蛍光観察又は蛍光測光システム、及び蛍光観察又は蛍光測光方法
【課題】高精度、高品質な蛍光観察、蛍光計測、更には微弱蛍光の観察や計測が可能な標本保持部材を用いた蛍光観察システム、蛍光測光システム、蛍光観察方法、及び蛍光測光方法を提供する。
【解決手段】低蛍光な標本保持部材を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムであって、前記低蛍光な標本保持部材が次の条件式を満足する。
BSG'／BSG≦０．６
但し、BSG'は前記低蛍光な標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【解決手段】低蛍光な標本保持部材を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムであって、前記低蛍光な標本保持部材が次の条件式を満足する。
BSG'／BSG≦０．６
但し、BSG'は前記低蛍光な標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光観察又は蛍光測光システム、及び蛍光観察又は蛍光測光方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の顕微鏡分野、蛍光顕微鏡分野、タンパク質・ＤＮＡ解析装置分野などにおける測定機器と装置の発展によって、これらの分野における観察・計測の傾向が変化している。その傾向の変化として次の２つの大きな流れがある。
【０００３】
一つの流れは、固定細胞の観察・計測から生細胞の観察・計測といった観察・計測対象の変化である。ポストゲノムの時代となり、蛍光色素一分子蛍光測定、蛍光色素の多色化による生体機能の同時解析など、微弱な蛍光を広帯域で正確に観察・計測する技術の重要性が増している。最先端のリサーチ分野では、生体の機能解明やタンパク質の挙動解析・相互作用の解析などを目的として、細胞を生かしたまま、長時間（数日から数週間）に亘り観察し続けるというニーズが高まり、そうした観察を実施する手法が種々提案されている。細胞の観察手法としては、蛍光タンパク質を所望の細胞に発現させたり、蛍光色素を導入したりして、その蛍光を観察する手法が主流である。さらに、究極の微弱蛍光観察といえる一分子蛍光観察などがあり、より一層微弱な蛍光の観察・計測が求められている。しかしながら、蛍光観察において蛍光物質を励起する光（励起光）の強度が強すぎると細胞にダメージを与える。このため、細胞を長時間生かし続けるためには、励起光強度をできるだけ弱くする必要がある。一方、蛍光物質に励起光を照射し続けると、その蛍光が次第に褪色していくことも良く知られている。従って、弱い励起光を照射することによって、褪色を抑制しつつ微弱な蛍光をＳ／Ｎ比よく観察できるようにすることは非常に有用である。
【０００４】
しかし、励起光を弱めると、それにつれて蛍光強度も弱くなるから、Ｓ／Ｎ比の高い蛍光画像を得ることが困難となる。即ち、蛍光が微弱であればあるほど、ノイズの影響が大きくなって、Ｓ／Ｎ比が下がる。ここで、ノイズとは主に光学系や試料からの自家蛍光などを含むものとする。
【０００５】
もう一つの流れは、従来の顕微鏡装置のように観察機能のみの装置から、蛍光強度、波長、被検出物の局在などを計測して定量化する機能を備えた装置への変化である。この場合、ノイズも含めた正確な定量性が要求される。
【０００６】
ところで、従来の蛍光観察装置及び蛍光計測装置として、例えば、次の特許文献１，２に記載のものが提案されている。
【特許文献１】特開平０８−３２０４３７号公報
【特許文献２】特開平０８−１７８８４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、特許文献１や特許文献２に開示されているような、従来の蛍光観察装置や蛍光計測装置は、蛍光観察における像の見えのよさや、蛍光測定における定量性に関して、装置に用いられている光学素子に含まれる不純物（特に、白金コロイド）から発した自家蛍光や、標本保持部材から発した自家蛍光や、低屈折率オイルから発した自家蛍光によるノイズの影響を受け易いものであった。
【０００８】
また、従来の蛍光顕微鏡を用いた蛍光検出システムにおいて、検出器で検出される信号は、所望の深度からの蛍光のみならず、蛍光顕微鏡観察に使用する対物レンズやイマージョン物質など光学系や試料から発した自家蛍光も含まれ、これらすべてがノイズ源となり、結果的にＳ／Ｎ比を大きく低下させる原因となっていた。
【０００９】
高倍率・高ＮＡの油浸対物レンズを用いて蛍光観察する場合、イマージョン物質として、対物レンズと試料との間に、水よりも自家蛍光の大きなイマージョン物質を充填する必要がある。一分子蛍光観察など微弱な蛍光を検出する際には、これらのノイズの寄与が大きくなるため、Ｓ／Ｎ比の劣化が顕著となっていた。
【００１０】
また、本発明者は、これらの自家蛍光によるノイズの問題に対処すべく、特願２００６−１７５４９５号、特願２００６−１７５４９６号に記載の蛍光観察又は蛍光計測システム、蛍光観察又は蛍光測光方法を発明した。
しかし、これらの発明は、それぞれカバーガラス、イマージョン物質の自家蛍光に着目したものであり、自家蛍光発生源として標本保持部材（例えば、スライドガラス）を考慮していないものであった。
微弱な蛍光をより高Ｓ／Ｎ比で観察・計測できるようにするためには、標本保持部材の自家蛍光も低減することが望まれる。
【００１１】
本発明は、上記従来の課題に鑑みてなされたものであり、自家蛍光によるノイズの影響を低減でき、高精度、高品質な蛍光観察、蛍光計測が可能で、更には微弱蛍光の観察や計測が可能な蛍光観察システム、蛍光測光システム、蛍光観察方法、及び蛍光測光方法を提供することを目的とする。
【００１２】
より詳しくは、本発明は、高精度、高品質な蛍光観察、蛍光計測、更には微弱蛍光の観察や計測が可能な標本保持部材を用いた蛍光観察システム、蛍光測光システム、蛍光観察方法、及び蛍光測光方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的を達成するため、本発明による蛍光観察又は蛍光測光システムは、低蛍光な標本保持部材を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムであって、前記低蛍光な標本保持部材が次の条件式(1-1)を満足することを特徴としている。
BSG'／BSG≦０．６ …(1-1)
但し、BSG'は前記低蛍光な標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【００１４】
また、本発明による蛍光観察又は蛍光測光方法は、次の工程（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）からなることを特徴としている。
（Ａ）生細胞を用いた蛍光を発する試料を選択する工程。
（Ｂ）前記工程（Ａ）で選択した試料を観察又は測光するためのアプリケーション、及び次の条件式(1-1)を満足する低蛍光な標本保持部材を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムを選択する工程。
（Ｃ）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーション及びシステムを用いて、前記工程（Ａ）で選択した試料を蛍光観察又は蛍光測光する工程。
BSG'／BSG≦０．６ …(1-1)
但し、BSG'は前記低蛍光な標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【００１５】
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程（Ａ）で選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-1)，(3-1)の少なくとも一方を満足することが好ましい。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦５ …(2-1)
４BSG／Ｂ≧０．２ …(3-1)
但し、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【００１６】
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）であることが好ましい。
【００１７】
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがカルシウムイオンイメージングであることが好ましい。
【００１８】
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションが動画観察又はタイムラプス観察であることが好ましい。
【００１９】
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることが好ましい。
【００２０】
また、本発明による全反射照明蛍光観察又は蛍光計測システムは、コンデンサレンズを用いてレーザ光を低蛍光な標本保持部材の底面で全反射するように照明し、この全反射照明によって標本保持部材に保持された標本から発する蛍光を、前記コンデンサレンズと対峙して設けられた対物レンズで検出する全反射照明蛍光観察又は蛍光測光システムであって、前記低蛍光な標本保持部材が次の条件式(1-1')を満足することを特徴としている。
BSG’／BSG≦０．８９ …(1-1')
但し、BSG’は前記低蛍光な標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【００２１】
また、本発明の蛍光観察又は蛍光計測システムにおいては、前記低蛍光な標本保持部材がガラスシャーレまたはガラスボトムディッシュであることが好ましい。
【００２２】
また、本発明の蛍光観察又は蛍光計測システムにおいては、前記低蛍光な標本保持部材がスライドガラスであることが好ましい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、自家蛍光によるノイズの影響を低減でき、高精度、高品質な蛍光観察、蛍光計測が可能で、更には微弱蛍光の観察や計測が可能な蛍光観察システム、蛍光測光システム、蛍光観察方法、及び蛍光測光方法が得られる。
より詳しくは、本発明によれば、高精度、高品質な蛍光観察、蛍光計測、更には微弱蛍光の観察や計測が可能な標本保持部材を用いた蛍光観察システム、蛍光測光システム、蛍光観察方法、及び蛍光測光方法が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
実施例の説明に先立ち、本発明を想到するに至った経緯を説明する。
（試料の明るさに着目した蛍光画像Ｓ／Ｎ比のランク分け）
まず、本発明者は、高精度、高品質な蛍光観察、蛍光測光、更には微弱蛍光観察や微弱蛍光測光などのアプリケーション（検鏡法）が可能な蛍光観察装置及び蛍光測光装置に要求されるノイズレベルに関して、観察・測光に用いられる試料ごとに後述する如くランク分けすることを試みた。
ここで、ランク分けに用いる式を定義する。被観察物（又は被測光物）の蛍光強度の平均値をＳ、背景（観察領域において被観察物、又は被測光物が存在しない部分）の自家蛍光の強度の平均値をＢ、それらの強度の揺らぎをそれぞれｓ，ｂとしたとき、アプリケーションのＳ／Ｎ比を次式(2-0)により定義した。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ） …(2-0)
【００２５】
(1)一分子蛍光観察
まず、最も自家蛍光の影響を受けやすい試料として、いわゆる一分子蛍光観察のＳ／Ｎ比について考察した。一分子蛍光観察では、観察光学系または測光光学系の自家蛍光が主たるノイズ成分である。一分子蛍光観察では、Ｓ／Ｎ比は次の条件式(2-3)を満たす。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦２ …(2-3)
【００２６】
(2)暗い試料の蛍光観察
次に、生細胞を用いた蛍光観察（又は測光）について考察した。生細胞観察では、細胞の活性を長時間に亘って維持する必要がある。一般に、細胞へのダメージを軽減するため、蛍光物質の量を少なくすることや、励起光の生細胞への照射強度を弱めることが行われる。したがって、蛍光の強度も小さくなり易い傾向にある。暗い試料の蛍光観察ではＳ／Ｎ比は次の条件式(2-2)を満たす。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦３ …(2-2)
【００２７】
(3)通常の明るさの試料の蛍光観察
最後に、一般的な固定細胞を用いた蛍光観察（又は測光）、あるいは、生細胞を用いた蛍光観察のうち、蛍光強度が強い場合について考察した。固定細胞の場合、細胞の活性を維持する必要がないため、蛍光物質の濃度を高くしたり、励起光強度を強めたりすることができる。従って、蛍光強度を高めることができる。また、生細胞を用いる場合でも、活性を維持する期間が短くてもよい場合や、細胞への影響が少ない部位に蛍光タンパクを発現させる場合などもこれに該当する。この場合、Ｓ／Ｎ比は次の条件式(2-1)を満たす。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦５ …(2-1)
【００２８】
以上のように、本発明者は、蛍光観察（又は測光）に用いられている試料の明るさについて、アプリケーションのＳ／Ｎ比に応じて３つに分類した。
【００２９】
（アプリケーションの種類）
次に、本発明者は、これらの試料を蛍光観察（又は測光）するためのアプリケーションの種類について考察した。
【００３０】
(1)ＦＲＥＴ観察
蛍光試料を観察又は測光する手法として、良く利用される手法の一つにＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）がある。
ＦＲＥＴはドナー物質とアクセプタ物質の２つの蛍光物質を用い、ドナー物質の蛍光波長とアクセプタ物質の励起波長とが略一致するようにしている。そのため、ＦＲＥＴにおける励起光の波長は、アクセプタ物質を単独で用いる場合の励起光の波長よりも、短波長側に離れている。一方、観察または測光光学系の自家蛍光は、励起光の波長が短くなるほど強くなる傾向を有する。従って、ＦＲＥＴでは、同じ蛍光波長を観察または測光する場合であっても、観察または測光光学系からの自家蛍光が大きくなるという問題がある。
【００３１】
(2)カルシウムイオンイメージング
また、細胞内、あるいは、細胞間の信号の伝達に大きな役割を果たしている物質にカルシウムイオンがある。このカルシウムイオンの濃度勾配や濃度の変化を観察、測光することは細胞の機能解明において極めて重要である。カルシウムイオンの濃度を検出する場合によく用いられる試薬として、Fura-2、Indo-1がある。これらの試薬には励起光として波長300〜400nmのＵＶ光が利用される。そのため、観察または測光光学系からの自家蛍光が大きくなるという問題があった。近年、ＵＶ光を用いないCameleonという蛍光試薬が提供されているが、Cameleonは上述のＦＲＥＴを応用した試薬であるため、ＦＲＥＴと同様の問題が起こる。
【００３２】
(3)動画、タイムラプス観察
細胞膜上の一分子を観察する場合や、前記ＦＲＥＴ、カルシウムイオンイメージングにおいては、その強度の比だけでなく、強度比の時間変化を調べることが重要である。変化のスピードが速い場合には、ビデオレートあるいはそれ以上の高速度カメラによる動画観察が行われる。動画観察の場合、変化の速い現象を検出するため、１コマ当たりのカメラの露光時間が必然的に短くなり、蛍光の輝度レベルが低くなる。従って、動画観察では、一般的な蛍光観察または測光に比べて蛍光が弱いため、Ｓ／Ｎ比の良い画像データを得ることが難しい。
一方、変化のスピードが遅い場合には、数時間から数日にわたり間欠的に観察を続けるタイムラプス観察が行われる。タイムラプス観察においては、細胞の活性を長時間にわたって維持する必要があるため、試料細胞へ照射する励起光の強度を可能な限り小さくすることが要求される。このため、タイムラプス観察では、一般的な蛍光観察または測光に比べて、蛍光が弱いため、Ｓ／Ｎ比の良い画像データを得ることが難しい。
【００３３】
以上述べたように、蛍光試料を観察する種々のアプリケーションにおいても、アプリケーションに応じたＳ／Ｎ比劣化要因が存在する。
実際には、上記条件式(2-1)〜(2-3)の少なくともいずれかの明るさの条件に当てはまる試料と、上記(1)〜(3)の各アプリケーションとの組み合わせによって蛍光観察または蛍光測光が行われており、Ｓ／Ｎ比も上記条件式(2-1)〜(2-3)と前記アプリケーション(1)〜(3)との組み合わせに応じて決まる。
【００３４】
（自家蛍光の割合の調査）
次に、本発明者は、従来の一般的な対物レンズ、イマージョン物質、標本保持部材を用いた顕微鏡や測光装置などの光学システムにおける各々の自家蛍光の割合を調べた。
なお、本発明における標本保持部材とは、蛍光観察標本を顕微鏡ステージ上に保持するための光学部材であって、かつ、結像性能には影響しないが、そこで発生する自家蛍光が蛍光観察画像に影響を与える部材を指す。具体的には、スライドガラスや、後述する実施例２に示すようにガラスシャーレやガラスボトムディッシュなどが含まれ、スライドガラスのみに限定されるものではない。
【００３５】
蛍光顕微鏡システムにおけるノイズは、試料からの自家蛍光と、光学系からの自家蛍光とに大別できる。本発明者は、正立顕微鏡BX51（OLYMPUS(株)製）を用いて測定した場合において、ノイズ成分のうち、試料からの自家蛍光と、光学系からの自家蛍光との割合を調査した。
【００３６】
光源から発した光はフィルタ（例えばU-MWIB3（OLYMPUS(株)製）のフィルタユニット）により、観察目的に応じた適切な波長が選択され、照明光学系を通り、励起光として試料に照射される。その際、照明光学系中に配置された対物レンズ、イマージョン物質、標本保持部材や、試料と一緒に封入されている物質が励起され、ノイズとなる自家蛍光を発する。本発明者は、この自家蛍光の量を、観察光学系に取り付けられたフォトマルチプライヤ（浜松ホトニクス(株)製）や冷却ＣＣＤであるCoolSNAP HQ（Photometrics社製）などの検出器を用いて測定した。
【００３７】
まず、通常の落射蛍光観察方法で試料の背景からの自家蛍光を測定し、次に試料を除いた状態で同測定を行う。これらの値の差が試料からの自家蛍光であり、残りが光学系からの自家蛍光として算出される。
算出されたノイズのうち、試料からの自家蛍光は、例えば、後述する如く試料の洗浄法や、試料作製条件によって大きく変動することが判明した。その結果、本発明者は、試料の作製条件により、試料からの自家蛍光のノイズのノイズ全体に及ぼす影響の度合の傾向が大きく３つに分類できることを見出した。これをノイズ全体に対する光学系からの自家蛍光のノイズの割合で示すと、次のように表すことができる。
普通の（洗浄しない）試料：
（光学系からの自家蛍光のノイズ）／Ｂ≧０．２ …(3'-1)
洗浄した試料：
（光学系からの自家蛍光のノイズ）／Ｂ≧０．４ …(3'-2)
極めて綺麗に洗浄した試料：
（光学系からの自家蛍光のノイズ）／Ｂ≧０．６ …(3'-3)
但し、上記条件式(3'-1)〜(3'-3)において、Ｂは背景（観察領域において被観察物、又は被測光物が存在しない部分）の自家蛍光の強度の平均値である。
上記条件式(3'-1)〜(3'-3)において、下限値が大きいほど光学系からの自家蛍光のノイズの占める割合が大きくなり、光学系からの自家蛍光を改善すれば、その効果がより顕著に現れる。
【００３８】
Ｓ／Ｎ比向上のためには光学系からの自家蛍光のノイズの内訳を知る必要がある。そこで、本発明者は、対物レンズとイマージョン物質と標本保持部材のそれぞれのノイズ（自家蛍光）値の割合を調査した。測定方法は、上述した試料からの自家蛍光と光学系からの自家蛍光の割合を調査したときと同様の方法を用いた。
【００３９】
まず、照明光学系に対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラス、標本保持部材を適切に配置した状態（実使用状態）で検出される自家蛍光量を測定する。その後、カバーガラスを光学系から除いて測定、次にイマージョンオイルを光学系から除いて測定、さらに標本保持部材を光学系から除いた状態での自家蛍光を測定し、それぞれの値の差分を取ることによって、対物レンズ、イマージョンオイル、カバーガラス、標本保持部材のそれぞれからの自家蛍光値を求めた。
UPLSAPO60XO（OLYMPUS(株)製），イマージョンオイル（OLYMPUS(株)製），カバーガラス（松浪ガラス工業(株)製），標本保持部材の一例として一般的に用いられるスライドガラス（松浪ガラス工業(株)製）のそれぞれからの自家蛍光値について測定したところ、対物レンズとイマージョンオイルとカバーガラスとスライドガラスの自家蛍光値は同程度であった。
また、さらに対物レンズを光学系から除いた状態での自家蛍光を測定し、対物レンズが光学系に配置されている状態での自家蛍光の測定値との差分を取ることによって、その他の光学部材の自家蛍光値を求めたところ、照明光学系に対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラス、標本保持部材を適切に配置した状態（実使用状態）で検出される自家蛍光量の１割程度であった。
従って、光学システムの観察光学系（又は測光光学系）全体のノイズに占める各々の自家蛍光は、対物レンズが約２０〜２５％、イマージョン物質が約２０〜２５％、カバーガラスが約２０〜２５％、標本保持部材が２０〜２５％、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラス、標本保持部材の合計では約９割、その他が約１割弱であると見積もれる。
【００４０】
従って、微弱蛍光観察（又は測光）において、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラス、標本保持部材からの自家蛍光は、Ｓ／Ｎ比の低下につながり、システム全体の検出性能を高めることができる。
【００４１】
しかるに、本発明者は、Ｓ／Ｎ比を５％向上するためには、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラス、標本保持部材の４つの自家蛍光成分のうち少なくとも一つを４０％低減、又はこれら４つの自家蛍光を全体で１０％低減させる必要があることを見出した。
【００４２】
なお、コンデンサレンズを用いてレーザ光を低蛍光な標本保持部材の底面で全反射するように照明し、この全反射照明によって標本保持部材に保持された標本から発する蛍光を、そのコンデンサレンズと対峙して設けられた対物レンズで検出する全反射照明蛍光観察又は蛍光測光システムにおいては、照明光が対物レンズやカバーガラスを通らないで標本保持部材に入射する。また、標本保持部材と標本との界面で全反射するときに標本へ向けて僅かに染み出したエバネッセント波によって標本を励起する。このため、このようなコンデンサレンズを用いた全反射顕微鏡観察では、標本の極く近傍で発光された蛍光を拾うのみであって、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラスの全体のノイズに占める各々の自家蛍光は、略ゼロに近くなり、像の見え等に影響する光学系からのノイズの殆どは標本保持部材の自家蛍光成分が占めることになる。
従って、この場合には、標本保持部材の自家蛍光を１０％低減させれば、Ｓ／Ｎ比を５％向上するために必要な「対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラス、標本保持部材の４つの自家蛍光を全体で１０％低減させること」ができる。
【００４３】
これらのことから、本発明者は、試料、アプリケーション、またその組み合わせにおけるＳ／Ｎ比と、Ｓ／Ｎ比を向上するために必要な条件を精査し、本発明を完成するに至った。
【００４４】
即ち、本発明の蛍光観察又は蛍光測光システムは、低蛍光な標本保持部材を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムであって、前記低蛍光な標本保持部材が次の条件式(1-1)を満足する。
BSG’／BSG≦０．６ …(1-1)
但し、BSG’は前記低蛍光な標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
上記条件式(1-1)の上限値は、上述した「Ｓ／Ｎ比を５％向上するためには、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラス、標本保持部材の４つの自家蛍光成分のうち少なくとも一つを４０％低減させる必要がある」ということより導出したものである。
【００４５】
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光システムにおいては、次の条件式(1-2)を満足するのがより好ましい。
BSG’／BSG≦０．４５ …(1-2)
但し、BSG’は前記低蛍光な標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
さらには、本発明の蛍光観察又は蛍光測光システムにおいては、次の条件式(1-3)を満足するのがより一層好ましい。
BSG’／BSG≦０．３ …(1-3)
但し、BSG’は前記低蛍光な標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【００４６】
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法は、次の工程（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）からなる。
（Ａ）生細胞を用いた蛍光を発する試料を選択する工程。
（Ｂ）前記工程（Ａ）で選択した試料を観察又は測光するためのアプリケーション、及び次の条件式(1-1)を満足する低蛍光な標本保持部材を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムを選択する工程。
（Ｃ）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーション及びシステムを用いて、前記工程（Ａ）で選択した試料を蛍光観察又は蛍光測光する工程。
BSG’／BSG≦０．６ …(1-1)
但し、BSG’は前記低蛍光な標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
上記条件式(1-1)の上限値は、上述した「Ｓ／Ｎ比を５％向上するためには、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラス、標本保持部材の４つの自家蛍光成分のうち少なくとも一つを４０％低減させる必要がある」ということより導出したものである。
【００４７】
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程（Ｂ）で用いる前記低蛍光な標本保持部材が次の条件式(1-2)を満足するのがより好ましい。
BSG’／BSG≦０．４５ …(1-2)
但し、BSG’は前記低蛍光な標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
さらには、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程（Ｂ）で用いる前記低蛍光な標本保持部材が次の条件式(1-3)を満足するのがより一層好ましい。
BSG’／BSG≦０．３ …(1-3)
但し、BSG’は前記低蛍光な標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【００４８】
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程（Ａ）で選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-1),(3-1)の少なくとも一方を満足するのが好ましい。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦５ …(2-1)
４BSG／Ｂ≧０．２ …(3-1)
但し、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
上記条件式(2-1)の上限値は、上述した試料の明るさのランク分けにおける「通常の明るさの試料」を蛍光観察・蛍光測光する場合に求められるアプリケーションのＳ／Ｎ比に対応させたものである。
上記上限式(3-1)の下限値は、上述したノイズ全体に対する光学系からの自家蛍光のノイズの割合における「普通の（洗浄しない）試料」についての条件式(3'-1)に対応させたものである。また、上記条件式(3-1)の左辺は、上述した「光学システムの観察光学系（又は測光光学系）全体のノイズに占める各々の自家蛍光は、対物レンズが約２０〜２５％、イマージョン物質が約２０〜２５％、カバーガラスが約２０〜２５％、標本保持部材が２０〜２５％、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラス、標本保持部材の合計では約９割」を占め、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラス、標本保持部材のそれぞれの光学系全体に占めるノイズの割合が同じであること、及び条件式(3'-1)より、光学系からの自家蛍光のノイズのうちの対物レンズ、イマージョン物質及びカバーガラスの自家蛍光のノイズの割合を標本保持部材の自家蛍光のノイズの割合に置き換えることによって導出したものである。
【００４９】
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程（Ａ）で選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-2),(3-2)の少なくとも一方を満足するのが好ましい。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦３ …(2-2)
４BSG／Ｂ≧０．４ …(3-2)
但し、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
上記条件式(2-2)の上限値は、上述した試料の明るさのランク分けにおける「暗い試料」を蛍光観察・蛍光測光する場合に求められるアプリケーションのＳ／Ｎ比に対応させたものである。
上記上限式(3-2)の下限値は、上述したノイズ全体に対する光学系からの自家蛍光のノイズの割合における「洗浄した試料」についての条件式(3'-2)に対応させたものである。また、上記条件式(3-2)の左辺は、上述した「光学システムの観察光学系（又は測光光学系）全体のノイズに占める各々の自家蛍光は、対物レンズが約２０〜２５％、イマージョン物質が約２０〜２５％、カバーガラスが約２０〜２５％、標本保持部材が２０〜２５％、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラス、標本保持部材の合計では約９割」を占め、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラス、標本保持部材のそれぞれの光学系全体に占めるノイズの割合が同じであること、及び条件式(3'-2)より、光学系からの自家蛍光のノイズのうちの対物レンズ、イマージョン物質及びカバーガラスの自家蛍光のノイズの割合を標本保持部材の自家蛍光のノイズの割合に置き換えることによって導出したものである。
【００５０】
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程（Ａ）で選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-3),(3-3)の少なくとも一方を満足するのが好ましい。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦２ …(2-3)
４BSG／Ｂ≧０．６ …(3-3)
但し、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
上記条件式(2-3)の上限値は、上述した試料の明るさのランク分けにおける「一分子」を蛍光観察・蛍光測光する場合に求められるアプリケーションのＳ／Ｎ比に対応させたものである。
上記上限式(3-3)の下限値は、上述したノイズ全体に対する光学系からの自家蛍光のノイズの割合における「極めて綺麗に洗浄した試料」についての条件式(3'-3)に対応させたものである。また、上記条件式(3-3)の左辺は、上述した「光学システムの観察光学系（又は測光光学系）全体のノイズに占める各々の自家蛍光は、対物レンズが約２０〜２５％、イマージョン物質が約２０〜２５％、カバーガラスが約２０〜２５％、標本保持部材が２０〜２５％、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラス、標本保持部材の合計では約９割」を占め、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラス、標本保持部材のそれぞれの光学系全体に占めるノイズの割合が同じであること、及び条件式(3'-3)より、光学系からの自家蛍光のノイズのうちの対物レンズ、イマージョン物質及びカバーガラスの自家蛍光のノイズの割合を標本保持部材の自家蛍光のノイズの割合に置き換えることによって導出したものである。
【００５１】
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）であるのが好ましい。
【００５２】
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがカルシウムイオンイメージングであるのが好ましい。
【００５３】
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションが動画観察又はタイムラプス観察であるのが好ましい。
【００５４】
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであるのが好ましい。
【００５５】
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程（Ｂ）で選択したシステムが落射蛍光システムまたは透過蛍光システムのいずれかであるのが好ましい。
【００５６】
また、本発明による全反射照明蛍光観察又は蛍光計測システムは、コンデンサレンズを用いてレーザ光を低蛍光な標本保持部材の底面で全反射するように照明し、この全反射照明によって標本保持部材に保持された標本から発する蛍光を、前記コンデンサレンズと対峙して設けられた対物レンズで検出する全反射照明蛍光観察又は蛍光測光システムであって、前記低蛍光な標本保持部材が次の条件式(1-1')を満足する。
BSG’／BSG≦０．８９ …(1-1')
但し、BSG’は前記低蛍光な標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
上述したように、コンデンサレンズを用いてレーザ光を低蛍光な標本保持部材の底面で全反射するように照明し、この全反射照明によって標本保持部材に保持された標本から発する蛍光を、そのコンデンサレンズと対峙して設けられた対物レンズで検出する全反射照明蛍光観察又は蛍光測光システムにおいては、照明光が対物レンズ、カバーガラスを通らないで標本保持部材に入射する。また、標本保持部材と標本との界面で全反射するときに標本へ向けて僅かに染み出したエバネッセント波によって標本を励起する。このため、このようなコンデンサレンズを用いた全反射顕微鏡観察では、標本の極く近傍で発光された蛍光を拾うのみであって、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラスの全体のノイズに占める各々の自家蛍光は、略ゼロに近くなり、像の見え等に影響する光学系からのノイズの殆どは標本保持部材の自家蛍光成分が占めることになる。
しかるに、上記条件式(1-1')の上限値は、「Ｓ／Ｎ比を５％向上するためには、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラス、標本保持部材の４つの自家蛍光を全体で１０％低減させる必要がある」、「この場合には、標本保持部材の自家蛍光を１０％低減させれば、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラス、標本保持部材の４つの自家蛍光を全体で１０％低減させることができる」ということより導出したものである。
【００５７】
次に、本発明の蛍光観察システム、蛍光測光システム、蛍光観察方法、蛍光測光方法の実施形態について、図面を参照して詳述する。
実施例１及び比較例１
図１は本発明の実施例１及び比較例１にかかる蛍光観察又は蛍光測光システムに適用可能な倒立蛍光顕微鏡装置の一例として白色アーク光源を用いた落射蛍光顕微鏡装置の概略構成を示す側面図、図２は図１の落射蛍光顕微鏡装置における要部の光学構成を簡略化して示す説明図である。図３は本発明の実施例１及び比較例１にかかる蛍光観察又は蛍光測光システムに適用可能な倒立蛍光顕微鏡装置の他の例として白色アーク光源を用いた透過蛍光顕微鏡装置の概略構成を示す側面図、図４は図３の透過蛍光顕微鏡装置における要部の光学構成を簡略化して示す説明図である。
【００５８】
図１に示す蛍光顕微鏡装置は、白色アーク光源１と、白色アーク光源１から発した光を試料（標本）８に照射する照射光学系２としての、落射投光管３から対物レンズ７に至る光学部材を備えた顕微鏡として構成されている。図１中、５はダイクロイックミラー、４は吸収フィルタ、６はバリアフィルタ、９はミラー、１０は顕微鏡本体、１１は観察鏡筒である。
照射光学系２は、図２に示すように、試料８側に配置された対物レンズ７と、落射投光管（図示省略）に配置された集光レンズ１２を有する。図２中、１３はイマージョン物質、１４はカバーガラス、１５は光軸、１６は標本保持部材としてのスライドガラスである。図２では、便宜上、吸収フィルタ４、ダイクロイックミラー５を省略し、白色アーク光源１から対物レンズ７までを直線的に示してある。
集光レンズ１２は、対物レンズ７の後側焦点位置あるいはその近傍に白色アーク光源１から射出された光を集光させるように構成されている。
試料８は、スライドガラス１６とカバーガラス１４に挟まれている。対物レンズ７とカバーガラス１４との間は、イマージョン物質１３で満たされている。
なお、試料８で発した蛍光は、対物レンズ７、ダイクロイックミラー５、バリアフィルタ６、ミラー９、観察鏡筒１１を経て観察される。また、図１の顕微鏡は、観察位置と共役な所定位置に検出器（図示省略）を取り付け、検出器を介して蛍光の強度を検出できるようになっている。
【００５９】
図３に示す蛍光顕微鏡装置は、白色アーク光源１’と、白色アーク光源１’から発した光を試料（標本）８に照射する照射光学系２’としての、コンデンサレンズ１７を有する光学部材を備えた顕微鏡として構成されている。図３中、５’はミラー、４は吸収フィルタ、６はバリアフィルタ、７は対物レンズ、９はミラー、１０は顕微鏡本体、１１は観察鏡筒である。
照射光学系２’は、図４に示すように、試料８を隔てて対物レンズ７と反対側に配置されたコンデンサレンズ１７を有する。図４中、１３はイマージョン物質、１４はカバーガラス、１５’は光軸、１６は標本保持部材としてのスライドガラスである。図４では、便宜上、吸収フィルタ４、ミラー５’を省略し、白色アーク光源１から対物レンズ７までを直線的に示してある。
試料８は、スライドガラス１６とカバーガラス１４に挟まれている。対物レンズ７とカバーガラス１４との間は、イマージョン物質１３で満たされている。
なお、試料８で発した蛍光は、対物レンズ７、バリアフィルタ６、ミラー９、観察鏡筒１１を経て観察される。また、図３の顕微鏡は、観察位置と共役な所定位置に検出器（図示省略）を取り付け、検出器を介して蛍光の強度を検出できるようになっている。
【００６０】
次に、本発明の実施例１及び比較例１の蛍光顕微鏡装置について説明する。本発明の実施例１及び比較例１の蛍光顕微鏡装置の基本的な光学構成は、図１及び図２、並びに図３及び図４に示した蛍光顕微鏡装置と同じである。以下は、実施例と比較例とで異なる構成部分のみを説明し、同一の構成部分についての重複する説明は省略する。
【００６１】
（標本保持部材の自家蛍光量の測定）
図１に示した蛍光顕微鏡装置と基本的な光学構成が同じ顕微鏡装置を用いて後述する実施例１及び比較例１のそれぞれの標本保持部材の自家蛍光量の測定を行った。対物レンズ７には、OLYMPUS(株)製UPLFLN40Xを用いた。また、図示省略した検出器として浜松ホトニクス(株)製ホトマル（R6355）を用いた。
標本保持部材単体をステージの上に置き、対物レンズを標本保持部材に当てつけた。その状態で、波長４８８ｎｍの励起光を照射し、検出器に検出される数値（ここでは、数値Ａとする）をカウントした。次いで、標本保持部材をステージから外し、対物レンズとステージとの間を１ｍｍ程度離した状態で波長４８８ｎｍの励起光を照射し、検出器に検出される数値（ここでは、数値Ｂとする）をカウントした。数値Ａから数値Ｂを差し引くことによって標本保持部材の自家蛍光量を得た。
【００６２】
（比較例１）
図１及び図２、並びに図３及び図４に示した蛍光顕微鏡装置と基本的な光学構成が同じ顕微鏡装置を用いて蛍光観察を行い、そのときの自家蛍光の強度を測定した。
標本保持部材としてのスライドガラス１６には、松浪ガラス工業(株)製の蛍光顕微鏡用スライドグラスNEO白縁磨No1を用いた。対物レンズ７には、OLYMPUS(株)製UPLSAPO60XO、カバーガラス１４には、松浪ガラス工業(株)製 MICRO COVER GLASS No.1-S、イマージョン物質１３には、OLYMPUS(株)製イマージョンオイル（ｎｄ＝1.52）を用いた。また、倒立顕微鏡の本体１０には、OLYMPUS(株)製IX71を用いた。そして、図示省略した検出器として浜松ホトニクス(株)製EM-CCDを用いて、図１及び図２に示すような通常の落射蛍光方式による蛍光観察、ならびに図３及び図４に示すような透過蛍光観察を行い、自家蛍光の強度を測定した。
このときの蛍光観察試料は上述の条件式(2-1)（即ち、（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦５）、および条件式(3-1)（即ち、４BSG／Ｂ≧０．２）を満たすものであった。
比較例１の蛍光顕微鏡装置では、自家蛍光による背景ノイズが強く、蛍光観察を満足に行うことができなかった。
【００６３】
（実施例１）
比較例１の蛍光顕微鏡装置と基本的な光学構成が同じ顕微鏡装置を用いて蛍光観察を行い、そのときの自家蛍光の強度を測定した。
実施例１の蛍光顕微鏡装置は、比較例１の蛍光顕微鏡装置で使用した光学部材のうち、標本保持部材１６（スライドガラス）のみを低蛍光な標本保持部材１６に変更し、その他は比較例１と同じ構成である。
実施例１の低蛍光な標本保持部材１６には、日本板硝子(株)製スーパークリアを松浪ガラス工業(株)製の蛍光顕微鏡用スライドグラスNEO白縁磨No1と同じ大きさ（２６ｍｍ×７６ｍｍ，厚さ１ｍｍ）に切断し、表面を研磨したものを用いた。
なお、比較例１と実施例１で用いた標本保持部材の自家蛍光量をそれぞれ測定したところ、比較例１のものを１としたとき、実施例１のものでは０．２５であった。すなわち、実施例１の標本保持部材１６の自家蛍光の強度は、比較例１の標本保持部材１６の自家蛍光の強度に対する比率が、条件式(1-1)（即ち、B'SG／BSG≦０．６）を満たすものであった。
実施例１の低蛍光標本保持部材（スライドガラス）を用いて、比較例１の蛍光顕微鏡装置による通常の落射蛍光方式による蛍光観察と同じ試料を同じ条件で観察したところ、自家蛍光による背景ノイズが低減され、蛍光像のＳ／Ｎ比が向上しており、満足に蛍光観察を行うことができた。
【００６４】
比較例１と実施例１との比較により、本発明の標本保持部材（スライドガラス）を用いると、蛍光観察像のＳ／Ｎ比が改善され、高品質な観察が可能であることが確認できた。
なお、本発明は実施例１の蛍光顕微鏡装置における標本保持部材の自家蛍光の強度の比率のものに限定されるものではない。例えば、実施例１において、好ましくはBSG'／BSG≦０．４５、さらに好ましくはBSG'／BSG≦３を満たす標本保持部材を用いれば、Ｓ／Ｎ比がより一層改善される。
【００６５】
また、実施例１の標本保持部材を用いた蛍光観察において、蛍光観察試料として、条件式(2-1)（即ち、（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦５）と条件式(3-1)（即ち、４BSG／Ｂ≧０．２）の組み合わせに代えて、次の条件式の組み合わせにおいてもそれぞれ蛍光観察像のＳ／Ｎ比が改善され、高品質な観察結果が得られた。
条件式(2-2)（即ち、（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦３）と条件式(3-2)（即ち、４BSG／Ｂ≧０．４）の組み合わせ。
条件式(2-3)（即ち、（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦２）、および条件式(3-3)（即ち、４BSG／Ｂ≧０．６）の組み合わせ。
【００６６】
また、実施例１では、倒立顕微鏡を用いて説明したが、本発明は倒立顕微鏡に限定適用されるものではなく、正立顕微鏡においても同様の効果を発揮する。
本発明を適用する顕微鏡としては、倒立顕微鏡と正立顕微鏡とを試料を挟んで配置した上下顕微鏡として構成してもよい。上下顕微鏡の場合には、正立顕微鏡側、倒立顕微鏡側のいずれか一方に本発明の実施例に示した標本保持部材が用いられていれば、本発明の効果が発揮される。上下顕微鏡において、正立顕微鏡側、および倒立顕微鏡側は、それぞれ独立に駆動する構成、あるいは連動して駆動する構成のいずれでもよい。さらに、正立顕微鏡側で通常蛍光観察、倒立顕微鏡側で全反射蛍光観察という具合に、上下の顕微鏡で互に異なる観察方法を用いてもよい。
【００６７】
実施例２及び比較例２
次に、本発明の実施例２及び比較例２として、コンデンサレンズ方式全反射蛍光観察（ＴＩＲＦ観察）システムについて説明する。
図５は本発明の実施例２及び比較例２にかかる蛍光観察又は蛍光測光システムに適用可能な正立蛍光顕微鏡装置の一例としてレーザ光源を用いたコンデンサレンズ方式全反射蛍光顕微鏡装置の概略構成を示す側面図、図６は図５のコンデンサレンズ方式全反射蛍光顕微鏡装置における要部の光学構成を簡略化して示す説明図である。
【００６８】
図５に示すコンデンサレンズ方式全反射蛍光観察装置は、培養液等の液体を蓄えることが可能な容器（シャーレ、ディッシュ、スライドガラス等）を標本保持部材１６’として用いている（なお、図５及び図６では、便宜上、標本保持部材１６’は標本８近傍の保持部のみを示してある）。この顕微鏡装置は、レーザ光源１”と、レーザ光源１”から発した光を試料（標本）８に全反射照射する照射光学系２”としての、光ファイバ１からコンデンサレンズ１７’に至る光学部材を備えた顕微鏡として構成されている。レーザ光源１”とコンデンサレンズ１７’は、光ファイバ１８で接続されている。また、照射光学系２”は、コンデンサレンズ１７’を介して全反射照明を行うために、コンデンサレンズ１７’へのレーザスポット入射位置を調節可能な機構（図６に示す入射角度調製可能なミラー２１）を備えている。図５中、７は対物レンズ、６はバリアフィルタ、１０’は顕微鏡本体、１９は結像レンズ、２０は検出器である。なお、図６では便宜上、図５に示した光ファイバ１８を省略して示してある。その他、図示を省略したが、照射光学系２”には、レーザ光源１”から発された光のうち励起波長のみを通過させその他の波長を吸収する吸収フィルタを有している。また、図５に示す顕微鏡は、バリアフィルタ６を通過した蛍光を観察鏡筒１１と検出器２０の双方へ導くことの可能な光路分岐部材（図示省略）を備えている。
【００６９】
図６に示す全反射照明では、図５に示した光ファイバ１８を介して導入された照明光がコンデンサレンズ１７’の周辺部から（標本８との界面で全反射するための）大きな入射角でイマージョン物質１３、標本保持部材１６’に入射し、標本保持部材１６’と標本８との界面で全反射する。そのとき、標本保持部材１６’から標本８に向けて極く僅かに滲みだしたエバネッセント波が標本８への励起光となっている。図６中、１５”は光軸、２２は対物レンズ７と標本８との間に充填された水である。
また、コンデンサレンズ方式の全反射照明では、照明光が対物レンズやカバーガラスを通らないで標本保持部材に入射する（なお、そもそも、図６の顕微鏡システムでは、カバーガラスは用いていない）。このため、図６に示すコンデンサレンズ方式の全反射照明では、標本８の極く近傍で発光された蛍光を拾うのみであって、イマージョン物質１３や対物レンズ１７から発生する自家蛍光は全く検出されない。そのため、標本８に最も近い、標本保持部材１６’からの自家蛍光のみが、像の見え等に影響する光学系からのノイズ源であると考えることができる。
なお、試料８で発した蛍光は、対物レンズ７、ダイクロイックミラー５、バリアフィルタ６、結像レンズ１９、光路分岐部材（図示省略）、観察鏡筒１１を経て観察される。また、結像レンズ１９を経た蛍光は、結像レンズ１９、光路分岐部材（図示省略）、検出器２０を介して強度が検出される。
【００７０】
（比較例２）
図５及び図６に示したコンデンサレンズ方式全反射蛍光顕微鏡装置と基本的な光学構成が同じコンデンサレンズ方式全反射蛍光顕微鏡装置を用いて全反射蛍光観察を行い、そのときの自家蛍光の強度を測定した。
標本保持部材１６’には、松浪硝子工業(株)製の蛍光顕微鏡用スライドグラスNEO白縁磨No1を用いた。対物レンズ７には、OLYMPUS(株)製XLUMPlanFl20XW、光源１”には、Ａｒレーザ（λ＝488nm）、吸収フィルタには、488バンドパスフィルタ、バリアフィルタ６には、５５０ハイパスフィルター、コンデンサレンズ１７’には、OLYMPUS(株)製WI-CDEVA、結像レンズ１９には、同社製U-TLU、イマージョンオイル物質１３には、OLYMPUS(株)製イマージョンオイルを用いた。また、正立顕微鏡の本体１０’には、OLYMPUS(株)製BX51WIを用いた。そして、検出器２０には、浜松ホトニクス(株)製EM-CCDを用いて、図５及び図６に示すような全反射照明による一分子蛍光観察を行い、自家蛍光の強度を測定した。
このときの蛍光観察標本は、Alexa488-IGGを１nM以下に調整後、標本保持部材１６’上に塗布したものである。この標本は上述の条件式(2-3)（即ち、（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦２）、および条件式(3-3)（即ち、4BSG' ／B≧０．６）を満たすものであった。
比較例２のコンデンサレンズ方式全反射蛍光顕微鏡装置では、自家蛍光による背景ノイズが強く、蛍光観察を満足に行うことができなかった。
【００７１】
（実施例２）
比較例２のコンデンサレンズ方式全反射蛍光顕微鏡装置と基本的な光学構成が同じコンデンサレンズ方式全反射蛍光顕微鏡装置を用いて全反射照明による一分子蛍光観察を行い、そのときの自家蛍光の強度を測定した。
実施例２のコンデンサレンズ方式全反射蛍光顕微鏡装置は、比較例２のコンデンサレンズ方式全反射蛍光顕微鏡装置で使用した光学部材のうち、標本保持部材１６’のみを低蛍光な標本保持部材１６’に変更し、その他は比較例２と同じ構成である。
実施例２の低蛍光な標本保持部材１６’には、実施例１で用いた低蛍光な標本保持部材１６と同一のものを用いた。
実施例２の標本保持部材１６’の自家蛍光の強度は、比較例２の標本保持部材１６’の自家蛍光の強度に対する比率が、条件式(1-1')（即ち、B'SG／BSG≦０．８９）を満たすものであった。
実施例２の低蛍光標本保持部材を用いて比較例２のコンデンサレンズ方式全反射蛍光顕微鏡装置による全反射照明による一分子蛍光観察と同じ試料を調整して同じ条件で観察したところ、自家蛍光による背景光が低減され、蛍光観察像のＳ／Ｎ比が改善されていることが確認できた。
【００７２】
比較例２と実施例２との比較により、本発明の標本保持部材を用いることにより、蛍光観察像のＳ／Ｎ比が向上し、より高品質な観察が可能であることが確認できた。
【００７３】
以上述べたことから理解されるように、本発明の蛍光観察又は蛍光測光システム、及び蛍光観察又は蛍光測光方法は、特許請求の範囲に記載された発明の他にも、以下に列挙する特徴を有する。
【００７４】
（１）低蛍光な標本保持部材を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムであって、前記低蛍光な標本保持部材が次の条件式(1-2)を満足することを特徴とする蛍光観察又は蛍光計測システム。
BSG'／BSG≦０．４５ …(1-2)
但し、BSG'は前記低蛍光な標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【００７５】
（２）低蛍光な標本保持部材を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムであって、前記低蛍光な標本保持部材が次の条件式(1-3)を満足することを特徴とする蛍光観察又は蛍光計測システム。
BSG'／BSG≦０．３ …(1-3)
但し、BSG'は前記低蛍光な標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【００７６】
（３）前記工程（Ａ）で選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-2)，(3-2)の少なくとも一方を満足することを特徴とする請求項２に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦３ …(2-2)
４BSG／Ｂ≧０．４ …(3-2)
但し、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【００７７】
（４）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）であることを特徴とする上記（３）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【００７８】
（５）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（４）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【００７９】
（６）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがカルシウムイオンイメージングであることを特徴とする上記（３）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【００８０】
（７）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（６）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【００８１】
（８）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションが動画観察又はタイムラプス観察であることを特徴とする上記（３）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【００８２】
（９）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（８）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【００８３】
（１０）前記工程（Ａ）で選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-3)，(3-3)の少なくとも一方を満足することを特徴とする請求項２に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦２ …(2-3)
４BSG／Ｂ≧０．６ …(3-3)
但し、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【００８４】
（１１）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）であることを特徴とする上記（１０）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【００８５】
（１２）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（１１）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【００８６】
（１３）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがカルシウムイオンイメージングであることを特徴とする上記（１０）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【００８７】
（１４）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（１３）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【００８８】
（１５）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションが動画観察又はタイムラプス観察であることを特徴とする上記（１０）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【００８９】
（１６）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（１５）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【００９０】
（１７）蛍光観察又は蛍光測光方法において、次の工程（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）からなることを特徴とする蛍光観察又は蛍光測光方法。
（Ａ）生細胞を用いた蛍光を発する試料を選択する工程。
（Ｂ）前記工程（Ａ）で選択した試料を観察又は測光するためのアプリケーション、及び次の条件式(1-2)を満足する低蛍光な標本保持部材を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムを選択する工程。
（Ｃ）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーション及びシステムを用いて、前記工程（Ａ）で選択した試料を蛍光観察又は蛍光測光する工程。
BSG'／BSG≦０．４５ …(1-2)
但し、BSG'は前記低蛍光な標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【００９１】
（１８）前記工程（Ａ）で選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-1)，(3-1)の少なくとも一方を満足することを特徴とする上記（１７）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦５ …(2-1)
４BSG／Ｂ≧０．２ …(3-1)
但し、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【００９２】
（１９）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）であることを特徴とする上記（１８）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【００９３】
（２０）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（１９）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【００９４】
（２１）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがカルシウムイオンイメージングであることを特徴とする上記（１８）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【００９５】
（２２）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（２１）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【００９６】
（２３）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションが動画観察又はタイムラプス観察であることを特徴とする上記（１８）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【００９７】
（２４）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（２３）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【００９８】
（２５）前記工程（Ａ）で選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-2)，(3-2)の少なくとも一方を満足することを特徴とする上記（１７）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦３ …(2-2)
４BSG／Ｂ≧０．４ …(3-2)
但し、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【００９９】
（２６）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）であることを特徴とする上記（２５）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１００】
（２７）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（２６）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１０１】
（２８）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがカルシウムイオンイメージングであることを特徴とする上記（２５）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１０２】
（２９）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（２８）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１０３】
（３０）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションが動画観察又はタイムラプス観察であることを特徴とする上記（２５）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１０４】
（３１）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（３０）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１０５】
（３２）前記工程（Ａ）で選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-3)，(3-3)の少なくとも一方を満足することを特徴とする上記（１７）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦２ …(2-3)
４BSG／Ｂ≧０．６ …(3-3)
但し、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【０１０６】
（３３）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）であることを特徴とする上記（３２）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１０７】
（３４）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（３３）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１０８】
（３５）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがカルシウムイオンイメージングであることを特徴とする上記（３２）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１０９】
（３６）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（３５）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１１０】
（３７）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションが動画観察又はタイムラプス観察であることを特徴とする上記（３２）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１１１】
（３８）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（３７）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１１２】
（３９）蛍光観察又は蛍光測光方法において、次の工程（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）からなることを特徴とする蛍光観察又は蛍光測光方法。
（Ａ）生細胞を用いた蛍光を発する試料を選択する工程。
（Ｂ）前記工程（Ａ）で選択した試料を観察又は測光するためのアプリケーション、及び次の条件式(1-3)を満足する低蛍光な標本保持部材を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムを選択する工程。
（Ｃ）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーション及びシステムを用いて、前記工程（Ａ）で選択した試料を蛍光観察又は蛍光測光する工程。
BSG'／BSG≦０．３ …(1-3)
但し、BSG'は前記低蛍光な標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【０１１３】
（４０）前記工程（Ａ）で選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-1)，(3-1)の少なくとも一方を満足することを特徴とする上記（３９）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦５ …(2-1)
３BSG／Ｂ≧０．２ …(3-1)
但し、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【０１１４】
（４１）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）であることを特徴とする上記（４０）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１１５】
（４２）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（４１）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１１６】
（４３）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがカルシウムイオンイメージングであることを特徴とする上記（４０）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１１７】
（４４）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（４３）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１１８】
（４５）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションが動画観察又はタイムラプス観察であることを特徴とする上記（４０）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１１９】
（４６）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（４５）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１２０】
（４７）前記工程（Ａ）で選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-2)，(3-2)の少なくとも一方を満足することを特徴とする上記（３９）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦３ …(2-2)
４BSG／Ｂ≧０．４ …(3-2)
但し、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【０１２１】
（４８）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）であることを特徴とする上記（４７）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１２２】
（４９）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（４８）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１２３】
（５０）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがカルシウムイオンイメージングであることを特徴とする上記（４７）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１２４】
（５１）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（５０）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１２５】
（５２）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションが動画観察又はタイムラプス観察であることを特徴とする上記（４７）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１２６】
（５３）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（５２）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１２７】
（５４）前記工程（Ａ）で選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-3)，(3-3)の少なくとも一方を満足することを特徴とする上記（３９）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦２ …(2-3)
４BSG／Ｂ≧０．６ …(3-3)
但し、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【０１２８】
（５５）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）であることを特徴とする上記（５４）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１２９】
（５６）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（５５）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１３０】
（５７）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがカルシウムイオンイメージングであることを特徴とする上記（５４）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１３１】
（５８）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（５７）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１３２】
（５９）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションが動画観察又はタイムラプス観察であることを特徴とする上記（５４）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１３３】
（６０）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（５９）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【産業上の利用可能性】
【０１３４】
本発明の蛍光観察又は蛍光測光システム、及び蛍光観察又は蛍光測光方法は、微弱な蛍光を広帯域で正確に観察・計測できる技術に関し、ノイズを含めた正確な定量性が必要とされる顕微鏡分野、蛍光顕微鏡分野、タンパク質・ＤＮＡ解析装置分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】本発明の実施例１及び比較例１にかかる蛍光観察又は蛍光測光システムに適用可能な倒立蛍光顕微鏡装置の一例として白色アーク光源を用いた落射蛍光顕微鏡装置の概略構成を示す側面図である。
【図２】図１の落射蛍光顕微鏡装置における要部の光学構成を簡略化して示す説明図である。
【図３】本発明の実施例１及び比較例１にかかる蛍光観察又は蛍光測光システムに適用可能な倒立蛍光顕微鏡装置の他の例として白色アーク光源を用いた透過蛍光顕微鏡装置の概略構成を示す側面図である。
【図４】図３の透過蛍光顕微鏡装置における要部の光学構成を簡略化して示す説明図である。
【図５】本発明の実施例２及び比較例２にかかる蛍光観察又は蛍光測光システムに適用可能な正立蛍光顕微鏡装置の一例としてレーザ光源を用いたコンデンサレンズ方式全反射蛍光顕微鏡装置の概略構成を示す側面図である。
【図６】図５のコンデンサレンズ方式全反射蛍光顕微鏡装置における要部の光学構成を簡略化して示す説明図である。
【符号の説明】
【０１３６】
１，１’ 白色アーク光源
１” レーザ光源
２，２’，２” 照射光学系
３ 落射投光管
４ 吸収フィルタ
５ ダイクロイックミラー
５’ ミラー
６ バリアフィルタ
７ 対物レンズ
８ 試料（標本）
９ ミラー
１０，１０’ 顕微鏡本体
１１ 観察鏡筒
１２ 集光レンズ
１３ イマージョン物質
１４ カバーガラス
１５，１５’，１５” 光軸
１６，１６’ 標本保持部材
１７，１７’ コンデンサレンズ
１８ 光ファイバ
１９ 結像レンズ
２０ 検出器
２１ 入射角度調製可能なミラー
２２ 水
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光観察又は蛍光測光システム、及び蛍光観察又は蛍光測光方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の顕微鏡分野、蛍光顕微鏡分野、タンパク質・ＤＮＡ解析装置分野などにおける測定機器と装置の発展によって、これらの分野における観察・計測の傾向が変化している。その傾向の変化として次の２つの大きな流れがある。
【０００３】
一つの流れは、固定細胞の観察・計測から生細胞の観察・計測といった観察・計測対象の変化である。ポストゲノムの時代となり、蛍光色素一分子蛍光測定、蛍光色素の多色化による生体機能の同時解析など、微弱な蛍光を広帯域で正確に観察・計測する技術の重要性が増している。最先端のリサーチ分野では、生体の機能解明やタンパク質の挙動解析・相互作用の解析などを目的として、細胞を生かしたまま、長時間（数日から数週間）に亘り観察し続けるというニーズが高まり、そうした観察を実施する手法が種々提案されている。細胞の観察手法としては、蛍光タンパク質を所望の細胞に発現させたり、蛍光色素を導入したりして、その蛍光を観察する手法が主流である。さらに、究極の微弱蛍光観察といえる一分子蛍光観察などがあり、より一層微弱な蛍光の観察・計測が求められている。しかしながら、蛍光観察において蛍光物質を励起する光（励起光）の強度が強すぎると細胞にダメージを与える。このため、細胞を長時間生かし続けるためには、励起光強度をできるだけ弱くする必要がある。一方、蛍光物質に励起光を照射し続けると、その蛍光が次第に褪色していくことも良く知られている。従って、弱い励起光を照射することによって、褪色を抑制しつつ微弱な蛍光をＳ／Ｎ比よく観察できるようにすることは非常に有用である。
【０００４】
しかし、励起光を弱めると、それにつれて蛍光強度も弱くなるから、Ｓ／Ｎ比の高い蛍光画像を得ることが困難となる。即ち、蛍光が微弱であればあるほど、ノイズの影響が大きくなって、Ｓ／Ｎ比が下がる。ここで、ノイズとは主に光学系や試料からの自家蛍光などを含むものとする。
【０００５】
もう一つの流れは、従来の顕微鏡装置のように観察機能のみの装置から、蛍光強度、波長、被検出物の局在などを計測して定量化する機能を備えた装置への変化である。この場合、ノイズも含めた正確な定量性が要求される。
【０００６】
ところで、従来の蛍光観察装置及び蛍光計測装置として、例えば、次の特許文献１，２に記載のものが提案されている。
【特許文献１】特開平０８−３２０４３７号公報
【特許文献２】特開平０８−１７８８４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、特許文献１や特許文献２に開示されているような、従来の蛍光観察装置や蛍光計測装置は、蛍光観察における像の見えのよさや、蛍光測定における定量性に関して、装置に用いられている光学素子に含まれる不純物（特に、白金コロイド）から発した自家蛍光や、標本保持部材から発した自家蛍光や、低屈折率オイルから発した自家蛍光によるノイズの影響を受け易いものであった。
【０００８】
また、従来の蛍光顕微鏡を用いた蛍光検出システムにおいて、検出器で検出される信号は、所望の深度からの蛍光のみならず、蛍光顕微鏡観察に使用する対物レンズやイマージョン物質など光学系や試料から発した自家蛍光も含まれ、これらすべてがノイズ源となり、結果的にＳ／Ｎ比を大きく低下させる原因となっていた。
【０００９】
高倍率・高ＮＡの油浸対物レンズを用いて蛍光観察する場合、イマージョン物質として、対物レンズと試料との間に、水よりも自家蛍光の大きなイマージョン物質を充填する必要がある。一分子蛍光観察など微弱な蛍光を検出する際には、これらのノイズの寄与が大きくなるため、Ｓ／Ｎ比の劣化が顕著となっていた。
【００１０】
また、本発明者は、これらの自家蛍光によるノイズの問題に対処すべく、特願２００６−１７５４９５号、特願２００６−１７５４９６号に記載の蛍光観察又は蛍光計測システム、蛍光観察又は蛍光測光方法を発明した。
しかし、これらの発明は、それぞれカバーガラス、イマージョン物質の自家蛍光に着目したものであり、自家蛍光発生源として標本保持部材（例えば、スライドガラス）を考慮していないものであった。
微弱な蛍光をより高Ｓ／Ｎ比で観察・計測できるようにするためには、標本保持部材の自家蛍光も低減することが望まれる。
【００１１】
本発明は、上記従来の課題に鑑みてなされたものであり、自家蛍光によるノイズの影響を低減でき、高精度、高品質な蛍光観察、蛍光計測が可能で、更には微弱蛍光の観察や計測が可能な蛍光観察システム、蛍光測光システム、蛍光観察方法、及び蛍光測光方法を提供することを目的とする。
【００１２】
より詳しくは、本発明は、高精度、高品質な蛍光観察、蛍光計測、更には微弱蛍光の観察や計測が可能な標本保持部材を用いた蛍光観察システム、蛍光測光システム、蛍光観察方法、及び蛍光測光方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的を達成するため、本発明による蛍光観察又は蛍光測光システムは、低蛍光な標本保持部材を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムであって、前記低蛍光な標本保持部材が次の条件式(1-1)を満足することを特徴としている。
BSG'／BSG≦０．６ …(1-1)
但し、BSG'は前記低蛍光な標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【００１４】
また、本発明による蛍光観察又は蛍光測光方法は、次の工程（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）からなることを特徴としている。
（Ａ）生細胞を用いた蛍光を発する試料を選択する工程。
（Ｂ）前記工程（Ａ）で選択した試料を観察又は測光するためのアプリケーション、及び次の条件式(1-1)を満足する低蛍光な標本保持部材を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムを選択する工程。
（Ｃ）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーション及びシステムを用いて、前記工程（Ａ）で選択した試料を蛍光観察又は蛍光測光する工程。
BSG'／BSG≦０．６ …(1-1)
但し、BSG'は前記低蛍光な標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【００１５】
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程（Ａ）で選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-1)，(3-1)の少なくとも一方を満足することが好ましい。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦５ …(2-1)
４BSG／Ｂ≧０．２ …(3-1)
但し、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【００１６】
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）であることが好ましい。
【００１７】
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがカルシウムイオンイメージングであることが好ましい。
【００１８】
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションが動画観察又はタイムラプス観察であることが好ましい。
【００１９】
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることが好ましい。
【００２０】
また、本発明による全反射照明蛍光観察又は蛍光計測システムは、コンデンサレンズを用いてレーザ光を低蛍光な標本保持部材の底面で全反射するように照明し、この全反射照明によって標本保持部材に保持された標本から発する蛍光を、前記コンデンサレンズと対峙して設けられた対物レンズで検出する全反射照明蛍光観察又は蛍光測光システムであって、前記低蛍光な標本保持部材が次の条件式(1-1')を満足することを特徴としている。
BSG’／BSG≦０．８９ …(1-1')
但し、BSG’は前記低蛍光な標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【００２１】
また、本発明の蛍光観察又は蛍光計測システムにおいては、前記低蛍光な標本保持部材がガラスシャーレまたはガラスボトムディッシュであることが好ましい。
【００２２】
また、本発明の蛍光観察又は蛍光計測システムにおいては、前記低蛍光な標本保持部材がスライドガラスであることが好ましい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、自家蛍光によるノイズの影響を低減でき、高精度、高品質な蛍光観察、蛍光計測が可能で、更には微弱蛍光の観察や計測が可能な蛍光観察システム、蛍光測光システム、蛍光観察方法、及び蛍光測光方法が得られる。
より詳しくは、本発明によれば、高精度、高品質な蛍光観察、蛍光計測、更には微弱蛍光の観察や計測が可能な標本保持部材を用いた蛍光観察システム、蛍光測光システム、蛍光観察方法、及び蛍光測光方法が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
実施例の説明に先立ち、本発明を想到するに至った経緯を説明する。
（試料の明るさに着目した蛍光画像Ｓ／Ｎ比のランク分け）
まず、本発明者は、高精度、高品質な蛍光観察、蛍光測光、更には微弱蛍光観察や微弱蛍光測光などのアプリケーション（検鏡法）が可能な蛍光観察装置及び蛍光測光装置に要求されるノイズレベルに関して、観察・測光に用いられる試料ごとに後述する如くランク分けすることを試みた。
ここで、ランク分けに用いる式を定義する。被観察物（又は被測光物）の蛍光強度の平均値をＳ、背景（観察領域において被観察物、又は被測光物が存在しない部分）の自家蛍光の強度の平均値をＢ、それらの強度の揺らぎをそれぞれｓ，ｂとしたとき、アプリケーションのＳ／Ｎ比を次式(2-0)により定義した。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ） …(2-0)
【００２５】
(1)一分子蛍光観察
まず、最も自家蛍光の影響を受けやすい試料として、いわゆる一分子蛍光観察のＳ／Ｎ比について考察した。一分子蛍光観察では、観察光学系または測光光学系の自家蛍光が主たるノイズ成分である。一分子蛍光観察では、Ｓ／Ｎ比は次の条件式(2-3)を満たす。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦２ …(2-3)
【００２６】
(2)暗い試料の蛍光観察
次に、生細胞を用いた蛍光観察（又は測光）について考察した。生細胞観察では、細胞の活性を長時間に亘って維持する必要がある。一般に、細胞へのダメージを軽減するため、蛍光物質の量を少なくすることや、励起光の生細胞への照射強度を弱めることが行われる。したがって、蛍光の強度も小さくなり易い傾向にある。暗い試料の蛍光観察ではＳ／Ｎ比は次の条件式(2-2)を満たす。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦３ …(2-2)
【００２７】
(3)通常の明るさの試料の蛍光観察
最後に、一般的な固定細胞を用いた蛍光観察（又は測光）、あるいは、生細胞を用いた蛍光観察のうち、蛍光強度が強い場合について考察した。固定細胞の場合、細胞の活性を維持する必要がないため、蛍光物質の濃度を高くしたり、励起光強度を強めたりすることができる。従って、蛍光強度を高めることができる。また、生細胞を用いる場合でも、活性を維持する期間が短くてもよい場合や、細胞への影響が少ない部位に蛍光タンパクを発現させる場合などもこれに該当する。この場合、Ｓ／Ｎ比は次の条件式(2-1)を満たす。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦５ …(2-1)
【００２８】
以上のように、本発明者は、蛍光観察（又は測光）に用いられている試料の明るさについて、アプリケーションのＳ／Ｎ比に応じて３つに分類した。
【００２９】
（アプリケーションの種類）
次に、本発明者は、これらの試料を蛍光観察（又は測光）するためのアプリケーションの種類について考察した。
【００３０】
(1)ＦＲＥＴ観察
蛍光試料を観察又は測光する手法として、良く利用される手法の一つにＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）がある。
ＦＲＥＴはドナー物質とアクセプタ物質の２つの蛍光物質を用い、ドナー物質の蛍光波長とアクセプタ物質の励起波長とが略一致するようにしている。そのため、ＦＲＥＴにおける励起光の波長は、アクセプタ物質を単独で用いる場合の励起光の波長よりも、短波長側に離れている。一方、観察または測光光学系の自家蛍光は、励起光の波長が短くなるほど強くなる傾向を有する。従って、ＦＲＥＴでは、同じ蛍光波長を観察または測光する場合であっても、観察または測光光学系からの自家蛍光が大きくなるという問題がある。
【００３１】
(2)カルシウムイオンイメージング
また、細胞内、あるいは、細胞間の信号の伝達に大きな役割を果たしている物質にカルシウムイオンがある。このカルシウムイオンの濃度勾配や濃度の変化を観察、測光することは細胞の機能解明において極めて重要である。カルシウムイオンの濃度を検出する場合によく用いられる試薬として、Fura-2、Indo-1がある。これらの試薬には励起光として波長300〜400nmのＵＶ光が利用される。そのため、観察または測光光学系からの自家蛍光が大きくなるという問題があった。近年、ＵＶ光を用いないCameleonという蛍光試薬が提供されているが、Cameleonは上述のＦＲＥＴを応用した試薬であるため、ＦＲＥＴと同様の問題が起こる。
【００３２】
(3)動画、タイムラプス観察
細胞膜上の一分子を観察する場合や、前記ＦＲＥＴ、カルシウムイオンイメージングにおいては、その強度の比だけでなく、強度比の時間変化を調べることが重要である。変化のスピードが速い場合には、ビデオレートあるいはそれ以上の高速度カメラによる動画観察が行われる。動画観察の場合、変化の速い現象を検出するため、１コマ当たりのカメラの露光時間が必然的に短くなり、蛍光の輝度レベルが低くなる。従って、動画観察では、一般的な蛍光観察または測光に比べて蛍光が弱いため、Ｓ／Ｎ比の良い画像データを得ることが難しい。
一方、変化のスピードが遅い場合には、数時間から数日にわたり間欠的に観察を続けるタイムラプス観察が行われる。タイムラプス観察においては、細胞の活性を長時間にわたって維持する必要があるため、試料細胞へ照射する励起光の強度を可能な限り小さくすることが要求される。このため、タイムラプス観察では、一般的な蛍光観察または測光に比べて、蛍光が弱いため、Ｓ／Ｎ比の良い画像データを得ることが難しい。
【００３３】
以上述べたように、蛍光試料を観察する種々のアプリケーションにおいても、アプリケーションに応じたＳ／Ｎ比劣化要因が存在する。
実際には、上記条件式(2-1)〜(2-3)の少なくともいずれかの明るさの条件に当てはまる試料と、上記(1)〜(3)の各アプリケーションとの組み合わせによって蛍光観察または蛍光測光が行われており、Ｓ／Ｎ比も上記条件式(2-1)〜(2-3)と前記アプリケーション(1)〜(3)との組み合わせに応じて決まる。
【００３４】
（自家蛍光の割合の調査）
次に、本発明者は、従来の一般的な対物レンズ、イマージョン物質、標本保持部材を用いた顕微鏡や測光装置などの光学システムにおける各々の自家蛍光の割合を調べた。
なお、本発明における標本保持部材とは、蛍光観察標本を顕微鏡ステージ上に保持するための光学部材であって、かつ、結像性能には影響しないが、そこで発生する自家蛍光が蛍光観察画像に影響を与える部材を指す。具体的には、スライドガラスや、後述する実施例２に示すようにガラスシャーレやガラスボトムディッシュなどが含まれ、スライドガラスのみに限定されるものではない。
【００３５】
蛍光顕微鏡システムにおけるノイズは、試料からの自家蛍光と、光学系からの自家蛍光とに大別できる。本発明者は、正立顕微鏡BX51（OLYMPUS(株)製）を用いて測定した場合において、ノイズ成分のうち、試料からの自家蛍光と、光学系からの自家蛍光との割合を調査した。
【００３６】
光源から発した光はフィルタ（例えばU-MWIB3（OLYMPUS(株)製）のフィルタユニット）により、観察目的に応じた適切な波長が選択され、照明光学系を通り、励起光として試料に照射される。その際、照明光学系中に配置された対物レンズ、イマージョン物質、標本保持部材や、試料と一緒に封入されている物質が励起され、ノイズとなる自家蛍光を発する。本発明者は、この自家蛍光の量を、観察光学系に取り付けられたフォトマルチプライヤ（浜松ホトニクス(株)製）や冷却ＣＣＤであるCoolSNAP HQ（Photometrics社製）などの検出器を用いて測定した。
【００３７】
まず、通常の落射蛍光観察方法で試料の背景からの自家蛍光を測定し、次に試料を除いた状態で同測定を行う。これらの値の差が試料からの自家蛍光であり、残りが光学系からの自家蛍光として算出される。
算出されたノイズのうち、試料からの自家蛍光は、例えば、後述する如く試料の洗浄法や、試料作製条件によって大きく変動することが判明した。その結果、本発明者は、試料の作製条件により、試料からの自家蛍光のノイズのノイズ全体に及ぼす影響の度合の傾向が大きく３つに分類できることを見出した。これをノイズ全体に対する光学系からの自家蛍光のノイズの割合で示すと、次のように表すことができる。
普通の（洗浄しない）試料：
（光学系からの自家蛍光のノイズ）／Ｂ≧０．２ …(3'-1)
洗浄した試料：
（光学系からの自家蛍光のノイズ）／Ｂ≧０．４ …(3'-2)
極めて綺麗に洗浄した試料：
（光学系からの自家蛍光のノイズ）／Ｂ≧０．６ …(3'-3)
但し、上記条件式(3'-1)〜(3'-3)において、Ｂは背景（観察領域において被観察物、又は被測光物が存在しない部分）の自家蛍光の強度の平均値である。
上記条件式(3'-1)〜(3'-3)において、下限値が大きいほど光学系からの自家蛍光のノイズの占める割合が大きくなり、光学系からの自家蛍光を改善すれば、その効果がより顕著に現れる。
【００３８】
Ｓ／Ｎ比向上のためには光学系からの自家蛍光のノイズの内訳を知る必要がある。そこで、本発明者は、対物レンズとイマージョン物質と標本保持部材のそれぞれのノイズ（自家蛍光）値の割合を調査した。測定方法は、上述した試料からの自家蛍光と光学系からの自家蛍光の割合を調査したときと同様の方法を用いた。
【００３９】
まず、照明光学系に対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラス、標本保持部材を適切に配置した状態（実使用状態）で検出される自家蛍光量を測定する。その後、カバーガラスを光学系から除いて測定、次にイマージョンオイルを光学系から除いて測定、さらに標本保持部材を光学系から除いた状態での自家蛍光を測定し、それぞれの値の差分を取ることによって、対物レンズ、イマージョンオイル、カバーガラス、標本保持部材のそれぞれからの自家蛍光値を求めた。
UPLSAPO60XO（OLYMPUS(株)製），イマージョンオイル（OLYMPUS(株)製），カバーガラス（松浪ガラス工業(株)製），標本保持部材の一例として一般的に用いられるスライドガラス（松浪ガラス工業(株)製）のそれぞれからの自家蛍光値について測定したところ、対物レンズとイマージョンオイルとカバーガラスとスライドガラスの自家蛍光値は同程度であった。
また、さらに対物レンズを光学系から除いた状態での自家蛍光を測定し、対物レンズが光学系に配置されている状態での自家蛍光の測定値との差分を取ることによって、その他の光学部材の自家蛍光値を求めたところ、照明光学系に対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラス、標本保持部材を適切に配置した状態（実使用状態）で検出される自家蛍光量の１割程度であった。
従って、光学システムの観察光学系（又は測光光学系）全体のノイズに占める各々の自家蛍光は、対物レンズが約２０〜２５％、イマージョン物質が約２０〜２５％、カバーガラスが約２０〜２５％、標本保持部材が２０〜２５％、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラス、標本保持部材の合計では約９割、その他が約１割弱であると見積もれる。
【００４０】
従って、微弱蛍光観察（又は測光）において、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラス、標本保持部材からの自家蛍光は、Ｓ／Ｎ比の低下につながり、システム全体の検出性能を高めることができる。
【００４１】
しかるに、本発明者は、Ｓ／Ｎ比を５％向上するためには、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラス、標本保持部材の４つの自家蛍光成分のうち少なくとも一つを４０％低減、又はこれら４つの自家蛍光を全体で１０％低減させる必要があることを見出した。
【００４２】
なお、コンデンサレンズを用いてレーザ光を低蛍光な標本保持部材の底面で全反射するように照明し、この全反射照明によって標本保持部材に保持された標本から発する蛍光を、そのコンデンサレンズと対峙して設けられた対物レンズで検出する全反射照明蛍光観察又は蛍光測光システムにおいては、照明光が対物レンズやカバーガラスを通らないで標本保持部材に入射する。また、標本保持部材と標本との界面で全反射するときに標本へ向けて僅かに染み出したエバネッセント波によって標本を励起する。このため、このようなコンデンサレンズを用いた全反射顕微鏡観察では、標本の極く近傍で発光された蛍光を拾うのみであって、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラスの全体のノイズに占める各々の自家蛍光は、略ゼロに近くなり、像の見え等に影響する光学系からのノイズの殆どは標本保持部材の自家蛍光成分が占めることになる。
従って、この場合には、標本保持部材の自家蛍光を１０％低減させれば、Ｓ／Ｎ比を５％向上するために必要な「対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラス、標本保持部材の４つの自家蛍光を全体で１０％低減させること」ができる。
【００４３】
これらのことから、本発明者は、試料、アプリケーション、またその組み合わせにおけるＳ／Ｎ比と、Ｓ／Ｎ比を向上するために必要な条件を精査し、本発明を完成するに至った。
【００４４】
即ち、本発明の蛍光観察又は蛍光測光システムは、低蛍光な標本保持部材を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムであって、前記低蛍光な標本保持部材が次の条件式(1-1)を満足する。
BSG’／BSG≦０．６ …(1-1)
但し、BSG’は前記低蛍光な標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
上記条件式(1-1)の上限値は、上述した「Ｓ／Ｎ比を５％向上するためには、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラス、標本保持部材の４つの自家蛍光成分のうち少なくとも一つを４０％低減させる必要がある」ということより導出したものである。
【００４５】
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光システムにおいては、次の条件式(1-2)を満足するのがより好ましい。
BSG’／BSG≦０．４５ …(1-2)
但し、BSG’は前記低蛍光な標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
さらには、本発明の蛍光観察又は蛍光測光システムにおいては、次の条件式(1-3)を満足するのがより一層好ましい。
BSG’／BSG≦０．３ …(1-3)
但し、BSG’は前記低蛍光な標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【００４６】
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法は、次の工程（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）からなる。
（Ａ）生細胞を用いた蛍光を発する試料を選択する工程。
（Ｂ）前記工程（Ａ）で選択した試料を観察又は測光するためのアプリケーション、及び次の条件式(1-1)を満足する低蛍光な標本保持部材を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムを選択する工程。
（Ｃ）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーション及びシステムを用いて、前記工程（Ａ）で選択した試料を蛍光観察又は蛍光測光する工程。
BSG’／BSG≦０．６ …(1-1)
但し、BSG’は前記低蛍光な標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
上記条件式(1-1)の上限値は、上述した「Ｓ／Ｎ比を５％向上するためには、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラス、標本保持部材の４つの自家蛍光成分のうち少なくとも一つを４０％低減させる必要がある」ということより導出したものである。
【００４７】
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程（Ｂ）で用いる前記低蛍光な標本保持部材が次の条件式(1-2)を満足するのがより好ましい。
BSG’／BSG≦０．４５ …(1-2)
但し、BSG’は前記低蛍光な標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
さらには、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程（Ｂ）で用いる前記低蛍光な標本保持部材が次の条件式(1-3)を満足するのがより一層好ましい。
BSG’／BSG≦０．３ …(1-3)
但し、BSG’は前記低蛍光な標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【００４８】
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程（Ａ）で選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-1),(3-1)の少なくとも一方を満足するのが好ましい。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦５ …(2-1)
４BSG／Ｂ≧０．２ …(3-1)
但し、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
上記条件式(2-1)の上限値は、上述した試料の明るさのランク分けにおける「通常の明るさの試料」を蛍光観察・蛍光測光する場合に求められるアプリケーションのＳ／Ｎ比に対応させたものである。
上記上限式(3-1)の下限値は、上述したノイズ全体に対する光学系からの自家蛍光のノイズの割合における「普通の（洗浄しない）試料」についての条件式(3'-1)に対応させたものである。また、上記条件式(3-1)の左辺は、上述した「光学システムの観察光学系（又は測光光学系）全体のノイズに占める各々の自家蛍光は、対物レンズが約２０〜２５％、イマージョン物質が約２０〜２５％、カバーガラスが約２０〜２５％、標本保持部材が２０〜２５％、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラス、標本保持部材の合計では約９割」を占め、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラス、標本保持部材のそれぞれの光学系全体に占めるノイズの割合が同じであること、及び条件式(3'-1)より、光学系からの自家蛍光のノイズのうちの対物レンズ、イマージョン物質及びカバーガラスの自家蛍光のノイズの割合を標本保持部材の自家蛍光のノイズの割合に置き換えることによって導出したものである。
【００４９】
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程（Ａ）で選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-2),(3-2)の少なくとも一方を満足するのが好ましい。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦３ …(2-2)
４BSG／Ｂ≧０．４ …(3-2)
但し、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
上記条件式(2-2)の上限値は、上述した試料の明るさのランク分けにおける「暗い試料」を蛍光観察・蛍光測光する場合に求められるアプリケーションのＳ／Ｎ比に対応させたものである。
上記上限式(3-2)の下限値は、上述したノイズ全体に対する光学系からの自家蛍光のノイズの割合における「洗浄した試料」についての条件式(3'-2)に対応させたものである。また、上記条件式(3-2)の左辺は、上述した「光学システムの観察光学系（又は測光光学系）全体のノイズに占める各々の自家蛍光は、対物レンズが約２０〜２５％、イマージョン物質が約２０〜２５％、カバーガラスが約２０〜２５％、標本保持部材が２０〜２５％、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラス、標本保持部材の合計では約９割」を占め、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラス、標本保持部材のそれぞれの光学系全体に占めるノイズの割合が同じであること、及び条件式(3'-2)より、光学系からの自家蛍光のノイズのうちの対物レンズ、イマージョン物質及びカバーガラスの自家蛍光のノイズの割合を標本保持部材の自家蛍光のノイズの割合に置き換えることによって導出したものである。
【００５０】
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程（Ａ）で選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-3),(3-3)の少なくとも一方を満足するのが好ましい。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦２ …(2-3)
４BSG／Ｂ≧０．６ …(3-3)
但し、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
上記条件式(2-3)の上限値は、上述した試料の明るさのランク分けにおける「一分子」を蛍光観察・蛍光測光する場合に求められるアプリケーションのＳ／Ｎ比に対応させたものである。
上記上限式(3-3)の下限値は、上述したノイズ全体に対する光学系からの自家蛍光のノイズの割合における「極めて綺麗に洗浄した試料」についての条件式(3'-3)に対応させたものである。また、上記条件式(3-3)の左辺は、上述した「光学システムの観察光学系（又は測光光学系）全体のノイズに占める各々の自家蛍光は、対物レンズが約２０〜２５％、イマージョン物質が約２０〜２５％、カバーガラスが約２０〜２５％、標本保持部材が２０〜２５％、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラス、標本保持部材の合計では約９割」を占め、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラス、標本保持部材のそれぞれの光学系全体に占めるノイズの割合が同じであること、及び条件式(3'-3)より、光学系からの自家蛍光のノイズのうちの対物レンズ、イマージョン物質及びカバーガラスの自家蛍光のノイズの割合を標本保持部材の自家蛍光のノイズの割合に置き換えることによって導出したものである。
【００５１】
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）であるのが好ましい。
【００５２】
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがカルシウムイオンイメージングであるのが好ましい。
【００５３】
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションが動画観察又はタイムラプス観察であるのが好ましい。
【００５４】
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであるのが好ましい。
【００５５】
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程（Ｂ）で選択したシステムが落射蛍光システムまたは透過蛍光システムのいずれかであるのが好ましい。
【００５６】
また、本発明による全反射照明蛍光観察又は蛍光計測システムは、コンデンサレンズを用いてレーザ光を低蛍光な標本保持部材の底面で全反射するように照明し、この全反射照明によって標本保持部材に保持された標本から発する蛍光を、前記コンデンサレンズと対峙して設けられた対物レンズで検出する全反射照明蛍光観察又は蛍光測光システムであって、前記低蛍光な標本保持部材が次の条件式(1-1')を満足する。
BSG’／BSG≦０．８９ …(1-1')
但し、BSG’は前記低蛍光な標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
上述したように、コンデンサレンズを用いてレーザ光を低蛍光な標本保持部材の底面で全反射するように照明し、この全反射照明によって標本保持部材に保持された標本から発する蛍光を、そのコンデンサレンズと対峙して設けられた対物レンズで検出する全反射照明蛍光観察又は蛍光測光システムにおいては、照明光が対物レンズ、カバーガラスを通らないで標本保持部材に入射する。また、標本保持部材と標本との界面で全反射するときに標本へ向けて僅かに染み出したエバネッセント波によって標本を励起する。このため、このようなコンデンサレンズを用いた全反射顕微鏡観察では、標本の極く近傍で発光された蛍光を拾うのみであって、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラスの全体のノイズに占める各々の自家蛍光は、略ゼロに近くなり、像の見え等に影響する光学系からのノイズの殆どは標本保持部材の自家蛍光成分が占めることになる。
しかるに、上記条件式(1-1')の上限値は、「Ｓ／Ｎ比を５％向上するためには、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラス、標本保持部材の４つの自家蛍光を全体で１０％低減させる必要がある」、「この場合には、標本保持部材の自家蛍光を１０％低減させれば、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラス、標本保持部材の４つの自家蛍光を全体で１０％低減させることができる」ということより導出したものである。
【００５７】
次に、本発明の蛍光観察システム、蛍光測光システム、蛍光観察方法、蛍光測光方法の実施形態について、図面を参照して詳述する。
実施例１及び比較例１
図１は本発明の実施例１及び比較例１にかかる蛍光観察又は蛍光測光システムに適用可能な倒立蛍光顕微鏡装置の一例として白色アーク光源を用いた落射蛍光顕微鏡装置の概略構成を示す側面図、図２は図１の落射蛍光顕微鏡装置における要部の光学構成を簡略化して示す説明図である。図３は本発明の実施例１及び比較例１にかかる蛍光観察又は蛍光測光システムに適用可能な倒立蛍光顕微鏡装置の他の例として白色アーク光源を用いた透過蛍光顕微鏡装置の概略構成を示す側面図、図４は図３の透過蛍光顕微鏡装置における要部の光学構成を簡略化して示す説明図である。
【００５８】
図１に示す蛍光顕微鏡装置は、白色アーク光源１と、白色アーク光源１から発した光を試料（標本）８に照射する照射光学系２としての、落射投光管３から対物レンズ７に至る光学部材を備えた顕微鏡として構成されている。図１中、５はダイクロイックミラー、４は吸収フィルタ、６はバリアフィルタ、９はミラー、１０は顕微鏡本体、１１は観察鏡筒である。
照射光学系２は、図２に示すように、試料８側に配置された対物レンズ７と、落射投光管（図示省略）に配置された集光レンズ１２を有する。図２中、１３はイマージョン物質、１４はカバーガラス、１５は光軸、１６は標本保持部材としてのスライドガラスである。図２では、便宜上、吸収フィルタ４、ダイクロイックミラー５を省略し、白色アーク光源１から対物レンズ７までを直線的に示してある。
集光レンズ１２は、対物レンズ７の後側焦点位置あるいはその近傍に白色アーク光源１から射出された光を集光させるように構成されている。
試料８は、スライドガラス１６とカバーガラス１４に挟まれている。対物レンズ７とカバーガラス１４との間は、イマージョン物質１３で満たされている。
なお、試料８で発した蛍光は、対物レンズ７、ダイクロイックミラー５、バリアフィルタ６、ミラー９、観察鏡筒１１を経て観察される。また、図１の顕微鏡は、観察位置と共役な所定位置に検出器（図示省略）を取り付け、検出器を介して蛍光の強度を検出できるようになっている。
【００５９】
図３に示す蛍光顕微鏡装置は、白色アーク光源１’と、白色アーク光源１’から発した光を試料（標本）８に照射する照射光学系２’としての、コンデンサレンズ１７を有する光学部材を備えた顕微鏡として構成されている。図３中、５’はミラー、４は吸収フィルタ、６はバリアフィルタ、７は対物レンズ、９はミラー、１０は顕微鏡本体、１１は観察鏡筒である。
照射光学系２’は、図４に示すように、試料８を隔てて対物レンズ７と反対側に配置されたコンデンサレンズ１７を有する。図４中、１３はイマージョン物質、１４はカバーガラス、１５’は光軸、１６は標本保持部材としてのスライドガラスである。図４では、便宜上、吸収フィルタ４、ミラー５’を省略し、白色アーク光源１から対物レンズ７までを直線的に示してある。
試料８は、スライドガラス１６とカバーガラス１４に挟まれている。対物レンズ７とカバーガラス１４との間は、イマージョン物質１３で満たされている。
なお、試料８で発した蛍光は、対物レンズ７、バリアフィルタ６、ミラー９、観察鏡筒１１を経て観察される。また、図３の顕微鏡は、観察位置と共役な所定位置に検出器（図示省略）を取り付け、検出器を介して蛍光の強度を検出できるようになっている。
【００６０】
次に、本発明の実施例１及び比較例１の蛍光顕微鏡装置について説明する。本発明の実施例１及び比較例１の蛍光顕微鏡装置の基本的な光学構成は、図１及び図２、並びに図３及び図４に示した蛍光顕微鏡装置と同じである。以下は、実施例と比較例とで異なる構成部分のみを説明し、同一の構成部分についての重複する説明は省略する。
【００６１】
（標本保持部材の自家蛍光量の測定）
図１に示した蛍光顕微鏡装置と基本的な光学構成が同じ顕微鏡装置を用いて後述する実施例１及び比較例１のそれぞれの標本保持部材の自家蛍光量の測定を行った。対物レンズ７には、OLYMPUS(株)製UPLFLN40Xを用いた。また、図示省略した検出器として浜松ホトニクス(株)製ホトマル（R6355）を用いた。
標本保持部材単体をステージの上に置き、対物レンズを標本保持部材に当てつけた。その状態で、波長４８８ｎｍの励起光を照射し、検出器に検出される数値（ここでは、数値Ａとする）をカウントした。次いで、標本保持部材をステージから外し、対物レンズとステージとの間を１ｍｍ程度離した状態で波長４８８ｎｍの励起光を照射し、検出器に検出される数値（ここでは、数値Ｂとする）をカウントした。数値Ａから数値Ｂを差し引くことによって標本保持部材の自家蛍光量を得た。
【００６２】
（比較例１）
図１及び図２、並びに図３及び図４に示した蛍光顕微鏡装置と基本的な光学構成が同じ顕微鏡装置を用いて蛍光観察を行い、そのときの自家蛍光の強度を測定した。
標本保持部材としてのスライドガラス１６には、松浪ガラス工業(株)製の蛍光顕微鏡用スライドグラスNEO白縁磨No1を用いた。対物レンズ７には、OLYMPUS(株)製UPLSAPO60XO、カバーガラス１４には、松浪ガラス工業(株)製 MICRO COVER GLASS No.1-S、イマージョン物質１３には、OLYMPUS(株)製イマージョンオイル（ｎｄ＝1.52）を用いた。また、倒立顕微鏡の本体１０には、OLYMPUS(株)製IX71を用いた。そして、図示省略した検出器として浜松ホトニクス(株)製EM-CCDを用いて、図１及び図２に示すような通常の落射蛍光方式による蛍光観察、ならびに図３及び図４に示すような透過蛍光観察を行い、自家蛍光の強度を測定した。
このときの蛍光観察試料は上述の条件式(2-1)（即ち、（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦５）、および条件式(3-1)（即ち、４BSG／Ｂ≧０．２）を満たすものであった。
比較例１の蛍光顕微鏡装置では、自家蛍光による背景ノイズが強く、蛍光観察を満足に行うことができなかった。
【００６３】
（実施例１）
比較例１の蛍光顕微鏡装置と基本的な光学構成が同じ顕微鏡装置を用いて蛍光観察を行い、そのときの自家蛍光の強度を測定した。
実施例１の蛍光顕微鏡装置は、比較例１の蛍光顕微鏡装置で使用した光学部材のうち、標本保持部材１６（スライドガラス）のみを低蛍光な標本保持部材１６に変更し、その他は比較例１と同じ構成である。
実施例１の低蛍光な標本保持部材１６には、日本板硝子(株)製スーパークリアを松浪ガラス工業(株)製の蛍光顕微鏡用スライドグラスNEO白縁磨No1と同じ大きさ（２６ｍｍ×７６ｍｍ，厚さ１ｍｍ）に切断し、表面を研磨したものを用いた。
なお、比較例１と実施例１で用いた標本保持部材の自家蛍光量をそれぞれ測定したところ、比較例１のものを１としたとき、実施例１のものでは０．２５であった。すなわち、実施例１の標本保持部材１６の自家蛍光の強度は、比較例１の標本保持部材１６の自家蛍光の強度に対する比率が、条件式(1-1)（即ち、B'SG／BSG≦０．６）を満たすものであった。
実施例１の低蛍光標本保持部材（スライドガラス）を用いて、比較例１の蛍光顕微鏡装置による通常の落射蛍光方式による蛍光観察と同じ試料を同じ条件で観察したところ、自家蛍光による背景ノイズが低減され、蛍光像のＳ／Ｎ比が向上しており、満足に蛍光観察を行うことができた。
【００６４】
比較例１と実施例１との比較により、本発明の標本保持部材（スライドガラス）を用いると、蛍光観察像のＳ／Ｎ比が改善され、高品質な観察が可能であることが確認できた。
なお、本発明は実施例１の蛍光顕微鏡装置における標本保持部材の自家蛍光の強度の比率のものに限定されるものではない。例えば、実施例１において、好ましくはBSG'／BSG≦０．４５、さらに好ましくはBSG'／BSG≦３を満たす標本保持部材を用いれば、Ｓ／Ｎ比がより一層改善される。
【００６５】
また、実施例１の標本保持部材を用いた蛍光観察において、蛍光観察試料として、条件式(2-1)（即ち、（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦５）と条件式(3-1)（即ち、４BSG／Ｂ≧０．２）の組み合わせに代えて、次の条件式の組み合わせにおいてもそれぞれ蛍光観察像のＳ／Ｎ比が改善され、高品質な観察結果が得られた。
条件式(2-2)（即ち、（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦３）と条件式(3-2)（即ち、４BSG／Ｂ≧０．４）の組み合わせ。
条件式(2-3)（即ち、（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦２）、および条件式(3-3)（即ち、４BSG／Ｂ≧０．６）の組み合わせ。
【００６６】
また、実施例１では、倒立顕微鏡を用いて説明したが、本発明は倒立顕微鏡に限定適用されるものではなく、正立顕微鏡においても同様の効果を発揮する。
本発明を適用する顕微鏡としては、倒立顕微鏡と正立顕微鏡とを試料を挟んで配置した上下顕微鏡として構成してもよい。上下顕微鏡の場合には、正立顕微鏡側、倒立顕微鏡側のいずれか一方に本発明の実施例に示した標本保持部材が用いられていれば、本発明の効果が発揮される。上下顕微鏡において、正立顕微鏡側、および倒立顕微鏡側は、それぞれ独立に駆動する構成、あるいは連動して駆動する構成のいずれでもよい。さらに、正立顕微鏡側で通常蛍光観察、倒立顕微鏡側で全反射蛍光観察という具合に、上下の顕微鏡で互に異なる観察方法を用いてもよい。
【００６７】
実施例２及び比較例２
次に、本発明の実施例２及び比較例２として、コンデンサレンズ方式全反射蛍光観察（ＴＩＲＦ観察）システムについて説明する。
図５は本発明の実施例２及び比較例２にかかる蛍光観察又は蛍光測光システムに適用可能な正立蛍光顕微鏡装置の一例としてレーザ光源を用いたコンデンサレンズ方式全反射蛍光顕微鏡装置の概略構成を示す側面図、図６は図５のコンデンサレンズ方式全反射蛍光顕微鏡装置における要部の光学構成を簡略化して示す説明図である。
【００６８】
図５に示すコンデンサレンズ方式全反射蛍光観察装置は、培養液等の液体を蓄えることが可能な容器（シャーレ、ディッシュ、スライドガラス等）を標本保持部材１６’として用いている（なお、図５及び図６では、便宜上、標本保持部材１６’は標本８近傍の保持部のみを示してある）。この顕微鏡装置は、レーザ光源１”と、レーザ光源１”から発した光を試料（標本）８に全反射照射する照射光学系２”としての、光ファイバ１からコンデンサレンズ１７’に至る光学部材を備えた顕微鏡として構成されている。レーザ光源１”とコンデンサレンズ１７’は、光ファイバ１８で接続されている。また、照射光学系２”は、コンデンサレンズ１７’を介して全反射照明を行うために、コンデンサレンズ１７’へのレーザスポット入射位置を調節可能な機構（図６に示す入射角度調製可能なミラー２１）を備えている。図５中、７は対物レンズ、６はバリアフィルタ、１０’は顕微鏡本体、１９は結像レンズ、２０は検出器である。なお、図６では便宜上、図５に示した光ファイバ１８を省略して示してある。その他、図示を省略したが、照射光学系２”には、レーザ光源１”から発された光のうち励起波長のみを通過させその他の波長を吸収する吸収フィルタを有している。また、図５に示す顕微鏡は、バリアフィルタ６を通過した蛍光を観察鏡筒１１と検出器２０の双方へ導くことの可能な光路分岐部材（図示省略）を備えている。
【００６９】
図６に示す全反射照明では、図５に示した光ファイバ１８を介して導入された照明光がコンデンサレンズ１７’の周辺部から（標本８との界面で全反射するための）大きな入射角でイマージョン物質１３、標本保持部材１６’に入射し、標本保持部材１６’と標本８との界面で全反射する。そのとき、標本保持部材１６’から標本８に向けて極く僅かに滲みだしたエバネッセント波が標本８への励起光となっている。図６中、１５”は光軸、２２は対物レンズ７と標本８との間に充填された水である。
また、コンデンサレンズ方式の全反射照明では、照明光が対物レンズやカバーガラスを通らないで標本保持部材に入射する（なお、そもそも、図６の顕微鏡システムでは、カバーガラスは用いていない）。このため、図６に示すコンデンサレンズ方式の全反射照明では、標本８の極く近傍で発光された蛍光を拾うのみであって、イマージョン物質１３や対物レンズ１７から発生する自家蛍光は全く検出されない。そのため、標本８に最も近い、標本保持部材１６’からの自家蛍光のみが、像の見え等に影響する光学系からのノイズ源であると考えることができる。
なお、試料８で発した蛍光は、対物レンズ７、ダイクロイックミラー５、バリアフィルタ６、結像レンズ１９、光路分岐部材（図示省略）、観察鏡筒１１を経て観察される。また、結像レンズ１９を経た蛍光は、結像レンズ１９、光路分岐部材（図示省略）、検出器２０を介して強度が検出される。
【００７０】
（比較例２）
図５及び図６に示したコンデンサレンズ方式全反射蛍光顕微鏡装置と基本的な光学構成が同じコンデンサレンズ方式全反射蛍光顕微鏡装置を用いて全反射蛍光観察を行い、そのときの自家蛍光の強度を測定した。
標本保持部材１６’には、松浪硝子工業(株)製の蛍光顕微鏡用スライドグラスNEO白縁磨No1を用いた。対物レンズ７には、OLYMPUS(株)製XLUMPlanFl20XW、光源１”には、Ａｒレーザ（λ＝488nm）、吸収フィルタには、488バンドパスフィルタ、バリアフィルタ６には、５５０ハイパスフィルター、コンデンサレンズ１７’には、OLYMPUS(株)製WI-CDEVA、結像レンズ１９には、同社製U-TLU、イマージョンオイル物質１３には、OLYMPUS(株)製イマージョンオイルを用いた。また、正立顕微鏡の本体１０’には、OLYMPUS(株)製BX51WIを用いた。そして、検出器２０には、浜松ホトニクス(株)製EM-CCDを用いて、図５及び図６に示すような全反射照明による一分子蛍光観察を行い、自家蛍光の強度を測定した。
このときの蛍光観察標本は、Alexa488-IGGを１nM以下に調整後、標本保持部材１６’上に塗布したものである。この標本は上述の条件式(2-3)（即ち、（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦２）、および条件式(3-3)（即ち、4BSG' ／B≧０．６）を満たすものであった。
比較例２のコンデンサレンズ方式全反射蛍光顕微鏡装置では、自家蛍光による背景ノイズが強く、蛍光観察を満足に行うことができなかった。
【００７１】
（実施例２）
比較例２のコンデンサレンズ方式全反射蛍光顕微鏡装置と基本的な光学構成が同じコンデンサレンズ方式全反射蛍光顕微鏡装置を用いて全反射照明による一分子蛍光観察を行い、そのときの自家蛍光の強度を測定した。
実施例２のコンデンサレンズ方式全反射蛍光顕微鏡装置は、比較例２のコンデンサレンズ方式全反射蛍光顕微鏡装置で使用した光学部材のうち、標本保持部材１６’のみを低蛍光な標本保持部材１６’に変更し、その他は比較例２と同じ構成である。
実施例２の低蛍光な標本保持部材１６’には、実施例１で用いた低蛍光な標本保持部材１６と同一のものを用いた。
実施例２の標本保持部材１６’の自家蛍光の強度は、比較例２の標本保持部材１６’の自家蛍光の強度に対する比率が、条件式(1-1')（即ち、B'SG／BSG≦０．８９）を満たすものであった。
実施例２の低蛍光標本保持部材を用いて比較例２のコンデンサレンズ方式全反射蛍光顕微鏡装置による全反射照明による一分子蛍光観察と同じ試料を調整して同じ条件で観察したところ、自家蛍光による背景光が低減され、蛍光観察像のＳ／Ｎ比が改善されていることが確認できた。
【００７２】
比較例２と実施例２との比較により、本発明の標本保持部材を用いることにより、蛍光観察像のＳ／Ｎ比が向上し、より高品質な観察が可能であることが確認できた。
【００７３】
以上述べたことから理解されるように、本発明の蛍光観察又は蛍光測光システム、及び蛍光観察又は蛍光測光方法は、特許請求の範囲に記載された発明の他にも、以下に列挙する特徴を有する。
【００７４】
（１）低蛍光な標本保持部材を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムであって、前記低蛍光な標本保持部材が次の条件式(1-2)を満足することを特徴とする蛍光観察又は蛍光計測システム。
BSG'／BSG≦０．４５ …(1-2)
但し、BSG'は前記低蛍光な標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【００７５】
（２）低蛍光な標本保持部材を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムであって、前記低蛍光な標本保持部材が次の条件式(1-3)を満足することを特徴とする蛍光観察又は蛍光計測システム。
BSG'／BSG≦０．３ …(1-3)
但し、BSG'は前記低蛍光な標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【００７６】
（３）前記工程（Ａ）で選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-2)，(3-2)の少なくとも一方を満足することを特徴とする請求項２に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦３ …(2-2)
４BSG／Ｂ≧０．４ …(3-2)
但し、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【００７７】
（４）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）であることを特徴とする上記（３）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【００７８】
（５）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（４）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【００７９】
（６）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがカルシウムイオンイメージングであることを特徴とする上記（３）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【００８０】
（７）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（６）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【００８１】
（８）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションが動画観察又はタイムラプス観察であることを特徴とする上記（３）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【００８２】
（９）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（８）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【００８３】
（１０）前記工程（Ａ）で選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-3)，(3-3)の少なくとも一方を満足することを特徴とする請求項２に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦２ …(2-3)
４BSG／Ｂ≧０．６ …(3-3)
但し、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【００８４】
（１１）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）であることを特徴とする上記（１０）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【００８５】
（１２）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（１１）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【００８６】
（１３）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがカルシウムイオンイメージングであることを特徴とする上記（１０）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【００８７】
（１４）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（１３）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【００８８】
（１５）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションが動画観察又はタイムラプス観察であることを特徴とする上記（１０）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【００８９】
（１６）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（１５）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【００９０】
（１７）蛍光観察又は蛍光測光方法において、次の工程（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）からなることを特徴とする蛍光観察又は蛍光測光方法。
（Ａ）生細胞を用いた蛍光を発する試料を選択する工程。
（Ｂ）前記工程（Ａ）で選択した試料を観察又は測光するためのアプリケーション、及び次の条件式(1-2)を満足する低蛍光な標本保持部材を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムを選択する工程。
（Ｃ）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーション及びシステムを用いて、前記工程（Ａ）で選択した試料を蛍光観察又は蛍光測光する工程。
BSG'／BSG≦０．４５ …(1-2)
但し、BSG'は前記低蛍光な標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【００９１】
（１８）前記工程（Ａ）で選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-1)，(3-1)の少なくとも一方を満足することを特徴とする上記（１７）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦５ …(2-1)
４BSG／Ｂ≧０．２ …(3-1)
但し、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【００９２】
（１９）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）であることを特徴とする上記（１８）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【００９３】
（２０）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（１９）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【００９４】
（２１）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがカルシウムイオンイメージングであることを特徴とする上記（１８）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【００９５】
（２２）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（２１）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【００９６】
（２３）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションが動画観察又はタイムラプス観察であることを特徴とする上記（１８）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【００９７】
（２４）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（２３）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【００９８】
（２５）前記工程（Ａ）で選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-2)，(3-2)の少なくとも一方を満足することを特徴とする上記（１７）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦３ …(2-2)
４BSG／Ｂ≧０．４ …(3-2)
但し、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【００９９】
（２６）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）であることを特徴とする上記（２５）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１００】
（２７）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（２６）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１０１】
（２８）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがカルシウムイオンイメージングであることを特徴とする上記（２５）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１０２】
（２９）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（２８）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１０３】
（３０）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションが動画観察又はタイムラプス観察であることを特徴とする上記（２５）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１０４】
（３１）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（３０）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１０５】
（３２）前記工程（Ａ）で選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-3)，(3-3)の少なくとも一方を満足することを特徴とする上記（１７）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦２ …(2-3)
４BSG／Ｂ≧０．６ …(3-3)
但し、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【０１０６】
（３３）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）であることを特徴とする上記（３２）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１０７】
（３４）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（３３）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１０８】
（３５）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがカルシウムイオンイメージングであることを特徴とする上記（３２）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１０９】
（３６）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（３５）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１１０】
（３７）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションが動画観察又はタイムラプス観察であることを特徴とする上記（３２）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１１１】
（３８）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（３７）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１１２】
（３９）蛍光観察又は蛍光測光方法において、次の工程（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）からなることを特徴とする蛍光観察又は蛍光測光方法。
（Ａ）生細胞を用いた蛍光を発する試料を選択する工程。
（Ｂ）前記工程（Ａ）で選択した試料を観察又は測光するためのアプリケーション、及び次の条件式(1-3)を満足する低蛍光な標本保持部材を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムを選択する工程。
（Ｃ）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーション及びシステムを用いて、前記工程（Ａ）で選択した試料を蛍光観察又は蛍光測光する工程。
BSG'／BSG≦０．３ …(1-3)
但し、BSG'は前記低蛍光な標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【０１１３】
（４０）前記工程（Ａ）で選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-1)，(3-1)の少なくとも一方を満足することを特徴とする上記（３９）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦５ …(2-1)
３BSG／Ｂ≧０．２ …(3-1)
但し、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【０１１４】
（４１）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）であることを特徴とする上記（４０）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１１５】
（４２）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（４１）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１１６】
（４３）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがカルシウムイオンイメージングであることを特徴とする上記（４０）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１１７】
（４４）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（４３）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１１８】
（４５）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションが動画観察又はタイムラプス観察であることを特徴とする上記（４０）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１１９】
（４６）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（４５）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１２０】
（４７）前記工程（Ａ）で選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-2)，(3-2)の少なくとも一方を満足することを特徴とする上記（３９）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦３ …(2-2)
４BSG／Ｂ≧０．４ …(3-2)
但し、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【０１２１】
（４８）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）であることを特徴とする上記（４７）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１２２】
（４９）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（４８）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１２３】
（５０）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがカルシウムイオンイメージングであることを特徴とする上記（４７）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１２４】
（５１）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（５０）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１２５】
（５２）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションが動画観察又はタイムラプス観察であることを特徴とする上記（４７）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１２６】
（５３）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（５２）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１２７】
（５４）前記工程（Ａ）で選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-3)，(3-3)の少なくとも一方を満足することを特徴とする上記（３９）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦２ …(2-3)
４BSG／Ｂ≧０．６ …(3-3)
但し、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【０１２８】
（５５）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）であることを特徴とする上記（５４）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１２９】
（５６）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（５５）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１３０】
（５７）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがカルシウムイオンイメージングであることを特徴とする上記（５４）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１３１】
（５８）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（５７）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１３２】
（５９）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションが動画観察又はタイムラプス観察であることを特徴とする上記（５４）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【０１３３】
（６０）前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（５９）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【産業上の利用可能性】
【０１３４】
本発明の蛍光観察又は蛍光測光システム、及び蛍光観察又は蛍光測光方法は、微弱な蛍光を広帯域で正確に観察・計測できる技術に関し、ノイズを含めた正確な定量性が必要とされる顕微鏡分野、蛍光顕微鏡分野、タンパク質・ＤＮＡ解析装置分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】本発明の実施例１及び比較例１にかかる蛍光観察又は蛍光測光システムに適用可能な倒立蛍光顕微鏡装置の一例として白色アーク光源を用いた落射蛍光顕微鏡装置の概略構成を示す側面図である。
【図２】図１の落射蛍光顕微鏡装置における要部の光学構成を簡略化して示す説明図である。
【図３】本発明の実施例１及び比較例１にかかる蛍光観察又は蛍光測光システムに適用可能な倒立蛍光顕微鏡装置の他の例として白色アーク光源を用いた透過蛍光顕微鏡装置の概略構成を示す側面図である。
【図４】図３の透過蛍光顕微鏡装置における要部の光学構成を簡略化して示す説明図である。
【図５】本発明の実施例２及び比較例２にかかる蛍光観察又は蛍光測光システムに適用可能な正立蛍光顕微鏡装置の一例としてレーザ光源を用いたコンデンサレンズ方式全反射蛍光顕微鏡装置の概略構成を示す側面図である。
【図６】図５のコンデンサレンズ方式全反射蛍光顕微鏡装置における要部の光学構成を簡略化して示す説明図である。
【符号の説明】
【０１３６】
１，１’ 白色アーク光源
１” レーザ光源
２，２’，２” 照射光学系
３ 落射投光管
４ 吸収フィルタ
５ ダイクロイックミラー
５’ ミラー
６ バリアフィルタ
７ 対物レンズ
８ 試料（標本）
９ ミラー
１０，１０’ 顕微鏡本体
１１ 観察鏡筒
１２ 集光レンズ
１３ イマージョン物質
１４ カバーガラス
１５，１５’，１５” 光軸
１６，１６’ 標本保持部材
１７，１７’ コンデンサレンズ
１８ 光ファイバ
１９ 結像レンズ
２０ 検出器
２１ 入射角度調製可能なミラー
２２ 水
【特許請求の範囲】
【請求項１】
低蛍光な標本保持部材を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムであって、
前記低蛍光な標本保持部材が次の条件式(1-1)を満足することを特徴とする蛍光観察又は蛍光計測システム。
BSG’／BSG≦０．６ …(1-1)
但し、BSG’は前記低蛍光な標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【請求項２】
蛍光観察又は蛍光測光方法において、次の工程（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）からなることを特徴とする蛍光観察又は蛍光測光方法。
（Ａ）生細胞を用いた蛍光を発する試料を選択する工程。
（Ｂ）前記工程（Ａ）で選択した試料を観察又は測光するためのアプリケーション、及び次の条件式(1-1)を満足する低蛍光な標本保持部材を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムを選択する工程。
（Ｃ）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーション及びシステムを用いて、前記工程（Ａ）で選択した試料を蛍光観察又は蛍光測光する工程。
BSG’／BSG≦０．６ …(1-1)
但し、BSG’は前記低蛍光な標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【請求項３】
前記工程（Ａ）で選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-1),(3-1)の少なくとも一方を満足することを特徴とする請求項２に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦５ …(2-1)
４BSG／Ｂ≧０．２ …(3-1)
但し、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【請求項４】
前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）であることを特徴とする請求項３に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【請求項５】
前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする請求項４に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【請求項６】
前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがカルシウムイオンイメージングであることを特徴とする請求項３に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【請求項７】
前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする請求項６に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【請求項８】
前記工程（Ｂ）で選択したシステムが落射蛍光システムまたは透過蛍光システムのいずれかであることを特徴とする請求項４に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【請求項９】
前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションが動画観察又はタイムラプス観察であることを特徴とする請求項３に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【請求項１０】
前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする請求項９に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【請求項１１】
コンデンサレンズを用いてレーザ光を低蛍光な標本保持部材の底面で全反射するように照明し、この全反射照明によって標本保持部材に保持された標本から発する蛍光を、前記コンデンサレンズと対峙して設けられた対物レンズで検出する全反射照明蛍光観察又は蛍光測光システムであって、
前記低蛍光な標本保持部材が次の条件式(1-1')を満足することを特徴とする全反射照明蛍光観察又は蛍光計測システム。
BSG’／BSG≦０．８９ …(1-1')
但し、BSG’は前記低蛍光な標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【請求項１２】
前記低蛍光な標本保持部材がガラスシャーレまたはガラスボトムディッシュであることを特徴とする請求項１又は１１に記載の蛍光観察又は蛍光計測システム。
【請求項１３】
前記低蛍光な標本保持部材がスライドガラスであることを特徴とする請求項１又は１１に記載の蛍光観察又は蛍光計測システム。
【請求項１】
低蛍光な標本保持部材を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムであって、
前記低蛍光な標本保持部材が次の条件式(1-1)を満足することを特徴とする蛍光観察又は蛍光計測システム。
BSG’／BSG≦０．６ …(1-1)
但し、BSG’は前記低蛍光な標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【請求項２】
蛍光観察又は蛍光測光方法において、次の工程（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）からなることを特徴とする蛍光観察又は蛍光測光方法。
（Ａ）生細胞を用いた蛍光を発する試料を選択する工程。
（Ｂ）前記工程（Ａ）で選択した試料を観察又は測光するためのアプリケーション、及び次の条件式(1-1)を満足する低蛍光な標本保持部材を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムを選択する工程。
（Ｃ）前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーション及びシステムを用いて、前記工程（Ａ）で選択した試料を蛍光観察又は蛍光測光する工程。
BSG’／BSG≦０．６ …(1-1)
但し、BSG’は前記低蛍光な標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【請求項３】
前記工程（Ａ）で選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-1),(3-1)の少なくとも一方を満足することを特徴とする請求項２に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦５ …(2-1)
４BSG／Ｂ≧０．２ …(3-1)
但し、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【請求項４】
前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）であることを特徴とする請求項３に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【請求項５】
前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする請求項４に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【請求項６】
前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションがカルシウムイオンイメージングであることを特徴とする請求項３に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【請求項７】
前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする請求項６に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【請求項８】
前記工程（Ｂ）で選択したシステムが落射蛍光システムまたは透過蛍光システムのいずれかであることを特徴とする請求項４に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【請求項９】
前記工程（Ｂ）で選択したアプリケーションが動画観察又はタイムラプス観察であることを特徴とする請求項３に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【請求項１０】
前記工程（Ｂ）で選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする請求項９に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
【請求項１１】
コンデンサレンズを用いてレーザ光を低蛍光な標本保持部材の底面で全反射するように照明し、この全反射照明によって標本保持部材に保持された標本から発する蛍光を、前記コンデンサレンズと対峙して設けられた対物レンズで検出する全反射照明蛍光観察又は蛍光測光システムであって、
前記低蛍光な標本保持部材が次の条件式(1-1')を満足することを特徴とする全反射照明蛍光観察又は蛍光計測システム。
BSG’／BSG≦０．８９ …(1-1')
但し、BSG’は前記低蛍光な標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値、BSGは従来一般的に使用されている標本保持部材の自家蛍光の強度の平均値である。
【請求項１２】
前記低蛍光な標本保持部材がガラスシャーレまたはガラスボトムディッシュであることを特徴とする請求項１又は１１に記載の蛍光観察又は蛍光計測システム。
【請求項１３】
前記低蛍光な標本保持部材がスライドガラスであることを特徴とする請求項１又は１１に記載の蛍光観察又は蛍光計測システム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００９−１４５０７８（Ｐ２００９−１４５０７８Ａ）
【公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３１９９４３（Ｐ２００７−３１９９４３）
【出願日】平成１９年１２月１１日（２００７．１２．１１）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月１１日（２００７．１２．１１）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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