膠原病の予防・治療剤
【課題】本発明は、ＴＲＥＭ−１の機能を阻害して膠原病予防・治療効果を発揮する膠原病の予防剤・治療剤を提供することを目的とする。また、本発明は、ＴＲＥＭ−１の機能を阻害することにより膠原病を予防・治療するための、膠原病の予防・治療剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【解決手段】ＴＲＥＭ−１阻害物質を含有してなる膠原病の予防・治療剤を用いる。ＴＲＥＭ−１阻害物質としては、可溶性ＴＲＥＭ−１や、可溶性ＴＲＥＭ−１発現ベクター等を好適に例示することができる。
【解決手段】ＴＲＥＭ−１阻害物質を含有してなる膠原病の予防・治療剤を用いる。ＴＲＥＭ−１阻害物質としては、可溶性ＴＲＥＭ−１や、可溶性ＴＲＥＭ−１発現ベクター等を好適に例示することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膠原病の予防・治療剤及びそのスクリーニング法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
膠原病は、関節リウマチ(Rheumatoid ahthritis; ＲＡ) 、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、全身性硬化症(ＳＳｃ)、皮膚筋炎(ＤＭ)、多発性筋炎(ＰＭ)、リウマチ熱(ＲＦ)、結節性多発性動脈炎(ＰＮ)、混合性結合組織病(mixed connective tissue disease; ＭＣＴＤ)等の一連の疾患群の総称である。膠原病は、自己免疫疾患であり、体内の血液中の自己抗体が、自己の細胞の核などと反応して免疫複合体を作り、組織に沈着したり、全身の関節・血管・内臓などを攻撃することによって生じるものと考えられている。
【０００３】
膠原病の１種である関節リウマチは、軟骨の変性や骨のびらんを伴い、最終的には関節機能を喪失させる。関節リウマチは、自己抗体を産生するリンパ球を含む大量の炎症細胞が関節に浸潤し、骨膜が過形成されることによって生じるとされている。より詳細に述べれば、関節リウマチは、ある未知の自己抗原を認識するＴ細胞が滑膜組織において炎症の開始を引き起こし、続いてマクロファージ及びリンパ球が滑膜組織に局所的に集合して、その炎症部位においてさらに活性化されることによって生じるとされている（非特許文献１）。特にマクロファージは、炎症性サイトカイン、プロスタグランジン、酸化窒素等の様々な炎症分子を産生するため、関節リウマチの進行に大きく寄与する。これらの炎症分子の産生は、サイトカインレセプターや補体レセプターやＩＴＡＭ（Immunoreceptor tyrosine-based activation motif）関連レセプター等の細胞表面分子の、それぞれのリガンド関与を通した活性化によって制御されている。免疫システムの制御に関連する前述のレセプター等の一部のレセプターは、膜アンカー型アダプター分子と非共有結合により会合している。多くの場合、これらのレセプターは、それらのアダプター分子なくしては細胞表面上での安定的な発現は不可能であり、また、それらのアダプター分子を介して細胞内へのシグナル伝達を行っている。
【０００４】
ＴＲＥＭ−１（Triggering receptor expressed on myeloid cells-1）は、ＩＴＡＭを有するアダプター分子であるＤＡＰ１２（DNAX activation protein 12）の活性化と関連した骨髄細胞上の膜貫通レセプターとして同定された（非特許文献２、３）。ＴＲＥＭ−１は、主に単球／マクロファージや好中球で発現し、ＴＬＲリガンド（ＬＰＳ、ＬＴＡ等）や炎症性サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ−１β等）などの様々な刺激によって誘導される（非特許文献２〜４）が、その天然リガンドは未だ同定されていない。ＴＲＥＭ−１の詳細な機能は未だ明らかではないが、ＴＲＥＭ−１に対して作動性（agonistic）のモノクローナル抗体で好中球や単球を処理すると、好中球や単球において、様々な炎症性サイトカインの産生や細胞表面分子の発現が引き起こされることが知られている（非特許文献２）。また、ＴＲＥＭ−１の機能を阻害する物質として、可溶性のＴＲＥＭ−１（ｓＴＲＥＭ−１）が知られている（非特許文献５）。このｓＴＲＥＭ−１は、膜結合ＴＲＥＭ−１をタンパク質分解して切断して得られる可溶性のポリペプチドであり、ＴＲＥＭ−１自体と競合することによってＴＲＥＭ−１の機能を阻害する性質を有する。
【０００５】
ＴＲＥＭ−１の作用が関与する疾患として、細菌感染が知られている。細菌感染の病態生理にＴＲＥＭ−１が重要な役割を果たしていることは、いくつかの実験で明らかにされている。例えば、ＴＲＥＭ−１と競合する「ｓＴＲＥＭ−１−Ｆｃ組換え融合タンパク質」や「ｓＴＲＥＭ−１合成ペプチド」を敗血性ショックモデルマウスに投与した結果、致死的な量のＬＰＳ投与や敗血性の細菌感染からマウスが保護されることが確認された（非特許文献６、７）。また、炎症性大腸炎は腸における細菌性の損傷がその発症機序に重要な役割を果たしていることが知られる疾患であるところ、実験的炎症性大腸炎モデルマウスにＴＲＥＭ−１アンタゴニストペプチドを投与してＴＲＥＭ−１からのシグナル伝達を遮断した結果、実験的炎症性大腸炎が軽減されることが確認された（非特許文献８）。このように、ＴＲＥＭ−１は、疾患に関連した細菌感染において重要な役割を果たしていることは知られている。
しかし、細菌感染以外の病態や疾患（特に膠原病）と、ＴＲＥＭ−１との関連の有無等については何ら知られていなかった。
【０００６】
【非特許文献１】Bresnihan, B. 1999. Pathogenesis of joint damage in rheumatoid arthritis. J. Rheumatol. 26:717-719
【非特許文献２】Bouchon, A., Dietrich, J., and Colonna, M. 2000. Cutting edge: inflammatory responses can be triggered by TREM-1, a novel receptor expressed on neutrophils and monocytes. J Immunol. 164:4991-4995
【非特許文献３】Klesney-Tait, J., Turnbull, IR., and Colonna, M. 2006. The TREM receptor family and signal integration. Nat Immunol. 7:1266-1273
【非特許文献４】Murakami, Y., Akahoshi, T., Hayashi, I., Endo, H., Kawai, S., Inoue, M., Kondo, H., and Kitasato, H. 2006. Induction of triggering receptor expressed on myeloid cells 1 in murine resident peritoneal macrophages by monosodium urate monohydrate crystals. Arthritis Rheum. 54:455-462
【非特許文献５】Gomez-Pina, V., et al. 2007. Metalloproteinases shed TREM-1 ectodomain from lipopolysaccharide-stimulated human monocytes. J Immunol. 179:4065-4073
【非特許文献６】Bouchon, A., Facchetti, F., Weigand, M,A., and Colonna M. 2001. TREM-1 amplifies inflammation and is a crucial mediator of septic shock. Nature. 410:1103-1107
【非特許文献７】Gibot, S., Kolopp-Sarda, MN., Bene, MC., Bollaert, PE., Lozniewski, A., Mory, F., Levy, B., and Faure, G,C. 2004. A soluble form of the triggering receptor expressed on myeloid cells-1 modulates the inflammatory response in murine sepsis. J Exp Med. 200:1419-1426
【非特許文献８】Schenk, M., Bouchon, A., Seibold, F., and Mueller C. 2007. TREM-1--expressing intestinal macrophages crucially amplify chronic inflammation in experimental colitis and inflammatory bowel diseases. J Clin Invest. 117:3097-3106
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ＴＲＥＭ−１の機能を阻害して膠原病予防・治療効果を発揮する膠原病の予防剤・治療剤を提供することを目的とする。また、本発明は、ＴＲＥＭ−１の機能を阻害することにより膠原病を予防・治療するための、膠原病の予防・治療剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、adenovirus-sTREM-1-Ig遺伝子を導入してＴＲＥＭ−１の機能を阻害することによって、コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）の進行や発症がＴ細胞やＢ細胞の免疫反応を損なうことなく有意に抑制されることを見い出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち本発明は、（１）ＴＲＥＭ−１阻害物質を含有してなる膠原病の予防・治療剤や、（２）ＴＲＥＭ−１阻害物質が、可溶性ＴＲＥＭ−１又は可溶性ＴＲＥＭ−１発現ベクターである上記（１）に記載の膠原病の予防・治療剤や、（３）可溶性ＴＲＥＭ−１が、配列番号１におけるアミノ酸番号１〜１９４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号５におけるアミノ酸番号１〜２００に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号３若しくは７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号３若しくは７に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである上記（２）に記載の膠原病の予防・治療剤や、（４）可溶性ＴＲＥＭ−１が、配列番号１におけるアミノ酸番号１〜１９４に示されるアミノ酸配列、配列番号５におけるアミノ酸番号１〜２００に示されるアミノ酸配列、及び、配列番号３又は７に示されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＴＲＥＭ−１阻害活性を有するポリペプチドである上記（２）に記載の膠原病の予防・治療剤や、（５）ＴＲＥＭ−１阻害物質が、イムノグロブリン結合−可溶性ＴＲＥＭ−１（ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ）である上記（１）に記載の膠原病の予防・治療剤や、（６）イムノグロブリン結合−可溶性ＴＲＥＭ−１（ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ）が、配列番号１又は５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである上記（５）に記載の膠原病の予防・治療剤や、（７）可溶性ＴＲＥＭ−１発現ベクターが、配列番号２におけるヌクレオチド番号１〜５８２に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号６におけるヌクレオチド番号１〜６００に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号４又は８に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、及び、配列番号４又は８に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドから選ばれるポリヌクレオチドを含む組換えベクターである上記（２）に記載の膠原病の予防・治療剤や、（８）可溶性ＴＲＥＭ−１発現ベクターが、配列番号２におけるヌクレオチド番号１〜５８２に示されるヌクレオチド配列、配列番号６におけるヌクレオチド番号１〜６００に示されるヌクレオチド配列、及び、配列番号４又は８に示されるヌクレオチド配列から選ばれるヌクレオチド配列に相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＴＲＥＭ−１阻害活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターである上記（２）に記載の膠原病の予防・治療剤や、（９）可溶性ＴＲＥＭ−１発現ベクターが、可溶性ＴＲＥＭ−１を発現する組換えウイルスベクターである上記（７）又は（８）に記載の膠原病の予防・治療剤や、（１０）膠原病が、関節リウマチである上記（１）〜（９）のいずれかに記載の膠原病の予防・治療剤に関する。
【００１０】
また本発明は、（１１）ＴＲＥＭ−１阻害物質を探索する工程を備えてなる、膠原病の予防・治療剤のスクリーニング法や、（１２）ＴＲＥＭ−１阻害物質を探索する工程が、被検物質存在下又は非存在下でＴＲＥＭ−１を含む細胞を培養し、培養上清中のＴＮＦα濃度を測定し、それらのＴＮＦα濃度を比較する工程であることを特徴とする上記（１１）に記載の膠原病の予防・治療剤のスクリーニング法に関する。
【発明の効果】
【００１１】
ＴＲＥＭ−１の機能を阻害することにより、膠原病の予防・治療効果を発揮することが可能であり、従って、ＴＲＥＭ−１阻害物質は膠原病の予防・治療等に有効である。また、ＴＲＥＭ−１阻害物質を探索することにより、膠原病の予防・治療剤をスクリーニングすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の膠原病の予防・治療剤としては、ＴＲＥＭ−１阻害物質を含有してなる組成物であれば特に制限されず、ここで「ＴＲＥＭ−１阻害物質」とは、ＴＲＥＭ−１を介してのシグナル伝達を阻害する活性を有する物質をいい、かかるＴＲＥＭ−１阻害物質としては、可溶性ＴＲＥＭ−１や、可溶性ＴＲＥＭ−１（ｓＴＲＥＭ−１）を発現する組換えベクターや、ＴＲＥＭ−１アンタゴニストを好適に例示することができる。これらのＴＲＥＭ−１阻害物質によって、ＴＲＥＭ−１の機能（ＴＲＥＭ−１を介してのシグナル伝達）が阻害され、その結果、ＴＲＥＭ−１阻害物質は膠原病の予防・治療剤の有効成分として有利に利用することができる。また、ＴＲＥＭ−１の由来は特に制限されないが、動物由来であることが好ましく、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等の哺乳動物由来であることがより好ましく、中でも、膠原病の予防・治療の対象とする哺乳動物由来であることがさらに好ましい。これらの哺乳動物におけるＴＲＥＭ−１は、マウスＴＲＥＭ−１（Genbank accession No.AK089439）、ヒトＴＲＥＭ−１（Genbank accession No.AF287008）、ウシＴＲＥＭ−１（Genbank accession No.AY525122）、ブタＴＲＥＭ−１（Genbank accession No.AY382476）等の配列情報を利用した遺伝子工学的手法（ＰＣＲやサザンハイブリダイゼーション等）により、ＴＲＥＭ−１をコードするポリヌクレオチドを入手し、そのポリヌクレオチドを適切な発現系を用いて発現させることにより、様々な由来のＴＲＥＭ−１を得ることができる。
【００１３】
上記可溶性ＴＲＥＭ−１としては、
（１）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドや、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド（マウスＬＰ１７）；
（２）配列番号１におけるアミノ酸番号１〜１９４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（マウスｓＴＲＥＭ−１）；
（３）配列番号１におけるアミノ酸番号１〜１９４に示されるアミノ酸配列又は配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＴＲＥＭ−１阻害活性を有するポリペプチド（マウスｓＴＲＥＭ−１変異体）；
（４）配列番号１におけるアミノ酸番号１〜１９４のうち、アミノ酸番号１〜１０２及び１２０〜１９４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＴＲＥＭ−１阻害活性を有するポリペプチド（マウスｓＴＲＥＭ−１変異体）；
（５）配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドや、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド（ヒトＬＰ１７）；
（６）配列番号５におけるアミノ酸番号１〜２００に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒトｓＴＲＥＭ−１）；
（７）配列番号５におけるアミノ酸番号１〜２００に示されるアミノ酸配列又は配列番号７に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＴＲＥＭ−１阻害活性を有するポリペプチド（ヒトｓＴＲＥＭ−１変異体）；
（８）配列番号５におけるアミノ酸番号１〜２００のうち、アミノ酸番号１〜１０２及び１２０〜２００に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＴＲＥＭ−１阻害活性を有するポリペプチド（ヒトｓＴＲＥＭ−１変異体）；
を例示することができ、中でも、マウスｓＴＲＥＭ−１やヒトｓＴＲＥＭ−１を好適に例示することができる。
【００１４】
また、安定性を向上させる観点から、これらの可溶性ＴＲＥＭ−１のＣ末端側に、リンカー配列（配列番号１におけるアミノ酸番号１９５〜１９９に示されるアミノ酸配列；配列番号５におけるアミノ酸番号２０１〜２０５に示されるアミノ酸配列）及びＩｇＧ１のＦｃ領域（配列番号１におけるアミノ酸番号２００〜４３０に示されるアミノ酸配列；配列番号５におけるアミノ酸番号２０６〜４３６に示されるアミノ酸配列）が付加されているポリペプチドを好ましく例示することができる。したがって、マウスやヒトのイムノグロブリン結合−可溶性ＴＲＥＭ−１（ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ）も膠原病の予防・治療剤として有利に用いることができる。なお、可溶性ＴＲＥＭ−１は、ＴＲＥＭ−１の天然リガンドをトラップすることにより、ＴＲＥＭ−１の機能を阻害すると考えられ、また、マウスＬＰ１７ポリペプチド（配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）がマウスＴＲＥＭ−１の機能を阻害することは、非特許文献７に開示されている。
【００１５】
上記ｓＴＲＥＭ−１変異体における「数個」としては、例えば２〜６０個、好ましくは２〜４０個、より好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜２０個、さらにより好ましくは２〜１０個、特に好ましくは２〜５個、最も好ましくは２〜３個を例示することができる。また、ｓＴＲＥＭ−１変異体のアミノ酸配列としては、配列番号１又は５におけるアミノ酸番号１〜１９４に示されるアミノ酸配列や、配列番号３又は７に示されるアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などを例示することができる。
【００１６】
上記の可溶性ＴＲＥＭ−１は、ＴＲＥＭ−１（膜型ＴＲＥＭ−１）のＣ末端の一部を欠失させること等により作製することができる。例えばマウスＴＲＥＭ−１の場合、Ｃ末端の３６アミノ酸を欠失させることにより可溶性ＴＲＥＭ−１（ｓＴＲＥＭ−１）を作製することができ、また、ヒトＴＲＥＭ−１の場合、Ｃ末端の３４アミノ酸を欠失させることにより可溶性ＴＲＥＭ−１（ｓＴＲＥＭ−１）を作製することができる。また、上記ｓＴＲＥＭ−１変異体は、化学合成によって作製することもできるし、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法を適用することにより作製することもできる。具体的には、配列番号２におけるヌクレオチド番号１〜５８２に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド（マウスｓＴＲＥＭ−１をコードするポリヌクレオチド）や、配列番号６におけるヌクレオチド番号１〜６００に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド（ヒトｓＴＲＥＭ−１をコードするポリヌクレオチド）や、他の生物由来のｓＴＲＥＭ−１ポリヌクレオチドに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらポリヌクレオチドに変異を導入し、この変異ポリヌクレオチドを適切な発現系を用いて発現させることにより、ｓＴＲＥＭ−１変異体を得ることができる。
【００１７】
上記のＴＲＥＭ−１アンタゴニストは、例えば、後述の本発明の膠原病の予防・治療剤のスクリーニング法等を利用することにより、適当な化合物ライブラリーから入手することができる。また、ＴＲＥＭ−１アンタゴニストが血しょう板上に存在することが示唆される報告（Blood. 110:1029-35）もあるため、血しょう板上に発現する物質を候補物質として用いることもできる。
【００１８】
上記可溶性ＴＲＥＭ−１発現ベクターとしては、いずれかの動物の生体内で、前述の可溶性ＴＲＥＭ−１を発現しうるものであれば特に制限されないが、いずれかの哺乳動物の生体内で前述の可溶性ＴＲＥＭ−１を発現する組換えベクター、好ましくは組換えウイルスベクターを挙げることができる。これら可溶性ＴＲＥＭ−１を発現する組換えベクターとして具体的には、
（１）配列番号４に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドや、該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドがインテグレートされた組換えベクター（マウスＬＰ１７ベクター）；
（２）配列番号２におけるヌクレオチド番号１〜５８２に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドがインテグレートされた組換えベクター（マウスｓＴＲＥＭ−１ベクター）；
（３）配列番号４に示されるヌクレオチド配列又は配列番号２におけるヌクレオチド番号１〜５８２に示されるヌクレオチド配列に相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＴＲＥＭ−１阻害活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがインテグレートされた組換えベクター（マウス変異ｓＴＲＥＭ−１ベクター）；
（４）配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドがインテグレートされた組換えベクター（安定型マウスｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇベクター）；
（５）配列番号８に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドや、該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドがインテグレートされた組換えベクター（ヒトＬＰ１７ベクター）；
（６）配列番号６におけるヌクレオチド番号１〜６００に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドがインテグレートされた組換えベクター（ヒトｓＴＲＥＭ−１ベクター）；
（７）配列番号８に示されるヌクレオチド配列又は配列番号６におけるヌクレオチド番号１〜６００に示されるヌクレオチド配列に相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＴＲＥＭ−１阻害活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがインテグレートされた組換えベクター（ヒト変異ｓＴＲＥＭ−１ベクター）；
（８）配列番号６に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドがインテグレートされた組換えベクター（安定型ヒトｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇベクター）；
を例示することができ、中でも、マウスｓＴＲＥＭ−１ベクター、安定型マウスｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇベクター、ヒトｓＴＲＥＭ−１ベクター、安定型ヒトｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇベクターを好適に例示することができる。
【００１９】
上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどのポリヌクレオチドをプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチド又はその断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第３版等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００２０】
すなわち、ストリジェントな条件下とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、５０〜７０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド（特にＤＮＡ）同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いポリヌクレオチド（特にＤＮＡ）同士がハイブリダイズしない条件あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６５℃、１× ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、又は０．１× ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件を挙げることができる。例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとしては、プローブとして使用するポリヌクレオチドの塩基配列と一定以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができ、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらにより好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを好適に例示することができる。
【００２１】
本発明の組換えベクター、好ましくは組換えウイルスベクターは、前述のｓＴＲＥＭ−１をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに適切にインテグレートすることにより構築することができる。発現ベクターとしては、投与対象である動物細胞において自立複製可能であるものや、あるいは前述の動物細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、ｓＴＲＥＭ−１を発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。発現ベクターとしては、動物細胞用発現ベクター、例えば、非分列細胞を含む全ての細胞（血球系以外）での一過性発現に用いられるアデノウイルスベクター（Science, 252, 431-434, 1991）や、分裂細胞での長期発現に用いられるレトロウイルスベクター（Microbiology and Immunology, 158, 1-23, 1992）や、非病原性、非分裂細胞にも導入可能で、長期発現に用いられるアデノ随伴ウイルスベクター（Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 97-129, 1992）などのウイルスベクターを挙げることができ、中でもアデノウイルスベクターを好適に例示することができる。本発明に用いることのできる発現ベクターの構築の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
【００２２】
本発明の膠原病の予防・治療剤は、ＴＲＥＭ−１阻害物質のみであってもよいし、摂取促進のための補助剤等の生理学的に認められる担体とともに製剤化したものであってもよい。また、ＴＲＥＭ−１阻害物質以外の膠原病の予防・治療剤を併用してもよい。
本発明の膠原病の予防・治療剤の剤型としては、特に制限されないが、錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤等の経口剤や、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液または懸濁液等の注射剤を例示することができ、ＴＲＥＭ−１阻害物質がＴＲＥＭ−１を発現する物質又は可溶性ＴＲＥＭ−１である場合は、注射剤を好適に例示することができる。注射剤の投与形態としては、静脈内投与や皮下投与を好適に例示することができる。
【００２３】
本発明の膠原病の予防・治療剤は、例えば、上述の本発明におけるＴＲＥＭ−１阻害物質を、生理学的に許容し得る担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定化剤、結合剤等とともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。錠剤、カプセル剤等に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴム等の結合剤、結晶性セルロース等の賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等の膨化剤、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリン等の甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリー等の香味剤等を用いることができる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂等の液状担体を含有することができる。注射剤は、本発明のポリペプチドを通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等を用いることができ、さらに、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（５０mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等を用いることができ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン等）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール等）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノール等）、酸化防止剤等を配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填することができる。投与量は、ＴＲＥＭ−１阻害物質の種類、患者の体重や年齢、投与方法等により変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
【００２４】
膠原病の予防・治療剤の投与対象としては、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等の哺乳動物を好適に例示することができる。
【００２５】
本発明の膠原病の予防・治療剤の対象となる膠原病としては、膠原病である限り特に制限されないが、関節リウマチ（ＲＡ）、痛風、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、シェーグレン症候群(ＳｊＳ)、全身性硬化症(ＳＳｃ)、多発性筋炎(ＰＭ)、皮膚筋炎(ＤＭ)、結節性多発性動脈炎(ＰＮ)、リウマチ熱(ＲＦ)、混合性結合組織病(mixed connective tissue disease; ＭＣＴＤ)、顕微鏡的多発血管炎(microscopic polyangitis; ＭＰＡ)、Wegener肉芽腫症(Wegener's granulomatosis; ＷＧ)、アレルギー性肉芽腫性血管炎(allergic granulomatous angitis; ＡＧＡ)、過敏性血管炎、ベーチェット病、コーガン症候群、ＲＳ３ＰＥを例示することができ、中でも、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、シェーグレン症候群(ＳｊＳ)を好適に例示することができる。
【００２６】
本発明の膠原病の予防・治療剤のスクリーニング法は、ＴＲＥＭ−１阻害物質を探索する工程を備えてなる。ＴＲＥＭ−１阻害物質を探索する工程として、例えば、被検物質存在下又は非存在下でＴＲＥＭ−１を含む細胞を培養し、培養上清中のＴＮＦα濃度を測定し、それらのＴＮＦα濃度を比較する工程を例示することができる。被検物質存在下でのＴＮＦα濃度が、被検物質非存在下のＴＮＦα濃度より低い場合は、その被検物質をＴＲＥＭ−１阻害物質と評価することができる。
【００２７】
本発明の膠原病の予防・治療方法は、本発明の膠原病の予防・治療剤を動物に投与する工程を備えてなる。動物としては、前述の哺乳動物を好適に例示することができる。また、本発明の膠原病の予防・治療剤以外の膠原病の予防・治療剤を併用してもよい。
【００２８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２９】
後述の実施例２〜７は、以下の１．〜１５．に記載の材料及び方法を用いて行った。
［材料及び方法］
１．試薬
ラット抗マウスＴＲＥＭ−１抗体、マウス抗ヒトＴＲＥＭ−１抗体、フィコエリトリン（ＰＥ）標識抗マウスＴＲＥＭ−１抗体、ＰＥ標識抗ヒトＴＲＥＭ−１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、抗マウスＩｇＧ１抗体、抗ラットＩｇＧ抗体、マウスＴＲＥＭ−１デュオセット（Duo set）、及びマウス腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）デュオセットは、R & D社（ミネソタ州ミネアポリス）から入手した。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ヒトＣＤ１４モノクローナル抗体は、Beckman-Coulter社（カリフォルニア州フラトン）から購入した。アロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識抗マウスＣＤ１１ｂモノクローナル抗体は、e-Bioscience社（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。ラビット抗ラットＩｇＧ抗体、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、及びジアミノベンジジン（Envision kit）はダコ・サイトメーション株式会社（Dako Cytomation Co. Ltd.）（京都府）から購入した。ヒトＴＮＦαに用いる特異的酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）用の試薬は、Biosource International社（カリフォルニア州カマリロ）から入手した。ＬＰＳ及びコラゲナーゼＡはSigma社（ミズーリ州セントルイス）から購入した。ＨＲＰで標識したラビット抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂの各抗体は、Zymed社（カリフォルニア州バーリンゲーム）から購入した。
【００３０】
２．細胞
ヒト滑膜組織は、信州大学及び国立下志津病院で全身人工関節置換術又は滑膜切除術を受ける関節リウマチ患者から得た。患者は手術前に同意書に署名した。なお、関節リウマチの診断は、米国リウマチ学会の基準に従って行った。
一方、マウスの滑膜組織は、コラーゲン関節炎（ＣＩＡ）マウスの膝関節から分離した。
ヒトやマウスの滑膜細胞は文献（Arthritis Rheum. 54:2074-2083； J Exp Med. 203:325-335）記載の方法により調製した。すなわち、滑膜組織を切除し、これを無血清ＤＭＥＭ中、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＡにより３７℃で１時間消化した。この滑膜組織消化物を懸濁し、ナイロンメッシュでろ過した。分離して得られた細胞を無血清ＤＭＥＭ中で３回洗浄した。
また、常在型腹腔マクロファージ（ＲＰＭ）は、非特許文献４に記載の方法により、ＤＢＡ１／Ｊ雄マウス（６〜８週齢）から単離した。
また、ヒトＰＢＭＣは、健常人から提供を受けたヘパリン添加末梢血についてフィコールパーク密度勾配遠心分離法を行うことによって単離した。
【００３１】
３．滑液中のｓＴＲＥＭ−１濃度の測定
滑液（ＳＦ）試料は、北里大学の関節リウマチ（ＲＡ）及び変形性関節炎（ＯＡ）の患者の炎症関節から得た。試料は全て、インフォームド・コンセントを得た上で提供を受けた。滑液中のｓＴＲＥＭ−１濃度は、常法である酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で測定した。
【００３２】
４．フローサイトメトリー
ヒト滑膜細胞又はＰＢＭＣについては、それをＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ１４モノクローナル抗体及びＰＥ標識抗ヒトＴＲＥＭ−１モノクローナル抗体で二重染色し、ゲーティングしたＣＤ１４細胞におけるＴＲＥＭ−１の発現を分析した。
また、マウスの滑膜細胞については、それをＡＰＣ標識抗マウスＣＤ１１ｂモノクローナル抗体及びＰＥ標識抗マウスＴＲＥＭ−１モノクローナル抗体で二重染色し、ゲーティングしたＣＤ１１ｂ細胞におけるＴＲＥＭ−１の発現を分析した。
全てのフローサイトメトリー実験においてＦＩＴＣ、ＰＥ又はＡＰＣで標識した適切なアイソタイプ対照モノクローナル抗体を使用した。データは、FACSCaliburを用いて採取し、CellQuestソフトウエア（BD Biosciences Immunocytometry Systems社、カリフォルニア州サンホセ）を使って分析した。
【００３３】
５．定量的リアルタイムＰＣＲ
定量的リアルタイムＰＣＲは、非特許文献４記載の方法により行った。すなわち、RNeasy Mini kit（Qiagen社、東京）を用いて細胞溶解物から全ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡをDNase I（Qiagen社）で処理し、Omniscript reverse transcriptase（Qiagen社）を使ってｃＤＮＡを合成した。特定のオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブを用いた定量的リアルタイムＰＣＲ（TaqMan社）によりｈＴＲＥＭ−１及びｒＲＮＡを調べた。TaqManＰＣＲは、QuantiTect Probe PCR（Qiagen社）で行った。７９００配列検出システムを用いて放出蛍光を定量分析することにより、ＰＣＲ増幅をリアルタイムでモニターした。対照試料の量を１任意ユニットとし、各ｍＲＮＡ試料を対照試料量に対して相対的に定量した。
【００３４】
６．免疫組織化学的解析
免疫組織化学的解析は、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）で包埋した凍結滑膜試料の切片を用いて行った。すなわち、８μｍ厚のクリオスタット切片を４％パラホルムアルデヒド中で２０分間固定し、その後試料をＰＢＳ中に５分間ずつ３回浸漬した。次いで、その試料中の組織切片を、１．５％Ｈ２Ｏ２を含むＰＢＳ中で１５分間、次に５％正常ウサギ血清を含むＰＢＳ中で３０分間処理した。ウサギ抗ＴＲＥＭ−１抗体とアイソタイプ適合対照抗体としての正常ウサギＩｇＧとを一次抗体として２５μｇ／ｍｌ含む５％正常ウサギ血清／ＰＢＳ中において、連続切片を４℃で一晩インキュベートした。次に試料を５分間２回の条件下ＰＢＳ中で洗浄し、製造者マニュアルに従い、ジアミノベンジジンで処理した。次いで、切片をヘマトキシリンで５秒間対比染色し、水道水で１０分間洗浄した。
【００３５】
７．サイトカイン産生アッセイ
５μｇ／ｍｌの抗ヒトＴＲＥＭ−１モノクローナル抗体、抗マウスＴＲＥＭ−１モノクローナル抗体、又はアイソタイプ適合対照抗体（ＩｇＧ抗体）を、平底プレートに４℃で一晩プレコーティングした。この平底プレートの各ウエルに、ＰＢＳで洗浄した細胞を１×１０５細胞／ウエルずつ添加し、これを１２００ｒｐｍで短時間遠心分離して、ＴＲＥＭ−１を抗体に結合させた。２４時間インキュベーションした後、遠心分離して培養培地を分取し、培養培地上清中のＴＮＦα濃度を特異的ＥＬＩＳＡで測定するまで−２０℃で保存した。
なお、前述の抗ヒトＴＲＥＭ−１モノクローナル抗体、抗マウスＴＲＥＭ−１モノクローナル抗体は、それぞれヒトＴＲＥＭ−１、マウスＴＲＥＭ−１に対してアゴニスティックに作用する性質も有しており、以下、「抗ＴＲＥＭ−１アゴニスト抗体」ともいう。
【００３６】
８．組換えアデノウイルス
マウスｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ遺伝子（配列番号１）を含む複製欠損アデノウイルス（以下、「ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ」ともいう。）又はＬａｃＺ遺伝子を含む複製欠損アデノウイルス（以下、「ＡｘＣＡ−ＬａｃＺ」ともいう。）は、それぞれ文献（Arthritis Rheum. 54:2074-2083）記載の方法により調製した。すなわち、組換えアデノウイルスをＨＥＫ２９３細胞中で増殖させて、高力価の組換えアデノウイルスを調製し、塩化セシウム密度勾配遠心法でＨＥＫ２３９細胞中から組換えアデノウイルスを精製した。
【００３７】
９．ＴＲＥＭ−１阻害活性のバイオアッセイ
ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇが発現するｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇが生物活性を有していることを示すため、ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ又はＡｘＣＡ−ＬａｃＺを感染させたＮＩＨ／３Ｔ３細胞の培養上清を用いてＴＲＥＭ−１の阻害活性を調べた。感染３日後にこれらの細胞の上清を回収した。各上清を連続希釈し、抗マウスＴＲＥＭ−１モノクローナル抗体（抗ＴＲＥＭ−１アゴニスト抗体）をプレコーティングした別々のウエルにおいて各希釈液５０μｌを３７℃でインキュベートした。インキュベート開始から１５分後、各ウエルにＲＰＭ（ＴＲＥＭ−１発現細胞）を１×１０５細胞で加えた。ＲＰＭの添加開始から２４時間インキュベートした後、培養培地を得、培養培地の上清中のＴＮＦα濃度をＥＬＩＳＡで測定した。
【００３８】
１０．血清中のｓＴＲＥＭ−１濃度
ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇを静脈内投与した後の血清中のｓＴＲＥＭ−１濃度を調べるため、０日目に１０９ｐｆｕのＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ又はＡｘＣＡ−ＬａｃＺを非免疫マウスに投与した。アデノウイルス投与の０日後、２日後、４日後及び７日後にマウスから血液試料を採取し、それを−２０℃で保存した。保存した血液試料についてＥＬＩＳＡを行い、血清中のｓＴＲＥＭ−１濃度を測定した。
【００３９】
１１．ＣＩＡ誘導及び関節炎の臨床評価
ＤＢＡ／１Ｊ雄マウスを日本チャールズ・リバー・ブリージング・ラボラトリーズ（東京）から購入し、東京医科歯科大学の動物実験施設で飼育した。８週齢のＤＢＡ／１Ｊ雄マウスの尾底部皮内に、ウシコラーゲンII型（ＣII）２００μｇを含むＣＦＡ（フロインドの完全アジュバンド）を投与して免疫した（初回免疫）。初回免疫の２１日後、同様にしてこれらマウスに２回目の免疫を行い（０日目）、以下のスコアリング法にしたがってマウスの各肢の疾患重症度を記録した。
スコアリング法； ０＝正常： １＝一箇所の関節に軽度の腫脹： ２＝二箇所の関節に軽度の腫脹： ３＝足又は指に重度の腫脹： ４＝足及び指全体に重度の腫脹。
関節の腫脹は、後肢の厚さと足首の幅をマイクロメーター（株式会社岡崎製作所、東京）で測定して数値化した。
次に、マウスの関節について組織学的検査を行うために、２回目の免疫の１４日後にコラーゲン関節炎（ＣＩＡ）マウスを屠殺した。このマウスの膝関節を切り取り、それを１０％緩衝ホルマリン中に固定し、１０％ＥＤＴＡで脱灰し、パラフィンに包埋した。包埋した膝関節の切片（４μｍ厚）をヘマトキシリン及びエオシンで染色し、組織学的検査を行った。炎症細胞の浸潤、滑膜内膜の変性（transformation of synovial lining）、軟骨破壊、及びパンヌス形成をそれぞれ上述のスコアリング法にしたがって０〜３でスコアリングした。組織学的スコアの最高点は１２点であった。
【００４０】
１２．インビボでの遺伝子導入
２回目の免疫の２日後及び９日後に、１０８ｐｆｕ又は１０９ｐｆｕのＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ（サンプル数：ｎ＝８）又はＡｘＣＡ−ＬａｃＺ（サンプル数：ｎ＝８）を含むＰＢＳ１００μｌをマウスに静脈内投与した。
【００４１】
１３．ウシII型コラーゲン（ＣII）特異的抗体の検出
マウス血清中のＣII特異的抗体は、ＥＬＩＳＡで測定した。具体的には、以下のような方法で測定した。
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で沸騰させることによって変性させた２μｇ／ｍｌのウシII型コラーゲンで、平底プレートをコーティングした。このプレートを０．０５％Tween 20を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で洗浄し、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳでブロッキングし、１０００倍希釈したマウス血清とインキュベートした。２％ＢＳＡを含むＰＢＳＴ中で、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Zymed社、カリフォルニア州バーリンゲーム）で標識したウサギ抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂの各抗体とインキュベートすることにより、陽性反応を検出した。最終反応は、TMB Microwell Peroxidase Substrate System（ＫＰＬ社、メリーランド州ゲイサーズバーグ）を用いて視覚化した。吸光度は、４５０ｎｍにて測定した。関節炎マウス又は非関節炎マウスから得たプール血清から作製した標準血清を用いて、ＣII特異的抗体ユニットを測定した。関節炎マウスの血清の４０倍希釈物を１０００ユニット／ｍｌ値とした。
【００４２】
１４．ＣII特異的Ｔ細胞の増殖
２回目の免疫の１４日後、各グループのマウスから脾細胞を単離した。これらの脾細胞（５×１０５個）を、ペニシリン／ストレプトマイシン及び１０％ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ１６４０倍地において変性ＣII（０〜１００μｇ／ｍｌ）で刺激しながら培養した。７２時間の培養期間の最後の１６時間、培養物を［３Ｈ］チミジン（０．０３７ＭＢｑ／ウエル）と共に培養し、脾細胞をマイクロ９６ハーベスター（PerkinElmer社、横浜）上に回収して増殖反応を評価した。マイクロプレートベータカウンター（「MicroβPlus」；PerkinElmer社）により、取り込まれた放射線を測定した。
【００４３】
１５．統計方法
各実験の結果は、平均±標準偏差（ＳＤ）で表した。統計分析にはマン・ ホイットニーのＵテストを用い、ｐ＜０．０５の場合を有意差有りとした。
【実施例２】
【００４４】
［滑液におけるヒトｓＴＲＥＭ−１及び関節リウマチの滑膜細胞におけるヒト膜結合型ＴＲＥＭ−１の検出］
（１）滑液中のｓＴＲＥＭ−１濃度の測定結果
ｓＴＲＥＭ−１及び膜結合型ＴＲＥＭ−１が細菌感染症で多量に認められることを報告する文献は何件かあるが（Nature. 410:1103-1107； N Engl J Med. 350:451-458）、関節リウマチにおけるｓＴＲＥＭ−１やＴＲＥＭ−１の発現は示されていなかった。そこで、関節リウマチにおけるｓＴＲＥＭ−１濃度を調べるため、関節リウマチ（ＲＡ）患者２３名及び変形性関節炎（ＯＡ）患者９名の滑液中のｓＴＲＥＭ−１濃度を、上記実施例１に記載された「滑液中のｓＴＲＥＭ−１濃度の測定」の方法にしたがって、ＥＬＩＳＡにより測定した。その結果を図１のＡに示す。図１のＡの結果から分かるように、ＲＡ患者の滑液中のｓＴＲＥＭ−１濃度は１７６３．２±１１８０．２ｐｇ／ｍｌであったのに対し、ＯＡ患者の滑液中のｓＴＲＥＭ−１濃度は１６２．２±２２０．２ｐｇ／ｍｌであり、ＲＡ患者の滑液中のｓＴＲＥＭ−１濃度はＯＡ患者のそれと比較して有意に高かった。このことから、ｓＴＲＥＭ−１は、炎症のないＯＡよりも、炎症を伴うＲＡにおいて高発現していることが示された。
【００４５】
（２）ヒト滑膜細胞におけるフローサイトメトリーの結果
次に、上記実施例２（１）におけるＲＡ患者のうち３名の滑膜細胞について、ＴＲＥＭ−１の発現の有無を調べるため、上記実施例１に記載された「フローサイトメトリー」の方法にしたがって、フローサイトメトリー解析を行った。具体的には、ＲＡ患者から採取した滑膜細胞の単一細胞懸濁液を、ＴＲＥＭ−１及びＣＤ１４（マクロファージマーカー）について二重染色し、ＴＲＥＭ−１を発現する滑膜細胞の解析を行った。その結果を図１のＢに示す。図１のＢの結果から分かるように、ＲＡ患者の炎症滑膜組織においてＣＤ１４を発現するマクロファージは、ＴＲＥＭ−１の発現を示した。このことから、滑膜組織中の浸潤マクロファージにおいてＴＲＥＭ−１が発現していることが示された。
【００４６】
（３）ヒト滑膜細胞におけるサイトカイン産生アッセイの結果
ＴＲＥＭ−１の発現に起因すると考えられる結果を直接調べるため、上記実施例２（１）におけるＲＡ患者の全滑膜細胞のＴＲＥＭ−１を、上記実施例１に記載された「サイトカイン産生アッセイ」の方法にしたがって、抗ＴＲＥＭ−１モノクローナル抗体（抗ＴＲＥＭ−１アゴニスト抗体）で２４時間刺激し、培養上清中の炎症性サイトカイン（ＴＮＦα）濃度をＥＬＩＳＡで測定した。その結果を図１のＣに示す。ＴＮＦαの分泌自体は、ＲＡの炎症関節から得た滑膜細胞で既に検出されていたが、図１のＣの結果から分かるように、抗ＴＲＥＭ−１アゴニスト抗体によるＴＲＥＭ−１の架橋によって、ＴＮＦαの分泌は、ＩｇＧ抗体（コントロール抗体）で刺激した場合と比較して、有意に高かった。このことから、ＴＲＥＭ−１を介した炎症プロセスが増大することにより、関節リウマチ患者の疾患が悪化し、組織破壊が進行することが示された。
【実施例３】
【００４７】
［コラーゲン関節炎（ＣＩＡ）マウスの滑膜細胞におけるマウスＴＲＥＭ−１の発現］
（１）ＣＩＡマウスの滑膜細胞に対する免疫組織化学的解析の結果
骨髄細胞でのＴＲＥＭ−１発現が、滑膜組織での炎症反応に寄与するかどうかを調べるため、ＣＩＡマウスの滑膜組織におけるマウスＴＲＥＭ−１の発現を、上記実施例１に記載された「免疫組織化学的解析」の方法により調べた。その結果を図２のＡ〜Ｃに示す。図２のＡ〜Ｃの結果から分かるように、ＴＲＥＭ−１を発現する細胞（単核球）が、炎症滑膜組織で豊富に認められた（図２のＣ）。
【００４８】
（２）ＣＩＡマウスの滑膜細胞に対するフローサイトメトリー分析の結果
次に、ＣＩＡマウスの炎症骨膜組織においてＴＲＥＭ−１が発現しているかどうかを調べるため、上記実施例１に記載された「ＣＩＡ誘導及び関節炎の臨床評価」の方法にしたがってＣＩＡ誘導したマウスについて、「フローサイトメトリー」の方法にしたがったフローサイトメトリー解析を行った。具体的には、ＣＩＡマウスから採取した滑膜細胞の単一細胞懸濁液を、ＴＲＥＭ−１及びＣＤ１１ｂ（マクロファージマーカー）について二重染色し、ＴＲＥＭ−１を発現する滑膜細胞の解析を行った。その結果を図２のＤに示す。図２のＤの結果から分かるように、ＣＩＡマウスの炎症滑膜組織においてＣＤ１１ｂを発現するマクロファージのほとんどは、ＴＲＥＭ−１の発現を示した。特に、初期炎症関節（２回目のコラーゲン免疫から７日後）におけるＴＲＥＭ−１の発現レベル（Ｄａｙ７）は、慢性炎症関節（２回目のコラーゲン免疫から１６日後）の場合（Ｄａｙ１６）に比べ高かった。このことから、ＴＲＥＭ−１は、慢性炎症関節よりも初期炎症関節において重要な役割を担っていることが示された。
【実施例４】
【００４９】
［インビボでのｓＴＲＥＭ−１の発現量、及び、インビトロでのＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇの生物活性］
（１）マウス血清中のｓＴＲＥＭ−１濃度測定の結果
ＣＩＡにおいてＴＲＥＭ−１を阻害することによる治療効果を調べるため、まず、ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ遺伝子を含む組換えアデノウイルス（ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ）を、上記実施例１に記載された「組換えアデノウイルス」の方法にしたがって構築した。
次に、ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇをマウスに投与した場合に、インビボにおいてｓＴＲＥＭ−１が実際に発現するかを調べるため、上記実施例１に記載された「血清中のｓＴＲＥＭ−１濃度」の方法にしたがって、マウス血清中のｓＴＲＥＭ−１の濃度をＥＬＩＳＡで測定した。その結果を図３のＡに示す。図３のＡの結果から分かるように、ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇの静脈内投与の２日後に、ｓＴＲＥＭ−１濃度が最大値を示し、それ以降７日目まで徐々に減少した。
一方、ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇに代えてＡｘＣＡ−ＬａｃＺを投与したマウスでは、血清中のｓＴＲＥＭ−１濃度の上昇は見られなかった（データは示さず）。
これらの結果から、ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇの静脈内投与により、ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇがインビボで効率的に産生されることが示された。
【００５０】
（２）ＴＲＥＭ−１阻害活性のバイオアッセイの結果
ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇが発現するｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇが生物活性を有しているかを確認するために、上記実施例１に記載された「ＴＲＥＭ−１阻害活性のバイオアッセイ」の方法にしたがって実験を行った。すなわち、ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇに感染させたＮＩＨ／３Ｔ３細胞中のｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇを含む培養上清が、抗ＴＲＥＭ−１アゴニスト抗体で刺激した常在型腹腔マクロファージ（ＲＰＭ）によるＴＮＦα産生に対して及ぼす効果を調べた。その結果を図３のＢに示す。図３のＢの結果から分かるように、ＡｘＣＡ−ＬａｃＺを感染させた細胞の培養上清（ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇを含まない）を添加した場合は、その添加量にかかわらずＴＮＦαの産生は阻害されなかった。それに対し、ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇを感染させたＮＩＨ／３Ｔ３細胞の培養上清（ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇを含む）を添加した場合は、ＴＮＦαの産生が著しく阻害され、また、その阻害の程度は培養上清の添加量に依存的であって、ｓＴＲＥＭ−１の濃度が３２０ｐｇ／ｍｌのときにＴＮＦαの産生は完全に阻害された。
これらの結果から、ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇの発現産物であるｓＴＲＥＭ−１−ＩＧが生物活性（炎症の抑制効果）を有していることが示された。
【実施例５】
【００５１】
［コラーゲン関節炎（ＣＩＡ）におけるｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ遺伝子導入による関節炎の抑制］
（１）ＣＩＡ誘導及び関節炎の臨床評価の結果
ＣＩＡにおけるＴＲＥＭ−１の病態生理学的機能を調べるため、上記実施例１に記載された「ＣＩＡ誘導及び関節炎の臨床評価」の方法にしたがって、マウスにＣＩＡを誘導し、さらに、上記実施例１に記載された「インビボでの遺伝子導入」の方法にしたがってそのマウスにＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇを導入してＴＲＥＭ−１の関与を阻害することによって、ＣＩＡの病態にどのような影響が見られるかを調べた。ＣＩＡマウスの関節炎の組織学的スコアの経時的推移を図４のＡに、ＣＩＡマウスの足首幅の経時的推移を図４のＢに、ＣＩＡマウスの後肢の厚さの経時的推移を図４のＣに示す。図４のＡ〜Ｃの結果から分かるように、１×１０９ｐｆｕのＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇを静脈内投与した場合は、ＡｘＣＡ−ＬａｃＺ（コントロール）を投与した場合に比べ、関節炎の進行が著しく抑制された。また、１×１０８ｐｆｕのＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇを静脈内投与した場合は、１×１０９ｐｆｕ投与した場合ほどではないが、コントロールに対して有意に関節炎が抑制された。すなわち、ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇは、投与量依存的に関節炎を阻害することが明らかとなった。これらの知見から、ＴＲＥＭ−１がＣＩＡの進行に大きな役割を担っていることが示され、ＴＲＥＭ−１を阻害することが関節炎の治療に有用である可能性が極めて高いことが判明した。
【００５２】
（２）ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇで処理されたマウスのＣＩＡの組織学的評価の結果
上記実施例５の（１）においてＣＩＡ誘導及びＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ導入されたマウスの関節の病変を組織学的に評価するため、２回目の免疫の１６日後にＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ又はＡｘＣＡ−ＬａｃＺ（コントロール）を導入したマウスの膝関節の切片を用意し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。その観察結果を図５のＡ（ＡｘＣＡ−ＬａｃＺ導入マウス）及びＢ（ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ導入マウス）に示す。図５のＡ及びＢから分かるように、ＡｘＣＡ−ＬａｃＺ導入マウスの関節は、炎症細胞の顕著な浸潤、滑膜内膜の変性、軟骨破壊、及びパンヌス形成という４つのパラメーター全てにおいてコラーゲン関節炎に特有の特徴を示した。それに対して、ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ導入マウスの関節では、炎症細胞の浸潤が顕著に減少し、内膜の過形成や骨及び軟骨の破壊の程度も低かった。
【００５３】
ＡｘＣＡ−ＬａｃＺ導入マウス、及び、ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ導入マウスの関節における上記の４つのパラメーターを０〜３（０，正常； １，軽微； ２，軽度； ３，重篤）の４段階でそれぞれ評価した。その観察結果を図５のＣに示す。図５のＣの結果から分かるように、ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ導入マウスの各パラメーターのスコアは、ＡｘＣＡ−ＬａｃＺ導入マウスのスコアに比べ、著しく低かった。これらの結果から、ＴＲＥＭ−１シグナル伝達がコラーゲン関節炎における関節の炎症及び破壊の促進に関与していることが示唆された。
【実施例６】
【００５４】
［Ｔ細胞応答に対するｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ遺伝子導入の効果］
（１）ウシII型コラーゲン（ＣII）特異的Ｔ細胞の増殖の結果
インビボでのＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ導入により、ＣIIに対するＴ細胞性免疫が影響されるかどうかを調べるため、上記実施例５の（１）においてＣＩＡ誘導及びＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ導入されたマウスの脾細胞におけるＴ細胞の増殖を、上記実施例１に記載された「ＣII特異的Ｔ細胞の増殖」の方法にしたがって、インビトロで測定した。すなわち、ＣＩＡ誘導マウスの２回目の免疫の２日後及び９日後に各種のアデノウイルス（ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ又はＡｘＣＡ−ＬａｃＺ）を導入し、１６日目にグループ毎に４個の脾臓を取り出し、II型コラーゲンと共培養した。その観察結果を図６のＡに示す。図６のＡの結果から分かるように、１０８ｐｆｕのＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ、１０９ｐｆｕのＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ、又は、ＡｘＣＡ−ＬａｃＺ（コントロール）を導入した各グループの増殖応答に有意な違いは観察されなかった。この結果から、ＴＲＥＭ−１を阻害しても抗原特異的Ｔ細胞応答は損なわれないことが示された。
【実施例７】
【００５５】
［Ｂ細胞応答に対するｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ遺伝子導入の効果］
（１）ウシII型コラーゲン（ＣII）特異的抗体の検出の結果
II型コラーゲンに対する液性免疫応答に及ぼすＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇの効果を調べるため、上記実施例１に記載された「ウシII型コラーゲン（ＣII）特異的抗体の検出」の方法にしたがって、２回目の免疫から１６日目に、１０８ｐｆｕ若しくは１０９ｐｆｕのＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ導入マウス又はＡｘＣＡ−ＬａｃＺ導入マウスから採血し、血清中の抗ＣII抗体（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ）について分析した。その結果を図６のＢに示す。図６のＢの結果から分かるように、上記の３つのマウス群の間に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂの各抗ＣII抗体の血中抗体価に有意な差異は観察されなかった。さらに、これらの抗ＣII抗体の抗体価は、２回目の免疫から０日目の時点においても有意な違いはなかった（データは示さず）。これらの結果から、ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇで処理してもコラーゲン関節炎における抗ＣII抗体の産生は損なわれないことが示された。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】Ａ：関節リウマチ（ＲＡ）又は変形性関節炎（ＯＡ）患者の滑液中のｓＴＲＥＭ−１濃度を特異的ＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す図である。Ｂ：ＲＡ患者の滑膜細胞を、ＴＲＥＭ−１及びＣＤ１４（マクロファージマーカー）について二重染色した結果を示す図である。Ｃ：ＲＡ患者の全滑膜細胞のＴＲＥＭ−１を、抗ＴＲＥＭ−１アゴニスト抗体で２４時間刺激し、培養上清中の炎症性サイトカイン（ＴＮＦα）濃度をＥＬＩＳＡで測定した結果を示す図である。なお、＊は、ｐ＜０．０１であることを示し、＊＊は、ｐ＜０．００１であることを示す。
【図２】Ａ〜Ｃ：ＣＩＡマウスの滑膜細胞に対する免疫組織化学的解析の結果を示す図である。Ａはヘマトキシリン・エオシン染色した図、Ｂはアイソタイプ適合対照抗体としての正常ウサギＩｇＧ抗体で染色した図、Ｃはラット抗マウスＴＲＥＭ−１抗体で染色した図である。Ｄ：ＣＩＡマウスの滑膜細胞を、ＴＲＥＭ−１及びＣＤ１１ｂについて二重染色した結果を示す図である。
【図３】Ａ：ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇを投与したマウスの血清中のｓＴＲＥＭ−１濃度をＥＬＩＳＡを用いて経時的に測定した結果を示す図である。Ｂ：ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇの発現産物であるｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇが、抗ＴＲＥＭ−１アゴニスト抗体で刺激した常在型腹腔マクロファージ（ＲＰＭ）によるＴＮＦα産生に対してどのような効果を奏するかを調べた結果を示す図である。
【図４】Ａ：２回目の免疫を行った後のＣＩＡマウスにＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇを導入した場合の関節炎の組織学的スコアの経時的推移を示す図である。Ｂ：２回目の免疫を行った後のＣＩＡマウスにＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇを導入した場合のマウスの足首幅の経時的推移を示す図である。Ｃ：２回目の免疫を行った後のＣＩＡマウスにＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇを導入した場合の後肢の厚さの経時的推移を示す図である。なお、＊は、ｐ＜０．０５であることを示し、＊＊は、ｐ＜０．０１であることを示す。
【図５】Ａ：ＣＩＡ誘導及びＡｘＣＡ−ＬａｃＺ（コントロール）導入されたマウスの膝関節の切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色した結果を示す図である。Ｂ：ＣＩＡ誘導及びＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ導入されたマウスの膝関節の切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色した結果を示す図である。Ｃ：ＣＩＡ誘導及びＡｘＣＡ−ＬａｃＺ（コントロール）導入されたマウスの膝関節、並びに、ＣＩＡ誘導及びＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ導入されたマウスの膝関節の関節炎の組織学的スコアを示す図である。
【図６】Ａ：ＣＩＡ誘導及びＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ導入されたマウスの脾細胞におけるＴ細胞の増殖を示す図である。Ｂ：ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ導入マウスの血清中の抗ＣII抗体（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ）について分析した結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膠原病の予防・治療剤及びそのスクリーニング法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
膠原病は、関節リウマチ(Rheumatoid ahthritis; ＲＡ) 、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、全身性硬化症(ＳＳｃ)、皮膚筋炎(ＤＭ)、多発性筋炎(ＰＭ)、リウマチ熱(ＲＦ)、結節性多発性動脈炎(ＰＮ)、混合性結合組織病(mixed connective tissue disease; ＭＣＴＤ)等の一連の疾患群の総称である。膠原病は、自己免疫疾患であり、体内の血液中の自己抗体が、自己の細胞の核などと反応して免疫複合体を作り、組織に沈着したり、全身の関節・血管・内臓などを攻撃することによって生じるものと考えられている。
【０００３】
膠原病の１種である関節リウマチは、軟骨の変性や骨のびらんを伴い、最終的には関節機能を喪失させる。関節リウマチは、自己抗体を産生するリンパ球を含む大量の炎症細胞が関節に浸潤し、骨膜が過形成されることによって生じるとされている。より詳細に述べれば、関節リウマチは、ある未知の自己抗原を認識するＴ細胞が滑膜組織において炎症の開始を引き起こし、続いてマクロファージ及びリンパ球が滑膜組織に局所的に集合して、その炎症部位においてさらに活性化されることによって生じるとされている（非特許文献１）。特にマクロファージは、炎症性サイトカイン、プロスタグランジン、酸化窒素等の様々な炎症分子を産生するため、関節リウマチの進行に大きく寄与する。これらの炎症分子の産生は、サイトカインレセプターや補体レセプターやＩＴＡＭ（Immunoreceptor tyrosine-based activation motif）関連レセプター等の細胞表面分子の、それぞれのリガンド関与を通した活性化によって制御されている。免疫システムの制御に関連する前述のレセプター等の一部のレセプターは、膜アンカー型アダプター分子と非共有結合により会合している。多くの場合、これらのレセプターは、それらのアダプター分子なくしては細胞表面上での安定的な発現は不可能であり、また、それらのアダプター分子を介して細胞内へのシグナル伝達を行っている。
【０００４】
ＴＲＥＭ−１（Triggering receptor expressed on myeloid cells-1）は、ＩＴＡＭを有するアダプター分子であるＤＡＰ１２（DNAX activation protein 12）の活性化と関連した骨髄細胞上の膜貫通レセプターとして同定された（非特許文献２、３）。ＴＲＥＭ−１は、主に単球／マクロファージや好中球で発現し、ＴＬＲリガンド（ＬＰＳ、ＬＴＡ等）や炎症性サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ−１β等）などの様々な刺激によって誘導される（非特許文献２〜４）が、その天然リガンドは未だ同定されていない。ＴＲＥＭ−１の詳細な機能は未だ明らかではないが、ＴＲＥＭ−１に対して作動性（agonistic）のモノクローナル抗体で好中球や単球を処理すると、好中球や単球において、様々な炎症性サイトカインの産生や細胞表面分子の発現が引き起こされることが知られている（非特許文献２）。また、ＴＲＥＭ−１の機能を阻害する物質として、可溶性のＴＲＥＭ−１（ｓＴＲＥＭ−１）が知られている（非特許文献５）。このｓＴＲＥＭ−１は、膜結合ＴＲＥＭ−１をタンパク質分解して切断して得られる可溶性のポリペプチドであり、ＴＲＥＭ−１自体と競合することによってＴＲＥＭ−１の機能を阻害する性質を有する。
【０００５】
ＴＲＥＭ−１の作用が関与する疾患として、細菌感染が知られている。細菌感染の病態生理にＴＲＥＭ−１が重要な役割を果たしていることは、いくつかの実験で明らかにされている。例えば、ＴＲＥＭ−１と競合する「ｓＴＲＥＭ−１−Ｆｃ組換え融合タンパク質」や「ｓＴＲＥＭ−１合成ペプチド」を敗血性ショックモデルマウスに投与した結果、致死的な量のＬＰＳ投与や敗血性の細菌感染からマウスが保護されることが確認された（非特許文献６、７）。また、炎症性大腸炎は腸における細菌性の損傷がその発症機序に重要な役割を果たしていることが知られる疾患であるところ、実験的炎症性大腸炎モデルマウスにＴＲＥＭ−１アンタゴニストペプチドを投与してＴＲＥＭ−１からのシグナル伝達を遮断した結果、実験的炎症性大腸炎が軽減されることが確認された（非特許文献８）。このように、ＴＲＥＭ−１は、疾患に関連した細菌感染において重要な役割を果たしていることは知られている。
しかし、細菌感染以外の病態や疾患（特に膠原病）と、ＴＲＥＭ−１との関連の有無等については何ら知られていなかった。
【０００６】
【非特許文献１】Bresnihan, B. 1999. Pathogenesis of joint damage in rheumatoid arthritis. J. Rheumatol. 26:717-719
【非特許文献２】Bouchon, A., Dietrich, J., and Colonna, M. 2000. Cutting edge: inflammatory responses can be triggered by TREM-1, a novel receptor expressed on neutrophils and monocytes. J Immunol. 164:4991-4995
【非特許文献３】Klesney-Tait, J., Turnbull, IR., and Colonna, M. 2006. The TREM receptor family and signal integration. Nat Immunol. 7:1266-1273
【非特許文献４】Murakami, Y., Akahoshi, T., Hayashi, I., Endo, H., Kawai, S., Inoue, M., Kondo, H., and Kitasato, H. 2006. Induction of triggering receptor expressed on myeloid cells 1 in murine resident peritoneal macrophages by monosodium urate monohydrate crystals. Arthritis Rheum. 54:455-462
【非特許文献５】Gomez-Pina, V., et al. 2007. Metalloproteinases shed TREM-1 ectodomain from lipopolysaccharide-stimulated human monocytes. J Immunol. 179:4065-4073
【非特許文献６】Bouchon, A., Facchetti, F., Weigand, M,A., and Colonna M. 2001. TREM-1 amplifies inflammation and is a crucial mediator of septic shock. Nature. 410:1103-1107
【非特許文献７】Gibot, S., Kolopp-Sarda, MN., Bene, MC., Bollaert, PE., Lozniewski, A., Mory, F., Levy, B., and Faure, G,C. 2004. A soluble form of the triggering receptor expressed on myeloid cells-1 modulates the inflammatory response in murine sepsis. J Exp Med. 200:1419-1426
【非特許文献８】Schenk, M., Bouchon, A., Seibold, F., and Mueller C. 2007. TREM-1--expressing intestinal macrophages crucially amplify chronic inflammation in experimental colitis and inflammatory bowel diseases. J Clin Invest. 117:3097-3106
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ＴＲＥＭ−１の機能を阻害して膠原病予防・治療効果を発揮する膠原病の予防剤・治療剤を提供することを目的とする。また、本発明は、ＴＲＥＭ−１の機能を阻害することにより膠原病を予防・治療するための、膠原病の予防・治療剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、adenovirus-sTREM-1-Ig遺伝子を導入してＴＲＥＭ−１の機能を阻害することによって、コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）の進行や発症がＴ細胞やＢ細胞の免疫反応を損なうことなく有意に抑制されることを見い出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち本発明は、（１）ＴＲＥＭ−１阻害物質を含有してなる膠原病の予防・治療剤や、（２）ＴＲＥＭ−１阻害物質が、可溶性ＴＲＥＭ−１又は可溶性ＴＲＥＭ−１発現ベクターである上記（１）に記載の膠原病の予防・治療剤や、（３）可溶性ＴＲＥＭ−１が、配列番号１におけるアミノ酸番号１〜１９４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号５におけるアミノ酸番号１〜２００に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号３若しくは７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号３若しくは７に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである上記（２）に記載の膠原病の予防・治療剤や、（４）可溶性ＴＲＥＭ−１が、配列番号１におけるアミノ酸番号１〜１９４に示されるアミノ酸配列、配列番号５におけるアミノ酸番号１〜２００に示されるアミノ酸配列、及び、配列番号３又は７に示されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＴＲＥＭ−１阻害活性を有するポリペプチドである上記（２）に記載の膠原病の予防・治療剤や、（５）ＴＲＥＭ−１阻害物質が、イムノグロブリン結合−可溶性ＴＲＥＭ−１（ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ）である上記（１）に記載の膠原病の予防・治療剤や、（６）イムノグロブリン結合−可溶性ＴＲＥＭ−１（ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ）が、配列番号１又は５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである上記（５）に記載の膠原病の予防・治療剤や、（７）可溶性ＴＲＥＭ−１発現ベクターが、配列番号２におけるヌクレオチド番号１〜５８２に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号６におけるヌクレオチド番号１〜６００に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号４又は８に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、及び、配列番号４又は８に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドから選ばれるポリヌクレオチドを含む組換えベクターである上記（２）に記載の膠原病の予防・治療剤や、（８）可溶性ＴＲＥＭ−１発現ベクターが、配列番号２におけるヌクレオチド番号１〜５８２に示されるヌクレオチド配列、配列番号６におけるヌクレオチド番号１〜６００に示されるヌクレオチド配列、及び、配列番号４又は８に示されるヌクレオチド配列から選ばれるヌクレオチド配列に相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＴＲＥＭ−１阻害活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターである上記（２）に記載の膠原病の予防・治療剤や、（９）可溶性ＴＲＥＭ−１発現ベクターが、可溶性ＴＲＥＭ−１を発現する組換えウイルスベクターである上記（７）又は（８）に記載の膠原病の予防・治療剤や、（１０）膠原病が、関節リウマチである上記（１）〜（９）のいずれかに記載の膠原病の予防・治療剤に関する。
【００１０】
また本発明は、（１１）ＴＲＥＭ−１阻害物質を探索する工程を備えてなる、膠原病の予防・治療剤のスクリーニング法や、（１２）ＴＲＥＭ−１阻害物質を探索する工程が、被検物質存在下又は非存在下でＴＲＥＭ−１を含む細胞を培養し、培養上清中のＴＮＦα濃度を測定し、それらのＴＮＦα濃度を比較する工程であることを特徴とする上記（１１）に記載の膠原病の予防・治療剤のスクリーニング法に関する。
【発明の効果】
【００１１】
ＴＲＥＭ−１の機能を阻害することにより、膠原病の予防・治療効果を発揮することが可能であり、従って、ＴＲＥＭ−１阻害物質は膠原病の予防・治療等に有効である。また、ＴＲＥＭ−１阻害物質を探索することにより、膠原病の予防・治療剤をスクリーニングすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の膠原病の予防・治療剤としては、ＴＲＥＭ−１阻害物質を含有してなる組成物であれば特に制限されず、ここで「ＴＲＥＭ−１阻害物質」とは、ＴＲＥＭ−１を介してのシグナル伝達を阻害する活性を有する物質をいい、かかるＴＲＥＭ−１阻害物質としては、可溶性ＴＲＥＭ−１や、可溶性ＴＲＥＭ−１（ｓＴＲＥＭ−１）を発現する組換えベクターや、ＴＲＥＭ−１アンタゴニストを好適に例示することができる。これらのＴＲＥＭ−１阻害物質によって、ＴＲＥＭ−１の機能（ＴＲＥＭ−１を介してのシグナル伝達）が阻害され、その結果、ＴＲＥＭ−１阻害物質は膠原病の予防・治療剤の有効成分として有利に利用することができる。また、ＴＲＥＭ−１の由来は特に制限されないが、動物由来であることが好ましく、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等の哺乳動物由来であることがより好ましく、中でも、膠原病の予防・治療の対象とする哺乳動物由来であることがさらに好ましい。これらの哺乳動物におけるＴＲＥＭ−１は、マウスＴＲＥＭ−１（Genbank accession No.AK089439）、ヒトＴＲＥＭ−１（Genbank accession No.AF287008）、ウシＴＲＥＭ−１（Genbank accession No.AY525122）、ブタＴＲＥＭ−１（Genbank accession No.AY382476）等の配列情報を利用した遺伝子工学的手法（ＰＣＲやサザンハイブリダイゼーション等）により、ＴＲＥＭ−１をコードするポリヌクレオチドを入手し、そのポリヌクレオチドを適切な発現系を用いて発現させることにより、様々な由来のＴＲＥＭ−１を得ることができる。
【００１３】
上記可溶性ＴＲＥＭ−１としては、
（１）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドや、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド（マウスＬＰ１７）；
（２）配列番号１におけるアミノ酸番号１〜１９４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（マウスｓＴＲＥＭ−１）；
（３）配列番号１におけるアミノ酸番号１〜１９４に示されるアミノ酸配列又は配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＴＲＥＭ−１阻害活性を有するポリペプチド（マウスｓＴＲＥＭ−１変異体）；
（４）配列番号１におけるアミノ酸番号１〜１９４のうち、アミノ酸番号１〜１０２及び１２０〜１９４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＴＲＥＭ−１阻害活性を有するポリペプチド（マウスｓＴＲＥＭ−１変異体）；
（５）配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドや、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド（ヒトＬＰ１７）；
（６）配列番号５におけるアミノ酸番号１〜２００に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヒトｓＴＲＥＭ−１）；
（７）配列番号５におけるアミノ酸番号１〜２００に示されるアミノ酸配列又は配列番号７に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＴＲＥＭ−１阻害活性を有するポリペプチド（ヒトｓＴＲＥＭ−１変異体）；
（８）配列番号５におけるアミノ酸番号１〜２００のうち、アミノ酸番号１〜１０２及び１２０〜２００に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＴＲＥＭ−１阻害活性を有するポリペプチド（ヒトｓＴＲＥＭ−１変異体）；
を例示することができ、中でも、マウスｓＴＲＥＭ−１やヒトｓＴＲＥＭ−１を好適に例示することができる。
【００１４】
また、安定性を向上させる観点から、これらの可溶性ＴＲＥＭ−１のＣ末端側に、リンカー配列（配列番号１におけるアミノ酸番号１９５〜１９９に示されるアミノ酸配列；配列番号５におけるアミノ酸番号２０１〜２０５に示されるアミノ酸配列）及びＩｇＧ１のＦｃ領域（配列番号１におけるアミノ酸番号２００〜４３０に示されるアミノ酸配列；配列番号５におけるアミノ酸番号２０６〜４３６に示されるアミノ酸配列）が付加されているポリペプチドを好ましく例示することができる。したがって、マウスやヒトのイムノグロブリン結合−可溶性ＴＲＥＭ−１（ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ）も膠原病の予防・治療剤として有利に用いることができる。なお、可溶性ＴＲＥＭ−１は、ＴＲＥＭ−１の天然リガンドをトラップすることにより、ＴＲＥＭ−１の機能を阻害すると考えられ、また、マウスＬＰ１７ポリペプチド（配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）がマウスＴＲＥＭ−１の機能を阻害することは、非特許文献７に開示されている。
【００１５】
上記ｓＴＲＥＭ−１変異体における「数個」としては、例えば２〜６０個、好ましくは２〜４０個、より好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜２０個、さらにより好ましくは２〜１０個、特に好ましくは２〜５個、最も好ましくは２〜３個を例示することができる。また、ｓＴＲＥＭ−１変異体のアミノ酸配列としては、配列番号１又は５におけるアミノ酸番号１〜１９４に示されるアミノ酸配列や、配列番号３又は７に示されるアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などを例示することができる。
【００１６】
上記の可溶性ＴＲＥＭ−１は、ＴＲＥＭ−１（膜型ＴＲＥＭ−１）のＣ末端の一部を欠失させること等により作製することができる。例えばマウスＴＲＥＭ−１の場合、Ｃ末端の３６アミノ酸を欠失させることにより可溶性ＴＲＥＭ−１（ｓＴＲＥＭ−１）を作製することができ、また、ヒトＴＲＥＭ−１の場合、Ｃ末端の３４アミノ酸を欠失させることにより可溶性ＴＲＥＭ−１（ｓＴＲＥＭ−１）を作製することができる。また、上記ｓＴＲＥＭ−１変異体は、化学合成によって作製することもできるし、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法を適用することにより作製することもできる。具体的には、配列番号２におけるヌクレオチド番号１〜５８２に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド（マウスｓＴＲＥＭ−１をコードするポリヌクレオチド）や、配列番号６におけるヌクレオチド番号１〜６００に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド（ヒトｓＴＲＥＭ−１をコードするポリヌクレオチド）や、他の生物由来のｓＴＲＥＭ−１ポリヌクレオチドに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらポリヌクレオチドに変異を導入し、この変異ポリヌクレオチドを適切な発現系を用いて発現させることにより、ｓＴＲＥＭ−１変異体を得ることができる。
【００１７】
上記のＴＲＥＭ−１アンタゴニストは、例えば、後述の本発明の膠原病の予防・治療剤のスクリーニング法等を利用することにより、適当な化合物ライブラリーから入手することができる。また、ＴＲＥＭ−１アンタゴニストが血しょう板上に存在することが示唆される報告（Blood. 110:1029-35）もあるため、血しょう板上に発現する物質を候補物質として用いることもできる。
【００１８】
上記可溶性ＴＲＥＭ−１発現ベクターとしては、いずれかの動物の生体内で、前述の可溶性ＴＲＥＭ−１を発現しうるものであれば特に制限されないが、いずれかの哺乳動物の生体内で前述の可溶性ＴＲＥＭ−１を発現する組換えベクター、好ましくは組換えウイルスベクターを挙げることができる。これら可溶性ＴＲＥＭ−１を発現する組換えベクターとして具体的には、
（１）配列番号４に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドや、該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドがインテグレートされた組換えベクター（マウスＬＰ１７ベクター）；
（２）配列番号２におけるヌクレオチド番号１〜５８２に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドがインテグレートされた組換えベクター（マウスｓＴＲＥＭ−１ベクター）；
（３）配列番号４に示されるヌクレオチド配列又は配列番号２におけるヌクレオチド番号１〜５８２に示されるヌクレオチド配列に相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＴＲＥＭ−１阻害活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがインテグレートされた組換えベクター（マウス変異ｓＴＲＥＭ−１ベクター）；
（４）配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドがインテグレートされた組換えベクター（安定型マウスｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇベクター）；
（５）配列番号８に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドや、該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドがインテグレートされた組換えベクター（ヒトＬＰ１７ベクター）；
（６）配列番号６におけるヌクレオチド番号１〜６００に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドがインテグレートされた組換えベクター（ヒトｓＴＲＥＭ−１ベクター）；
（７）配列番号８に示されるヌクレオチド配列又は配列番号６におけるヌクレオチド番号１〜６００に示されるヌクレオチド配列に相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＴＲＥＭ−１阻害活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがインテグレートされた組換えベクター（ヒト変異ｓＴＲＥＭ−１ベクター）；
（８）配列番号６に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドがインテグレートされた組換えベクター（安定型ヒトｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇベクター）；
を例示することができ、中でも、マウスｓＴＲＥＭ−１ベクター、安定型マウスｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇベクター、ヒトｓＴＲＥＭ−１ベクター、安定型ヒトｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇベクターを好適に例示することができる。
【００１９】
上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどのポリヌクレオチドをプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチド又はその断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第３版等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００２０】
すなわち、ストリジェントな条件下とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、５０〜７０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド（特にＤＮＡ）同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いポリヌクレオチド（特にＤＮＡ）同士がハイブリダイズしない条件あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６５℃、１× ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、又は０．１× ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件を挙げることができる。例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとしては、プローブとして使用するポリヌクレオチドの塩基配列と一定以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができ、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらにより好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを好適に例示することができる。
【００２１】
本発明の組換えベクター、好ましくは組換えウイルスベクターは、前述のｓＴＲＥＭ−１をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに適切にインテグレートすることにより構築することができる。発現ベクターとしては、投与対象である動物細胞において自立複製可能であるものや、あるいは前述の動物細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、ｓＴＲＥＭ−１を発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。発現ベクターとしては、動物細胞用発現ベクター、例えば、非分列細胞を含む全ての細胞（血球系以外）での一過性発現に用いられるアデノウイルスベクター（Science, 252, 431-434, 1991）や、分裂細胞での長期発現に用いられるレトロウイルスベクター（Microbiology and Immunology, 158, 1-23, 1992）や、非病原性、非分裂細胞にも導入可能で、長期発現に用いられるアデノ随伴ウイルスベクター（Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 97-129, 1992）などのウイルスベクターを挙げることができ、中でもアデノウイルスベクターを好適に例示することができる。本発明に用いることのできる発現ベクターの構築の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
【００２２】
本発明の膠原病の予防・治療剤は、ＴＲＥＭ−１阻害物質のみであってもよいし、摂取促進のための補助剤等の生理学的に認められる担体とともに製剤化したものであってもよい。また、ＴＲＥＭ−１阻害物質以外の膠原病の予防・治療剤を併用してもよい。
本発明の膠原病の予防・治療剤の剤型としては、特に制限されないが、錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤等の経口剤や、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液または懸濁液等の注射剤を例示することができ、ＴＲＥＭ−１阻害物質がＴＲＥＭ−１を発現する物質又は可溶性ＴＲＥＭ−１である場合は、注射剤を好適に例示することができる。注射剤の投与形態としては、静脈内投与や皮下投与を好適に例示することができる。
【００２３】
本発明の膠原病の予防・治療剤は、例えば、上述の本発明におけるＴＲＥＭ−１阻害物質を、生理学的に許容し得る担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定化剤、結合剤等とともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。錠剤、カプセル剤等に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴム等の結合剤、結晶性セルロース等の賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等の膨化剤、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリン等の甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリー等の香味剤等を用いることができる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂等の液状担体を含有することができる。注射剤は、本発明のポリペプチドを通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等を用いることができ、さらに、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（５０mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等を用いることができ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン等）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール等）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノール等）、酸化防止剤等を配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填することができる。投与量は、ＴＲＥＭ−１阻害物質の種類、患者の体重や年齢、投与方法等により変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
【００２４】
膠原病の予防・治療剤の投与対象としては、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等の哺乳動物を好適に例示することができる。
【００２５】
本発明の膠原病の予防・治療剤の対象となる膠原病としては、膠原病である限り特に制限されないが、関節リウマチ（ＲＡ）、痛風、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、シェーグレン症候群(ＳｊＳ)、全身性硬化症(ＳＳｃ)、多発性筋炎(ＰＭ)、皮膚筋炎(ＤＭ)、結節性多発性動脈炎(ＰＮ)、リウマチ熱(ＲＦ)、混合性結合組織病(mixed connective tissue disease; ＭＣＴＤ)、顕微鏡的多発血管炎(microscopic polyangitis; ＭＰＡ)、Wegener肉芽腫症(Wegener's granulomatosis; ＷＧ)、アレルギー性肉芽腫性血管炎(allergic granulomatous angitis; ＡＧＡ)、過敏性血管炎、ベーチェット病、コーガン症候群、ＲＳ３ＰＥを例示することができ、中でも、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、シェーグレン症候群(ＳｊＳ)を好適に例示することができる。
【００２６】
本発明の膠原病の予防・治療剤のスクリーニング法は、ＴＲＥＭ−１阻害物質を探索する工程を備えてなる。ＴＲＥＭ−１阻害物質を探索する工程として、例えば、被検物質存在下又は非存在下でＴＲＥＭ−１を含む細胞を培養し、培養上清中のＴＮＦα濃度を測定し、それらのＴＮＦα濃度を比較する工程を例示することができる。被検物質存在下でのＴＮＦα濃度が、被検物質非存在下のＴＮＦα濃度より低い場合は、その被検物質をＴＲＥＭ−１阻害物質と評価することができる。
【００２７】
本発明の膠原病の予防・治療方法は、本発明の膠原病の予防・治療剤を動物に投与する工程を備えてなる。動物としては、前述の哺乳動物を好適に例示することができる。また、本発明の膠原病の予防・治療剤以外の膠原病の予防・治療剤を併用してもよい。
【００２８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２９】
後述の実施例２〜７は、以下の１．〜１５．に記載の材料及び方法を用いて行った。
［材料及び方法］
１．試薬
ラット抗マウスＴＲＥＭ−１抗体、マウス抗ヒトＴＲＥＭ−１抗体、フィコエリトリン（ＰＥ）標識抗マウスＴＲＥＭ−１抗体、ＰＥ標識抗ヒトＴＲＥＭ−１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、抗マウスＩｇＧ１抗体、抗ラットＩｇＧ抗体、マウスＴＲＥＭ−１デュオセット（Duo set）、及びマウス腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）デュオセットは、R & D社（ミネソタ州ミネアポリス）から入手した。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ヒトＣＤ１４モノクローナル抗体は、Beckman-Coulter社（カリフォルニア州フラトン）から購入した。アロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識抗マウスＣＤ１１ｂモノクローナル抗体は、e-Bioscience社（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。ラビット抗ラットＩｇＧ抗体、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、及びジアミノベンジジン（Envision kit）はダコ・サイトメーション株式会社（Dako Cytomation Co. Ltd.）（京都府）から購入した。ヒトＴＮＦαに用いる特異的酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）用の試薬は、Biosource International社（カリフォルニア州カマリロ）から入手した。ＬＰＳ及びコラゲナーゼＡはSigma社（ミズーリ州セントルイス）から購入した。ＨＲＰで標識したラビット抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂの各抗体は、Zymed社（カリフォルニア州バーリンゲーム）から購入した。
【００３０】
２．細胞
ヒト滑膜組織は、信州大学及び国立下志津病院で全身人工関節置換術又は滑膜切除術を受ける関節リウマチ患者から得た。患者は手術前に同意書に署名した。なお、関節リウマチの診断は、米国リウマチ学会の基準に従って行った。
一方、マウスの滑膜組織は、コラーゲン関節炎（ＣＩＡ）マウスの膝関節から分離した。
ヒトやマウスの滑膜細胞は文献（Arthritis Rheum. 54:2074-2083； J Exp Med. 203:325-335）記載の方法により調製した。すなわち、滑膜組織を切除し、これを無血清ＤＭＥＭ中、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＡにより３７℃で１時間消化した。この滑膜組織消化物を懸濁し、ナイロンメッシュでろ過した。分離して得られた細胞を無血清ＤＭＥＭ中で３回洗浄した。
また、常在型腹腔マクロファージ（ＲＰＭ）は、非特許文献４に記載の方法により、ＤＢＡ１／Ｊ雄マウス（６〜８週齢）から単離した。
また、ヒトＰＢＭＣは、健常人から提供を受けたヘパリン添加末梢血についてフィコールパーク密度勾配遠心分離法を行うことによって単離した。
【００３１】
３．滑液中のｓＴＲＥＭ−１濃度の測定
滑液（ＳＦ）試料は、北里大学の関節リウマチ（ＲＡ）及び変形性関節炎（ＯＡ）の患者の炎症関節から得た。試料は全て、インフォームド・コンセントを得た上で提供を受けた。滑液中のｓＴＲＥＭ−１濃度は、常法である酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で測定した。
【００３２】
４．フローサイトメトリー
ヒト滑膜細胞又はＰＢＭＣについては、それをＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ１４モノクローナル抗体及びＰＥ標識抗ヒトＴＲＥＭ−１モノクローナル抗体で二重染色し、ゲーティングしたＣＤ１４細胞におけるＴＲＥＭ−１の発現を分析した。
また、マウスの滑膜細胞については、それをＡＰＣ標識抗マウスＣＤ１１ｂモノクローナル抗体及びＰＥ標識抗マウスＴＲＥＭ−１モノクローナル抗体で二重染色し、ゲーティングしたＣＤ１１ｂ細胞におけるＴＲＥＭ−１の発現を分析した。
全てのフローサイトメトリー実験においてＦＩＴＣ、ＰＥ又はＡＰＣで標識した適切なアイソタイプ対照モノクローナル抗体を使用した。データは、FACSCaliburを用いて採取し、CellQuestソフトウエア（BD Biosciences Immunocytometry Systems社、カリフォルニア州サンホセ）を使って分析した。
【００３３】
５．定量的リアルタイムＰＣＲ
定量的リアルタイムＰＣＲは、非特許文献４記載の方法により行った。すなわち、RNeasy Mini kit（Qiagen社、東京）を用いて細胞溶解物から全ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡをDNase I（Qiagen社）で処理し、Omniscript reverse transcriptase（Qiagen社）を使ってｃＤＮＡを合成した。特定のオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブを用いた定量的リアルタイムＰＣＲ（TaqMan社）によりｈＴＲＥＭ−１及びｒＲＮＡを調べた。TaqManＰＣＲは、QuantiTect Probe PCR（Qiagen社）で行った。７９００配列検出システムを用いて放出蛍光を定量分析することにより、ＰＣＲ増幅をリアルタイムでモニターした。対照試料の量を１任意ユニットとし、各ｍＲＮＡ試料を対照試料量に対して相対的に定量した。
【００３４】
６．免疫組織化学的解析
免疫組織化学的解析は、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）で包埋した凍結滑膜試料の切片を用いて行った。すなわち、８μｍ厚のクリオスタット切片を４％パラホルムアルデヒド中で２０分間固定し、その後試料をＰＢＳ中に５分間ずつ３回浸漬した。次いで、その試料中の組織切片を、１．５％Ｈ２Ｏ２を含むＰＢＳ中で１５分間、次に５％正常ウサギ血清を含むＰＢＳ中で３０分間処理した。ウサギ抗ＴＲＥＭ−１抗体とアイソタイプ適合対照抗体としての正常ウサギＩｇＧとを一次抗体として２５μｇ／ｍｌ含む５％正常ウサギ血清／ＰＢＳ中において、連続切片を４℃で一晩インキュベートした。次に試料を５分間２回の条件下ＰＢＳ中で洗浄し、製造者マニュアルに従い、ジアミノベンジジンで処理した。次いで、切片をヘマトキシリンで５秒間対比染色し、水道水で１０分間洗浄した。
【００３５】
７．サイトカイン産生アッセイ
５μｇ／ｍｌの抗ヒトＴＲＥＭ−１モノクローナル抗体、抗マウスＴＲＥＭ−１モノクローナル抗体、又はアイソタイプ適合対照抗体（ＩｇＧ抗体）を、平底プレートに４℃で一晩プレコーティングした。この平底プレートの各ウエルに、ＰＢＳで洗浄した細胞を１×１０５細胞／ウエルずつ添加し、これを１２００ｒｐｍで短時間遠心分離して、ＴＲＥＭ−１を抗体に結合させた。２４時間インキュベーションした後、遠心分離して培養培地を分取し、培養培地上清中のＴＮＦα濃度を特異的ＥＬＩＳＡで測定するまで−２０℃で保存した。
なお、前述の抗ヒトＴＲＥＭ−１モノクローナル抗体、抗マウスＴＲＥＭ−１モノクローナル抗体は、それぞれヒトＴＲＥＭ−１、マウスＴＲＥＭ−１に対してアゴニスティックに作用する性質も有しており、以下、「抗ＴＲＥＭ−１アゴニスト抗体」ともいう。
【００３６】
８．組換えアデノウイルス
マウスｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ遺伝子（配列番号１）を含む複製欠損アデノウイルス（以下、「ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ」ともいう。）又はＬａｃＺ遺伝子を含む複製欠損アデノウイルス（以下、「ＡｘＣＡ−ＬａｃＺ」ともいう。）は、それぞれ文献（Arthritis Rheum. 54:2074-2083）記載の方法により調製した。すなわち、組換えアデノウイルスをＨＥＫ２９３細胞中で増殖させて、高力価の組換えアデノウイルスを調製し、塩化セシウム密度勾配遠心法でＨＥＫ２３９細胞中から組換えアデノウイルスを精製した。
【００３７】
９．ＴＲＥＭ−１阻害活性のバイオアッセイ
ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇが発現するｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇが生物活性を有していることを示すため、ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ又はＡｘＣＡ−ＬａｃＺを感染させたＮＩＨ／３Ｔ３細胞の培養上清を用いてＴＲＥＭ−１の阻害活性を調べた。感染３日後にこれらの細胞の上清を回収した。各上清を連続希釈し、抗マウスＴＲＥＭ−１モノクローナル抗体（抗ＴＲＥＭ−１アゴニスト抗体）をプレコーティングした別々のウエルにおいて各希釈液５０μｌを３７℃でインキュベートした。インキュベート開始から１５分後、各ウエルにＲＰＭ（ＴＲＥＭ−１発現細胞）を１×１０５細胞で加えた。ＲＰＭの添加開始から２４時間インキュベートした後、培養培地を得、培養培地の上清中のＴＮＦα濃度をＥＬＩＳＡで測定した。
【００３８】
１０．血清中のｓＴＲＥＭ−１濃度
ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇを静脈内投与した後の血清中のｓＴＲＥＭ−１濃度を調べるため、０日目に１０９ｐｆｕのＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ又はＡｘＣＡ−ＬａｃＺを非免疫マウスに投与した。アデノウイルス投与の０日後、２日後、４日後及び７日後にマウスから血液試料を採取し、それを−２０℃で保存した。保存した血液試料についてＥＬＩＳＡを行い、血清中のｓＴＲＥＭ−１濃度を測定した。
【００３９】
１１．ＣＩＡ誘導及び関節炎の臨床評価
ＤＢＡ／１Ｊ雄マウスを日本チャールズ・リバー・ブリージング・ラボラトリーズ（東京）から購入し、東京医科歯科大学の動物実験施設で飼育した。８週齢のＤＢＡ／１Ｊ雄マウスの尾底部皮内に、ウシコラーゲンII型（ＣII）２００μｇを含むＣＦＡ（フロインドの完全アジュバンド）を投与して免疫した（初回免疫）。初回免疫の２１日後、同様にしてこれらマウスに２回目の免疫を行い（０日目）、以下のスコアリング法にしたがってマウスの各肢の疾患重症度を記録した。
スコアリング法； ０＝正常： １＝一箇所の関節に軽度の腫脹： ２＝二箇所の関節に軽度の腫脹： ３＝足又は指に重度の腫脹： ４＝足及び指全体に重度の腫脹。
関節の腫脹は、後肢の厚さと足首の幅をマイクロメーター（株式会社岡崎製作所、東京）で測定して数値化した。
次に、マウスの関節について組織学的検査を行うために、２回目の免疫の１４日後にコラーゲン関節炎（ＣＩＡ）マウスを屠殺した。このマウスの膝関節を切り取り、それを１０％緩衝ホルマリン中に固定し、１０％ＥＤＴＡで脱灰し、パラフィンに包埋した。包埋した膝関節の切片（４μｍ厚）をヘマトキシリン及びエオシンで染色し、組織学的検査を行った。炎症細胞の浸潤、滑膜内膜の変性（transformation of synovial lining）、軟骨破壊、及びパンヌス形成をそれぞれ上述のスコアリング法にしたがって０〜３でスコアリングした。組織学的スコアの最高点は１２点であった。
【００４０】
１２．インビボでの遺伝子導入
２回目の免疫の２日後及び９日後に、１０８ｐｆｕ又は１０９ｐｆｕのＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ（サンプル数：ｎ＝８）又はＡｘＣＡ−ＬａｃＺ（サンプル数：ｎ＝８）を含むＰＢＳ１００μｌをマウスに静脈内投与した。
【００４１】
１３．ウシII型コラーゲン（ＣII）特異的抗体の検出
マウス血清中のＣII特異的抗体は、ＥＬＩＳＡで測定した。具体的には、以下のような方法で測定した。
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で沸騰させることによって変性させた２μｇ／ｍｌのウシII型コラーゲンで、平底プレートをコーティングした。このプレートを０．０５％Tween 20を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で洗浄し、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳでブロッキングし、１０００倍希釈したマウス血清とインキュベートした。２％ＢＳＡを含むＰＢＳＴ中で、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Zymed社、カリフォルニア州バーリンゲーム）で標識したウサギ抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂの各抗体とインキュベートすることにより、陽性反応を検出した。最終反応は、TMB Microwell Peroxidase Substrate System（ＫＰＬ社、メリーランド州ゲイサーズバーグ）を用いて視覚化した。吸光度は、４５０ｎｍにて測定した。関節炎マウス又は非関節炎マウスから得たプール血清から作製した標準血清を用いて、ＣII特異的抗体ユニットを測定した。関節炎マウスの血清の４０倍希釈物を１０００ユニット／ｍｌ値とした。
【００４２】
１４．ＣII特異的Ｔ細胞の増殖
２回目の免疫の１４日後、各グループのマウスから脾細胞を単離した。これらの脾細胞（５×１０５個）を、ペニシリン／ストレプトマイシン及び１０％ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ１６４０倍地において変性ＣII（０〜１００μｇ／ｍｌ）で刺激しながら培養した。７２時間の培養期間の最後の１６時間、培養物を［３Ｈ］チミジン（０．０３７ＭＢｑ／ウエル）と共に培養し、脾細胞をマイクロ９６ハーベスター（PerkinElmer社、横浜）上に回収して増殖反応を評価した。マイクロプレートベータカウンター（「MicroβPlus」；PerkinElmer社）により、取り込まれた放射線を測定した。
【００４３】
１５．統計方法
各実験の結果は、平均±標準偏差（ＳＤ）で表した。統計分析にはマン・ ホイットニーのＵテストを用い、ｐ＜０．０５の場合を有意差有りとした。
【実施例２】
【００４４】
［滑液におけるヒトｓＴＲＥＭ−１及び関節リウマチの滑膜細胞におけるヒト膜結合型ＴＲＥＭ−１の検出］
（１）滑液中のｓＴＲＥＭ−１濃度の測定結果
ｓＴＲＥＭ−１及び膜結合型ＴＲＥＭ−１が細菌感染症で多量に認められることを報告する文献は何件かあるが（Nature. 410:1103-1107； N Engl J Med. 350:451-458）、関節リウマチにおけるｓＴＲＥＭ−１やＴＲＥＭ−１の発現は示されていなかった。そこで、関節リウマチにおけるｓＴＲＥＭ−１濃度を調べるため、関節リウマチ（ＲＡ）患者２３名及び変形性関節炎（ＯＡ）患者９名の滑液中のｓＴＲＥＭ−１濃度を、上記実施例１に記載された「滑液中のｓＴＲＥＭ−１濃度の測定」の方法にしたがって、ＥＬＩＳＡにより測定した。その結果を図１のＡに示す。図１のＡの結果から分かるように、ＲＡ患者の滑液中のｓＴＲＥＭ−１濃度は１７６３．２±１１８０．２ｐｇ／ｍｌであったのに対し、ＯＡ患者の滑液中のｓＴＲＥＭ−１濃度は１６２．２±２２０．２ｐｇ／ｍｌであり、ＲＡ患者の滑液中のｓＴＲＥＭ−１濃度はＯＡ患者のそれと比較して有意に高かった。このことから、ｓＴＲＥＭ−１は、炎症のないＯＡよりも、炎症を伴うＲＡにおいて高発現していることが示された。
【００４５】
（２）ヒト滑膜細胞におけるフローサイトメトリーの結果
次に、上記実施例２（１）におけるＲＡ患者のうち３名の滑膜細胞について、ＴＲＥＭ−１の発現の有無を調べるため、上記実施例１に記載された「フローサイトメトリー」の方法にしたがって、フローサイトメトリー解析を行った。具体的には、ＲＡ患者から採取した滑膜細胞の単一細胞懸濁液を、ＴＲＥＭ−１及びＣＤ１４（マクロファージマーカー）について二重染色し、ＴＲＥＭ−１を発現する滑膜細胞の解析を行った。その結果を図１のＢに示す。図１のＢの結果から分かるように、ＲＡ患者の炎症滑膜組織においてＣＤ１４を発現するマクロファージは、ＴＲＥＭ−１の発現を示した。このことから、滑膜組織中の浸潤マクロファージにおいてＴＲＥＭ−１が発現していることが示された。
【００４６】
（３）ヒト滑膜細胞におけるサイトカイン産生アッセイの結果
ＴＲＥＭ−１の発現に起因すると考えられる結果を直接調べるため、上記実施例２（１）におけるＲＡ患者の全滑膜細胞のＴＲＥＭ−１を、上記実施例１に記載された「サイトカイン産生アッセイ」の方法にしたがって、抗ＴＲＥＭ−１モノクローナル抗体（抗ＴＲＥＭ−１アゴニスト抗体）で２４時間刺激し、培養上清中の炎症性サイトカイン（ＴＮＦα）濃度をＥＬＩＳＡで測定した。その結果を図１のＣに示す。ＴＮＦαの分泌自体は、ＲＡの炎症関節から得た滑膜細胞で既に検出されていたが、図１のＣの結果から分かるように、抗ＴＲＥＭ−１アゴニスト抗体によるＴＲＥＭ−１の架橋によって、ＴＮＦαの分泌は、ＩｇＧ抗体（コントロール抗体）で刺激した場合と比較して、有意に高かった。このことから、ＴＲＥＭ−１を介した炎症プロセスが増大することにより、関節リウマチ患者の疾患が悪化し、組織破壊が進行することが示された。
【実施例３】
【００４７】
［コラーゲン関節炎（ＣＩＡ）マウスの滑膜細胞におけるマウスＴＲＥＭ−１の発現］
（１）ＣＩＡマウスの滑膜細胞に対する免疫組織化学的解析の結果
骨髄細胞でのＴＲＥＭ−１発現が、滑膜組織での炎症反応に寄与するかどうかを調べるため、ＣＩＡマウスの滑膜組織におけるマウスＴＲＥＭ−１の発現を、上記実施例１に記載された「免疫組織化学的解析」の方法により調べた。その結果を図２のＡ〜Ｃに示す。図２のＡ〜Ｃの結果から分かるように、ＴＲＥＭ−１を発現する細胞（単核球）が、炎症滑膜組織で豊富に認められた（図２のＣ）。
【００４８】
（２）ＣＩＡマウスの滑膜細胞に対するフローサイトメトリー分析の結果
次に、ＣＩＡマウスの炎症骨膜組織においてＴＲＥＭ−１が発現しているかどうかを調べるため、上記実施例１に記載された「ＣＩＡ誘導及び関節炎の臨床評価」の方法にしたがってＣＩＡ誘導したマウスについて、「フローサイトメトリー」の方法にしたがったフローサイトメトリー解析を行った。具体的には、ＣＩＡマウスから採取した滑膜細胞の単一細胞懸濁液を、ＴＲＥＭ−１及びＣＤ１１ｂ（マクロファージマーカー）について二重染色し、ＴＲＥＭ−１を発現する滑膜細胞の解析を行った。その結果を図２のＤに示す。図２のＤの結果から分かるように、ＣＩＡマウスの炎症滑膜組織においてＣＤ１１ｂを発現するマクロファージのほとんどは、ＴＲＥＭ−１の発現を示した。特に、初期炎症関節（２回目のコラーゲン免疫から７日後）におけるＴＲＥＭ−１の発現レベル（Ｄａｙ７）は、慢性炎症関節（２回目のコラーゲン免疫から１６日後）の場合（Ｄａｙ１６）に比べ高かった。このことから、ＴＲＥＭ−１は、慢性炎症関節よりも初期炎症関節において重要な役割を担っていることが示された。
【実施例４】
【００４９】
［インビボでのｓＴＲＥＭ−１の発現量、及び、インビトロでのＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇの生物活性］
（１）マウス血清中のｓＴＲＥＭ−１濃度測定の結果
ＣＩＡにおいてＴＲＥＭ−１を阻害することによる治療効果を調べるため、まず、ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ遺伝子を含む組換えアデノウイルス（ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ）を、上記実施例１に記載された「組換えアデノウイルス」の方法にしたがって構築した。
次に、ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇをマウスに投与した場合に、インビボにおいてｓＴＲＥＭ−１が実際に発現するかを調べるため、上記実施例１に記載された「血清中のｓＴＲＥＭ−１濃度」の方法にしたがって、マウス血清中のｓＴＲＥＭ−１の濃度をＥＬＩＳＡで測定した。その結果を図３のＡに示す。図３のＡの結果から分かるように、ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇの静脈内投与の２日後に、ｓＴＲＥＭ−１濃度が最大値を示し、それ以降７日目まで徐々に減少した。
一方、ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇに代えてＡｘＣＡ−ＬａｃＺを投与したマウスでは、血清中のｓＴＲＥＭ−１濃度の上昇は見られなかった（データは示さず）。
これらの結果から、ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇの静脈内投与により、ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇがインビボで効率的に産生されることが示された。
【００５０】
（２）ＴＲＥＭ−１阻害活性のバイオアッセイの結果
ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇが発現するｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇが生物活性を有しているかを確認するために、上記実施例１に記載された「ＴＲＥＭ−１阻害活性のバイオアッセイ」の方法にしたがって実験を行った。すなわち、ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇに感染させたＮＩＨ／３Ｔ３細胞中のｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇを含む培養上清が、抗ＴＲＥＭ−１アゴニスト抗体で刺激した常在型腹腔マクロファージ（ＲＰＭ）によるＴＮＦα産生に対して及ぼす効果を調べた。その結果を図３のＢに示す。図３のＢの結果から分かるように、ＡｘＣＡ−ＬａｃＺを感染させた細胞の培養上清（ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇを含まない）を添加した場合は、その添加量にかかわらずＴＮＦαの産生は阻害されなかった。それに対し、ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇを感染させたＮＩＨ／３Ｔ３細胞の培養上清（ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇを含む）を添加した場合は、ＴＮＦαの産生が著しく阻害され、また、その阻害の程度は培養上清の添加量に依存的であって、ｓＴＲＥＭ−１の濃度が３２０ｐｇ／ｍｌのときにＴＮＦαの産生は完全に阻害された。
これらの結果から、ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇの発現産物であるｓＴＲＥＭ−１−ＩＧが生物活性（炎症の抑制効果）を有していることが示された。
【実施例５】
【００５１】
［コラーゲン関節炎（ＣＩＡ）におけるｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ遺伝子導入による関節炎の抑制］
（１）ＣＩＡ誘導及び関節炎の臨床評価の結果
ＣＩＡにおけるＴＲＥＭ−１の病態生理学的機能を調べるため、上記実施例１に記載された「ＣＩＡ誘導及び関節炎の臨床評価」の方法にしたがって、マウスにＣＩＡを誘導し、さらに、上記実施例１に記載された「インビボでの遺伝子導入」の方法にしたがってそのマウスにＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇを導入してＴＲＥＭ−１の関与を阻害することによって、ＣＩＡの病態にどのような影響が見られるかを調べた。ＣＩＡマウスの関節炎の組織学的スコアの経時的推移を図４のＡに、ＣＩＡマウスの足首幅の経時的推移を図４のＢに、ＣＩＡマウスの後肢の厚さの経時的推移を図４のＣに示す。図４のＡ〜Ｃの結果から分かるように、１×１０９ｐｆｕのＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇを静脈内投与した場合は、ＡｘＣＡ−ＬａｃＺ（コントロール）を投与した場合に比べ、関節炎の進行が著しく抑制された。また、１×１０８ｐｆｕのＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇを静脈内投与した場合は、１×１０９ｐｆｕ投与した場合ほどではないが、コントロールに対して有意に関節炎が抑制された。すなわち、ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇは、投与量依存的に関節炎を阻害することが明らかとなった。これらの知見から、ＴＲＥＭ−１がＣＩＡの進行に大きな役割を担っていることが示され、ＴＲＥＭ−１を阻害することが関節炎の治療に有用である可能性が極めて高いことが判明した。
【００５２】
（２）ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇで処理されたマウスのＣＩＡの組織学的評価の結果
上記実施例５の（１）においてＣＩＡ誘導及びＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ導入されたマウスの関節の病変を組織学的に評価するため、２回目の免疫の１６日後にＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ又はＡｘＣＡ−ＬａｃＺ（コントロール）を導入したマウスの膝関節の切片を用意し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。その観察結果を図５のＡ（ＡｘＣＡ−ＬａｃＺ導入マウス）及びＢ（ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ導入マウス）に示す。図５のＡ及びＢから分かるように、ＡｘＣＡ−ＬａｃＺ導入マウスの関節は、炎症細胞の顕著な浸潤、滑膜内膜の変性、軟骨破壊、及びパンヌス形成という４つのパラメーター全てにおいてコラーゲン関節炎に特有の特徴を示した。それに対して、ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ導入マウスの関節では、炎症細胞の浸潤が顕著に減少し、内膜の過形成や骨及び軟骨の破壊の程度も低かった。
【００５３】
ＡｘＣＡ−ＬａｃＺ導入マウス、及び、ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ導入マウスの関節における上記の４つのパラメーターを０〜３（０，正常； １，軽微； ２，軽度； ３，重篤）の４段階でそれぞれ評価した。その観察結果を図５のＣに示す。図５のＣの結果から分かるように、ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ導入マウスの各パラメーターのスコアは、ＡｘＣＡ−ＬａｃＺ導入マウスのスコアに比べ、著しく低かった。これらの結果から、ＴＲＥＭ−１シグナル伝達がコラーゲン関節炎における関節の炎症及び破壊の促進に関与していることが示唆された。
【実施例６】
【００５４】
［Ｔ細胞応答に対するｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ遺伝子導入の効果］
（１）ウシII型コラーゲン（ＣII）特異的Ｔ細胞の増殖の結果
インビボでのＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ導入により、ＣIIに対するＴ細胞性免疫が影響されるかどうかを調べるため、上記実施例５の（１）においてＣＩＡ誘導及びＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ導入されたマウスの脾細胞におけるＴ細胞の増殖を、上記実施例１に記載された「ＣII特異的Ｔ細胞の増殖」の方法にしたがって、インビトロで測定した。すなわち、ＣＩＡ誘導マウスの２回目の免疫の２日後及び９日後に各種のアデノウイルス（ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ又はＡｘＣＡ−ＬａｃＺ）を導入し、１６日目にグループ毎に４個の脾臓を取り出し、II型コラーゲンと共培養した。その観察結果を図６のＡに示す。図６のＡの結果から分かるように、１０８ｐｆｕのＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ、１０９ｐｆｕのＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ、又は、ＡｘＣＡ−ＬａｃＺ（コントロール）を導入した各グループの増殖応答に有意な違いは観察されなかった。この結果から、ＴＲＥＭ−１を阻害しても抗原特異的Ｔ細胞応答は損なわれないことが示された。
【実施例７】
【００５５】
［Ｂ細胞応答に対するｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ遺伝子導入の効果］
（１）ウシII型コラーゲン（ＣII）特異的抗体の検出の結果
II型コラーゲンに対する液性免疫応答に及ぼすＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇの効果を調べるため、上記実施例１に記載された「ウシII型コラーゲン（ＣII）特異的抗体の検出」の方法にしたがって、２回目の免疫から１６日目に、１０８ｐｆｕ若しくは１０９ｐｆｕのＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ導入マウス又はＡｘＣＡ−ＬａｃＺ導入マウスから採血し、血清中の抗ＣII抗体（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ）について分析した。その結果を図６のＢに示す。図６のＢの結果から分かるように、上記の３つのマウス群の間に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂの各抗ＣII抗体の血中抗体価に有意な差異は観察されなかった。さらに、これらの抗ＣII抗体の抗体価は、２回目の免疫から０日目の時点においても有意な違いはなかった（データは示さず）。これらの結果から、ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇで処理してもコラーゲン関節炎における抗ＣII抗体の産生は損なわれないことが示された。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】Ａ：関節リウマチ（ＲＡ）又は変形性関節炎（ＯＡ）患者の滑液中のｓＴＲＥＭ−１濃度を特異的ＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す図である。Ｂ：ＲＡ患者の滑膜細胞を、ＴＲＥＭ−１及びＣＤ１４（マクロファージマーカー）について二重染色した結果を示す図である。Ｃ：ＲＡ患者の全滑膜細胞のＴＲＥＭ−１を、抗ＴＲＥＭ−１アゴニスト抗体で２４時間刺激し、培養上清中の炎症性サイトカイン（ＴＮＦα）濃度をＥＬＩＳＡで測定した結果を示す図である。なお、＊は、ｐ＜０．０１であることを示し、＊＊は、ｐ＜０．００１であることを示す。
【図２】Ａ〜Ｃ：ＣＩＡマウスの滑膜細胞に対する免疫組織化学的解析の結果を示す図である。Ａはヘマトキシリン・エオシン染色した図、Ｂはアイソタイプ適合対照抗体としての正常ウサギＩｇＧ抗体で染色した図、Ｃはラット抗マウスＴＲＥＭ−１抗体で染色した図である。Ｄ：ＣＩＡマウスの滑膜細胞を、ＴＲＥＭ−１及びＣＤ１１ｂについて二重染色した結果を示す図である。
【図３】Ａ：ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇを投与したマウスの血清中のｓＴＲＥＭ−１濃度をＥＬＩＳＡを用いて経時的に測定した結果を示す図である。Ｂ：ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇの発現産物であるｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇが、抗ＴＲＥＭ−１アゴニスト抗体で刺激した常在型腹腔マクロファージ（ＲＰＭ）によるＴＮＦα産生に対してどのような効果を奏するかを調べた結果を示す図である。
【図４】Ａ：２回目の免疫を行った後のＣＩＡマウスにＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇを導入した場合の関節炎の組織学的スコアの経時的推移を示す図である。Ｂ：２回目の免疫を行った後のＣＩＡマウスにＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇを導入した場合のマウスの足首幅の経時的推移を示す図である。Ｃ：２回目の免疫を行った後のＣＩＡマウスにＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇを導入した場合の後肢の厚さの経時的推移を示す図である。なお、＊は、ｐ＜０．０５であることを示し、＊＊は、ｐ＜０．０１であることを示す。
【図５】Ａ：ＣＩＡ誘導及びＡｘＣＡ−ＬａｃＺ（コントロール）導入されたマウスの膝関節の切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色した結果を示す図である。Ｂ：ＣＩＡ誘導及びＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ導入されたマウスの膝関節の切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色した結果を示す図である。Ｃ：ＣＩＡ誘導及びＡｘＣＡ−ＬａｃＺ（コントロール）導入されたマウスの膝関節、並びに、ＣＩＡ誘導及びＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ導入されたマウスの膝関節の関節炎の組織学的スコアを示す図である。
【図６】Ａ：ＣＩＡ誘導及びＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ導入されたマウスの脾細胞におけるＴ細胞の増殖を示す図である。Ｂ：ＡｘＣＡ−ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ導入マウスの血清中の抗ＣII抗体（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ）について分析した結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＲＥＭ−１阻害物質を含有してなる膠原病の予防・治療剤。
【請求項２】
ＴＲＥＭ−１阻害物質が、可溶性ＴＲＥＭ−１又は可溶性ＴＲＥＭ−１発現ベクターである請求項１に記載の膠原病の予防・治療剤。
【請求項３】
可溶性ＴＲＥＭ−１が、配列番号１におけるアミノ酸番号１〜１９４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号５におけるアミノ酸番号１〜２００に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号３若しくは７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号３若しくは７に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである請求項２に記載の膠原病の予防・治療剤。
【請求項４】
可溶性ＴＲＥＭ−１が、配列番号１におけるアミノ酸番号１〜１９４に示されるアミノ酸配列、配列番号５におけるアミノ酸番号１〜２００に示されるアミノ酸配列、及び、配列番号３又は７に示されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＴＲＥＭ−１阻害活性を有するポリペプチドである請求項２に記載の膠原病の予防・治療剤。
【請求項５】
ＴＲＥＭ−１阻害物質が、イムノグロブリン結合−可溶性ＴＲＥＭ−１（ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ）である請求項１に記載の膠原病の予防・治療剤。
【請求項６】
イムノグロブリン結合−可溶性ＴＲＥＭ−１（ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ）が、配列番号１又は５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである請求項５に記載の膠原病の予防・治療剤。
【請求項７】
可溶性ＴＲＥＭ−１発現ベクターが、配列番号２におけるヌクレオチド番号１〜５８２に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号６におけるヌクレオチド番号１〜６００に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号４又は８に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、及び、配列番号４又は８に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドから選ばれるポリヌクレオチドを含む組換えベクターである請求項２に記載の膠原病の予防・治療剤。
【請求項８】
可溶性ＴＲＥＭ−１発現ベクターが、配列番号２におけるヌクレオチド番号１〜５８２に示されるヌクレオチド配列、配列番号６におけるヌクレオチド番号１〜６００に示されるヌクレオチド配列、及び、配列番号４又は８に示されるヌクレオチド配列から選ばれるヌクレオチド配列に相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＴＲＥＭ−１阻害活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターである請求項２に記載の膠原病の予防・治療剤。
【請求項９】
可溶性ＴＲＥＭ−１発現ベクターが、可溶性ＴＲＥＭ−１を発現する組換えウイルスベクターである請求項７又は８に記載の膠原病の予防・治療剤。
【請求項１０】
膠原病が、関節リウマチである請求項１〜９のいずれかに記載の膠原病の予防・治療剤。
【請求項１１】
ＴＲＥＭ−１阻害物質を探索する工程を備えてなる、膠原病の予防・治療剤のスクリーニング法。
【請求項１２】
ＴＲＥＭ−１阻害物質を探索する工程が、被検物質存在下又は非存在下でＴＲＥＭ−１を含む細胞を培養し、培養上清中のＴＮＦα濃度を測定し、それらのＴＮＦα濃度を比較する工程であることを特徴とする請求項１１に記載の膠原病の予防・治療剤のスクリーニング法。
【請求項１】
ＴＲＥＭ−１阻害物質を含有してなる膠原病の予防・治療剤。
【請求項２】
ＴＲＥＭ−１阻害物質が、可溶性ＴＲＥＭ−１又は可溶性ＴＲＥＭ−１発現ベクターである請求項１に記載の膠原病の予防・治療剤。
【請求項３】
可溶性ＴＲＥＭ−１が、配列番号１におけるアミノ酸番号１〜１９４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号５におけるアミノ酸番号１〜２００に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号３若しくは７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号３若しくは７に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである請求項２に記載の膠原病の予防・治療剤。
【請求項４】
可溶性ＴＲＥＭ−１が、配列番号１におけるアミノ酸番号１〜１９４に示されるアミノ酸配列、配列番号５におけるアミノ酸番号１〜２００に示されるアミノ酸配列、及び、配列番号３又は７に示されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＴＲＥＭ−１阻害活性を有するポリペプチドである請求項２に記載の膠原病の予防・治療剤。
【請求項５】
ＴＲＥＭ−１阻害物質が、イムノグロブリン結合−可溶性ＴＲＥＭ−１（ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ）である請求項１に記載の膠原病の予防・治療剤。
【請求項６】
イムノグロブリン結合−可溶性ＴＲＥＭ−１（ｓＴＲＥＭ−１−Ｉｇ）が、配列番号１又は５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである請求項５に記載の膠原病の予防・治療剤。
【請求項７】
可溶性ＴＲＥＭ−１発現ベクターが、配列番号２におけるヌクレオチド番号１〜５８２に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号６におけるヌクレオチド番号１〜６００に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号４又は８に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、及び、配列番号４又は８に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドから選ばれるポリヌクレオチドを含む組換えベクターである請求項２に記載の膠原病の予防・治療剤。
【請求項８】
可溶性ＴＲＥＭ−１発現ベクターが、配列番号２におけるヌクレオチド番号１〜５８２に示されるヌクレオチド配列、配列番号６におけるヌクレオチド番号１〜６００に示されるヌクレオチド配列、及び、配列番号４又は８に示されるヌクレオチド配列から選ばれるヌクレオチド配列に相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＴＲＥＭ−１阻害活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターである請求項２に記載の膠原病の予防・治療剤。
【請求項９】
可溶性ＴＲＥＭ−１発現ベクターが、可溶性ＴＲＥＭ−１を発現する組換えウイルスベクターである請求項７又は８に記載の膠原病の予防・治療剤。
【請求項１０】
膠原病が、関節リウマチである請求項１〜９のいずれかに記載の膠原病の予防・治療剤。
【請求項１１】
ＴＲＥＭ−１阻害物質を探索する工程を備えてなる、膠原病の予防・治療剤のスクリーニング法。
【請求項１２】
ＴＲＥＭ−１阻害物質を探索する工程が、被検物質存在下又は非存在下でＴＲＥＭ−１を含む細胞を培養し、培養上清中のＴＮＦα濃度を測定し、それらのＴＮＦα濃度を比較する工程であることを特徴とする請求項１１に記載の膠原病の予防・治療剤のスクリーニング法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１１−９３８０６（Ｐ２０１１−９３８０６Ａ）
【公開日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３９２９２（Ｐ２００８−３９２９２）
【出願日】平成２０年２月２０日（２００８．２．２０）
【出願人】（５０４１７９２５５）国立大学法人 東京医科歯科大学 (228)
【出願人】（０００００２９５６）田辺三菱製薬株式会社 (225)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月２０日（２００８．２．２０）
【出願人】（５０４１７９２５５）国立大学法人 東京医科歯科大学 (228)
【出願人】（０００００２９５６）田辺三菱製薬株式会社 (225)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]