薬理シャペロンを用いるファブリー病の治療方法
本発明は、α−ガラクトシダーゼＡの特異的薬理シャペロンの投与後に、ファブリー病に関連する代理マーカーの改善が存在するか否かを判定することによる、ファブリー病患者の治療方法を提供する。この方法には、個体に対して有効量の１−デオキシガラクトノジリマイシンを投与するステップが含まれ、ここで１−デオキシガラクトノジリマイシンは、α−ガラクトシダーゼＡの活性を増大させるために有効な量でα−ガラクトシダーゼＡに結合している。本発明は同様に、患者に由来する細胞の細胞質染色パターンに対する効果を評価することによってα−ガラクトシダーゼＡの特異的薬理シャペロンの投与後のファブリー病患者の治療応答を監視し増大させる方法であって、健常な個体に由来する細胞内の染色パターンに類似する細胞内の染色パターンの検出が、ファブリー病を患う個体が応答者であることの標示である方法も提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、全体が参照により本明細書に援用されている２００７年３月３０日出願の米国仮特許出願第６０／９０９，１８５号明細書に対する優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、α−ガラクトシダーゼＡ活性を少なくとも３倍回復させること、そしてより詳細にはその活性を正常範囲内のレベルまで回復させることによりファブリー病を治療する方法を提供する。さらに本発明は、特異的代理マーカーの存在および／または数量の変化を評価することによりファブリー病を患う個体の特異的薬理シャペロンを用いた治療を監視するための方法を提供する。本発明は同様に、細胞内レベルで治療の効果を評価することによりファブリー病を患う個体の特異的薬理シャペロンを用いた治療を監視するための方法をも提供する。
【背景技術】
【０００３】
ファブリー病は、スフィンゴ糖脂質類からの末端α−ガラクトシル残基の加水分解を担う酵素であるリソソームα−ガラクトシダーゼＡ（α−ＧａｌＡ）のＸ連鎖性遺伝的欠損によってひき起こされるスフィンゴ糖脂質（ＧＳＬ）蓄積症である。酵素活性欠損の結果として、中性スフィンゴ糖脂質、主にグロボトリアオシルセラミド（セラミド・トリヘキソシド、ＣＴＨ、ＧＬ−３）が血管内皮細胞中に漸進的に被着し、この身体条件を有する患者において腎不全と共に早期心筋梗塞および卒中がひき起こされる。この障害は、臨床所見によって、全身性血管障害を伴う古典的な形態、そして臨床所見が心臓組織に限定されている非定型的形態（ａｔｙｐｉｃａｌ ｖａｒｉａｎｔ ｆｏｒｍ）という２つのグループに分類される。
【０００４】
疾病の頻度は、男性では約１：４０，０００と推定され、異なる民族集団において世界中で報告されている。古典型に罹患した男性において、臨床所見には角化血管膜（皮膚の小さい隆起した赤みがかった紫色の染み）、肢端感覚異常（手足の灼熱感）、発汗低下症（発汗能力の低下）および特徴的な角膜および水晶体混濁が含まれる（非特許文献１）。脂質蓄積は、動脈の循環を損ない心臓発作または卒中のリスクを増大させることになる可能性がある。心臓が肥大する可能性もあり、徐々に腎臓にも影響が及び得る。その他の症候としては、特に飲食後の発熱および胃腸障害が含まれる。一部の女性キャリヤが症候を示すこともある。
【０００５】
罹患した男性の推定寿命は短くなり、心臓、脳および／または腎臓の血管疾患の結果として通常４０歳代から５０歳代で死亡する。これとは対照的に、より穏やかな「心臓型」を患う患者は、通常は正常なα−ＧａｌＡ活性の５〜１５％を有し、左心室肥大または心筋症を呈する。古典型に罹患した者が重症となる場合であっても、これらの心臓型患者は、本質的に無症候状態にとどまる。最近になって、原因不明の左心室肥大型心筋症をもつ成人の男性患者の１１％に心臓型が発見され、このことはファブリー病の頻度が以前に推定されたよりも高い可能性があることを示唆していた（非特許文献２）。
【０００６】
α−ＧａｌＡ遺伝子はＸｑ２２にマッピングされ（非特許文献３）、全長ｃＤＮＡおよびα−ＧａｌＡをコードする全１２−ｋｂのゲノム配列が報告されてきた（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６および非特許文献７）。ファブリー病の原因となる変異の顕著な遺伝的異質性が存在する（非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０および非特許文献１１）。今までに、小さい欠失および挿入そしてより大きな遺伝子再構成に加えて、さまざまなミスセンス、ナンセンスそしてスプライシング変異が報告されてきた。
【０００７】
治療
ファブリー病の治療は主として、例えばＦａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｉｎｃ．）およびＲｅｐｌａｇａｌ（登録商標）（ＴＫＴ，Ｉｎｃ．）として市販されている製品といった組換え型α−ＧａｌＡを用いた酵素補充療法（ＥＲＴ）によっている。ＥＲＴには、典型的には、対応する野生型タンパク質の精製形態の静脈内、皮下または筋内への輸液または長時間放出のための生体侵食性（ｂｉｏ−ｅｒｏｄａｂｌｅ）固体形態のタンパク質の移植が関与する。ＥＲＴに伴う主要な問題点の１つは、輸液されるタンパク質が急速に分解することから、治療的に有効なタンパク質量を達成しそれを維持することにある。その結果、ＥＲＴは高用量の輸液を何回も必要とし、その結果として費用と時間のかかるものとなる。
【０００８】
ＥＲＴには、例えば正しく折畳まれたタンパク質の大規模生成、精製および蓄積、グリコシル化未変性タンパク質の獲得、一部の患者における抗タンパク質免疫応答の生成および、有意な中枢神経系の関与を有する疾病に影響を及ぼすのに充分な量でタンパク質が血液−脳障壁を横断できないことに伴う問題点などのさらなる欠点がいくつかある。
【０００９】
機能タンパク質をコードする核酸配列を含む組換え型ベクターまたは機能タンパク質を発現する遺伝子操作されたヒト細胞を用いた遺伝子療法もまた、タンパク質補充の恩恵を受けるタンパク質欠損症およびその他の障害を治療する目的で使用されている。将来性はあるものの、この手法には同様に、分裂中の細胞に感染するかまたは形質導入する能力がベクターにないこと、標的遺伝子の発現が低いことそして遺伝子がひとたび送達された時点で発現が調節されること（例えば、数多くのウイルスベクターが、効能を得るために細胞が分裂中であることを必要としている）などの技術的な問題点による制限もある。
【００１０】
タンパク質欠損症を治療するための第３の比較的最近の手法には、欠損している酵素タンパク質の天然の基質の合成を阻害して病状を改善させるための小分子阻害物質の使用が関与している。この「基質剥奪」手法は、リソソーム蓄積障害またはスフィンゴ糖脂質蓄積障害と呼ばれる約４０の関連する酵素障害からなる一連の障害について、具体的に記述されてきた。これらの遺伝性疾患は、細胞内の糖脂質破壊の触媒として作用するリソソーム酵素の欠損により脂質の異常な蓄積が生じ、細胞の機能が破壊されることを特徴としている。治療用に提案されている小分子阻害物質は、糖脂質の合成に関与する酵素を阻害し、欠損酵素により分解される必要のある細胞糖脂質の量を削減するために特異的なものである。この手法もまた、糖脂質が生物学的機能に必要であり、余剰の剥奪が有害効果をひき起こすかもしれないという点において制限がある。具体的には、糖脂質は、脳により１つのニューロンから別のニューロンにシグナルを送るために使用される。糖脂質の数が過度に少ないかまたは過度に多い場合、シグナルを送るニューロンの能力は妨げられる。
【００１１】
さらに、リソソーム蓄積症のゴーシェ病についての１つの基質阻害物質ＮＢ−ＤＮＪを用いた治療には、末梢神経障害および重症の胃腸影響を含めたヒトにおける数多くの有害事象が付随する。これらの効果は、治療上の有効用量ではない１５０ｍｇ／日という低用量でさえ出現する。以上のことから、米国および欧州におけるゴーシェ病の治療のためのＮＢ−ＤＮＪの投与は、ＥＲＴが選択肢ではない軽度乃至は中等度のＩ型ゴーシェ病患者を含め成人に著しく限定されており、カナダでは療法として認可されていない（非特許文献１２）
【００１２】
特異的シャペロン戦略である第４の手法は、おそらくは小胞体（ＥＲ）またはその他の細胞タンパク質分解／排出システムにおいて、変異タンパク質を分解から救済する。以前の特許および刊行物では、誤って折畳まれたリソソーム酵素を含めた内因性酵素タンパク質をＥＲ品質管理機序により分解から救済するための治療戦略について記述されている。特定の実施形態においては、この戦略は、特定のリソソーム障害に結びつけられる欠陥あるリソソーム酵素に対して特異的に結合する小分子可逆的阻害物質を利用する。治療が不在の場合、変異酵素タンパク質はＥＲ内で誤って折畳まれ（非特許文献１３）、最終製品に至るその成熟が遅延し、その後ＥＲ内で分解される。シャペロン戦略には、ＥＲ品質管理システムからの不当なまたは異常な分解または誤って折畳まれたタンパク質の細胞内蓄積を防止するための、変異タンパク質の正しい折畳みを促進する化合物の使用が関与する。これらの特異的シャペロンは、薬理シャペロン（または活性部位特異的シャペロン）と呼称される。
【００１３】
シャペロン戦略は、全体が参照により本明細書に援用されているＦａｎらに対する特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、および特許文献５中にあるように、リソソーム蓄積障害に関与する酵素について記述され例証されてきた。例えば、変異型ファブリー酵素α−ガラクトシダーゼＡ（α−ＧａｌＡ）の強力な競合阻害物質であるガラクトースの小分子誘導体、１−デオキシガラクトノジリマイシン（ＤＧＪ）は、中性ｐＨでヒト変異型α−ＧａｌＡ（Ｒ３０１Ｑ）の生体内安定性を有効に増大させ、Ｒ３０１ＱまたはＱ２７９Ｅ変異でファブリー病患者から確立したリンパ芽球内の変異型酵素活性を４５％以上増強した。さらに、変異型（Ｒ３０１Ｑ）α−ＧａｌＡを過剰発現する遺伝子導入マウスにＤＧＪを経口投与すると、主要な器官内で酵素活性が実質的に上昇した（非特許文献１４）。組織培養内のゴーシェ病患者の細胞からの酸性β−ガラクトシダーゼ（グルコセレブロシダーゼ；Ｇｂａ）の類似したレスキューについては、Ｆａｎらに対する係属中の特許文献２中で記述されている別のイミノ糖、イソファゴミン（ＩＦＧ）およびその誘導体を用い、かつ（共に２００４年１１月１２日に出願された係属中の特許文献６および特許文献７に記述されている）Ｇｂａに特異的なその他の化合物を用いて、記述されてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第６，２７４，５９７号明細書
【特許文献２】米国特許第６，５８３，１５８号明細書
【特許文献３】米国特許第６，５８９，９６４号明細書
【特許文献４】米国特許第６，５９９，９１９号明細書
【特許文献５】米国特許第６，９１６，８２９号明細書
【特許文献６】米国特許出願第１０／９８８，４２８号明細書
【特許文献７】米国特許出願第１０／９８８，４２７号明細書
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 8th Edition 2001, Scriver et al., ed., pp. 3733-3774, McGraw-Hill, New York
【非特許文献２】Nakao et al., N. Engl. J. Med. 1995; 333: 288-293
【非特許文献３】Bishop et al., Am. J. Hum. Genet. 1985; 37: A144
【非特許文献４】Calhoun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985; 82: 7364-7368
【非特許文献５】Bishop et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986; 83: 4859-4863
【非特許文献６】Tsuji et al., Eur. J. Biochem. 1987; 165: 275-280
【非特許文献７】Kornreich et al., Nucleic Acids Res. 1989; 17: 3301-3302
【非特許文献８】The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 8th Edition 2001, Scriver et al., ed., pp. 3733-3774, McGraw-Hill, New York
【非特許文献９】Eng et al., Am. J. Hum. Genet. 1993; 53: 1186-1197
【非特許文献１０】Eng et al., Mol. Med. 1997; 3: 174-182
【非特許文献１１】Davies et al., Eur. J. Hum. Genet. 1996; 4: 219-224
【非特許文献１２】Weinreb et al., Am J. Hematology. 2005. 80: 223-29
【非特許文献１３】Ishii et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 1996; 220: 812-815
【非特許文献１４】Fan et al., Nature Med. 1999; 5: 112-115
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
阻害物質であるシャペロンによる誤って折畳まれたタンパク質のレスキューの成功は、酵素阻害濃度が必要とされる基質剥奪手法とは対照的に、酵素を完全に阻害するのに必要なものよりも低い生体内での特異的阻害物質の濃度の達成によって左右される。有効であるシャペロンの低い用量は、同様に、基質阻害物質の使用を阻む有害な副作用の量および重症度も低減させる。しかしながら、今までのところ、ファブリー病の治療に対するこれらの手法についての臨床および前臨床試験は、有益ではあるにせよ改善が患者のα−ＧａｌＡ活性を正常レベルにすることはできない、ということを示唆している。その上、代理マーカー上または細胞内レベルで薬理シャペロンを用いるファブリー病の臨床治療効果は未知のままである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、ＤＧＪなどの特異的薬理シャペロンでのファブリー病患者の治療方法およびファブリー病に関連する代理マーカーの存在および／またはレベルの変化を評価することによるその治療に対する応答の監視方法を提供する。
【００１８】
一実施形態において、本治療方法には、α−ガラクトシダーゼＡの特異的薬理シャペロンの投与後に、ファブリー病に関連する代理マーカーの改善が存在するか否かを判定するステップが関与する。
【００１９】
具体的な一実施形態においては、改善は、患者が応答者（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）であることを示す。
【００２０】
一実施形態において、代理マーカーは全身性代理マーカーである。特定の実施形態においては、マーカーは、細胞および組織内におけるリソソームα−ガラクトシダーゼＡ活性またはＧＬ−３の蓄積である。別の実施形態において代理マーカーは、ファブリー患者由来の細胞内でＥＲからリソソームへのα−ガラクトシダーゼＡの異常輸送；エンドソーム経路を通した細胞脂質の異常輸送；ＥＲまたは細胞質ゾルにおける誤って折畳まれた大量のα−ガラクトシダーゼＡの存在；（ストレス関連マーカーの遺伝子および／またはタンパク質発現により判定した際の）α−ガラクトシダーゼＡの毒性蓄積が起こす細胞ストレスの存在；エンドソームｐＨレベルの異常；細胞形態の異常；ユビキチン／プロテアソーム経路の抑制；およびユビキチン化タンパク質の量の増加から選択される細胞内代理マーカーである。
【００２１】
具体的な一実施形態においては、薬理シャペロンはα−ガラクトシダーゼＡの阻害物質である。別の実施形態においては、阻害物質は、１−デオキシガラクトノジリマイシンなどの可逆的競合阻害物質である。
【００２２】
本発明は同様に、α−ガラクトシダーゼＡの特異的薬理シャペロン投与後のファブリー病患者の治療応答を監視する方法をも提供している。この方法には、患者に由来する細胞の細胞質染色パターンに対する効果を評価するステップが含まれ、健常な個体に由来する細胞内の染色パターンに類似する細胞内の染色パターンの検出が、ファブリー病を患う個体が応答者であることの指標である。
【００２３】
一実施形態においては、細胞質染色はリソソーム染色である。その他の実施形態においては、リソソーム染色はα−ガラクトシダーゼＡ、ＬＡＭＰ−１発現またはポリユビキチン化タンパク質の存在の検出である。
【００２４】
具体的な一実施形態においては、特異的薬理シャペロンは、α−ガラクトシダーゼＡの阻害物質である。別の実施形態においては、阻害物質は１−デオキシガラクトノジリマイシンなどの可逆的競合阻害物質である。
【００２５】
本発明は同様に、必要としている個体の体内のα−ガラクトシダーゼＡタンパク質の活性を増大させる方法をも提供している。この方法には、タンパク質に結合する有効量の特異的薬理シャペロンを、個体の体内のタンパク質の活性を少なくとも約５０％だけ増大させるのに有効な量で個体に投与するステップが含まれる。
【００２６】
特定の一実施形態においては、α−ガラクトシダーゼＡタンパク質は野生型タンパク質である。別の実施形態においては、α−ガラクトシダーゼＡタンパク質は酵素である。一実施形態においては、酵素はリソソーム酵素である。さらに別の実施形態では、リソソーム酵素は野生型α−ガラクトシダーゼＡタンパク質である。
【００２７】
本発明の一実施形態においては、薬理シャペロンはα−ガラクトシダーゼＡの阻害物質である。別の実施形態においては、阻害物質は、１−デオキシガラクトノジリマイシンなどの可逆的競合阻害物質である。
【００２８】
一実施形態においては、１−デオキシガラクトノジリマイシンは、タンパク質の活性を少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも２倍（約１００％）、より好ましくは少なくとも約３倍〜５倍、より好ましくは少なくとも約１０倍、そしてさらに一層好ましくは少なくとも約１５倍増大させるのに有効な量で投与される。
【００２９】
本発明の一実施形態においては、個体は、野生型タンパク質に対してホモ接合性である。別の実施形態においては、個体は、野生型タンパク質に対してヘテロ接合性であり、タンパク質をコードするその他の対立遺伝子についての変異遺伝子型を有する。特定の実施形態においては、個体はファブリー病を患っている。
【００３０】
本発明の別の実施形態においては、α−ガラクトシダーゼＡ活性は少なくとも２倍、好ましくは少なくとも３倍〜５倍、より好ましくは少なくとも１０倍増大する。具体的な一実施形態においては、α−ガラクトシダーゼＡ活性は、正常範囲内まで増大する。
【００３１】
本発明は同様に、治療が必要な患者におけるファブリー病の治療方法において、個体に対し有効量の１−デオキシガラクトノジリマイシンを投与するステップを含み、１−デオキシガラクトノジリマイシンが、患者の体内のα−ガラクトシダーゼＡの活性を少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも３倍〜５倍、より好ましくは少なくとも１０倍増大させるのに有効な量でα−ガラクトシダーゼＡに結合する方法をも提供している。具体的な一実施形態においては、α−ガラクトシダーゼＡ活性は、正常範囲内まで増大する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】健常なボランティアにおける、プラシーボ、１日２回５０ｍｇおよび１日２回１５０ｍｇについての経時的なα−ＧａｌＡ酵素活性データを示す。
【図２】４８週間にわたるＤＧＪ投与の結果としてのファブリー病患者における白血球活性の平均的増加を示す。
【図３】１２週間にわたるＤＧＪを用いた治療の後の２人のファブリー病患者におけるＧＬ−３レベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、酵素活性レベルを少なくとも約３倍に増大させるかまたは前例のない正常レベルまで酵素活性レベルを増大させるための特異的薬理シャペロンの用量の設定法を提供する。具体的実施形態においては、特異的薬理シャペロンはα−ＧａｌＡの可逆的競合阻害物質、好ましくはＤＧＪである。
【００３４】
さらに、本発明は、１−ＤＧＪなどのα−ＧａｌＡの可逆的競合阻害物質である特異的薬理シャペロンを用いたファブリー病の治療に対する患者の応答を監視するための方法を提供する。特に、治療は、血管壁内の細胞および腎臓、心臓および皮膚細胞を含めた細胞内のグロボトリアオシルセラミド（ＧＬ−３）の細胞被着物；尿中ＧＬ−３レベル；白血球、血漿、皮膚、腎臓および心臓細胞中のα−ＧａｌＡ活性；そして尿中タンパク尿（ｕｒｉｎａｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎｕｒｉａ）を含む（ただしこれらに限定されるわけではない）、ファブリー病に関連するマーカーについて生体試料を検定することによって監視される。付加的なマーカーとしては、角化血管腫、低発汗、チクチクする痛み、または末端部の灼熱感、胃腸障害、白内障またはその他の視力障害および聴力損失の存在が含まれる。
【００３５】
さらに、変異型タンパク質の毒性蓄積に起因する細胞ストレスの緩和および変異型タンパク質の輸送などの細胞内疾病マーカーの評価も同様に想定されている。
【００３６】
本発明は、一部には、ファブリー病治療向けのＤＧＪの第Ｉ相および第ＩＩ相試験から得た結果に基づいている。発見された事実の中には、療法の治療的効果の指標となるファブリー病の代理マーカーに関する変化の特定；α−ＧａｌＡ活性を増大させる投薬量範囲および投薬計画の特定；そして意外にも、白血球中で測定した場合に少なくとも２倍、より好ましくは３倍〜５倍そして一部のケースでは最高１０倍そして１５倍ものα−ＧａｌＡ活性の増大を達成するようにＤＧＪ治療の用量設定を行えること、があった。さらに、白血球中で測定される通り、前例のない治療効果である正常範囲までα−ＧａｌＡ活性レベルを回復させるようにＤＧＪの投与を用量設定することができた。
【００３７】
定義
本明細書中で使用される用語は一般に、本発明に関しておよび各用語が使用される具体的状況の中で当該技術分野におけるその通常の意味を有する。一部の用語について、本発明の組成物および方法そしてその作製および使用方法を説明する上で実施者に対するさらなる指針を提供することを目的として、以下でまたは明細書の他の箇所で論述される。
【００３８】
「ファブリー病」という用語は、リソソームα−ガラクトシダーゼ活性の欠損に起因するスフィンゴ糖脂質異化のＸ連鎖先天異常を意味する。この欠陥は、グロボトリアオシルセラミドおよび関連するスフィンゴ糖脂質の、心臓、腎臓、皮膚およびその他の組織内での蓄積をひき起こす。
【００３９】
「非定型ファブリー病」という用語は、α−ＧａｌＡ欠損症の主として心臓での徴候、すなわち心臓特に左心室の有意な肥大につながる心筋細胞中の漸進的なグロボトリアオシルセラミドの蓄積を示す患者を意味する。
【００４０】
「ファブリー病患者」とは、以下で定義されているような変異α−ガラクトシダーゼＡに起因してファブリー病を患うと診断された個体を意味する。
【００４１】
ヒトα−ガラクトシダーゼＡとは、配列番号２に記されているアミノ配列を有するヒトＧｌａ遺伝子によってコードされた酵素を意味する。ヒトα−ＧａｌＡ酵素は４２９個のアミノ酸からなり、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ７８０２７にある。
【００４２】
本明細書で使用される「変異型ａ−ＧａｌＡ」という用語は、酵素がＥＲ内で通常存在する条件下でその未変性立体構造を達成できなくする変異を有するａ−ＧａｌＡを意味する。この立体構造が達成できない場合、結果として酵素は、タンパク質輸送系内のその正常な経路を通してリソソームまで輸送されるのではなくむしろ分解させられる。この用語は同様に、酵素活性の減少またはより急速な代謝回転を結果としてもたらすその他のα−ＧａｌＡ変異をも包含する。
【００４３】
ファブリー病に結びつけられる例示的なα−ＧａｌＡ変異としては、Ｒ３０１Ｑ、Ｌ１６６Ｖ、Ａ１５６Ｖ、Ｇ２７２ＳおよびＭ２９６Ｉが含まれる。
【００４４】
本明細書中で使用される「特異的薬理シャペロン」（「ＳＰＣ」）または「薬理シャペロン」という用語は、１つのタンパク質に特異的に結合し、（ｉ）タンパク質の安定した分子立体構造の形成を増強する；（ｉｉ）ＥＲから別の細胞位置好ましくは未変性細胞位置までの輸送を誘発する、すなわちタンパク質のＥＲ関連分解を防止する；（ｉｉｉ）誤って折畳まれたタンパク質の凝集を防止する；および／または（ｉｖ）タンパク質に対し少なくとも部分的な野生型機能および／または活性を回復させるまたは増強させる、という効果のうちの１つ以上を有する、小分子、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物などを含めたあらゆる分子を意味する。例えばα−ＧａｌＡに対し特異的に結合する化合物とは、包括的一群の関係するまたは無関係の酵素ではなくα−ＧａｌＡに結合しそれに対してシャペロン効果を及ぼす化合物を意味する。本発明においてはＳＰＣは可逆的競合阻害物質であってよい。以下では、本発明が企図しているいくつかの特異的薬理シャペロンについて記述する：
【００４５】
１−デオキシガラクトノジリマイシンとは、以下の構造を有する化合物を意味する。
【化１】
【００４６】
この用語は、遊離塩基と任意の塩形態の両方を含む。ＤＧＪの塩酸塩は塩酸ミガラスタット（Ｍｉｇｌｕｓｔａｔ）として知られている。
【００４７】
α−ＧａｌＡについてのさらにその他のＳＰＣは、Ｆａｎらに対する米国特許第６，２７４，５９７号明細書、６，７７４，１３５号明細書および６，５９９，９１９号明細書の中で記述されており、α−３，４−ジ−エピ−ホモノジリマイシン、４−エピ−ファゴミン、およびα−アロ−ホモノジリマイシン、Ｎ−メチル−デオキシガラクトノジリマイシン、β−１−Ｃ−ブチル−デオキシガラクトノジリマイシン、およびα−ガラクト−ホモノジリマイシン、カリステジンＡ３、カリステジンＢ２、Ｎ−メチル−カリステジンＡ３、およびＮ−メチル−カリステジンＢ２を含む。
【００４８】
ファブリー病の「代理マーカー」または「代理臨床マーカー」というのは、ファブリー病に関連する（ただし健常な個体には関連しない）かつ単独でまたはファブリー病のその他の異常なマーカーまたは症候と組合せた形でファブリー病の信頼性の高い指標であるバイオマーカーの異常な存在、レベルの増大、異常な不在またはレベルの低下を意味する。
【００４９】
限定的な意味のない例として、ファブリー病の代理マーカーには、細胞（例えば線維芽細胞）および組織中のリソソームα−ＧａｌＡ活性の減少；ＧＬ−３の細胞被着；ホモシステインおよび血管細胞粘着分子−１（ＶＣＡＭ−１）の血漿濃度の増加；心臓肥大（特に左心室の）、弁閉鎖不全および不整脈を導く心筋細胞および弁膜線維芽細胞内部のＧＬ−３蓄積；タンパク尿；ＣＴＨ、ラクトシルセラミド、セラミドなどの脂質の尿濃度の増加およびグルコシルセラミドおよびスフィンゴミエリンの尿濃度の減少（Fuller et al., Clinical Chemistry. 2005; 51: 688-694）；糸球体上皮細胞内の積層封入体（ゼブラ小体）の存在；腎不全；発汗低下（これは高熱不耐性をひき起こす）；角化血管腫の存在；および高頻度感音難聴、進行性難聴、突発性難聴、または耳鳴りなどの聴覚異常が含まれる。神経症状には、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）または卒中；肢端強皮症（末端部のヒリヒリ感またはチクチク感）として表われる神経因性疼痛が含まれる。
【００５０】
ファブリー病の特徴的マーカーは、男性のヘミ接合体と女性のヘテロ接合体（キャリヤ）において、同じ有病率で発生するが、女性の方が典型的に罹患の重症度が低い。
【００５１】
その他の代理マーカーは、細胞内レベルで存在し（「細胞内代理マーカー」）、ファブリー患者由来の細胞内におけるＥＲからリソソームへのα−ＧａｌＡの異常輸送；エンドソーム経路を通した脂質の異常輸送；ＥＲまたは細胞質ゾルにおいて誤って折畳まれた大量のα−ＧａｌＡの存在；（ストレス関連マーカーの遺伝子および／またはタンパク質発現により判定した際の）α−ＧａｌＡの毒性蓄積が起こす細胞ストレスの存在；エンドソームｐＨレベルの異常；細胞形態の異常；ユビキチン／プロテアソーム経路の抑制；およびユビキチン化タンパク質の量の増加を含む。
【００５２】
「代理マーカーの改善」というのは、ＳＰＣを用いた治療の後の、ファブリー病を患っておらずしかもその代理マーカーの異常な存在、不在または量の変化を説明するその他の疾病を患っていない健常な個体と比べてファブリー病において異常に存在するか、異常に不在であるかまたは増加した量もしくは減少した量で存在する１つ以上の臨床的代理マーカーの改善、削減または増大の効果を意味する。
【００５３】
「応答者」というのは、１つ以上の代理マーカーの改善および／または疾病の進行の改善または逆転を示す、ファブリー病に関連する疾病および付随するα−ＧａｌＡ変異の診断を受けここで請求されている方法にしたがって治療され監視される個体のことである。
【００５４】
さらに、個体が応答者であるか否かの決定は、ＳＰＣを用いた治療に応答した変異型α−ＧａｌＡタンパク質の細胞内輸送などを評価することによって、細胞内レベルで行なうことができる。ＥＲからリソソームまでの輸送の回復は、応答を示す。個体が応答者であるか否かを決定するために査定され得るその他の細胞内評価には、上述の細胞内代理マーカーの改善が含まれる。
【００５５】
具体的な一実施形態においては、本発明は、患者由来の白血球の中で決定されるα−ＧａｌＡ活性の約３倍増加を達成するためのＤＧＪを用いた治療方法を提供する。さらなる実施形態においては、本発明は、例えば白血球中で測定されるα−ＧａｌＡ活性の少なくとも５倍増加、またはα−ＧａｌＡ活性の１０倍増加、そして具体的実施形態ではα−ＧａｌＡ活性の１５倍増加を達成するためのＤＧＪを用いた治療方法を提供する。本発明は最低限、α−ＧａｌＡ活性の少なくとも２倍増加を提供する。
【００５６】
同様にして、本発明は、ファブリー病患者由来の白血球内でα−ＧａｌＡ活性の正常範囲内までの増大の達成を提供しており、その他の治療的戦略を用いては達成されたことがなく前臨床データが予想できなかったと思われる結果がこれにあてはまる。具体的な実施形態においては、「正常範囲」というのは、The Metabolic & Molecular Bases of Inherited Disease, 8th Edition McGraw Hill, 2001)からのデータの中に記載されている通りの活性範囲である。
【００５７】
「治療上有効な用量」および「有効量」という用語は、治療応答を得るのに充分である特異的薬理シャペロンの量を意味する。治療応答とは、前述の症候および代理臨床マーカーのいずれかの改善を含め、療法に対する有効な応答としてユーザー（例えば臨床医）が認識するあらゆる応答であってよい。治療応答とは、前述の症候および代理臨床マーカーのいずれかの改善を含め、療法に対する有効な応答としてユーザー（例えば臨床医）が認識するあらゆる応答であってよい。したがって治療応答は、一般的に、上述のもののような疾患または障害の１つ以上の症候またはマーカーの改善である。
【００５８】
「薬学的に許容できる」という語句は、生理学的に許容可能であり、ヒトに投与された場合に典型的には、望ましくない反応を生成しない分子的実体および組成物を意味する。好ましくは、本明細書で使用されている「薬学的に許容できる」という用語は、連邦または州政府の規制機関により承認されていることまたは、動物、より詳細にはヒトにおける使用のために米国薬局方またはその他の一般的に認知された薬局方の中に列挙されていることを意味する。「担体」という用語は、化合物を投与する場合に用いられる希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを意味する。かかる薬学的担体は、水および油などの無菌の液体であり得る。特に注射用溶液用の担体として、好ましくは、水または水溶液食塩溶液およびデキストロースおよびグリセロール水溶液が利用される。適切な薬学的担体は、"Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin, 18th Editionの中で記述されている。
【００５９】
「約」および「およそ」という用語は、一般に、測定の性質または精度から許容可能な程度の測定数量についての誤差を意味する。典型的には、例示的な誤差の程度は所与の値または値範囲の２０パーセント（％）以内、好ましくは１０％以内、そしてより好ましくは５％以内である。本明細書中で示されている数値的数量は、特に明記しないかぎり近似であり、これは、明示的に記載されていない場合に「約」または「およそ」という用語が暗示され得る、ということを意味している。
【００６０】
製剤および投与
ＳＰＣを全身に送達するために、任意の適切な医薬製剤を使用してよい。一部の実施形態においては、ＳＰＣは、可逆的競合阻害物質である。一実施形態において、阻害物質はイミノ糖例えばＤＧＪであり、これは単剤療法として、好ましくは経口剤形で投与される。この実施形態においては、投薬計画が、治療対象の個体の血漿中で安定した定常状態レベルの化合物を提供するものでなくてはならない。これは、分割用量または制御放出型製剤を毎日投与することによってか、または持続放出剤形を、頻度を少なくして投与することによって得ることができる。
【００６１】
製剤
ＳＰＣは、例えば錠剤、カプセルまたは液体の形での経口投与または注射用無菌水溶液の形での投与を含めたあらゆる投与経路に適した形で投与可能である。一部の実施形態においては、ＳＰＣは阻害物質好ましくはＤＧＪ糖などの可逆的競合阻害物質である。化合物を経口投与向けに調合する場合、錠剤またはカプセルは、結合剤（例えばアルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えばラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えばジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容できる賦形剤を用いて従来の手段により調製可能である。錠剤は、当該技術分野において周知の方法によりコーティングされてよい。
【００６２】
具体的な一実施形態においては、ＤＧＪ−ＨＣｌは、ステアリン酸マグネシウム（植物性）およびデンプン１５００（２５ｍｇのＤＧＪ／カプセル）と共に粉末充填された硬ゼラチンカプセルとして投与される。
【００６３】
経口投与のための液体調製物は、例えば溶液、シロップまたは懸濁液などの形をとっていてもよいし、または使用前に水または別の適切なビヒクルと共に構成するための乾燥製品としての体裁をとっていてもよい。このような液体調製物は、懸濁剤（例えば水、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用油）；乳化剤（例えばレシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えばアーモンドオイル、油性エステル、エチルアルコールまたは分留植物油）；および防腐剤（例えばメチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）などの薬学的に許容できる添加剤を用いて、従来の手段によって調製されてよい。調製物は同様に、適宜、緩衝塩、着香料、着色剤および甘味料を含有していてよい。経口投与向けの調製物は、セラミド特異的グルコシルトランスフェラーゼ阻害物質の制御放出または持続放出を提供するように適切に調合され得る。
【００６４】
もう１つの具体的な実施形態においては、１００ｍｇのＤＧＪを経口水溶液（約２４０ｍｌ）の形で投与する。
【００６５】
非経口／注射用途に適したＳＰＣの医薬製剤には一般に、無菌水溶液または分散剤、そして無菌注射溶液または分散剤の即時調製用の無菌粉末が含まれる。全てのケースにおいて、形態は無菌でなくてはならず、注射針を容易に通過する程度に流動的でなくてはならない。それは、製造および貯蔵条件下で安定していなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用を受けないように保存されていなくてはならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物および植物油を含む溶媒または分散媒質であり得る。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用、分散の場合には所要粒径の維持そして界面活性剤の使用などによって維持可能である。微生物の作用の予防は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ベンジルアルコール、ソルビン酸などといったさまざまな抗細菌および抗真菌剤により得ることができる。数多くのケースにおいて、例えば糖または塩化ナトリウムなどの等張剤を含み入れることが合理的である。注射用組成物の長時間吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンといった吸収を遅延させる作用物質を組成物中に使用することによって得ることができる。
【００６６】
無菌注射溶液は、必要に応じて以上で列挙したその他の成分のさまざまなものと共に適切な溶媒中に所要量でＳＰＣを取込み、その後ろ過または最終滅菌を行なうことによって調製される。一般に、分散剤は、以上に列挙したその他の所要成分および基本的分散媒質を含有する無菌ビヒクル中にさまざまな滅菌済み活性成分を取込むことによって調製される。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、事前に無菌ろ過した溶液から、活性成分に任意の付加的な所望の成分が加わった粉末を生成する真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【００６７】
上述の製剤は、１つまたは複数の賦形剤を含有し得る。製剤中に含み入れてよい薬学的に許容できる賦形剤は、緩衝液例えばクエン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、および重炭酸塩緩衝液、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質例えば血清アルブミン、コラーゲンおよびゼラチン；塩例えばＥＤＴＡまたはＥＧＴＡおよび塩化ナトリウム；リポソーム；ポリビニルピロリドン；糖例えばデキストラン、マンニトール、ソルビトール、およびグリセロール；プロピレングリコールおよびポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ−４０００、ＰＥＧ−６０００）；グリセロール、グリシンまたはその他のアミノ酸および脂質である。製剤と共に使用するための緩衝系としては、クエン酸塩、酢酸塩、重炭酸塩、およびリン酸塩緩衝液が含まれる。リン酸塩緩衝液が好ましい実施形態である。
【００６８】
製剤は同様に非イオン洗浄剤も含有できる。好ましい非イオン洗浄剤にはポリソルベート２０、ポリソルベート８０、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４、ノニデットＰ−４０、オクチルα−グルコシド、オクチルβ−グルコシド、ブリッジ３５、プルロニックおよびトゥイーン２０が含まれる。
【００６９】
投与
ＳＰＣの投与経路は、（好ましくは）経口であるかまたは、静脈内、皮下、動脈内、腹腔内、眼内、筋内、口腔、直腸、膣内、眼窩内、脳内、皮内、頭蓋内、髄腔内、心室内、鞘内、嚢内、関節包内、肺内、鼻腔内、経粘膜、経皮、または吸入を介したものであってよい。
【００７０】
ＳＰＣの上述の非経口製剤の投与は、調製物の定期的なボーラス注入によるものであってよく、または、体外容器（例えば静注用バッグ）または体内容器（例えば生体侵食性移植片）からの静脈内または腹腔内投与によって投与されてよい。例えば、各々参照により本明細書に援用されている米国特許第４，４０７，９５７号明細書および同第５，７９８，１１３号明細書を参照のこと。肺内送達の方法および器具は、例えば各々参照により本明細書に援用されている米国特許第５，６５４，００７号明細書、同第５，７８０，０１４号明細書および同第５，８１４，６０７号明細書の中に記載されている。その他の有用な非経口送達系としては、エチレン酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な輸液系、ポンプ送達、カプセル化細胞送達、リポソーム送達、針送達型注射、無針注射、ネブライザ、エアロゾル化装置、電気穿孔、および経皮パッチが含まれる。無針注射装置は、参照により本明細書に援用されている米国特許第５，８７９，３２７号明細書；同第５，５２０，６３９号明細書；同第５，８４６，２３３号明細書および同第５，７０４，９１１号明細書の中に記載されている。上述の製剤のいずれもこれらの方法を用いて投与可能である。
【００７１】
さらに、詰め替え可能なペン型注射器および無針注射装置などの患者に便利なように設計されたさまざまな装置を本明細書中で論述されている本発明の製剤について使用してよい。
【００７２】
投薬量
当業者であれば、本発明の方法において使用されている化合物の有効量は、日常的実験により判定され得るが、０．０１〜１００μＭの間、好ましくは０．０１〜１０μＭの間、最も好ましくは０．０５〜１μＭの間の血清レベルを得るための量になるものと予想される、ということを理解する。マウスにおける臨床試験および前臨床試験により、ＤＧＪの薬理学的効果（酵素活性の増強）が、およそ０．４μＭの血漿濃度で見られるということが示唆されている。
【００７３】
ＳＰＣの有効用量は１日体重１ｋｇあたり０．５〜１０００ｍｇの間であると予想されている。ＳＰＣがＤＧＪである具体的実施形態においては、用量は１日あたり約１０〜６００ｍｇ、より具体的には２５〜３００ｍｇ、より具体的には５０〜１５０ｍｇ／日である。
【００７４】
詳細な実施形態においては、ＤＧＪは、２５ｍｇ１日２回、１００ｍｇ１日２回または２５０１日２回で投与される。複数回用量第Ｉ相試験からのデータは、５０ｍｇ１日２回の投薬で０．４μＭのトラフ濃度が得られることを示している。ファブリー病患者についての第ＩＩ相試験からのデータは、評価された最低用量（２５ｍｇ１日２回）での酵素活性の増加を実証した。
【００７５】
代理マーカーを用いたファブリー病治療の監視
本発明は同様に、特異的薬理シャペロンを用いたファブリー病患者の治療を監視する方法も提供している。具体的には、疾患の進行およびＤＧＪでの治療に対するその応答を評価するためにさまざまな検定が利用される。特に、さまざまな全身および細胞内マーカーを検定することができる。本発明の監視態様は、さまざまな細胞物質の侵襲的測定および非侵襲的測定の両方を包含している。
【００７６】
グロボトリアオシルセラミドの蓄積
ファブリー病に罹患したヒトの血漿および尿中のグロボトリアオシルセラミド（ＧＢ３またはＧＬ−３）濃度を測定する方法が、Boscaro et al., Rapid Commun Mass Spectrom. 2002;16(16):1507-14の中に記載されている。この参考文献では、分析は、フローインジェクション分析−エレクトロスプレーイオン化−タンデム質量分析法（ＦＩＡ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）を用いて実施される。
【００７７】
ファブリー病患者の皮膚内に蓄積されたＧＬ−３の免疫電子顕微鏡による検出が、Kanekura et al., Br J Dermatol. 2005;153(3):544-8の中に最近記載された。この方法は、ＧＬ−３のリソソーム蓄積を検出するのに充分な感度を示す。皮膚生検は、皮膚から試料層を取り出す「パンチ」装置を使用することによって採取することができる。
【００７８】
腎生検は、超音波、Ｘ線またはＣＴスキャンによる誘導を用いて実施される。一部の状況下では、生検は、頸静脈の１つに生検カテーテルを通すことにより実施され、これは経頸静脈生検と呼ばれる。腎臓内、具体的には血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、メサンギウム細胞および間質細胞、有足細胞および遠位尿細管上皮細胞を含めた全ての腎細胞型におけるＧＬ−３蓄積が、Thurburg et al., Kidney Int. 2002;62(6):1933-46.の中に記載されている。腎臓生検の超構造研究（電子顕微鏡）によって、全タイプの腎臓細胞の細胞質内の典型的封入体を明らかにすることができる（Sessa et al., J Inherit Metab Dis. 2001; 24 Suppl 2:66-70)。細胞は、３５〜５０Ａの周期性を伴う明暗層の同心的薄層形成（「シマウマ」または「たまねぎの皮」の外観）によって特徴づけされる。
【００７９】
腎臓機能は、確立した方法にしたがって糸球体ろ過速度（ｍｌ／分）を決定することによっておよび血清クレアチンレベルを査定することによって査定可能である。その他の腎臓査定としては、２４時間のタンパク質排泄、尿中タンパク電気泳動、総タンパク量、微量アルブミン、尿中ベータ−２−マイクログロブリン力価が含まれる。ＧＬ−３堆積物およびタンパク尿の減少が、腎臓の健常性の直接的な測定値である。
【００８０】
近年、大気圧光イオン化質量分析法（ＡＰＰＩ−ＭＳ）が、直接注射および液体クロマトグラフィ（ＬＣ）との結合の両方の場合に、ＧＬ−３分子種の分析用として効率の良い方法であることが示された。この技術は、ファブリー病患者から単離した生体試料からの多数の種の検出を可能にした（Delobel et al., J Mass Spectrom. 2005 Nov 14; [Epub ahead of print]［印刷前電子出版］）。
【００８１】
α−ガラクトシダーゼ活性
上述の通り、α−ＧａｌＡ活性の非侵襲的査定を、血液白血球中または培養された線維芽細胞中で測定することができる。かかる検定には典型的に、患者からの血液白血球の抽出、細胞の溶解そして４−メチルウンベリフェラルアルファＤ−ガラクトシドおよび／またはＮ−アセチルガラクトースアミンなどの酵素基質の添加時点での溶解物中の活性の決定が関与する（米国特許第６，２７４，５９７号明細書参照）。
【００８２】
血液および血漿中のα−ガラクトシダーゼの濃度を決定するためのα−ＧａｌＡ活性およびタンパク質の測定用の２つの高感度免疫検定が、Fuller et al., Clin Chem. 2004;50(11):1979-85中に記載されている。
【００８３】
本発明によると、α−ＧａｌＡ活性の少なくとも２倍増加、そして一部のケースではα−ＧａｌＡ活性の少なくとも３倍増加、少なくとも５倍、最高１０倍までの増加、そして一部の実施形態では１５倍増加を達成するように投薬量を設定することが可能である。これらの結果は、白血球で観察できる。
【００８４】
別の実施形態においては、本発明は、ファブリー病患者におけるα−ＧａｌＡ活性の正常なレベルを達成するべくＤＧＪの投薬量を設定することを提供している。
【００８５】
心臓の評価
α−ＧａｌＡ活性の増加は、少なくとも心臓疾患患者のサブセットにおいて心臓疾患を監視するかまたは検出する役割を果たし得る。心臓細胞内のＧＬ−３の評価は、心内膜心筋生検を通して達成できる。これは、心筋組織の小片を採取するために生検鉗子（端部に把持装置を備えた小さなカテーテル）を使用することが関与する侵襲的処置である。
【００８６】
核周辺空胞内に存在するＧＬ−３は、酸性染色液で陽性に染色される。さらに、生検の組織学的検査は、透過電子顕微鏡法を用いて心内膜の肥厚を確認し、心室質量を測定し、または肥大性心筋繊維の存在を判定することにより行なうことができる。
【００８７】
さらに、総頸動脈および橈骨動脈の直径、内膜−中膜厚み（ＩＭＴ）および伸展性が、高解像度エコートラッキングシステムおよび圧平眼圧測定を用いて査定された。Boutouyrie et al., Acta Paediatr Suppl. 2002;91(439):62-6。心筋細胞は同様に、ＧＬ−３の蓄積についても検査される。ＭＲＩまたはドップラー心エコー検査法を用いて、巨視的心臓形態を査定することができる。心臓機能は、例えば左心室駆出分画を決定することおよび心電図を用いることによって査定することができる。
【００８８】
神経因性疼痛／末梢神経障害
末端部の疼痛は、患者に対して行なわれる主観テストを用いて査定できる。さらに、神経障害を評価するためには定量的官能検査（ＣＡＳＥ試験）を使用することができる。ＣＡＳＥ試験は、冷たさ、暖かさまたは振動の感覚を感じた時点で直ちにボタンを押すよう患者に求める生物物理学的技術である。これらの刺激は、手または足の皮膚に置かれた電極によって送達される。
【００８９】
脳血管
卒中および高血圧に加えて、その他のファブリー関連の脳血管徴候および関連する症候としては、片側不全麻痺、めまい、複視；発作；脳底動脈虚血および動脈瘤；内耳迷路障害または脳内出血が含まれ得る。
【００９０】
神経系
ファブリー病を患う男性および女性の患者には、有意な加齢に関連した大脳白質病巣（ＷＭＬ）を見出すことができる。神経学的効果の評価は、例えば定量的発汗刺激性軸索反射試験（ＱＳＡＲＴ）を用いて査定できる。ＱＳＡＲＴは、自律機能の日常的試験およびファブリー病において見られるような遠位細径線維神経障害における高感度試験である。
【００９１】
発汗低下／発汗減少
ファブリー病患者における発汗障害および高熱不耐性は、選択的な末梢神経損傷または汗腺をとり囲む小血管内の細胞質内脂質被着に原因があるとされてきた。
【００９２】
Hilz et al. (Acta Paediatr Suppl. 2002;91(439):38-42)は、ファブリー病患者における温度知覚、振動知覚、発汗刺激性およびエクリン汗腺機能、および四肢および表皮血流および血管反応性の障害を査定するための方法について記述した。これらの方法には、熱誘発試験、定量的発汗刺激性軸索反射試験（ＱＳＡＲＴ）および静脈閉塞プレチスモグラフィが含まれる。ＱＳＡＲＴは３つの部分を有し、安静時皮膚温、安静時汗出力および刺激された発汗量を測定する。測定は典型的には腕、脚またはその両方で行なわれる。小さなプラスチック製カップが皮膚上に置かれ、温度と皮膚下の汗の量が測定される。発汗を刺激するために、皮膚を通して汗腺まで電気的に化学物質が送達されるが、患者は暖かさしか感じない。神経および汗腺が正しく機能しているか否かを判定するべくデータを分析するのにコンピュータが使用される。
【００９３】
さらに、涙液および唾液の減少も、約４０％のファブリー病患者にみられる。
【００９４】
温度不耐性
高熱不耐性に加えて、小血管壁、神経周囲細胞および無髄神経細胞または有髄神経細胞内に脂質が被着した結果、細径線維神経障害が起こるために低温および熱感受性が発生することが多い。
【００９５】
眼内混濁
ファブリー病患者は、ほぼ例外なく、渦巻き状の角膜混濁、水晶体混濁および結膜と網膜の血管病変を示す。角膜混濁は、細隙灯顕微鏡検査を用いて見ることができる。ファブリー病患者には、（時としてプロペラ状に分布した）水晶体内のクリーム色の前嚢被着および（ファブリー白内障と呼ばれる）水晶体後面上の白っぽい粒状スポーク様被着といった２つのタイプの水晶体混濁が指摘されてきた。
【００９６】
聴力損失
従来の聴力検査、鼓膜聴力検査、ＡＢＲ聴力検査および耳音響放射を用いた蝸牛機能を評価するための非侵襲性方法が、Germain et al., BMC Med Genet. 2002;3(1):10)の中に記載されている。
【００９７】
胃腸障害
胃腸症候は、腸間膜血管および自律神経節内のスフィンゴ糖脂質付着の結果発生し得る。症候には、食後鼓腸；腹部のけいれんおよび疼痛；早期満腹感；下痢；便秘；吐き気；嘔吐が含まれる。
【００９８】
その他の代理マーカー
ファブリー病のその他のマーカーには、ＧＬ−３の蓄積に起因するリンパ浮腫（末端部の膨れ）が含まれる。さらに、ファブリー病患者には拡張期血圧の有意な減少が存在することが最近になって発見されており、これにより運動耐容の説明がつくかもしれない（Bierer et al., Respiration. 2005;72(5):504-11）。
【００９９】
これらのマーカーは、治療前にそれらが異常であると識別された場合にのみ治療を監視するために使用可能であるということを理解すべきである。さらに、マーカーの異常な上昇が、ファブリー病の存在と相関関係づけされ、腎臓疾患またはその他の脳血管疾患などのその他の原因または合併症に起因しないということも認識されている。
【０１００】
細胞内マーカーを検出するための分子生物学監視検定
特異的薬理シャペロンを用いたファブリー病の治療の監視は、上述の全身的または巨視的レベルに加えて細胞内レベルで行なうことができる。例えば、ゴルジ複合体への脂質のエンドソーム−リソソーム膜輸送の障害が、リソソーム蓄積症の特徴である（Sillence et al., J Lipid Res. 2002;43(11):1837-45）。したがって、ファブリー病治療の１つの監視方法は、標識された脂質（ＢＯＤＩＰＹ−コレステロール）を有する患者由来の細胞に接触し、エンドソーム構造内でのその輸送を監視することにある。例えばエンドソーム構造内の病的蓄積は、その患者が治療にうまく応答していないことの指標であると考えられる。
【０１０１】
一例として、リソソームおよびエンドソーム内のｐＨ範囲を測定するために、細胞により取り込まれるｐＨ感応性蛍光プローブを使用することができる（すなわち、フルオレセインはｐＨ５で赤色であり、５．５〜６．５で青色乃至緑色である）。リソソームの形態およびｐＨが、野生型細胞とシャペロン治療された患者および未治療の患者の細胞において比較される。この検定は、ｐＨ感受性を判定するために平板読取り装置検定と並行して実行できる。例えば、ＢＯＤＩＰＹ−ＬａｃＣｅｒは、正常細胞中ではゴルジまで輸送されるが、脂質蓄積障害では細胞のリソソームに蓄積する。ＢＯＤＩＰＹ−ＬａｃＣｅｒは、膜内の濃度に応じて緑色または赤色の蛍光を発し、リソソーム内の緑色／赤色比を用いて濃度変化を測定することができる。化合物で処理されたおよび未処理の生きた健常な細胞および患者の細胞がＢＯＤＩＰＹ−ＬａｃＣｅｒでインキュベートされ、ＦＡＣＳおよび／または共焦点顕微鏡で赤色／緑色比を測定することができ、共焦点顕微鏡を用いて染色パターン（リソソーム対ゴルジ）を決定することができる。
【０１０２】
輸送は、ｐＨ勾配に沿って細胞内で発生し（すなわちＥＲのｐＨ約７、ゴルジのｐＨ約６．２〜７．０、トランスゴルジ網のｐＨ約６．０、早期および後期エンドソームのｐＨ約６．５、リソソームのｐＨ約４．５）、ファブリー細胞などの輸送欠陥を有する細胞内では内腔およびエンドソームｐＨが分断される。したがって、輸送に対するｐＨのプラス効果に相関された場合、野生型細胞、ＳＰＣ治療を受けた患者および未治療の患者の細胞におけるｐＨ感受性を判定するための検定を用いて、ファブリー病患者における輸送の回復を監視することができる。患者の細胞のｐＨ変化に対する感受性がさらに強い場合には、細胞ｐＨ感受性を低減させ、リソソームの形態または機能を回復させ、またより一般的には正常な輸送を回復させるＳＰＣについてのスクリーニング検定を作り出すことが可能となる。
【０１０３】
さらに、輸送欠陥の軽減は、Ｌｙｓｏ−Ｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）などのリソソームマーカーでの欠損酵素（α−ＧａｌＡ）の同時局在化を判定することにより分子レベルで査定可能である。リソソーム内のα−ＧａｌＡの局在化は、ＥＲからリソソームまでの輸送が特異的薬理シャペロンを用いた治療により回復することの証拠である。簡単に言うと、正常な細胞およびＳＰＣで治療されたおよび未治療の患者の細胞が酵素およびエンドソーム／リソソームマーカー（例えばＲａｂ７、Ｒａｂ９、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ジストロフィン関連タンパク質ＰＡＤ）に対する一次抗体および蛍光タグ付けされた二次抗体と共に固定され染色される。酵素およびその他のエンドサイトーシス経路マーカーの濃度に起因する蛍光の量を定量化するためにＦＡＣＳおよび／または共焦点顕微鏡が使用され、染色パターンの変化を判定するために共焦点顕微鏡を用いることができる。さらに、エンドグリコシダーゼＨ処理の組合わされたパルス−チェイス代謝標識などの従来の生化学方法。Ｅｎｄｏ Ｈは、ＥＲグリコシル化を獲得した（高マンノースＮ−連結）、すなわちＥＲに局在化されているタンパク質のみを分割し、ＥＲ外でゴルジまでそれを行ないゴルジ内で付加的なグリコシル化を獲得したタンパク質を分割しない。したがって、Ｅｎｄｏ Ｈ感受性α−ＧａｌＡのレベルが高くなればなるほど、ＥＲ内のタンパク質の蓄積が増大する。α−ＧａｌＡがゴルジ内へそれを行なった場合、全てのＮ連結糖が分割されることから、タンパク質がゴルジから退出したか否かを確認するためにグリコシダーゼＰＮＧアーゼＦを使用することができる。
【０１０４】
ＥＲストレス。ファブリー病患者における誤って折畳まれたα−ＧａｌＡなどのＥＲ細胞内の誤って折畳まれたタンパク質の毒性蓄積は、ＥＲストレスをもたらすことが多い。これにより、細胞ホメオスタシスの分断を解消しようと試みる細胞ストレス応答が誘発されることになる。したがって、特異的薬理シャペロンでの治療の後の患者におけるＥＲストレスのマーカーを測定することで、治療の効果を監視する別の方法が提供される。かかるマーカーには、ＢｉＰ、ＩＲＥ１、ＰＥＲＫ／ＡＴＦ４、ＡＴＦ６、ＸＢＰ１（Ｘ−ｂｏｘ結合因子１）およびＪＮＫ（ｃ−Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ）を含む、折畳まれていないタンパク質の応答と結びつけられる遺伝子およびタンパク質が含まれる。ＥＲストレスを査定するための１つの方法は、野生型細胞とファブリー病患者細胞との間と同様、ＳＰＣ治療を受けた細胞と未治療の細胞との間の発現レベルを比較することにある。対照として、ＥＲストレス誘発物質（例えばＥＲ内の折畳まれていないタンパク質のＮ−グリコシル化および蓄積の阻害ためのツニカマイシン、ラクタシスチンまたはＨ２Ｏ２）およびストレス緩和剤（例えばタンパク質合成を阻害するためのシクロヘキサミド）を使用することができる。
【０１０５】
ＥＲストレス応答を監視するために企図されている別の方法は、遺伝子チップ解析を介したものである。例えばさまざまなストレス遺伝子を伴う遺伝子チップを用いて、ＥＲストレス応答のタイプ（早期、後期、アポトーシスなど）および発現レベルを測定することができる。一例として、ＨＧ−Ｕ９５Ａアレイを使用することができる（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．）。
【０１０６】
最後に、長期にわたるＥＲストレスが、ＥＲ内の折畳まれていないタンパク質のレベルおよび結果としてのストレスレベルに応じて、アポトーシスおよび細胞死をもたらし得ることから、細胞は多少の差こそあれ、ツニカマイシンまたはプロテアソーム阻害物質などのＥＲストレス誘発物質に対する感受性を有する。ストレス誘発物質に対する細胞の感受性が高くなればなるほど、観察されるアポトーシスまたは死細胞の数は多くなる。アポトーシスは、カスパーゼ３（アポトーシスの早期指標）について蛍光基質類似体、ＦＡＣＳ、共焦点顕微鏡を使用して、かつ／または蛍光平板読取り装置（ハイスループット検定のためには９６ウェルのフォーマット）を用いてアポトーシスまたは細胞死について陽性の細胞の百分率を決定すること（ＦＡＣＳおよび／または共焦点顕微鏡検査）を用いて測定でき、そうでなければ蛍光平板読取り装置で９６ウェルのフォーマットでのタンパク質濃度との関係において蛍光強度を測定することができる。
【０１０７】
ＥＲ中の毒性タンパク質蓄積の結果としてもたらされる細胞ストレスに対する別の応答は、ユビキチン／プロテアソーム経路の抑制である。これにより、エンドサイトーシス経路は全体的に破壊される（Rocca et al., Molecular Biology of the Cell. 2001; 12: 1293-1301）。誤って折畳まれたタンパク質の蓄積は時として、ポリユビキチンの量の増加と相関される（Lowe et al., Neuropathol Appl Neurobiol. 1990; 16: 281-91）。
【０１０８】
プロテオソーム機能およびユビキチン化は、日常的検定を用いて査定できる。例えば、生きた動物における２６Ｓプロテアソーム機能のイメージングによる評価が、生物発光イメージング用のユビキチン−ルシフェラーゼリポータにより達成された（Luker et al., Nature Medicine. 2003. 9, 969-973）。プロテアソーム単離のためのキットは、例えばＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｃａｔ．Ｎｏ．５３９１７６）から市販されている。ユビキチン化は、免疫組織化学または免疫蛍光を用いて、形態学的試験によって検査可能である。例えば、健常な細胞およびＳＰＣで治療されたおよび未治療の患者の細胞を、ユビキチン化されたタンパク質に対する一次抗体と共に固定および染色することができ、ＦＡＣＳおよび／または共焦点顕微鏡検査による二次抗体の蛍光検出を用いて、ユビキチン化されたタンパク質レベルの変化を判定する。
【０１０９】
ユビキチン化されたタンパク質を検出するための別の検定は、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ(商標)（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）である。このモデルでは、ビオチン−ユビキチン（ｂｉｏ−Ｕｂ）を用いて、ＧＳＴ−ＵｂｃＨ５ａ融合タンパク質のＧＳＴ部分がユビキチン化される。ＡＴＰの存在下でのＥ１によるユビキチン活性化の後、ｂｉｏ−ＵｂがＵｂｃＨ５ａに移送される。この反応において、ＵｂｃＨ５ａはｂｉｏ−Ｕｂをそのタグ付けされたＧＳＴ部分に移送するための担体として作用する。ビオチニル化されたユビキチン化された状態となったタンパク質は次に、抗−ＧＳＴアクセプタおよびストレプトアビジンにより捕捉される。ドナーはビーズを作り、結果としてシグナルを生成する。ユビキチン化が無い場合、いかなるシグナルも生成されない。
【０１１０】
最後に、ＥＬＩＳＡサンドイッチ検定を用いて、変異型α−ＧａｌＡを捕捉することができる。α−ＧａｌＡ（例えばウサギ）に対する一次抗体は表面に吸収され、酵素が、細胞溶解物または血清とのインキュベーション中に捕捉され、次に二次酵素結合検出を伴って、ユビキチン化タンパク質に対する抗体（例えばマウスまたはラット）を用いてユビキチン化酵素の量が検出かつ定量化される。あるいは、検定を用いて、細胞抽出物または血清中のマルチユビキチン化タンパク質の合計量を定量化することができると思われる。
【０１１１】
女性キャリヤ
一部の女性キャリヤは、無症候状態にとどまり、正常なα−ＧａｌＡ濃度を有する一方、一部は、特に年令が高くなるにつれて軽度乃至重度の疾病の臨床症候を示す。この可変性は、一部には、女性の胚の一部のまたは全ての細胞中の１個のＸ染色体の不活性化の結果であると考えられている。１１人の女性キャリヤについての一試験において、タンパク尿、肢端感覚異常および角化血管腫が疾病の最も一般的な症候であることが発見された（Guffon, Journal of Medical Genetics. 2003; 40: e38）。一部の患者は、めまい、腹痛、うつ病、運動／高熱不耐性、冷えまたは発熱および発汗、衰弱およびうつ病を含めた症候を示した。弁膜症および重度の肥大性心筋症が、４０歳代、５０歳代または６０歳代で発生し、患者のうち２人が、移植を要する末期的腎不全を示した。一人の女性は、内嚢視床卒中を有し、肺合併症（１人において慢性閉塞性気管支肺症および肺塞栓症）も２人の患者において記録された。
【０１１２】
以上のことから、本発明の方法は、女性キャリヤの治療を開始する場合にも利用可能である。
【０１１３】
併用療法
本発明の治療的監視は同様に、ＤＧＪおよびＥＲＴまたは遺伝子療法の組合せを用いた患者の治療の後にも適用可能である。このような併用療法は、同一所有者の米国特許出願公開第２００４／０１８０４１９号明細書（出願番号第１０／７７１，２３６号、および第２００４／０２１９１３２号明細書（出願番号第１０／７８１，３５６号）の中に記載されている。両方の出願共、その全体が参照により本明細書に援用されている。
【実施例】
【０１１４】
本発明は、以下で提示する実施例を用いて詳細に記述される。かかる実施例の使用は、例示にすぎず、本発明またはいずれかの例示された用語の範囲および意味を決して限定するものではない。同様にして、本発明は、本明細書中に記載されているいずれかの特定の好ましい実施形態に限定されるわけではない。実際、本明細書を読んだ時点で、当業者にとっては、本発明の数多くの修正および変形形態が明らかになる。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲の文言ならびに特許請求の範囲の権利対象である等価物の全範囲によってのみ限定されるものである。
【０１１５】
実施例：内因性酵素が欠損したバックグラウンド内でヒト変異型α−ＧａｌＡを発現する遺伝子導入マウスに対するＤＧＪの投与
α−ＧａｌＡノックアウトバックグラウンド（ＴｇＭ／ＫＯマウス）内でヒト変異型α−ＧａｌＡ（Ｒ３０１Ｑ）のみを発現する遺伝子導入マウスを確立し、評価した。この実施例は、α−ＧａｌＡのミスフォールディングをひき起こすミスセンス変異に特異的である、ファブリー病用の薬理シャペロン療法を試験し評価するための生化学モデルとして役立つ。
【０１１６】
方法
マウス
ファブリーＲ３０１ＱＴｇ／ＫＯマウスは、ロバート・デスニック（Ｒｏｂｅｒｔ Ｄｅｓｎｉｃｋ）博士から贈呈されたものである。雄のＣ５７ＢＬ／６マウスを、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ， ＮＹ）から購入し、ケージ１個あたりマウス４匹の割合でステンレス製ケージの中に収容した。全ての試験は８週齢で行ない、ＩＡＣＵＣ指針を厳守して実施した。
【０１１７】
薬物投与
α−ＧａｌＡ検定用として、１０匹の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスからなる４つのグループに、２８日間にわたり１日体重１ｋｇあたり、０、１、１０または１００ｍｇのＩＦＧ ＨＣｌを飲料水に入れて投薬した。ＧＬ−３検定のためには、６〜７匹の雄Ｒ３０１ＱＴｇ／ＫＯマウスからなる２つのグループに、２８日間にわたり経口で毎日０または３０ｍｇ／ｋｇのＤＧＪ ＨＣｌを投薬した。投薬後、指示された組織を採取し、以下に記載する通りに処理した。
【０１１８】
酵素活性検定
投薬の後、指示された組織を採取し、凍結させた。検定緩衝液中で約５０ｍｇの組織を均質化することによって、組織溶解物を調製した。２．５μＬの溶解物を、１７．５μＬの検定緩衝液および５０μＬのそれぞれの基質溶液（以上の項で詳述されたものと同じ）と組合せた。その後反応混合物を１時間３７℃でインキュベートした。その後、７０μＬの停止溶液（０．４Ｍのグリシン、ｐＨ１０．８）を添加し、３５５ｎｍの励起および４６０ｎｍの発光でＶｉｃｔｏｒ平板読取り装置上で蛍光を読取った。溶解物中の酵素活性からバックグラウンドを減算し、ＭｉｃｒｏＢＣＡタンパク質検定キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク質濃度を正規化した。ｎモル／ｍｇタンパク質／時として表現された絶対酵素活性への蛍光データの変換のために４−ＭＵ標準曲線を（以上の項で詳述されたものと同様に）実行するかまたはさらに未処置活性の％に正規化した。
【０１１９】
マウス組織からのＧＬ−３分析
組織試料を、血液を除去するように洗浄し、秤量し、ＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）系中で溶媒系と均質化した。ホモジネートを次に、Ｃ１８カートリッジ上での固相抽出を用いて抽出した。溶離液を蒸発させ、ＬＣ／ＭＳ系への注入に先立ち再構成させた。９個のＧＬ３イソ型を、ポジティブＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳを用いて測定した。ＬＣ分離をＺｏｒｂａｘ Ｃ１８カラム上で達成した。
【０１２０】
結果
酵素活性
雄のＲ３０１Ｑ Ｔｇ／ＫＯマウスに対し毎日ＤＧＪ ＨＣｌ（３０ｍｇ／ｋｇ；４週間）を経口強制投与することにより、心臓、腎臓、皮膚、肝臓および脾臓組織内で変異型ＧＬＡ活性が有意な形で（＊ｐ＜０．０５、ｔ−検定対未処置）増大する（それぞれ、１１±０．１、５．５±０．３、６．２±０．７、３±０．０２および５±０．１倍；各組織についてｎ＝６〜７匹のマウス）。データは２つの別々の測定を表わしている。２つの類似した実験を、ＤＧＪ ＨＣｌの経口投与を受けた（飲料水中３０ｍｇ／ｋｇ／日；４週間）雄および雌のＲ３０１Ｑ Ｔｇ／ＫＯマウスにおいて実施し、処置された全ての組織において変異型ＧＬＡ活性の同等の増加が観察された。
【０１２１】
組織ＧＬ−３
雄のＲ３０１Ｑ Ｔｇ／ＫＯマウスに対して毎日ＤＧＪ ＨＣｌ（３０ｍｇ／ｋｇ；４週間）を経口強制投与することにより、皮膚および心臓内で、ＧＬ−３基質レベル（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで測定）が有意な形で減少する。処置されたＲ３０１Ｑ Ｔｇ／ＫＯマウスの皮膚組織内にＤＧＪ ＨＣｌを毎日投与した後、ＧＬ−３レベルは１１分の５まで有意に減少した（＊ｐ＜０．０５；１グループあたりｎ＝６〜７匹のマウス）。処置されたＲ３０１Ｑ Ｔｇ／ＫＯマウスの心臓組織内にＤＧＪ ＨＣｌを毎日投与した後、ＧＬ−３レベルは８分の５まで有意に減少した（＊ｐ＜０．０１；１グループあたりｎ＝６〜７匹のマウス）。腎臓組織中でもＧＬ−３レベルを分析し、これは減少傾向を示したものの、統計的有意性には至らなかった。
【０１２２】
論述
上述の知見は、ファブリー病に罹患した主要組織内における薬理シャペロンでの治療に応答した、生体内基質クリアランスの最初の証拠であることから、有意義である。
【０１２３】
上述の通り、ファブリー病のための唯一承認された治療は、酵素補充療法である。最近になって、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）（７年）（Askari et al.、予稿原稿提出済み）により長期間ＥＲＴ療法を受けて死亡したファブリー病患者に由来する心臓、腎臓、脳（海馬傍回）、腸、副腎、大動脈、皮膚、肝臓および脾臓の中にＧＬ−３が存続していることが実証された。この患者は、血管内皮細胞内にＧＬ−３リソソーム封入を有していなかったが、全ての器官からの細胞の細胞膜および細胞質の中に、ＧＬ−３免疫反応性が観察された。腎臓の血管内皮細胞および線維芽細胞内には、ＧＬ−３がリソソームマーカー、ＥＲマーカーおよび核マーカーと同時局在化し、これらのコンパートメントならびに細胞膜内における存在は、免疫金電子顕微鏡検査で確認された。７年間にわたりＥＲＴを受けた別のファブリー病患者に由来する培養された皮膚の線維芽細胞も類似した知見を示した。３人の罹患していない対照に由来する組織は、ＩＨＣおよびＥＭによってＧＬ−３について一様に陰性であった。これらのデータは、薬理シャペロン療法が、ファブリー病患者における主要臓器内での基質のクリアランスに優れているかまたは比較的優れているということを示唆している。
【０１２４】
結論としては、ファブリー病における長年のＥＲＴの後でさえ、細胞および組織内にはかなりの量のＧＬ−３免疫反応性が残存している。本発明者らは初めて、リソソーム外細胞領域内に蓄積されたグロボトリアオシルセラミドの存在を実証した。これらの知見は、疾病の機序を理解するために極めて重要であり、新規の特異的療法に対する応答を査定するためのグロボトリアオシルセラミドについての免疫染色の使用を示唆している。
【０１２５】
実施例２：安全性、耐容性および薬物動態を評価するための単回用量ＤＧＪの投与
この実施例は、健常なボランティアにおけるＤＧＪの安全性、耐容性および薬物動態を評価するためのＤＧＪの逐次漸増単回経口用量の無作為化された２重盲検プラセボ対照第Ｉ相試験について記述している。
【０１２６】
試験の設計および持続時間
この試験は、経口投与後のＤＧＪの安全性、耐容性および薬物動態を評価するためのヒト初回投与、単一施設、第Ｉ相、無作為化、２重盲検、単一用量、プラセボ対照、逐次漸増用量試験であった。この試験では、連続するコホート間で最低１週間の安全性評価期間を設けて、用量上昇型投薬計画において、２５、７５、２２５および６７５ｍｇのＤＧＪまたはプラセボの経口単回用量投与を受けた８人の対象（６人が被験薬および２人がプラセボ）からなる４つのグループをテストした。次の用量レベル（すなわち次のグループ）への用量上昇は、先行する１つまたは複数のグループの安全性および耐容性の精査後に続行された。対象は、投薬の１４時間前から投薬終了２４時間後まで、治療施設内に収容された。食事を予定表により制御し、薬物投与後４時間は対象が自由に行動できるようにした。
【０１２７】
試験対象集団
対象は、一般社会人からなり、施設に収容されたことのない１９才以上５０才以下の年令の健常な非喫煙男性ボランティアであった。
【０１２８】
安全性および耐容性の査定
バイタルサイン、臨床検査パラメータ（血清化学、血液学および尿検査）、ＥＣＧ、身体検査を評価することによっておよび治療期間中の有害事象を記録することによって安全性を判定した。
【０１２９】
薬物動態試料採取
投薬の前およびその後０．２５、０．５、０．７５、１、１．５、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１６および２４時間の時点でＥＤＴＡの入った血液収集試験管内に血液試料（各１０ｍＬ）を収集した。血液試料を氷浴中で冷却し、可能なかぎり早く冷却下で遠心分離した。血漿試料を２つのアリコートに分割し、検定中２０±１０℃で保管した。試験の終了時に、全ての試料を分析のためＭＤＳ Ｐｈａｒｍａ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｌｉｎｃｏｌｎ）に移送した。以下の間隔にわたりＤＧＪを分析するために各対象から完全な尿排出量を収集した：
・ −４〜０時間
・ ０〜４時間
・ ４〜８時間
・ ８〜１２時間
・ １２〜２４時間
【０１３０】
統計的分析
臨床検査評価、身体検査、有害事象、ＥＣＧ監視およびバイタルサインの査定を含む安全性データを、治療グループおよび収集時点別にまとめた。定量的安全性データならびにベースラインとの差異について、記述統計データ（算術平均、標準偏差、中央値、最小および最大値）を計算した。定性的安全性データの分類のために、頻度計数値をコンパイルした。さらに、正常範囲外シフトを記載したシフト表を、臨床検査結果について提供した。身体検査の結果およびＥＣＧについても、正常−異常シフト表を提示した。
【０１３１】
ＭｅｄＤＲＡ７．０バージョンディクショナリを用いて有害事象をコード化し、有害事象を報告している対象の数および報告された有害事象の数について治療別にまとめた。報告者用語（ｖｅｒｂａｔｉｍ ｔｅｒｍ）、コード化された用語（ｃｏｄｅｄ ｔｅｒｍ）、治療グループ、重症度そして治療との関係を含めた対象別有害事象データリストを提供した。治療別に、併用薬および病歴を列挙した。
【０１３２】
記述統計データ（算術平均、標準偏差、変動係数、試料サイズ、最小値、最大値および中央値）を用いて、治療グループ別に薬物動態パラメータをまとめた。さらに、ＡＵＣ０−ｔ、ＡＵＣｉｎｆおよびＣｍａｘについて幾何平均を計算した。
【０１３３】
結果
この試験中に、５人の対象（１６％）が１０件の治療関連有害事象（ＡＥ）を報告した。コホートＢ（７５ｍｇ）内では２人の対象がＡＥを有し、コホートＤ（６７５ｍｇ）内では３人の対象がＡＥを有していた。コホートＡ（２５ｍｇ）またはＣ（２２５ｍｇ）においては、どの対象もＡＥを示さなかった。用量レベルの増大に関係する傾向は全く観察されなかった。少なくとも１０％の対象がＡＥを全く報告しなかった。
【０１３４】
ＡＥは、５つの体組織、すなわち胃腸系（水様便）、筋骨格および結合組織（筋骨格剛性）、神経系（めまい、頭痛）、呼吸器、胸郭および縦隔系（咽頭痛）および皮膚および皮下系（発疹）において発生した。
【０１３５】
臨床検査において正常範囲からの偏差が投薬後に発生したが、いずれも臨床的に有意であるとは判断されなかった。試験全体を通して調査されたいずれのパラメータにも、臨床的に関連性ある平均データシフトは全く存在しなかった。いずれのバイタルサイン、ＥＣＧまたは身体検査パラメータにも、臨床的に関連性ある異常は全く発生しなかった。
【０１３６】
ＤＧＪは、用量が２５ｍｇ以上６７５ｍｇ以下まで増加した場合でも、この健常な男性対象グループにとって安全でかつ充分な耐容性が示されるものと思われた。
【０１３７】
薬物動態評価
以下の表は、試験中に得られた薬物動態データをまとめている。
【０１３８】
【表１】
【０１３９】
ＤＧＪの薬物動態特性は全ての対象および全ての用量レベルにおいて充分に示された。平均して、全ての用量レベルについておよそ３時間でピーク濃度が発生した。全ての用量レベルにわたる平均半減期は、およそ３．０時間から４．６時間の範囲であった。ＤＧＪのＡＵＣおよびＣｍａｘは、用量を２５ｍｇから２２５ｍｇまで増大させた場合に用量に比例して増加するように思われた。
【０１４０】
平均腎クリアランス値は、用量が２５ｍｇから６７５ｍｇまで増大するにつれて５．９０から７．６６Ｌ／時までの範囲であった。尿中に排泄されたＤＧＪの平均累積百分率は一般に、用量が２５ｍｇから７５ｍｇまで増大するにつれて増加し、２２５ｍｇと６７５ｍｇの用量レベルは同程度であった。
【０１４１】
実施例３：安全性、耐容性および薬物動態およびα−ガラクトシダーゼＡ酵素活性に対する影響を評価するための単回用量ＤＧＪの投与
この実施例は、健常なボランティアにおける安全性、耐容性、薬物動態およびα−ガラクトシダーゼＡ（α−ＧａｌＡ）酵素活性に対するＤＧＪの影響を評価するためのＤＧＪの１日２回の経口用量の無作為化された２重盲検プラセボ対照第Ｉｂ相試験について記述している。
【０１４２】
試験の設計および持続時間
この試験は、経口投与後の健常なボランティアにおけるＤＧＪの経口投与後のＤＧＪの安全性、耐容性、薬物動態およびα−ＧａｌＡ酵素活性に対する影響を評価するためのヒト初回投与、単一施設、第Ｉｂ相、無作為化、２重盲検、１日２回用量、プラセボ対照試験であった。この試験では、７日間の追訪を伴って連続７日間経口投与された、５０または１５０ｍｇ１日２回の用量をＤＧＪまたはプラセボを受けた８人の対象（６人が被験薬で２人がプラセボ）からなる２つのグループをテストした。対象は、投薬の１４時間前から投薬終了２４時間後まで、治療施設内に収容された。食事を予定表により制御し、薬物投与後４時間は対象が自由に行動できるようにした。
【０１４３】
薬物動態パラメータを１日目と７日目の血漿中ＤＧＪについて計算した。さらに、尿中に排泄された（投薬から１２時間後）ＤＧＪの累積百分率を計算した。投薬開始前、そして試験開始後１００時間、１５０時間そして３３６時間目にも、白血球（ＷＢＣ）中のα−ＧａｌＡ活性を計算した。
【０１４４】
試験対象集団
対象は、一般社会人からなり、施設に収容されたことのない１９才以上５０才以下の年令の健常な非喫煙男性ボランティアであった。
【０１４５】
安全性および耐容性の査定
バイタルサイン、臨床検査パラメータ（血清化学、血液学および尿検査）、ＥＣＧ、身体検査を評価することによっておよび治療期間中の有害事象を記録することによって安全性を判定した。
【０１４６】
薬物動態試料採取
投薬の前およびその後０．２５、０．５、０．７５、１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１および１２時間の時点でＥＤＴＡの入った血液収集試験管内に血液試料（各１０ｍＬ）を収集した。血液試料を氷浴中で冷却し、可能なかぎり早く冷却下で遠心分離した。血漿試料を２つのアリコートに分割し、検定中２０±１０℃で保管した。試験の終了時に、全ての試料を分析のためＭＤＳ Ｐｈａｒｍａ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｌｉｎｃｏｌｎ）に移送した。１日目と７日目にＤＧＪ投与後の最初の１２時間の腎クリアランスを判定するためにＤＧＪを分析する目的で各対象から完全な尿排出量を収集した。
【０１４７】
ＷＢＣα−ＧａｌＡ酵素活性試料採取
投薬前およびその後１００時間、１５０時間および３３６時間の時点で抽出されたＥＤＴＡおよびＷＢＣを含有する血液収集試験管内に、血液試料（各１０ｍＬ）を収集した。上述の通りに試料を処理し、Desnick, R.J. (ed) Enzyme therapy in genetic diseases. Vol 2. Alan R Liss, New York, pp 17-32.の中で記述されている通りに、ＷＢＣα−ＧａｌＡ酵素活性レベルを決定した。統計的分析。臨床検査評価、身体検査、有害事象、ＥＣＧ監視およびバイタルサイン査定を含む安全性データを、治療グループおよび収集時点別にまとめた。定量的安全性データならびにベースラインとの差異について、記述統計データ（算術平均、標準偏差、中央値、最小および最大値）を計算した。定性的安全性データの分類のために、頻度計数値をコンパイルした。さらに、正常範囲外シフトを記載したシフト表を、臨床検査結果について提供した。身体検査の結果およびＥＣＧについても、正常−異常シフト表を提示した。
【０１４８】
ＭｅｄＤＲＡ７．０バージョンディクショナリを用いて有害事象をコード化し、有害事象を報告している対象の数および報告された有害事象の数について治療別にまとめた。報告者用語、コード化された用語、治療グループ、重症度そして治療との関係を含めた対象別有害事象データリストを提供した。治療別に、併用薬および病歴を列挙した。
【０１４９】
記述統計データ（算術平均、標準偏差、変動係数、試料サイズ、最小値、最大値および中央値）を用いて、治療グループ別に薬物動態パラメータをまとめた。
【０１５０】
結果。プラセボで治療された対象はいずれもＡＥを有さず、５０ｍｇ１日２回または１５０ｍｇ１日２回のＤＧＪを受けたいかなる対象もＡＥを示さなかった。５０ｍｇ１日２回および１５０ｍｇ１日２回で用量が投与された場合、健常な男性対象のこのグループにとって、ＤＧＪは安全で充分な耐容性があると思われた。
【０１５１】
臨床試験において正常範囲からの偏差が投薬後に発生したが、いずれも臨床的に有意であるとは判断されなかった。試験全体を通して調査されたいずれのパラメータにも、臨床的に関連性ある平均データシフトは全く存在しなかった。いずれのバイタルサイン、ＥＣＧまたは身体検査パラメータにも、臨床的に関連性ある異常は全く発生しなかった。
【０１５２】
薬物動態評価
以下の表は、試験中に得られた薬物動態データをまとめている。
【０１５３】
【表２】
【０１５４】
ＤＧＪの薬物動態特性は全ての対象および全ての用量レベルにおいて充分に示された。平均して、全ての用量レベルについておよそ３時間でピーク濃度が発生した。ＤＧＪのＣｍａｘは、用量を５０ｍｇから１５０ｍｇまで増大させた場合に用量に比例して増加した。
【０１５５】
平均除去半減期（ｔ１／２）は、１日目の５０ｍｇと１５０ｍｇの用量レベルにおいて同程度であった（２．５時間対２．４時間）。
【０１５６】
投薬後１２時間の期間にわたって排泄されたＤＧＪの平均百分率は、１日目でそれぞれ５０ｍｇおよび１５０ｍｇの用量レベルで１６％と４２％であり、７日目にはそれぞれ４８％と６０％まで増大した。
【０１５７】
α−ガラクトシダーゼＡ（α−ＧａｌＡ）酵素活性
試験中に得たα−ＧａｌＡ酵素活性データは、図１に示されている。ＤＧＪは、５０ｍｇ１日２回又は１５０ｍｇ１日２回の投薬量で対象におけるＷＢＣα−ＧａｌＡ酵素活性を阻害しなかった。その上、ＤＧＪは、健常なボランティアにおけるＷＢＣα−ＧａｌＡ活性増加の用量依存的傾向を作り出した。α−ＧａｌＡ酵素レベルは、プラセボ、５０ｍｇ１日２回のＤＧＪおよび１５０ｍｇ１日２回のＤＧＪが投与された対象のＷＢＣで測定した。プラセボは、ＷＢＣα−ＧａｌＡ酵素レベルに全く影響を及ぼさなかった。プラセボに応答した酵素レベルの変動は、臨床的に有意なものではなかった。５０ｍｇ１日２回および１５０ｍｇ１日２回のＤＧＪは共に、正規化されたＷＢＣα−ＧａｌＡ酵素レベルを増加させた。５０ｍｇ１日２回のＤＧＪに応答して、ＷＢＣα−ＧａｌＡ酵素活性は、それぞれ投薬後１００時間、１５０時間および３３６時間で投薬前レベルの１２０％、１３０％および１４５％まで増大した。１５０ｍｇ１日２回のＤＧＪに応答して、ＷＢＣα−ＧａｌＡ酵素活性は、それぞれ投薬後１００時間、１５０時間および３３６時間で、投薬前レベルの１５０％、１８５％および１８５％まで増大した。
【０１５８】
実施例４：ファブリー病患者に対するＤＧＪの投与および治療応答の監視
この実施例は、α−Ｇａｌ折畳み変異型を用いたファブリー病患者におけるＤＧＪの無作為化盲検第ＩＩ相試験および提案されている監視について記述している。
【０１５９】
登録患者
（遺伝子型によって確認された）α−ＧａｌＡ中の公知のミスセンス変異を有するファブリー病患者；最高６ヵ月間ＥＲＴを中止する意志のある、現在ＥＲＴ（Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標））を受けている患者；またはこれまでＥＲＴ治療を受けたことのない新たに診断された患者。
【０１６０】
試験設計
２治療群設計を計画した。一方の治療群においては、適格な患者に対し、１２週間（最高４８週間まで延長）、１日おきに１５０ｍｇのＤＧＪ−ＨＣｌを投与した。第２の治療群においては、２５ｍｇ、１００ｍｇそして次に２５０ｍｇ１日２回の上昇用量を６週間にわたり投与し、その後、試験の残りの期間中１日５０ｍｇを投与した。
【０１６１】
監視
ＧＬ−３沈着物
ベースライン、３ヵ月および６ヵ月の時点で、皮膚、腎臓および心臓の生検を実施し、皮膚線維芽細胞、心筋細胞およびさまざまな腎細胞内のＧＬ−３沈着物について評価する。ＧＬ−３のクリアランスが全ての細胞において観察されることが予想されている。従来のＥＲＴによる治療では心筋細胞または腎有足細胞または皮膚組織内のクリアランスは、示されなかった（ただし、ＥＲＴ６ヵ月目および１８ヵ月目での尿沈渣の変化は、酵素補充により腎組織内のスフィンゴ糖脂質の蓄積のクリアランスがあったことを示唆していた： Clin Chim Acta. 2005;360(1-2):103-7)）。
【０１６２】
α−ＧａｌＡ活性
さらに、生検から得た分画された組織内および（ベースラインでおよび毎月収集される血液からの）血液白血球および血漿内で、α−ＧａｌＡ活性を査定する。ＤＧＪ治療は、白血球、線維芽細胞および血漿中で、ベースラインよりも約２倍〜約１０倍、α−ＧａｌＡ活性を増大させるものと予想されている。同様に、ＥＲＴ治療で実証されなかったα−ＧａｌＡ活性の増加が組織内で観察されることも予想されている。
【０１６３】
尿検査
α−ＧａｌＡおよびＧＬ−３についてベースラインおよび毎月、尿と尿沈渣を分析する。さらに、ＣＴＨ、ラクトシルセラミド、セラミドなどのその他の脂質の異常な存在およびグルコシルセラミドおよびスフィンゴミエリンの異常な減少または不在も同様に評価される。
【０１６４】
腎疾患の状態を監視するためにアルブミン（タンパク尿）およびクレアチンを含めたタンパク質の存在についても、尿を分析する。ＤＧＪ治療はタンパク尿を減少させ、ＧＬ−３沈渣を減少させると予想されている。
【０１６５】
心臓解析
心臓形態（例えば左心室肥大）および心臓機能（例えばうっ血性心不全、虚血、梗塞、不整脈）を査定するために、上述の生検に加えて、ひずみ速度評価を伴うＭＲＩおよび心エコー図を、ベースライン、３ヵ月目および６ヵ月目に実施する。その他の治療では、左心室肥大の直接的減少または左心室駆出の増大が実証されたことはない。（腎不全に関連する）高血圧が出血性脳卒中のリスクを増大し得ることから、高血圧も同様に評価した。
【０１６６】
あらゆる導通異常、不整脈、脚ブロックまたは頻脈または徐脈の改善を分析するため、ベースラインおよび診察毎に、心電図を実施する。以前の治療は、これらの症候を呈する患者において改善を示さなかった。
【０１６７】
腎臓解析
ＧＬ−３のクリアランスについて光学顕微鏡および電子顕微鏡を用いて、腎有足細胞を評価する。
【０１６８】
脳解析
虚血性卒中の原因となり得る虚血領域の削減について査定するため、ベースラインおよび試験の終了時点で、ＭＲＩおよびＭＲＡを実施する。ＤＧＪによるＧＬ−３集積の削減は、卒中の罹患率を低減させることが予想されている。補充酵素は、血液脳関門を横断できないことから、ＥＲＴで脳虚血の改善が達成されたことは全く無い。
【０１６９】
眼科
眼科検査は、白内障などの角膜および水晶体混濁の減少を査定するために実施される。
【０１７０】
神経因性疼痛
肢端感覚異常の減少を評価するために、ベースラインにおいておよび毎月の診察毎に患者に対し主観的な患者アンケート調査を行なう。これは、末梢神経細胞の微小血管系内のＧＬ−３クリアランスの証拠であり得る。
【０１７１】
神経障害
末梢神経障害を評価するためには、定量的官能試験（ＣＡＳＥ試験）を使用する。
【０１７２】
発汗減少
エクリン汗腺に連結されている小神経線維を査定する定量的発汗刺激性軸索反射試験（ＱＳＡＲＴ）を用いて、汗腺を評価する。汗腺の改善は発汗増加と相関関係を有するはずであり、同様に、末梢神経細胞の微小血管系内のＧＬ−３クリアランスの証拠でもあり得る。この分析は、ベースラインおよび３ヵ月目および６ヵ月目で実施される。
【０１７３】
結果
α−ＧａｌＡ活性
少なくとも１２週間ＤＧＪで治療した最初の１１人の患者から得られるデータは、ＤＧＪが、１１人の患者のうちの１０人においてファブリー病で欠損している酵素の活性の増加を導くということを示唆している（図２）。試験中、３人の患者は、試験全体を通して１日おきに１５０ｍｇのＤＧＪを受けた（図２では、白い正方形、三角形および菱形で表示されている）。試験中の８人の患者が、６週間にわたって２５、１００そして次に２５０ｍｇ１日２回の逐次漸増用量を受け、その後試験の残りの期間５０ｍｇ／日を受けた（図２では、黒丸で表わされている）。表中の正常の百分率を計算する目的で、複数回用量第Ｉ相試験の１５人の健常なボランティアの白血球中のα−ＧＡＬのレベルの平均を使用し正常なα−ＧＡＬのレベルを導出した。１１人の患者は、１０の異なる遺伝子変異を示し、ゼロから正常の３０％までの範囲にあるα−ＧａｌＡのベースラインレベルを有していた。
【０１７４】
ＧＬ−３レベル
腎臓のＧＬ−３レベルは第三者専門機関によって電子顕微鏡検査法を用いて査定された（図３）。これまで２人の患者について入手されたデータは、１２週間の治療の後１人の患者の腎臓の多数の細胞型においてＧＬ−３の減少が見られることを示した（メサンギウム細胞および糸球体内皮および遠位尿細管の細胞）。２人目の患者は、２４週間の治療後に同じ腎細胞型の中でＧＬ−３レベルの減少を示したが、これらの減少は、患者のベースラインにおけるＧＬ−３のレベルが比較的低いことから、それ単独で決定的なものではなかった。両方の患者共、間質毛細血管の細胞を含めたその他の腎細胞型の中のＧＬ−３レベルの減少を示したが、これらの減少は有意なものではなかった。
【０１７５】
液体クロマトグラフィ質量分析法によって査定されるようなベースラインでのおよび治療後の尿および血漿ＧＬ−３レベルが、１０人の患者について入手できた。大部分の患者は、治療の前後両方で正常かまたは正常に近い尿および血漿中ＧＬ−３レベルを有していた。ベースラインで高いレベルの尿または血漿中ＧＬ−３を有していたわずかな患者については、患者ごとの変動が大きいために、結果の解釈が困難であった。
【０１７６】
光学および電子顕微鏡法によって査定される通りのベースラインでのおよび治療後の皮膚ＧＬ−３レベルが、１０人の患者について入手できた。７人の患者が、治療前後の両方において正常または正常に近い皮膚ＧＬ−３レベルを有していた。その他の３人の患者についての結果は、経時的な変動を伴って、一部の皮膚細胞型におけるＧＬ−３の減少とその他の皮膚細胞型におけるＧＬ−３の増加の証拠を示していたことから、解釈が困難であった。
【０１７７】
これらの試験における大部分の患者は、治療の前には正常または正常に近い心臓、腎臓および中枢神経系機能を有しており、１２〜４８週間の治療の後も臨床的に有意な変化は全く観察されなかった。
【０１７８】
より長い治療期間にわたる場合および／またはより重症であり治療前により高いＧＬ−３蓄積を提示している患者の場合には、より顕著なＧＬ−３の減少が明白になるものと予想される。
【０１７９】
論述
これらの結果は、シャペロン療法の有効性についての原理実証である。ＤＧＪは、α−ＧａｌＡの活性を、従来の生体外および遺伝子導入動物試験から予測されたものに比べ罹患個体内で著しく高いレベルまで増大させることが示された。予想外に、６週間後に用量を最低用量（５０ｍｇ／日）まで削減した場合でも酵素活性は高い状態にとどまっており、このことは、シャペロン療法の効能を実証している。
【０１８０】
重要なことに、シャペロンは小分子であることから、血液脳関門および腎臓などの器官をとり囲む関門などの内皮関門を容易に横断でき、結合組織に進入する。ＥＲＴでは、体外から投与された酵素がこれらの関門を貫通せず、したがって心臓内の心筋細胞、周皮細胞および血管平滑筋、腎有足細胞、周皮細胞、神経周膜または細動脈、組織球および線維芽細胞の筋層内のＧＬ−３レベルに対しいかなる効果も及ぼさないことから、この事実はＥＲＴに比べて有意な改善である（Eng et al., Am J Hum Genet. 2001; 68(3): 711-722）。その上、上述した通り、近年になって、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）での長期ＥＲＴ療法（７年）を受けてきた死亡したファブリー病患者由来の心臓、腎臓、脳（海馬傍回）、腸、副腎、大動脈、皮膚、肝臓および脾臓内にＧＬ−３が存続することが実証された（Askari et al.、予稿原稿提出済み）。
【０１８１】
本発明は、本明細書中に記載された具体的実施形態によってその範囲が限定されるものではない。実際、以上の記述および添付図面から当業者には、本明細書に記載されているものに加えて本発明のさまざまな修正が明らかになる。かかる修正は、添付の特許請求の範囲内に包含されるものである。
【０１８２】
本出願全体を通して特許、特許出願、公報、製品関連文書およびプロトコルが引用されているが、その開示は、あらゆる目的のために全体が本明細書に参照により援用されている。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、全体が参照により本明細書に援用されている２００７年３月３０日出願の米国仮特許出願第６０／９０９，１８５号明細書に対する優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、α−ガラクトシダーゼＡ活性を少なくとも３倍回復させること、そしてより詳細にはその活性を正常範囲内のレベルまで回復させることによりファブリー病を治療する方法を提供する。さらに本発明は、特異的代理マーカーの存在および／または数量の変化を評価することによりファブリー病を患う個体の特異的薬理シャペロンを用いた治療を監視するための方法を提供する。本発明は同様に、細胞内レベルで治療の効果を評価することによりファブリー病を患う個体の特異的薬理シャペロンを用いた治療を監視するための方法をも提供する。
【背景技術】
【０００３】
ファブリー病は、スフィンゴ糖脂質類からの末端α−ガラクトシル残基の加水分解を担う酵素であるリソソームα−ガラクトシダーゼＡ（α−ＧａｌＡ）のＸ連鎖性遺伝的欠損によってひき起こされるスフィンゴ糖脂質（ＧＳＬ）蓄積症である。酵素活性欠損の結果として、中性スフィンゴ糖脂質、主にグロボトリアオシルセラミド（セラミド・トリヘキソシド、ＣＴＨ、ＧＬ−３）が血管内皮細胞中に漸進的に被着し、この身体条件を有する患者において腎不全と共に早期心筋梗塞および卒中がひき起こされる。この障害は、臨床所見によって、全身性血管障害を伴う古典的な形態、そして臨床所見が心臓組織に限定されている非定型的形態（ａｔｙｐｉｃａｌ ｖａｒｉａｎｔ ｆｏｒｍ）という２つのグループに分類される。
【０００４】
疾病の頻度は、男性では約１：４０，０００と推定され、異なる民族集団において世界中で報告されている。古典型に罹患した男性において、臨床所見には角化血管膜（皮膚の小さい隆起した赤みがかった紫色の染み）、肢端感覚異常（手足の灼熱感）、発汗低下症（発汗能力の低下）および特徴的な角膜および水晶体混濁が含まれる（非特許文献１）。脂質蓄積は、動脈の循環を損ない心臓発作または卒中のリスクを増大させることになる可能性がある。心臓が肥大する可能性もあり、徐々に腎臓にも影響が及び得る。その他の症候としては、特に飲食後の発熱および胃腸障害が含まれる。一部の女性キャリヤが症候を示すこともある。
【０００５】
罹患した男性の推定寿命は短くなり、心臓、脳および／または腎臓の血管疾患の結果として通常４０歳代から５０歳代で死亡する。これとは対照的に、より穏やかな「心臓型」を患う患者は、通常は正常なα−ＧａｌＡ活性の５〜１５％を有し、左心室肥大または心筋症を呈する。古典型に罹患した者が重症となる場合であっても、これらの心臓型患者は、本質的に無症候状態にとどまる。最近になって、原因不明の左心室肥大型心筋症をもつ成人の男性患者の１１％に心臓型が発見され、このことはファブリー病の頻度が以前に推定されたよりも高い可能性があることを示唆していた（非特許文献２）。
【０００６】
α−ＧａｌＡ遺伝子はＸｑ２２にマッピングされ（非特許文献３）、全長ｃＤＮＡおよびα−ＧａｌＡをコードする全１２−ｋｂのゲノム配列が報告されてきた（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６および非特許文献７）。ファブリー病の原因となる変異の顕著な遺伝的異質性が存在する（非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０および非特許文献１１）。今までに、小さい欠失および挿入そしてより大きな遺伝子再構成に加えて、さまざまなミスセンス、ナンセンスそしてスプライシング変異が報告されてきた。
【０００７】
治療
ファブリー病の治療は主として、例えばＦａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｉｎｃ．）およびＲｅｐｌａｇａｌ（登録商標）（ＴＫＴ，Ｉｎｃ．）として市販されている製品といった組換え型α−ＧａｌＡを用いた酵素補充療法（ＥＲＴ）によっている。ＥＲＴには、典型的には、対応する野生型タンパク質の精製形態の静脈内、皮下または筋内への輸液または長時間放出のための生体侵食性（ｂｉｏ−ｅｒｏｄａｂｌｅ）固体形態のタンパク質の移植が関与する。ＥＲＴに伴う主要な問題点の１つは、輸液されるタンパク質が急速に分解することから、治療的に有効なタンパク質量を達成しそれを維持することにある。その結果、ＥＲＴは高用量の輸液を何回も必要とし、その結果として費用と時間のかかるものとなる。
【０００８】
ＥＲＴには、例えば正しく折畳まれたタンパク質の大規模生成、精製および蓄積、グリコシル化未変性タンパク質の獲得、一部の患者における抗タンパク質免疫応答の生成および、有意な中枢神経系の関与を有する疾病に影響を及ぼすのに充分な量でタンパク質が血液−脳障壁を横断できないことに伴う問題点などのさらなる欠点がいくつかある。
【０００９】
機能タンパク質をコードする核酸配列を含む組換え型ベクターまたは機能タンパク質を発現する遺伝子操作されたヒト細胞を用いた遺伝子療法もまた、タンパク質補充の恩恵を受けるタンパク質欠損症およびその他の障害を治療する目的で使用されている。将来性はあるものの、この手法には同様に、分裂中の細胞に感染するかまたは形質導入する能力がベクターにないこと、標的遺伝子の発現が低いことそして遺伝子がひとたび送達された時点で発現が調節されること（例えば、数多くのウイルスベクターが、効能を得るために細胞が分裂中であることを必要としている）などの技術的な問題点による制限もある。
【００１０】
タンパク質欠損症を治療するための第３の比較的最近の手法には、欠損している酵素タンパク質の天然の基質の合成を阻害して病状を改善させるための小分子阻害物質の使用が関与している。この「基質剥奪」手法は、リソソーム蓄積障害またはスフィンゴ糖脂質蓄積障害と呼ばれる約４０の関連する酵素障害からなる一連の障害について、具体的に記述されてきた。これらの遺伝性疾患は、細胞内の糖脂質破壊の触媒として作用するリソソーム酵素の欠損により脂質の異常な蓄積が生じ、細胞の機能が破壊されることを特徴としている。治療用に提案されている小分子阻害物質は、糖脂質の合成に関与する酵素を阻害し、欠損酵素により分解される必要のある細胞糖脂質の量を削減するために特異的なものである。この手法もまた、糖脂質が生物学的機能に必要であり、余剰の剥奪が有害効果をひき起こすかもしれないという点において制限がある。具体的には、糖脂質は、脳により１つのニューロンから別のニューロンにシグナルを送るために使用される。糖脂質の数が過度に少ないかまたは過度に多い場合、シグナルを送るニューロンの能力は妨げられる。
【００１１】
さらに、リソソーム蓄積症のゴーシェ病についての１つの基質阻害物質ＮＢ−ＤＮＪを用いた治療には、末梢神経障害および重症の胃腸影響を含めたヒトにおける数多くの有害事象が付随する。これらの効果は、治療上の有効用量ではない１５０ｍｇ／日という低用量でさえ出現する。以上のことから、米国および欧州におけるゴーシェ病の治療のためのＮＢ−ＤＮＪの投与は、ＥＲＴが選択肢ではない軽度乃至は中等度のＩ型ゴーシェ病患者を含め成人に著しく限定されており、カナダでは療法として認可されていない（非特許文献１２）
【００１２】
特異的シャペロン戦略である第４の手法は、おそらくは小胞体（ＥＲ）またはその他の細胞タンパク質分解／排出システムにおいて、変異タンパク質を分解から救済する。以前の特許および刊行物では、誤って折畳まれたリソソーム酵素を含めた内因性酵素タンパク質をＥＲ品質管理機序により分解から救済するための治療戦略について記述されている。特定の実施形態においては、この戦略は、特定のリソソーム障害に結びつけられる欠陥あるリソソーム酵素に対して特異的に結合する小分子可逆的阻害物質を利用する。治療が不在の場合、変異酵素タンパク質はＥＲ内で誤って折畳まれ（非特許文献１３）、最終製品に至るその成熟が遅延し、その後ＥＲ内で分解される。シャペロン戦略には、ＥＲ品質管理システムからの不当なまたは異常な分解または誤って折畳まれたタンパク質の細胞内蓄積を防止するための、変異タンパク質の正しい折畳みを促進する化合物の使用が関与する。これらの特異的シャペロンは、薬理シャペロン（または活性部位特異的シャペロン）と呼称される。
【００１３】
シャペロン戦略は、全体が参照により本明細書に援用されているＦａｎらに対する特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、および特許文献５中にあるように、リソソーム蓄積障害に関与する酵素について記述され例証されてきた。例えば、変異型ファブリー酵素α−ガラクトシダーゼＡ（α−ＧａｌＡ）の強力な競合阻害物質であるガラクトースの小分子誘導体、１−デオキシガラクトノジリマイシン（ＤＧＪ）は、中性ｐＨでヒト変異型α−ＧａｌＡ（Ｒ３０１Ｑ）の生体内安定性を有効に増大させ、Ｒ３０１ＱまたはＱ２７９Ｅ変異でファブリー病患者から確立したリンパ芽球内の変異型酵素活性を４５％以上増強した。さらに、変異型（Ｒ３０１Ｑ）α−ＧａｌＡを過剰発現する遺伝子導入マウスにＤＧＪを経口投与すると、主要な器官内で酵素活性が実質的に上昇した（非特許文献１４）。組織培養内のゴーシェ病患者の細胞からの酸性β−ガラクトシダーゼ（グルコセレブロシダーゼ；Ｇｂａ）の類似したレスキューについては、Ｆａｎらに対する係属中の特許文献２中で記述されている別のイミノ糖、イソファゴミン（ＩＦＧ）およびその誘導体を用い、かつ（共に２００４年１１月１２日に出願された係属中の特許文献６および特許文献７に記述されている）Ｇｂａに特異的なその他の化合物を用いて、記述されてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第６，２７４，５９７号明細書
【特許文献２】米国特許第６，５８３，１５８号明細書
【特許文献３】米国特許第６，５８９，９６４号明細書
【特許文献４】米国特許第６，５９９，９１９号明細書
【特許文献５】米国特許第６，９１６，８２９号明細書
【特許文献６】米国特許出願第１０／９８８，４２８号明細書
【特許文献７】米国特許出願第１０／９８８，４２７号明細書
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 8th Edition 2001, Scriver et al., ed., pp. 3733-3774, McGraw-Hill, New York
【非特許文献２】Nakao et al., N. Engl. J. Med. 1995; 333: 288-293
【非特許文献３】Bishop et al., Am. J. Hum. Genet. 1985; 37: A144
【非特許文献４】Calhoun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985; 82: 7364-7368
【非特許文献５】Bishop et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986; 83: 4859-4863
【非特許文献６】Tsuji et al., Eur. J. Biochem. 1987; 165: 275-280
【非特許文献７】Kornreich et al., Nucleic Acids Res. 1989; 17: 3301-3302
【非特許文献８】The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 8th Edition 2001, Scriver et al., ed., pp. 3733-3774, McGraw-Hill, New York
【非特許文献９】Eng et al., Am. J. Hum. Genet. 1993; 53: 1186-1197
【非特許文献１０】Eng et al., Mol. Med. 1997; 3: 174-182
【非特許文献１１】Davies et al., Eur. J. Hum. Genet. 1996; 4: 219-224
【非特許文献１２】Weinreb et al., Am J. Hematology. 2005. 80: 223-29
【非特許文献１３】Ishii et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 1996; 220: 812-815
【非特許文献１４】Fan et al., Nature Med. 1999; 5: 112-115
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
阻害物質であるシャペロンによる誤って折畳まれたタンパク質のレスキューの成功は、酵素阻害濃度が必要とされる基質剥奪手法とは対照的に、酵素を完全に阻害するのに必要なものよりも低い生体内での特異的阻害物質の濃度の達成によって左右される。有効であるシャペロンの低い用量は、同様に、基質阻害物質の使用を阻む有害な副作用の量および重症度も低減させる。しかしながら、今までのところ、ファブリー病の治療に対するこれらの手法についての臨床および前臨床試験は、有益ではあるにせよ改善が患者のα−ＧａｌＡ活性を正常レベルにすることはできない、ということを示唆している。その上、代理マーカー上または細胞内レベルで薬理シャペロンを用いるファブリー病の臨床治療効果は未知のままである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、ＤＧＪなどの特異的薬理シャペロンでのファブリー病患者の治療方法およびファブリー病に関連する代理マーカーの存在および／またはレベルの変化を評価することによるその治療に対する応答の監視方法を提供する。
【００１８】
一実施形態において、本治療方法には、α−ガラクトシダーゼＡの特異的薬理シャペロンの投与後に、ファブリー病に関連する代理マーカーの改善が存在するか否かを判定するステップが関与する。
【００１９】
具体的な一実施形態においては、改善は、患者が応答者（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）であることを示す。
【００２０】
一実施形態において、代理マーカーは全身性代理マーカーである。特定の実施形態においては、マーカーは、細胞および組織内におけるリソソームα−ガラクトシダーゼＡ活性またはＧＬ−３の蓄積である。別の実施形態において代理マーカーは、ファブリー患者由来の細胞内でＥＲからリソソームへのα−ガラクトシダーゼＡの異常輸送；エンドソーム経路を通した細胞脂質の異常輸送；ＥＲまたは細胞質ゾルにおける誤って折畳まれた大量のα−ガラクトシダーゼＡの存在；（ストレス関連マーカーの遺伝子および／またはタンパク質発現により判定した際の）α−ガラクトシダーゼＡの毒性蓄積が起こす細胞ストレスの存在；エンドソームｐＨレベルの異常；細胞形態の異常；ユビキチン／プロテアソーム経路の抑制；およびユビキチン化タンパク質の量の増加から選択される細胞内代理マーカーである。
【００２１】
具体的な一実施形態においては、薬理シャペロンはα−ガラクトシダーゼＡの阻害物質である。別の実施形態においては、阻害物質は、１−デオキシガラクトノジリマイシンなどの可逆的競合阻害物質である。
【００２２】
本発明は同様に、α−ガラクトシダーゼＡの特異的薬理シャペロン投与後のファブリー病患者の治療応答を監視する方法をも提供している。この方法には、患者に由来する細胞の細胞質染色パターンに対する効果を評価するステップが含まれ、健常な個体に由来する細胞内の染色パターンに類似する細胞内の染色パターンの検出が、ファブリー病を患う個体が応答者であることの指標である。
【００２３】
一実施形態においては、細胞質染色はリソソーム染色である。その他の実施形態においては、リソソーム染色はα−ガラクトシダーゼＡ、ＬＡＭＰ−１発現またはポリユビキチン化タンパク質の存在の検出である。
【００２４】
具体的な一実施形態においては、特異的薬理シャペロンは、α−ガラクトシダーゼＡの阻害物質である。別の実施形態においては、阻害物質は１−デオキシガラクトノジリマイシンなどの可逆的競合阻害物質である。
【００２５】
本発明は同様に、必要としている個体の体内のα−ガラクトシダーゼＡタンパク質の活性を増大させる方法をも提供している。この方法には、タンパク質に結合する有効量の特異的薬理シャペロンを、個体の体内のタンパク質の活性を少なくとも約５０％だけ増大させるのに有効な量で個体に投与するステップが含まれる。
【００２６】
特定の一実施形態においては、α−ガラクトシダーゼＡタンパク質は野生型タンパク質である。別の実施形態においては、α−ガラクトシダーゼＡタンパク質は酵素である。一実施形態においては、酵素はリソソーム酵素である。さらに別の実施形態では、リソソーム酵素は野生型α−ガラクトシダーゼＡタンパク質である。
【００２７】
本発明の一実施形態においては、薬理シャペロンはα−ガラクトシダーゼＡの阻害物質である。別の実施形態においては、阻害物質は、１−デオキシガラクトノジリマイシンなどの可逆的競合阻害物質である。
【００２８】
一実施形態においては、１−デオキシガラクトノジリマイシンは、タンパク質の活性を少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも２倍（約１００％）、より好ましくは少なくとも約３倍〜５倍、より好ましくは少なくとも約１０倍、そしてさらに一層好ましくは少なくとも約１５倍増大させるのに有効な量で投与される。
【００２９】
本発明の一実施形態においては、個体は、野生型タンパク質に対してホモ接合性である。別の実施形態においては、個体は、野生型タンパク質に対してヘテロ接合性であり、タンパク質をコードするその他の対立遺伝子についての変異遺伝子型を有する。特定の実施形態においては、個体はファブリー病を患っている。
【００３０】
本発明の別の実施形態においては、α−ガラクトシダーゼＡ活性は少なくとも２倍、好ましくは少なくとも３倍〜５倍、より好ましくは少なくとも１０倍増大する。具体的な一実施形態においては、α−ガラクトシダーゼＡ活性は、正常範囲内まで増大する。
【００３１】
本発明は同様に、治療が必要な患者におけるファブリー病の治療方法において、個体に対し有効量の１−デオキシガラクトノジリマイシンを投与するステップを含み、１−デオキシガラクトノジリマイシンが、患者の体内のα−ガラクトシダーゼＡの活性を少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも３倍〜５倍、より好ましくは少なくとも１０倍増大させるのに有効な量でα−ガラクトシダーゼＡに結合する方法をも提供している。具体的な一実施形態においては、α−ガラクトシダーゼＡ活性は、正常範囲内まで増大する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】健常なボランティアにおける、プラシーボ、１日２回５０ｍｇおよび１日２回１５０ｍｇについての経時的なα−ＧａｌＡ酵素活性データを示す。
【図２】４８週間にわたるＤＧＪ投与の結果としてのファブリー病患者における白血球活性の平均的増加を示す。
【図３】１２週間にわたるＤＧＪを用いた治療の後の２人のファブリー病患者におけるＧＬ−３レベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、酵素活性レベルを少なくとも約３倍に増大させるかまたは前例のない正常レベルまで酵素活性レベルを増大させるための特異的薬理シャペロンの用量の設定法を提供する。具体的実施形態においては、特異的薬理シャペロンはα−ＧａｌＡの可逆的競合阻害物質、好ましくはＤＧＪである。
【００３４】
さらに、本発明は、１−ＤＧＪなどのα−ＧａｌＡの可逆的競合阻害物質である特異的薬理シャペロンを用いたファブリー病の治療に対する患者の応答を監視するための方法を提供する。特に、治療は、血管壁内の細胞および腎臓、心臓および皮膚細胞を含めた細胞内のグロボトリアオシルセラミド（ＧＬ−３）の細胞被着物；尿中ＧＬ−３レベル；白血球、血漿、皮膚、腎臓および心臓細胞中のα−ＧａｌＡ活性；そして尿中タンパク尿（ｕｒｉｎａｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎｕｒｉａ）を含む（ただしこれらに限定されるわけではない）、ファブリー病に関連するマーカーについて生体試料を検定することによって監視される。付加的なマーカーとしては、角化血管腫、低発汗、チクチクする痛み、または末端部の灼熱感、胃腸障害、白内障またはその他の視力障害および聴力損失の存在が含まれる。
【００３５】
さらに、変異型タンパク質の毒性蓄積に起因する細胞ストレスの緩和および変異型タンパク質の輸送などの細胞内疾病マーカーの評価も同様に想定されている。
【００３６】
本発明は、一部には、ファブリー病治療向けのＤＧＪの第Ｉ相および第ＩＩ相試験から得た結果に基づいている。発見された事実の中には、療法の治療的効果の指標となるファブリー病の代理マーカーに関する変化の特定；α−ＧａｌＡ活性を増大させる投薬量範囲および投薬計画の特定；そして意外にも、白血球中で測定した場合に少なくとも２倍、より好ましくは３倍〜５倍そして一部のケースでは最高１０倍そして１５倍ものα−ＧａｌＡ活性の増大を達成するようにＤＧＪ治療の用量設定を行えること、があった。さらに、白血球中で測定される通り、前例のない治療効果である正常範囲までα−ＧａｌＡ活性レベルを回復させるようにＤＧＪの投与を用量設定することができた。
【００３７】
定義
本明細書中で使用される用語は一般に、本発明に関しておよび各用語が使用される具体的状況の中で当該技術分野におけるその通常の意味を有する。一部の用語について、本発明の組成物および方法そしてその作製および使用方法を説明する上で実施者に対するさらなる指針を提供することを目的として、以下でまたは明細書の他の箇所で論述される。
【００３８】
「ファブリー病」という用語は、リソソームα−ガラクトシダーゼ活性の欠損に起因するスフィンゴ糖脂質異化のＸ連鎖先天異常を意味する。この欠陥は、グロボトリアオシルセラミドおよび関連するスフィンゴ糖脂質の、心臓、腎臓、皮膚およびその他の組織内での蓄積をひき起こす。
【００３９】
「非定型ファブリー病」という用語は、α−ＧａｌＡ欠損症の主として心臓での徴候、すなわち心臓特に左心室の有意な肥大につながる心筋細胞中の漸進的なグロボトリアオシルセラミドの蓄積を示す患者を意味する。
【００４０】
「ファブリー病患者」とは、以下で定義されているような変異α−ガラクトシダーゼＡに起因してファブリー病を患うと診断された個体を意味する。
【００４１】
ヒトα−ガラクトシダーゼＡとは、配列番号２に記されているアミノ配列を有するヒトＧｌａ遺伝子によってコードされた酵素を意味する。ヒトα−ＧａｌＡ酵素は４２９個のアミノ酸からなり、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ７８０２７にある。
【００４２】
本明細書で使用される「変異型ａ−ＧａｌＡ」という用語は、酵素がＥＲ内で通常存在する条件下でその未変性立体構造を達成できなくする変異を有するａ−ＧａｌＡを意味する。この立体構造が達成できない場合、結果として酵素は、タンパク質輸送系内のその正常な経路を通してリソソームまで輸送されるのではなくむしろ分解させられる。この用語は同様に、酵素活性の減少またはより急速な代謝回転を結果としてもたらすその他のα−ＧａｌＡ変異をも包含する。
【００４３】
ファブリー病に結びつけられる例示的なα−ＧａｌＡ変異としては、Ｒ３０１Ｑ、Ｌ１６６Ｖ、Ａ１５６Ｖ、Ｇ２７２ＳおよびＭ２９６Ｉが含まれる。
【００４４】
本明細書中で使用される「特異的薬理シャペロン」（「ＳＰＣ」）または「薬理シャペロン」という用語は、１つのタンパク質に特異的に結合し、（ｉ）タンパク質の安定した分子立体構造の形成を増強する；（ｉｉ）ＥＲから別の細胞位置好ましくは未変性細胞位置までの輸送を誘発する、すなわちタンパク質のＥＲ関連分解を防止する；（ｉｉｉ）誤って折畳まれたタンパク質の凝集を防止する；および／または（ｉｖ）タンパク質に対し少なくとも部分的な野生型機能および／または活性を回復させるまたは増強させる、という効果のうちの１つ以上を有する、小分子、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物などを含めたあらゆる分子を意味する。例えばα−ＧａｌＡに対し特異的に結合する化合物とは、包括的一群の関係するまたは無関係の酵素ではなくα−ＧａｌＡに結合しそれに対してシャペロン効果を及ぼす化合物を意味する。本発明においてはＳＰＣは可逆的競合阻害物質であってよい。以下では、本発明が企図しているいくつかの特異的薬理シャペロンについて記述する：
【００４５】
１−デオキシガラクトノジリマイシンとは、以下の構造を有する化合物を意味する。
【化１】
【００４６】
この用語は、遊離塩基と任意の塩形態の両方を含む。ＤＧＪの塩酸塩は塩酸ミガラスタット（Ｍｉｇｌｕｓｔａｔ）として知られている。
【００４７】
α−ＧａｌＡについてのさらにその他のＳＰＣは、Ｆａｎらに対する米国特許第６，２７４，５９７号明細書、６，７７４，１３５号明細書および６，５９９，９１９号明細書の中で記述されており、α−３，４−ジ−エピ−ホモノジリマイシン、４−エピ−ファゴミン、およびα−アロ−ホモノジリマイシン、Ｎ−メチル−デオキシガラクトノジリマイシン、β−１−Ｃ−ブチル−デオキシガラクトノジリマイシン、およびα−ガラクト−ホモノジリマイシン、カリステジンＡ３、カリステジンＢ２、Ｎ−メチル−カリステジンＡ３、およびＮ−メチル−カリステジンＢ２を含む。
【００４８】
ファブリー病の「代理マーカー」または「代理臨床マーカー」というのは、ファブリー病に関連する（ただし健常な個体には関連しない）かつ単独でまたはファブリー病のその他の異常なマーカーまたは症候と組合せた形でファブリー病の信頼性の高い指標であるバイオマーカーの異常な存在、レベルの増大、異常な不在またはレベルの低下を意味する。
【００４９】
限定的な意味のない例として、ファブリー病の代理マーカーには、細胞（例えば線維芽細胞）および組織中のリソソームα−ＧａｌＡ活性の減少；ＧＬ−３の細胞被着；ホモシステインおよび血管細胞粘着分子−１（ＶＣＡＭ−１）の血漿濃度の増加；心臓肥大（特に左心室の）、弁閉鎖不全および不整脈を導く心筋細胞および弁膜線維芽細胞内部のＧＬ−３蓄積；タンパク尿；ＣＴＨ、ラクトシルセラミド、セラミドなどの脂質の尿濃度の増加およびグルコシルセラミドおよびスフィンゴミエリンの尿濃度の減少（Fuller et al., Clinical Chemistry. 2005; 51: 688-694）；糸球体上皮細胞内の積層封入体（ゼブラ小体）の存在；腎不全；発汗低下（これは高熱不耐性をひき起こす）；角化血管腫の存在；および高頻度感音難聴、進行性難聴、突発性難聴、または耳鳴りなどの聴覚異常が含まれる。神経症状には、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）または卒中；肢端強皮症（末端部のヒリヒリ感またはチクチク感）として表われる神経因性疼痛が含まれる。
【００５０】
ファブリー病の特徴的マーカーは、男性のヘミ接合体と女性のヘテロ接合体（キャリヤ）において、同じ有病率で発生するが、女性の方が典型的に罹患の重症度が低い。
【００５１】
その他の代理マーカーは、細胞内レベルで存在し（「細胞内代理マーカー」）、ファブリー患者由来の細胞内におけるＥＲからリソソームへのα−ＧａｌＡの異常輸送；エンドソーム経路を通した脂質の異常輸送；ＥＲまたは細胞質ゾルにおいて誤って折畳まれた大量のα−ＧａｌＡの存在；（ストレス関連マーカーの遺伝子および／またはタンパク質発現により判定した際の）α−ＧａｌＡの毒性蓄積が起こす細胞ストレスの存在；エンドソームｐＨレベルの異常；細胞形態の異常；ユビキチン／プロテアソーム経路の抑制；およびユビキチン化タンパク質の量の増加を含む。
【００５２】
「代理マーカーの改善」というのは、ＳＰＣを用いた治療の後の、ファブリー病を患っておらずしかもその代理マーカーの異常な存在、不在または量の変化を説明するその他の疾病を患っていない健常な個体と比べてファブリー病において異常に存在するか、異常に不在であるかまたは増加した量もしくは減少した量で存在する１つ以上の臨床的代理マーカーの改善、削減または増大の効果を意味する。
【００５３】
「応答者」というのは、１つ以上の代理マーカーの改善および／または疾病の進行の改善または逆転を示す、ファブリー病に関連する疾病および付随するα−ＧａｌＡ変異の診断を受けここで請求されている方法にしたがって治療され監視される個体のことである。
【００５４】
さらに、個体が応答者であるか否かの決定は、ＳＰＣを用いた治療に応答した変異型α−ＧａｌＡタンパク質の細胞内輸送などを評価することによって、細胞内レベルで行なうことができる。ＥＲからリソソームまでの輸送の回復は、応答を示す。個体が応答者であるか否かを決定するために査定され得るその他の細胞内評価には、上述の細胞内代理マーカーの改善が含まれる。
【００５５】
具体的な一実施形態においては、本発明は、患者由来の白血球の中で決定されるα−ＧａｌＡ活性の約３倍増加を達成するためのＤＧＪを用いた治療方法を提供する。さらなる実施形態においては、本発明は、例えば白血球中で測定されるα−ＧａｌＡ活性の少なくとも５倍増加、またはα−ＧａｌＡ活性の１０倍増加、そして具体的実施形態ではα−ＧａｌＡ活性の１５倍増加を達成するためのＤＧＪを用いた治療方法を提供する。本発明は最低限、α−ＧａｌＡ活性の少なくとも２倍増加を提供する。
【００５６】
同様にして、本発明は、ファブリー病患者由来の白血球内でα−ＧａｌＡ活性の正常範囲内までの増大の達成を提供しており、その他の治療的戦略を用いては達成されたことがなく前臨床データが予想できなかったと思われる結果がこれにあてはまる。具体的な実施形態においては、「正常範囲」というのは、The Metabolic & Molecular Bases of Inherited Disease, 8th Edition McGraw Hill, 2001)からのデータの中に記載されている通りの活性範囲である。
【００５７】
「治療上有効な用量」および「有効量」という用語は、治療応答を得るのに充分である特異的薬理シャペロンの量を意味する。治療応答とは、前述の症候および代理臨床マーカーのいずれかの改善を含め、療法に対する有効な応答としてユーザー（例えば臨床医）が認識するあらゆる応答であってよい。治療応答とは、前述の症候および代理臨床マーカーのいずれかの改善を含め、療法に対する有効な応答としてユーザー（例えば臨床医）が認識するあらゆる応答であってよい。したがって治療応答は、一般的に、上述のもののような疾患または障害の１つ以上の症候またはマーカーの改善である。
【００５８】
「薬学的に許容できる」という語句は、生理学的に許容可能であり、ヒトに投与された場合に典型的には、望ましくない反応を生成しない分子的実体および組成物を意味する。好ましくは、本明細書で使用されている「薬学的に許容できる」という用語は、連邦または州政府の規制機関により承認されていることまたは、動物、より詳細にはヒトにおける使用のために米国薬局方またはその他の一般的に認知された薬局方の中に列挙されていることを意味する。「担体」という用語は、化合物を投与する場合に用いられる希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを意味する。かかる薬学的担体は、水および油などの無菌の液体であり得る。特に注射用溶液用の担体として、好ましくは、水または水溶液食塩溶液およびデキストロースおよびグリセロール水溶液が利用される。適切な薬学的担体は、"Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin, 18th Editionの中で記述されている。
【００５９】
「約」および「およそ」という用語は、一般に、測定の性質または精度から許容可能な程度の測定数量についての誤差を意味する。典型的には、例示的な誤差の程度は所与の値または値範囲の２０パーセント（％）以内、好ましくは１０％以内、そしてより好ましくは５％以内である。本明細書中で示されている数値的数量は、特に明記しないかぎり近似であり、これは、明示的に記載されていない場合に「約」または「およそ」という用語が暗示され得る、ということを意味している。
【００６０】
製剤および投与
ＳＰＣを全身に送達するために、任意の適切な医薬製剤を使用してよい。一部の実施形態においては、ＳＰＣは、可逆的競合阻害物質である。一実施形態において、阻害物質はイミノ糖例えばＤＧＪであり、これは単剤療法として、好ましくは経口剤形で投与される。この実施形態においては、投薬計画が、治療対象の個体の血漿中で安定した定常状態レベルの化合物を提供するものでなくてはならない。これは、分割用量または制御放出型製剤を毎日投与することによってか、または持続放出剤形を、頻度を少なくして投与することによって得ることができる。
【００６１】
製剤
ＳＰＣは、例えば錠剤、カプセルまたは液体の形での経口投与または注射用無菌水溶液の形での投与を含めたあらゆる投与経路に適した形で投与可能である。一部の実施形態においては、ＳＰＣは阻害物質好ましくはＤＧＪ糖などの可逆的競合阻害物質である。化合物を経口投与向けに調合する場合、錠剤またはカプセルは、結合剤（例えばアルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えばラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えばジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容できる賦形剤を用いて従来の手段により調製可能である。錠剤は、当該技術分野において周知の方法によりコーティングされてよい。
【００６２】
具体的な一実施形態においては、ＤＧＪ−ＨＣｌは、ステアリン酸マグネシウム（植物性）およびデンプン１５００（２５ｍｇのＤＧＪ／カプセル）と共に粉末充填された硬ゼラチンカプセルとして投与される。
【００６３】
経口投与のための液体調製物は、例えば溶液、シロップまたは懸濁液などの形をとっていてもよいし、または使用前に水または別の適切なビヒクルと共に構成するための乾燥製品としての体裁をとっていてもよい。このような液体調製物は、懸濁剤（例えば水、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用油）；乳化剤（例えばレシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えばアーモンドオイル、油性エステル、エチルアルコールまたは分留植物油）；および防腐剤（例えばメチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）などの薬学的に許容できる添加剤を用いて、従来の手段によって調製されてよい。調製物は同様に、適宜、緩衝塩、着香料、着色剤および甘味料を含有していてよい。経口投与向けの調製物は、セラミド特異的グルコシルトランスフェラーゼ阻害物質の制御放出または持続放出を提供するように適切に調合され得る。
【００６４】
もう１つの具体的な実施形態においては、１００ｍｇのＤＧＪを経口水溶液（約２４０ｍｌ）の形で投与する。
【００６５】
非経口／注射用途に適したＳＰＣの医薬製剤には一般に、無菌水溶液または分散剤、そして無菌注射溶液または分散剤の即時調製用の無菌粉末が含まれる。全てのケースにおいて、形態は無菌でなくてはならず、注射針を容易に通過する程度に流動的でなくてはならない。それは、製造および貯蔵条件下で安定していなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用を受けないように保存されていなくてはならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物および植物油を含む溶媒または分散媒質であり得る。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用、分散の場合には所要粒径の維持そして界面活性剤の使用などによって維持可能である。微生物の作用の予防は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ベンジルアルコール、ソルビン酸などといったさまざまな抗細菌および抗真菌剤により得ることができる。数多くのケースにおいて、例えば糖または塩化ナトリウムなどの等張剤を含み入れることが合理的である。注射用組成物の長時間吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンといった吸収を遅延させる作用物質を組成物中に使用することによって得ることができる。
【００６６】
無菌注射溶液は、必要に応じて以上で列挙したその他の成分のさまざまなものと共に適切な溶媒中に所要量でＳＰＣを取込み、その後ろ過または最終滅菌を行なうことによって調製される。一般に、分散剤は、以上に列挙したその他の所要成分および基本的分散媒質を含有する無菌ビヒクル中にさまざまな滅菌済み活性成分を取込むことによって調製される。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、事前に無菌ろ過した溶液から、活性成分に任意の付加的な所望の成分が加わった粉末を生成する真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【００６７】
上述の製剤は、１つまたは複数の賦形剤を含有し得る。製剤中に含み入れてよい薬学的に許容できる賦形剤は、緩衝液例えばクエン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、および重炭酸塩緩衝液、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質例えば血清アルブミン、コラーゲンおよびゼラチン；塩例えばＥＤＴＡまたはＥＧＴＡおよび塩化ナトリウム；リポソーム；ポリビニルピロリドン；糖例えばデキストラン、マンニトール、ソルビトール、およびグリセロール；プロピレングリコールおよびポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ−４０００、ＰＥＧ−６０００）；グリセロール、グリシンまたはその他のアミノ酸および脂質である。製剤と共に使用するための緩衝系としては、クエン酸塩、酢酸塩、重炭酸塩、およびリン酸塩緩衝液が含まれる。リン酸塩緩衝液が好ましい実施形態である。
【００６８】
製剤は同様に非イオン洗浄剤も含有できる。好ましい非イオン洗浄剤にはポリソルベート２０、ポリソルベート８０、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４、ノニデットＰ−４０、オクチルα−グルコシド、オクチルβ−グルコシド、ブリッジ３５、プルロニックおよびトゥイーン２０が含まれる。
【００６９】
投与
ＳＰＣの投与経路は、（好ましくは）経口であるかまたは、静脈内、皮下、動脈内、腹腔内、眼内、筋内、口腔、直腸、膣内、眼窩内、脳内、皮内、頭蓋内、髄腔内、心室内、鞘内、嚢内、関節包内、肺内、鼻腔内、経粘膜、経皮、または吸入を介したものであってよい。
【００７０】
ＳＰＣの上述の非経口製剤の投与は、調製物の定期的なボーラス注入によるものであってよく、または、体外容器（例えば静注用バッグ）または体内容器（例えば生体侵食性移植片）からの静脈内または腹腔内投与によって投与されてよい。例えば、各々参照により本明細書に援用されている米国特許第４，４０７，９５７号明細書および同第５，７９８，１１３号明細書を参照のこと。肺内送達の方法および器具は、例えば各々参照により本明細書に援用されている米国特許第５，６５４，００７号明細書、同第５，７８０，０１４号明細書および同第５，８１４，６０７号明細書の中に記載されている。その他の有用な非経口送達系としては、エチレン酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な輸液系、ポンプ送達、カプセル化細胞送達、リポソーム送達、針送達型注射、無針注射、ネブライザ、エアロゾル化装置、電気穿孔、および経皮パッチが含まれる。無針注射装置は、参照により本明細書に援用されている米国特許第５，８７９，３２７号明細書；同第５，５２０，６３９号明細書；同第５，８４６，２３３号明細書および同第５，７０４，９１１号明細書の中に記載されている。上述の製剤のいずれもこれらの方法を用いて投与可能である。
【００７１】
さらに、詰め替え可能なペン型注射器および無針注射装置などの患者に便利なように設計されたさまざまな装置を本明細書中で論述されている本発明の製剤について使用してよい。
【００７２】
投薬量
当業者であれば、本発明の方法において使用されている化合物の有効量は、日常的実験により判定され得るが、０．０１〜１００μＭの間、好ましくは０．０１〜１０μＭの間、最も好ましくは０．０５〜１μＭの間の血清レベルを得るための量になるものと予想される、ということを理解する。マウスにおける臨床試験および前臨床試験により、ＤＧＪの薬理学的効果（酵素活性の増強）が、およそ０．４μＭの血漿濃度で見られるということが示唆されている。
【００７３】
ＳＰＣの有効用量は１日体重１ｋｇあたり０．５〜１０００ｍｇの間であると予想されている。ＳＰＣがＤＧＪである具体的実施形態においては、用量は１日あたり約１０〜６００ｍｇ、より具体的には２５〜３００ｍｇ、より具体的には５０〜１５０ｍｇ／日である。
【００７４】
詳細な実施形態においては、ＤＧＪは、２５ｍｇ１日２回、１００ｍｇ１日２回または２５０１日２回で投与される。複数回用量第Ｉ相試験からのデータは、５０ｍｇ１日２回の投薬で０．４μＭのトラフ濃度が得られることを示している。ファブリー病患者についての第ＩＩ相試験からのデータは、評価された最低用量（２５ｍｇ１日２回）での酵素活性の増加を実証した。
【００７５】
代理マーカーを用いたファブリー病治療の監視
本発明は同様に、特異的薬理シャペロンを用いたファブリー病患者の治療を監視する方法も提供している。具体的には、疾患の進行およびＤＧＪでの治療に対するその応答を評価するためにさまざまな検定が利用される。特に、さまざまな全身および細胞内マーカーを検定することができる。本発明の監視態様は、さまざまな細胞物質の侵襲的測定および非侵襲的測定の両方を包含している。
【００７６】
グロボトリアオシルセラミドの蓄積
ファブリー病に罹患したヒトの血漿および尿中のグロボトリアオシルセラミド（ＧＢ３またはＧＬ−３）濃度を測定する方法が、Boscaro et al., Rapid Commun Mass Spectrom. 2002;16(16):1507-14の中に記載されている。この参考文献では、分析は、フローインジェクション分析−エレクトロスプレーイオン化−タンデム質量分析法（ＦＩＡ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）を用いて実施される。
【００７７】
ファブリー病患者の皮膚内に蓄積されたＧＬ−３の免疫電子顕微鏡による検出が、Kanekura et al., Br J Dermatol. 2005;153(3):544-8の中に最近記載された。この方法は、ＧＬ−３のリソソーム蓄積を検出するのに充分な感度を示す。皮膚生検は、皮膚から試料層を取り出す「パンチ」装置を使用することによって採取することができる。
【００７８】
腎生検は、超音波、Ｘ線またはＣＴスキャンによる誘導を用いて実施される。一部の状況下では、生検は、頸静脈の１つに生検カテーテルを通すことにより実施され、これは経頸静脈生検と呼ばれる。腎臓内、具体的には血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、メサンギウム細胞および間質細胞、有足細胞および遠位尿細管上皮細胞を含めた全ての腎細胞型におけるＧＬ−３蓄積が、Thurburg et al., Kidney Int. 2002;62(6):1933-46.の中に記載されている。腎臓生検の超構造研究（電子顕微鏡）によって、全タイプの腎臓細胞の細胞質内の典型的封入体を明らかにすることができる（Sessa et al., J Inherit Metab Dis. 2001; 24 Suppl 2:66-70)。細胞は、３５〜５０Ａの周期性を伴う明暗層の同心的薄層形成（「シマウマ」または「たまねぎの皮」の外観）によって特徴づけされる。
【００７９】
腎臓機能は、確立した方法にしたがって糸球体ろ過速度（ｍｌ／分）を決定することによっておよび血清クレアチンレベルを査定することによって査定可能である。その他の腎臓査定としては、２４時間のタンパク質排泄、尿中タンパク電気泳動、総タンパク量、微量アルブミン、尿中ベータ−２−マイクログロブリン力価が含まれる。ＧＬ−３堆積物およびタンパク尿の減少が、腎臓の健常性の直接的な測定値である。
【００８０】
近年、大気圧光イオン化質量分析法（ＡＰＰＩ−ＭＳ）が、直接注射および液体クロマトグラフィ（ＬＣ）との結合の両方の場合に、ＧＬ−３分子種の分析用として効率の良い方法であることが示された。この技術は、ファブリー病患者から単離した生体試料からの多数の種の検出を可能にした（Delobel et al., J Mass Spectrom. 2005 Nov 14; [Epub ahead of print]［印刷前電子出版］）。
【００８１】
α−ガラクトシダーゼ活性
上述の通り、α−ＧａｌＡ活性の非侵襲的査定を、血液白血球中または培養された線維芽細胞中で測定することができる。かかる検定には典型的に、患者からの血液白血球の抽出、細胞の溶解そして４−メチルウンベリフェラルアルファＤ−ガラクトシドおよび／またはＮ−アセチルガラクトースアミンなどの酵素基質の添加時点での溶解物中の活性の決定が関与する（米国特許第６，２７４，５９７号明細書参照）。
【００８２】
血液および血漿中のα−ガラクトシダーゼの濃度を決定するためのα−ＧａｌＡ活性およびタンパク質の測定用の２つの高感度免疫検定が、Fuller et al., Clin Chem. 2004;50(11):1979-85中に記載されている。
【００８３】
本発明によると、α−ＧａｌＡ活性の少なくとも２倍増加、そして一部のケースではα−ＧａｌＡ活性の少なくとも３倍増加、少なくとも５倍、最高１０倍までの増加、そして一部の実施形態では１５倍増加を達成するように投薬量を設定することが可能である。これらの結果は、白血球で観察できる。
【００８４】
別の実施形態においては、本発明は、ファブリー病患者におけるα−ＧａｌＡ活性の正常なレベルを達成するべくＤＧＪの投薬量を設定することを提供している。
【００８５】
心臓の評価
α−ＧａｌＡ活性の増加は、少なくとも心臓疾患患者のサブセットにおいて心臓疾患を監視するかまたは検出する役割を果たし得る。心臓細胞内のＧＬ−３の評価は、心内膜心筋生検を通して達成できる。これは、心筋組織の小片を採取するために生検鉗子（端部に把持装置を備えた小さなカテーテル）を使用することが関与する侵襲的処置である。
【００８６】
核周辺空胞内に存在するＧＬ−３は、酸性染色液で陽性に染色される。さらに、生検の組織学的検査は、透過電子顕微鏡法を用いて心内膜の肥厚を確認し、心室質量を測定し、または肥大性心筋繊維の存在を判定することにより行なうことができる。
【００８７】
さらに、総頸動脈および橈骨動脈の直径、内膜−中膜厚み（ＩＭＴ）および伸展性が、高解像度エコートラッキングシステムおよび圧平眼圧測定を用いて査定された。Boutouyrie et al., Acta Paediatr Suppl. 2002;91(439):62-6。心筋細胞は同様に、ＧＬ−３の蓄積についても検査される。ＭＲＩまたはドップラー心エコー検査法を用いて、巨視的心臓形態を査定することができる。心臓機能は、例えば左心室駆出分画を決定することおよび心電図を用いることによって査定することができる。
【００８８】
神経因性疼痛／末梢神経障害
末端部の疼痛は、患者に対して行なわれる主観テストを用いて査定できる。さらに、神経障害を評価するためには定量的官能検査（ＣＡＳＥ試験）を使用することができる。ＣＡＳＥ試験は、冷たさ、暖かさまたは振動の感覚を感じた時点で直ちにボタンを押すよう患者に求める生物物理学的技術である。これらの刺激は、手または足の皮膚に置かれた電極によって送達される。
【００８９】
脳血管
卒中および高血圧に加えて、その他のファブリー関連の脳血管徴候および関連する症候としては、片側不全麻痺、めまい、複視；発作；脳底動脈虚血および動脈瘤；内耳迷路障害または脳内出血が含まれ得る。
【００９０】
神経系
ファブリー病を患う男性および女性の患者には、有意な加齢に関連した大脳白質病巣（ＷＭＬ）を見出すことができる。神経学的効果の評価は、例えば定量的発汗刺激性軸索反射試験（ＱＳＡＲＴ）を用いて査定できる。ＱＳＡＲＴは、自律機能の日常的試験およびファブリー病において見られるような遠位細径線維神経障害における高感度試験である。
【００９１】
発汗低下／発汗減少
ファブリー病患者における発汗障害および高熱不耐性は、選択的な末梢神経損傷または汗腺をとり囲む小血管内の細胞質内脂質被着に原因があるとされてきた。
【００９２】
Hilz et al. (Acta Paediatr Suppl. 2002;91(439):38-42)は、ファブリー病患者における温度知覚、振動知覚、発汗刺激性およびエクリン汗腺機能、および四肢および表皮血流および血管反応性の障害を査定するための方法について記述した。これらの方法には、熱誘発試験、定量的発汗刺激性軸索反射試験（ＱＳＡＲＴ）および静脈閉塞プレチスモグラフィが含まれる。ＱＳＡＲＴは３つの部分を有し、安静時皮膚温、安静時汗出力および刺激された発汗量を測定する。測定は典型的には腕、脚またはその両方で行なわれる。小さなプラスチック製カップが皮膚上に置かれ、温度と皮膚下の汗の量が測定される。発汗を刺激するために、皮膚を通して汗腺まで電気的に化学物質が送達されるが、患者は暖かさしか感じない。神経および汗腺が正しく機能しているか否かを判定するべくデータを分析するのにコンピュータが使用される。
【００９３】
さらに、涙液および唾液の減少も、約４０％のファブリー病患者にみられる。
【００９４】
温度不耐性
高熱不耐性に加えて、小血管壁、神経周囲細胞および無髄神経細胞または有髄神経細胞内に脂質が被着した結果、細径線維神経障害が起こるために低温および熱感受性が発生することが多い。
【００９５】
眼内混濁
ファブリー病患者は、ほぼ例外なく、渦巻き状の角膜混濁、水晶体混濁および結膜と網膜の血管病変を示す。角膜混濁は、細隙灯顕微鏡検査を用いて見ることができる。ファブリー病患者には、（時としてプロペラ状に分布した）水晶体内のクリーム色の前嚢被着および（ファブリー白内障と呼ばれる）水晶体後面上の白っぽい粒状スポーク様被着といった２つのタイプの水晶体混濁が指摘されてきた。
【００９６】
聴力損失
従来の聴力検査、鼓膜聴力検査、ＡＢＲ聴力検査および耳音響放射を用いた蝸牛機能を評価するための非侵襲性方法が、Germain et al., BMC Med Genet. 2002;3(1):10)の中に記載されている。
【００９７】
胃腸障害
胃腸症候は、腸間膜血管および自律神経節内のスフィンゴ糖脂質付着の結果発生し得る。症候には、食後鼓腸；腹部のけいれんおよび疼痛；早期満腹感；下痢；便秘；吐き気；嘔吐が含まれる。
【００９８】
その他の代理マーカー
ファブリー病のその他のマーカーには、ＧＬ−３の蓄積に起因するリンパ浮腫（末端部の膨れ）が含まれる。さらに、ファブリー病患者には拡張期血圧の有意な減少が存在することが最近になって発見されており、これにより運動耐容の説明がつくかもしれない（Bierer et al., Respiration. 2005;72(5):504-11）。
【００９９】
これらのマーカーは、治療前にそれらが異常であると識別された場合にのみ治療を監視するために使用可能であるということを理解すべきである。さらに、マーカーの異常な上昇が、ファブリー病の存在と相関関係づけされ、腎臓疾患またはその他の脳血管疾患などのその他の原因または合併症に起因しないということも認識されている。
【０１００】
細胞内マーカーを検出するための分子生物学監視検定
特異的薬理シャペロンを用いたファブリー病の治療の監視は、上述の全身的または巨視的レベルに加えて細胞内レベルで行なうことができる。例えば、ゴルジ複合体への脂質のエンドソーム−リソソーム膜輸送の障害が、リソソーム蓄積症の特徴である（Sillence et al., J Lipid Res. 2002;43(11):1837-45）。したがって、ファブリー病治療の１つの監視方法は、標識された脂質（ＢＯＤＩＰＹ−コレステロール）を有する患者由来の細胞に接触し、エンドソーム構造内でのその輸送を監視することにある。例えばエンドソーム構造内の病的蓄積は、その患者が治療にうまく応答していないことの指標であると考えられる。
【０１０１】
一例として、リソソームおよびエンドソーム内のｐＨ範囲を測定するために、細胞により取り込まれるｐＨ感応性蛍光プローブを使用することができる（すなわち、フルオレセインはｐＨ５で赤色であり、５．５〜６．５で青色乃至緑色である）。リソソームの形態およびｐＨが、野生型細胞とシャペロン治療された患者および未治療の患者の細胞において比較される。この検定は、ｐＨ感受性を判定するために平板読取り装置検定と並行して実行できる。例えば、ＢＯＤＩＰＹ−ＬａｃＣｅｒは、正常細胞中ではゴルジまで輸送されるが、脂質蓄積障害では細胞のリソソームに蓄積する。ＢＯＤＩＰＹ−ＬａｃＣｅｒは、膜内の濃度に応じて緑色または赤色の蛍光を発し、リソソーム内の緑色／赤色比を用いて濃度変化を測定することができる。化合物で処理されたおよび未処理の生きた健常な細胞および患者の細胞がＢＯＤＩＰＹ−ＬａｃＣｅｒでインキュベートされ、ＦＡＣＳおよび／または共焦点顕微鏡で赤色／緑色比を測定することができ、共焦点顕微鏡を用いて染色パターン（リソソーム対ゴルジ）を決定することができる。
【０１０２】
輸送は、ｐＨ勾配に沿って細胞内で発生し（すなわちＥＲのｐＨ約７、ゴルジのｐＨ約６．２〜７．０、トランスゴルジ網のｐＨ約６．０、早期および後期エンドソームのｐＨ約６．５、リソソームのｐＨ約４．５）、ファブリー細胞などの輸送欠陥を有する細胞内では内腔およびエンドソームｐＨが分断される。したがって、輸送に対するｐＨのプラス効果に相関された場合、野生型細胞、ＳＰＣ治療を受けた患者および未治療の患者の細胞におけるｐＨ感受性を判定するための検定を用いて、ファブリー病患者における輸送の回復を監視することができる。患者の細胞のｐＨ変化に対する感受性がさらに強い場合には、細胞ｐＨ感受性を低減させ、リソソームの形態または機能を回復させ、またより一般的には正常な輸送を回復させるＳＰＣについてのスクリーニング検定を作り出すことが可能となる。
【０１０３】
さらに、輸送欠陥の軽減は、Ｌｙｓｏ−Ｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）などのリソソームマーカーでの欠損酵素（α−ＧａｌＡ）の同時局在化を判定することにより分子レベルで査定可能である。リソソーム内のα−ＧａｌＡの局在化は、ＥＲからリソソームまでの輸送が特異的薬理シャペロンを用いた治療により回復することの証拠である。簡単に言うと、正常な細胞およびＳＰＣで治療されたおよび未治療の患者の細胞が酵素およびエンドソーム／リソソームマーカー（例えばＲａｂ７、Ｒａｂ９、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ジストロフィン関連タンパク質ＰＡＤ）に対する一次抗体および蛍光タグ付けされた二次抗体と共に固定され染色される。酵素およびその他のエンドサイトーシス経路マーカーの濃度に起因する蛍光の量を定量化するためにＦＡＣＳおよび／または共焦点顕微鏡が使用され、染色パターンの変化を判定するために共焦点顕微鏡を用いることができる。さらに、エンドグリコシダーゼＨ処理の組合わされたパルス−チェイス代謝標識などの従来の生化学方法。Ｅｎｄｏ Ｈは、ＥＲグリコシル化を獲得した（高マンノースＮ−連結）、すなわちＥＲに局在化されているタンパク質のみを分割し、ＥＲ外でゴルジまでそれを行ないゴルジ内で付加的なグリコシル化を獲得したタンパク質を分割しない。したがって、Ｅｎｄｏ Ｈ感受性α−ＧａｌＡのレベルが高くなればなるほど、ＥＲ内のタンパク質の蓄積が増大する。α−ＧａｌＡがゴルジ内へそれを行なった場合、全てのＮ連結糖が分割されることから、タンパク質がゴルジから退出したか否かを確認するためにグリコシダーゼＰＮＧアーゼＦを使用することができる。
【０１０４】
ＥＲストレス。ファブリー病患者における誤って折畳まれたα−ＧａｌＡなどのＥＲ細胞内の誤って折畳まれたタンパク質の毒性蓄積は、ＥＲストレスをもたらすことが多い。これにより、細胞ホメオスタシスの分断を解消しようと試みる細胞ストレス応答が誘発されることになる。したがって、特異的薬理シャペロンでの治療の後の患者におけるＥＲストレスのマーカーを測定することで、治療の効果を監視する別の方法が提供される。かかるマーカーには、ＢｉＰ、ＩＲＥ１、ＰＥＲＫ／ＡＴＦ４、ＡＴＦ６、ＸＢＰ１（Ｘ−ｂｏｘ結合因子１）およびＪＮＫ（ｃ−Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ）を含む、折畳まれていないタンパク質の応答と結びつけられる遺伝子およびタンパク質が含まれる。ＥＲストレスを査定するための１つの方法は、野生型細胞とファブリー病患者細胞との間と同様、ＳＰＣ治療を受けた細胞と未治療の細胞との間の発現レベルを比較することにある。対照として、ＥＲストレス誘発物質（例えばＥＲ内の折畳まれていないタンパク質のＮ−グリコシル化および蓄積の阻害ためのツニカマイシン、ラクタシスチンまたはＨ２Ｏ２）およびストレス緩和剤（例えばタンパク質合成を阻害するためのシクロヘキサミド）を使用することができる。
【０１０５】
ＥＲストレス応答を監視するために企図されている別の方法は、遺伝子チップ解析を介したものである。例えばさまざまなストレス遺伝子を伴う遺伝子チップを用いて、ＥＲストレス応答のタイプ（早期、後期、アポトーシスなど）および発現レベルを測定することができる。一例として、ＨＧ−Ｕ９５Ａアレイを使用することができる（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．）。
【０１０６】
最後に、長期にわたるＥＲストレスが、ＥＲ内の折畳まれていないタンパク質のレベルおよび結果としてのストレスレベルに応じて、アポトーシスおよび細胞死をもたらし得ることから、細胞は多少の差こそあれ、ツニカマイシンまたはプロテアソーム阻害物質などのＥＲストレス誘発物質に対する感受性を有する。ストレス誘発物質に対する細胞の感受性が高くなればなるほど、観察されるアポトーシスまたは死細胞の数は多くなる。アポトーシスは、カスパーゼ３（アポトーシスの早期指標）について蛍光基質類似体、ＦＡＣＳ、共焦点顕微鏡を使用して、かつ／または蛍光平板読取り装置（ハイスループット検定のためには９６ウェルのフォーマット）を用いてアポトーシスまたは細胞死について陽性の細胞の百分率を決定すること（ＦＡＣＳおよび／または共焦点顕微鏡検査）を用いて測定でき、そうでなければ蛍光平板読取り装置で９６ウェルのフォーマットでのタンパク質濃度との関係において蛍光強度を測定することができる。
【０１０７】
ＥＲ中の毒性タンパク質蓄積の結果としてもたらされる細胞ストレスに対する別の応答は、ユビキチン／プロテアソーム経路の抑制である。これにより、エンドサイトーシス経路は全体的に破壊される（Rocca et al., Molecular Biology of the Cell. 2001; 12: 1293-1301）。誤って折畳まれたタンパク質の蓄積は時として、ポリユビキチンの量の増加と相関される（Lowe et al., Neuropathol Appl Neurobiol. 1990; 16: 281-91）。
【０１０８】
プロテオソーム機能およびユビキチン化は、日常的検定を用いて査定できる。例えば、生きた動物における２６Ｓプロテアソーム機能のイメージングによる評価が、生物発光イメージング用のユビキチン−ルシフェラーゼリポータにより達成された（Luker et al., Nature Medicine. 2003. 9, 969-973）。プロテアソーム単離のためのキットは、例えばＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｃａｔ．Ｎｏ．５３９１７６）から市販されている。ユビキチン化は、免疫組織化学または免疫蛍光を用いて、形態学的試験によって検査可能である。例えば、健常な細胞およびＳＰＣで治療されたおよび未治療の患者の細胞を、ユビキチン化されたタンパク質に対する一次抗体と共に固定および染色することができ、ＦＡＣＳおよび／または共焦点顕微鏡検査による二次抗体の蛍光検出を用いて、ユビキチン化されたタンパク質レベルの変化を判定する。
【０１０９】
ユビキチン化されたタンパク質を検出するための別の検定は、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ(商標)（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）である。このモデルでは、ビオチン−ユビキチン（ｂｉｏ−Ｕｂ）を用いて、ＧＳＴ−ＵｂｃＨ５ａ融合タンパク質のＧＳＴ部分がユビキチン化される。ＡＴＰの存在下でのＥ１によるユビキチン活性化の後、ｂｉｏ−ＵｂがＵｂｃＨ５ａに移送される。この反応において、ＵｂｃＨ５ａはｂｉｏ−Ｕｂをそのタグ付けされたＧＳＴ部分に移送するための担体として作用する。ビオチニル化されたユビキチン化された状態となったタンパク質は次に、抗−ＧＳＴアクセプタおよびストレプトアビジンにより捕捉される。ドナーはビーズを作り、結果としてシグナルを生成する。ユビキチン化が無い場合、いかなるシグナルも生成されない。
【０１１０】
最後に、ＥＬＩＳＡサンドイッチ検定を用いて、変異型α−ＧａｌＡを捕捉することができる。α−ＧａｌＡ（例えばウサギ）に対する一次抗体は表面に吸収され、酵素が、細胞溶解物または血清とのインキュベーション中に捕捉され、次に二次酵素結合検出を伴って、ユビキチン化タンパク質に対する抗体（例えばマウスまたはラット）を用いてユビキチン化酵素の量が検出かつ定量化される。あるいは、検定を用いて、細胞抽出物または血清中のマルチユビキチン化タンパク質の合計量を定量化することができると思われる。
【０１１１】
女性キャリヤ
一部の女性キャリヤは、無症候状態にとどまり、正常なα−ＧａｌＡ濃度を有する一方、一部は、特に年令が高くなるにつれて軽度乃至重度の疾病の臨床症候を示す。この可変性は、一部には、女性の胚の一部のまたは全ての細胞中の１個のＸ染色体の不活性化の結果であると考えられている。１１人の女性キャリヤについての一試験において、タンパク尿、肢端感覚異常および角化血管腫が疾病の最も一般的な症候であることが発見された（Guffon, Journal of Medical Genetics. 2003; 40: e38）。一部の患者は、めまい、腹痛、うつ病、運動／高熱不耐性、冷えまたは発熱および発汗、衰弱およびうつ病を含めた症候を示した。弁膜症および重度の肥大性心筋症が、４０歳代、５０歳代または６０歳代で発生し、患者のうち２人が、移植を要する末期的腎不全を示した。一人の女性は、内嚢視床卒中を有し、肺合併症（１人において慢性閉塞性気管支肺症および肺塞栓症）も２人の患者において記録された。
【０１１２】
以上のことから、本発明の方法は、女性キャリヤの治療を開始する場合にも利用可能である。
【０１１３】
併用療法
本発明の治療的監視は同様に、ＤＧＪおよびＥＲＴまたは遺伝子療法の組合せを用いた患者の治療の後にも適用可能である。このような併用療法は、同一所有者の米国特許出願公開第２００４／０１８０４１９号明細書（出願番号第１０／７７１，２３６号、および第２００４／０２１９１３２号明細書（出願番号第１０／７８１，３５６号）の中に記載されている。両方の出願共、その全体が参照により本明細書に援用されている。
【実施例】
【０１１４】
本発明は、以下で提示する実施例を用いて詳細に記述される。かかる実施例の使用は、例示にすぎず、本発明またはいずれかの例示された用語の範囲および意味を決して限定するものではない。同様にして、本発明は、本明細書中に記載されているいずれかの特定の好ましい実施形態に限定されるわけではない。実際、本明細書を読んだ時点で、当業者にとっては、本発明の数多くの修正および変形形態が明らかになる。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲の文言ならびに特許請求の範囲の権利対象である等価物の全範囲によってのみ限定されるものである。
【０１１５】
実施例：内因性酵素が欠損したバックグラウンド内でヒト変異型α−ＧａｌＡを発現する遺伝子導入マウスに対するＤＧＪの投与
α−ＧａｌＡノックアウトバックグラウンド（ＴｇＭ／ＫＯマウス）内でヒト変異型α−ＧａｌＡ（Ｒ３０１Ｑ）のみを発現する遺伝子導入マウスを確立し、評価した。この実施例は、α−ＧａｌＡのミスフォールディングをひき起こすミスセンス変異に特異的である、ファブリー病用の薬理シャペロン療法を試験し評価するための生化学モデルとして役立つ。
【０１１６】
方法
マウス
ファブリーＲ３０１ＱＴｇ／ＫＯマウスは、ロバート・デスニック（Ｒｏｂｅｒｔ Ｄｅｓｎｉｃｋ）博士から贈呈されたものである。雄のＣ５７ＢＬ／６マウスを、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ， ＮＹ）から購入し、ケージ１個あたりマウス４匹の割合でステンレス製ケージの中に収容した。全ての試験は８週齢で行ない、ＩＡＣＵＣ指針を厳守して実施した。
【０１１７】
薬物投与
α−ＧａｌＡ検定用として、１０匹の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスからなる４つのグループに、２８日間にわたり１日体重１ｋｇあたり、０、１、１０または１００ｍｇのＩＦＧ ＨＣｌを飲料水に入れて投薬した。ＧＬ−３検定のためには、６〜７匹の雄Ｒ３０１ＱＴｇ／ＫＯマウスからなる２つのグループに、２８日間にわたり経口で毎日０または３０ｍｇ／ｋｇのＤＧＪ ＨＣｌを投薬した。投薬後、指示された組織を採取し、以下に記載する通りに処理した。
【０１１８】
酵素活性検定
投薬の後、指示された組織を採取し、凍結させた。検定緩衝液中で約５０ｍｇの組織を均質化することによって、組織溶解物を調製した。２．５μＬの溶解物を、１７．５μＬの検定緩衝液および５０μＬのそれぞれの基質溶液（以上の項で詳述されたものと同じ）と組合せた。その後反応混合物を１時間３７℃でインキュベートした。その後、７０μＬの停止溶液（０．４Ｍのグリシン、ｐＨ１０．８）を添加し、３５５ｎｍの励起および４６０ｎｍの発光でＶｉｃｔｏｒ平板読取り装置上で蛍光を読取った。溶解物中の酵素活性からバックグラウンドを減算し、ＭｉｃｒｏＢＣＡタンパク質検定キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク質濃度を正規化した。ｎモル／ｍｇタンパク質／時として表現された絶対酵素活性への蛍光データの変換のために４−ＭＵ標準曲線を（以上の項で詳述されたものと同様に）実行するかまたはさらに未処置活性の％に正規化した。
【０１１９】
マウス組織からのＧＬ−３分析
組織試料を、血液を除去するように洗浄し、秤量し、ＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）系中で溶媒系と均質化した。ホモジネートを次に、Ｃ１８カートリッジ上での固相抽出を用いて抽出した。溶離液を蒸発させ、ＬＣ／ＭＳ系への注入に先立ち再構成させた。９個のＧＬ３イソ型を、ポジティブＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳを用いて測定した。ＬＣ分離をＺｏｒｂａｘ Ｃ１８カラム上で達成した。
【０１２０】
結果
酵素活性
雄のＲ３０１Ｑ Ｔｇ／ＫＯマウスに対し毎日ＤＧＪ ＨＣｌ（３０ｍｇ／ｋｇ；４週間）を経口強制投与することにより、心臓、腎臓、皮膚、肝臓および脾臓組織内で変異型ＧＬＡ活性が有意な形で（＊ｐ＜０．０５、ｔ−検定対未処置）増大する（それぞれ、１１±０．１、５．５±０．３、６．２±０．７、３±０．０２および５±０．１倍；各組織についてｎ＝６〜７匹のマウス）。データは２つの別々の測定を表わしている。２つの類似した実験を、ＤＧＪ ＨＣｌの経口投与を受けた（飲料水中３０ｍｇ／ｋｇ／日；４週間）雄および雌のＲ３０１Ｑ Ｔｇ／ＫＯマウスにおいて実施し、処置された全ての組織において変異型ＧＬＡ活性の同等の増加が観察された。
【０１２１】
組織ＧＬ−３
雄のＲ３０１Ｑ Ｔｇ／ＫＯマウスに対して毎日ＤＧＪ ＨＣｌ（３０ｍｇ／ｋｇ；４週間）を経口強制投与することにより、皮膚および心臓内で、ＧＬ−３基質レベル（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで測定）が有意な形で減少する。処置されたＲ３０１Ｑ Ｔｇ／ＫＯマウスの皮膚組織内にＤＧＪ ＨＣｌを毎日投与した後、ＧＬ−３レベルは１１分の５まで有意に減少した（＊ｐ＜０．０５；１グループあたりｎ＝６〜７匹のマウス）。処置されたＲ３０１Ｑ Ｔｇ／ＫＯマウスの心臓組織内にＤＧＪ ＨＣｌを毎日投与した後、ＧＬ−３レベルは８分の５まで有意に減少した（＊ｐ＜０．０１；１グループあたりｎ＝６〜７匹のマウス）。腎臓組織中でもＧＬ−３レベルを分析し、これは減少傾向を示したものの、統計的有意性には至らなかった。
【０１２２】
論述
上述の知見は、ファブリー病に罹患した主要組織内における薬理シャペロンでの治療に応答した、生体内基質クリアランスの最初の証拠であることから、有意義である。
【０１２３】
上述の通り、ファブリー病のための唯一承認された治療は、酵素補充療法である。最近になって、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）（７年）（Askari et al.、予稿原稿提出済み）により長期間ＥＲＴ療法を受けて死亡したファブリー病患者に由来する心臓、腎臓、脳（海馬傍回）、腸、副腎、大動脈、皮膚、肝臓および脾臓の中にＧＬ−３が存続していることが実証された。この患者は、血管内皮細胞内にＧＬ−３リソソーム封入を有していなかったが、全ての器官からの細胞の細胞膜および細胞質の中に、ＧＬ−３免疫反応性が観察された。腎臓の血管内皮細胞および線維芽細胞内には、ＧＬ−３がリソソームマーカー、ＥＲマーカーおよび核マーカーと同時局在化し、これらのコンパートメントならびに細胞膜内における存在は、免疫金電子顕微鏡検査で確認された。７年間にわたりＥＲＴを受けた別のファブリー病患者に由来する培養された皮膚の線維芽細胞も類似した知見を示した。３人の罹患していない対照に由来する組織は、ＩＨＣおよびＥＭによってＧＬ−３について一様に陰性であった。これらのデータは、薬理シャペロン療法が、ファブリー病患者における主要臓器内での基質のクリアランスに優れているかまたは比較的優れているということを示唆している。
【０１２４】
結論としては、ファブリー病における長年のＥＲＴの後でさえ、細胞および組織内にはかなりの量のＧＬ−３免疫反応性が残存している。本発明者らは初めて、リソソーム外細胞領域内に蓄積されたグロボトリアオシルセラミドの存在を実証した。これらの知見は、疾病の機序を理解するために極めて重要であり、新規の特異的療法に対する応答を査定するためのグロボトリアオシルセラミドについての免疫染色の使用を示唆している。
【０１２５】
実施例２：安全性、耐容性および薬物動態を評価するための単回用量ＤＧＪの投与
この実施例は、健常なボランティアにおけるＤＧＪの安全性、耐容性および薬物動態を評価するためのＤＧＪの逐次漸増単回経口用量の無作為化された２重盲検プラセボ対照第Ｉ相試験について記述している。
【０１２６】
試験の設計および持続時間
この試験は、経口投与後のＤＧＪの安全性、耐容性および薬物動態を評価するためのヒト初回投与、単一施設、第Ｉ相、無作為化、２重盲検、単一用量、プラセボ対照、逐次漸増用量試験であった。この試験では、連続するコホート間で最低１週間の安全性評価期間を設けて、用量上昇型投薬計画において、２５、７５、２２５および６７５ｍｇのＤＧＪまたはプラセボの経口単回用量投与を受けた８人の対象（６人が被験薬および２人がプラセボ）からなる４つのグループをテストした。次の用量レベル（すなわち次のグループ）への用量上昇は、先行する１つまたは複数のグループの安全性および耐容性の精査後に続行された。対象は、投薬の１４時間前から投薬終了２４時間後まで、治療施設内に収容された。食事を予定表により制御し、薬物投与後４時間は対象が自由に行動できるようにした。
【０１２７】
試験対象集団
対象は、一般社会人からなり、施設に収容されたことのない１９才以上５０才以下の年令の健常な非喫煙男性ボランティアであった。
【０１２８】
安全性および耐容性の査定
バイタルサイン、臨床検査パラメータ（血清化学、血液学および尿検査）、ＥＣＧ、身体検査を評価することによっておよび治療期間中の有害事象を記録することによって安全性を判定した。
【０１２９】
薬物動態試料採取
投薬の前およびその後０．２５、０．５、０．７５、１、１．５、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１６および２４時間の時点でＥＤＴＡの入った血液収集試験管内に血液試料（各１０ｍＬ）を収集した。血液試料を氷浴中で冷却し、可能なかぎり早く冷却下で遠心分離した。血漿試料を２つのアリコートに分割し、検定中２０±１０℃で保管した。試験の終了時に、全ての試料を分析のためＭＤＳ Ｐｈａｒｍａ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｌｉｎｃｏｌｎ）に移送した。以下の間隔にわたりＤＧＪを分析するために各対象から完全な尿排出量を収集した：
・ −４〜０時間
・ ０〜４時間
・ ４〜８時間
・ ８〜１２時間
・ １２〜２４時間
【０１３０】
統計的分析
臨床検査評価、身体検査、有害事象、ＥＣＧ監視およびバイタルサインの査定を含む安全性データを、治療グループおよび収集時点別にまとめた。定量的安全性データならびにベースラインとの差異について、記述統計データ（算術平均、標準偏差、中央値、最小および最大値）を計算した。定性的安全性データの分類のために、頻度計数値をコンパイルした。さらに、正常範囲外シフトを記載したシフト表を、臨床検査結果について提供した。身体検査の結果およびＥＣＧについても、正常−異常シフト表を提示した。
【０１３１】
ＭｅｄＤＲＡ７．０バージョンディクショナリを用いて有害事象をコード化し、有害事象を報告している対象の数および報告された有害事象の数について治療別にまとめた。報告者用語（ｖｅｒｂａｔｉｍ ｔｅｒｍ）、コード化された用語（ｃｏｄｅｄ ｔｅｒｍ）、治療グループ、重症度そして治療との関係を含めた対象別有害事象データリストを提供した。治療別に、併用薬および病歴を列挙した。
【０１３２】
記述統計データ（算術平均、標準偏差、変動係数、試料サイズ、最小値、最大値および中央値）を用いて、治療グループ別に薬物動態パラメータをまとめた。さらに、ＡＵＣ０−ｔ、ＡＵＣｉｎｆおよびＣｍａｘについて幾何平均を計算した。
【０１３３】
結果
この試験中に、５人の対象（１６％）が１０件の治療関連有害事象（ＡＥ）を報告した。コホートＢ（７５ｍｇ）内では２人の対象がＡＥを有し、コホートＤ（６７５ｍｇ）内では３人の対象がＡＥを有していた。コホートＡ（２５ｍｇ）またはＣ（２２５ｍｇ）においては、どの対象もＡＥを示さなかった。用量レベルの増大に関係する傾向は全く観察されなかった。少なくとも１０％の対象がＡＥを全く報告しなかった。
【０１３４】
ＡＥは、５つの体組織、すなわち胃腸系（水様便）、筋骨格および結合組織（筋骨格剛性）、神経系（めまい、頭痛）、呼吸器、胸郭および縦隔系（咽頭痛）および皮膚および皮下系（発疹）において発生した。
【０１３５】
臨床検査において正常範囲からの偏差が投薬後に発生したが、いずれも臨床的に有意であるとは判断されなかった。試験全体を通して調査されたいずれのパラメータにも、臨床的に関連性ある平均データシフトは全く存在しなかった。いずれのバイタルサイン、ＥＣＧまたは身体検査パラメータにも、臨床的に関連性ある異常は全く発生しなかった。
【０１３６】
ＤＧＪは、用量が２５ｍｇ以上６７５ｍｇ以下まで増加した場合でも、この健常な男性対象グループにとって安全でかつ充分な耐容性が示されるものと思われた。
【０１３７】
薬物動態評価
以下の表は、試験中に得られた薬物動態データをまとめている。
【０１３８】
【表１】
【０１３９】
ＤＧＪの薬物動態特性は全ての対象および全ての用量レベルにおいて充分に示された。平均して、全ての用量レベルについておよそ３時間でピーク濃度が発生した。全ての用量レベルにわたる平均半減期は、およそ３．０時間から４．６時間の範囲であった。ＤＧＪのＡＵＣおよびＣｍａｘは、用量を２５ｍｇから２２５ｍｇまで増大させた場合に用量に比例して増加するように思われた。
【０１４０】
平均腎クリアランス値は、用量が２５ｍｇから６７５ｍｇまで増大するにつれて５．９０から７．６６Ｌ／時までの範囲であった。尿中に排泄されたＤＧＪの平均累積百分率は一般に、用量が２５ｍｇから７５ｍｇまで増大するにつれて増加し、２２５ｍｇと６７５ｍｇの用量レベルは同程度であった。
【０１４１】
実施例３：安全性、耐容性および薬物動態およびα−ガラクトシダーゼＡ酵素活性に対する影響を評価するための単回用量ＤＧＪの投与
この実施例は、健常なボランティアにおける安全性、耐容性、薬物動態およびα−ガラクトシダーゼＡ（α−ＧａｌＡ）酵素活性に対するＤＧＪの影響を評価するためのＤＧＪの１日２回の経口用量の無作為化された２重盲検プラセボ対照第Ｉｂ相試験について記述している。
【０１４２】
試験の設計および持続時間
この試験は、経口投与後の健常なボランティアにおけるＤＧＪの経口投与後のＤＧＪの安全性、耐容性、薬物動態およびα−ＧａｌＡ酵素活性に対する影響を評価するためのヒト初回投与、単一施設、第Ｉｂ相、無作為化、２重盲検、１日２回用量、プラセボ対照試験であった。この試験では、７日間の追訪を伴って連続７日間経口投与された、５０または１５０ｍｇ１日２回の用量をＤＧＪまたはプラセボを受けた８人の対象（６人が被験薬で２人がプラセボ）からなる２つのグループをテストした。対象は、投薬の１４時間前から投薬終了２４時間後まで、治療施設内に収容された。食事を予定表により制御し、薬物投与後４時間は対象が自由に行動できるようにした。
【０１４３】
薬物動態パラメータを１日目と７日目の血漿中ＤＧＪについて計算した。さらに、尿中に排泄された（投薬から１２時間後）ＤＧＪの累積百分率を計算した。投薬開始前、そして試験開始後１００時間、１５０時間そして３３６時間目にも、白血球（ＷＢＣ）中のα−ＧａｌＡ活性を計算した。
【０１４４】
試験対象集団
対象は、一般社会人からなり、施設に収容されたことのない１９才以上５０才以下の年令の健常な非喫煙男性ボランティアであった。
【０１４５】
安全性および耐容性の査定
バイタルサイン、臨床検査パラメータ（血清化学、血液学および尿検査）、ＥＣＧ、身体検査を評価することによっておよび治療期間中の有害事象を記録することによって安全性を判定した。
【０１４６】
薬物動態試料採取
投薬の前およびその後０．２５、０．５、０．７５、１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１および１２時間の時点でＥＤＴＡの入った血液収集試験管内に血液試料（各１０ｍＬ）を収集した。血液試料を氷浴中で冷却し、可能なかぎり早く冷却下で遠心分離した。血漿試料を２つのアリコートに分割し、検定中２０±１０℃で保管した。試験の終了時に、全ての試料を分析のためＭＤＳ Ｐｈａｒｍａ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｌｉｎｃｏｌｎ）に移送した。１日目と７日目にＤＧＪ投与後の最初の１２時間の腎クリアランスを判定するためにＤＧＪを分析する目的で各対象から完全な尿排出量を収集した。
【０１４７】
ＷＢＣα−ＧａｌＡ酵素活性試料採取
投薬前およびその後１００時間、１５０時間および３３６時間の時点で抽出されたＥＤＴＡおよびＷＢＣを含有する血液収集試験管内に、血液試料（各１０ｍＬ）を収集した。上述の通りに試料を処理し、Desnick, R.J. (ed) Enzyme therapy in genetic diseases. Vol 2. Alan R Liss, New York, pp 17-32.の中で記述されている通りに、ＷＢＣα−ＧａｌＡ酵素活性レベルを決定した。統計的分析。臨床検査評価、身体検査、有害事象、ＥＣＧ監視およびバイタルサイン査定を含む安全性データを、治療グループおよび収集時点別にまとめた。定量的安全性データならびにベースラインとの差異について、記述統計データ（算術平均、標準偏差、中央値、最小および最大値）を計算した。定性的安全性データの分類のために、頻度計数値をコンパイルした。さらに、正常範囲外シフトを記載したシフト表を、臨床検査結果について提供した。身体検査の結果およびＥＣＧについても、正常−異常シフト表を提示した。
【０１４８】
ＭｅｄＤＲＡ７．０バージョンディクショナリを用いて有害事象をコード化し、有害事象を報告している対象の数および報告された有害事象の数について治療別にまとめた。報告者用語、コード化された用語、治療グループ、重症度そして治療との関係を含めた対象別有害事象データリストを提供した。治療別に、併用薬および病歴を列挙した。
【０１４９】
記述統計データ（算術平均、標準偏差、変動係数、試料サイズ、最小値、最大値および中央値）を用いて、治療グループ別に薬物動態パラメータをまとめた。
【０１５０】
結果。プラセボで治療された対象はいずれもＡＥを有さず、５０ｍｇ１日２回または１５０ｍｇ１日２回のＤＧＪを受けたいかなる対象もＡＥを示さなかった。５０ｍｇ１日２回および１５０ｍｇ１日２回で用量が投与された場合、健常な男性対象のこのグループにとって、ＤＧＪは安全で充分な耐容性があると思われた。
【０１５１】
臨床試験において正常範囲からの偏差が投薬後に発生したが、いずれも臨床的に有意であるとは判断されなかった。試験全体を通して調査されたいずれのパラメータにも、臨床的に関連性ある平均データシフトは全く存在しなかった。いずれのバイタルサイン、ＥＣＧまたは身体検査パラメータにも、臨床的に関連性ある異常は全く発生しなかった。
【０１５２】
薬物動態評価
以下の表は、試験中に得られた薬物動態データをまとめている。
【０１５３】
【表２】
【０１５４】
ＤＧＪの薬物動態特性は全ての対象および全ての用量レベルにおいて充分に示された。平均して、全ての用量レベルについておよそ３時間でピーク濃度が発生した。ＤＧＪのＣｍａｘは、用量を５０ｍｇから１５０ｍｇまで増大させた場合に用量に比例して増加した。
【０１５５】
平均除去半減期（ｔ１／２）は、１日目の５０ｍｇと１５０ｍｇの用量レベルにおいて同程度であった（２．５時間対２．４時間）。
【０１５６】
投薬後１２時間の期間にわたって排泄されたＤＧＪの平均百分率は、１日目でそれぞれ５０ｍｇおよび１５０ｍｇの用量レベルで１６％と４２％であり、７日目にはそれぞれ４８％と６０％まで増大した。
【０１５７】
α−ガラクトシダーゼＡ（α−ＧａｌＡ）酵素活性
試験中に得たα−ＧａｌＡ酵素活性データは、図１に示されている。ＤＧＪは、５０ｍｇ１日２回又は１５０ｍｇ１日２回の投薬量で対象におけるＷＢＣα−ＧａｌＡ酵素活性を阻害しなかった。その上、ＤＧＪは、健常なボランティアにおけるＷＢＣα−ＧａｌＡ活性増加の用量依存的傾向を作り出した。α−ＧａｌＡ酵素レベルは、プラセボ、５０ｍｇ１日２回のＤＧＪおよび１５０ｍｇ１日２回のＤＧＪが投与された対象のＷＢＣで測定した。プラセボは、ＷＢＣα−ＧａｌＡ酵素レベルに全く影響を及ぼさなかった。プラセボに応答した酵素レベルの変動は、臨床的に有意なものではなかった。５０ｍｇ１日２回および１５０ｍｇ１日２回のＤＧＪは共に、正規化されたＷＢＣα−ＧａｌＡ酵素レベルを増加させた。５０ｍｇ１日２回のＤＧＪに応答して、ＷＢＣα−ＧａｌＡ酵素活性は、それぞれ投薬後１００時間、１５０時間および３３６時間で投薬前レベルの１２０％、１３０％および１４５％まで増大した。１５０ｍｇ１日２回のＤＧＪに応答して、ＷＢＣα−ＧａｌＡ酵素活性は、それぞれ投薬後１００時間、１５０時間および３３６時間で、投薬前レベルの１５０％、１８５％および１８５％まで増大した。
【０１５８】
実施例４：ファブリー病患者に対するＤＧＪの投与および治療応答の監視
この実施例は、α−Ｇａｌ折畳み変異型を用いたファブリー病患者におけるＤＧＪの無作為化盲検第ＩＩ相試験および提案されている監視について記述している。
【０１５９】
登録患者
（遺伝子型によって確認された）α−ＧａｌＡ中の公知のミスセンス変異を有するファブリー病患者；最高６ヵ月間ＥＲＴを中止する意志のある、現在ＥＲＴ（Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標））を受けている患者；またはこれまでＥＲＴ治療を受けたことのない新たに診断された患者。
【０１６０】
試験設計
２治療群設計を計画した。一方の治療群においては、適格な患者に対し、１２週間（最高４８週間まで延長）、１日おきに１５０ｍｇのＤＧＪ−ＨＣｌを投与した。第２の治療群においては、２５ｍｇ、１００ｍｇそして次に２５０ｍｇ１日２回の上昇用量を６週間にわたり投与し、その後、試験の残りの期間中１日５０ｍｇを投与した。
【０１６１】
監視
ＧＬ−３沈着物
ベースライン、３ヵ月および６ヵ月の時点で、皮膚、腎臓および心臓の生検を実施し、皮膚線維芽細胞、心筋細胞およびさまざまな腎細胞内のＧＬ−３沈着物について評価する。ＧＬ−３のクリアランスが全ての細胞において観察されることが予想されている。従来のＥＲＴによる治療では心筋細胞または腎有足細胞または皮膚組織内のクリアランスは、示されなかった（ただし、ＥＲＴ６ヵ月目および１８ヵ月目での尿沈渣の変化は、酵素補充により腎組織内のスフィンゴ糖脂質の蓄積のクリアランスがあったことを示唆していた： Clin Chim Acta. 2005;360(1-2):103-7)）。
【０１６２】
α−ＧａｌＡ活性
さらに、生検から得た分画された組織内および（ベースラインでおよび毎月収集される血液からの）血液白血球および血漿内で、α−ＧａｌＡ活性を査定する。ＤＧＪ治療は、白血球、線維芽細胞および血漿中で、ベースラインよりも約２倍〜約１０倍、α−ＧａｌＡ活性を増大させるものと予想されている。同様に、ＥＲＴ治療で実証されなかったα−ＧａｌＡ活性の増加が組織内で観察されることも予想されている。
【０１６３】
尿検査
α−ＧａｌＡおよびＧＬ−３についてベースラインおよび毎月、尿と尿沈渣を分析する。さらに、ＣＴＨ、ラクトシルセラミド、セラミドなどのその他の脂質の異常な存在およびグルコシルセラミドおよびスフィンゴミエリンの異常な減少または不在も同様に評価される。
【０１６４】
腎疾患の状態を監視するためにアルブミン（タンパク尿）およびクレアチンを含めたタンパク質の存在についても、尿を分析する。ＤＧＪ治療はタンパク尿を減少させ、ＧＬ−３沈渣を減少させると予想されている。
【０１６５】
心臓解析
心臓形態（例えば左心室肥大）および心臓機能（例えばうっ血性心不全、虚血、梗塞、不整脈）を査定するために、上述の生検に加えて、ひずみ速度評価を伴うＭＲＩおよび心エコー図を、ベースライン、３ヵ月目および６ヵ月目に実施する。その他の治療では、左心室肥大の直接的減少または左心室駆出の増大が実証されたことはない。（腎不全に関連する）高血圧が出血性脳卒中のリスクを増大し得ることから、高血圧も同様に評価した。
【０１６６】
あらゆる導通異常、不整脈、脚ブロックまたは頻脈または徐脈の改善を分析するため、ベースラインおよび診察毎に、心電図を実施する。以前の治療は、これらの症候を呈する患者において改善を示さなかった。
【０１６７】
腎臓解析
ＧＬ−３のクリアランスについて光学顕微鏡および電子顕微鏡を用いて、腎有足細胞を評価する。
【０１６８】
脳解析
虚血性卒中の原因となり得る虚血領域の削減について査定するため、ベースラインおよび試験の終了時点で、ＭＲＩおよびＭＲＡを実施する。ＤＧＪによるＧＬ−３集積の削減は、卒中の罹患率を低減させることが予想されている。補充酵素は、血液脳関門を横断できないことから、ＥＲＴで脳虚血の改善が達成されたことは全く無い。
【０１６９】
眼科
眼科検査は、白内障などの角膜および水晶体混濁の減少を査定するために実施される。
【０１７０】
神経因性疼痛
肢端感覚異常の減少を評価するために、ベースラインにおいておよび毎月の診察毎に患者に対し主観的な患者アンケート調査を行なう。これは、末梢神経細胞の微小血管系内のＧＬ−３クリアランスの証拠であり得る。
【０１７１】
神経障害
末梢神経障害を評価するためには、定量的官能試験（ＣＡＳＥ試験）を使用する。
【０１７２】
発汗減少
エクリン汗腺に連結されている小神経線維を査定する定量的発汗刺激性軸索反射試験（ＱＳＡＲＴ）を用いて、汗腺を評価する。汗腺の改善は発汗増加と相関関係を有するはずであり、同様に、末梢神経細胞の微小血管系内のＧＬ−３クリアランスの証拠でもあり得る。この分析は、ベースラインおよび３ヵ月目および６ヵ月目で実施される。
【０１７３】
結果
α−ＧａｌＡ活性
少なくとも１２週間ＤＧＪで治療した最初の１１人の患者から得られるデータは、ＤＧＪが、１１人の患者のうちの１０人においてファブリー病で欠損している酵素の活性の増加を導くということを示唆している（図２）。試験中、３人の患者は、試験全体を通して１日おきに１５０ｍｇのＤＧＪを受けた（図２では、白い正方形、三角形および菱形で表示されている）。試験中の８人の患者が、６週間にわたって２５、１００そして次に２５０ｍｇ１日２回の逐次漸増用量を受け、その後試験の残りの期間５０ｍｇ／日を受けた（図２では、黒丸で表わされている）。表中の正常の百分率を計算する目的で、複数回用量第Ｉ相試験の１５人の健常なボランティアの白血球中のα−ＧＡＬのレベルの平均を使用し正常なα−ＧＡＬのレベルを導出した。１１人の患者は、１０の異なる遺伝子変異を示し、ゼロから正常の３０％までの範囲にあるα−ＧａｌＡのベースラインレベルを有していた。
【０１７４】
ＧＬ−３レベル
腎臓のＧＬ−３レベルは第三者専門機関によって電子顕微鏡検査法を用いて査定された（図３）。これまで２人の患者について入手されたデータは、１２週間の治療の後１人の患者の腎臓の多数の細胞型においてＧＬ−３の減少が見られることを示した（メサンギウム細胞および糸球体内皮および遠位尿細管の細胞）。２人目の患者は、２４週間の治療後に同じ腎細胞型の中でＧＬ−３レベルの減少を示したが、これらの減少は、患者のベースラインにおけるＧＬ−３のレベルが比較的低いことから、それ単独で決定的なものではなかった。両方の患者共、間質毛細血管の細胞を含めたその他の腎細胞型の中のＧＬ−３レベルの減少を示したが、これらの減少は有意なものではなかった。
【０１７５】
液体クロマトグラフィ質量分析法によって査定されるようなベースラインでのおよび治療後の尿および血漿ＧＬ−３レベルが、１０人の患者について入手できた。大部分の患者は、治療の前後両方で正常かまたは正常に近い尿および血漿中ＧＬ−３レベルを有していた。ベースラインで高いレベルの尿または血漿中ＧＬ−３を有していたわずかな患者については、患者ごとの変動が大きいために、結果の解釈が困難であった。
【０１７６】
光学および電子顕微鏡法によって査定される通りのベースラインでのおよび治療後の皮膚ＧＬ−３レベルが、１０人の患者について入手できた。７人の患者が、治療前後の両方において正常または正常に近い皮膚ＧＬ−３レベルを有していた。その他の３人の患者についての結果は、経時的な変動を伴って、一部の皮膚細胞型におけるＧＬ−３の減少とその他の皮膚細胞型におけるＧＬ−３の増加の証拠を示していたことから、解釈が困難であった。
【０１７７】
これらの試験における大部分の患者は、治療の前には正常または正常に近い心臓、腎臓および中枢神経系機能を有しており、１２〜４８週間の治療の後も臨床的に有意な変化は全く観察されなかった。
【０１７８】
より長い治療期間にわたる場合および／またはより重症であり治療前により高いＧＬ−３蓄積を提示している患者の場合には、より顕著なＧＬ−３の減少が明白になるものと予想される。
【０１７９】
論述
これらの結果は、シャペロン療法の有効性についての原理実証である。ＤＧＪは、α−ＧａｌＡの活性を、従来の生体外および遺伝子導入動物試験から予測されたものに比べ罹患個体内で著しく高いレベルまで増大させることが示された。予想外に、６週間後に用量を最低用量（５０ｍｇ／日）まで削減した場合でも酵素活性は高い状態にとどまっており、このことは、シャペロン療法の効能を実証している。
【０１８０】
重要なことに、シャペロンは小分子であることから、血液脳関門および腎臓などの器官をとり囲む関門などの内皮関門を容易に横断でき、結合組織に進入する。ＥＲＴでは、体外から投与された酵素がこれらの関門を貫通せず、したがって心臓内の心筋細胞、周皮細胞および血管平滑筋、腎有足細胞、周皮細胞、神経周膜または細動脈、組織球および線維芽細胞の筋層内のＧＬ−３レベルに対しいかなる効果も及ぼさないことから、この事実はＥＲＴに比べて有意な改善である（Eng et al., Am J Hum Genet. 2001; 68(3): 711-722）。その上、上述した通り、近年になって、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）での長期ＥＲＴ療法（７年）を受けてきた死亡したファブリー病患者由来の心臓、腎臓、脳（海馬傍回）、腸、副腎、大動脈、皮膚、肝臓および脾臓内にＧＬ−３が存続することが実証された（Askari et al.、予稿原稿提出済み）。
【０１８１】
本発明は、本明細書中に記載された具体的実施形態によってその範囲が限定されるものではない。実際、以上の記述および添付図面から当業者には、本明細書に記載されているものに加えて本発明のさまざまな修正が明らかになる。かかる修正は、添付の特許請求の範囲内に包含されるものである。
【０１８２】
本出願全体を通して特許、特許出願、公報、製品関連文書およびプロトコルが引用されているが、その開示は、あらゆる目的のために全体が本明細書に参照により援用されている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−ガラクトシダーゼＡの特異的薬理シャペロンの投与後に、ファブリー病に関連する代理マーカーの改善が存在するか否かを判定するステップを含む、ファブリー病患者の治療方法。
【請求項２】
改善が患者が応答者であることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
代理マーカーが全身性代理マーカーである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
マーカーが、細胞および組織内のリソソームα−ガラクトシダーゼＡ活性またはＧＬ−３蓄積である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
代理マーカーが細胞内代理マーカーである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
細胞内代理マーカーが、ファブリー患者由来の細胞内におけるＥＲからリソソームへのα−ガラクトシダーゼＡの異常輸送；エンドソーム経路を通した細胞脂質の異常輸送；ＥＲまたは細胞質ゾル内における誤って折畳まれた大量のα−ガラクトシダーゼＡの存在；（ストレス関連マーカーの遺伝子および／またはタンパク質発現により判定した際の）α−ガラクトシダーゼＡの毒性蓄積が起こす細胞ストレスの存在；エンドソームｐＨレベルの異常；細胞形態の異常；ユビキチン／プロテアソーム経路の抑制；およびユビキチン化タンパク質の量の増加からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
特異的薬理シャペロンがα−ガラクトシダーゼＡの阻害物質である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
阻害物質が可逆的競合阻害物質である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
阻害物質が１−デオキシガラクトノジリマイシンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
α−ガラクトシダーゼＡの特異的薬理シャペロン投与後のファブリー病患者の治療応答を監視する方法であって、患者に由来する細胞の細胞質染色パターンに対する効果を評価するステップを含み、健常な個体に由来する細胞内の染色パターンに類似する細胞内の染色パターンの検出が、ファブリー病を患う個体が応答者であることの標示である、方法。
【請求項１１】
細胞質染色がリソソーム染色である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
リソソーム染色がα−ガラクトシダーゼＡの存在の検出である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
リソソーム染色がＬＡＭＰ−１発現の検出である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細胞質染色がポリユビキチン化タンパク質の検出である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
特異的薬理シャペロンが、α−ガラクトシダーゼＡの阻害物質である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
阻害物質が可逆的競合阻害物質である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
阻害物質が１−デオキシガラクトノジリマイシンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
患者が、女性のファブリー病キャリヤである、請求項１、２または１１に記載の方法。
【請求項１９】
必要としている個体の体内でα−ガラクトシダーゼＡタンパク質の活性を増大させる方法において、タンパク質に結合する有効量の特異的薬理シャペロンを、個体の体内のタンパク質の活性を少なくとも約５０％だけ増大させるのに有効な量で個体に投与するステップを含む方法。
【請求項２０】
α−ガラクトシダーゼＡタンパク質が野生型タンパク質である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
α−ガラクトシダーゼＡタンパク質が酵素である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
酵素がリソソーム酵素である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
リソソーム酵素が野生型α−ガラクトシダーゼＡタンパク質である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
特異的薬理シャペロンがα−ガラクトシダーゼＡの阻害物質である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
阻害物質が可逆的競合阻害物質である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
阻害物質が１−デオキシガラクトノジリマイシンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
１−デオキシガラクトノジリマイシンが、タンパク質の活性を少なくとも約５０％増大させるのに有効な量で投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
１−デオキシガラクトノジリマイシンが、タンパク質の活性を少なくとも２倍（約１００％）増大させるのに有効な量で投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
１−デオキシガラクトノジリマイシンが、タンパク質の活性を少なくとも約３倍増大させるのに有効な量で投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
１−デオキシガラクトノジリマイシンが、タンパク質の活性を少なくとも約１０倍増大させるのに有効な量で投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
１−デオキシガラクトノジリマイシンが、タンパク質の活性を少なくとも約１５倍増大させるのに有効な量で投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
個体が、野生型タンパク質に対してホモ接合性である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３３】
個体が、野生型タンパク質に対してヘテロ接合性であり、タンパク質をコードするその他の対立遺伝子についての変異遺伝子型を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３４】
個体がファブリー病を患っている、請求項１９に記載の方法。
【請求項３５】
α−ガラクトシダーゼＡ活性が少なくとも２倍増大する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
α−ガラクトシダーゼＡ活性が少なくとも３倍増大する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
α−ガラクトシダーゼＡ活性が少なくとも１０倍増大する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
α−ガラクトシダーゼＡ活性が、正常範囲内まで増大する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
治療が必要な患者におけるファブリー病の治療方法であって、個体に対し有効量の１−デオキシガラクトノジリマイシンを投与するステップを含み、１−デオキシガラクトノジリマイシンが、患者の体内のα−ガラクトシダーゼＡの活性を少なくとも約２倍増大させるのに有効な量でα−ガラクトシダーゼＡに結合する、方法。
【請求項４０】
α−ガラクトシダーゼＡが少なくとも３倍増大する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
α−ガラクトシダーゼＡ活性が少なくとも１０倍増大する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
α−ガラクトシダーゼＡ活性が、正常範囲内まで増大する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
要治療患者におけるファブリー病の治療方法であって、個体に対し有効量の１−デオキシガラクトノジリマイシンを投与するステップを含み、１−デオキシガラクトノジリマイシンが組織グロボトリアオシルセラミドを削減する、方法。
【請求項４４】
組織が皮膚、心臓または腎臓である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
グロボトリアオシルセラミド削減が少なくとも３分の２への削減である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
グロボトリアオシルセラミド削減が少なくとも２分の１への削減である、請求項４３に記載の方法。
【請求項１】
α−ガラクトシダーゼＡの特異的薬理シャペロンの投与後に、ファブリー病に関連する代理マーカーの改善が存在するか否かを判定するステップを含む、ファブリー病患者の治療方法。
【請求項２】
改善が患者が応答者であることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
代理マーカーが全身性代理マーカーである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
マーカーが、細胞および組織内のリソソームα−ガラクトシダーゼＡ活性またはＧＬ−３蓄積である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
代理マーカーが細胞内代理マーカーである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
細胞内代理マーカーが、ファブリー患者由来の細胞内におけるＥＲからリソソームへのα−ガラクトシダーゼＡの異常輸送；エンドソーム経路を通した細胞脂質の異常輸送；ＥＲまたは細胞質ゾル内における誤って折畳まれた大量のα−ガラクトシダーゼＡの存在；（ストレス関連マーカーの遺伝子および／またはタンパク質発現により判定した際の）α−ガラクトシダーゼＡの毒性蓄積が起こす細胞ストレスの存在；エンドソームｐＨレベルの異常；細胞形態の異常；ユビキチン／プロテアソーム経路の抑制；およびユビキチン化タンパク質の量の増加からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
特異的薬理シャペロンがα−ガラクトシダーゼＡの阻害物質である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
阻害物質が可逆的競合阻害物質である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
阻害物質が１−デオキシガラクトノジリマイシンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
α−ガラクトシダーゼＡの特異的薬理シャペロン投与後のファブリー病患者の治療応答を監視する方法であって、患者に由来する細胞の細胞質染色パターンに対する効果を評価するステップを含み、健常な個体に由来する細胞内の染色パターンに類似する細胞内の染色パターンの検出が、ファブリー病を患う個体が応答者であることの標示である、方法。
【請求項１１】
細胞質染色がリソソーム染色である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
リソソーム染色がα−ガラクトシダーゼＡの存在の検出である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
リソソーム染色がＬＡＭＰ−１発現の検出である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細胞質染色がポリユビキチン化タンパク質の検出である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
特異的薬理シャペロンが、α−ガラクトシダーゼＡの阻害物質である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
阻害物質が可逆的競合阻害物質である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
阻害物質が１−デオキシガラクトノジリマイシンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
患者が、女性のファブリー病キャリヤである、請求項１、２または１１に記載の方法。
【請求項１９】
必要としている個体の体内でα−ガラクトシダーゼＡタンパク質の活性を増大させる方法において、タンパク質に結合する有効量の特異的薬理シャペロンを、個体の体内のタンパク質の活性を少なくとも約５０％だけ増大させるのに有効な量で個体に投与するステップを含む方法。
【請求項２０】
α−ガラクトシダーゼＡタンパク質が野生型タンパク質である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
α−ガラクトシダーゼＡタンパク質が酵素である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
酵素がリソソーム酵素である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
リソソーム酵素が野生型α−ガラクトシダーゼＡタンパク質である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
特異的薬理シャペロンがα−ガラクトシダーゼＡの阻害物質である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
阻害物質が可逆的競合阻害物質である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
阻害物質が１−デオキシガラクトノジリマイシンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
１−デオキシガラクトノジリマイシンが、タンパク質の活性を少なくとも約５０％増大させるのに有効な量で投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
１−デオキシガラクトノジリマイシンが、タンパク質の活性を少なくとも２倍（約１００％）増大させるのに有効な量で投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
１−デオキシガラクトノジリマイシンが、タンパク質の活性を少なくとも約３倍増大させるのに有効な量で投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
１−デオキシガラクトノジリマイシンが、タンパク質の活性を少なくとも約１０倍増大させるのに有効な量で投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
１−デオキシガラクトノジリマイシンが、タンパク質の活性を少なくとも約１５倍増大させるのに有効な量で投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
個体が、野生型タンパク質に対してホモ接合性である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３３】
個体が、野生型タンパク質に対してヘテロ接合性であり、タンパク質をコードするその他の対立遺伝子についての変異遺伝子型を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３４】
個体がファブリー病を患っている、請求項１９に記載の方法。
【請求項３５】
α−ガラクトシダーゼＡ活性が少なくとも２倍増大する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
α−ガラクトシダーゼＡ活性が少なくとも３倍増大する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
α−ガラクトシダーゼＡ活性が少なくとも１０倍増大する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
α−ガラクトシダーゼＡ活性が、正常範囲内まで増大する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
治療が必要な患者におけるファブリー病の治療方法であって、個体に対し有効量の１−デオキシガラクトノジリマイシンを投与するステップを含み、１−デオキシガラクトノジリマイシンが、患者の体内のα−ガラクトシダーゼＡの活性を少なくとも約２倍増大させるのに有効な量でα−ガラクトシダーゼＡに結合する、方法。
【請求項４０】
α−ガラクトシダーゼＡが少なくとも３倍増大する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
α−ガラクトシダーゼＡ活性が少なくとも１０倍増大する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
α−ガラクトシダーゼＡ活性が、正常範囲内まで増大する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
要治療患者におけるファブリー病の治療方法であって、個体に対し有効量の１−デオキシガラクトノジリマイシンを投与するステップを含み、１−デオキシガラクトノジリマイシンが組織グロボトリアオシルセラミドを削減する、方法。
【請求項４４】
組織が皮膚、心臓または腎臓である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
グロボトリアオシルセラミド削減が少なくとも３分の２への削減である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
グロボトリアオシルセラミド削減が少なくとも２分の１への削減である、請求項４３に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１０−５２３５７８（Ｐ２０１０−５２３５７８Ａ）
【公表日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０２２１８（Ｐ２０１０−５０２２１８）
【出願日】平成２０年３月２８日（２００８．３．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５８６６８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１２１８２６
【国際公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【出願人】（５０７１７００９９）アミカス セラピューティックス インコーポレイテッド (21)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２８日（２００８．３．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５８６６８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１２１８２６
【国際公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【出願人】（５０７１７００９９）アミカス セラピューティックス インコーポレイテッド (21)
【Ｆターム（参考）】
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