血管内皮成長因子受容体−Ｉに対する抗体
血管内皮成長因子Ｉ（ＶＥＧＦＲ−Ｉ）に特異的なモノクローナル抗体。本発明は、ＣＤＲ１，ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の相補性決定領域に相当する配列を含む。可変重鎖及び軽鎖免疫グロブリン分子を含むアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を提供する。本発明は、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の作製及び発現方法、並びに抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体を投与することによる、血管形成関連障害を治療し、かつ腫瘍増殖を低減する方法をも提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、血管内皮成長因子−Ｉ（ＶＥＧＦＲ−Ｉ）に特異的な抗体に、並びにＶＥＧＦＲ−Ｉに対する抗体により血管新生関連疾患及び腫瘍を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
胚及び成体における予め存在する血管からの毛細血管の形成をいう血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）は、腫瘍増殖（成長）、生存、及び転移における主要な要素であることが知られている。成長因子及びそれらの受容体、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング成長因子−δ（ＴＧＦ−／３）、酸性及び塩基性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、腫瘍血管新生に一定の役割を演じていると考えられる。Klagsburn & D'Amore, Annual Rev. Physiol., 53 : 217-239 (1991)を参照のこと。上記成長因子のそれらの細胞表面受容体への結合は、受容体の活性化を含み、これは、シグナル伝達経路を開始させ、そして修飾し、そして細胞の増殖と分化を導く。ＶＥＧＦ、すなわち、内皮細胞特異的細胞分裂誘発物質は、それが、内皮細胞の増殖を特異的に促進することにより血管新生誘発物質として作用するという点で、上記因子の中で、区別される。
【０００３】
ＶＥＧＦの生物学的応答は、胚形成の間（Millaure, Cell, 72 : 835-846 (1993)）に、及び腫瘍形成の間に、内皮細胞上に選択的に発現されるその高アフィニティー受容体を通じて仲介される。ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲｓ）は、典型的には、それらのアミノ末端細胞外受容体リガンド結合性ドメイン内に数個、典型的には５又は７個のイムノグロブリン様ループを有することを特徴とするクラスIII受容体型チロシン・キナーゼである（Kaipainen et al, J. Exp. Med., 178 : 2077-2088 (1993)）。他の２つの領域は、キナーゼ挿入ドメインといわれる、可変長の親水性ｉｎｔｅｒｌｄｎａｓｅ配列の挿入により中断されているトランスメンブラン領域とカルボキシ末端細胞内触媒ドメインを含む（Terman et al., Oncogene, 6 : 1677-1683 (1991)）。ＶＥＧＦＲｓは、Shibuya et al., Oncogene, 5 : 519-524 (1990)により配列決定されたｚ，ｓ−様チロシン・キナーゼ受容体（ｆｌｔ−１）又はＶＥＧＦＲ−Ｉ、１９９２年２月２０日出願されたＷＯ９２／１４２４８及びTerman et al., Oncogene, 6 : 1677-1683 (1991)中に記載され、かつ、Matthews et al., Proc. Natl. Acad. Sd. USA, 88 : 9026-9030 (1991)により配列決定されたキナーゼ挿入ドメイン含有受容体／胎児肝キナーゼ（ＫＤＲ／ｆｉｋ−１）又はＶＥＧＦＲ−２を含む、但し、他の受容体、例えば、ニューロピリン−１及び−２もＶＥＧＦに結合しうる。他のチロシン・キナーゼ受容体ＶＥＧＦＲ−３（ｆｌｔ−４）は、ＶＥＧＦホモログ、ＶＥＧＦ−Ｃ及びＶＥＧＦ−Ｄに結合し、そしてリンパ管の発達においてより重要である。
【０００４】
病理学的血管新生の調節におけるＶＥＧＦＲ−Ｉの重要性は、インビボにおける実験モデルにおいて示されてきた。ＶＥＧＦＲ−Ｉチロシン・キナーゼ・ドメインの欠陥は、腫瘍における低減された血管形成をもたらし、これは、病理学的血管新生におけるＶＥＧＦＲ−Ｉチロシン・キナーゼの意義のある役割を示すものである（Hiratsuka et al., Cancer Research, 61 : 1207-1213 (2001)）。ＶＥＧＦＲ−Ｉチロシン・キナーゼ・ドメインは、内皮細胞及びマクロファージ内へのマトリックス・メタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）の導入による腫瘍の病因及び転移の促進のためにも必要とされる（Hiratsuka et al., Cancer Cell, 2 : 289-300 (2002)）。さらに、ＶＥＧＦＲ−Ｉは、ＰＩＧＦ応答性ＢＭ由来前駆細胞の流動化及び分化を仲介することが示されている（Hattori et al., Nature Medicine, 8 : 841-849 (2002)）。抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体によるＶＥＧＦＲ−Ｉの阻害は、骨髄由来内皮及び単球前駆細胞の動員が腫瘍内で血管形成することを妨害することにより、腫瘍血管新生の低減を導く（Lyden et al., Nature Medicine, 7 : 1194-1201 (2001)）。抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体による処置は、腫瘍内の病理学的血管新生、及び動物モデルにおける虚血性網膜炎をも有効に阻害した（Lutten et al., Nature Medicine, 8 : 831-840 (2002)）。
【０００５】
血管新生におけるＶＥＧＦＲ−Ｉの役割に加えて、ＶＥＧＦとその受容体の同時発現も、血液学的悪性細胞及び特定の固形腫瘍細胞においてしばしば発見された（Bellamy, Cancer Research, 59 : 728-733 (1999); Ferrer et al., Urology, 54 : 567-572 (1999); Price et al., Cell Growth Differ., 12 : 129-135 (2001)）。ＶＥＧＦは、リガンドにより刺激された内分泌ループを通じての下流細胞内シグナリング経路の活性化によりＶＥＧＦ受容体発現性白血病細胞の増殖、生存、及び侵入を直接に誘導することが示されている（Dias et al., Proc. Natl. Acad. Sd. USA, 98: 10857-10862 (2001)); Gerber et al., J. Mol. Med., 81 : 20-31 (2003)）。ＶＥＧＦ刺激は、ＥＲＫ１／２及びＰＩ３／Ａｋｔ−キナーゼ・シグナリング経路の活性化を誘導することによりＶＥＧＦＲ−Ｉ発現性乳癌細胞の高められた侵入性をももたらす（Price et al., Cell Growth Differ., 12 : 129-135 (2001)）。
【０００６】
ＶＥＧＦＲ−Ｉとそのリガンドは、炎症性障害において重要な役割を演じることも示されている。ＶＥＧＦ−Ｂ欠陥は、関節炎のモデルにおいて炎症関連血管密度の低下及び滑液炎症をもたらした（Mould et al., Arthritis Rheum., 48 : 2660-2669 (2003)）。ＰＩＧＦは、血管拡大、炎症性細胞、及び単球／マクロファージを仲介することにより皮膚炎症のコントロールにおいて重要な役割をも演じ、そして動物モデルにおけるアテローム性動脈硬化症及びリウマチ様関節炎の調節に貢献することが示されている（Luttun et al., Nature Medicine, 8 : 831-840 (2002); Autiero & Thromb Haemost, 1 : 1356-1370 (2003)）。中和性抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体による処置は、関節炎における炎症性調節破壊を抑制し、アテローム性動脈硬化斑の成長及び傷つきやすさを低下させた。抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の抗炎症効果は、末梢血液中への骨髄由来骨髄前駆細胞の低減された流動化、骨髄細胞の欠陥のある活性化、及び炎症化組織内でのＶＥＧＦＲ−Ｉ−発現性白血球の弱化された分化及び浸潤に帰されていた。したがって、ＶＥＧＦＲ−Ｉは、炎症関連障害の治療のための治療ターゲットでもあることができる。
【０００７】
ＶＥＧＦ受容体活性を阻害する作用物質、例えば、ＶＥＧＦＲ−Ｉに特異的な完全ヒト・モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）の必要性が未だ在る。抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、血管新生関連疾患及び癌の治療のための有用、かつ、新規な治療用アンタゴニストでありうる。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の簡単な説明
１の態様において、本発明は、ＶＥＧＦＲ−Ｉに特異的に結合し、そして配列番号２の軽鎖相補性決定領域−２（ＣＤＲ２）、及び配列番号３の軽鎖相補性領域−３（ＣＤＲ３）を含むモノクローナル抗体又はその断片を提供する。
【０００９】
他の態様においては、本発明は、ＶＥＧＦＲ−Ｉに特異的に結合し、そして配列番号２の軽鎖相補性決定領域−２（ＣＤＲ２）及び配列番号３の軽鎖相補性領域−３（ＣＤＲ３）を含む抗体又はその断片のアミノ酸配列に少なくとも７０％相同であるモノクローナル抗体又はその断片を提供する。
【００１０】
他の態様においては、本発明は、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、及び配列番号２７から成る群から選ばれるヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。上記ヌクレオチド配列は、ＶＥＧＦＲ−Ｉに特異的に結合する抗体又はその断片をコードする。
【００１１】
他の態様においては、本発明は、ＶＥＧＦＲ−Ｉに特異的に結合する抗体又はその断片をコードし、そして配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、及び配列番号２７から成る群から選ばれるヌクレオチド配列に少なくとも７０％相同であるヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。
【００１２】
他の態様においては、本発明は、ＶＥＧＦＲ−Ｉに特異的に結合し、そして配列番号２の軽鎖相補性決定領域−２（ＣＤＲ２）及び配列番号３の軽鎖相補性領域−３（ＣＤＲ３）を含む抗体又はその断片の治療有効量を投与することにより血管新生を阻害し又は腫瘍増殖を低減する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の詳細な説明
１の態様において、本発明は、ＶＥＧＦＲ−Ｉに特異的に結合するモノクローナル抗体及びその断片を提供する（特にことわらない限り、このような抗体及びその断片を本明細書中、「抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体」という）。本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、配列番号２の軽鎖相補性決定領域−２（ＣＤＲ２）及び配列番号３の軽鎖相補性領域−３（ＣＤＲ３）を含む。あるいは、そして好ましくは、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、以下の配列を有する軽鎖相補性領域−１（ＣＤＲ１）を含む：
ＲＡＳＱＳＸ1ＳＳＳＹＬＡ｛ここで、Ｘ1はＶ又はＧである（配列番号１又は４）｝。あるいは、そして好ましくは、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、以下の配列を有する重鎖ＣＤＲ１を含む：
ＧＦＸ2ＦＳＳＹＧＭＨ｛ここで、Ｘ2はＴ又はＡである（配列番号５又は１１）｝。あるいは、そして好ましくは、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、以下の配列を有する重鎖ＣＤＲ２を含む：
ＶＩＷＸ3ＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＸ4Ｇ｛ここで、Ｘ3はＹ又はＦであり、そしてＸ4はＫ又はＲである（配列番号６，９又は１２）｝。あるいは、そして好ましくは、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、以下の配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む：
ＤＨＸ5ＧＳＧＸ6ＨＸ7ＹＸ8ＹＹＧＸ9ＤＶ｛ここで、Ｘ5はＦ又はＹであり；Ｘ6はＡ又はＶであり；Ｘ7はＹ，Ｓ又はＨであり；Ｘ8はＹ又はＦであり；そしてＸ9はＭ又はＬである（配列番号７，８，１０，１３）｝。
好ましい抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体（クローン「６Ｆ９」、「１３Ｇ１２」、「１５Ｆ１１」、及び「１８Ｆ１」（又は「ＭＣ−１８Ｆ１」）と命名した）のＣＤＲのアミノ酸配列を以下の表１中に示す。
【００１４】
【表１】
【００１５】
他の態様において、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、配列番号１４，１５又は１６の軽鎖可変領域（ＶL）、及び／又は配列番号１７，１８，１９又は２０の重鎖可変領域（ＶH）を有する。本発明の好ましい抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のアミノ酸配列を以下の表２中に示す。
【００１６】
【表２】
【００１７】
好ましい態様においては、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体はヒト抗体である。
本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、ＶＥＧＦＲ−Ｉに特異的に結合する完全抗体及び抗体断片を含む。本発明に係る抗体のタイプの非制限的な例は、天然抗体；１本鎖抗体；多価１本鎖抗体、例えば、ダイアボディー、及びトリアボディー；１価断片、例えばＦａｂ（Fragment, antigen binding）、２価断片、例えば（ＦａＶ）2；Ｆｖ（fragment viable）断片又はそれらの誘導体、例えば、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片；及び単ドメイン抗体であって、ＶＥＧＦＲ−Ｉに特異的に結合するものを含む。
【００１８】
天然抗体は、２つの同一の重鎖と２つの同一の軽鎖を有し、各軽鎖は鎖間ジスルフィド結合により重鎖に共有結合され、そして複数のジスルフィド結合が、上記２つの重鎖を互いにさらに連結する。個々の鎖は、類似のサイズ（１１０〜１２５アミノ酸）及び構造を有するが、異なる機能を有するドメインに折り重なることができる。軽鎖は、１つのＶLと１つの定常ドメイン（ＣL）を含みうる。重鎖も、１つのＶH、及び／又は抗体のクラス又はアイソタイプに依存して、３つ又は４つの定常ドメイン（ＣH１，ＣH２，ＣH３、及びＣH４）を含みうる。ヒトにおいては、上記アイソタイプは、ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＧ、及びＩｇＭであり、ＩｇＡとＩｇＧは、サブクラス又はサブタイプ（ＩｇＡ1-2とＩｇＧ1-4）にさらに分けられる。
【００１９】
１本鎖抗体は、それらが由来するところの完全抗体の定常ドメインのいくつか又は全てを欠く。１本鎖抗体を製造するために使用されるペプチド・リンカーは、ＶLドメインとＶHドメインの正しい３次元の折りたたみが保証されるように選択されたフレキシブル・ペプチドであることができる。一般に、ＶL又はＶH配列のカルボキシ末端は、このようなペプチド・リンカーにより相補性ＶH又はＶL配列のアミノ酸末端に共有結合されうる。上記リンカーは、一般に、１０〜５０アミノ酸残基、好ましくは、１０〜３０アミノ酸残基、より好ましくは１２〜３０アミノ酸残基、そして最も好ましくは１５〜２５アミノ酸残基である。このようなリンカー・ペプチドの例は、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）3（配列番号２８）を含む。
【００２０】
各１本鎖が第１のペプチド・リンカーにより共有結合された１つのＶHと１つのＶLドメインを有するところの多数１本鎖抗体は、少なくとも１以上のペプチド・リンカーにより共有結合されて多価１本鎖抗体が形成され、これは１特異的又は多特異的であることができる。多価１本鎖抗体の各鎖は、可変軽鎖断片と可変重鎖断片を含み、そしてペプチド・リンカーにより少なくとも１つの他の鎖に連結される。
【００２１】
２つの１本鎖抗体は、併合されて、３価ダイマーとしても知られるダイアボディーを形成しうる。ダイアボディーは、２つの鎖と２つの結合部位を有し、そして１特異的又は２特異的であることができる。ダイアボディーの各鎖は、ＶLドメインに接続されたＶHドメインを含む。これらのドメインは、同一鎖上のドメイン間の対合を防止し、それにより、異なる鎖上の相補性ドメインの間での対合を駆動して、２つの抗原結合部位を再創製するために十分に短いリンカーと接続される。
【００２２】
３つの１本鎖抗体は、併合されて、３価トリマーとしても知られるトリアボディーを形成しうる。トリアボディーは、ＶL又はＶHドメインのカルボキシ末端に、直接に、すなわち、リンカー配列によらずに、ＶL又はＶHドメインのアミノ酸末端を用いて構築される。トリアボディーは、環状の頭〜尾のやり方で配置されたポリペプチドをもつ３つのＦｖ頭を有する。トリアボディーの可能なコンホメーションは、互いに１２０°の角度で平面内に位置する３つの結合部位を含む平面である。トリアボディーは１特異的、２特異的又は３特異的であることができる。
【００２３】
Ｆａｂ断片は、ＶLＣLＶＨＣＨ1ドメインから成る抗体の断片をいう。パパイン消化により生成されたものは、「Ｆａｂ」といわれ、そして重鎖ヒンジ領域を保持していない。ペプシン消化により生成されたものは、「（Ｆａｂ′）2」（この場合、鎖間ジスルフィド結合は無傷である）か、又は「Ｆａｂ′」（この場合、上記ジスルフィド結合は保持されていない）といわれる。２価（Ｆａｂ′）2断片は、１価Ｆａｂ断片のアビジチーよりも高い抗原に対するアビジチーを有する。
【００２４】
Ｆｖ断片は、ＶL及びＶHドメインから成る抗体の部分であり、そして抗原結合部位を構成する。ｓｃＦｖは、１のポリペプチド鎖上にＶLドメインとＶHドメインを含む抗体断片であり、１のドメインのＮ末端と他のドメインのＣ末端は、フレキシブル・リンカーにより結合されて、上記２つの断片が会合して機能的抗原結合部位を形成することを可能にする（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号（Ladner et al.）、ＷＯ８８／０９３４４（Huston et al.）、両者を本明細書中に援用する）。ＷＯ９２／０１０４７（McCafferty et al.）（本明細書中に援用する）は、可溶性組換え遺伝子ディスプレイ・パッケージ、例えばバクテリオファージの表面上へのｓｃＦｖ断片のディスプレイを記載する。
【００２５】
単一ドメイン抗体は、抗原に効率的に結合することができる単一の可変ドメインを有する。結合アフィニティー及び特異性が主に１の又は他の可変ドメインに付与される抗体の例は、本分野において知られている。例えば、Jeffrey, P.D. et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 90 : 10310-4 (1993)を参照のこと。この文献は、本明細書中に援用され、そして、主に抗体重鎖によりジゴキシンに結合する抗−ジゴキシン抗体を開示する。ＶH及びＶLドメインを含む抗体から単一ドメイン抗体を製造するために、ＣＤＲ領域外の一定のアミノ酸置換が、結合、発現又は溶解度を高めるために望ましい。例えば、ＶH−ＶL境界内に埋没してしまうであろうアミノ酸残基を修飾することが望ましい。
【００２６】
本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の各ドメインは、完全な抗体の重鎖又は軽鎖可変ドメインであることができ、又はそれは、天然ドメイン、又は例えば、ＷＯ９３／１１２３６（Griffiths et al.）中に記載されるような技術を用いてインビトロにおいて、構築された合成ドメインの、機能的等価物又は突然変異体又は誘導体であることができる。例えば、少なくとも１つのアミノ酸を欠いている抗体可変ドメインに相当するドメインを一緒に結合することが可能である。重要な特徴は、相補性ドメインと会合して抗原結合部位を形成する各ドメインの能力である。したがって、用語「可変重／軽鎖断片」は、ＶＥＧＦＲ−Ｉ結合特異性に対する実体的効果を有さない変異体を除外するものと解釈されるべきではない。
【００２７】
本明細書中に使用するとき、「抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体」は、ＶＥＧＦＲ−Ｉについての特異性を保持する本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の修飾を含む。このような修飾は、非制限的に、エフェクター分子、例えば、化学療法剤（例えば、シスプラチン、タキソール、ドクソルビシン）又は細胞毒（例えば、タンパク質、又は非タンパク質性の有機化学療法剤）への結合を含む。修飾はさらに、非制限的に、検出可能なレポーター分子への結合を含む。抗体の半減期を延長する修飾（例えば、ペグ化）も含まれる。
【００２８】
タンパク質及び非タンパク質性剤は、本分野において知られた方法により上記抗体に結合されうる。結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）方法は、直接連結、共有結合リンカーを介しての連結、及び特異的結合対メンバー（例えば、アビジン−ビオチン）を含む。このような方法は、例えば、ドキソルビシンの結合に関して、本明細書中に援用するGreenfield et al., Cancer Research 50, 6600-6607 (1990)により記載されたもの、並びに白金化合物の結合に関して、両者とも本明細書中に援用するArnon et al., Adv. Exp. Med. Biol. 303, 79-90 (1991)及びKiseleva et al., Mol. Biol. (USSR) 25, 508-514 (1991)により記載されたものを含む。
【００２９】
本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、その結合特性が、直接突然変異、アフィニティー成熟、ファージ・ディスプレイ、又は鎖シャッフルの方法により改良されているところの抗体をも含む。アフィニティー及び特異性は、本発明に係る抗体のＣＤＲｓの内のいずれかを突然変異させることにより、及び所望の特性を有する抗原結合部位についてスクリーニングすることにより、修飾又は改善されうる（例えば、本明細書中に援用するYang et al., J. Mol. Biol., 254 : 392-403 (1995)を参照のこと）。ＣＤＲｓは、当業者に知られたさまざまな方法で突然変異されうる。例えば、１の方法は、同一抗原結合部位をもつ集団において、２０アミノ酸の全てが特別の位置に存在するように、個々の残基又は残基の組合せを無作為化することである。あるいは、突然変異は、エラー・プローン（error prone）ＰＣＲ法により一定範囲のＣＤＲ残基にわたり誘導される（例えば、本明細書中に援用するHawkins et al., J. Mol. Biol., 226 : 889-896 (1992)を参照のこと）。例えば、重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子を含有するファージ・ディスプレイ・ベクターがＥ．ｃｏｌｉの突然変異誘発遺伝子株において増幅されうる（例えば、本明細書中に援用するLow et al., J. Mol. Biol., 250 : 359-368 (1996)を参照のこと）。
【００３０】
抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、本発明に係る抗体の可変又は超可変領域のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列をもつポリペプチドを含む機能的等価物をも含む。「実質的に同じ」アミノ酸配列は、２つの配列が最適にアラインメントされ、そして当該２つの配列の間のアミノ酸の正しい対合を測定するために比較されるとき、他のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、そしてより好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。「実質的に同じ」アミノ酸配列は、Pearson and Lipman, Pro. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444-8 (1988)に従うＦＡＳＴＡサーチ法により測定されるとき、他のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、そしてより好ましくは少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列をも含む。
【００３１】
先に述べたように、本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、ＶＥＧＦＲ−Ｉに特異的に結合する。このような抗体は、１特異的又は、１の抗原結合性部位がＶＥＧＦＲ−Ｉに特異的である限り２特異的であることができる。ＶＥＧＦＲ−Ｉについての抗体の抗体特異性（抗原の特別なエピトープについての抗体の選択的認識をいう）は、アフィニティー及び／又はアビジチーに基づいて決定されうる。抗原と抗体の解離平衡定数（kd）により表されるアフィニティーは、抗原性決定基（エピトープ）と抗体結合部位の間の結合強さを計測する。アビジチーは、抗体とその抗原との間の結合の強さの尺度である。抗体は、典型的には、１０-5〜１０-11リッター／モルのkdで結合する。１０-4リッター／モル未満のkdは、一般に、非特異的結合を示すと考えられている。kdの値が小さければ小さい程、抗原性決定基と抗体結合部位の間の結合の強さはより大きくなる。
【００３２】
本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、ＶＥＧＦＲ−Ｉの細胞外領域に特異的に結合し、そして好ましくは、ＶＥＧＦＲ−Ｉのリガンドがその受容体に結合することを妨げることによりＶＥＧＦＲ−Ｉの活性化を中和する。このような好ましい態様においては、抗体は、（ＶＥＧＦ（Ａ）、ＶＥＧＦ−Ｂ、及びＰＩＧＦを含む）ＶＥＧＦＲ−Ｉの天然リガンドと少なくとも同程度に強くＶＥＧＦＲ−Ｉに結合する。
【００３３】
ＶＥＧＦＲ−Ｉの活性化の中和は、シグナル伝達に関連する活性の内の１以上を低減し、阻害し、不活性化し、そして／又は破壊することを含む。このような活性は、受容体の二量体化、ＶＥＧＦＲ−Ｉの自己リン酸化、ＶＥＧＦＲ−Ｉの内部細胞質チロシン・キナーゼ・ドメインの活性化、ＤＮＡ合成（遺伝子活性化）及び細胞分裂サイクルの進行又は分裂の調節に関連する多シグナル伝達及びトランス活性化経路の開始を含む。ＶＥＧＦＲ−Ｉ中和の１の尺度は、チロシン・キナーゼ活性ＶＥＧＦＲ−Ｉの阻害である。チロシン・キナーゼの阻害は、周知の方法、例えば、組換えキナーゼ受容体の自己リン酸化レベル、及び／又は天然又は合成基質のリン酸化を計測するリン酸化アッセイを用いて測定されうる。リン酸化は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ又はウェスタン・ブロットにおけるホスホチロシンに特異的な抗体を用いて検出されうる。チロシン・キナーゼ活性に関するいくつかのアッセイは、両者とも本明細書中に援用するPanek et al., J. Pharmacol. Exp. Them., 283 : 1433-44 (1997)及びBatley et al., Life ScL, 62 : 143-50 (1988)中に記載されている。
【００３４】
さらに、タンパク質発現の検出のための方法が、抗体がＶＥＧＦＲ−Ｉの活性化を中和するか否かを決定するために使用されることができ、ここでは、計測されるタンパク質がＶＥＧＦＲ−Ｉチロシン・キナーゼ活性により調節される。これらの方法は、タンパク質発現の検出のための免疫組織化学（ＩＨＣ）、遺伝子増幅の検出のための蛍光インサイチュー・ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、競争放射リガンド結合アッセイ、固体マトリックス・ブロッティング技術、例えば、ノーザン及びサザン・ブロット、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）及びＥＬＩＳＡを含む。例えば、Grandis et al., Cancer, 78 : 1284-92 (1996); Shimizu et al., Japan J. Cancer Res. 85 : 567-71 (1994); Sauter et al., Am. J. Path., 148 : 1047-53 (1996); Collins, Glia, 15 : 289-96 (1995); Radinsky et al., Clin. Cancer Res., 1 : 19-31 (1995); Petrides et al., Cancer Res., 50 : 3934-39 (1990); Hoffmann et al., Anticancer Res., 17 : 4419-26 (1997); Wikstrand et l., Cancer Res., 55 : 3140-48 (1995)（これらの全てを本明細書中に援用する）を参照のこと。
【００３５】
インビボアッセイも、ＶＥＧＦＲ−Ｉ中和を検出するために使用されうる。例えば、受容体チロシン・キナーゼ阻害は、阻害剤の存在下又は不在下で、受容体リガンドにより刺激された細胞系を用いた細胞分裂誘発アッセイにより観察されうる。例えば、ＶＥＧＦ（Ａ）又はＶＥＧＦ−Ｂで刺激されたＨＵＶＥＣ細胞（ＡＴＣＣ）が、ＶＥＧＦＲ−Ｉ阻害をアッセイするために使用されうる。他の方法は、例えば、マウス内に注射されたヒト腫瘍細胞を用いた、ＶＥＧＦ−発現腫瘍細胞の増殖の阻害についての試験を含む。例えば、本明細書中に援用する米国特許第６，３６５，１５７（Rockwell et al.）を参照のこと。
【００３６】
もちろん、本発明は、ＶＥＧＦＲ−Ｉ中和のいずれの特定のメカニズムにより限定されるものではない。例えば、本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、ＶＥＧＦＲ−Ｉに外部から結合し、ＶＥＧＦＲ−Ｉへのリガンドの結合及び受容体会合チロシン・キナーゼを介して仲介されるその後のシグナル伝達をブロックし、そしてシグナル伝達カスケードにおけるＶＥＧＦＲ−Ｉ及びその他の下流タンパク質のリン酸化を防止することができる。受容体−抗体複合体は、インターナライズされ、そして分解されて、受容体細胞表面ダウン・レギュレーションをもたらされることもできる。マトリックス・メタロプロテイナーゼ（その機能は、腫瘍細胞侵入、及び転移である）も、本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体によりダウン・レギュレートされることができる。
【００３７】
ヒト抗ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、天然抗体、又は、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子から構築されるＦａｂ又はｓｃＦｖファージ・ディスプレイ・ライブラリーから得られることができ、そして本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体のＣＤＲ配列は、このような抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体内に挿入されうる。
【００３８】
ヒト抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、当業者に周知の方法により製造されうる。このような方法は、Kohler and Milstein, Nature, 256 : 495-497 (1975) 及びCampbell, Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas, Burdon et al., Eds., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985)（これらの全てを本明細書中に援用する）により記載されるトランスジェニック・マウスを用いたハイブリドーマ法；並びにHuse et al., Science, 246, 1275-1281 (1989)（これを本明細書中に援用する）により記載される組換えＤＮＡ法を含む。
【００３９】
抗体断片は、完全抗体を解裂させることにより、又は当該断片をコードするＤＮＡを発現させることにより、製造されうる。抗体の断片は、Lamoyi et al., J. Immunol. Methods, 56 : 235-243 (1983)及びParham, J. Immunol. 131 : 2895-2902 (1983)（両者を本明細書中に援用する）により記載される方法により調製されうる。このような断片は、１又は両者のＦａｂ断片又はＦ（ａｂ′）2断片を含みうる。このような断片は、１本鎖断片可変領域抗体、すなわち、ｓｃＦｖ、ダイアボディー、又は他の抗体断片をも含みうる。このような抗体の製造方法は、ＰＣＴ出願ＷＯ９３／２１３１９、ヨーロッパ特許出願第２３９，４００号、ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０９６２２、ヨーロッパ特許出願第３３８，７４５号、及びヨーロッパ特許出願ＥＰ３３２，４２４号（これらの全てを本明細書中に援用する）中に開示されている。
【００４０】
他の態様においては、本発明は、本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体をコードするポリヌクレオチドを提供する。このようなポリヌクレオチドは、配列番号２の軽鎖ＣＤＲ２、配列番号３の軽鎖ＣＤＲ３、及び、好ましくは、表１中に列記された他のＣＤＲｓの内の１以上をコードする。表３は、好ましい抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の核酸配列を示す。
【００４１】
【表３】
【００４２】
【表４】
【００４３】
ヒト抗体をコードするＤＮＡは、対応のヒト抗体領域から実質的に又は排他的に得られた、ＣＤＲｓ以外の、ヒト定常領域及び可変領域をコードするＤＮＡと、ヒトから得られたＣＤＲｓをコードするＤＮＡ（軽鎖可変ドメインＣＤＲｓに関して配列番号１〜４、及び重鎖可変ドメインＣＤＲｓに関して配列番号５〜１３）とを、組換えることにより調製されうる。
【００４４】
本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体をコードするポリヌクレオチドは、本発明に係るポリヌクレオチドの核酸配列と実質的に同じ核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。「実質的に同じ」核酸配列とは、本明細書中、２つの配列が（適当なヌクレオチド挿入又は欠失を伴って）最適にアラインメントされ、そして当該２つの配列の間のヌクレオチドの正しい対合を測定するために比較されるとき、他の核酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、そしてより好ましくは少なくとも９０％の同一性を有する配列として定義される。
【００４５】
抗体の断片をコードするＤＮＡの好適な源は、完全長抗体を発現するいずれかの細胞、例えば、ハイブリドーマ、及び脾臓細胞を含む。断片は、抗体等価物としてそれ自体使用されることができ、又は上記のように、等価物に組換えられることができる。この節に記載されるＤＮＡ欠失及び組換えは、知られた方法、例えば、「抗体の機能的等価物」と題する節において先に列記した公表された特許出願中に記載されたもの、及び／又は以下に記載するような、他の標準的な組換えＤＮＡ技術により実施されうる。ＤＮＡの他の源は、本分野において知られているような、ファージ・ディスプレイ・ライブラリーから製造された１本鎖抗体である。
【００４６】
さらに、本発明は、発現配列、プロモーター、及びエンハンサー配列に作用可能な状態で連結された先に記載されたポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。非制限的に酵母及び哺乳動物細胞培養系を含む、原核、例えば、細菌、及び真核系において抗体ポリペプチドの効率的な合成のためのさまざまな発現ベクターが、開発されてきた。本発明のベクターは、染色体の、非染色体の、そして合成ＤＮＡ配列のセグメントを含むことができる。
【００４７】
好適な発現ベクターのいずれをも使用しうる。例えば、原核クローニング・ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉからのプラスミド、例えば、ｃｏｌＥｌ，ｐＣＲｌ，ｐＢＴ３２２，ｐＭＢ９，ｐＵＣ，ｐＫＳＭ、及びＲＰ４を含む。原核ベクターは、ファージＤＮＡの誘導体、例えば、Ｍｌ３、及び他の繊維状１本鎖ＤＮＡファージを含む。酵母において有用なベクターの例は、２μプラスミドである。哺乳動物細胞内での発現に好適なベクターは、ＳＶ−４０、アデノウィルス、レトロウィルス由来ＤＮＡ配列の周知の誘導体、及び先に記載されるような、機能的哺乳動物ベクターと、機能的プラスミド及びファージＤＮＡとの組換えから得られるシャトル・ベクターを含む。
【００４８】
追加の真核発現ベクターは本分野において知られている｛例えば、PJ. Southern & P.Berg, J. Mol. Appl. Genet, 1 : 327-341 (1982); Soubramani et al., Mol. Cell. Biol, 1 : 854-864 (1981); Kaufinann & Sharp,“Amplification And Expression of Sequences Cotransfected with a Modular Dihydrofolate Reductase Complementary DNA Gene,”J. Mol. Biol, 159 : 601-621 (1982); Kaufhiann & Sharp, Mol. Cell. Biol, 159 : 601-664 (1982); Scahill et al.,“Expression And Characterization Of The Product OfA Human Immune Interferon DNA Gene In Chinese Hamster Ovary Cells,”Proc. Nat'l Acad. ScL USA, 80 : 4654-4659 (1983); Urlaub & Chasin, Proc. Nat'l Acad. ScL USA, 77 : 4216-4220, (1980)を参照のこと（これらの全てを本明細書中に援用する）｝。
【００４９】
本発明において有用な発現ベクターは、発現されるべきＤＮＡ配列又は断片に作用可能な状態で連結された少なくとも１つの発現制御配列を含む。制御配列は、クローン化されたＤＮＡ配列の発現を制御し、かつ、調節するために、ベクター内に挿入される。有用な発現制御配列の例は、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ファージ・ラムダの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコート・タンパク質の制御領域、酵母の解糖プロモーター、例えば、３−ホスホグリセレート・キナーゼのプロモーター、酵母酸ホスファターゼのプロモーター、例えば、Ｐｈｏ５、酵母アルファ−接合因子のプロモーター、及びポリオーマ、アデノウィルス、レトロウィルス、及びシミアン・ウィルス由来のプロモーター、例えば、初期及び後期プロモーター又はＳＶ４０、並びに原核又は真核細胞及びそれらのウィルス又はそれらの組換え体の遺伝子の発現を制御することが知られている他の配列である。
【００５０】
本発明は、先に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞をも提供する。本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、ハイブリドーマ以外の細胞系内で発現されうる。本発明に係るポリペプチドをコードする配列を含む核酸は、好適な哺乳動物宿主細胞の形質転換のために有用であることができる。
【００５１】
特に好ましい細胞系は、高レベルの発現、着目タンパク質の構成的発現、及び宿主タンパク質からの最小汚染に基づいて選択される。発現のための宿主として利用されうる哺乳動物細胞系は、本分野において周知であり、そして非制限的に、Chinese Hamster Ovary (CHO) 細胞、Baby Hamster Kidney (BHK)細胞、そして他の多くのものを含む、不死化細胞系を含む。好適な追加の真核細胞は、酵母及び他の真菌を含む。有用な原核宿主は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＧ−９３６、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１，Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０，Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｘ１７７６，Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ２２８２，Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１、及びＭＲＣ１、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、例えば、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、及びストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）を含む。
【００５２】
本発明の組換え宿主細胞は、抗体の発現を許容する条件下で細胞を培養し、そして宿主細胞又は宿主細胞の取り囲む培地から抗体を精製することにより、抗体を製造するために使用されうる。組換え宿主細胞における分泌のための発現された抗体のターゲッティングは、着目の抗体コーディング遺伝子の５′末端に、シグナル又は分泌リーダー・ペプチド−コーディング配列を挿入することにより容易化される｛Shokri et al., (2003) Appl. Microbiol Biotechnol. 60 (6) : 654-664, Nielsen et al., Prot. Eng., 10 : 1-6 (1997), von Heinje et al., Nucl. Acids Res., 14 : 4683-4690 (1986)（これらの全てを本明細書中に援用する）を参照のこと｝。上記分泌リーダー・ペプチド要素は、原核又は真核配列のいずれかから得られうる。したがって、好適には、宿主細胞の細胞質ゾルから外へのポリペプチドの移動、及び培地中への分泌を指令するために、当該ポリペプチドのＮ末端に連結されたアミノ酸である分泌リーダー・ペプチドが使用される。
【００５３】
本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、追加のアミノ酸残基に融合されうる。このようなアミノ酸残基は、例えば、単離を容易にするためのペプチド・タグであることができる。特異的な臓器又は組織に対する抗体の帰巣のための他のアミノ酸残基も、企図される。
【００５４】
他の態様においては、本発明は、治療の必要な哺乳動物に、本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の治療的に有効な量を投与することにより医学的症状を治療する方法を提供する。治療的に有効とは、所望の治療効果を作り出す、例えば、チロシン・キナーゼ活性を阻害するために有効な量を意味する。
【００５５】
好ましい態様においては、本発明は、治療の必要な哺乳動物に本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の治療有効量を投与することにより腫瘍増殖を低減し又は血管新生を阻害する方法を提供する。特定のメカニズムに拘束されることを意図しないが、本発明に係る方法による治療されうる症状は、例えば、腫瘍増殖又は病理学的血管新生がＶＥＧＦＲ傍分泌及び／又は自己分泌ループを介して刺激されるようなものを含む。
【００５６】
腫瘍細胞の低減に関しては、このような腫瘍は、原発性腫瘍及び転移性腫瘍、並びに難治性腫瘍を含む。難治性腫瘍は、化学療法剤単独、抗体単独、放射線単独又はそれらの組合せによる処置の如き他の処置形態に応答しないか又はそれに対し抵抗性である腫瘍を含む。難治性腫瘍は、上記剤による処置により抑制されるようであるが、処置が中断した後、５年以内、しばしば１０年以内又はそれより遅れて再発する腫瘍をも包含する。
【００５７】
本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、ＶＥＧＦＲ−Ｉを発現する腫瘍の治療に有用である。このような腫瘍は、それらの環境中に存在するＶＥＧＦに対して特徴的に感受性であり、そして自己分泌刺激ループにおいてＶＥＧＦをさらに生産し、そしてＶＥＧＦにより刺激されうる。それゆえ、上記方法は、血管形成されていないか又は未だ実質的に血管形成されていない固形又は非固形腫瘍の治療に有効である。
【００５８】
治療されうる固形腫瘍の例は、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、神経膠腫、及びリンパ腫を含む。このような腫瘍のいくつかの例は、類表皮腫瘍、扁平上皮腫瘍、例えば、頭部及び首部腫瘍、結腸直腸腫瘍、前立腺腫瘍、乳腫瘍、肺腫瘍（小細胞及び非小細胞肺腫瘍を含む）、膵臓腫瘍、甲状腺腫瘍、卵巣腫瘍、及び肝臓腫瘍を含む。他の例は、Ｋａｐｏｓｉ肉腫、ＣＮＳ新形成、神経芽腫、毛細血管芽腫、髄膜腫、及び脳転移、メラノーマ、胃腸及び腎臓癌及び肉腫、横紋筋肉腫、神経膠芽腫、好ましくは神経膠芽腫多形、及び平滑筋肉腫を含む。本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体がそれにとって有効であるところの血管形成される皮膚癌の例は、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、及び悪性ケラチノサイトの増殖を抑制することにより治療されうる皮膚癌、例えば、ヒト悪性ケラチノサイトを含む。
【００５９】
非固形腫瘍の例は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、赤血球性白血病又は単球性白血病を含む。リンパ腫のいくつかの例は、Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ及び非Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓリンパ腫を含む。
【００６０】
血管新生の抑制に関して、本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、血管形成された腫瘍又は新形成、又は過剰な血管新生を特徴とする血管新生疾患をもつ患者を治療するために有効である。このような腫瘍及び新形成は、例えば、悪性腫瘍及び新形成、例えば、芽腫、癌腫又は肉腫、高く血管性の腫瘍及び新形成を含む。本発明に係る方法により処置されうる癌は、例えば、脳、尿生殖器管、リンパ系、胃、腎臓、結腸、喉頭、並びに肺及び骨の癌を含む。非制限的な例は、さらに、類表皮腫瘍、扁平上皮腫瘍、例えば、頭部及び首部の腫瘍、結腸直腸腫瘍、前立腺腫瘍、乳腫瘍、肺腫瘍（肺腺癌、及び小細胞及び非小細胞肺腫瘍を含む）、膵臓腫瘍、甲状腺腫瘍、卵巣腫瘍、及び肝臓腫瘍を含む。上記方法は、血管形成された皮膚癌、例えば、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、及び悪性ケラチノサイト、例えばヒト悪性ケラチノサイトの増殖を抑制することにより治療されうる皮膚癌の治療にも有用である。治療されうる他の癌は、Ｋａｐｏｓｉ’ｓ肉腫、ＣＮＳ新形成（神経芽腫、毛細血管芽腫、骨髄腫及び脳転移）、メラノーマ、胃腸及び腎臓癌腫及び肉腫、横紋筋肉腫、神経膠芽腫、例えば、神経膠芽腫多形、及び平滑筋肉腫を含む。
【００６１】
例えば、炎症及び／又は血管形成を含む過剰な血管新生を特徴とする病理学的血管新生症状の非制限的な例は、アテローム性動脈硬化症、リウマチ様関節炎（ＲＡ）、新生血管緑内障、増殖性網膜症、例えば、増殖性糖尿病性網膜症、黄斑変性、血管腫、血管繊維腫、及び乾癬を含む。非新形成性血管新生疾患の他の非制限的な例は、早熟の網膜症（水晶体後繊維増殖症）、角膜移植拒絶、インスリン依存性真性糖尿病、多発性硬化症、重症筋無力症、クローン病、自己免疫性腎炎、原発性胆汁閉塞性肝硬変、乾癬、急性膵臓炎、同種移植拒絶、アレルギー性炎症、接触皮膚炎及び遅延過敏反応、炎症性腸疾患、敗血性ショック、骨粗しょう症、骨関節炎、ニューロン炎症により誘導される認知欠陥、ウスラーウェーバー症候群、再狭窄、及び真菌、寄生虫、及びウィルス感染、例えば、サイトメガロウィルス感染である。
【００６２】
本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体により治療されうる医学的症状の確定は、十分に当業者の能力及び知識の範囲内にある。例えば、臨床的に有意な新形成又は血管形成疾患を患っているか又は臨床的に有意な兆候に発展するリスクのあるヒト患者は、本発明に係るＶＥＧＦ受容体抗体の投与に好適である。臨床医は、例えば、臨床試験、身体検査、及び医学的／家族の病歴により、個体が上記治療の候補であるか否かを、容易に決定しうる。
【００６３】
本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、腫瘍又は病理学的症状の進行を妨害し、抑制し、又は低減させるために十分な量で、腫瘍又は血管形成関連病理学的症状を患う患者に、治療的処置のために、投与されうる。進行は、例えば、腫瘍又は病理学的症状の成長、浸潤、転移、及び／又は再発を含む。この使用のために有効な量は、当該疾患の重度、及び患者自身の免疫系の一般状態に依存するであろう。投薬スケジュールも、患者の病的状態及び状況に伴って変化するであろうし、そして典型的には、１回のボーラス投与又は連続輸注から、１日当り多数回投与まで（例えば、４〜６時間毎）に亘るであろうし、又は処置内科医及び患者の状態により指示されるであろう。しかしながら、本発明は特定の投与量に限定されることはないことに留意すべきである。
【００６４】
他の態様においては、１以上の他の剤とともに、本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体を投与することによる医学的症状の治療方法を提供する。例えば、本発明の１の態様は、抗新形成又は抗血管形成剤とともに、本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体を投与することにより、医学的症状を治療する方法を提供する。抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、抗新形成剤又は抗血管形成剤の内の１以上に化学的又は生合成的に連結されうる。
【００６５】
好適な抗新形成剤のいずれか、例えば、化学療法剤又は放射線が使用されうる。化学療法剤の例は、非制限的に、シスプラチン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、パクリタキセル、イリノテカン（ＣＰＴ−II）、トポテカム又はそれらの組合せを含む。抗新形成剤が放射線であるとき、放射線源は、処置される患者に対して外部（外部ビーム放射線治療−ＥＢＲＴ）又は内部（近接照射療法−ＢＴ）のいずれかであることができる。
【００６６】
さらに、本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、腫瘍増殖又は血管形成に関連する他の受容体を中和する抗体とともに投与されうる。このような受容体の１例は、ＶＥＧＦＲ−２／ＫＤＲである。１の態様においては、本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、ＶＥＧＦＲ−２に特異的に結合する受容体アンタゴニストとともに使用される。特に好ましいのは、ＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインに結合し、そしてそのリガンド、例えばＶＥＧＦ（Ａ），ＶＥＧＦ−Ｃ，ＶＥＧＦ−Ｄ、又はＶＥＧＦ−Ｅの内のいずれか１つにより結合をブロックする抗原結合性タンパク質である。
【００６７】
このような受容体の他の例は、ＥＧＦＲである。本発明の１の態様においては、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、ＥＧＦＲアンタゴニストとともに使用される。ＥＧＦＲアンタゴニストは、ＥＧＦＲ又はＥＧＦＲのリガンドに結合し、そしてＥＧＦＲがそのリガンドに結合することを阻害する抗体であることができる。ＥＧＦＲのリガンドは、例えば、ＥＧＦ，ＴＧＦ−ｃｅアンフィレギュリン、ヘパリン結合性ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ）、及びベータレキュルリン（ｂｅｔａｒｅｃｕｌｌｕｌｉｎ）を含む。ＥＧＦとＴＧＦ−αは、ＥＧＦＲ仲介刺激をもたらす主要な内因性リガンドであると考えられている。但し、ＴＧＦ−αは、血管形成の促進においてより強力であることが示されている。ＥＧＦＲアンタゴニストはＥＧＦＲの細胞外部分に外部から結合することができ、これは、リガンドの結合を阻害することもしないこともでき、又はチロシン・キナーゼ・ドメインに内部から結合することができる。ＥＧＦＲに結合するＥＧＦＲアンタゴニストの例は、非制限的に、生物学的分子、例えば、ＥＧＦＲに特異的な抗体（及びその機能的等価物）、及び小分子、例えば、ＥＧＦＲの細胞質ドメインに直接作用する合成キナーゼ阻害剤を含む。
【００６８】
腫瘍形成に関連する成長因子受容体の他の例は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦＲ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦＲ）、神経成長因子（ＮＧＦＲ）、及び線維芽細胞成長因子（ＦＧＦＲ）である。
【００６９】
さらに他の態様においては、本発明は、１以上の好適なアジュバント、例えば、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０、及びＩＬ−１３）又は他の免疫刺激剤とともに本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体を投与することにより医学的症状を治療する方法を提供する。例えば、Larrivee et al.,前掲を参照のこと。
【００７０】
併用療法においては、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、他の剤並びにそのいずれかの組合せによる療法を開始する前、間、又は後に、すなわち、抗新形成剤療法の前及び間、前及び後、間及び後、又は前、間及び後に、投与されうる。例えば、本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、放射線療法を開始する、１〜３０日前、好ましくは３〜２０日前、より好ましくは５〜１２日前に投与されうる。しかしながら、本発明は、特定の投与スケジュールのいずれにも限定されない。投与される他の剤の投与量は、例えば、剤のタイプ、処置される医学的症状のタイプ及び重度、及び剤の投与経路を含む多数の要因に依存する。しかしながら、本発明は、特定の投与量のいずれにも限定されない。
【００７１】
本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体を投与するために、そして場合により、抗新形成剤及び／又は他の受容体のアンタゴニストを同時投与するために好適な方法又は経路のいずれをも使用しうる。投与経路は、例えば、経口、静脈内、腹膜内、皮下、又は筋肉内投与を含む。しかしながら、本発明は、特定の投与方法又は経路のいずれにも限定されないことを強調しておく。
【００７２】
本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、受容体に特異的に結合し、そしてリガンド−毒素インターナライゼーションに従って毒性かつ致死性の荷重をデリバリーする、コンジュゲートとして投与されうることに注目のこと。
【００７３】
本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、予防又は治療の目的をもって哺乳動物において使用されるとき、医薬として許容される担体をさらに含む組成物の形態で投与されるであろうことが理解される。好適な医薬として許容される担体は、例えば、水、生理食塩水、リン酸塩バッファー生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、並びにそれらの組合せの内の１以上を含む。医薬として許容される担体は、微量の、補助物質、例えば、水和又は乳化剤、保存料又はバッファーであって結合性タンパク質の保存寿命又は有効性を強化するものをさらに含むことができる。注射用組成物は、本分野において周知であるように、哺乳動物への投与後に活性成分の速い、持続性の又は遅延性の放出を提供するために配合されうる。
【００７４】
本発明に係るヒト抗体は、ヒトへの投与のために特に有用であるけれども、それらは、他の哺乳動物にも投与されうる。用語「哺乳動物」とは、本明細書中に使用するとき、非制限的に、ヒト、実験動物、家庭内ペット、及び農場動物を含むと意図される。
【００７５】
本発明は、本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の治療有効量を含む腫瘍増殖及び／又は血管形成阻害用キットをも含む。キットは、例えば、腫瘍形成又は血管形成に関連する他の成長因子受容体（例えば、先に記載した、ＶＥＧＦＲ−２／ＦＫＤＲ，ＥＧＦＲ，ＰＤＧＦＲ，ＩＧＦＲ，ＮＧＦＲ，ＦＧＦＲ、等）の好適なアンタゴニストのいずれかをさらに含むことができる。あるいは又はさらに、本発明に係るキットは、抗新形成剤をさらに含むことができる。本発明において好適な新形成剤の例は、本明細書中に既に記載した。本発明に係るキットは、その例も先に記載したアジュバントをさらに含むことができる。
【００７６】
他の態様において、本発明は、インビボ又はインビトロにおいて本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体を用いた検査又は診断方法を提供する。このような方法においては、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、ターゲット又はレポーター成分に連結されることができる。
【実施例】
【００７７】
実施例
以下の実施例は、慣用方法、例えば、ベクター及びプラスミドの構築、上記ベクター及びプラスミド内へのポリペプチド・コーディング遺伝子の挿入、又は宿主細胞内へのプラスミドの導入において使用されるものの詳細な説明は含まない。このような方法は、当業者に周知であり、そしてSambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T.(1989), Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press（これを本明細書中に援用する）を含む多数の刊行物中に記載されている。
【００７８】
材料
試薬と化学物質は、特にことわらない限り、Ｓｉｇｍａ（St. Louis, MO）から購入した。ヒトＶＥＧＦ１６５と可溶性組換えヒトＶＥＧＦＲ−Ｉアルカリ・ホスファターゼ（ｒｈｕ ＶＥＧＦＲ−Ｉ ＡＰ）タンパク質を、安定的にトランスフェクトされた細胞内で発現させ、そして当業者に知られた手順に従って細胞培養上清から精製した（Tessler, J. Biol. Chem., 269 : 12456-12461 (1994)（これを本明細書中に援用する））。ＰＩＧＦ及び可溶性組換えＶＥＧＦＲ−Ｉ Ｆｃ（ｒｈｕ ＶＥＧＦＲ−Ｉ Ｆｃ）タンパク質を、（R&D Systems Inc. Minneapolis, MN）から購入した。細胞培養容器及びアッセイ・プレートは、（BD Biosciences, Bedford, MA）から購入した。
【００７９】
細胞系
ヒト乳癌細胞系ＤＵ４４７５，ＭＤＡ−ＭＢ−２３１，ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、並びにマウス、メラノーマ細胞系Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ ８．６５３及びＮＳＯを、American Type Tissue Culture Collection (Manassas, VA）から得た。Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ ８．６５３ Ｂｃｌ／２トランスフェクト体細胞系を先に記載されたようにハウス内で創製した（Ray S, Diamond B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91 : 5548-51, 1994）。腫瘍細胞を、１０％ ＦＣＳ（Hyclone, Logan, UT）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（Invitrogen/Life Technologies, Inc., Rockville, MD）中で維持した。ブタ大動脈内皮ＶＥＧＦＲ−Ｉ発現細胞系は、Dr.L. Claesson-Welsh, Uppsala Universityにより提供され、そして１０％ ＦＣＳ（Hyclone, Logan, UT）を含有するＦ１２培地（Invitrogen/Life Technologies, Inc., Rockville, MD）中で培養された。全ての細胞を、加湿、５％ ＣＯ2雰囲気中３７℃で維持した。
【００８０】
実施例１：抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の生成
ヒト抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉモノクローナル抗体（本明細書中、「抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体」という）を、ヒト免疫グロブリン・ガンマ重鎖及びカッパ軽鎖を作り出すＫＭトランスジェニック・マウス（Medarex, San Jose, Calif）を用いて標準的なハイブリドーマ技術（Harlow & Lane, ed ., Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 211-213 (1998)（これを本明細書中に援用する））により作製した。ＫＭマウスに、完全フロイント・アジュバント中のＶＥＧＦＲ−Ｉ断片結晶化（Ｆｃ）を皮下（ｓ．ｃ．）で免疫化した。動物に、融合前、不完全フロイント・アジュバント中の同一ＶＥＧＦＲ−Ｉタンパク質を、３回腹膜内（ｉ．ｐ．）でブーストした。動物を、リン酸塩バッファー溶液（ＰＢＳ）中ＶＥＧＦＲ−Ｉタンパク質２５ミリグラムの最終ｉ．ｐ．ブーストを受容する前１ヶ月間、休ませた。４日後、脾臓細胞を、上記免疫化されたマウスから収獲し、そしてポリエチレン・グリコール（ＰＥＧ，ＭＷ：１４５０kD）を用いてＰ３−Ｘ６３−Ａｇ ８．６５３ Ｂｃｌ−２トランスフェクト体形質細胞腫細胞と融合させた。融合後、細胞を、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を補ったＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン、チミジン）培地中に再懸濁させ、そしてハイブリドーマ細胞の樹立のためにウェル当り２００マイクロリッターの密度で９６ウェル・プレートに小分けした。融合後６日目に、培地１００マイクロリッターを吸引し、そして新鮮培地１００マイクロリッターで置換した。
【００８１】
実施例２Ａ：実施例１からの抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体はＶＥＧＦＲ−Ｉに結合し、そしてＶＥＧＦＲ−Ｉがそのリガンドに結合することを阻害する
ａ．ＶＥＧＦＲ−Ｉ結合及びブロッキング・アッセイ
融合後１０〜１２日目に、ハイブリドーマを、ＥＬＩＳＡ−ベースの結合及びブロッキング・アッセイにおいて、抗体産生及びｒｈｕ ＶＥＧＦＲ−Ｉタンパク質との培養上清の特異的結合活性についてスクリーニングした。ポジティブなハイブリドーマを、モノクローナル・ハイブリドーマの樹立のために限界希釈により３回、継代培養した。
【００８２】
特に、ハイブリドーマ上清又は精製抗体を、５％ ＦＢＳ及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（ＥＬＩＳＡバッファー）中で希釈し、そして３０分間、ｒｈｕ ＶＥＧＦＲ−Ｉ ＡＰ又はＡＰコートされた９６ウェル・マイクロタイター・プレート内でインキュベートした。プレートを、上記ＥＬＩＳＡバッファーで洗浄し、そして３０分間、ヤギ抗−マウスＩｇＧ−ホースラデッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート（Bio Sourse International, Camarillo, CA）とともにインキュベートした。ＴＭＢ（３，３′，５，５′−テトラ−メチルベンジジン）基質（Kierkegaard and Perry Lab, Inc., Gaithersburg, MD）を、製造者の指示に従って発色のために使用した。４５０ナノメーター（nm）における吸光度を、抗体の結合活性の定量のために読んだ。抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体を産生するハイブリドーマの同定のために、ハイブリドーマ上清を、１時間ＶＥＧＦＲ−Ｉ ＡＰと予めインキュベートした。混合物を、１時間、ＶＥＧＦ又はＰＩＧＦコートされた９６ウェル・マイクロタイター・プレート内でＥＬＩＳＡバッファーとともにインキュベートした。ＡＰのためのＰＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニル・ホスフェート）基質を、製造者の指示に従って発色のために使用した。ＶＥＧＦＲＩのＶＥＧＦ又はＰＩＧＦへの結合の定量のために４０５nmにおける吸光度を読んだ。光学密度（ＯＤ）値を、マイクロタイター・プレート・リーダー（Molecular Device Corp., Sunnyvale, CA）上で読んだ。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ３ソフトウェア（Graph Pad Software, Inc., San Diego, CA）を用いて、抗体のＥＤ５０及びＩＣ５０を分析した。
【００８３】
図３は、「６Ｆ９」、「１３Ｇ１２」、「１５Ｆ１１」、及び「１８Ｆ１」と命名されたハイブリドーマから産生された精製抗体の結合活性を示す。これらの抗体は、ＥＬＩＳＡ−ベースの結合アッセイにおいて、０．１〜０．３nMのＥＤ５０をもつ結合活性を示した。図４と５は、それぞれ、クローン６Ｆ９，１３Ｆ１２，１５Ｆ１１，１８Ｆ１が、０．４〜０．８nMのＩＣ５０をもってＶＥＧＦＲ−Ｉへの、ＰＩＧＦの結合そして０．７〜０．８nMのＩＣ５０をもってＶＥＧＦＲ−ＩへのＶＥＧＦの結合を有効にブロックしたことを示す。上記抗体の結合及びブロッキング特性を以下の表４にまとめる。
【００８４】
【表５】
【００８５】
ｂ．抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体のアフィニティーの計測
抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体クローン６Ｆ９，１３Ｆ１２，１５Ｆ１１，１８Ｆ１のアフィニティーを、製造者により提供された手順に従ってＢＩＡｃｏｒｅ ２０００（Pharmacia, Piscataway, NJ）を用いてプラズモン共鳴技術により測定した。抗体の動態分析を、低密度で、センサー表面上にＶＥＧＦＲ−Ｉの組換え細胞外ドメインを固定化することにより実施した。（Ｋon）速度と解離（Ｋoff）速度を、製造者により提供されたＢＩＡａｖａｌｕａｔｉｏｎ ２．１ソフトウェアを用いて決定した。
【００８６】
抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体クローン６Ｆ９，１３Ｆ１２，１５Ｆ１１、及び１８Ｆ１は、それぞれ、６９，１２１，７０、及び５４pMのＫD値をもって高アフィニティーを示した。上記抗体の動態を以下の表５にまとめる。
【００８７】
【表６】
【００８８】
ｃ．抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の特異性の評価
ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉに対する抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉモノクローナル抗体の特異性を測定するために、精製抗体１８Ｆ１を、ＥＬＩＳＡベースのアッセイにおいてテストした。１μｇ／mlの、組換えヒトＶＥＧＦＲ−Ｉ Ｆｃ、マウスＶＥＧＦＲ−Ｉ Ｆｃ、マウスＶＥＧＦＲ−２ Ｆｃ、又はヒトＶＥＧＦＲ−２アルカリ・ホスファターゼを、一夜４℃で９６ウェル・マイクロタイター・プレート内でＰＢＳでコートした。洗浄後、受容体コートされたプレートを、５％ Ｄｒｙ Ｍｉｌｋ及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳでブロックした。ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉに対する１次抗体１８Ｆ１、マウスＶＥＧＦＲ−Ｉに対するＭＦ１、ヒトＶＥＧＦＲ−２に対するＩＣ１１、又はマウスＶＥＧＦＲ−２に対するＤＣ１Ｏ１の逐次希釈物を、３０分間上記受容体コートされたプレート内でインキュベートした。洗浄後、３０分間上記プレート内で２次抗−１次ＨＲＰコンジュゲート抗体をインキュベートした。プレートを洗浄し、そして発色のために基質ＴＭＢ（３，３′，５，５′−テトラ−メチルベンジジン）とともにインキュベートした。４５０nmにおける吸光度を、抗体の結合活性の定量のためにＯＤ値として読んだ。データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて分析した。
【００８９】
図６Ａ−Ｄは、ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉに対するモノクローナル抗体１８Ｆ１の特異性を（図６Ａ）、そして当該抗体が、マウスＶＥＧＦＲ−Ｉ（図６Ｂ）、ヒトＶＥＧＦＲ−２（図６Ｃ）、及びマウスＶＥＧＦＲ−２（図６Ｄ）との交差反応性を有さないことを示す。結果は、抗−ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１が、その対応の受容体と厳密な結合特異性を有することを示す。
【００９０】
ｄ．ウェスタン・ブロット
集密ブタ大動脈内皮ＶＥＧＦＲ−Ｉ発現（ＰＡＥ−ＶＥＧＦＲ−Ｉ）細胞及びＢＴ４７４ヒト乳癌細胞を４８時間、血清消耗Ｆ１２培地中で培養した。次いで、当該細胞を、１時間０．１〜３７μｇ／mlの範囲の濃度で抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体クローン１８Ｆ１とともに予めインキュベートし、そしてその後、３７℃で５分間ＶＥＧＦ又はＰＩＧＦで刺激した。次いで細胞を、氷冷ＰＢＳで濯ぎ、そして溶解バッファー（５０mM ＨＥＰＥＳ １５０mM ＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、並びに１０％グリセロールであって１mMフェニルメチルスルホニル・クロリド、１０μｇ／mlアプロチニン、１０μｇ／mlロイペプチン、及び１mMナトリウム・バナデートを含むもの）中に溶解した。細胞溶解産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、そしてＩｍｍｏｂｉｌｏｎ膜（Millipore Corp. Billerica, MA）上に転移させた。転移後、ブロットを、ブロッキング溶液とともにインキュベートし、そして抗ホスホチロシン抗体（ＰＹ２０，Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）でプローブし、その後洗浄した。タンパク質含有物を、ホースラティッシュ・ペルオキシダーゼ結合２次抗体を用いて可視化し、その後化学発光を増強した（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）。抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ特異的抗体（Oncogene Research Products, San Diego, CA）を、ＶＥＧＦＲ−Ｉの再ブロットのために使用した。
抗ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の全てが、ＶＥＧＦＲ−Ｉ組換えタンパク質の１８０kD分子を認識した。
【００９１】
実施例２Ｂ：抗−ヒト抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉに特異的である
ＨｕＶＥＧＦＲ−Ｉ−Ｆｃ、マウスＶＥＧＦＲ−Ｉ−ＡＰ（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）又はｈｕＶＥＧＦＲ−２−ＡＰ（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（１００ng／ウェル）を９６ストリップ−ウェル・プレート上にコートし、そして５％ミルク／ＰＢＳでブロックした。ＶＥＧＦＲ−Ｉ又はＶＥＧＦＲ−２が結合したプレートへの、１８Ｆ１、及びその他の抗−ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体又はラット抗−マウスＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体、ＭＦ１（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｒｅｆ．１８）の結合を、先にハイブリドーマ上清スクリーニングについて記載したように評価した。但し、結合された抗体は、１８Ｆ１及び抗−ヒトＶＥＧＦＲ−２抗体ＩＣ１１に関しては、ヤギ抗−ヒト・カッパ−ＨＲＰ抗体（BioSource International, Camarillo, CA）で、又はＭＦ１に関しては、ヤギ抗−ラットＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（BioSource International）で、検出した。
【００９２】
８Ｆ１は、ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉとの特異的反応性を示したが（図３２Ａ）、マウスＶＥＧＦＲ−Ｉ（図３２Ｂ）及びヒトＶＥＧＦＲ−２（図３２Ｃ）との交差反応性は示さなかった。抗−マウスＶＥＧＦＲ−Ｉブロッキング抗体ＭＦ１も、種特異的にマウスに結合性であることが証明されたが（図３２Ｂ）、ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉには結合性でない（図３２Ａ）。
【００９３】
実施例３：抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、ＶＥＧＦＲ−Ｉ発現細胞上の天然ＶＥＧＦＲ−Ｉに結合する
ａ．フロー・サイトメトリー分析
１０6個のＰＡＥ−ＶＥＧＦＲ−Ｉ細胞のアリコートを、集密に満たない培養物から収獲し、そして氷上で１時間、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、及び０．０２％アジ化ナトリウム（染色バッファー）を含有するＰＢＳ中の、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体クローン６Ｆ９，１３Ｇ１２，Ｆ１１、及び１８Ｆ１とともにインキュベートした。１０6個のＤＵ４４７５ヒト乳癌細胞のアリコートを、集密に満たない培養物から収獲し、そして氷上で１時間、１ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．０２％アジ化ナトリウム（染色バッファー）を含有するＰＢＳ中の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体クローン１８Ｆ１とともにインキュベートした。対合したＩｇＧアイソタイプ（Jackson Immuno Research, West Grove, PA）を、ネガティブ・コントロールとして使用した。細胞を、フロー・バッファーで２回洗浄し、そして氷上３０分間、染色バッファー中のフルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体（BioSource International, Camarillo, CA）とともにインキュベートした。細胞を先のように洗浄し、そしてＥｐｉｃｓ ＸＬフロー・サイトメーター（Beckman-Coulter, Hialeah, FL）上で分析した。死んだ細胞及び残渣を、前方及び側方光散乱に基づき上記分析から除外した。平均蛍光強度単位（ＭＦＲＪ）を、ポジティブ集団のパーセンテージを乗じた平均ｌｏｇ蛍光として計算した。
【００９４】
図７は、ＰＡＥ−ＶＥＧＦＲ−Ｉ発現細胞とのクローン６Ｆ９，１３Ｇ１２，１５Ｆ１１、及び１８Ｆ１の結合反応性を示す。図８Ａと８Ｂは、それぞれ、ＰＡＥ−ＶＥＧＦＲ−Ｉ発現細胞、及びＤＵ４４７５ヒト乳癌腫とのクローン１８Ｆ１の結合反応性を示す。これらの結果は、ヒト抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体が、細胞表面上に発現された天然ＶＥＧＦＲ−Ｉに結合することを示す。
【００９５】
ｂ．表面ＶＥＧＦＲ−Ｉブロッキング・アッセイ
細胞表面上のＶＥＧＦＲ−Ｉへの125Ｉ−ＶＥＧＦの結合を、ＰＡＥ−ＶＥＧＦＲ−Ｉ発現細胞を用いて実行した。細胞を、非コート・プラスチック細胞培養プレート上で培養し、これは、125Ｉ−ＶＥＧＦの特異的結合に影響を及ぼさずに非特異的結合を低減することが分かっていた。集密細胞を、２４時間、血清−及び成長補充物質−不含ダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）ＺＦ−１２培地（Invitrogen, Carsbad, CA）中でインキュベートした。細胞を、０．０２５Ｍ ＨＥＰＥＳ及び１mg／mlウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する氷冷ＤＭＥＭ ＺＦ−１２培地で１回濯いだ。標識ＶＥＧＦの２００倍モル過剰の濃度で、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１又はコールドＶＥＧＦの逐次希釈物を、プレート内の各ウェルに添加し、そして１時間４℃でインキュベートした。洗浄後、125Ｉ−ＶＥＧＦを２ng／mlの濃度で添加し、そしてプラットフォーム・シェーカー上で２時間４℃でインキュベートした。細胞を、１mg／ml ＢＳＡ及び０．２５mM ＣａＣｌ2を含有するＰＢＳで３回洗浄し、そして１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１mg／ml ＢＳＡ、及び０．１６％ ＮａＮ3の存在下５分間インキュベートして、結合ＶＥＧＦを除去した。各ウェルの可溶性分をガンマ・カウンター内でカウントした。上記アッセイを、少なくとも３つの独立した実験において３連で実行し、そしてデータを、Ｐｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを用いて分析した。
【００９６】
図９は、天然ＶＥＧＦＲ−Ｉがブタ大動脈内皮細胞上の125Ｉ−ＶＥＧＦに結合することを劇的に妨害する抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１の強いブロッキング活性を示す。
【００９７】
実施例４：抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、ＶＥＧＦＲ−Ｉの自己リン酸化、並びにＶＥＧＦ及びＰＩＧＦに応答するＭＡＰＫ及びＡｋｔの活性化を阻害する
ａ．ＶＥＧＦＲ−Ｉリン酸化アッセイ
そのリガンドにより誘導されるＶＥＧＦＲ−Ｉの自己リン酸化の並びにそれにより得られる古典的ＭＡＲＫ、細胞外シグナル調節タンパク質キナーゼ１Ｚ／２（ＥＰＫ １Ｚ２）、及びＰＢＫ／Ａｔｋ下流シグナリング経路の活性化は、細胞の生物学的応答、例えば、増殖、運動性、生存、及び分化を仲介する。ＶＥＧＦＲ−Ｉをリン酸化し、そしてＥＲＫ１Ｚ２及びＡｋｔキナーゼ下流シグナリングを活性化する抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の能力は、ＰＡＥ−ＶＥＧＦＲ−Ｉトランスフェクト体及びＢＴ４７４乳癌細胞を用いることにより測定される）。
【００９８】
ＰＡＥ−ＶＥＧＦＲ−Ｉ及びＢＴ４７４細胞は、１００又は１５０mm2プレート内に５×１０5／ウェルの密度で播かれ、そして１８〜４８時間無血清培地中で培養される。培養基を交換した後、細胞を、１時間、３７℃で、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体クローン６Ｆ９，１５Ｆ１１、及び１８Ｆ１又はアイソタイプ対照で処理し、そしてその後、１０分間、５０ng／mlのＶＥＧＦ又は１００ng／mlのＰＩＧＦとともにインキュベートした。処理後、全細胞タンパク質抽出物を、溶解バッファー〔２０mM ＨＥＰＥＳ（pH７．４）、１０mM ＭｇＣｌ2、２mM ＭｎＣｌ2、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、及び１mM ＤＴＴ〕を用いて単離し、そして抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体（Ｃ−１７，Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）を用いて免疫沈降させた。リン酸化ＶＥＧＦＲ−Ｉのウェスタン・ブロットを、抗−ホスホ−キナーゼ抗体（ＰＹ−２０，Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）を用いて検出した。タンパク質を、発電化学発光システム（ＥＣＬ）（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）を用いて検出し、そしてＮＩＨ Ｉｍａｇｅ（National Institute of Mental Health, Bethesda, MD）を用いた濃度計により定量した。
【００９９】
ｂ．インビトロ・キナーゼ・アッセイ
ＭＡＰＫ及びＡｋｔリン酸化の評価のために、ＢＴ４７４細胞を、１８時間、無血清培地中、１２ウェル・プレート内で５×１０5／ウェルの密度で播いた。細胞を、３７℃で、１時間、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体クローン１８Ｆ１又はアイソタイプ対照で処理し、そして５〜１０分間、５０ng／mlのＶＥＧＦ又は１００ng／mlのＰＩＧＦとともにインキュベートした。細胞溶解、タンパク質単離、及びエレクトロブロッティングを実行した。膜を、１μｇ／mlの濃度で、リン酸化ｐ４４／ｐ４２ ＭＡＰキナーゼ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４，Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）又はリン酸化Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３，Cell Signaling Technology, Beverly, MA）に対する抗体とともにインキュベートし、その後、２次ＩｇＧ−ＨＲＰ（１：５０００）とともにインキュベートした。サンプルの等しいローディングを保証するために、膜を、ストリップし、そして抗−ｐ４４／ｐ４２（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）又は抗−Ａｋｔ抗体（Cell Signaling Technology, Beverly, MA）で再プローブ化した。
【０１００】
ｃ．結果
図１０〜１４に示すように、ＰＡＥ−ＶＥＧＦＲ−Ｉトランスフェクト体及びＢＴ４７４乳癌細胞における、ＶＥＧＦＲ−Ｉの有意なリン酸化及びＥＲＫ１／２及びＡｋｔシグナリングの活性化は、ＶＥＧＦ及びＰＩＧＦにより誘導された。これは、乳癌細胞と内皮細胞の両者におけるＶＥＧＦＲ−Ｉ、及び当該受容体関連下流キナーゼ・シグナリング経路の内因的活性を示唆している。図１０と１１に、それぞれ、示すように、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１による処理は、ＰＡＥ−ＶＥＧＦＲ−Ｉトランスフェクト体及びＢＴ４７４乳癌細胞において、非処理対照に比較してＶＥＧＦＲ−ＩのＰＩＧＦ又はＶＥＧＦ刺激リン酸化を有意に低下させた。図１２と１３に、それぞれ、示すように、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１５Ｆ１１及び６Ｆ９による処理も、ＰＡＥ−ＶＥＧＦＲ−Ｉトランスフェクト体細胞におけるＰＩＧＦ及びＶＥＧＦにより誘導されるＥＲＫ１／２下流シグナリングを劇的に阻害した。Ａｋｔプロテイン・キナーゼの活性化は、乳癌において細胞生存を仲介する重要な細胞内シグナリング事件である。図１４Ａと１４Ｂに、それぞれ示すように、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１による処理は、ＰＡＥ−ＶＥＧＦＲ−Ｉトランスフェクト体細胞におけるＰＩＧＦ及びＶＥＧＦにより誘導されるＥＲＫ１／２下流シグナリングを劇点に阻害した。
【０１０１】
図１５に示すように、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１は、ＢＴ４７４乳癌細胞におけるＡｋｔのＰＩＧＦ刺激リン酸化を有意にブロックした。これらの結果は、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体による処理が、乳癌細胞と内皮細胞の両者においてＶＥＧＦＲ−Ｉと下流シグナリング・キナーゼ経路の活性化を阻害するために有効であることを証明する。
【０１０２】
実施例５：抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、乳腫瘍細胞のインビトロ増殖をブロックする
腫瘍低酸素症は、悪性進行の増強、侵略性の増加、及び化学療法剤耐性に関連する。低酸素症腫瘍細胞は、ＶＥＧＦＲ−Ｉを含むさまざまな遺伝子発現のアップレギュレーションによる生存及び増殖のためのシグナリング経路を活性化する生物学的応答を経験する（Harris AL. Nat Rev Cancer. 2 : 38-47, 2002）。
【０１０３】
細胞増殖アッセイ
ＤＵ４４７５癌腫細胞を、１８時間無血清培地中９６ウェル・プレート内で５×１０3／ウェルの密度で播き、そしていくつかのケースにおいて、１００nMのデスフェロキサミンでさらに５時間処理した。腫瘍細胞増殖に対する抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の阻害効果を、４８時間、５０ng／mlのＶＥＧＦ又は２００ng／mlのＰＩＧＦの存在下、３，１０、及び３０μｇ／mlの投与量において、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体クローン６Ｆ９，１３Ｇ１２，１５Ｆ１１、及び１８Ｆ１とともに細胞をインキュベートすることにより測定した。次いで、生存細胞を、Ｃｏｕｌｔｅｒサイトメーター（Coulter Electronics Ltd. Luton, Beds, England）を用いて３連でカウントした。各実験を３連で実行した。
【０１０４】
低酸素症擬似剤デスフェロキサミンで予め処理されたＤＵ４４７５腫瘍細胞の増殖速度は、ＶＥＧＦ又はＰＩＧＦのいずれかの刺激に応答して約２倍高められた。図１６と１７に、それぞれ、示すように、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体による処理は、投与量に応答して、ＤＵ４４７５乳癌細胞のＶＥＧＦ及びＰＩＧＦ刺激増殖を有効に低下させた。図１８Ａと１８Ｂは、それぞれ、ＤＵ４４７５乳癌細胞のＶＥＧＦ及びＰＩＧＦ刺激増殖の細胞カウント数に対する、抗体クローン１８Ｆ１の抗体濃度を、プロットする。ＩＣ５０値で表される抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体によるインビトロにおけるＰＩＧＦ誘導ＤＵ４４７５細胞増殖の阻害を、以下の表６にまとめる。
【０１０５】
【表７】
【０１０６】
実施例６Ａ：抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、乳腫瘍異種移植片の成長を抑制する
ヒト乳癌異種移植片の処理
ヒト抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の抗腫瘍効果を、ヒト異種移植片乳腫瘍モデルにおいて試験した。
無胸腺ヌード・マウス（Charles River Laboratories, Wilmington, MA）に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Collaborative Research Biochemicals, Bedford, MA）中で混合された２×１０6個のＤＵ４４７５細胞又は５×１０6個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を、左脇腹領域に皮下注射した。上記ＤＵ４４７５及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１モデルにおいて、腫瘍は、約２００mm3の大きさに達するように放置され、そしてその後、マウスを、群当り１２〜１６匹の動物から成る群に無作為に分けた。動物は、各週３回、０．５mg（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）又は１mg（ＤＵ４４７５）の投与量で、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体クローン６Ｆ９，１５Ｆ１１、又は１８Ｆ１のｉ．ｐ．投与を受けた。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５モデルにおいては、腫瘍細胞を、マウスの乳房のふくらんだ領域内に皮下移植した。腫瘍が成長して約２００mm3の大きさに達した後、マウスを、群当り１５匹の動物の群に無作為に分け、そして週当り３回１８Ｆ１抗体０．５mg／投与を腹膜内投与した。対照群内のマウスは、等体積の生理食塩水溶液を受容した。動物の処理を、実験の期間、続けた。腫瘍を、週２回カリパスで計測した。腫瘍体積を、以下の式〔π／６（ｗ１×ｗ２×ｗ２）〕｛式中、ｗ１は最大腫瘍直径を表し、そしてｗ２は最小腫瘍直径を表す。｝を用いて計算した。
【０１０７】
図１９Ａと１９Ｂに示すように、週３回の１mg／投与の投与量における抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体６Ｆ９，１５Ｆ１１，１３Ｆ１２、及び１８Ｆ１の全身投与は、ＤＵ４４７５異種移植片の腫瘍増殖の統計的に有意な抑制を導いた（ｐ＜０．０５）。図２０Ａ，２０Ｂ、及び２０Ｃに、それぞれ、示すように、週３回の０．５又は１mg／投与の投与量における抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１の全身投与は、ＤＵ４４７５，ＭＤＡ−ＭＢ−２３１，ＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片の腫瘍増殖の統計的に有意な抑制を導いた（ＡＮＯＶＡ ｐ＜０．０５）。図２１Ａと２１Ｂに示すように、週２回の２０又は４０mg／kgの投与量における癌細胞増殖の抑制のためのヒトＶＥＧＦＲ−Ｉに対する抗体クローン１８Ｆ１、及び腫瘍血管形成を抑制するためのマウスＶＥＧＦＲ−Ｉに対するクローンＭＦ１による処理は、いずれかの抗体単独に比較したとき、ＤＵ４４７５及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片モデルにおける腫瘍増殖のより強い抑制をもたらした（ｐ＜０．０５）。これらの結果は、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体による癌細胞増殖の直接的促進及び腫瘍血管形成の調節におけるＶＥＧＦＲ−Ｉのインビボにおける機能の遮断が、異種移植片モデルにおけるＶＥＧＦＲ−Ｉボジティブ乳腫瘍の増殖を抑制するために有効であることを証明するものである。
【０１０８】
実施例６Ｂ：抗−ヒト抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、乳癌細胞のインビトロ増殖をブロックする
ＤＵ４４７５癌腫細胞（２×１０4／ウェル）を、１８時間無血清培地中２４ウェル・プレートに播き、そしてその後、さらに６時間、低酸素症擬似剤デスフェリオキサミン（Ｓｉｇｍａ）で処理した。抗−ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１の逐次希釈物を、３連で上記プレートに添加し、そして４８時間、５０ng／mlのＶＥＧＦ−Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）又は２００ng／mlのＰＩＧＦの存在下でインキュベートした。全細胞数（結合、及び懸濁液中）を、Ｃｏｕｌｔｅｒ細胞カウンター（Coulter Electronics Ltd., England）を用いて各ウェルについて測定した。
【０１０９】
ＩＭＣ−１８Ｆ１の処理は、ＤＵ４４７５乳癌細胞のＶＥＧＦ−Ａ及びＰＩＧＦ刺激増殖を有意にブロックした（それぞれ、図３１Ａと３１Ｂ；推定ＩＣ５０：３０〜５０nM）。アイソタイプ対照抗体は、細胞増殖に対して効果を有していなかった。したがって、１８Ｆ１は、腫瘍細胞増殖／生存のＶＥＧＦＲ−Ｉリガンド誘導促進を抑制した。
【０１１０】
実施例７：抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、結腸癌細胞のＶＥＧＦ−Ａ及びＶＥＧＦ−Ｂ刺激コロニー形成を阻害する
１０％ ＦＢＳ及び１％アガロースを含有する１mL ＤＭＥＭ培地（Cambrex Corporation, East Rutherford, NJ）を、６つのウェル・プレートの各ウェルに入れた。無血清培地中のＨＴ−２９ヒト結腸癌腫細胞を、１時間、６６nMの１８Ｆ１又は対照ＩｇＧで処理し、その後、さらに４時間、１０ng／mLのＶＥＧＦ−Ａ又は５０ng／mlのＶＥＧＦ−Ｂで処理した。処理された細胞を、０．５％アガロース並びに適当な抗体及び／又はリガンドを含有する１０％ ＦＢＳ ＤＭＥＭ １mLと混合した。２５０個の細胞を含有する上記懸濁液１mLを、上記１％アガロース基底層の上面に、各ウェル内で、プレーティングした。２日後、抗体及び／又はリガンドを含有する追加の培地を、上記ウェルに添加して、アガロースを水和される状態に保った。細胞を３７℃で１４日間放置して増殖させた。その後、直径５０μｍ超のコロニーを、解剖顕微鏡を用いてカウントした。ｈｉＳａｔ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｖ２．０３，GraphPad Software, San Diego, CA）を用いて、統計分析を実施した。
【０１１１】
コロニーの数と大きさは、完全培地のみ中での非処理細胞に比較して、細胞がＶＥＧＦ−Ａ又はＶＥＧＦ−Ｂで処理されたウェル内で有意に増加した。図２２に示すように、１８Ｆ１での処理は、リガンドによる刺激の不存在下、ベース活性に比較して、リガンド誘導コロニー形成を完全に阻害した（ｐ＜０．０３）（図２２）。したがって、接着細胞と非接着細胞の両者に関して、１８Ｆ１は、腫瘍細胞の生存と増殖を抑制する能力を有している。
【０１１２】
実施例８：抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、結腸癌細胞のＶＥＧＦ−Ａ及びＶＥＧＦ−Ｂ誘導転移及び侵入を阻害する
ＨＴ−２９細胞（２．５×１０4）又はＳＷ４８０細胞（１．５×１０4）を、２４ウェルＭＡＴＲＩＧＥＬTMコート（ＨＴ−２９）又は非コート（ＳＷ４８０）８．０μｍ多孔サイズ膜挿入物（Becton Dickinson Labware, Bedford, MA）の上部表面における抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１（６６nM）とともに１％ ＦＢＳを含有する培地中でインキュベートした。上記挿入物を、４８時間１０ng／mL ＶＥＧＦ−Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）又は５０ng／mL ＶＥＧＦ−Ｂ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有する低部チャンバー内に入れた。上記挿入物の上部チャンバーに残存する細胞を、綿棒で除去した。上記挿入物の下側に移動する細胞を、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ（Harleco, Gibbstown, NJ）で染色し、そして１００倍の倍率で１０個の無作為の視野内でカウントした。ＩｎＳｔａｔ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｖ２．０３，GraphPad Software, San Diego, CA）を用いて統計分析を実施した。
【０１１３】
図２３Ａと２３Ｂに示すように、ＶＥＧＦ−Ａ又はＶＥＧＦ−Ｂは、非コート膜を通ってリガンドに向かうＨＴ−２９細胞の移動を誘導した。図２４Ａと２４Ｂに示すように、上記リガンドは、ＭＡＴＲＩＧＥＬTMコート膜を通ってのＳＷ４８０細胞の侵入をも誘導した。１８Ｆ１は、リガンドによる刺激の不存在下、ベース活性に比較して、ＶＥＧＦＲ−Ｉリガンド誘導転移及び侵入を完全にブロックした（ｐ＜０．０５．図２３と２４）。したがって、腫瘍細胞増殖及び生存に対する負の効果に加えて、１８Ｆ１は、腫瘍細胞の侵入及びその後の転移を抑制する手段を提供しうる。
【０１１４】
実施例９：抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ特異的抗体による処理は、ＶＥＧＦＲ−Ｉ発現性ヒト異種移植片腫瘍のインビボにおける増殖を抑制する
雌の無胸腺ｎｕ／ｎｕマウス６週齢に、ＭＡＴＲＩＧＥＬTM（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で１：１に希釈された、培地中のヒト腫瘍細胞系を含有する０．４mL体積の懸濁液を、側背表面上に皮下注射した。異種移植片モデルにおいて使用された細胞系（カッコ内に細胞投与量を示す（１０6細胞／マウス））は、ヒト結腸癌細胞系ＤＬＤ−Ｉ（５）、ＧＥＯ（５）、及びＨＴ−２９（５）；ヒト乳癌細胞系ＤＵ４４７５（２）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（５）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（５）、及びＢＴ４７４（５）であった。腫瘍が約２００〜３００mm3に達したとき、マウスを、腫瘍サイズにより無作為に分け、そして処理群に分割した。腫瘍増殖を、週に約２回評価し、腫瘍体積を、π／６×（長さ×幅2）｛式中、長さ＝最大直径、そして幅＝長さに対して垂直な直径｝として計算した。腫瘍寸法を、カリパスを用いて計測した。Ｔ／Ｃ％を、１００×（最終処置腫瘍体積／開始処置腫瘍体積）／（最終対照腫瘍体積／開始対照腫瘍体積）として計算した。
【０１１５】
１８Ｆ１を、０．９％ ＵＳＰ生理食塩水（Ｂｒａｕｎ）又はリン酸塩バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）中で希釈し、そして０．５mL／マウスの体積で腹膜内投与した。腫瘍増殖に対する処置の効果を、分散の反復計測分析を用いて分析した（ＲＭ ＡＮＯＶＡ）。ｐ＜０．０５は有意と考えられる。
【０１１６】
図２５に示すように、腹膜内１８Ｆ１の投与は、ＤＵ４４７５（図２５Ａ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５（図２５Ｂ）異種移植片腫瘍を有意に（ｐ＜０．０５）抑制した。図２６に示すように、１８Ｆ１単独療法の有意な抗腫瘍効果も、ＨＴ−２９（図２６Ａ）、ＤＬＤ−Ｉ（図２６Ｂ）、及びＧＥＯ（図２６Ｃ）結腸癌異種移植片に対して観察された。これらの結果は、ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉの遮断が、ＶＥＧＦＲ−Ｉ発現性ヒト腫瘍細胞系により樹立された異種移植片腫瘍の増殖を有効に抑制することを証明するものである。
【０１１７】
実施例１０：抗−ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉ処置は、増殖及び生存経路のインビボにおけるシグナリングを抑制し、そして腫瘍細胞アポトーシスを誘導する
パラフィン埋め込みＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片を、腫瘍細胞増殖、生存、及びアポトーシスのマーカーについて、免疫組織化学的に評価した。増殖及び生存のマーカーは、ｋｉ−６７（ウサギｐＡｂ；Lab Vision Corporation, Fremont, CA）、ホスホ特異的ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（ウサギｐＡｂ；Cell Signaling Technology）、及びホスホ特異的Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）（ウサギｐＡｂ；Cell Signaling Technology）を含んでいた。ウサギ抗体のためのＥｎＶｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（DAKO Cytomation, Carpenteria, CA）を、キットの指示書に従い、クロマゲンとして３，３′ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）とともに使用した。Ｍａｙｅｒ’ｓヘマトキシリン中での短時間の対比染色の後、全ての切片を、脱水し、清澄化し、そして永久マウンティング培地を用いてカバースリップをした。腫瘍アポトーシスを、キットの指示書に従って、ＡｐｏｐＴａｇ（登録商標）Peroxidase In Situ Apoptosis Detectio Kit (Chemicon, Temecula, CA）を用いてＴＵＮＥＬアッセイにより評価した。ポジティブ免疫染色及びＴＵＮＥＬポジティブ免疫蛍光を分析し、そしてＡｘｉｏａｍデジタル・カメラ（Carl Zeiss, Germany）を備えたＡｘｉｏｓｋｏｐ光学顕微鏡を用いて画像形成した。
【０１１８】
図２７に示すように、増殖性細胞（ｋｉ−６７）のためのマーカーは、２０mg／kgにおける１８Ｆ１による処理から１４日後（雌ｎｕ／ｎｕ無胸腺マウスにおいて約０．５mg／投与）、２回／週（試験番号３０６７−０４）、有意に低下した。さらに、１８Ｆ１処理は、上記時点においてＭＡＰＫの活性化における顕著な低下をもたらした（図２７）。ＴＵＮＥＬポジティブ事件により計測されるアポトーシスの増加（図２７）、及びＡｋｔリン酸化における有意な低下は、１８Ｆ１による処置から１週間後（０．５mg／投与、Ｍ−Ｗ−Ｆ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片腫瘍においても検出された。
【０１１９】
実施例１１：ヒト及びネズミＶＥＧＦＲ−Ｉのインビボにおける遮断は、ヒト乳癌異種移植片に対するより大きな抗腫瘍活性を導く
１８Ｆ１を、マウスＶＥＧＦＲ−Ｉ，ＭＦ１に対する抗体とともに使用した。１８Ｆ１を、０．９％ ＵＳＰ生理食塩水（Ｂｒａｕｎ）又はリン酸塩バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）中で希釈し、そして０．５ml／マウスの体積で腹膜内投与した。腫瘍増殖に対する処置の効果を、分散の反復計測分析を用いて分析した（ＲＭ ＡＮＯＶＡ）、ｐ＜０．０５は有意であると考えられた。図２８に示すように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図２８Ａ）とＤＵ４４７５（図２８Ｂ）異種移植片の両者において、１８Ｆ１による腫瘍発現ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉの阻害、及びＭＦ１による内因性マウスＶＥＧＦＲ−Ｉの阻害は、有意な腫瘍増殖阻害（ｐ＜０．０５）をもたらした。ＭＦ１は、腫瘍血管形成の低減を通じて腫瘍増殖を阻害することが先に示されている。１８Ｆ１とＭＦ１の組合せは、単独療法よりも有意に大きな腫瘍増殖阻害をもたらした（ｐ＜０．０５）。１８Ｆ１とＭＦ１の併用療法は、体重損失を伴わなかった。これらのデータは、患者における１８Ｆ１処置による腫瘍血管形成と腫瘍細胞増殖及び生存の２重阻害を裏付けるものである。
【０１２０】
実施例１２：化学療法と併用される抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体
１８Ｆ１＋ＭＦ１を、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１モデルにおける細胞毒療法、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、及びパクリタキセルと併用した。１８Ｆ１を、０．９％ ＵＳＰ生理食塩水（Ｂｒａｕｎ）又はリン酸塩バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）中で希釈した。マウス当り一定投与量で投与された抗体処置を、０．５mL／マウスの体積で投与した。体重に正比例する投与量で投与された抗体と細胞毒処置を、１０μＬ／体重ｇの体積で与えた。５−フルオロウラシルとロイコボリン（５−ＦＵ／ＬＶ）を、ＵＳＰ生理食塩水中で別々に希釈し、そして別々に投与した。パクリタキセルを、５％ベンジル・アルコール（Ｓｉｇｍａ）、５％ Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（Ｓｉｇｍａ）、及び９０％ ＵＳＰ生理食塩水中で、又は５％エチル・アルコール（Ｓｉｇｍａ）、５％ Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ、及び９０％ ＵＳＰ生理食塩水中で作製した。シクロホスファミドとドキソルビシンを、投与のためにＵＳＰ生理食塩水中に溶解した。ＡＵ処置は、ｉ．ｐ．で投与された。腫瘍増殖に対する処置の効果を、分散の反復計測分析を用いて分析した（ＲＭ−ＡＮＯＶＡ）、ｐ＜０．０５は有意であると考えた。
【０１２１】
図２９に示すように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１モデルにおいては、シクロホスファミド療法の活性投与量への１８Ｆ１＋ＭＦ１の添加は、抗腫瘍効果を有意に増大させた。図３０に示すように、５−ＦＵ／ＬＶとドキソルビシン化学療法が一定の投与レベルにおいて投与されたとき、１８Ｆ１とＭＦ１は、上記２つの化学療法の抗腫瘍効果を高めた。
【０１２２】
ＤＵ４４７５異種移植片モデルにおいては、ＩＭＣ−１８Ｆ１＋ＭＦ１が５−ＦＵ／ＬＶ、ドキソルビシン、及びパクリタキセルと併用されたとき活性が高まる傾向があった（より低いＴ／Ｃ％）。但し、この効果は、ＩＭＣ−１８Ｆ１＋ＭＦ１単独、又は細胞毒性剤単独療法に比較して統計的有意に達しなかった。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１においては、これは、ドキソルビシンに関して再び当てはまった。但し、５−ＦＵ／ＬＶ及びパクリタキセルに関しては、併用により活性が高まるという傾向はなかった。アビシチーの欠如は、選択された投与レベルにおける単独療法としての５−ＦＵ／ＬＶとパクリタキセルの最小効果に因ることができる。シクロホスファミドとの併用も、ＩＭＣ−１８Ｆ１＋ＭＦ１単独（Ｔ／Ｃ％＝６０）又はシクロホスファミド単独療法（Ｔ／Ｃ％＝６５）に比較して、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５モデル（Ｔ／Ｃ％＝５１）において増加した活性を有していた。但し、これらの差は統計的に有意ではなかった。同一の試験においてこれは、ドキソルビシンとパクリタキセルにも当てはまった。上記のＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５データと同様に、ＢＶＩＣ−１８Ｆ１，ＭＦ１、及びシクロホスファミドの組合せは、ＤＵ４４７５異種移植片モデルにおいて、抗体又は細胞毒療法単独に比較して、高められた抗腫瘍活性を示した。
【０１２３】
統計分析
腫瘍体積とインビトロ腫瘍細胞増殖の分析は、ＳｉｇｍａＳｔａｔ統計パッケージ（Ｖ．２．０３；Jandel Scientific, San Rafael, CA）を用いたスチューデントｔ−テストを用いて分析した。ｐ＜０．０５の差は、統計的に有意であると考えた。
【０１２４】
実施例１３：抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体のＶＨ／ＶＬ領域のクローニング及びシーケンシング
ポリ（Ａ＋）ｍＲＮＡを、Ｆａｓｔ−ｔｒａｃｋキット（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いてＶＥＧＦＲ−Ｉ免疫化ＫＭマウスから得られたハイブリドーマ細胞産生クローン６Ｆ９，１３Ｇ１２，１５Ｆ１１、及び１８Ｆ１から単離した。ランダム・プライムｃＤＮＡの作製の後に、Ｃｌｏｎｔｅｃｈキットを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。プライマー（前進：５′−ＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧ、及び後退：３′−ＴＧＣＣＡＧＧＧＧＧＡＡＧＡＣＣＧＡＴＧＧ）、並びに（前進：５′−ＡＴＧＧＡＡＡＣＣＣＣＡＧＣＧＣＡＧＣＴＴＣＴＣ、及び後退：３′−ＣＧＧＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣＡＧＡＴＧ）を、それぞれ、重鎖とカッパ軽鎖の可変領域に結合させるために使用した。ハイブリドーマからのヒト免疫グロブリン由来重鎖及びカッパ鎖転写産物の配列を、先に記載したプライマーを用いてポリ（Ａ＋）ＲＮＡから作製されたＰＣＲ産物の直接シーケンシングにより得た。またＰＣＲ産物を、ＴＡクローニング・キット（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いてｐＣＲ２．１にクローニングし、そして両鎖を、Ｐｒｉｓｍ ｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒシーケンシング・キット及びＡＢＩ３７３０ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（GENEWIZ, North Brunswick, NJ）を用いてシーケンシングした。全配列を、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアを用いたＫａｔａｍａｎ抗体配列プログラムに対するアラインメントにより分析した。
【０１２５】
上記表２は、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体クローン６Ｆ９，１３Ｇ１２，１５Ｆ１１、及び１８Ｆ１の軽鎖及び重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。ＣＤＲ１，ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメインの配列を、下線により示す。上記表３は、クローン６Ｆ９，１３Ｇ１２，１５Ｆ１１、及び１８Ｆ１の重鎖及び軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【０１２６】
実施例１４：ヒトＩｇＧ１抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の遺伝子操作及び発現
抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体クローン６Ｆ９，１３Ｇ１２，１５Ｆ１１、及び１８Ｆ１の重鎖及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列を、発現ベクター内へのクローニングのためにＰＣＲにより増幅した。重鎖可変領域を、ベクターｐＥＥ６．１（Lonza Biologies pic, Slough, Berkshire, UK）内で、フレーム内で、ヒト免疫グロブリン重鎖ガンマ定常領域に融合した。完全ヒト軽鎖ｃＤＮＡを、ベクターｐＥＥ１２．１（Lonza Biologies. PLC, Slough, Berkshire, UK）内に直接クローン化した。操作された免疫グロブリン発現ベクターを、エレクトロポレーションによりＮＳＯミエローマ細胞内に安定にトランスフェクトし、そしてグルタミン・シンセターゼ選択培地中で選択した。安定性クローンを、抗−Ｆｃ及びＶＥＧＦＲ−Ｉ特異的結合ＥＬＩＳＡによる抗体発現についてスクリーニングした。ポジティブ・クローンを、２週間以内の期間にわたり、スピナー・フラスコ又はバイオリアクター内で抗体生産のための無血清培養基中で増殖させた。完全長ＩｇＧ１抗体を、プロテインＡアフィニティー・クロマトグラフィー（Poros A, PerSeptive Biosystems Inc., Foster City, CA）により精製し、そして中性バッファー生理食塩水溶液中に溶出した。
【０１２７】
以上の説明及び実施例は、本発明を単に説明するためのものであり、本発明を限定することを意図していない。本発明の開示された側面及び態様の各々は、個々に、又は本発明の他の側面、態様、及び変更と組合せて考慮されうる。さらに特にことわらない限り、本発明の方法のステップのいずれも、実行における特定の順番に拘束されない。本発明の本質及び実体を取り込む開示された態様の変更も当業者にとって自明であろうし、そしてこのような変更も本発明の範囲内にある。さらに、本明細書中に引用する文献の全てを、それらの全体として本明細書中に援用する。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】図１は、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の各種態様の軽鎖可変領域と重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【図２】図２は、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の各種態様の軽鎖可変領域と重鎖可変領域のヌクレオチド配列である。
【図３】図３は、ＶＥＧＦＲ−Ｉへの本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の各種態様のインビトロ結合活性を計測するＥＬＩＳＡベースの結合アッセイの結果を示すチャートである。
【図４】図４は、ＶＥＧＦＲ−Ｉ結合についての、ＰＩＧＦとの、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の各種態様のインビトロにおける競合を計測するＥＬＩＳＡベースのブロッキング・アッセイの結果を示すチャートである。
【図５】図５は、ＶＥＧＦＲ−Ｉ結合についての、ＶＥＧＦとの、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の各種態様のインビトロにおける競合を計測するＥＬＩＳＡベースのブロッキング・アッセイの結果を示すチャートである。
【図６】図６Ａ−Ｄは、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１の特異性の結果を示すチャートである。ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉ（図６Ａ）に結合するが、マウスＶＥＧＦＲ−Ｉ（図６Ｂ）、ヒトＶＥＧＦＲ−２（図６Ｃ）、又はマウスＶＥＧＦＲ−２（図６Ｄ）には結合しない。
【図７】図７Ａ−Ｅは、ＶＥＧＦＲ−Ｉ発現ブタ大動脈内皮細胞との、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の各種態様の結合反応性を示すフロー・サイトメトリー分析の結果である。
【図８】図８Ａ−Ｂは、ＶＥＧＦＲ−Ｉ発現ブタ内皮細胞（図８Ａ）及びＤＵ４４７５ヒト乳癌細胞（図８Ｂ）との、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１の結合反応性を示すフロー・サイトメトリー分析の結果である。
【図９】図９は、内皮細胞上のＶＥＧＦＲ−Ｉに結合するＶＥＧＦとの、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１のインビトロにおける競合を計測する細胞ベースのブロッキング・アッセイの結果を示すチャートである。
【図１０】図１０は、ブタ大動脈内皮ＶＥＧＦＲ−Ｉ発現細胞における本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１による処理によるＶＥＧＦＲ−ＩのＰＩＧＦ刺激リン酸化の低減を示すウェスタン・ブロット分析である。
【０１２９】
【図１１】図１１は、ＢＴ４７４乳癌細胞における本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１による処理によるＶＥＧＦＲ−ＩのＰＩＧＦ又はＶＥＧＦ刺激リン酸化の阻害を示すウェスタン・ブロット分析である。
【図１２】図１２は、ブタ大動脈内皮ＶＥＧＦＲ−Ｉ発現細胞における本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の各種態様によるＥＲＫ１／２下流シグナリングのＰＩＧＦ誘導活性化の阻害を示すウェスタン・ブロット分析である。
【図１３】図１３は、ブタ大動脈内皮ＶＥＧＦＲ−Ｉ発現細胞における本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の各種態様によるＥＲＫ１／２下流シグナリングのＶＥＧＦ誘導活性化の阻害を示すウェスタン・ブロット分析である。
【図１４】図１４Ａ−Ｂは、ＶＥＧＦＲ−Ｉ発現ブタ大動脈内皮細胞における本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１によるＥＲＫ１／２下流シグナリングのＰＩＧＦ（図１４Ａ）又はＶＥＧＦ（図１４Ｂ）−誘導活性化の阻害を示すウェスタン・ブロット分析である。
【図１５】図１５は、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１が、ＢＴ４７４乳癌細胞におけるＰＩＧＦ又はＶＥＧＦ−刺激リン酸化をブロックすることを示すウェスタン・ブロット分析である。
【図１６】図１６は投与量に応答して、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の各種態様により処理されたＤＵ４４７５乳癌細胞内でのＶＥＧＦ刺激細胞増殖の阻害を示す投与量応答曲線である。
【図１７】図１７は、投与量に応答して、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の各種態様により処理されたＤＵ４４７５乳癌細胞におけるＰＩＧＦ刺激細胞増殖の阻害を示す投与量応答曲線である。
【図１８】図１８Ａ−Ｂは、投与量に応答して、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１により処理されたＤＵ４４７５乳癌細胞におけるＰＩＧＦ（図１８Ａ）又はＶＥＧＦ（図１８Ｂ）−刺激細胞増殖の阻害を示す投与量応答曲線である。
【図１９Ａ】本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の各種態様による処理後の日数に対してＤＵ４４７５乳癌腫瘍の腫瘍増殖をプロットしたチャートである。
【図１９Ｂ】本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の各種態様による処理後の日数に対してＤＵ４４７５乳癌腫瘍の腫瘍増殖をプロットしたチャートである。
【図２０】図２０Ａ−Ｃは、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１による処理後の日数に対してＤＵ４４７５（図２０Ａ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図２０Ｂ）、及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５（図２０Ｃ）の腫瘍増殖をプロットしたチャートである。
【０１３０】
【図２１】図２１Ａ−Ｂは、本発明の抗−ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１及び抗−マウスＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体ＭＦ１による処理後の日数に対してＤＵ４４７５（図２１Ａ）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図２１Ｂ）乳腫瘍の腫瘍増殖をプロットしたチャートである。
【図２２】図２２は、ＶＥＧＦ−Ａ及びＶＥＧＦ−Ｂの存在下、抗−ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１による処理後に存在する結腸癌細胞コロニーの数のチャートである。
【図２３】図２３Ａは、ＶＥＧＦ−Ａ及びＶＥＧＦ−Ｂの存在下抗ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１による処理後の転移腫瘍細胞の数のチャートである。 図２３Ｂは、ＶＥＧＦ−Ａ及びＶＥＧＦ−Ｂの存在下抗ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１による処理後の染色された転移細胞の光学顕微鏡写真である。
【図２４】図２４Ａは、ＶＥＧＦ−Ａ又はＶＥＧＦ−Ｂの存在下、抗ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１による処理後のＭＡＴＲＩＧＥＬTMの層を横切って移動した腫瘍細胞の数のチャートである。 図２４Ｂは、ＶＥＧＦ−Ａ及びＶＥＧＦ−Ｂの存在下、抗ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１による処理後の染色された転移細胞の光学顕微鏡写真である。
【図２５】図２５は、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１，６Ｆ９、及び１５Ｆ１１による処理後の日数に対して、ＤＵ４４７５（図２５Ａ）及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５（図２５Ｂ）乳腫瘍の腫瘍増殖をプロットしたチャートである。
【図２６】図２６は、抗−ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１の特定投与量による処理後の日数に対して、ＨＴ−２９（図２６Ａ）、ＤＬＤ−１（図２６Ｂ）、及びＧＥＯ（図２６Ｃ）結腸癌細胞の増殖をプロットしたチャートである。
【図２７】図２７は、抗−ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１による処理後のＭＤＳ−ＭＢ−２３１異種移植片腫瘍の光学顕微鏡写真である。
【図２８】図２８は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図２８Ａ）及びＤＵ４４７５（図２８Ｂ）異種移植片における抗−ヒト抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１、抗−マウス抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体ＭＦ−Ｉの特定投与量による処理後の日数に対して腫瘍増殖をプロットしたチャートである。
【図２９】図２９は、ＭＤＳ−ＭＢ−２３１異種移植片における、シクロホスファミドと併用した抗−ヒト抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１及び抗−マウス抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体ＭＦ１による処理後の日数に対して腫瘍増殖をプロットしたチャートである。
【図３０】図３０Ａと３０Ｂは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片における抗−ヒト抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１及び抗−マウス抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体ＭＦ１と併用した５−ＦＵ／ＬＶ又はドキソルビシンによる処理後の日数に対して腫瘍増殖をプロットしたチャートである。
【図３１】図３１は、デスフェロキサミンによる処理後の、ＶＥＧＦ−Ａ（図３１Ａ）又はＰＩＧＦ（図３１Ｂ）の存在下、１８Ｆ１の各種量の抗体濃度に対する全腫瘍細胞カウント数のチャートである。
【図３２】図３２Ａ，３２Ｂ、及び３２Ｃは、抗−ヒト抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１と抗−マウス抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体ＭＦ１の特異性を示すチャートである。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、血管内皮成長因子−Ｉ（ＶＥＧＦＲ−Ｉ）に特異的な抗体に、並びにＶＥＧＦＲ−Ｉに対する抗体により血管新生関連疾患及び腫瘍を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
胚及び成体における予め存在する血管からの毛細血管の形成をいう血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）は、腫瘍増殖（成長）、生存、及び転移における主要な要素であることが知られている。成長因子及びそれらの受容体、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング成長因子−δ（ＴＧＦ−／３）、酸性及び塩基性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、腫瘍血管新生に一定の役割を演じていると考えられる。Klagsburn & D'Amore, Annual Rev. Physiol., 53 : 217-239 (1991)を参照のこと。上記成長因子のそれらの細胞表面受容体への結合は、受容体の活性化を含み、これは、シグナル伝達経路を開始させ、そして修飾し、そして細胞の増殖と分化を導く。ＶＥＧＦ、すなわち、内皮細胞特異的細胞分裂誘発物質は、それが、内皮細胞の増殖を特異的に促進することにより血管新生誘発物質として作用するという点で、上記因子の中で、区別される。
【０００３】
ＶＥＧＦの生物学的応答は、胚形成の間（Millaure, Cell, 72 : 835-846 (1993)）に、及び腫瘍形成の間に、内皮細胞上に選択的に発現されるその高アフィニティー受容体を通じて仲介される。ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲｓ）は、典型的には、それらのアミノ末端細胞外受容体リガンド結合性ドメイン内に数個、典型的には５又は７個のイムノグロブリン様ループを有することを特徴とするクラスIII受容体型チロシン・キナーゼである（Kaipainen et al, J. Exp. Med., 178 : 2077-2088 (1993)）。他の２つの領域は、キナーゼ挿入ドメインといわれる、可変長の親水性ｉｎｔｅｒｌｄｎａｓｅ配列の挿入により中断されているトランスメンブラン領域とカルボキシ末端細胞内触媒ドメインを含む（Terman et al., Oncogene, 6 : 1677-1683 (1991)）。ＶＥＧＦＲｓは、Shibuya et al., Oncogene, 5 : 519-524 (1990)により配列決定されたｚ，ｓ−様チロシン・キナーゼ受容体（ｆｌｔ−１）又はＶＥＧＦＲ−Ｉ、１９９２年２月２０日出願されたＷＯ９２／１４２４８及びTerman et al., Oncogene, 6 : 1677-1683 (1991)中に記載され、かつ、Matthews et al., Proc. Natl. Acad. Sd. USA, 88 : 9026-9030 (1991)により配列決定されたキナーゼ挿入ドメイン含有受容体／胎児肝キナーゼ（ＫＤＲ／ｆｉｋ−１）又はＶＥＧＦＲ−２を含む、但し、他の受容体、例えば、ニューロピリン−１及び−２もＶＥＧＦに結合しうる。他のチロシン・キナーゼ受容体ＶＥＧＦＲ−３（ｆｌｔ−４）は、ＶＥＧＦホモログ、ＶＥＧＦ−Ｃ及びＶＥＧＦ−Ｄに結合し、そしてリンパ管の発達においてより重要である。
【０００４】
病理学的血管新生の調節におけるＶＥＧＦＲ−Ｉの重要性は、インビボにおける実験モデルにおいて示されてきた。ＶＥＧＦＲ−Ｉチロシン・キナーゼ・ドメインの欠陥は、腫瘍における低減された血管形成をもたらし、これは、病理学的血管新生におけるＶＥＧＦＲ−Ｉチロシン・キナーゼの意義のある役割を示すものである（Hiratsuka et al., Cancer Research, 61 : 1207-1213 (2001)）。ＶＥＧＦＲ−Ｉチロシン・キナーゼ・ドメインは、内皮細胞及びマクロファージ内へのマトリックス・メタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）の導入による腫瘍の病因及び転移の促進のためにも必要とされる（Hiratsuka et al., Cancer Cell, 2 : 289-300 (2002)）。さらに、ＶＥＧＦＲ−Ｉは、ＰＩＧＦ応答性ＢＭ由来前駆細胞の流動化及び分化を仲介することが示されている（Hattori et al., Nature Medicine, 8 : 841-849 (2002)）。抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体によるＶＥＧＦＲ−Ｉの阻害は、骨髄由来内皮及び単球前駆細胞の動員が腫瘍内で血管形成することを妨害することにより、腫瘍血管新生の低減を導く（Lyden et al., Nature Medicine, 7 : 1194-1201 (2001)）。抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体による処置は、腫瘍内の病理学的血管新生、及び動物モデルにおける虚血性網膜炎をも有効に阻害した（Lutten et al., Nature Medicine, 8 : 831-840 (2002)）。
【０００５】
血管新生におけるＶＥＧＦＲ−Ｉの役割に加えて、ＶＥＧＦとその受容体の同時発現も、血液学的悪性細胞及び特定の固形腫瘍細胞においてしばしば発見された（Bellamy, Cancer Research, 59 : 728-733 (1999); Ferrer et al., Urology, 54 : 567-572 (1999); Price et al., Cell Growth Differ., 12 : 129-135 (2001)）。ＶＥＧＦは、リガンドにより刺激された内分泌ループを通じての下流細胞内シグナリング経路の活性化によりＶＥＧＦ受容体発現性白血病細胞の増殖、生存、及び侵入を直接に誘導することが示されている（Dias et al., Proc. Natl. Acad. Sd. USA, 98: 10857-10862 (2001)); Gerber et al., J. Mol. Med., 81 : 20-31 (2003)）。ＶＥＧＦ刺激は、ＥＲＫ１／２及びＰＩ３／Ａｋｔ−キナーゼ・シグナリング経路の活性化を誘導することによりＶＥＧＦＲ−Ｉ発現性乳癌細胞の高められた侵入性をももたらす（Price et al., Cell Growth Differ., 12 : 129-135 (2001)）。
【０００６】
ＶＥＧＦＲ−Ｉとそのリガンドは、炎症性障害において重要な役割を演じることも示されている。ＶＥＧＦ−Ｂ欠陥は、関節炎のモデルにおいて炎症関連血管密度の低下及び滑液炎症をもたらした（Mould et al., Arthritis Rheum., 48 : 2660-2669 (2003)）。ＰＩＧＦは、血管拡大、炎症性細胞、及び単球／マクロファージを仲介することにより皮膚炎症のコントロールにおいて重要な役割をも演じ、そして動物モデルにおけるアテローム性動脈硬化症及びリウマチ様関節炎の調節に貢献することが示されている（Luttun et al., Nature Medicine, 8 : 831-840 (2002); Autiero & Thromb Haemost, 1 : 1356-1370 (2003)）。中和性抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体による処置は、関節炎における炎症性調節破壊を抑制し、アテローム性動脈硬化斑の成長及び傷つきやすさを低下させた。抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の抗炎症効果は、末梢血液中への骨髄由来骨髄前駆細胞の低減された流動化、骨髄細胞の欠陥のある活性化、及び炎症化組織内でのＶＥＧＦＲ−Ｉ−発現性白血球の弱化された分化及び浸潤に帰されていた。したがって、ＶＥＧＦＲ−Ｉは、炎症関連障害の治療のための治療ターゲットでもあることができる。
【０００７】
ＶＥＧＦ受容体活性を阻害する作用物質、例えば、ＶＥＧＦＲ−Ｉに特異的な完全ヒト・モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）の必要性が未だ在る。抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、血管新生関連疾患及び癌の治療のための有用、かつ、新規な治療用アンタゴニストでありうる。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の簡単な説明
１の態様において、本発明は、ＶＥＧＦＲ−Ｉに特異的に結合し、そして配列番号２の軽鎖相補性決定領域−２（ＣＤＲ２）、及び配列番号３の軽鎖相補性領域−３（ＣＤＲ３）を含むモノクローナル抗体又はその断片を提供する。
【０００９】
他の態様においては、本発明は、ＶＥＧＦＲ−Ｉに特異的に結合し、そして配列番号２の軽鎖相補性決定領域−２（ＣＤＲ２）及び配列番号３の軽鎖相補性領域−３（ＣＤＲ３）を含む抗体又はその断片のアミノ酸配列に少なくとも７０％相同であるモノクローナル抗体又はその断片を提供する。
【００１０】
他の態様においては、本発明は、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、及び配列番号２７から成る群から選ばれるヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。上記ヌクレオチド配列は、ＶＥＧＦＲ−Ｉに特異的に結合する抗体又はその断片をコードする。
【００１１】
他の態様においては、本発明は、ＶＥＧＦＲ−Ｉに特異的に結合する抗体又はその断片をコードし、そして配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、及び配列番号２７から成る群から選ばれるヌクレオチド配列に少なくとも７０％相同であるヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。
【００１２】
他の態様においては、本発明は、ＶＥＧＦＲ−Ｉに特異的に結合し、そして配列番号２の軽鎖相補性決定領域−２（ＣＤＲ２）及び配列番号３の軽鎖相補性領域−３（ＣＤＲ３）を含む抗体又はその断片の治療有効量を投与することにより血管新生を阻害し又は腫瘍増殖を低減する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の詳細な説明
１の態様において、本発明は、ＶＥＧＦＲ−Ｉに特異的に結合するモノクローナル抗体及びその断片を提供する（特にことわらない限り、このような抗体及びその断片を本明細書中、「抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体」という）。本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、配列番号２の軽鎖相補性決定領域−２（ＣＤＲ２）及び配列番号３の軽鎖相補性領域−３（ＣＤＲ３）を含む。あるいは、そして好ましくは、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、以下の配列を有する軽鎖相補性領域−１（ＣＤＲ１）を含む：
ＲＡＳＱＳＸ1ＳＳＳＹＬＡ｛ここで、Ｘ1はＶ又はＧである（配列番号１又は４）｝。あるいは、そして好ましくは、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、以下の配列を有する重鎖ＣＤＲ１を含む：
ＧＦＸ2ＦＳＳＹＧＭＨ｛ここで、Ｘ2はＴ又はＡである（配列番号５又は１１）｝。あるいは、そして好ましくは、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、以下の配列を有する重鎖ＣＤＲ２を含む：
ＶＩＷＸ3ＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＸ4Ｇ｛ここで、Ｘ3はＹ又はＦであり、そしてＸ4はＫ又はＲである（配列番号６，９又は１２）｝。あるいは、そして好ましくは、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、以下の配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む：
ＤＨＸ5ＧＳＧＸ6ＨＸ7ＹＸ8ＹＹＧＸ9ＤＶ｛ここで、Ｘ5はＦ又はＹであり；Ｘ6はＡ又はＶであり；Ｘ7はＹ，Ｓ又はＨであり；Ｘ8はＹ又はＦであり；そしてＸ9はＭ又はＬである（配列番号７，８，１０，１３）｝。
好ましい抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体（クローン「６Ｆ９」、「１３Ｇ１２」、「１５Ｆ１１」、及び「１８Ｆ１」（又は「ＭＣ−１８Ｆ１」）と命名した）のＣＤＲのアミノ酸配列を以下の表１中に示す。
【００１４】
【表１】
【００１５】
他の態様において、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、配列番号１４，１５又は１６の軽鎖可変領域（ＶL）、及び／又は配列番号１７，１８，１９又は２０の重鎖可変領域（ＶH）を有する。本発明の好ましい抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のアミノ酸配列を以下の表２中に示す。
【００１６】
【表２】
【００１７】
好ましい態様においては、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体はヒト抗体である。
本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、ＶＥＧＦＲ−Ｉに特異的に結合する完全抗体及び抗体断片を含む。本発明に係る抗体のタイプの非制限的な例は、天然抗体；１本鎖抗体；多価１本鎖抗体、例えば、ダイアボディー、及びトリアボディー；１価断片、例えばＦａｂ（Fragment, antigen binding）、２価断片、例えば（ＦａＶ）2；Ｆｖ（fragment viable）断片又はそれらの誘導体、例えば、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片；及び単ドメイン抗体であって、ＶＥＧＦＲ−Ｉに特異的に結合するものを含む。
【００１８】
天然抗体は、２つの同一の重鎖と２つの同一の軽鎖を有し、各軽鎖は鎖間ジスルフィド結合により重鎖に共有結合され、そして複数のジスルフィド結合が、上記２つの重鎖を互いにさらに連結する。個々の鎖は、類似のサイズ（１１０〜１２５アミノ酸）及び構造を有するが、異なる機能を有するドメインに折り重なることができる。軽鎖は、１つのＶLと１つの定常ドメイン（ＣL）を含みうる。重鎖も、１つのＶH、及び／又は抗体のクラス又はアイソタイプに依存して、３つ又は４つの定常ドメイン（ＣH１，ＣH２，ＣH３、及びＣH４）を含みうる。ヒトにおいては、上記アイソタイプは、ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＧ、及びＩｇＭであり、ＩｇＡとＩｇＧは、サブクラス又はサブタイプ（ＩｇＡ1-2とＩｇＧ1-4）にさらに分けられる。
【００１９】
１本鎖抗体は、それらが由来するところの完全抗体の定常ドメインのいくつか又は全てを欠く。１本鎖抗体を製造するために使用されるペプチド・リンカーは、ＶLドメインとＶHドメインの正しい３次元の折りたたみが保証されるように選択されたフレキシブル・ペプチドであることができる。一般に、ＶL又はＶH配列のカルボキシ末端は、このようなペプチド・リンカーにより相補性ＶH又はＶL配列のアミノ酸末端に共有結合されうる。上記リンカーは、一般に、１０〜５０アミノ酸残基、好ましくは、１０〜３０アミノ酸残基、より好ましくは１２〜３０アミノ酸残基、そして最も好ましくは１５〜２５アミノ酸残基である。このようなリンカー・ペプチドの例は、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）3（配列番号２８）を含む。
【００２０】
各１本鎖が第１のペプチド・リンカーにより共有結合された１つのＶHと１つのＶLドメインを有するところの多数１本鎖抗体は、少なくとも１以上のペプチド・リンカーにより共有結合されて多価１本鎖抗体が形成され、これは１特異的又は多特異的であることができる。多価１本鎖抗体の各鎖は、可変軽鎖断片と可変重鎖断片を含み、そしてペプチド・リンカーにより少なくとも１つの他の鎖に連結される。
【００２１】
２つの１本鎖抗体は、併合されて、３価ダイマーとしても知られるダイアボディーを形成しうる。ダイアボディーは、２つの鎖と２つの結合部位を有し、そして１特異的又は２特異的であることができる。ダイアボディーの各鎖は、ＶLドメインに接続されたＶHドメインを含む。これらのドメインは、同一鎖上のドメイン間の対合を防止し、それにより、異なる鎖上の相補性ドメインの間での対合を駆動して、２つの抗原結合部位を再創製するために十分に短いリンカーと接続される。
【００２２】
３つの１本鎖抗体は、併合されて、３価トリマーとしても知られるトリアボディーを形成しうる。トリアボディーは、ＶL又はＶHドメインのカルボキシ末端に、直接に、すなわち、リンカー配列によらずに、ＶL又はＶHドメインのアミノ酸末端を用いて構築される。トリアボディーは、環状の頭〜尾のやり方で配置されたポリペプチドをもつ３つのＦｖ頭を有する。トリアボディーの可能なコンホメーションは、互いに１２０°の角度で平面内に位置する３つの結合部位を含む平面である。トリアボディーは１特異的、２特異的又は３特異的であることができる。
【００２３】
Ｆａｂ断片は、ＶLＣLＶＨＣＨ1ドメインから成る抗体の断片をいう。パパイン消化により生成されたものは、「Ｆａｂ」といわれ、そして重鎖ヒンジ領域を保持していない。ペプシン消化により生成されたものは、「（Ｆａｂ′）2」（この場合、鎖間ジスルフィド結合は無傷である）か、又は「Ｆａｂ′」（この場合、上記ジスルフィド結合は保持されていない）といわれる。２価（Ｆａｂ′）2断片は、１価Ｆａｂ断片のアビジチーよりも高い抗原に対するアビジチーを有する。
【００２４】
Ｆｖ断片は、ＶL及びＶHドメインから成る抗体の部分であり、そして抗原結合部位を構成する。ｓｃＦｖは、１のポリペプチド鎖上にＶLドメインとＶHドメインを含む抗体断片であり、１のドメインのＮ末端と他のドメインのＣ末端は、フレキシブル・リンカーにより結合されて、上記２つの断片が会合して機能的抗原結合部位を形成することを可能にする（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号（Ladner et al.）、ＷＯ８８／０９３４４（Huston et al.）、両者を本明細書中に援用する）。ＷＯ９２／０１０４７（McCafferty et al.）（本明細書中に援用する）は、可溶性組換え遺伝子ディスプレイ・パッケージ、例えばバクテリオファージの表面上へのｓｃＦｖ断片のディスプレイを記載する。
【００２５】
単一ドメイン抗体は、抗原に効率的に結合することができる単一の可変ドメインを有する。結合アフィニティー及び特異性が主に１の又は他の可変ドメインに付与される抗体の例は、本分野において知られている。例えば、Jeffrey, P.D. et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 90 : 10310-4 (1993)を参照のこと。この文献は、本明細書中に援用され、そして、主に抗体重鎖によりジゴキシンに結合する抗−ジゴキシン抗体を開示する。ＶH及びＶLドメインを含む抗体から単一ドメイン抗体を製造するために、ＣＤＲ領域外の一定のアミノ酸置換が、結合、発現又は溶解度を高めるために望ましい。例えば、ＶH−ＶL境界内に埋没してしまうであろうアミノ酸残基を修飾することが望ましい。
【００２６】
本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の各ドメインは、完全な抗体の重鎖又は軽鎖可変ドメインであることができ、又はそれは、天然ドメイン、又は例えば、ＷＯ９３／１１２３６（Griffiths et al.）中に記載されるような技術を用いてインビトロにおいて、構築された合成ドメインの、機能的等価物又は突然変異体又は誘導体であることができる。例えば、少なくとも１つのアミノ酸を欠いている抗体可変ドメインに相当するドメインを一緒に結合することが可能である。重要な特徴は、相補性ドメインと会合して抗原結合部位を形成する各ドメインの能力である。したがって、用語「可変重／軽鎖断片」は、ＶＥＧＦＲ−Ｉ結合特異性に対する実体的効果を有さない変異体を除外するものと解釈されるべきではない。
【００２７】
本明細書中に使用するとき、「抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体」は、ＶＥＧＦＲ−Ｉについての特異性を保持する本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の修飾を含む。このような修飾は、非制限的に、エフェクター分子、例えば、化学療法剤（例えば、シスプラチン、タキソール、ドクソルビシン）又は細胞毒（例えば、タンパク質、又は非タンパク質性の有機化学療法剤）への結合を含む。修飾はさらに、非制限的に、検出可能なレポーター分子への結合を含む。抗体の半減期を延長する修飾（例えば、ペグ化）も含まれる。
【００２８】
タンパク質及び非タンパク質性剤は、本分野において知られた方法により上記抗体に結合されうる。結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）方法は、直接連結、共有結合リンカーを介しての連結、及び特異的結合対メンバー（例えば、アビジン−ビオチン）を含む。このような方法は、例えば、ドキソルビシンの結合に関して、本明細書中に援用するGreenfield et al., Cancer Research 50, 6600-6607 (1990)により記載されたもの、並びに白金化合物の結合に関して、両者とも本明細書中に援用するArnon et al., Adv. Exp. Med. Biol. 303, 79-90 (1991)及びKiseleva et al., Mol. Biol. (USSR) 25, 508-514 (1991)により記載されたものを含む。
【００２９】
本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、その結合特性が、直接突然変異、アフィニティー成熟、ファージ・ディスプレイ、又は鎖シャッフルの方法により改良されているところの抗体をも含む。アフィニティー及び特異性は、本発明に係る抗体のＣＤＲｓの内のいずれかを突然変異させることにより、及び所望の特性を有する抗原結合部位についてスクリーニングすることにより、修飾又は改善されうる（例えば、本明細書中に援用するYang et al., J. Mol. Biol., 254 : 392-403 (1995)を参照のこと）。ＣＤＲｓは、当業者に知られたさまざまな方法で突然変異されうる。例えば、１の方法は、同一抗原結合部位をもつ集団において、２０アミノ酸の全てが特別の位置に存在するように、個々の残基又は残基の組合せを無作為化することである。あるいは、突然変異は、エラー・プローン（error prone）ＰＣＲ法により一定範囲のＣＤＲ残基にわたり誘導される（例えば、本明細書中に援用するHawkins et al., J. Mol. Biol., 226 : 889-896 (1992)を参照のこと）。例えば、重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子を含有するファージ・ディスプレイ・ベクターがＥ．ｃｏｌｉの突然変異誘発遺伝子株において増幅されうる（例えば、本明細書中に援用するLow et al., J. Mol. Biol., 250 : 359-368 (1996)を参照のこと）。
【００３０】
抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、本発明に係る抗体の可変又は超可変領域のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列をもつポリペプチドを含む機能的等価物をも含む。「実質的に同じ」アミノ酸配列は、２つの配列が最適にアラインメントされ、そして当該２つの配列の間のアミノ酸の正しい対合を測定するために比較されるとき、他のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、そしてより好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。「実質的に同じ」アミノ酸配列は、Pearson and Lipman, Pro. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444-8 (1988)に従うＦＡＳＴＡサーチ法により測定されるとき、他のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、そしてより好ましくは少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列をも含む。
【００３１】
先に述べたように、本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、ＶＥＧＦＲ−Ｉに特異的に結合する。このような抗体は、１特異的又は、１の抗原結合性部位がＶＥＧＦＲ−Ｉに特異的である限り２特異的であることができる。ＶＥＧＦＲ−Ｉについての抗体の抗体特異性（抗原の特別なエピトープについての抗体の選択的認識をいう）は、アフィニティー及び／又はアビジチーに基づいて決定されうる。抗原と抗体の解離平衡定数（kd）により表されるアフィニティーは、抗原性決定基（エピトープ）と抗体結合部位の間の結合強さを計測する。アビジチーは、抗体とその抗原との間の結合の強さの尺度である。抗体は、典型的には、１０-5〜１０-11リッター／モルのkdで結合する。１０-4リッター／モル未満のkdは、一般に、非特異的結合を示すと考えられている。kdの値が小さければ小さい程、抗原性決定基と抗体結合部位の間の結合の強さはより大きくなる。
【００３２】
本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、ＶＥＧＦＲ−Ｉの細胞外領域に特異的に結合し、そして好ましくは、ＶＥＧＦＲ−Ｉのリガンドがその受容体に結合することを妨げることによりＶＥＧＦＲ−Ｉの活性化を中和する。このような好ましい態様においては、抗体は、（ＶＥＧＦ（Ａ）、ＶＥＧＦ−Ｂ、及びＰＩＧＦを含む）ＶＥＧＦＲ−Ｉの天然リガンドと少なくとも同程度に強くＶＥＧＦＲ−Ｉに結合する。
【００３３】
ＶＥＧＦＲ−Ｉの活性化の中和は、シグナル伝達に関連する活性の内の１以上を低減し、阻害し、不活性化し、そして／又は破壊することを含む。このような活性は、受容体の二量体化、ＶＥＧＦＲ−Ｉの自己リン酸化、ＶＥＧＦＲ−Ｉの内部細胞質チロシン・キナーゼ・ドメインの活性化、ＤＮＡ合成（遺伝子活性化）及び細胞分裂サイクルの進行又は分裂の調節に関連する多シグナル伝達及びトランス活性化経路の開始を含む。ＶＥＧＦＲ−Ｉ中和の１の尺度は、チロシン・キナーゼ活性ＶＥＧＦＲ−Ｉの阻害である。チロシン・キナーゼの阻害は、周知の方法、例えば、組換えキナーゼ受容体の自己リン酸化レベル、及び／又は天然又は合成基質のリン酸化を計測するリン酸化アッセイを用いて測定されうる。リン酸化は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ又はウェスタン・ブロットにおけるホスホチロシンに特異的な抗体を用いて検出されうる。チロシン・キナーゼ活性に関するいくつかのアッセイは、両者とも本明細書中に援用するPanek et al., J. Pharmacol. Exp. Them., 283 : 1433-44 (1997)及びBatley et al., Life ScL, 62 : 143-50 (1988)中に記載されている。
【００３４】
さらに、タンパク質発現の検出のための方法が、抗体がＶＥＧＦＲ−Ｉの活性化を中和するか否かを決定するために使用されることができ、ここでは、計測されるタンパク質がＶＥＧＦＲ−Ｉチロシン・キナーゼ活性により調節される。これらの方法は、タンパク質発現の検出のための免疫組織化学（ＩＨＣ）、遺伝子増幅の検出のための蛍光インサイチュー・ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、競争放射リガンド結合アッセイ、固体マトリックス・ブロッティング技術、例えば、ノーザン及びサザン・ブロット、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）及びＥＬＩＳＡを含む。例えば、Grandis et al., Cancer, 78 : 1284-92 (1996); Shimizu et al., Japan J. Cancer Res. 85 : 567-71 (1994); Sauter et al., Am. J. Path., 148 : 1047-53 (1996); Collins, Glia, 15 : 289-96 (1995); Radinsky et al., Clin. Cancer Res., 1 : 19-31 (1995); Petrides et al., Cancer Res., 50 : 3934-39 (1990); Hoffmann et al., Anticancer Res., 17 : 4419-26 (1997); Wikstrand et l., Cancer Res., 55 : 3140-48 (1995)（これらの全てを本明細書中に援用する）を参照のこと。
【００３５】
インビボアッセイも、ＶＥＧＦＲ−Ｉ中和を検出するために使用されうる。例えば、受容体チロシン・キナーゼ阻害は、阻害剤の存在下又は不在下で、受容体リガンドにより刺激された細胞系を用いた細胞分裂誘発アッセイにより観察されうる。例えば、ＶＥＧＦ（Ａ）又はＶＥＧＦ−Ｂで刺激されたＨＵＶＥＣ細胞（ＡＴＣＣ）が、ＶＥＧＦＲ−Ｉ阻害をアッセイするために使用されうる。他の方法は、例えば、マウス内に注射されたヒト腫瘍細胞を用いた、ＶＥＧＦ−発現腫瘍細胞の増殖の阻害についての試験を含む。例えば、本明細書中に援用する米国特許第６，３６５，１５７（Rockwell et al.）を参照のこと。
【００３６】
もちろん、本発明は、ＶＥＧＦＲ−Ｉ中和のいずれの特定のメカニズムにより限定されるものではない。例えば、本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、ＶＥＧＦＲ−Ｉに外部から結合し、ＶＥＧＦＲ−Ｉへのリガンドの結合及び受容体会合チロシン・キナーゼを介して仲介されるその後のシグナル伝達をブロックし、そしてシグナル伝達カスケードにおけるＶＥＧＦＲ−Ｉ及びその他の下流タンパク質のリン酸化を防止することができる。受容体−抗体複合体は、インターナライズされ、そして分解されて、受容体細胞表面ダウン・レギュレーションをもたらされることもできる。マトリックス・メタロプロテイナーゼ（その機能は、腫瘍細胞侵入、及び転移である）も、本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体によりダウン・レギュレートされることができる。
【００３７】
ヒト抗ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、天然抗体、又は、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子から構築されるＦａｂ又はｓｃＦｖファージ・ディスプレイ・ライブラリーから得られることができ、そして本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体のＣＤＲ配列は、このような抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体内に挿入されうる。
【００３８】
ヒト抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、当業者に周知の方法により製造されうる。このような方法は、Kohler and Milstein, Nature, 256 : 495-497 (1975) 及びCampbell, Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas, Burdon et al., Eds., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985)（これらの全てを本明細書中に援用する）により記載されるトランスジェニック・マウスを用いたハイブリドーマ法；並びにHuse et al., Science, 246, 1275-1281 (1989)（これを本明細書中に援用する）により記載される組換えＤＮＡ法を含む。
【００３９】
抗体断片は、完全抗体を解裂させることにより、又は当該断片をコードするＤＮＡを発現させることにより、製造されうる。抗体の断片は、Lamoyi et al., J. Immunol. Methods, 56 : 235-243 (1983)及びParham, J. Immunol. 131 : 2895-2902 (1983)（両者を本明細書中に援用する）により記載される方法により調製されうる。このような断片は、１又は両者のＦａｂ断片又はＦ（ａｂ′）2断片を含みうる。このような断片は、１本鎖断片可変領域抗体、すなわち、ｓｃＦｖ、ダイアボディー、又は他の抗体断片をも含みうる。このような抗体の製造方法は、ＰＣＴ出願ＷＯ９３／２１３１９、ヨーロッパ特許出願第２３９，４００号、ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０９６２２、ヨーロッパ特許出願第３３８，７４５号、及びヨーロッパ特許出願ＥＰ３３２，４２４号（これらの全てを本明細書中に援用する）中に開示されている。
【００４０】
他の態様においては、本発明は、本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体をコードするポリヌクレオチドを提供する。このようなポリヌクレオチドは、配列番号２の軽鎖ＣＤＲ２、配列番号３の軽鎖ＣＤＲ３、及び、好ましくは、表１中に列記された他のＣＤＲｓの内の１以上をコードする。表３は、好ましい抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の核酸配列を示す。
【００４１】
【表３】
【００４２】
【表４】
【００４３】
ヒト抗体をコードするＤＮＡは、対応のヒト抗体領域から実質的に又は排他的に得られた、ＣＤＲｓ以外の、ヒト定常領域及び可変領域をコードするＤＮＡと、ヒトから得られたＣＤＲｓをコードするＤＮＡ（軽鎖可変ドメインＣＤＲｓに関して配列番号１〜４、及び重鎖可変ドメインＣＤＲｓに関して配列番号５〜１３）とを、組換えることにより調製されうる。
【００４４】
本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体をコードするポリヌクレオチドは、本発明に係るポリヌクレオチドの核酸配列と実質的に同じ核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。「実質的に同じ」核酸配列とは、本明細書中、２つの配列が（適当なヌクレオチド挿入又は欠失を伴って）最適にアラインメントされ、そして当該２つの配列の間のヌクレオチドの正しい対合を測定するために比較されるとき、他の核酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、そしてより好ましくは少なくとも９０％の同一性を有する配列として定義される。
【００４５】
抗体の断片をコードするＤＮＡの好適な源は、完全長抗体を発現するいずれかの細胞、例えば、ハイブリドーマ、及び脾臓細胞を含む。断片は、抗体等価物としてそれ自体使用されることができ、又は上記のように、等価物に組換えられることができる。この節に記載されるＤＮＡ欠失及び組換えは、知られた方法、例えば、「抗体の機能的等価物」と題する節において先に列記した公表された特許出願中に記載されたもの、及び／又は以下に記載するような、他の標準的な組換えＤＮＡ技術により実施されうる。ＤＮＡの他の源は、本分野において知られているような、ファージ・ディスプレイ・ライブラリーから製造された１本鎖抗体である。
【００４６】
さらに、本発明は、発現配列、プロモーター、及びエンハンサー配列に作用可能な状態で連結された先に記載されたポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。非制限的に酵母及び哺乳動物細胞培養系を含む、原核、例えば、細菌、及び真核系において抗体ポリペプチドの効率的な合成のためのさまざまな発現ベクターが、開発されてきた。本発明のベクターは、染色体の、非染色体の、そして合成ＤＮＡ配列のセグメントを含むことができる。
【００４７】
好適な発現ベクターのいずれをも使用しうる。例えば、原核クローニング・ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉからのプラスミド、例えば、ｃｏｌＥｌ，ｐＣＲｌ，ｐＢＴ３２２，ｐＭＢ９，ｐＵＣ，ｐＫＳＭ、及びＲＰ４を含む。原核ベクターは、ファージＤＮＡの誘導体、例えば、Ｍｌ３、及び他の繊維状１本鎖ＤＮＡファージを含む。酵母において有用なベクターの例は、２μプラスミドである。哺乳動物細胞内での発現に好適なベクターは、ＳＶ−４０、アデノウィルス、レトロウィルス由来ＤＮＡ配列の周知の誘導体、及び先に記載されるような、機能的哺乳動物ベクターと、機能的プラスミド及びファージＤＮＡとの組換えから得られるシャトル・ベクターを含む。
【００４８】
追加の真核発現ベクターは本分野において知られている｛例えば、PJ. Southern & P.Berg, J. Mol. Appl. Genet, 1 : 327-341 (1982); Soubramani et al., Mol. Cell. Biol, 1 : 854-864 (1981); Kaufinann & Sharp,“Amplification And Expression of Sequences Cotransfected with a Modular Dihydrofolate Reductase Complementary DNA Gene,”J. Mol. Biol, 159 : 601-621 (1982); Kaufhiann & Sharp, Mol. Cell. Biol, 159 : 601-664 (1982); Scahill et al.,“Expression And Characterization Of The Product OfA Human Immune Interferon DNA Gene In Chinese Hamster Ovary Cells,”Proc. Nat'l Acad. ScL USA, 80 : 4654-4659 (1983); Urlaub & Chasin, Proc. Nat'l Acad. ScL USA, 77 : 4216-4220, (1980)を参照のこと（これらの全てを本明細書中に援用する）｝。
【００４９】
本発明において有用な発現ベクターは、発現されるべきＤＮＡ配列又は断片に作用可能な状態で連結された少なくとも１つの発現制御配列を含む。制御配列は、クローン化されたＤＮＡ配列の発現を制御し、かつ、調節するために、ベクター内に挿入される。有用な発現制御配列の例は、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ファージ・ラムダの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコート・タンパク質の制御領域、酵母の解糖プロモーター、例えば、３−ホスホグリセレート・キナーゼのプロモーター、酵母酸ホスファターゼのプロモーター、例えば、Ｐｈｏ５、酵母アルファ−接合因子のプロモーター、及びポリオーマ、アデノウィルス、レトロウィルス、及びシミアン・ウィルス由来のプロモーター、例えば、初期及び後期プロモーター又はＳＶ４０、並びに原核又は真核細胞及びそれらのウィルス又はそれらの組換え体の遺伝子の発現を制御することが知られている他の配列である。
【００５０】
本発明は、先に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞をも提供する。本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、ハイブリドーマ以外の細胞系内で発現されうる。本発明に係るポリペプチドをコードする配列を含む核酸は、好適な哺乳動物宿主細胞の形質転換のために有用であることができる。
【００５１】
特に好ましい細胞系は、高レベルの発現、着目タンパク質の構成的発現、及び宿主タンパク質からの最小汚染に基づいて選択される。発現のための宿主として利用されうる哺乳動物細胞系は、本分野において周知であり、そして非制限的に、Chinese Hamster Ovary (CHO) 細胞、Baby Hamster Kidney (BHK)細胞、そして他の多くのものを含む、不死化細胞系を含む。好適な追加の真核細胞は、酵母及び他の真菌を含む。有用な原核宿主は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＧ−９３６、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１，Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０，Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｘ１７７６，Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ２２８２，Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１、及びＭＲＣ１、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、例えば、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、及びストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）を含む。
【００５２】
本発明の組換え宿主細胞は、抗体の発現を許容する条件下で細胞を培養し、そして宿主細胞又は宿主細胞の取り囲む培地から抗体を精製することにより、抗体を製造するために使用されうる。組換え宿主細胞における分泌のための発現された抗体のターゲッティングは、着目の抗体コーディング遺伝子の５′末端に、シグナル又は分泌リーダー・ペプチド−コーディング配列を挿入することにより容易化される｛Shokri et al., (2003) Appl. Microbiol Biotechnol. 60 (6) : 654-664, Nielsen et al., Prot. Eng., 10 : 1-6 (1997), von Heinje et al., Nucl. Acids Res., 14 : 4683-4690 (1986)（これらの全てを本明細書中に援用する）を参照のこと｝。上記分泌リーダー・ペプチド要素は、原核又は真核配列のいずれかから得られうる。したがって、好適には、宿主細胞の細胞質ゾルから外へのポリペプチドの移動、及び培地中への分泌を指令するために、当該ポリペプチドのＮ末端に連結されたアミノ酸である分泌リーダー・ペプチドが使用される。
【００５３】
本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、追加のアミノ酸残基に融合されうる。このようなアミノ酸残基は、例えば、単離を容易にするためのペプチド・タグであることができる。特異的な臓器又は組織に対する抗体の帰巣のための他のアミノ酸残基も、企図される。
【００５４】
他の態様においては、本発明は、治療の必要な哺乳動物に、本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の治療的に有効な量を投与することにより医学的症状を治療する方法を提供する。治療的に有効とは、所望の治療効果を作り出す、例えば、チロシン・キナーゼ活性を阻害するために有効な量を意味する。
【００５５】
好ましい態様においては、本発明は、治療の必要な哺乳動物に本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の治療有効量を投与することにより腫瘍増殖を低減し又は血管新生を阻害する方法を提供する。特定のメカニズムに拘束されることを意図しないが、本発明に係る方法による治療されうる症状は、例えば、腫瘍増殖又は病理学的血管新生がＶＥＧＦＲ傍分泌及び／又は自己分泌ループを介して刺激されるようなものを含む。
【００５６】
腫瘍細胞の低減に関しては、このような腫瘍は、原発性腫瘍及び転移性腫瘍、並びに難治性腫瘍を含む。難治性腫瘍は、化学療法剤単独、抗体単独、放射線単独又はそれらの組合せによる処置の如き他の処置形態に応答しないか又はそれに対し抵抗性である腫瘍を含む。難治性腫瘍は、上記剤による処置により抑制されるようであるが、処置が中断した後、５年以内、しばしば１０年以内又はそれより遅れて再発する腫瘍をも包含する。
【００５７】
本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、ＶＥＧＦＲ−Ｉを発現する腫瘍の治療に有用である。このような腫瘍は、それらの環境中に存在するＶＥＧＦに対して特徴的に感受性であり、そして自己分泌刺激ループにおいてＶＥＧＦをさらに生産し、そしてＶＥＧＦにより刺激されうる。それゆえ、上記方法は、血管形成されていないか又は未だ実質的に血管形成されていない固形又は非固形腫瘍の治療に有効である。
【００５８】
治療されうる固形腫瘍の例は、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、神経膠腫、及びリンパ腫を含む。このような腫瘍のいくつかの例は、類表皮腫瘍、扁平上皮腫瘍、例えば、頭部及び首部腫瘍、結腸直腸腫瘍、前立腺腫瘍、乳腫瘍、肺腫瘍（小細胞及び非小細胞肺腫瘍を含む）、膵臓腫瘍、甲状腺腫瘍、卵巣腫瘍、及び肝臓腫瘍を含む。他の例は、Ｋａｐｏｓｉ肉腫、ＣＮＳ新形成、神経芽腫、毛細血管芽腫、髄膜腫、及び脳転移、メラノーマ、胃腸及び腎臓癌及び肉腫、横紋筋肉腫、神経膠芽腫、好ましくは神経膠芽腫多形、及び平滑筋肉腫を含む。本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体がそれにとって有効であるところの血管形成される皮膚癌の例は、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、及び悪性ケラチノサイトの増殖を抑制することにより治療されうる皮膚癌、例えば、ヒト悪性ケラチノサイトを含む。
【００５９】
非固形腫瘍の例は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、赤血球性白血病又は単球性白血病を含む。リンパ腫のいくつかの例は、Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ及び非Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓリンパ腫を含む。
【００６０】
血管新生の抑制に関して、本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、血管形成された腫瘍又は新形成、又は過剰な血管新生を特徴とする血管新生疾患をもつ患者を治療するために有効である。このような腫瘍及び新形成は、例えば、悪性腫瘍及び新形成、例えば、芽腫、癌腫又は肉腫、高く血管性の腫瘍及び新形成を含む。本発明に係る方法により処置されうる癌は、例えば、脳、尿生殖器管、リンパ系、胃、腎臓、結腸、喉頭、並びに肺及び骨の癌を含む。非制限的な例は、さらに、類表皮腫瘍、扁平上皮腫瘍、例えば、頭部及び首部の腫瘍、結腸直腸腫瘍、前立腺腫瘍、乳腫瘍、肺腫瘍（肺腺癌、及び小細胞及び非小細胞肺腫瘍を含む）、膵臓腫瘍、甲状腺腫瘍、卵巣腫瘍、及び肝臓腫瘍を含む。上記方法は、血管形成された皮膚癌、例えば、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、及び悪性ケラチノサイト、例えばヒト悪性ケラチノサイトの増殖を抑制することにより治療されうる皮膚癌の治療にも有用である。治療されうる他の癌は、Ｋａｐｏｓｉ’ｓ肉腫、ＣＮＳ新形成（神経芽腫、毛細血管芽腫、骨髄腫及び脳転移）、メラノーマ、胃腸及び腎臓癌腫及び肉腫、横紋筋肉腫、神経膠芽腫、例えば、神経膠芽腫多形、及び平滑筋肉腫を含む。
【００６１】
例えば、炎症及び／又は血管形成を含む過剰な血管新生を特徴とする病理学的血管新生症状の非制限的な例は、アテローム性動脈硬化症、リウマチ様関節炎（ＲＡ）、新生血管緑内障、増殖性網膜症、例えば、増殖性糖尿病性網膜症、黄斑変性、血管腫、血管繊維腫、及び乾癬を含む。非新形成性血管新生疾患の他の非制限的な例は、早熟の網膜症（水晶体後繊維増殖症）、角膜移植拒絶、インスリン依存性真性糖尿病、多発性硬化症、重症筋無力症、クローン病、自己免疫性腎炎、原発性胆汁閉塞性肝硬変、乾癬、急性膵臓炎、同種移植拒絶、アレルギー性炎症、接触皮膚炎及び遅延過敏反応、炎症性腸疾患、敗血性ショック、骨粗しょう症、骨関節炎、ニューロン炎症により誘導される認知欠陥、ウスラーウェーバー症候群、再狭窄、及び真菌、寄生虫、及びウィルス感染、例えば、サイトメガロウィルス感染である。
【００６２】
本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体により治療されうる医学的症状の確定は、十分に当業者の能力及び知識の範囲内にある。例えば、臨床的に有意な新形成又は血管形成疾患を患っているか又は臨床的に有意な兆候に発展するリスクのあるヒト患者は、本発明に係るＶＥＧＦ受容体抗体の投与に好適である。臨床医は、例えば、臨床試験、身体検査、及び医学的／家族の病歴により、個体が上記治療の候補であるか否かを、容易に決定しうる。
【００６３】
本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、腫瘍又は病理学的症状の進行を妨害し、抑制し、又は低減させるために十分な量で、腫瘍又は血管形成関連病理学的症状を患う患者に、治療的処置のために、投与されうる。進行は、例えば、腫瘍又は病理学的症状の成長、浸潤、転移、及び／又は再発を含む。この使用のために有効な量は、当該疾患の重度、及び患者自身の免疫系の一般状態に依存するであろう。投薬スケジュールも、患者の病的状態及び状況に伴って変化するであろうし、そして典型的には、１回のボーラス投与又は連続輸注から、１日当り多数回投与まで（例えば、４〜６時間毎）に亘るであろうし、又は処置内科医及び患者の状態により指示されるであろう。しかしながら、本発明は特定の投与量に限定されることはないことに留意すべきである。
【００６４】
他の態様においては、１以上の他の剤とともに、本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体を投与することによる医学的症状の治療方法を提供する。例えば、本発明の１の態様は、抗新形成又は抗血管形成剤とともに、本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体を投与することにより、医学的症状を治療する方法を提供する。抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、抗新形成剤又は抗血管形成剤の内の１以上に化学的又は生合成的に連結されうる。
【００６５】
好適な抗新形成剤のいずれか、例えば、化学療法剤又は放射線が使用されうる。化学療法剤の例は、非制限的に、シスプラチン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、パクリタキセル、イリノテカン（ＣＰＴ−II）、トポテカム又はそれらの組合せを含む。抗新形成剤が放射線であるとき、放射線源は、処置される患者に対して外部（外部ビーム放射線治療−ＥＢＲＴ）又は内部（近接照射療法−ＢＴ）のいずれかであることができる。
【００６６】
さらに、本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、腫瘍増殖又は血管形成に関連する他の受容体を中和する抗体とともに投与されうる。このような受容体の１例は、ＶＥＧＦＲ−２／ＫＤＲである。１の態様においては、本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、ＶＥＧＦＲ−２に特異的に結合する受容体アンタゴニストとともに使用される。特に好ましいのは、ＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインに結合し、そしてそのリガンド、例えばＶＥＧＦ（Ａ），ＶＥＧＦ−Ｃ，ＶＥＧＦ−Ｄ、又はＶＥＧＦ−Ｅの内のいずれか１つにより結合をブロックする抗原結合性タンパク質である。
【００６７】
このような受容体の他の例は、ＥＧＦＲである。本発明の１の態様においては、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、ＥＧＦＲアンタゴニストとともに使用される。ＥＧＦＲアンタゴニストは、ＥＧＦＲ又はＥＧＦＲのリガンドに結合し、そしてＥＧＦＲがそのリガンドに結合することを阻害する抗体であることができる。ＥＧＦＲのリガンドは、例えば、ＥＧＦ，ＴＧＦ−ｃｅアンフィレギュリン、ヘパリン結合性ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ）、及びベータレキュルリン（ｂｅｔａｒｅｃｕｌｌｕｌｉｎ）を含む。ＥＧＦとＴＧＦ−αは、ＥＧＦＲ仲介刺激をもたらす主要な内因性リガンドであると考えられている。但し、ＴＧＦ−αは、血管形成の促進においてより強力であることが示されている。ＥＧＦＲアンタゴニストはＥＧＦＲの細胞外部分に外部から結合することができ、これは、リガンドの結合を阻害することもしないこともでき、又はチロシン・キナーゼ・ドメインに内部から結合することができる。ＥＧＦＲに結合するＥＧＦＲアンタゴニストの例は、非制限的に、生物学的分子、例えば、ＥＧＦＲに特異的な抗体（及びその機能的等価物）、及び小分子、例えば、ＥＧＦＲの細胞質ドメインに直接作用する合成キナーゼ阻害剤を含む。
【００６８】
腫瘍形成に関連する成長因子受容体の他の例は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦＲ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦＲ）、神経成長因子（ＮＧＦＲ）、及び線維芽細胞成長因子（ＦＧＦＲ）である。
【００６９】
さらに他の態様においては、本発明は、１以上の好適なアジュバント、例えば、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０、及びＩＬ−１３）又は他の免疫刺激剤とともに本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体を投与することにより医学的症状を治療する方法を提供する。例えば、Larrivee et al.,前掲を参照のこと。
【００７０】
併用療法においては、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、他の剤並びにそのいずれかの組合せによる療法を開始する前、間、又は後に、すなわち、抗新形成剤療法の前及び間、前及び後、間及び後、又は前、間及び後に、投与されうる。例えば、本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、放射線療法を開始する、１〜３０日前、好ましくは３〜２０日前、より好ましくは５〜１２日前に投与されうる。しかしながら、本発明は、特定の投与スケジュールのいずれにも限定されない。投与される他の剤の投与量は、例えば、剤のタイプ、処置される医学的症状のタイプ及び重度、及び剤の投与経路を含む多数の要因に依存する。しかしながら、本発明は、特定の投与量のいずれにも限定されない。
【００７１】
本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体を投与するために、そして場合により、抗新形成剤及び／又は他の受容体のアンタゴニストを同時投与するために好適な方法又は経路のいずれをも使用しうる。投与経路は、例えば、経口、静脈内、腹膜内、皮下、又は筋肉内投与を含む。しかしながら、本発明は、特定の投与方法又は経路のいずれにも限定されないことを強調しておく。
【００７２】
本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、受容体に特異的に結合し、そしてリガンド−毒素インターナライゼーションに従って毒性かつ致死性の荷重をデリバリーする、コンジュゲートとして投与されうることに注目のこと。
【００７３】
本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、予防又は治療の目的をもって哺乳動物において使用されるとき、医薬として許容される担体をさらに含む組成物の形態で投与されるであろうことが理解される。好適な医薬として許容される担体は、例えば、水、生理食塩水、リン酸塩バッファー生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、並びにそれらの組合せの内の１以上を含む。医薬として許容される担体は、微量の、補助物質、例えば、水和又は乳化剤、保存料又はバッファーであって結合性タンパク質の保存寿命又は有効性を強化するものをさらに含むことができる。注射用組成物は、本分野において周知であるように、哺乳動物への投与後に活性成分の速い、持続性の又は遅延性の放出を提供するために配合されうる。
【００７４】
本発明に係るヒト抗体は、ヒトへの投与のために特に有用であるけれども、それらは、他の哺乳動物にも投与されうる。用語「哺乳動物」とは、本明細書中に使用するとき、非制限的に、ヒト、実験動物、家庭内ペット、及び農場動物を含むと意図される。
【００７５】
本発明は、本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の治療有効量を含む腫瘍増殖及び／又は血管形成阻害用キットをも含む。キットは、例えば、腫瘍形成又は血管形成に関連する他の成長因子受容体（例えば、先に記載した、ＶＥＧＦＲ−２／ＦＫＤＲ，ＥＧＦＲ，ＰＤＧＦＲ，ＩＧＦＲ，ＮＧＦＲ，ＦＧＦＲ、等）の好適なアンタゴニストのいずれかをさらに含むことができる。あるいは又はさらに、本発明に係るキットは、抗新形成剤をさらに含むことができる。本発明において好適な新形成剤の例は、本明細書中に既に記載した。本発明に係るキットは、その例も先に記載したアジュバントをさらに含むことができる。
【００７６】
他の態様において、本発明は、インビボ又はインビトロにおいて本発明に係る抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体を用いた検査又は診断方法を提供する。このような方法においては、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、ターゲット又はレポーター成分に連結されることができる。
【実施例】
【００７７】
実施例
以下の実施例は、慣用方法、例えば、ベクター及びプラスミドの構築、上記ベクター及びプラスミド内へのポリペプチド・コーディング遺伝子の挿入、又は宿主細胞内へのプラスミドの導入において使用されるものの詳細な説明は含まない。このような方法は、当業者に周知であり、そしてSambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T.(1989), Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press（これを本明細書中に援用する）を含む多数の刊行物中に記載されている。
【００７８】
材料
試薬と化学物質は、特にことわらない限り、Ｓｉｇｍａ（St. Louis, MO）から購入した。ヒトＶＥＧＦ１６５と可溶性組換えヒトＶＥＧＦＲ−Ｉアルカリ・ホスファターゼ（ｒｈｕ ＶＥＧＦＲ−Ｉ ＡＰ）タンパク質を、安定的にトランスフェクトされた細胞内で発現させ、そして当業者に知られた手順に従って細胞培養上清から精製した（Tessler, J. Biol. Chem., 269 : 12456-12461 (1994)（これを本明細書中に援用する））。ＰＩＧＦ及び可溶性組換えＶＥＧＦＲ−Ｉ Ｆｃ（ｒｈｕ ＶＥＧＦＲ−Ｉ Ｆｃ）タンパク質を、（R&D Systems Inc. Minneapolis, MN）から購入した。細胞培養容器及びアッセイ・プレートは、（BD Biosciences, Bedford, MA）から購入した。
【００７９】
細胞系
ヒト乳癌細胞系ＤＵ４４７５，ＭＤＡ−ＭＢ−２３１，ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、並びにマウス、メラノーマ細胞系Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ ８．６５３及びＮＳＯを、American Type Tissue Culture Collection (Manassas, VA）から得た。Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ ８．６５３ Ｂｃｌ／２トランスフェクト体細胞系を先に記載されたようにハウス内で創製した（Ray S, Diamond B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91 : 5548-51, 1994）。腫瘍細胞を、１０％ ＦＣＳ（Hyclone, Logan, UT）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（Invitrogen/Life Technologies, Inc., Rockville, MD）中で維持した。ブタ大動脈内皮ＶＥＧＦＲ−Ｉ発現細胞系は、Dr.L. Claesson-Welsh, Uppsala Universityにより提供され、そして１０％ ＦＣＳ（Hyclone, Logan, UT）を含有するＦ１２培地（Invitrogen/Life Technologies, Inc., Rockville, MD）中で培養された。全ての細胞を、加湿、５％ ＣＯ2雰囲気中３７℃で維持した。
【００８０】
実施例１：抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の生成
ヒト抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉモノクローナル抗体（本明細書中、「抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体」という）を、ヒト免疫グロブリン・ガンマ重鎖及びカッパ軽鎖を作り出すＫＭトランスジェニック・マウス（Medarex, San Jose, Calif）を用いて標準的なハイブリドーマ技術（Harlow & Lane, ed ., Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 211-213 (1998)（これを本明細書中に援用する））により作製した。ＫＭマウスに、完全フロイント・アジュバント中のＶＥＧＦＲ−Ｉ断片結晶化（Ｆｃ）を皮下（ｓ．ｃ．）で免疫化した。動物に、融合前、不完全フロイント・アジュバント中の同一ＶＥＧＦＲ−Ｉタンパク質を、３回腹膜内（ｉ．ｐ．）でブーストした。動物を、リン酸塩バッファー溶液（ＰＢＳ）中ＶＥＧＦＲ−Ｉタンパク質２５ミリグラムの最終ｉ．ｐ．ブーストを受容する前１ヶ月間、休ませた。４日後、脾臓細胞を、上記免疫化されたマウスから収獲し、そしてポリエチレン・グリコール（ＰＥＧ，ＭＷ：１４５０kD）を用いてＰ３−Ｘ６３−Ａｇ ８．６５３ Ｂｃｌ−２トランスフェクト体形質細胞腫細胞と融合させた。融合後、細胞を、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を補ったＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン、チミジン）培地中に再懸濁させ、そしてハイブリドーマ細胞の樹立のためにウェル当り２００マイクロリッターの密度で９６ウェル・プレートに小分けした。融合後６日目に、培地１００マイクロリッターを吸引し、そして新鮮培地１００マイクロリッターで置換した。
【００８１】
実施例２Ａ：実施例１からの抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体はＶＥＧＦＲ−Ｉに結合し、そしてＶＥＧＦＲ−Ｉがそのリガンドに結合することを阻害する
ａ．ＶＥＧＦＲ−Ｉ結合及びブロッキング・アッセイ
融合後１０〜１２日目に、ハイブリドーマを、ＥＬＩＳＡ−ベースの結合及びブロッキング・アッセイにおいて、抗体産生及びｒｈｕ ＶＥＧＦＲ−Ｉタンパク質との培養上清の特異的結合活性についてスクリーニングした。ポジティブなハイブリドーマを、モノクローナル・ハイブリドーマの樹立のために限界希釈により３回、継代培養した。
【００８２】
特に、ハイブリドーマ上清又は精製抗体を、５％ ＦＢＳ及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（ＥＬＩＳＡバッファー）中で希釈し、そして３０分間、ｒｈｕ ＶＥＧＦＲ−Ｉ ＡＰ又はＡＰコートされた９６ウェル・マイクロタイター・プレート内でインキュベートした。プレートを、上記ＥＬＩＳＡバッファーで洗浄し、そして３０分間、ヤギ抗−マウスＩｇＧ−ホースラデッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート（Bio Sourse International, Camarillo, CA）とともにインキュベートした。ＴＭＢ（３，３′，５，５′−テトラ−メチルベンジジン）基質（Kierkegaard and Perry Lab, Inc., Gaithersburg, MD）を、製造者の指示に従って発色のために使用した。４５０ナノメーター（nm）における吸光度を、抗体の結合活性の定量のために読んだ。抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体を産生するハイブリドーマの同定のために、ハイブリドーマ上清を、１時間ＶＥＧＦＲ−Ｉ ＡＰと予めインキュベートした。混合物を、１時間、ＶＥＧＦ又はＰＩＧＦコートされた９６ウェル・マイクロタイター・プレート内でＥＬＩＳＡバッファーとともにインキュベートした。ＡＰのためのＰＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニル・ホスフェート）基質を、製造者の指示に従って発色のために使用した。ＶＥＧＦＲＩのＶＥＧＦ又はＰＩＧＦへの結合の定量のために４０５nmにおける吸光度を読んだ。光学密度（ＯＤ）値を、マイクロタイター・プレート・リーダー（Molecular Device Corp., Sunnyvale, CA）上で読んだ。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ３ソフトウェア（Graph Pad Software, Inc., San Diego, CA）を用いて、抗体のＥＤ５０及びＩＣ５０を分析した。
【００８３】
図３は、「６Ｆ９」、「１３Ｇ１２」、「１５Ｆ１１」、及び「１８Ｆ１」と命名されたハイブリドーマから産生された精製抗体の結合活性を示す。これらの抗体は、ＥＬＩＳＡ−ベースの結合アッセイにおいて、０．１〜０．３nMのＥＤ５０をもつ結合活性を示した。図４と５は、それぞれ、クローン６Ｆ９，１３Ｆ１２，１５Ｆ１１，１８Ｆ１が、０．４〜０．８nMのＩＣ５０をもってＶＥＧＦＲ−Ｉへの、ＰＩＧＦの結合そして０．７〜０．８nMのＩＣ５０をもってＶＥＧＦＲ−ＩへのＶＥＧＦの結合を有効にブロックしたことを示す。上記抗体の結合及びブロッキング特性を以下の表４にまとめる。
【００８４】
【表５】
【００８５】
ｂ．抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体のアフィニティーの計測
抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体クローン６Ｆ９，１３Ｆ１２，１５Ｆ１１，１８Ｆ１のアフィニティーを、製造者により提供された手順に従ってＢＩＡｃｏｒｅ ２０００（Pharmacia, Piscataway, NJ）を用いてプラズモン共鳴技術により測定した。抗体の動態分析を、低密度で、センサー表面上にＶＥＧＦＲ−Ｉの組換え細胞外ドメインを固定化することにより実施した。（Ｋon）速度と解離（Ｋoff）速度を、製造者により提供されたＢＩＡａｖａｌｕａｔｉｏｎ ２．１ソフトウェアを用いて決定した。
【００８６】
抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体クローン６Ｆ９，１３Ｆ１２，１５Ｆ１１、及び１８Ｆ１は、それぞれ、６９，１２１，７０、及び５４pMのＫD値をもって高アフィニティーを示した。上記抗体の動態を以下の表５にまとめる。
【００８７】
【表６】
【００８８】
ｃ．抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の特異性の評価
ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉに対する抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉモノクローナル抗体の特異性を測定するために、精製抗体１８Ｆ１を、ＥＬＩＳＡベースのアッセイにおいてテストした。１μｇ／mlの、組換えヒトＶＥＧＦＲ−Ｉ Ｆｃ、マウスＶＥＧＦＲ−Ｉ Ｆｃ、マウスＶＥＧＦＲ−２ Ｆｃ、又はヒトＶＥＧＦＲ−２アルカリ・ホスファターゼを、一夜４℃で９６ウェル・マイクロタイター・プレート内でＰＢＳでコートした。洗浄後、受容体コートされたプレートを、５％ Ｄｒｙ Ｍｉｌｋ及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳでブロックした。ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉに対する１次抗体１８Ｆ１、マウスＶＥＧＦＲ−Ｉに対するＭＦ１、ヒトＶＥＧＦＲ−２に対するＩＣ１１、又はマウスＶＥＧＦＲ−２に対するＤＣ１Ｏ１の逐次希釈物を、３０分間上記受容体コートされたプレート内でインキュベートした。洗浄後、３０分間上記プレート内で２次抗−１次ＨＲＰコンジュゲート抗体をインキュベートした。プレートを洗浄し、そして発色のために基質ＴＭＢ（３，３′，５，５′−テトラ−メチルベンジジン）とともにインキュベートした。４５０nmにおける吸光度を、抗体の結合活性の定量のためにＯＤ値として読んだ。データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて分析した。
【００８９】
図６Ａ−Ｄは、ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉに対するモノクローナル抗体１８Ｆ１の特異性を（図６Ａ）、そして当該抗体が、マウスＶＥＧＦＲ−Ｉ（図６Ｂ）、ヒトＶＥＧＦＲ−２（図６Ｃ）、及びマウスＶＥＧＦＲ−２（図６Ｄ）との交差反応性を有さないことを示す。結果は、抗−ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１が、その対応の受容体と厳密な結合特異性を有することを示す。
【００９０】
ｄ．ウェスタン・ブロット
集密ブタ大動脈内皮ＶＥＧＦＲ−Ｉ発現（ＰＡＥ−ＶＥＧＦＲ−Ｉ）細胞及びＢＴ４７４ヒト乳癌細胞を４８時間、血清消耗Ｆ１２培地中で培養した。次いで、当該細胞を、１時間０．１〜３７μｇ／mlの範囲の濃度で抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体クローン１８Ｆ１とともに予めインキュベートし、そしてその後、３７℃で５分間ＶＥＧＦ又はＰＩＧＦで刺激した。次いで細胞を、氷冷ＰＢＳで濯ぎ、そして溶解バッファー（５０mM ＨＥＰＥＳ １５０mM ＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、並びに１０％グリセロールであって１mMフェニルメチルスルホニル・クロリド、１０μｇ／mlアプロチニン、１０μｇ／mlロイペプチン、及び１mMナトリウム・バナデートを含むもの）中に溶解した。細胞溶解産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、そしてＩｍｍｏｂｉｌｏｎ膜（Millipore Corp. Billerica, MA）上に転移させた。転移後、ブロットを、ブロッキング溶液とともにインキュベートし、そして抗ホスホチロシン抗体（ＰＹ２０，Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）でプローブし、その後洗浄した。タンパク質含有物を、ホースラティッシュ・ペルオキシダーゼ結合２次抗体を用いて可視化し、その後化学発光を増強した（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）。抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ特異的抗体（Oncogene Research Products, San Diego, CA）を、ＶＥＧＦＲ−Ｉの再ブロットのために使用した。
抗ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の全てが、ＶＥＧＦＲ−Ｉ組換えタンパク質の１８０kD分子を認識した。
【００９１】
実施例２Ｂ：抗−ヒト抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉに特異的である
ＨｕＶＥＧＦＲ−Ｉ−Ｆｃ、マウスＶＥＧＦＲ−Ｉ−ＡＰ（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）又はｈｕＶＥＧＦＲ−２−ＡＰ（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（１００ng／ウェル）を９６ストリップ−ウェル・プレート上にコートし、そして５％ミルク／ＰＢＳでブロックした。ＶＥＧＦＲ−Ｉ又はＶＥＧＦＲ−２が結合したプレートへの、１８Ｆ１、及びその他の抗−ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体又はラット抗−マウスＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体、ＭＦ１（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｒｅｆ．１８）の結合を、先にハイブリドーマ上清スクリーニングについて記載したように評価した。但し、結合された抗体は、１８Ｆ１及び抗−ヒトＶＥＧＦＲ−２抗体ＩＣ１１に関しては、ヤギ抗−ヒト・カッパ−ＨＲＰ抗体（BioSource International, Camarillo, CA）で、又はＭＦ１に関しては、ヤギ抗−ラットＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（BioSource International）で、検出した。
【００９２】
８Ｆ１は、ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉとの特異的反応性を示したが（図３２Ａ）、マウスＶＥＧＦＲ−Ｉ（図３２Ｂ）及びヒトＶＥＧＦＲ−２（図３２Ｃ）との交差反応性は示さなかった。抗−マウスＶＥＧＦＲ−Ｉブロッキング抗体ＭＦ１も、種特異的にマウスに結合性であることが証明されたが（図３２Ｂ）、ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉには結合性でない（図３２Ａ）。
【００９３】
実施例３：抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、ＶＥＧＦＲ−Ｉ発現細胞上の天然ＶＥＧＦＲ−Ｉに結合する
ａ．フロー・サイトメトリー分析
１０6個のＰＡＥ−ＶＥＧＦＲ−Ｉ細胞のアリコートを、集密に満たない培養物から収獲し、そして氷上で１時間、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、及び０．０２％アジ化ナトリウム（染色バッファー）を含有するＰＢＳ中の、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体クローン６Ｆ９，１３Ｇ１２，Ｆ１１、及び１８Ｆ１とともにインキュベートした。１０6個のＤＵ４４７５ヒト乳癌細胞のアリコートを、集密に満たない培養物から収獲し、そして氷上で１時間、１ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．０２％アジ化ナトリウム（染色バッファー）を含有するＰＢＳ中の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体クローン１８Ｆ１とともにインキュベートした。対合したＩｇＧアイソタイプ（Jackson Immuno Research, West Grove, PA）を、ネガティブ・コントロールとして使用した。細胞を、フロー・バッファーで２回洗浄し、そして氷上３０分間、染色バッファー中のフルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体（BioSource International, Camarillo, CA）とともにインキュベートした。細胞を先のように洗浄し、そしてＥｐｉｃｓ ＸＬフロー・サイトメーター（Beckman-Coulter, Hialeah, FL）上で分析した。死んだ細胞及び残渣を、前方及び側方光散乱に基づき上記分析から除外した。平均蛍光強度単位（ＭＦＲＪ）を、ポジティブ集団のパーセンテージを乗じた平均ｌｏｇ蛍光として計算した。
【００９４】
図７は、ＰＡＥ−ＶＥＧＦＲ−Ｉ発現細胞とのクローン６Ｆ９，１３Ｇ１２，１５Ｆ１１、及び１８Ｆ１の結合反応性を示す。図８Ａと８Ｂは、それぞれ、ＰＡＥ−ＶＥＧＦＲ−Ｉ発現細胞、及びＤＵ４４７５ヒト乳癌腫とのクローン１８Ｆ１の結合反応性を示す。これらの結果は、ヒト抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体が、細胞表面上に発現された天然ＶＥＧＦＲ−Ｉに結合することを示す。
【００９５】
ｂ．表面ＶＥＧＦＲ−Ｉブロッキング・アッセイ
細胞表面上のＶＥＧＦＲ−Ｉへの125Ｉ−ＶＥＧＦの結合を、ＰＡＥ−ＶＥＧＦＲ−Ｉ発現細胞を用いて実行した。細胞を、非コート・プラスチック細胞培養プレート上で培養し、これは、125Ｉ−ＶＥＧＦの特異的結合に影響を及ぼさずに非特異的結合を低減することが分かっていた。集密細胞を、２４時間、血清−及び成長補充物質−不含ダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）ＺＦ−１２培地（Invitrogen, Carsbad, CA）中でインキュベートした。細胞を、０．０２５Ｍ ＨＥＰＥＳ及び１mg／mlウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する氷冷ＤＭＥＭ ＺＦ−１２培地で１回濯いだ。標識ＶＥＧＦの２００倍モル過剰の濃度で、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１又はコールドＶＥＧＦの逐次希釈物を、プレート内の各ウェルに添加し、そして１時間４℃でインキュベートした。洗浄後、125Ｉ−ＶＥＧＦを２ng／mlの濃度で添加し、そしてプラットフォーム・シェーカー上で２時間４℃でインキュベートした。細胞を、１mg／ml ＢＳＡ及び０．２５mM ＣａＣｌ2を含有するＰＢＳで３回洗浄し、そして１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１mg／ml ＢＳＡ、及び０．１６％ ＮａＮ3の存在下５分間インキュベートして、結合ＶＥＧＦを除去した。各ウェルの可溶性分をガンマ・カウンター内でカウントした。上記アッセイを、少なくとも３つの独立した実験において３連で実行し、そしてデータを、Ｐｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを用いて分析した。
【００９６】
図９は、天然ＶＥＧＦＲ−Ｉがブタ大動脈内皮細胞上の125Ｉ−ＶＥＧＦに結合することを劇的に妨害する抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１の強いブロッキング活性を示す。
【００９７】
実施例４：抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、ＶＥＧＦＲ−Ｉの自己リン酸化、並びにＶＥＧＦ及びＰＩＧＦに応答するＭＡＰＫ及びＡｋｔの活性化を阻害する
ａ．ＶＥＧＦＲ−Ｉリン酸化アッセイ
そのリガンドにより誘導されるＶＥＧＦＲ−Ｉの自己リン酸化の並びにそれにより得られる古典的ＭＡＲＫ、細胞外シグナル調節タンパク質キナーゼ１Ｚ／２（ＥＰＫ １Ｚ２）、及びＰＢＫ／Ａｔｋ下流シグナリング経路の活性化は、細胞の生物学的応答、例えば、増殖、運動性、生存、及び分化を仲介する。ＶＥＧＦＲ−Ｉをリン酸化し、そしてＥＲＫ１Ｚ２及びＡｋｔキナーゼ下流シグナリングを活性化する抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の能力は、ＰＡＥ−ＶＥＧＦＲ−Ｉトランスフェクト体及びＢＴ４７４乳癌細胞を用いることにより測定される）。
【００９８】
ＰＡＥ−ＶＥＧＦＲ−Ｉ及びＢＴ４７４細胞は、１００又は１５０mm2プレート内に５×１０5／ウェルの密度で播かれ、そして１８〜４８時間無血清培地中で培養される。培養基を交換した後、細胞を、１時間、３７℃で、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体クローン６Ｆ９，１５Ｆ１１、及び１８Ｆ１又はアイソタイプ対照で処理し、そしてその後、１０分間、５０ng／mlのＶＥＧＦ又は１００ng／mlのＰＩＧＦとともにインキュベートした。処理後、全細胞タンパク質抽出物を、溶解バッファー〔２０mM ＨＥＰＥＳ（pH７．４）、１０mM ＭｇＣｌ2、２mM ＭｎＣｌ2、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、及び１mM ＤＴＴ〕を用いて単離し、そして抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体（Ｃ−１７，Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）を用いて免疫沈降させた。リン酸化ＶＥＧＦＲ−Ｉのウェスタン・ブロットを、抗−ホスホ−キナーゼ抗体（ＰＹ−２０，Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）を用いて検出した。タンパク質を、発電化学発光システム（ＥＣＬ）（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）を用いて検出し、そしてＮＩＨ Ｉｍａｇｅ（National Institute of Mental Health, Bethesda, MD）を用いた濃度計により定量した。
【００９９】
ｂ．インビトロ・キナーゼ・アッセイ
ＭＡＰＫ及びＡｋｔリン酸化の評価のために、ＢＴ４７４細胞を、１８時間、無血清培地中、１２ウェル・プレート内で５×１０5／ウェルの密度で播いた。細胞を、３７℃で、１時間、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体クローン１８Ｆ１又はアイソタイプ対照で処理し、そして５〜１０分間、５０ng／mlのＶＥＧＦ又は１００ng／mlのＰＩＧＦとともにインキュベートした。細胞溶解、タンパク質単離、及びエレクトロブロッティングを実行した。膜を、１μｇ／mlの濃度で、リン酸化ｐ４４／ｐ４２ ＭＡＰキナーゼ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４，Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）又はリン酸化Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３，Cell Signaling Technology, Beverly, MA）に対する抗体とともにインキュベートし、その後、２次ＩｇＧ−ＨＲＰ（１：５０００）とともにインキュベートした。サンプルの等しいローディングを保証するために、膜を、ストリップし、そして抗−ｐ４４／ｐ４２（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）又は抗−Ａｋｔ抗体（Cell Signaling Technology, Beverly, MA）で再プローブ化した。
【０１００】
ｃ．結果
図１０〜１４に示すように、ＰＡＥ−ＶＥＧＦＲ−Ｉトランスフェクト体及びＢＴ４７４乳癌細胞における、ＶＥＧＦＲ−Ｉの有意なリン酸化及びＥＲＫ１／２及びＡｋｔシグナリングの活性化は、ＶＥＧＦ及びＰＩＧＦにより誘導された。これは、乳癌細胞と内皮細胞の両者におけるＶＥＧＦＲ−Ｉ、及び当該受容体関連下流キナーゼ・シグナリング経路の内因的活性を示唆している。図１０と１１に、それぞれ、示すように、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１による処理は、ＰＡＥ−ＶＥＧＦＲ−Ｉトランスフェクト体及びＢＴ４７４乳癌細胞において、非処理対照に比較してＶＥＧＦＲ−ＩのＰＩＧＦ又はＶＥＧＦ刺激リン酸化を有意に低下させた。図１２と１３に、それぞれ、示すように、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１５Ｆ１１及び６Ｆ９による処理も、ＰＡＥ−ＶＥＧＦＲ−Ｉトランスフェクト体細胞におけるＰＩＧＦ及びＶＥＧＦにより誘導されるＥＲＫ１／２下流シグナリングを劇的に阻害した。Ａｋｔプロテイン・キナーゼの活性化は、乳癌において細胞生存を仲介する重要な細胞内シグナリング事件である。図１４Ａと１４Ｂに、それぞれ示すように、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１による処理は、ＰＡＥ−ＶＥＧＦＲ−Ｉトランスフェクト体細胞におけるＰＩＧＦ及びＶＥＧＦにより誘導されるＥＲＫ１／２下流シグナリングを劇点に阻害した。
【０１０１】
図１５に示すように、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１は、ＢＴ４７４乳癌細胞におけるＡｋｔのＰＩＧＦ刺激リン酸化を有意にブロックした。これらの結果は、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体による処理が、乳癌細胞と内皮細胞の両者においてＶＥＧＦＲ−Ｉと下流シグナリング・キナーゼ経路の活性化を阻害するために有効であることを証明する。
【０１０２】
実施例５：抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、乳腫瘍細胞のインビトロ増殖をブロックする
腫瘍低酸素症は、悪性進行の増強、侵略性の増加、及び化学療法剤耐性に関連する。低酸素症腫瘍細胞は、ＶＥＧＦＲ−Ｉを含むさまざまな遺伝子発現のアップレギュレーションによる生存及び増殖のためのシグナリング経路を活性化する生物学的応答を経験する（Harris AL. Nat Rev Cancer. 2 : 38-47, 2002）。
【０１０３】
細胞増殖アッセイ
ＤＵ４４７５癌腫細胞を、１８時間無血清培地中９６ウェル・プレート内で５×１０3／ウェルの密度で播き、そしていくつかのケースにおいて、１００nMのデスフェロキサミンでさらに５時間処理した。腫瘍細胞増殖に対する抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の阻害効果を、４８時間、５０ng／mlのＶＥＧＦ又は２００ng／mlのＰＩＧＦの存在下、３，１０、及び３０μｇ／mlの投与量において、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体クローン６Ｆ９，１３Ｇ１２，１５Ｆ１１、及び１８Ｆ１とともに細胞をインキュベートすることにより測定した。次いで、生存細胞を、Ｃｏｕｌｔｅｒサイトメーター（Coulter Electronics Ltd. Luton, Beds, England）を用いて３連でカウントした。各実験を３連で実行した。
【０１０４】
低酸素症擬似剤デスフェロキサミンで予め処理されたＤＵ４４７５腫瘍細胞の増殖速度は、ＶＥＧＦ又はＰＩＧＦのいずれかの刺激に応答して約２倍高められた。図１６と１７に、それぞれ、示すように、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体による処理は、投与量に応答して、ＤＵ４４７５乳癌細胞のＶＥＧＦ及びＰＩＧＦ刺激増殖を有効に低下させた。図１８Ａと１８Ｂは、それぞれ、ＤＵ４４７５乳癌細胞のＶＥＧＦ及びＰＩＧＦ刺激増殖の細胞カウント数に対する、抗体クローン１８Ｆ１の抗体濃度を、プロットする。ＩＣ５０値で表される抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体によるインビトロにおけるＰＩＧＦ誘導ＤＵ４４７５細胞増殖の阻害を、以下の表６にまとめる。
【０１０５】
【表７】
【０１０６】
実施例６Ａ：抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、乳腫瘍異種移植片の成長を抑制する
ヒト乳癌異種移植片の処理
ヒト抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の抗腫瘍効果を、ヒト異種移植片乳腫瘍モデルにおいて試験した。
無胸腺ヌード・マウス（Charles River Laboratories, Wilmington, MA）に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Collaborative Research Biochemicals, Bedford, MA）中で混合された２×１０6個のＤＵ４４７５細胞又は５×１０6個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を、左脇腹領域に皮下注射した。上記ＤＵ４４７５及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１モデルにおいて、腫瘍は、約２００mm3の大きさに達するように放置され、そしてその後、マウスを、群当り１２〜１６匹の動物から成る群に無作為に分けた。動物は、各週３回、０．５mg（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）又は１mg（ＤＵ４４７５）の投与量で、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体クローン６Ｆ９，１５Ｆ１１、又は１８Ｆ１のｉ．ｐ．投与を受けた。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５モデルにおいては、腫瘍細胞を、マウスの乳房のふくらんだ領域内に皮下移植した。腫瘍が成長して約２００mm3の大きさに達した後、マウスを、群当り１５匹の動物の群に無作為に分け、そして週当り３回１８Ｆ１抗体０．５mg／投与を腹膜内投与した。対照群内のマウスは、等体積の生理食塩水溶液を受容した。動物の処理を、実験の期間、続けた。腫瘍を、週２回カリパスで計測した。腫瘍体積を、以下の式〔π／６（ｗ１×ｗ２×ｗ２）〕｛式中、ｗ１は最大腫瘍直径を表し、そしてｗ２は最小腫瘍直径を表す。｝を用いて計算した。
【０１０７】
図１９Ａと１９Ｂに示すように、週３回の１mg／投与の投与量における抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体６Ｆ９，１５Ｆ１１，１３Ｆ１２、及び１８Ｆ１の全身投与は、ＤＵ４４７５異種移植片の腫瘍増殖の統計的に有意な抑制を導いた（ｐ＜０．０５）。図２０Ａ，２０Ｂ、及び２０Ｃに、それぞれ、示すように、週３回の０．５又は１mg／投与の投与量における抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１の全身投与は、ＤＵ４４７５，ＭＤＡ−ＭＢ−２３１，ＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片の腫瘍増殖の統計的に有意な抑制を導いた（ＡＮＯＶＡ ｐ＜０．０５）。図２１Ａと２１Ｂに示すように、週２回の２０又は４０mg／kgの投与量における癌細胞増殖の抑制のためのヒトＶＥＧＦＲ−Ｉに対する抗体クローン１８Ｆ１、及び腫瘍血管形成を抑制するためのマウスＶＥＧＦＲ−Ｉに対するクローンＭＦ１による処理は、いずれかの抗体単独に比較したとき、ＤＵ４４７５及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片モデルにおける腫瘍増殖のより強い抑制をもたらした（ｐ＜０．０５）。これらの結果は、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体による癌細胞増殖の直接的促進及び腫瘍血管形成の調節におけるＶＥＧＦＲ−Ｉのインビボにおける機能の遮断が、異種移植片モデルにおけるＶＥＧＦＲ−Ｉボジティブ乳腫瘍の増殖を抑制するために有効であることを証明するものである。
【０１０８】
実施例６Ｂ：抗−ヒト抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、乳癌細胞のインビトロ増殖をブロックする
ＤＵ４４７５癌腫細胞（２×１０4／ウェル）を、１８時間無血清培地中２４ウェル・プレートに播き、そしてその後、さらに６時間、低酸素症擬似剤デスフェリオキサミン（Ｓｉｇｍａ）で処理した。抗−ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１の逐次希釈物を、３連で上記プレートに添加し、そして４８時間、５０ng／mlのＶＥＧＦ−Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）又は２００ng／mlのＰＩＧＦの存在下でインキュベートした。全細胞数（結合、及び懸濁液中）を、Ｃｏｕｌｔｅｒ細胞カウンター（Coulter Electronics Ltd., England）を用いて各ウェルについて測定した。
【０１０９】
ＩＭＣ−１８Ｆ１の処理は、ＤＵ４４７５乳癌細胞のＶＥＧＦ−Ａ及びＰＩＧＦ刺激増殖を有意にブロックした（それぞれ、図３１Ａと３１Ｂ；推定ＩＣ５０：３０〜５０nM）。アイソタイプ対照抗体は、細胞増殖に対して効果を有していなかった。したがって、１８Ｆ１は、腫瘍細胞増殖／生存のＶＥＧＦＲ−Ｉリガンド誘導促進を抑制した。
【０１１０】
実施例７：抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、結腸癌細胞のＶＥＧＦ−Ａ及びＶＥＧＦ−Ｂ刺激コロニー形成を阻害する
１０％ ＦＢＳ及び１％アガロースを含有する１mL ＤＭＥＭ培地（Cambrex Corporation, East Rutherford, NJ）を、６つのウェル・プレートの各ウェルに入れた。無血清培地中のＨＴ−２９ヒト結腸癌腫細胞を、１時間、６６nMの１８Ｆ１又は対照ＩｇＧで処理し、その後、さらに４時間、１０ng／mLのＶＥＧＦ−Ａ又は５０ng／mlのＶＥＧＦ−Ｂで処理した。処理された細胞を、０．５％アガロース並びに適当な抗体及び／又はリガンドを含有する１０％ ＦＢＳ ＤＭＥＭ １mLと混合した。２５０個の細胞を含有する上記懸濁液１mLを、上記１％アガロース基底層の上面に、各ウェル内で、プレーティングした。２日後、抗体及び／又はリガンドを含有する追加の培地を、上記ウェルに添加して、アガロースを水和される状態に保った。細胞を３７℃で１４日間放置して増殖させた。その後、直径５０μｍ超のコロニーを、解剖顕微鏡を用いてカウントした。ｈｉＳａｔ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｖ２．０３，GraphPad Software, San Diego, CA）を用いて、統計分析を実施した。
【０１１１】
コロニーの数と大きさは、完全培地のみ中での非処理細胞に比較して、細胞がＶＥＧＦ−Ａ又はＶＥＧＦ−Ｂで処理されたウェル内で有意に増加した。図２２に示すように、１８Ｆ１での処理は、リガンドによる刺激の不存在下、ベース活性に比較して、リガンド誘導コロニー形成を完全に阻害した（ｐ＜０．０３）（図２２）。したがって、接着細胞と非接着細胞の両者に関して、１８Ｆ１は、腫瘍細胞の生存と増殖を抑制する能力を有している。
【０１１２】
実施例８：抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体は、結腸癌細胞のＶＥＧＦ−Ａ及びＶＥＧＦ−Ｂ誘導転移及び侵入を阻害する
ＨＴ−２９細胞（２．５×１０4）又はＳＷ４８０細胞（１．５×１０4）を、２４ウェルＭＡＴＲＩＧＥＬTMコート（ＨＴ−２９）又は非コート（ＳＷ４８０）８．０μｍ多孔サイズ膜挿入物（Becton Dickinson Labware, Bedford, MA）の上部表面における抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１（６６nM）とともに１％ ＦＢＳを含有する培地中でインキュベートした。上記挿入物を、４８時間１０ng／mL ＶＥＧＦ−Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）又は５０ng／mL ＶＥＧＦ−Ｂ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有する低部チャンバー内に入れた。上記挿入物の上部チャンバーに残存する細胞を、綿棒で除去した。上記挿入物の下側に移動する細胞を、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ（Harleco, Gibbstown, NJ）で染色し、そして１００倍の倍率で１０個の無作為の視野内でカウントした。ＩｎＳｔａｔ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｖ２．０３，GraphPad Software, San Diego, CA）を用いて統計分析を実施した。
【０１１３】
図２３Ａと２３Ｂに示すように、ＶＥＧＦ−Ａ又はＶＥＧＦ−Ｂは、非コート膜を通ってリガンドに向かうＨＴ−２９細胞の移動を誘導した。図２４Ａと２４Ｂに示すように、上記リガンドは、ＭＡＴＲＩＧＥＬTMコート膜を通ってのＳＷ４８０細胞の侵入をも誘導した。１８Ｆ１は、リガンドによる刺激の不存在下、ベース活性に比較して、ＶＥＧＦＲ−Ｉリガンド誘導転移及び侵入を完全にブロックした（ｐ＜０．０５．図２３と２４）。したがって、腫瘍細胞増殖及び生存に対する負の効果に加えて、１８Ｆ１は、腫瘍細胞の侵入及びその後の転移を抑制する手段を提供しうる。
【０１１４】
実施例９：抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ特異的抗体による処理は、ＶＥＧＦＲ−Ｉ発現性ヒト異種移植片腫瘍のインビボにおける増殖を抑制する
雌の無胸腺ｎｕ／ｎｕマウス６週齢に、ＭＡＴＲＩＧＥＬTM（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で１：１に希釈された、培地中のヒト腫瘍細胞系を含有する０．４mL体積の懸濁液を、側背表面上に皮下注射した。異種移植片モデルにおいて使用された細胞系（カッコ内に細胞投与量を示す（１０6細胞／マウス））は、ヒト結腸癌細胞系ＤＬＤ−Ｉ（５）、ＧＥＯ（５）、及びＨＴ−２９（５）；ヒト乳癌細胞系ＤＵ４４７５（２）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（５）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（５）、及びＢＴ４７４（５）であった。腫瘍が約２００〜３００mm3に達したとき、マウスを、腫瘍サイズにより無作為に分け、そして処理群に分割した。腫瘍増殖を、週に約２回評価し、腫瘍体積を、π／６×（長さ×幅2）｛式中、長さ＝最大直径、そして幅＝長さに対して垂直な直径｝として計算した。腫瘍寸法を、カリパスを用いて計測した。Ｔ／Ｃ％を、１００×（最終処置腫瘍体積／開始処置腫瘍体積）／（最終対照腫瘍体積／開始対照腫瘍体積）として計算した。
【０１１５】
１８Ｆ１を、０．９％ ＵＳＰ生理食塩水（Ｂｒａｕｎ）又はリン酸塩バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）中で希釈し、そして０．５mL／マウスの体積で腹膜内投与した。腫瘍増殖に対する処置の効果を、分散の反復計測分析を用いて分析した（ＲＭ ＡＮＯＶＡ）。ｐ＜０．０５は有意と考えられる。
【０１１６】
図２５に示すように、腹膜内１８Ｆ１の投与は、ＤＵ４４７５（図２５Ａ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５（図２５Ｂ）異種移植片腫瘍を有意に（ｐ＜０．０５）抑制した。図２６に示すように、１８Ｆ１単独療法の有意な抗腫瘍効果も、ＨＴ−２９（図２６Ａ）、ＤＬＤ−Ｉ（図２６Ｂ）、及びＧＥＯ（図２６Ｃ）結腸癌異種移植片に対して観察された。これらの結果は、ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉの遮断が、ＶＥＧＦＲ−Ｉ発現性ヒト腫瘍細胞系により樹立された異種移植片腫瘍の増殖を有効に抑制することを証明するものである。
【０１１７】
実施例１０：抗−ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉ処置は、増殖及び生存経路のインビボにおけるシグナリングを抑制し、そして腫瘍細胞アポトーシスを誘導する
パラフィン埋め込みＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片を、腫瘍細胞増殖、生存、及びアポトーシスのマーカーについて、免疫組織化学的に評価した。増殖及び生存のマーカーは、ｋｉ−６７（ウサギｐＡｂ；Lab Vision Corporation, Fremont, CA）、ホスホ特異的ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（ウサギｐＡｂ；Cell Signaling Technology）、及びホスホ特異的Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）（ウサギｐＡｂ；Cell Signaling Technology）を含んでいた。ウサギ抗体のためのＥｎＶｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（DAKO Cytomation, Carpenteria, CA）を、キットの指示書に従い、クロマゲンとして３，３′ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）とともに使用した。Ｍａｙｅｒ’ｓヘマトキシリン中での短時間の対比染色の後、全ての切片を、脱水し、清澄化し、そして永久マウンティング培地を用いてカバースリップをした。腫瘍アポトーシスを、キットの指示書に従って、ＡｐｏｐＴａｇ（登録商標）Peroxidase In Situ Apoptosis Detectio Kit (Chemicon, Temecula, CA）を用いてＴＵＮＥＬアッセイにより評価した。ポジティブ免疫染色及びＴＵＮＥＬポジティブ免疫蛍光を分析し、そしてＡｘｉｏａｍデジタル・カメラ（Carl Zeiss, Germany）を備えたＡｘｉｏｓｋｏｐ光学顕微鏡を用いて画像形成した。
【０１１８】
図２７に示すように、増殖性細胞（ｋｉ−６７）のためのマーカーは、２０mg／kgにおける１８Ｆ１による処理から１４日後（雌ｎｕ／ｎｕ無胸腺マウスにおいて約０．５mg／投与）、２回／週（試験番号３０６７−０４）、有意に低下した。さらに、１８Ｆ１処理は、上記時点においてＭＡＰＫの活性化における顕著な低下をもたらした（図２７）。ＴＵＮＥＬポジティブ事件により計測されるアポトーシスの増加（図２７）、及びＡｋｔリン酸化における有意な低下は、１８Ｆ１による処置から１週間後（０．５mg／投与、Ｍ−Ｗ−Ｆ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片腫瘍においても検出された。
【０１１９】
実施例１１：ヒト及びネズミＶＥＧＦＲ−Ｉのインビボにおける遮断は、ヒト乳癌異種移植片に対するより大きな抗腫瘍活性を導く
１８Ｆ１を、マウスＶＥＧＦＲ−Ｉ，ＭＦ１に対する抗体とともに使用した。１８Ｆ１を、０．９％ ＵＳＰ生理食塩水（Ｂｒａｕｎ）又はリン酸塩バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）中で希釈し、そして０．５ml／マウスの体積で腹膜内投与した。腫瘍増殖に対する処置の効果を、分散の反復計測分析を用いて分析した（ＲＭ ＡＮＯＶＡ）、ｐ＜０．０５は有意であると考えられた。図２８に示すように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図２８Ａ）とＤＵ４４７５（図２８Ｂ）異種移植片の両者において、１８Ｆ１による腫瘍発現ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉの阻害、及びＭＦ１による内因性マウスＶＥＧＦＲ−Ｉの阻害は、有意な腫瘍増殖阻害（ｐ＜０．０５）をもたらした。ＭＦ１は、腫瘍血管形成の低減を通じて腫瘍増殖を阻害することが先に示されている。１８Ｆ１とＭＦ１の組合せは、単独療法よりも有意に大きな腫瘍増殖阻害をもたらした（ｐ＜０．０５）。１８Ｆ１とＭＦ１の併用療法は、体重損失を伴わなかった。これらのデータは、患者における１８Ｆ１処置による腫瘍血管形成と腫瘍細胞増殖及び生存の２重阻害を裏付けるものである。
【０１２０】
実施例１２：化学療法と併用される抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体
１８Ｆ１＋ＭＦ１を、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１モデルにおける細胞毒療法、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、及びパクリタキセルと併用した。１８Ｆ１を、０．９％ ＵＳＰ生理食塩水（Ｂｒａｕｎ）又はリン酸塩バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）中で希釈した。マウス当り一定投与量で投与された抗体処置を、０．５mL／マウスの体積で投与した。体重に正比例する投与量で投与された抗体と細胞毒処置を、１０μＬ／体重ｇの体積で与えた。５−フルオロウラシルとロイコボリン（５−ＦＵ／ＬＶ）を、ＵＳＰ生理食塩水中で別々に希釈し、そして別々に投与した。パクリタキセルを、５％ベンジル・アルコール（Ｓｉｇｍａ）、５％ Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（Ｓｉｇｍａ）、及び９０％ ＵＳＰ生理食塩水中で、又は５％エチル・アルコール（Ｓｉｇｍａ）、５％ Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ、及び９０％ ＵＳＰ生理食塩水中で作製した。シクロホスファミドとドキソルビシンを、投与のためにＵＳＰ生理食塩水中に溶解した。ＡＵ処置は、ｉ．ｐ．で投与された。腫瘍増殖に対する処置の効果を、分散の反復計測分析を用いて分析した（ＲＭ−ＡＮＯＶＡ）、ｐ＜０．０５は有意であると考えた。
【０１２１】
図２９に示すように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１モデルにおいては、シクロホスファミド療法の活性投与量への１８Ｆ１＋ＭＦ１の添加は、抗腫瘍効果を有意に増大させた。図３０に示すように、５−ＦＵ／ＬＶとドキソルビシン化学療法が一定の投与レベルにおいて投与されたとき、１８Ｆ１とＭＦ１は、上記２つの化学療法の抗腫瘍効果を高めた。
【０１２２】
ＤＵ４４７５異種移植片モデルにおいては、ＩＭＣ−１８Ｆ１＋ＭＦ１が５−ＦＵ／ＬＶ、ドキソルビシン、及びパクリタキセルと併用されたとき活性が高まる傾向があった（より低いＴ／Ｃ％）。但し、この効果は、ＩＭＣ−１８Ｆ１＋ＭＦ１単独、又は細胞毒性剤単独療法に比較して統計的有意に達しなかった。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１においては、これは、ドキソルビシンに関して再び当てはまった。但し、５−ＦＵ／ＬＶ及びパクリタキセルに関しては、併用により活性が高まるという傾向はなかった。アビシチーの欠如は、選択された投与レベルにおける単独療法としての５−ＦＵ／ＬＶとパクリタキセルの最小効果に因ることができる。シクロホスファミドとの併用も、ＩＭＣ−１８Ｆ１＋ＭＦ１単独（Ｔ／Ｃ％＝６０）又はシクロホスファミド単独療法（Ｔ／Ｃ％＝６５）に比較して、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５モデル（Ｔ／Ｃ％＝５１）において増加した活性を有していた。但し、これらの差は統計的に有意ではなかった。同一の試験においてこれは、ドキソルビシンとパクリタキセルにも当てはまった。上記のＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５データと同様に、ＢＶＩＣ−１８Ｆ１，ＭＦ１、及びシクロホスファミドの組合せは、ＤＵ４４７５異種移植片モデルにおいて、抗体又は細胞毒療法単独に比較して、高められた抗腫瘍活性を示した。
【０１２３】
統計分析
腫瘍体積とインビトロ腫瘍細胞増殖の分析は、ＳｉｇｍａＳｔａｔ統計パッケージ（Ｖ．２．０３；Jandel Scientific, San Rafael, CA）を用いたスチューデントｔ−テストを用いて分析した。ｐ＜０．０５の差は、統計的に有意であると考えた。
【０１２４】
実施例１３：抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体のＶＨ／ＶＬ領域のクローニング及びシーケンシング
ポリ（Ａ＋）ｍＲＮＡを、Ｆａｓｔ−ｔｒａｃｋキット（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いてＶＥＧＦＲ−Ｉ免疫化ＫＭマウスから得られたハイブリドーマ細胞産生クローン６Ｆ９，１３Ｇ１２，１５Ｆ１１、及び１８Ｆ１から単離した。ランダム・プライムｃＤＮＡの作製の後に、Ｃｌｏｎｔｅｃｈキットを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。プライマー（前進：５′−ＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧ、及び後退：３′−ＴＧＣＣＡＧＧＧＧＧＡＡＧＡＣＣＧＡＴＧＧ）、並びに（前進：５′−ＡＴＧＧＡＡＡＣＣＣＣＡＧＣＧＣＡＧＣＴＴＣＴＣ、及び後退：３′−ＣＧＧＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣＡＧＡＴＧ）を、それぞれ、重鎖とカッパ軽鎖の可変領域に結合させるために使用した。ハイブリドーマからのヒト免疫グロブリン由来重鎖及びカッパ鎖転写産物の配列を、先に記載したプライマーを用いてポリ（Ａ＋）ＲＮＡから作製されたＰＣＲ産物の直接シーケンシングにより得た。またＰＣＲ産物を、ＴＡクローニング・キット（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いてｐＣＲ２．１にクローニングし、そして両鎖を、Ｐｒｉｓｍ ｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒシーケンシング・キット及びＡＢＩ３７３０ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（GENEWIZ, North Brunswick, NJ）を用いてシーケンシングした。全配列を、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアを用いたＫａｔａｍａｎ抗体配列プログラムに対するアラインメントにより分析した。
【０１２５】
上記表２は、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体クローン６Ｆ９，１３Ｇ１２，１５Ｆ１１、及び１８Ｆ１の軽鎖及び重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。ＣＤＲ１，ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメインの配列を、下線により示す。上記表３は、クローン６Ｆ９，１３Ｇ１２，１５Ｆ１１、及び１８Ｆ１の重鎖及び軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【０１２６】
実施例１４：ヒトＩｇＧ１抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の遺伝子操作及び発現
抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体クローン６Ｆ９，１３Ｇ１２，１５Ｆ１１、及び１８Ｆ１の重鎖及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列を、発現ベクター内へのクローニングのためにＰＣＲにより増幅した。重鎖可変領域を、ベクターｐＥＥ６．１（Lonza Biologies pic, Slough, Berkshire, UK）内で、フレーム内で、ヒト免疫グロブリン重鎖ガンマ定常領域に融合した。完全ヒト軽鎖ｃＤＮＡを、ベクターｐＥＥ１２．１（Lonza Biologies. PLC, Slough, Berkshire, UK）内に直接クローン化した。操作された免疫グロブリン発現ベクターを、エレクトロポレーションによりＮＳＯミエローマ細胞内に安定にトランスフェクトし、そしてグルタミン・シンセターゼ選択培地中で選択した。安定性クローンを、抗−Ｆｃ及びＶＥＧＦＲ−Ｉ特異的結合ＥＬＩＳＡによる抗体発現についてスクリーニングした。ポジティブ・クローンを、２週間以内の期間にわたり、スピナー・フラスコ又はバイオリアクター内で抗体生産のための無血清培養基中で増殖させた。完全長ＩｇＧ１抗体を、プロテインＡアフィニティー・クロマトグラフィー（Poros A, PerSeptive Biosystems Inc., Foster City, CA）により精製し、そして中性バッファー生理食塩水溶液中に溶出した。
【０１２７】
以上の説明及び実施例は、本発明を単に説明するためのものであり、本発明を限定することを意図していない。本発明の開示された側面及び態様の各々は、個々に、又は本発明の他の側面、態様、及び変更と組合せて考慮されうる。さらに特にことわらない限り、本発明の方法のステップのいずれも、実行における特定の順番に拘束されない。本発明の本質及び実体を取り込む開示された態様の変更も当業者にとって自明であろうし、そしてこのような変更も本発明の範囲内にある。さらに、本明細書中に引用する文献の全てを、それらの全体として本明細書中に援用する。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】図１は、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の各種態様の軽鎖可変領域と重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【図２】図２は、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の各種態様の軽鎖可変領域と重鎖可変領域のヌクレオチド配列である。
【図３】図３は、ＶＥＧＦＲ−Ｉへの本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の各種態様のインビトロ結合活性を計測するＥＬＩＳＡベースの結合アッセイの結果を示すチャートである。
【図４】図４は、ＶＥＧＦＲ−Ｉ結合についての、ＰＩＧＦとの、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の各種態様のインビトロにおける競合を計測するＥＬＩＳＡベースのブロッキング・アッセイの結果を示すチャートである。
【図５】図５は、ＶＥＧＦＲ−Ｉ結合についての、ＶＥＧＦとの、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の各種態様のインビトロにおける競合を計測するＥＬＩＳＡベースのブロッキング・アッセイの結果を示すチャートである。
【図６】図６Ａ−Ｄは、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１の特異性の結果を示すチャートである。ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉ（図６Ａ）に結合するが、マウスＶＥＧＦＲ−Ｉ（図６Ｂ）、ヒトＶＥＧＦＲ−２（図６Ｃ）、又はマウスＶＥＧＦＲ−２（図６Ｄ）には結合しない。
【図７】図７Ａ−Ｅは、ＶＥＧＦＲ−Ｉ発現ブタ大動脈内皮細胞との、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の各種態様の結合反応性を示すフロー・サイトメトリー分析の結果である。
【図８】図８Ａ−Ｂは、ＶＥＧＦＲ−Ｉ発現ブタ内皮細胞（図８Ａ）及びＤＵ４４７５ヒト乳癌細胞（図８Ｂ）との、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１の結合反応性を示すフロー・サイトメトリー分析の結果である。
【図９】図９は、内皮細胞上のＶＥＧＦＲ−Ｉに結合するＶＥＧＦとの、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１のインビトロにおける競合を計測する細胞ベースのブロッキング・アッセイの結果を示すチャートである。
【図１０】図１０は、ブタ大動脈内皮ＶＥＧＦＲ−Ｉ発現細胞における本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１による処理によるＶＥＧＦＲ−ＩのＰＩＧＦ刺激リン酸化の低減を示すウェスタン・ブロット分析である。
【０１２９】
【図１１】図１１は、ＢＴ４７４乳癌細胞における本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１による処理によるＶＥＧＦＲ−ＩのＰＩＧＦ又はＶＥＧＦ刺激リン酸化の阻害を示すウェスタン・ブロット分析である。
【図１２】図１２は、ブタ大動脈内皮ＶＥＧＦＲ−Ｉ発現細胞における本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の各種態様によるＥＲＫ１／２下流シグナリングのＰＩＧＦ誘導活性化の阻害を示すウェスタン・ブロット分析である。
【図１３】図１３は、ブタ大動脈内皮ＶＥＧＦＲ−Ｉ発現細胞における本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の各種態様によるＥＲＫ１／２下流シグナリングのＶＥＧＦ誘導活性化の阻害を示すウェスタン・ブロット分析である。
【図１４】図１４Ａ−Ｂは、ＶＥＧＦＲ−Ｉ発現ブタ大動脈内皮細胞における本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１によるＥＲＫ１／２下流シグナリングのＰＩＧＦ（図１４Ａ）又はＶＥＧＦ（図１４Ｂ）−誘導活性化の阻害を示すウェスタン・ブロット分析である。
【図１５】図１５は、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１が、ＢＴ４７４乳癌細胞におけるＰＩＧＦ又はＶＥＧＦ−刺激リン酸化をブロックすることを示すウェスタン・ブロット分析である。
【図１６】図１６は投与量に応答して、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の各種態様により処理されたＤＵ４４７５乳癌細胞内でのＶＥＧＦ刺激細胞増殖の阻害を示す投与量応答曲線である。
【図１７】図１７は、投与量に応答して、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の各種態様により処理されたＤＵ４４７５乳癌細胞におけるＰＩＧＦ刺激細胞増殖の阻害を示す投与量応答曲線である。
【図１８】図１８Ａ−Ｂは、投与量に応答して、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１により処理されたＤＵ４４７５乳癌細胞におけるＰＩＧＦ（図１８Ａ）又はＶＥＧＦ（図１８Ｂ）−刺激細胞増殖の阻害を示す投与量応答曲線である。
【図１９Ａ】本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の各種態様による処理後の日数に対してＤＵ４４７５乳癌腫瘍の腫瘍増殖をプロットしたチャートである。
【図１９Ｂ】本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体の各種態様による処理後の日数に対してＤＵ４４７５乳癌腫瘍の腫瘍増殖をプロットしたチャートである。
【図２０】図２０Ａ−Ｃは、本発明の抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１による処理後の日数に対してＤＵ４４７５（図２０Ａ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図２０Ｂ）、及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５（図２０Ｃ）の腫瘍増殖をプロットしたチャートである。
【０１３０】
【図２１】図２１Ａ−Ｂは、本発明の抗−ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１及び抗−マウスＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体ＭＦ１による処理後の日数に対してＤＵ４４７５（図２１Ａ）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図２１Ｂ）乳腫瘍の腫瘍増殖をプロットしたチャートである。
【図２２】図２２は、ＶＥＧＦ−Ａ及びＶＥＧＦ−Ｂの存在下、抗−ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１による処理後に存在する結腸癌細胞コロニーの数のチャートである。
【図２３】図２３Ａは、ＶＥＧＦ−Ａ及びＶＥＧＦ−Ｂの存在下抗ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１による処理後の転移腫瘍細胞の数のチャートである。 図２３Ｂは、ＶＥＧＦ−Ａ及びＶＥＧＦ−Ｂの存在下抗ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１による処理後の染色された転移細胞の光学顕微鏡写真である。
【図２４】図２４Ａは、ＶＥＧＦ−Ａ又はＶＥＧＦ−Ｂの存在下、抗ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１による処理後のＭＡＴＲＩＧＥＬTMの層を横切って移動した腫瘍細胞の数のチャートである。 図２４Ｂは、ＶＥＧＦ−Ａ及びＶＥＧＦ−Ｂの存在下、抗ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１による処理後の染色された転移細胞の光学顕微鏡写真である。
【図２５】図２５は、抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１，６Ｆ９、及び１５Ｆ１１による処理後の日数に対して、ＤＵ４４７５（図２５Ａ）及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５（図２５Ｂ）乳腫瘍の腫瘍増殖をプロットしたチャートである。
【図２６】図２６は、抗−ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１の特定投与量による処理後の日数に対して、ＨＴ−２９（図２６Ａ）、ＤＬＤ−１（図２６Ｂ）、及びＧＥＯ（図２６Ｃ）結腸癌細胞の増殖をプロットしたチャートである。
【図２７】図２７は、抗−ヒトＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１による処理後のＭＤＳ−ＭＢ−２３１異種移植片腫瘍の光学顕微鏡写真である。
【図２８】図２８は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図２８Ａ）及びＤＵ４４７５（図２８Ｂ）異種移植片における抗−ヒト抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１、抗−マウス抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体ＭＦ−Ｉの特定投与量による処理後の日数に対して腫瘍増殖をプロットしたチャートである。
【図２９】図２９は、ＭＤＳ−ＭＢ−２３１異種移植片における、シクロホスファミドと併用した抗−ヒト抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１及び抗−マウス抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体ＭＦ１による処理後の日数に対して腫瘍増殖をプロットしたチャートである。
【図３０】図３０Ａと３０Ｂは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片における抗−ヒト抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１及び抗−マウス抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体ＭＦ１と併用した５−ＦＵ／ＬＶ又はドキソルビシンによる処理後の日数に対して腫瘍増殖をプロットしたチャートである。
【図３１】図３１は、デスフェロキサミンによる処理後の、ＶＥＧＦ−Ａ（図３１Ａ）又はＰＩＧＦ（図３１Ｂ）の存在下、１８Ｆ１の各種量の抗体濃度に対する全腫瘍細胞カウント数のチャートである。
【図３２】図３２Ａ，３２Ｂ、及び３２Ｃは、抗−ヒト抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体１８Ｆ１と抗−マウス抗−ＶＥＧＦＲ−Ｉ抗体ＭＦ１の特異性を示すチャートである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２の軽鎖相補性決定領域−２（ＣＤＲ２）及び配列番号３の軽鎖ＣＤＲ３を含むＶＥＧＦＲ−Ｉに特異的に結合する単離ヒトモノクローナル抗体又はその断片。
【請求項２】
以下の配列：
ＲＡＳＱＳＸ1ＳＳＳＹＬＡ3
｛配列中、Ｘ1はＶ又はＧである。｝を有する軽鎖ＣＤＲ１領域をさらに含む、請求項１に記載の抗体又はその断片。
【請求項３】
以下の配列：
ＧＦＸ2ＦＳＳＹＧＭＨ
｛配列中、Ｘ2はＴ又はＡである。｝を有する重鎖ＣＤＲ１をさらに含む、請求項１に記載の抗体又はその断片。
【請求項４】
以下の配列：
ＶＩＷＸ3ＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＸ4Ｇ
｛配列中、Ｘ3はＹ又はＦであり、そしてＸ4はＫ又はＲである。｝を有する重鎖ＣＤＲ２をさらに含む、請求項１に記載の抗体又はその断片。
【請求項５】
以下の配列：
ＤＨＸ5ＧＳＧＸ6ＨＸ7ＹＸ8ＹＹＧＸ9ＤＶ
｛配列中、Ｘ5はＦ又はＹであり；Ｘ6はＡ又はＶであり；Ｘ7はＹ，Ｓ又はＨであり；Ｘ8はＹ又はＦであり；そしてＸ9はＭ又はＬである。｝を有する重鎖ＣＤＲ３をさらに含む、請求項１に記載の抗体又はその断片。
【請求項６】
（ｉ）配列番号１４，１５、及び１６から成る群から選ばれる軽鎖可変領域、又は（ii）配列番号１７，１８，１９、及び２０から成る群から選ばれる重鎖可変領域を含む抗体又はその断片。
【請求項７】
請求項１の抗体又はその断片をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項８】
ＶＥＧＦＲ−Ｉに特異的に結合する抗体又はその断片をコードする、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、及び配列番号２７から成る群から選ばれるヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項９】
発現配列に連結された請求項７に記載のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１に記載の抗体又はその断片を発現する、請求項１０に記載の組換え宿主細胞又はその子孫。
【請求項１２】
請求項１に記載の抗体又はその断片の発現を許容する条件下、請求項１０に記載の細胞を培養することを含む抗体又はその断片の製造方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の抗体又はその断片の有効量を哺乳動物に投与することを含む、当該哺乳動物におけるＶＦＧＦＲ−Ｉの活性の調節方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の抗体又はその断片の有効量を、哺乳動物に投与することを含む、当該哺乳動物における血管形成の阻害方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の抗体又はその断片の有効量を、哺乳動物に投与することを含む、当該哺乳動物における腫瘍増殖の低減方法。
【請求項１６】
抗−新形成剤又は処置を投与することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記腫瘍が乳腫瘍である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１】
配列番号２の軽鎖相補性決定領域−２（ＣＤＲ２）及び配列番号３の軽鎖ＣＤＲ３を含むＶＥＧＦＲ−Ｉに特異的に結合する単離ヒトモノクローナル抗体又はその断片。
【請求項２】
以下の配列：
ＲＡＳＱＳＸ1ＳＳＳＹＬＡ3
｛配列中、Ｘ1はＶ又はＧである。｝を有する軽鎖ＣＤＲ１領域をさらに含む、請求項１に記載の抗体又はその断片。
【請求項３】
以下の配列：
ＧＦＸ2ＦＳＳＹＧＭＨ
｛配列中、Ｘ2はＴ又はＡである。｝を有する重鎖ＣＤＲ１をさらに含む、請求項１に記載の抗体又はその断片。
【請求項４】
以下の配列：
ＶＩＷＸ3ＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＸ4Ｇ
｛配列中、Ｘ3はＹ又はＦであり、そしてＸ4はＫ又はＲである。｝を有する重鎖ＣＤＲ２をさらに含む、請求項１に記載の抗体又はその断片。
【請求項５】
以下の配列：
ＤＨＸ5ＧＳＧＸ6ＨＸ7ＹＸ8ＹＹＧＸ9ＤＶ
｛配列中、Ｘ5はＦ又はＹであり；Ｘ6はＡ又はＶであり；Ｘ7はＹ，Ｓ又はＨであり；Ｘ8はＹ又はＦであり；そしてＸ9はＭ又はＬである。｝を有する重鎖ＣＤＲ３をさらに含む、請求項１に記載の抗体又はその断片。
【請求項６】
（ｉ）配列番号１４，１５、及び１６から成る群から選ばれる軽鎖可変領域、又は（ii）配列番号１７，１８，１９、及び２０から成る群から選ばれる重鎖可変領域を含む抗体又はその断片。
【請求項７】
請求項１の抗体又はその断片をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項８】
ＶＥＧＦＲ−Ｉに特異的に結合する抗体又はその断片をコードする、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、及び配列番号２７から成る群から選ばれるヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項９】
発現配列に連結された請求項７に記載のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１に記載の抗体又はその断片を発現する、請求項１０に記載の組換え宿主細胞又はその子孫。
【請求項１２】
請求項１に記載の抗体又はその断片の発現を許容する条件下、請求項１０に記載の細胞を培養することを含む抗体又はその断片の製造方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の抗体又はその断片の有効量を哺乳動物に投与することを含む、当該哺乳動物におけるＶＦＧＦＲ−Ｉの活性の調節方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の抗体又はその断片の有効量を、哺乳動物に投与することを含む、当該哺乳動物における血管形成の阻害方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の抗体又はその断片の有効量を、哺乳動物に投与することを含む、当該哺乳動物における腫瘍増殖の低減方法。
【請求項１６】
抗−新形成剤又は処置を投与することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記腫瘍が乳腫瘍である、請求項１５に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【公表番号】特表２００８−５２０２４６（Ｐ２００８−５２０２４６Ａ）
【公表日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４３２９５（Ｐ２００７−５４３２９５）
【出願日】平成１７年１１月１８日（２００５．１１．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４１９０４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５５８０９
【国際公開日】平成１８年５月２６日（２００６．５．２６）
【出願人】（５００５８１０２１）イムクローン システムズ インコーポレイティド (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月１８日（２００５．１１．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４１９０４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５５８０９
【国際公開日】平成１８年５月２６日（２００６．５．２６）
【出願人】（５００５８１０２１）イムクローン システムズ インコーポレイティド (7)
【Ｆターム（参考）】
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