血管新生活性とＭＭＰ阻害活性を有するメリッサの葉抽出物の分画およびそれを含む組成物
本発明は、優れた血管新生活性とＭＭＰ阻害活性を有するメリッサの葉のエチルアセテート分画およびそれを含む組成物に関する。特に、メリッサの葉のエチルアセテート分画は、メリッサの葉を５０〜１００％のＣ１〜Ｃ６アルコールで抽出・濃縮し、次いでその濃縮アルコール抽出物を水中で懸濁し、エチルアセテートを用いて分画し、さらにそれを乾燥してメリッサの葉のエチルアセテート分画を得ることを特徴とする。本発明のメリッサの葉のエチルアセテート分画は強力かつ優れた抗血管新生活性とＭＭＰ阻害活性を有する。従って、本発明のメリッサの葉のエチルアセテート分画を含む組成物は、血管新生関連疾患およびＭＭＰ媒介性疾患の治療または予防のための薬剤としても使用することができる。
【選択図面】図２
【選択図面】図２
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、優れた血管新生活性とＭＭＰ阻害活性を有するメリッサの葉のエチルアセテート分画およびそれを含む組成物に関し、特に、メリッサの葉のエチルアセテート分画は、メリッサの葉を５０〜１００％のＣ１〜Ｃ６アルコールで抽出・濃縮し、次いでその濃縮アルコール抽出物を水中で懸濁し、エチルアセテートを用いて分画し、さらにそれを乾燥してメリッサの葉のエチルアセテート分画を得ることを特徴とする。
【背景技術】
【０００２】
メリッサ（Melissa officinalis、以下メリッサと呼ぶ）、シソ科の多年生草本（ハーブ）で、レモンバーム、バーム、または慣用名や民間名として浮腫の植物とも呼ばれる。
【０００３】
メリッサの主要成分はフラボノイド、テルペン酸、揮発油、アルコール性のフェノール化合物およびコーヒー酸誘導体の配糖体である。特に、シナロシド、コスモシン、ラムノシトリンとイソクエルシトリンはフラボノイドとして多量に含まれる成分であり、ウルソール酸は成分テルペン酸として多量に含まれる成分である。コーヒー酸誘導体としてのロスマリン酸は最も多量に含まれる成分（約４.７％）であり、およびゲラニアール、ネラール、シトロネラルおよびオイゲノールはメリッサの葉抽出物に含まれた揮発油として公知の成分である。
【０００４】
ロスマリン酸、メリッサの葉抽出物に多量に含まれる非揮発性成分は、強力な抗炎症性と解熱作用を有し、精油はうつ病、神経性頭痛、記憶減少、神経痛、熱に利用され、さらに鎮静、抗菌性、抗ウィルス、抗酸化と抗ホルモン作用を有することがよく知られている。最近になって、メリッサの葉抽出物は、末梢血管の拡張に役立つ血液循環活性化剤に含まれている。
【０００５】
血管新生は新しい毛細管血管の生成過程であり、血管新生は、厳重に規制され、胚発育中、組織再構築、創傷治癒および黄体発育の定期サイクル中に起こる。（Folkman and CotranのRelation of vascular proliferation to tumor growth, Int Rev Exp Pathol、１６、２０７−２４８、１９７６年）。
【０００６】
内皮細胞は、体内の他の細胞型に比べて非常に緩慢に成長するが、内皮細胞の増殖は、細胞外基質または血管新生因子の刺激作用から血管新生媒介物を放出する、活性化した加水分解性酵素である血管新生促進サイトカインによって誘発される。
【０００７】
一般に、血管新生の過程は、血管の基底膜の劣化、内皮細胞の移動、および内皮細胞の増殖と分化を介する内腔形成であり、前記血管新生の過程における主要イベントの１つは、毛細管血管の形成前の細胞外基質の破壊であり、マトリックス分解の最も重要な酵素は細胞外マトリックス分解酵素（ＭＭＰ）である。
【０００８】
血管新生の調節障害が起こるか、またはＭＭＰが過剰活性化すると、病理学的な血管新生が起こり、多くの疾患の原因となる。［Polverini PJのCritical Reviews in Oral Biology、６（３）、２３０−２４７（１９９５年）；ArupDasらのProgress in Retinal and Eye Research、第２２巻（２００３年）７２１−７４８；Nick Di GirolamoらのIOVS、２００１年８月、第４２巻、Ｎｏ．９、１９６３−１９６８； Patricia LeeらのSurvey of ophthalmology、第４３巻、Ｎｏ．３、１９９８年１１月〜１２月、２４５−２６９；D.B. HollandらのBritish Journal of Dermatology、２００４年、第１５０巻、７２−８１；Anthony H Vagnucci JrらのThe Lancet、第３６１巻、２００３年２月１５日、６０５−６０８；Berislav V. ZlokovicのTrends in Neuroscience、第２８巻、Ｎｏ．４、２００５年４月、２０２−２０８；Jaap G. NeelsらのThe FASEB Journal express、第１０論文、1096／fj.03-1101fje、オンライン公開日２００４年４月１４日；D.L. CrandallらのMicrocirculation、１９９７年４月、２１１−２３２；G. VorosらのEndocrinology、第１４６巻、２００５年、４５４５−４５５４；M.A. RupnickらのPNAS、第９９巻、２００２年、１０７３０−１０７３５；E. BrakenhielmらのCirc. Res.、第９４巻、２００４年、１５７９−１５８８； H.R. LijnenらのArterioscler Thromb Vase Biol、第２２巻、２００２年、３７４−３７９；D. DemeulemeesterらのBiochem. Biophys. Res. Commun.、第３２９巻、２００５年、１０５−１１０、など］。
【０００９】
癌の増殖と転移；
血管腫、血管線維腫、血管変形・奇形、およびアテローム性動脈硬化、血管狭窄症、風土性（地方病性）硬化症および狭窄症などの心疾患；
糖尿病性網膜症、黄斑変性症（加齢性黄斑変性症を含む）、翼状片、網膜変性症、角膜の移植における血管新生、血管新生緑内障などの眼科疾患、角膜の癒着と虹彩の癒着、水晶体後線維増殖、顆粒結膜炎、角膜潰瘍、増殖性硝子体網膜症、未成熟網膜症、眼の炎症、円錐角膜、シェーグレン症候群、近視、眼腫瘍と角膜移植の拒絶反応などの血管新生角膜疾患；
肥満症；
関節炎、関節リウマチ、骨関節炎、敗血症性関節炎などの慢性炎症性疾患、ＭＭＰ媒介性のオステオパシーおよび外傷性関節損傷後の変性軟骨減少；
中枢神経系の炎症や炎症性腸疾患などの炎症疾患；
乾癖、毛細血管拡張症、化膿性肉芽腫、脂漏性皮膚炎およびざ瘡などの皮膚科疾患；
アルツハイマー疾患；
角膜の癒着、蛋白尿、腹部の大動脈瘤、神経脱髄疾患、肝線維症、腎糸球体疾患、胎膜の早期破水、歯肉炎と歯周炎などの歯周疾患。
【００１０】
特に、血管新生は癌細胞増殖と転移に非常に重要な役割を果たす。新しい血管は栄養分や酸素を急速に増殖する癌細胞に供給するだけではなく、転移の進化を助長する役割も果たす。［Folkman and TylerのCancer Invasion and metastasis、Biologic mechanisms and Therapy （S.B. Day ed.） Raven press 出版、ニューヨーク、９４−１０３（１９７７年）； Polverini PJのCritical Reviews in Oral Biology、６（３）、２３０−２４７（１９９５年）］。
【００１１】
癌患者の死亡は転移に起因し、現在癌の治療に使用されている化学療法と免疫療法には抗転移作用が欠如しているために癌患者の生存に寄与することができない。
【００１２】
公知の炎症性疾患である関節炎は自己免疫性の疾患として始まるが、骨膜空洞での血管内皮細胞の増殖は、最終的に関節内の軟骨を破壊する炎症性サイトカインによって活性化される。言い換えれば、骨膜空洞での骨膜細胞と内皮細胞の増殖は炎症を誘発するサイトカインの助けで、血管新生とパンヌス形成を誘導し、それは軟骨の破壊に主要な役割を果たす。［Koch AE、Polverini PJおよびLcibovich SJのArth Rheum、２９、４７１−４７９、１９８６年；Stupack DG、Storgard CMおよびCheresh DA BrazのJMed Biol Res、第３２巻、５７８−５８１、１９９９年、Koch AEのArthritis Rheum、４１、９５１−９６２、１９９８年）。その一方、関節炎と外傷性関節損傷におけるストロメライシンが活性の高いコラゲナーゼに対してプロコラゲナーゼを活性化する上で重要な役割を果たすことが認識されている［Murphy, G.らのBiochem. J.、２４８、２６５−２６８（１９８７年）］。従って、ＭＭＰ活性の下方制御は関節炎の進行を防止することができる。
【００１３】
全世界で多くの人々がさまざまな眼疾患のためにその視力を失っており、多くの患者が硝子体液への毛細管血球の浸潤のために盲目になった。［Jeffrey MIおよびTakayuki AのJ Clin Invest、１０３、１２３１−１２３６、１９９９年］。加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管新生緑内障、血管新生角膜疾患は典型的な血管新生眼疾患である。［Adamis AP、Aiello LPおよびD'Amato RAのAngiogenesis、３、９−１４（１９９９年）］。糖尿病性網膜症、糖尿病の合併症は毛細管の破壊と網膜表面の出血による被覆に起因する。
【００１４】
コラゲナーゼ、ゼラチナーゼおよびストロメライシンは角膜細胞外基質の破壊に関与している。これは、多くの潰瘍性眼疾患、特に感染または化学損傷の伴う疾患において罹患率と失明の重要なメカニズムであると思われている。（Burns, F.R.らのInvest Opthalmol and Visual Sci、３２、１５６９−１５７５、１９８９年）。潰瘍形成時に眼中に存在するＭＭＰは、内生的に白血球または線維芽細胞の浸潤、または外因的に微生物にのいずれかに由来する。
【００１５】
乾癖は角化細胞の極度に活性の高い増殖に起因する。急速に増殖する細胞は十分な血液供給を必要とし、血管新生は乾癖において異常に誘発される。（Folkman J.のJ Invest Dermatol、５９、４０−４８、１９７２年）。
【００１６】
炎症性刺激作用や微生物によって分泌されるコラゲナーゼは、歯肉結合組織におけるコラーゲンを分解し、最後には歯周炎を起こす。コラゲナーゼ活性とストロメライシン活性は、炎症性歯肉から単離された線維芽細胞内で確認されており、酵素のレベルは観察された歯肉炎の重度と相関関係を持つ。（Beeley、N.R.A.らの前出のOverall、CM.らのJ Periodontal Res、２２、８１−８８、１９８７年）。
【００１７】
ＭＭＰは、ミエリンまたは血液脳関門破壊するＣＮＳ（中枢神経系）の病原体と相関関係を持つ。また、ＭＭＰは、アルツハイマー疾患におけるアミロイドβ前駆体タンパク質の蓄積に関連することも報告されている。［Yong、VWらのTrends Neurosci、２１（２）、７５−８０（１９９８年）］。
【００１８】
脳脊髄液中の過剰レベルゼラチナーゼＢは多発性硬化症および他の神経障害の発生に結びついており、［Beeley、N.R.Aら、前出；Miyazaki, K.らのNature、３６２、８３９−８４１（１９９３）］、アミロイドβ前駆体タンパク質の劣化と蓄積の一因となる［Backstrom JRらのJ neurosci、１６（２４）、７９１０−９（１９９６年）］。
【００１９】
また、最近の報告はＭＭＰ-１活性がアルツハイマー疾患者の脳に高度に誘発されていることを明らかにしており、
また、ＭＭＰの酵素前駆体を活性化するＭＭＰ-３は、前記疾患の病態生理学にも関与する。［Leake A、Morris CMおよびWhateleyのJ Neurosci Lett、２９１、２０１−３、２０００；Yoshiyama Y、Asahina M、およびHattori TのActa Neu-ropathol （berl）、９９、９１−５、２０００）。
【００２０】
ＭＭＰによる基底膜の劣化は癌浸潤、転移さらに血管新生に非常に重要な方法である。つまり、ＭＭＰの過剰発現は血管新生、癌浸潤および癌の転移を促進することができる。
【００２１】
アデノ癌腫の場合、浸潤性近位胃癌細胞は７２−ｋＤ形態のＩＶ型コラゲナーゼを発現する。［Schwartz, G.K.らのCancer ７３、２２−２７（１９９４年）］。Ｈａ−ｒａｓおよびｖ−ｍｙｃ癌遺伝子またはＨａ−ｒａｓ単独によって形質転換されたラット胚細胞は、ヌードマウスで転移性であり、９２ｋＤａゼラチナーゼ／コラゲナーゼ（ＭＭＰ-９）を放出する。［Bernhard, EJらのProc. Natl. Acad. Sci ９１、４２９３−４５９７（１９９４年）］。
【００２２】
従って、これらの疾患を治療するため、血管新生の阻害剤またはＭＭＰ阻害剤を開発することができる。
【００２３】
これに関連して、本発明者らは、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）チューブ形成などのインビトロアッセイ、およびマウスのマトリゲルモデルやＣＡＭアッセイなどのインビボ試験法を介してメリッサの葉抽出物が抗血管新生作用を持つ韓国特許登録番号第１０−５５０，２９８号を開示した。
【００２４】
さらに、本発明者らは、韓国特許登録番号第１０−４７３，６８８号で、メリッサの葉抽出物がＭＭＰ（細胞外マトリックス分解酵素）に対して阻害作用を有し、それは血管新生の過程で基底膜を劣化させるのに重要であることを開示した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
本発明者らは、研究を重ねた結果、優れた血管新生活性とＭＭＰ阻害活性を有する、より活性の高いメリッサの葉分画を得られることを見出し本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明の目的は、優れた血管新生活性とＭＭＰ阻害活性を有するメリッサの葉のエチルアセテート分画およびそれを含む組成物を提供することにある。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＡＬＳ−Ｌ１０２３のＭＭＰ活性に対する阻害作用を示すグラフである。
【図２】ＡＬＳ−Ｌ１０２３のＨＵＶＥＣチューブ形成に対する阻害作用を示す写真である。
【図３】ＡＬＳ−Ｌ１０２３の血管新生に対する阻害作用を解析するマウスのマトリゲルアッセイの結果を示すグラフである。
【図４】高用量のＡＬＳ−Ｌ１０２３を与えた直後の高脂肪食由来肥満ラットにおける脂肪肝と炎症細胞浸潤の減少を溶媒対照群と比べて示す肝組織の光学顕微鏡写真である。
【図５】中・高用量のＡＬＳ−Ｌ１０２３を与えた直後の高脂肪食由来肥満ラットの後腹膜脂肪組織における脂肪細胞面積の減少を、溶媒対照群と比べて示すグラフである。
【図６】ＡＬＳ−Ｌ１０２３の経口投与による滲出性加齢黄斑変性症の進行に対するＡＬＳ-Ｌ１０２３の阻害作用を示す写真である。
【図７】ＡＬＳ−Ｌ１０２３の投与量２０００ｍｇ／ｋｇでの単回経口投与毒性試験におけるラットの体重変化を示すグラフである。
【図８】ＡＬＳ−Ｌ１０２３の投与量２０００ｍｇ／ｋｇでの単回経口投与毒性試験におけるラットの体温変化を示すグラフである。さらに、
【図９】ＡＬＳ−Ｌ１０２３の投与量２０００ｍｇ／ｋｇでの単回経口投与毒性試験における臓器の相対重量を総体重のパーセントとして示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
そこで、本発明は優れた血管新生活性と細胞外マトリックス分解酵素（ＭＭＰ）阻害活性を有するメリッサの葉のエチルアセテート分画を提供するものである。
【００２９】
また本発明は、血管新生関連疾患およびＭＭＰ媒介性疾患の治療または予防のためのメリッサの葉のエチルアセテート分画を含む組成物を提供することを課題とする。
【００３０】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００３１】
本発明に係るメリッサの葉のエチルアセテート分画は、メリッサの葉を５０〜１００％のＣ１〜Ｃ６アルコールで抽出・濃縮し、次いでその濃縮アルコール抽出物を水中で懸濁し、エチルアセテートを用いて分画し、さらにそれを乾燥してメリッサの葉のエチルアセテート分画を得ることを特徴とする。
【００３２】
本発明に係るメリッサの葉のエチルアセテート分画の作製法で使用するメリッサの葉は、乾燥または非乾燥のもの、またはその混合物であってもよく、抽出効率を高めるため、メリッサの葉を小片に切断するか、または微粉化することもできる。
【００３３】
この時点では、メリッサの葉のアルコール抽出物は従来の方法を用いて抽出することができ、使用する抽出溶媒は５０〜１００％のアルコール、好ましくは７０〜８０％のアルコールとし、アルコールとメリッサの葉との容量比は５〜１０：１であってもよく、前記アルコールはＣ１〜Ｃ６アルコール、好ましくはメタノール、エタノールまたはその混合物であってもよい。
【００３４】
本発明の実施例では、メリッサの葉の７５％エタノール抽出液を水中で懸濁し、エチルアセテートを用いて分画し、さらにそれを乾燥してメリッサの葉のエチルアセテート分画を得た（ＡＬＳ−Ｌ１０２３と呼ぶ）。
【００３５】
水溶性物質と不水溶性物質は抽出溶媒として５０〜１００％のアルコールを使用することで効率的に抽出することができ、この方法はエチルアセテート可溶性の水不溶性物質を得るために効果的である。
【００３６】
エチルアセテートは、生成物の収率、残基の毒性および基準物質の相対含有量を考慮して第２抽出溶媒として選択される。
【００３７】
優れた抗血管新生活性を有するメリッサの葉から分画の大量作製を行う場合、メリッサの葉の５０〜１００％アルコール抽出物を水中で懸濁し、エチルアセテートを用いて分画し、さらにそれを乾燥してメリッサの葉のエチルアセテート分画を得る（以下の実施例ではＡＬＳ−Ｌ１０２３と呼ぶ）。
【００３８】
また、メリッサの葉を５０〜１００％のＣ１〜Ｃ６アルコールで抽出・乾燥し、そのアルコール抽出物を水中で懸濁し、次いで、エチルアセテートを用いて分画・乾燥し、そのエチルアセテート分画を水中で再懸濁し、さらにそれを乾燥してメリッサの葉のエチルアセテート分画を得ることもできる。
【００３９】
得られたメリッサの葉のエチルアセテート分画は動物試験と前臨床試験に使用した。
【００４０】
本発明者らは、本発明におけるメリッサの葉のエチルアセテート分画は、他の溶媒分配で得られたその他の分画と比べて血管新生活性とＭＭＰ活性の阻害に優れていることを見出した。前記メリッサの葉のエチルアセテート分画は、ＭＭＰ阻害アッセイ、ＨＵＶＥＣチューブ形成アッセイ、およびマウスのマトリゲル移植アッセイによって、血管新生の阻害において最も効果的かつ優れた活性を示す。また、本発明者らは、この分画が、脂肪組織、脂肪細胞のサイズを縮小するとともに、脂肪酸の酸化に関連した遺伝子発現を誘導することで肥満を抑制することも見出した。
【００４１】
従って、本発明に係るメリッサの葉のエチルアセテート分画を、血管新生関連疾患およびＭＭＰ媒介性疾患の治療または予防用の抗血管新生剤およびＭＭＰ阻害剤として使用できることが明らかである。
【００４２】
従って本発明はメリッサの葉のエチルアセテート分画を含む組成物を提供するものである。
【００４３】
本発明の組成物で治療または予防することができる血管新生関連疾患およびＭＭＰ媒介性疾患は、限定するものではないが、癌の増殖と転移と；血管腫、血管線維腫、血管変形・奇形、およびアテローム性動脈硬化、血管狭窄症、風土性（地方病性）硬化症および狭窄症などの心疾患と；糖尿病性網膜症、黄斑変性症（加齢性黄斑変性症を含む）、翼状片、網膜変性症、角膜の移植における血管新生、血管新生緑内障などの眼科疾患、角膜の癒着と虹彩の癒着、水晶体後線維増殖、顆粒結膜炎、角膜潰瘍、増殖性硝子体網膜症、未成熟網膜症、眼の炎症、円錐角膜、シェーグレン症候群、近視、眼腫瘍と角膜移植の拒絶反応などの血管新生角膜疾患と；肥満症と；関節炎、関節リウマチ、骨関節炎、敗血症性関節炎などの慢性炎症性疾患、中枢神経系の炎症や炎症性腸疾患などの炎症疾患と；ＭＭＰ媒介性のオステオパシーと退行性軟骨減少と；乾癖、毛細血管拡張症、化膿性肉芽腫、脂漏性皮膚炎およびざ瘡などの皮膚科疾患と；アルツハイマー疾患と；角膜の癒着、蛋白尿、腹部大動脈瘤、神経脱髄疾患、肝線維症、腎糸球体疾患、胎膜の早期破水、歯肉炎や歯周炎などの歯周疾患と、を含む。
【００４４】
本発明の組成物は公知の抗血管新生剤または公知のＭＭＰ阻害剤と併用することができる。
【００４５】
本発明では、血管新生関連疾患およびＭＭＰ媒介性疾患の治療剤または予防剤として使用されるメリッサの葉のエチルアセテート分画を含む組成物は医薬組成物または食品組成物であり得る。
【００４６】
また、本発明の医薬組成物は、希釈剤、分散剤、界面活性剤、溶媒、崩壊剤、甘味料、結合剤、コーティング剤、発泡剤、潤滑剤、流動促進剤または風味剤などの薬学的・生理的学的に許容できる添加物を含むことができる。
【００４７】
活性成分としての本発明のメリッサの葉のエチルアセテート分画を含む医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤と組み合せて製剤することができる。
【００４８】
本発明の医薬組成物は任意の形態、例えば顆粒、粉末、錠剤、被覆錠剤、カプセル、ピル、シロップ剤、ドロップ剤、液剤、溶液、懸濁液、エマルジョン、または注射剤などの形態で製剤することができる。
【００４９】
例えば、錠剤またはカプセル型の組成物では、その活性成分を薬学的に許容される不活性担体と無毒性の担体と結合させることができ、適切な結合剤、潤滑剤、崩壊剤および発色剤を必要に応じて含むこともできる。好適な結合剤の例には、限定するものではないが、デンプン、ゼラチン、デキストリン、マルトデキストリン、グルコースやβラクトースなどの天然の砂糖、トウモロコシ甘味料、アカシア、トラガントやオレイン酸ナトリウムなどの天然および合成ゴム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムが含まれる。崩壊剤には、限定するものではないが、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンゴムなどが含まれる。
【００５０】
液体溶媒型の組成物では、薬学的に許容される担体は、生理食塩液、滅菌水、リンゲル液、緩衝生理食塩液、アルブミン注射液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールまたは混合溶液であり、抗酸化物、緩衝液、静菌剤などの一般的な添加物をこの組成物に添加することができる。従来の方法を用いるかまたはレミントンの薬科学（米国ペンシルベニア州イーストンのＭａｃｋ出版社）に記載の方法を用いることで、本組成物の組成を疾患または成分に応じて所望の形態で製剤することができる。
【００５１】
また、活性成分としての本発明のメリッサの葉のエチルアセテート分画を含む食品組成物は、機能的食品、栄養補助食品または食品添加物としても使用することができ、食品添加物の場合、本発明の食品組成物を肉、飲料水、チョコレート、食料雑貨類、スナック、ピザ、即席ラーメン、麺類、チューインガム、アイスクリーム、アルコール飲料、複合ビタミン、または健康食品に添加することができる。
【００５２】
本発明は、血管新生関連疾患およびＭＭＰ媒介性疾患の治療または予防のため、メリッサの葉のエチルアセテート分画を含む組成物の使用方法を提供するものであり、本発明の組成物は食品と、血管新生関連疾患およびＭＭＰ媒介性疾患の治療または予防用医薬と、に使用することができる。
【００５３】
また本発明は、メリッサの葉のエチルアセテート分画の治療有効量を哺乳動物に投与することを含む、血管新生関連疾患およびＭＭＰ媒介性疾患の治療または予防方法も提供する。
【００５４】
本明細書中で用いた、治療目的のための「哺乳動物」は、哺乳動物として分類される任意の動物、好ましくはヒトを意味する。
【００５５】
本明細書中で用いた「治療有効量」は、本組成物投与対象の動物またはヒトにおいて生物学的応答または医療対応を誘導する量を意味し、通常の熟練度を有する医療提供者であれば、最適な臨床結果を達成するために、その治療有効量、ならびにその適切な用量と投与の頻度を決定することができ、治療有効量は、疾患の種類、患者症状の重度、成分の内容、年齢、体重、個々の患者の性別、食品、投与時間、投与経路、前記組成物の構成比率、治療期間、および他の同時投与する医薬品などのさまざまな要因で変動し、本発明の組成物は、単回投与、または複数回投与などの投与管理体制の一部として投与することができ、メリッサの葉のエチルアセテート分画の好ましい投与量は１日あたり３ｍｇ／ｋｇ〜２５０ｍｇ／ｋｇである。
【００５６】
本発明の組成物はさまざまな経路、例えば、限定するものではないが、経口、直腸、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、粘膜内、皮下、真皮内、経皮、経皮、腟内、直腸内、経鼻、経眼、ないしは腸管内などの経路で投与することができる。
【００５７】
以下の実施例は本発明をさらに例示することを意図するが、これらの実施例と実験例は、本発明をよりよく理解するためのもので、その範囲を限定するものではない。
【００５８】
（実施例）
【００５９】
（実施例１）メリッサの葉のエチルアセテート分画の作製
強力な抗血管新生活性を有するメリッサの葉抽出物を作製するため、蒸留水、５０％水溶性エタノール、７５％水溶性エタノール、１００％エタノールおよびメタノールをそれぞれ用いてメリッサの葉を抽出する。その粗抽出物を遠心分離し、ろ過・濃縮し、次いで凍結乾燥して抽出物の粉末を得た。前記粉末は使用するまで４℃にて保存する。前記抽出物の抗血管新生作用を５０μｇ／ｍｌの濃度にてＨＵＶＥＣチューブ形成アッセイで検査した。表１に示したように、水、５０％、７５％、１００％エタノール、および１００％メタノール抽出液を含むすべての抽出液はＨＵＶＥＣチューブ形成アッセイで阻害作用を示した。特に、前記７５％エタノール抽出液が、他の抽出液と比べて相対的に良好な阻害活性を示したことから、７５％エタノールを第１抽出溶媒として選択する。
【００６０】
【表１】
【００６１】
メリッサの葉分画から最も強力な抗血管新生活性を見出すため、ヘキサン、エチルアセテート、およびブタノールを用いてメリッサの葉の７５％エタノール抽出液を連続的に区分する。各分画を遠心分離し、ろ過・濃縮し、次いで凍結乾燥して分画粉末を得る。前記粉末は使用するまで４℃にて保存する。前記抗血管新生作用を５０μｇ／ｍｌの濃度にてＨＵＶＥＣチューブ形成アッセイでそれぞれ検査した。表２に示したように、前記エチルアセテート分画が最も強力な抗血管新生活性を示す。
【００６２】
【表２】
【００６３】
これらのアッセイの結果に基づいて、優れた抗血管新生活性を有するメリッサの葉分画の大量作製を以下の通りに行った。メリッサの葉の７５％エタノール抽出液を水中で懸濁し、エチルアセテートを用いて分画し、さらにそれを乾燥してメリッサの葉のエチルアセテート分画を得た（以下の実施例ではＡＬＳ−Ｌ１０２３と呼ぶ）。このＡＬＳ−Ｌ１０２３を動物試験と前臨床試験に使用した。
【００６４】
以下にＡＬＳ−Ｌ１０２３の詳細な大量作製方法を説明する。
乾燥した１００ｋｇのメリッサの葉を、８３℃にて４時間、３５０Ｌの７５％水溶性エタノールを用いて２回抽出した。前記抽出物を１０μｍフィルタでろ過し、３０Ｌに濃縮し、次いで４０Ｌエチルアセテートを用いて２回分画した。この分画を蒸留水で洗浄した後、１５Ｌの容量になるまで濃縮し、次いで４５℃の熱風で乾燥した。最終的に、５ｋｇのＡＬＳ−Ｌ１０２３を乾燥粉末形態で得た。
【００６５】
（実施例２）ＡＬＳ−Ｌ１０２３のインビトロアッセイ
（１）ＭＭＰ阻害アッセイ
大量作製したＡＬＳ−Ｌ１０２３によるＭＭＰ阻害を調べるために、分光蛍光分析方法（パーキンエルマー社製ＬＳ５０Ｂ）を用いてＭＭＰ酵素活性アッセイを行った。
前記アッセイに使用するヒトＭＭＰ酵素は、ＡｎｇｉｏＬａｂ社のバキュロウイルスシステムを用いた組換え体タンパク質産生法によって調製し、蛍光定量的基質（Ｂａｃｈｅｍ社カタログＮｏ．Ｍ-２１０５）をＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の基質として使用し、さまざまな濃度のＡＬＳ−Ｌ１０２３をＭＭＰ酵素と基質を含有する反応緩衝液に添加して蛍光強度を測定した。ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９に対するＡＬＳ−Ｌ１０２３のＩＣ５０はそれぞれ１７．７＋１．０ｍｇ／ｍＬと１２．３±１．４ｍｇ／ｍＬであった。
ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９に対するメリッサの葉の７５％エタノール抽出液のＩＣ５０はそれぞれ３３．６＋１．５ｍｇ／ｍＬと２６．０±１．７ｍｇ／ｍＬであった。かくして、ＡＬＳ−Ｌ１０２３のＭＭＰ阻害活性はメリッサの葉の７５％エタノール抽出液の阻害活性と比べて高いことが確認された（図１）。
【００６６】
（２）ＨＵＶＥＣチューブ形成阻害活性
前記ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）チューブ形成アッセイは、インビボ有効性に緊密に関連するインビトロアッセイであるので、ＨＵＶＥＣチューブ形成に対するＡＬＳ−Ｌ１０２３の作用を調べた。
前記チューブ形成アッセイを行うため、ＨＵＶＥＣを新たに得られたコードから単離した。細胞を培養し、抗第ＶＩＩＩ因子抗体を用いた免疫細胞の化学的染色によって識別した。通路５以内で培養したＨＵＶＥＣを、さまざまな濃度のＡＬＳ−Ｌ１０２３の不在下または存在下で、３７℃にてマトリゲル（米国マサチューセッツ州ベッドフォードのＢＤバイオサイエンス社製）上で１８時間増殖させた。チューブ形成を顕微鏡で観察した。図２に示したように、大量作製したＡＬＳ−Ｌ１０２３は５０ｍｇ／ｍＬの濃度でチューブ形成を阻害した。チューブの毛細管ネットワークは、対照で観察されたが、ＡＬＳ−Ｌ１０２３によって連絡切断した。また、表３に示したように、ＡＬＳ−Ｌ１０２３は用量依存方式でＨＵＶＥＣチューブ形成を阻害した。
【００６７】
【表３】
【００６８】
（３）細胞毒性試験
ＡＬＳ−Ｌ１０２３のＨＵＶＥＣに対する細胞毒性試験を行うため、ウェルあたり５，０００〜１０，０００のＨＵＶＥＣを９６ウェルプレートに播種し、さまざまな濃度のＡＬＳ−Ｌ１０２３を各ウェルに添加した。前記細胞生存度を、ＸＴＴテトラゾリウム基（ナトリウム３’−［Ｌ−（フェニルアミノカルボニル）−３，４−テトラゾリウム］−ビス［４−メトキシ−６−ニトロ］ベンゼンスルホン酸水和物）細胞増殖キット（ドイツのロッシェ社製）で検査し、生細胞をＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）プレートリーダーで測定した。ＡＬＳ−Ｌ１０２３は５０ｍｇ／ｍＬ濃度にて、ＨＵＶＥＣ生存度に影響を及ぼさず、ＨＵＶＥＣチューブ形成阻害活性を示した。
【００６９】
（４）マウスのマトリゲルアッセイ
マウスのマトリゲル移植アッセイを行って、ＡＬＳ−Ｌ１０２３でインビボ血管新生の阻害を定量的に測定した。
５０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）と５０単位／ｍＬのヘパリンを含有する０．４ｍＬのマトリゲルを皮下注射でＣ５７ＢＬ／６マウスに移植した。マウス１匹あたりに、１０％エタノール中に溶解した０．５ｍｇのＡＬＳ−Ｌ１０２３を経口で１日２回、４日間にわたって投与した。１０％エタノールを経口で対照群に投与した。５日目に、マウスの表皮を除去して、マトリゲルを回収し、次いで前記マトリゲル中のヘモグロビンの量をＤｒａｂｋｉｎ試薬（シグマ社製、米国）で判定した。
図３に示したように、ＡＬＳ−Ｌ１０２３による治療群から回収したマトリゲル中のヘモグロビン含有量は溶媒対照群に比べて減少した。ＡＬＳ−Ｌ１０２３による血管新生阻害の割合は３３％であった。
【００７０】
（製剤例）
好適な賦形剤をＡＬＳ−Ｌ１０２３に添加してその安定性を向上させ、次いでその２５０ｍｇを硬質カプセルにパッケージングした。その混合比を以下の表４に記載する。
【００７１】
【表４】
【００７２】
（実施例３）ＡＬＳ−Ｌ１０２３分画の抗肥満作用
高脂肪食由来の肥満症に関し、以下の実験を行って腹部脂肪に対するＡＬＳ−Ｌ１０２３の阻害作用を調べた。活性成分として製剤したＡＬＳ-Ｌ１０２３を、０（対照群）、０．１％（低）、０．２５％（中）、および０．５％（高）（製剤形態：０、０．１７、０．４２、０．８３％）の含有量で、４５ＫｃａＬ％の高脂肪飼料（米国リサーチダイエット社製）と混合した。活性成分ＡＬＳ−Ｌ１０２３を含有しない対照群の調製には、製剤したＡＬＳ−Ｌ１０２３に含まれた賦形剤を、高用量として０．３３％の含有量で前記高脂肪飼料と混合した。１週間の順化期間後、生後７週間の雄ＳＤラットを群あたり７匹のマウスからなる群に分割し、１２週間にわたって給餌した。次いで、その体重と腹部脂肪の重さを測定し、肝臓と脂肪組織の生化学的血液試験と病理組織学的試験を行った。
【００７３】
（１）体重
体重の測定は、マウス取得日、投与開始日、投与開始後１週間毎に１回の頻度、および解剖日に行った。表５にその結果をまとめた通り、溶媒対照群の平均体重は２０４.７３±５.５７ｇ（投与前）から６３３.６３±４３.０８ｇ（１２週間にわたる投与後）へと常に増加し、ＡＬＳ−Ｌ１０２３群（低、中、および高用量群）の平均体重も、２１０．１０＋５.１９ｇ、２０４.９７＋６.６１ｇ、および２０８.０１＋７.６５ｇ（投与前）から６２３.７２＋５８.０２ｇ、５８８.６９＋３３.７６ｇ、および５８４.８３＋３３.４４ｇ（１２週間にわたる投与後）へと常に増加した。溶媒対照群とＡＬＳ−Ｌ１０２３群の間に統計的有意差は認められなかったが、ＡＬＳ−Ｌ１０２３群の平均体重は用量依存方式では減少した。
【００７４】
【表５】
【００７５】
（２）飼料摂取
１日の飼料摂取量を以下の通りに決定した。フィーダーを粉末状の飼料で充填し、次いでその重量を測定した。前記フィーダーを用いた前記動物の給餌後２４時間にてその重量を測定し、測定重量の差を１日の飼料摂取量として決定した。その測定は、投与開始日と、投与開始後１週間毎に１回の頻度で行った。
溶媒対照群の１日の平均飼料摂取量は１２週間にわたって１８.４６〜２２.７３ｇの範囲内であり、低、中、および高用量群の１日の平均飼料摂取量はそれぞれ１７.１４〜２１.８４ｇ、１７.２９〜２２.０３ｇおよび１６.９９〜２０．８４ｇの範囲内であった。溶媒対照群に比べて有意差認められなかった。
【００７６】
（３）臓器と脂肪組織の重量
解剖と採血前に、１８時間以上にわたって前記動物を絶食させ、エーテルで麻酔し、続いて採血と静脈切開を行った。その腸間膜脂肪組織、精巣上体脂肪組織、および後腹膜脂肪組織をその腹部の空洞から切除し、秤量し、その肝臓、心臓、腎臓、脾臓、および膵臓を秤量した。
結果として、溶媒対照群と実験群間の心臓、肝臓、膵臓、腎臓（左右）および脾臓の重量に有意差は認められなかった。低、中・高用量群の腸間膜脂肪組織の重量は、それぞれ１５.９０+４.３６ｇ、１２.６４+１.６９ｇ、および１１.２３+３.３２ｇであった。つまり、用量依存方式では、実験群での重量は溶媒対照群の１５.１６±４.４１ｇに比べて減少した。低、中・高用量群の精巣上体脂肪組織重量は、それぞれ１７.７４±３.３７ｇ、１６.２９±２.６２ｇ、および１５.６７±３.８３ｇであった。つまり、用量依存方式では実験群での重量は溶媒対照群の２０．８０±４.４１ｇに比べて減少し、高用量群で統計的な有意差（ｐ＜０．０５）が観察された。低、中・高用量群の後腹膜脂肪組織重量は、それぞれ２７.２０±５.７６ｇ、２１.３６±４.０３ｇ、および２３.９４±６.２４ｇであった。つまり、用量依存方式では実験群での重量は溶媒対照群の２９.７３±３.２３ｇに比べて減少し、中用量群で統計的な有意差（ｐ＜０．０５）が観察された。低、中・高用量群の腸間膜脂肪組織、精巣上体脂肪組織および後腹膜脂肪組織を含む腹部脂肪組織の総重量は、それぞれ６０．８４±１１.６６ｇ、５０．２９±７.３１ｇ、および５０．８４±１１.８４ｇであった。つまり、実験群での重量は溶媒対照群の６５.６９±１０．１３ｇに比べて減少し、中・高用量群で統計的有意差（ｐ＜０．０５）が観察された（表６を参照）。
【００７７】
【表６】
【００７８】
（４）生化学的血液試験
生化学的血液試験では、対照群と実験群間のＡＳＴ（アスパラギン酸アミノ基転移酵素）、ＡＬＴ（アラニンアミノ基転移酵素）、およびＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）の血清レベルなどの肝指数に有意差は認められなかった。低、中・高用量群の全血液コレステロールレベル値は、それぞれ８８.０７＋１４.３５ｍｇ／ｄＬ、８６.９６＋１７.６８ｍｇ／ｄＬ、および７９.９０+１０．４５ｍｇ／ｄＬであった。つまり、用量依存方式では、実験群でのコレステロール値は溶媒対照群の１０２.０９＋２１.８２ｍｇ／ｄＬと比べて減少した。低、中・高用量群の中性脂肪値は、それぞれ５０．９３＋１５.２８ｍｇ／ｄＬ、４６.６３＋１１.７７ｍｇ／ｄＬ、および４５.５０＋２２.４５ｍｇ/ｄＬであった。つまり、用量依存方式では、実験群での中性脂肪値は溶媒対照群の５８.１３＋２５.０４ｍｇ/ｄＬと比べて減少した。低、中・高用量群のＬＤＬ値は、それぞれ９.５６+２.６７ｍｇ／ｄＬ、９.１１＋２.９２ｍｇ／ｄＬ、および８.５６＋２.２６ｍｇ／ｄＬであった。つまり、用量依存方式では、実験群でのＬＤＬ値も溶媒対照群の１２.３１±３.７０ｍｇ／ｄＬと比べて減少した。しかしながら、対照群と実験群間のグルコース、全タンパク質、およびアルブミンのレベルに有意差は認められなかった。かくして、ＡＬＳ−Ｌ１０２３の投与に関しては、総コレステロール、中性脂肪、およびＬＤＬにおける実験群の血清レベルは、用量依存方式では溶媒対照群と比べて減少した（表７を参照）。
【００７９】
【表７】
【００８０】
（５）肝臓の病理組織学的試験
肝臓を秤量し、次いで１０％中性緩衝ホルマリン溶液中に固定し、続いて慣用的な組織学的治療を行った。組織のスライドサンプルを調製し、次いでＨ＆Ｅを用いて染色し、続いて顕微鏡下で脂肪肝を観察した。その結果、溶媒対照群では、肝細胞の肝小葉において脂肪小球の過剰蓄積が観察された。それは脂肪肝の発見であった。小滴性または大滴性脂肪性の変化は主に肝門脈の周りで観察された。脂肪肝の進行期で発生する炎症細胞浸潤は、脂肪肝が発生した風船化肝細胞相互間またはその周りに主に起こった。中度の脂肪肝では、炎症細胞浸潤は中心静脈の周りに起こった。その他の異常病理学的な知見は観察されなかった。
低用量群では、脂肪肝も観察され、それは溶媒対照群で観察されたものと同様であった。中用量群では、溶媒対照と低用量群に比べてわずか減少した脂肪肝と炎症細胞浸潤が観察された。
高用量群では、脂肪肝の阻害または炎症細胞浸潤の減少が観察され、それは中用量群で観察されたものと同様であった（図４を参照）。この結果は、ＡＬＳ−Ｌ１０２３がその上に阻害作用を発揮したことを示唆する。
【００８１】
（６）脂肪組織における脂肪細胞面積
切除した後腹膜脂肪組織を秤量し、次いでパラフィン封入した組織サンプルを慣用的な病理組織プロセッシングで調製し、続いてＨ＆Ｅ染色を行った。５つのサンプリング部位を無作為選択し、光学顕微鏡に接続されたStereo Investigatorソフトウェア（米国バーモント州のMicroBrightField社製）を用いて、各サンプリング部位に隣接する１０の脂肪細胞面積の平均値を各被験体の脂肪細胞面積として決定した。図５に示したように、中・高用量群では脂肪細胞面積が溶媒対照群に比べて減少したことが観察された。高用量群では、有意差（ｐ＜０．０５）が観察された。
総合すれば、高脂肪食誘発性肥満ラットにＡＬＳ−Ｌ１０２３を１２週間にわたって与えたところ、ＡＬＳ−Ｌ１０２３は、腹部脂肪組織重量と総コレステロールと中性脂肪との血清レベルの減少、脂肪肝の軽減、および脂肪細胞サイズの縮小を含む肥満阻害作用を発揮した。
【００８２】
（実施例４）新生血管性眼疾患に対するＡＬＳ−Ｌ１０２３の作用
網膜血管新生に対するＡＬＳ−Ｌ１０２３の有効性を評価するため、
ＲＯＰ（未熟児網膜症）動物モデル中から酸素誘発性網膜症マウスを選び、その生後１３日目に、ＤＭＳＯで希釈したＡＬＳ−Ｌ１０２３を２５ｍｇ／ｋｇの用量にて腹腔内注入し、それを５日間にわたって行った。
その結果、正常な網膜は血管の均１かつコンパクトパターンを示すが、ＲＯＰ対照群では網膜血管新生と多くの異常血管が観察され、ＡＬＳ−Ｌ１０２３群では、中心網膜と周辺網膜における血管新生の顕著な減少と、異常血管数がＲＯＰ対照群に比べて減少したことが観察された。かくして、ＡＬＳ-Ｌ１０２３は眼血管新生の予防と治療に効果的であると考えられる。
【００８３】
（実施例５）黄斑変性症に対するＡＬＳ−Ｌ１０２３の作用
製剤したＡＬＳ−Ｌ１０２３カプセルを、滲出性加齢黄斑変性症と診断された男性患者に、１日３回、１回あたり２カプセルを１２週間にわたって経口投与し、次いで、患者の網膜下領域の写真を取り、黄斑変性症領域のサイズを投与前に取った写真と比べてた。図６に示したように、黄斑変性症領域における進行は観察されなかった。かくして、ＡＬＳ−Ｌ１０２３は加齢性黄斑変性症の予防と治療に効果的であると考えられる。
【００８４】
（実験例）ＡＬＳ−Ｌ１０２３の安全性試験
本試験物質ＡＬＳ−Ｌ１０２３の原料であるメリッサの葉は食品または医薬として長期間にわたって使用されており、米国ＩＤＡによってＧＲＡＳ（一般に安全と見なされる）として分類されている。そのため、前記試験物質ＡＬＳ−Ｌ１０２３は無毒性と考慮されるが、本実験は急性毒性試験（限度試験）として、ＯＥＣＤガイドラインに従って、単回経口投与量を２０００ｍｇ／ｋｇのＡＬＳ−Ｌ１０２３と設定して行った。
１０匹の雄ラットと１０匹の雌ラットを、各群が５匹のラットからなるように対照群と実験群に無作為分割した。対照群には１ｍＬ／１５０ｇ（体重）のトウモロコシ油を投与し、実験群には２０００ｍｇ／ｋｇのＡＬＳ−Ｌ１０２３を含有するトウモロコシ油を投与した。本試験物質ＡＬＳ−Ｌ１０２３は水に溶解しないので、本試験ではトウモロコシ油に懸濁した。本試験物質は投与日に調製し、投与に先立ってボルテックスすることによって懸濁した。
【００８５】
まず、１匹のラットに経口投与し、その後２４時間観察した。次に、２匹のラットを経口投与し、その後７２時間観察した。次いで、残りの１７匹のラッに経口投与し、３０分間にわたって毒性を観察し、その後、３０分毎に１回の観察を４時間にわたって続けた。続いて、１日に２回、１４日間にわたっての観察を行い、体重と体温を毎日記録した。
実験の最終日にＣＯ２を用いて前記ラットを安楽死させて解剖した。病理学者の見地から調べた異常組織を切除し、生理組織学的検査に供した。
【００８６】
その結果、２０００ｍｇ／ｋｇのＡＬＳ-Ｌ１０２３を５匹の各雄・雌ラットに単回経口投与した場合、１４日にわたる観察期間中に有意な毒性の発見は観察されなかった。
対照群と実験群との両方で、明白に異なる臨床的異常現象は観察されなかったが、１匹の雌ラットが投与後６０分後でわずかな興奮状態を示したが、投与後９０分後には安定した状態に戻った。
加えて、ＡＬＳ−Ｌ１０２３の投与は対照群と実験群のいずれにおいても体重と体温に影響を及ぼさなかった（図７と図８を参照）。
総体重に対する胸腺、心臓、脾臓、腎臓、肝臓、および脳の相対重量（％）を図９に示す。わずかだが、対照群の雌ラットの肝臓の重さが、ＡＬＳ−Ｌ１０２３を投与した試験群の雌ラットと比べて統計的な有意差をもって増加したことが観察された。ただしこれは雄ラットの場合には観察されなかった。解剖による異常な知見や他の風変わりな知見はなかった。
また、いくつかの異常な知見が病理学者の観点によって検出されたが、その組織学的検査では異常現象の証拠はなかった。
そのため、２０００ｍｇ／ｋｇのＡＬＳ−Ｌ１０２３の単回経口投与量による有毒症状は観察期間にわたって誘発されなかった。
（産業上の利用可能性）
【００８７】
本発明のメリッサの葉のエチルアセテート分画は強力かつ優れた抗血管新生活性とＭＭＰ阻害活性を有する。従って、本発明のメリッサの葉のエチルアセテート分画を含む組成物は、血管新生関連疾患およびＭＭＰ媒介性疾患の治療または予防のための薬剤としても使用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、優れた血管新生活性とＭＭＰ阻害活性を有するメリッサの葉のエチルアセテート分画およびそれを含む組成物に関し、特に、メリッサの葉のエチルアセテート分画は、メリッサの葉を５０〜１００％のＣ１〜Ｃ６アルコールで抽出・濃縮し、次いでその濃縮アルコール抽出物を水中で懸濁し、エチルアセテートを用いて分画し、さらにそれを乾燥してメリッサの葉のエチルアセテート分画を得ることを特徴とする。
【背景技術】
【０００２】
メリッサ（Melissa officinalis、以下メリッサと呼ぶ）、シソ科の多年生草本（ハーブ）で、レモンバーム、バーム、または慣用名や民間名として浮腫の植物とも呼ばれる。
【０００３】
メリッサの主要成分はフラボノイド、テルペン酸、揮発油、アルコール性のフェノール化合物およびコーヒー酸誘導体の配糖体である。特に、シナロシド、コスモシン、ラムノシトリンとイソクエルシトリンはフラボノイドとして多量に含まれる成分であり、ウルソール酸は成分テルペン酸として多量に含まれる成分である。コーヒー酸誘導体としてのロスマリン酸は最も多量に含まれる成分（約４.７％）であり、およびゲラニアール、ネラール、シトロネラルおよびオイゲノールはメリッサの葉抽出物に含まれた揮発油として公知の成分である。
【０００４】
ロスマリン酸、メリッサの葉抽出物に多量に含まれる非揮発性成分は、強力な抗炎症性と解熱作用を有し、精油はうつ病、神経性頭痛、記憶減少、神経痛、熱に利用され、さらに鎮静、抗菌性、抗ウィルス、抗酸化と抗ホルモン作用を有することがよく知られている。最近になって、メリッサの葉抽出物は、末梢血管の拡張に役立つ血液循環活性化剤に含まれている。
【０００５】
血管新生は新しい毛細管血管の生成過程であり、血管新生は、厳重に規制され、胚発育中、組織再構築、創傷治癒および黄体発育の定期サイクル中に起こる。（Folkman and CotranのRelation of vascular proliferation to tumor growth, Int Rev Exp Pathol、１６、２０７−２４８、１９７６年）。
【０００６】
内皮細胞は、体内の他の細胞型に比べて非常に緩慢に成長するが、内皮細胞の増殖は、細胞外基質または血管新生因子の刺激作用から血管新生媒介物を放出する、活性化した加水分解性酵素である血管新生促進サイトカインによって誘発される。
【０００７】
一般に、血管新生の過程は、血管の基底膜の劣化、内皮細胞の移動、および内皮細胞の増殖と分化を介する内腔形成であり、前記血管新生の過程における主要イベントの１つは、毛細管血管の形成前の細胞外基質の破壊であり、マトリックス分解の最も重要な酵素は細胞外マトリックス分解酵素（ＭＭＰ）である。
【０００８】
血管新生の調節障害が起こるか、またはＭＭＰが過剰活性化すると、病理学的な血管新生が起こり、多くの疾患の原因となる。［Polverini PJのCritical Reviews in Oral Biology、６（３）、２３０−２４７（１９９５年）；ArupDasらのProgress in Retinal and Eye Research、第２２巻（２００３年）７２１−７４８；Nick Di GirolamoらのIOVS、２００１年８月、第４２巻、Ｎｏ．９、１９６３−１９６８； Patricia LeeらのSurvey of ophthalmology、第４３巻、Ｎｏ．３、１９９８年１１月〜１２月、２４５−２６９；D.B. HollandらのBritish Journal of Dermatology、２００４年、第１５０巻、７２−８１；Anthony H Vagnucci JrらのThe Lancet、第３６１巻、２００３年２月１５日、６０５−６０８；Berislav V. ZlokovicのTrends in Neuroscience、第２８巻、Ｎｏ．４、２００５年４月、２０２−２０８；Jaap G. NeelsらのThe FASEB Journal express、第１０論文、1096／fj.03-1101fje、オンライン公開日２００４年４月１４日；D.L. CrandallらのMicrocirculation、１９９７年４月、２１１−２３２；G. VorosらのEndocrinology、第１４６巻、２００５年、４５４５−４５５４；M.A. RupnickらのPNAS、第９９巻、２００２年、１０７３０−１０７３５；E. BrakenhielmらのCirc. Res.、第９４巻、２００４年、１５７９−１５８８； H.R. LijnenらのArterioscler Thromb Vase Biol、第２２巻、２００２年、３７４−３７９；D. DemeulemeesterらのBiochem. Biophys. Res. Commun.、第３２９巻、２００５年、１０５−１１０、など］。
【０００９】
癌の増殖と転移；
血管腫、血管線維腫、血管変形・奇形、およびアテローム性動脈硬化、血管狭窄症、風土性（地方病性）硬化症および狭窄症などの心疾患；
糖尿病性網膜症、黄斑変性症（加齢性黄斑変性症を含む）、翼状片、網膜変性症、角膜の移植における血管新生、血管新生緑内障などの眼科疾患、角膜の癒着と虹彩の癒着、水晶体後線維増殖、顆粒結膜炎、角膜潰瘍、増殖性硝子体網膜症、未成熟網膜症、眼の炎症、円錐角膜、シェーグレン症候群、近視、眼腫瘍と角膜移植の拒絶反応などの血管新生角膜疾患；
肥満症；
関節炎、関節リウマチ、骨関節炎、敗血症性関節炎などの慢性炎症性疾患、ＭＭＰ媒介性のオステオパシーおよび外傷性関節損傷後の変性軟骨減少；
中枢神経系の炎症や炎症性腸疾患などの炎症疾患；
乾癖、毛細血管拡張症、化膿性肉芽腫、脂漏性皮膚炎およびざ瘡などの皮膚科疾患；
アルツハイマー疾患；
角膜の癒着、蛋白尿、腹部の大動脈瘤、神経脱髄疾患、肝線維症、腎糸球体疾患、胎膜の早期破水、歯肉炎と歯周炎などの歯周疾患。
【００１０】
特に、血管新生は癌細胞増殖と転移に非常に重要な役割を果たす。新しい血管は栄養分や酸素を急速に増殖する癌細胞に供給するだけではなく、転移の進化を助長する役割も果たす。［Folkman and TylerのCancer Invasion and metastasis、Biologic mechanisms and Therapy （S.B. Day ed.） Raven press 出版、ニューヨーク、９４−１０３（１９７７年）； Polverini PJのCritical Reviews in Oral Biology、６（３）、２３０−２４７（１９９５年）］。
【００１１】
癌患者の死亡は転移に起因し、現在癌の治療に使用されている化学療法と免疫療法には抗転移作用が欠如しているために癌患者の生存に寄与することができない。
【００１２】
公知の炎症性疾患である関節炎は自己免疫性の疾患として始まるが、骨膜空洞での血管内皮細胞の増殖は、最終的に関節内の軟骨を破壊する炎症性サイトカインによって活性化される。言い換えれば、骨膜空洞での骨膜細胞と内皮細胞の増殖は炎症を誘発するサイトカインの助けで、血管新生とパンヌス形成を誘導し、それは軟骨の破壊に主要な役割を果たす。［Koch AE、Polverini PJおよびLcibovich SJのArth Rheum、２９、４７１−４７９、１９８６年；Stupack DG、Storgard CMおよびCheresh DA BrazのJMed Biol Res、第３２巻、５７８−５８１、１９９９年、Koch AEのArthritis Rheum、４１、９５１−９６２、１９９８年）。その一方、関節炎と外傷性関節損傷におけるストロメライシンが活性の高いコラゲナーゼに対してプロコラゲナーゼを活性化する上で重要な役割を果たすことが認識されている［Murphy, G.らのBiochem. J.、２４８、２６５−２６８（１９８７年）］。従って、ＭＭＰ活性の下方制御は関節炎の進行を防止することができる。
【００１３】
全世界で多くの人々がさまざまな眼疾患のためにその視力を失っており、多くの患者が硝子体液への毛細管血球の浸潤のために盲目になった。［Jeffrey MIおよびTakayuki AのJ Clin Invest、１０３、１２３１−１２３６、１９９９年］。加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管新生緑内障、血管新生角膜疾患は典型的な血管新生眼疾患である。［Adamis AP、Aiello LPおよびD'Amato RAのAngiogenesis、３、９−１４（１９９９年）］。糖尿病性網膜症、糖尿病の合併症は毛細管の破壊と網膜表面の出血による被覆に起因する。
【００１４】
コラゲナーゼ、ゼラチナーゼおよびストロメライシンは角膜細胞外基質の破壊に関与している。これは、多くの潰瘍性眼疾患、特に感染または化学損傷の伴う疾患において罹患率と失明の重要なメカニズムであると思われている。（Burns, F.R.らのInvest Opthalmol and Visual Sci、３２、１５６９−１５７５、１９８９年）。潰瘍形成時に眼中に存在するＭＭＰは、内生的に白血球または線維芽細胞の浸潤、または外因的に微生物にのいずれかに由来する。
【００１５】
乾癖は角化細胞の極度に活性の高い増殖に起因する。急速に増殖する細胞は十分な血液供給を必要とし、血管新生は乾癖において異常に誘発される。（Folkman J.のJ Invest Dermatol、５９、４０−４８、１９７２年）。
【００１６】
炎症性刺激作用や微生物によって分泌されるコラゲナーゼは、歯肉結合組織におけるコラーゲンを分解し、最後には歯周炎を起こす。コラゲナーゼ活性とストロメライシン活性は、炎症性歯肉から単離された線維芽細胞内で確認されており、酵素のレベルは観察された歯肉炎の重度と相関関係を持つ。（Beeley、N.R.A.らの前出のOverall、CM.らのJ Periodontal Res、２２、８１−８８、１９８７年）。
【００１７】
ＭＭＰは、ミエリンまたは血液脳関門破壊するＣＮＳ（中枢神経系）の病原体と相関関係を持つ。また、ＭＭＰは、アルツハイマー疾患におけるアミロイドβ前駆体タンパク質の蓄積に関連することも報告されている。［Yong、VWらのTrends Neurosci、２１（２）、７５−８０（１９９８年）］。
【００１８】
脳脊髄液中の過剰レベルゼラチナーゼＢは多発性硬化症および他の神経障害の発生に結びついており、［Beeley、N.R.Aら、前出；Miyazaki, K.らのNature、３６２、８３９−８４１（１９９３）］、アミロイドβ前駆体タンパク質の劣化と蓄積の一因となる［Backstrom JRらのJ neurosci、１６（２４）、７９１０−９（１９９６年）］。
【００１９】
また、最近の報告はＭＭＰ-１活性がアルツハイマー疾患者の脳に高度に誘発されていることを明らかにしており、
また、ＭＭＰの酵素前駆体を活性化するＭＭＰ-３は、前記疾患の病態生理学にも関与する。［Leake A、Morris CMおよびWhateleyのJ Neurosci Lett、２９１、２０１−３、２０００；Yoshiyama Y、Asahina M、およびHattori TのActa Neu-ropathol （berl）、９９、９１−５、２０００）。
【００２０】
ＭＭＰによる基底膜の劣化は癌浸潤、転移さらに血管新生に非常に重要な方法である。つまり、ＭＭＰの過剰発現は血管新生、癌浸潤および癌の転移を促進することができる。
【００２１】
アデノ癌腫の場合、浸潤性近位胃癌細胞は７２−ｋＤ形態のＩＶ型コラゲナーゼを発現する。［Schwartz, G.K.らのCancer ７３、２２−２７（１９９４年）］。Ｈａ−ｒａｓおよびｖ−ｍｙｃ癌遺伝子またはＨａ−ｒａｓ単独によって形質転換されたラット胚細胞は、ヌードマウスで転移性であり、９２ｋＤａゼラチナーゼ／コラゲナーゼ（ＭＭＰ-９）を放出する。［Bernhard, EJらのProc. Natl. Acad. Sci ９１、４２９３−４５９７（１９９４年）］。
【００２２】
従って、これらの疾患を治療するため、血管新生の阻害剤またはＭＭＰ阻害剤を開発することができる。
【００２３】
これに関連して、本発明者らは、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）チューブ形成などのインビトロアッセイ、およびマウスのマトリゲルモデルやＣＡＭアッセイなどのインビボ試験法を介してメリッサの葉抽出物が抗血管新生作用を持つ韓国特許登録番号第１０−５５０，２９８号を開示した。
【００２４】
さらに、本発明者らは、韓国特許登録番号第１０−４７３，６８８号で、メリッサの葉抽出物がＭＭＰ（細胞外マトリックス分解酵素）に対して阻害作用を有し、それは血管新生の過程で基底膜を劣化させるのに重要であることを開示した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
本発明者らは、研究を重ねた結果、優れた血管新生活性とＭＭＰ阻害活性を有する、より活性の高いメリッサの葉分画を得られることを見出し本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明の目的は、優れた血管新生活性とＭＭＰ阻害活性を有するメリッサの葉のエチルアセテート分画およびそれを含む組成物を提供することにある。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＡＬＳ−Ｌ１０２３のＭＭＰ活性に対する阻害作用を示すグラフである。
【図２】ＡＬＳ−Ｌ１０２３のＨＵＶＥＣチューブ形成に対する阻害作用を示す写真である。
【図３】ＡＬＳ−Ｌ１０２３の血管新生に対する阻害作用を解析するマウスのマトリゲルアッセイの結果を示すグラフである。
【図４】高用量のＡＬＳ−Ｌ１０２３を与えた直後の高脂肪食由来肥満ラットにおける脂肪肝と炎症細胞浸潤の減少を溶媒対照群と比べて示す肝組織の光学顕微鏡写真である。
【図５】中・高用量のＡＬＳ−Ｌ１０２３を与えた直後の高脂肪食由来肥満ラットの後腹膜脂肪組織における脂肪細胞面積の減少を、溶媒対照群と比べて示すグラフである。
【図６】ＡＬＳ−Ｌ１０２３の経口投与による滲出性加齢黄斑変性症の進行に対するＡＬＳ-Ｌ１０２３の阻害作用を示す写真である。
【図７】ＡＬＳ−Ｌ１０２３の投与量２０００ｍｇ／ｋｇでの単回経口投与毒性試験におけるラットの体重変化を示すグラフである。
【図８】ＡＬＳ−Ｌ１０２３の投与量２０００ｍｇ／ｋｇでの単回経口投与毒性試験におけるラットの体温変化を示すグラフである。さらに、
【図９】ＡＬＳ−Ｌ１０２３の投与量２０００ｍｇ／ｋｇでの単回経口投与毒性試験における臓器の相対重量を総体重のパーセントとして示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
そこで、本発明は優れた血管新生活性と細胞外マトリックス分解酵素（ＭＭＰ）阻害活性を有するメリッサの葉のエチルアセテート分画を提供するものである。
【００２９】
また本発明は、血管新生関連疾患およびＭＭＰ媒介性疾患の治療または予防のためのメリッサの葉のエチルアセテート分画を含む組成物を提供することを課題とする。
【００３０】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００３１】
本発明に係るメリッサの葉のエチルアセテート分画は、メリッサの葉を５０〜１００％のＣ１〜Ｃ６アルコールで抽出・濃縮し、次いでその濃縮アルコール抽出物を水中で懸濁し、エチルアセテートを用いて分画し、さらにそれを乾燥してメリッサの葉のエチルアセテート分画を得ることを特徴とする。
【００３２】
本発明に係るメリッサの葉のエチルアセテート分画の作製法で使用するメリッサの葉は、乾燥または非乾燥のもの、またはその混合物であってもよく、抽出効率を高めるため、メリッサの葉を小片に切断するか、または微粉化することもできる。
【００３３】
この時点では、メリッサの葉のアルコール抽出物は従来の方法を用いて抽出することができ、使用する抽出溶媒は５０〜１００％のアルコール、好ましくは７０〜８０％のアルコールとし、アルコールとメリッサの葉との容量比は５〜１０：１であってもよく、前記アルコールはＣ１〜Ｃ６アルコール、好ましくはメタノール、エタノールまたはその混合物であってもよい。
【００３４】
本発明の実施例では、メリッサの葉の７５％エタノール抽出液を水中で懸濁し、エチルアセテートを用いて分画し、さらにそれを乾燥してメリッサの葉のエチルアセテート分画を得た（ＡＬＳ−Ｌ１０２３と呼ぶ）。
【００３５】
水溶性物質と不水溶性物質は抽出溶媒として５０〜１００％のアルコールを使用することで効率的に抽出することができ、この方法はエチルアセテート可溶性の水不溶性物質を得るために効果的である。
【００３６】
エチルアセテートは、生成物の収率、残基の毒性および基準物質の相対含有量を考慮して第２抽出溶媒として選択される。
【００３７】
優れた抗血管新生活性を有するメリッサの葉から分画の大量作製を行う場合、メリッサの葉の５０〜１００％アルコール抽出物を水中で懸濁し、エチルアセテートを用いて分画し、さらにそれを乾燥してメリッサの葉のエチルアセテート分画を得る（以下の実施例ではＡＬＳ−Ｌ１０２３と呼ぶ）。
【００３８】
また、メリッサの葉を５０〜１００％のＣ１〜Ｃ６アルコールで抽出・乾燥し、そのアルコール抽出物を水中で懸濁し、次いで、エチルアセテートを用いて分画・乾燥し、そのエチルアセテート分画を水中で再懸濁し、さらにそれを乾燥してメリッサの葉のエチルアセテート分画を得ることもできる。
【００３９】
得られたメリッサの葉のエチルアセテート分画は動物試験と前臨床試験に使用した。
【００４０】
本発明者らは、本発明におけるメリッサの葉のエチルアセテート分画は、他の溶媒分配で得られたその他の分画と比べて血管新生活性とＭＭＰ活性の阻害に優れていることを見出した。前記メリッサの葉のエチルアセテート分画は、ＭＭＰ阻害アッセイ、ＨＵＶＥＣチューブ形成アッセイ、およびマウスのマトリゲル移植アッセイによって、血管新生の阻害において最も効果的かつ優れた活性を示す。また、本発明者らは、この分画が、脂肪組織、脂肪細胞のサイズを縮小するとともに、脂肪酸の酸化に関連した遺伝子発現を誘導することで肥満を抑制することも見出した。
【００４１】
従って、本発明に係るメリッサの葉のエチルアセテート分画を、血管新生関連疾患およびＭＭＰ媒介性疾患の治療または予防用の抗血管新生剤およびＭＭＰ阻害剤として使用できることが明らかである。
【００４２】
従って本発明はメリッサの葉のエチルアセテート分画を含む組成物を提供するものである。
【００４３】
本発明の組成物で治療または予防することができる血管新生関連疾患およびＭＭＰ媒介性疾患は、限定するものではないが、癌の増殖と転移と；血管腫、血管線維腫、血管変形・奇形、およびアテローム性動脈硬化、血管狭窄症、風土性（地方病性）硬化症および狭窄症などの心疾患と；糖尿病性網膜症、黄斑変性症（加齢性黄斑変性症を含む）、翼状片、網膜変性症、角膜の移植における血管新生、血管新生緑内障などの眼科疾患、角膜の癒着と虹彩の癒着、水晶体後線維増殖、顆粒結膜炎、角膜潰瘍、増殖性硝子体網膜症、未成熟網膜症、眼の炎症、円錐角膜、シェーグレン症候群、近視、眼腫瘍と角膜移植の拒絶反応などの血管新生角膜疾患と；肥満症と；関節炎、関節リウマチ、骨関節炎、敗血症性関節炎などの慢性炎症性疾患、中枢神経系の炎症や炎症性腸疾患などの炎症疾患と；ＭＭＰ媒介性のオステオパシーと退行性軟骨減少と；乾癖、毛細血管拡張症、化膿性肉芽腫、脂漏性皮膚炎およびざ瘡などの皮膚科疾患と；アルツハイマー疾患と；角膜の癒着、蛋白尿、腹部大動脈瘤、神経脱髄疾患、肝線維症、腎糸球体疾患、胎膜の早期破水、歯肉炎や歯周炎などの歯周疾患と、を含む。
【００４４】
本発明の組成物は公知の抗血管新生剤または公知のＭＭＰ阻害剤と併用することができる。
【００４５】
本発明では、血管新生関連疾患およびＭＭＰ媒介性疾患の治療剤または予防剤として使用されるメリッサの葉のエチルアセテート分画を含む組成物は医薬組成物または食品組成物であり得る。
【００４６】
また、本発明の医薬組成物は、希釈剤、分散剤、界面活性剤、溶媒、崩壊剤、甘味料、結合剤、コーティング剤、発泡剤、潤滑剤、流動促進剤または風味剤などの薬学的・生理的学的に許容できる添加物を含むことができる。
【００４７】
活性成分としての本発明のメリッサの葉のエチルアセテート分画を含む医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤と組み合せて製剤することができる。
【００４８】
本発明の医薬組成物は任意の形態、例えば顆粒、粉末、錠剤、被覆錠剤、カプセル、ピル、シロップ剤、ドロップ剤、液剤、溶液、懸濁液、エマルジョン、または注射剤などの形態で製剤することができる。
【００４９】
例えば、錠剤またはカプセル型の組成物では、その活性成分を薬学的に許容される不活性担体と無毒性の担体と結合させることができ、適切な結合剤、潤滑剤、崩壊剤および発色剤を必要に応じて含むこともできる。好適な結合剤の例には、限定するものではないが、デンプン、ゼラチン、デキストリン、マルトデキストリン、グルコースやβラクトースなどの天然の砂糖、トウモロコシ甘味料、アカシア、トラガントやオレイン酸ナトリウムなどの天然および合成ゴム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムが含まれる。崩壊剤には、限定するものではないが、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンゴムなどが含まれる。
【００５０】
液体溶媒型の組成物では、薬学的に許容される担体は、生理食塩液、滅菌水、リンゲル液、緩衝生理食塩液、アルブミン注射液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールまたは混合溶液であり、抗酸化物、緩衝液、静菌剤などの一般的な添加物をこの組成物に添加することができる。従来の方法を用いるかまたはレミントンの薬科学（米国ペンシルベニア州イーストンのＭａｃｋ出版社）に記載の方法を用いることで、本組成物の組成を疾患または成分に応じて所望の形態で製剤することができる。
【００５１】
また、活性成分としての本発明のメリッサの葉のエチルアセテート分画を含む食品組成物は、機能的食品、栄養補助食品または食品添加物としても使用することができ、食品添加物の場合、本発明の食品組成物を肉、飲料水、チョコレート、食料雑貨類、スナック、ピザ、即席ラーメン、麺類、チューインガム、アイスクリーム、アルコール飲料、複合ビタミン、または健康食品に添加することができる。
【００５２】
本発明は、血管新生関連疾患およびＭＭＰ媒介性疾患の治療または予防のため、メリッサの葉のエチルアセテート分画を含む組成物の使用方法を提供するものであり、本発明の組成物は食品と、血管新生関連疾患およびＭＭＰ媒介性疾患の治療または予防用医薬と、に使用することができる。
【００５３】
また本発明は、メリッサの葉のエチルアセテート分画の治療有効量を哺乳動物に投与することを含む、血管新生関連疾患およびＭＭＰ媒介性疾患の治療または予防方法も提供する。
【００５４】
本明細書中で用いた、治療目的のための「哺乳動物」は、哺乳動物として分類される任意の動物、好ましくはヒトを意味する。
【００５５】
本明細書中で用いた「治療有効量」は、本組成物投与対象の動物またはヒトにおいて生物学的応答または医療対応を誘導する量を意味し、通常の熟練度を有する医療提供者であれば、最適な臨床結果を達成するために、その治療有効量、ならびにその適切な用量と投与の頻度を決定することができ、治療有効量は、疾患の種類、患者症状の重度、成分の内容、年齢、体重、個々の患者の性別、食品、投与時間、投与経路、前記組成物の構成比率、治療期間、および他の同時投与する医薬品などのさまざまな要因で変動し、本発明の組成物は、単回投与、または複数回投与などの投与管理体制の一部として投与することができ、メリッサの葉のエチルアセテート分画の好ましい投与量は１日あたり３ｍｇ／ｋｇ〜２５０ｍｇ／ｋｇである。
【００５６】
本発明の組成物はさまざまな経路、例えば、限定するものではないが、経口、直腸、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、粘膜内、皮下、真皮内、経皮、経皮、腟内、直腸内、経鼻、経眼、ないしは腸管内などの経路で投与することができる。
【００５７】
以下の実施例は本発明をさらに例示することを意図するが、これらの実施例と実験例は、本発明をよりよく理解するためのもので、その範囲を限定するものではない。
【００５８】
（実施例）
【００５９】
（実施例１）メリッサの葉のエチルアセテート分画の作製
強力な抗血管新生活性を有するメリッサの葉抽出物を作製するため、蒸留水、５０％水溶性エタノール、７５％水溶性エタノール、１００％エタノールおよびメタノールをそれぞれ用いてメリッサの葉を抽出する。その粗抽出物を遠心分離し、ろ過・濃縮し、次いで凍結乾燥して抽出物の粉末を得た。前記粉末は使用するまで４℃にて保存する。前記抽出物の抗血管新生作用を５０μｇ／ｍｌの濃度にてＨＵＶＥＣチューブ形成アッセイで検査した。表１に示したように、水、５０％、７５％、１００％エタノール、および１００％メタノール抽出液を含むすべての抽出液はＨＵＶＥＣチューブ形成アッセイで阻害作用を示した。特に、前記７５％エタノール抽出液が、他の抽出液と比べて相対的に良好な阻害活性を示したことから、７５％エタノールを第１抽出溶媒として選択する。
【００６０】
【表１】
【００６１】
メリッサの葉分画から最も強力な抗血管新生活性を見出すため、ヘキサン、エチルアセテート、およびブタノールを用いてメリッサの葉の７５％エタノール抽出液を連続的に区分する。各分画を遠心分離し、ろ過・濃縮し、次いで凍結乾燥して分画粉末を得る。前記粉末は使用するまで４℃にて保存する。前記抗血管新生作用を５０μｇ／ｍｌの濃度にてＨＵＶＥＣチューブ形成アッセイでそれぞれ検査した。表２に示したように、前記エチルアセテート分画が最も強力な抗血管新生活性を示す。
【００６２】
【表２】
【００６３】
これらのアッセイの結果に基づいて、優れた抗血管新生活性を有するメリッサの葉分画の大量作製を以下の通りに行った。メリッサの葉の７５％エタノール抽出液を水中で懸濁し、エチルアセテートを用いて分画し、さらにそれを乾燥してメリッサの葉のエチルアセテート分画を得た（以下の実施例ではＡＬＳ−Ｌ１０２３と呼ぶ）。このＡＬＳ−Ｌ１０２３を動物試験と前臨床試験に使用した。
【００６４】
以下にＡＬＳ−Ｌ１０２３の詳細な大量作製方法を説明する。
乾燥した１００ｋｇのメリッサの葉を、８３℃にて４時間、３５０Ｌの７５％水溶性エタノールを用いて２回抽出した。前記抽出物を１０μｍフィルタでろ過し、３０Ｌに濃縮し、次いで４０Ｌエチルアセテートを用いて２回分画した。この分画を蒸留水で洗浄した後、１５Ｌの容量になるまで濃縮し、次いで４５℃の熱風で乾燥した。最終的に、５ｋｇのＡＬＳ−Ｌ１０２３を乾燥粉末形態で得た。
【００６５】
（実施例２）ＡＬＳ−Ｌ１０２３のインビトロアッセイ
（１）ＭＭＰ阻害アッセイ
大量作製したＡＬＳ−Ｌ１０２３によるＭＭＰ阻害を調べるために、分光蛍光分析方法（パーキンエルマー社製ＬＳ５０Ｂ）を用いてＭＭＰ酵素活性アッセイを行った。
前記アッセイに使用するヒトＭＭＰ酵素は、ＡｎｇｉｏＬａｂ社のバキュロウイルスシステムを用いた組換え体タンパク質産生法によって調製し、蛍光定量的基質（Ｂａｃｈｅｍ社カタログＮｏ．Ｍ-２１０５）をＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の基質として使用し、さまざまな濃度のＡＬＳ−Ｌ１０２３をＭＭＰ酵素と基質を含有する反応緩衝液に添加して蛍光強度を測定した。ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９に対するＡＬＳ−Ｌ１０２３のＩＣ５０はそれぞれ１７．７＋１．０ｍｇ／ｍＬと１２．３±１．４ｍｇ／ｍＬであった。
ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９に対するメリッサの葉の７５％エタノール抽出液のＩＣ５０はそれぞれ３３．６＋１．５ｍｇ／ｍＬと２６．０±１．７ｍｇ／ｍＬであった。かくして、ＡＬＳ−Ｌ１０２３のＭＭＰ阻害活性はメリッサの葉の７５％エタノール抽出液の阻害活性と比べて高いことが確認された（図１）。
【００６６】
（２）ＨＵＶＥＣチューブ形成阻害活性
前記ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）チューブ形成アッセイは、インビボ有効性に緊密に関連するインビトロアッセイであるので、ＨＵＶＥＣチューブ形成に対するＡＬＳ−Ｌ１０２３の作用を調べた。
前記チューブ形成アッセイを行うため、ＨＵＶＥＣを新たに得られたコードから単離した。細胞を培養し、抗第ＶＩＩＩ因子抗体を用いた免疫細胞の化学的染色によって識別した。通路５以内で培養したＨＵＶＥＣを、さまざまな濃度のＡＬＳ−Ｌ１０２３の不在下または存在下で、３７℃にてマトリゲル（米国マサチューセッツ州ベッドフォードのＢＤバイオサイエンス社製）上で１８時間増殖させた。チューブ形成を顕微鏡で観察した。図２に示したように、大量作製したＡＬＳ−Ｌ１０２３は５０ｍｇ／ｍＬの濃度でチューブ形成を阻害した。チューブの毛細管ネットワークは、対照で観察されたが、ＡＬＳ−Ｌ１０２３によって連絡切断した。また、表３に示したように、ＡＬＳ−Ｌ１０２３は用量依存方式でＨＵＶＥＣチューブ形成を阻害した。
【００６７】
【表３】
【００６８】
（３）細胞毒性試験
ＡＬＳ−Ｌ１０２３のＨＵＶＥＣに対する細胞毒性試験を行うため、ウェルあたり５，０００〜１０，０００のＨＵＶＥＣを９６ウェルプレートに播種し、さまざまな濃度のＡＬＳ−Ｌ１０２３を各ウェルに添加した。前記細胞生存度を、ＸＴＴテトラゾリウム基（ナトリウム３’−［Ｌ−（フェニルアミノカルボニル）−３，４−テトラゾリウム］−ビス［４−メトキシ−６−ニトロ］ベンゼンスルホン酸水和物）細胞増殖キット（ドイツのロッシェ社製）で検査し、生細胞をＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）プレートリーダーで測定した。ＡＬＳ−Ｌ１０２３は５０ｍｇ／ｍＬ濃度にて、ＨＵＶＥＣ生存度に影響を及ぼさず、ＨＵＶＥＣチューブ形成阻害活性を示した。
【００６９】
（４）マウスのマトリゲルアッセイ
マウスのマトリゲル移植アッセイを行って、ＡＬＳ−Ｌ１０２３でインビボ血管新生の阻害を定量的に測定した。
５０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）と５０単位／ｍＬのヘパリンを含有する０．４ｍＬのマトリゲルを皮下注射でＣ５７ＢＬ／６マウスに移植した。マウス１匹あたりに、１０％エタノール中に溶解した０．５ｍｇのＡＬＳ−Ｌ１０２３を経口で１日２回、４日間にわたって投与した。１０％エタノールを経口で対照群に投与した。５日目に、マウスの表皮を除去して、マトリゲルを回収し、次いで前記マトリゲル中のヘモグロビンの量をＤｒａｂｋｉｎ試薬（シグマ社製、米国）で判定した。
図３に示したように、ＡＬＳ−Ｌ１０２３による治療群から回収したマトリゲル中のヘモグロビン含有量は溶媒対照群に比べて減少した。ＡＬＳ−Ｌ１０２３による血管新生阻害の割合は３３％であった。
【００７０】
（製剤例）
好適な賦形剤をＡＬＳ−Ｌ１０２３に添加してその安定性を向上させ、次いでその２５０ｍｇを硬質カプセルにパッケージングした。その混合比を以下の表４に記載する。
【００７１】
【表４】
【００７２】
（実施例３）ＡＬＳ−Ｌ１０２３分画の抗肥満作用
高脂肪食由来の肥満症に関し、以下の実験を行って腹部脂肪に対するＡＬＳ−Ｌ１０２３の阻害作用を調べた。活性成分として製剤したＡＬＳ-Ｌ１０２３を、０（対照群）、０．１％（低）、０．２５％（中）、および０．５％（高）（製剤形態：０、０．１７、０．４２、０．８３％）の含有量で、４５ＫｃａＬ％の高脂肪飼料（米国リサーチダイエット社製）と混合した。活性成分ＡＬＳ−Ｌ１０２３を含有しない対照群の調製には、製剤したＡＬＳ−Ｌ１０２３に含まれた賦形剤を、高用量として０．３３％の含有量で前記高脂肪飼料と混合した。１週間の順化期間後、生後７週間の雄ＳＤラットを群あたり７匹のマウスからなる群に分割し、１２週間にわたって給餌した。次いで、その体重と腹部脂肪の重さを測定し、肝臓と脂肪組織の生化学的血液試験と病理組織学的試験を行った。
【００７３】
（１）体重
体重の測定は、マウス取得日、投与開始日、投与開始後１週間毎に１回の頻度、および解剖日に行った。表５にその結果をまとめた通り、溶媒対照群の平均体重は２０４.７３±５.５７ｇ（投与前）から６３３.６３±４３.０８ｇ（１２週間にわたる投与後）へと常に増加し、ＡＬＳ−Ｌ１０２３群（低、中、および高用量群）の平均体重も、２１０．１０＋５.１９ｇ、２０４.９７＋６.６１ｇ、および２０８.０１＋７.６５ｇ（投与前）から６２３.７２＋５８.０２ｇ、５８８.６９＋３３.７６ｇ、および５８４.８３＋３３.４４ｇ（１２週間にわたる投与後）へと常に増加した。溶媒対照群とＡＬＳ−Ｌ１０２３群の間に統計的有意差は認められなかったが、ＡＬＳ−Ｌ１０２３群の平均体重は用量依存方式では減少した。
【００７４】
【表５】
【００７５】
（２）飼料摂取
１日の飼料摂取量を以下の通りに決定した。フィーダーを粉末状の飼料で充填し、次いでその重量を測定した。前記フィーダーを用いた前記動物の給餌後２４時間にてその重量を測定し、測定重量の差を１日の飼料摂取量として決定した。その測定は、投与開始日と、投与開始後１週間毎に１回の頻度で行った。
溶媒対照群の１日の平均飼料摂取量は１２週間にわたって１８.４６〜２２.７３ｇの範囲内であり、低、中、および高用量群の１日の平均飼料摂取量はそれぞれ１７.１４〜２１.８４ｇ、１７.２９〜２２.０３ｇおよび１６.９９〜２０．８４ｇの範囲内であった。溶媒対照群に比べて有意差認められなかった。
【００７６】
（３）臓器と脂肪組織の重量
解剖と採血前に、１８時間以上にわたって前記動物を絶食させ、エーテルで麻酔し、続いて採血と静脈切開を行った。その腸間膜脂肪組織、精巣上体脂肪組織、および後腹膜脂肪組織をその腹部の空洞から切除し、秤量し、その肝臓、心臓、腎臓、脾臓、および膵臓を秤量した。
結果として、溶媒対照群と実験群間の心臓、肝臓、膵臓、腎臓（左右）および脾臓の重量に有意差は認められなかった。低、中・高用量群の腸間膜脂肪組織の重量は、それぞれ１５.９０+４.３６ｇ、１２.６４+１.６９ｇ、および１１.２３+３.３２ｇであった。つまり、用量依存方式では、実験群での重量は溶媒対照群の１５.１６±４.４１ｇに比べて減少した。低、中・高用量群の精巣上体脂肪組織重量は、それぞれ１７.７４±３.３７ｇ、１６.２９±２.６２ｇ、および１５.６７±３.８３ｇであった。つまり、用量依存方式では実験群での重量は溶媒対照群の２０．８０±４.４１ｇに比べて減少し、高用量群で統計的な有意差（ｐ＜０．０５）が観察された。低、中・高用量群の後腹膜脂肪組織重量は、それぞれ２７.２０±５.７６ｇ、２１.３６±４.０３ｇ、および２３.９４±６.２４ｇであった。つまり、用量依存方式では実験群での重量は溶媒対照群の２９.７３±３.２３ｇに比べて減少し、中用量群で統計的な有意差（ｐ＜０．０５）が観察された。低、中・高用量群の腸間膜脂肪組織、精巣上体脂肪組織および後腹膜脂肪組織を含む腹部脂肪組織の総重量は、それぞれ６０．８４±１１.６６ｇ、５０．２９±７.３１ｇ、および５０．８４±１１.８４ｇであった。つまり、実験群での重量は溶媒対照群の６５.６９±１０．１３ｇに比べて減少し、中・高用量群で統計的有意差（ｐ＜０．０５）が観察された（表６を参照）。
【００７７】
【表６】
【００７８】
（４）生化学的血液試験
生化学的血液試験では、対照群と実験群間のＡＳＴ（アスパラギン酸アミノ基転移酵素）、ＡＬＴ（アラニンアミノ基転移酵素）、およびＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）の血清レベルなどの肝指数に有意差は認められなかった。低、中・高用量群の全血液コレステロールレベル値は、それぞれ８８.０７＋１４.３５ｍｇ／ｄＬ、８６.９６＋１７.６８ｍｇ／ｄＬ、および７９.９０+１０．４５ｍｇ／ｄＬであった。つまり、用量依存方式では、実験群でのコレステロール値は溶媒対照群の１０２.０９＋２１.８２ｍｇ／ｄＬと比べて減少した。低、中・高用量群の中性脂肪値は、それぞれ５０．９３＋１５.２８ｍｇ／ｄＬ、４６.６３＋１１.７７ｍｇ／ｄＬ、および４５.５０＋２２.４５ｍｇ/ｄＬであった。つまり、用量依存方式では、実験群での中性脂肪値は溶媒対照群の５８.１３＋２５.０４ｍｇ/ｄＬと比べて減少した。低、中・高用量群のＬＤＬ値は、それぞれ９.５６+２.６７ｍｇ／ｄＬ、９.１１＋２.９２ｍｇ／ｄＬ、および８.５６＋２.２６ｍｇ／ｄＬであった。つまり、用量依存方式では、実験群でのＬＤＬ値も溶媒対照群の１２.３１±３.７０ｍｇ／ｄＬと比べて減少した。しかしながら、対照群と実験群間のグルコース、全タンパク質、およびアルブミンのレベルに有意差は認められなかった。かくして、ＡＬＳ−Ｌ１０２３の投与に関しては、総コレステロール、中性脂肪、およびＬＤＬにおける実験群の血清レベルは、用量依存方式では溶媒対照群と比べて減少した（表７を参照）。
【００７９】
【表７】
【００８０】
（５）肝臓の病理組織学的試験
肝臓を秤量し、次いで１０％中性緩衝ホルマリン溶液中に固定し、続いて慣用的な組織学的治療を行った。組織のスライドサンプルを調製し、次いでＨ＆Ｅを用いて染色し、続いて顕微鏡下で脂肪肝を観察した。その結果、溶媒対照群では、肝細胞の肝小葉において脂肪小球の過剰蓄積が観察された。それは脂肪肝の発見であった。小滴性または大滴性脂肪性の変化は主に肝門脈の周りで観察された。脂肪肝の進行期で発生する炎症細胞浸潤は、脂肪肝が発生した風船化肝細胞相互間またはその周りに主に起こった。中度の脂肪肝では、炎症細胞浸潤は中心静脈の周りに起こった。その他の異常病理学的な知見は観察されなかった。
低用量群では、脂肪肝も観察され、それは溶媒対照群で観察されたものと同様であった。中用量群では、溶媒対照と低用量群に比べてわずか減少した脂肪肝と炎症細胞浸潤が観察された。
高用量群では、脂肪肝の阻害または炎症細胞浸潤の減少が観察され、それは中用量群で観察されたものと同様であった（図４を参照）。この結果は、ＡＬＳ−Ｌ１０２３がその上に阻害作用を発揮したことを示唆する。
【００８１】
（６）脂肪組織における脂肪細胞面積
切除した後腹膜脂肪組織を秤量し、次いでパラフィン封入した組織サンプルを慣用的な病理組織プロセッシングで調製し、続いてＨ＆Ｅ染色を行った。５つのサンプリング部位を無作為選択し、光学顕微鏡に接続されたStereo Investigatorソフトウェア（米国バーモント州のMicroBrightField社製）を用いて、各サンプリング部位に隣接する１０の脂肪細胞面積の平均値を各被験体の脂肪細胞面積として決定した。図５に示したように、中・高用量群では脂肪細胞面積が溶媒対照群に比べて減少したことが観察された。高用量群では、有意差（ｐ＜０．０５）が観察された。
総合すれば、高脂肪食誘発性肥満ラットにＡＬＳ−Ｌ１０２３を１２週間にわたって与えたところ、ＡＬＳ−Ｌ１０２３は、腹部脂肪組織重量と総コレステロールと中性脂肪との血清レベルの減少、脂肪肝の軽減、および脂肪細胞サイズの縮小を含む肥満阻害作用を発揮した。
【００８２】
（実施例４）新生血管性眼疾患に対するＡＬＳ−Ｌ１０２３の作用
網膜血管新生に対するＡＬＳ−Ｌ１０２３の有効性を評価するため、
ＲＯＰ（未熟児網膜症）動物モデル中から酸素誘発性網膜症マウスを選び、その生後１３日目に、ＤＭＳＯで希釈したＡＬＳ−Ｌ１０２３を２５ｍｇ／ｋｇの用量にて腹腔内注入し、それを５日間にわたって行った。
その結果、正常な網膜は血管の均１かつコンパクトパターンを示すが、ＲＯＰ対照群では網膜血管新生と多くの異常血管が観察され、ＡＬＳ−Ｌ１０２３群では、中心網膜と周辺網膜における血管新生の顕著な減少と、異常血管数がＲＯＰ対照群に比べて減少したことが観察された。かくして、ＡＬＳ-Ｌ１０２３は眼血管新生の予防と治療に効果的であると考えられる。
【００８３】
（実施例５）黄斑変性症に対するＡＬＳ−Ｌ１０２３の作用
製剤したＡＬＳ−Ｌ１０２３カプセルを、滲出性加齢黄斑変性症と診断された男性患者に、１日３回、１回あたり２カプセルを１２週間にわたって経口投与し、次いで、患者の網膜下領域の写真を取り、黄斑変性症領域のサイズを投与前に取った写真と比べてた。図６に示したように、黄斑変性症領域における進行は観察されなかった。かくして、ＡＬＳ−Ｌ１０２３は加齢性黄斑変性症の予防と治療に効果的であると考えられる。
【００８４】
（実験例）ＡＬＳ−Ｌ１０２３の安全性試験
本試験物質ＡＬＳ−Ｌ１０２３の原料であるメリッサの葉は食品または医薬として長期間にわたって使用されており、米国ＩＤＡによってＧＲＡＳ（一般に安全と見なされる）として分類されている。そのため、前記試験物質ＡＬＳ−Ｌ１０２３は無毒性と考慮されるが、本実験は急性毒性試験（限度試験）として、ＯＥＣＤガイドラインに従って、単回経口投与量を２０００ｍｇ／ｋｇのＡＬＳ−Ｌ１０２３と設定して行った。
１０匹の雄ラットと１０匹の雌ラットを、各群が５匹のラットからなるように対照群と実験群に無作為分割した。対照群には１ｍＬ／１５０ｇ（体重）のトウモロコシ油を投与し、実験群には２０００ｍｇ／ｋｇのＡＬＳ−Ｌ１０２３を含有するトウモロコシ油を投与した。本試験物質ＡＬＳ−Ｌ１０２３は水に溶解しないので、本試験ではトウモロコシ油に懸濁した。本試験物質は投与日に調製し、投与に先立ってボルテックスすることによって懸濁した。
【００８５】
まず、１匹のラットに経口投与し、その後２４時間観察した。次に、２匹のラットを経口投与し、その後７２時間観察した。次いで、残りの１７匹のラッに経口投与し、３０分間にわたって毒性を観察し、その後、３０分毎に１回の観察を４時間にわたって続けた。続いて、１日に２回、１４日間にわたっての観察を行い、体重と体温を毎日記録した。
実験の最終日にＣＯ２を用いて前記ラットを安楽死させて解剖した。病理学者の見地から調べた異常組織を切除し、生理組織学的検査に供した。
【００８６】
その結果、２０００ｍｇ／ｋｇのＡＬＳ-Ｌ１０２３を５匹の各雄・雌ラットに単回経口投与した場合、１４日にわたる観察期間中に有意な毒性の発見は観察されなかった。
対照群と実験群との両方で、明白に異なる臨床的異常現象は観察されなかったが、１匹の雌ラットが投与後６０分後でわずかな興奮状態を示したが、投与後９０分後には安定した状態に戻った。
加えて、ＡＬＳ−Ｌ１０２３の投与は対照群と実験群のいずれにおいても体重と体温に影響を及ぼさなかった（図７と図８を参照）。
総体重に対する胸腺、心臓、脾臓、腎臓、肝臓、および脳の相対重量（％）を図９に示す。わずかだが、対照群の雌ラットの肝臓の重さが、ＡＬＳ−Ｌ１０２３を投与した試験群の雌ラットと比べて統計的な有意差をもって増加したことが観察された。ただしこれは雄ラットの場合には観察されなかった。解剖による異常な知見や他の風変わりな知見はなかった。
また、いくつかの異常な知見が病理学者の観点によって検出されたが、その組織学的検査では異常現象の証拠はなかった。
そのため、２０００ｍｇ／ｋｇのＡＬＳ−Ｌ１０２３の単回経口投与量による有毒症状は観察期間にわたって誘発されなかった。
（産業上の利用可能性）
【００８７】
本発明のメリッサの葉のエチルアセテート分画は強力かつ優れた抗血管新生活性とＭＭＰ阻害活性を有する。従って、本発明のメリッサの葉のエチルアセテート分画を含む組成物は、血管新生関連疾患およびＭＭＰ媒介性疾患の治療または予防のための薬剤としても使用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管新生活性とＭＭＰ阻害活性を有することを特徴とするメリッサの葉のエチルアセテート分画。
【請求項２】
メリッサの葉を５０〜１００％のＣ１〜Ｃ６アルコールで抽出・濃縮し、次いでその濃縮アルコール抽出物を水中で懸濁し、エチルアセテートを用いて分画し、さらにそれを乾燥してメリッサの葉のエチルアセテート分画を得ることを特徴とする請求項１に記載のメリッサの葉のエチルアセテート分画。
【請求項３】
前記Ｃ１〜Ｃ６アルコールは７０〜８０％Ｃ１〜Ｃ６アルコールであることを特徴とする請求項２に記載のメリッサの葉のエチルアセテート分画。
【請求項４】
前記Ｃ１〜Ｃ６アルコールはエタノールまたはメタノールであることを特徴とする請求項３に記載のメリッサの葉のエチルアセテート分画。
【請求項５】
請求項１のメリッサの葉のエチルアセテート分画を含む肥満症の予防または治療のための組成物。
【請求項６】
糖尿病性網膜症、黄斑変性症（加齢性黄斑変性症を含む）、翼状片、網膜変性症、角膜の移植血管新生、新生血管緑内障、新生血管角膜疾患、水晶体後線維増殖、トラコーマ、角膜潰瘍、増殖性硝子体網膜症、未成熟網膜症、眼の炎症、円錐角膜、シェーグレン症候群、近視、眼腫瘍または移植拒絶後角膜移植の予防または治療のための組成物において、請求項１に記載のメリッサの葉のエチルアセテート分画を含むことを特徴とする組成物。
【請求項７】
癌の増殖と転移の予防または治療のための組成物において、請求項１に記載のメリッサの葉のエチルアセテート分画を含むことを特徴とする組成物。
【請求項８】
血管腫、血管線維腫、血管変形、動脈硬化症、血管付着／接着・粘着・固着・遵守、強皮症、または再狭窄症の予防または治療のための組成物において、請求項１に記載のメリッサの葉のエチルアセテート分画を含むことを特徴とする組成物。
【請求項９】
関節炎、関節リウマチ、骨関節炎、敗血症性関節炎、ＭＭＰ媒介性の骨減少症、または外傷性関節損傷後の変性軟骨減少の予防または治療のための組成物において、請求項１に記載のメリッサの葉のエチルアセテート分画を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１０】
前記中枢神経系または炎症性腸疾患の炎症性疾患の予防または治療のための組成物において、請求項１に記載のメリッサの葉のエチルアセテート分画を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１１】
乾癖、毛細血管拡張症、化膿性肉芽腫、脂漏性皮膚炎、またはざ瘡の予防または治療のための組成物において、請求項１に記載のメリッサの葉のエチルアセテート分画を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１２】
アルツハイマー疾患の予防または治療のための組成物において、請求項１に記載のメリッサの葉のエチルアセテート分画を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１３】
異常創部癒着、蛋白尿、腹部の大動脈瘤、神経脱髄疾患、肝線維症、腎糸球体疾患、胎膜の早期破水、または歯周疾患の予防または治療のための組成物において、請求項１に記載のメリッサの葉のエチルアセテート分画を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１４】
前記組成物は、顆粒、粉末、錠剤、被覆錠剤、カプセル、ピル、シロップ剤、ドロップ剤、液剤、溶液、懸濁液、エマルジョン、または注射剤の剤形に製剤されることを特徴とする請求項５〜１３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１】
血管新生活性とＭＭＰ阻害活性を有することを特徴とするメリッサの葉のエチルアセテート分画。
【請求項２】
メリッサの葉を５０〜１００％のＣ１〜Ｃ６アルコールで抽出・濃縮し、次いでその濃縮アルコール抽出物を水中で懸濁し、エチルアセテートを用いて分画し、さらにそれを乾燥してメリッサの葉のエチルアセテート分画を得ることを特徴とする請求項１に記載のメリッサの葉のエチルアセテート分画。
【請求項３】
前記Ｃ１〜Ｃ６アルコールは７０〜８０％Ｃ１〜Ｃ６アルコールであることを特徴とする請求項２に記載のメリッサの葉のエチルアセテート分画。
【請求項４】
前記Ｃ１〜Ｃ６アルコールはエタノールまたはメタノールであることを特徴とする請求項３に記載のメリッサの葉のエチルアセテート分画。
【請求項５】
請求項１のメリッサの葉のエチルアセテート分画を含む肥満症の予防または治療のための組成物。
【請求項６】
糖尿病性網膜症、黄斑変性症（加齢性黄斑変性症を含む）、翼状片、網膜変性症、角膜の移植血管新生、新生血管緑内障、新生血管角膜疾患、水晶体後線維増殖、トラコーマ、角膜潰瘍、増殖性硝子体網膜症、未成熟網膜症、眼の炎症、円錐角膜、シェーグレン症候群、近視、眼腫瘍または移植拒絶後角膜移植の予防または治療のための組成物において、請求項１に記載のメリッサの葉のエチルアセテート分画を含むことを特徴とする組成物。
【請求項７】
癌の増殖と転移の予防または治療のための組成物において、請求項１に記載のメリッサの葉のエチルアセテート分画を含むことを特徴とする組成物。
【請求項８】
血管腫、血管線維腫、血管変形、動脈硬化症、血管付着／接着・粘着・固着・遵守、強皮症、または再狭窄症の予防または治療のための組成物において、請求項１に記載のメリッサの葉のエチルアセテート分画を含むことを特徴とする組成物。
【請求項９】
関節炎、関節リウマチ、骨関節炎、敗血症性関節炎、ＭＭＰ媒介性の骨減少症、または外傷性関節損傷後の変性軟骨減少の予防または治療のための組成物において、請求項１に記載のメリッサの葉のエチルアセテート分画を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１０】
前記中枢神経系または炎症性腸疾患の炎症性疾患の予防または治療のための組成物において、請求項１に記載のメリッサの葉のエチルアセテート分画を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１１】
乾癖、毛細血管拡張症、化膿性肉芽腫、脂漏性皮膚炎、またはざ瘡の予防または治療のための組成物において、請求項１に記載のメリッサの葉のエチルアセテート分画を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１２】
アルツハイマー疾患の予防または治療のための組成物において、請求項１に記載のメリッサの葉のエチルアセテート分画を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１３】
異常創部癒着、蛋白尿、腹部の大動脈瘤、神経脱髄疾患、肝線維症、腎糸球体疾患、胎膜の早期破水、または歯周疾患の予防または治療のための組成物において、請求項１に記載のメリッサの葉のエチルアセテート分画を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１４】
前記組成物は、顆粒、粉末、錠剤、被覆錠剤、カプセル、ピル、シロップ剤、ドロップ剤、液剤、溶液、懸濁液、エマルジョン、または注射剤の剤形に製剤されることを特徴とする請求項５〜１３の何れか一項に記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１０−５３６８４７（Ｐ２０１０−５３６８４７Ａ）
【公表日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２１７９４（Ｐ２０１０−５２１７９４）
【出願日】平成２０年８月２５日（２００８．８．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００８／００４９３８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２５５３２
【国際公開日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【出願人】（５１００４３９７３）アンジオラブ，インコーポレーテッド (1)
【出願人】（５１００４４００６）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月２５日（２００８．８．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００８／００４９３８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２５５３２
【国際公開日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【出願人】（５１００４３９７３）アンジオラブ，インコーポレーテッド (1)
【出願人】（５１００４４００６）
【Ｆターム（参考）】
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