物は二倍体ＭＩＣのままである。細胞は、分離し（今や接合完了体と呼ばれる）、最初の接合後細胞分裂を行い、４個のカリオナイド（karyonide）細胞を形成する。各カリオナイドは、独立して分化した新しいＭＡＣ及び機能性ＭＩＣの有糸分裂コピーを受けとる。それからカリオナイドは二分裂による栄養増殖を開始する。
【０１４３】
図７は、１つのエピソームプラスミドと、１つの組込み型発現プラスミドを用いたテトラヒメナ細胞の形質転換の模式図を示す。この２つのプラスミドを用いる手法は、全ＩｇＧを産生し、かつチミジン要求性を示す、安定形質移入テトラヒメナ細胞をもたらす。
【０１４４】
図８は、テトラヒメナ・サーモフィラ(Tetrahymena thermophile)細胞において発現される抗ＣＤ４抗体Ｇｋ１．５及びその断片の代表的な免疫ブロットを示す。図８Ａには、細胞ペレットにおける、並びに安定形質転換細胞の上清における、Ｇｋ１．５及びその断片の発現が、組換えタンパク質発現の誘導（ｐ．ｉ．）後、異なる時間について示されており、当該細胞は、マルチ発酵槽（０．５Ｌ、実験室規模）で培養した。イー・バイオサイエンス社（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）製の抗ＣＤ４抗体クローンＧｋ１．５を陽性対照として用いた。染色は、Ｈｒｐ結合抗ラットＩｇＧを用いて行った。図８Ｂには、タンパク質Ｇカラムを用いて、生成した上清を精製した後のテトラヒメナで発現された抗体Ｇｋ１．５及びその断片の代表的な免疫ブロットを示す。
【０１４５】
図９は、テトラヒメナ・サーモフィラ(Tetrahymena thermophile)とホモ・サピエンス(Homo sapiens)との間においけるコドン使用頻度の比較を示す。ホモ・サピエンスのものは、哺乳類細胞株で発現されるモノクローナル抗体又はその断片若しくは誘導体に応用できる。さらなる説明については本文を参照のこと。
【０１４６】
図１０は、繊毛虫、特にテトラヒメナ属において用いられる遺伝コードを示す。グルタミンをコードする、非標準ヌクレオチドコードであるＵＡＡ及びＵＡＧは太字で示してある。しかしながら、一般的な遺伝コードによれば、これらのトリプレットは終止コドンである（取消し線の引かれたトリプレットを参照）。「１ＬＣ」は「１文字コード」を表し、「３ＬＣ」は「３文字コード」を表す。
【０１４７】
参考文献
トンドラビ・エムエム(Tondravi,MM);ヤオ・エム−シー（Yao,M-C）(1986):リボソームＲＮＡ遺伝子のマイクロインジェクションによるテトラヒメナ・サーモフィラの形質転換(Transformation of Tetrahymena thermophila by microinjection of ribosomal RNA genes.) 米国科学アカデミー紀要(PNAS)83, 4369-4373.
【０１４８】
ガートリグ・ジェー(Gaertig,J);ゴロフスキー・エムエー(Gorovsky,MA)(1992):接合固体のエレクトロポレーションによるテトラヒメナ・サーモフィラの効率的な大量形質転換( Efficient mass transformation of Tetrahymena thermophila by electroporation of conjugants.)米国科学アカデミー紀要(PNAS)89, 9196-9200.
【０１４９】
キャシディ‐ハンリー・ディー（Cassidy-Hanley,D）;ボーウェン・ジェー（Bowen,J）;リー・ジェーエイチ（Lee,JH）;コール・イー（Cole,E）; バープランク・エルエー(VerPlank、LA); ガートリグ・ジェー(Gaertig,J); ゴロフスキー・エムエー(Gorovsky,MA);バーンズ・ピージェー（Bruns,PJ）(1997):パーティクル・ボンバードメントによる接合テトラヒメナ・サーモフィラの生殖細胞及び体細胞形質転換(Germline and somatic transformation of mating Tetrahymena thermophila by particle bombardment.)ジェネティクス(Genetics)146, 135-147.
【０１５０】
クーファー・ピー(Kufer,P);ラッタービューズ・アール(Lutterbuse,R);バエウーレ・ピーエー(Baeuerle,PA)(2004):二重特異性抗体のリバイバル（A revival of bispecific antibodies.）トレンズ・イン・バイオテクノロジー(Trends in Biotechnology),第２２巻(Volume 22),イシュー５（Issue 5）, 238-244,2004年５月１日(1 May 2004)
【０１５１】
ラフ・ピー(Ruf,P);リンドホーファー・エイチ(Lindhofer,H)(2001):三機能性二重特異性抗体による長期間持続抗腫瘍免疫性の導入(Induction of a long-lasting antitumor immunity by a trifunctional bispecific Antibody.)ブラッド(Blood),2001年10月15日(15 October 2001),第98巻(Vol. 98), 第８号(No. 8), pp.2526-2534
【０１５２】
シールズ・アールエル(Shields,RL)ら(2002):ヒトＩｇＧ１Ｎ結合型オリゴ糖のフコース欠如はヒトFc RIII及び抗体依存性細胞障害性を向上させる(Lack of Fucose on Human IgGl N-Linked Oligosaccharide Improves Binding to Human Fc RIII and Antibody-dependent Cellular Toxicity.)ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J Biol Chem)第277巻(Vol. 277),第３０号(No. 30), pp. 26733-26740
【０１５３】
ウェイ・ワイ(Wei,Y)ら (2008)酵母発現とインビトロ化学酵素グリコシル化の組合せを介したヒトIgG1‐Fcの糖工学(Glyco-engineering of human IgGl-Fc through combined yeast expression and in vitro chemo enzymatic glycosylation.)バイオケミストリー(Biochemistry)30; 47(39): 10294
【０１５４】
ジャーングロス(Gerngross)(2004):酵母及び糸状菌における治療効果のあるヒト蛋白質の製造における進歩（Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi.）ネイチャー・バイオテクノロジー(Nature Biotechnology)22 (11), 1409
【０１５５】
ウェイデ・ティー(Weide, T.);ボッカウ・ユー（Bockau, U.）;レイブ・エー(Rave, A.);ハーマン・エル(Herrmann, L.)及びハートマン・エム・ダブリュ・ダブリュ(Hartmann, M. W. W.):リコンビナーゼ・システムは繊毛虫テトラヒメナ・サーモフィラにおける発現カセットのクローニングを容易にする。（A recombinase system facilitates cloning of expression cassettes in the ciliate Tetrahymena thermophila.）ビー・エム・シー・マイクロバイオロジー(BMC Microbiol),第７巻（Vol. 7）, pp. 12, 2007
【０１５６】
ウェイデ・ティー(Weide, T.);ハーマン・エル(Herrmann, L.);ボッカウ・ユー(Bockau, U.);ニエバー・エヌ(Niebur, N.);アルダグ・アイ(Aldag, I.);ラロイ・ダブリュ(Laroy, W.);コントリラス・アール(Contreras, R.);ティートケ・エー(Tiedtke, A.)及びハートマン・エム・ダブリュ・ダブリュ(Hartmann, M. W. W.):テトラヒメナ・サーモフィラによる機能性ヒト酵素の分泌(Secretion of functional human enzymes by Tetrahymena thermophila.) ビー・エム・シー・バイオテクノロジー(BMC Biotechnol),第６巻(Vol. 6), pp. 19, 2006
【０１５７】
バンノ・ワイ(Banno, Y.),ヤノ・ケー(Yano, K.)及びノザワ・ワイ(Nozawa, Y.):テトラヒメナ・ピリフォルミス由来の分泌プロテアーゼの精製及び特性評価(Purification and characterization of a secreted protease from Tetrahymena pyriformis.)ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(Eur J Biochem),第１３２巻（Vol. 132）(3), pp. 563-8, 1983
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体の異種発現系であって、以下を含む、上記異種発現系：
ａ）少なくとも１種の繊毛虫宿主細胞、及び
ｂ）上記繊毛虫宿主細胞に組み込まれる少なくとも１種の異種核酸分子であって、上記モノクローナル抗体又はその断片若しくは誘導体をコードする上記異種核酸分子。
【請求項２】
上記モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体が、本質的にフコースを含まないＮ−グリカン構造を有する、請求項１に記載の異種発現系。
【請求項３】
上記モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体が、以下から成る群から選択される少なくとも１つの効果を有する、請求項１又は２に記載の異種発現系：
・抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）の増強
・補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）の増強
・抗体依存性アポトーシスの増強、及び／又は
・抗体依存性オプソニン作用の増強。
【請求項４】
上記モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体の血清半減期が延長されている、請求項１から３の何れか１項に記載の異種発現系。
【請求項５】
上記異種発現系が、以下をさらに含む、請求項１から４の何れか１項に記載の異種発現系：
ｃ）上記核酸分子に作動可能に連結したプロモーター、及び／又は
ｄ）上記核酸分子に作動可能に連結したシグナル配列であって、該シグナル配列は、上記核酸分子によってコードされるモノクローナル抗体又はその断片を細胞外培地に分泌させる原因となる、上記シグナル配列。
【請求項６】
繊毛虫宿主細胞の形質移入のためのベクターであって、該ベクターは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体をコードする少なくとも１つの核酸分子を含む、上記ベクター。
【請求項７】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体の異種発現系であって、当該異種発現系は、請求項１に記載の少なくとも２種の繊毛虫宿主細胞の接合により得られた繊毛虫宿主細胞を含む、上記異種発現系。
【請求項８】
請求項７に記載の少なくとも１種のベクターにより形質移入されたものであるか、又は請求項１に記載の少なくとも２種の繊毛虫宿主細胞の接合により得られたものである、繊毛虫宿主細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の少なくとも２種の繊毛虫宿主細胞又は請求項７に記載の少なくとも２種の異種発現系を含むライブラリであって、各宿主細胞には、抗体又はその断片若しくは誘導体をコードする少なくとも１つの異種核酸分子が、好ましくはベクターの形態で組み込まれており、かつ少なくとも２種の繊毛虫が、それらが互いに接合できるように選択される、上記ライブラリ。
【請求項１０】
上記繊毛虫が、テトラヒメナ科（Tetrahymenidae）に属するものである、請求項１から５及び７の何れか１項に記載の異種発現系又は請求項８に記載の繊毛虫宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１から５及び７の何れか１項に記載の異種発現系、請求項８に記載の繊毛虫宿主細胞、及び／又は請求項１５から１７の何れか１項に記載の方法により製造されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体。
【請求項１２】
表１（ＡＤＣＣ）又は表３（非ＡＤＣＣ）に記載の標的の少なくとも１つに結合する、請求項１１に記載のモノクローナル抗体又はその断片若しくは誘導体。
【請求項１３】
以下からなる群から選択される、請求項１１又は１２に記載のモノクローナル抗体又はその断片若しくは誘導体：
・マウスｍＡｂ、キメラｍＡｂ、ヒト化ｍＡｂ、及び／又はヒトｍＡｂ、
・ＩｇＧ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、及び／又はＦ（ａｂ）２、及び／又は
・修飾抗体形式。
【請求項１４】
以下からなる群から選択される少なくとも１つの特徴を有する、請求項１１から１３に記載のモノクローナル抗体又はその断片若しくは誘導体：
・ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、及び／又は抗体依存性アポトーシスの増強、
・血清半減期の延長、及び／又は
・二重特異性、三重特異性、又は多重特異性。
【請求項１５】
繊毛虫宿主細胞において、少なくとも１種のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体を製造するための方法であって、以下の工程を含む、上記方法：
ａ）上記モノクローナル抗体又はその断片若しくは誘導体をコードする少なくとも１種の核酸分子を用いて、又は好ましくは請求項６に記載の少なくとも１種のベクターを用いて、少なくとも１種の繊毛虫宿主細胞を形質移入する工程、及び
ｂ）タンパク質の発現を可能にする条件下で上記宿主細胞を培養する工程。
【請求項１６】
繊毛虫宿主細胞において、少なくとも１種のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体を製造するための方法であって、以下の工程を含む、上記方法：
ａ）抗体又はその断片若しくは誘導体をコードする少なくとも１種の核酸分子を用いて、又は好ましくは請求項６に記載の少なくとも１種のベクターを用いて、少なくとも２種の異なる繊毛虫宿主細胞を形質移入する工程、
ｂ）上記２種の繊毛虫宿主細胞又はその子孫を接合させ、少なくとも２種の異なる抗体又はその断片若しくは誘導体をコードする、少なくとも２種の異なる核酸分子を保有する少なくとも１種の繊毛虫細胞を取得する工程、並びに
ｃ）上記の如く製造された繊毛虫細胞をタンパク質の発現を可能にする条件下で培養する工程。
【請求項１７】
医薬組成物を製造するための方法であって、以下の工程を含む、上記方法：
ａ）請求項１から５、７若しくは１０に記載の繊毛虫発現系において、又は請求項１５若しくは１６に記載の方法を用いて、請求項１１から１４に記載の抗体又はその断片若しくは誘導体タンパク質を発現させる工程、並びに
ｂ）上記の如く得られたタンパク質を単離及び／又は精製する工程。
【請求項１８】
請求項１１から１４に記載の抗体又はその断片若しくは誘導体、及び／又は請求項１５から１７の何れか１項に記載の方法を用いて製造された抗体又はその断片若しくは誘導体を含む、医薬組成物。
【請求項１】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体の異種発現系であって、以下を含む、上記異種発現系：
ａ）少なくとも１種の繊毛虫宿主細胞、及び
ｂ）上記繊毛虫宿主細胞に組み込まれる少なくとも１種の異種核酸分子であって、上記モノクローナル抗体又はその断片若しくは誘導体をコードする上記異種核酸分子。
【請求項２】
上記モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体が、本質的にフコースを含まないＮ−グリカン構造を有する、請求項１に記載の異種発現系。
【請求項３】
上記モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体が、以下から成る群から選択される少なくとも１つの効果を有する、請求項１又は２に記載の異種発現系：
・抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）の増強
・補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）の増強
・抗体依存性アポトーシスの増強、及び／又は
・抗体依存性オプソニン作用の増強。
【請求項４】
上記モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体の血清半減期が延長されている、請求項１から３の何れか１項に記載の異種発現系。
【請求項５】
上記異種発現系が、以下をさらに含む、請求項１から４の何れか１項に記載の異種発現系：
ｃ）上記核酸分子に作動可能に連結したプロモーター、及び／又は
ｄ）上記核酸分子に作動可能に連結したシグナル配列であって、該シグナル配列は、上記核酸分子によってコードされるモノクローナル抗体又はその断片を細胞外培地に分泌させる原因となる、上記シグナル配列。
【請求項６】
繊毛虫宿主細胞の形質移入のためのベクターであって、該ベクターは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体をコードする少なくとも１つの核酸分子を含む、上記ベクター。
【請求項７】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体の異種発現系であって、当該異種発現系は、請求項１に記載の少なくとも２種の繊毛虫宿主細胞の接合により得られた繊毛虫宿主細胞を含む、上記異種発現系。
【請求項８】
請求項７に記載の少なくとも１種のベクターにより形質移入されたものであるか、又は請求項１に記載の少なくとも２種の繊毛虫宿主細胞の接合により得られたものである、繊毛虫宿主細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の少なくとも２種の繊毛虫宿主細胞又は請求項７に記載の少なくとも２種の異種発現系を含むライブラリであって、各宿主細胞には、抗体又はその断片若しくは誘導体をコードする少なくとも１つの異種核酸分子が、好ましくはベクターの形態で組み込まれており、かつ少なくとも２種の繊毛虫が、それらが互いに接合できるように選択される、上記ライブラリ。
【請求項１０】
上記繊毛虫が、テトラヒメナ科（Tetrahymenidae）に属するものである、請求項１から５及び７の何れか１項に記載の異種発現系又は請求項８に記載の繊毛虫宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１から５及び７の何れか１項に記載の異種発現系、請求項８に記載の繊毛虫宿主細胞、及び／又は請求項１５から１７の何れか１項に記載の方法により製造されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体。
【請求項１２】
表１（ＡＤＣＣ）又は表３（非ＡＤＣＣ）に記載の標的の少なくとも１つに結合する、請求項１１に記載のモノクローナル抗体又はその断片若しくは誘導体。
【請求項１３】
以下からなる群から選択される、請求項１１又は１２に記載のモノクローナル抗体又はその断片若しくは誘導体：
・マウスｍＡｂ、キメラｍＡｂ、ヒト化ｍＡｂ、及び／又はヒトｍＡｂ、
・ＩｇＧ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、及び／又はＦ（ａｂ）２、及び／又は
・修飾抗体形式。
【請求項１４】
以下からなる群から選択される少なくとも１つの特徴を有する、請求項１１から１３に記載のモノクローナル抗体又はその断片若しくは誘導体：
・ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、及び／又は抗体依存性アポトーシスの増強、
・血清半減期の延長、及び／又は
・二重特異性、三重特異性、又は多重特異性。
【請求項１５】
繊毛虫宿主細胞において、少なくとも１種のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体を製造するための方法であって、以下の工程を含む、上記方法：
ａ）上記モノクローナル抗体又はその断片若しくは誘導体をコードする少なくとも１種の核酸分子を用いて、又は好ましくは請求項６に記載の少なくとも１種のベクターを用いて、少なくとも１種の繊毛虫宿主細胞を形質移入する工程、及び
ｂ）タンパク質の発現を可能にする条件下で上記宿主細胞を培養する工程。
【請求項１６】
繊毛虫宿主細胞において、少なくとも１種のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はその断片若しくは誘導体を製造するための方法であって、以下の工程を含む、上記方法：
ａ）抗体又はその断片若しくは誘導体をコードする少なくとも１種の核酸分子を用いて、又は好ましくは請求項６に記載の少なくとも１種のベクターを用いて、少なくとも２種の異なる繊毛虫宿主細胞を形質移入する工程、
ｂ）上記２種の繊毛虫宿主細胞又はその子孫を接合させ、少なくとも２種の異なる抗体又はその断片若しくは誘導体をコードする、少なくとも２種の異なる核酸分子を保有する少なくとも１種の繊毛虫細胞を取得する工程、並びに
ｃ）上記の如く製造された繊毛虫細胞をタンパク質の発現を可能にする条件下で培養する工程。
【請求項１７】
医薬組成物を製造するための方法であって、以下の工程を含む、上記方法：
ａ）請求項１から５、７若しくは１０に記載の繊毛虫発現系において、又は請求項１５若しくは１６に記載の方法を用いて、請求項１１から１４に記載の抗体又はその断片若しくは誘導体タンパク質を発現させる工程、並びに
ｂ）上記の如く得られたタンパク質を単離及び／又は精製する工程。
【請求項１８】
請求項１１から１４に記載の抗体又はその断片若しくは誘導体、及び／又は請求項１５から１７の何れか１項に記載の方法を用いて製造された抗体又はその断片若しくは誘導体を含む、医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２０１３−５２０９７６（Ｐ２０１３−５２０９７６Ａ）
【公表日】平成２５年６月１０日（２０１３．６．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５５４１５（Ｐ２０１２−５５５４１５）
【出願日】平成２３年３月２日（２０１１．３．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５３１２９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０７５２０
【国際公開日】平成２３年９月９日（２０１１．９．９）
【出願人】（５０２２１０４５９）シリアン アクチェンゲゼルシャフト (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年６月１０日（２０１３．６．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月２日（２０１１．３．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５３１２９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０７５２０
【国際公開日】平成２３年９月９日（２０１１．９．９）
【出願人】（５０２２１０４５９）シリアン アクチェンゲゼルシャフト (4)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]