蛍光測定装置、複合光学素子、及び試料収容容器
【課題】複数の試料から発生する蛍光を同時に測定することができる蛍光測定装置と、これに用いる複合光学素子及び試料の収容容器を提供する。
【解決手段】蛍光測定装置１０は、励起光光源１１、励起光分岐プリズム１２、集光容器１３、受光部１６を備える。励起光光源１１は、平行光の励起光ＥＬを励起光分岐プリズム１２に入射させる。励起光分岐プリズム１２は、集光容器１３に正対して配置され、励起光ＥＬを凹部６１の配列に応じた本数及び位置に分岐させて出射する。集光容器１３は、励起光ＥＬの照射により蛍光ＦＬを発生する試料を収容する凹部６１を複数有し、凹部６１の内面は反射面であるとともに、励起光ＥＬを試料に集光する形状となっている。受光部１６は、試料から発生した蛍光ＦＬを受光して光電変換することにより、各々の試料から発生した蛍光ＦＬの光量を測定する。
【解決手段】蛍光測定装置１０は、励起光光源１１、励起光分岐プリズム１２、集光容器１３、受光部１６を備える。励起光光源１１は、平行光の励起光ＥＬを励起光分岐プリズム１２に入射させる。励起光分岐プリズム１２は、集光容器１３に正対して配置され、励起光ＥＬを凹部６１の配列に応じた本数及び位置に分岐させて出射する。集光容器１３は、励起光ＥＬの照射により蛍光ＦＬを発生する試料を収容する凹部６１を複数有し、凹部６１の内面は反射面であるとともに、励起光ＥＬを試料に集光する形状となっている。受光部１６は、試料から発生した蛍光ＦＬを受光して光電変換することにより、各々の試料から発生した蛍光ＦＬの光量を測定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、励起光を照射することにより試料から発せられる蛍光を測定する蛍光測定装置と、これに用いる複合光学素子及び試料を収容する容器に関し、さらに詳しくは、複数の試料から発生する蛍光を測定する蛍光測定装置、これに用いる複合光学素子及び複数の試料を収容する容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムのような長大なＤＮＡ分子の中から、特定のＤＮＡ断片を選択的に増幅させる手法として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた手法（以下、ＰＣＲ法という）が知られている。周知のように、ＰＣＲ法は、増幅対象（以下、テンプレートという）を含む二本鎖ＤＮＡと、テンプレートに相補的なオリゴヌクレオチド（以下、プライマーという）と、テンプレートに結合したプライマーを起点としてＤＮＡ鎖の合成を促すＤＮＡポリメラーゼとを含む試料溶液（以下、単に試料という）を加熱／冷却するサイクルを繰り返すことにより、加熱による二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡへの変性と、冷却時のＤＮＡ鎖長に応じた再結合性の相違とを利用してテンプレートを増幅する手法である。
【０００３】
また、近年では単にテンプレートを増幅させるだけでなく、増幅前のテンプレートの総量やＰＣＲ産物の総量を定量的に評価することができるように改良されたＰＣＲ法（以下、定量ＰＣＲ法という）が知られている。定量ＰＣＲ法の具体的な手法としては、例えば、アガロースゲル電気泳動法、ＳＹＢＲグリーン法、蛍光プローブ法が知られている。アガロースゲル電気泳動法は、アガロースゲル電気泳動によってＰＣＲ産物を分離し、これを同条件で増幅した既知試料と比較することにより未知試料を定量する。また、ＳＹＢＲグリーン法は、二本鎖ＤＮＡに結合するＤＮＡ結合色素（ＳＹＢＲグリーン）を加えてＰＣＲを行うと同時に、ＤＮＡ結合色素から発せられる蛍光をリアルタイムに測定し、これとＤＮＡ結合色素を含まない標準試料と比較することで二本鎖ＤＮＡ濃度を定量する。蛍光プローブ法は、テンプレートの両端に相補的に結合するプライマーに加えて、テンプレート内に相補的に結合する蛍光プローブを用いる。このとき蛍光プローブとしては、テンプレートに特異的に結合するものを選ぶことで、テンプレートの総量やＰＣＲ産物の総量を正確に定量することができる。
【０００４】
定量ＰＣＲ法によってテンプレートを増幅させる装置の中でも、蛍光を測定して未知試料を定量する蛍光測定装置には、試料を加熱／冷却する恒温槽と、ＤＮＡ結合色素や蛍光プローブを励起して蛍光を発生させる励起光を照射する光源や光学系、発生した蛍光を集光する光学系や受光素子等が備えられている。また、こうした蛍光測定装置では、通常、試料に照射する励起光の光量と比較して、試料から発せられる蛍光の光量は極めて小さいため、蛍光を効率良く発生させたり、発生した蛍光を効率良く受光する等の目的で様々な工夫がなされる。
【０００５】
例えば、試料を入れる容器の周囲に半球状や放物面状のリフレクタを設け、このリフレクタによって試料から発生した蛍光を受光素子に効率良く導くようにした蛍光測定装置が知られている（特許文献１，２）。また、従来、円筒状に形成されていた容器を椀型に形成し、さらに蓋の形状を容器内に膨出したレンズ形状とすることによって、試料の凝集を防ぎ、励起光の照射効率及び蛍光の発生効率を向上させた試料容器が知られている（特許文献３）。さらに、従来は、励起光を照射する光軸と蛍光の受光する光軸とが略垂直になるように構成されていたところ、近年では、バンドルファイバを用いることによって、一つのプローブで、ほぼ同一の光路で励起光の照射と蛍光の受光とを両立するとともに、複数種類の波長帯の蛍光を測定可能にした蛍光測定装置も知られている（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−１９７７９号公報
【特許文献２】特開２００８−１８０５６７号公報
【特許文献３】特開２００６−２１４９８６号公報
【特許文献４】特開２００９−１９９６１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のような蛍光測定装置は、通常、一つの試料に対して励起光を照射して蛍光を測定する。このとき、蛍光を受光素子に導く受光プローブや受光光学系と試料との相対的な位置や向き、特に、受光プローブや受光光学系と試料との距離によって、受光プローブや受光光学系に入射し、受光素子に到達する蛍光の光量が変化する。したがって、ＰＣＲ産物の総量等を正確に定量するためには、試料に対して受光プローブや受光光学系を正確に位置決めしたり、試料に対する位置や向き、距離に応じて受光量を校正する必要がある。さらに、前述のように試料の周囲にリフレクタを設ける場合や、レンズ等の集光光学系を用いる場合には、受光プローブや受光光学系の位置決め精度が蛍光の受光量に及ぼす影響が顕著である。こうしたことから、従来の蛍光測定装置では、新しい試料を用いる度に、あるいは複数の試料を収容した容器を用いる場合には各試料に合わせて受光プローブや受光光学系を移動させる度に、これらの位置決めするという煩雑な作業を繰り返す必要があった。
【０００８】
また、前述のように、蛍光測定装置は、一つの試料に対して励起光を照射し、その蛍光を測定するが、これを複数同時に行うことは難しい。例えば、複数の試料を配列して収容する試料容器を用い、かつ、各々の試料に個別の受光プローブや受光光学系を設ければ、同時に各試料からの蛍光を測定することができる。しかし、こうして単に複数の試料を配列する場合、受光プローブや受光光学系には対応する試料からの蛍光だけでなく、周辺に配列された他の試料からの蛍光も迷光として入射してしまう。このため、こうした方法で蛍光を測定し、各試料中のＰＣＲ産物の総量等を定量したとしても、その正確性に問題が生じる。
【０００９】
また、こうして複数の試料を配列する場合、配列のスペース等を考慮すれば、特許文献１，２等に記載されているように、各々の試料についてリフレクタを設けることは難しい。このため、複数の試料を配列してこれらから発生する蛍光を測定する場合には、前述のように迷光によって蛍光の測定精度が悪化するだけでなく、蛍光の受光量自体にも問題がある。
【００１０】
本発明は上述の問題点を鑑みてなされたものであり、複数の試料から発生する蛍光を同時に測定するとともに、迷光が少なく、発生した蛍光を効率良く受光することができ、また試料と受光光学系の位置合わせ精度にほとんど影響されずに、ＰＣＲ産物の総量等を正確に定量することができる蛍光測定装置を提供することを目的とする。また、これに用いる複合光学素子及び複数の試料を収容する容器を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の蛍光測定装置は、励起光が照射されることにより蛍光を発生する試料が収容される凹部を複数有し、前記凹部の内面が前記励起光及び前記蛍光を反射するとともに、前記励起光が平行光の場合に、入射した前記励起光を前記試料に集光する内面形状に形成された試料収容手段と、前記励起光を発生させ、前記励起光を平行光に整えて出射する励起光光源と、前記試料収容手段に正対して配置され、前記励起光光源から平行光に整えられた前記励起光が入射され、前記励起光を前記凹部の配列に応じて分岐させ、前記凹部にそれぞれ入射させる励起光分岐手段と、前記励起光分岐手段を介して前記試料収容手段に正対して配置され、前記試料から発生した蛍光を受光して光電変換することにより、各々の前記試料から発生した蛍光の光量を測定する受光手段と、を備えることを特徴とする。
【００１２】
前記凹部の内面は放物面であり、前記励起光分岐手段から入射される平行光の前記励起光を前記放物面の焦点に集光させるとともに、前記焦点にある前記試料から発せられた前記蛍光が平行光に整えて前記凹部から出射させることが好ましい。
【００１３】
前記励起光分岐手段は、前記蛍光を透過し、前記励起光の少なくとも一部を反射する半透膜を介して、複数のプリズムを接合して形成されることが好ましい。
【００１４】
前記励起光分岐手段は、前記励起光光源から入射する前記励起光を前記励起光分岐手段の中で複数に分岐させる第１分岐手段と、前記第１分岐手段から入射する複数の前記励起光を前記凹部の配列に応じてさらに分岐させて前記試料収容手段側に出射する第２分岐手段とからなることが好ましい。
【００１５】
前記励起光分岐手段は、複数の前記凹部に各々等しい光量の前記励起光を入射させることが好ましい。
【００１６】
前記試料収容手段に前記励起光を照射したときに、前記試料収容手段によって反射されることにより前記受光手段に入射する前記励起光をカットする励起光カット手段が、前記励起光分岐手段と前記受光手段との間に設けられることが好ましい。
【００１７】
前記受光手段は、前記凹部に一対一に対応するように配列されたフォトダイオードからなることが好ましい。
【００１８】
前記試料収容手段は、前記凹部に収容した複数の前記試料の温度を一様に調節する温度調節手段内に配置され、前記試料は、二本鎖ＤＮＡと、前記励起光が照射されることによって前記二本鎖ＤＮＡの総数に応じた蛍光を発生させる蛍光発生手段とを含み、前記温度調節手段によって前記試料の温度を変化させることによって前記二本鎖ＤＮＡの少なくとも一部配列を増幅させることが好ましい。
【００１９】
本発明の試料収容容器は、励起光が照射されることにより蛍光を発生する試料が収容される凹部を複数有し、前記凹部の内面が前記励起光及び前記蛍光を反射するとともに、前記励起光が平行光の場合に、入射した前記励起光を前記試料に集光させることを特徴とする。
【００２０】
前記凹部の内面は放物面であり、前記励起光分岐手段から照射される平行光の前記励起光を前記放物面の焦点に集光させるとともに、前記焦点にある前記試料から発せられた前記蛍光を平行光に整えて前記凹部から出射させることが好ましい。
【００２１】
前記凹部の内面は、反射膜がコーティングされて反射面が形成されることが好ましい。
【００２２】
本発明の複合光学素子は、蛍光物質から蛍光を発生させる励起光が入射され、前記励起光の少なくとも一部を反射する半透膜を介して、各々の接合面が平行になるように複数のプリズムを接合して形成され、前記半透膜によって前記励起光を複数平行に分岐させて第２分岐手段に入射させる第１分岐手段と、前記第１分岐手段から複数の平行な励起光が入射され、前記励起光の少なくとも一部を反射し、かつ、前記蛍光を透過する半透膜を介して、各々の接合面が平行になるように複数のプリズムを接合して形成され、前記半透膜によって前記励起光を複数平行に分岐させて前記蛍光物質に入射させるとともに、前記蛍光物質から発生した前記蛍光を透過させる第２分岐手段と、を備えることを特徴とする。
【００２３】
また、前記第１分岐手段に設けられた複数の前記半透膜は、前記第２分岐手段に入射させる前記励起光の光量が等しくなるように前記励起光に対する反射率及び透過率が定められ、前記励起光の入射光軸に沿って当該反射率が高くなる順に配置されるとともに、前記第２分岐手段に設けられた複数の前記半透膜は、出射する前記励起光の光量が等しくなるように前記励起光に対する反射率及び透過率が定められ、前記第１分岐手段から入射する前記励起光の入射光軸に沿って当該反射率が高くなる順に配置されることが好ましい。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、複数の試料から発生する蛍光を各々峻別して同時に測定することができるとともに、各試料で発生した蛍光を効率良く受光することができる。また、受光光学系と試料との位置合わせ精度にほとんど影響されずに、各試料のＰＣＲ産物の総量等を正確に定量することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】蛍光測定装置の概略を示すブロック図である。
【図２】受光部、励起光分岐プリズム、及び集光容器の構成を示す図である。
【図３】励起光分岐プリズムの第１分岐部と励起光光源の構成とその作用を示す説明図である。
【図４】励起光分岐プリズムの第２分岐部の構成とその作用を示す説明図である。
【図５】集光容器の各凹部に励起光を照射した時の作用を示す説明図である。
【図６】試料から蛍光が出射する場合の凹部の作用を示す説明図である。
【図７】励起光カットフィルタを設けた例を示すブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
図１に示すように、蛍光測定装置１０は、励起光ＥＬを照射することによって試料から発せられる蛍光ＦＬを受光し、その光量を測定する装置であり、励起光光源１１、励起光分岐プリズム１２（励起光分岐手段）、集光容器１３（試料収容容器，試料収容手段）、恒温槽１４（温度調節手段）、受光部１６（受光手段）等から構成される。また、蛍光測定装置１０は、試料を加熱／冷却するサイクルを繰り返すことにより、二本鎖ＤＮＡの所定部分をテンプレートとして選択的に増幅するいわゆるＰＣＲ装置である。このため、蛍光測定装置１０では、テンプレートを含む二本鎖ＤＮＡ、テンプレートの両端に相補的に結合するプライマー、ＤＮＡの合成素材であるデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、プライマーを起点としてＤＮＡの合成を促すＤＮＡポリメラーゼに加え、例えば、ＰＣＲの過程でテンプレート内に結合する蛍光プローブを含む溶液を試料とし、この試料を加熱／冷却するサイクルを繰り返すことにより試料から発せられる蛍光を測定する。
【００２７】
励起光光源１１は、励起光ＥＬを発生する光源装置であり、レーザーダイオード（以下、ＬＤという）とコリメートレンズとからなる。ＬＤは、試料に用いる蛍光プローブの特性に応じて、蛍光プローブを励起して蛍光を発生させ得る波長の光を発光する。ＬＤは、例えば、波長４７０ｎｍの青色光を発し、この青色光を照射されることによって蛍光プローブから波長５６０ｎｍの緑色の蛍光を発する。また、コリメートレンズは、ＬＤで発生した光を平行光に整える。このため、励起光分岐プリズム１２には、平行光に整えられた青色光が励起光ＥＬとして入射する。
【００２８】
励起光分岐プリズム１２は、集光容器１３に正対する位置に配置され、後述するように側面方向から入射される励起光ＥＬを、集光容器１３が収容する複数の試料に分配して照射する。また、このとき励起光ＥＬは、励起光分岐プリズム１２への入射時と同様に、平行光に保たれたまま、集光容器１３に照射される。こうして励起光ＥＬが各試料に分配して照射されることにより、各試料からは、各試料が含むテンプレート数に応じた蛍光ＦＬが発生する。こうして各試料から発生した蛍光ＦＬは、励起光分岐プリズム１２を通って受光部１６に入射する。
【００２９】
集光容器１３は、蛍光測定装置１０で用いる試料を入れる容器であり、複数の試料を同時に収容することができるようになっている。こうした複数の試料を収容するスペース（図４参照。凹部６１）は、集光容器１３に対してほぼ垂直に入射する平行光を凹部６１内の極狭い領域に集光させる形状の凹面鏡となっている。したがって、励起光分岐プリズム１２から複数に分岐して入射される平行光の励起光ＥＬは、それぞれの試料に集光される。また、励起光ＥＬが照射されることによって試料から発生する蛍光ＦＬは、励起光ＥＬとは逆の光路で、凹部６１によって反射されることにより概ね平行光として集光容器１３を出射し、励起光分岐プリズム１２に入射する。そして、励起光分岐プリズム１２を通過して、受光部１６に到達する。なお、集光容器１３は、試料を収容した状態で恒温槽１４内に配置される。
【００３０】
恒温槽１４は、配置された集光容器１３の全体を一様な温度に調節する装置である。したがって、集光容器１３に収容された複数の試料は、温度環境は全て等しい。恒温槽１４は、こうした温度調節を、内蔵するヒーター及びクーラー（いずれも図示しない）によって行う。また、恒温槽１４は、蛍光測定装置１０をＰＣＲ装置として用いるときには、これらのヒーター及びクーラーを用いて、集光容器１３の全体を一様に加熱／冷却するサイクルを繰り返す。例えば、テンプレートを増幅させるときには、恒温槽１４は、試料中に含まれる二本鎖ＤＮＡの鎖長等に応じて、集光容器１３を８０〜９０度程度の高温に加熱し、数十秒〜数分程度、この温度を維持する。このとき、試料に含まれる二本鎖ＤＮＡは一本鎖ＤＮＡに変性する。次に、集光容器１３の温度を、試料に用いたプライマーの種類に応じて、例えば６０度程度の低温に急速に冷却すると、一本鎖ＤＮＡのテンプレートの端に、プライマーが優先的に結合する。同時に、テンプレート内の所定位置には蛍光プローブが結合する。その後、恒温槽１４の温度が、ＤＮＡポリメラーゼが活性化する６０〜７０度程度の温度に調節されると、一本鎖ＤＮＡに結合したプライマーを起点としてテンプレートの相補鎖が合成される。また、このときエキソヌクレアーゼ活性により蛍光プローブは上書きされ、蛍光プローブ内に含まれる蛍光レポーターと励起光吸収剤（クエンチャー）とが分離される。これにより、試料に対して励起光ＥＬを照射したときに、蛍光レポーターから蛍光が発せられるようになる。恒温槽１４によってこうした加熱／冷却のサイクルが繰り返されることによって、指数関数的にテンプレートが増幅されるとともに、これに応じて、励起光ＥＬを照射したときに試料から発生する蛍光ＦＬが増大する。
【００３１】
受光部１６は、例えばフォトダイオード等の光電変換素子からなり、励起光分岐プリズム１２を介して集光容器１３に正対する位置に配置される。受光部１６は、試料から発せられた蛍光ＦＬを受光すると、その光量に応じた信号を出力する。こうして受光部１６から出力される信号と、前述の加熱／冷却のサイクルの総数等に応じて、増幅前後のテンプレートの総量等が定量される。
【００３２】
図２に示すように、励起光分岐プリズム１２は、複数のプリズムを接合して全体として平板状に形成された複合光学素子であり、各プリズムの接合面には入射した光の波長に応じて、その一部成分を透過／反射する半透膜が設けられている。半透膜は、例えば、誘電体の多層膜等で形成される。また、励起光分岐プリズム１２は、第１分岐部２１と第２分岐部２２とからなる。
【００３３】
第１分岐部２１は、励起光分岐プリズム１２の側面から入射される励起光ＥＬの光路を複数に分岐させて第２分岐部２２に入射させる部材である。この第１分岐部２１は、２つの三角プリズム２３，２４と４つの平行四辺形プリズム２６〜２９からなり、励起光ＥＬの入射光軸（ｙ方向）に沿って縦長の直方体状に形成される。三角プリズム２３，２４は、第１分岐部２１の両端に配置されるとともに、これらの三角プリズム２３，２４の側面のうち、第１分岐部２１の側面として露呈される端面はほぼ正方形状に形成され、励起光ＥＬは三角プリズム２３の正方形の端面から、この端面に対して垂直に入射される。また、平行四辺形プリズム２６、〜２９は全て等しい大きさ及び形状に形成され、三角プリズム２３，２４に挟み込まれるように斜面を合わせて平行に配置される。このため、三角プリズム２３，２４及び平行四辺形プリズム２６〜２９の接合面は全て平行であるとともに、励起光ＥＬの入射光軸に対して４５度傾斜している。そして、これらの接合面における励起光ＥＬの反射光は、第１分岐部２１の長手方向に垂直な方向（ｘ方向）に出射し、第２分岐部２２に入射する。
【００３４】
さらに、第１分岐部２１には、これらの三角プリズム２３，２４及び平行四辺形プリズム２６〜２９の接合面には、半透膜３１〜３４，３６が設けられている。半透膜３１〜３４は、ほぼ全ての波長帯の光を透過するが、励起光ＥＬについて、その一部成分を反射する光学薄膜である。例えば、半透膜３１は、励起光光源１１から入射する励起光ＥＬの８０％を透過し、残り２０％を第２分岐部２２側に反射する。同様に、半透膜３２は、半透膜３１を透過して入射する励起光ＥＬの７５％を透過し、残り２５％を第２分岐部２２側に反射するとともに、半透膜３３は、半透膜３２を透過して入射する励起光ＥＬの約６６．６％（２／３）を透過し、約３３．３％（１／３）を第２分岐部２２側に反射する。そして、半透膜３４は、半透膜３３を透過して入射する励起光ＥＬの５０％を透過し、残り５０％を第２分岐部２２側に反射する。さらに、半透膜３６は、半透膜３１〜３４と同様にほぼ全ての波長帯の光を透過するが、励起光ＥＬについてはこれを全て反射する光学薄膜である。こうして三角プリズム２３，２４及び平行四辺形プリズム２６〜２９の接合面に半透膜３１〜３４，３６が設けられていることによって、励起光分岐プリズム１２に入射された励起光ＥＬは、第１分岐部２１で５本の平行光に分岐され、第２分岐部２２に入射する。また、半透膜３１〜３４，３６の透過率及び反射率が上述のように定められていることによって、第１分岐部２１で５本に分岐された励起光ＥＬの光量は等しい。
【００３５】
第２分岐部２２は、第１分岐部２１から５本に分岐されて入射する励起光ＥＬを集光容器１３に設けられた凹部６１の位置及び個数に合わせてさらに分岐させ、これらの凹部６１に各々入れられた試料に励起光ＥＬを照射する部材である。また、こうして励起光ＥＬを照射したことにより、各試料からは蛍光ＦＬが発生するとともに、蛍光ＦＬの発生に寄与しなかった励起光ＥＬが集光容器１３で反射される。このため、第２分岐部２２には、集光容器１３側から、蛍光ＦＬと励起光ＥＬの反射光が入射するが、後述するように第２分岐部２２は、蛍光ＦＬを透過して受光部１６に入射させ、励起光ＥＬは少なくともその一部成分を反射する。
【００３６】
この第２分岐部２２は、２個の三角プリズム４１，４２と４個の平行四辺形プリズム４３〜４６とを接合して形成され、三角プリズム４１，４２を両端に配置し、これらの三角プリズム４１，４２に挟み込まれるように斜面を合わせて平行四辺形プリズム４３〜４６が配置される。また、三角プリズム４１，４２及び平行四辺形プリズム４３〜４６間の各接合面は、平行であるとともに、第１分岐部２１から入射する励起光ＥＬの光軸（ｘ方向）に対して４５度傾斜している。さらに、これらの三角プリズム４１，４２及び平行四辺形プリズム４３〜４６の接合面には、半透膜５１〜５４，５６がそれぞれ設けられるとともに、第２分岐部２２は、三角プリズム４１の長手方向の側面によって第１分岐部２１の長手方向に沿った側面に接合される。このため、第１分岐部２１から入射する５本の励起光ＥＬはそれぞれ半透膜５１〜５４，５６に到達するとともに、各励起光ＥＬは、後述するように半透膜５１〜５４，５６によって下方（ｚ方向のマイナス側）に反射され、集光容器１３に入射する。
【００３７】
半透膜５１〜５４は、蛍光ＦＬを含むほぼすべての波長帯の光を透過するが、励起光ＥＬについては所定の光量を反射する光学薄膜である。例えば、半透膜５１は、第１分岐部２１から入射する励起光ＥＬの８０％を透過し、残り２０％を集光容器１３側に反射する。同様に、半透膜５２は、半透膜５１を透過して入射する励起光ＥＬの７５％を透過し、残り２０％を集光容器１３側に反射するとともに、半透膜５３は、半透膜５２を透過して入射する励起光ＥＬの約６６．６％を透過し、残り約３３．３％を反射する。そして、半透膜５４は、半透膜５３を透過した励起光ＥＬの５０％を透過し、残り５０％を集光容器１３側に反射する。さらに、半透膜５６は、他の半透膜５１〜５４と同様にほぼ全ての波長帯の光を透過するが、励起光ＥＬについては入射した成分を全て反射する光学薄膜である。こうして三角プリズム４１，４２と平行四辺形プリズム４２〜４５との接合面に半透膜５１〜５４，５６が設けられていることによって、第１分岐部２１から入射する５本の励起光ＥＬは、さらに５箇所で分岐され、それぞれ集光容器１３に照射される。
【００３８】
また、第２分岐部２２には、上述のように第１分岐部２１から励起光ＥＬが入射するだけでなく、試料で発生した蛍光ＦＬと集光容器１３で反射された励起光ＥＬが集光容器１３側から入射するが、蛍光ＦＬは半透膜５１〜５４，５６を透過して受光部１６に入射する。また、集光容器１３による励起光ＥＬの反射光は、半透膜５１〜５４，５６によって少なくともその一部成分が反射される。
【００３９】
集光容器１３には試料を収容する凹部６１が複数設けられている。これらの凹部６１は、第１分岐部２１が励起光ＥＬを分岐させる間隔と、第２分岐部２２が励起光ＥＬを分岐させる間隔とに応じて配列されており、縦横に５箇所ずつ、合計で２５箇所に設けられている。このため、集光容器１３は、各凹部６１に試料を収容して恒温槽１４に配置されるときに、各凹部６１の位置が励起光分岐プリズム１２からの励起光ＥＬの照射位置にほぼ合致するように定められた所定の位置に配置される。
【００４０】
また、集光容器１３は不透明な樹脂からなるが、凹部６１の内面にはアルミニウム薄膜等からなる反射膜がコーティングされている。このため、凹部６１の内面は励起光ＥＬや蛍光ＦＬを反射する反射面を形成する。さらに、凹部６１の内面は概ね放物面形状に形成されている。したがって、平行光の励起光ＥＬが凹部６１に入射すると、励起光ＥＬは放物面の焦点近傍に集光される。同時に、凹部６１に入れられた試料から発せられる蛍光ＦＬのうち、焦点近傍で発生した蛍光ＦＬは凹部６１の内面で反射されることにより、平行光となって凹部６１を出射し、励起光分岐プリズム１２に入射する。
【００４１】
受光部１６は、集光容器１３の凹部６１に一対一に対応して設けられたフォトダイオード６２からなる。また、これらのフォトダイオード６２は、励起光分岐プリズム１２を介して、それぞれ対応する凹部６１に正対する位置に設けられている。フォトダイオード６２のこうした配置と、励起光分岐プリズム１２の構成や集光容器１３の凹部６１の形状等によって、各々のフォトダイオード６２には、ほぼ対応する凹部６１から出射した光だけが入射する。このため、各フォトダイオード６２が受光量に応じて出力する信号は、各凹部６１に収容された試料に対応したものである。したがって、各フォトダイオード６２から出力された信号と、集光容器１３を加熱／冷却したサイクルの総数等に応じて、増幅前後のテンプレートの総量等が定量される。
【００４２】
上述のように構成される蛍光測定装置１０は、以下に説明するように動作して、テンプレートを増幅する。まず、テンプレートを含む二本鎖ＤＮＡ、プライマー、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ、蛍光プローブを適量含有した液体状の試料６６（図４参照）が作製される。このとき、増幅するテンプレートの違い等に応じて、二本鎖ＤＮＡやプライマー、蛍光プローブ等の種類が異なる複数の試料６６が作製される。こうして作製された複数種類の試料６６は、集光容器１３の凹部６１にそれぞれ適量収容される。このとき、試料６６が収容された各凹部６１には、試料６６の溶媒が揮発することを防ぐために、試料６６に溶解せず、試料６６よりも比重が小さい揮発防止液６７（図４参照）が注がれる。したがって、集光容器１３の凹部６１に収容された試料６６の上面は揮発防止液６７で覆われる。こうして試料６６が収容された集光容器１３は、恒温槽１４内の所定位置に配置される。この恒温槽１４内の所定位置は、集光容器１３の各凹部６１の配列と、励起光分岐プリズム１２による励起光ＥＬの分岐位置、受光部１６のフォトダイオード６２の配列を概ね一致させるとともに、集光容器１３と励起光分岐プリズム１２及び受光部１６との距離を、各試料６６からの蛍光ＦＬの測定に適した所定の距離にする集光容器１３の配置位置である。こうして集光容器１３が配置されると、恒温槽１４は集光容器１３の全体を一様な温度に調節する。
【００４３】
こうして集光容器１３が配置されると、蛍光測定装置１０は、恒温槽１４によって集光容器１３に収容されたすべての温度を一様に加熱／冷却するサイクルを繰り返すことによりテンプレートを増幅させる。テンプレートを増幅させるときには、まず、蛍光測定装置１０は、恒温槽１４によって集光容器１３に収容された全ての試料６６を一様に、所定温度の高温に加熱する。これにより、各試料６６に含まれる二本鎖ＤＮＡは一本鎖ＤＮＡに変性する。そして、二本鎖ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡに変性するまでに要する十分な時間が経過すると、蛍光測定装置１０は、試料６６を所定温度の低温になるまで、恒温槽１４の温度を急速に冷却する。このとき、プライマーと蛍光プローブの鎖長が一本鎖ＤＮＡに比べて短いので、プライマーと蛍光プローブは優先的に一本鎖ＤＮＡのテンプレートに結合する。こうして、プライマー及び蛍光プローブを一本鎖ＤＮＡに結合させると、蛍光測定装置１０は、ＤＮＡポリメラーゼが活性化する温度まで試料６６の温度を上昇させる。このとき、プライマーを起点としてテンプレートが増幅され、同時に、蛍光プローブが分解され、蛍光プローブに含まれる蛍光レポーターがクエンチャーから分離される。これにより、励起光ＥＬを照射することにより、試料６６から蛍光ＦＬが発生するようになる。蛍光測定装置１０は、上述の加熱／冷却のサイクルを繰り返すことによりテンプレートを増幅させる。
【００４４】
また、蛍光測定装置１０は、上述のようにテンプレートを増幅させると同時に、集光容器１３に収容された各試料６６にそれぞれ励起光ＥＬを照射し、各試料６６から蛍光ＦＬを発生させ、その光量をそれぞれ測定する。
【００４５】
図３に示すように、蛍光測定装置１０は、ＬＤ６８を発光させ、励起光ＥＬを発生させる。このとき、ＬＤ６８から出射する励起光ＥＬは、所定の角度範囲で拡散するが、コリメートレンズ６９を通ることによって平行光に整えられる。したがって、平行光の励起光ＥＬが励起光光源１１から励起光分岐プリズム１２の第１分岐部２１に入射する。
【００４６】
励起光ＥＬは、三角プリズム２３の正方形の端面から第１分岐部２１に入射し、三角プリズム２３と平行四辺形プリズム２６の接合面に設けられた半透膜３１に到達する。このとき、励起光ＥＬの２０％は半透膜３１で反射される。したがって、励起光ＥＬは、その一部成分が入射光軸（ｙ方向）に対して光路が９０度折り曲げられてｘ方向に分岐し、第２分岐部２２に入射する。一方、半透膜３１に入射した励起光ＥＬのうち、８０％は半透膜３１を透過する。こうして半透膜３１を透過した励起光ＥＬは、平行四辺形プリズム２６と平行四辺形プリズム２７の接合面に設けられた半透膜３２に入射する。
【００４７】
こうして半透膜３２に入射した励起光ＥＬは、２５％の成分が反射され、入射光軸に対して光路が９０度折り曲げられて分岐し、第２分岐部２２に入射する。また、半透膜３２で分岐して第２分岐部２２に入射する励起光ＥＬは、前述の三角プリズム２３と平行四辺形プリズム２６との接合面で分岐された励起光ＥＬと平行であり、その光量も等しく、励起光光源１１から出射された励起光ＥＬの２０％の光量となっている。また、平行四辺形プリズム２６と平行四辺形プリズム２６との接合面に設けられた半透膜３２に入射した励起光ＥＬの７５％はこれを透過し、平行四辺形プリズム２７と平行四辺形プリズム２８の接合面に設けられた半透膜３３に入射する。
【００４８】
半透膜３３に入射した励起光ＥＬは、上述と同様にして、約３３％が半透膜３３によって反射されて分岐し、第２分岐部２２に入射するとともに、約６６％は半透膜３３を透過し、平行四辺形プリズム２８と平行四辺形プリズム２９の接合面に設けられた半透膜３４に入射する。そして、半透膜３４に入射した励起光ＥＬは、５０％が半透膜３４によって反射されて分岐し、第２分岐部２２に入射するとともに、５０％は半透膜３４を透過し、平行四辺形プリズム２９と三角プリズム２４との接合面に設けられた半透膜３６に入射する。こうして半透膜３６に入射した励起光ＥＬは、半透膜３６によって１００％反射され、その光路を９０度折り曲げられ、半透膜３１〜３４で分岐された各励起光ＥＬと平行に第２分岐部２２に入射する。
【００４９】
上述のようにして第１分岐部２１では、励起光光源１１からｙ方向に沿って入射する励起光ＥＬを５本のｘ方向に沿った励起光ＥＬに分岐させて第２分岐部２２へと入射させる。また、これらの５本の励起光ＥＬの光量は、いずれも励起光光源１１から出射された励起光ＥＬの光量の１／５となっている。さらに、励起光光源１１から出射される励起光ＥＬが平行光であるので、第１分岐部２１によって分岐され、第２分岐部２２に入射する各励起光ＥＬは、いずれも平行光である。
【００５０】
図４に示すように、第１分岐部２１からｘ方向に沿って第２分岐部２２に入射した各励起光ＥＬは、それぞれ第２分岐部２２によってさらに５本に分岐されて集光容器１３側に出射される。
【００５１】
まず、第１分岐部２１から第２分岐部２２に入射した励起光ＥＬは、三角プリズム４１と平行四辺形プリズム４３の接合面に設けられた半透膜５１に入射する。このとき、励起光ＥＬの２０％が半透膜５１で反射され、励起光分岐プリズム１２の下方に向けて光路を９０度折り曲げられて分岐し、集光容器１３側に出射される。一方、半透膜５１に入射した励起光ＥＬのうち、８０％は半透膜５１を透過して、平行四辺形プリズム４３と平行四辺形プリズム４４の接合面に設けられた半透膜５２に入射する。
【００５２】
半透膜５２に入射した励起光ＥＬは２５％の成分が反射し、励起光分岐プリズム１２の下方に向けて光路を９０度折り曲げられて分岐され、集光容器１３側に出射される。また、７５％の成分は半透膜５２を透過し、平行四辺形プリズム４４と平行四辺形プリズム４５との接合面に設けられた半透膜５３に入射する。
【００５３】
こうして半透膜５３に入射した励起光ＥＬは、約３３．３％の成分が半透膜５３で反射されることにより分岐して集光容器１３側に出射されるとともに、約６６．６％の成分が半透膜５３を透過して、平行四辺形プリズム４５と平行四辺形プリズム４６の接合面に設けられた半透膜５４に入射する。そして、半透膜５４に入射した励起光ＥＬは、５０％が半透膜５４によって反射されて分岐し、集光容器１３側に出射し、残り５０％の成分は半透膜５４を透過して、平行四辺形プリズム４６と三角プリズム４２の接合面に設けられた半透膜５６に入射する。こうして半透膜５６に入射した励起光ＥＬは、半透膜５６によって１００％反射され、集光容器１３側に出射される。
【００５４】
このように、第２分岐部２２は、第１分岐部２１から入射する励起光ＥＬをそれぞれさらに５本の励起光ＥＬに分岐させて、下方の集光容器１３に向けて出射する。したがって、励起光光源１１から出射された励起光ＥＬは、励起光分岐プリズム１２によって合計で２５本の平行な励起光ＥＬに分岐されて出射される。また、励起光分岐プリズム１２から出射される各励起光ＥＬは、いずれも平行光であるとともに、各励起光ＥＬの光量は励起光光源１１から出射される励起光ＥＬの４％である。さらに、集光容器１３が前述のように恒温槽１４内の所定位置に配置されていることにより、励起光分岐プリズム１２から出射される各励起光ＥＬは、集光容器１３の各凹部６１にそれぞれ入射する。
【００５５】
凹部６１に入射される励起光ＥＬは、図５に示すように、試料６６に集光される。前述のように、集光容器１３の凹部６１には試料６６と揮発防止液６７が収容されるとともに、試料６６は凹部６１の下方に、揮発防止液６７は凹部６１の上方に互いに分離して収容される。また、凹部６１の内面は反射面となっている。さらに、上述のように、励起光分岐プリズム１２から入射する励起光ＥＬは平行光である。したがって、励起光分岐プリズム１２から凹部６１に入射する励起光ＥＬは、揮発防止液６７を透過して試料６６に直接照射されると同時に、揮発防止液６７や試料６６を透過し、凹部６１の内面に到達した成分は、凹部６１の内面で反射される。このとき、凹部６１の内面はほぼ放物面形状に形成され、かつ、凹部６１に入射する励起光ＥＬは平行光であるため、凹部６１の内面で反射した励起光は、試料６６内の概ね一定の範囲（以下、焦点近傍という）７１に集光する。なお、焦点近傍７１の位置が試料６６内にあるように、凹部６１内面の形状、または凹部６１に収容する試料６６の量等が予め定められている。こうして試料６６に励起光ＥＬが集光される。
【００５６】
試料６６から発生した蛍光ＦＬは、凹部６１からから出射すると、励起光分岐プリズム１２を通過して、集光容器１３の対面に設けられた受光部１６に入射する。このとき、前述のように焦点近傍７１に励起光ＥＬが集光されることから、これに応じて、試料６６から発生する蛍光ＦＬの殆どは、焦点近傍７１から発生する。こうして焦点近傍７１から発生する蛍光ＦＬは、図６に示すように、特定の方向性はなく焦点近傍７１から四方八方に出射する。したがって、焦点近傍７１で発生した蛍光ＦＬの中には、蛍光ＦＬａ，ＦＬｂ，ＦＬｃのように凹部６１から直接出射するものもあるが、その大部分は、凹部６１の内面によって反射され、平行光となって凹部６１から出射される。
【００５７】
こうして凹部６１から平行光となって出射した蛍光ＦＬは、励起光分岐プリズム１２に入射し、各凹部６１の直上に位置する半透膜５１〜５４，５６を透過して、対応するフォトダイオード６２に入射する（図４参照）。したがって、各フォトダイオード６２は、各々に対応して配置された凹部６１の試料６６からの蛍光ＦＬをほぼ個別に光電変換する。これにより、蛍光測定装置１０は、複数の試料６６から同時に発生する蛍光ＦＬを個別に測定する。
【００５８】
なお、焦点近傍７１から発生する蛍光ＦＬのうち、蛍光ＦＬａ及び蛍光ＦＬｂのように、凹部６１から直接的に斜めに出射する蛍光ＦＬは、上述のように出射した凹部６１に対応しないフォトダイオード６２に入射して迷光となるが、上述のように凹部６１の内面で反射されて平行光となって出射する蛍光ＦＬと比較して、その光量は十分に小さく抑えられる。このため、蛍光測定装置１０による蛍光ＦＬの測定には、蛍光ＦＬａや蛍光ＦＬｂのような凹部６１を斜めに出射して迷光となる蛍光はほとんど影響を与えない。
【００５９】
以上のように、蛍光測定装置１０は、励起光分岐プリズム１２によって複数の試料６６に同時に平行光の励起光ＥＬを照射するとともに、試料６６を収容する凹部６１の内面が反射面となっており、かつ平行光を試料６６に集光させる形状となっている。これにより、蛍光測定装置１０は、励起光ＥＬの利用効率を向上させることができるとともに、試料６６からの蛍光ＦＬの発生効率を向上させることができる。
【００６０】
また、蛍光測定装置１０によって試料６６に励起光ＥＬを照射する場合、蛍光ＦＬは凹部６１の焦点近傍７１から発生する。そして、焦点近傍７１から発生した蛍光ＦＬは、凹部６１の内面によって反射されることによってほぼ平行光となって凹部６１を出射する。したがって、凹部６１の位置に対応するようにフォトダイオード６２等の受光素子を配置しておくことで、複数の試料６６から同時に発生した蛍光ＦＬを各々峻別して受光し、各々の試料６６からの蛍光ＦＬを独立して測定することができる。
【００６１】
さらに、蛍光測定装置１０によれば、各試料６６から発生させる蛍光ＦＬの大部分を平行光にしてフォトダイオード６２に導くので、各試料６６で発生させた蛍光ＦＬを効率良く受光することができる。このため、ＰＣＲの加熱／冷却のサイクル数が少ない場合などで、各試料６６から発生する蛍光ＦＬの光量が小さいときにも、各試料６６からの蛍光ＦＬをより精密に測定することができる。
【００６２】
また、蛍光測定装置１０は、凹部６１の内面が放物面状に形成されているが、これ以外にレンズ等の集光要素を用いず、また、凹部６１の内面形状も平行光の励起光ＥＬを入射させるだけで機能するものである。このため、蛍光測定装置１０は、集光容器１３、励起光分岐プリズム１２、受光部１６の各間隔に影響されずに蛍光ＦＬの測定を行うことができる。したがって、蛍光測定装置１０の場合、励起光分岐プリズム１２によって分岐された励起光ＥＬが各凹部６１にそれぞれ照射されるように概ね配置されていれば、集光容器１３の恒温槽１４内での配置や、集光容器１３，励起光分岐プリズム１２，受光部１６の配置間隔等の細かな調整は不要であり、容易に、かつ、短時間で蛍光ＦＬの測定を開始することができる。
【００６３】
なお、上述の実施形態では、集光容器１３に励起光ＥＬを照射すると、集光容器１３の表面や、反射面となっている凹部６１の内面で反射され、励起光ＥＬの反射光が励起光分岐プリズム１２に入射する。こうして励起光分岐プリズム１２に入射する励起光ＥＬの反射光は、第２分岐部２２の半透膜５１〜５４，５６に入射するが、前述のように半透膜５１〜５４は、励起光ＥＬを部分的に透過する。したがって、励起光ＥＬの反射光が励起光分岐プリズム１２に入射すると、半透膜５１〜５４によって減光されるものの、これを透過してフォトダイオード６２に入射する。
【００６４】
蛍光測定装置１０では、前述のように効率良く蛍光ＦＬを発生させるとともに、受光効率も向上させることから、こうした励起光ＥＬの反射光があっても十分に精度良く蛍光ＦＬの光量を測定することができるが、励起光ＥＬの反射光は受光部１６に到達させないようにすることがより好ましい。このため、例えば図７に示すように、励起光分岐プリズム１２と受光部１６との間に、少なくとも蛍光ＦＬを透過し、励起光ＥＬを吸収または反射する励起光カットフィルタ７６を設けることが好ましい。こうした励起光カットフィルタ７６は、例えば、誘電体薄膜の積層体で形成される。なお、ここでは、励起光分岐プリズム１２と受光部１６との間に励起光カットフィルタ７６を設ける例を説明したが、励起光カットフィルタ７６は必ずしも励起光分岐プリズム１２や受光部１６から独立して設けられている必要はない。例えば、励起光カットフィルタ７６は、励起光分岐プリズム１２の上面（受光部１６側の表面）に、励起光分岐プリズム１２と一体に設けても良く、同様に、受光部１６と一体に設けても良い。こうして励起光カットフィルタ７６を設けておくことで、蛍光ＦＬだけを受光部１６へ入射させることができるようになるため、より精密に蛍光ＦＬの光量を測定することができる。
【００６５】
なお、上述の実施形態では、受光部１６が複数の試料６６に一対一に対応して配列されたフォトダイオード６２からなる例を説明したが、受光部１６の構成は蛍光ＦＬの光量を測定することができればこの例に限らない。例えば、いわゆるＣＣＤやＣＭＯＳ等のエリアイメージセンサを受光部１６として好適に用いることができる。また、ラインセンサを配列したものを受光部１６として用いても良い。さらに、上述の実施形態では、励起光分離プリズム１２からフォトダイオード６２に直接的に蛍光が入射する例を説明したがこれに限らず、励起光分離プリズム１２と受光部１６との間に、励起光分離プリズム１２から受光部１６に入射する蛍光を集光したり、受光部１６に導くための部材を設けても良い。例えば、集光容器１３の各凹部６１に対して、それぞれ集光レンズと光ファイバを設ける。そして、励起光分離プリズム１２から入射する蛍光を集光レンズで光ファイバに集光して入射させ、この光ファイバの他端から受光部１６に入射させる。こうして、励起光分離プリズム１２と受光部１６との間に集光レンズ及び光ファイバを設けると、各凹部６１に対応する光ファイバに細経の光ファイバを用いて、これらを結束しておくことで、受光部１６としてデジタルカメラ等に用いられるような一般的な受光面が小さいエリアイメージセンサを用いることができ、受光部１６をコンパクトに構成することができる。また、集光レンズ及び光ファイバを介して蛍光を受光部１６に導くことによって、受光部１６を励起光分離プリズム１２から離れた位置に設けたり、集光容器１３に正対しない任意の向きに配置することができる。
【００６６】
なお、上述の実施形態では、凹部６１の形状を放物面状に形成する例を説明したが、これに限らない。凹部６１の内面形状は、円筒状の穴に試料を収容する場合等、照射された励起光ＥＬを試料６６に集光させない場合と比較して、試料６６に効率良く励起光ＥＬを照射することができる形状であれば良い。例えば、凹部６１の内面のうち、一部分が放物面となっていても良い。また、凹部６１の内面形状は平行光を一点に集光する厳密な放物面となっている必要はなく、試料６６内のある程度の広がりを持った部分的な領域に平行光を集光する形状となっていれば良い。但し、蛍光ＦＬが凹部６１を出射するときに平行光となっている割合が高いほど、迷光が少なく、かつ、受光部１６では発生した蛍光ＦＬを効率良く利用することができる。このため、凹部６１の内面形状は、凹部６１から出射する蛍光ＦＬの６０％以上が平行光の光軸（蛍光ＦＬｃの方向に沿った光軸）の±１０度以内に収まる形状であることが好ましい。さらに、凹部６１から出射する蛍光ＦＬの７０％以上が同様の角度範囲に収まることが好ましく、８０％以上の蛍光ＦＬが上述の角度範囲内に収まることが特に好ましい。また、上述の光量の蛍光ＦＬが、平行光の光軸を基準として±５度以下の範囲に収まることがより好ましく、±３度以下に収まることが特に好ましい。
【００６７】
また、上述の実施形態では、集光容器１３を樹脂材料で形成し、凹部６１の内面にアルミニウム等からなる反射膜をコーティングして反射面を形成する例を説明したがこれに限らない。例えば、集光容器１３の全体を光沢のある金属材料で形成しても良い。また、上述の実施形態のように集光容器１３を樹脂材料で形成する場合には、凹部６１の内面にコーティングする反射膜の材料は励起光ＥＬ及び蛍光ＦＬを反射するものであれば、任意の材料を用いることができる。
【００６８】
なお、上述の実施形態では、集光容器１３の縦横に５箇所ずつ、合計で２５箇所に凹部６１が設けられた例を説明したが、集光容器１３で同時に収容する試料６６の最大数は２５でなくても良く、集光容器１３には任意の個数の凹部６１を設けて良い。また、この場合、上述の実施形態で説明したように、集光容器１３の凹部６１の位置と、励起光分岐プリズム１２及び受光部１６の構成を予め対応するように構成しておくことが好ましい。
【００６９】
なお、上述の実施形態では、励起光ＥＬが波長４７０ｎｍの青色光であり、蛍光ＦＬは波長５６０ｎｍの緑色光である例を説明したが、励起光ＥＬや蛍光ＦＬの波長はこの例に限らない。励起光ＥＬや蛍光ＦＬの波長は、使用する蛍光プローブやＤＮＡ結合色素の種類に応じて任意に定めることができる。また、蛍光測定装置１０で、複数種類の蛍光プローブやＤＮＡ結合色素を用いる場合には、これに応じて励起光光源１１に複数のＬＤ６８を設け、叙述の実施形態と同様に、励起光分岐プリズム１２に設けられた各々の半透膜の特性をこれに応じたものにすれば良い。
【００７０】
なお、上述の実施形態では、試料６６の溶媒が揮発してしまうことを防ぐために、試料６６を収容した凹部６１に揮発防止液６７を入れる例を説明したが、これに限らず、例えば凹部６１の開口形状や試料６６の収容量等に合わせて作成されたフタを各凹部６１に取り付けるようにしても良い。また、揮発防止液６７を用いる場合にも、凹部６１の内容物がこぼれることを防ぐためにこうしたフタを用いるようにしても良い。但し、凹部６１の開口に取り付けるフタは、少なくとも励起光ＥＬや蛍光ＦＬを透過する材料でする必要があり、このフタによる屈折や反射が励起光ＥＬの照射や蛍光ＦＬの測定に影響が少ない形状とすることが好ましい。
【００７１】
なお、上述の実施形態では、全ての凹部６１に等しい光量の励起光ＥＬを照射する例を説明したが、これに限らず、励起光分岐プリズム１２の各半透膜の反射率及び透過率を各々に定めることによって、各凹部６１に照射する励起光ＥＬの光量をそれぞれに異なるものにしても良い。
【００７２】
なお、上述の実施形態では、蛍光測定装置１０をＤＮＡを増幅するＰＣＲ装置として用いる例を説明したが、蛍光測定装置１０は試料６６から蛍光ＦＬを発生させ、その光量を測定するものであれば、ＰＣＲ以外にも任意の用途に用いることができる。
【符号の説明】
【００７３】
１０ 蛍光測定装置
１１ 励起光光源
１２ 励起光分岐プリズム
１３ 集光容器
１４ 恒温槽
１６ 受光部
２１ 第１分岐部
２２ 第２分岐部
２３，２４，４１，４２ 三角プリズム
２６〜２９，４３〜４６ 平行四辺形プリズム
３１〜３４，３６，５１〜５４，５６ 半透膜
６１ 凹部
６２ フォトダイオード
６６ 試料
６７ 揮発防止液
６８ ＬＤ
６９ コリメートレンズ
７１ 焦点近傍
７６ 励起光カットフィルタ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、励起光を照射することにより試料から発せられる蛍光を測定する蛍光測定装置と、これに用いる複合光学素子及び試料を収容する容器に関し、さらに詳しくは、複数の試料から発生する蛍光を測定する蛍光測定装置、これに用いる複合光学素子及び複数の試料を収容する容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムのような長大なＤＮＡ分子の中から、特定のＤＮＡ断片を選択的に増幅させる手法として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた手法（以下、ＰＣＲ法という）が知られている。周知のように、ＰＣＲ法は、増幅対象（以下、テンプレートという）を含む二本鎖ＤＮＡと、テンプレートに相補的なオリゴヌクレオチド（以下、プライマーという）と、テンプレートに結合したプライマーを起点としてＤＮＡ鎖の合成を促すＤＮＡポリメラーゼとを含む試料溶液（以下、単に試料という）を加熱／冷却するサイクルを繰り返すことにより、加熱による二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡへの変性と、冷却時のＤＮＡ鎖長に応じた再結合性の相違とを利用してテンプレートを増幅する手法である。
【０００３】
また、近年では単にテンプレートを増幅させるだけでなく、増幅前のテンプレートの総量やＰＣＲ産物の総量を定量的に評価することができるように改良されたＰＣＲ法（以下、定量ＰＣＲ法という）が知られている。定量ＰＣＲ法の具体的な手法としては、例えば、アガロースゲル電気泳動法、ＳＹＢＲグリーン法、蛍光プローブ法が知られている。アガロースゲル電気泳動法は、アガロースゲル電気泳動によってＰＣＲ産物を分離し、これを同条件で増幅した既知試料と比較することにより未知試料を定量する。また、ＳＹＢＲグリーン法は、二本鎖ＤＮＡに結合するＤＮＡ結合色素（ＳＹＢＲグリーン）を加えてＰＣＲを行うと同時に、ＤＮＡ結合色素から発せられる蛍光をリアルタイムに測定し、これとＤＮＡ結合色素を含まない標準試料と比較することで二本鎖ＤＮＡ濃度を定量する。蛍光プローブ法は、テンプレートの両端に相補的に結合するプライマーに加えて、テンプレート内に相補的に結合する蛍光プローブを用いる。このとき蛍光プローブとしては、テンプレートに特異的に結合するものを選ぶことで、テンプレートの総量やＰＣＲ産物の総量を正確に定量することができる。
【０００４】
定量ＰＣＲ法によってテンプレートを増幅させる装置の中でも、蛍光を測定して未知試料を定量する蛍光測定装置には、試料を加熱／冷却する恒温槽と、ＤＮＡ結合色素や蛍光プローブを励起して蛍光を発生させる励起光を照射する光源や光学系、発生した蛍光を集光する光学系や受光素子等が備えられている。また、こうした蛍光測定装置では、通常、試料に照射する励起光の光量と比較して、試料から発せられる蛍光の光量は極めて小さいため、蛍光を効率良く発生させたり、発生した蛍光を効率良く受光する等の目的で様々な工夫がなされる。
【０００５】
例えば、試料を入れる容器の周囲に半球状や放物面状のリフレクタを設け、このリフレクタによって試料から発生した蛍光を受光素子に効率良く導くようにした蛍光測定装置が知られている（特許文献１，２）。また、従来、円筒状に形成されていた容器を椀型に形成し、さらに蓋の形状を容器内に膨出したレンズ形状とすることによって、試料の凝集を防ぎ、励起光の照射効率及び蛍光の発生効率を向上させた試料容器が知られている（特許文献３）。さらに、従来は、励起光を照射する光軸と蛍光の受光する光軸とが略垂直になるように構成されていたところ、近年では、バンドルファイバを用いることによって、一つのプローブで、ほぼ同一の光路で励起光の照射と蛍光の受光とを両立するとともに、複数種類の波長帯の蛍光を測定可能にした蛍光測定装置も知られている（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−１９７７９号公報
【特許文献２】特開２００８−１８０５６７号公報
【特許文献３】特開２００６−２１４９８６号公報
【特許文献４】特開２００９−１９９６１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のような蛍光測定装置は、通常、一つの試料に対して励起光を照射して蛍光を測定する。このとき、蛍光を受光素子に導く受光プローブや受光光学系と試料との相対的な位置や向き、特に、受光プローブや受光光学系と試料との距離によって、受光プローブや受光光学系に入射し、受光素子に到達する蛍光の光量が変化する。したがって、ＰＣＲ産物の総量等を正確に定量するためには、試料に対して受光プローブや受光光学系を正確に位置決めしたり、試料に対する位置や向き、距離に応じて受光量を校正する必要がある。さらに、前述のように試料の周囲にリフレクタを設ける場合や、レンズ等の集光光学系を用いる場合には、受光プローブや受光光学系の位置決め精度が蛍光の受光量に及ぼす影響が顕著である。こうしたことから、従来の蛍光測定装置では、新しい試料を用いる度に、あるいは複数の試料を収容した容器を用いる場合には各試料に合わせて受光プローブや受光光学系を移動させる度に、これらの位置決めするという煩雑な作業を繰り返す必要があった。
【０００８】
また、前述のように、蛍光測定装置は、一つの試料に対して励起光を照射し、その蛍光を測定するが、これを複数同時に行うことは難しい。例えば、複数の試料を配列して収容する試料容器を用い、かつ、各々の試料に個別の受光プローブや受光光学系を設ければ、同時に各試料からの蛍光を測定することができる。しかし、こうして単に複数の試料を配列する場合、受光プローブや受光光学系には対応する試料からの蛍光だけでなく、周辺に配列された他の試料からの蛍光も迷光として入射してしまう。このため、こうした方法で蛍光を測定し、各試料中のＰＣＲ産物の総量等を定量したとしても、その正確性に問題が生じる。
【０００９】
また、こうして複数の試料を配列する場合、配列のスペース等を考慮すれば、特許文献１，２等に記載されているように、各々の試料についてリフレクタを設けることは難しい。このため、複数の試料を配列してこれらから発生する蛍光を測定する場合には、前述のように迷光によって蛍光の測定精度が悪化するだけでなく、蛍光の受光量自体にも問題がある。
【００１０】
本発明は上述の問題点を鑑みてなされたものであり、複数の試料から発生する蛍光を同時に測定するとともに、迷光が少なく、発生した蛍光を効率良く受光することができ、また試料と受光光学系の位置合わせ精度にほとんど影響されずに、ＰＣＲ産物の総量等を正確に定量することができる蛍光測定装置を提供することを目的とする。また、これに用いる複合光学素子及び複数の試料を収容する容器を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の蛍光測定装置は、励起光が照射されることにより蛍光を発生する試料が収容される凹部を複数有し、前記凹部の内面が前記励起光及び前記蛍光を反射するとともに、前記励起光が平行光の場合に、入射した前記励起光を前記試料に集光する内面形状に形成された試料収容手段と、前記励起光を発生させ、前記励起光を平行光に整えて出射する励起光光源と、前記試料収容手段に正対して配置され、前記励起光光源から平行光に整えられた前記励起光が入射され、前記励起光を前記凹部の配列に応じて分岐させ、前記凹部にそれぞれ入射させる励起光分岐手段と、前記励起光分岐手段を介して前記試料収容手段に正対して配置され、前記試料から発生した蛍光を受光して光電変換することにより、各々の前記試料から発生した蛍光の光量を測定する受光手段と、を備えることを特徴とする。
【００１２】
前記凹部の内面は放物面であり、前記励起光分岐手段から入射される平行光の前記励起光を前記放物面の焦点に集光させるとともに、前記焦点にある前記試料から発せられた前記蛍光が平行光に整えて前記凹部から出射させることが好ましい。
【００１３】
前記励起光分岐手段は、前記蛍光を透過し、前記励起光の少なくとも一部を反射する半透膜を介して、複数のプリズムを接合して形成されることが好ましい。
【００１４】
前記励起光分岐手段は、前記励起光光源から入射する前記励起光を前記励起光分岐手段の中で複数に分岐させる第１分岐手段と、前記第１分岐手段から入射する複数の前記励起光を前記凹部の配列に応じてさらに分岐させて前記試料収容手段側に出射する第２分岐手段とからなることが好ましい。
【００１５】
前記励起光分岐手段は、複数の前記凹部に各々等しい光量の前記励起光を入射させることが好ましい。
【００１６】
前記試料収容手段に前記励起光を照射したときに、前記試料収容手段によって反射されることにより前記受光手段に入射する前記励起光をカットする励起光カット手段が、前記励起光分岐手段と前記受光手段との間に設けられることが好ましい。
【００１７】
前記受光手段は、前記凹部に一対一に対応するように配列されたフォトダイオードからなることが好ましい。
【００１８】
前記試料収容手段は、前記凹部に収容した複数の前記試料の温度を一様に調節する温度調節手段内に配置され、前記試料は、二本鎖ＤＮＡと、前記励起光が照射されることによって前記二本鎖ＤＮＡの総数に応じた蛍光を発生させる蛍光発生手段とを含み、前記温度調節手段によって前記試料の温度を変化させることによって前記二本鎖ＤＮＡの少なくとも一部配列を増幅させることが好ましい。
【００１９】
本発明の試料収容容器は、励起光が照射されることにより蛍光を発生する試料が収容される凹部を複数有し、前記凹部の内面が前記励起光及び前記蛍光を反射するとともに、前記励起光が平行光の場合に、入射した前記励起光を前記試料に集光させることを特徴とする。
【００２０】
前記凹部の内面は放物面であり、前記励起光分岐手段から照射される平行光の前記励起光を前記放物面の焦点に集光させるとともに、前記焦点にある前記試料から発せられた前記蛍光を平行光に整えて前記凹部から出射させることが好ましい。
【００２１】
前記凹部の内面は、反射膜がコーティングされて反射面が形成されることが好ましい。
【００２２】
本発明の複合光学素子は、蛍光物質から蛍光を発生させる励起光が入射され、前記励起光の少なくとも一部を反射する半透膜を介して、各々の接合面が平行になるように複数のプリズムを接合して形成され、前記半透膜によって前記励起光を複数平行に分岐させて第２分岐手段に入射させる第１分岐手段と、前記第１分岐手段から複数の平行な励起光が入射され、前記励起光の少なくとも一部を反射し、かつ、前記蛍光を透過する半透膜を介して、各々の接合面が平行になるように複数のプリズムを接合して形成され、前記半透膜によって前記励起光を複数平行に分岐させて前記蛍光物質に入射させるとともに、前記蛍光物質から発生した前記蛍光を透過させる第２分岐手段と、を備えることを特徴とする。
【００２３】
また、前記第１分岐手段に設けられた複数の前記半透膜は、前記第２分岐手段に入射させる前記励起光の光量が等しくなるように前記励起光に対する反射率及び透過率が定められ、前記励起光の入射光軸に沿って当該反射率が高くなる順に配置されるとともに、前記第２分岐手段に設けられた複数の前記半透膜は、出射する前記励起光の光量が等しくなるように前記励起光に対する反射率及び透過率が定められ、前記第１分岐手段から入射する前記励起光の入射光軸に沿って当該反射率が高くなる順に配置されることが好ましい。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、複数の試料から発生する蛍光を各々峻別して同時に測定することができるとともに、各試料で発生した蛍光を効率良く受光することができる。また、受光光学系と試料との位置合わせ精度にほとんど影響されずに、各試料のＰＣＲ産物の総量等を正確に定量することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】蛍光測定装置の概略を示すブロック図である。
【図２】受光部、励起光分岐プリズム、及び集光容器の構成を示す図である。
【図３】励起光分岐プリズムの第１分岐部と励起光光源の構成とその作用を示す説明図である。
【図４】励起光分岐プリズムの第２分岐部の構成とその作用を示す説明図である。
【図５】集光容器の各凹部に励起光を照射した時の作用を示す説明図である。
【図６】試料から蛍光が出射する場合の凹部の作用を示す説明図である。
【図７】励起光カットフィルタを設けた例を示すブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
図１に示すように、蛍光測定装置１０は、励起光ＥＬを照射することによって試料から発せられる蛍光ＦＬを受光し、その光量を測定する装置であり、励起光光源１１、励起光分岐プリズム１２（励起光分岐手段）、集光容器１３（試料収容容器，試料収容手段）、恒温槽１４（温度調節手段）、受光部１６（受光手段）等から構成される。また、蛍光測定装置１０は、試料を加熱／冷却するサイクルを繰り返すことにより、二本鎖ＤＮＡの所定部分をテンプレートとして選択的に増幅するいわゆるＰＣＲ装置である。このため、蛍光測定装置１０では、テンプレートを含む二本鎖ＤＮＡ、テンプレートの両端に相補的に結合するプライマー、ＤＮＡの合成素材であるデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、プライマーを起点としてＤＮＡの合成を促すＤＮＡポリメラーゼに加え、例えば、ＰＣＲの過程でテンプレート内に結合する蛍光プローブを含む溶液を試料とし、この試料を加熱／冷却するサイクルを繰り返すことにより試料から発せられる蛍光を測定する。
【００２７】
励起光光源１１は、励起光ＥＬを発生する光源装置であり、レーザーダイオード（以下、ＬＤという）とコリメートレンズとからなる。ＬＤは、試料に用いる蛍光プローブの特性に応じて、蛍光プローブを励起して蛍光を発生させ得る波長の光を発光する。ＬＤは、例えば、波長４７０ｎｍの青色光を発し、この青色光を照射されることによって蛍光プローブから波長５６０ｎｍの緑色の蛍光を発する。また、コリメートレンズは、ＬＤで発生した光を平行光に整える。このため、励起光分岐プリズム１２には、平行光に整えられた青色光が励起光ＥＬとして入射する。
【００２８】
励起光分岐プリズム１２は、集光容器１３に正対する位置に配置され、後述するように側面方向から入射される励起光ＥＬを、集光容器１３が収容する複数の試料に分配して照射する。また、このとき励起光ＥＬは、励起光分岐プリズム１２への入射時と同様に、平行光に保たれたまま、集光容器１３に照射される。こうして励起光ＥＬが各試料に分配して照射されることにより、各試料からは、各試料が含むテンプレート数に応じた蛍光ＦＬが発生する。こうして各試料から発生した蛍光ＦＬは、励起光分岐プリズム１２を通って受光部１６に入射する。
【００２９】
集光容器１３は、蛍光測定装置１０で用いる試料を入れる容器であり、複数の試料を同時に収容することができるようになっている。こうした複数の試料を収容するスペース（図４参照。凹部６１）は、集光容器１３に対してほぼ垂直に入射する平行光を凹部６１内の極狭い領域に集光させる形状の凹面鏡となっている。したがって、励起光分岐プリズム１２から複数に分岐して入射される平行光の励起光ＥＬは、それぞれの試料に集光される。また、励起光ＥＬが照射されることによって試料から発生する蛍光ＦＬは、励起光ＥＬとは逆の光路で、凹部６１によって反射されることにより概ね平行光として集光容器１３を出射し、励起光分岐プリズム１２に入射する。そして、励起光分岐プリズム１２を通過して、受光部１６に到達する。なお、集光容器１３は、試料を収容した状態で恒温槽１４内に配置される。
【００３０】
恒温槽１４は、配置された集光容器１３の全体を一様な温度に調節する装置である。したがって、集光容器１３に収容された複数の試料は、温度環境は全て等しい。恒温槽１４は、こうした温度調節を、内蔵するヒーター及びクーラー（いずれも図示しない）によって行う。また、恒温槽１４は、蛍光測定装置１０をＰＣＲ装置として用いるときには、これらのヒーター及びクーラーを用いて、集光容器１３の全体を一様に加熱／冷却するサイクルを繰り返す。例えば、テンプレートを増幅させるときには、恒温槽１４は、試料中に含まれる二本鎖ＤＮＡの鎖長等に応じて、集光容器１３を８０〜９０度程度の高温に加熱し、数十秒〜数分程度、この温度を維持する。このとき、試料に含まれる二本鎖ＤＮＡは一本鎖ＤＮＡに変性する。次に、集光容器１３の温度を、試料に用いたプライマーの種類に応じて、例えば６０度程度の低温に急速に冷却すると、一本鎖ＤＮＡのテンプレートの端に、プライマーが優先的に結合する。同時に、テンプレート内の所定位置には蛍光プローブが結合する。その後、恒温槽１４の温度が、ＤＮＡポリメラーゼが活性化する６０〜７０度程度の温度に調節されると、一本鎖ＤＮＡに結合したプライマーを起点としてテンプレートの相補鎖が合成される。また、このときエキソヌクレアーゼ活性により蛍光プローブは上書きされ、蛍光プローブ内に含まれる蛍光レポーターと励起光吸収剤（クエンチャー）とが分離される。これにより、試料に対して励起光ＥＬを照射したときに、蛍光レポーターから蛍光が発せられるようになる。恒温槽１４によってこうした加熱／冷却のサイクルが繰り返されることによって、指数関数的にテンプレートが増幅されるとともに、これに応じて、励起光ＥＬを照射したときに試料から発生する蛍光ＦＬが増大する。
【００３１】
受光部１６は、例えばフォトダイオード等の光電変換素子からなり、励起光分岐プリズム１２を介して集光容器１３に正対する位置に配置される。受光部１６は、試料から発せられた蛍光ＦＬを受光すると、その光量に応じた信号を出力する。こうして受光部１６から出力される信号と、前述の加熱／冷却のサイクルの総数等に応じて、増幅前後のテンプレートの総量等が定量される。
【００３２】
図２に示すように、励起光分岐プリズム１２は、複数のプリズムを接合して全体として平板状に形成された複合光学素子であり、各プリズムの接合面には入射した光の波長に応じて、その一部成分を透過／反射する半透膜が設けられている。半透膜は、例えば、誘電体の多層膜等で形成される。また、励起光分岐プリズム１２は、第１分岐部２１と第２分岐部２２とからなる。
【００３３】
第１分岐部２１は、励起光分岐プリズム１２の側面から入射される励起光ＥＬの光路を複数に分岐させて第２分岐部２２に入射させる部材である。この第１分岐部２１は、２つの三角プリズム２３，２４と４つの平行四辺形プリズム２６〜２９からなり、励起光ＥＬの入射光軸（ｙ方向）に沿って縦長の直方体状に形成される。三角プリズム２３，２４は、第１分岐部２１の両端に配置されるとともに、これらの三角プリズム２３，２４の側面のうち、第１分岐部２１の側面として露呈される端面はほぼ正方形状に形成され、励起光ＥＬは三角プリズム２３の正方形の端面から、この端面に対して垂直に入射される。また、平行四辺形プリズム２６、〜２９は全て等しい大きさ及び形状に形成され、三角プリズム２３，２４に挟み込まれるように斜面を合わせて平行に配置される。このため、三角プリズム２３，２４及び平行四辺形プリズム２６〜２９の接合面は全て平行であるとともに、励起光ＥＬの入射光軸に対して４５度傾斜している。そして、これらの接合面における励起光ＥＬの反射光は、第１分岐部２１の長手方向に垂直な方向（ｘ方向）に出射し、第２分岐部２２に入射する。
【００３４】
さらに、第１分岐部２１には、これらの三角プリズム２３，２４及び平行四辺形プリズム２６〜２９の接合面には、半透膜３１〜３４，３６が設けられている。半透膜３１〜３４は、ほぼ全ての波長帯の光を透過するが、励起光ＥＬについて、その一部成分を反射する光学薄膜である。例えば、半透膜３１は、励起光光源１１から入射する励起光ＥＬの８０％を透過し、残り２０％を第２分岐部２２側に反射する。同様に、半透膜３２は、半透膜３１を透過して入射する励起光ＥＬの７５％を透過し、残り２５％を第２分岐部２２側に反射するとともに、半透膜３３は、半透膜３２を透過して入射する励起光ＥＬの約６６．６％（２／３）を透過し、約３３．３％（１／３）を第２分岐部２２側に反射する。そして、半透膜３４は、半透膜３３を透過して入射する励起光ＥＬの５０％を透過し、残り５０％を第２分岐部２２側に反射する。さらに、半透膜３６は、半透膜３１〜３４と同様にほぼ全ての波長帯の光を透過するが、励起光ＥＬについてはこれを全て反射する光学薄膜である。こうして三角プリズム２３，２４及び平行四辺形プリズム２６〜２９の接合面に半透膜３１〜３４，３６が設けられていることによって、励起光分岐プリズム１２に入射された励起光ＥＬは、第１分岐部２１で５本の平行光に分岐され、第２分岐部２２に入射する。また、半透膜３１〜３４，３６の透過率及び反射率が上述のように定められていることによって、第１分岐部２１で５本に分岐された励起光ＥＬの光量は等しい。
【００３５】
第２分岐部２２は、第１分岐部２１から５本に分岐されて入射する励起光ＥＬを集光容器１３に設けられた凹部６１の位置及び個数に合わせてさらに分岐させ、これらの凹部６１に各々入れられた試料に励起光ＥＬを照射する部材である。また、こうして励起光ＥＬを照射したことにより、各試料からは蛍光ＦＬが発生するとともに、蛍光ＦＬの発生に寄与しなかった励起光ＥＬが集光容器１３で反射される。このため、第２分岐部２２には、集光容器１３側から、蛍光ＦＬと励起光ＥＬの反射光が入射するが、後述するように第２分岐部２２は、蛍光ＦＬを透過して受光部１６に入射させ、励起光ＥＬは少なくともその一部成分を反射する。
【００３６】
この第２分岐部２２は、２個の三角プリズム４１，４２と４個の平行四辺形プリズム４３〜４６とを接合して形成され、三角プリズム４１，４２を両端に配置し、これらの三角プリズム４１，４２に挟み込まれるように斜面を合わせて平行四辺形プリズム４３〜４６が配置される。また、三角プリズム４１，４２及び平行四辺形プリズム４３〜４６間の各接合面は、平行であるとともに、第１分岐部２１から入射する励起光ＥＬの光軸（ｘ方向）に対して４５度傾斜している。さらに、これらの三角プリズム４１，４２及び平行四辺形プリズム４３〜４６の接合面には、半透膜５１〜５４，５６がそれぞれ設けられるとともに、第２分岐部２２は、三角プリズム４１の長手方向の側面によって第１分岐部２１の長手方向に沿った側面に接合される。このため、第１分岐部２１から入射する５本の励起光ＥＬはそれぞれ半透膜５１〜５４，５６に到達するとともに、各励起光ＥＬは、後述するように半透膜５１〜５４，５６によって下方（ｚ方向のマイナス側）に反射され、集光容器１３に入射する。
【００３７】
半透膜５１〜５４は、蛍光ＦＬを含むほぼすべての波長帯の光を透過するが、励起光ＥＬについては所定の光量を反射する光学薄膜である。例えば、半透膜５１は、第１分岐部２１から入射する励起光ＥＬの８０％を透過し、残り２０％を集光容器１３側に反射する。同様に、半透膜５２は、半透膜５１を透過して入射する励起光ＥＬの７５％を透過し、残り２０％を集光容器１３側に反射するとともに、半透膜５３は、半透膜５２を透過して入射する励起光ＥＬの約６６．６％を透過し、残り約３３．３％を反射する。そして、半透膜５４は、半透膜５３を透過した励起光ＥＬの５０％を透過し、残り５０％を集光容器１３側に反射する。さらに、半透膜５６は、他の半透膜５１〜５４と同様にほぼ全ての波長帯の光を透過するが、励起光ＥＬについては入射した成分を全て反射する光学薄膜である。こうして三角プリズム４１，４２と平行四辺形プリズム４２〜４５との接合面に半透膜５１〜５４，５６が設けられていることによって、第１分岐部２１から入射する５本の励起光ＥＬは、さらに５箇所で分岐され、それぞれ集光容器１３に照射される。
【００３８】
また、第２分岐部２２には、上述のように第１分岐部２１から励起光ＥＬが入射するだけでなく、試料で発生した蛍光ＦＬと集光容器１３で反射された励起光ＥＬが集光容器１３側から入射するが、蛍光ＦＬは半透膜５１〜５４，５６を透過して受光部１６に入射する。また、集光容器１３による励起光ＥＬの反射光は、半透膜５１〜５４，５６によって少なくともその一部成分が反射される。
【００３９】
集光容器１３には試料を収容する凹部６１が複数設けられている。これらの凹部６１は、第１分岐部２１が励起光ＥＬを分岐させる間隔と、第２分岐部２２が励起光ＥＬを分岐させる間隔とに応じて配列されており、縦横に５箇所ずつ、合計で２５箇所に設けられている。このため、集光容器１３は、各凹部６１に試料を収容して恒温槽１４に配置されるときに、各凹部６１の位置が励起光分岐プリズム１２からの励起光ＥＬの照射位置にほぼ合致するように定められた所定の位置に配置される。
【００４０】
また、集光容器１３は不透明な樹脂からなるが、凹部６１の内面にはアルミニウム薄膜等からなる反射膜がコーティングされている。このため、凹部６１の内面は励起光ＥＬや蛍光ＦＬを反射する反射面を形成する。さらに、凹部６１の内面は概ね放物面形状に形成されている。したがって、平行光の励起光ＥＬが凹部６１に入射すると、励起光ＥＬは放物面の焦点近傍に集光される。同時に、凹部６１に入れられた試料から発せられる蛍光ＦＬのうち、焦点近傍で発生した蛍光ＦＬは凹部６１の内面で反射されることにより、平行光となって凹部６１を出射し、励起光分岐プリズム１２に入射する。
【００４１】
受光部１６は、集光容器１３の凹部６１に一対一に対応して設けられたフォトダイオード６２からなる。また、これらのフォトダイオード６２は、励起光分岐プリズム１２を介して、それぞれ対応する凹部６１に正対する位置に設けられている。フォトダイオード６２のこうした配置と、励起光分岐プリズム１２の構成や集光容器１３の凹部６１の形状等によって、各々のフォトダイオード６２には、ほぼ対応する凹部６１から出射した光だけが入射する。このため、各フォトダイオード６２が受光量に応じて出力する信号は、各凹部６１に収容された試料に対応したものである。したがって、各フォトダイオード６２から出力された信号と、集光容器１３を加熱／冷却したサイクルの総数等に応じて、増幅前後のテンプレートの総量等が定量される。
【００４２】
上述のように構成される蛍光測定装置１０は、以下に説明するように動作して、テンプレートを増幅する。まず、テンプレートを含む二本鎖ＤＮＡ、プライマー、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ、蛍光プローブを適量含有した液体状の試料６６（図４参照）が作製される。このとき、増幅するテンプレートの違い等に応じて、二本鎖ＤＮＡやプライマー、蛍光プローブ等の種類が異なる複数の試料６６が作製される。こうして作製された複数種類の試料６６は、集光容器１３の凹部６１にそれぞれ適量収容される。このとき、試料６６が収容された各凹部６１には、試料６６の溶媒が揮発することを防ぐために、試料６６に溶解せず、試料６６よりも比重が小さい揮発防止液６７（図４参照）が注がれる。したがって、集光容器１３の凹部６１に収容された試料６６の上面は揮発防止液６７で覆われる。こうして試料６６が収容された集光容器１３は、恒温槽１４内の所定位置に配置される。この恒温槽１４内の所定位置は、集光容器１３の各凹部６１の配列と、励起光分岐プリズム１２による励起光ＥＬの分岐位置、受光部１６のフォトダイオード６２の配列を概ね一致させるとともに、集光容器１３と励起光分岐プリズム１２及び受光部１６との距離を、各試料６６からの蛍光ＦＬの測定に適した所定の距離にする集光容器１３の配置位置である。こうして集光容器１３が配置されると、恒温槽１４は集光容器１３の全体を一様な温度に調節する。
【００４３】
こうして集光容器１３が配置されると、蛍光測定装置１０は、恒温槽１４によって集光容器１３に収容されたすべての温度を一様に加熱／冷却するサイクルを繰り返すことによりテンプレートを増幅させる。テンプレートを増幅させるときには、まず、蛍光測定装置１０は、恒温槽１４によって集光容器１３に収容された全ての試料６６を一様に、所定温度の高温に加熱する。これにより、各試料６６に含まれる二本鎖ＤＮＡは一本鎖ＤＮＡに変性する。そして、二本鎖ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡに変性するまでに要する十分な時間が経過すると、蛍光測定装置１０は、試料６６を所定温度の低温になるまで、恒温槽１４の温度を急速に冷却する。このとき、プライマーと蛍光プローブの鎖長が一本鎖ＤＮＡに比べて短いので、プライマーと蛍光プローブは優先的に一本鎖ＤＮＡのテンプレートに結合する。こうして、プライマー及び蛍光プローブを一本鎖ＤＮＡに結合させると、蛍光測定装置１０は、ＤＮＡポリメラーゼが活性化する温度まで試料６６の温度を上昇させる。このとき、プライマーを起点としてテンプレートが増幅され、同時に、蛍光プローブが分解され、蛍光プローブに含まれる蛍光レポーターがクエンチャーから分離される。これにより、励起光ＥＬを照射することにより、試料６６から蛍光ＦＬが発生するようになる。蛍光測定装置１０は、上述の加熱／冷却のサイクルを繰り返すことによりテンプレートを増幅させる。
【００４４】
また、蛍光測定装置１０は、上述のようにテンプレートを増幅させると同時に、集光容器１３に収容された各試料６６にそれぞれ励起光ＥＬを照射し、各試料６６から蛍光ＦＬを発生させ、その光量をそれぞれ測定する。
【００４５】
図３に示すように、蛍光測定装置１０は、ＬＤ６８を発光させ、励起光ＥＬを発生させる。このとき、ＬＤ６８から出射する励起光ＥＬは、所定の角度範囲で拡散するが、コリメートレンズ６９を通ることによって平行光に整えられる。したがって、平行光の励起光ＥＬが励起光光源１１から励起光分岐プリズム１２の第１分岐部２１に入射する。
【００４６】
励起光ＥＬは、三角プリズム２３の正方形の端面から第１分岐部２１に入射し、三角プリズム２３と平行四辺形プリズム２６の接合面に設けられた半透膜３１に到達する。このとき、励起光ＥＬの２０％は半透膜３１で反射される。したがって、励起光ＥＬは、その一部成分が入射光軸（ｙ方向）に対して光路が９０度折り曲げられてｘ方向に分岐し、第２分岐部２２に入射する。一方、半透膜３１に入射した励起光ＥＬのうち、８０％は半透膜３１を透過する。こうして半透膜３１を透過した励起光ＥＬは、平行四辺形プリズム２６と平行四辺形プリズム２７の接合面に設けられた半透膜３２に入射する。
【００４７】
こうして半透膜３２に入射した励起光ＥＬは、２５％の成分が反射され、入射光軸に対して光路が９０度折り曲げられて分岐し、第２分岐部２２に入射する。また、半透膜３２で分岐して第２分岐部２２に入射する励起光ＥＬは、前述の三角プリズム２３と平行四辺形プリズム２６との接合面で分岐された励起光ＥＬと平行であり、その光量も等しく、励起光光源１１から出射された励起光ＥＬの２０％の光量となっている。また、平行四辺形プリズム２６と平行四辺形プリズム２６との接合面に設けられた半透膜３２に入射した励起光ＥＬの７５％はこれを透過し、平行四辺形プリズム２７と平行四辺形プリズム２８の接合面に設けられた半透膜３３に入射する。
【００４８】
半透膜３３に入射した励起光ＥＬは、上述と同様にして、約３３％が半透膜３３によって反射されて分岐し、第２分岐部２２に入射するとともに、約６６％は半透膜３３を透過し、平行四辺形プリズム２８と平行四辺形プリズム２９の接合面に設けられた半透膜３４に入射する。そして、半透膜３４に入射した励起光ＥＬは、５０％が半透膜３４によって反射されて分岐し、第２分岐部２２に入射するとともに、５０％は半透膜３４を透過し、平行四辺形プリズム２９と三角プリズム２４との接合面に設けられた半透膜３６に入射する。こうして半透膜３６に入射した励起光ＥＬは、半透膜３６によって１００％反射され、その光路を９０度折り曲げられ、半透膜３１〜３４で分岐された各励起光ＥＬと平行に第２分岐部２２に入射する。
【００４９】
上述のようにして第１分岐部２１では、励起光光源１１からｙ方向に沿って入射する励起光ＥＬを５本のｘ方向に沿った励起光ＥＬに分岐させて第２分岐部２２へと入射させる。また、これらの５本の励起光ＥＬの光量は、いずれも励起光光源１１から出射された励起光ＥＬの光量の１／５となっている。さらに、励起光光源１１から出射される励起光ＥＬが平行光であるので、第１分岐部２１によって分岐され、第２分岐部２２に入射する各励起光ＥＬは、いずれも平行光である。
【００５０】
図４に示すように、第１分岐部２１からｘ方向に沿って第２分岐部２２に入射した各励起光ＥＬは、それぞれ第２分岐部２２によってさらに５本に分岐されて集光容器１３側に出射される。
【００５１】
まず、第１分岐部２１から第２分岐部２２に入射した励起光ＥＬは、三角プリズム４１と平行四辺形プリズム４３の接合面に設けられた半透膜５１に入射する。このとき、励起光ＥＬの２０％が半透膜５１で反射され、励起光分岐プリズム１２の下方に向けて光路を９０度折り曲げられて分岐し、集光容器１３側に出射される。一方、半透膜５１に入射した励起光ＥＬのうち、８０％は半透膜５１を透過して、平行四辺形プリズム４３と平行四辺形プリズム４４の接合面に設けられた半透膜５２に入射する。
【００５２】
半透膜５２に入射した励起光ＥＬは２５％の成分が反射し、励起光分岐プリズム１２の下方に向けて光路を９０度折り曲げられて分岐され、集光容器１３側に出射される。また、７５％の成分は半透膜５２を透過し、平行四辺形プリズム４４と平行四辺形プリズム４５との接合面に設けられた半透膜５３に入射する。
【００５３】
こうして半透膜５３に入射した励起光ＥＬは、約３３．３％の成分が半透膜５３で反射されることにより分岐して集光容器１３側に出射されるとともに、約６６．６％の成分が半透膜５３を透過して、平行四辺形プリズム４５と平行四辺形プリズム４６の接合面に設けられた半透膜５４に入射する。そして、半透膜５４に入射した励起光ＥＬは、５０％が半透膜５４によって反射されて分岐し、集光容器１３側に出射し、残り５０％の成分は半透膜５４を透過して、平行四辺形プリズム４６と三角プリズム４２の接合面に設けられた半透膜５６に入射する。こうして半透膜５６に入射した励起光ＥＬは、半透膜５６によって１００％反射され、集光容器１３側に出射される。
【００５４】
このように、第２分岐部２２は、第１分岐部２１から入射する励起光ＥＬをそれぞれさらに５本の励起光ＥＬに分岐させて、下方の集光容器１３に向けて出射する。したがって、励起光光源１１から出射された励起光ＥＬは、励起光分岐プリズム１２によって合計で２５本の平行な励起光ＥＬに分岐されて出射される。また、励起光分岐プリズム１２から出射される各励起光ＥＬは、いずれも平行光であるとともに、各励起光ＥＬの光量は励起光光源１１から出射される励起光ＥＬの４％である。さらに、集光容器１３が前述のように恒温槽１４内の所定位置に配置されていることにより、励起光分岐プリズム１２から出射される各励起光ＥＬは、集光容器１３の各凹部６１にそれぞれ入射する。
【００５５】
凹部６１に入射される励起光ＥＬは、図５に示すように、試料６６に集光される。前述のように、集光容器１３の凹部６１には試料６６と揮発防止液６７が収容されるとともに、試料６６は凹部６１の下方に、揮発防止液６７は凹部６１の上方に互いに分離して収容される。また、凹部６１の内面は反射面となっている。さらに、上述のように、励起光分岐プリズム１２から入射する励起光ＥＬは平行光である。したがって、励起光分岐プリズム１２から凹部６１に入射する励起光ＥＬは、揮発防止液６７を透過して試料６６に直接照射されると同時に、揮発防止液６７や試料６６を透過し、凹部６１の内面に到達した成分は、凹部６１の内面で反射される。このとき、凹部６１の内面はほぼ放物面形状に形成され、かつ、凹部６１に入射する励起光ＥＬは平行光であるため、凹部６１の内面で反射した励起光は、試料６６内の概ね一定の範囲（以下、焦点近傍という）７１に集光する。なお、焦点近傍７１の位置が試料６６内にあるように、凹部６１内面の形状、または凹部６１に収容する試料６６の量等が予め定められている。こうして試料６６に励起光ＥＬが集光される。
【００５６】
試料６６から発生した蛍光ＦＬは、凹部６１からから出射すると、励起光分岐プリズム１２を通過して、集光容器１３の対面に設けられた受光部１６に入射する。このとき、前述のように焦点近傍７１に励起光ＥＬが集光されることから、これに応じて、試料６６から発生する蛍光ＦＬの殆どは、焦点近傍７１から発生する。こうして焦点近傍７１から発生する蛍光ＦＬは、図６に示すように、特定の方向性はなく焦点近傍７１から四方八方に出射する。したがって、焦点近傍７１で発生した蛍光ＦＬの中には、蛍光ＦＬａ，ＦＬｂ，ＦＬｃのように凹部６１から直接出射するものもあるが、その大部分は、凹部６１の内面によって反射され、平行光となって凹部６１から出射される。
【００５７】
こうして凹部６１から平行光となって出射した蛍光ＦＬは、励起光分岐プリズム１２に入射し、各凹部６１の直上に位置する半透膜５１〜５４，５６を透過して、対応するフォトダイオード６２に入射する（図４参照）。したがって、各フォトダイオード６２は、各々に対応して配置された凹部６１の試料６６からの蛍光ＦＬをほぼ個別に光電変換する。これにより、蛍光測定装置１０は、複数の試料６６から同時に発生する蛍光ＦＬを個別に測定する。
【００５８】
なお、焦点近傍７１から発生する蛍光ＦＬのうち、蛍光ＦＬａ及び蛍光ＦＬｂのように、凹部６１から直接的に斜めに出射する蛍光ＦＬは、上述のように出射した凹部６１に対応しないフォトダイオード６２に入射して迷光となるが、上述のように凹部６１の内面で反射されて平行光となって出射する蛍光ＦＬと比較して、その光量は十分に小さく抑えられる。このため、蛍光測定装置１０による蛍光ＦＬの測定には、蛍光ＦＬａや蛍光ＦＬｂのような凹部６１を斜めに出射して迷光となる蛍光はほとんど影響を与えない。
【００５９】
以上のように、蛍光測定装置１０は、励起光分岐プリズム１２によって複数の試料６６に同時に平行光の励起光ＥＬを照射するとともに、試料６６を収容する凹部６１の内面が反射面となっており、かつ平行光を試料６６に集光させる形状となっている。これにより、蛍光測定装置１０は、励起光ＥＬの利用効率を向上させることができるとともに、試料６６からの蛍光ＦＬの発生効率を向上させることができる。
【００６０】
また、蛍光測定装置１０によって試料６６に励起光ＥＬを照射する場合、蛍光ＦＬは凹部６１の焦点近傍７１から発生する。そして、焦点近傍７１から発生した蛍光ＦＬは、凹部６１の内面によって反射されることによってほぼ平行光となって凹部６１を出射する。したがって、凹部６１の位置に対応するようにフォトダイオード６２等の受光素子を配置しておくことで、複数の試料６６から同時に発生した蛍光ＦＬを各々峻別して受光し、各々の試料６６からの蛍光ＦＬを独立して測定することができる。
【００６１】
さらに、蛍光測定装置１０によれば、各試料６６から発生させる蛍光ＦＬの大部分を平行光にしてフォトダイオード６２に導くので、各試料６６で発生させた蛍光ＦＬを効率良く受光することができる。このため、ＰＣＲの加熱／冷却のサイクル数が少ない場合などで、各試料６６から発生する蛍光ＦＬの光量が小さいときにも、各試料６６からの蛍光ＦＬをより精密に測定することができる。
【００６２】
また、蛍光測定装置１０は、凹部６１の内面が放物面状に形成されているが、これ以外にレンズ等の集光要素を用いず、また、凹部６１の内面形状も平行光の励起光ＥＬを入射させるだけで機能するものである。このため、蛍光測定装置１０は、集光容器１３、励起光分岐プリズム１２、受光部１６の各間隔に影響されずに蛍光ＦＬの測定を行うことができる。したがって、蛍光測定装置１０の場合、励起光分岐プリズム１２によって分岐された励起光ＥＬが各凹部６１にそれぞれ照射されるように概ね配置されていれば、集光容器１３の恒温槽１４内での配置や、集光容器１３，励起光分岐プリズム１２，受光部１６の配置間隔等の細かな調整は不要であり、容易に、かつ、短時間で蛍光ＦＬの測定を開始することができる。
【００６３】
なお、上述の実施形態では、集光容器１３に励起光ＥＬを照射すると、集光容器１３の表面や、反射面となっている凹部６１の内面で反射され、励起光ＥＬの反射光が励起光分岐プリズム１２に入射する。こうして励起光分岐プリズム１２に入射する励起光ＥＬの反射光は、第２分岐部２２の半透膜５１〜５４，５６に入射するが、前述のように半透膜５１〜５４は、励起光ＥＬを部分的に透過する。したがって、励起光ＥＬの反射光が励起光分岐プリズム１２に入射すると、半透膜５１〜５４によって減光されるものの、これを透過してフォトダイオード６２に入射する。
【００６４】
蛍光測定装置１０では、前述のように効率良く蛍光ＦＬを発生させるとともに、受光効率も向上させることから、こうした励起光ＥＬの反射光があっても十分に精度良く蛍光ＦＬの光量を測定することができるが、励起光ＥＬの反射光は受光部１６に到達させないようにすることがより好ましい。このため、例えば図７に示すように、励起光分岐プリズム１２と受光部１６との間に、少なくとも蛍光ＦＬを透過し、励起光ＥＬを吸収または反射する励起光カットフィルタ７６を設けることが好ましい。こうした励起光カットフィルタ７６は、例えば、誘電体薄膜の積層体で形成される。なお、ここでは、励起光分岐プリズム１２と受光部１６との間に励起光カットフィルタ７６を設ける例を説明したが、励起光カットフィルタ７６は必ずしも励起光分岐プリズム１２や受光部１６から独立して設けられている必要はない。例えば、励起光カットフィルタ７６は、励起光分岐プリズム１２の上面（受光部１６側の表面）に、励起光分岐プリズム１２と一体に設けても良く、同様に、受光部１６と一体に設けても良い。こうして励起光カットフィルタ７６を設けておくことで、蛍光ＦＬだけを受光部１６へ入射させることができるようになるため、より精密に蛍光ＦＬの光量を測定することができる。
【００６５】
なお、上述の実施形態では、受光部１６が複数の試料６６に一対一に対応して配列されたフォトダイオード６２からなる例を説明したが、受光部１６の構成は蛍光ＦＬの光量を測定することができればこの例に限らない。例えば、いわゆるＣＣＤやＣＭＯＳ等のエリアイメージセンサを受光部１６として好適に用いることができる。また、ラインセンサを配列したものを受光部１６として用いても良い。さらに、上述の実施形態では、励起光分離プリズム１２からフォトダイオード６２に直接的に蛍光が入射する例を説明したがこれに限らず、励起光分離プリズム１２と受光部１６との間に、励起光分離プリズム１２から受光部１６に入射する蛍光を集光したり、受光部１６に導くための部材を設けても良い。例えば、集光容器１３の各凹部６１に対して、それぞれ集光レンズと光ファイバを設ける。そして、励起光分離プリズム１２から入射する蛍光を集光レンズで光ファイバに集光して入射させ、この光ファイバの他端から受光部１６に入射させる。こうして、励起光分離プリズム１２と受光部１６との間に集光レンズ及び光ファイバを設けると、各凹部６１に対応する光ファイバに細経の光ファイバを用いて、これらを結束しておくことで、受光部１６としてデジタルカメラ等に用いられるような一般的な受光面が小さいエリアイメージセンサを用いることができ、受光部１６をコンパクトに構成することができる。また、集光レンズ及び光ファイバを介して蛍光を受光部１６に導くことによって、受光部１６を励起光分離プリズム１２から離れた位置に設けたり、集光容器１３に正対しない任意の向きに配置することができる。
【００６６】
なお、上述の実施形態では、凹部６１の形状を放物面状に形成する例を説明したが、これに限らない。凹部６１の内面形状は、円筒状の穴に試料を収容する場合等、照射された励起光ＥＬを試料６６に集光させない場合と比較して、試料６６に効率良く励起光ＥＬを照射することができる形状であれば良い。例えば、凹部６１の内面のうち、一部分が放物面となっていても良い。また、凹部６１の内面形状は平行光を一点に集光する厳密な放物面となっている必要はなく、試料６６内のある程度の広がりを持った部分的な領域に平行光を集光する形状となっていれば良い。但し、蛍光ＦＬが凹部６１を出射するときに平行光となっている割合が高いほど、迷光が少なく、かつ、受光部１６では発生した蛍光ＦＬを効率良く利用することができる。このため、凹部６１の内面形状は、凹部６１から出射する蛍光ＦＬの６０％以上が平行光の光軸（蛍光ＦＬｃの方向に沿った光軸）の±１０度以内に収まる形状であることが好ましい。さらに、凹部６１から出射する蛍光ＦＬの７０％以上が同様の角度範囲に収まることが好ましく、８０％以上の蛍光ＦＬが上述の角度範囲内に収まることが特に好ましい。また、上述の光量の蛍光ＦＬが、平行光の光軸を基準として±５度以下の範囲に収まることがより好ましく、±３度以下に収まることが特に好ましい。
【００６７】
また、上述の実施形態では、集光容器１３を樹脂材料で形成し、凹部６１の内面にアルミニウム等からなる反射膜をコーティングして反射面を形成する例を説明したがこれに限らない。例えば、集光容器１３の全体を光沢のある金属材料で形成しても良い。また、上述の実施形態のように集光容器１３を樹脂材料で形成する場合には、凹部６１の内面にコーティングする反射膜の材料は励起光ＥＬ及び蛍光ＦＬを反射するものであれば、任意の材料を用いることができる。
【００６８】
なお、上述の実施形態では、集光容器１３の縦横に５箇所ずつ、合計で２５箇所に凹部６１が設けられた例を説明したが、集光容器１３で同時に収容する試料６６の最大数は２５でなくても良く、集光容器１３には任意の個数の凹部６１を設けて良い。また、この場合、上述の実施形態で説明したように、集光容器１３の凹部６１の位置と、励起光分岐プリズム１２及び受光部１６の構成を予め対応するように構成しておくことが好ましい。
【００６９】
なお、上述の実施形態では、励起光ＥＬが波長４７０ｎｍの青色光であり、蛍光ＦＬは波長５６０ｎｍの緑色光である例を説明したが、励起光ＥＬや蛍光ＦＬの波長はこの例に限らない。励起光ＥＬや蛍光ＦＬの波長は、使用する蛍光プローブやＤＮＡ結合色素の種類に応じて任意に定めることができる。また、蛍光測定装置１０で、複数種類の蛍光プローブやＤＮＡ結合色素を用いる場合には、これに応じて励起光光源１１に複数のＬＤ６８を設け、叙述の実施形態と同様に、励起光分岐プリズム１２に設けられた各々の半透膜の特性をこれに応じたものにすれば良い。
【００７０】
なお、上述の実施形態では、試料６６の溶媒が揮発してしまうことを防ぐために、試料６６を収容した凹部６１に揮発防止液６７を入れる例を説明したが、これに限らず、例えば凹部６１の開口形状や試料６６の収容量等に合わせて作成されたフタを各凹部６１に取り付けるようにしても良い。また、揮発防止液６７を用いる場合にも、凹部６１の内容物がこぼれることを防ぐためにこうしたフタを用いるようにしても良い。但し、凹部６１の開口に取り付けるフタは、少なくとも励起光ＥＬや蛍光ＦＬを透過する材料でする必要があり、このフタによる屈折や反射が励起光ＥＬの照射や蛍光ＦＬの測定に影響が少ない形状とすることが好ましい。
【００７１】
なお、上述の実施形態では、全ての凹部６１に等しい光量の励起光ＥＬを照射する例を説明したが、これに限らず、励起光分岐プリズム１２の各半透膜の反射率及び透過率を各々に定めることによって、各凹部６１に照射する励起光ＥＬの光量をそれぞれに異なるものにしても良い。
【００７２】
なお、上述の実施形態では、蛍光測定装置１０をＤＮＡを増幅するＰＣＲ装置として用いる例を説明したが、蛍光測定装置１０は試料６６から蛍光ＦＬを発生させ、その光量を測定するものであれば、ＰＣＲ以外にも任意の用途に用いることができる。
【符号の説明】
【００７３】
１０ 蛍光測定装置
１１ 励起光光源
１２ 励起光分岐プリズム
１３ 集光容器
１４ 恒温槽
１６ 受光部
２１ 第１分岐部
２２ 第２分岐部
２３，２４，４１，４２ 三角プリズム
２６〜２９，４３〜４６ 平行四辺形プリズム
３１〜３４，３６，５１〜５４，５６ 半透膜
６１ 凹部
６２ フォトダイオード
６６ 試料
６７ 揮発防止液
６８ ＬＤ
６９ コリメートレンズ
７１ 焦点近傍
７６ 励起光カットフィルタ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起光が照射されることにより蛍光を発生する試料が収容される凹部を複数有し、前記凹部の内面が前記励起光及び前記蛍光を反射するとともに、前記励起光が平行光の場合に、入射した前記励起光を前記試料に集光する内面形状に形成された試料収容手段と、
前記励起光を発生させ、前記励起光を平行光に整えて出射する励起光光源と、
前記試料収容手段に正対して配置され、前記励起光光源から平行光に整えられた前記励起光が入射され、前記励起光を前記凹部の配列に応じて分岐させ、前記凹部にそれぞれ入射させる励起光分岐手段と、
前記励起光分岐手段を介して前記試料収容手段に正対して配置され、前記試料から発生した蛍光を受光して光電変換することにより、各々の前記試料から発生した蛍光の光量を測定する受光手段と、
を備えることを特徴とする蛍光測定装置。
【請求項２】
前記凹部の内面は放物面であり、前記励起光分岐手段から入射される前記励起光を前記放物面の焦点に集光させるとともに、前記焦点にある前記試料から発せられた前記蛍光を平行光に整えて前記凹部から出射させることを特徴とする請求項１記載の蛍光測定装置。
【請求項３】
前記励起光分岐手段は、前記蛍光を透過し、前記励起光の少なくとも一部を反射する半透膜を介して、複数のプリズムを接合して形成されることを特徴とする請求項１または２記載の蛍光測定装置。
【請求項４】
前記励起光分岐手段は、前記励起光光源から入射する前記励起光を前記励起光分岐手段の中で複数に分岐させる第１分岐手段と、前記第１分岐手段から入射する複数の前記励起光を前記凹部の配列に応じてさらに分岐させて前記試料収容手段側に出射する第２分岐手段とからなることを特徴とする請求項１ないし３いずれかに記載の蛍光測定装置。
【請求項５】
前記励起光分岐手段は、複数の前記凹部に各々等しい光量の前記励起光を入射させることを特徴とする請求項１ないし４いずれかに記載の蛍光測定装置。
【請求項６】
前記試料収容手段に前記励起光を照射したときに、前記試料収容手段によって反射されることにより前記受光手段に入射する方向に進む前記励起光をカットする励起光カット手段が、前記励起光分岐手段と前記受光手段との間に設けられたことを特徴とする請求項１ないし５いずれかに記載の蛍光測定装置。
【請求項７】
前記受光手段は、前記凹部に一対一に対応するように配列されたフォトダイオードからなることを特徴とする請求項１ないし６いずれかに記載の蛍光測定装置。
【請求項８】
前記試料収容手段は、前記凹部に収容した複数の前記試料の温度を一様に調節する温度調節手段内に配置され、
前記試料は、二本鎖ＤＮＡと、前記励起光が照射されることによって前記二本鎖ＤＮＡの総数に応じた蛍光を発生させる蛍光発生手段とを含み、
前記温度調節手段によって前記試料の温度を変化させることによって前記二本鎖ＤＮＡの少なくとも一部配列を増幅させることを特徴とする請求項１ないし７いずれかに記載の蛍光測定装置。
【請求項９】
励起光が照射されることにより蛍光を発生する試料が収容される凹部を複数有し、前記凹部の内面が前記励起光及び前記蛍光を反射するとともに、前記励起光が平行光の場合に、入射した前記励起光を前記試料に集光させることを特徴とする試料収容容器。
【請求項１０】
前記凹部の内面は放物面であり、前記励起光分岐手段から照射される前記励起光を前記放物面の焦点に集光させるとともに、前記焦点にある前記試料から発せられた前記蛍光を平行光に整えて前記凹部から出射させることを特徴とする請求項９記載の試料収容容器。
【請求項１１】
前記凹部の内面は、反射膜がコーティングされて反射面が形成されることを特徴とする請求項９または１０記載の試料収容容器。
【請求項１２】
蛍光物質から蛍光を発生させる励起光が入射され、前記励起光の少なくとも一部を反射する半透膜を介して、各々の接合面が平行になるように複数のプリズムを接合して形成され、前記半透膜によって前記励起光を複数平行に分岐させて第２分岐手段に入射させる第１分岐手段と、
前記第１分岐手段から複数の平行な励起光が入射され、前記励起光の少なくとも一部を反射し、かつ、前記蛍光を透過する半透膜を介して、各々の接合面が平行になるように複数のプリズムを接合して形成され、前記半透膜によって前記励起光を複数平行に分岐させて前記蛍光物質に入射させるとともに、前記蛍光物質から発生した前記蛍光を透過させる第２分岐手段と、
を備えることを特徴とする複合光学素子。
【請求項１３】
前記第１分岐手段に設けられた複数の前記半透膜は、前記第２分岐手段に入射させる前記励起光の光量が等しくなるように前記励起光に対する反射率及び透過率が定められ、前記励起光の入射光軸に沿って当該反射率が高くなる順に配置されるとともに、
前記第２分岐手段に設けられた複数の前記半透膜は、出射する前記励起光の光量が等しくなるように前記励起光に対する反射率及び透過率が定められ、前記第１分岐手段から入射する前記励起光の入射光軸に沿って当該反射率が高くなる順に配置されることを特徴とする請求項１２記載の複合光学素子。
【請求項１】
励起光が照射されることにより蛍光を発生する試料が収容される凹部を複数有し、前記凹部の内面が前記励起光及び前記蛍光を反射するとともに、前記励起光が平行光の場合に、入射した前記励起光を前記試料に集光する内面形状に形成された試料収容手段と、
前記励起光を発生させ、前記励起光を平行光に整えて出射する励起光光源と、
前記試料収容手段に正対して配置され、前記励起光光源から平行光に整えられた前記励起光が入射され、前記励起光を前記凹部の配列に応じて分岐させ、前記凹部にそれぞれ入射させる励起光分岐手段と、
前記励起光分岐手段を介して前記試料収容手段に正対して配置され、前記試料から発生した蛍光を受光して光電変換することにより、各々の前記試料から発生した蛍光の光量を測定する受光手段と、
を備えることを特徴とする蛍光測定装置。
【請求項２】
前記凹部の内面は放物面であり、前記励起光分岐手段から入射される前記励起光を前記放物面の焦点に集光させるとともに、前記焦点にある前記試料から発せられた前記蛍光を平行光に整えて前記凹部から出射させることを特徴とする請求項１記載の蛍光測定装置。
【請求項３】
前記励起光分岐手段は、前記蛍光を透過し、前記励起光の少なくとも一部を反射する半透膜を介して、複数のプリズムを接合して形成されることを特徴とする請求項１または２記載の蛍光測定装置。
【請求項４】
前記励起光分岐手段は、前記励起光光源から入射する前記励起光を前記励起光分岐手段の中で複数に分岐させる第１分岐手段と、前記第１分岐手段から入射する複数の前記励起光を前記凹部の配列に応じてさらに分岐させて前記試料収容手段側に出射する第２分岐手段とからなることを特徴とする請求項１ないし３いずれかに記載の蛍光測定装置。
【請求項５】
前記励起光分岐手段は、複数の前記凹部に各々等しい光量の前記励起光を入射させることを特徴とする請求項１ないし４いずれかに記載の蛍光測定装置。
【請求項６】
前記試料収容手段に前記励起光を照射したときに、前記試料収容手段によって反射されることにより前記受光手段に入射する方向に進む前記励起光をカットする励起光カット手段が、前記励起光分岐手段と前記受光手段との間に設けられたことを特徴とする請求項１ないし５いずれかに記載の蛍光測定装置。
【請求項７】
前記受光手段は、前記凹部に一対一に対応するように配列されたフォトダイオードからなることを特徴とする請求項１ないし６いずれかに記載の蛍光測定装置。
【請求項８】
前記試料収容手段は、前記凹部に収容した複数の前記試料の温度を一様に調節する温度調節手段内に配置され、
前記試料は、二本鎖ＤＮＡと、前記励起光が照射されることによって前記二本鎖ＤＮＡの総数に応じた蛍光を発生させる蛍光発生手段とを含み、
前記温度調節手段によって前記試料の温度を変化させることによって前記二本鎖ＤＮＡの少なくとも一部配列を増幅させることを特徴とする請求項１ないし７いずれかに記載の蛍光測定装置。
【請求項９】
励起光が照射されることにより蛍光を発生する試料が収容される凹部を複数有し、前記凹部の内面が前記励起光及び前記蛍光を反射するとともに、前記励起光が平行光の場合に、入射した前記励起光を前記試料に集光させることを特徴とする試料収容容器。
【請求項１０】
前記凹部の内面は放物面であり、前記励起光分岐手段から照射される前記励起光を前記放物面の焦点に集光させるとともに、前記焦点にある前記試料から発せられた前記蛍光を平行光に整えて前記凹部から出射させることを特徴とする請求項９記載の試料収容容器。
【請求項１１】
前記凹部の内面は、反射膜がコーティングされて反射面が形成されることを特徴とする請求項９または１０記載の試料収容容器。
【請求項１２】
蛍光物質から蛍光を発生させる励起光が入射され、前記励起光の少なくとも一部を反射する半透膜を介して、各々の接合面が平行になるように複数のプリズムを接合して形成され、前記半透膜によって前記励起光を複数平行に分岐させて第２分岐手段に入射させる第１分岐手段と、
前記第１分岐手段から複数の平行な励起光が入射され、前記励起光の少なくとも一部を反射し、かつ、前記蛍光を透過する半透膜を介して、各々の接合面が平行になるように複数のプリズムを接合して形成され、前記半透膜によって前記励起光を複数平行に分岐させて前記蛍光物質に入射させるとともに、前記蛍光物質から発生した前記蛍光を透過させる第２分岐手段と、
を備えることを特徴とする複合光学素子。
【請求項１３】
前記第１分岐手段に設けられた複数の前記半透膜は、前記第２分岐手段に入射させる前記励起光の光量が等しくなるように前記励起光に対する反射率及び透過率が定められ、前記励起光の入射光軸に沿って当該反射率が高くなる順に配置されるとともに、
前記第２分岐手段に設けられた複数の前記半透膜は、出射する前記励起光の光量が等しくなるように前記励起光に対する反射率及び透過率が定められ、前記第１分岐手段から入射する前記励起光の入射光軸に沿って当該反射率が高くなる順に配置されることを特徴とする請求項１２記載の複合光学素子。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１１−２５７２６９（Ｐ２０１１−２５７２６９Ａ）
【公開日】平成２３年１２月２２日（２０１１．１２．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１３２０９３（Ｐ２０１０−１３２０９３）
【出願日】平成２２年６月９日（２０１０．６．９）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１２月２２日（２０１１．１２．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月９日（２０１０．６．９）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
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