複合ナノ粒子
テスト分子の分配係数を測定する方法にして、以下の工程を含むことを特徴とする方法：多孔表面を有するナノ粒子と第一の溶媒から成る組成物に、該分子を混合する工程において、第二の溶媒が多孔表面に吸収され、第一の溶媒は第二の溶媒に対して非混和性を有するものである工程；及び、該ナノ粒子と第一の溶媒とを分離する工程。第一の溶媒の中に残る分子の量は、分配係数の計算が可能となるように、決定される。分離を容易にするために、ナノ粒子は、磁性材料の芯を有していても良い。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔表面を有するナノ粒子、かかるナノ粒子を製造する方法、並びに、分子の分配係数 (partition coefficient) の測定や、生物学的に活性な種の如き、触媒活性の種の封入における、それらの使用に関するものである。更に、成分を、ナノ粒子等の多孔材料の孔に析出 (depositing) させる方法にも、関連している。
【背景技術】
【０００２】
「ナノ粒子 (nanoparticles)」という語は、ナノメートルの尺度の大きさを有する粒子について述べるために用いられている。一般的に、これらの粒子は、サイズが約１ｎｍ乃至１μｍまでの範囲内であり得、通常は、１ｎｍから２〜３百ナノメートルの直径を有している。このようにサイズが小さいことから、ナノ粒子は、表面積と体積との比が非常に大きい。この特徴は、ナノ粒子の多くの使用の場合に、多くの不均一触媒作用の如く、その工程において、できる限り少ない体積で、最大の表面積が必要とされる理由を明らかにしている。
【０００３】
ナノ粒子は、その内部構造において、多様であり得る。最も単純な粒子が、単に一つの材料のみでできている一方で、より複雑な粒子は、異なる材料で形成された１つ又はそれ以上の異なる層が周りに配置された芯 (core) の領域を有する場合がある。
【０００４】
ナノ粒子を製造するための多くの方法がある。それは、材料の単純なすり潰しや粉砕の技術から、マイクロエマルジョンからの析出 (deposition) 及びエマルジョンの重合を通じて、材料の電気アーク蒸発までの範囲に到る。用いられる方法は、必要とされる粒子の複雑さ、例えば、その粒子の異なる材料の層の数、異なる層が如何に相互作用するか、及び、その他の十分に定義された要因に基づいている。
【０００５】
ナノ粒子を、単一の材料から単純な粉砕の技術によって製造することが、最も単純な製造方法であるが、粒子内部の芯を化学的又は物理的な劣化 (degradation)から保護するために、外側がコーティングされた粒子が、広く用いられている。
【０００６】
様々に異なる芯材料及び表面層を有するナノ粒子の製造方法が、広く知られている。
ＵＳ６，５４８，２６４は、外側にシリカコーティングを有する粒子の範囲、及びマイクロエマルジョンを用いたそれらの製造方法について、開示している。
【０００７】
ＷＯ ０３／０５７３５９として公開された国際出願ＰＣＴ／ＧＢ２００３／００００２９（Ｒｅａｄｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）も、磁性の芯を有するシリカ粒子の製造方法について、記載している。アルミナ、チタニア、又はジルコニアのような、他のコートされた材料のナノ粒子を、ゾル・ゲル技術又は関連の技術によって製造する方法が、知られている。
【０００８】
【特許文献１】ＵＳ６，５４８，２６４
【特許文献２】ＷＯ ０３／０５７３５９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ナノ粒子の表面層の孔質 (porosity) を利用するものであり、かかる粒子を新しい用法に利用するものである。孔質は、該粒子を製造する際に、制御することができる。また、この製造方法は、多孔のコーティング又は層の内側で、粒子の芯に所望の分子の導入を許容するものであり、そして該粒子の孔質は、捕捉された分子へのアクセスを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第一の態様においては、ナノ粒子が、二つの非混和性の溶媒から成る溶媒系における分子の分配係数を決定するプロセスにおいて、調製され、使用される。分子の分配係数は、その中で測定される溶媒系に依存し、平衡状態にある該二つの溶媒間で分子がどのように分配されるかについての数値的評価を与える。これは、医薬品の発展における、一つの特別な用法を有する。
【００１１】
分配係数の値を測定するための、現時点での技術は、"Pharmacokinetic Optimization in Drug Research: Biological, Physicochemical and Computational Strategies" (B. Testa, H. van de Waterbeemd, G. Folkers, R. Guy (editors), Verlag Helvetica Chimica Acta, Zurich, 2001) に記載されている。最も一般的に適用されている測定においては、テスト分子が、第一の溶媒、例えば水に、公知の濃度で溶解せしめられている。この溶液の公知の量が、その後、公知の量の第二の溶媒、例えばｎ−オクタノールに添加され、そしてそれら二つの相は、十分に混ぜられる。この系は、それから、濃度平衡に到達するようにされる。最後に、第一の溶媒を含む相が、分離され、この溶液中のテスト分子の濃度が測定される。この値から、分配係数（Ｐ）が決定され得るのである。
【００１２】
分配係数を決定するための、この方法により、幾つかの問題が発生する。非混和性のこれら二つの相が混ぜられると、濃度平衡に到達するには、長時間平衡させる必要がある。これは、二つの相の間の接触面積が、比較的少ないためである。また、二つの相の分離は、相の間の境界線（境界面）の位置を視覚的に評価することを、必要とするからである。ある分子が、一つの相に高度に可溶であると、その溶媒を非常に少ない量で用いることが必要となる場合があり、境界面の位置の評価が困難になる。更に、分配されるべき相のために境界面が認識できなければならない、という事実により、比較的多量の溶媒の使用を必要とする。これは、多量の有害な廃棄物を生み、その手順のためのコストを高める。
【００１３】
これらの問題が組み合わさることにより、この工程は、特に産業規模で実施される場合に、コストと時間のかかるものとなる。
【００１４】
本発明は、一つの態様において、テスト分子の分配係数の測定方法においてナノ粒子を用いることにより、上記の問題の克服を求めるものである。
【００１５】
従って、第一の態様において、本発明は、第一の溶媒及びナノ粒子の本体 (body of nanoparticles) を含有する混合物中の二つの溶媒間の化学的化合物の分配係数を決定する方法を提供するのであり、そこにおいて、第二の溶媒は、ナノ粒子の孔 (pore) 内に吸収されている。それらに吸収された溶媒を有するナノ粒子の本体は、所定量の溶媒を提供することができ、その際の溶媒の量は極少量であり得、極度の分配係数の決定 (determination of extreme partition coefficients) を許容する。該ナノ粒子は、例えばナノ粒子が磁選を許容する磁性体の芯を有する際に、第一の溶媒から簡単に分離せしめられ得る。遠心分離や、ナノ粒子の沈殿を起すために、例えば別の溶媒を加えることによって、該系の誘電率を変えるという方法の如き、その他の分離方法も利用可能であるので、本発明の本態様にて採用されるナノ粒子は、多孔材料のみからなるものでもよい。
【００１６】
分配係数の測定にナノ粒子を使用しても、その結果に影響を及ぼさない、すなわち、ナノ粒子は、得られる分配係数の値に、著しい影響を及ぼすことはない、ということが、示されてきた。測定された化合物の平衡分布が速やかに得られるので、その手順は速やかであり得、また簡単且つ効果的にナノ粒子が分離されるので、用いられるべき一方又は両方の溶媒が、少量となることにより、経済的と為し得るのである。
【００１７】
分配係数の正確な決定のためには、第一の溶媒相が第二の溶媒相で予め飽和せしめられているか、あるいはその逆であることが、望ましい。従って、二つの溶媒は、互いに完全に不溶である必要はなく、重要なのは、それらが二つの非混和性の相を形成することであり、「非混和性の（immiscible)」との語は、ここでは、その意味にて用いられる。
【００１８】
本発明は、また、分配係数を決定するための本方法において有用なナノ粒子を含む組成物にも、ある。ここでは、多孔の外側コーティングを有するナノ粒子及び第一の溶媒の混合物が提供され、そこで、第二の溶媒がナノ粒子の多孔コーティングに吸収されるのであり、その場合の第一の溶媒と第二の溶媒とは、非混和性である。このような組成物は、例えば第一の溶媒中の粒子のコロイド的な分散物として安定しており、長い貯蔵寿命を有し、そして所定量の第二の溶媒を、簡単に且つ正確に投与すること(dipensing)を許容する。この組成物においては、第二の溶媒相は、ナノ粒子中に完全に吸収されること、つまり、ナノ粒子の外側に自由に現われないことが、好ましい。
【００１９】
従って、第一の溶媒の単位体積当たりの（すなわち、組成物全体の単位体積当たりでもある）、第二の溶媒を含むナノ粒子の量を、予め決めること、つまり、特定の組成物に関して知り、固定することができる。ナノ粒子は、第一の溶媒中に、コロイド溶液として、均一に分布せしめられ得る。そのため、二つの溶媒の体積の比は、前もって正確に決定される。従って、ある量の組成物の容量的投与 (volumetric dispensing)が実施され得、如何なる任意の量の二つの溶媒でも、簡単な方法で、所定の比率にて得られる。そして、高い精度が達成され得るのである。
【００２０】
この組成物は、蒸発を避けるため、密閉容器にて保管されることが、好ましい。
【００２１】
ナノ粒子が懸濁せしめられる第一の溶媒は、好ましくは、水性のもの、例えば、水又は水性溶液或いは含水相である。
【００２２】
ナノ粒子の多孔の外側コーティングに吸収される前記第二の溶媒は、例えば、水に対して非混和性である溶媒である。例えば、ｎ−オクタノール、シクロヘキサン、アルカン（Ｃ6−Ｃ10）、クロロホルム、プロピレングリコールジペラゴネート（propylene glycol dipelargonate: ＰＧＤＰ）、１，２−ジクロロエタン、オリーブオイル、ベンゼン、トルエン、ニトロベンゼン、クロロベンゼン、テトラクロロメタン、オレイルアルコール、４−メチルペンタン−２−オール、ペンタン−１−オール、ペンタン−２−オール、イソブタノール、ブタン−１−オール、２−メチルブタン−２−オール、ブタン−２−オール、ブタン−２−オン、ジエチルエーテル、イソアミルアセテート、エチルアセテート等である。
【００２３】
二つの溶媒とも、好ましくは、何等の生物学的に活性な種を持つ化合物も、特に何等の薬学的に活性な化合物 (pharmaceutically active compound)も含んでいない。
【００２４】
溶媒を含む粒子を形成するために、超臨界流体を用いて、この本発明の組成物を形成する方法は、以下に記述される。
【００２５】
本発明によって提供される組成物の代替的な形式のもので、本文に記載された分配係数の決定の如き、定量的分析の手順において便利な形態をした所定の量の溶媒（すなわち、上記第二の溶媒と呼ばれる溶媒）の正確な投与に適したものも、夫々が多孔表面を有し、その孔の中に溶媒が吸収せしめられているナノ粒子を、組成物の単位重量当たり所定の量含んだ組成物である。この組成物は、自由溶媒(free solvent)が存在しない（すなわち、全てナノ粒子内に吸収せしめられている）ものであり、それによって、該溶媒が、効果的に微粒子的に固体(solid)であり、重さを量ることによって（重量測定法によって）必要量を投与することが可能（dispensable）であることが、好ましい。従って、溶媒の量は、組成物の単位重量当たり、事前に定められている。この組成物も、溶媒の蒸発を避けるため、密閉容器にて保管されることが好ましい。この溶媒は、実質的に溶質を含まないもの、例えば生物学的に活性な化合物を含まないものとすることができる。この組成物は、上記のように二つの溶媒の組成物を得るために、望ましい量の別の溶媒（上記で第一の溶媒と呼ばれているもの）と正確に混合されてよく、これは、例えばユーザーによって、使用の直前に行われてよいものである。超臨界流体を用いた、本発明のこの組成物の形成方法は、以下に記述される。
【００２６】
本発明の第二の態様においては、触媒的に活性な種、特に生物学的に活性な種、特に生物学的触媒が、多孔のナノ粒子の芯に捕捉され得、その際、触媒反応を起すため、触媒活性が維持され、基質の分子が粒子の孔を通じてそこに接触可能であるということを、見出したことに、起因するものである。これは、多孔コーティングが、該生物学的に活性な種のサイズよりも小さい孔サイズを有することによるものである。一つの有利な点は、生理活性を持つ種が、化学的結合をすることなしに捕捉され得るため、本質的に、最適な性質の遊離状態(free state of optimum nature)にあるということである。従って、その活性は、分子が支持体に化学的に結合せしめられる公知の技術とは異なり、障害を受けたり、変更されたりすることがない。
【００２７】
粒子サイズ、特に芯 (core) のサイズを制御することにより、捕捉された種を公知の再現可能な量にて含む、ナノ粒子の本体を提供することが可能となる。芯のサイズは、生理活性を持つ種の分子が、一つのみ存在する程度のサイズでもよく、その場合、ナノ粒子の集団において、触媒分子を全く含まないものもあれば、一つよりも多く含むものある。従って、触媒的に活性な種の分子を、粒子当たり平均で、多くて一つ含む、ナノ粒子の集団又は集合を、提供することが可能である。
【００２８】
この捕捉による一つの利点は、不活性化の程度を低減するコーティングによって、生理活性を持つ種の会合又は凝集 (agglomerization)を低減する（二量体、三量体、四量体等の形成を低減する）ということである。
【００２９】
本発明のかかる態様における、触媒的に活性な種を含むナノ粒子は、多くの用途、例えば酵素反応及びその他の触媒反応、分析方法（例えば、抗原−抗体反応、蛋白質−薬物結合、バイオレセプター−抗原結合、オリゴヌクレオチドの認識、ビオチン−ストレプトアビジン反応の如き、標的とする分子を捕捉された種に結合することによるもの）において、及び、バイオセンサー等として、採用され得る。重要な利点は、自由な形態の嵩高い生理活性を持つ種を、目的に合ったサイズの多孔コーティングを有するナノ粒子の芯の内部に捕捉するということである。これは、捕捉された種が、コーティングを通じて溶液に溶解されることを防ぐ。一方、コーティングの孔サイズは、捕捉された分子に自由に接近することを許容し、小さい分子（孔サイズよりも小さい）の交換を許容する。従って、捕捉された芯磁石 (core magnet) を用いて又はその他の手段によって、分離が達成され得る。その結果、複合ナノ粒子の多孔コーティングは、分子の認識及び分離のための「ナノメンブラン (nanomembrane)」であると考えられ得る。
【００３０】
更に、触媒的に活性な種をカプセル化する本発明のナノ粒子は、触媒作用が小規模にて行われることを許容し、不均一系触媒からの生成物の簡単な分離を許容する。
【００３１】
上記のように、本発明は、第一の溶媒中に存在し、その多孔コーティングに吸収された第二の溶媒を担持する多孔コーティングを有する、ナノ粒子の組成物を提供するものである。本発明は、更に、その孔に、組成物の単位重量当たり所定の量において吸収せしめられている溶媒を有するナノ粒子の組成物を、提供するものである。
【００３２】
本発明者らは、ナノ粒子の孔において、溶媒液の如き材料を、高度な量的精度をもって析出する新規な方法を見出した。この方法は、ナノ粒子のみならず、大きな物体の表面、又は任意のサイズの粒子の表面等の、如何なる多孔表面における材料の析出にも、適用することができる。
【００３３】
従って、本発明に従う更に別の態様によれば、多孔材料が超臨界流体中において或る成分の溶液に接触することによって、多孔材料の孔において該成分を析出又は分散させる方法が、提供される。好適には、かかる超臨界流体は、減圧し、そして蒸発を許容することによって、除去せしめられる。
【００３４】
好適な超臨界流体は、容易に制御できる温度及び圧力において、超臨界となる二酸化炭素である（ＳＣ−ＣＯ2）。適切な超臨界流体を形成することのできる、その他の物質の例には、エタン、水、ブタン、アンモニア、並びに、Ａｒ、Ｘｅ、及びＫｒの如き貴ガス (noble gas)がある。
【００３５】
ＳＣ−ＣＯ2に可溶の成分は、例えば、炭化水素類（脂肪族及び芳香族の両者を含む）、ハロカーボン類、アルデヒド類、エステル類、ケトン類、及びｎ−オクタノールのように、炭素原子を１乃至１２個有する脂肪族アルコール類等のアルコール類の如き有機分子である。特に、本発明の態様の一つにおいては、比較的低分子量（例えば≦２００）の溶媒化合物に適用することができるが、本発明は、また、例えば分子量が≦５００、特に２００−５００である生物学的種及び薬物分子等の大きな分子の如き、他の分子の析出又は分散をも含んでいる。二つ又はそれ以上の化合物が、同時に析出又は分散せしめられてもよい。
【００３６】
本発明は、更に、上記の如き超臨界流体を用いた方法によって、所定の量で第一の成分を含む多孔粒子を調製する工程と、該第一の成分を含有する粒子を、液状の第二の成分に添加する工程とを含む、二つの成分を有する組成物の調製方法も、提供する。これら二つの成分は、一般的に、非混和性である。前記第二の成分は、例えば、水性であってよい。第二の成分が大過剰である場合に、例えば、重量比が１００：１又はそれ以上、例えば、１００：１乃至３０００：１の範囲、好ましくは５００：１乃至１５００：１である場合にも、二つの成分の、正確な比率が成し遂げられ得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
多孔コートされたナノ粒子の形成及び特性
上記せるように、多孔のコーティングによって取り囲まれた芯を有する固体のナノ粒子は、以下の工程を含む方法によって、製造され得る：
ａ）芯となる種を含み、且つ、有機安定剤によってコロイド的に安定化せしめられているか、又は、ミセル凝集体（例えば、界面活性剤分子によって取り囲まれた、安定化せしめられた水滴）として安定化せしめられているコロイド粒子を、液状媒質中において形成する工程；及び
ｂ）前記コロイド粒子又はミセル粒子と、前記液状媒質との界面区域内にて、前駆物質の化合物を加水分解することによって、前記コロイド粒子の周りに、多孔コーティングを形成する工程。
【００３８】
好ましくは、多孔コーティングを所望の厚さにするために、ナノ粒子は、コロイド系から取り出される前に、例えば、１時間から数週間、好ましくは２−５日間、熟成される (aged) こととなる。
【００３９】
粒子の芯の周りに形成される多孔コーティングは、アルミナ、シリカ、チタニア、ジルコニア、又はカーボンの如き多孔材料の部類から、形成されてよい。好ましくは、多孔コーティングは、コロイド懸濁液の界面領域で、シリコン含有化合物の加水分解により、シリカから形成される。
【００４０】
この加水分解される化合物は、アルコキシシラン化合物、即ち、少なくとも一つのＳｉ−ＯＲ結合を有する化合物 [但し、Ｒは、テトラエチルオルソシラン（ＴＥＯＳ、Ｓｉ（ＯＣ2Ｈ5）4）の如く、好ましくは１−８個の炭素原子、更に好ましくは１−４個の炭素原子を有するアルキルである]；及び、クロロ−、ブロモ−、ヒドロ−、及びメタロ−シラン（加水分解が起きる、Ｓｉ−Ｃｌ、Ｓｉ−Ｂｒ、Ｓｉ−Ｈ、又はＳｉ−Ｍ結合を含有する）であり得る。その代わりとしては、加水分解される化合物は、チタニウムイソプロポキシド又はチタニウムテトラクロライドの如き、チタニウム、アルミニウム、又はジルコニウムの、類似アルコキシ、ハロ、ヒドロ化合物（又は金属間化合物）とすることができる。
【００４１】
上記化合物の加水分解の後、前記の熟成の工程により、−ＯＨ種の相互縮合が許容されて、その中に粒子を取り囲む三次元ゲル（例えば、Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ又はＴｉ−Ｏ−Ｔｉの結合を伴うもの）を形成する。
【００４２】
カーボンコーティングの形成のために、工程（ａ）で形成されたコロイド粒子は、コロイド懸濁液から分離せしめられ、そして熱分解されることにより、粒子の周りの有機界面活性剤のコーティングが分解して、ナノ粒子の芯の周りに多孔カーボンの外側コーティングが形成されるようになる。ポリビニルアルコール、フェノール／ポリフェノール、多糖類等の如き、その他のカーボン前駆物質（類）を、多孔カーボンの形成に用いることができる。
【００４３】
工程（ａ）における方法の好ましい形態においては、コロイド粒子は、界面活性剤によって安定化せしめられた分散相の小滴又はミセルを有し、且つ芯材料の溶解された化合物を含むエマルジョンを形成し、そしてコア種の沈殿を惹起して、それによってミセルの内部にコロイド状の粒子を形成することにより、作られる。この沈殿は、アルカリ又はアンモニアの添加によって惹起され得る。
【００４４】
コロイド粒子を安定化させるために用いられる好ましい界面活性剤には、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、オレイン酸、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、及び、ＡＯＴやＴＸ１００等の如き非イオン性界面活性剤が含まれる。
【００４５】
前記多孔材料は、その表面に、生化学的又は生物学的種（例えば、ペプチド類、マーカー類 (markers)、同種の結合相手、可溶化剤類）の如き、他の種の化学的（例えば共有)結合のため、若しくは、リンカー分子を使用又は使用することなく、基質にナノ粒子を結合するために、官能基、例えば、ＯＨ基を有していてよい。また、静電相互作用によって、所定のｐＨでの荷電表面上の、荷電した種の固定化も、含まれる。
【００４６】
異なる金属の、複数の金属含有種が、コロイド粒子中に、そしてそれ故に製造されたナノ粒子の芯中に含まれていてもよい。通常は、このような金属含有種は、金属、合金、金属酸化物、金属水酸化物、及び金属炭化物の中から選択される。好ましくは、この金属含有種は、強磁性 (ナノ粒子の磁気分離を可能にするもの)若しくは超常磁性であり、又は単一ドメインの磁性ナノ粒子が採用される。ナノ粒子の芯に含まれ得る磁性材料には、マグネタイト(Ｆｅ3Ｏ4）、マグヘマイト（γＦｅ3Ｏ4）、グレイジャイト(Ｆｅ3Ｓ4）、及びＦｅ2ＣｏＯ4 が、含まれる。
【００４７】
その代わりとして、又は、追加的に、ナノ粒子の芯は、触媒的に若しくは生物学的に活性な種を含有していてもよい。好適な生物学的活性の種は、酵素や蛋白質を含んでいる。その例は、血液／肝臓組織中にある、ラクターゼ、メタロチオニン、シトクロム（シトクロムｂ、シトクロムｃ、又はシトクロムＰ４５０等）、血清アルブミン（類）、カルボキシルエステラーゼ類、キナーゼ、短核酸オリゴマー類、抗体種及び酵素インジケータ類である。好適な触媒種には、ヘテロポリ酸類、メタロチオレイン類、コランド類（corands）、コラプレックス類（coraplexes）、スフェランド類、スフェラプレックス類（spheraplexes）、キャビタンド類、ホスト−ゲスト触媒類の如き無機触媒化合物（例えば、「定量的な合成（ship in a bottle chemistry）」によって形成されたもの）、及び介在 (intercalated) 触媒類などがある。
【００４８】
ナノ粒子の芯が、触媒的又は生物学的活性の種を含む場合、多孔コーティングは、その触媒的又は生物学的活性の種よりも小さい孔サイズを持つようにし、それによって活性種がナノ粒子のコーティング内部に保持されるようにすることが、好ましい。
【００４９】
さらに、ナノ粒子の多孔コーティングは、小さな分子がそこを通り抜けるのを許容できる程の大きさの孔サイズを有することが好ましい。特に、触媒活性の種が、ナノ粒子の芯においてカプセル化 (encapsulated) される時、多孔の外側コーティングの孔サイズは、触媒反応の反応剤及び生成物の何れのサイズよりも大きいことが、好ましい。この場合、反応剤分子は、ナノ粒子の多孔コーティングを通過して、ナノ粒子の内部に保持された触媒的又は生物学的活性の種と相互に作用することができ、その相互作用による生成物は、多孔コーティングを通過して出て行くことができる。
【００５０】
前記ナノ粒子は、好ましくは１ｎｍ乃至１μｍ、更に好ましくは１乃至１００ｎｍの平均直径を有する。多孔コーティングは、所望の厚さを有してよいが、好ましくは１乃至１００ｎｍ、更に好ましくは１乃至５０ｎｍの平均厚さを有する。ナノ粒子の芯が、触媒的又は生物学的活性の種を含む場合、芯の直径は、１乃至１０ｎｍとすることができ、好ましくは、１乃至５ｎｍである。
【００５１】
テスト分子の分配係数の測定における多孔コートされたナノ粒子の使用
本発明は、多孔ナノ粒子の使用を通じて、二つの非混和性の溶媒間のテスト分子の分配を達成するための方法を提供する。この方法は、テスト分子を、多孔の外側コーティングを有するナノ粒子を含むコロイド懸濁液である第一の溶媒と混合する工程を含み、そこでは、第二の溶媒が多孔の外側コーティング中に吸収せしめられており、ナノ粒子は、第二の溶媒に対して非混和性を有する第一の溶媒中に、懸濁せしめられている。このテスト分子は、第二の溶媒に部分的に溶解し、そしてナノ粒子の多孔の外側コーティングの中に保持され、また部分的には第一の溶媒の中に、保持せしめられる。
【００５２】
テストされる化合物（検体)、ナノ粒子、ナノ粒子を含む第一の溶媒、及びナノ粒子の孔内の第二の溶媒を含む組成物を調製するための工程は、あらゆる好適な方法によって、実施されてよい。例えば、検体は、ナノ粒子の組成物に混合される緩衝剤等に、並びに第一及び第二の溶媒に、溶液として、導入される。検体溶液は、第一の溶媒に対する混和性を有し、両者は、共に、例えば水性である。代替的には、ＤＭＳＯの如き少量の溶媒に溶解せしめられた公知の量の検体を、ナノ粒子並びに第一及び第二の溶媒の組成物に注入する。その他の代替法は、第二の溶媒を含むナノ粒子を、第一の溶媒中の検体の溶液に導入するというものである。
【００５３】
テスト分子の分配を達成するための速度を最適化するために、二つの非混和性の溶媒の接触面積を最大限にすることが、望ましい。これは、表面積と体積との比率が高い粒子を形成することによって達成され得る。すなわち、粒子の直径が小さければ小さいほど、分配は早く達成されるのである。更に、ナノ粒子上の多孔コーティングは、テスト分子の分配速度を上げるため、できる限り多くの溶媒を吸収すべきである。このように、小さくて、孔の体積の大きい粒子が、好ましい。テスト分子の速やかな分配を好むという多孔コーティングの特徴が最適化されると、本発明のナノ粒子を用いて、分配時間を１−１０分又はそれ以下の範囲にすることができる。これは、先行技術で達成された分配時間に比べて目覚しく改善されていることを意味する。
【００５４】
この方法では、上記の溶媒とナノ粒子を含む組成物が、採用されてよい。
【００５５】
二つの非混和性の溶媒間でテスト分子の分離を達成するための本発明の方法は、テスト分子の分配係数の値を決定するために、用いてもよい。
【００５６】
以下の用語は、分配係数について論じる際に、用いられる：
【００５７】
ｌｏｇＰは、テスト分子の分配係数のために引用される標準値である[但し、Ｐ＝［Ｃ］organic／［Ｃ］aqueousである]。その他に指定が無い限りは、これらの値は、電子的に中性の形態である分子を用いたオクタノール−水の二相系のために記録される。
【００５８】
ｌｏｇＤは、本明細書において、最も一般的に用いられる値である。これは、特定のｐＨ値におけるテスト分子の分配係数に当てはまる。これらの値を計算する際に、Ｄについて、以下の関係が用いられる。
【００５９】
【数１】
【００６０】
テスト分子の分配係数（ｌｏｇＰ又はｌｏｇＤの何れか）の値を測定するための一つの方法は、以下の工程を含んでいる：
ａ）多孔表面を有するナノ粒子と第一の溶媒からなる組成物にして、第二の溶媒が該ナ ノ粒子の多孔表面内に吸収されており、且つ、該第一の溶媒と該第二の溶媒が非混 和性である組成物を調製する工程；
ｂ）テストされるべき分子を、工程ａ）の組成物に導入する工程；
ｃ）工程ｂ）の生成物を、二つの成分、即ちナノ粒子を含む第一のものと、前記第一の 溶媒を含む第二のものとに分離する工程；並びに、
ｄ）分配係数の計算を可能とするために、前記第一の溶媒中に残る、テストされるべき 分子の量を決定する工程。
【００６１】
この方法の工程ｃ）は、混合物を、ナノ粒子と上澄み溶液とを含む二つの成分に分離するために、工程ｂ）の生成物を、例えばろ過又は遠心分離することによって、或いは上記したその他の分離方法によって、達成され得る。ナノ粒子の芯が、磁性材料を有する場合には、上記方法の工程ｃ）を実施するために、代替として磁界を用いることも可能である。この場合、工程ｂ）の生成物に適用される磁界は、反応混合物からナノ粒子を沈殿させるように作用せしめられ得る。
【００６２】
分配係数を測定するための方法における工程ｄ）は、溶液中のテスト分子の濃度を決定し得るあらゆる分析技術によって達成され得る。それら技術は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、滴定、ＵＶ−可視分光法、蛍光、リン光、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、質量分析（ＭＳ）、ＧＣ−ＭＳ、重量測定、表面プラズマ、及び電気分析法の技術を含み得る。好ましくは、工程ｄ）で用いられる技術は、上澄み溶液の更なる工程を必要とするものではなく、また、反応槽からサンプルを取り除くことなく実施され得るものである。最も好適な態様において、工程ｄ）にて用いられる技術は、ＵＶ−可視分光法である。
【００６３】
上澄み溶液中のテスト分子の濃度を決定するために、ＵＶ−可視分光法が用いられる好適なケースにおいては、ｌｏｇＤを計算するために、以下の式を用いることができる。
【００６４】
【数２】
【００６５】
本発明の方法によって測定されたｌｏｇＤの値と、先行技術の方法によって測定されたｌｏｇＤの値との相関関係が、図１及び図２に示されている。
【００６６】
第二の溶媒（ナノ粒子の多孔の外側コーティングに吸収されている）と第一の溶媒との体積比は、これら二つの溶媒におけるテスト分子のおよその溶解度（それが事前に知られていない場合には、推測により、又は実験によって決められてよい）に基づいて、選択される。本発明においては、第一の溶媒と第二の溶媒の比率は、３０００：１乃至１：１とすることができる。一般的に、第一の溶媒と第二の溶媒の比率は、５０：１よりも大きく、好ましくは１００：１又はそれ以上、更に、５００：１又はそれ以上と高く、例えば５００：１乃至１５００：１の範囲としてもよい。
【００６７】
このような、テスト分子の分配係数を測定する方法は、先行技術の方法に比べて、幾つかの明確な利点を有している。
【００６８】
第一に、テスト分子の分配は、前述の理由により、先行技術よりも早く達成される。
【００６９】
第二に、ナノ粒子の芯が磁性材料を有する場合、分配係数を測定するために用いられる混合物は、溶液に磁界を適用することによって、ナノ粒子成分と上澄み溶液とに、容易に分離せしめられ得るのである。通常は、該混合物のそれら二つの成分の分離は、数秒の範囲で達成され得ることとなる。
【００７０】
第三に、溶媒のうちの一つがナノ粒子の多孔コーティングに吸収されるので、測定中の揮発性の溶媒の蒸発による問題が、克服され得ることである。先行技術の方法では、揮発性の溶媒中で成分の分配について測定する際には、溶媒の蒸発を避けるために、測定中に溶媒の量を変更し、大いに注意を払わねばならず、分配係数の計算を、複雑にしていた。しかし、本方法では、揮発性の溶媒は、ナノ粒子の多孔の外側コーティングに吸収され得るため、溶媒の蒸発速度を低下させる。テスト分子の、より速やかな分配と組み合わされて、全体的な測定時間が減少することになり、それによって、本発明の方法を用いたテスト分子の揮発性の溶媒への分配が許容されることになるのである。
【００７１】
第四に、本方法では、分離は、例えば磁選、ろ過、又は遠心分離によるナノ粒子の分離によって、達成されるため、二つの溶媒の分離の達成のために溶媒の境界面の目視による判定に頼ることはない。そのため、テスト分子の分配係数を測定する本方法は、先行技術の方法に比べて、より少ない量の溶媒を用いて実施され得る。より少ない量の溶媒は、測定のコストを低下せしめ、工程の自動化を容易にする。更に、より少ない量の溶媒を用いた測定では、発生する有害な廃物の量も少なく、それによって、該工程のコスト及び環境に対する影響を、更に低下させる。
【００７２】
最後に、本発明工程は、テスト分子が溶媒の何れか一つに高度に可溶である場合でさえも、分配係数を測定するために用いられ得る。上記のように、第一の溶媒と第二の溶媒との好適な比率は、各溶媒におけるテスト分子の溶解度によって決定される。本発明の方法にあっては、分配係数値の測定において、より広い範囲の第一の溶媒と第二の溶媒との比率が用いられ得る。これは、テスト分子の濃度測定の前の溶媒の分離が、第一及び第二の溶媒間の境界の、目視による決定を必要としないという事実によるものである。３０００：１乃至１：１という比率において、第一の溶媒：第二の溶媒が、用いられ得る。少量の溶媒、テスト分子、及び複合ナノ粒子の使用と、上澄みにおけるテスト分子の濃度の速やかな分光光学的決定との組み合わせにより、分配係数の迅速な評価が許容される。従って、ロボットに適した(robot-friendly)方法において、幅広い種類のテスト分子の、高い流量でのスクリーニングが、確立され得る。
【００７３】
多孔の外側コーティングを有するナノ粒子内に被包された触媒種
多孔の外側コーティング内に触媒的に活性な種を被包（カプセル化）するナノ粒子の有利な点は、様々な外側コーティングと触媒的に活性な種が考えられ得るため、多様である。生物学的に活性な種を含む使用もあるため、本発明の多孔コートがなされたナノ粒子の、不均一無機触媒における使用が、考えられる。
【００７４】
一つの態様においては、磁性材料を含む芯を有するナノ粒子は、懸濁液においてその触媒活性が活用され、磁界を用いて反応生成物からの触媒の分離が容易に達成されるため、特に有用である。
【００７５】
芯材料が生物学的に活性な種を含む場合に、本発明のナノ粒子の更なる有利な点は、生物学的に活性な種は、例えば、その種を基材に結合するための可溶化基または連結基の付加によって、その自由状態における場合に比べて、化学的に変化せしめられにくいということである。これは、含まれている種の物理的構造が、ペンダント基又はそれと同等のものへの結合によって変更されないということである。従って、本発明の、この態様において、前記の種は、被包されていない形態と同様の方法で活動をする。
【００７６】
また、酵素分子の如く、生物学的に活性な分子の懸濁液は、かかる分子の濃度が特定の閾値よりも高められたときに、溶液の中で会合することも知られている。これは、生物学的に活性な種の、懸濁液中での高濃度での使用を制限する。というのも、会合は、分子の表面積と体積との比率の低下をもたらし、それ故、分子の相互作用のために利用可能な結合サイトの数を潜在的に低下させるからである。しかし、本発明では、生物学的に活性な種を取り巻く多孔の外側コーティングが、分子の会合を防ぎ、その種が懸濁液中に、先行技術の方法よりも、より高い濃度にて存在することを、許容する。
【００７７】
前記被包方法の、様々な芯材料に対する広い適用可能性、及び潜在的な多孔の外側コーティングの範囲により、本発明のナノ粒子には、潜在的に莫大な種類の適用が得られる。適用として考えられるものには、様々な薬物分子の分析方法、分子結合定数の測定、（生物学的な系及び化学的な系の両方における）触媒反応、バイオセンサーの適用、抗体−抗原、蓄積及び開放などが含まれる。一つの例には、薬物／アルブミン相互作用、及び／又は、結合定数の決定について研究するための、アルブミンの被包（カプセル化）がある。
【実施例】
【００７８】
実施例１： 多孔シリカコートがなされたＦｅ3Ｏ4ナノ粒子の形成
脱イオン化水、予め乾燥させた過剰のトルエン、及びイオン性界面活性剤（ＣＴＡＢ）を用いて、マイクロエマルジョンの形成が、行われた。概して、実験は、室温にて行われた。このマイクロエマルジョンは、以下の通り形成された：トルエン中にＣＴＡＢが十分に分散せしめられた懸濁液を作るため、勢いよく攪拌しつつ、０．０２モルのＣＴＡＢ（９９％、Aldrich）を、１００ｇの乾燥トルエン（９９＋％、Fisher）に添加した。０．３４２８ｇのＦｅＣｌ2・４Ｈ2Ｏ及び０．９３２１ｇのＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ（共に、９９％、Aldrich）が、６．２ｇの水に、溶解せしめられた。この溶液は、窒素雰囲気中において、ＣＴＡＢのトルエン懸濁液に、ゆっくりと滴下することで、添加された。４時間攪拌した後、ＮＨ3溶液（１８．１Ｍ、１ｍｌ、Fisher）が、該混合物に添加された。１時間後、系全体 (whole system)の色が、黒く変化した。これは、Ｆｅ2+、Ｆｅ3+、及びアンモニアの添加は、磁性Ｆｅ3Ｏ4の沈殿物を生成することを前もって示している。この時点で、テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）（９９％、Aldrich）が、反応混合物に添加された。該混合物には、１時間の間、窒素のバブリングが行われた。このアンモニア溶液（高ｐＨ）は、ＴＥＯＳの加水分解／縮合に触媒作用を及ぼし、シリカゲルと成した。このシリカの上層は、懸濁液中にて、５日間、熟成せしめられた。最後に、沈殿物が、磁気分離の手段によって隔離され、界面活性剤及び有機溶媒を除去するために、高温のエタノール、水、及びアセトンで、数回洗浄された。その後、沈殿物は、室温にて乾燥せしめられ、濃い茶色の粉末を得た。
【００７９】
実施例２： 実施例１の生成物の分析
実施例１で得られた生成物が、様々な技術を用いて分析された。
【００８０】
この粒子は、超常磁気応答を示す磁界への露呈によって、強力な磁気応答を示した（図３参照）。
【００８１】
Ｆｅ3Ｏ4ナノ粒子は、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によって、直径が約１２ｎｍであることが示された（図４参照）。これに対して、Ｘ線回折（ＸＲＤ）測定による計算は、該粒子の直径が１７ｎｍ程度であることを示している（図５参照）。
【００８２】
このナノ粒子の化学的組成物は、エネルギー分散分光法（ＥＤＳ）によって測定された（表１参照）。
【００８３】
【表１】
【００８４】
表１からの計算は、シリカコートされたＦｅ3Ｏ4の組成物の個々の粒子がＦｅ3Ｏ4.24・１．７４ＳｉＯ2であることを示している。実施例１の方法を用いるものの、ＴＥＯＳの濃度を変えた、粒子を形成するための更なる実験は、Ｆｅ3Ｏ4.1・０．２１ＳｉＯ2の組成を有するナノ粒子も得られ得るということを示唆している。これは、実施例１の方法を用いることによって、ナノ粒子上のシリカコーティングの厚さを、目的に合わせたものとすることが可能であることを、示している。
【００８５】
実施例３： 実施例１で生成したナノ粒子上のシリカコーティングの多孔度の測定
実施例１の方法によって製造されたＦｅ3Ｏ4 ナノ粒子のシリカコーティングの孔に捕捉され得るｎ−オクタノールの最大量の評価は、熱重量（ＴＧ）分析によって得ることが出来る（図６及び７参照）。実施例１の方法によって調製された生成物のＴＧ分析によって得られた値は、シリカコーティングが、ナノ粒子１ｇ当たり０．５４ｍｌまで吸収可能であることを示唆している。ＢＥＴ（シリカ１ｇｍ当たり３００ｍ2 超）及び孔サイズの測定（孔サイズの範囲０．５−３ｎｍ）も、複合ナノ粒子が、実際に多孔質であることを、示している。
【００８６】
実施例４： 表面水酸基のキャッピング
実施例１の方法によって得られた、多孔シリカでコートされたＦｅ3Ｏ4ナノ粒子は、シリカコーティング上の表面水酸基を、トリメチルシリル（−Ｓｉ（ＣＨ3）3）基でキャップするために、更に変更せしめられた。過剰のＣＴＭＳが、１２０℃の窒素雰囲気中において、乾燥シリカゲルでコートしたＦｅ3Ｏ4固定床を通じて流れるようにされた。ＣＴＭＳによる処理の前後の、多孔シリカでコートされたＦｅ3Ｏ4ナノ粒子のＩＲスペクトルは、図８に示されており、そして図は、Ｓｉ−ＯＨシグナル（〜９６７ｃｍ-1）の強度の減少、及び、シリカ表面上の−ＯＨ基のキャッピングを示すＳｉ−ＣＨ3 シグナル(〜８５０ｃｍ-1〜１２６５ｃｍ-1）の発現を示している。
【００８７】
実施例５： 多孔シリカでコートされたＦｅ3Ｏ4の形成
実施例１と同じ方法によって、Ｆｅ2ＣｏＯ4ナノ粒子が生成せしめられ、多孔シリカコーティングによってコートされた。この場合、等モル量のＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ（実施例１に記載の使用量と同じ量）とＣｏＣｌ2・ｘＨ2Ｏとが、実施例１と同じ方法で、ＣＴＡＢのトルエン懸濁液に添加された水に溶解せしめられた。Ｆｅ2ＣｏＯ4 粒子のサイズは、実施例１で形成されたＦｅ3Ｏ4粒子と略同じサイズのものとして、ＸＲＤにより測定された（図９）。
【００８８】
実施例６： 多孔シリカでコートされたナノ粒子を用いたｌｏｇＤ値の測定
オルトリン酸二水素カリウム（９９％、Aldrich）の０．１ｍＭ水溶液で、ｐＨ値が７．４に調整されたものが、以下の測定における緩衝溶液として、用いられた。ガラス瓶内で、ｎ−オクタノールで予め予備飽和された緩衝溶液に、テスト分子が溶解せしめられた。このテスト分子の濃度は、約１×１０-5Ｍに維持された。前記緩衝溶液にて予備飽和されたｎ−オクタノールの、１０乃至１００μｌが、多孔シリカでコートされたＦｅ3Ｏ4のナノ粒子（実施例１の方法によって得られたもの）に、毛管作用によって、物理的に吸収せしめられた。添加されたオクタノールの全てが、完全に吸着され、それを含むナノ粒子は、乾燥した粉末のように思われ、油性の小滴は、全く見られなかった。公知の量のｎ−オクタノールを含有しているナノ粒子が、公知の濃度のテスト分子溶液に分散するようにされた。この混合物中の水溶液とｎ−オクタノールとの体積比は、１００：１に設定された。前記のガラス瓶は、密閉され、オービタル・シェーカーに入れられた。ｎ−オクタノールの小滴が複合物から（視覚上）分離することを避けるため、振り混ぜ速度が、注意深く制御された。振り混ぜの後、外部の磁石が、瓶の底付近に置かれた。磁性によって誘発された沈殿が、２〜３分以内で起こった。この沈殿の前後の、上澄みの水性相内のテスト分子の検体のＵＶ−可視吸収が、ベースライン補正 (baseline correction) を用いて測定された。その後、以下の式を用いて、ｌｏｇＤ値が得られた。
【００８９】
【数３】
【００９０】
他に記載が無い限り、第一の溶媒（水）と第二の溶媒（ｎ−オクタノール）との体積比は、１００：１に固定された。
【００９１】
一部のテスト分子の検体の分配係数値は、キャップされていないナノ粒子と比較するために、トリメチルシリル（ＴＭＳ）基にてキャップされたナノ粒子の表面−ＯＨ基を用いて測定された。
【００９２】
比較の目的のため、各テスト分子の検体の分配係数は、先行技術の「振とうフラスコ」法により、同じテスト分子濃度及び相体積比率を用いて、個別に測定された。これらの測定の結果が、以下の表２乃至表４に示されている。
【００９３】
【表２】
【００９４】
【表３】
【００９５】
【表４】
【００９６】
実施例７： 酵素の芯を用いたナノ粒子の形成
第一の緩衝溶液が、５００ｍｌの脱イオン化水中に、リン酸二水素カリウムの０．０１ｍｏｌと塩化ナトリウムの０．２５ｍｏｌを含んで、調製された。緩衝ｐＨ値は、２０℃での水酸化ナトリウム溶液の添加により、７．０に調整された。
【００９７】
その後、ペニシリナーゼ（Bacillus cereusから精製されたβ−ラクタマーゼＩ、Sigma）が、酵素濃度が５０ｎＭとなるように、同じ組成物の第二の緩衝溶液に溶解せしめられた。連続的に攪拌しながら、第一の緩衝溶液の５．２ｇが、ゆっくりと滴下して添加されることで、実施例１と同様にして（１００ｇの乾燥トルエン中に０．０２ｍｏｌのＣＴＡＢ）マイクロエマルジョンが形成された。第二の緩衝溶液（ペニシリナーゼを含む）の２ｍｌが、４時間を越えて、添加された。その後、この混合物は、更に４時間攪拌されることで、マイクロエマルジョン系における酵素分子の均等な分散を、確実にした。酵素活性の比較のため、この混合物の２００μｌのサンプルが、除去された（実施例８を参照）。その後、６．９４ｇのＴＥＯＳが、この系にゆっくりと添加せしめられ、それによって、水／トルエン界面での加水分解が起き、外側のシリカコーティングが形成された。
【００９８】
実施例８： 実施例７の生成物に対する酵素活性の試験
検定された標準ペニシリンＶ（フェノキシメチルペニシリン酸)(３ｎＭ、Sigma）の加水分解を経ても、酵素が機能する(functional)か、どうかを確認するため、実施例７でのＴＥＯＳの添加の前に取り出された２００μｌの混合物のサンプルが、２３２ｎｍでペニシリン (pencilling) のラクタム基の加水分解が理解できるＵＶ−可視分光法を用いて、分析された。ＴＥＯＳの添加から６日後に、実施例７の混合物から、更に２００μｌが、抽出され、同様の方法にて分析された。
【００９９】
図１０乃至１２に、ＵＶ−可視スペクトルが示されている。このスペクトル曲線は、主に、ペニシリンＶのＵＶ−可視スペクトルを表している。典型的なＵＶ−可視スペクトルの変化を示す、添加された自由状態のβ−ラクタマーゼＩによるペニシリンＶの加水分解が、図１０にプロットされている。２３２ｎｍ（ラクタム基が吸収する領域）での吸収値が、５分を越えて減少するということは、ペニシリンＶから対応のペニシロ酸への急速な転換が起きているということ（ラクタム基の加水分解）を、明確に示している。図１１は、ＴＥＯＳの添加の前に、反応混合物から抽出された２００μｌのサンプル（シリカコートなし）を添加した際の、ペニシリンＶ溶液の結果を示している。ラクタム基が位置している２３２ｎｍでの吸光度の値は、ここでも、５分の間、減少が見られた。これは、混合物のミセルに導入された際にも、酵素が、なお活性であることを示している。図１２も、実施例７（シリカコートされたナノ粒子）の混合物にＴＥＯＳを添加した６日後に抽出されたサンプルを用いた場合に、同様のスペクトルの変化が観察されたことを示している。２３２ｎｍでの吸光度の値は、５分を越えて、２つのスペクトルの間で、明白に減少し続けた。
【０１００】
これらの結果は、捕捉された酵素が、ミセル及びシリカコートされた複合環境の両方において、機能を有することを示している。
【０１０１】
次に、超臨界流体を用いて、成分を多孔材料、特にナノ粒子に析出させる本発明の方法の詳細について、説明する。
【０１０２】
ある化合物の超臨界状態は、その臨界値の、或いはそれ以上の温度及び圧力において、達成され得る。化合物の臨界温度は、それを超えると、適用される圧力如何に拘わらず、純粋な気体成分を液化せしめることができない温度として、定義される。それから、臨界圧力は、該臨界温度における蒸気圧として、定義される。気体及び液体の相が同一になる時の温度及び圧力が、臨界点である。超臨界環境においては、一つの相のみが、存在する。いわゆる流体は、気体又は液体の何れでも無く、それら二つの極値（extremes）の中間として、最も適切に表現される。この相は、液体に共通の溶媒の力のほか、気体に共通する輸送能力を、保持する。二酸化炭素は、最も一般的に知られる超臨界流体である。気体、液体、及び超臨界状態の違いを例示するために、二酸化炭素の圧力−温度のダイヤグラムが、図１３に示されている。図１３に見られるように、純粋なＣＯ2は、３１．０６℃未満の温度においてのみ、圧縮によって液化せしめられ得る。この臨界温度Ｔｃ及び対応の臨界圧力Ｐｃ（７３．８バール）を越えると、明確な液体相又は気体相は存在しない。これは、ＳＣ−ＣＯ2 が存在する超臨界領域として、言及される。
【０１０３】
ＳＣ−ＣＯ2の特性は、温度及び圧力に依存しているが、一般的に、気体の状態と液体の状態の中間体である。超臨界のＣＯ2は、環境にやさしい溶媒であるという有利な点を有する。それが持つ主な特性のうちの一つには、化学的化合物を溶解する能力がある。ＳＣ−ＣＯ2における化学的化合物の溶解度は、温度及び圧力によって影響される。ＳＣ−ＣＯ2中でのｎ−オクタノールの溶解度については、２００１年に調べられた (H. Nakaya, O. Miyawaki and K. Nakamura, Enz. Micro. Tech., 28, 176-182, 2001)。この研究において、ｎ−オクタノール／水系中における超臨界ＣＯ2のｌｏｇＰは、ＣＯ2におけるｎ−オクタノールの溶解度から、決定された。ｎ−オクタノールにおけるＳＣ−ＣＯ2の溶解度は、５５バール、５０℃において、約１．０Ｍである。圧力が増加せしめられると、溶解度が増加せしめられる。これは、ｎ−オクタノールが、ＳＣ−ＣＯ2 において良好な溶解度を有することを、示している。ＳＣ−ＣＯ2は、液体ＣＯ2に比して、実質的に高い拡散率及び低い粘度を有する。その密度の故に、この粘度及び拡散率は、温度及び圧力に依存している。異なる圧力及び温度でのＳＣ−ＣＯ2 の拡散率及び粘度の曲線は、M.A. McHugh and V.J. Krukonis, Supercritical Fluid Extraction-Principles and Practice, Butterworths, Boston, MA, 10, 1986 and S.V. Kamat, B. Iwaskewyct, E.J. Berkman and A.J. Russell, Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 2940, 1993. に示されている。拡散率が、温度の増加又は圧力の低下に伴って増加することについても、示されている。拡散率とは異なり、粘度は、温度の増加又は圧力の低下に伴って減少することが、示される。
【０１０４】
ＳＣ−ＣＯ2の、高いｎ−オクタノールの溶解度、高い拡散率及び低い粘度という利点は、超臨界媒体を介したｎ−オクタノールの多孔ナノ複合体への運搬についての、以下の実施例において、採用されている。その結果となるものは、均一に装填されたオクタノールと共に磁性ナノ複合体を含む均質な溶液 (homogeneous solution)である。
【０１０５】
実施例９： ＳＣ−ＣＯ2 の運搬を介した多孔ナノ複合体へのｎ−オクタノールの装填及びストック溶液の準備
以下の実施例では、ｎ−オクタノール（９９％）、リン酸二水素カリウム、４−ニトロアニソール（９７％）、４−ニトロベンジルアルコール（９９％）、および４−ニトロフェノール（９８％）が、Aldrichから入手された。イミプラミン、キノリン、クロルプロマジン、ベンズアミドについては、分析用の品質又はそれ以上のものが、Sigmaから入手された。これらの薬品は、全て、それ以上の精製を行うことなく用いられた。
【０１０６】
図１４に示された設定を用いて、多孔ナノ複合体へのｎ−オクタノールの装填が行われた。
【０１０７】
図１４は、高圧ＣＯ2がパイプ２を通じて運搬される、オートクレーブ１を示している。このオートクレーブ１は、圧力検出器３、及び、一定の温度を保つ為の温度コントローラ４を有している。オートクレーブ１は、弁付管５によって、水槽７に保持されたサンプルホルダー６に接続されている。
【０１０８】
上記実施例１で調製された、乾燥した多孔シリカ被包のナノ複合体０．０６０７ｇが、サンプルホルダー６内に置かれた。その後、マイクロピペットを用いて、３０μＬのｎ−オクタノールがホルダー６内に添加された。このオートクレーブ槽とサンプルホルダー（合計容量３０ｍｌ）がＣＯ2で満たされ、２つのコンパートメントの間の弁や外部排出口を開閉することによって、ＣＯ2 でフラッシュされた。これは、この槽が所望の圧力（１５０バール）に達する前に、２、３回行われた。少量のｎ−オクタノールの多孔粒子中への分散を許容するため、オートクレーブとサンプルホルダーの温度は、４０℃に維持された。２時間後、この系の高圧は、大気中に、非常にゆっくりと、放出された。サンプルホルダーの重量変化を測定することによって、０．０１５５ｇのｎ−オクタノール（密度０．８２４０ｇ／ｍＬ）が、粒子に吸着せしめられ、その量は、１８．８μＬとなることが判った。
【０１０９】
ＳＣ−ＣＯ2 におけるｎ−オクタノールの比較的高い溶解度により、ｎ−オクタノールの一部は、除圧工程の間に、失われた。ｎ−オクタノールを有する複合体の粉末は、溶媒を乾燥した粉末に直接に混合して調製されたサンプルとは異なり、軽くて且つ乾燥しているもののように見えた。図１５のプロットは、幾つかの同様の実験において、測定された（獲得重量）ｎ−オクタノールの吸収量と、同量の粒子に添加されたｎ−オクタノールの量との間の関係を示している。
【０１１０】
別の手順においては、ｎ−オクタノールは、オートクレーブ１に置かれて、ＳＣ−ＣＯ2がサンプルホルダー６内の粒子と接触せしめられる前に、オートクレーブにおいてＳＣ−ＣＯ2中に溶解する。二つの手順とも、同様の結果を生むと考えられる。
【０１１１】
理論に縛られたくはないが、気体の如き特徴を有するＳＣ−流体は、粒子の孔内に（液体に比して）、非常に自由に浸透し、減圧時には、溶解された成分の溶解度の減少が、粒子の孔の広い表面区域（粒子の外側面区域又は反応槽の表面区域よりもかなり大きい）上に凝縮することを許容するものと、推定することが出来る。
【０１１２】
水性溶媒にｎ−オクタノールを担持するこれらの粒子のストック溶液を調製するために、ｐＨ＝７．４で、０．１ｍＭのリン酸二水素カリウムを含む緩衝溶液が、最初に調製され、分液漏斗に配置された。水相を覆うｎ−オクタノールの薄い層を提供するために、適性な量のｎ−オクタノールが、添加された（ｎ−オクタノールの密度は、水よりも低い）。ｎ−オクタノールと水との混合を行うため、５乃至１０分間、漏斗が攪拌された。その後、この溶媒混合物を、光による劣化や蒸発から保護するため、漏斗は、アルミホイルで覆われた。二つの層の分離を許容するように、この漏斗は、直立の位置にて、３日間配置された。その後、水にて飽和せしめられたｎ−オクタノール相が、回収された。
【０１１３】
溶液１ｍＬ当たりのｎ−オクタノールが０．００３８ｍＬの濃度である均質なストック溶液を得るために、かかる飽和緩衝溶液５ｍＬ中に、ナノ複合体を含む粒子が、分散せしめられた。これと同じ方法にて調製されたストック溶液を用いて、分配係数の測定が、下記の通り行われた。
【０１１４】
実施例１０： ストック溶液を用いた分配係数の決定
各実験において、ＳＣ−ＣＯ2を用いる方法によって調製された、ナノ粒子を含むｎ−オクタノールのストック溶液１ｍＬが、マイクロピペットを用いて取り出され、３ｍＬの検体溶液と混合された。その混合系を３０分間攪拌した後、リアクター管の底部付近に置かれた外部の磁石によって、磁性ナノ複合体が、数分間で沈殿せしめられた。分配の前後両方の水性相における検体の吸収について判定するために、ＵＶ−可視分光法が用いられた。この方法によって、７つの検体の分配係数（ｌｏｇＤ）が測定され、従来から用いられている振とうフラスコ法によって決定されたｐＨ＝７．４での、これらの検体のｌｏｇＤ値と、上記実施例６で得られた結果と共に、下記の表５に示された。
【０１１５】
分配係数の決定のために、好適なｎ−オクタノール／ナノ粒子比率を用いて、ストック溶液が調製された。０．０７１ｇのナノ複合体に対して４０μｌのｎ−オクタノールという典型的な比率は、ＳＣ−ＣＯ2の運搬の後、実際に、ナノ複合体上に２２．３μｌのｎ−オクタノールを与えた。このストック溶液は、これらのｎ−オクタノールを予め吸収したナノ複合体を、５ｍｌのリン酸カリウム緩衝溶液（ｐＨ＝７．４）中に直接的に分散せしめることによって、調製された。ここで記載されている作業では、緩衝溶液中のｎ−オクタノールの典型的な容量濃度は、緩衝溶液１ｍｌ当たりｎ−オクタノール０．００４５ｍｌというものである。
【０１１６】
分配の前後の水系相中の薬物濃度を定量的に決定するために、ＵＶ−可視分光法が、用いられた。ｎ−オクタノール／水の分配係数（ｌｏｇＤ）は、平衡状態にあるこれら二相における種の活性の比率として定義された。溶解が大きい時は、活性を置き換えるために、濃度を用いる。この定義は、以下の式によって表現され得る。
【０１１７】
【数４】
【０１１８】
前記のように、ｌｏｇＤの測定のために、１ｍＬのストック溶液が、初期の薬物溶液３ｍＬと混合された。緩衝溶液中のｎ−オクタノールの濃度は、１ｍＬのストック溶液当たり０．００４５ｍＬのｎ−オクタノールであるので、測定時の水／ｎ−オクタノールの体積比は、約８８９：１である。この比率は、振とうフラスコ法で用いられる１００：１という通常の比率よりもかなり高く、高いｌｏｇＤ値の、信頼性のある決定が、可能となる。振とうフラスコ法では、このように少量のｎ−オクタノール相を分離することは困難であるが、磁性ナノ複合体を用いることによって、極めて容易となると見受けられる。
【０１１９】
表５は、本実施例のストック溶液方法、振とうフラスコ法、及び実施例６の磁性ナノ複合体方法を用いて、独立して測定されたｌｏｇＤ値の結果のリストである。各薬物検体について、３種類の方法の全てによって、少なくとも５回測定され、その測定されたｌｏｇＤ値の平均が示されている。振とうフラスコ法においても、磁性ナノ複合体法と同様に、水／ｎ−オクタノールの容積比率として、１００が用いられている。統計信頼度は、９５％である。文献から得られた各薬物検体のｌｏｇＤ値も、比較のために、リストアップされている。
【０１２０】
【表５】
【０１２１】
上記の結果から、これら三つの全ての方法によって、１．２６０乃至３．２０の範囲内にある薬物分子のｌｏｇＤ値が、首尾よく測定された。このデータから分かるように、ストック溶液法によって得られたｌｏｇＤ値の殆どが、文献値に対して十分な相関関係を有している。我々の測定においては、水／ｎ−オクタノールの高い体積比が用いられたことから、特に、低いｌｏｇＤ値を有するそれら薬物分子の感度が制限されることが、観察された。低いｌｏｇＤ値を有する薬物化合物で、ｎ−オクタノール相への低い溶解度を示すものは、分配の後でさえも、水相中のそれらの濃度に、大きな変化を与えることは無い。その結果、低いｌｏｇＤ値の化合物に対する実験結果の精度は、用いられる相の比率（添加されるストック溶液の量に関連する）と、関与する検知技術の感度に、大きく左右される。濃度の測定におけるわずかな誤差は、最終的に得られるｌｏｇＤ値に重大な変化を惹起する。典型的な例は、ｐＨ＝７．４の時のｌｏｇＤ値が０．６６のベンズアミドである。分析方法の感度を高めること、又は、用いる水／ｎ−オクタノールの体積比を減少させることによって、誤差の程度がより小さくされ得ることが期待される。
【０１２２】
この発明方法による結果及び文献から得られた値の相関曲線が、図１６に示されている（ベンズアミドのデータは、除外されている）。このカーブの相関係数は、０．９９５８であることが見出される。図１７は、本実施例のストック溶液方法の結果と、標準的な振とうフラスコ法の結果との相関曲線を示している。このカーブの相関係数は、０．９８７である。図８は、本実施例のストック溶液法の結果と実施例６の磁性ナノ複合体法との、相関曲線を示している。このカーブの相関係数は０．９８８である。これらは、全て、ストック溶液法の信頼性を示しており、超臨界二酸化炭素を用いることによって、ｎ−オクタノールの多孔ナノ複合体への均質な分散／沈殿が、首尾よく行われ得ることを、はっきりと示している。表３においては、ストック溶液法によって測定されたｌｏｇＤ値の統計的偏差が、同じ信頼度にある他の二つの方法によるものよりも、わずかに大きくなっている。
【０１２３】
テストされた化合物のｌｏｇＤ値が分からない場合の手順においては、ストック溶液に含まれる第二の溶媒（例えばｎ−オクタノール）の量を、逆算によって確認するために、ナノ粒子を含む同じストック溶液を用いた公知のｌｏｇＤの一つ又は複数の化合物に対する試験を並行して行うことが好ましいと言える。
【０１２４】
本発明については、上記した模範的な具体例に関連付けて記載してきたが、当業者であれば、ここで開示した内容を得た時に、数多くの同様な修正や変形を加え得ることは、明らかであろう。従って、上記で示した本発明の模範的な具体例は、あくまでも例示的なものであり、本発明を限定するものでは無いことが考慮されるべきである。記載された具体例には、本発明の精神や範囲を逸脱することなく、様々な変更を加えることができるのである。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】図１は、ナノ粒子を用いた測定によって得られたｌｏｇＤの結果と、文献値との相関関係を示している。
【図２】図２は、ナノ粒子を用いた測定によって得られたｌｏｇＤの結果と、先行技術の方法を用いて得られた値との間の相関関係を示している。
【図３】図３は、実施例１の方法を用いて得られた粒子の磁場応答を示している。
【図４】図４は、実施例１の方法によって製造された、シリカでコートされた粒子の、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による顕微鏡写真を示している。
【図５】図５は、実施例１で得られたシリカコートのＦｅ3Ｏ4 ナノ粒子についての、１．５４０５６ｎｍの波長を用いて記録されたＸ線回析（ＸＲＤ）パターンを示している。
【図６】図６は、実施例１で得られたシリカコートのＦｅ3Ｏ4 ナノ粒子についての熱重量分析（ＴＧ）を示している。
【図７】図７は、シリカコートされたＦｅ3Ｏ4 ナノ粒子であって、そのシリカコーティングがｎ−オクタノールにて飽和せしめられたものの熱重量分析（ＴＧ）を示している。
【図８】図８は、二つの赤外線（ＩＲ）スペクトルを示している：ａ）は、シリカでコートされたＦｅ3Ｏ4 ナノ粒子のものであり；ｂ）は、シリカでコートされたＦｅ3Ｏ4 ナノ粒子で、クロロトリメチルシラン（ＣＴＭＳ）にて処理されたものについてのものである。
【図９】図９は、実施例５において得られたＦｅ2ＣｏＯ4ナノ粒子のＸＲＤパターンを示している。
【図１０】図１０は、β−ラクタマーゼＩの存在下における、ペニシリンＶ溶液のＵＶ−可視スペクトルを示している。
【図１１】図１１は、β−ラクタマーゼＩのミセル溶液の存在下における、ペニシリンＶ溶液のＵＶ−可視スペクトルを示している。
【図１２】図１２は、多孔のシリカコーティング内にカプセル化されたβ−ラクタマーゼＩの存在下における、ペニシリンＶ溶液のＵＶ−可視スペクトルを示している。
【図１３】図１３は、二酸化炭素の圧力−温度のダイヤグラムである。
【図１４】図１４は、超臨界のＣＯ2を用いた、粒子上への析出のための装置の概略図である。
【図１５】図１５は、添加されたオクタノール量に対する、吸収されたｎ−オクタノールのグラフである。
【図１６】図１６は、表５に示された結果についての、相関関係のカーブである。
【図１７】図１７は、表５に示された結果についての、相関関係のカーブである。
【図１８】図１８は、表５に示された結果についての、相関関係のカーブである。
【符号の説明】
【０１２６】
１ オートクレーブ ２ パイプ
３ 圧力検出器 ４ 温度コントローラ
５ 弁付管 ６ サンプルホルダー
７ 水槽
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔表面を有するナノ粒子、かかるナノ粒子を製造する方法、並びに、分子の分配係数 (partition coefficient) の測定や、生物学的に活性な種の如き、触媒活性の種の封入における、それらの使用に関するものである。更に、成分を、ナノ粒子等の多孔材料の孔に析出 (depositing) させる方法にも、関連している。
【背景技術】
【０００２】
「ナノ粒子 (nanoparticles)」という語は、ナノメートルの尺度の大きさを有する粒子について述べるために用いられている。一般的に、これらの粒子は、サイズが約１ｎｍ乃至１μｍまでの範囲内であり得、通常は、１ｎｍから２〜３百ナノメートルの直径を有している。このようにサイズが小さいことから、ナノ粒子は、表面積と体積との比が非常に大きい。この特徴は、ナノ粒子の多くの使用の場合に、多くの不均一触媒作用の如く、その工程において、できる限り少ない体積で、最大の表面積が必要とされる理由を明らかにしている。
【０００３】
ナノ粒子は、その内部構造において、多様であり得る。最も単純な粒子が、単に一つの材料のみでできている一方で、より複雑な粒子は、異なる材料で形成された１つ又はそれ以上の異なる層が周りに配置された芯 (core) の領域を有する場合がある。
【０００４】
ナノ粒子を製造するための多くの方法がある。それは、材料の単純なすり潰しや粉砕の技術から、マイクロエマルジョンからの析出 (deposition) 及びエマルジョンの重合を通じて、材料の電気アーク蒸発までの範囲に到る。用いられる方法は、必要とされる粒子の複雑さ、例えば、その粒子の異なる材料の層の数、異なる層が如何に相互作用するか、及び、その他の十分に定義された要因に基づいている。
【０００５】
ナノ粒子を、単一の材料から単純な粉砕の技術によって製造することが、最も単純な製造方法であるが、粒子内部の芯を化学的又は物理的な劣化 (degradation)から保護するために、外側がコーティングされた粒子が、広く用いられている。
【０００６】
様々に異なる芯材料及び表面層を有するナノ粒子の製造方法が、広く知られている。
ＵＳ６，５４８，２６４は、外側にシリカコーティングを有する粒子の範囲、及びマイクロエマルジョンを用いたそれらの製造方法について、開示している。
【０００７】
ＷＯ ０３／０５７３５９として公開された国際出願ＰＣＴ／ＧＢ２００３／００００２９（Ｒｅａｄｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）も、磁性の芯を有するシリカ粒子の製造方法について、記載している。アルミナ、チタニア、又はジルコニアのような、他のコートされた材料のナノ粒子を、ゾル・ゲル技術又は関連の技術によって製造する方法が、知られている。
【０００８】
【特許文献１】ＵＳ６，５４８，２６４
【特許文献２】ＷＯ ０３／０５７３５９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ナノ粒子の表面層の孔質 (porosity) を利用するものであり、かかる粒子を新しい用法に利用するものである。孔質は、該粒子を製造する際に、制御することができる。また、この製造方法は、多孔のコーティング又は層の内側で、粒子の芯に所望の分子の導入を許容するものであり、そして該粒子の孔質は、捕捉された分子へのアクセスを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第一の態様においては、ナノ粒子が、二つの非混和性の溶媒から成る溶媒系における分子の分配係数を決定するプロセスにおいて、調製され、使用される。分子の分配係数は、その中で測定される溶媒系に依存し、平衡状態にある該二つの溶媒間で分子がどのように分配されるかについての数値的評価を与える。これは、医薬品の発展における、一つの特別な用法を有する。
【００１１】
分配係数の値を測定するための、現時点での技術は、"Pharmacokinetic Optimization in Drug Research: Biological, Physicochemical and Computational Strategies" (B. Testa, H. van de Waterbeemd, G. Folkers, R. Guy (editors), Verlag Helvetica Chimica Acta, Zurich, 2001) に記載されている。最も一般的に適用されている測定においては、テスト分子が、第一の溶媒、例えば水に、公知の濃度で溶解せしめられている。この溶液の公知の量が、その後、公知の量の第二の溶媒、例えばｎ−オクタノールに添加され、そしてそれら二つの相は、十分に混ぜられる。この系は、それから、濃度平衡に到達するようにされる。最後に、第一の溶媒を含む相が、分離され、この溶液中のテスト分子の濃度が測定される。この値から、分配係数（Ｐ）が決定され得るのである。
【００１２】
分配係数を決定するための、この方法により、幾つかの問題が発生する。非混和性のこれら二つの相が混ぜられると、濃度平衡に到達するには、長時間平衡させる必要がある。これは、二つの相の間の接触面積が、比較的少ないためである。また、二つの相の分離は、相の間の境界線（境界面）の位置を視覚的に評価することを、必要とするからである。ある分子が、一つの相に高度に可溶であると、その溶媒を非常に少ない量で用いることが必要となる場合があり、境界面の位置の評価が困難になる。更に、分配されるべき相のために境界面が認識できなければならない、という事実により、比較的多量の溶媒の使用を必要とする。これは、多量の有害な廃棄物を生み、その手順のためのコストを高める。
【００１３】
これらの問題が組み合わさることにより、この工程は、特に産業規模で実施される場合に、コストと時間のかかるものとなる。
【００１４】
本発明は、一つの態様において、テスト分子の分配係数の測定方法においてナノ粒子を用いることにより、上記の問題の克服を求めるものである。
【００１５】
従って、第一の態様において、本発明は、第一の溶媒及びナノ粒子の本体 (body of nanoparticles) を含有する混合物中の二つの溶媒間の化学的化合物の分配係数を決定する方法を提供するのであり、そこにおいて、第二の溶媒は、ナノ粒子の孔 (pore) 内に吸収されている。それらに吸収された溶媒を有するナノ粒子の本体は、所定量の溶媒を提供することができ、その際の溶媒の量は極少量であり得、極度の分配係数の決定 (determination of extreme partition coefficients) を許容する。該ナノ粒子は、例えばナノ粒子が磁選を許容する磁性体の芯を有する際に、第一の溶媒から簡単に分離せしめられ得る。遠心分離や、ナノ粒子の沈殿を起すために、例えば別の溶媒を加えることによって、該系の誘電率を変えるという方法の如き、その他の分離方法も利用可能であるので、本発明の本態様にて採用されるナノ粒子は、多孔材料のみからなるものでもよい。
【００１６】
分配係数の測定にナノ粒子を使用しても、その結果に影響を及ぼさない、すなわち、ナノ粒子は、得られる分配係数の値に、著しい影響を及ぼすことはない、ということが、示されてきた。測定された化合物の平衡分布が速やかに得られるので、その手順は速やかであり得、また簡単且つ効果的にナノ粒子が分離されるので、用いられるべき一方又は両方の溶媒が、少量となることにより、経済的と為し得るのである。
【００１７】
分配係数の正確な決定のためには、第一の溶媒相が第二の溶媒相で予め飽和せしめられているか、あるいはその逆であることが、望ましい。従って、二つの溶媒は、互いに完全に不溶である必要はなく、重要なのは、それらが二つの非混和性の相を形成することであり、「非混和性の（immiscible)」との語は、ここでは、その意味にて用いられる。
【００１８】
本発明は、また、分配係数を決定するための本方法において有用なナノ粒子を含む組成物にも、ある。ここでは、多孔の外側コーティングを有するナノ粒子及び第一の溶媒の混合物が提供され、そこで、第二の溶媒がナノ粒子の多孔コーティングに吸収されるのであり、その場合の第一の溶媒と第二の溶媒とは、非混和性である。このような組成物は、例えば第一の溶媒中の粒子のコロイド的な分散物として安定しており、長い貯蔵寿命を有し、そして所定量の第二の溶媒を、簡単に且つ正確に投与すること(dipensing)を許容する。この組成物においては、第二の溶媒相は、ナノ粒子中に完全に吸収されること、つまり、ナノ粒子の外側に自由に現われないことが、好ましい。
【００１９】
従って、第一の溶媒の単位体積当たりの（すなわち、組成物全体の単位体積当たりでもある）、第二の溶媒を含むナノ粒子の量を、予め決めること、つまり、特定の組成物に関して知り、固定することができる。ナノ粒子は、第一の溶媒中に、コロイド溶液として、均一に分布せしめられ得る。そのため、二つの溶媒の体積の比は、前もって正確に決定される。従って、ある量の組成物の容量的投与 (volumetric dispensing)が実施され得、如何なる任意の量の二つの溶媒でも、簡単な方法で、所定の比率にて得られる。そして、高い精度が達成され得るのである。
【００２０】
この組成物は、蒸発を避けるため、密閉容器にて保管されることが、好ましい。
【００２１】
ナノ粒子が懸濁せしめられる第一の溶媒は、好ましくは、水性のもの、例えば、水又は水性溶液或いは含水相である。
【００２２】
ナノ粒子の多孔の外側コーティングに吸収される前記第二の溶媒は、例えば、水に対して非混和性である溶媒である。例えば、ｎ−オクタノール、シクロヘキサン、アルカン（Ｃ6−Ｃ10）、クロロホルム、プロピレングリコールジペラゴネート（propylene glycol dipelargonate: ＰＧＤＰ）、１，２−ジクロロエタン、オリーブオイル、ベンゼン、トルエン、ニトロベンゼン、クロロベンゼン、テトラクロロメタン、オレイルアルコール、４−メチルペンタン−２−オール、ペンタン−１−オール、ペンタン−２−オール、イソブタノール、ブタン−１−オール、２−メチルブタン−２−オール、ブタン−２−オール、ブタン−２−オン、ジエチルエーテル、イソアミルアセテート、エチルアセテート等である。
【００２３】
二つの溶媒とも、好ましくは、何等の生物学的に活性な種を持つ化合物も、特に何等の薬学的に活性な化合物 (pharmaceutically active compound)も含んでいない。
【００２４】
溶媒を含む粒子を形成するために、超臨界流体を用いて、この本発明の組成物を形成する方法は、以下に記述される。
【００２５】
本発明によって提供される組成物の代替的な形式のもので、本文に記載された分配係数の決定の如き、定量的分析の手順において便利な形態をした所定の量の溶媒（すなわち、上記第二の溶媒と呼ばれる溶媒）の正確な投与に適したものも、夫々が多孔表面を有し、その孔の中に溶媒が吸収せしめられているナノ粒子を、組成物の単位重量当たり所定の量含んだ組成物である。この組成物は、自由溶媒(free solvent)が存在しない（すなわち、全てナノ粒子内に吸収せしめられている）ものであり、それによって、該溶媒が、効果的に微粒子的に固体(solid)であり、重さを量ることによって（重量測定法によって）必要量を投与することが可能（dispensable）であることが、好ましい。従って、溶媒の量は、組成物の単位重量当たり、事前に定められている。この組成物も、溶媒の蒸発を避けるため、密閉容器にて保管されることが好ましい。この溶媒は、実質的に溶質を含まないもの、例えば生物学的に活性な化合物を含まないものとすることができる。この組成物は、上記のように二つの溶媒の組成物を得るために、望ましい量の別の溶媒（上記で第一の溶媒と呼ばれているもの）と正確に混合されてよく、これは、例えばユーザーによって、使用の直前に行われてよいものである。超臨界流体を用いた、本発明のこの組成物の形成方法は、以下に記述される。
【００２６】
本発明の第二の態様においては、触媒的に活性な種、特に生物学的に活性な種、特に生物学的触媒が、多孔のナノ粒子の芯に捕捉され得、その際、触媒反応を起すため、触媒活性が維持され、基質の分子が粒子の孔を通じてそこに接触可能であるということを、見出したことに、起因するものである。これは、多孔コーティングが、該生物学的に活性な種のサイズよりも小さい孔サイズを有することによるものである。一つの有利な点は、生理活性を持つ種が、化学的結合をすることなしに捕捉され得るため、本質的に、最適な性質の遊離状態(free state of optimum nature)にあるということである。従って、その活性は、分子が支持体に化学的に結合せしめられる公知の技術とは異なり、障害を受けたり、変更されたりすることがない。
【００２７】
粒子サイズ、特に芯 (core) のサイズを制御することにより、捕捉された種を公知の再現可能な量にて含む、ナノ粒子の本体を提供することが可能となる。芯のサイズは、生理活性を持つ種の分子が、一つのみ存在する程度のサイズでもよく、その場合、ナノ粒子の集団において、触媒分子を全く含まないものもあれば、一つよりも多く含むものある。従って、触媒的に活性な種の分子を、粒子当たり平均で、多くて一つ含む、ナノ粒子の集団又は集合を、提供することが可能である。
【００２８】
この捕捉による一つの利点は、不活性化の程度を低減するコーティングによって、生理活性を持つ種の会合又は凝集 (agglomerization)を低減する（二量体、三量体、四量体等の形成を低減する）ということである。
【００２９】
本発明のかかる態様における、触媒的に活性な種を含むナノ粒子は、多くの用途、例えば酵素反応及びその他の触媒反応、分析方法（例えば、抗原−抗体反応、蛋白質−薬物結合、バイオレセプター−抗原結合、オリゴヌクレオチドの認識、ビオチン−ストレプトアビジン反応の如き、標的とする分子を捕捉された種に結合することによるもの）において、及び、バイオセンサー等として、採用され得る。重要な利点は、自由な形態の嵩高い生理活性を持つ種を、目的に合ったサイズの多孔コーティングを有するナノ粒子の芯の内部に捕捉するということである。これは、捕捉された種が、コーティングを通じて溶液に溶解されることを防ぐ。一方、コーティングの孔サイズは、捕捉された分子に自由に接近することを許容し、小さい分子（孔サイズよりも小さい）の交換を許容する。従って、捕捉された芯磁石 (core magnet) を用いて又はその他の手段によって、分離が達成され得る。その結果、複合ナノ粒子の多孔コーティングは、分子の認識及び分離のための「ナノメンブラン (nanomembrane)」であると考えられ得る。
【００３０】
更に、触媒的に活性な種をカプセル化する本発明のナノ粒子は、触媒作用が小規模にて行われることを許容し、不均一系触媒からの生成物の簡単な分離を許容する。
【００３１】
上記のように、本発明は、第一の溶媒中に存在し、その多孔コーティングに吸収された第二の溶媒を担持する多孔コーティングを有する、ナノ粒子の組成物を提供するものである。本発明は、更に、その孔に、組成物の単位重量当たり所定の量において吸収せしめられている溶媒を有するナノ粒子の組成物を、提供するものである。
【００３２】
本発明者らは、ナノ粒子の孔において、溶媒液の如き材料を、高度な量的精度をもって析出する新規な方法を見出した。この方法は、ナノ粒子のみならず、大きな物体の表面、又は任意のサイズの粒子の表面等の、如何なる多孔表面における材料の析出にも、適用することができる。
【００３３】
従って、本発明に従う更に別の態様によれば、多孔材料が超臨界流体中において或る成分の溶液に接触することによって、多孔材料の孔において該成分を析出又は分散させる方法が、提供される。好適には、かかる超臨界流体は、減圧し、そして蒸発を許容することによって、除去せしめられる。
【００３４】
好適な超臨界流体は、容易に制御できる温度及び圧力において、超臨界となる二酸化炭素である（ＳＣ−ＣＯ2）。適切な超臨界流体を形成することのできる、その他の物質の例には、エタン、水、ブタン、アンモニア、並びに、Ａｒ、Ｘｅ、及びＫｒの如き貴ガス (noble gas)がある。
【００３５】
ＳＣ−ＣＯ2に可溶の成分は、例えば、炭化水素類（脂肪族及び芳香族の両者を含む）、ハロカーボン類、アルデヒド類、エステル類、ケトン類、及びｎ−オクタノールのように、炭素原子を１乃至１２個有する脂肪族アルコール類等のアルコール類の如き有機分子である。特に、本発明の態様の一つにおいては、比較的低分子量（例えば≦２００）の溶媒化合物に適用することができるが、本発明は、また、例えば分子量が≦５００、特に２００−５００である生物学的種及び薬物分子等の大きな分子の如き、他の分子の析出又は分散をも含んでいる。二つ又はそれ以上の化合物が、同時に析出又は分散せしめられてもよい。
【００３６】
本発明は、更に、上記の如き超臨界流体を用いた方法によって、所定の量で第一の成分を含む多孔粒子を調製する工程と、該第一の成分を含有する粒子を、液状の第二の成分に添加する工程とを含む、二つの成分を有する組成物の調製方法も、提供する。これら二つの成分は、一般的に、非混和性である。前記第二の成分は、例えば、水性であってよい。第二の成分が大過剰である場合に、例えば、重量比が１００：１又はそれ以上、例えば、１００：１乃至３０００：１の範囲、好ましくは５００：１乃至１５００：１である場合にも、二つの成分の、正確な比率が成し遂げられ得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
多孔コートされたナノ粒子の形成及び特性
上記せるように、多孔のコーティングによって取り囲まれた芯を有する固体のナノ粒子は、以下の工程を含む方法によって、製造され得る：
ａ）芯となる種を含み、且つ、有機安定剤によってコロイド的に安定化せしめられているか、又は、ミセル凝集体（例えば、界面活性剤分子によって取り囲まれた、安定化せしめられた水滴）として安定化せしめられているコロイド粒子を、液状媒質中において形成する工程；及び
ｂ）前記コロイド粒子又はミセル粒子と、前記液状媒質との界面区域内にて、前駆物質の化合物を加水分解することによって、前記コロイド粒子の周りに、多孔コーティングを形成する工程。
【００３８】
好ましくは、多孔コーティングを所望の厚さにするために、ナノ粒子は、コロイド系から取り出される前に、例えば、１時間から数週間、好ましくは２−５日間、熟成される (aged) こととなる。
【００３９】
粒子の芯の周りに形成される多孔コーティングは、アルミナ、シリカ、チタニア、ジルコニア、又はカーボンの如き多孔材料の部類から、形成されてよい。好ましくは、多孔コーティングは、コロイド懸濁液の界面領域で、シリコン含有化合物の加水分解により、シリカから形成される。
【００４０】
この加水分解される化合物は、アルコキシシラン化合物、即ち、少なくとも一つのＳｉ−ＯＲ結合を有する化合物 [但し、Ｒは、テトラエチルオルソシラン（ＴＥＯＳ、Ｓｉ（ＯＣ2Ｈ5）4）の如く、好ましくは１−８個の炭素原子、更に好ましくは１−４個の炭素原子を有するアルキルである]；及び、クロロ−、ブロモ−、ヒドロ−、及びメタロ−シラン（加水分解が起きる、Ｓｉ−Ｃｌ、Ｓｉ−Ｂｒ、Ｓｉ−Ｈ、又はＳｉ−Ｍ結合を含有する）であり得る。その代わりとしては、加水分解される化合物は、チタニウムイソプロポキシド又はチタニウムテトラクロライドの如き、チタニウム、アルミニウム、又はジルコニウムの、類似アルコキシ、ハロ、ヒドロ化合物（又は金属間化合物）とすることができる。
【００４１】
上記化合物の加水分解の後、前記の熟成の工程により、−ＯＨ種の相互縮合が許容されて、その中に粒子を取り囲む三次元ゲル（例えば、Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ又はＴｉ−Ｏ−Ｔｉの結合を伴うもの）を形成する。
【００４２】
カーボンコーティングの形成のために、工程（ａ）で形成されたコロイド粒子は、コロイド懸濁液から分離せしめられ、そして熱分解されることにより、粒子の周りの有機界面活性剤のコーティングが分解して、ナノ粒子の芯の周りに多孔カーボンの外側コーティングが形成されるようになる。ポリビニルアルコール、フェノール／ポリフェノール、多糖類等の如き、その他のカーボン前駆物質（類）を、多孔カーボンの形成に用いることができる。
【００４３】
工程（ａ）における方法の好ましい形態においては、コロイド粒子は、界面活性剤によって安定化せしめられた分散相の小滴又はミセルを有し、且つ芯材料の溶解された化合物を含むエマルジョンを形成し、そしてコア種の沈殿を惹起して、それによってミセルの内部にコロイド状の粒子を形成することにより、作られる。この沈殿は、アルカリ又はアンモニアの添加によって惹起され得る。
【００４４】
コロイド粒子を安定化させるために用いられる好ましい界面活性剤には、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、オレイン酸、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、及び、ＡＯＴやＴＸ１００等の如き非イオン性界面活性剤が含まれる。
【００４５】
前記多孔材料は、その表面に、生化学的又は生物学的種（例えば、ペプチド類、マーカー類 (markers)、同種の結合相手、可溶化剤類）の如き、他の種の化学的（例えば共有)結合のため、若しくは、リンカー分子を使用又は使用することなく、基質にナノ粒子を結合するために、官能基、例えば、ＯＨ基を有していてよい。また、静電相互作用によって、所定のｐＨでの荷電表面上の、荷電した種の固定化も、含まれる。
【００４６】
異なる金属の、複数の金属含有種が、コロイド粒子中に、そしてそれ故に製造されたナノ粒子の芯中に含まれていてもよい。通常は、このような金属含有種は、金属、合金、金属酸化物、金属水酸化物、及び金属炭化物の中から選択される。好ましくは、この金属含有種は、強磁性 (ナノ粒子の磁気分離を可能にするもの)若しくは超常磁性であり、又は単一ドメインの磁性ナノ粒子が採用される。ナノ粒子の芯に含まれ得る磁性材料には、マグネタイト(Ｆｅ3Ｏ4）、マグヘマイト（γＦｅ3Ｏ4）、グレイジャイト(Ｆｅ3Ｓ4）、及びＦｅ2ＣｏＯ4 が、含まれる。
【００４７】
その代わりとして、又は、追加的に、ナノ粒子の芯は、触媒的に若しくは生物学的に活性な種を含有していてもよい。好適な生物学的活性の種は、酵素や蛋白質を含んでいる。その例は、血液／肝臓組織中にある、ラクターゼ、メタロチオニン、シトクロム（シトクロムｂ、シトクロムｃ、又はシトクロムＰ４５０等）、血清アルブミン（類）、カルボキシルエステラーゼ類、キナーゼ、短核酸オリゴマー類、抗体種及び酵素インジケータ類である。好適な触媒種には、ヘテロポリ酸類、メタロチオレイン類、コランド類（corands）、コラプレックス類（coraplexes）、スフェランド類、スフェラプレックス類（spheraplexes）、キャビタンド類、ホスト−ゲスト触媒類の如き無機触媒化合物（例えば、「定量的な合成（ship in a bottle chemistry）」によって形成されたもの）、及び介在 (intercalated) 触媒類などがある。
【００４８】
ナノ粒子の芯が、触媒的又は生物学的活性の種を含む場合、多孔コーティングは、その触媒的又は生物学的活性の種よりも小さい孔サイズを持つようにし、それによって活性種がナノ粒子のコーティング内部に保持されるようにすることが、好ましい。
【００４９】
さらに、ナノ粒子の多孔コーティングは、小さな分子がそこを通り抜けるのを許容できる程の大きさの孔サイズを有することが好ましい。特に、触媒活性の種が、ナノ粒子の芯においてカプセル化 (encapsulated) される時、多孔の外側コーティングの孔サイズは、触媒反応の反応剤及び生成物の何れのサイズよりも大きいことが、好ましい。この場合、反応剤分子は、ナノ粒子の多孔コーティングを通過して、ナノ粒子の内部に保持された触媒的又は生物学的活性の種と相互に作用することができ、その相互作用による生成物は、多孔コーティングを通過して出て行くことができる。
【００５０】
前記ナノ粒子は、好ましくは１ｎｍ乃至１μｍ、更に好ましくは１乃至１００ｎｍの平均直径を有する。多孔コーティングは、所望の厚さを有してよいが、好ましくは１乃至１００ｎｍ、更に好ましくは１乃至５０ｎｍの平均厚さを有する。ナノ粒子の芯が、触媒的又は生物学的活性の種を含む場合、芯の直径は、１乃至１０ｎｍとすることができ、好ましくは、１乃至５ｎｍである。
【００５１】
テスト分子の分配係数の測定における多孔コートされたナノ粒子の使用
本発明は、多孔ナノ粒子の使用を通じて、二つの非混和性の溶媒間のテスト分子の分配を達成するための方法を提供する。この方法は、テスト分子を、多孔の外側コーティングを有するナノ粒子を含むコロイド懸濁液である第一の溶媒と混合する工程を含み、そこでは、第二の溶媒が多孔の外側コーティング中に吸収せしめられており、ナノ粒子は、第二の溶媒に対して非混和性を有する第一の溶媒中に、懸濁せしめられている。このテスト分子は、第二の溶媒に部分的に溶解し、そしてナノ粒子の多孔の外側コーティングの中に保持され、また部分的には第一の溶媒の中に、保持せしめられる。
【００５２】
テストされる化合物（検体)、ナノ粒子、ナノ粒子を含む第一の溶媒、及びナノ粒子の孔内の第二の溶媒を含む組成物を調製するための工程は、あらゆる好適な方法によって、実施されてよい。例えば、検体は、ナノ粒子の組成物に混合される緩衝剤等に、並びに第一及び第二の溶媒に、溶液として、導入される。検体溶液は、第一の溶媒に対する混和性を有し、両者は、共に、例えば水性である。代替的には、ＤＭＳＯの如き少量の溶媒に溶解せしめられた公知の量の検体を、ナノ粒子並びに第一及び第二の溶媒の組成物に注入する。その他の代替法は、第二の溶媒を含むナノ粒子を、第一の溶媒中の検体の溶液に導入するというものである。
【００５３】
テスト分子の分配を達成するための速度を最適化するために、二つの非混和性の溶媒の接触面積を最大限にすることが、望ましい。これは、表面積と体積との比率が高い粒子を形成することによって達成され得る。すなわち、粒子の直径が小さければ小さいほど、分配は早く達成されるのである。更に、ナノ粒子上の多孔コーティングは、テスト分子の分配速度を上げるため、できる限り多くの溶媒を吸収すべきである。このように、小さくて、孔の体積の大きい粒子が、好ましい。テスト分子の速やかな分配を好むという多孔コーティングの特徴が最適化されると、本発明のナノ粒子を用いて、分配時間を１−１０分又はそれ以下の範囲にすることができる。これは、先行技術で達成された分配時間に比べて目覚しく改善されていることを意味する。
【００５４】
この方法では、上記の溶媒とナノ粒子を含む組成物が、採用されてよい。
【００５５】
二つの非混和性の溶媒間でテスト分子の分離を達成するための本発明の方法は、テスト分子の分配係数の値を決定するために、用いてもよい。
【００５６】
以下の用語は、分配係数について論じる際に、用いられる：
【００５７】
ｌｏｇＰは、テスト分子の分配係数のために引用される標準値である[但し、Ｐ＝［Ｃ］organic／［Ｃ］aqueousである]。その他に指定が無い限りは、これらの値は、電子的に中性の形態である分子を用いたオクタノール−水の二相系のために記録される。
【００５８】
ｌｏｇＤは、本明細書において、最も一般的に用いられる値である。これは、特定のｐＨ値におけるテスト分子の分配係数に当てはまる。これらの値を計算する際に、Ｄについて、以下の関係が用いられる。
【００５９】
【数１】
【００６０】
テスト分子の分配係数（ｌｏｇＰ又はｌｏｇＤの何れか）の値を測定するための一つの方法は、以下の工程を含んでいる：
ａ）多孔表面を有するナノ粒子と第一の溶媒からなる組成物にして、第二の溶媒が該ナ ノ粒子の多孔表面内に吸収されており、且つ、該第一の溶媒と該第二の溶媒が非混 和性である組成物を調製する工程；
ｂ）テストされるべき分子を、工程ａ）の組成物に導入する工程；
ｃ）工程ｂ）の生成物を、二つの成分、即ちナノ粒子を含む第一のものと、前記第一の 溶媒を含む第二のものとに分離する工程；並びに、
ｄ）分配係数の計算を可能とするために、前記第一の溶媒中に残る、テストされるべき 分子の量を決定する工程。
【００６１】
この方法の工程ｃ）は、混合物を、ナノ粒子と上澄み溶液とを含む二つの成分に分離するために、工程ｂ）の生成物を、例えばろ過又は遠心分離することによって、或いは上記したその他の分離方法によって、達成され得る。ナノ粒子の芯が、磁性材料を有する場合には、上記方法の工程ｃ）を実施するために、代替として磁界を用いることも可能である。この場合、工程ｂ）の生成物に適用される磁界は、反応混合物からナノ粒子を沈殿させるように作用せしめられ得る。
【００６２】
分配係数を測定するための方法における工程ｄ）は、溶液中のテスト分子の濃度を決定し得るあらゆる分析技術によって達成され得る。それら技術は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、滴定、ＵＶ−可視分光法、蛍光、リン光、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、質量分析（ＭＳ）、ＧＣ−ＭＳ、重量測定、表面プラズマ、及び電気分析法の技術を含み得る。好ましくは、工程ｄ）で用いられる技術は、上澄み溶液の更なる工程を必要とするものではなく、また、反応槽からサンプルを取り除くことなく実施され得るものである。最も好適な態様において、工程ｄ）にて用いられる技術は、ＵＶ−可視分光法である。
【００６３】
上澄み溶液中のテスト分子の濃度を決定するために、ＵＶ−可視分光法が用いられる好適なケースにおいては、ｌｏｇＤを計算するために、以下の式を用いることができる。
【００６４】
【数２】
【００６５】
本発明の方法によって測定されたｌｏｇＤの値と、先行技術の方法によって測定されたｌｏｇＤの値との相関関係が、図１及び図２に示されている。
【００６６】
第二の溶媒（ナノ粒子の多孔の外側コーティングに吸収されている）と第一の溶媒との体積比は、これら二つの溶媒におけるテスト分子のおよその溶解度（それが事前に知られていない場合には、推測により、又は実験によって決められてよい）に基づいて、選択される。本発明においては、第一の溶媒と第二の溶媒の比率は、３０００：１乃至１：１とすることができる。一般的に、第一の溶媒と第二の溶媒の比率は、５０：１よりも大きく、好ましくは１００：１又はそれ以上、更に、５００：１又はそれ以上と高く、例えば５００：１乃至１５００：１の範囲としてもよい。
【００６７】
このような、テスト分子の分配係数を測定する方法は、先行技術の方法に比べて、幾つかの明確な利点を有している。
【００６８】
第一に、テスト分子の分配は、前述の理由により、先行技術よりも早く達成される。
【００６９】
第二に、ナノ粒子の芯が磁性材料を有する場合、分配係数を測定するために用いられる混合物は、溶液に磁界を適用することによって、ナノ粒子成分と上澄み溶液とに、容易に分離せしめられ得るのである。通常は、該混合物のそれら二つの成分の分離は、数秒の範囲で達成され得ることとなる。
【００７０】
第三に、溶媒のうちの一つがナノ粒子の多孔コーティングに吸収されるので、測定中の揮発性の溶媒の蒸発による問題が、克服され得ることである。先行技術の方法では、揮発性の溶媒中で成分の分配について測定する際には、溶媒の蒸発を避けるために、測定中に溶媒の量を変更し、大いに注意を払わねばならず、分配係数の計算を、複雑にしていた。しかし、本方法では、揮発性の溶媒は、ナノ粒子の多孔の外側コーティングに吸収され得るため、溶媒の蒸発速度を低下させる。テスト分子の、より速やかな分配と組み合わされて、全体的な測定時間が減少することになり、それによって、本発明の方法を用いたテスト分子の揮発性の溶媒への分配が許容されることになるのである。
【００７１】
第四に、本方法では、分離は、例えば磁選、ろ過、又は遠心分離によるナノ粒子の分離によって、達成されるため、二つの溶媒の分離の達成のために溶媒の境界面の目視による判定に頼ることはない。そのため、テスト分子の分配係数を測定する本方法は、先行技術の方法に比べて、より少ない量の溶媒を用いて実施され得る。より少ない量の溶媒は、測定のコストを低下せしめ、工程の自動化を容易にする。更に、より少ない量の溶媒を用いた測定では、発生する有害な廃物の量も少なく、それによって、該工程のコスト及び環境に対する影響を、更に低下させる。
【００７２】
最後に、本発明工程は、テスト分子が溶媒の何れか一つに高度に可溶である場合でさえも、分配係数を測定するために用いられ得る。上記のように、第一の溶媒と第二の溶媒との好適な比率は、各溶媒におけるテスト分子の溶解度によって決定される。本発明の方法にあっては、分配係数値の測定において、より広い範囲の第一の溶媒と第二の溶媒との比率が用いられ得る。これは、テスト分子の濃度測定の前の溶媒の分離が、第一及び第二の溶媒間の境界の、目視による決定を必要としないという事実によるものである。３０００：１乃至１：１という比率において、第一の溶媒：第二の溶媒が、用いられ得る。少量の溶媒、テスト分子、及び複合ナノ粒子の使用と、上澄みにおけるテスト分子の濃度の速やかな分光光学的決定との組み合わせにより、分配係数の迅速な評価が許容される。従って、ロボットに適した(robot-friendly)方法において、幅広い種類のテスト分子の、高い流量でのスクリーニングが、確立され得る。
【００７３】
多孔の外側コーティングを有するナノ粒子内に被包された触媒種
多孔の外側コーティング内に触媒的に活性な種を被包（カプセル化）するナノ粒子の有利な点は、様々な外側コーティングと触媒的に活性な種が考えられ得るため、多様である。生物学的に活性な種を含む使用もあるため、本発明の多孔コートがなされたナノ粒子の、不均一無機触媒における使用が、考えられる。
【００７４】
一つの態様においては、磁性材料を含む芯を有するナノ粒子は、懸濁液においてその触媒活性が活用され、磁界を用いて反応生成物からの触媒の分離が容易に達成されるため、特に有用である。
【００７５】
芯材料が生物学的に活性な種を含む場合に、本発明のナノ粒子の更なる有利な点は、生物学的に活性な種は、例えば、その種を基材に結合するための可溶化基または連結基の付加によって、その自由状態における場合に比べて、化学的に変化せしめられにくいということである。これは、含まれている種の物理的構造が、ペンダント基又はそれと同等のものへの結合によって変更されないということである。従って、本発明の、この態様において、前記の種は、被包されていない形態と同様の方法で活動をする。
【００７６】
また、酵素分子の如く、生物学的に活性な分子の懸濁液は、かかる分子の濃度が特定の閾値よりも高められたときに、溶液の中で会合することも知られている。これは、生物学的に活性な種の、懸濁液中での高濃度での使用を制限する。というのも、会合は、分子の表面積と体積との比率の低下をもたらし、それ故、分子の相互作用のために利用可能な結合サイトの数を潜在的に低下させるからである。しかし、本発明では、生物学的に活性な種を取り巻く多孔の外側コーティングが、分子の会合を防ぎ、その種が懸濁液中に、先行技術の方法よりも、より高い濃度にて存在することを、許容する。
【００７７】
前記被包方法の、様々な芯材料に対する広い適用可能性、及び潜在的な多孔の外側コーティングの範囲により、本発明のナノ粒子には、潜在的に莫大な種類の適用が得られる。適用として考えられるものには、様々な薬物分子の分析方法、分子結合定数の測定、（生物学的な系及び化学的な系の両方における）触媒反応、バイオセンサーの適用、抗体−抗原、蓄積及び開放などが含まれる。一つの例には、薬物／アルブミン相互作用、及び／又は、結合定数の決定について研究するための、アルブミンの被包（カプセル化）がある。
【実施例】
【００７８】
実施例１： 多孔シリカコートがなされたＦｅ3Ｏ4ナノ粒子の形成
脱イオン化水、予め乾燥させた過剰のトルエン、及びイオン性界面活性剤（ＣＴＡＢ）を用いて、マイクロエマルジョンの形成が、行われた。概して、実験は、室温にて行われた。このマイクロエマルジョンは、以下の通り形成された：トルエン中にＣＴＡＢが十分に分散せしめられた懸濁液を作るため、勢いよく攪拌しつつ、０．０２モルのＣＴＡＢ（９９％、Aldrich）を、１００ｇの乾燥トルエン（９９＋％、Fisher）に添加した。０．３４２８ｇのＦｅＣｌ2・４Ｈ2Ｏ及び０．９３２１ｇのＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ（共に、９９％、Aldrich）が、６．２ｇの水に、溶解せしめられた。この溶液は、窒素雰囲気中において、ＣＴＡＢのトルエン懸濁液に、ゆっくりと滴下することで、添加された。４時間攪拌した後、ＮＨ3溶液（１８．１Ｍ、１ｍｌ、Fisher）が、該混合物に添加された。１時間後、系全体 (whole system)の色が、黒く変化した。これは、Ｆｅ2+、Ｆｅ3+、及びアンモニアの添加は、磁性Ｆｅ3Ｏ4の沈殿物を生成することを前もって示している。この時点で、テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）（９９％、Aldrich）が、反応混合物に添加された。該混合物には、１時間の間、窒素のバブリングが行われた。このアンモニア溶液（高ｐＨ）は、ＴＥＯＳの加水分解／縮合に触媒作用を及ぼし、シリカゲルと成した。このシリカの上層は、懸濁液中にて、５日間、熟成せしめられた。最後に、沈殿物が、磁気分離の手段によって隔離され、界面活性剤及び有機溶媒を除去するために、高温のエタノール、水、及びアセトンで、数回洗浄された。その後、沈殿物は、室温にて乾燥せしめられ、濃い茶色の粉末を得た。
【００７９】
実施例２： 実施例１の生成物の分析
実施例１で得られた生成物が、様々な技術を用いて分析された。
【００８０】
この粒子は、超常磁気応答を示す磁界への露呈によって、強力な磁気応答を示した（図３参照）。
【００８１】
Ｆｅ3Ｏ4ナノ粒子は、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によって、直径が約１２ｎｍであることが示された（図４参照）。これに対して、Ｘ線回折（ＸＲＤ）測定による計算は、該粒子の直径が１７ｎｍ程度であることを示している（図５参照）。
【００８２】
このナノ粒子の化学的組成物は、エネルギー分散分光法（ＥＤＳ）によって測定された（表１参照）。
【００８３】
【表１】
【００８４】
表１からの計算は、シリカコートされたＦｅ3Ｏ4の組成物の個々の粒子がＦｅ3Ｏ4.24・１．７４ＳｉＯ2であることを示している。実施例１の方法を用いるものの、ＴＥＯＳの濃度を変えた、粒子を形成するための更なる実験は、Ｆｅ3Ｏ4.1・０．２１ＳｉＯ2の組成を有するナノ粒子も得られ得るということを示唆している。これは、実施例１の方法を用いることによって、ナノ粒子上のシリカコーティングの厚さを、目的に合わせたものとすることが可能であることを、示している。
【００８５】
実施例３： 実施例１で生成したナノ粒子上のシリカコーティングの多孔度の測定
実施例１の方法によって製造されたＦｅ3Ｏ4 ナノ粒子のシリカコーティングの孔に捕捉され得るｎ−オクタノールの最大量の評価は、熱重量（ＴＧ）分析によって得ることが出来る（図６及び７参照）。実施例１の方法によって調製された生成物のＴＧ分析によって得られた値は、シリカコーティングが、ナノ粒子１ｇ当たり０．５４ｍｌまで吸収可能であることを示唆している。ＢＥＴ（シリカ１ｇｍ当たり３００ｍ2 超）及び孔サイズの測定（孔サイズの範囲０．５−３ｎｍ）も、複合ナノ粒子が、実際に多孔質であることを、示している。
【００８６】
実施例４： 表面水酸基のキャッピング
実施例１の方法によって得られた、多孔シリカでコートされたＦｅ3Ｏ4ナノ粒子は、シリカコーティング上の表面水酸基を、トリメチルシリル（−Ｓｉ（ＣＨ3）3）基でキャップするために、更に変更せしめられた。過剰のＣＴＭＳが、１２０℃の窒素雰囲気中において、乾燥シリカゲルでコートしたＦｅ3Ｏ4固定床を通じて流れるようにされた。ＣＴＭＳによる処理の前後の、多孔シリカでコートされたＦｅ3Ｏ4ナノ粒子のＩＲスペクトルは、図８に示されており、そして図は、Ｓｉ−ＯＨシグナル（〜９６７ｃｍ-1）の強度の減少、及び、シリカ表面上の−ＯＨ基のキャッピングを示すＳｉ−ＣＨ3 シグナル(〜８５０ｃｍ-1〜１２６５ｃｍ-1）の発現を示している。
【００８７】
実施例５： 多孔シリカでコートされたＦｅ3Ｏ4の形成
実施例１と同じ方法によって、Ｆｅ2ＣｏＯ4ナノ粒子が生成せしめられ、多孔シリカコーティングによってコートされた。この場合、等モル量のＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ（実施例１に記載の使用量と同じ量）とＣｏＣｌ2・ｘＨ2Ｏとが、実施例１と同じ方法で、ＣＴＡＢのトルエン懸濁液に添加された水に溶解せしめられた。Ｆｅ2ＣｏＯ4 粒子のサイズは、実施例１で形成されたＦｅ3Ｏ4粒子と略同じサイズのものとして、ＸＲＤにより測定された（図９）。
【００８８】
実施例６： 多孔シリカでコートされたナノ粒子を用いたｌｏｇＤ値の測定
オルトリン酸二水素カリウム（９９％、Aldrich）の０．１ｍＭ水溶液で、ｐＨ値が７．４に調整されたものが、以下の測定における緩衝溶液として、用いられた。ガラス瓶内で、ｎ−オクタノールで予め予備飽和された緩衝溶液に、テスト分子が溶解せしめられた。このテスト分子の濃度は、約１×１０-5Ｍに維持された。前記緩衝溶液にて予備飽和されたｎ−オクタノールの、１０乃至１００μｌが、多孔シリカでコートされたＦｅ3Ｏ4のナノ粒子（実施例１の方法によって得られたもの）に、毛管作用によって、物理的に吸収せしめられた。添加されたオクタノールの全てが、完全に吸着され、それを含むナノ粒子は、乾燥した粉末のように思われ、油性の小滴は、全く見られなかった。公知の量のｎ−オクタノールを含有しているナノ粒子が、公知の濃度のテスト分子溶液に分散するようにされた。この混合物中の水溶液とｎ−オクタノールとの体積比は、１００：１に設定された。前記のガラス瓶は、密閉され、オービタル・シェーカーに入れられた。ｎ−オクタノールの小滴が複合物から（視覚上）分離することを避けるため、振り混ぜ速度が、注意深く制御された。振り混ぜの後、外部の磁石が、瓶の底付近に置かれた。磁性によって誘発された沈殿が、２〜３分以内で起こった。この沈殿の前後の、上澄みの水性相内のテスト分子の検体のＵＶ−可視吸収が、ベースライン補正 (baseline correction) を用いて測定された。その後、以下の式を用いて、ｌｏｇＤ値が得られた。
【００８９】
【数３】
【００９０】
他に記載が無い限り、第一の溶媒（水）と第二の溶媒（ｎ−オクタノール）との体積比は、１００：１に固定された。
【００９１】
一部のテスト分子の検体の分配係数値は、キャップされていないナノ粒子と比較するために、トリメチルシリル（ＴＭＳ）基にてキャップされたナノ粒子の表面−ＯＨ基を用いて測定された。
【００９２】
比較の目的のため、各テスト分子の検体の分配係数は、先行技術の「振とうフラスコ」法により、同じテスト分子濃度及び相体積比率を用いて、個別に測定された。これらの測定の結果が、以下の表２乃至表４に示されている。
【００９３】
【表２】
【００９４】
【表３】
【００９５】
【表４】
【００９６】
実施例７： 酵素の芯を用いたナノ粒子の形成
第一の緩衝溶液が、５００ｍｌの脱イオン化水中に、リン酸二水素カリウムの０．０１ｍｏｌと塩化ナトリウムの０．２５ｍｏｌを含んで、調製された。緩衝ｐＨ値は、２０℃での水酸化ナトリウム溶液の添加により、７．０に調整された。
【００９７】
その後、ペニシリナーゼ（Bacillus cereusから精製されたβ−ラクタマーゼＩ、Sigma）が、酵素濃度が５０ｎＭとなるように、同じ組成物の第二の緩衝溶液に溶解せしめられた。連続的に攪拌しながら、第一の緩衝溶液の５．２ｇが、ゆっくりと滴下して添加されることで、実施例１と同様にして（１００ｇの乾燥トルエン中に０．０２ｍｏｌのＣＴＡＢ）マイクロエマルジョンが形成された。第二の緩衝溶液（ペニシリナーゼを含む）の２ｍｌが、４時間を越えて、添加された。その後、この混合物は、更に４時間攪拌されることで、マイクロエマルジョン系における酵素分子の均等な分散を、確実にした。酵素活性の比較のため、この混合物の２００μｌのサンプルが、除去された（実施例８を参照）。その後、６．９４ｇのＴＥＯＳが、この系にゆっくりと添加せしめられ、それによって、水／トルエン界面での加水分解が起き、外側のシリカコーティングが形成された。
【００９８】
実施例８： 実施例７の生成物に対する酵素活性の試験
検定された標準ペニシリンＶ（フェノキシメチルペニシリン酸)(３ｎＭ、Sigma）の加水分解を経ても、酵素が機能する(functional)か、どうかを確認するため、実施例７でのＴＥＯＳの添加の前に取り出された２００μｌの混合物のサンプルが、２３２ｎｍでペニシリン (pencilling) のラクタム基の加水分解が理解できるＵＶ−可視分光法を用いて、分析された。ＴＥＯＳの添加から６日後に、実施例７の混合物から、更に２００μｌが、抽出され、同様の方法にて分析された。
【００９９】
図１０乃至１２に、ＵＶ−可視スペクトルが示されている。このスペクトル曲線は、主に、ペニシリンＶのＵＶ−可視スペクトルを表している。典型的なＵＶ−可視スペクトルの変化を示す、添加された自由状態のβ−ラクタマーゼＩによるペニシリンＶの加水分解が、図１０にプロットされている。２３２ｎｍ（ラクタム基が吸収する領域）での吸収値が、５分を越えて減少するということは、ペニシリンＶから対応のペニシロ酸への急速な転換が起きているということ（ラクタム基の加水分解）を、明確に示している。図１１は、ＴＥＯＳの添加の前に、反応混合物から抽出された２００μｌのサンプル（シリカコートなし）を添加した際の、ペニシリンＶ溶液の結果を示している。ラクタム基が位置している２３２ｎｍでの吸光度の値は、ここでも、５分の間、減少が見られた。これは、混合物のミセルに導入された際にも、酵素が、なお活性であることを示している。図１２も、実施例７（シリカコートされたナノ粒子）の混合物にＴＥＯＳを添加した６日後に抽出されたサンプルを用いた場合に、同様のスペクトルの変化が観察されたことを示している。２３２ｎｍでの吸光度の値は、５分を越えて、２つのスペクトルの間で、明白に減少し続けた。
【０１００】
これらの結果は、捕捉された酵素が、ミセル及びシリカコートされた複合環境の両方において、機能を有することを示している。
【０１０１】
次に、超臨界流体を用いて、成分を多孔材料、特にナノ粒子に析出させる本発明の方法の詳細について、説明する。
【０１０２】
ある化合物の超臨界状態は、その臨界値の、或いはそれ以上の温度及び圧力において、達成され得る。化合物の臨界温度は、それを超えると、適用される圧力如何に拘わらず、純粋な気体成分を液化せしめることができない温度として、定義される。それから、臨界圧力は、該臨界温度における蒸気圧として、定義される。気体及び液体の相が同一になる時の温度及び圧力が、臨界点である。超臨界環境においては、一つの相のみが、存在する。いわゆる流体は、気体又は液体の何れでも無く、それら二つの極値（extremes）の中間として、最も適切に表現される。この相は、液体に共通の溶媒の力のほか、気体に共通する輸送能力を、保持する。二酸化炭素は、最も一般的に知られる超臨界流体である。気体、液体、及び超臨界状態の違いを例示するために、二酸化炭素の圧力−温度のダイヤグラムが、図１３に示されている。図１３に見られるように、純粋なＣＯ2は、３１．０６℃未満の温度においてのみ、圧縮によって液化せしめられ得る。この臨界温度Ｔｃ及び対応の臨界圧力Ｐｃ（７３．８バール）を越えると、明確な液体相又は気体相は存在しない。これは、ＳＣ−ＣＯ2 が存在する超臨界領域として、言及される。
【０１０３】
ＳＣ−ＣＯ2の特性は、温度及び圧力に依存しているが、一般的に、気体の状態と液体の状態の中間体である。超臨界のＣＯ2は、環境にやさしい溶媒であるという有利な点を有する。それが持つ主な特性のうちの一つには、化学的化合物を溶解する能力がある。ＳＣ−ＣＯ2における化学的化合物の溶解度は、温度及び圧力によって影響される。ＳＣ−ＣＯ2中でのｎ−オクタノールの溶解度については、２００１年に調べられた (H. Nakaya, O. Miyawaki and K. Nakamura, Enz. Micro. Tech., 28, 176-182, 2001)。この研究において、ｎ−オクタノール／水系中における超臨界ＣＯ2のｌｏｇＰは、ＣＯ2におけるｎ−オクタノールの溶解度から、決定された。ｎ−オクタノールにおけるＳＣ−ＣＯ2の溶解度は、５５バール、５０℃において、約１．０Ｍである。圧力が増加せしめられると、溶解度が増加せしめられる。これは、ｎ−オクタノールが、ＳＣ−ＣＯ2 において良好な溶解度を有することを、示している。ＳＣ−ＣＯ2は、液体ＣＯ2に比して、実質的に高い拡散率及び低い粘度を有する。その密度の故に、この粘度及び拡散率は、温度及び圧力に依存している。異なる圧力及び温度でのＳＣ−ＣＯ2 の拡散率及び粘度の曲線は、M.A. McHugh and V.J. Krukonis, Supercritical Fluid Extraction-Principles and Practice, Butterworths, Boston, MA, 10, 1986 and S.V. Kamat, B. Iwaskewyct, E.J. Berkman and A.J. Russell, Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 2940, 1993. に示されている。拡散率が、温度の増加又は圧力の低下に伴って増加することについても、示されている。拡散率とは異なり、粘度は、温度の増加又は圧力の低下に伴って減少することが、示される。
【０１０４】
ＳＣ−ＣＯ2の、高いｎ−オクタノールの溶解度、高い拡散率及び低い粘度という利点は、超臨界媒体を介したｎ−オクタノールの多孔ナノ複合体への運搬についての、以下の実施例において、採用されている。その結果となるものは、均一に装填されたオクタノールと共に磁性ナノ複合体を含む均質な溶液 (homogeneous solution)である。
【０１０５】
実施例９： ＳＣ−ＣＯ2 の運搬を介した多孔ナノ複合体へのｎ−オクタノールの装填及びストック溶液の準備
以下の実施例では、ｎ−オクタノール（９９％）、リン酸二水素カリウム、４−ニトロアニソール（９７％）、４−ニトロベンジルアルコール（９９％）、および４−ニトロフェノール（９８％）が、Aldrichから入手された。イミプラミン、キノリン、クロルプロマジン、ベンズアミドについては、分析用の品質又はそれ以上のものが、Sigmaから入手された。これらの薬品は、全て、それ以上の精製を行うことなく用いられた。
【０１０６】
図１４に示された設定を用いて、多孔ナノ複合体へのｎ−オクタノールの装填が行われた。
【０１０７】
図１４は、高圧ＣＯ2がパイプ２を通じて運搬される、オートクレーブ１を示している。このオートクレーブ１は、圧力検出器３、及び、一定の温度を保つ為の温度コントローラ４を有している。オートクレーブ１は、弁付管５によって、水槽７に保持されたサンプルホルダー６に接続されている。
【０１０８】
上記実施例１で調製された、乾燥した多孔シリカ被包のナノ複合体０．０６０７ｇが、サンプルホルダー６内に置かれた。その後、マイクロピペットを用いて、３０μＬのｎ−オクタノールがホルダー６内に添加された。このオートクレーブ槽とサンプルホルダー（合計容量３０ｍｌ）がＣＯ2で満たされ、２つのコンパートメントの間の弁や外部排出口を開閉することによって、ＣＯ2 でフラッシュされた。これは、この槽が所望の圧力（１５０バール）に達する前に、２、３回行われた。少量のｎ−オクタノールの多孔粒子中への分散を許容するため、オートクレーブとサンプルホルダーの温度は、４０℃に維持された。２時間後、この系の高圧は、大気中に、非常にゆっくりと、放出された。サンプルホルダーの重量変化を測定することによって、０．０１５５ｇのｎ−オクタノール（密度０．８２４０ｇ／ｍＬ）が、粒子に吸着せしめられ、その量は、１８．８μＬとなることが判った。
【０１０９】
ＳＣ−ＣＯ2 におけるｎ−オクタノールの比較的高い溶解度により、ｎ−オクタノールの一部は、除圧工程の間に、失われた。ｎ−オクタノールを有する複合体の粉末は、溶媒を乾燥した粉末に直接に混合して調製されたサンプルとは異なり、軽くて且つ乾燥しているもののように見えた。図１５のプロットは、幾つかの同様の実験において、測定された（獲得重量）ｎ−オクタノールの吸収量と、同量の粒子に添加されたｎ−オクタノールの量との間の関係を示している。
【０１１０】
別の手順においては、ｎ−オクタノールは、オートクレーブ１に置かれて、ＳＣ−ＣＯ2がサンプルホルダー６内の粒子と接触せしめられる前に、オートクレーブにおいてＳＣ−ＣＯ2中に溶解する。二つの手順とも、同様の結果を生むと考えられる。
【０１１１】
理論に縛られたくはないが、気体の如き特徴を有するＳＣ−流体は、粒子の孔内に（液体に比して）、非常に自由に浸透し、減圧時には、溶解された成分の溶解度の減少が、粒子の孔の広い表面区域（粒子の外側面区域又は反応槽の表面区域よりもかなり大きい）上に凝縮することを許容するものと、推定することが出来る。
【０１１２】
水性溶媒にｎ−オクタノールを担持するこれらの粒子のストック溶液を調製するために、ｐＨ＝７．４で、０．１ｍＭのリン酸二水素カリウムを含む緩衝溶液が、最初に調製され、分液漏斗に配置された。水相を覆うｎ−オクタノールの薄い層を提供するために、適性な量のｎ−オクタノールが、添加された（ｎ−オクタノールの密度は、水よりも低い）。ｎ−オクタノールと水との混合を行うため、５乃至１０分間、漏斗が攪拌された。その後、この溶媒混合物を、光による劣化や蒸発から保護するため、漏斗は、アルミホイルで覆われた。二つの層の分離を許容するように、この漏斗は、直立の位置にて、３日間配置された。その後、水にて飽和せしめられたｎ−オクタノール相が、回収された。
【０１１３】
溶液１ｍＬ当たりのｎ−オクタノールが０．００３８ｍＬの濃度である均質なストック溶液を得るために、かかる飽和緩衝溶液５ｍＬ中に、ナノ複合体を含む粒子が、分散せしめられた。これと同じ方法にて調製されたストック溶液を用いて、分配係数の測定が、下記の通り行われた。
【０１１４】
実施例１０： ストック溶液を用いた分配係数の決定
各実験において、ＳＣ−ＣＯ2を用いる方法によって調製された、ナノ粒子を含むｎ−オクタノールのストック溶液１ｍＬが、マイクロピペットを用いて取り出され、３ｍＬの検体溶液と混合された。その混合系を３０分間攪拌した後、リアクター管の底部付近に置かれた外部の磁石によって、磁性ナノ複合体が、数分間で沈殿せしめられた。分配の前後両方の水性相における検体の吸収について判定するために、ＵＶ−可視分光法が用いられた。この方法によって、７つの検体の分配係数（ｌｏｇＤ）が測定され、従来から用いられている振とうフラスコ法によって決定されたｐＨ＝７．４での、これらの検体のｌｏｇＤ値と、上記実施例６で得られた結果と共に、下記の表５に示された。
【０１１５】
分配係数の決定のために、好適なｎ−オクタノール／ナノ粒子比率を用いて、ストック溶液が調製された。０．０７１ｇのナノ複合体に対して４０μｌのｎ−オクタノールという典型的な比率は、ＳＣ−ＣＯ2の運搬の後、実際に、ナノ複合体上に２２．３μｌのｎ−オクタノールを与えた。このストック溶液は、これらのｎ−オクタノールを予め吸収したナノ複合体を、５ｍｌのリン酸カリウム緩衝溶液（ｐＨ＝７．４）中に直接的に分散せしめることによって、調製された。ここで記載されている作業では、緩衝溶液中のｎ−オクタノールの典型的な容量濃度は、緩衝溶液１ｍｌ当たりｎ−オクタノール０．００４５ｍｌというものである。
【０１１６】
分配の前後の水系相中の薬物濃度を定量的に決定するために、ＵＶ−可視分光法が、用いられた。ｎ−オクタノール／水の分配係数（ｌｏｇＤ）は、平衡状態にあるこれら二相における種の活性の比率として定義された。溶解が大きい時は、活性を置き換えるために、濃度を用いる。この定義は、以下の式によって表現され得る。
【０１１７】
【数４】
【０１１８】
前記のように、ｌｏｇＤの測定のために、１ｍＬのストック溶液が、初期の薬物溶液３ｍＬと混合された。緩衝溶液中のｎ−オクタノールの濃度は、１ｍＬのストック溶液当たり０．００４５ｍＬのｎ−オクタノールであるので、測定時の水／ｎ−オクタノールの体積比は、約８８９：１である。この比率は、振とうフラスコ法で用いられる１００：１という通常の比率よりもかなり高く、高いｌｏｇＤ値の、信頼性のある決定が、可能となる。振とうフラスコ法では、このように少量のｎ−オクタノール相を分離することは困難であるが、磁性ナノ複合体を用いることによって、極めて容易となると見受けられる。
【０１１９】
表５は、本実施例のストック溶液方法、振とうフラスコ法、及び実施例６の磁性ナノ複合体方法を用いて、独立して測定されたｌｏｇＤ値の結果のリストである。各薬物検体について、３種類の方法の全てによって、少なくとも５回測定され、その測定されたｌｏｇＤ値の平均が示されている。振とうフラスコ法においても、磁性ナノ複合体法と同様に、水／ｎ−オクタノールの容積比率として、１００が用いられている。統計信頼度は、９５％である。文献から得られた各薬物検体のｌｏｇＤ値も、比較のために、リストアップされている。
【０１２０】
【表５】
【０１２１】
上記の結果から、これら三つの全ての方法によって、１．２６０乃至３．２０の範囲内にある薬物分子のｌｏｇＤ値が、首尾よく測定された。このデータから分かるように、ストック溶液法によって得られたｌｏｇＤ値の殆どが、文献値に対して十分な相関関係を有している。我々の測定においては、水／ｎ−オクタノールの高い体積比が用いられたことから、特に、低いｌｏｇＤ値を有するそれら薬物分子の感度が制限されることが、観察された。低いｌｏｇＤ値を有する薬物化合物で、ｎ−オクタノール相への低い溶解度を示すものは、分配の後でさえも、水相中のそれらの濃度に、大きな変化を与えることは無い。その結果、低いｌｏｇＤ値の化合物に対する実験結果の精度は、用いられる相の比率（添加されるストック溶液の量に関連する）と、関与する検知技術の感度に、大きく左右される。濃度の測定におけるわずかな誤差は、最終的に得られるｌｏｇＤ値に重大な変化を惹起する。典型的な例は、ｐＨ＝７．４の時のｌｏｇＤ値が０．６６のベンズアミドである。分析方法の感度を高めること、又は、用いる水／ｎ−オクタノールの体積比を減少させることによって、誤差の程度がより小さくされ得ることが期待される。
【０１２２】
この発明方法による結果及び文献から得られた値の相関曲線が、図１６に示されている（ベンズアミドのデータは、除外されている）。このカーブの相関係数は、０．９９５８であることが見出される。図１７は、本実施例のストック溶液方法の結果と、標準的な振とうフラスコ法の結果との相関曲線を示している。このカーブの相関係数は、０．９８７である。図８は、本実施例のストック溶液法の結果と実施例６の磁性ナノ複合体法との、相関曲線を示している。このカーブの相関係数は０．９８８である。これらは、全て、ストック溶液法の信頼性を示しており、超臨界二酸化炭素を用いることによって、ｎ−オクタノールの多孔ナノ複合体への均質な分散／沈殿が、首尾よく行われ得ることを、はっきりと示している。表３においては、ストック溶液法によって測定されたｌｏｇＤ値の統計的偏差が、同じ信頼度にある他の二つの方法によるものよりも、わずかに大きくなっている。
【０１２３】
テストされた化合物のｌｏｇＤ値が分からない場合の手順においては、ストック溶液に含まれる第二の溶媒（例えばｎ−オクタノール）の量を、逆算によって確認するために、ナノ粒子を含む同じストック溶液を用いた公知のｌｏｇＤの一つ又は複数の化合物に対する試験を並行して行うことが好ましいと言える。
【０１２４】
本発明については、上記した模範的な具体例に関連付けて記載してきたが、当業者であれば、ここで開示した内容を得た時に、数多くの同様な修正や変形を加え得ることは、明らかであろう。従って、上記で示した本発明の模範的な具体例は、あくまでも例示的なものであり、本発明を限定するものでは無いことが考慮されるべきである。記載された具体例には、本発明の精神や範囲を逸脱することなく、様々な変更を加えることができるのである。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】図１は、ナノ粒子を用いた測定によって得られたｌｏｇＤの結果と、文献値との相関関係を示している。
【図２】図２は、ナノ粒子を用いた測定によって得られたｌｏｇＤの結果と、先行技術の方法を用いて得られた値との間の相関関係を示している。
【図３】図３は、実施例１の方法を用いて得られた粒子の磁場応答を示している。
【図４】図４は、実施例１の方法によって製造された、シリカでコートされた粒子の、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による顕微鏡写真を示している。
【図５】図５は、実施例１で得られたシリカコートのＦｅ3Ｏ4 ナノ粒子についての、１．５４０５６ｎｍの波長を用いて記録されたＸ線回析（ＸＲＤ）パターンを示している。
【図６】図６は、実施例１で得られたシリカコートのＦｅ3Ｏ4 ナノ粒子についての熱重量分析（ＴＧ）を示している。
【図７】図７は、シリカコートされたＦｅ3Ｏ4 ナノ粒子であって、そのシリカコーティングがｎ−オクタノールにて飽和せしめられたものの熱重量分析（ＴＧ）を示している。
【図８】図８は、二つの赤外線（ＩＲ）スペクトルを示している：ａ）は、シリカでコートされたＦｅ3Ｏ4 ナノ粒子のものであり；ｂ）は、シリカでコートされたＦｅ3Ｏ4 ナノ粒子で、クロロトリメチルシラン（ＣＴＭＳ）にて処理されたものについてのものである。
【図９】図９は、実施例５において得られたＦｅ2ＣｏＯ4ナノ粒子のＸＲＤパターンを示している。
【図１０】図１０は、β−ラクタマーゼＩの存在下における、ペニシリンＶ溶液のＵＶ−可視スペクトルを示している。
【図１１】図１１は、β−ラクタマーゼＩのミセル溶液の存在下における、ペニシリンＶ溶液のＵＶ−可視スペクトルを示している。
【図１２】図１２は、多孔のシリカコーティング内にカプセル化されたβ−ラクタマーゼＩの存在下における、ペニシリンＶ溶液のＵＶ−可視スペクトルを示している。
【図１３】図１３は、二酸化炭素の圧力−温度のダイヤグラムである。
【図１４】図１４は、超臨界のＣＯ2を用いた、粒子上への析出のための装置の概略図である。
【図１５】図１５は、添加されたオクタノール量に対する、吸収されたｎ−オクタノールのグラフである。
【図１６】図１６は、表５に示された結果についての、相関関係のカーブである。
【図１７】図１７は、表５に示された結果についての、相関関係のカーブである。
【図１８】図１８は、表５に示された結果についての、相関関係のカーブである。
【符号の説明】
【０１２６】
１ オートクレーブ ２ パイプ
３ 圧力検出器 ４ 温度コントローラ
５ 弁付管 ６ サンプルホルダー
７ 水槽
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二つの非混和性溶媒間の化合物の分配係数を測定する方法にして、以下の工程を含むことを特徴とする方法：
ａ）前記化合物を含有し、且つ、多孔表面を有するナノ粒子と第一の溶媒を含む組成物にして、第二の溶媒が該ナノ粒子の孔内に吸収され、更に、該第一と第二の溶媒が非混和性であるものを調製する工程；
ｂ）工程ａ）の生成物を、ナノ粒子を含む第一のものと前記溶媒を含む第二のものである、二つの成分に分離する工程；並びに、
ｃ）前記第一の成分と第二の成分の間の前記化合物の分配から、前記分配係数を決定する工程。
【請求項２】
多孔表面を有するナノ粒子と、第一の溶媒とを含み、且つ第二の溶媒が、該ナノ粒子の孔内に吸収され、更に、前記第一及び該第二の溶媒が、非混和性であることを特徴とする組成物。
【請求項３】
前記ナノ粒子が、前記第一の溶媒中において、コロイド的に安定した懸濁液を形成している請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記多孔表面が、シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコニア、またはカーボンの何れか一つによって形成されている請求項２または請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ナノ粒子が、更に磁性材料の芯を有する請求項２乃至請求項４の何れか１つに記載の組成物。
【請求項６】
前記磁性材料の芯が、マグネタイト(Ｆｅ3Ｏ4）、マグヘマイト（γＦｅ3Ｏ4）、グレイジャイト(Ｆｅ3Ｓ4）、Ｆｅ2ＣｏＯ4、強磁性の金属若しくは合金またはカーバイドから形成されている請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ナノ粒子が、２ｎｍ〜１μｍの直径を有している請求項２乃至請求項６の何れか１つに記載の組成物。
【請求項８】
前記ナノ粒子の多孔表面層が、１ｎｍ〜１００ｎｍの厚さを有している請求項２乃至請求項７の何れか１つに記載の組成物。
【請求項９】
前記第一の溶媒が、水性、特に水である請求項２乃至請求項８の何れか１つに記載の組成物。
【請求項１０】
前記第二の溶媒が、ｎ−オクタノール、シクロヘキサン、Ｃ6−Ｃ10のアルカン、クロロホルム、プロピレングリコールジペラゴネート（ＰＧＤＰ）、１，２−ジクロロエタン、オリーブオイル、ベンゼン、トルエン、ニトロベンゼン、クロロベンゼン、テトラクロロメタン、オレイルアルコール、４−メチルペンタン−２−オール、ペンタン−１−オール、ペンタン−２−オール、イソブタノール、ブタン−１−オール、２−メチルブタン−２−オール、ブタン−２−オール、ブタン−２−オン、ジエチルエーテル、イソアミルアセテート、エチルアセテート等のうちの一つ、または、それらのうちの二つ若しくはそれ以上の単相の混合物である請求項２乃至請求項９の何れかに１つ記載の組成物。
【請求項１１】
前記第一の溶媒と前記第二の溶媒との体積比が、３０００：１〜１：１（好ましくは、５００：１〜５０：１の範囲内）である請求項２乃至請求項１０の何れか１つに記載の組成物。
【請求項１２】
前記第一の溶媒と前記第二の溶媒との体積比が、少なくとも１００：１である請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
二つの非混和性溶媒間の化合物の分配を達成する方法にして、該化合物を、請求項２乃至請求項１２の何れか１つに記載の組成物に組み入れる工程を含む方法。
【請求項１４】
定量分析技術において用いるための組成物にして、それぞれが多孔表面を有するナノ粒子と、該組成物の単位重量当たり所定の量において該ナノ粒子の孔に吸着せしめられた溶媒とを含む組成物。
【請求項１５】
前記多孔表面が、シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコニア、またはカーボンのうちの何れか一つによって形成されている請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ナノ粒子のそれぞれが、磁性材料の芯を有している請求項１４または請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記溶媒が、水に対して非混和性である請求項１４乃至請求項１６の何れか１つに記載の組成物。
【請求項１８】
前記第二の溶媒が、ｎ−オクタノール、シクロヘキサン、Ｃ6−Ｃ10のアルカン、クロロホルム、プロピレングリコールジペラゴネート（ＰＧＤＰ）、１，２−ジクロロエタン、オリーブオイル、ベンゼン、トルエン、ニトロベンゼン、クロロベンゼン、テトラクロロメタン、オレイルアルコール、４−メチルペンタン−２−オール、ペンタン−１−オール、ペンタン−２−オール、イソブタノール、ブタン−１−オール、２−メチルブタン−２−オール、ブタン−２−オール、ブタン−２−オン、ジエチルエーテル、イソアミルアセテート、エチルアセテート等のうちの一つ、または、それらのうちの二つ若しくはそれ以上の単相の混合物である請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１４乃至請求項１８の何れか１つに記載の組成物の、分配係数を決定する方法における使用。
【請求項２０】
二つの非混和性溶媒間の化合物の分配係数を測定する方法にして、以下の工程を含むことを特徴とする方法：
ａ）前記化合物を、請求項２乃至請求項１３の何れか１つに従う組成物に組み入れる工程；
ｂ）工程ａ）の生成物を、ナノ粒子を含む第一のものと前記第一の溶媒を含む第二のものである、二つの成分に分離する工程；並びに、
ｃ）前記第一の成分と第二の成分の間の前記化合物の分配から、前記分配係数を決定する工程。
【請求項２１】
工程ｃ）が、前記第一の溶媒中に残る前記化合物の量を決定することを含んでいる請求項１または請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記化合物が、生物活性の薬物分子である請求項１、請求項２０または請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
工程ｂ）が、ろ過、遠心分離、及び磁選のうちの何れかによって行われる請求項１及び請求項２０乃至請求項２２の何れか１つに記載の方法。
【請求項２４】
工程ｃ）が、前記上清溶液のＵＶ可視スペクトルを記録することを含んでいる請求項１及び請求項２０乃至請求項２３の何れか１つに記載の方法。
【請求項２５】
前記分離工程ｂ）を行う前に、更に、前記工程ａ）の組成物を振り混ぜることを含む請求項１及び請求項２０乃至請求項２４の何れか１つに記載の方法。
【請求項２６】
触媒活性の種を含む芯と、該芯を取り囲み、該触媒活性の種が捕捉される孔サイズを有する多孔層とを有するナノ粒子。
【請求項２７】
前記芯の触媒活性の種が、生物学的に活性な種、例えば酵素又はその他の蛋白質である請求項２６に記載のナノ粒子。
【請求項２８】
前記生物学的に活性な種が、血清アルブミン、β−ラクタマーゼＩ（ペニシリナーゼ）、キナーゼ、カルボキシルエステラーゼ、メタロチオニン、シトクロムｂ、ｃ、Ｐ４５０等のうちの何れか１つである請求項２７に記載のナノ粒子。
【請求項２９】
前記多孔層が、シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコニア、又はカーボンの何れかによって形成されている請求項２６乃至請求項２８の何れか１つに記載のナノ粒子。
【請求項３０】
前記芯が、更に、磁性材料を含んでいる請求項２６乃至請求項２９の何れか１つに記載のナノ粒子。
【請求項３１】
前記磁性の芯が、マグネタイト(Ｆｅ3Ｏ4）、マグヘマイト（γＦｅ3Ｏ4）、グレイジャイト(Ｆｅ3Ｓ4）若しくはＦｅ2ＣｏＯ4、又は強磁性の金属若しくは合金（Ｆｅ−Ｐｔ、Ｆｅ−Ｃｏ、Ｆｅ−Ｎｉ等）、金属カーバイド等から形成されている請求項３０に記載のナノ粒子。
【請求項３２】
前記ナノ粒子が、２ｎｍ〜１μｍの平均直径を有する請求項２６乃至請求項３１の何れか１つに記載のナノ粒子。
【請求項３３】
前記ナノ粒子のコアが、１〜１０ｎｍの平均直径を有する請求項２６乃至請求項３２の何れか１つに記載のナノ粒子。
【請求項３４】
前記ナノ粒子上の多孔の外側コーティングが、１ｎｍ〜１００ｎｍの厚さを有している請求項２６乃至請求項３３の何れか１つに記載のナノ粒子。
【請求項３５】
少なくとも一部が請求項２６乃至請求項３４の何れか１つに記載のナノ粒子であるナノ粒子の集合体であって、該集合体のナノ粒子当たりの前記触媒活性の種の分子数の平均が、１を越えないナノ粒子の集合体。
【請求項３６】
請求項２６乃至請求項３４の何れか１つに記載のナノ粒子を製造する方法にして、以下の工程を含むことを特徴とする方法：
ａ）液状媒体中において、ナノ粒子の芯に含有せしめられる前記触媒活性の種を含むコロイド粒子を、界面活性剤によってコロイド的に安定化せしめて、形成する工程；及び
ｂ）前記コロイド粒子を、加水分解又は熱分解によって処理して、前記触媒活性の種を取り囲む多孔層を形成する工程。
【請求項３７】
工程ａ）において、前記コロイド粒子が、磁性材料又は磁性材料の先駆物質を更に含んでいる請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記コロイド粒子が、水に対して非混和性である溶媒中において水性のコロイド粒子を含んでいる請求項３６または請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
シリコン、アルミニウム、チタニウム、又はジルコニウムの塩を、工程ａ）の生成物に更に添加し、該コロイド境界での加水分解の際に対応の酸化化合物を形成する請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記シリコンの塩が、テトラエチルオルソシリケート（ＴＥＯＳ）であり、そして前記界面活性剤が、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）である請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
多孔材料の孔の中に成分を析出させる方法にして、該多孔材料を、超臨界流体中において、該成分の溶液に接触させることによって行う方法。
【請求項４２】
前記超臨界流体が、減圧し、気化を許容することによって、除去される請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記成分が、液体である請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４４】
前記成分が、実質的に水に不溶性である請求項４１乃至請求項４３の何れか１つに記載の方法。
【請求項４５】
前記多孔材料が、多孔の粒子である請求項４１乃至請求項４４の何れか１つに記載の方法。
【請求項４６】
前記多孔粒子が、１μｍを越えない粒子サイズを有するナノ粒子である請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記多孔材料が、多孔のシリカ表面を有している請求項４１乃至請求項４６の何れか１つに記載の方法。
【請求項４８】
前記超臨界流体が、二酸化炭素である請求項４１乃至請求項４７の何れか１つに記載の方法。
【請求項４９】
二つの成分を含有する組成物を調製する方法にして、請求項４５乃至請求項４８に記載の方法によって所定の量の第一の成分を含む多孔粒子を調製する工程と、かかる粒子を液体である第二の成分に添加する工程とを含む方法。
【請求項５０】
前記第一及び第二の成分が、非混和性である請求項４９に記載の方法。
【請求項１】
二つの非混和性溶媒間の化合物の分配係数を測定する方法にして、以下の工程を含むことを特徴とする方法：
ａ）前記化合物を含有し、且つ、多孔表面を有するナノ粒子と第一の溶媒を含む組成物にして、第二の溶媒が該ナノ粒子の孔内に吸収され、更に、該第一と第二の溶媒が非混和性であるものを調製する工程；
ｂ）工程ａ）の生成物を、ナノ粒子を含む第一のものと前記溶媒を含む第二のものである、二つの成分に分離する工程；並びに、
ｃ）前記第一の成分と第二の成分の間の前記化合物の分配から、前記分配係数を決定する工程。
【請求項２】
多孔表面を有するナノ粒子と、第一の溶媒とを含み、且つ第二の溶媒が、該ナノ粒子の孔内に吸収され、更に、前記第一及び該第二の溶媒が、非混和性であることを特徴とする組成物。
【請求項３】
前記ナノ粒子が、前記第一の溶媒中において、コロイド的に安定した懸濁液を形成している請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記多孔表面が、シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコニア、またはカーボンの何れか一つによって形成されている請求項２または請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ナノ粒子が、更に磁性材料の芯を有する請求項２乃至請求項４の何れか１つに記載の組成物。
【請求項６】
前記磁性材料の芯が、マグネタイト(Ｆｅ3Ｏ4）、マグヘマイト（γＦｅ3Ｏ4）、グレイジャイト(Ｆｅ3Ｓ4）、Ｆｅ2ＣｏＯ4、強磁性の金属若しくは合金またはカーバイドから形成されている請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ナノ粒子が、２ｎｍ〜１μｍの直径を有している請求項２乃至請求項６の何れか１つに記載の組成物。
【請求項８】
前記ナノ粒子の多孔表面層が、１ｎｍ〜１００ｎｍの厚さを有している請求項２乃至請求項７の何れか１つに記載の組成物。
【請求項９】
前記第一の溶媒が、水性、特に水である請求項２乃至請求項８の何れか１つに記載の組成物。
【請求項１０】
前記第二の溶媒が、ｎ−オクタノール、シクロヘキサン、Ｃ6−Ｃ10のアルカン、クロロホルム、プロピレングリコールジペラゴネート（ＰＧＤＰ）、１，２−ジクロロエタン、オリーブオイル、ベンゼン、トルエン、ニトロベンゼン、クロロベンゼン、テトラクロロメタン、オレイルアルコール、４−メチルペンタン−２−オール、ペンタン−１−オール、ペンタン−２−オール、イソブタノール、ブタン−１−オール、２−メチルブタン−２−オール、ブタン−２−オール、ブタン−２−オン、ジエチルエーテル、イソアミルアセテート、エチルアセテート等のうちの一つ、または、それらのうちの二つ若しくはそれ以上の単相の混合物である請求項２乃至請求項９の何れかに１つ記載の組成物。
【請求項１１】
前記第一の溶媒と前記第二の溶媒との体積比が、３０００：１〜１：１（好ましくは、５００：１〜５０：１の範囲内）である請求項２乃至請求項１０の何れか１つに記載の組成物。
【請求項１２】
前記第一の溶媒と前記第二の溶媒との体積比が、少なくとも１００：１である請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
二つの非混和性溶媒間の化合物の分配を達成する方法にして、該化合物を、請求項２乃至請求項１２の何れか１つに記載の組成物に組み入れる工程を含む方法。
【請求項１４】
定量分析技術において用いるための組成物にして、それぞれが多孔表面を有するナノ粒子と、該組成物の単位重量当たり所定の量において該ナノ粒子の孔に吸着せしめられた溶媒とを含む組成物。
【請求項１５】
前記多孔表面が、シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコニア、またはカーボンのうちの何れか一つによって形成されている請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ナノ粒子のそれぞれが、磁性材料の芯を有している請求項１４または請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記溶媒が、水に対して非混和性である請求項１４乃至請求項１６の何れか１つに記載の組成物。
【請求項１８】
前記第二の溶媒が、ｎ−オクタノール、シクロヘキサン、Ｃ6−Ｃ10のアルカン、クロロホルム、プロピレングリコールジペラゴネート（ＰＧＤＰ）、１，２−ジクロロエタン、オリーブオイル、ベンゼン、トルエン、ニトロベンゼン、クロロベンゼン、テトラクロロメタン、オレイルアルコール、４−メチルペンタン−２−オール、ペンタン−１−オール、ペンタン−２−オール、イソブタノール、ブタン−１−オール、２−メチルブタン−２−オール、ブタン−２−オール、ブタン−２−オン、ジエチルエーテル、イソアミルアセテート、エチルアセテート等のうちの一つ、または、それらのうちの二つ若しくはそれ以上の単相の混合物である請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１４乃至請求項１８の何れか１つに記載の組成物の、分配係数を決定する方法における使用。
【請求項２０】
二つの非混和性溶媒間の化合物の分配係数を測定する方法にして、以下の工程を含むことを特徴とする方法：
ａ）前記化合物を、請求項２乃至請求項１３の何れか１つに従う組成物に組み入れる工程；
ｂ）工程ａ）の生成物を、ナノ粒子を含む第一のものと前記第一の溶媒を含む第二のものである、二つの成分に分離する工程；並びに、
ｃ）前記第一の成分と第二の成分の間の前記化合物の分配から、前記分配係数を決定する工程。
【請求項２１】
工程ｃ）が、前記第一の溶媒中に残る前記化合物の量を決定することを含んでいる請求項１または請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記化合物が、生物活性の薬物分子である請求項１、請求項２０または請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
工程ｂ）が、ろ過、遠心分離、及び磁選のうちの何れかによって行われる請求項１及び請求項２０乃至請求項２２の何れか１つに記載の方法。
【請求項２４】
工程ｃ）が、前記上清溶液のＵＶ可視スペクトルを記録することを含んでいる請求項１及び請求項２０乃至請求項２３の何れか１つに記載の方法。
【請求項２５】
前記分離工程ｂ）を行う前に、更に、前記工程ａ）の組成物を振り混ぜることを含む請求項１及び請求項２０乃至請求項２４の何れか１つに記載の方法。
【請求項２６】
触媒活性の種を含む芯と、該芯を取り囲み、該触媒活性の種が捕捉される孔サイズを有する多孔層とを有するナノ粒子。
【請求項２７】
前記芯の触媒活性の種が、生物学的に活性な種、例えば酵素又はその他の蛋白質である請求項２６に記載のナノ粒子。
【請求項２８】
前記生物学的に活性な種が、血清アルブミン、β−ラクタマーゼＩ（ペニシリナーゼ）、キナーゼ、カルボキシルエステラーゼ、メタロチオニン、シトクロムｂ、ｃ、Ｐ４５０等のうちの何れか１つである請求項２７に記載のナノ粒子。
【請求項２９】
前記多孔層が、シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコニア、又はカーボンの何れかによって形成されている請求項２６乃至請求項２８の何れか１つに記載のナノ粒子。
【請求項３０】
前記芯が、更に、磁性材料を含んでいる請求項２６乃至請求項２９の何れか１つに記載のナノ粒子。
【請求項３１】
前記磁性の芯が、マグネタイト(Ｆｅ3Ｏ4）、マグヘマイト（γＦｅ3Ｏ4）、グレイジャイト(Ｆｅ3Ｓ4）若しくはＦｅ2ＣｏＯ4、又は強磁性の金属若しくは合金（Ｆｅ−Ｐｔ、Ｆｅ−Ｃｏ、Ｆｅ−Ｎｉ等）、金属カーバイド等から形成されている請求項３０に記載のナノ粒子。
【請求項３２】
前記ナノ粒子が、２ｎｍ〜１μｍの平均直径を有する請求項２６乃至請求項３１の何れか１つに記載のナノ粒子。
【請求項３３】
前記ナノ粒子のコアが、１〜１０ｎｍの平均直径を有する請求項２６乃至請求項３２の何れか１つに記載のナノ粒子。
【請求項３４】
前記ナノ粒子上の多孔の外側コーティングが、１ｎｍ〜１００ｎｍの厚さを有している請求項２６乃至請求項３３の何れか１つに記載のナノ粒子。
【請求項３５】
少なくとも一部が請求項２６乃至請求項３４の何れか１つに記載のナノ粒子であるナノ粒子の集合体であって、該集合体のナノ粒子当たりの前記触媒活性の種の分子数の平均が、１を越えないナノ粒子の集合体。
【請求項３６】
請求項２６乃至請求項３４の何れか１つに記載のナノ粒子を製造する方法にして、以下の工程を含むことを特徴とする方法：
ａ）液状媒体中において、ナノ粒子の芯に含有せしめられる前記触媒活性の種を含むコロイド粒子を、界面活性剤によってコロイド的に安定化せしめて、形成する工程；及び
ｂ）前記コロイド粒子を、加水分解又は熱分解によって処理して、前記触媒活性の種を取り囲む多孔層を形成する工程。
【請求項３７】
工程ａ）において、前記コロイド粒子が、磁性材料又は磁性材料の先駆物質を更に含んでいる請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記コロイド粒子が、水に対して非混和性である溶媒中において水性のコロイド粒子を含んでいる請求項３６または請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
シリコン、アルミニウム、チタニウム、又はジルコニウムの塩を、工程ａ）の生成物に更に添加し、該コロイド境界での加水分解の際に対応の酸化化合物を形成する請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記シリコンの塩が、テトラエチルオルソシリケート（ＴＥＯＳ）であり、そして前記界面活性剤が、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）である請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
多孔材料の孔の中に成分を析出させる方法にして、該多孔材料を、超臨界流体中において、該成分の溶液に接触させることによって行う方法。
【請求項４２】
前記超臨界流体が、減圧し、気化を許容することによって、除去される請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記成分が、液体である請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４４】
前記成分が、実質的に水に不溶性である請求項４１乃至請求項４３の何れか１つに記載の方法。
【請求項４５】
前記多孔材料が、多孔の粒子である請求項４１乃至請求項４４の何れか１つに記載の方法。
【請求項４６】
前記多孔粒子が、１μｍを越えない粒子サイズを有するナノ粒子である請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記多孔材料が、多孔のシリカ表面を有している請求項４１乃至請求項４６の何れか１つに記載の方法。
【請求項４８】
前記超臨界流体が、二酸化炭素である請求項４１乃至請求項４７の何れか１つに記載の方法。
【請求項４９】
二つの成分を含有する組成物を調製する方法にして、請求項４５乃至請求項４８に記載の方法によって所定の量の第一の成分を含む多孔粒子を調製する工程と、かかる粒子を液体である第二の成分に添加する工程とを含む方法。
【請求項５０】
前記第一及び第二の成分が、非混和性である請求項４９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公表番号】特表２００７−５３０３９７（Ｐ２００７−５３０３９７Ａ）
【公表日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２００１３（Ｐ２００６−５２００１３）
【出願日】平成１６年７月１６日（２００４．７．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００３１０３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００７２８４
【国際公開日】平成１７年１月２７日（２００５．１．２７）
【出願人】（５０６０１４６７５）ザ ユニヴァーシティー オブ リーディング (1)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＲＥＡＤＩＮＧ
【出願人】（３９１００８９５１）アストラゼネカ・アクチエボラーグ (625)
【氏名又は名称原語表記】ＡＳＴＲＡＺＥＮＥＣＡ ＡＫＴＩＥＢＯＬＡＧ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月１６日（２００４．７．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００３１０３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００７２８４
【国際公開日】平成１７年１月２７日（２００５．１．２７）
【出願人】（５０６０１４６７５）ザ ユニヴァーシティー オブ リーディング (1)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＲＥＡＤＩＮＧ
【出願人】（３９１００８９５１）アストラゼネカ・アクチエボラーグ (625)
【氏名又は名称原語表記】ＡＳＴＲＡＺＥＮＥＣＡ ＡＫＴＩＥＢＯＬＡＧ
【Ｆターム（参考）】
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