置換ジヒドロプテリジン−６−オン誘導体、その製造方法及びキナーゼ阻害剤としてのその使用
明細書に定義する式（Ｉ）のジヒドロプテリジン−６−オン誘導体とその医薬的に許容可能な塩、その製造方法及び前記誘導体等を含有する医薬組成物を開示する。本発明の化合物は治療面において癌等の蛋白質キナーゼ活性の調節異常に付随する疾患の処置に有用であり得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は蛋白質キナーゼの活性を調節する所定の置換ジヒドロプテリジン−６−オン化合物に関する。従って、本発明の化合物は蛋白質キナーゼ活性の調節異常に起因する疾患の治療に有用である。本発明はこれらの化合物の製造方法、これらの化合物を含有する医薬組成物、及びこれらの化合物を含有する医薬組成物を使用する疾患の治療方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
癌治療における有糸分裂阻害剤の使用は広範なヒト癌の治療に広く受け入れられている臨床ストラテジーである。タキサン類（パクリタキセルとドセタキセル）とニチニチソウアルカロイド類（ビンクリスチンとビンブラスチン）は微小管を安定化又は不安定化することにより作用し、有糸分裂進行中の細胞に破滅的結末をもたらす。これらの薬剤は数種類の腫瘍型の一次治療薬であり、シスプラチン耐性の卵巣癌、乳癌、肺癌、膀胱癌及び十二指腸癌の二次治療薬である（タキサン類）。しかし、細胞運動、食作用及び軸索輸送等のプロセスにおける微小管の役割により、これらの薬剤では末梢神経障害等の所定の障害が頻繁に認められる。有糸分裂の進行は全増殖細胞の要件であるため、有糸分裂を標的とする癌治療は一般に広範な腫瘍型に適用可能である。数種類の蛋白質キナーゼは細胞周期の調整に重要な役割を果たし、そのうちには、Ｃｄｋ−２やＡｕｒｏｒａ−Ａのように既に腫瘍学の場で標的治療の対象となっているものもある。有糸分裂の忠実性は最も重要であり、細胞周期中に染色体の完全性を維持するために正常細胞には数個の「チェックポイント」が存在する。これらのチェックポイントは癌化中に破綻することが多く、そのため、癌細胞では異数性や染色体不安定性が生じる。癌細胞は異常な有糸分裂を進行させようとするので、「チェックポイント機能の低下した」腫瘍細胞で有糸分裂を阻害すると、破滅的結末につながると考えられる。
【０００３】
有糸分裂の開始、進行及び終了には４種類のセリン／スレオニンキナーゼ（Ｐｌｋ−１〜４）を含むポロ様キナーゼファミリーが主に関与している。これらのキナーゼはｎ末端キナーゼドメインと、ユニークなｃ末端「ポロボックス」ドメインをもつことを特徴とする。このドメインは各種有糸分裂構造（中心体、動原体、紡錘体極、中央体）にキナーゼを送達するのに関与しており、有糸分裂の正常な進行にはＰｌｋの時間的及び空間的制御が重要である（ｖａｎ Ｖｕｇｔ ａｎｄ Ｍｅｄｅｍａ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００５，２４（１７）：２８４４−５９；Ｂａｒｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００４，５（６）：４２９−４０；Ｄａｉ ａｎｄ Ｃｏｇｓｗｅｌｌ，Ｐｒｏｇ Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ Ｒｅｓ．２００３，５：３２７−３４；Ｇｌｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１９９８，１２（２４）：３７７７−８７に概説）。このファミリーのメンバーで最も詳細に特性決定されているのはＰｌｋ−１であり、その酵素活性はＧ２／Ｍ期遷移、中心体成熟及び分離、前期の染色体アーム凝集と中期／後期遷移時の姉妹染色分体分離の制御、有糸分裂終了を開始するための後期促進複合体の活性化、細胞質分裂等の有糸分裂中の数種類のプロセスに関係があるとされている（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ，ＥＭＢＯ Ｊ．２００５，２４（５）：１０５７−６７；ｖａｎ Ｖｕｇｔ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００４，９（３５）：３６８４１−５４；Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００４，１０１（１３）：４４１９−２４ ２００４；Ｎａｋａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００３，２７８（２８）：２５２７７−８０；Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ−Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００２，２７７（５０）：４８８８４−８；Ｂａｒｔｈｏｌｏｍｅｗ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２００１ ２１（１５）：４９４９−５９；Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ．２００１，１２（６）：１７９１−９；Ｒｏｓｈａｋ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ．２０００，１２（６）：４０５−１１）。Ｐｌｋ−１は乳癌、卵巣癌、非小細胞肺癌、結腸癌、頭頸部癌、子宮内膜癌及び十二指腸癌を含む数種類の腫瘍細胞で過剰発現され、その過剰発現は予後不良に相関することが多い。
【０００４】
正常細胞では「チェックポイントによる」細胞周期停止を生じるが、腫瘍細胞では各種手段（ｓｉＲＮＡ及びアンチセンス切断、ドミナントネガティブ蛋白質及び免疫除去）によりＰｌｋ−１機能が妨害される結果、異常な有糸分裂を生じ、延いては有糸分裂の破綻に至る。従って、薬物でＰｌｋ−１機能を低下させると、数種類の多様な癌の治療に治療効果があると思われる。細胞周期における有糸分裂阻止とアポトーシスを生じるにはＰＬＫ１の阻害で十分であり、細胞周期遮断にこのファミリーの他の２つのメンバーの阻害は不可欠ではなく、むしろ、血液悪性腫瘍や神経障害等の副作用を招く場合もある。文献に報告されているように、Ｐｌｋ２はＢ細胞新生物で転写がダウンレギュレートされる。バーキットリンパ腫（ＢＬ）では非常に高頻度でサイレンシングが生じるが、他の型のＢ細胞新生物でも検出され、異常なシトシンメチル化に結び付けられる。ＢＬ細胞でＳｎｋ／Ｐｌｋ２の異所性発現の結果、アポトーシスが生じたことから、ＰＬＫ２はＢ細胞新生物形成において腫瘍サプレッサーとしての役割を果たす可能性がある（Ｓｙｅｄ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２００６，１０７，２５０−２５６）。更に、ＰＬＫ２とＰＬＫ３はいずれもニューロンシナプス可塑性において有糸分裂以外の重要な役割を果たすことが報告されている（Ｐａｋ，Ｄ．Ｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，３０２，１３８６−１３７３；Ｋａｕｓｅｌｍａｎｎ，Ｇ．ＥＭＢＯ Ｊ．１９９９，１８，５５２８−５５３９）。
【０００５】
Ｗａｒｎｅｒ Ｌａｍｂｅｒｔ Ｃｏ．名義のＷＯ２００１／０１９８２５には癌等の細胞増殖性疾患の治療用としてのプテリジン誘導体が開示されている。
【０００６】
いずれもＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｐｈａｒｍａ名義のＷＯ２００３／０２０７２２、ＷＯ２００４／０７６０５４及びＷＯ２００７／０９０８４４には細胞増殖性疾患の治療用としてのジヒドロプテリジン−６−オン誘導体とその塩も開示されている。
【０００７】
これらの開発にも拘わらず、前記疾患に有効な薬剤が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００１／０１９８２５号
【特許文献２】国際公開第２００３／０２０７２２号
【特許文献３】国際公開第２００４／０７６０５４号
【特許文献４】国際公開第２００７／０９０８４４号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ｖａｎ Ｖｕｇｔ ａｎｄ Ｍｅｄｅｍａ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００５，２４（１７）：２８４４−５９
【非特許文献２】Ｂａｒｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００４，５（６）：４２９−４０
【非特許文献３】Ｄａｉ ａｎｄ Ｃｏｇｓｗｅｌｌ，Ｐｒｏｇ Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ Ｒｅｓ．２００３，５：３２７−３４
【非特許文献４】Ｇｌｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１９９８，１２（２４）：３７７７−８７
【非特許文献５】Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ，ＥＭＢＯ Ｊ．２００５，２４（５）：１０５７−６７
【非特許文献６】ｖａｎ Ｖｕｇｔ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００４，９（３５）：３６８４１−５４
【非特許文献７】Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００４，１０１（１３）：４４１９−２４ ２００４
【非特許文献８】Ｎａｋａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００３，２７８（２８）：２５２７７−８０
【非特許文献９】Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ−Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００２，２７７（５０）：４８８８４−８
【非特許文献１０】Ｂａｒｔｈｏｌｏｍｅｗ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２００１ ２１（１５）：４９４９−５９
【非特許文献１１】Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ．２００１，１２（６）：１７９１−９
【非特許文献１２】Ｒｏｓｈａｋ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ．２０００，１２（６）：４０５−１１
【非特許文献１３】Ｓｙｅｄ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２００６，１０７，２５０−２５６
【非特許文献１４】Ｐａｋ，Ｄ．Ｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，３０２，１３８６−１３７３
【非特許文献１５】Ｋａｕｓｅｌｍａｎｎ，Ｇ．ＥＭＢＯ Ｊ．１９９９，１８，５５２８−５５３９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは以下に記載する式（Ｉ）の化合物が選択的ＰＬＫ１阻害剤であり、従って、抗腫瘍薬として治療面で有用であり、しかも毒性と副作用の両面において、現在入手可能な抗腫瘍薬に付随する上記欠点を伴わないことを今般発見した。
【００１１】
従って、本発明の第１の目的は式（Ｉ）：
【００１２】
【化１】
［式中、
Ｒ１は直鎖又は分岐鎖Ｃ１−Ｃ３アルキル、Ｃ１−Ｃ３アルコキシ、Ｃ１−Ｃ３ポリフッ化アルキル、Ｃ１−Ｃ３ポリフッ化アルコキシ及び−ＣＯＲ’（式中、Ｒ’は置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキルである。）から選択される置換されていてもよい基であり；
Ｒ２は−ＮＲ”Ｒ”’基（式中、Ｒ”及びＲ”’は各々独立して水素又は直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル及び複素環から選択される置換されていてもよい基である。）であり、あるいはＲ”とＲ”’はそれらが結合している窒素原子と一緒になり、Ｎ、Ｏ又はＳから選択される更に１個のヘテロ原子を含んでもよい置換されていてもよい複素環を形成してもよく；
Ｒ３及びＲ４は各々独立して水素又は直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル及び複素環から選択される置換されていてもよい基である。］により表される置換ジヒドロプテリジン−６−オン化合物及びその医薬的に許容可能な塩を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は更に、標準合成変換から構成される方法により製造される式（Ｉ）により表される置換ジヒドロプテリジン−６−オン化合物の合成方法を提供する。
【００１４】
本発明は更に蛋白質キナーゼ活性、特にＰＬＫファミリー、ＡＢＬ、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、ＡＵＲ１、ＡＵＲ２、ＢＲＫ、ＣＤＣ７／ＤＢＦ４、ＣＤＫ２／ＣＹＣＡ、ＣＨＫ１、ＣＫ２、ＥＧＦＲ１、ＥＲＫ２、ＦＡＫ、ＦＧＦＲ１、ＦＬＴ３、ＧＳＫ３β、ＩＧＦＲ１、ＩＫＫ２、ＩＲ、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＩＴ、ＬＣＫ、ＭＡＰＫＡＰＫ２、ＭＥＴ、ＭＰＳ１、ＮＥＫ６、ＮＩＭ１、Ｐ３８α、ＰＡＫ４、ＰＤＧＦＲ、ＰＤＫ１、ＰＩＭ１、ＰＫＡα、ＰＫＣβ、ＰＬＫ１、ＲＥＴ、ＳＴＬＫ２、ＳＵＬＵ１、ＴＲＫＡ、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＺＡＰ７０の調節異常に起因及び／又は付随する疾患の治療方法を提供し、特に、上記化合物はＰＬＫ２及びＰＬＫ３に比較してＰＬＫ１キナーゼに対する選択的活性を示した。
【００１５】
本発明の好ましい１方法は癌、細胞増殖性疾患、自己免疫疾患及び神経変性疾患から構成される群から選択される蛋白質キナーゼ活性の調節異常に起因及び／又は付随する疾患の治療方法である。
【００１６】
本発明の別の好ましい方法は特定種の癌の治療方法であり、限定されないが、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌（小細胞肺癌を含む。）、十二指腸癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、子宮頸癌、甲状腺癌、前立腺癌及び皮膚癌（扁平上皮細胞癌を含む。）等の癌；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、毛様細胞リンパ腫及びバーキットリンパ腫等のリンパ系造血器腫瘍；急性及び慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群並びに前骨髄球性白血病等の骨髄系造血器腫瘍；線維肉腫及び横紋筋肉腫等の間葉系腫瘍；星状細胞腫、神経細胞芽腫、神経膠腫及びシュワン細胞腫等の中枢及び末梢神経系腫瘍；メラノーマ、セミノーマ、奇形癌腫、骨肉腫、色素性乾皮症、ケラトキサントーマ、甲状腺濾胞癌及びカポジ肉腫等の他の腫瘍が挙げられる。
【００１７】
本発明の別の好ましい方法は例えば良性前立腺過形成、家族性大腸腺腫症、神経線維腫症、乾癬、アテローム性動脈硬化症に伴う血管平滑筋細胞増殖、肺線維症、関節炎、糸球体腎炎並びに手術後狭窄及び再狭窄等の特定の細胞増殖性疾患の治療方法である。
【００１８】
本発明は更に抗癌治療で同時、別個又は順次使用するために放射線療法又は化学療法レジメンと式（Ｉ）の化合物を併用する治療方法を提供する。
【００１９】
更に、本発明はＰＬＫ−１蛋白質活性の阻害方法として、前記蛋白質を有効量の式（Ｉ）の化合物と接触させる段階を含む方法を提供する。
【００２０】
本発明は更に、式（Ｉ）の１種以上の化合物又はその医薬的に許容可能な塩と、医薬的に許容可能な賦形剤、担体又は希釈剤を含有する医薬組成物を提供する。
【００２１】
本発明は更に、公知細胞増殖抑制剤又は細胞傷害剤、抗生物質型薬剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、ホルモン剤、免疫剤、インターフェロン型薬剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤（例えばＣＯＸ−２阻害剤）、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、テロメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗増殖因子受容体剤、抗ＨＥＲ剤、抗ＥＧＦＲ剤、抗血管新生剤（例えば血管新生阻害剤）、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ｒａｓ−ｒａｆシグナル伝達経路阻害剤、細胞周期阻害剤、他のｃｄｋ阻害剤、チューブリン結合剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤等と共に式（Ｉ）の化合物を含有する医薬組成物を提供する。
【００２２】
更に、本発明は抗癌治療で同時、別個又は順次使用するための併用製剤として、上記式（Ｉ）の化合物又はその医薬的に許容可能な塩と、１種以上の化学療法剤を含む製剤又はキットを提供する。
【００２３】
更に別の側面において、本発明は医薬用としての上記式（Ｉ）の化合物又はその医薬的に許容可能な塩を提供する。
【００２４】
更に、本発明は癌の治療方法で使用するための上記式（Ｉ）の化合物又はその医薬的に許容可能な塩を提供する。
【００２５】
最後に、本発明は抗腫瘍活性をもつ医薬の製造における上記式（Ｉ）の化合物又はその医薬的に許容可能な塩の使用を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
特に指定しない限り、式（Ｉ）の化合物自体とその任意医薬組成物又は前記化合物を含む任意治療処置に言及する場合には、本発明は本発明の化合物の水和物、溶媒和物、複合体、代謝産物、プロドラッグ、担体、Ｎ−オキシド及び医薬的に許容可能な塩の全てを包含する。
【００２７】
式（Ｉ）の化合物の代謝産物とは、式（Ｉ）のこの同一化合物が例えば治療を必要とする哺乳動物に投与後にインビボ変換される任意化合物である。限定例ではないが、一般に、式（Ｉ）の化合物の投与後にこの同一誘導体は各種化合物に変換される場合があり、例えば排泄し易い水酸化誘導体等の溶解度の高い誘導体が挙げられる。従って、この場合に存在する代謝経路に応じて、これらの水酸化誘導体の任意のものを式（Ｉ）の化合物の代謝産物とみなすことができる。
【００２８】
プロドラッグとは、式（Ｉ）の活性な親薬剤をインビボ放出する任意共有結合化合物である。
【００２９】
本発明の化合物にキラル中心又は別の形態の異性体中心が存在する場合には、エナンチオマーとジアステレオマーを含むこのような異性体の全形態を本発明に含むものとする。キラル中心を含む化合物はエナンチオリッチな混合物であるラセミ混合物として使用してもよいし、周知技術を使用してラセミ混合物を分離し、個々のエナンチオマーを単独で使用してもよい。化合物が不飽和炭素−炭素二重結合をもつ場合には、シス（Ｚ）異性体とトランス（Ｅ）異性体の両方が本発明の範囲に含まれる。
【００３０】
化合物がケト−エノール互変異性体等の互変異性体として存在している場合もあるが、そのような場合には、平衡状態で存在しているか又は主に一方の形態で存在しているかに関係なく、各互変異性体を本発明に含むものとする。
【００３１】
本明細書において、「直鎖又は分岐鎖アルキル」なる用語は特に指定しない限り、夫々炭素原子数１〜６と１〜３のアルキル基であるＣ１−Ｃ６アルキル基とＣ１−Ｃ３アルキル基（例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル等）を意味する。
【００３２】
Ｃ１−Ｃ３アルコキシなる用語は、酸素原子（−Ｏ−）を介して分子の残余と結合した上記Ｃ１−Ｃ３アルキル基の任意のものを意味する。
【００３３】
Ｃ１−Ｃ３ポリフッ化アルキル又はアルコキシなる用語は、２個以上のフッ素原子で置換された上記直鎖又は分岐鎖Ｃ１−Ｃ３アルキル又はアルコキシ基の任意のもの（例えばトリフルオロメチル、トリフルオロエチル、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロピル、トリフルオロメトキシ等）を意味する。
【００３４】
「Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル」なる用語は特に指定しない限り、１個以上の二重結合を含んでいてもよいが、完全共役π電子系をもたない３〜６員炭素単環を意味する。シクロアルキル基の例は限定されないが、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロペンテン、シクロヘキサン、シクロヘキセン及びシクロヘキサジエンである。
【００３５】
「複素環」なる用語は１個以上の炭素原子が窒素、酸素及び硫黄等のヘテロ原子で置換された３〜７員飽和又は部分不飽和炭素環を意味する。ヘテロシクロアルキル基の非限定的な例は例えばピラン、ピロリジン、ピロリン、イミダゾリン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、ピラゾリン、チアゾリン、チアゾリジン、ジヒドロフラン、テトラヒドロフラン、１，３−ジオキソラン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン等である。
【００３６】
必要に応じて、上記置換基は各々更に上記基の１個以上で置換されていてもよい。
【００３７】
式（Ｉ）の化合物の医薬的に許容可能な塩としては、無機酸又は有機酸（例えば硝酸、塩酸、臭化水素酸、硫酸、過塩素酸、リン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、蓚酸、フマル酸、マロン酸、リンゴ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、イセチオン酸及びサリチル酸）との酸付加塩が挙げられる。本発明の化合物の酸付加塩は塩酸塩とメシル酸塩から選択することが好ましい。
【００３８】
式（Ｉ）の化合物の医薬的に許容可能な塩としては更に無機塩基又は有機塩基（例えばアルカリ又はアルカリ土類金属、特にナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム又はマグネシウムの水酸化物、炭酸塩又は重炭酸塩、非環状又は環状アミン、好ましくはメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン等）との塩が挙げられる。
【００３９】
好ましい１分類の式（Ｉ）の化合物は、Ｒ４が置換されていてもよい直鎖又は分岐鎖Ｃ１−Ｃ６アルキルである化合物である。
【００４０】
別の好ましい分類の式（Ｉ）の化合物は、Ｒ１が−ＯＣＦ３、−ＯＣＨ３、−ＣＨ３及び−ＣＯＲ’（式中、Ｒ’は上記に定義した通りである。）から選択される基であり；
Ｒ２がメチルピペラジニル基：
【００４１】
【化２】
であり；
Ｒ３がＣ３−Ｃ６シクロアルキルである化合物である。
【００４２】
特に好ましい式（Ｉ）の化合物は以下の化合物：
（Ｒ）−８−シクロペンチル−７−エチル−５−メチル−２−［５−（４−メチルピペラジン−１−イル）−２−トリフルオロメトキシフェニルアミノ］−７，８−ジヒドロ−５Ｈ−プテリジン−６−オン、
（Ｒ）−８−シクロペンチル−７−エチル−２−［２−メトキシ−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニルアミノ］−５−メチル−７，８−ジヒドロ−５Ｈ−プテリジン−６−オン、及び
（Ｒ）−８−シクロペンチル−７−エチル−５−メチル−２−［２−メチル−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニルアミノ］−７，８−ジヒドロ−５Ｈ−プテリジン−６−オンである。
【００４３】
必要に応じて医薬的に許容可能な塩の形態である本発明の式（Ｉ）の任意の特定の化合物については、実験のセクションと特許請求の範囲参照。
【００４４】
本発明は更に、
１）式（ＩＩ）：
【００４５】
【化３】
（式中、Ｒ３及びＲ４は上記に定義した通りである。）の化合物を式（ＩＩＩ）：
【００４６】
【化４】
（式中、Ｒ１及びＲ２は上記に定義した通りである。）の化合物と反応させ、式（Ｉ）の化合物を得る段階と、
必要に応じてその医薬的に許容可能な塩に変換する段階を含むことを特徴とする上記式（Ｉ）の化合物の製造方法を提供する。
【００４７】
上記方法は類推方法であり、当分野で周知の手法により実施することができる。
【００４８】
上記方法の段階１によると、式（ＩＩ）の化合物と式（ＩＩＩ）の化合物の反応は従来の手法に従って種々の様式で実施することができる。エタノール又は水又はその混液等の適切な溶媒中で酸性条件（例えばＨＣｌ）下に室温から約１００℃までの温度にて約２〜約４８時間実施することが好ましい。
【００４９】
式（Ｉ）の化合物の製造方法の任意変法によると、出発材料と他の任意反応成分は公知であるか又は公知手法により容易に製造される。式（ＩＩ）の化合物はＷＯ２００３／０２０７２２及びＷＯ２００４／０７６４５４に記載されているように製造することができる。式（ＩＩＩ）の化合物は市販品もあるし、下記製造例２〜４に記載するように類推により製造できるものもある。
【００５０】
以上から当業者に自明の通り、上記方法により式（Ｉ）の化合物を製造する際に、出発材料又はその中間体内に官能基が存在している場合には望ましくない副反応を生じる可能性があるので、従来の手法により適正に保護する必要がある。同様に、これらの出発材料等から遊離脱保護化合物への変換も公知手順により実施することができる。
【００５１】
容易に理解される通り、上記方法により製造される式（Ｉ）の化合物が異性体の混合物として得られる場合には、従来の手法を使用して式（Ｉ）の単一異性体に分離する方法又は従来のラセミ分割法としては、例えばジアステレオマー塩誘導体の分別結晶や分取キラルＨＰＬＣが本発明の範囲内に含まれる。従来のラセミ分割法としては、例えばジアステレマー塩誘導体の分別結晶や分取キラルＨＰＬＣが挙げられる。
【００５２】
薬理作用
式（Ｉ）の化合物は蛋白質キナーゼ阻害剤として活性であるため、例えば腫瘍細胞の無制御な増殖を制限するために有用である。治療面では、上記腫瘍等の各種腫瘍の治療に加え、良性前立腺過形成、家族性大腸腺腫症、神経線維腫症、乾癬、アテローム性動脈硬化症に伴う血管平滑筋細胞増殖、肺線維症、関節炎、糸球体腎炎並びに手術後狭窄及び再狭窄等の他の細胞増殖性疾患の治療にも使用することができる。
【００５３】
推定ＰＬＫ−１阻害剤の阻害活性と選択化合物の効力を下記アッセイにより測定した。
【００５４】
本明細書で使用する短縮形と略語は以下の意味である：
Ｃｉ キュリー
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＫＤａ キロダルトン
μＣｉ マイクロキュリー
ｍｇ ミリグラム
μｇ マイクログラム
ｎｇ ナノグラム
Ｌ リットル
ｍＬ ミリリットル
μＬ マイクロリットル
Ｍ モル
ｍＭ ミリモル
μＭ マイクロモル
ｎＭ ナノモル
Ｅｔ エチル。
【００５５】
組換えＰＬＫ１キナーゼドメインのクローニング、発現及び精製
ｉｍａＧｅｎｅｓからクローンＩＲＡＴｐ９７０Ａ０７８Ｄとして購入した全長ヒトＰＬＫ１遺伝子からＰＬＫ１キナーゼドメイン（全長配列の残基２〜３４５に対応，Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセション番号Ｐ５３３５０参照）をＰＣＲ増幅した。
【００５６】
フォワードオリゴヌクレオチド：
５’ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＡＴＴＣＧＡＡＡＡＣＣＴＧＴＡＴＴＴＴＣＡＧＧＧＣＣＣＴＡＧＴＧＣＴＧＣＡＧＴＧＡＣＴＧＣＡＧＧＧＡＡＧ３’［配列番号１］
とリバースオリゴヌクレオチド：
５’ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＣＡＣＴＡＴＴＴＡＴＴＧＡＧＧＡＣＴＧＴＧＡＧＧＧＧＣＴＴ−３’［配列番号２］
を使用して増幅を実施した。
【００５７】
クローニングの目的で、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）テクノロジー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用するクローニングに適したａｔｔＢで挟まれたＰＣＲ産物を得るためにａｔｔＢ部位をオリゴヌクレオチドに付加した。更に、精製の目的で、ＴＥＶ（登録商標）開裂部位（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をフォワードプライマーに付加した。得られたＰＣＲ産物をｐＤＯＮＲ２２１プラスミドにクローニングした後、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）に対応するように改変したバキュロウイルス発現ベクターｐＶＬ１３９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入した。発現と精製の目的で、ＨｉｓタグをＰＬＫキナーゼドメインのＮ末端に付加した。Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）マニュアルに記載されているプロトコルに従ってクローニングを実施した。
【００５８】
ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（登録商標）トランスフェクションキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用してＳｆ９昆虫細胞に発現ベクターとウイルスＤＮＡを同時トランスフェクトすることによりバキュロウイルスを作製した。５日後にウイルス上清を回収し、３回増幅してウイルス力価を増加した。Ｈｉｇｈ５昆虫細胞に感染させることにより組換え蛋白質を産生させた。４８時間感染後に細胞を回収し、ペレット化し、−８０℃で凍結させた。組換え蛋白質を精製するために、ペレットを解凍し、溶解用緩衝液（ＰＢＳ，ＮａＣｌ １５０ｍＭ，ＣＨＡＰＳ ０．１％，ＤＴＴ ２０ｍＭ，グリセロール１０％，プロテアーゼ阻害剤）に再懸濁し、音波処理により溶解させた。遠心により溶解液を清澄化し、Ｎｉｃｈｅｌアフィニティーカラムにロードした。十分に洗浄後、ＴＥＶ（登録商標）プロテアーゼの存在下で温置することにより組換え蛋白質を開裂及び溶出させた。
【００５９】
ＰＬＫ−１キナーゼ活性の阻害剤の生化学アッセイ
トランスリン酸化アッセイを使用して推定キナーゼ阻害剤の阻害活性と選択化合物の効力を測定した。
【００６０】
ＡＴＰ（３３Ｐ−γ−ＡＴＰで追跡）と、それ自体の最適な緩衝液及び補因子の存在下で夫々の特異的なセリン−スレオニン又はチロシンキナーゼにより特定ペプチド又は蛋白質基質をトランスリン酸化する。
【００６１】
リン酸化反応後に、９８％を上回る非放射性ＡＴＰと放射性ＡＴＰを過剰のイオン交換ダウエックス樹脂に吸着させた後、樹脂を重力により反応プレートの底に沈降させる。
【００６２】
次にリン酸化基質を含有する上清を回収し、計数用プレートに導入後、β線計数により評価する。
【００６３】
試薬／アッセイ条件
ｉ．ダウエックス樹脂調製
湿潤樹脂（ＳＩＧＭＡ，特注製造樹脂ＤＯＷＥＸ １×８ ２００〜４００メッシュ，２．５Ｋｇ）５００ｇを計量し、１５０ｍＭギ酸ナトリウム，ｐＨ３．００で２Ｌまで希釈する。樹脂を（数時間）沈降させた後、上清を捨てる。２〜３日間かけて上記のように３回洗浄後、樹脂を沈降させ、上清を捨て、ペレット１容量当たり１５０ｍＭギ酸ナトリウム緩衝液２容量を加える。その後、ｐＨを測定すると、３．００前後になる。洗浄した樹脂は１週間以上安定であり、ストック樹脂を使用時まで４℃に維持する。
【００６４】
ｉｉ．キナーゼ緩衝液（ＫＢ）
ＰＬＫ１アッセイのキナーゼ緩衝液は１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ＤＴＴ，３μＭ ＮａＶＯ３，０．２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ，及び１０ｍＭ β−グリセロリン酸を添加した５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．９から構成した。
【００６５】
ｉｉｉ．アッセイ条件
ＰＬＫ−１の最終酵素濃度を３ｎＭとし、４０μＭ ＡＴＰ、３ｎＭ ３３Ｐ−γ−ＡＴＰ及び８５μＭ基質α−カゼインＳＩＧＭＡ，＃Ｃ−３２４０の存在下でキナーゼアッセイを実施した。
【００６６】
自動化ダウエックスアッセイ
１）３×酵素ミックス（３倍量のキナーゼ緩衝液で調製），５μＬ／ウェル
２）３×基質及びＡＴＰミックス（ｄｄＨ２Ｏで調製）に３３Ｐ−γ−ＡＴＰを添加，５μＬ／ウェル
３）３×試験化合物（３％ＤＭＳＯのｄｄＨ２Ｏ溶液で希釈）−５μＬ／ウェル。
【００６７】
化合物希釈及びアッセイスキームを以下に規定する。
【００６８】
ｉ．化合物の希釈
試験化合物を１００％ＤＭＳＯに溶解した１０ｍＭストック溶液を９６ウェル１２×８フォーマットマイクロタイタープレートに分配した。
【００６９】
％阻害試験では、１００％ＤＭＳＯで１ｍＭ、１００μＭ及び１０μＭの個々の希釈プレートを調製後、３％ＤＭＳＯのｄｄＨ２Ｏ溶液で３×濃度（３０、３及び０．３μＭ）に希釈する。Ｍｕｌｔｉｍｅｋ ９６（Ｂｅｃｋｍａｎ）を希釈に使用し、化合物を試験プレートに分注する。
【００７０】
ＩＣ５０測定では、化合物を１ｍＭ，１００％ＤＭＳＯ溶液としてマイクロタイタープレートの最初のカラム（Ａ１〜Ｇ１）に１００μＬずつ加える。
【００７１】
プレートの全７種の化合物でカラムＡ１からＡ１０まで３％ＤＭＳＯ水溶液による３倍系列希釈にＢｉｏｍｅｋ ２０００（Ｂｅｃｋｍａｎ）を使用する。標準実験では、全化合物の最高濃度を３０μＭとした後、最終試験混合物で１０μＭまで希釈する。
【００７２】
ｉｉ．アッセイスキーム
化合物希釈液（３×）５μＬでＶ字底３８４ウェルプレート（試験プレート）を調製後、酵素ミックス（３×）用リザーバ１個とＡＴＰミックス（３×）用リザーバ１個と共にＰｌａｔｅＴｒａｋ １２自動化ステーション（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ；ロボットはアッセイ開始用の３８４チップ分注ヘッド１個と樹脂分配用の９６チップヘッド１個をもつ）に配置する。試験開始時にロボットはＡＴＰミックス５μＬを吸引し、チップの内側に空隙（３μＬ）を作り、ＰＬＫ１ミックス５μＬを吸引する。その後、プレートに分配し、ロボット自体で３サイクル混合後にキナーゼ反応を開始する。
【００７３】
この時点で全試薬に適正な濃度が回復される。
【００７４】
ロボットはプレートを６０分間室温で温置した後、ダウエックス樹脂懸濁液７０μＬを反応ミックスに分注することにより反応を停止する。樹脂の添加直後に３サイクル混合を行う。
【００７５】
全プレートの停止後に今度は正常チップを使用して更に１サイクル混合を実施した後、ＡＴＰ吸着を最大限にするようにプレートを約１時間静置する。この時点で上清２０μＬをＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ ４０（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）７０μＬと共に３８４−Ｏｐｔｉｐｌａｔｅｓ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）に導入し、オービタルシェーカーで５分間振盪後、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｔｏｐ Ｃｏｕｎｔ放射能カウンターでプレートを読取る。
【００７６】
ｉｉｉ．データ分析
一次アッセイには阻害率％を提供し、二次アッセイ／ヒット確認ルーチンにはＩＣ５０測定用に１０倍系列希釈曲線のＳ字フィッティングを提供するＳＷパッケージ「Ａｓｓａｙ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ」の社内カスタマイズ版によりデータを分析する。
【００７７】
組換えＰＬＫ２キナーゼドメインのクローニング、発現及び精製
ヒト精巣ｃＤＮＡライブラリーからＰＬＫ２キナーゼドメイン（全長配列の残基２〜３７５に対応，Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセション番号Ｑ９ＮＹＹ３参照）をＰＣＲ増幅した。フォワードオリゴヌクレオチド：
５’ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＡＣＴＧＧＡＡＧＴＴＣＴＧＴＴＣＣＡＧＧＧＧＣＣＣＧＡＧＣＴＴＴＴＧＣＧＧＡＧＣＡＴＣＡＣＣＴＡＣＣ−３’［配列番号３］
とリバースオリゴヌクレオチド：
５’ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＴＡＴＴＴＧＣＣＡＣＣＡＡＡＡＡＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣ−３’［配列番号４］
を使用して増幅を実施した。
【００７８】
クローニングの目的で、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）テクノロジー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用するクローニングに適したａｔｔＢで挟まれたＰＣＲ産物を得るためにａｔｔＢ部位をオリゴヌクレオチドに付加した。更に、精製の目的でＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）開裂部位（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をフォワードプライマーに付加した。得られたＰＣＲ産物をＧａｔｅｗａｙ（登録商標）に対応するように改変したバキュロウイルス発現ベクターｐＶＬ１３９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。発現と精製の目的で、ＧＳＴタグを両方のＰＬＫキナーゼドメインのＮ末端に付加した。Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）マニュアルに記載されているプロトコルに従ってクローニングを実施した。
【００７９】
ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（登録商標）トランスフェクションキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用してＳｆ９昆虫細胞に発現ベクターとウイルスＤＮＡを同時トランスフェクトすることによりバキュロウイルスを作製した。５日後にウイルス上清を回収し、３回増幅してウイルス力価を増加した。Ｈｉｇｈ５昆虫細胞に細胞１０９個当たりウイルス上清３ｍｌを細胞１×１０６個／ｍｌの密度で感染させることにより組換え蛋白質を産生させた。４８時間感染後に細胞を回収し、ペレット化し、−８０℃で凍結させた。組換え蛋白質を精製するために、ペレットを解凍し、溶解用緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４ ５０ｍＭ，ＮａＣｌ １５０ｍＭ，ＣＨＡＰＳ ０．２％，ＤＴＴ ２０ｍＭ，グリセロール１０％）に再懸濁し、音波処理により溶解させた。２４０００ｇで３０分間遠心により溶解液を清澄化し、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦ（登録商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムにロードした。十分に洗浄後、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）プロテアーゼの存在下で温置することにより組換え蛋白質を開裂及び溶出させた。
【００８０】
ＰＬＫ−２キナーゼ活性の阻害剤の生化学アッセイ
ＰＬＫ−１酵素について記載したと同様にインビトロキナーゼ阻害アッセイを実施した。
【００８１】
ｉ．ＰＬＫ−２のキナーゼ緩衝液（ＫＢ）
キナーゼ緩衝液は５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．９，５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ＤＴＴ，３μＭ ＮａＶＯ３，１０ｍＭ β−グリセロリン酸及び０．２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡから構成した。
【００８２】
ｉｉ．ＰＬＫ−２のアッセイ条件（終濃度）
酵素濃度５ｎＭ、２００μＭ ＡＴＰ、３ｎＭ ３３Ｐ−γ−ＡＴＰ及び１７５μＭ基質α−カゼインＳＩＧＭＡ，＃Ｃ−３２４０でキナーゼアッセイを実施した。
【００８３】
組換えＰＬＫ３キナーゼドメインのクローニング、発現及び精製
ヒト精巣ｃＤＮＡライブラリーからＰＬＫ３キナーゼドメイン（全長配列の残基２〜３５５に対応，Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセション番号Ｑ９Ｈ４Ｂ４参照）をＰＣＲ増幅した。フォワードオリゴヌクレオチド：
５’ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＡＣＴＧＧＡＡＧＴＴＣＴＧＴＴＣＣＡＧＧＧＧＣＣＣＧＡＧＣＣＴＧＣＣＧＣＣＧＧＴＴＴＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＣ−３’［配列番号５］
とリバースオリゴヌクレオチド：
５’ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＴＧＡＣＡＡＡＧＡＧＧＣＴＣＴＴＧＧＴＡＡＣＴＴＴＧＧＣ−３’［配列番号６］
を使用して増幅を実施した。
【００８４】
クローニングの目的で、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）テクノロジー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用するクローニングに適したａｔｔＢで挟まれたＰＣＲ産物を得るためにａｔｔＢ部位をオリゴヌクレオチドに付加した。更に、精製の目的でＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）開裂部位（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をフォワードプライマーに付加した。得られたＰＣＲ産物をＧａｔｅｗａｙ（登録商標）に対応するように改変したバキュロウイルス発現ベクターｐＶＬ１３９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。発現と精製の目的で、ＧＳＴタグをＰＬＫ３キナーゼドメインのＮ末端に付加した。Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）マニュアルに記載されているプロトコルに従ってクローニングを実施した。
【００８５】
ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（登録商標）トランスフェクションキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用してＳｆ９昆虫細胞に発現ベクターとウイルスＤＮＡを同時トランスフェクトすることによりバキュロウイルスを作製した。５日後にウイルス上清を回収し、３回増幅してウイルス力価を増加した。Ｈｉｇｈ５昆虫細胞に細胞１０９個当たりウイルス上清３ｍｌを細胞１×１０６個／ｍｌの密度で感染させることにより組換え蛋白質を産生させた。４８時間感染後に細胞を回収し、ペレット化し、−８０℃で凍結させた。組換え蛋白質を精製するために、ペレットを解凍し、溶解用緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４ ５０ｍＭ，ＮａＣｌ １５０ｍＭ，ＣＨＡＰＳ ０．２％，ＤＴＴ ２０ｍＭ，グリセロール１０％）に再懸濁し、音波処理により溶解させた。２４０００ｇで３０分間遠心により溶解液を清澄化し、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦ（登録商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムにロードした。十分に洗浄後、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）プロテアーゼの存在下で温置することにより組換え蛋白質を開裂及び溶出させた。
【００８６】
ＰＬＫ−３キナーゼ活性の阻害剤の生化学アッセイ
ＰＬＫ−１酵素について記載したと同様にインビトロキナーゼ阻害アッセイを実施した。
【００８７】
ｉ．ＰＬＫ−３のキナーゼ緩衝液（ＫＢ）
キナーゼ緩衝液は５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．９，５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ＤＴＴ，３μＭ ＮａＶＯ３，１０ｍＭ β−グリセロリン酸及び０．２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡから構成した。
【００８８】
ｉｉ．ＰＬＫ−３のアッセイ条件（終濃度）
酵素濃度０．５ｎＭ、５０μＭ ＡＴＰ、３ｎＭ ３３Ｐ−γ−ＡＴＰ及び１１０μＭ基質α−カゼインＳＩＧＭＡ，＃Ｃ−３２４０でキナーゼアッセイを実施した。
【００８９】
Ａｕｒｏｒａ−２キナーゼ活性の阻害剤の生化学アッセイ
ＰＬＫ−１酵素について記載したと同様にインビトロキナーゼ阻害アッセイを実施した。
【００９０】
ｉ．Ａｕｒｏｒａ−２のキナーゼ緩衝液（ＫＢ）
キナーゼ緩衝液は５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．０，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ＤＴＴ，３μＭ ＮａＶＯ３、及び０．２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡから構成した。
【００９１】
ｉｉ．Ａｕｒｏｒａ−２のアッセイ条件（終濃度）
酵素濃度２．５ｎＭ，１０μＭ ＡＴＰ，１ｎＭ ３３Ｐ−γ−ＡＴＰ、及びＬＲＲＷＳＬＧ反復配列４個から構成される基質８μＭでキナーゼアッセイを実施した。
【００９２】
Ｃｄｋ２／サイクリンＡ活性の阻害アッセイ
キナーゼ反応：１．５μＭヒストンＨ１基質，２５μＭ ＡＴＰ（０．２μＣｉ Ｐ３３γ−ＡＴＰ）、バキュロウイルスで同時発現させたＣｄｋ２／サイクリンＡ ３０ｎｇ、１０μＭ阻害剤を最終容量１００μＬの緩衝液（ＴＲＩＳ ＨＣｌ １０ｍＭ ｐＨ７．５，ＭｇＣｌ２ １０ｍＭ，７．５ｍＭ ＤＴＴ）に加え、９６ウェルＵ字底プレートの各ウェルに加えた。１０分間３７℃で温置後、１２０ｍＭ ＥＤＴＡ ２０μＬにより反応を停止した。
【００９３】
吸着：各ウェルから１００μＬをＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎプレートに移し、ホスホセルロースフィルターと基質結合させた。次にＣａ＋＋／Ｍｇ＋＋を含まないＰＢＳ１５０μＬ／ウェルでプレートを３回洗浄し、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ濾過システムで濾過した。
【００９４】
ＰＬＫ−１酵素について記載したと同様にインビトロキナーゼ阻害アッセイを実施した。
【００９５】
ｉ．ＣＤＫ−２／ＣｙｃＡのキナーゼ緩衝液（ＫＢ）
キナーゼ緩衝液はＴＲＩＳ ＨＣｌ ５０ｍＭ ｐＨ７．５，ＭｇＣｌ２ １０ｍＭ，ＤＴＴ １ｍＭ，ＮａＶＯ３ ３μＭ，０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡから構成した。
【００９６】
ｉｉ．ＣＤＫ−２のアッセイ条件（終濃度）
酵素濃度１．０８ｎＭ，１０μＭ ＡＴＰ，１ｎＭ ３３Ｐ−γ−ＡＴＰ及び４μＭ基質ヒストンＨ１でキナーゼアッセイを実施した。
【００９７】
インビトロ細胞増殖アッセイ
Ａ２７８０ヒト卵巣癌及びＭＣＦ７ヒト乳癌細胞（１２５０個／ウェル）を白色３８４ウェルプレートで完全培地（ＲＰＭＩ１６４０又はＥＭＥＭ＋１０％ウシ胎仔血清）に撒き、播種から２４時間後に０．１％ ＤＭＳＯに溶解した化合物で処理した。細胞を３７℃で５％ ＣＯ２下に温置し、７２時間後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の指示に従って使用してプレートを処理した。
【００９８】
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏは代謝活性細胞の指標であるＡＴＰ存在量の定量に基づく均一法である。ルシフェラーゼとＤ−ルシフェリンによる発光に基づくシステムを使用してＡＴＰを定量する。発光シグナルは培養液中に存在する細胞数に比例する。
【００９９】
要約すると、試薬溶液２５μＬ／ウェルを各ウェルに加え、５分間振盪後にルミノメーターによるとマイクロプレートは赤色である。発光シグナルは培養液中に存在する細胞数に比例する。
【０１００】
式（Ｉ）の化合物を上記のように試験した結果、アイソフォームＰＬＫ２及びＰＬＫ３に比較して顕著な選択的ＰＬＫ１阻害活性をもつことが判明した。生化学アッセイにおいて、ＰＬＫ１のＩＣ５０は一般に０．１μＭ未満である。
【０１０１】
１例として、Ｓｔｅｅｇｍａｉｅｒ，Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００７，１７（４），３１６−３２２に記載されている従来技術の最も近縁の化合物（Ｒｅｆ）と比較して上記方法で試験した本発明の式（Ｉ）の代表的な化合物の１例の実験データ（ＩＣ５０）を報告する下表１参照。
【０１０２】
【表１】
【０１０３】
驚くべきことに、本発明の新規化合物はＰＬＫ１生化学アッセイで参照化合物に比較して選択性が高かった。実際に、本発明の式Ｉの化合物はＰＬＫ２／ＰＬＫ１比とＰＬＫ３／ＰＬＫ１比が参照化合物よりも大きい。
【０１０４】
本発明の化合物は単剤として投与することもできるし、細胞増殖抑制剤又は細胞傷害剤、抗生物質型薬剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、ホルモン剤、免疫剤、インターフェロン型薬剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤（例えばＣＯＸ−２阻害剤）、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、テロメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗増殖因子受容体剤、抗ＨＥＲ剤、抗ＥＧＦＲ剤、抗血管新生剤（例えば血管新生阻害剤）、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ｒａｓ−ｒａｆシグナル伝達経路阻害剤、細胞周期阻害剤、他のｃｄｋ阻害剤、チューブリン結合剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤等と共に、放射線療法又は化学療法レジメン等の公知抗癌治療と併用することもできる。
【０１０５】
固定用量として製剤化する場合には、このような併用製剤は下記用量範囲内の本発明の化合物と許容用量範囲内の他の医薬活性剤を併用する。
【０１０６】
併用製剤が不適切な場合には、式（Ｉ）の化合物を公知抗癌剤と順次使用してもよい。
【０１０７】
哺乳動物（例えばヒト）に投与するのに適した本発明の式（Ｉ）の化合物は通常の経路で投与することができ、用量レベルは患者の年齢、体重、状態及び投与経路により異なる。例えば、式（Ｉ）の化合物の経口投与に採用される適切な用量は１回当たり約１０〜約５００ｍｇを１日１〜５回投与することができる。本発明の化合物は各種剤形で投与することができ、例えば錠剤、カプセル剤、糖衣錠、フィルムコーティング錠、溶液剤又は懸濁液剤として経口投与することもできるし、座剤として直腸投与することもできるし、例えば筋肉内又は静脈内及び／又は髄腔内及び／又は脊髄内注射又は輸液により非経口投与することもできる。
【０１０８】
本発明は更に、担体でも希釈剤でもよい医薬的に許容可能な賦形剤と共に式（Ｉ）の化合物又はその医薬的に許容可能な塩を含有する医薬組成物を包含する。
【０１０９】
本発明の化合物を含有する医薬組成物は一般に従来の手法に従って製造され、適切な医薬形態で投与される。例えば、固体経口形態は活性化合物と共に希釈剤（例えばラクトース、デキストロース、サッカロース、スクロース、セルロース、コーンスターチ又はジャガイモ澱粉）；滑沢剤（例えばシリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム及び／又はポリエチレングリコール）；結合剤（例えば澱粉、アラビアガム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース又はポリビニルピロリドン）；崩壊剤（例えば澱粉、アルギン酸、アルギン酸塩又は澱粉グリコール酸ナトリウム）；発泡混合物；色素；甘味剤；湿潤剤（例えばレシチン、ポリソルベート、ラウリル硫酸塩）；及び一般に医薬製剤で使用される薬理的に不活性な非毒性物質を含有することができる。これらの医薬製剤は例えば混合、顆粒化、錠剤化、糖衣又はフィルムコーティング工程により公知の通りに製造することができる。
【０１１０】
経口投与用液体分散液剤としては、例えばシロップ、エマルション及び懸濁液剤が挙げられる。１例として、シロップには担体としてサッカロース又はサッカロースとグリセリン及び／又はマンニトール及びソルビトールを添加することができる。
【０１１１】
懸濁液剤及びエマルションには担体として天然ガム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース又はポリビニルアルコールを添加することができる。筋肉内注射用懸濁液剤又は溶液剤は活性化合物と共に医薬的に許容可能な担体、例えば滅菌水、オリーブ油、オレイン酸エチル、グリコール類（例えばプロピレングリコール）、及び必要に応じて適量の塩酸リドカインを含有することができる。
【０１１２】
静脈内注射又は輸液用溶液剤には担体として滅菌水を加えてもよいし、滅菌等張塩類水溶液でもよく、この形態が好ましいが、担体としてプロピレングリコールを加えてもよい。
【０１１３】
座剤は活性化合物と共に医薬的に許容可能な担体（例えばカカオバター、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル界面活性剤又はレシチン）を含有することができる。
【０１１４】
本発明を更に詳細に例証するために、以下に実施例を記載するが、これらの実施例により本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１１５】
以下の実施例に従って製造した本発明の化合物を１Ｈ ＮＭＲ及びＭＳ分析により特性決定した。
【０１１６】
実施例１
（Ｒ）−８−シクロペンチル−７−エチル−５−メチル−２−［５−（４−メチルピペラジン−１−イル）−２−トリフルオロメトキシフェニルアミノ］−７，８−ジヒドロ−５Ｈ−プテリジン−６−オン（Ｒ１＝ＯＣＦ３，Ｒ２＝４−メチルピペラジン，Ｒ３＝シクロペンチル，Ｒ４＝エチル）
【０１１７】
【化５】
ＷＯ２００４／０７６４５４に記載されているように製造した（Ｒ）−２−クロロ−８−シクロペンチル−７−エチル−５−メチル−７，８−ジヒドロ−５Ｈ−プテリジン−６−オン（０．６０ｇ，２ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ／エタノール２／１混液（６０ｍＬ）に懸濁した懸濁液に３７％ＨＣｌ（０．６ｍＬ）と製造例１に記載したように製造した２−トリフルオロメトキシ−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニルアミン（０．５５ｇ，２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を７２時間還流し、小容量（２０ｍＬ）まで濃縮し、水（３０ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（２×５０ｍＬ）で抽出した。ＮａＨＣＯ３の添加により水相を中和後、ＤＣＭ（２×５０ｍＬ）で抽出した。有機フラクションを合わせて硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を蒸発乾涸した。粗製固形物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（溶離液：ＤＣＭ／ＥｔＯＨ ９０／１０）により精製し、標記化合物を薄茶色固体として得た（０．２３ｇ，２２％収率）。
【０１１８】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ ０．７６（ｔ，Ｊ＝７．５０Ｈｚ，３Ｈ）１．４４（ｍ，２Ｈ）１．６０（ｍ，２Ｈ）１．７３（ｍ，２Ｈ）１．８２（ｍ，４Ｈ）２．２７（ｓ，３Ｈ）２．４９−２．５３（ｍ，４Ｈ）３．０９−３．１８（ｍ，４Ｈ）３．２３（ｓ，３Ｈ）４．１８（ｄｄ，Ｊ＝７．５６，３．６６Ｈｚ，１Ｈ）４．２０−４．２８（ｍ，１Ｈ）６．６７（ｄｄ，Ｊ＝９．１５，３．０５Ｈｚ，１Ｈ）７．１２−７．２１（ｍ，１Ｈ）７．５４（ｄ，Ｊ＝３．０５Ｈｚ，１Ｈ）７．７７（ｓ，１Ｈ）７．９３（ｓ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）：５３４［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１１９】
（上記又は製造例２及び３に記載したように製造した）適切な出発材料を使用して同様の手順により以下の生成物を得ることができる：
（Ｒ）−８−シクロペンチル−７−エチル−２−［２−メトキシ−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニルアミノ］−５−メチル−７，８−ジヒドロ−５Ｈ−プテリジン−６−オン（Ｒ１＝ＯＣＨ３，Ｒ２＝Ａ−メチルピペラジン，Ｒ３＝シクロペンチル，Ｒ４＝エチル）１Ｈ ＮＭＲ（４０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ ０．７８（ｔ，Ｊ＝７．４４Ｈｚ，３Ｈ）１．５７（ｍ，２Ｈ）１．６０（ｍ，２Ｈ）１．７１（ｍ，２Ｈ）１．７３（ｍ，２Ｈ）１．９６（ｍ，２Ｈ）２．２３（ｓ，３Ｈ）２．４５−２．４９（ｍ，４Ｈ）３．０１（ｄ，Ｊ＝５．００Ｈｚ，４Ｈ）３．２５（ｓ，３Ｈ）３．８０（ｓ，３Ｈ）４．１８（ｄｄ，Ｊ＝７．９９，３．７２Ｈｚ，１Ｈ）４．４３−４．５４（ｍ，１Ｈ）６．４９（ｄｄ，Ｊ＝８．７８，２．９３Ｈｚ，１Ｈ）６．８８（ｄ，Ｊ＝８．９０Ｈｚ，１Ｈ）７．４０（ｓ，１Ｈ）７．８３（ｓ，１Ｈ）７．９９（ｄ，Ｊ＝２．９３Ｈｚ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）：４８０［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１２０】
（Ｒ）−８−シクロペンチル−７−エチル−５−メチル−２−［２−メチル−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニルアミノ］−７，８−ジヒドロ−５Ｈ−プテリジン−６−オン（Ｒ１＝ＣＨ３，Ｒ２＝４−メチルピペラジン，Ｒ３＝シクロペンチル，Ｒ４＝エチル）１Ｈ ＮＭＲ（４０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ ０．７７（ｔ，Ｊ＝７．５０Ｈｚ，３Ｈ）１．４１（ｍ，２Ｈ）１．５８（ｍ，２Ｈ）１．７１（ｍ，２Ｈ）１．７４（ｍ，２Ｈ）１．８３（ｍ，２Ｈ）２．１１（ｓ，３Ｈ）２．２２（ｓ，３Ｈ）２．４１−２．４６（ｍ，４Ｈ）３．０１−３．０７（ｍ，４Ｈ）３．２２（ｓ，３Ｈ）４．１２（ｄｄ，Ｊ＝７．８０，３．６６Ｈｚ，１Ｈ）４．１８−４．３１（ｍ，１Ｈ）６．５９（ｄｄ，Ｊ＝８．３５，２．５０Ｈｚ，１Ｈ）７．００（ｄ，Ｊ＝８．４１Ｈｚ，１Ｈ）７．１６（ｄ，Ｊ＝２．５６Ｈｚ，１Ｈ）７．７３（ｓ，１Ｈ）７．８７（ｓ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）：４６４［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１２１】
製造例１
２−トリフルオロメトキシ−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニルアミン三塩酸塩
【０１２２】
【化６】
ステップ１：Ｎ−（５−ブロモ−２−トリフルオロメトキシフェニル）アセトアミド
【０１２３】
【化７】
２−トリフルオロメトキシ−５−ブロモフェニルアミン（５．１２ｇ，２０ｍｍｏｌ）の０℃のＥｔＯＨ（５０ｍＬ）溶液に無水酢酸（４．７ｍＬ，５０ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（１０ｍＬ）溶液を加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を蒸発乾涸し、固形物にジエチルエーテルを加えてトリチュレートし、濾過し、Ｎ−（５−ブロモ−２−トリフルオロメトキシフェニル）アセトアミド５．６４ｇ（９５％収率）を得た。
【０１２４】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：２．１１（ｓ，３Ｈ）７．３９（ｍ，２Ｈ）８．２１（ｓ，１Ｈ）９．８７（ｓ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）：２５７［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１２５】
ステップ２：Ｎ−［２−トリフルオロメトキシ−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニル］アセトアミド
【０１２６】
【化８】
アルゴン置換した丸底フラスコにＰｄ２（ｄｂａ）３（１５７ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）と、２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ビフェニル（１３４．７ｍｇ，０．３４ｍｍｏｌ）と、Ｎ−（５−ブロモ−２−トリフルオロメトキシフェニル）アセトアミド（５．０５ｇ，１７ｍｍｏｌ）を仕込んだ。フラスコを排気し、再びアルゴン置換した。ＬｉＮ（ＴＭＳ）２溶液（１Ｍ ＴＨＦ溶液，３７．６ｍＬ）とＮ−メチルピペラジン（２．３ｍＬ，２０．５ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を３時間還流した。次に反応混合物を室温まで冷却し、濃縮した。粗製固形物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（溶離液：ＤＣＭ／ＥｔＯＨ ９０／１０）により精製し、Ｎ−［２−トリフルオロメトキシ−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニル］アセトアミド４．７８ｇ（８８％収率）を得た。
【０１２７】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：２．０６（ｓ，３Ｈ）２．２２（ｓ，３Ｈ）２．４５（ｍ，４Ｈ）３．１１（ｍ，４Ｈ）６．７５（ｄｄ，Ｊ＝９．１５，３．０５Ｈｚ，１Ｈ）７．１７（ｄｄ，Ｊ＝９．１５，１．４６Ｈｚ，１Ｈ）７．４１（ｂｓ，１Ｈ）９．５４（ｓ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）：２９９［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１２８】
ステップ３：２−トリフルオロメトキシ−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニルアミン三塩酸塩
【０１２９】
【化９】
Ｎ−［２−トリフルオロメトキシ−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニル］アセトアミド（４．７５ｇ，１５ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（１００ｍＬ）溶液をＨＣｌ ３７％（３５ｍＬ）で処理した。還流下に１時間後に混合物を濃縮し、ヘキサンを加えてトリチュレートし、定量的収率で２−トリフルオロメトキシ−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニルアミン三塩酸塩５．７４ｇを得た。
【０１３０】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：２．８２（ｄ，Ｊ＝４．７６Ｈｚ ３Ｈ）３．１（ｍ，４Ｈ）３．４８（ｍ，４Ｈ）６．２４（ｄｄ，Ｊ＝８．９０，２．９３Ｈｚ，１Ｈ）６．４０（ｄ，Ｊ＝２．９３Ｈｚ，１Ｈ）６．９８（ｄｄ，Ｊ＝８．９０，１．３４Ｈｚ，１Ｈ）１０．３１（ｂｓ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）：３１８［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１３１】
製造例２
２−メトキシ−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニルアミン
【０１３２】
【化１０】
ステップ１：１−（４−メトキシ−３−ニトロフェニル）−４−メチルピペラジン
アルゴン置換した丸底フラスコにＰｄ（ＯＡｃ）２（８５ｍｇ，０．３８ｍｍｏｌ）と、２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ビフェニル（２２５ｍｇ，０．５７ｍｍｏｌ）と、Ｋ３ＰＯ４（２．２６ｇ，１０．６８ｍｍｏｌ）と、４−ブロモ−１−メトキシ−２−ニトロベンゼン（１．７７ｇ，７．６３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５０ｍＬ）溶液を仕込んだ。フラスコを排気し、再びアルゴン置換した。Ｎ−メチルピペラジン（１．０１ｍＬ，９．１５ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を７２時間還流した。次に反応混合物を室温まで冷却し、濃縮した。粗製固形物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（溶離液：ＤＣＭ／ＥｔＯＨ ９０／１０）により精製し、標記化合物１．０５ｇ（５５％収率）を得た。
【０１３３】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：２．２２（ｓ，３Ｈ）２．４５（ｍ，４Ｈ）３．０９（ｍ，４Ｈ）３．８３（ｓ，３Ｈ）７．２２（ｄ，Ｊ＝９．２７Ｈｚ，１Ｈ）７．２６（ｄｄ，Ｊ＝９．２７ ａｎｄ ２．９３Ｈｚ，１Ｈ）７．３５（ｄ，Ｊ＝２．９３Ｈｚ，１Ｈ）。
【０１３４】
ステップ２：２−メトキシ−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニルアミン
１−（４−メトキシ−３−ニトロフェニル）−４−メチルピペラジン（１．０ｇ，４．０ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（１００ｍＬ）溶液をＰｄ／Ｃ１０％（１５０ｍｇ）の存在下に３５ｐｓｉで２時間水素化した。混合物をセライトパッドで濾過し、溶液を濃縮し、標記化合物０．８ｇ（９０％収率）を得た。
【０１３５】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：２．２１（ｓ，３Ｈ）２．４３（ｍ，４Ｈ）２．９４（ｍ，４Ｈ）３．６８（ｓ，３Ｈ）４．５５（ｓ，２Ｈ）６．０９（ｄｄ，Ｊ＝８．６６ ａｎｄ ２．８０Ｈｚ，１Ｈ）６．３０（ｄ，Ｊ＝２．８０Ｈｚ，１Ｈ）６．６４（ｄ，Ｊ＝８．６６Ｈｚ，１Ｈ）。
【０１３６】
製造例３
２−メチル−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニルアミン塩酸塩
【０１３７】
【化１１】
ステップ１：メチル−４−（４−メチル−３−ニトロフェニル）ピペラジン。円筒形石英管に４−フルオロ−１−メチル−２−ニトロベンゼン（２０．０ｇ，１２９ｍｍｏｌ）とＮ−メチルピペラジン（２６ｇ，２５８ｍｍｏｌ）を入れた。ＨＰＬＣにより出発材料が消滅したと判断されるまで反応混合物を４８時間２００℃に加熱した。溶媒を減圧除去し、残渣をＤＣＭに溶解した。溶液を２回水洗し、有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を減圧除去した。最終化合物（１４．６５ｇ，４８％収率）を茶色油状物として得た。
【０１３８】
ステップ２：２−メチル−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニルアミン。１−メチル−４−（４−メチル−３−ニトロフェニル）ピペラジン（９．０ｇ，３８．２９ｍｍｏｌ）をエタノール（１００ｍＬ）とシクロヘキセン（７ｍｌ）に溶解した溶液にＰｄ／Ｃ１０％（１．５ｇ）を加えた。ＨＰＬＣにより出発材料が消滅したと判断されるまで反応混合物を８０℃に６時間加熱した。Ｐｄを反応混合物から濾別し、溶媒を濾液から減圧除去した。粗生成物をＤＣＭで希釈し、ＨＣｌジオキサン溶液で処理し、沈殿を採取し、ジエチルエーテルで洗浄し、最終化合物を茶色固体として定量的収率で得た。
【０１３９】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ ２．１０（ｓ，３Ｈ）２．８２（ｓ，３Ｈ）２．９１−３．０１（ｍ，２Ｈ）３．０６−３．２１（ｍ，２Ｈ）３．４９（ｄ，Ｊ＝１４．０２Ｈｚ，２Ｈ）３．６６（ｄ，Ｊ＝１２．４４Ｈｚ，２Ｈ）６．５７（ｂｓ，１Ｈ）６．６３（ｂｓ，１Ｈ）７．０１（ｄ，Ｊ＝７．６８Ｈｚ，１Ｈ）１０．２１（ｂｓ，１Ｈ）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は蛋白質キナーゼの活性を調節する所定の置換ジヒドロプテリジン−６−オン化合物に関する。従って、本発明の化合物は蛋白質キナーゼ活性の調節異常に起因する疾患の治療に有用である。本発明はこれらの化合物の製造方法、これらの化合物を含有する医薬組成物、及びこれらの化合物を含有する医薬組成物を使用する疾患の治療方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
癌治療における有糸分裂阻害剤の使用は広範なヒト癌の治療に広く受け入れられている臨床ストラテジーである。タキサン類（パクリタキセルとドセタキセル）とニチニチソウアルカロイド類（ビンクリスチンとビンブラスチン）は微小管を安定化又は不安定化することにより作用し、有糸分裂進行中の細胞に破滅的結末をもたらす。これらの薬剤は数種類の腫瘍型の一次治療薬であり、シスプラチン耐性の卵巣癌、乳癌、肺癌、膀胱癌及び十二指腸癌の二次治療薬である（タキサン類）。しかし、細胞運動、食作用及び軸索輸送等のプロセスにおける微小管の役割により、これらの薬剤では末梢神経障害等の所定の障害が頻繁に認められる。有糸分裂の進行は全増殖細胞の要件であるため、有糸分裂を標的とする癌治療は一般に広範な腫瘍型に適用可能である。数種類の蛋白質キナーゼは細胞周期の調整に重要な役割を果たし、そのうちには、Ｃｄｋ−２やＡｕｒｏｒａ−Ａのように既に腫瘍学の場で標的治療の対象となっているものもある。有糸分裂の忠実性は最も重要であり、細胞周期中に染色体の完全性を維持するために正常細胞には数個の「チェックポイント」が存在する。これらのチェックポイントは癌化中に破綻することが多く、そのため、癌細胞では異数性や染色体不安定性が生じる。癌細胞は異常な有糸分裂を進行させようとするので、「チェックポイント機能の低下した」腫瘍細胞で有糸分裂を阻害すると、破滅的結末につながると考えられる。
【０００３】
有糸分裂の開始、進行及び終了には４種類のセリン／スレオニンキナーゼ（Ｐｌｋ−１〜４）を含むポロ様キナーゼファミリーが主に関与している。これらのキナーゼはｎ末端キナーゼドメインと、ユニークなｃ末端「ポロボックス」ドメインをもつことを特徴とする。このドメインは各種有糸分裂構造（中心体、動原体、紡錘体極、中央体）にキナーゼを送達するのに関与しており、有糸分裂の正常な進行にはＰｌｋの時間的及び空間的制御が重要である（ｖａｎ Ｖｕｇｔ ａｎｄ Ｍｅｄｅｍａ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００５，２４（１７）：２８４４−５９；Ｂａｒｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００４，５（６）：４２９−４０；Ｄａｉ ａｎｄ Ｃｏｇｓｗｅｌｌ，Ｐｒｏｇ Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ Ｒｅｓ．２００３，５：３２７−３４；Ｇｌｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１９９８，１２（２４）：３７７７−８７に概説）。このファミリーのメンバーで最も詳細に特性決定されているのはＰｌｋ−１であり、その酵素活性はＧ２／Ｍ期遷移、中心体成熟及び分離、前期の染色体アーム凝集と中期／後期遷移時の姉妹染色分体分離の制御、有糸分裂終了を開始するための後期促進複合体の活性化、細胞質分裂等の有糸分裂中の数種類のプロセスに関係があるとされている（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ，ＥＭＢＯ Ｊ．２００５，２４（５）：１０５７−６７；ｖａｎ Ｖｕｇｔ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００４，９（３５）：３６８４１−５４；Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００４，１０１（１３）：４４１９−２４ ２００４；Ｎａｋａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００３，２７８（２８）：２５２７７−８０；Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ−Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００２，２７７（５０）：４８８８４−８；Ｂａｒｔｈｏｌｏｍｅｗ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２００１ ２１（１５）：４９４９−５９；Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ．２００１，１２（６）：１７９１−９；Ｒｏｓｈａｋ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ．２０００，１２（６）：４０５−１１）。Ｐｌｋ−１は乳癌、卵巣癌、非小細胞肺癌、結腸癌、頭頸部癌、子宮内膜癌及び十二指腸癌を含む数種類の腫瘍細胞で過剰発現され、その過剰発現は予後不良に相関することが多い。
【０００４】
正常細胞では「チェックポイントによる」細胞周期停止を生じるが、腫瘍細胞では各種手段（ｓｉＲＮＡ及びアンチセンス切断、ドミナントネガティブ蛋白質及び免疫除去）によりＰｌｋ−１機能が妨害される結果、異常な有糸分裂を生じ、延いては有糸分裂の破綻に至る。従って、薬物でＰｌｋ−１機能を低下させると、数種類の多様な癌の治療に治療効果があると思われる。細胞周期における有糸分裂阻止とアポトーシスを生じるにはＰＬＫ１の阻害で十分であり、細胞周期遮断にこのファミリーの他の２つのメンバーの阻害は不可欠ではなく、むしろ、血液悪性腫瘍や神経障害等の副作用を招く場合もある。文献に報告されているように、Ｐｌｋ２はＢ細胞新生物で転写がダウンレギュレートされる。バーキットリンパ腫（ＢＬ）では非常に高頻度でサイレンシングが生じるが、他の型のＢ細胞新生物でも検出され、異常なシトシンメチル化に結び付けられる。ＢＬ細胞でＳｎｋ／Ｐｌｋ２の異所性発現の結果、アポトーシスが生じたことから、ＰＬＫ２はＢ細胞新生物形成において腫瘍サプレッサーとしての役割を果たす可能性がある（Ｓｙｅｄ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２００６，１０７，２５０−２５６）。更に、ＰＬＫ２とＰＬＫ３はいずれもニューロンシナプス可塑性において有糸分裂以外の重要な役割を果たすことが報告されている（Ｐａｋ，Ｄ．Ｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，３０２，１３８６−１３７３；Ｋａｕｓｅｌｍａｎｎ，Ｇ．ＥＭＢＯ Ｊ．１９９９，１８，５５２８−５５３９）。
【０００５】
Ｗａｒｎｅｒ Ｌａｍｂｅｒｔ Ｃｏ．名義のＷＯ２００１／０１９８２５には癌等の細胞増殖性疾患の治療用としてのプテリジン誘導体が開示されている。
【０００６】
いずれもＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｐｈａｒｍａ名義のＷＯ２００３／０２０７２２、ＷＯ２００４／０７６０５４及びＷＯ２００７／０９０８４４には細胞増殖性疾患の治療用としてのジヒドロプテリジン−６−オン誘導体とその塩も開示されている。
【０００７】
これらの開発にも拘わらず、前記疾患に有効な薬剤が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００１／０１９８２５号
【特許文献２】国際公開第２００３／０２０７２２号
【特許文献３】国際公開第２００４／０７６０５４号
【特許文献４】国際公開第２００７／０９０８４４号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ｖａｎ Ｖｕｇｔ ａｎｄ Ｍｅｄｅｍａ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００５，２４（１７）：２８４４−５９
【非特許文献２】Ｂａｒｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００４，５（６）：４２９−４０
【非特許文献３】Ｄａｉ ａｎｄ Ｃｏｇｓｗｅｌｌ，Ｐｒｏｇ Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ Ｒｅｓ．２００３，５：３２７−３４
【非特許文献４】Ｇｌｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１９９８，１２（２４）：３７７７−８７
【非特許文献５】Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ，ＥＭＢＯ Ｊ．２００５，２４（５）：１０５７−６７
【非特許文献６】ｖａｎ Ｖｕｇｔ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００４，９（３５）：３６８４１−５４
【非特許文献７】Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００４，１０１（１３）：４４１９−２４ ２００４
【非特許文献８】Ｎａｋａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００３，２７８（２８）：２５２７７−８０
【非特許文献９】Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ−Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００２，２７７（５０）：４８８８４−８
【非特許文献１０】Ｂａｒｔｈｏｌｏｍｅｗ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２００１ ２１（１５）：４９４９−５９
【非特許文献１１】Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ．２００１，１２（６）：１７９１−９
【非特許文献１２】Ｒｏｓｈａｋ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ．２０００，１２（６）：４０５−１１
【非特許文献１３】Ｓｙｅｄ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２００６，１０７，２５０−２５６
【非特許文献１４】Ｐａｋ，Ｄ．Ｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，３０２，１３８６−１３７３
【非特許文献１５】Ｋａｕｓｅｌｍａｎｎ，Ｇ．ＥＭＢＯ Ｊ．１９９９，１８，５５２８−５５３９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは以下に記載する式（Ｉ）の化合物が選択的ＰＬＫ１阻害剤であり、従って、抗腫瘍薬として治療面で有用であり、しかも毒性と副作用の両面において、現在入手可能な抗腫瘍薬に付随する上記欠点を伴わないことを今般発見した。
【００１１】
従って、本発明の第１の目的は式（Ｉ）：
【００１２】
【化１】
［式中、
Ｒ１は直鎖又は分岐鎖Ｃ１−Ｃ３アルキル、Ｃ１−Ｃ３アルコキシ、Ｃ１−Ｃ３ポリフッ化アルキル、Ｃ１−Ｃ３ポリフッ化アルコキシ及び−ＣＯＲ’（式中、Ｒ’は置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキルである。）から選択される置換されていてもよい基であり；
Ｒ２は−ＮＲ”Ｒ”’基（式中、Ｒ”及びＲ”’は各々独立して水素又は直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル及び複素環から選択される置換されていてもよい基である。）であり、あるいはＲ”とＲ”’はそれらが結合している窒素原子と一緒になり、Ｎ、Ｏ又はＳから選択される更に１個のヘテロ原子を含んでもよい置換されていてもよい複素環を形成してもよく；
Ｒ３及びＲ４は各々独立して水素又は直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル及び複素環から選択される置換されていてもよい基である。］により表される置換ジヒドロプテリジン−６−オン化合物及びその医薬的に許容可能な塩を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は更に、標準合成変換から構成される方法により製造される式（Ｉ）により表される置換ジヒドロプテリジン−６−オン化合物の合成方法を提供する。
【００１４】
本発明は更に蛋白質キナーゼ活性、特にＰＬＫファミリー、ＡＢＬ、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、ＡＵＲ１、ＡＵＲ２、ＢＲＫ、ＣＤＣ７／ＤＢＦ４、ＣＤＫ２／ＣＹＣＡ、ＣＨＫ１、ＣＫ２、ＥＧＦＲ１、ＥＲＫ２、ＦＡＫ、ＦＧＦＲ１、ＦＬＴ３、ＧＳＫ３β、ＩＧＦＲ１、ＩＫＫ２、ＩＲ、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＩＴ、ＬＣＫ、ＭＡＰＫＡＰＫ２、ＭＥＴ、ＭＰＳ１、ＮＥＫ６、ＮＩＭ１、Ｐ３８α、ＰＡＫ４、ＰＤＧＦＲ、ＰＤＫ１、ＰＩＭ１、ＰＫＡα、ＰＫＣβ、ＰＬＫ１、ＲＥＴ、ＳＴＬＫ２、ＳＵＬＵ１、ＴＲＫＡ、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＺＡＰ７０の調節異常に起因及び／又は付随する疾患の治療方法を提供し、特に、上記化合物はＰＬＫ２及びＰＬＫ３に比較してＰＬＫ１キナーゼに対する選択的活性を示した。
【００１５】
本発明の好ましい１方法は癌、細胞増殖性疾患、自己免疫疾患及び神経変性疾患から構成される群から選択される蛋白質キナーゼ活性の調節異常に起因及び／又は付随する疾患の治療方法である。
【００１６】
本発明の別の好ましい方法は特定種の癌の治療方法であり、限定されないが、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌（小細胞肺癌を含む。）、十二指腸癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、子宮頸癌、甲状腺癌、前立腺癌及び皮膚癌（扁平上皮細胞癌を含む。）等の癌；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、毛様細胞リンパ腫及びバーキットリンパ腫等のリンパ系造血器腫瘍；急性及び慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群並びに前骨髄球性白血病等の骨髄系造血器腫瘍；線維肉腫及び横紋筋肉腫等の間葉系腫瘍；星状細胞腫、神経細胞芽腫、神経膠腫及びシュワン細胞腫等の中枢及び末梢神経系腫瘍；メラノーマ、セミノーマ、奇形癌腫、骨肉腫、色素性乾皮症、ケラトキサントーマ、甲状腺濾胞癌及びカポジ肉腫等の他の腫瘍が挙げられる。
【００１７】
本発明の別の好ましい方法は例えば良性前立腺過形成、家族性大腸腺腫症、神経線維腫症、乾癬、アテローム性動脈硬化症に伴う血管平滑筋細胞増殖、肺線維症、関節炎、糸球体腎炎並びに手術後狭窄及び再狭窄等の特定の細胞増殖性疾患の治療方法である。
【００１８】
本発明は更に抗癌治療で同時、別個又は順次使用するために放射線療法又は化学療法レジメンと式（Ｉ）の化合物を併用する治療方法を提供する。
【００１９】
更に、本発明はＰＬＫ−１蛋白質活性の阻害方法として、前記蛋白質を有効量の式（Ｉ）の化合物と接触させる段階を含む方法を提供する。
【００２０】
本発明は更に、式（Ｉ）の１種以上の化合物又はその医薬的に許容可能な塩と、医薬的に許容可能な賦形剤、担体又は希釈剤を含有する医薬組成物を提供する。
【００２１】
本発明は更に、公知細胞増殖抑制剤又は細胞傷害剤、抗生物質型薬剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、ホルモン剤、免疫剤、インターフェロン型薬剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤（例えばＣＯＸ−２阻害剤）、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、テロメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗増殖因子受容体剤、抗ＨＥＲ剤、抗ＥＧＦＲ剤、抗血管新生剤（例えば血管新生阻害剤）、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ｒａｓ−ｒａｆシグナル伝達経路阻害剤、細胞周期阻害剤、他のｃｄｋ阻害剤、チューブリン結合剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤等と共に式（Ｉ）の化合物を含有する医薬組成物を提供する。
【００２２】
更に、本発明は抗癌治療で同時、別個又は順次使用するための併用製剤として、上記式（Ｉ）の化合物又はその医薬的に許容可能な塩と、１種以上の化学療法剤を含む製剤又はキットを提供する。
【００２３】
更に別の側面において、本発明は医薬用としての上記式（Ｉ）の化合物又はその医薬的に許容可能な塩を提供する。
【００２４】
更に、本発明は癌の治療方法で使用するための上記式（Ｉ）の化合物又はその医薬的に許容可能な塩を提供する。
【００２５】
最後に、本発明は抗腫瘍活性をもつ医薬の製造における上記式（Ｉ）の化合物又はその医薬的に許容可能な塩の使用を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
特に指定しない限り、式（Ｉ）の化合物自体とその任意医薬組成物又は前記化合物を含む任意治療処置に言及する場合には、本発明は本発明の化合物の水和物、溶媒和物、複合体、代謝産物、プロドラッグ、担体、Ｎ−オキシド及び医薬的に許容可能な塩の全てを包含する。
【００２７】
式（Ｉ）の化合物の代謝産物とは、式（Ｉ）のこの同一化合物が例えば治療を必要とする哺乳動物に投与後にインビボ変換される任意化合物である。限定例ではないが、一般に、式（Ｉ）の化合物の投与後にこの同一誘導体は各種化合物に変換される場合があり、例えば排泄し易い水酸化誘導体等の溶解度の高い誘導体が挙げられる。従って、この場合に存在する代謝経路に応じて、これらの水酸化誘導体の任意のものを式（Ｉ）の化合物の代謝産物とみなすことができる。
【００２８】
プロドラッグとは、式（Ｉ）の活性な親薬剤をインビボ放出する任意共有結合化合物である。
【００２９】
本発明の化合物にキラル中心又は別の形態の異性体中心が存在する場合には、エナンチオマーとジアステレオマーを含むこのような異性体の全形態を本発明に含むものとする。キラル中心を含む化合物はエナンチオリッチな混合物であるラセミ混合物として使用してもよいし、周知技術を使用してラセミ混合物を分離し、個々のエナンチオマーを単独で使用してもよい。化合物が不飽和炭素−炭素二重結合をもつ場合には、シス（Ｚ）異性体とトランス（Ｅ）異性体の両方が本発明の範囲に含まれる。
【００３０】
化合物がケト−エノール互変異性体等の互変異性体として存在している場合もあるが、そのような場合には、平衡状態で存在しているか又は主に一方の形態で存在しているかに関係なく、各互変異性体を本発明に含むものとする。
【００３１】
本明細書において、「直鎖又は分岐鎖アルキル」なる用語は特に指定しない限り、夫々炭素原子数１〜６と１〜３のアルキル基であるＣ１−Ｃ６アルキル基とＣ１−Ｃ３アルキル基（例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル等）を意味する。
【００３２】
Ｃ１−Ｃ３アルコキシなる用語は、酸素原子（−Ｏ−）を介して分子の残余と結合した上記Ｃ１−Ｃ３アルキル基の任意のものを意味する。
【００３３】
Ｃ１−Ｃ３ポリフッ化アルキル又はアルコキシなる用語は、２個以上のフッ素原子で置換された上記直鎖又は分岐鎖Ｃ１−Ｃ３アルキル又はアルコキシ基の任意のもの（例えばトリフルオロメチル、トリフルオロエチル、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロピル、トリフルオロメトキシ等）を意味する。
【００３４】
「Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル」なる用語は特に指定しない限り、１個以上の二重結合を含んでいてもよいが、完全共役π電子系をもたない３〜６員炭素単環を意味する。シクロアルキル基の例は限定されないが、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロペンテン、シクロヘキサン、シクロヘキセン及びシクロヘキサジエンである。
【００３５】
「複素環」なる用語は１個以上の炭素原子が窒素、酸素及び硫黄等のヘテロ原子で置換された３〜７員飽和又は部分不飽和炭素環を意味する。ヘテロシクロアルキル基の非限定的な例は例えばピラン、ピロリジン、ピロリン、イミダゾリン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、ピラゾリン、チアゾリン、チアゾリジン、ジヒドロフラン、テトラヒドロフラン、１，３−ジオキソラン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン等である。
【００３６】
必要に応じて、上記置換基は各々更に上記基の１個以上で置換されていてもよい。
【００３７】
式（Ｉ）の化合物の医薬的に許容可能な塩としては、無機酸又は有機酸（例えば硝酸、塩酸、臭化水素酸、硫酸、過塩素酸、リン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、蓚酸、フマル酸、マロン酸、リンゴ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、イセチオン酸及びサリチル酸）との酸付加塩が挙げられる。本発明の化合物の酸付加塩は塩酸塩とメシル酸塩から選択することが好ましい。
【００３８】
式（Ｉ）の化合物の医薬的に許容可能な塩としては更に無機塩基又は有機塩基（例えばアルカリ又はアルカリ土類金属、特にナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム又はマグネシウムの水酸化物、炭酸塩又は重炭酸塩、非環状又は環状アミン、好ましくはメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン等）との塩が挙げられる。
【００３９】
好ましい１分類の式（Ｉ）の化合物は、Ｒ４が置換されていてもよい直鎖又は分岐鎖Ｃ１−Ｃ６アルキルである化合物である。
【００４０】
別の好ましい分類の式（Ｉ）の化合物は、Ｒ１が−ＯＣＦ３、−ＯＣＨ３、−ＣＨ３及び−ＣＯＲ’（式中、Ｒ’は上記に定義した通りである。）から選択される基であり；
Ｒ２がメチルピペラジニル基：
【００４１】
【化２】
であり；
Ｒ３がＣ３−Ｃ６シクロアルキルである化合物である。
【００４２】
特に好ましい式（Ｉ）の化合物は以下の化合物：
（Ｒ）−８−シクロペンチル−７−エチル−５−メチル−２−［５−（４−メチルピペラジン−１−イル）−２−トリフルオロメトキシフェニルアミノ］−７，８−ジヒドロ−５Ｈ−プテリジン−６−オン、
（Ｒ）−８−シクロペンチル−７−エチル−２−［２−メトキシ−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニルアミノ］−５−メチル−７，８−ジヒドロ−５Ｈ−プテリジン−６−オン、及び
（Ｒ）−８−シクロペンチル−７−エチル−５−メチル−２−［２−メチル−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニルアミノ］−７，８−ジヒドロ−５Ｈ−プテリジン−６−オンである。
【００４３】
必要に応じて医薬的に許容可能な塩の形態である本発明の式（Ｉ）の任意の特定の化合物については、実験のセクションと特許請求の範囲参照。
【００４４】
本発明は更に、
１）式（ＩＩ）：
【００４５】
【化３】
（式中、Ｒ３及びＲ４は上記に定義した通りである。）の化合物を式（ＩＩＩ）：
【００４６】
【化４】
（式中、Ｒ１及びＲ２は上記に定義した通りである。）の化合物と反応させ、式（Ｉ）の化合物を得る段階と、
必要に応じてその医薬的に許容可能な塩に変換する段階を含むことを特徴とする上記式（Ｉ）の化合物の製造方法を提供する。
【００４７】
上記方法は類推方法であり、当分野で周知の手法により実施することができる。
【００４８】
上記方法の段階１によると、式（ＩＩ）の化合物と式（ＩＩＩ）の化合物の反応は従来の手法に従って種々の様式で実施することができる。エタノール又は水又はその混液等の適切な溶媒中で酸性条件（例えばＨＣｌ）下に室温から約１００℃までの温度にて約２〜約４８時間実施することが好ましい。
【００４９】
式（Ｉ）の化合物の製造方法の任意変法によると、出発材料と他の任意反応成分は公知であるか又は公知手法により容易に製造される。式（ＩＩ）の化合物はＷＯ２００３／０２０７２２及びＷＯ２００４／０７６４５４に記載されているように製造することができる。式（ＩＩＩ）の化合物は市販品もあるし、下記製造例２〜４に記載するように類推により製造できるものもある。
【００５０】
以上から当業者に自明の通り、上記方法により式（Ｉ）の化合物を製造する際に、出発材料又はその中間体内に官能基が存在している場合には望ましくない副反応を生じる可能性があるので、従来の手法により適正に保護する必要がある。同様に、これらの出発材料等から遊離脱保護化合物への変換も公知手順により実施することができる。
【００５１】
容易に理解される通り、上記方法により製造される式（Ｉ）の化合物が異性体の混合物として得られる場合には、従来の手法を使用して式（Ｉ）の単一異性体に分離する方法又は従来のラセミ分割法としては、例えばジアステレオマー塩誘導体の分別結晶や分取キラルＨＰＬＣが本発明の範囲内に含まれる。従来のラセミ分割法としては、例えばジアステレマー塩誘導体の分別結晶や分取キラルＨＰＬＣが挙げられる。
【００５２】
薬理作用
式（Ｉ）の化合物は蛋白質キナーゼ阻害剤として活性であるため、例えば腫瘍細胞の無制御な増殖を制限するために有用である。治療面では、上記腫瘍等の各種腫瘍の治療に加え、良性前立腺過形成、家族性大腸腺腫症、神経線維腫症、乾癬、アテローム性動脈硬化症に伴う血管平滑筋細胞増殖、肺線維症、関節炎、糸球体腎炎並びに手術後狭窄及び再狭窄等の他の細胞増殖性疾患の治療にも使用することができる。
【００５３】
推定ＰＬＫ−１阻害剤の阻害活性と選択化合物の効力を下記アッセイにより測定した。
【００５４】
本明細書で使用する短縮形と略語は以下の意味である：
Ｃｉ キュリー
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＫＤａ キロダルトン
μＣｉ マイクロキュリー
ｍｇ ミリグラム
μｇ マイクログラム
ｎｇ ナノグラム
Ｌ リットル
ｍＬ ミリリットル
μＬ マイクロリットル
Ｍ モル
ｍＭ ミリモル
μＭ マイクロモル
ｎＭ ナノモル
Ｅｔ エチル。
【００５５】
組換えＰＬＫ１キナーゼドメインのクローニング、発現及び精製
ｉｍａＧｅｎｅｓからクローンＩＲＡＴｐ９７０Ａ０７８Ｄとして購入した全長ヒトＰＬＫ１遺伝子からＰＬＫ１キナーゼドメイン（全長配列の残基２〜３４５に対応，Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセション番号Ｐ５３３５０参照）をＰＣＲ増幅した。
【００５６】
フォワードオリゴヌクレオチド：
５’ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＡＴＴＣＧＡＡＡＡＣＣＴＧＴＡＴＴＴＴＣＡＧＧＧＣＣＣＴＡＧＴＧＣＴＧＣＡＧＴＧＡＣＴＧＣＡＧＧＧＡＡＧ３’［配列番号１］
とリバースオリゴヌクレオチド：
５’ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＣＡＣＴＡＴＴＴＡＴＴＧＡＧＧＡＣＴＧＴＧＡＧＧＧＧＣＴＴ−３’［配列番号２］
を使用して増幅を実施した。
【００５７】
クローニングの目的で、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）テクノロジー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用するクローニングに適したａｔｔＢで挟まれたＰＣＲ産物を得るためにａｔｔＢ部位をオリゴヌクレオチドに付加した。更に、精製の目的で、ＴＥＶ（登録商標）開裂部位（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をフォワードプライマーに付加した。得られたＰＣＲ産物をｐＤＯＮＲ２２１プラスミドにクローニングした後、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）に対応するように改変したバキュロウイルス発現ベクターｐＶＬ１３９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入した。発現と精製の目的で、ＨｉｓタグをＰＬＫキナーゼドメインのＮ末端に付加した。Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）マニュアルに記載されているプロトコルに従ってクローニングを実施した。
【００５８】
ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（登録商標）トランスフェクションキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用してＳｆ９昆虫細胞に発現ベクターとウイルスＤＮＡを同時トランスフェクトすることによりバキュロウイルスを作製した。５日後にウイルス上清を回収し、３回増幅してウイルス力価を増加した。Ｈｉｇｈ５昆虫細胞に感染させることにより組換え蛋白質を産生させた。４８時間感染後に細胞を回収し、ペレット化し、−８０℃で凍結させた。組換え蛋白質を精製するために、ペレットを解凍し、溶解用緩衝液（ＰＢＳ，ＮａＣｌ １５０ｍＭ，ＣＨＡＰＳ ０．１％，ＤＴＴ ２０ｍＭ，グリセロール１０％，プロテアーゼ阻害剤）に再懸濁し、音波処理により溶解させた。遠心により溶解液を清澄化し、Ｎｉｃｈｅｌアフィニティーカラムにロードした。十分に洗浄後、ＴＥＶ（登録商標）プロテアーゼの存在下で温置することにより組換え蛋白質を開裂及び溶出させた。
【００５９】
ＰＬＫ−１キナーゼ活性の阻害剤の生化学アッセイ
トランスリン酸化アッセイを使用して推定キナーゼ阻害剤の阻害活性と選択化合物の効力を測定した。
【００６０】
ＡＴＰ（３３Ｐ−γ−ＡＴＰで追跡）と、それ自体の最適な緩衝液及び補因子の存在下で夫々の特異的なセリン−スレオニン又はチロシンキナーゼにより特定ペプチド又は蛋白質基質をトランスリン酸化する。
【００６１】
リン酸化反応後に、９８％を上回る非放射性ＡＴＰと放射性ＡＴＰを過剰のイオン交換ダウエックス樹脂に吸着させた後、樹脂を重力により反応プレートの底に沈降させる。
【００６２】
次にリン酸化基質を含有する上清を回収し、計数用プレートに導入後、β線計数により評価する。
【００６３】
試薬／アッセイ条件
ｉ．ダウエックス樹脂調製
湿潤樹脂（ＳＩＧＭＡ，特注製造樹脂ＤＯＷＥＸ １×８ ２００〜４００メッシュ，２．５Ｋｇ）５００ｇを計量し、１５０ｍＭギ酸ナトリウム，ｐＨ３．００で２Ｌまで希釈する。樹脂を（数時間）沈降させた後、上清を捨てる。２〜３日間かけて上記のように３回洗浄後、樹脂を沈降させ、上清を捨て、ペレット１容量当たり１５０ｍＭギ酸ナトリウム緩衝液２容量を加える。その後、ｐＨを測定すると、３．００前後になる。洗浄した樹脂は１週間以上安定であり、ストック樹脂を使用時まで４℃に維持する。
【００６４】
ｉｉ．キナーゼ緩衝液（ＫＢ）
ＰＬＫ１アッセイのキナーゼ緩衝液は１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ＤＴＴ，３μＭ ＮａＶＯ３，０．２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ，及び１０ｍＭ β−グリセロリン酸を添加した５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．９から構成した。
【００６５】
ｉｉｉ．アッセイ条件
ＰＬＫ−１の最終酵素濃度を３ｎＭとし、４０μＭ ＡＴＰ、３ｎＭ ３３Ｐ−γ−ＡＴＰ及び８５μＭ基質α−カゼインＳＩＧＭＡ，＃Ｃ−３２４０の存在下でキナーゼアッセイを実施した。
【００６６】
自動化ダウエックスアッセイ
１）３×酵素ミックス（３倍量のキナーゼ緩衝液で調製），５μＬ／ウェル
２）３×基質及びＡＴＰミックス（ｄｄＨ２Ｏで調製）に３３Ｐ−γ−ＡＴＰを添加，５μＬ／ウェル
３）３×試験化合物（３％ＤＭＳＯのｄｄＨ２Ｏ溶液で希釈）−５μＬ／ウェル。
【００６７】
化合物希釈及びアッセイスキームを以下に規定する。
【００６８】
ｉ．化合物の希釈
試験化合物を１００％ＤＭＳＯに溶解した１０ｍＭストック溶液を９６ウェル１２×８フォーマットマイクロタイタープレートに分配した。
【００６９】
％阻害試験では、１００％ＤＭＳＯで１ｍＭ、１００μＭ及び１０μＭの個々の希釈プレートを調製後、３％ＤＭＳＯのｄｄＨ２Ｏ溶液で３×濃度（３０、３及び０．３μＭ）に希釈する。Ｍｕｌｔｉｍｅｋ ９６（Ｂｅｃｋｍａｎ）を希釈に使用し、化合物を試験プレートに分注する。
【００７０】
ＩＣ５０測定では、化合物を１ｍＭ，１００％ＤＭＳＯ溶液としてマイクロタイタープレートの最初のカラム（Ａ１〜Ｇ１）に１００μＬずつ加える。
【００７１】
プレートの全７種の化合物でカラムＡ１からＡ１０まで３％ＤＭＳＯ水溶液による３倍系列希釈にＢｉｏｍｅｋ ２０００（Ｂｅｃｋｍａｎ）を使用する。標準実験では、全化合物の最高濃度を３０μＭとした後、最終試験混合物で１０μＭまで希釈する。
【００７２】
ｉｉ．アッセイスキーム
化合物希釈液（３×）５μＬでＶ字底３８４ウェルプレート（試験プレート）を調製後、酵素ミックス（３×）用リザーバ１個とＡＴＰミックス（３×）用リザーバ１個と共にＰｌａｔｅＴｒａｋ １２自動化ステーション（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ；ロボットはアッセイ開始用の３８４チップ分注ヘッド１個と樹脂分配用の９６チップヘッド１個をもつ）に配置する。試験開始時にロボットはＡＴＰミックス５μＬを吸引し、チップの内側に空隙（３μＬ）を作り、ＰＬＫ１ミックス５μＬを吸引する。その後、プレートに分配し、ロボット自体で３サイクル混合後にキナーゼ反応を開始する。
【００７３】
この時点で全試薬に適正な濃度が回復される。
【００７４】
ロボットはプレートを６０分間室温で温置した後、ダウエックス樹脂懸濁液７０μＬを反応ミックスに分注することにより反応を停止する。樹脂の添加直後に３サイクル混合を行う。
【００７５】
全プレートの停止後に今度は正常チップを使用して更に１サイクル混合を実施した後、ＡＴＰ吸着を最大限にするようにプレートを約１時間静置する。この時点で上清２０μＬをＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ ４０（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）７０μＬと共に３８４−Ｏｐｔｉｐｌａｔｅｓ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）に導入し、オービタルシェーカーで５分間振盪後、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｔｏｐ Ｃｏｕｎｔ放射能カウンターでプレートを読取る。
【００７６】
ｉｉｉ．データ分析
一次アッセイには阻害率％を提供し、二次アッセイ／ヒット確認ルーチンにはＩＣ５０測定用に１０倍系列希釈曲線のＳ字フィッティングを提供するＳＷパッケージ「Ａｓｓａｙ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ」の社内カスタマイズ版によりデータを分析する。
【００７７】
組換えＰＬＫ２キナーゼドメインのクローニング、発現及び精製
ヒト精巣ｃＤＮＡライブラリーからＰＬＫ２キナーゼドメイン（全長配列の残基２〜３７５に対応，Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセション番号Ｑ９ＮＹＹ３参照）をＰＣＲ増幅した。フォワードオリゴヌクレオチド：
５’ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＡＣＴＧＧＡＡＧＴＴＣＴＧＴＴＣＣＡＧＧＧＧＣＣＣＧＡＧＣＴＴＴＴＧＣＧＧＡＧＣＡＴＣＡＣＣＴＡＣＣ−３’［配列番号３］
とリバースオリゴヌクレオチド：
５’ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＴＡＴＴＴＧＣＣＡＣＣＡＡＡＡＡＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣ−３’［配列番号４］
を使用して増幅を実施した。
【００７８】
クローニングの目的で、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）テクノロジー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用するクローニングに適したａｔｔＢで挟まれたＰＣＲ産物を得るためにａｔｔＢ部位をオリゴヌクレオチドに付加した。更に、精製の目的でＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）開裂部位（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をフォワードプライマーに付加した。得られたＰＣＲ産物をＧａｔｅｗａｙ（登録商標）に対応するように改変したバキュロウイルス発現ベクターｐＶＬ１３９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。発現と精製の目的で、ＧＳＴタグを両方のＰＬＫキナーゼドメインのＮ末端に付加した。Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）マニュアルに記載されているプロトコルに従ってクローニングを実施した。
【００７９】
ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（登録商標）トランスフェクションキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用してＳｆ９昆虫細胞に発現ベクターとウイルスＤＮＡを同時トランスフェクトすることによりバキュロウイルスを作製した。５日後にウイルス上清を回収し、３回増幅してウイルス力価を増加した。Ｈｉｇｈ５昆虫細胞に細胞１０９個当たりウイルス上清３ｍｌを細胞１×１０６個／ｍｌの密度で感染させることにより組換え蛋白質を産生させた。４８時間感染後に細胞を回収し、ペレット化し、−８０℃で凍結させた。組換え蛋白質を精製するために、ペレットを解凍し、溶解用緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４ ５０ｍＭ，ＮａＣｌ １５０ｍＭ，ＣＨＡＰＳ ０．２％，ＤＴＴ ２０ｍＭ，グリセロール１０％）に再懸濁し、音波処理により溶解させた。２４０００ｇで３０分間遠心により溶解液を清澄化し、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦ（登録商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムにロードした。十分に洗浄後、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）プロテアーゼの存在下で温置することにより組換え蛋白質を開裂及び溶出させた。
【００８０】
ＰＬＫ−２キナーゼ活性の阻害剤の生化学アッセイ
ＰＬＫ−１酵素について記載したと同様にインビトロキナーゼ阻害アッセイを実施した。
【００８１】
ｉ．ＰＬＫ−２のキナーゼ緩衝液（ＫＢ）
キナーゼ緩衝液は５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．９，５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ＤＴＴ，３μＭ ＮａＶＯ３，１０ｍＭ β−グリセロリン酸及び０．２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡから構成した。
【００８２】
ｉｉ．ＰＬＫ−２のアッセイ条件（終濃度）
酵素濃度５ｎＭ、２００μＭ ＡＴＰ、３ｎＭ ３３Ｐ−γ−ＡＴＰ及び１７５μＭ基質α−カゼインＳＩＧＭＡ，＃Ｃ−３２４０でキナーゼアッセイを実施した。
【００８３】
組換えＰＬＫ３キナーゼドメインのクローニング、発現及び精製
ヒト精巣ｃＤＮＡライブラリーからＰＬＫ３キナーゼドメイン（全長配列の残基２〜３５５に対応，Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセション番号Ｑ９Ｈ４Ｂ４参照）をＰＣＲ増幅した。フォワードオリゴヌクレオチド：
５’ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＡＣＴＧＧＡＡＧＴＴＣＴＧＴＴＣＣＡＧＧＧＧＣＣＣＧＡＧＣＣＴＧＣＣＧＣＣＧＧＴＴＴＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＣ−３’［配列番号５］
とリバースオリゴヌクレオチド：
５’ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＴＧＡＣＡＡＡＧＡＧＧＣＴＣＴＴＧＧＴＡＡＣＴＴＴＧＧＣ−３’［配列番号６］
を使用して増幅を実施した。
【００８４】
クローニングの目的で、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）テクノロジー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用するクローニングに適したａｔｔＢで挟まれたＰＣＲ産物を得るためにａｔｔＢ部位をオリゴヌクレオチドに付加した。更に、精製の目的でＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）開裂部位（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をフォワードプライマーに付加した。得られたＰＣＲ産物をＧａｔｅｗａｙ（登録商標）に対応するように改変したバキュロウイルス発現ベクターｐＶＬ１３９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。発現と精製の目的で、ＧＳＴタグをＰＬＫ３キナーゼドメインのＮ末端に付加した。Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）マニュアルに記載されているプロトコルに従ってクローニングを実施した。
【００８５】
ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（登録商標）トランスフェクションキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用してＳｆ９昆虫細胞に発現ベクターとウイルスＤＮＡを同時トランスフェクトすることによりバキュロウイルスを作製した。５日後にウイルス上清を回収し、３回増幅してウイルス力価を増加した。Ｈｉｇｈ５昆虫細胞に細胞１０９個当たりウイルス上清３ｍｌを細胞１×１０６個／ｍｌの密度で感染させることにより組換え蛋白質を産生させた。４８時間感染後に細胞を回収し、ペレット化し、−８０℃で凍結させた。組換え蛋白質を精製するために、ペレットを解凍し、溶解用緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４ ５０ｍＭ，ＮａＣｌ １５０ｍＭ，ＣＨＡＰＳ ０．２％，ＤＴＴ ２０ｍＭ，グリセロール１０％）に再懸濁し、音波処理により溶解させた。２４０００ｇで３０分間遠心により溶解液を清澄化し、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦ（登録商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムにロードした。十分に洗浄後、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）プロテアーゼの存在下で温置することにより組換え蛋白質を開裂及び溶出させた。
【００８６】
ＰＬＫ−３キナーゼ活性の阻害剤の生化学アッセイ
ＰＬＫ−１酵素について記載したと同様にインビトロキナーゼ阻害アッセイを実施した。
【００８７】
ｉ．ＰＬＫ−３のキナーゼ緩衝液（ＫＢ）
キナーゼ緩衝液は５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．９，５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ＤＴＴ，３μＭ ＮａＶＯ３，１０ｍＭ β−グリセロリン酸及び０．２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡから構成した。
【００８８】
ｉｉ．ＰＬＫ−３のアッセイ条件（終濃度）
酵素濃度０．５ｎＭ、５０μＭ ＡＴＰ、３ｎＭ ３３Ｐ−γ−ＡＴＰ及び１１０μＭ基質α−カゼインＳＩＧＭＡ，＃Ｃ−３２４０でキナーゼアッセイを実施した。
【００８９】
Ａｕｒｏｒａ−２キナーゼ活性の阻害剤の生化学アッセイ
ＰＬＫ−１酵素について記載したと同様にインビトロキナーゼ阻害アッセイを実施した。
【００９０】
ｉ．Ａｕｒｏｒａ−２のキナーゼ緩衝液（ＫＢ）
キナーゼ緩衝液は５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．０，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ＤＴＴ，３μＭ ＮａＶＯ３、及び０．２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡから構成した。
【００９１】
ｉｉ．Ａｕｒｏｒａ−２のアッセイ条件（終濃度）
酵素濃度２．５ｎＭ，１０μＭ ＡＴＰ，１ｎＭ ３３Ｐ−γ−ＡＴＰ、及びＬＲＲＷＳＬＧ反復配列４個から構成される基質８μＭでキナーゼアッセイを実施した。
【００９２】
Ｃｄｋ２／サイクリンＡ活性の阻害アッセイ
キナーゼ反応：１．５μＭヒストンＨ１基質，２５μＭ ＡＴＰ（０．２μＣｉ Ｐ３３γ−ＡＴＰ）、バキュロウイルスで同時発現させたＣｄｋ２／サイクリンＡ ３０ｎｇ、１０μＭ阻害剤を最終容量１００μＬの緩衝液（ＴＲＩＳ ＨＣｌ １０ｍＭ ｐＨ７．５，ＭｇＣｌ２ １０ｍＭ，７．５ｍＭ ＤＴＴ）に加え、９６ウェルＵ字底プレートの各ウェルに加えた。１０分間３７℃で温置後、１２０ｍＭ ＥＤＴＡ ２０μＬにより反応を停止した。
【００９３】
吸着：各ウェルから１００μＬをＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎプレートに移し、ホスホセルロースフィルターと基質結合させた。次にＣａ＋＋／Ｍｇ＋＋を含まないＰＢＳ１５０μＬ／ウェルでプレートを３回洗浄し、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ濾過システムで濾過した。
【００９４】
ＰＬＫ−１酵素について記載したと同様にインビトロキナーゼ阻害アッセイを実施した。
【００９５】
ｉ．ＣＤＫ−２／ＣｙｃＡのキナーゼ緩衝液（ＫＢ）
キナーゼ緩衝液はＴＲＩＳ ＨＣｌ ５０ｍＭ ｐＨ７．５，ＭｇＣｌ２ １０ｍＭ，ＤＴＴ １ｍＭ，ＮａＶＯ３ ３μＭ，０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡから構成した。
【００９６】
ｉｉ．ＣＤＫ−２のアッセイ条件（終濃度）
酵素濃度１．０８ｎＭ，１０μＭ ＡＴＰ，１ｎＭ ３３Ｐ−γ−ＡＴＰ及び４μＭ基質ヒストンＨ１でキナーゼアッセイを実施した。
【００９７】
インビトロ細胞増殖アッセイ
Ａ２７８０ヒト卵巣癌及びＭＣＦ７ヒト乳癌細胞（１２５０個／ウェル）を白色３８４ウェルプレートで完全培地（ＲＰＭＩ１６４０又はＥＭＥＭ＋１０％ウシ胎仔血清）に撒き、播種から２４時間後に０．１％ ＤＭＳＯに溶解した化合物で処理した。細胞を３７℃で５％ ＣＯ２下に温置し、７２時間後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の指示に従って使用してプレートを処理した。
【００９８】
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏは代謝活性細胞の指標であるＡＴＰ存在量の定量に基づく均一法である。ルシフェラーゼとＤ−ルシフェリンによる発光に基づくシステムを使用してＡＴＰを定量する。発光シグナルは培養液中に存在する細胞数に比例する。
【００９９】
要約すると、試薬溶液２５μＬ／ウェルを各ウェルに加え、５分間振盪後にルミノメーターによるとマイクロプレートは赤色である。発光シグナルは培養液中に存在する細胞数に比例する。
【０１００】
式（Ｉ）の化合物を上記のように試験した結果、アイソフォームＰＬＫ２及びＰＬＫ３に比較して顕著な選択的ＰＬＫ１阻害活性をもつことが判明した。生化学アッセイにおいて、ＰＬＫ１のＩＣ５０は一般に０．１μＭ未満である。
【０１０１】
１例として、Ｓｔｅｅｇｍａｉｅｒ，Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００７，１７（４），３１６−３２２に記載されている従来技術の最も近縁の化合物（Ｒｅｆ）と比較して上記方法で試験した本発明の式（Ｉ）の代表的な化合物の１例の実験データ（ＩＣ５０）を報告する下表１参照。
【０１０２】
【表１】
【０１０３】
驚くべきことに、本発明の新規化合物はＰＬＫ１生化学アッセイで参照化合物に比較して選択性が高かった。実際に、本発明の式Ｉの化合物はＰＬＫ２／ＰＬＫ１比とＰＬＫ３／ＰＬＫ１比が参照化合物よりも大きい。
【０１０４】
本発明の化合物は単剤として投与することもできるし、細胞増殖抑制剤又は細胞傷害剤、抗生物質型薬剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、ホルモン剤、免疫剤、インターフェロン型薬剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤（例えばＣＯＸ−２阻害剤）、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、テロメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗増殖因子受容体剤、抗ＨＥＲ剤、抗ＥＧＦＲ剤、抗血管新生剤（例えば血管新生阻害剤）、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ｒａｓ−ｒａｆシグナル伝達経路阻害剤、細胞周期阻害剤、他のｃｄｋ阻害剤、チューブリン結合剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤等と共に、放射線療法又は化学療法レジメン等の公知抗癌治療と併用することもできる。
【０１０５】
固定用量として製剤化する場合には、このような併用製剤は下記用量範囲内の本発明の化合物と許容用量範囲内の他の医薬活性剤を併用する。
【０１０６】
併用製剤が不適切な場合には、式（Ｉ）の化合物を公知抗癌剤と順次使用してもよい。
【０１０７】
哺乳動物（例えばヒト）に投与するのに適した本発明の式（Ｉ）の化合物は通常の経路で投与することができ、用量レベルは患者の年齢、体重、状態及び投与経路により異なる。例えば、式（Ｉ）の化合物の経口投与に採用される適切な用量は１回当たり約１０〜約５００ｍｇを１日１〜５回投与することができる。本発明の化合物は各種剤形で投与することができ、例えば錠剤、カプセル剤、糖衣錠、フィルムコーティング錠、溶液剤又は懸濁液剤として経口投与することもできるし、座剤として直腸投与することもできるし、例えば筋肉内又は静脈内及び／又は髄腔内及び／又は脊髄内注射又は輸液により非経口投与することもできる。
【０１０８】
本発明は更に、担体でも希釈剤でもよい医薬的に許容可能な賦形剤と共に式（Ｉ）の化合物又はその医薬的に許容可能な塩を含有する医薬組成物を包含する。
【０１０９】
本発明の化合物を含有する医薬組成物は一般に従来の手法に従って製造され、適切な医薬形態で投与される。例えば、固体経口形態は活性化合物と共に希釈剤（例えばラクトース、デキストロース、サッカロース、スクロース、セルロース、コーンスターチ又はジャガイモ澱粉）；滑沢剤（例えばシリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム及び／又はポリエチレングリコール）；結合剤（例えば澱粉、アラビアガム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース又はポリビニルピロリドン）；崩壊剤（例えば澱粉、アルギン酸、アルギン酸塩又は澱粉グリコール酸ナトリウム）；発泡混合物；色素；甘味剤；湿潤剤（例えばレシチン、ポリソルベート、ラウリル硫酸塩）；及び一般に医薬製剤で使用される薬理的に不活性な非毒性物質を含有することができる。これらの医薬製剤は例えば混合、顆粒化、錠剤化、糖衣又はフィルムコーティング工程により公知の通りに製造することができる。
【０１１０】
経口投与用液体分散液剤としては、例えばシロップ、エマルション及び懸濁液剤が挙げられる。１例として、シロップには担体としてサッカロース又はサッカロースとグリセリン及び／又はマンニトール及びソルビトールを添加することができる。
【０１１１】
懸濁液剤及びエマルションには担体として天然ガム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース又はポリビニルアルコールを添加することができる。筋肉内注射用懸濁液剤又は溶液剤は活性化合物と共に医薬的に許容可能な担体、例えば滅菌水、オリーブ油、オレイン酸エチル、グリコール類（例えばプロピレングリコール）、及び必要に応じて適量の塩酸リドカインを含有することができる。
【０１１２】
静脈内注射又は輸液用溶液剤には担体として滅菌水を加えてもよいし、滅菌等張塩類水溶液でもよく、この形態が好ましいが、担体としてプロピレングリコールを加えてもよい。
【０１１３】
座剤は活性化合物と共に医薬的に許容可能な担体（例えばカカオバター、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル界面活性剤又はレシチン）を含有することができる。
【０１１４】
本発明を更に詳細に例証するために、以下に実施例を記載するが、これらの実施例により本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１１５】
以下の実施例に従って製造した本発明の化合物を１Ｈ ＮＭＲ及びＭＳ分析により特性決定した。
【０１１６】
実施例１
（Ｒ）−８−シクロペンチル−７−エチル−５−メチル−２−［５−（４−メチルピペラジン−１−イル）−２−トリフルオロメトキシフェニルアミノ］−７，８−ジヒドロ−５Ｈ−プテリジン−６−オン（Ｒ１＝ＯＣＦ３，Ｒ２＝４−メチルピペラジン，Ｒ３＝シクロペンチル，Ｒ４＝エチル）
【０１１７】
【化５】
ＷＯ２００４／０７６４５４に記載されているように製造した（Ｒ）−２−クロロ−８−シクロペンチル−７−エチル−５−メチル−７，８−ジヒドロ−５Ｈ−プテリジン−６−オン（０．６０ｇ，２ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ／エタノール２／１混液（６０ｍＬ）に懸濁した懸濁液に３７％ＨＣｌ（０．６ｍＬ）と製造例１に記載したように製造した２−トリフルオロメトキシ−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニルアミン（０．５５ｇ，２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を７２時間還流し、小容量（２０ｍＬ）まで濃縮し、水（３０ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（２×５０ｍＬ）で抽出した。ＮａＨＣＯ３の添加により水相を中和後、ＤＣＭ（２×５０ｍＬ）で抽出した。有機フラクションを合わせて硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を蒸発乾涸した。粗製固形物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（溶離液：ＤＣＭ／ＥｔＯＨ ９０／１０）により精製し、標記化合物を薄茶色固体として得た（０．２３ｇ，２２％収率）。
【０１１８】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ ０．７６（ｔ，Ｊ＝７．５０Ｈｚ，３Ｈ）１．４４（ｍ，２Ｈ）１．６０（ｍ，２Ｈ）１．７３（ｍ，２Ｈ）１．８２（ｍ，４Ｈ）２．２７（ｓ，３Ｈ）２．４９−２．５３（ｍ，４Ｈ）３．０９−３．１８（ｍ，４Ｈ）３．２３（ｓ，３Ｈ）４．１８（ｄｄ，Ｊ＝７．５６，３．６６Ｈｚ，１Ｈ）４．２０−４．２８（ｍ，１Ｈ）６．６７（ｄｄ，Ｊ＝９．１５，３．０５Ｈｚ，１Ｈ）７．１２−７．２１（ｍ，１Ｈ）７．５４（ｄ，Ｊ＝３．０５Ｈｚ，１Ｈ）７．７７（ｓ，１Ｈ）７．９３（ｓ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）：５３４［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１１９】
（上記又は製造例２及び３に記載したように製造した）適切な出発材料を使用して同様の手順により以下の生成物を得ることができる：
（Ｒ）−８−シクロペンチル−７−エチル−２−［２−メトキシ−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニルアミノ］−５−メチル−７，８−ジヒドロ−５Ｈ−プテリジン−６−オン（Ｒ１＝ＯＣＨ３，Ｒ２＝Ａ−メチルピペラジン，Ｒ３＝シクロペンチル，Ｒ４＝エチル）１Ｈ ＮＭＲ（４０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ ０．７８（ｔ，Ｊ＝７．４４Ｈｚ，３Ｈ）１．５７（ｍ，２Ｈ）１．６０（ｍ，２Ｈ）１．７１（ｍ，２Ｈ）１．７３（ｍ，２Ｈ）１．９６（ｍ，２Ｈ）２．２３（ｓ，３Ｈ）２．４５−２．４９（ｍ，４Ｈ）３．０１（ｄ，Ｊ＝５．００Ｈｚ，４Ｈ）３．２５（ｓ，３Ｈ）３．８０（ｓ，３Ｈ）４．１８（ｄｄ，Ｊ＝７．９９，３．７２Ｈｚ，１Ｈ）４．４３−４．５４（ｍ，１Ｈ）６．４９（ｄｄ，Ｊ＝８．７８，２．９３Ｈｚ，１Ｈ）６．８８（ｄ，Ｊ＝８．９０Ｈｚ，１Ｈ）７．４０（ｓ，１Ｈ）７．８３（ｓ，１Ｈ）７．９９（ｄ，Ｊ＝２．９３Ｈｚ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）：４８０［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１２０】
（Ｒ）−８−シクロペンチル−７−エチル−５−メチル−２−［２−メチル−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニルアミノ］−７，８−ジヒドロ−５Ｈ−プテリジン−６−オン（Ｒ１＝ＣＨ３，Ｒ２＝４−メチルピペラジン，Ｒ３＝シクロペンチル，Ｒ４＝エチル）１Ｈ ＮＭＲ（４０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ ０．７７（ｔ，Ｊ＝７．５０Ｈｚ，３Ｈ）１．４１（ｍ，２Ｈ）１．５８（ｍ，２Ｈ）１．７１（ｍ，２Ｈ）１．７４（ｍ，２Ｈ）１．８３（ｍ，２Ｈ）２．１１（ｓ，３Ｈ）２．２２（ｓ，３Ｈ）２．４１−２．４６（ｍ，４Ｈ）３．０１−３．０７（ｍ，４Ｈ）３．２２（ｓ，３Ｈ）４．１２（ｄｄ，Ｊ＝７．８０，３．６６Ｈｚ，１Ｈ）４．１８−４．３１（ｍ，１Ｈ）６．５９（ｄｄ，Ｊ＝８．３５，２．５０Ｈｚ，１Ｈ）７．００（ｄ，Ｊ＝８．４１Ｈｚ，１Ｈ）７．１６（ｄ，Ｊ＝２．５６Ｈｚ，１Ｈ）７．７３（ｓ，１Ｈ）７．８７（ｓ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）：４６４［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１２１】
製造例１
２−トリフルオロメトキシ−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニルアミン三塩酸塩
【０１２２】
【化６】
ステップ１：Ｎ−（５−ブロモ−２−トリフルオロメトキシフェニル）アセトアミド
【０１２３】
【化７】
２−トリフルオロメトキシ−５−ブロモフェニルアミン（５．１２ｇ，２０ｍｍｏｌ）の０℃のＥｔＯＨ（５０ｍＬ）溶液に無水酢酸（４．７ｍＬ，５０ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（１０ｍＬ）溶液を加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を蒸発乾涸し、固形物にジエチルエーテルを加えてトリチュレートし、濾過し、Ｎ−（５−ブロモ−２−トリフルオロメトキシフェニル）アセトアミド５．６４ｇ（９５％収率）を得た。
【０１２４】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：２．１１（ｓ，３Ｈ）７．３９（ｍ，２Ｈ）８．２１（ｓ，１Ｈ）９．８７（ｓ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）：２５７［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１２５】
ステップ２：Ｎ−［２−トリフルオロメトキシ−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニル］アセトアミド
【０１２６】
【化８】
アルゴン置換した丸底フラスコにＰｄ２（ｄｂａ）３（１５７ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）と、２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ビフェニル（１３４．７ｍｇ，０．３４ｍｍｏｌ）と、Ｎ−（５−ブロモ−２−トリフルオロメトキシフェニル）アセトアミド（５．０５ｇ，１７ｍｍｏｌ）を仕込んだ。フラスコを排気し、再びアルゴン置換した。ＬｉＮ（ＴＭＳ）２溶液（１Ｍ ＴＨＦ溶液，３７．６ｍＬ）とＮ−メチルピペラジン（２．３ｍＬ，２０．５ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を３時間還流した。次に反応混合物を室温まで冷却し、濃縮した。粗製固形物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（溶離液：ＤＣＭ／ＥｔＯＨ ９０／１０）により精製し、Ｎ−［２−トリフルオロメトキシ−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニル］アセトアミド４．７８ｇ（８８％収率）を得た。
【０１２７】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：２．０６（ｓ，３Ｈ）２．２２（ｓ，３Ｈ）２．４５（ｍ，４Ｈ）３．１１（ｍ，４Ｈ）６．７５（ｄｄ，Ｊ＝９．１５，３．０５Ｈｚ，１Ｈ）７．１７（ｄｄ，Ｊ＝９．１５，１．４６Ｈｚ，１Ｈ）７．４１（ｂｓ，１Ｈ）９．５４（ｓ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）：２９９［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１２８】
ステップ３：２−トリフルオロメトキシ−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニルアミン三塩酸塩
【０１２９】
【化９】
Ｎ−［２−トリフルオロメトキシ−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニル］アセトアミド（４．７５ｇ，１５ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（１００ｍＬ）溶液をＨＣｌ ３７％（３５ｍＬ）で処理した。還流下に１時間後に混合物を濃縮し、ヘキサンを加えてトリチュレートし、定量的収率で２−トリフルオロメトキシ−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニルアミン三塩酸塩５．７４ｇを得た。
【０１３０】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：２．８２（ｄ，Ｊ＝４．７６Ｈｚ ３Ｈ）３．１（ｍ，４Ｈ）３．４８（ｍ，４Ｈ）６．２４（ｄｄ，Ｊ＝８．９０，２．９３Ｈｚ，１Ｈ）６．４０（ｄ，Ｊ＝２．９３Ｈｚ，１Ｈ）６．９８（ｄｄ，Ｊ＝８．９０，１．３４Ｈｚ，１Ｈ）１０．３１（ｂｓ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）：３１８［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１３１】
製造例２
２−メトキシ−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニルアミン
【０１３２】
【化１０】
ステップ１：１−（４−メトキシ−３−ニトロフェニル）−４−メチルピペラジン
アルゴン置換した丸底フラスコにＰｄ（ＯＡｃ）２（８５ｍｇ，０．３８ｍｍｏｌ）と、２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ビフェニル（２２５ｍｇ，０．５７ｍｍｏｌ）と、Ｋ３ＰＯ４（２．２６ｇ，１０．６８ｍｍｏｌ）と、４−ブロモ−１−メトキシ−２−ニトロベンゼン（１．７７ｇ，７．６３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５０ｍＬ）溶液を仕込んだ。フラスコを排気し、再びアルゴン置換した。Ｎ−メチルピペラジン（１．０１ｍＬ，９．１５ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を７２時間還流した。次に反応混合物を室温まで冷却し、濃縮した。粗製固形物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（溶離液：ＤＣＭ／ＥｔＯＨ ９０／１０）により精製し、標記化合物１．０５ｇ（５５％収率）を得た。
【０１３３】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：２．２２（ｓ，３Ｈ）２．４５（ｍ，４Ｈ）３．０９（ｍ，４Ｈ）３．８３（ｓ，３Ｈ）７．２２（ｄ，Ｊ＝９．２７Ｈｚ，１Ｈ）７．２６（ｄｄ，Ｊ＝９．２７ ａｎｄ ２．９３Ｈｚ，１Ｈ）７．３５（ｄ，Ｊ＝２．９３Ｈｚ，１Ｈ）。
【０１３４】
ステップ２：２−メトキシ−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニルアミン
１−（４−メトキシ−３−ニトロフェニル）−４−メチルピペラジン（１．０ｇ，４．０ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（１００ｍＬ）溶液をＰｄ／Ｃ１０％（１５０ｍｇ）の存在下に３５ｐｓｉで２時間水素化した。混合物をセライトパッドで濾過し、溶液を濃縮し、標記化合物０．８ｇ（９０％収率）を得た。
【０１３５】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：２．２１（ｓ，３Ｈ）２．４３（ｍ，４Ｈ）２．９４（ｍ，４Ｈ）３．６８（ｓ，３Ｈ）４．５５（ｓ，２Ｈ）６．０９（ｄｄ，Ｊ＝８．６６ ａｎｄ ２．８０Ｈｚ，１Ｈ）６．３０（ｄ，Ｊ＝２．８０Ｈｚ，１Ｈ）６．６４（ｄ，Ｊ＝８．６６Ｈｚ，１Ｈ）。
【０１３６】
製造例３
２−メチル−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニルアミン塩酸塩
【０１３７】
【化１１】
ステップ１：メチル−４−（４−メチル−３−ニトロフェニル）ピペラジン。円筒形石英管に４−フルオロ−１−メチル−２−ニトロベンゼン（２０．０ｇ，１２９ｍｍｏｌ）とＮ−メチルピペラジン（２６ｇ，２５８ｍｍｏｌ）を入れた。ＨＰＬＣにより出発材料が消滅したと判断されるまで反応混合物を４８時間２００℃に加熱した。溶媒を減圧除去し、残渣をＤＣＭに溶解した。溶液を２回水洗し、有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を減圧除去した。最終化合物（１４．６５ｇ，４８％収率）を茶色油状物として得た。
【０１３８】
ステップ２：２−メチル−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニルアミン。１−メチル−４−（４−メチル−３−ニトロフェニル）ピペラジン（９．０ｇ，３８．２９ｍｍｏｌ）をエタノール（１００ｍＬ）とシクロヘキセン（７ｍｌ）に溶解した溶液にＰｄ／Ｃ１０％（１．５ｇ）を加えた。ＨＰＬＣにより出発材料が消滅したと判断されるまで反応混合物を８０℃に６時間加熱した。Ｐｄを反応混合物から濾別し、溶媒を濾液から減圧除去した。粗生成物をＤＣＭで希釈し、ＨＣｌジオキサン溶液で処理し、沈殿を採取し、ジエチルエーテルで洗浄し、最終化合物を茶色固体として定量的収率で得た。
【０１３９】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ ２．１０（ｓ，３Ｈ）２．８２（ｓ，３Ｈ）２．９１−３．０１（ｍ，２Ｈ）３．０６−３．２１（ｍ，２Ｈ）３．４９（ｄ，Ｊ＝１４．０２Ｈｚ，２Ｈ）３．６６（ｄ，Ｊ＝１２．４４Ｈｚ，２Ｈ）６．５７（ｂｓ，１Ｈ）６．６３（ｂｓ，１Ｈ）７．０１（ｄ，Ｊ＝７．６８Ｈｚ，１Ｈ）１０．２１（ｂｓ，１Ｈ）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
［式中、
Ｒ１は直鎖又は分岐鎖Ｃ１−Ｃ３アルキル、Ｃ１−Ｃ３アルコキシ、Ｃ１−Ｃ３ポリフッ化アルキル、Ｃ１−Ｃ３ポリフッ化アルコキシ及び−ＣＯＲ’（式中、Ｒ’は置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキルである。）から選択される置換されていてもよい基であり；
Ｒ２は−ＮＲ”Ｒ”’基（式中、Ｒ”及びＲ”’は各々独立して水素又は直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル及び複素環から選択される置換されていてもよい基である。）であり、あるいはＲ”とＲ”’はそれらが結合している窒素原子と一緒になり、Ｎ、Ｏ又はＳから選択される更に１個のヘテロ原子を含んでもよい置換されていてもよい複素環を形成してもよく；
Ｒ３及びＲ４は各々独立して水素又は直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル及び複素環から選択される置換されていてもよい基である。］
の化合物及びその医薬的に許容可能な塩。
【請求項２】
Ｒ４が置換されていてもよい直鎖又は分岐鎖Ｃ１−Ｃ６アルキルである
請求項１に定義される式（Ｉ）の化合物。
【請求項３】
Ｒ１が−ＯＣＦ３、−ＯＣＨ３、−ＣＨ３及び−ＣＯＲ’（式中、Ｒ’は請求項１に定義した通りである。）から選択される基であり；
Ｒ２がメチルピペラジニル基：
【化２】
であり；
Ｒ３がＣ３−Ｃ６シクロアルキルである
請求項１又は２に定義される式（Ｉ）の化合物。
【請求項４】
（Ｒ）−８−シクロペンチル−７−エチル−５−メチル−２−［５−（４−メチルピペラジン−１−イル）−２−トリフルオロメトキシフェニルアミノ］−７，８−ジヒドロ−５Ｈ−プテリジン−６−オン、
（Ｒ）−８−シクロペンチル−７−エチル−２−［２−メトキシ−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニルアミノ］−５−メチル−７，８−ジヒドロ−５Ｈ−プテリジン−６−オン、及び
（Ｒ）−８−シクロペンチル−７−エチル−５−メチル−２−［２−メチル−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニルアミノ］−７，８−ジヒドロ−５Ｈ−プテリジン−６−オン
から構成される群から選択される化合物又はその医薬的に許容可能な塩。
【請求項５】
請求項１に定義される式（Ｉ）の化合物の製造方法であって、
１）式（ＩＩ）：
【化３】
（式中、Ｒ３及びＲ４は請求項１に定義した通りである。）の化合物を式（ＩＩＩ）：
【化４】
（式中、Ｒ１及びＲ２は請求項１に定義した通りである。）の化合物と反応させ、式（Ｉ）の化合物を得る段階と、
必要に応じてその医薬的に許容可能な塩に変換する段階
を含む方法。
【請求項６】
蛋白質キナーゼ活性の調節異常に起因及び／又は付随する疾患の治療方法であって、前記治療を必要とする哺乳動物に有効量の請求項１に定義される式（Ｉ）の化合物を投与する段階を含む前記方法。
【請求項７】
ＰＬＫファミリー活性の調節異常に起因及び／又は付随する疾患の治療方法である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＰＬＫ−１活性の調節異常に起因及び／又は付随する疾患の治療方法である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
疾患が癌、細胞増殖性疾患、ウイルス感染症、自己免疫疾患及び神経変性疾患から構成される群から選択される請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
癌が膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌（小細胞肺癌を含む。）、十二指腸癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、子宮頸癌、甲状腺癌、前立腺癌及び皮膚癌（扁平上皮細胞癌を含む。）等の癌；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、毛様細胞リンパ腫及びバーキットリンパ腫を含むリンパ系造血器腫瘍；急性及び慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群並びに前骨髄球性白血病を含む骨髄系造血器腫瘍；線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む間葉系腫瘍；星状細胞腫、神経細胞芽腫、神経膠腫及びシュワン細胞腫を含む中枢及び末梢神経系腫瘍；メラノーマ、セミノーマ、奇形癌腫、骨肉腫、色素性乾皮症、ケラトキサントーマ、甲状腺濾胞癌及びカポジ肉腫を含む他の腫瘍から構成される群から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞増殖性疾患が良性前立腺過形成、家族性大腸腺腫症、神経線維腫症、乾癬、アテローム性動脈硬化症に伴う血管平滑筋細胞増殖、肺線維症、関節炎、糸球体腎炎並びに手術後狭窄及び再狭窄から構成される群から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ＨＩＶ感染個体におけるウイルス感染症の治療するための請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
腫瘍血管新生及び転移抑制と臓器移植拒絶反応及び宿主対移植片病の治療を行う請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
治療を必要とする哺乳動物に少なくとも１種の細胞増殖抑制剤又は細胞傷害剤と併用して放射線療法又は化学療法レジメンを実施する段階を更に含む請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
治療を必要とする哺乳動物がヒトである請求項６に記載の方法。
【請求項１６】
ＰＬＫ−１蛋白質の活性の阻害方法であって、前記蛋白質を有効量の請求項１に定義される化合物と接触させる段階を含む前記方法。
【請求項１７】
治療有効量の請求項１に定義される式（Ｉ）の化合物又はその医薬的に許容可能な塩、及び少なくとも１種の医薬的に許容可能な賦形剤、担体及び／又は希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項１８】
更に１種以上の化学療法剤を含む請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
抗癌治療で同時、別個又は順次使用するための併用製剤として、請求項１に定義される式（Ｉ）の化合物もしくはその医薬的に許容可能な塩又は請求項１７に定義される医薬組成物及び１種以上の化学療法剤を含む製剤又はキット。
【請求項２０】
医薬用としての請求項１に定義される式（Ｉ）の化合物又はその医薬的に許容可能な塩。
【請求項２１】
癌の治療方法で使用するための請求項１に定義される式（Ｉ）の化合物又はその医薬的に許容可能な塩。
【請求項２２】
抗癌活性をもつ医薬の製造における請求項１に定義される式（Ｉ）の化合物又はその医薬的に許容可能な塩の使用。
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
［式中、
Ｒ１は直鎖又は分岐鎖Ｃ１−Ｃ３アルキル、Ｃ１−Ｃ３アルコキシ、Ｃ１−Ｃ３ポリフッ化アルキル、Ｃ１−Ｃ３ポリフッ化アルコキシ及び−ＣＯＲ’（式中、Ｒ’は置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキルである。）から選択される置換されていてもよい基であり；
Ｒ２は−ＮＲ”Ｒ”’基（式中、Ｒ”及びＲ”’は各々独立して水素又は直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル及び複素環から選択される置換されていてもよい基である。）であり、あるいはＲ”とＲ”’はそれらが結合している窒素原子と一緒になり、Ｎ、Ｏ又はＳから選択される更に１個のヘテロ原子を含んでもよい置換されていてもよい複素環を形成してもよく；
Ｒ３及びＲ４は各々独立して水素又は直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル及び複素環から選択される置換されていてもよい基である。］
の化合物及びその医薬的に許容可能な塩。
【請求項２】
Ｒ４が置換されていてもよい直鎖又は分岐鎖Ｃ１−Ｃ６アルキルである
請求項１に定義される式（Ｉ）の化合物。
【請求項３】
Ｒ１が−ＯＣＦ３、−ＯＣＨ３、−ＣＨ３及び−ＣＯＲ’（式中、Ｒ’は請求項１に定義した通りである。）から選択される基であり；
Ｒ２がメチルピペラジニル基：
【化２】
であり；
Ｒ３がＣ３−Ｃ６シクロアルキルである
請求項１又は２に定義される式（Ｉ）の化合物。
【請求項４】
（Ｒ）−８−シクロペンチル−７−エチル−５−メチル−２−［５−（４−メチルピペラジン−１−イル）−２−トリフルオロメトキシフェニルアミノ］−７，８−ジヒドロ−５Ｈ−プテリジン−６−オン、
（Ｒ）−８−シクロペンチル−７−エチル−２−［２−メトキシ−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニルアミノ］−５−メチル−７，８−ジヒドロ−５Ｈ−プテリジン−６−オン、及び
（Ｒ）−８−シクロペンチル−７−エチル−５−メチル−２−［２−メチル−５−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニルアミノ］−７，８−ジヒドロ−５Ｈ−プテリジン−６−オン
から構成される群から選択される化合物又はその医薬的に許容可能な塩。
【請求項５】
請求項１に定義される式（Ｉ）の化合物の製造方法であって、
１）式（ＩＩ）：
【化３】
（式中、Ｒ３及びＲ４は請求項１に定義した通りである。）の化合物を式（ＩＩＩ）：
【化４】
（式中、Ｒ１及びＲ２は請求項１に定義した通りである。）の化合物と反応させ、式（Ｉ）の化合物を得る段階と、
必要に応じてその医薬的に許容可能な塩に変換する段階
を含む方法。
【請求項６】
蛋白質キナーゼ活性の調節異常に起因及び／又は付随する疾患の治療方法であって、前記治療を必要とする哺乳動物に有効量の請求項１に定義される式（Ｉ）の化合物を投与する段階を含む前記方法。
【請求項７】
ＰＬＫファミリー活性の調節異常に起因及び／又は付随する疾患の治療方法である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＰＬＫ−１活性の調節異常に起因及び／又は付随する疾患の治療方法である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
疾患が癌、細胞増殖性疾患、ウイルス感染症、自己免疫疾患及び神経変性疾患から構成される群から選択される請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
癌が膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌（小細胞肺癌を含む。）、十二指腸癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、子宮頸癌、甲状腺癌、前立腺癌及び皮膚癌（扁平上皮細胞癌を含む。）等の癌；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、毛様細胞リンパ腫及びバーキットリンパ腫を含むリンパ系造血器腫瘍；急性及び慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群並びに前骨髄球性白血病を含む骨髄系造血器腫瘍；線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む間葉系腫瘍；星状細胞腫、神経細胞芽腫、神経膠腫及びシュワン細胞腫を含む中枢及び末梢神経系腫瘍；メラノーマ、セミノーマ、奇形癌腫、骨肉腫、色素性乾皮症、ケラトキサントーマ、甲状腺濾胞癌及びカポジ肉腫を含む他の腫瘍から構成される群から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞増殖性疾患が良性前立腺過形成、家族性大腸腺腫症、神経線維腫症、乾癬、アテローム性動脈硬化症に伴う血管平滑筋細胞増殖、肺線維症、関節炎、糸球体腎炎並びに手術後狭窄及び再狭窄から構成される群から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ＨＩＶ感染個体におけるウイルス感染症の治療するための請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
腫瘍血管新生及び転移抑制と臓器移植拒絶反応及び宿主対移植片病の治療を行う請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
治療を必要とする哺乳動物に少なくとも１種の細胞増殖抑制剤又は細胞傷害剤と併用して放射線療法又は化学療法レジメンを実施する段階を更に含む請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
治療を必要とする哺乳動物がヒトである請求項６に記載の方法。
【請求項１６】
ＰＬＫ−１蛋白質の活性の阻害方法であって、前記蛋白質を有効量の請求項１に定義される化合物と接触させる段階を含む前記方法。
【請求項１７】
治療有効量の請求項１に定義される式（Ｉ）の化合物又はその医薬的に許容可能な塩、及び少なくとも１種の医薬的に許容可能な賦形剤、担体及び／又は希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項１８】
更に１種以上の化学療法剤を含む請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
抗癌治療で同時、別個又は順次使用するための併用製剤として、請求項１に定義される式（Ｉ）の化合物もしくはその医薬的に許容可能な塩又は請求項１７に定義される医薬組成物及び１種以上の化学療法剤を含む製剤又はキット。
【請求項２０】
医薬用としての請求項１に定義される式（Ｉ）の化合物又はその医薬的に許容可能な塩。
【請求項２１】
癌の治療方法で使用するための請求項１に定義される式（Ｉ）の化合物又はその医薬的に許容可能な塩。
【請求項２２】
抗癌活性をもつ医薬の製造における請求項１に定義される式（Ｉ）の化合物又はその医薬的に許容可能な塩の使用。
【公表番号】特表２０１１−５０５４０３（Ｐ２０１１−５０５４０３Ａ）
【公表日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３６４１２（Ｐ２０１０−５３６４１２）
【出願日】平成２０年１１月２６日（２００８．１１．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６６２５３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７１４８０
【国際公開日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【出願人】（３０７０１２４０３）ネルビアーノ・メデイカル・サイエンシーズ・エツセ・エルレ・エルレ (55)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月２６日（２００８．１１．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６６２５３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７１４８０
【国際公開日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【出願人】（３０７０１２４０３）ネルビアーノ・メデイカル・サイエンシーズ・エツセ・エルレ・エルレ (55)
【Ｆターム（参考）】
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