脂肪酸を含有するＳ−ニトロソタンパク質とその製法
【課題】
タンパク質の構造を変化させることなく、システイン残基に効率よくＮＯを付加させ、生体内へＮＯを供与することが可能なニトロソタンパク質を提供する。
【解決手段】
発明者らは上記の目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、タンパク質に脂肪酸、Ｎ−アセチルアミノ酸などの安定化剤を含有することにより、チオール基とＮＯが反応し、Ｓ−ニトロソアルブミンを提供することが可能となり、本発明に到達した。特にアルブミンにおいては、脂肪酸、Ｎ−アセチルアミノ酸などの安定化剤を含有することにより、３４番目のシステインの反応性を高め、速やかにシステインとＮＯが反応し、Ｓ−ニトロソアルブミンを提供することが可能となり、本発明に到達した。本発明のＳ−ニトロソタンパク質は、ＳＨ基と一酸化窒素との結合効率や安定性を高めることができる。
タンパク質の構造を変化させることなく、システイン残基に効率よくＮＯを付加させ、生体内へＮＯを供与することが可能なニトロソタンパク質を提供する。
【解決手段】
発明者らは上記の目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、タンパク質に脂肪酸、Ｎ−アセチルアミノ酸などの安定化剤を含有することにより、チオール基とＮＯが反応し、Ｓ−ニトロソアルブミンを提供することが可能となり、本発明に到達した。特にアルブミンにおいては、脂肪酸、Ｎ−アセチルアミノ酸などの安定化剤を含有することにより、３４番目のシステインの反応性を高め、速やかにシステインとＮＯが反応し、Ｓ−ニトロソアルブミンを提供することが可能となり、本発明に到達した。本発明のＳ−ニトロソタンパク質は、ＳＨ基と一酸化窒素との結合効率や安定性を高めることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪酸を含有するＳ−ニトロソタンパク質及び、その製造方法に関するものである。さらに詳しくは、Ｓ−ニトロソグルタチオンとタンパク質溶液を混合するだけで、効率よく一酸化窒素を付加されたＳ−ニトロソタンパク質に関するもので
【背景技術】
【０００２】
一酸化窒素（以下、ＮＯと略記する）は生理機能の調節、病態発現、治療への応用など多岐にわたり研究されているが、特に虚血性疾患や臓器移植時などでは血流減少に伴う基質枯渇に起因する内因性ＮＯの産性低下により様々な障害が引き起こされるため、外因的なＮＯの補充（ＮＯ補充療法と称されている）が必要不可欠となっている。これまでに、ＮＯ補充療法として、ＮＯの吸入療法などが試みられてきたが、ＮＯ自身の反応性の高さ及び多様性のため、生体内での消失が極めて短時間であること及び選択的に有益な効果を得ることが困難であるという現状があった（非特許文献１）。
【０００３】
また、生体内においてはＮＯはタンパク質などのチオール基（以下、ＳＨ基と略記する）と反応し、Ｓ−ニトロソチオール（以下、ＲＳ−ＮＯと略記する）へと変換され、比較的安定な状態を保ち、ＮＯリザーバーとして働き、生体内のＮＯ濃度の調節に関与していることが知られている（非特許文献２）。
【０００４】
ニトロソ化したタンパク質が有用である事例として、構成アミノ酸配列のうち１つ以上のアミノ酸残基に変異を有するアルブミン変異体を用いて、ニトロソ化の効率、およびその抗菌活性を種々の細菌感染モデル動物を用いて解析した結果、該アルブミン変異体が効率的にニトロソ化され、そのニトロソ化体が、ＮＯや低分子のニトロソチオールに比べて、より強力な抗菌活性を示すことが報告されている（特許文献１）。
【０００５】
一方、ＮＯの輸送タンパク質としてアルブミンを使用することが可能であるが、アルブミンにはフリーのシステイン残基は３４番目に存在するものの、反応性が極めて低い。そのため、アルブミンとＮＯ供与剤の反応を試みても、速やかにＳ−ニトロソアルブミンが得られないことが知られている。そこで、アルブミンにＮＯを付加させるために、適当な化学修飾剤を付加させて結合効率を高めるか、アルブミンのアミノ酸の一部をシステインに変異させる事によって反応効率を高める方法が知られているが、これらの方法はアルブミン本来の構造を変化させてしまうため、生体内での挙動が変化するなどの問題があった。
【非特許文献１】Ignarro LJ et al. Pharm Res. 1989, 6, 651-659
【非特許文献２】Ignarro LJ et al.J Pharmacol Exp Ther. 1981, 218 739-749
【特許文献１】特開２００５−２０６５７７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
タンパク質の構造を変化させることなく、システイン残基に効率よくＮＯを付加させ、生体内へＮＯを供与することが可能なニトロソタンパク質を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者らは上記の目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、タンパク質に脂肪酸、Ｎ−アセチルアミノ酸などの安定化剤を含有することにより、チオール基とＮＯが反応し、Ｓ−ニトロソアルブミンを提供することが可能となり、本発明に到達した。特にアルブミンにおいては、脂肪酸、Ｎ−アセチルアミノ酸などの安定化剤を含有することにより、３４番目のシステインの反応性を高め、速やかにシステインとＮＯが反応し、Ｓ−ニトロソアルブミンを提供することが可能となり、本発明に到達した。
【０００８】
すなわち、本発明は、
（１）Ｎ−アセチルアミノ酸、脂肪酸又は脂肪酸塩から選ばれる１つ又は複数の組み合わせの安定化剤を含有するＳ−ニトロソタンパク質。
（２）Ｎ−アセチルアミノ酸がＮ−アセチルトリプトファン又はＮ−アセチルメチオニンである（１）記載のＳ−ニトロソタンパク質。
（３）脂肪酸がオレイン酸又はカプリル酸である（１）記載のＳ−ニトロソタンパク質。
（４）脂肪酸塩がカプリル酸ナトリウムである（１）記載のＳ−ニトロソタンパク質。
（５）Ｎ−アセチルアミノ酸、脂肪酸又は脂肪酸塩から選ばれる１つ又は複数の組み合わせの安定化剤を含有するタンパク質溶液に、一酸化窒素供与剤を含有させてＳ−ニトロソタンパク質を製造する方法。
（６）一酸化窒素供与剤がＳ−ニトロソグルタチオンである（５）記載の製造方法
（７）（１）〜（４）記載のＳ−ニトロソタンパク質がＳ−ニトロソアルブミンでありそれを含有する虚血性疾患の改善剤。
（８）（１）〜（４）記載のＳ−ニトロソタンパク質がＳ−ニトロソアルブミンでありそれを含有する臓器移植時の臓器保護剤。
（９）（１）〜（４）記載のＳ−ニトロソタンパク質がＳ−ニトロソアルブミンでありそれを含有する医薬組成物。
（１０）安定化剤を含有するアルブミン製剤と一酸化窒素供与剤とを投与２４時間前〜投与直前に混合調整することにより得られる（９）記載の医薬組成物
である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のＳ−ニトロソタンパク質は、Ｎ−アセチルアミノ酸、脂肪酸又は脂肪酸塩から選ばれる１つ又は複数の組み合わせの安定化剤を含有することにより、ＳＨ基と一酸化窒素との結合効率や安定性を高めることができる。例えばタンパク質がアルブミンの場合は、その構造変化がほとんどなく、安定なＳ−ニトロソチオール形態のものが得られる。
【００１０】
Ｓ−ニトロソアルブミンは、虚血性疾患や臓器移植時などで血流減少に伴う基質枯渇に起因する内因性ＮＯの産生低下により引き起こされる様々な障害に対して、ＮＯの供与源として働き、活性酸素種からの虚血部位臓器の保護作用を示す。さらにＳ−ニトロソタンパク質は、肝組織血流の改善、好中球浸潤の抑制、好アポトーシス作用などの生理活性が期待できる。さらには、タンパク質例えばアルブミンは、構造変化がほとんどないことから異種タンパクと認識されず、人体に対して安全に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明において、ニトロソ化とは、ニトロソ基（−ＮＯ）が付加されることである。タンパク質のニトロソ化は、タンパク質中のチオール基へニトロソ基が付加されることが好ましく、亜硝酸塩、Ｓ−ニトロソグルタチオン（以下、ＧＳＮＯと略記する）、Ｓ−ニトロソシステイン、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−ＤＬ−ペニシラミン、propylamine NONOate等の一酸化窒素供与剤と反応させる公知の方法によって達成することができる。
【００１２】
本発明における、ニトロソ化されるタンパク質は特に特定されるものでなく、一般的なタンパク質でも可能である。例えば、アルブミン、グロブリン、ヘパリン、ヘモグロビン、α1-アンチトリプシン等チオール基を有するタンパク質であれば良い。中でも血液中に存在する、アルブミン、グロブリン、ヘパリンが好適である。また、これらタンパク質は遺伝子操作で製造されたものでも充分に用いることができる。医薬品として用いる場合は、ヒト由来のものがよくその場合、個体から採取されたものでも遺伝子操作で製造されたものでもかまわない。特に、ヒト由来のアルブミンは個体から採取されたものでも遺伝子操作で製造されたものでも好適である。
【００１３】
本発明におけるタンパク質に含有させる安定化剤は、Ｎ−アセチルアミノ酸、脂肪酸又は脂肪酸塩から選ばれる１つ又は複数の組み合わせができる。この安定化剤の存在により、例えばアルブミンのアミノ酸配列３４番目のチオール基を一酸化窒素を付加させるニトロソ化が可能となり、ニトロソ化後も安定なタンパク質となりうるのである。
【００１４】
タンパク質に含有させる脂肪酸又は脂肪酸塩は、特に限られるものでは無く、一般式ＣｎＨｍＣ００Ｈの内、ｎ＝２〜３０がよく、さらにはｎ＝４〜２０、より好ましくはｎ＝６〜１０のものがよい。例えば、カプリル酸、カプロン酸、カプリン酸が挙げられるが、その中でもカプリル酸が好適である。脂肪酸塩としては、そのナトリウム塩、カリウム塩などが挙げられる。
【００１５】
タンパク質に含有するときの脂肪酸又は脂肪酸塩の濃度は０．０１〜１００ｍＭがよく、さらには０．１〜５０ｍＭ、より好ましくは１〜２０ｍＭがよい。タンパク質に含有するときの脂肪酸又は脂肪酸塩は、特に決まった方法が有るものでなく、予め含有している状態でも適当な量を添加してもよく、混合状態であればタンパク質のニトロソ化において充分に良好な環境となる。
【００１６】
また、安定化剤として含有するＮ−アセチルアミノ酸としては、Ｎ−アセチルトリプトファンやＮ−アセチルメチオニン等のアミノ酸成分が挙げられる。
【００１７】
その他、薬剤の賦形剤が含有していてもニトロソ化において特に問題は無い。
【００１８】
ニトロソ化においては、例えばカプリル酸等の脂肪酸と、例えばアルブミン等のタンパク質との溶液に、ニトロソ化の為の一酸化窒素供与剤を含有させることで、タンパク質のチオール基がニトロソ化する。
【００１９】
一酸化窒素供与剤としては、亜硝酸塩、ＧＳＮＯ、Ｓ−ニトロソシステイン、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−ＤＬ−ペニシラミン、propylamine NONOate等が挙げられるが、ＧＳＮＯが好適である。
【００２０】
タンパク質をニトロソ化するときの、一酸化窒素供与剤の含有量は、０．０１〜５０ｍＭがよく、さらには０．１〜３０ｍＭ、より好ましくは１〜１０ｍＭがよい。
【００２１】
タンパク質をニトロソ化するときの温度は、４〜４０℃がよく、さらには１５〜４０℃、より好ましくは２５〜３７℃がよい。その時の時間は、１〜３６０分がよく、さらには１０〜３００分、より好ましくは２０〜１８０分がよい。
【００２２】
タンパク質の中でも化学修飾されていないアルブミンにおいては、そのアミノ酸配列の３４番目のアミノ酸のチオール基がニトロソ化される。このとき、アミノ酸の分子内開裂や分子間開裂を伴うものでなく、非常に温和な状況でニトロソ化されることから、本来のアルブミンとしての機能や立体構造を損なうことがほとんどない。
【００２３】
また、例えばアルブミンの中にはチオール基が分子内架橋している場所が１７個存在するが、それを開裂した後この脂肪酸存在下でニトロソ化することもできる。
【００２４】
本発明のＳ−ニトロソタンパク質がＳ−ニトロソアルブミンである場合、そのものが虚血性肝疾患モデル動物に有効であり、それを含有する虚血性疾患の改善剤とすることができる。
【００２５】
本発明のＳ−ニトロソタンパク質がＳ−ニトロソアルブミンである場合、そのものが抗アポトーシス効果や抗酸化物質の誘導作用を有することから臓器移植時の臓器保護剤とすることができる。
【００２６】
これら本発明の改善剤や保護剤の投与方法は、経口投与、皮下注射投与、静脈内投与などが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００２７】
本発明のＳ−ニトロソタンパク質がＳ−ニトロソアルブミンでありそれを含有する医薬組成物とすることができる。医薬組成物としては、例えば錠剤を構成する一般的な賦形剤、滑沢剤、結合剤等と本発明のＳ−ニトロソアルブミンとで成るものや、注射剤を構成する一般的な溶媒、等張化剤、ｐＨ調整剤、防腐剤等と本発明のＳ−ニトロソアルブミンとで成るもの等が挙げられる。
【００２８】
さらには、安定化剤を含有するアルブミン製剤と一酸化窒素供与剤とを別包装しておき、投与２４時間前〜投与直前に混合調整する様な医薬組成物も挙げられる。Ｓ−ニトロソアルブミンは、Ｎ−アセチルアミノ酸、脂肪酸又は脂肪酸塩から選ばれる１つ又は複数の組み合わせの安定化剤を含有することで従来のものより安定化しているものの、投与２４時間前〜投与直前に混合調整しうる医薬組成物とすることで、より安定に供給しうるものとすることができる。
【実施例】
【００２９】
（実施例１）
カプリル酸１６．０ｍＭとＮ−アセチルトリプトファン１８．６ｍＭを含有する３ｍＭの遺伝子組み換えヒト血清アルブミン（以下、ＨＳＡと略記する）製剤溶液について、そのＳＨ基の感受性を５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（以下、ＤＴＮＢ法と略記する）を用いて波長４０５ｎｍの吸光度を測定することにより確認した。その結果を図１に示す。
【００３０】
図１の■印での経時変化に示されるごとく、アルブミン製剤では３０分程度で反応がプラトーに達しており、カプリル酸１６．０ｍＭを含有するＨＳＡ製剤溶液におけるアルブミンのＳＨ基が感受性の高いことを確認した。
【００３１】
（比較例１）
カプリル酸１６．０ｍＭとＮ−アセチルトリプトファン１８．６ｍＭを含有する上記ＨＳＡ製剤に活性炭を加え、脱脂処理を施した同濃度のアルブミンについて、実施例１と同様にそのＳＨ基の感受性を確認した。その結果を図１に示す。
図１の●印での経時変化に示されるごとく、脱脂処理済アルブミンでは吸光度が緩やかに上昇し、３０分が経過してもまだ反応がプラトーに達しなかった。
【００３２】
（実施例２）
１．６ｍＭ カプリル酸及び１．８６ｍＭ Ｎ−アセチルトリプトファンを含有した３００μＭ ＨＳＡ溶液を調製し、ＨＳＡのモル比で５倍量のＧＳＮＯを加え３７℃、１分間反応させてＳ−ニトロソＨＳＡ試料を得た。その後その試料について、４℃保存で遮光あり、４℃保存で遮光なし、２５℃保存で遮光あり、２５℃保存で遮光なしのそれぞれの条件で１０日間保存試験を行い、経時的にＮＯ濃度をGriess試薬を用いたHPLC-flow reactor system法で測定することによりＨＳＡのニトロソ化状態を確認した。
【００３３】
その結果を図２に示す。４℃遮光ありの条件と４℃遮光なしの条件ではニトロソ基の残存率に大きな差はみられなかったものの、２５℃保存の条件では遮光ありの条件に比べ、遮光なしの条件においてＮＯの消失が極端に早かった。今回の検討ではＮＯドナーであるＧＳＮＯの除去操作を行っていないことから、残存率が５日目まで徐々に上昇したと考えられる。
【００３４】
（比較例２）
１．６ｍＭカプリル酸及び１．８６ｍＭ Ｎ−アセチルトリプトファンを含有しない３００μＭＨＳＡ溶液を用いた以外は、実施例２と全て同様にした。その結果、安定性を見るまでもなくＨＳＡのニトロソ化そのものを観察しなかった。
【００３５】
（実施例３）
１．６ｍＭカプリル酸及び１．８６ｍＭ Ｎ−アセチルトリプトファンを含有する３００μＭのＨＳＡ溶液を調製し、１．５ｍＭ Ｓ−ニトロソチオール（ＧＳＮＯ）溶液を添加し、遮光下３７℃で約３０分混合してＳ−ニトロソＨＳＡ試料を得た。その試料について、ＮＯ濃度をGriess試薬を用いたHPLC-flow reactor system法で測定することによりＨＳＡのニトロソ化を確認した。
【００３６】
（試験例１）
実施例３で得られたＳ−ニトロソアルブミンの構造を確認するため、円二色性スペクトル（Jasco J-720型分光偏光計、以下、ＣＤ−スペクトルと略記する）を測定した。その結果を図３、図４に示した。
【００３７】
図３より、二次構造を反映する遠視外領域におけるニトロソＨＳＡ試料のスペクトルは、ＨＳＡとほぼ同様のＣＤ−スペクトルを示し、アルブミン本来のα-へリックス構造を維持していることが観察された。
【００３８】
また、図４より、三次構造を反映する近紫外領域のスペクトルもニトロソアルブミンはＨＳＡとほぼ同様のＣＤ−スペクトルを示し、アルブミン本来の三次構造を維持していることが観察された。以上より、実施例３で得られたニトロソＨＳＡ試料はＨＳＡ本来の構造を十分に保持している。
【００３９】
（試験例２）
実施例３により得られたＳ−ニトロソＨＳＡ試料を６０℃で１０時間の低温殺菌を行った。定温殺菌処理後のＳ−ニトロソＨＳＡ試料について、ＳＤＳ電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略記する）におけるジチオトレイトール（以下、ＤＴＴと略記する）の存在、非存在下での、タンパク質の凝集化の有無を確認した。その結果を、図５に示す。
【００４０】
低温殺菌処理後のニトロソＨＳＡ試料は、ＨＳＡ、ニトロソＨＳＡ（以下、Ｓ−ＮＯ−ＨＳＡと略記する）と同様、凝集化が認められなかった。すなわち、低温殺菌処理後のニトロソＨＳＡ試料は、低温殺菌でも安定である。
【００４１】
（試験例３）
ラットにおいてエーテル麻酔下、腹部を正中切開で開腹し肝臓を露出させ、中葉及び左葉のみが虚血状態になるように問脈と肝動脈を同時にクリップで挟み、４５分間血流を遮断し、その後血流を回復させる虚血再灌流障害モデルを用いて、ニトロソＨＳＡ試料の評価を行った。その評価として、６０分後に誘導されるＡＳＴ及びＡＳＴの血漿中濃度を測定した。
【００４２】
すなわち、再灌流後、実施例３で得られたニトロソＨＳＡ試料を０．１μｍｏｌ／ｋｇ又は０．５μｍｏｌ／ｋｇそれぞれを別途直ちに静脈内投与した。比較としてＨＳＡ０．５μｍｏｌ／ｋｇを別途同様に投与した。その結果を図６に示した。
【００４３】
図６より、ニトロソＨＳＡ試料０．５μｍｏｌ／ｋｇ投与群において、アラニンアミノ基転移酵素値（以下、ＡＬＴ値と略記する）及びアスパラギン酸アミノ基転移酵素値（以下、ＡＳＴ値）の上昇はＨＳＡ投与群に比べ有意に抑制された。このことは、ニトロソＨＳＡ試料が肝臓虚血再灌流障害に効果を有することを示す。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】脂肪酸存在下のＨＳＡにおけるＳＨ基感受性の経時変化を示す。■印のアルブミン製剤は、試料が脂肪酸存在下のＨＳＡ（実施例１）である。●印の脱脂済アルブミンは、試料が脱脂されたＨＳＡ（比較例１）である。縦軸は、ＤＴＮＢがＳＨ基と反応して遊離される３−カルボキシ−４−ニトロチオフェノレートイオンの４０５ｎｍの吸光度を示す。
【図２】ニトロソＨＳＡ試料を各条件で保存した場合の、ＨＳＡ溶液のＮＯ付加率の経時変化を示す。縦軸は、Ｓ−ｎｉｔｒｏｓｏ ｍｏｉｅｔｙすなわちＮＯ付加率を表す。----●----印は、４℃保存で遮光あり、――●――印は、４℃保存で遮光なし、----■----印は、２５℃保存で遮光あり、――■――印は、２５℃保存で遮光なしの保存条件である。縦軸は、１ｍｏｌ ＨＳＡあたりのＮＯ濃度を示す。
【図３】遠紫外領域（Ｆａｒ−ＵＶ ＣＤ ｓｐｅｃｔｒａ）におけるニトロソＨＳＡ試料のスペクトルを示す。縦軸は［θ］すなわちｍｏｌ楕円率を、横軸は波長を表す。波線のＨＳＡはニトロソ化されていないアルブミンを、実線のＳ−ＮＯ−ＨＳＡはニトロソＨＳＡ試料を示す。
【図４】近紫外領域（Ｎｅａｒ−ＵＶ ＣＤ ｓｐｅｃｔｒａ）におけるニトロソＨＳＡ試料のスペクトルを示す。縦軸は［θ］すなわちｍｏｌ楕円率を、横軸は波長を表す。波線のＨＳＡはニトロソ化されていないアルブミンを、実線のＳ−ＮＯ−ＨＳＡはニトロソＨＳＡ試料を示す。
【図５】定温殺菌処理後のＳ−ニトロソＨＳＡ試料について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥした泳動のバンドを示す。１：分子量マーカーは分子量マーカーとしてtrypsin inhibitor（分子量：２０，１００）、carbonic anhydrase（分子量：３０，０００）、ovalbumin（分子量：４５，０００）、albumin（分子量：６６，０００）、phosphorylase b（分子量：９７，０００）試料を、２：ＨＳＡはニトロソ化されていないアルブミンを、３：Ｓ−ＮＯ−ＨＳＡはＳ−ニトロソＨＳＡ試料を、４：Ｓ−ＮＯ−ＨＳＡ（６０℃、１０ｈ）は低温殺菌処理後のニトロソＨＳＡ試料を示す。
【図６】ラットにおける、低温殺菌処理後のニトロソＨＳＡ試料の虚血前と再灌流後とのＡＬＴとＡＳＴとのレベルの変動を示す。縦軸のＡＬＴはアラニンアミノ基転移酵素量を、ＡＳＴはアスパラギン酸アミノ基転移酵素量を表す。白い棒線で示したＨＳＡ０．５μｍｏｌ／ｋｇはニトロソ化されていないアルブミン０．５μｍｏｌ／ｋｇ投与の場合を、黒い棒線で示したＳ−ＮＯ−ＨＳＡ０．１μｍｏｌ／ｋｇはニトロソＨＳＡ試料０．１μｍｏｌ／ｋｇ投与の場合を、斑点の棒線で示したＳ−ＮＯ−ＨＳＡ０．５μｍｏｌ／ｋｇはニトロソＨＳＡ試料０．５μｍｏｌ／ｋｇ投与の場合を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪酸を含有するＳ−ニトロソタンパク質及び、その製造方法に関するものである。さらに詳しくは、Ｓ−ニトロソグルタチオンとタンパク質溶液を混合するだけで、効率よく一酸化窒素を付加されたＳ−ニトロソタンパク質に関するもので
【背景技術】
【０００２】
一酸化窒素（以下、ＮＯと略記する）は生理機能の調節、病態発現、治療への応用など多岐にわたり研究されているが、特に虚血性疾患や臓器移植時などでは血流減少に伴う基質枯渇に起因する内因性ＮＯの産性低下により様々な障害が引き起こされるため、外因的なＮＯの補充（ＮＯ補充療法と称されている）が必要不可欠となっている。これまでに、ＮＯ補充療法として、ＮＯの吸入療法などが試みられてきたが、ＮＯ自身の反応性の高さ及び多様性のため、生体内での消失が極めて短時間であること及び選択的に有益な効果を得ることが困難であるという現状があった（非特許文献１）。
【０００３】
また、生体内においてはＮＯはタンパク質などのチオール基（以下、ＳＨ基と略記する）と反応し、Ｓ−ニトロソチオール（以下、ＲＳ−ＮＯと略記する）へと変換され、比較的安定な状態を保ち、ＮＯリザーバーとして働き、生体内のＮＯ濃度の調節に関与していることが知られている（非特許文献２）。
【０００４】
ニトロソ化したタンパク質が有用である事例として、構成アミノ酸配列のうち１つ以上のアミノ酸残基に変異を有するアルブミン変異体を用いて、ニトロソ化の効率、およびその抗菌活性を種々の細菌感染モデル動物を用いて解析した結果、該アルブミン変異体が効率的にニトロソ化され、そのニトロソ化体が、ＮＯや低分子のニトロソチオールに比べて、より強力な抗菌活性を示すことが報告されている（特許文献１）。
【０００５】
一方、ＮＯの輸送タンパク質としてアルブミンを使用することが可能であるが、アルブミンにはフリーのシステイン残基は３４番目に存在するものの、反応性が極めて低い。そのため、アルブミンとＮＯ供与剤の反応を試みても、速やかにＳ−ニトロソアルブミンが得られないことが知られている。そこで、アルブミンにＮＯを付加させるために、適当な化学修飾剤を付加させて結合効率を高めるか、アルブミンのアミノ酸の一部をシステインに変異させる事によって反応効率を高める方法が知られているが、これらの方法はアルブミン本来の構造を変化させてしまうため、生体内での挙動が変化するなどの問題があった。
【非特許文献１】Ignarro LJ et al. Pharm Res. 1989, 6, 651-659
【非特許文献２】Ignarro LJ et al.J Pharmacol Exp Ther. 1981, 218 739-749
【特許文献１】特開２００５−２０６５７７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
タンパク質の構造を変化させることなく、システイン残基に効率よくＮＯを付加させ、生体内へＮＯを供与することが可能なニトロソタンパク質を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者らは上記の目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、タンパク質に脂肪酸、Ｎ−アセチルアミノ酸などの安定化剤を含有することにより、チオール基とＮＯが反応し、Ｓ−ニトロソアルブミンを提供することが可能となり、本発明に到達した。特にアルブミンにおいては、脂肪酸、Ｎ−アセチルアミノ酸などの安定化剤を含有することにより、３４番目のシステインの反応性を高め、速やかにシステインとＮＯが反応し、Ｓ−ニトロソアルブミンを提供することが可能となり、本発明に到達した。
【０００８】
すなわち、本発明は、
（１）Ｎ−アセチルアミノ酸、脂肪酸又は脂肪酸塩から選ばれる１つ又は複数の組み合わせの安定化剤を含有するＳ−ニトロソタンパク質。
（２）Ｎ−アセチルアミノ酸がＮ−アセチルトリプトファン又はＮ−アセチルメチオニンである（１）記載のＳ−ニトロソタンパク質。
（３）脂肪酸がオレイン酸又はカプリル酸である（１）記載のＳ−ニトロソタンパク質。
（４）脂肪酸塩がカプリル酸ナトリウムである（１）記載のＳ−ニトロソタンパク質。
（５）Ｎ−アセチルアミノ酸、脂肪酸又は脂肪酸塩から選ばれる１つ又は複数の組み合わせの安定化剤を含有するタンパク質溶液に、一酸化窒素供与剤を含有させてＳ−ニトロソタンパク質を製造する方法。
（６）一酸化窒素供与剤がＳ−ニトロソグルタチオンである（５）記載の製造方法
（７）（１）〜（４）記載のＳ−ニトロソタンパク質がＳ−ニトロソアルブミンでありそれを含有する虚血性疾患の改善剤。
（８）（１）〜（４）記載のＳ−ニトロソタンパク質がＳ−ニトロソアルブミンでありそれを含有する臓器移植時の臓器保護剤。
（９）（１）〜（４）記載のＳ−ニトロソタンパク質がＳ−ニトロソアルブミンでありそれを含有する医薬組成物。
（１０）安定化剤を含有するアルブミン製剤と一酸化窒素供与剤とを投与２４時間前〜投与直前に混合調整することにより得られる（９）記載の医薬組成物
である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のＳ−ニトロソタンパク質は、Ｎ−アセチルアミノ酸、脂肪酸又は脂肪酸塩から選ばれる１つ又は複数の組み合わせの安定化剤を含有することにより、ＳＨ基と一酸化窒素との結合効率や安定性を高めることができる。例えばタンパク質がアルブミンの場合は、その構造変化がほとんどなく、安定なＳ−ニトロソチオール形態のものが得られる。
【００１０】
Ｓ−ニトロソアルブミンは、虚血性疾患や臓器移植時などで血流減少に伴う基質枯渇に起因する内因性ＮＯの産生低下により引き起こされる様々な障害に対して、ＮＯの供与源として働き、活性酸素種からの虚血部位臓器の保護作用を示す。さらにＳ−ニトロソタンパク質は、肝組織血流の改善、好中球浸潤の抑制、好アポトーシス作用などの生理活性が期待できる。さらには、タンパク質例えばアルブミンは、構造変化がほとんどないことから異種タンパクと認識されず、人体に対して安全に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明において、ニトロソ化とは、ニトロソ基（−ＮＯ）が付加されることである。タンパク質のニトロソ化は、タンパク質中のチオール基へニトロソ基が付加されることが好ましく、亜硝酸塩、Ｓ−ニトロソグルタチオン（以下、ＧＳＮＯと略記する）、Ｓ−ニトロソシステイン、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−ＤＬ−ペニシラミン、propylamine NONOate等の一酸化窒素供与剤と反応させる公知の方法によって達成することができる。
【００１２】
本発明における、ニトロソ化されるタンパク質は特に特定されるものでなく、一般的なタンパク質でも可能である。例えば、アルブミン、グロブリン、ヘパリン、ヘモグロビン、α1-アンチトリプシン等チオール基を有するタンパク質であれば良い。中でも血液中に存在する、アルブミン、グロブリン、ヘパリンが好適である。また、これらタンパク質は遺伝子操作で製造されたものでも充分に用いることができる。医薬品として用いる場合は、ヒト由来のものがよくその場合、個体から採取されたものでも遺伝子操作で製造されたものでもかまわない。特に、ヒト由来のアルブミンは個体から採取されたものでも遺伝子操作で製造されたものでも好適である。
【００１３】
本発明におけるタンパク質に含有させる安定化剤は、Ｎ−アセチルアミノ酸、脂肪酸又は脂肪酸塩から選ばれる１つ又は複数の組み合わせができる。この安定化剤の存在により、例えばアルブミンのアミノ酸配列３４番目のチオール基を一酸化窒素を付加させるニトロソ化が可能となり、ニトロソ化後も安定なタンパク質となりうるのである。
【００１４】
タンパク質に含有させる脂肪酸又は脂肪酸塩は、特に限られるものでは無く、一般式ＣｎＨｍＣ００Ｈの内、ｎ＝２〜３０がよく、さらにはｎ＝４〜２０、より好ましくはｎ＝６〜１０のものがよい。例えば、カプリル酸、カプロン酸、カプリン酸が挙げられるが、その中でもカプリル酸が好適である。脂肪酸塩としては、そのナトリウム塩、カリウム塩などが挙げられる。
【００１５】
タンパク質に含有するときの脂肪酸又は脂肪酸塩の濃度は０．０１〜１００ｍＭがよく、さらには０．１〜５０ｍＭ、より好ましくは１〜２０ｍＭがよい。タンパク質に含有するときの脂肪酸又は脂肪酸塩は、特に決まった方法が有るものでなく、予め含有している状態でも適当な量を添加してもよく、混合状態であればタンパク質のニトロソ化において充分に良好な環境となる。
【００１６】
また、安定化剤として含有するＮ−アセチルアミノ酸としては、Ｎ−アセチルトリプトファンやＮ−アセチルメチオニン等のアミノ酸成分が挙げられる。
【００１７】
その他、薬剤の賦形剤が含有していてもニトロソ化において特に問題は無い。
【００１８】
ニトロソ化においては、例えばカプリル酸等の脂肪酸と、例えばアルブミン等のタンパク質との溶液に、ニトロソ化の為の一酸化窒素供与剤を含有させることで、タンパク質のチオール基がニトロソ化する。
【００１９】
一酸化窒素供与剤としては、亜硝酸塩、ＧＳＮＯ、Ｓ−ニトロソシステイン、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−ＤＬ−ペニシラミン、propylamine NONOate等が挙げられるが、ＧＳＮＯが好適である。
【００２０】
タンパク質をニトロソ化するときの、一酸化窒素供与剤の含有量は、０．０１〜５０ｍＭがよく、さらには０．１〜３０ｍＭ、より好ましくは１〜１０ｍＭがよい。
【００２１】
タンパク質をニトロソ化するときの温度は、４〜４０℃がよく、さらには１５〜４０℃、より好ましくは２５〜３７℃がよい。その時の時間は、１〜３６０分がよく、さらには１０〜３００分、より好ましくは２０〜１８０分がよい。
【００２２】
タンパク質の中でも化学修飾されていないアルブミンにおいては、そのアミノ酸配列の３４番目のアミノ酸のチオール基がニトロソ化される。このとき、アミノ酸の分子内開裂や分子間開裂を伴うものでなく、非常に温和な状況でニトロソ化されることから、本来のアルブミンとしての機能や立体構造を損なうことがほとんどない。
【００２３】
また、例えばアルブミンの中にはチオール基が分子内架橋している場所が１７個存在するが、それを開裂した後この脂肪酸存在下でニトロソ化することもできる。
【００２４】
本発明のＳ−ニトロソタンパク質がＳ−ニトロソアルブミンである場合、そのものが虚血性肝疾患モデル動物に有効であり、それを含有する虚血性疾患の改善剤とすることができる。
【００２５】
本発明のＳ−ニトロソタンパク質がＳ−ニトロソアルブミンである場合、そのものが抗アポトーシス効果や抗酸化物質の誘導作用を有することから臓器移植時の臓器保護剤とすることができる。
【００２６】
これら本発明の改善剤や保護剤の投与方法は、経口投与、皮下注射投与、静脈内投与などが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００２７】
本発明のＳ−ニトロソタンパク質がＳ−ニトロソアルブミンでありそれを含有する医薬組成物とすることができる。医薬組成物としては、例えば錠剤を構成する一般的な賦形剤、滑沢剤、結合剤等と本発明のＳ−ニトロソアルブミンとで成るものや、注射剤を構成する一般的な溶媒、等張化剤、ｐＨ調整剤、防腐剤等と本発明のＳ−ニトロソアルブミンとで成るもの等が挙げられる。
【００２８】
さらには、安定化剤を含有するアルブミン製剤と一酸化窒素供与剤とを別包装しておき、投与２４時間前〜投与直前に混合調整する様な医薬組成物も挙げられる。Ｓ−ニトロソアルブミンは、Ｎ−アセチルアミノ酸、脂肪酸又は脂肪酸塩から選ばれる１つ又は複数の組み合わせの安定化剤を含有することで従来のものより安定化しているものの、投与２４時間前〜投与直前に混合調整しうる医薬組成物とすることで、より安定に供給しうるものとすることができる。
【実施例】
【００２９】
（実施例１）
カプリル酸１６．０ｍＭとＮ−アセチルトリプトファン１８．６ｍＭを含有する３ｍＭの遺伝子組み換えヒト血清アルブミン（以下、ＨＳＡと略記する）製剤溶液について、そのＳＨ基の感受性を５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（以下、ＤＴＮＢ法と略記する）を用いて波長４０５ｎｍの吸光度を測定することにより確認した。その結果を図１に示す。
【００３０】
図１の■印での経時変化に示されるごとく、アルブミン製剤では３０分程度で反応がプラトーに達しており、カプリル酸１６．０ｍＭを含有するＨＳＡ製剤溶液におけるアルブミンのＳＨ基が感受性の高いことを確認した。
【００３１】
（比較例１）
カプリル酸１６．０ｍＭとＮ−アセチルトリプトファン１８．６ｍＭを含有する上記ＨＳＡ製剤に活性炭を加え、脱脂処理を施した同濃度のアルブミンについて、実施例１と同様にそのＳＨ基の感受性を確認した。その結果を図１に示す。
図１の●印での経時変化に示されるごとく、脱脂処理済アルブミンでは吸光度が緩やかに上昇し、３０分が経過してもまだ反応がプラトーに達しなかった。
【００３２】
（実施例２）
１．６ｍＭ カプリル酸及び１．８６ｍＭ Ｎ−アセチルトリプトファンを含有した３００μＭ ＨＳＡ溶液を調製し、ＨＳＡのモル比で５倍量のＧＳＮＯを加え３７℃、１分間反応させてＳ−ニトロソＨＳＡ試料を得た。その後その試料について、４℃保存で遮光あり、４℃保存で遮光なし、２５℃保存で遮光あり、２５℃保存で遮光なしのそれぞれの条件で１０日間保存試験を行い、経時的にＮＯ濃度をGriess試薬を用いたHPLC-flow reactor system法で測定することによりＨＳＡのニトロソ化状態を確認した。
【００３３】
その結果を図２に示す。４℃遮光ありの条件と４℃遮光なしの条件ではニトロソ基の残存率に大きな差はみられなかったものの、２５℃保存の条件では遮光ありの条件に比べ、遮光なしの条件においてＮＯの消失が極端に早かった。今回の検討ではＮＯドナーであるＧＳＮＯの除去操作を行っていないことから、残存率が５日目まで徐々に上昇したと考えられる。
【００３４】
（比較例２）
１．６ｍＭカプリル酸及び１．８６ｍＭ Ｎ−アセチルトリプトファンを含有しない３００μＭＨＳＡ溶液を用いた以外は、実施例２と全て同様にした。その結果、安定性を見るまでもなくＨＳＡのニトロソ化そのものを観察しなかった。
【００３５】
（実施例３）
１．６ｍＭカプリル酸及び１．８６ｍＭ Ｎ−アセチルトリプトファンを含有する３００μＭのＨＳＡ溶液を調製し、１．５ｍＭ Ｓ−ニトロソチオール（ＧＳＮＯ）溶液を添加し、遮光下３７℃で約３０分混合してＳ−ニトロソＨＳＡ試料を得た。その試料について、ＮＯ濃度をGriess試薬を用いたHPLC-flow reactor system法で測定することによりＨＳＡのニトロソ化を確認した。
【００３６】
（試験例１）
実施例３で得られたＳ−ニトロソアルブミンの構造を確認するため、円二色性スペクトル（Jasco J-720型分光偏光計、以下、ＣＤ−スペクトルと略記する）を測定した。その結果を図３、図４に示した。
【００３７】
図３より、二次構造を反映する遠視外領域におけるニトロソＨＳＡ試料のスペクトルは、ＨＳＡとほぼ同様のＣＤ−スペクトルを示し、アルブミン本来のα-へリックス構造を維持していることが観察された。
【００３８】
また、図４より、三次構造を反映する近紫外領域のスペクトルもニトロソアルブミンはＨＳＡとほぼ同様のＣＤ−スペクトルを示し、アルブミン本来の三次構造を維持していることが観察された。以上より、実施例３で得られたニトロソＨＳＡ試料はＨＳＡ本来の構造を十分に保持している。
【００３９】
（試験例２）
実施例３により得られたＳ−ニトロソＨＳＡ試料を６０℃で１０時間の低温殺菌を行った。定温殺菌処理後のＳ−ニトロソＨＳＡ試料について、ＳＤＳ電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略記する）におけるジチオトレイトール（以下、ＤＴＴと略記する）の存在、非存在下での、タンパク質の凝集化の有無を確認した。その結果を、図５に示す。
【００４０】
低温殺菌処理後のニトロソＨＳＡ試料は、ＨＳＡ、ニトロソＨＳＡ（以下、Ｓ−ＮＯ−ＨＳＡと略記する）と同様、凝集化が認められなかった。すなわち、低温殺菌処理後のニトロソＨＳＡ試料は、低温殺菌でも安定である。
【００４１】
（試験例３）
ラットにおいてエーテル麻酔下、腹部を正中切開で開腹し肝臓を露出させ、中葉及び左葉のみが虚血状態になるように問脈と肝動脈を同時にクリップで挟み、４５分間血流を遮断し、その後血流を回復させる虚血再灌流障害モデルを用いて、ニトロソＨＳＡ試料の評価を行った。その評価として、６０分後に誘導されるＡＳＴ及びＡＳＴの血漿中濃度を測定した。
【００４２】
すなわち、再灌流後、実施例３で得られたニトロソＨＳＡ試料を０．１μｍｏｌ／ｋｇ又は０．５μｍｏｌ／ｋｇそれぞれを別途直ちに静脈内投与した。比較としてＨＳＡ０．５μｍｏｌ／ｋｇを別途同様に投与した。その結果を図６に示した。
【００４３】
図６より、ニトロソＨＳＡ試料０．５μｍｏｌ／ｋｇ投与群において、アラニンアミノ基転移酵素値（以下、ＡＬＴ値と略記する）及びアスパラギン酸アミノ基転移酵素値（以下、ＡＳＴ値）の上昇はＨＳＡ投与群に比べ有意に抑制された。このことは、ニトロソＨＳＡ試料が肝臓虚血再灌流障害に効果を有することを示す。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】脂肪酸存在下のＨＳＡにおけるＳＨ基感受性の経時変化を示す。■印のアルブミン製剤は、試料が脂肪酸存在下のＨＳＡ（実施例１）である。●印の脱脂済アルブミンは、試料が脱脂されたＨＳＡ（比較例１）である。縦軸は、ＤＴＮＢがＳＨ基と反応して遊離される３−カルボキシ−４−ニトロチオフェノレートイオンの４０５ｎｍの吸光度を示す。
【図２】ニトロソＨＳＡ試料を各条件で保存した場合の、ＨＳＡ溶液のＮＯ付加率の経時変化を示す。縦軸は、Ｓ−ｎｉｔｒｏｓｏ ｍｏｉｅｔｙすなわちＮＯ付加率を表す。----●----印は、４℃保存で遮光あり、――●――印は、４℃保存で遮光なし、----■----印は、２５℃保存で遮光あり、――■――印は、２５℃保存で遮光なしの保存条件である。縦軸は、１ｍｏｌ ＨＳＡあたりのＮＯ濃度を示す。
【図３】遠紫外領域（Ｆａｒ−ＵＶ ＣＤ ｓｐｅｃｔｒａ）におけるニトロソＨＳＡ試料のスペクトルを示す。縦軸は［θ］すなわちｍｏｌ楕円率を、横軸は波長を表す。波線のＨＳＡはニトロソ化されていないアルブミンを、実線のＳ−ＮＯ−ＨＳＡはニトロソＨＳＡ試料を示す。
【図４】近紫外領域（Ｎｅａｒ−ＵＶ ＣＤ ｓｐｅｃｔｒａ）におけるニトロソＨＳＡ試料のスペクトルを示す。縦軸は［θ］すなわちｍｏｌ楕円率を、横軸は波長を表す。波線のＨＳＡはニトロソ化されていないアルブミンを、実線のＳ−ＮＯ−ＨＳＡはニトロソＨＳＡ試料を示す。
【図５】定温殺菌処理後のＳ−ニトロソＨＳＡ試料について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥした泳動のバンドを示す。１：分子量マーカーは分子量マーカーとしてtrypsin inhibitor（分子量：２０，１００）、carbonic anhydrase（分子量：３０，０００）、ovalbumin（分子量：４５，０００）、albumin（分子量：６６，０００）、phosphorylase b（分子量：９７，０００）試料を、２：ＨＳＡはニトロソ化されていないアルブミンを、３：Ｓ−ＮＯ−ＨＳＡはＳ−ニトロソＨＳＡ試料を、４：Ｓ−ＮＯ−ＨＳＡ（６０℃、１０ｈ）は低温殺菌処理後のニトロソＨＳＡ試料を示す。
【図６】ラットにおける、低温殺菌処理後のニトロソＨＳＡ試料の虚血前と再灌流後とのＡＬＴとＡＳＴとのレベルの変動を示す。縦軸のＡＬＴはアラニンアミノ基転移酵素量を、ＡＳＴはアスパラギン酸アミノ基転移酵素量を表す。白い棒線で示したＨＳＡ０．５μｍｏｌ／ｋｇはニトロソ化されていないアルブミン０．５μｍｏｌ／ｋｇ投与の場合を、黒い棒線で示したＳ−ＮＯ−ＨＳＡ０．１μｍｏｌ／ｋｇはニトロソＨＳＡ試料０．１μｍｏｌ／ｋｇ投与の場合を、斑点の棒線で示したＳ−ＮＯ−ＨＳＡ０．５μｍｏｌ／ｋｇはニトロソＨＳＡ試料０．５μｍｏｌ／ｋｇ投与の場合を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−アセチルアミノ酸、脂肪酸又は脂肪酸塩から選ばれる１つ又は複数の組み合わせの安定化剤を含有するＳ−ニトロソタンパク質。
【請求項２】
Ｎ−アセチルアミノ酸がＮ−アセチルトリプトファン又はＮ−アセチルメチオニンである請求項１記載のＳ−ニトロソタンパク質。
【請求項３】
脂肪酸がオレイン酸又はカプリル酸である請求項１記載のＳ−ニトロソタンパク質。
【請求項４】
脂肪酸塩がカプリル酸ナトリウムである請求項１記載のＳ−ニトロソタンパク質。
【請求項５】
Ｎ−アセチルアミノ酸、脂肪酸又は脂肪酸塩から選ばれる１つ又は複数の組み合わせの安定化剤を含有するタンパク質溶液に、一酸化窒素供与剤を含有させてＳ−ニトロソタンパク質を製造する方法。
【請求項６】
一酸化窒素供与剤がＳ−ニトロソグルタチオンである請求項５記載の製造方法
【請求項７】
請求項１〜４記載のＳ−ニトロソタンパク質がＳ−ニトロソアルブミンでありそれを含有する虚血性疾患の改善剤。
【請求項８】
請求項１〜４記載のＳ−ニトロソタンパク質がＳ−ニトロソアルブミンでありそれを含有する臓器移植時の臓器保護剤。
【請求項９】
請求項１〜４記載のＳ−ニトロソタンパク質がＳ−ニトロソアルブミンでありそれを含有する医薬組成物。
【請求項１０】
安定化剤を含有するアルブミン製剤と一酸化窒素供与剤とを投与２４時間前〜投与直前に混合調整することにより得られる請求項９記載の医薬組成物
【請求項１】
Ｎ−アセチルアミノ酸、脂肪酸又は脂肪酸塩から選ばれる１つ又は複数の組み合わせの安定化剤を含有するＳ−ニトロソタンパク質。
【請求項２】
Ｎ−アセチルアミノ酸がＮ−アセチルトリプトファン又はＮ−アセチルメチオニンである請求項１記載のＳ−ニトロソタンパク質。
【請求項３】
脂肪酸がオレイン酸又はカプリル酸である請求項１記載のＳ−ニトロソタンパク質。
【請求項４】
脂肪酸塩がカプリル酸ナトリウムである請求項１記載のＳ−ニトロソタンパク質。
【請求項５】
Ｎ−アセチルアミノ酸、脂肪酸又は脂肪酸塩から選ばれる１つ又は複数の組み合わせの安定化剤を含有するタンパク質溶液に、一酸化窒素供与剤を含有させてＳ−ニトロソタンパク質を製造する方法。
【請求項６】
一酸化窒素供与剤がＳ−ニトロソグルタチオンである請求項５記載の製造方法
【請求項７】
請求項１〜４記載のＳ−ニトロソタンパク質がＳ−ニトロソアルブミンでありそれを含有する虚血性疾患の改善剤。
【請求項８】
請求項１〜４記載のＳ−ニトロソタンパク質がＳ−ニトロソアルブミンでありそれを含有する臓器移植時の臓器保護剤。
【請求項９】
請求項１〜４記載のＳ−ニトロソタンパク質がＳ−ニトロソアルブミンでありそれを含有する医薬組成物。
【請求項１０】
安定化剤を含有するアルブミン製剤と一酸化窒素供与剤とを投与２４時間前〜投与直前に混合調整することにより得られる請求項９記載の医薬組成物
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００８−５０２９４（Ｐ２００８−５０２９４Ａ）
【公開日】平成２０年３月６日（２００８．３．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２２７４２７（Ｐ２００６−２２７４２７）
【出願日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００６年８月８日 日本血液代替物学会発行の「日本血液代替物学会 会誌 人工血液 Ｖｏｌ．１４（１）」に発表
【出願人】（０００１３５０３６）ニプロ株式会社 (583)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年３月６日（２００８．３．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００６年８月８日 日本血液代替物学会発行の「日本血液代替物学会 会誌 人工血液 Ｖｏｌ．１４（１）」に発表
【出願人】（０００１３５０３６）ニプロ株式会社 (583)
【Ｆターム（参考）】
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