腸内細菌科に属するＬ−アミノ酸生産細菌を用いるアミノ酸の製造法
【課題】発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法、および特にＬ−フェニルアラニン及びＬ−ヒスチジンの生産に有用な細菌の提供。
【解決手段】Ｌ−アミノ酸生合成に影響する、コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドロゲナーゼ又はホスホグルコースイソメラーゼなどの細菌酵素をコードする遺伝子の３’末端に、転写可能であり、特定の配列番号のペプチド又はその変異体をコードするＤＮＡ断片を連結することにより改変されている、腸内細菌科に属する細菌を用いる発酵による、L-アミノ酸、例えばL-フェニルアラニン及びL-ヒスチジンの製造法。
【解決手段】Ｌ−アミノ酸生合成に影響する、コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドロゲナーゼ又はホスホグルコースイソメラーゼなどの細菌酵素をコードする遺伝子の３’末端に、転写可能であり、特定の配列番号のペプチド又はその変異体をコードするＤＮＡ断片を連結することにより改変されている、腸内細菌科に属する細菌を用いる発酵による、L-アミノ酸、例えばL-フェニルアラニン及びL-ヒスチジンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法に関し、さらに詳しくは、この発酵に有用な遺伝子に関する。これらの遺伝子は、Ｌ−アミノ酸、特にＬ−フェニルアラニン及びＬ−ヒスチジンの生産の向上に有用である。
【背景技術】
【０００２】
従来、Ｌ−アミノ酸は、天然資源から得られる微生物又はそれらの突然変異体の株を利用した発酵方法により工業的に生産されている。通常、微生物はＬ−アミノ酸の生産性を高めるように改変される。
【０００３】
組換えＤＮＡによる微生物の形質転換など、Ｌ−アミノ酸の生産量を高める多くの方法が報告されている（例えば、特許文献１を参照）。生産量を高める他の方法は、アミノ酸生合成に関与する酵素の活性を増大させること及び／又は目的Ｌ−アミノ酸によるフィードバック阻害に対して目的酵素を脱感作させること（例えば、特許文献２又は特許文献３〜５を参照）、並びに、目的化合物の前駆体を他の経路に用いる遺伝子を欠損した菌株を作成すること、又は、目的化合物の分解に関与する遺伝子を欠損した菌株を作成することを含む。
【０００４】
通常には、これらの操作は、生育できない株、極めて低速度でのみ生育する株、又は、アミノ酸等の付加的栄養素を要求する株を生じる。例えば、ある遺伝子の発現を過剰にすることは、細胞増殖を有意に減少させ、結果として、細菌の目的化合物の生産能を低下させ得る。
【０００５】
上記の問題を避ける可能性のある方法としては、炭素、窒素もしくはリンのフラックス分布、又は、菌体からの目的物質の分泌に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現を最適化することである。
【０００６】
この目的は、アミノ酸又は核酸の生合成遺伝子のプロモーター配列に変異を導入すること（特許文献６）、種々の強さの合成プロモーターのライブラリーを得ること（非特許文献１）、人工プロモーターのライブラリーを作成すること（特許文献７）などによって多くは達成された。
【０００７】
ssrA RNAによりコードされるssrAペプチドタグでタンパク質にタグ付けすることにより、タンパク質分解においてタグ付タンパク質をマークすることが知られている(非特許文献２)。SsrA RNA (同義語: SsrA , tmRNA , 10Sa RNA , トランスファー-メッセンジャーRNA , SipB , B2621 )は、「トランス-トランスレーション」機構を用いてtRNAとmRNAの両方として働くことにより、停止コドンの無い「壊れた」mRNAの末端から停止リボソームを遊離させる機能を有する。ssrAは、また、適切なtRNAが存在しないことによる停止リボソームの遊離を媒介する(非特許文献３)。他の翻訳の問題もSsrA活性を導くことがある。さらに、SsrA RNAは、欠陥mRNAの分解を刺激する(非特許文献４)。
【０００８】
ssrA RNAは、RNase Pにより処理され、アラニル-tRNAシンテターゼによりチャージされるt-RNA様構造領域を含む(非特許文献５)。SsrA RNAは、また、メッセンジャーRNAとして働き、生成するタンパク質に付加されてこのタンパク質を分解の目的とする翻訳タグをコードする領域を有する(非特許文献６)。SsrA RNAの構造及び翻訳機構は詳しく検討されている(非特許文献７)。SsrA RNAは、より大きな前駆体RNAとして転写され、ついでプロセッシングされて成熟RNAを形成する。
【０００９】
ssrA は、Mycoplasma capricolum、Bacillus subtilis (非特許文献８)、Dichelobacter nodosus、Synechococcus sp. PCC6301及び PCC6803株、Thermus thermophilus、Salmonella enterica serovar Typhimurium由来のRNA、並びに、Caulobacter crescentus由来のツーピースRNAと同様である。tmRNA遺伝子は、細菌種の同定のためのプローブとして使用されている (非特許文献９)。
【００１０】
しかしながら、Ｌ−アミノ酸、例えば、Ｌ−フェニルアラニンやＬ−ヒスチジンの生産にssrAタギングを使用することを記載した報告はない。特に、Ｌ−アミノ酸生合成に影響する細菌酵素をコードする遺伝子の直ぐ下流に付加した、配列番号２のペプチド又はその変異体をコードするＤＮＡを含む腸内細菌科細菌を用いることについて依然の報告はない。
【特許文献１】米国特許第４，２７８，７６５号
【特許文献２】国際公開ＷＯ９５／１６０４２
【特許文献３】米国特許第４，３４６，１７０号
【特許文献４】米国特許第５，６６１，０１２号
【特許文献５】米国特許第６，０４０，１６０号
【特許文献６】EP1033407A1
【非特許文献１】Jensen P.R., and Hammer K., Appl. Environ. Microbiol., 1998, 64, No.1. 82-87 Biotechnol. Bioeng., 1998, 58, 2-3, 191-5
【特許文献７】WO03089605
【非特許文献２】Gottesmann S. and al, Genes&Dev.,12:1338-1347(1998)
【非特許文献３】Hayes C.S. and al, PNAS, 99(6):3440-3445(2002)
【非特許文献４】Yamamoto Y. et al, RNA, 9:408-418 (2003))。
【非特許文献５】Komine Y et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 (20):9223-7 (1994)
【非特許文献６】Tu G.-F.and al, J Biol Chem, 270(16):9322-9326 (1995)
【非特許文献７】Corvaisier S. et al, J Biol Chem, 278(17):14788-97(2003)
【非特許文献８】Muto A. and al, Genes Cells, 7(5):509-19 (2000)
【非特許文献９】Schonhuber W. and al, BMC Microbiology, 1(1):20 (2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、Ｌ−アミノ酸生産株の生産性を高めること、及び、これらの株を用いるＬ−アミノ酸の製造法を提供することである。これらの目的は、生合成経路において他のアミノ酸と共通する過程を有する目的アミノ酸の合成に関与する酵素のSsrAタギングにより、共通する生合成過程及び／又は前駆体を有するアミノ酸を犠牲にすることにより目的アミノ酸の生産を向上し得るという知見に基づき達成された。また、解糖の異なる経路（例えば、ペントースリン酸経路及びEntner-Duodoroff 経路）の間の炭素フラックスの分配に関与する酵素のSsrAタギングにより、解糖経路の一つにおいて生成した前駆体が共通するこれらのアミノ酸の生産を向上できることが見出された。いずれの場合も、改変細菌の原栄養性は維持されることが見出された。
【００１２】
この目的は、産物のタンパク質が共にssrA遺伝子の一部によりコードされるC末端の短ペプチドを有する新規な改変trpA遺伝子及び新規な改変pgi遺伝子を構築することにより達成された。この変異型TryA-ssrAを用いることにより、変異型tryA-ssrA遺伝子を本来のtryA遺伝子の代わりにＬ−フェニルアラニン生産株の細胞に導入したときにＬ−フェニルアラニン生産を向上させることができた。また、この変異型Pgi-ssrAを用いることにより、変異型pgi-ssrA遺伝子を本来のpgi遺伝子の代わりにＬ−ヒスチジン生産株の細胞に導入したときにＬ−ヒスチジン生産を向上させることができた。以上の知見に基づき本発明
は完成された。
【００１３】
本発明の目的の一つは、Ｌ−アミノ酸生合成に影響する細菌酵素をコードする遺伝子、及び、転写可能であり、配列番号２のペプチド又はその変異体をコードするＤＮＡ断片であって、前記遺伝子の３’末端に連結される前記断片を含む、腸内細菌科に属するＬ−アミノ酸生産細菌を提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、エシェリヒア属細菌である上記細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、Ｌ−フェニルアラニン生産菌である上記細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記酵素がコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドロゲナーゼである上記細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、Ｌ−ヒスチジン生産菌である上記細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記酵素がホスホグルコースイソメラーゼである上記細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、上記細菌を培地で培養し、該培地から該Ｌ−アミノ酸を単離することを含む、Ｌ−アミノ酸の製造方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記Ｌ−アミノ酸がＬ−フェニルアラニンである上記方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記Ｌ−アミノ酸がＬ−ヒスチジンである上記方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、上記細菌を培地で培養し、培地にＬ−フェニルアラニンを生成、蓄積させ、アスパラギン酸又はその誘導体と得られたＬ−フェニルアラニンとからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを合成することを含む、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルの製造方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、Ｌ−フェニルアラニンをエステル化してＬ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを生成し、Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを、Ｎ−アシル−Ｌ−アスパルトアンヒドリドであるアスパラギン酸誘導体と縮合させ、反応液からＮ−アシル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを分離し、Ｎ−アシル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを水素化してα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを生成することをさらに含む、上記方法を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
１．本発明の細菌
芳香族アミノ酸、分岐鎖アミノ酸などのアミノ酸の一部は、細胞による生合成において共通する前駆体を有することが知られている。そのようなアミノ酸を菌株により生産させる場合、その菌株を、目的アミノ酸と共通する前駆体を有する他のアミノ酸について栄養要求性にすることが有用である。これにより、目的アミノ酸の生合成経路から分岐する生合成に共通前駆体が向けられることを防ぐことができる。
【００１６】
目的アミノ酸の生産を確保する他の方法としては、共通前駆体を有するものとは反対に、共通前駆体からの他のアミノ酸の生成に関与する酵素にいわゆるリーキー(leaky)変異を生じさせることがある。この場合、細菌において他のＬ−アミノ酸の合成が抑制されるため、これらのＬ−アミノ酸を細菌に供給する必要がない。
【００１７】
酵素のSsrAタギングは、酵素が転写されたssrA-タグ付RNAがRnase Pにより分解され(Komine Y et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 (20):9223-7 (1994))、ssrAタグ付酵
素がClpXP及びClpAPプロテアーゼによりタンパク質分解されるため(Wah D.A. et al, Chem. Biol., 9(11):1237-45 (2002)、酵素活性の低下をもたらす。ssrAタギングによるこのような改変により、リーキー型表現型を示しながら、改変細菌の原栄養性の維持が可能になる。また、ssrAタギングにより、副産物の生合成に関与する１又は複数の酵素の活性を低下させることにより副産物のレベルを低下させることが可能になる。
【００１８】
本発明において「Ｌ−アミノ酸生産菌」とは、培地で培養したときに、培地中にＬ−アミノ酸を生産し且つ排出する能力のある細菌を意味する。Ｌ−アミノ酸生産能は、育種によって付与されるか又は高められてもよい。本明細書中で使用される「Ｌ−アミノ酸生産菌」という用語はまた、培地でエシェリヒア・コリＫ１２等の野生型株又は親株のエシェリヒア・コリよりも大量にＬ−アミノ酸を生産し且つ蓄積することのできる細菌を意味し、好ましくは細菌が培地中に０．５ｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは１．０ｇ／Ｌ以上の量の目的Ｌ−アミノ酸を蓄積させることができることを意味する。「Ｌ−アミノ酸」という用語には、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、及びＬ−バリンが含まれる。Ｌ−ヒスチジンが特に好ましい。また、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−チロシンがより好ましく、Ｌ−フェニルアラニンが特に好ましい。
【００１９】
腸内細菌科としては、エシェリヒア属、エンテロバクター属、エルビニア属、クレブシエラ属、パントエア属、プロビデンシア属、サルモネラ属、セラチア属、シゲラ属、モルガネラ属等に属する細菌が挙げられる。具体的には、ＮＣＢＩ(National Center for Biotechnology Information)データベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock)で使用される分類学に従って腸内細菌科に分類されるものを使用することができる。エシェリヒア属又はパントエア属に属する細菌が好ましい。
【００２０】
「エシェリヒア属細菌」という語句は、この細菌が、微生物学の分野の当業者に既知の分類に従ってエシェリヒア属に分類されることを意味する。本発明で使用される場合のエシェリヒア属に属する微生物の例としては、エシェリヒア・コリが挙げられるが、これに限定されない。
【００２１】
本発明で使用することができるエシェリヒア属に属する細菌は、特に限定されないが、例えば、Neidhardt, F.C.他(Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Table 1)により記載される細菌が本発明により包含される。
【００２２】
本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を有し、ssrA遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を、細菌酵素をコードする遺伝子の3'末端に付加することにより改変された腸内細菌科の株を包含する。ssrA遺伝子の一部は、配列番号２で表わされるペプチド又はその変異体をコードし、細菌酵素は、目的Ｌ−アミノ酸を共通の全期待を有するＬ−アミノ酸の生合成経路に関与する。さらに、本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を有し、ssrA遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片で形質転換され、そのＤＮＡ断片によりコードされたペプチド成分が発現する腸内細菌科の株も包含する。
【００２３】
ssrA遺伝子(別名: ECK2617, b2621, sipB)は、tmRNA (別名: SsrA, 10Sa RNA, トランスファー-メッセンジャーRNA, SipB, B2621)をコードする。ssrA遺伝子(GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990の配列におけるヌクレオチド2753615〜2753977)は、E. co
li K-12の染色体上のsmpB遺伝子とintA遺伝子との間に位置する。エシェリヒア・コリ由来のssrA遺伝子は、配列番号１に示す。tmRNAがコードするタンパク質分解誘導ペプチドタグの配列は配列番号２に示す。このペプチドは、配列番号１に示すssrA遺伝子の９０〜１１９位のヌクレオチドによりコードされる。また、他のssrA遺伝子も解明されている。Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Serratia marcescens, Escherichia
coli, Pseudomonas flurescens, Pseudomonas chlororaphis,及びPseudomonas putida由来のtmRNAがコードするタンパク質分解誘導ペプチドタグなどである。
【００２４】
共通する前駆体を有する二つのＬ−アミノ酸を同時に生産することのできる細菌を用いてもよい。本発明の目的は、二つのアミノ酸すなわちＬ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンを同時に生産するように予め改変した株を用いて達成された。このような株は、転写デュアルレギュレーターすなわちtryR遺伝子をRedドリブンレコンビネーション法により破壊することにより得ることができる。tyrR遺伝子の欠失は、鋳型として形質転換株の染色体DNAを用いるPCRにより確認できる。Ｌ−アミノ酸を生産できる細菌、好ましくはフェニルアラニンとチロシンとを同時に生産できる細菌を用いてもよい。E. coli MG1655 ΔtyrRがこのような株の例である。E. coli MG1655 ΔtyrRは、WO 05/010175に記載された標準的技術により、染色体のtyrR遺伝子を、Cmマーカーを含むDNAカセットで置換した後、そのマーカーを切り出すことにより得た。また、pgi遺伝子がssrAタギングにより改変されペントースリン酸経路へのD-グルコース-6-リン酸のフラックスが増加し、Ｌ−ヒスチジンの生産性が向上したＬ−ヒスチジン生産株も包含される。
【００２５】
「転写可能であり、配列番号２のペプチド又はその変異体をコードするＤＮＡ断片であって、前記遺伝子の３’末端に連結される前記断片」という語句は、細菌酵素をコードする遺伝子が、野生型株の遺伝子などの非改変遺伝子と比べて、その3'末端に付加的なヌクレオチド残基を有するように改変されていることを意味する。細菌酵素をコードする遺伝子の3'末端におけるこのＤＮＡ断片（配列番号２又はその変異体をコードする）の存在によりタグ付mRNA種が形成され、対応する翻訳タンパク質が、タグ付された、すなわち、Ｃ末端に連結した付加的ペプチドを有する。細菌酵素は、遺伝的組換え、Ｃ末端延長、Ｃ末端融合などの方法により改変されてもよい。改変酵素タンパク質の長さは、例えば、特異的抗体を用いるウェスタンブロット、タンパク質配列決定などにより測定できる。「配列番号２のペプチド又はその変異体を、タンパク質のカルボキシル末端に連結する」という語句は、また、翻訳された改変タンパク質が細菌において改変タンパク質が調節された速度で分解するように発現することを意味する(McGinness K.E. and al, Molecular Cell, 22: 701-707 (2006))。
【００２６】
「転写可能であるＤＮＡ断片」という語句は、ＤＮＡ断片が細菌酵素をコードする遺伝子の3'末端に、細菌酵素をコードする遺伝子の終止コドンが除去され、必要なＤＮＡ断片がその遺伝子の最終コドンの直後に導入されるように連結されることを意味する。このようなＤＮＡ構築物は、一つの転写単位として転写され、所望のＤＮＡ断片を目的（細菌酵素）遺伝子のmRNAにタグ付けする。この結果、ssrAタグ付けタンパク質が発現することになる。
【００２７】
本発明で使用される「その変異体」という語句は、配列の変化を有するタンパク質であって、この配列の変化がアミノ酸の欠失、挿入、付加、又は置換のいずれであっても、有用なレベル、例えば、タグ付タンパク質の活性を減少させ、結果としてＬ−アミノ酸の生産を向上させるのに有用なレベルで、所望の活性を維持しているペプチドを意味する。変異体ペプチドにおける変化の数は、ペプチドの三次元構造におけるアミノ酸残基の位置又はタイプによって異なる。変化の数は、配列番号２に示すペプチドでは１〜４、好ましくは１〜２であり得る。ペプチドの機能に重要ではないペプチドの領域でこれらの変異体の変化が起こり得る。これは、幾つかのアミノ酸が互いに高い相同性を有するため、活性が
このような変化による影響を受けないからである。したがって、ssrAタグ付タンパク質がプロテアーゼにより認識され、分解される限り、変異体ペプチドは、配列番号２で示される全アミノ酸配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するものであり得る。既知の方法、例えば、３つのパラメーター：スコア、同一性、及び類似性を算出する、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴ２．０を使用して、２つのアミノ酸配列間の相同性を計算することができる。
【００２８】
１つ又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加は、活性が維持されるような保存的変異であるべきである。代表的な保存的変異は保存的置換である。保存的置換の例としては、ＡｌａのＳｅｒ又はＴｈｒへの置換、ＡｒｇのＧｌｎ、Ｈｉｓ、又はＬｙｓへの置換、ＡｓｎのＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、又はＡｓｐへの置換、ＡｓｐのＡｓｎ、Ｇｌｕ、又はＧｌｎへの置換、ＣｙｓのＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＧｌｎのＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、又はＡｒｇへの置換、ＧｌｕのＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、又はＡｓｐへの置換、ＧｌｙのＰｒｏへの置換、ＨｉｓのＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、又はＴｙｒへの置換、ＩｌｅのＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、又はＰｈｅへの置換、ＬｅｕのＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、又はＰｈｅへの置換、ＬｙｓのＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、又はＡｒｇへの置換、ＭｅｔのＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、又はＰｈｅへの置換、ＰｈｅのＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、又はＬｅｕへの置換、ＳｅｒのＴｈｒ又はＡｌａへの置換、ＴｈｒのＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＴｒｐのＰｈｅ又はＴｙｒへの置換、ＴｙｒのＨｉｓ、Ｐｈｅ、又はＴｒｐへの置換、及びＶａｌのＭｅｔ、Ｉｌｅ、又はＬｅｕへの置換が挙げられる。
【００２９】
Bacillus subtilis (BACSU), Bacillus stearothermophilus (BACST), Serratia marcescens (SERMA), Escherichia coli (ECOLI), Pseudomonas flurescens (PSEFL), Pseudomonas chlororaphis (PSECL), Pseudomonas putida (PSEUPU)由来のtmRNAがコードするタンパク質分解誘導ペプチドタグの一次配列を比較データにより、そのC末端におけるアミノ酸配列"YALAA"の高い相同性が示された（図５）。ペプチド活性を損なうことなく類似アミノ酸残基（コロンで示す）を類似アミノ酸で置換することができる。しかし、他の非保存的アミノ酸残基の改変は、tmRNAがコードするタンパク質分解誘導ペプチドタグの活性を変化をもたらさないかもしれない。McGinness K.E. et al.(Molecular Cell, 22:701-707 (2006))によるペプチドタグ付アミノ酸配列も本発明のペプチド変異体として考えられる。
【００３０】
タグペプチドと実質的に同じペプチドをコードするＤＮＡは、例えば、指定部位での１つ又は複数のアミノ酸残基が、欠失、置換、挿入又は付加を包含するように、部位特異的変異誘発法を用いて、タグペプチド成分をコードするDNAのヌクレオチド配列（配列番号１）を改変することにより得ることができる。上記のような改変ＤＮＡは、従来から知られている変異処理により得ることができる。このような処理としては、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡのヒドロキシルアミン処理、或いはＵＶ照射又はＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン若しくは亜硝酸等の試薬による上記ＤＮＡを含有する細菌の処理が挙げられる。タグペプチドと実質的に同じペプチドをコードするＤＮＡは、適切な細胞において上記のような変異を有するＤＮＡを発現させ、発現生成物の活性を試験することにより得ることができる。タグペプチドと実質的に同じタンパク質をコードするＤＮＡはまた、例えば、ストリンジェントな条件下で配列番号１に示される塩基配列を例えば含む塩基配列を有するプローブとハイブリダイズし、タグペプチドの活性を有するペプチドをコードするＤＮＡを単離することにより得ることができる。本明細書中で言及される「ストリンジェントな条件」は、いわゆる特異的ハイブリッドが形成され、且つ非特異的ハイブリッドが形成されない条件である。例えば、ストリンジェントな条件は、高い相同性を有するＤＮＡ、例えば、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは
７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡは互いにハイブリダイズすることが可能であるが、上記未満の相同性を有するＤＮＡは互いにハイブリダイズすることができない条件により例示され得る。あるいは、サザンハイブリダイゼーションでの通常の洗浄条件に相当する塩濃度、すなわち、６０℃で１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで、ＤＮＡがハイブリダイズする条件により、ストリンジェントな条件が例示され得る。洗浄時間は、ブロット法に使用される膜のタイプによって異なり、これは一般的には製造業者によって推奨されるものである。例えば、ストリンジェントな条件下でのＨｙｂｏｎｄ（登録商標）Ｎ＋ナイロン膜(Amersham)の推奨される洗浄時間は１５分間である。好ましくは、洗浄は２、３回行われる。
【００３１】
配列番号１の塩基配列の部分配列をプローブとして使用することもできる。プローブは、配列番号１の塩基配列に基づいたプライマー、及び鋳型として配列番号１の塩基配列を含有するＤＮＡ断片を使用するＰＣＲにより調製され得る。
【００３２】
上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加は、例えば細菌の種又は属の多様性に起因して自然に存在し、且つタグペプチド成分を含む変異も包含する（突然変異体又は変異体）。
【００３３】
配列番号２に示すペプチド又はその変異体をコードするＤＮＡ断片を3'末端に有する細菌遺伝子の発現は、ペプチドをコードするＤＮＡで細菌を形質転換することにより達成できる。より詳しくは、ＤＮＡ断片をタンパク質をコードする遺伝子の下流の細菌染色体にコードフレームを乱さないように導入し、好ましくは、本来の染色体遺伝子を、タグ付タンパク質をコードする変異遺伝子により通常の方法で置換することにより達成できる。ＤＮＡにより細菌の形質転換により、本発明の延長タンパク質をコードする染色体変異遺伝子が形成される。形質転換の方法には、これまでに報告された任意の方法が含まれる。
【００３４】
例えば、遺伝子組換えにより変異遺伝子を含むＤＮＡを導入するのに以下の方法を用いてもよい。変異遺伝子を調製し、細菌を変異遺伝子を含むＤＮＡ断片で形質転換する。次いで、染色体上の本来の遺伝子を相同組換えにより変異遺伝子で置換し、得られる株を選択する。相同組換えによりこのような遺伝子置換は、線状ＤＮＡを用いて、「Ｒｅｄ駆動性組込み(Red-driven integration)」として知られる方法(Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 12, p 6640-6645 (2000))や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法(U.S. Patent 6,303,383又はJP 05-007491A)によって行うことができる。細胞のＤＮＡに対する透過性を増大するために、塩化カルシウムで受容細胞を処理する方法が、エシェリヒア・コリＫ−１２に関して報告されており(Mandel,
M.及びHiga, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970))、この方法が使用され得る。
【００３５】
プラスミドＤＮＡの調製方法としては、ＤＮＡの分解及び連結、形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択等、又は当業者に既知の他の方法が挙げられるがこれらに限定されない。これらの方法は、例えばSambrook, J., Fritsch, E.F.,及び Maniatis, T.著"Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition" Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載されている。
【００３６】
本発明において、「Ｌ−アミノ酸生合成に影響する細菌酵素」という語句は、望まない産物、例えば、目的Ｌ−アミノ酸と共通の前駆体を有する産物の生合成経路に関与する酵素を意味する。「望まない産物の生合成経路に関与する細菌酵素」という語句は、目的Ｌ−アミノ酸と共通の前駆体が望まない産物に変換される反応を触媒する酵素を意味する。これは、酵素が、望まない産物の生産をもたらす生合成経路の分岐の方へ反応を向けることにより生じる。「Ｌ−アミノ酸生合成に影響する細菌酵素」という語句は、また、目的
Ｌ−アミノ酸の副生物の生合成経路に関与する酵素を意味する。このような副生物の存在により、精製における有意な技術的な問題が生じ、Ｌ−アミノ酸生産に負の影響を与えることがある。
【００３７】
Ｌ−アミノ酸生合成に影響する細菌酵素をコードする遺伝子は、本発明の目的遺伝子である。このような遺伝子は、これらに限定されるものではないが、コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードするtryA遺伝子、ホスホグルコースイソメラーゼをコードするpgi遺伝子、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードするilvE遺伝子、スレオニンデヒドラターゼをコードするilvA及びtdcB遺伝子、Ｌ−スレオニンデアミナーゼをコードするsdaA及びsdaB遺伝子、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼをコードするargA遺伝子、アルギニノスクシネートシンターゼをコードするargG遺伝子、γ−グルタミルキナーゼをコードするproB遺伝子、ホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子、ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子などである。一般に、目的Ｌ−アミノ酸の経路から誘導される代謝物の生産を引きおこす、及び／又は、副生物の形成に関与する遺伝子はいずれも本発明の目的の遺伝子である。
【００３８】
コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（同義語: B2600, TyrA）は、コリスミ酸とプレフェン酸との間の可逆的変換、及び、プレフェン酸と、チロシンの生合成経路の中間体化合物であるp-ヒドロキシフェニルピルビン酸との間の可逆的変換を触媒する。コリスミ酸の変換は、チロシン及びフェニルアラニンの両方の生合成における第１の段階である。ssrAタギングによるTyrAタンパク質の改変は、L-チロシン生合成経路へのプレフェン酸のフラックスの低減、及び、L-フェニルアラニンの生産の増強に有用であり得る。コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドロゲナーゼの活性は、2.5 mMコリスミ酸の存在下でのストップトタイムアッセイを用いて、又は、0.8%アガロースで調製したプレートにおける酵素抗体複合体の免疫拡散分析(Rood J.I., Perrot B. et al., Eur J Biochem.; 124, 513-519 (1982))により測定できる。Escherichia coli由来のコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする野生型tyrA遺伝子（同義語: ECK2597, b2600）は知られている。tyrA遺伝子は、E. coli K-12株の染色体上でpheA遺伝子とaroF遺伝子との間に位置する(GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990の配列におけるヌクレオチド2736970〜2738091に相補的なヌクレオチド)。Escherichia coli由来のtyrA遺伝子は、配列番号３により示され、tyrA遺伝子によりコードされるアミノ酸配列は配列番号４により示される。
【００３９】
フェニルアラニンの生合成経路において、プレフェン酸とフェニルピルビン酸との間の可逆的変換は、E. coliではpheA遺伝子（同義語：ECK2596, b2599)）によりそのサブユニットがコードされるコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（同義語：B2599, PheA）により触媒される。pheA遺伝子は、E. coli K-12株の染色体上でpheA遺伝子リーダーペプチドとtyrA遺伝子との間に位置する(GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990の配列におけるヌクレオチド2735767〜2736927)。Escherichia coli由来のpheA遺伝子は、配列番号５により示され、pheA遺伝子によりコードされるアミノ酸配列は配列番号６により示される。ssrAタギングによるTyrA及びPheAタンパク質の同時の改変は、L-チロシン及びL-チロシン生合成経路へのコリスミ酸のフラックスを低減し、L-フェニルアラニンの生産を増強するのに有用である。
【００４０】
ホスホグルコースイソメラーゼ（同義語：B4025, Pgi, グルコース-6-リン酸イソメラーゼ, D-グルコース-6-リン酸-ケトール-イソメラーゼ）は、糖新生及び解糖の経路におけるβ-D-グルコース-6-リン酸とD-フルクトース-6-リン酸との間の可逆的変換を触媒する。ホスホグルコースイソメラーゼの活性の低減は、ヒスチジン前駆代謝物である5-ホスホリボシル1-ピロリン酸が生成するペントースリン酸経路への炭素フラックスの再分配を導く。ホスホグルコースイソメラーゼの活性は、例えば、G6Pデヒドロゲナーゼ(Winkler
H.H., J Bacteriol.,101, 2:470-475 (1970))を用いる共役アッセイによるFriedberg I. (J Bacteriol., 112,3:1201-1205 (1972))に記載の方法により検出できる。Escherichia
coli 由来のグルコース-6-リン酸イソメラーゼをコードする野生型pgi遺伝子（同義語：ECK4017, b4025）は知られている。pgi遺伝子は、E. coli K-12株の染色体上でlysC遺伝子とygbE遺伝子との間に位置する(GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990の配列におけるヌクレオチド4,231,781〜4,233,430)。Escherichia coli由来のpgi遺伝子は、配列番号７により示され、pgi遺伝子によりコードされるアミノ酸配列は配列番号８により示される。
【００４１】
分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（同義語：B3770, IlvE）は、α-ケトグルタル酸及び三種の脂肪族分岐鎖アミノ酸の一つをそれぞれ生成する一連のアミノ基転移反応を触媒する。ssrAタギングによるIlvEタンパク質の改変は、L-バリン生合成経路への2-ケトイソバレリン酸のフラックスを低減し、これにより副生物としてのL-イソロイシンの量の低減ももたらし、L-ロイシンの生産を増強するのに有用であり得る。分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼの活性は、例えば、Lee-Peng FC et al (J. Bacteriol., 139(2); 339-45 (1979))に記載の方法により測定できる。Escherichia coli 由来の分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする野生型ilvE遺伝子（同義語：ECK3762, b3770, スレオニンデアミナーゼ, L-スレオニンヒドロリアーゼ）は知られている。ilvE遺伝子は、E. coli K-12株の染色体上でilvM遺伝子とilvD遺伝子との間に位置する(GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990の配列におけるヌクレオチド3,950,507〜3,951,436)。
【００４２】
スレオニンデヒドラターゼ（同義語：B3772, Ile, IlvA）は、L-スレオニンの脱アミノ化を触媒する。ssrAタギングによるIlvAタンパク質の改変は、L-スレオニンの分解を防ぎ、L-イソロイシン生合成経路へのL-スレオニンのフラックスを低減し、また、L-アルギニンの生産を増強するのに有用であり得る。スレオニンデヒドラターゼの活性は、例えば、Eisenstein, E. (J. Biol. Chem., 266(9); 5801-7 (1991))に記載の方法により測定できる。Escherichia coli 由来のスレオニンデヒドラターゼをコードする野生型ilvA遺伝子（同義語：ECK3764, b3772, ile）は知られている。ilvA遺伝子は、E. coli K-12株の染色体上でilvD遺伝子とilvY遺伝子との間に位置する(GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990の配列におけるヌクレオチド3,953,354〜3,954,898)。
【００４３】
スレオニンデヒドラターゼ（同義語：B3117, Tdc, TdcB, スレオニンデアミナーゼ, L-セリンデヒドラターゼ, セリンデアミナーゼ, L-スレオニンヒドロリアーゼ）は、L-スレオニンの脱アミノ化を触媒する。ssrAタギングによるTdcBタンパク質の改変は、L-スレオニンの分解を防ぎ、L-イソロイシン生合成経路へのL-スレオニンのフラックスを低減するのに有用であり得る。Escherichia coli 由来のスレオニンデヒドラターゼをコードする野生型tdcB遺伝子（同義語：ECK3106, b3117, tdc）は知られている。tdcB遺伝子は、E. coli K-12株の染色体上でtdcC遺伝子とtdcA遺伝子との間に位置する(GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990の配列におけるヌクレオチド3,263,061〜3,264,050に相補的なヌクレオチド)。
【００４４】
スレオニンデアミナーゼSdaA（同義語：B1814, SdaA, SDH1, L-SD, L-スレオニンデアミナーゼI, L-セリンデヒドラターゼ1, SDH-1, L-SD1, L-ヒドロキシアミノ酸デヒドラターゼ1, L-セリンデアミナーゼ1, L-セリンヒドロリアーゼ1）及びSdaB（同義語：B2797, SdaB, L-スレオニンデアミナーゼII, L-セリンデアミナーゼ2, L-セリンデヒドラターゼ2, SDH-2, L-SD2, L-セリンヒドロリアーゼ2）は、L-スレオニンの脱アミノ化を触媒する。ssrAタギングによるスレオニンデアミナーゼタンパク質の改変は、L-スレオニンの分解を防ぎ、L-イソロイシン生合成経路へのL-スレオニンのフラックスを低減するのに有用であり得る。Escherichia coli 由来のスレオニンデヒドラターゼをコードする野生型sdaA
遺伝子（同義語：ECK1812, b1814）及びadaB遺伝子（同義語：ECK2792, b2797）は知られている。sdaA遺伝子は、E. coli K-12株の染色体上でyeaB遺伝子とyoaD遺伝子との間に位置する(GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990の配列におけるヌクレオチド1,894,956〜1,896,320)。sdaB遺伝子は、E. coli K-12株の染色体上でsdaC遺伝子とxni遺伝子との間に位置する(GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990の配列におけるヌクレオチド2,927,598〜2,928,965)。
【００４５】
N-アセチルグルタミン酸シンターゼ（同義語：B2818, ArgA, NAGS, アセチル-CoA:L-グルタミン酸 N-アセチルトランスフェラーゼ, アミノ酸-N-アセチルトランスフェラーゼ）は、L-グルタミン酸とアセチル-CoAからのN-アセチルグルタミン酸の合成を触媒する。ssrAタギングによるArgAタンパク質の改変は、L-プロリン生産のためのグルタミン蓄積に有用であり得る。N-アセチルグルタミン酸シンターゼの活性は、例えば、Marvil, D.K. and
Leisinger, T. (J. Biol. Chem., 252(10); 3295-303 (1977))に記載の方法により測定できる。Escherichia coli 由来のスレオニンデヒドラターゼをコードする野生型argA遺伝子（同義語：ECK2814, Arg2, Arg1, b2818）は知られている。argA遺伝子は、E. coli K-12株の染色体上でamiC遺伝子とrecD遺伝子との間に位置する(GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990の配列におけるヌクレオチド2,947,264〜2,948,595)。
【００４６】
アルギノコハク酸シンターゼ（同義語：B3172, ArgG, アルギノコハク酸シンテターゼ,
シトルリン-アスパラギン酸リガーゼ, L-シトルリン:L-アスパラギン酸リガーゼ）は、アルギノコハク酸、L-アスパラギン酸及びシトルリンの合成を触媒する。ssrAタギングによるArgGタンパク質の改変は、シトルリン生産に有用であり得る。Escherichia coli 由来のアルギノコハク酸シンターゼをコードする野生型argG遺伝子（同義語：ECK3161, b3172）は知られている。argG遺伝子は、E. coli K-12株の染色体上でargR遺伝子とyhbX遺伝子との間に位置する(GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990の配列におけるヌクレオチド3,316,659〜3,318,002)。
【００４７】
γ-グルタミルキナーゼ（同義語：B0242, ProB, グルタミン酸 5-キナーゼ, GK, ATP:L-グルタミン酸 5-ホスホトランスフェラーゼ, G5K）は、プロリン合成の最初の反応であるグルタミン酸のリン酸化の反応を触媒する。ssrAタギングによるProBタンパク質の改変は、L-アルギニン生産のためのグルタミン蓄積に有用であり得る。γ-グルタミルキナーゼの活性は、例えば、Smith, C.J. et al, (J. Bacteriol., 157(2); 545-51 (1984))に記載の方法により測定できる。Escherichia coli 由来のγ-グルタミルキナーゼをコードする野生型proB遺伝子（同義語：ECK0243, pro(2), b0242, pro2）は知られている。proB遺伝子は、E. coli K-12株の染色体上でphoE遺伝子とproA遺伝子との間に位置する(GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990の配列におけるヌクレオチド259,612〜260,715)。
【００４８】
ホモセリンキナーゼ（同義語：B0003, ThrB, ATP:L-ホモセリン O-ホスホトランスフェラーゼ）は、ホモセリンのリン酸化の反応を触媒する。ssrAタギングによるThrBタンパク質の改変は、L-メチオニン生産に有用であり得る。ホモセリンキナーゼの活性は、例えば、Shames, S.L. and Wedler, F.C. (Arch. Biochem. Biophys., 235(2); 359-70 (1984))に記載の方法により測定できる。Escherichia coli 由来のホモセリンキナーゼをコードする野生型thrB遺伝子（同義語：ECK0003, b0003）は知られている。thrB遺伝子は、E. coli K-12株の染色体上でthrA遺伝子とthrC遺伝子との間に位置する(GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990の配列におけるヌクレオチド2,801〜3,733)。
【００４９】
ホモセリンデヒドロゲナーゼは、ホモセリンからのL-アスパラギン酸セミアルデヒドの生成を触媒する。Escherichia coli では、ホモセリンでヒドロゲナーゼは、thrA遺伝子によりコードされるアスパラギン酸キナーゼ／ホモセリンでヒドロゲナーゼタンパク質の
一部である。しかし、Corynebacteriaなどの他の微生物では、ホモセリンでヒドロゲナーゼは、独立した酵素である。ssrAタギングによるホモセリンでヒドロゲナーゼの改変は、L-リジン生産に有用であり得る。
【００５０】
ssrA, tyrA, pheA, pgi, ilvE, ilvA, tdcB, sdaA, sdaB, argA, argG, proB, thrB及び他の目的遺伝子は、遺伝子の既知の塩基配列に基づいて調製されたプライマーを用いるPCR (polymerase chain reaction; White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)参照) によって得ることができる。他の微生物に由来するタグペプチドをコードする遺伝子も同様に得ることができる。
【００５１】
転写可能であり、配列番号２のペプチド又はその変異体をコードするＤＮＡ断片を、コリスミ酸／プレフェン酸デヒドロゲナーゼ及びホスホグルコースイソメラーゼをコードする遺伝子の３’末端に連結する上記の技術及び教示は、他の目的遺伝子から転写される他のタンパク質を活性を改変するために同様に適用することができる。
【００５２】
本発明の細菌は、上記のDNAを、L-アミノ酸生産能を元来有する細菌に導入することによって得ることができる。あるいは、本発明の細菌は、上記のDNAを既に含む細菌に、L-アミノ酸生産能を付与することによって得ることができる。
【００５３】
L-アミノ酸生産菌
芳香族又は非芳香族L-アミノ酸を生産できる細菌を本発明で用いることができる。
【００５４】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌
本発明のＬ−フェニルアラニン生産菌の親株の例としては、E.coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)、変異型pheA34遺伝子を保持するE.coli HW1089 (ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E.coli MWEC101-b (KR8903681)、E.coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるがこれらに限定されない。また、親株として、E. coli K-12
[W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びAJ 12604と命名されたE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424 B1)。さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するL-フェニルアラニン産生菌も使用できる(米国出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。
【００５５】
Ｌ−ヒスチジン生産菌
本発明のＬ−ヒスチジン生産菌の親株の例としては、E. coli 24株 (VKPM B-5945, RU2003677)、E. coli 80株 (VKPM B-7270, RU2119536)、E. coli NRRL B-12116 − B12121 (米国特許第4,388,405号)、E. coli H-9342 (FERM BP-6675)及びH-9343 (FERM BP-6676) (米国特許第6,344,347号)、E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087)、E. coli AI80/pFM201(米国特許第6,258,554号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５６】
本発明のL-ヒスチジン生産菌の親株の例としては、L-ヒスチジン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。L-ヒスチジン生合成系酵素をコードする遺伝子の例としては、ATPホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)、ホスホリボシルAMPサイクロヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、ホスホリボシル-ATPピロホスホヒドロラーゼ遺伝子(hisIE)、ホスホリボシルフォルミミノ-5-アミノイミダゾールカルボキサミドリボタイドイソメラーゼ遺伝子(hisA)、アミドトランスフェラーゼ遺伝子(hisH)、ヒスチジノールホスフェートアミノトランスフェラーゼ遺伝子(hisC)、ヒスチジノールフ
ォスファターゼ遺伝子(hisB)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子(hisD)などが挙げられる。
【００５７】
hisG及びhisBHAFIにコードされるL-ヒスチジン生合成系酵素はL-ヒスチジンにより阻害されることが知られており、従って、L-ヒスチジン生産能は、ATPホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)にフィードバック阻害への耐性を付与する変異を導入することにより効率的に増大させることができる(ロシア特許第2003677号及び第2119536号)。
【００５８】
L-ヒスチジン産生能を有する株の具体例としては、L-ヒスチジン生合成系酵素をコードするDNAを保持するベクターを導入したE. coli FERM-P 5038及び5048 (JP 56-005099 A)、アミノ酸輸送の遺伝子であるrhtを導入したE.coli株(EP1016710A)、スルファグアニディン、DL-1,2,4-トリアゾール-3-アラニン及びストレプトマイシンに対する耐性を付与したE. coli 80株(VKPM B-7270, ロシア特許第2119536号)などが挙げられる。
【００５９】
Ｌ−トリプトファン生産菌
本発明のＬ−トリプトファン生産菌の親株の例としては、変異trpS遺伝子によりコードされるトリプトファニル-tRNAシンテターゼが欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、セリンによるフィードバック阻害を受けないホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニル酸シンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,180,373号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、ホスホエノールピルビン酸産生能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるがこれらに限定されない。さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するL-トリプトファン産生菌も使用できる(米国出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。
【００６０】
本発明のL-トリプトファン産生菌の親株の例としては、アンスラニレートシンターゼ、ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ、及び、トリプトファンシンターゼから選ばれる酵素の活性の一種以上が増大した株も挙げられる。アンスラニレートシンターゼ及びホスホグリセレートデヒドロゲナーゼは共にL-トリプトファン及びL-セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。このような変異を有する株の具体例としては、脱感作型アンスラニレートシンターゼを保持するE. coli SV164、及び、E. coli SV164に、フィードバック阻害が解除されたホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異serA遺伝子を含むプラスミドpGH5 (WO 94/08031)を導入することにより得られた形質転換株が挙げられる。
【００６１】
L-トリプトファン生産菌の親株の例としては、脱感作型アンスラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株(JP 57-71397 A, JP 62-244382 A, 米国特許第4,371,614号)も挙げられる。さらに、L-トリプトファン生産能を、トリプトファンオペロン(trpBA)中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝子の発現を増大させることにより付与してもよい。トリプトファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpBによりコードされるα及びβサブユニットからなる。さらに、L-トリプトファン生産能を、イソクエン酸リアーゼ-リンゴ酸シンターゼオペロンの発現を増大させることにより改良してもよい(WO2005/103275)。
【００６２】
Ｌ−バリン生産菌
本発明のＬ−バリン生産菌の親株の例としては、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変された株(米国特許第5,998,178号)が挙げられるがこれらに限定されない。アテニ
ュエーションに必要なilvGMEDAオペロンの領域を除去し、生産されるL-バリンによりオペロンの発現が減衰しないようにすることが好ましい。さらに、オペロンのilvA遺伝子は破壊され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少することが好ましい。
【００６３】
L-バリン産生菌の親株の例としては、アミノアシルt-RNAシンテターゼの変異を有する変異株(米国特許第5,658,766号)も挙げられる。例えば、イソロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS 遺伝子に変異を有するE. coli VL1970が使用できる。E. coli VL1970は、1988年6月24日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (Russia, 117545 Moscow, 1st Dorozhny Proezd, 1)に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。
【００６４】
さらに、生育にリポ酸を要求する、及び／または、H+-ATPaseを欠失している変異株(WO96/06926)を親株として用いることができる。
【００６５】
Ｌ−イソロイシン生産菌
本発明のＬ−イソロイシン生産菌の親株の例としては、６−ジメチルアミノプリンに耐性を有する変異株(JP 5-304969 A)、チアイソロイシン、イソロイシンヒドロキシメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、さらにDL-エチオニン及び／またはアルギニンヒドロキシメートに耐性を有する変異株(JP 5-130882 A).が挙げられるがこれらに限定されない。さらに、スレオニンデアミナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼなどのL-イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(JP 2-458 A, FR 0356739, 及び米国特許第5,998,178号)。
【００６６】
Ｌ−ロイシン生産菌
本発明のＬ−ロイシン生産菌の親株の例としては、ロイシン耐性のE. coil株 (例えば、57株 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号)またはβ−２−チエニルアラニン、３−ヒドロキシロイシン、４−アザロイシン、5,5,5-トリフルオロロイシンなどのロイシンアナログ耐性のE.coli株(JP 62-34397 B及びJP 8-70879 A)、WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法で得られたE. coli株、E. coli H-9068 (JP 8-70879 A)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６７】
本発明の細菌は、L-ロイシン生合成に関与する遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、L-ロイシンによるフィードバック阻害を受けないイソプロピルリンゴ酸シンターゼをコードする変異leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)に代表されるleuABCDオペロンの遺伝子が挙げられる。さらに、本発明の細菌は、細菌の細胞からL-アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、b2682遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP 1239041 A2)が挙げられる。
【００６８】
Ｌ−アルギニン生産菌
本発明のＬ−アルギニン生産菌の親株の例としては、E. coli 237株 (VKPM B-7925) (米国出願公開2002/058315 A1)、及び、変異N-アセチルグルタミン酸シンターゼを保持するその誘導体株(ロシア特許出願第2001112869号)、E. coli 382株 (VKPM B-7926) (EP1170358A1)、N-アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードするargA遺伝子が導入されたアルギニン産生株(EP1170361A1)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６９】
L-アルギニン産生菌の親株の例としては、L-アルギニン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。L-アルギニン生合成系酵素をコードする
遺伝子の例としては、N-アセチルグルタミルホスフェートレダクターゼ遺伝子(argC)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(argJ)、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ遺伝子(argB)、アセチルオルニチントランスアミナーゼ遺伝子(argD)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子(argF)、アルギノコハク酸シンテターゼ遺伝子(argG)、アルギノコハク酸リアーゼ遺伝子(argH)、カルバモイルリン酸シンターゼ遺伝子（carAB）が挙げられる。
【００７０】
Ｌ−シトルリン生産菌
本発明のＬ−シトルリン生産菌の親株の例としては、フィードバック耐性変異カルバモイルリン酸シンセターゼを保持するエシェリヒア属に属する株 (米国特許第6,991,924号)が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７１】
＜２＞本発明の製造法
本発明の製造法は、本発明の微生物を培地中で培養し、該培養物中にＬ−アミノ酸を生産蓄積させ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取することを含むＬ−アミノ酸の製造法である。
【００７２】
本発明において、培地等からのＬ−アミノ酸の培養、回収、及び精製は、Ｌ−アミノ酸を微生物によって製造する従来の発酵方法に従って行うことができる。
【００７３】
炭素源、窒素源、ミネラル、および必要に応じて微生物が生育のために必要とする適量の栄養素が含まれていれば、培地は合成培地又は天然培地のいずれであってもよい。炭素源としては、グルコース、スクロース等の炭水化物、並びに様々な有機酸が挙げられる。選択された微生物の資化の態様に応じて、エタノール及びグリセロール等のアルコールを使用してもよい。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム等の様々なアンモニウム塩、アミン類等の他の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物、及び消化された発酵性微生物等の天然の窒素源を使用することができる。ミネラルとしては、一リン酸カリウム、二リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウム等を使用することができる。ビタミンとしては、チアミン、酵母エキス等を使用することができる。
【００７４】
培養は、振盪または通気下での撹拌等の好気条件下で、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３８℃の温度で、行うことが好ましい。培地のｐＨは通常、５〜９であり、好ましくは６．５〜７．２である。培地のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウム、様々な酸、様々な塩基、及び緩衝液で調整することができる。通常、１〜５日間の培養により培地中に標的Ｌ−アミノ酸が蓄積する。
【００７５】
培養後、遠心分離又は膜濾過によって、細胞等の固体を液体培地から除去し、イオン交換法、濃縮法、及び／又は結晶化法によって、標的Ｌ−アミノ酸を回収及び精製することができる。
【００７６】
本発明の方法によって製造されたフェニルアラニンは、例えば、α-L-アスパルチル-L-フェニルアラニンの低級アルキルエステル(「アスパルテーム」とも呼ばれる)の製造に使用することができる。すなわち、本発明の方法は、L-フェニルアラニンを原料として用いるα-L-アスパルチル-L-フェニルアラニンの低級アルキルエステルの製造を包含し得る。この方法は、上記の本発明の方法によって製造されたL-フェニルアラニンと、アスパラギン酸又はその誘導体とからα-L-アスパルチル-L-フェニルアラニンの低級アルキルエステルを合成することを含む。低級アルキルエステルとしては、メチルエステル、エチルエステル及びプロピルエステル等が挙げられる。
【００７７】
本発明において、L-フェニルアラニン、及びアスパラギン酸又はその誘導体からα-L-アスパルチル-L-フェニルアラニンの低級アルキルエステルを合成する方法は、α-L-アスパルチル-L-フェニルアラニンの低級アルキルエステルの合成にL-フェニルアラニン又はその誘導体が用いられる限り特に制限されず、通常の方法を用いることができる。具体的には、例えば、α-L-アスパルチル-L-フェニルアラニンの低級アルキルエステルは、以下の方法により製造することができる(米国特許第3,786,039号)。L-フェニルアラニンをL-フェニルアラニンの低級アルキルエステルにエステル化する。このL-フェニルアラニンアルキルエステルを、β-カルボキシル基が保護され、α-カルボキシル基がエステル化されて活性化されたL-アスパラギン酸の誘導体と反応させる。前記誘導体としては、N-ホルミル-、N-カルボベンゾキシ-、又はN-p-メトキシカルボベンゾキシ-L-アスパラギン酸無水物のようなN-アシル-L-アスパラギン酸無水物が挙げられる。この縮合反応により、N-アシル-α-L-アスパルチル-L-フェニルアラニンと、N-アシル-β-L-アスパルチル-L-フェニルアラニンの混合物が得られる。この縮合反応を、37℃における酸解離定数が10-4以下の有機酸の存在下で行うと、β-体に対するα-体の割合が上昇する(特開昭51-113841)。続いて、N-アシル-α-L-アスパルチル-L-フェニルアラニンを混合物から分離し、水素化してα-L-アスパルチル-L-フェニルアラニンを得る。
【実施例】
【００７８】
本発明を、下記の非限定的実施例によりさらに具体的に説明する。
【００７９】
［実施例１］変異型tyrA-ssrA遺伝子を含むE. coli MG1655ΔtyrRtyrA-ssrA株の構築
１．変異tryA-ssrA遺伝子による、E. coliにおける天然pheA遺伝子及びtyrA遺伝子領域の3'末端に位置する36-ntの置換
天然pheA遺伝子及びtyrA遺伝子領域の3'末端に位置する36-ntを置換するために、1)pheA遺伝子の5'末端に位置する36-nt、2)attL及びattR部位を有するcat遺伝子、3)クロラムフェニコール耐性マーカー(CmR)をコードするDNA断片、4)終止コドンTAA、5)ssrA遺伝子の90〜119位に位置する30-nt、及び6) tyrA遺伝子領域の3'末端に位置する36-ntを保持するDNA断片を、Datsenko, K. A. とWanner, B. L.( Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 2000, 97, 6640-6645)により記載された、「Red-mediated integration」及び／又は「Red-driven integration」とも呼ばれる方法（図１）により、E. coli MG1655 ΔtyrRの染色体に、天然pheA遺伝子及び3'末端tyrA遺伝子領域に置き換えて組み込んだ。
【００８０】
DNA断片は、2回の連続PCRによって得た。第１回目のPCRの増幅産物の5μlを第２回目のPCRのテンプレートとして用いた。
【００８１】
cat遺伝子によりコードされるCmRマーカーを含む第１のDNA断片を、プライマーP1（配列番号９）及びP2（配列番号１０）と、テンプレートとしてpMW118-attL-Cm-attR (WO 05/010175) (図２)とを用いるPCRにより得た。プライマーP1は、pheA遺伝子の5'末端に位置する36-nt領域に同一の領域と、pMW118-attL-Cm-attRの27-nt attL領域に相補的な領域とを有する。プライマーP2は、ssrA遺伝子の30-nt領域に同一の領域と、pMW118-attL-Cm-attRの27-nt attR領域に相補的な領域とを有する。これらの二つの領域の間に、プライマーP2において終止コドンTAAが挿入された。PCRの条件は次の通りであった。95℃5分で変性； 95℃30秒、50℃30秒、72℃1分のプロファイルで30サイクル；最終ステップ：72℃5分。
【００８２】
1709bpの産物が得られ、アガロースゲルで精製され、この5μlを、プライマーP1（配列番号９）及びP3（配列番号１１）を用いる第２回のPCR反応のテンプレートとして用いた。プライマーP3は、tyrA遺伝子領域の3'末端に位置する36-nt領域に相補的な領域と、プライマーP2の5'末端に位置する18-nt領域に同一の領域とを有する。PCRの条件は次の通りであった。95℃5分で変性； 95℃30秒、50℃30秒、72℃1分のプロファイルで30サイクル
；最終ステップ：72℃5分。
【００８３】
1745bpのPCR産物が得られ、アガロースゲルで精製され、温度感受性複製開始点を有するプラスミドpKD46を保持するE. coli MG1655ΔtyrR株のエレクトロポレーションに用いた。プラスミドpkD46は、アラビノース誘導性ParaBプロモーターに制御されるλRed相同組換えシステムの遺伝子（γ、β、exo遺伝子）を含む、λファージの2154塩基のDNA断片（GenBankアクセッション番号 J02459, 31088〜33241位）を含む。プラスミドpKD46はPCR産物を、天然pheA遺伝子及びtyrA遺伝子領域の3'末端に位置する36-nt の代わりにE. coli MG1655ΔtyrR株の染色体に組み込むために必要である。
【００８４】
エレクトロポレーション用のコンピテントセルは次のようにして調製した。すなわち、エシェリヒア・コリMG1655ΔtyrR /pKD46株を、100mg／Lのアンピシリンを含んだLB培地中で３０℃、一晩培養し、培養物を、アンピシリンとL-アラビノース（10 mM）を含んだ5mLのSOB培地（Sambrook, J.ら、モレキュラークローニング：実験室マニュアル第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989年））で100倍希釈した[アラビノースは、Redシステム遺伝子をコードするプラスミドを誘導するために用いられた]。細胞を３０℃で通気しながらＯＤ600が約０．６になるまで生育させた後、100倍に濃縮し、氷冷したH2Oで３回洗浄することによってエレクトロポレーションに使用できるようにした。エレクトロポレーションは７０μＬの細胞と約１００ｎｇのＰＣＲ産物を用いて行った。エレクトロポレーションは"BioRad" エレクトロポレーター (USA, No. 165-2098, version 2-89)を用いて製造者の指示書に従って行った。処理後の細胞は１ｍＬのＳＯＣ培地（Sambrook, J.ら、モレキュラークローニング：実験室マニュアル第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989年））で希釈し、３７℃で２時間培養した後、クロラムフェニコール(20μg/ml)を含むＬ−寒天培地上で３７℃で平板培養し、ＣｍR組換え体を選択した。
【００８５】
２．PCRによるpheA遺伝子欠失の確認
24時間生育させた後、コロニーを、アレル特異的プライマーP4（配列番号１２）及びP5（配列番号１３）を用いるPCRによりCmRマーカーの存在に関して試験した。このために、新たに単離したコロニーを水(20μl)に懸濁し、得られた懸濁液の1μlをPCRに用いた。温度プロファイルは次の通りであった。95℃5分で初期変性；（95℃30秒の変性、50℃30秒のアニーリング、72℃1分の伸長）を30サイクル；72℃5分の最終伸長。
【００８６】
試験したCmRコロニーのいくつかが、求める2373-bp DNA断片を含んでおり、これによりpheA遺伝子の1869-bp天然領域がハイブリッドtyrA-ssrA遺伝子で置換されていることが確認された（図１及び図３参照）。得られた変異株をMG1655 ΔtyrR (pheA::cat tyrA-ssrAと命名した。
【００８７】
３．E. coli MG1655 ΔtyrR (pheA::cat tyrA-ssrA 株のcat遺伝子の、野生型pheA遺伝子による置換
cat遺伝子を置換するため、実施例１（図３）にも記載した、Datsenko, K. A. とWanner, B. L.( Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 2000, 97, 6640-6645)により記載された、「Red-mediated integration」及び／又は「Red-driven integration」とも呼ばれる方法により、野生型pheA遺伝子を保持するDNA断片を、E. coli MG1655 ΔtyrR (pheA::cat tyrA-ssrA/pKD46の染色体に、cat遺伝子の代わりに組み込んだ。
【００８８】
野生型pheA遺伝子は、E. coli MG1655株の染色体DNAをテンプレートして用い、プライマーP4（配列番号１２）及びP6（配列番号１４）を用いるPCRにより得た。
【００８９】
プライマーP6は、終止コドンTAAを有するssrA遺伝子90〜119位に位置する領域に同一の領域と、pheA遺伝子の3'末端に位置する19-nt領域に相補的な領域とを有する。
【００９０】
PCRの条件は次の通りであった。95℃5分で変性； 95℃30秒、50℃30秒、72℃1分のプロファイルで30サイクル；最終ステップ：72℃5分。
【００９１】
増幅されたDNA断片をアガロースゲル電気泳動で精製し、"GenElute Spin Columns" ("Sigma", USA)を用いて抽出し、エタノールで沈殿させた。得られたDNA断片を、上記と同様に、エレクトロポレーション及びE. coli MG1655 ΔtyrR (pheA::cat tyrA-ssrA/pKD46染色体へのRed媒介組込み(Red-mediated integration)に使用した。得られたE. coli MG1655 ΔtyrR tyrA-ssrA/pKD46株を最少培地M9上で選択した。培地にL-フェニルアラニンが含まれないことにより、原栄養性であるPhe+のコロニーの選択ができた。
【００９２】
４．PCRによるpheA遺伝子再構成の確認
24時間生育させた後、コロニーを、アレル特異的プライマーP4（配列番号１２）及びP5（配列番号１３）を用いるPCRによりpheA遺伝子の存在に関して試験した。このために、新たに単離したコロニーを水(20μl)に懸濁し、得られた懸濁液の1μlをPCRに用いた。温度プロファイルは次の通りであった。95℃5分で初期DNA変性；（95℃30秒の変性、50℃30秒のアニーリング、72℃1分10秒の伸長）を30サイクル；72℃5分の最終伸長。
【００９３】
試験したPhe+コロニーのいくつかが、求める1827-bp DNA断片を含んでおり、これによりcat遺伝子の2373-bp天然領域がpheA遺伝子で置換されていることが確認された（図２参照）。得られた変異株をMG1655 ΔtyrR tyrA-ssrA/pKD46と命名した（図４）。
【００９４】
次に、pKD46プラスミドを除去するために、Ｃｍを含むL-寒天培地上、４２℃で２回継代し、得られたコロニーのアンピシリン感受性について試験した。
【００９５】
以上により、変異型tyrA遺伝子を有し、tyrR遺伝子を欠失した株が得られた。この株をMG1655ΔtyrRtyrA-ssrAと命名した。
【００９６】
［実施例２］L-フェニルアラニン生産に対するtyrA遺伝子のssrAタギングの効果
E. coli MG1655 ΔtyrR tyrA-ssrA株及びMG1655 ΔtyrR株のそれぞれを、栄養培地で18時間37℃で培養し、これらの培養物のそれぞれの0.3 mlを、20×200mmの試験管に入れた3
mlの下記の組成を有する発酵培地に接種し、ロータリーシェイカーにより72時間32℃で培養した。
【００９７】
培養後、媒地中のL-フェニルアラニン及びL-チロシンの蓄積量をTLCにより測定した。薄層シリカゲルプレート(10x15 cm)に、培養液のアリコート(1-2μl)をスポットし、展開溶媒(2-プロパノール : 酢酸エチル: アンモニア : 水 = 16 : 16 : 3 : 9)で展開し、ニンヒドリン試薬でL-フェニルアラニン及びL-チロシンを検出した。４試験管の発酵の結果を表１に示す。
【００９８】
培養培地の組成(g/l)は以下の通りであった。
グルコース 40.0
(NH4)2SO4 16.0
K2HPO4 1.0
MgSO4・7H2O 1.0
MnSO4・5H2O 0.01
FeSO4・7H2O 0.01
イーストエキストラト 2.0
CaCO3 30.0
MgSO4・7H2O 及び CaCO3 はそれぞれ別個に滅菌した。
【００９９】
表１から明らかなように、MG1655 ΔtyrR tyrA-ssrA株は、MG1655ΔtyrRと比べて、L-フェニルアランの蓄積量が高く、L-チロシンの量が少なかった。
【０１００】
［実施例３］L-ヒスチジン生産に対するpgi遺伝子のssrAタギングの効果
配列番号２又は配列番号１５のペプチドでタギングしたpgi遺伝子を有するL-ヒスチジン生産株を得た。これらの二つのペプチドは、末端アミノ酸残基の一つの置換（アラニン又はバリン）で相違する。これらの株は次のようにして得た。先ず、配列番号２又は配列番号１５のペプチドをコードする遺伝子の3'末端に付加的な塩基配列を含むpgi遺伝子の二つの改変体を、E.coli MG1655株の染色体DNAをテンプレートとし、プライマーpgi1 (配列番号１６)及びpgi-LAA (配列番号１７)又はpgiLVA (配列番号１８)をそれぞれ用いるPCRにより得た。プライマーpgi1は、pgi遺伝子の5'末端に相補的であり、その5'末端にSacI制限部位を含む。プライマーpgi-LVA及びpgi-LAAは、終止コドンを含まないpgi遺伝子の3'末端の領域、それぞれ配列番号２又は１５の短ペプチドをコードする領域、終止コドン、及び、その5'末端にXbaI制限部位を含む。次に、二つのPCR断片を別個にSacI及びXbaI制限酵素で処理し、同じ制限酵素で予め処理したpMW119プラスミドに連結した。得られたプラスミドを、それぞれ、pMW-pgi-ssrALAA及びpMWpgi-ssrALVAと命名した。
【０１０１】
次いで、野生型pgi遺伝子をL-ヒスチジン生産株80において欠失させた。
このために、cat遺伝子によりコードされるCmRマーカーを含むDNA断片を、プライマーP7（配列番号１９）及びP8（配列番号２０）と、テンプレートとしてpMW118-attL-Cm-attR
(WO 05/010175) (図２)とを用いるPCRにより得た。プライマーP7は、pgi遺伝子の5'末端に位置する36-nt領域に同一の領域と、pMW118-attL-Cm-attRの28-nt attR領域に相補的な領域とを有する。プライマーP8は、pgi遺伝子の3'末端に位置する36-nt領域に同一の領域と、pMW118-attL-Cm-attRの28-nt attL領域に相補的な領域とを有する。PCR及び得られたDNA断片のエレクトロポレーションは上記（実施例１のセクション１参照）と同様に行った。
【０１０２】
pgi遺伝子の欠失は、アレル特異的プライマーP9（配列番号２１）及びP10（配列番号２２）を用いるPCRにより確認した。このために、新たに単離したコロニーを水(20μl)に懸濁し、得られた懸濁液の1μlをPCRに用いた。温度プロファイルは次の通りであった。95℃5分で初期変性；（95℃30秒の変性、50℃30秒のアニーリング、72℃１分10秒の伸長）を30サイクル；72℃5分の最終伸長。
【０１０３】
試験したCmRコロニーのいくつかが、求める1709-bp DNA断片を含んでおり、これによりpgi遺伝子の1651-bp天然領域がcat遺伝子で置換されていることが確認された。得られた変異株を80 Δpgiと命名した。
【０１０４】
得られた80 Δpgi株を、上記と同様にして、プラスミドpMW-pgi-ssrALAA 及びpMWpgi-ssrALVAで形質転換した。得られた株をそえぞれ80Δpgi/pMW-pgi-ssrALAA 及び80Δpgi/pMWpgi-ssrALVAと命名した。
【０１０５】
ミニジャーバッチ発酵のため、L-寒天上で生育させた80、80Δpgi/pMW-pgi-ssrALAA 及び80Δpgi/pMWpgi-ssrALVAのそれぞれの一白金耳をL-ブロスに移し、回転撹拌(140 rpm)により30℃で、培養物の光学密度OD540が約2.0になるまで培養した。種培養の25mlを、250mlの発酵培地に加え、回転撹拌(1500 rpm)により29℃で培養した。バッチ発酵の時間は約35〜40時間であった。培養後、媒地中に蓄積したヒスチジンの量をろ紙クロマトグラフィーにより測定した。ろ紙を移動相(n-ブタノール : 酢酸: 水 = 4 : 1 : 1 (v/v))で展開した。ニンヒドリンのアセトン溶液(0.5%)を可視化試薬として用いた。結果を表２に示す。表２から明らかなように、80Δpgi/pMW-pgi-ssrALAA 及び80Δpgi/pMWpgi-ssrALVA株
は、80株と比べて、L-フェニルアランの蓄積量が高かった。
【０１０６】
発酵培地組成 (pH 6.0) (g/l):
グルコース 50.0
マメノウ 0.2 （TN換算）
(NH4)2SO4 8.0
KH2PO4 0.5
MgSO4 7H20 0.4
FeSO4 7H20 0.02
MnSO4 0.02
チアミン 0.001
ベタイン 2.0
L-プロリン 0.8
L-グルタミン酸 3.0
L-アスパラギン酸 1.0
アデノシン 0.2
【０１０７】
本発明を好ましい態様について詳細に説明したが、当業者にとっては、本発明の範囲から離れることなく、種々の改変をしたり、均等物を用いたりできることは明らかである。本明細書に引用した文献は、引用により本願の一部として含める。
【０１０８】
【表１】
【０１０９】
【表２】
【０１１０】
［配列の説明]
1: Escherichia coli由来ssrA遺伝子
2: tmRNAによりコードされるタンパク質分解誘導ぺプチドタグ
3: Escherichia coli由来tyrA遺伝子
4: tyrA遺伝子によりコードされるアミノ酸配列
5: Escherichia coli由来pheA遺伝子
6: pheA遺伝子によりコードされるアミノ酸配列
7: Escherichia coli由来pgi遺伝子
8: pgi遺伝子によりコードされるアミノ酸配列
9: プライマー P1
10: プライマー P2
11: プライマー P3
12: プライマー P4
13: プライマー P5
14: プライマー P6
15: tmRNAにコードされるタンパク質分解誘導ぺプチドタグ
16: プライマー pgi1
17: プライマー pgi-LAA
18: プライマー pgi-LVA
19: プライマー P7
20: プライマー P8
21: プライマー P9
22: プライマー P10
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】tyrA遺伝子伸長のスキームを示す。
【図２】pMW118-attL-Cm-attR.におけるプライマーP1及びP2の相対的位置を示す。
【図３】pheA遺伝子を欠失した染色体DNA断片の構築を示す。
【図４】pheA遺伝子でcat遺伝子座を置換するスキームを示す。tyrA-ssrA遺伝子座及びcat遺伝子を含む E.coli 染色体遺伝子座。得られた構築物の確認に用いたP4及びP5のサイトを黒矢印で示す。
【図５】Bacillus subtilis (BACSU)、Bacillus stearothermophilus (BACST)、Serratia marcescens (SERMA)、 Escherichia coli (ECOLI)、Pseudomonas flurescens (PSEFL)、Pseudomonas chlororaphis (PSECL)及び Pseudomonas putida (PSEUPU)由来のtmRNAがコードするタンパク質分解誘導ペプチドタグの一次配列のアライメントを示す。アライメントは、PIRマルチプルアライメントプログラム(http://pir.georgetown.edu)を用いて行った。同一アミノ酸はアスタリスク(*)で、類似アミノ酸はコロン(:)でマークした。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵によるＬ−アミノ酸の製造方法に関し、さらに詳しくは、この発酵に有用な遺伝子に関する。これらの遺伝子は、Ｌ−アミノ酸、特にＬ−フェニルアラニン及びＬ−ヒスチジンの生産の向上に有用である。
【背景技術】
【０００２】
従来、Ｌ−アミノ酸は、天然資源から得られる微生物又はそれらの突然変異体の株を利用した発酵方法により工業的に生産されている。通常、微生物はＬ−アミノ酸の生産性を高めるように改変される。
【０００３】
組換えＤＮＡによる微生物の形質転換など、Ｌ−アミノ酸の生産量を高める多くの方法が報告されている（例えば、特許文献１を参照）。生産量を高める他の方法は、アミノ酸生合成に関与する酵素の活性を増大させること及び／又は目的Ｌ−アミノ酸によるフィードバック阻害に対して目的酵素を脱感作させること（例えば、特許文献２又は特許文献３〜５を参照）、並びに、目的化合物の前駆体を他の経路に用いる遺伝子を欠損した菌株を作成すること、又は、目的化合物の分解に関与する遺伝子を欠損した菌株を作成することを含む。
【０００４】
通常には、これらの操作は、生育できない株、極めて低速度でのみ生育する株、又は、アミノ酸等の付加的栄養素を要求する株を生じる。例えば、ある遺伝子の発現を過剰にすることは、細胞増殖を有意に減少させ、結果として、細菌の目的化合物の生産能を低下させ得る。
【０００５】
上記の問題を避ける可能性のある方法としては、炭素、窒素もしくはリンのフラックス分布、又は、菌体からの目的物質の分泌に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現を最適化することである。
【０００６】
この目的は、アミノ酸又は核酸の生合成遺伝子のプロモーター配列に変異を導入すること（特許文献６）、種々の強さの合成プロモーターのライブラリーを得ること（非特許文献１）、人工プロモーターのライブラリーを作成すること（特許文献７）などによって多くは達成された。
【０００７】
ssrA RNAによりコードされるssrAペプチドタグでタンパク質にタグ付けすることにより、タンパク質分解においてタグ付タンパク質をマークすることが知られている(非特許文献２)。SsrA RNA (同義語: SsrA , tmRNA , 10Sa RNA , トランスファー-メッセンジャーRNA , SipB , B2621 )は、「トランス-トランスレーション」機構を用いてtRNAとmRNAの両方として働くことにより、停止コドンの無い「壊れた」mRNAの末端から停止リボソームを遊離させる機能を有する。ssrAは、また、適切なtRNAが存在しないことによる停止リボソームの遊離を媒介する(非特許文献３)。他の翻訳の問題もSsrA活性を導くことがある。さらに、SsrA RNAは、欠陥mRNAの分解を刺激する(非特許文献４)。
【０００８】
ssrA RNAは、RNase Pにより処理され、アラニル-tRNAシンテターゼによりチャージされるt-RNA様構造領域を含む(非特許文献５)。SsrA RNAは、また、メッセンジャーRNAとして働き、生成するタンパク質に付加されてこのタンパク質を分解の目的とする翻訳タグをコードする領域を有する(非特許文献６)。SsrA RNAの構造及び翻訳機構は詳しく検討されている(非特許文献７)。SsrA RNAは、より大きな前駆体RNAとして転写され、ついでプロセッシングされて成熟RNAを形成する。
【０００９】
ssrA は、Mycoplasma capricolum、Bacillus subtilis (非特許文献８)、Dichelobacter nodosus、Synechococcus sp. PCC6301及び PCC6803株、Thermus thermophilus、Salmonella enterica serovar Typhimurium由来のRNA、並びに、Caulobacter crescentus由来のツーピースRNAと同様である。tmRNA遺伝子は、細菌種の同定のためのプローブとして使用されている (非特許文献９)。
【００１０】
しかしながら、Ｌ−アミノ酸、例えば、Ｌ−フェニルアラニンやＬ−ヒスチジンの生産にssrAタギングを使用することを記載した報告はない。特に、Ｌ−アミノ酸生合成に影響する細菌酵素をコードする遺伝子の直ぐ下流に付加した、配列番号２のペプチド又はその変異体をコードするＤＮＡを含む腸内細菌科細菌を用いることについて依然の報告はない。
【特許文献１】米国特許第４，２７８，７６５号
【特許文献２】国際公開ＷＯ９５／１６０４２
【特許文献３】米国特許第４，３４６，１７０号
【特許文献４】米国特許第５，６６１，０１２号
【特許文献５】米国特許第６，０４０，１６０号
【特許文献６】EP1033407A1
【非特許文献１】Jensen P.R., and Hammer K., Appl. Environ. Microbiol., 1998, 64, No.1. 82-87 Biotechnol. Bioeng., 1998, 58, 2-3, 191-5
【特許文献７】WO03089605
【非特許文献２】Gottesmann S. and al, Genes&Dev.,12:1338-1347(1998)
【非特許文献３】Hayes C.S. and al, PNAS, 99(6):3440-3445(2002)
【非特許文献４】Yamamoto Y. et al, RNA, 9:408-418 (2003))。
【非特許文献５】Komine Y et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 (20):9223-7 (1994)
【非特許文献６】Tu G.-F.and al, J Biol Chem, 270(16):9322-9326 (1995)
【非特許文献７】Corvaisier S. et al, J Biol Chem, 278(17):14788-97(2003)
【非特許文献８】Muto A. and al, Genes Cells, 7(5):509-19 (2000)
【非特許文献９】Schonhuber W. and al, BMC Microbiology, 1(1):20 (2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、Ｌ−アミノ酸生産株の生産性を高めること、及び、これらの株を用いるＬ−アミノ酸の製造法を提供することである。これらの目的は、生合成経路において他のアミノ酸と共通する過程を有する目的アミノ酸の合成に関与する酵素のSsrAタギングにより、共通する生合成過程及び／又は前駆体を有するアミノ酸を犠牲にすることにより目的アミノ酸の生産を向上し得るという知見に基づき達成された。また、解糖の異なる経路（例えば、ペントースリン酸経路及びEntner-Duodoroff 経路）の間の炭素フラックスの分配に関与する酵素のSsrAタギングにより、解糖経路の一つにおいて生成した前駆体が共通するこれらのアミノ酸の生産を向上できることが見出された。いずれの場合も、改変細菌の原栄養性は維持されることが見出された。
【００１２】
この目的は、産物のタンパク質が共にssrA遺伝子の一部によりコードされるC末端の短ペプチドを有する新規な改変trpA遺伝子及び新規な改変pgi遺伝子を構築することにより達成された。この変異型TryA-ssrAを用いることにより、変異型tryA-ssrA遺伝子を本来のtryA遺伝子の代わりにＬ−フェニルアラニン生産株の細胞に導入したときにＬ−フェニルアラニン生産を向上させることができた。また、この変異型Pgi-ssrAを用いることにより、変異型pgi-ssrA遺伝子を本来のpgi遺伝子の代わりにＬ−ヒスチジン生産株の細胞に導入したときにＬ−ヒスチジン生産を向上させることができた。以上の知見に基づき本発明
は完成された。
【００１３】
本発明の目的の一つは、Ｌ−アミノ酸生合成に影響する細菌酵素をコードする遺伝子、及び、転写可能であり、配列番号２のペプチド又はその変異体をコードするＤＮＡ断片であって、前記遺伝子の３’末端に連結される前記断片を含む、腸内細菌科に属するＬ−アミノ酸生産細菌を提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、エシェリヒア属細菌である上記細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、Ｌ−フェニルアラニン生産菌である上記細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記酵素がコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドロゲナーゼである上記細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、Ｌ−ヒスチジン生産菌である上記細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記酵素がホスホグルコースイソメラーゼである上記細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、上記細菌を培地で培養し、該培地から該Ｌ−アミノ酸を単離することを含む、Ｌ−アミノ酸の製造方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記Ｌ−アミノ酸がＬ−フェニルアラニンである上記方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記Ｌ−アミノ酸がＬ−ヒスチジンである上記方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、上記細菌を培地で培養し、培地にＬ−フェニルアラニンを生成、蓄積させ、アスパラギン酸又はその誘導体と得られたＬ−フェニルアラニンとからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを合成することを含む、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルの製造方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、Ｌ−フェニルアラニンをエステル化してＬ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを生成し、Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを、Ｎ−アシル−Ｌ−アスパルトアンヒドリドであるアスパラギン酸誘導体と縮合させ、反応液からＮ−アシル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを分離し、Ｎ−アシル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを水素化してα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを生成することをさらに含む、上記方法を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
１．本発明の細菌
芳香族アミノ酸、分岐鎖アミノ酸などのアミノ酸の一部は、細胞による生合成において共通する前駆体を有することが知られている。そのようなアミノ酸を菌株により生産させる場合、その菌株を、目的アミノ酸と共通する前駆体を有する他のアミノ酸について栄養要求性にすることが有用である。これにより、目的アミノ酸の生合成経路から分岐する生合成に共通前駆体が向けられることを防ぐことができる。
【００１６】
目的アミノ酸の生産を確保する他の方法としては、共通前駆体を有するものとは反対に、共通前駆体からの他のアミノ酸の生成に関与する酵素にいわゆるリーキー(leaky)変異を生じさせることがある。この場合、細菌において他のＬ−アミノ酸の合成が抑制されるため、これらのＬ−アミノ酸を細菌に供給する必要がない。
【００１７】
酵素のSsrAタギングは、酵素が転写されたssrA-タグ付RNAがRnase Pにより分解され(Komine Y et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 (20):9223-7 (1994))、ssrAタグ付酵
素がClpXP及びClpAPプロテアーゼによりタンパク質分解されるため(Wah D.A. et al, Chem. Biol., 9(11):1237-45 (2002)、酵素活性の低下をもたらす。ssrAタギングによるこのような改変により、リーキー型表現型を示しながら、改変細菌の原栄養性の維持が可能になる。また、ssrAタギングにより、副産物の生合成に関与する１又は複数の酵素の活性を低下させることにより副産物のレベルを低下させることが可能になる。
【００１８】
本発明において「Ｌ−アミノ酸生産菌」とは、培地で培養したときに、培地中にＬ−アミノ酸を生産し且つ排出する能力のある細菌を意味する。Ｌ−アミノ酸生産能は、育種によって付与されるか又は高められてもよい。本明細書中で使用される「Ｌ−アミノ酸生産菌」という用語はまた、培地でエシェリヒア・コリＫ１２等の野生型株又は親株のエシェリヒア・コリよりも大量にＬ−アミノ酸を生産し且つ蓄積することのできる細菌を意味し、好ましくは細菌が培地中に０．５ｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは１．０ｇ／Ｌ以上の量の目的Ｌ−アミノ酸を蓄積させることができることを意味する。「Ｌ−アミノ酸」という用語には、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、及びＬ−バリンが含まれる。Ｌ−ヒスチジンが特に好ましい。また、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−チロシンがより好ましく、Ｌ−フェニルアラニンが特に好ましい。
【００１９】
腸内細菌科としては、エシェリヒア属、エンテロバクター属、エルビニア属、クレブシエラ属、パントエア属、プロビデンシア属、サルモネラ属、セラチア属、シゲラ属、モルガネラ属等に属する細菌が挙げられる。具体的には、ＮＣＢＩ(National Center for Biotechnology Information)データベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock)で使用される分類学に従って腸内細菌科に分類されるものを使用することができる。エシェリヒア属又はパントエア属に属する細菌が好ましい。
【００２０】
「エシェリヒア属細菌」という語句は、この細菌が、微生物学の分野の当業者に既知の分類に従ってエシェリヒア属に分類されることを意味する。本発明で使用される場合のエシェリヒア属に属する微生物の例としては、エシェリヒア・コリが挙げられるが、これに限定されない。
【００２１】
本発明で使用することができるエシェリヒア属に属する細菌は、特に限定されないが、例えば、Neidhardt, F.C.他(Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Table 1)により記載される細菌が本発明により包含される。
【００２２】
本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を有し、ssrA遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を、細菌酵素をコードする遺伝子の3'末端に付加することにより改変された腸内細菌科の株を包含する。ssrA遺伝子の一部は、配列番号２で表わされるペプチド又はその変異体をコードし、細菌酵素は、目的Ｌ−アミノ酸を共通の全期待を有するＬ−アミノ酸の生合成経路に関与する。さらに、本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を有し、ssrA遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片で形質転換され、そのＤＮＡ断片によりコードされたペプチド成分が発現する腸内細菌科の株も包含する。
【００２３】
ssrA遺伝子(別名: ECK2617, b2621, sipB)は、tmRNA (別名: SsrA, 10Sa RNA, トランスファー-メッセンジャーRNA, SipB, B2621)をコードする。ssrA遺伝子(GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990の配列におけるヌクレオチド2753615〜2753977)は、E. co
li K-12の染色体上のsmpB遺伝子とintA遺伝子との間に位置する。エシェリヒア・コリ由来のssrA遺伝子は、配列番号１に示す。tmRNAがコードするタンパク質分解誘導ペプチドタグの配列は配列番号２に示す。このペプチドは、配列番号１に示すssrA遺伝子の９０〜１１９位のヌクレオチドによりコードされる。また、他のssrA遺伝子も解明されている。Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Serratia marcescens, Escherichia
coli, Pseudomonas flurescens, Pseudomonas chlororaphis,及びPseudomonas putida由来のtmRNAがコードするタンパク質分解誘導ペプチドタグなどである。
【００２４】
共通する前駆体を有する二つのＬ−アミノ酸を同時に生産することのできる細菌を用いてもよい。本発明の目的は、二つのアミノ酸すなわちＬ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンを同時に生産するように予め改変した株を用いて達成された。このような株は、転写デュアルレギュレーターすなわちtryR遺伝子をRedドリブンレコンビネーション法により破壊することにより得ることができる。tyrR遺伝子の欠失は、鋳型として形質転換株の染色体DNAを用いるPCRにより確認できる。Ｌ−アミノ酸を生産できる細菌、好ましくはフェニルアラニンとチロシンとを同時に生産できる細菌を用いてもよい。E. coli MG1655 ΔtyrRがこのような株の例である。E. coli MG1655 ΔtyrRは、WO 05/010175に記載された標準的技術により、染色体のtyrR遺伝子を、Cmマーカーを含むDNAカセットで置換した後、そのマーカーを切り出すことにより得た。また、pgi遺伝子がssrAタギングにより改変されペントースリン酸経路へのD-グルコース-6-リン酸のフラックスが増加し、Ｌ−ヒスチジンの生産性が向上したＬ−ヒスチジン生産株も包含される。
【００２５】
「転写可能であり、配列番号２のペプチド又はその変異体をコードするＤＮＡ断片であって、前記遺伝子の３’末端に連結される前記断片」という語句は、細菌酵素をコードする遺伝子が、野生型株の遺伝子などの非改変遺伝子と比べて、その3'末端に付加的なヌクレオチド残基を有するように改変されていることを意味する。細菌酵素をコードする遺伝子の3'末端におけるこのＤＮＡ断片（配列番号２又はその変異体をコードする）の存在によりタグ付mRNA種が形成され、対応する翻訳タンパク質が、タグ付された、すなわち、Ｃ末端に連結した付加的ペプチドを有する。細菌酵素は、遺伝的組換え、Ｃ末端延長、Ｃ末端融合などの方法により改変されてもよい。改変酵素タンパク質の長さは、例えば、特異的抗体を用いるウェスタンブロット、タンパク質配列決定などにより測定できる。「配列番号２のペプチド又はその変異体を、タンパク質のカルボキシル末端に連結する」という語句は、また、翻訳された改変タンパク質が細菌において改変タンパク質が調節された速度で分解するように発現することを意味する(McGinness K.E. and al, Molecular Cell, 22: 701-707 (2006))。
【００２６】
「転写可能であるＤＮＡ断片」という語句は、ＤＮＡ断片が細菌酵素をコードする遺伝子の3'末端に、細菌酵素をコードする遺伝子の終止コドンが除去され、必要なＤＮＡ断片がその遺伝子の最終コドンの直後に導入されるように連結されることを意味する。このようなＤＮＡ構築物は、一つの転写単位として転写され、所望のＤＮＡ断片を目的（細菌酵素）遺伝子のmRNAにタグ付けする。この結果、ssrAタグ付けタンパク質が発現することになる。
【００２７】
本発明で使用される「その変異体」という語句は、配列の変化を有するタンパク質であって、この配列の変化がアミノ酸の欠失、挿入、付加、又は置換のいずれであっても、有用なレベル、例えば、タグ付タンパク質の活性を減少させ、結果としてＬ−アミノ酸の生産を向上させるのに有用なレベルで、所望の活性を維持しているペプチドを意味する。変異体ペプチドにおける変化の数は、ペプチドの三次元構造におけるアミノ酸残基の位置又はタイプによって異なる。変化の数は、配列番号２に示すペプチドでは１〜４、好ましくは１〜２であり得る。ペプチドの機能に重要ではないペプチドの領域でこれらの変異体の変化が起こり得る。これは、幾つかのアミノ酸が互いに高い相同性を有するため、活性が
このような変化による影響を受けないからである。したがって、ssrAタグ付タンパク質がプロテアーゼにより認識され、分解される限り、変異体ペプチドは、配列番号２で示される全アミノ酸配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するものであり得る。既知の方法、例えば、３つのパラメーター：スコア、同一性、及び類似性を算出する、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴ２．０を使用して、２つのアミノ酸配列間の相同性を計算することができる。
【００２８】
１つ又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加は、活性が維持されるような保存的変異であるべきである。代表的な保存的変異は保存的置換である。保存的置換の例としては、ＡｌａのＳｅｒ又はＴｈｒへの置換、ＡｒｇのＧｌｎ、Ｈｉｓ、又はＬｙｓへの置換、ＡｓｎのＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、又はＡｓｐへの置換、ＡｓｐのＡｓｎ、Ｇｌｕ、又はＧｌｎへの置換、ＣｙｓのＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＧｌｎのＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、又はＡｒｇへの置換、ＧｌｕのＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、又はＡｓｐへの置換、ＧｌｙのＰｒｏへの置換、ＨｉｓのＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、又はＴｙｒへの置換、ＩｌｅのＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、又はＰｈｅへの置換、ＬｅｕのＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、又はＰｈｅへの置換、ＬｙｓのＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、又はＡｒｇへの置換、ＭｅｔのＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、又はＰｈｅへの置換、ＰｈｅのＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、又はＬｅｕへの置換、ＳｅｒのＴｈｒ又はＡｌａへの置換、ＴｈｒのＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＴｒｐのＰｈｅ又はＴｙｒへの置換、ＴｙｒのＨｉｓ、Ｐｈｅ、又はＴｒｐへの置換、及びＶａｌのＭｅｔ、Ｉｌｅ、又はＬｅｕへの置換が挙げられる。
【００２９】
Bacillus subtilis (BACSU), Bacillus stearothermophilus (BACST), Serratia marcescens (SERMA), Escherichia coli (ECOLI), Pseudomonas flurescens (PSEFL), Pseudomonas chlororaphis (PSECL), Pseudomonas putida (PSEUPU)由来のtmRNAがコードするタンパク質分解誘導ペプチドタグの一次配列を比較データにより、そのC末端におけるアミノ酸配列"YALAA"の高い相同性が示された（図５）。ペプチド活性を損なうことなく類似アミノ酸残基（コロンで示す）を類似アミノ酸で置換することができる。しかし、他の非保存的アミノ酸残基の改変は、tmRNAがコードするタンパク質分解誘導ペプチドタグの活性を変化をもたらさないかもしれない。McGinness K.E. et al.(Molecular Cell, 22:701-707 (2006))によるペプチドタグ付アミノ酸配列も本発明のペプチド変異体として考えられる。
【００３０】
タグペプチドと実質的に同じペプチドをコードするＤＮＡは、例えば、指定部位での１つ又は複数のアミノ酸残基が、欠失、置換、挿入又は付加を包含するように、部位特異的変異誘発法を用いて、タグペプチド成分をコードするDNAのヌクレオチド配列（配列番号１）を改変することにより得ることができる。上記のような改変ＤＮＡは、従来から知られている変異処理により得ることができる。このような処理としては、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡのヒドロキシルアミン処理、或いはＵＶ照射又はＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン若しくは亜硝酸等の試薬による上記ＤＮＡを含有する細菌の処理が挙げられる。タグペプチドと実質的に同じペプチドをコードするＤＮＡは、適切な細胞において上記のような変異を有するＤＮＡを発現させ、発現生成物の活性を試験することにより得ることができる。タグペプチドと実質的に同じタンパク質をコードするＤＮＡはまた、例えば、ストリンジェントな条件下で配列番号１に示される塩基配列を例えば含む塩基配列を有するプローブとハイブリダイズし、タグペプチドの活性を有するペプチドをコードするＤＮＡを単離することにより得ることができる。本明細書中で言及される「ストリンジェントな条件」は、いわゆる特異的ハイブリッドが形成され、且つ非特異的ハイブリッドが形成されない条件である。例えば、ストリンジェントな条件は、高い相同性を有するＤＮＡ、例えば、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは
７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡは互いにハイブリダイズすることが可能であるが、上記未満の相同性を有するＤＮＡは互いにハイブリダイズすることができない条件により例示され得る。あるいは、サザンハイブリダイゼーションでの通常の洗浄条件に相当する塩濃度、すなわち、６０℃で１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで、ＤＮＡがハイブリダイズする条件により、ストリンジェントな条件が例示され得る。洗浄時間は、ブロット法に使用される膜のタイプによって異なり、これは一般的には製造業者によって推奨されるものである。例えば、ストリンジェントな条件下でのＨｙｂｏｎｄ（登録商標）Ｎ＋ナイロン膜(Amersham)の推奨される洗浄時間は１５分間である。好ましくは、洗浄は２、３回行われる。
【００３１】
配列番号１の塩基配列の部分配列をプローブとして使用することもできる。プローブは、配列番号１の塩基配列に基づいたプライマー、及び鋳型として配列番号１の塩基配列を含有するＤＮＡ断片を使用するＰＣＲにより調製され得る。
【００３２】
上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加は、例えば細菌の種又は属の多様性に起因して自然に存在し、且つタグペプチド成分を含む変異も包含する（突然変異体又は変異体）。
【００３３】
配列番号２に示すペプチド又はその変異体をコードするＤＮＡ断片を3'末端に有する細菌遺伝子の発現は、ペプチドをコードするＤＮＡで細菌を形質転換することにより達成できる。より詳しくは、ＤＮＡ断片をタンパク質をコードする遺伝子の下流の細菌染色体にコードフレームを乱さないように導入し、好ましくは、本来の染色体遺伝子を、タグ付タンパク質をコードする変異遺伝子により通常の方法で置換することにより達成できる。ＤＮＡにより細菌の形質転換により、本発明の延長タンパク質をコードする染色体変異遺伝子が形成される。形質転換の方法には、これまでに報告された任意の方法が含まれる。
【００３４】
例えば、遺伝子組換えにより変異遺伝子を含むＤＮＡを導入するのに以下の方法を用いてもよい。変異遺伝子を調製し、細菌を変異遺伝子を含むＤＮＡ断片で形質転換する。次いで、染色体上の本来の遺伝子を相同組換えにより変異遺伝子で置換し、得られる株を選択する。相同組換えによりこのような遺伝子置換は、線状ＤＮＡを用いて、「Ｒｅｄ駆動性組込み(Red-driven integration)」として知られる方法(Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 12, p 6640-6645 (2000))や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法(U.S. Patent 6,303,383又はJP 05-007491A)によって行うことができる。細胞のＤＮＡに対する透過性を増大するために、塩化カルシウムで受容細胞を処理する方法が、エシェリヒア・コリＫ−１２に関して報告されており(Mandel,
M.及びHiga, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970))、この方法が使用され得る。
【００３５】
プラスミドＤＮＡの調製方法としては、ＤＮＡの分解及び連結、形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択等、又は当業者に既知の他の方法が挙げられるがこれらに限定されない。これらの方法は、例えばSambrook, J., Fritsch, E.F.,及び Maniatis, T.著"Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition" Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載されている。
【００３６】
本発明において、「Ｌ−アミノ酸生合成に影響する細菌酵素」という語句は、望まない産物、例えば、目的Ｌ−アミノ酸と共通の前駆体を有する産物の生合成経路に関与する酵素を意味する。「望まない産物の生合成経路に関与する細菌酵素」という語句は、目的Ｌ−アミノ酸と共通の前駆体が望まない産物に変換される反応を触媒する酵素を意味する。これは、酵素が、望まない産物の生産をもたらす生合成経路の分岐の方へ反応を向けることにより生じる。「Ｌ−アミノ酸生合成に影響する細菌酵素」という語句は、また、目的
Ｌ−アミノ酸の副生物の生合成経路に関与する酵素を意味する。このような副生物の存在により、精製における有意な技術的な問題が生じ、Ｌ−アミノ酸生産に負の影響を与えることがある。
【００３７】
Ｌ−アミノ酸生合成に影響する細菌酵素をコードする遺伝子は、本発明の目的遺伝子である。このような遺伝子は、これらに限定されるものではないが、コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードするtryA遺伝子、ホスホグルコースイソメラーゼをコードするpgi遺伝子、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードするilvE遺伝子、スレオニンデヒドラターゼをコードするilvA及びtdcB遺伝子、Ｌ−スレオニンデアミナーゼをコードするsdaA及びsdaB遺伝子、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼをコードするargA遺伝子、アルギニノスクシネートシンターゼをコードするargG遺伝子、γ−グルタミルキナーゼをコードするproB遺伝子、ホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子、ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子などである。一般に、目的Ｌ−アミノ酸の経路から誘導される代謝物の生産を引きおこす、及び／又は、副生物の形成に関与する遺伝子はいずれも本発明の目的の遺伝子である。
【００３８】
コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（同義語: B2600, TyrA）は、コリスミ酸とプレフェン酸との間の可逆的変換、及び、プレフェン酸と、チロシンの生合成経路の中間体化合物であるp-ヒドロキシフェニルピルビン酸との間の可逆的変換を触媒する。コリスミ酸の変換は、チロシン及びフェニルアラニンの両方の生合成における第１の段階である。ssrAタギングによるTyrAタンパク質の改変は、L-チロシン生合成経路へのプレフェン酸のフラックスの低減、及び、L-フェニルアラニンの生産の増強に有用であり得る。コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドロゲナーゼの活性は、2.5 mMコリスミ酸の存在下でのストップトタイムアッセイを用いて、又は、0.8%アガロースで調製したプレートにおける酵素抗体複合体の免疫拡散分析(Rood J.I., Perrot B. et al., Eur J Biochem.; 124, 513-519 (1982))により測定できる。Escherichia coli由来のコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする野生型tyrA遺伝子（同義語: ECK2597, b2600）は知られている。tyrA遺伝子は、E. coli K-12株の染色体上でpheA遺伝子とaroF遺伝子との間に位置する(GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990の配列におけるヌクレオチド2736970〜2738091に相補的なヌクレオチド)。Escherichia coli由来のtyrA遺伝子は、配列番号３により示され、tyrA遺伝子によりコードされるアミノ酸配列は配列番号４により示される。
【００３９】
フェニルアラニンの生合成経路において、プレフェン酸とフェニルピルビン酸との間の可逆的変換は、E. coliではpheA遺伝子（同義語：ECK2596, b2599)）によりそのサブユニットがコードされるコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（同義語：B2599, PheA）により触媒される。pheA遺伝子は、E. coli K-12株の染色体上でpheA遺伝子リーダーペプチドとtyrA遺伝子との間に位置する(GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990の配列におけるヌクレオチド2735767〜2736927)。Escherichia coli由来のpheA遺伝子は、配列番号５により示され、pheA遺伝子によりコードされるアミノ酸配列は配列番号６により示される。ssrAタギングによるTyrA及びPheAタンパク質の同時の改変は、L-チロシン及びL-チロシン生合成経路へのコリスミ酸のフラックスを低減し、L-フェニルアラニンの生産を増強するのに有用である。
【００４０】
ホスホグルコースイソメラーゼ（同義語：B4025, Pgi, グルコース-6-リン酸イソメラーゼ, D-グルコース-6-リン酸-ケトール-イソメラーゼ）は、糖新生及び解糖の経路におけるβ-D-グルコース-6-リン酸とD-フルクトース-6-リン酸との間の可逆的変換を触媒する。ホスホグルコースイソメラーゼの活性の低減は、ヒスチジン前駆代謝物である5-ホスホリボシル1-ピロリン酸が生成するペントースリン酸経路への炭素フラックスの再分配を導く。ホスホグルコースイソメラーゼの活性は、例えば、G6Pデヒドロゲナーゼ(Winkler
H.H., J Bacteriol.,101, 2:470-475 (1970))を用いる共役アッセイによるFriedberg I. (J Bacteriol., 112,3:1201-1205 (1972))に記載の方法により検出できる。Escherichia
coli 由来のグルコース-6-リン酸イソメラーゼをコードする野生型pgi遺伝子（同義語：ECK4017, b4025）は知られている。pgi遺伝子は、E. coli K-12株の染色体上でlysC遺伝子とygbE遺伝子との間に位置する(GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990の配列におけるヌクレオチド4,231,781〜4,233,430)。Escherichia coli由来のpgi遺伝子は、配列番号７により示され、pgi遺伝子によりコードされるアミノ酸配列は配列番号８により示される。
【００４１】
分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（同義語：B3770, IlvE）は、α-ケトグルタル酸及び三種の脂肪族分岐鎖アミノ酸の一つをそれぞれ生成する一連のアミノ基転移反応を触媒する。ssrAタギングによるIlvEタンパク質の改変は、L-バリン生合成経路への2-ケトイソバレリン酸のフラックスを低減し、これにより副生物としてのL-イソロイシンの量の低減ももたらし、L-ロイシンの生産を増強するのに有用であり得る。分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼの活性は、例えば、Lee-Peng FC et al (J. Bacteriol., 139(2); 339-45 (1979))に記載の方法により測定できる。Escherichia coli 由来の分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする野生型ilvE遺伝子（同義語：ECK3762, b3770, スレオニンデアミナーゼ, L-スレオニンヒドロリアーゼ）は知られている。ilvE遺伝子は、E. coli K-12株の染色体上でilvM遺伝子とilvD遺伝子との間に位置する(GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990の配列におけるヌクレオチド3,950,507〜3,951,436)。
【００４２】
スレオニンデヒドラターゼ（同義語：B3772, Ile, IlvA）は、L-スレオニンの脱アミノ化を触媒する。ssrAタギングによるIlvAタンパク質の改変は、L-スレオニンの分解を防ぎ、L-イソロイシン生合成経路へのL-スレオニンのフラックスを低減し、また、L-アルギニンの生産を増強するのに有用であり得る。スレオニンデヒドラターゼの活性は、例えば、Eisenstein, E. (J. Biol. Chem., 266(9); 5801-7 (1991))に記載の方法により測定できる。Escherichia coli 由来のスレオニンデヒドラターゼをコードする野生型ilvA遺伝子（同義語：ECK3764, b3772, ile）は知られている。ilvA遺伝子は、E. coli K-12株の染色体上でilvD遺伝子とilvY遺伝子との間に位置する(GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990の配列におけるヌクレオチド3,953,354〜3,954,898)。
【００４３】
スレオニンデヒドラターゼ（同義語：B3117, Tdc, TdcB, スレオニンデアミナーゼ, L-セリンデヒドラターゼ, セリンデアミナーゼ, L-スレオニンヒドロリアーゼ）は、L-スレオニンの脱アミノ化を触媒する。ssrAタギングによるTdcBタンパク質の改変は、L-スレオニンの分解を防ぎ、L-イソロイシン生合成経路へのL-スレオニンのフラックスを低減するのに有用であり得る。Escherichia coli 由来のスレオニンデヒドラターゼをコードする野生型tdcB遺伝子（同義語：ECK3106, b3117, tdc）は知られている。tdcB遺伝子は、E. coli K-12株の染色体上でtdcC遺伝子とtdcA遺伝子との間に位置する(GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990の配列におけるヌクレオチド3,263,061〜3,264,050に相補的なヌクレオチド)。
【００４４】
スレオニンデアミナーゼSdaA（同義語：B1814, SdaA, SDH1, L-SD, L-スレオニンデアミナーゼI, L-セリンデヒドラターゼ1, SDH-1, L-SD1, L-ヒドロキシアミノ酸デヒドラターゼ1, L-セリンデアミナーゼ1, L-セリンヒドロリアーゼ1）及びSdaB（同義語：B2797, SdaB, L-スレオニンデアミナーゼII, L-セリンデアミナーゼ2, L-セリンデヒドラターゼ2, SDH-2, L-SD2, L-セリンヒドロリアーゼ2）は、L-スレオニンの脱アミノ化を触媒する。ssrAタギングによるスレオニンデアミナーゼタンパク質の改変は、L-スレオニンの分解を防ぎ、L-イソロイシン生合成経路へのL-スレオニンのフラックスを低減するのに有用であり得る。Escherichia coli 由来のスレオニンデヒドラターゼをコードする野生型sdaA
遺伝子（同義語：ECK1812, b1814）及びadaB遺伝子（同義語：ECK2792, b2797）は知られている。sdaA遺伝子は、E. coli K-12株の染色体上でyeaB遺伝子とyoaD遺伝子との間に位置する(GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990の配列におけるヌクレオチド1,894,956〜1,896,320)。sdaB遺伝子は、E. coli K-12株の染色体上でsdaC遺伝子とxni遺伝子との間に位置する(GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990の配列におけるヌクレオチド2,927,598〜2,928,965)。
【００４５】
N-アセチルグルタミン酸シンターゼ（同義語：B2818, ArgA, NAGS, アセチル-CoA:L-グルタミン酸 N-アセチルトランスフェラーゼ, アミノ酸-N-アセチルトランスフェラーゼ）は、L-グルタミン酸とアセチル-CoAからのN-アセチルグルタミン酸の合成を触媒する。ssrAタギングによるArgAタンパク質の改変は、L-プロリン生産のためのグルタミン蓄積に有用であり得る。N-アセチルグルタミン酸シンターゼの活性は、例えば、Marvil, D.K. and
Leisinger, T. (J. Biol. Chem., 252(10); 3295-303 (1977))に記載の方法により測定できる。Escherichia coli 由来のスレオニンデヒドラターゼをコードする野生型argA遺伝子（同義語：ECK2814, Arg2, Arg1, b2818）は知られている。argA遺伝子は、E. coli K-12株の染色体上でamiC遺伝子とrecD遺伝子との間に位置する(GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990の配列におけるヌクレオチド2,947,264〜2,948,595)。
【００４６】
アルギノコハク酸シンターゼ（同義語：B3172, ArgG, アルギノコハク酸シンテターゼ,
シトルリン-アスパラギン酸リガーゼ, L-シトルリン:L-アスパラギン酸リガーゼ）は、アルギノコハク酸、L-アスパラギン酸及びシトルリンの合成を触媒する。ssrAタギングによるArgGタンパク質の改変は、シトルリン生産に有用であり得る。Escherichia coli 由来のアルギノコハク酸シンターゼをコードする野生型argG遺伝子（同義語：ECK3161, b3172）は知られている。argG遺伝子は、E. coli K-12株の染色体上でargR遺伝子とyhbX遺伝子との間に位置する(GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990の配列におけるヌクレオチド3,316,659〜3,318,002)。
【００４７】
γ-グルタミルキナーゼ（同義語：B0242, ProB, グルタミン酸 5-キナーゼ, GK, ATP:L-グルタミン酸 5-ホスホトランスフェラーゼ, G5K）は、プロリン合成の最初の反応であるグルタミン酸のリン酸化の反応を触媒する。ssrAタギングによるProBタンパク質の改変は、L-アルギニン生産のためのグルタミン蓄積に有用であり得る。γ-グルタミルキナーゼの活性は、例えば、Smith, C.J. et al, (J. Bacteriol., 157(2); 545-51 (1984))に記載の方法により測定できる。Escherichia coli 由来のγ-グルタミルキナーゼをコードする野生型proB遺伝子（同義語：ECK0243, pro(2), b0242, pro2）は知られている。proB遺伝子は、E. coli K-12株の染色体上でphoE遺伝子とproA遺伝子との間に位置する(GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990の配列におけるヌクレオチド259,612〜260,715)。
【００４８】
ホモセリンキナーゼ（同義語：B0003, ThrB, ATP:L-ホモセリン O-ホスホトランスフェラーゼ）は、ホモセリンのリン酸化の反応を触媒する。ssrAタギングによるThrBタンパク質の改変は、L-メチオニン生産に有用であり得る。ホモセリンキナーゼの活性は、例えば、Shames, S.L. and Wedler, F.C. (Arch. Biochem. Biophys., 235(2); 359-70 (1984))に記載の方法により測定できる。Escherichia coli 由来のホモセリンキナーゼをコードする野生型thrB遺伝子（同義語：ECK0003, b0003）は知られている。thrB遺伝子は、E. coli K-12株の染色体上でthrA遺伝子とthrC遺伝子との間に位置する(GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990の配列におけるヌクレオチド2,801〜3,733)。
【００４９】
ホモセリンデヒドロゲナーゼは、ホモセリンからのL-アスパラギン酸セミアルデヒドの生成を触媒する。Escherichia coli では、ホモセリンでヒドロゲナーゼは、thrA遺伝子によりコードされるアスパラギン酸キナーゼ／ホモセリンでヒドロゲナーゼタンパク質の
一部である。しかし、Corynebacteriaなどの他の微生物では、ホモセリンでヒドロゲナーゼは、独立した酵素である。ssrAタギングによるホモセリンでヒドロゲナーゼの改変は、L-リジン生産に有用であり得る。
【００５０】
ssrA, tyrA, pheA, pgi, ilvE, ilvA, tdcB, sdaA, sdaB, argA, argG, proB, thrB及び他の目的遺伝子は、遺伝子の既知の塩基配列に基づいて調製されたプライマーを用いるPCR (polymerase chain reaction; White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)参照) によって得ることができる。他の微生物に由来するタグペプチドをコードする遺伝子も同様に得ることができる。
【００５１】
転写可能であり、配列番号２のペプチド又はその変異体をコードするＤＮＡ断片を、コリスミ酸／プレフェン酸デヒドロゲナーゼ及びホスホグルコースイソメラーゼをコードする遺伝子の３’末端に連結する上記の技術及び教示は、他の目的遺伝子から転写される他のタンパク質を活性を改変するために同様に適用することができる。
【００５２】
本発明の細菌は、上記のDNAを、L-アミノ酸生産能を元来有する細菌に導入することによって得ることができる。あるいは、本発明の細菌は、上記のDNAを既に含む細菌に、L-アミノ酸生産能を付与することによって得ることができる。
【００５３】
L-アミノ酸生産菌
芳香族又は非芳香族L-アミノ酸を生産できる細菌を本発明で用いることができる。
【００５４】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌
本発明のＬ−フェニルアラニン生産菌の親株の例としては、E.coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)、変異型pheA34遺伝子を保持するE.coli HW1089 (ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E.coli MWEC101-b (KR8903681)、E.coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるがこれらに限定されない。また、親株として、E. coli K-12
[W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びAJ 12604と命名されたE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424 B1)。さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するL-フェニルアラニン産生菌も使用できる(米国出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。
【００５５】
Ｌ−ヒスチジン生産菌
本発明のＬ−ヒスチジン生産菌の親株の例としては、E. coli 24株 (VKPM B-5945, RU2003677)、E. coli 80株 (VKPM B-7270, RU2119536)、E. coli NRRL B-12116 − B12121 (米国特許第4,388,405号)、E. coli H-9342 (FERM BP-6675)及びH-9343 (FERM BP-6676) (米国特許第6,344,347号)、E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087)、E. coli AI80/pFM201(米国特許第6,258,554号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５６】
本発明のL-ヒスチジン生産菌の親株の例としては、L-ヒスチジン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。L-ヒスチジン生合成系酵素をコードする遺伝子の例としては、ATPホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)、ホスホリボシルAMPサイクロヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、ホスホリボシル-ATPピロホスホヒドロラーゼ遺伝子(hisIE)、ホスホリボシルフォルミミノ-5-アミノイミダゾールカルボキサミドリボタイドイソメラーゼ遺伝子(hisA)、アミドトランスフェラーゼ遺伝子(hisH)、ヒスチジノールホスフェートアミノトランスフェラーゼ遺伝子(hisC)、ヒスチジノールフ
ォスファターゼ遺伝子(hisB)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子(hisD)などが挙げられる。
【００５７】
hisG及びhisBHAFIにコードされるL-ヒスチジン生合成系酵素はL-ヒスチジンにより阻害されることが知られており、従って、L-ヒスチジン生産能は、ATPホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)にフィードバック阻害への耐性を付与する変異を導入することにより効率的に増大させることができる(ロシア特許第2003677号及び第2119536号)。
【００５８】
L-ヒスチジン産生能を有する株の具体例としては、L-ヒスチジン生合成系酵素をコードするDNAを保持するベクターを導入したE. coli FERM-P 5038及び5048 (JP 56-005099 A)、アミノ酸輸送の遺伝子であるrhtを導入したE.coli株(EP1016710A)、スルファグアニディン、DL-1,2,4-トリアゾール-3-アラニン及びストレプトマイシンに対する耐性を付与したE. coli 80株(VKPM B-7270, ロシア特許第2119536号)などが挙げられる。
【００５９】
Ｌ−トリプトファン生産菌
本発明のＬ−トリプトファン生産菌の親株の例としては、変異trpS遺伝子によりコードされるトリプトファニル-tRNAシンテターゼが欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、セリンによるフィードバック阻害を受けないホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニル酸シンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,180,373号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、ホスホエノールピルビン酸産生能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるがこれらに限定されない。さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するL-トリプトファン産生菌も使用できる(米国出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。
【００６０】
本発明のL-トリプトファン産生菌の親株の例としては、アンスラニレートシンターゼ、ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ、及び、トリプトファンシンターゼから選ばれる酵素の活性の一種以上が増大した株も挙げられる。アンスラニレートシンターゼ及びホスホグリセレートデヒドロゲナーゼは共にL-トリプトファン及びL-セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。このような変異を有する株の具体例としては、脱感作型アンスラニレートシンターゼを保持するE. coli SV164、及び、E. coli SV164に、フィードバック阻害が解除されたホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異serA遺伝子を含むプラスミドpGH5 (WO 94/08031)を導入することにより得られた形質転換株が挙げられる。
【００６１】
L-トリプトファン生産菌の親株の例としては、脱感作型アンスラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株(JP 57-71397 A, JP 62-244382 A, 米国特許第4,371,614号)も挙げられる。さらに、L-トリプトファン生産能を、トリプトファンオペロン(trpBA)中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝子の発現を増大させることにより付与してもよい。トリプトファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpBによりコードされるα及びβサブユニットからなる。さらに、L-トリプトファン生産能を、イソクエン酸リアーゼ-リンゴ酸シンターゼオペロンの発現を増大させることにより改良してもよい(WO2005/103275)。
【００６２】
Ｌ−バリン生産菌
本発明のＬ−バリン生産菌の親株の例としては、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変された株(米国特許第5,998,178号)が挙げられるがこれらに限定されない。アテニ
ュエーションに必要なilvGMEDAオペロンの領域を除去し、生産されるL-バリンによりオペロンの発現が減衰しないようにすることが好ましい。さらに、オペロンのilvA遺伝子は破壊され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少することが好ましい。
【００６３】
L-バリン産生菌の親株の例としては、アミノアシルt-RNAシンテターゼの変異を有する変異株(米国特許第5,658,766号)も挙げられる。例えば、イソロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS 遺伝子に変異を有するE. coli VL1970が使用できる。E. coli VL1970は、1988年6月24日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (Russia, 117545 Moscow, 1st Dorozhny Proezd, 1)に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。
【００６４】
さらに、生育にリポ酸を要求する、及び／または、H+-ATPaseを欠失している変異株(WO96/06926)を親株として用いることができる。
【００６５】
Ｌ−イソロイシン生産菌
本発明のＬ−イソロイシン生産菌の親株の例としては、６−ジメチルアミノプリンに耐性を有する変異株(JP 5-304969 A)、チアイソロイシン、イソロイシンヒドロキシメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、さらにDL-エチオニン及び／またはアルギニンヒドロキシメートに耐性を有する変異株(JP 5-130882 A).が挙げられるがこれらに限定されない。さらに、スレオニンデアミナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼなどのL-イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(JP 2-458 A, FR 0356739, 及び米国特許第5,998,178号)。
【００６６】
Ｌ−ロイシン生産菌
本発明のＬ−ロイシン生産菌の親株の例としては、ロイシン耐性のE. coil株 (例えば、57株 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号)またはβ−２−チエニルアラニン、３−ヒドロキシロイシン、４−アザロイシン、5,5,5-トリフルオロロイシンなどのロイシンアナログ耐性のE.coli株(JP 62-34397 B及びJP 8-70879 A)、WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法で得られたE. coli株、E. coli H-9068 (JP 8-70879 A)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６７】
本発明の細菌は、L-ロイシン生合成に関与する遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、L-ロイシンによるフィードバック阻害を受けないイソプロピルリンゴ酸シンターゼをコードする変異leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)に代表されるleuABCDオペロンの遺伝子が挙げられる。さらに、本発明の細菌は、細菌の細胞からL-アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、b2682遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP 1239041 A2)が挙げられる。
【００６８】
Ｌ−アルギニン生産菌
本発明のＬ−アルギニン生産菌の親株の例としては、E. coli 237株 (VKPM B-7925) (米国出願公開2002/058315 A1)、及び、変異N-アセチルグルタミン酸シンターゼを保持するその誘導体株(ロシア特許出願第2001112869号)、E. coli 382株 (VKPM B-7926) (EP1170358A1)、N-アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードするargA遺伝子が導入されたアルギニン産生株(EP1170361A1)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６９】
L-アルギニン産生菌の親株の例としては、L-アルギニン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。L-アルギニン生合成系酵素をコードする
遺伝子の例としては、N-アセチルグルタミルホスフェートレダクターゼ遺伝子(argC)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(argJ)、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ遺伝子(argB)、アセチルオルニチントランスアミナーゼ遺伝子(argD)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子(argF)、アルギノコハク酸シンテターゼ遺伝子(argG)、アルギノコハク酸リアーゼ遺伝子(argH)、カルバモイルリン酸シンターゼ遺伝子（carAB）が挙げられる。
【００７０】
Ｌ−シトルリン生産菌
本発明のＬ−シトルリン生産菌の親株の例としては、フィードバック耐性変異カルバモイルリン酸シンセターゼを保持するエシェリヒア属に属する株 (米国特許第6,991,924号)が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７１】
＜２＞本発明の製造法
本発明の製造法は、本発明の微生物を培地中で培養し、該培養物中にＬ−アミノ酸を生産蓄積させ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取することを含むＬ−アミノ酸の製造法である。
【００７２】
本発明において、培地等からのＬ−アミノ酸の培養、回収、及び精製は、Ｌ−アミノ酸を微生物によって製造する従来の発酵方法に従って行うことができる。
【００７３】
炭素源、窒素源、ミネラル、および必要に応じて微生物が生育のために必要とする適量の栄養素が含まれていれば、培地は合成培地又は天然培地のいずれであってもよい。炭素源としては、グルコース、スクロース等の炭水化物、並びに様々な有機酸が挙げられる。選択された微生物の資化の態様に応じて、エタノール及びグリセロール等のアルコールを使用してもよい。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム等の様々なアンモニウム塩、アミン類等の他の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物、及び消化された発酵性微生物等の天然の窒素源を使用することができる。ミネラルとしては、一リン酸カリウム、二リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウム等を使用することができる。ビタミンとしては、チアミン、酵母エキス等を使用することができる。
【００７４】
培養は、振盪または通気下での撹拌等の好気条件下で、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３８℃の温度で、行うことが好ましい。培地のｐＨは通常、５〜９であり、好ましくは６．５〜７．２である。培地のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウム、様々な酸、様々な塩基、及び緩衝液で調整することができる。通常、１〜５日間の培養により培地中に標的Ｌ−アミノ酸が蓄積する。
【００７５】
培養後、遠心分離又は膜濾過によって、細胞等の固体を液体培地から除去し、イオン交換法、濃縮法、及び／又は結晶化法によって、標的Ｌ−アミノ酸を回収及び精製することができる。
【００７６】
本発明の方法によって製造されたフェニルアラニンは、例えば、α-L-アスパルチル-L-フェニルアラニンの低級アルキルエステル(「アスパルテーム」とも呼ばれる)の製造に使用することができる。すなわち、本発明の方法は、L-フェニルアラニンを原料として用いるα-L-アスパルチル-L-フェニルアラニンの低級アルキルエステルの製造を包含し得る。この方法は、上記の本発明の方法によって製造されたL-フェニルアラニンと、アスパラギン酸又はその誘導体とからα-L-アスパルチル-L-フェニルアラニンの低級アルキルエステルを合成することを含む。低級アルキルエステルとしては、メチルエステル、エチルエステル及びプロピルエステル等が挙げられる。
【００７７】
本発明において、L-フェニルアラニン、及びアスパラギン酸又はその誘導体からα-L-アスパルチル-L-フェニルアラニンの低級アルキルエステルを合成する方法は、α-L-アスパルチル-L-フェニルアラニンの低級アルキルエステルの合成にL-フェニルアラニン又はその誘導体が用いられる限り特に制限されず、通常の方法を用いることができる。具体的には、例えば、α-L-アスパルチル-L-フェニルアラニンの低級アルキルエステルは、以下の方法により製造することができる(米国特許第3,786,039号)。L-フェニルアラニンをL-フェニルアラニンの低級アルキルエステルにエステル化する。このL-フェニルアラニンアルキルエステルを、β-カルボキシル基が保護され、α-カルボキシル基がエステル化されて活性化されたL-アスパラギン酸の誘導体と反応させる。前記誘導体としては、N-ホルミル-、N-カルボベンゾキシ-、又はN-p-メトキシカルボベンゾキシ-L-アスパラギン酸無水物のようなN-アシル-L-アスパラギン酸無水物が挙げられる。この縮合反応により、N-アシル-α-L-アスパルチル-L-フェニルアラニンと、N-アシル-β-L-アスパルチル-L-フェニルアラニンの混合物が得られる。この縮合反応を、37℃における酸解離定数が10-4以下の有機酸の存在下で行うと、β-体に対するα-体の割合が上昇する(特開昭51-113841)。続いて、N-アシル-α-L-アスパルチル-L-フェニルアラニンを混合物から分離し、水素化してα-L-アスパルチル-L-フェニルアラニンを得る。
【実施例】
【００７８】
本発明を、下記の非限定的実施例によりさらに具体的に説明する。
【００７９】
［実施例１］変異型tyrA-ssrA遺伝子を含むE. coli MG1655ΔtyrRtyrA-ssrA株の構築
１．変異tryA-ssrA遺伝子による、E. coliにおける天然pheA遺伝子及びtyrA遺伝子領域の3'末端に位置する36-ntの置換
天然pheA遺伝子及びtyrA遺伝子領域の3'末端に位置する36-ntを置換するために、1)pheA遺伝子の5'末端に位置する36-nt、2)attL及びattR部位を有するcat遺伝子、3)クロラムフェニコール耐性マーカー(CmR)をコードするDNA断片、4)終止コドンTAA、5)ssrA遺伝子の90〜119位に位置する30-nt、及び6) tyrA遺伝子領域の3'末端に位置する36-ntを保持するDNA断片を、Datsenko, K. A. とWanner, B. L.( Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 2000, 97, 6640-6645)により記載された、「Red-mediated integration」及び／又は「Red-driven integration」とも呼ばれる方法（図１）により、E. coli MG1655 ΔtyrRの染色体に、天然pheA遺伝子及び3'末端tyrA遺伝子領域に置き換えて組み込んだ。
【００８０】
DNA断片は、2回の連続PCRによって得た。第１回目のPCRの増幅産物の5μlを第２回目のPCRのテンプレートとして用いた。
【００８１】
cat遺伝子によりコードされるCmRマーカーを含む第１のDNA断片を、プライマーP1（配列番号９）及びP2（配列番号１０）と、テンプレートとしてpMW118-attL-Cm-attR (WO 05/010175) (図２)とを用いるPCRにより得た。プライマーP1は、pheA遺伝子の5'末端に位置する36-nt領域に同一の領域と、pMW118-attL-Cm-attRの27-nt attL領域に相補的な領域とを有する。プライマーP2は、ssrA遺伝子の30-nt領域に同一の領域と、pMW118-attL-Cm-attRの27-nt attR領域に相補的な領域とを有する。これらの二つの領域の間に、プライマーP2において終止コドンTAAが挿入された。PCRの条件は次の通りであった。95℃5分で変性； 95℃30秒、50℃30秒、72℃1分のプロファイルで30サイクル；最終ステップ：72℃5分。
【００８２】
1709bpの産物が得られ、アガロースゲルで精製され、この5μlを、プライマーP1（配列番号９）及びP3（配列番号１１）を用いる第２回のPCR反応のテンプレートとして用いた。プライマーP3は、tyrA遺伝子領域の3'末端に位置する36-nt領域に相補的な領域と、プライマーP2の5'末端に位置する18-nt領域に同一の領域とを有する。PCRの条件は次の通りであった。95℃5分で変性； 95℃30秒、50℃30秒、72℃1分のプロファイルで30サイクル
；最終ステップ：72℃5分。
【００８３】
1745bpのPCR産物が得られ、アガロースゲルで精製され、温度感受性複製開始点を有するプラスミドpKD46を保持するE. coli MG1655ΔtyrR株のエレクトロポレーションに用いた。プラスミドpkD46は、アラビノース誘導性ParaBプロモーターに制御されるλRed相同組換えシステムの遺伝子（γ、β、exo遺伝子）を含む、λファージの2154塩基のDNA断片（GenBankアクセッション番号 J02459, 31088〜33241位）を含む。プラスミドpKD46はPCR産物を、天然pheA遺伝子及びtyrA遺伝子領域の3'末端に位置する36-nt の代わりにE. coli MG1655ΔtyrR株の染色体に組み込むために必要である。
【００８４】
エレクトロポレーション用のコンピテントセルは次のようにして調製した。すなわち、エシェリヒア・コリMG1655ΔtyrR /pKD46株を、100mg／Lのアンピシリンを含んだLB培地中で３０℃、一晩培養し、培養物を、アンピシリンとL-アラビノース（10 mM）を含んだ5mLのSOB培地（Sambrook, J.ら、モレキュラークローニング：実験室マニュアル第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989年））で100倍希釈した[アラビノースは、Redシステム遺伝子をコードするプラスミドを誘導するために用いられた]。細胞を３０℃で通気しながらＯＤ600が約０．６になるまで生育させた後、100倍に濃縮し、氷冷したH2Oで３回洗浄することによってエレクトロポレーションに使用できるようにした。エレクトロポレーションは７０μＬの細胞と約１００ｎｇのＰＣＲ産物を用いて行った。エレクトロポレーションは"BioRad" エレクトロポレーター (USA, No. 165-2098, version 2-89)を用いて製造者の指示書に従って行った。処理後の細胞は１ｍＬのＳＯＣ培地（Sambrook, J.ら、モレキュラークローニング：実験室マニュアル第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989年））で希釈し、３７℃で２時間培養した後、クロラムフェニコール(20μg/ml)を含むＬ−寒天培地上で３７℃で平板培養し、ＣｍR組換え体を選択した。
【００８５】
２．PCRによるpheA遺伝子欠失の確認
24時間生育させた後、コロニーを、アレル特異的プライマーP4（配列番号１２）及びP5（配列番号１３）を用いるPCRによりCmRマーカーの存在に関して試験した。このために、新たに単離したコロニーを水(20μl)に懸濁し、得られた懸濁液の1μlをPCRに用いた。温度プロファイルは次の通りであった。95℃5分で初期変性；（95℃30秒の変性、50℃30秒のアニーリング、72℃1分の伸長）を30サイクル；72℃5分の最終伸長。
【００８６】
試験したCmRコロニーのいくつかが、求める2373-bp DNA断片を含んでおり、これによりpheA遺伝子の1869-bp天然領域がハイブリッドtyrA-ssrA遺伝子で置換されていることが確認された（図１及び図３参照）。得られた変異株をMG1655 ΔtyrR (pheA::cat tyrA-ssrAと命名した。
【００８７】
３．E. coli MG1655 ΔtyrR (pheA::cat tyrA-ssrA 株のcat遺伝子の、野生型pheA遺伝子による置換
cat遺伝子を置換するため、実施例１（図３）にも記載した、Datsenko, K. A. とWanner, B. L.( Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 2000, 97, 6640-6645)により記載された、「Red-mediated integration」及び／又は「Red-driven integration」とも呼ばれる方法により、野生型pheA遺伝子を保持するDNA断片を、E. coli MG1655 ΔtyrR (pheA::cat tyrA-ssrA/pKD46の染色体に、cat遺伝子の代わりに組み込んだ。
【００８８】
野生型pheA遺伝子は、E. coli MG1655株の染色体DNAをテンプレートして用い、プライマーP4（配列番号１２）及びP6（配列番号１４）を用いるPCRにより得た。
【００８９】
プライマーP6は、終止コドンTAAを有するssrA遺伝子90〜119位に位置する領域に同一の領域と、pheA遺伝子の3'末端に位置する19-nt領域に相補的な領域とを有する。
【００９０】
PCRの条件は次の通りであった。95℃5分で変性； 95℃30秒、50℃30秒、72℃1分のプロファイルで30サイクル；最終ステップ：72℃5分。
【００９１】
増幅されたDNA断片をアガロースゲル電気泳動で精製し、"GenElute Spin Columns" ("Sigma", USA)を用いて抽出し、エタノールで沈殿させた。得られたDNA断片を、上記と同様に、エレクトロポレーション及びE. coli MG1655 ΔtyrR (pheA::cat tyrA-ssrA/pKD46染色体へのRed媒介組込み(Red-mediated integration)に使用した。得られたE. coli MG1655 ΔtyrR tyrA-ssrA/pKD46株を最少培地M9上で選択した。培地にL-フェニルアラニンが含まれないことにより、原栄養性であるPhe+のコロニーの選択ができた。
【００９２】
４．PCRによるpheA遺伝子再構成の確認
24時間生育させた後、コロニーを、アレル特異的プライマーP4（配列番号１２）及びP5（配列番号１３）を用いるPCRによりpheA遺伝子の存在に関して試験した。このために、新たに単離したコロニーを水(20μl)に懸濁し、得られた懸濁液の1μlをPCRに用いた。温度プロファイルは次の通りであった。95℃5分で初期DNA変性；（95℃30秒の変性、50℃30秒のアニーリング、72℃1分10秒の伸長）を30サイクル；72℃5分の最終伸長。
【００９３】
試験したPhe+コロニーのいくつかが、求める1827-bp DNA断片を含んでおり、これによりcat遺伝子の2373-bp天然領域がpheA遺伝子で置換されていることが確認された（図２参照）。得られた変異株をMG1655 ΔtyrR tyrA-ssrA/pKD46と命名した（図４）。
【００９４】
次に、pKD46プラスミドを除去するために、Ｃｍを含むL-寒天培地上、４２℃で２回継代し、得られたコロニーのアンピシリン感受性について試験した。
【００９５】
以上により、変異型tyrA遺伝子を有し、tyrR遺伝子を欠失した株が得られた。この株をMG1655ΔtyrRtyrA-ssrAと命名した。
【００９６】
［実施例２］L-フェニルアラニン生産に対するtyrA遺伝子のssrAタギングの効果
E. coli MG1655 ΔtyrR tyrA-ssrA株及びMG1655 ΔtyrR株のそれぞれを、栄養培地で18時間37℃で培養し、これらの培養物のそれぞれの0.3 mlを、20×200mmの試験管に入れた3
mlの下記の組成を有する発酵培地に接種し、ロータリーシェイカーにより72時間32℃で培養した。
【００９７】
培養後、媒地中のL-フェニルアラニン及びL-チロシンの蓄積量をTLCにより測定した。薄層シリカゲルプレート(10x15 cm)に、培養液のアリコート(1-2μl)をスポットし、展開溶媒(2-プロパノール : 酢酸エチル: アンモニア : 水 = 16 : 16 : 3 : 9)で展開し、ニンヒドリン試薬でL-フェニルアラニン及びL-チロシンを検出した。４試験管の発酵の結果を表１に示す。
【００９８】
培養培地の組成(g/l)は以下の通りであった。
グルコース 40.0
(NH4)2SO4 16.0
K2HPO4 1.0
MgSO4・7H2O 1.0
MnSO4・5H2O 0.01
FeSO4・7H2O 0.01
イーストエキストラト 2.0
CaCO3 30.0
MgSO4・7H2O 及び CaCO3 はそれぞれ別個に滅菌した。
【００９９】
表１から明らかなように、MG1655 ΔtyrR tyrA-ssrA株は、MG1655ΔtyrRと比べて、L-フェニルアランの蓄積量が高く、L-チロシンの量が少なかった。
【０１００】
［実施例３］L-ヒスチジン生産に対するpgi遺伝子のssrAタギングの効果
配列番号２又は配列番号１５のペプチドでタギングしたpgi遺伝子を有するL-ヒスチジン生産株を得た。これらの二つのペプチドは、末端アミノ酸残基の一つの置換（アラニン又はバリン）で相違する。これらの株は次のようにして得た。先ず、配列番号２又は配列番号１５のペプチドをコードする遺伝子の3'末端に付加的な塩基配列を含むpgi遺伝子の二つの改変体を、E.coli MG1655株の染色体DNAをテンプレートとし、プライマーpgi1 (配列番号１６)及びpgi-LAA (配列番号１７)又はpgiLVA (配列番号１８)をそれぞれ用いるPCRにより得た。プライマーpgi1は、pgi遺伝子の5'末端に相補的であり、その5'末端にSacI制限部位を含む。プライマーpgi-LVA及びpgi-LAAは、終止コドンを含まないpgi遺伝子の3'末端の領域、それぞれ配列番号２又は１５の短ペプチドをコードする領域、終止コドン、及び、その5'末端にXbaI制限部位を含む。次に、二つのPCR断片を別個にSacI及びXbaI制限酵素で処理し、同じ制限酵素で予め処理したpMW119プラスミドに連結した。得られたプラスミドを、それぞれ、pMW-pgi-ssrALAA及びpMWpgi-ssrALVAと命名した。
【０１０１】
次いで、野生型pgi遺伝子をL-ヒスチジン生産株80において欠失させた。
このために、cat遺伝子によりコードされるCmRマーカーを含むDNA断片を、プライマーP7（配列番号１９）及びP8（配列番号２０）と、テンプレートとしてpMW118-attL-Cm-attR
(WO 05/010175) (図２)とを用いるPCRにより得た。プライマーP7は、pgi遺伝子の5'末端に位置する36-nt領域に同一の領域と、pMW118-attL-Cm-attRの28-nt attR領域に相補的な領域とを有する。プライマーP8は、pgi遺伝子の3'末端に位置する36-nt領域に同一の領域と、pMW118-attL-Cm-attRの28-nt attL領域に相補的な領域とを有する。PCR及び得られたDNA断片のエレクトロポレーションは上記（実施例１のセクション１参照）と同様に行った。
【０１０２】
pgi遺伝子の欠失は、アレル特異的プライマーP9（配列番号２１）及びP10（配列番号２２）を用いるPCRにより確認した。このために、新たに単離したコロニーを水(20μl)に懸濁し、得られた懸濁液の1μlをPCRに用いた。温度プロファイルは次の通りであった。95℃5分で初期変性；（95℃30秒の変性、50℃30秒のアニーリング、72℃１分10秒の伸長）を30サイクル；72℃5分の最終伸長。
【０１０３】
試験したCmRコロニーのいくつかが、求める1709-bp DNA断片を含んでおり、これによりpgi遺伝子の1651-bp天然領域がcat遺伝子で置換されていることが確認された。得られた変異株を80 Δpgiと命名した。
【０１０４】
得られた80 Δpgi株を、上記と同様にして、プラスミドpMW-pgi-ssrALAA 及びpMWpgi-ssrALVAで形質転換した。得られた株をそえぞれ80Δpgi/pMW-pgi-ssrALAA 及び80Δpgi/pMWpgi-ssrALVAと命名した。
【０１０５】
ミニジャーバッチ発酵のため、L-寒天上で生育させた80、80Δpgi/pMW-pgi-ssrALAA 及び80Δpgi/pMWpgi-ssrALVAのそれぞれの一白金耳をL-ブロスに移し、回転撹拌(140 rpm)により30℃で、培養物の光学密度OD540が約2.0になるまで培養した。種培養の25mlを、250mlの発酵培地に加え、回転撹拌(1500 rpm)により29℃で培養した。バッチ発酵の時間は約35〜40時間であった。培養後、媒地中に蓄積したヒスチジンの量をろ紙クロマトグラフィーにより測定した。ろ紙を移動相(n-ブタノール : 酢酸: 水 = 4 : 1 : 1 (v/v))で展開した。ニンヒドリンのアセトン溶液(0.5%)を可視化試薬として用いた。結果を表２に示す。表２から明らかなように、80Δpgi/pMW-pgi-ssrALAA 及び80Δpgi/pMWpgi-ssrALVA株
は、80株と比べて、L-フェニルアランの蓄積量が高かった。
【０１０６】
発酵培地組成 (pH 6.0) (g/l):
グルコース 50.0
マメノウ 0.2 （TN換算）
(NH4)2SO4 8.0
KH2PO4 0.5
MgSO4 7H20 0.4
FeSO4 7H20 0.02
MnSO4 0.02
チアミン 0.001
ベタイン 2.0
L-プロリン 0.8
L-グルタミン酸 3.0
L-アスパラギン酸 1.0
アデノシン 0.2
【０１０７】
本発明を好ましい態様について詳細に説明したが、当業者にとっては、本発明の範囲から離れることなく、種々の改変をしたり、均等物を用いたりできることは明らかである。本明細書に引用した文献は、引用により本願の一部として含める。
【０１０８】
【表１】
【０１０９】
【表２】
【０１１０】
［配列の説明]
1: Escherichia coli由来ssrA遺伝子
2: tmRNAによりコードされるタンパク質分解誘導ぺプチドタグ
3: Escherichia coli由来tyrA遺伝子
4: tyrA遺伝子によりコードされるアミノ酸配列
5: Escherichia coli由来pheA遺伝子
6: pheA遺伝子によりコードされるアミノ酸配列
7: Escherichia coli由来pgi遺伝子
8: pgi遺伝子によりコードされるアミノ酸配列
9: プライマー P1
10: プライマー P2
11: プライマー P3
12: プライマー P4
13: プライマー P5
14: プライマー P6
15: tmRNAにコードされるタンパク質分解誘導ぺプチドタグ
16: プライマー pgi1
17: プライマー pgi-LAA
18: プライマー pgi-LVA
19: プライマー P7
20: プライマー P8
21: プライマー P9
22: プライマー P10
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】tyrA遺伝子伸長のスキームを示す。
【図２】pMW118-attL-Cm-attR.におけるプライマーP1及びP2の相対的位置を示す。
【図３】pheA遺伝子を欠失した染色体DNA断片の構築を示す。
【図４】pheA遺伝子でcat遺伝子座を置換するスキームを示す。tyrA-ssrA遺伝子座及びcat遺伝子を含む E.coli 染色体遺伝子座。得られた構築物の確認に用いたP4及びP5のサイトを黒矢印で示す。
【図５】Bacillus subtilis (BACSU)、Bacillus stearothermophilus (BACST)、Serratia marcescens (SERMA)、 Escherichia coli (ECOLI)、Pseudomonas flurescens (PSEFL)、Pseudomonas chlororaphis (PSECL)及び Pseudomonas putida (PSEUPU)由来のtmRNAがコードするタンパク質分解誘導ペプチドタグの一次配列のアライメントを示す。アライメントは、PIRマルチプルアライメントプログラム(http://pir.georgetown.edu)を用いて行った。同一アミノ酸はアスタリスク(*)で、類似アミノ酸はコロン(:)でマークした。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ）Ｌ−アミノ酸生合成に影響する細菌酵素をコードする遺伝子、及び、Ｂ）転写可能であり、配列番号２のペプチド又はその変異体をコードするＤＮＡ断片であって、前記遺伝子の３’末端に連結される前記断片を含む、腸内細菌科に属するＬ−アミノ酸生産細菌。
【請求項２】
エシェリヒア属細菌である請求項１記載の細菌。
【請求項３】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌である請求項１記載の細菌。
【請求項４】
前記酵素がコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドロゲナーゼである請求項１記載の細菌。
【請求項５】
Ｌ−ヒスチジン生産菌である請求項１記載の細菌。
【請求項６】
前記酵素がホスホグルコースイソメラーゼである請求項１記載の細菌。
【請求項７】
請求項１に記載の細菌を培地で培養し、該培地から該Ｌ−アミノ酸を単離することを含む、Ｌ−アミノ酸の製造方法。
【請求項８】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−フェニルアラニンである請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−ヒスチジンである請求項７記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の細菌を培地で培養し、培地にＬ−フェニルアラニンを生成、蓄積させ、アスパラギン酸又はその誘導体と得られたＬ−フェニルアラニンとからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを合成することを含む、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルの製造方法。
【請求項１１】
さらに、Ｌ−フェニルアラニンをエステル化してＬ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを生成し、Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを、Ｎ−アシル−Ｌ−アスパルトアンヒドリドであるアスパラギン酸誘導体と縮合させ、反応液からＮ−アシル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを分離し、Ｎ−アシル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを水素化してα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを生成することを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１】
Ａ）Ｌ−アミノ酸生合成に影響する細菌酵素をコードする遺伝子、及び、Ｂ）転写可能であり、配列番号２のペプチド又はその変異体をコードするＤＮＡ断片であって、前記遺伝子の３’末端に連結される前記断片を含む、腸内細菌科に属するＬ−アミノ酸生産細菌。
【請求項２】
エシェリヒア属細菌である請求項１記載の細菌。
【請求項３】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌である請求項１記載の細菌。
【請求項４】
前記酵素がコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドロゲナーゼである請求項１記載の細菌。
【請求項５】
Ｌ−ヒスチジン生産菌である請求項１記載の細菌。
【請求項６】
前記酵素がホスホグルコースイソメラーゼである請求項１記載の細菌。
【請求項７】
請求項１に記載の細菌を培地で培養し、該培地から該Ｌ−アミノ酸を単離することを含む、Ｌ−アミノ酸の製造方法。
【請求項８】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−フェニルアラニンである請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−ヒスチジンである請求項７記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の細菌を培地で培養し、培地にＬ−フェニルアラニンを生成、蓄積させ、アスパラギン酸又はその誘導体と得られたＬ−フェニルアラニンとからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを合成することを含む、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルの製造方法。
【請求項１１】
さらに、Ｌ−フェニルアラニンをエステル化してＬ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを生成し、Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを、Ｎ−アシル−Ｌ−アスパルトアンヒドリドであるアスパラギン酸誘導体と縮合させ、反応液からＮ−アシル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを分離し、Ｎ−アシル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを水素化してα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを生成することを含む、請求項１０記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００９−１１２３００（Ｐ２００９−１１２３００Ａ）
【公開日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００８−２５１４８１（Ｐ２００８−２５１４８１）
【出願日】平成２０年９月２９日（２００８．９．２９）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２５１４８１（Ｐ２００８−２５１４８１）
【出願日】平成２０年９月２９日（２００８．９．２９）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
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