本発明は、ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックス；シンタキシンに由来する１本のポリペプチドヘリックス；シナプトブレビンもしくはその相同体に由来する１本のポリペプチドヘリックス；および該ポリペプチドヘリックスに結合させた１もしくは複数のカーゴ部分を含んでなり、ここで、４本のポリペプチドヘリックスが安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成する複合体形成系に関する。本発明はさらに、複合体形成系を作り出す方法および複合体形成系の使用にも関する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、ＳＮＡＲＥ複合体を基礎とする分子足場を形成するための複合体形成系に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
真核細胞内では、小胞融合として知られている過程において、小胞が膜と融合する。例えば、小胞は、細胞原形質膜またはエンドソームもしくはリソソームなどの他の細胞コンパートメントと融合することができる。小胞融合の最も研究された形態は、シナプス後ニューロンの神経インパルスの伝搬を引き起こすように神経伝達物質を放出するための神経細胞のシナプス前膜とシナプス小胞のドッキングである。
【０００３】
小胞融合の過程はＳＮＡＲＥタンパク質（ＳＮＡＲＥ）によって媒介されており、それらは酵母や哺乳動物細胞では６０を超えるメンバーから成る巨大タンパク質スーパーファミリーである。ＳＮＡＲＥは、小さいが、豊富にあり、そして大部分が膜結合タンパク質である。それらは構造とサイズで大きく異なるが、それらはすべて、ＳＮＡＲＥ複合体と呼ばれる密な４本ヘリックス束への集合を可能にするＳＮＡＲＥモチーフと呼ばれるそれらのサイトゾルドメイン内のセグメントを共有する。ＳＮＡＲＥモチーフは、長さが約６０〜７０アミノ酸であると考えられているが（Jahn RおよびScheller RH）、このことは十分に規定されていない。ＳＮＡＲＥ複合体は３種類のタンパク質：シンタキシンおよびＳＮＡＰ−２５（これらは細胞膜に常在している）；ならびにシナプトブレビン（小胞結合膜タンパク質またはＶＡＭＰとも呼ばれる）（これは小胞膜にアンカーされている）、で構成されることもある。
【０００４】
ニューロンのエキソサイトーシスにおいて、シンタキシンとシナプトブレビンは、それらのＣ末端ドメインによってそれらのそれぞれの膜にアンカーされているが、ＳＮＡＰ−２５は、数個のシステインが連結しているパルミトイル鎖を介して原形質膜につなぎ留められている。コアＳＮＡＲＥ複合体は４本のαヘリックス束であって、そこでは、１本のαヘリックスがシンタキシンによってもたらされ、１本のαヘリックスがシナプトブレビンによってもたらされ、そして２本のαヘリックスがＳＮＡＰ−２５によってもたらされる。このＳＮＡＲＥ複合体は、非常に安定していることが分かっている。小胞融合にかかわる分子機構の略図を図１に示している。
【発明の概要】
【０００５】
発明者らは、ＳＮＡＲＥ複合体とその形成がさまざまな適用に使用できることを見出した。そのために、本発明の基礎は：
ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックス；
シンタキシンに由来する１本のポリペプチドヘリックス；
シナプトブレビンもしくはその相同体に由来する１本のポリペプチドヘリックス；および
該ポリペプチドヘリックスに結合させた１もしくは複数のカーゴ部分（cargo moieties）、
を含んでなり、ここで、４本のポリペプチドヘリックスが安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成する複合体形成系である。
【０００６】
本発明の種々の態様において、先の複合体形成系に更なる制限を加えることができる。本発明はさらに、先の複合体形成系を使用した安定なＳＮＡＲＥ複合体を作製する方法、ならびに先の複合体形成系と得られた安定なＳＮＡＲＥ複合体の使用に関する。
【０００７】
本発明の詳細な説明
以下の説明は、本発明の多くの異なった実施形態を提示する。しかしながら、記載したほとんどすべての制限、好ましい特徴および変形形態は、それらがすべて先に記載した複合体形成系に基づいている限り、本発明の他の実施形態に適切であることは、当業者にはすぐに分かるであろう。
【０００８】
一態様において、本発明では分子足場を形成するための複合体形成系を提供するが、その系は：
ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックス；
シンタキシンに由来する１本のポリペプチドヘリックス；
シナプトブレビンもしくはその相同体に由来する１本のポリペプチドヘリックス；および
該ポリペプチドヘリックスに結合させた１もしくは複数のカーゴ部分、
を含んでなり、ここで、４本のポリペプチドヘリックスが安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成し；かつ、ここで、ポリペプチドヘリックスのうちの少なくとも２本が５０アミノ酸未満の長さである。
【０００９】
本発明の他の態様において、複合体形成系が、５０アミノ酸未満の長さであるポリペプチドヘリックスをたった２本しか持たないとは限らない。
本発明は、異なった機能単位を形成する安定した複合体の制御された集合を可能にする。安定した複合体を持つ利点は、複合体が解離するリスクなしに比較的厳しい条件でそれを使用できるという点である。これは、１もしくは複数のカーゴ部分が結合されている（単数もしくは複数の）ヘリックスが複合体の一部のままで残るので、確実に１もしくは複数のカーゴ部分が複合体の残った部分から解離しないようにすることを意味する。
【００１０】
先に示したように、複合体形成系は、安定したＳＮＡＲＥ複合体の形成に基づいている。そのため、本発明の４本のポリペプチドヘリックスには、それらが安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成する限り、ある程度の任意の配列を持つことができる。
【００１１】
ニューロンでは、以下のタンパク質：ＳＮＡＰ−２５；シンタキシン；およびシナプトブレビン、からＳＮＡＲＥ複合体が形成される。これらのタンパク質、および他のＳＮＡＲＥタンパク質は、ＳＮＡＲＥ複合体を形成するのに関与するタンパク質の一部であるＳＮＡＲＥモチーフまたはＳＮＡＲＥドメインを含んでいる。これらのＳＮＡＲＥドメインまたはモチーフが、ＳＮＡＲＥ複合体を形成するために一緒に詰め込まれるヘリックスである。一般的に、ＳＮＡＲＥタンパク質の一部だけが、ＳＮＡＲＥ複合体形成にかかわるが；ＳＮＡＲＥタンパク質全体ではない。例えば、シンタキシンには、ヘッドドメインとしても知られているＣ末端膜貫通ドメイン、ＳＮＡＲＥドメインおよびＮ末端調節ドメインがある。明らかに、ＳＮＡＲＥドメインだけがＳＮＡＲＥ複合体を形成するのに関与する。
【００１２】
「ＳＮＡＲＥモチーフ」や「ＳＮＡＲＥドメイン」といった用語は、当業者にとって周知である。さらに、さまざまな異なったＳＮＡＲＥタンパク質のＳＮＡＲＥモチーフやＳＮＡＲＥドメインもまた当業者に周知である（Jahn R and Scheller RH（2006）；Sieber et al.（2006）；Besteiro（2006））。
【００１３】
本発明の４本のポリペプチドヘリックスは、ＳＮＡＲＥ複合体を形成するＳＮＡＲＥタンパク質、すなわち、ＳＮＡＰタンパク質；シンタキシン；およびシナプトブレビンもしくはその相同体、のＳＮＡＲＥドメインまたはモチーフに基づいている。そのため、一実施形態において、複合体形成系は：ＳＮＡＰタンパク質のＳＮＡＲＥモチーフに由来する２本のポリペプチドヘリックス；シンタキシンのＳＮＡＲＥモチーフに由来する１本のポリペプチドヘリックス；およびシナプトブレビンもしくはその相同体のＳＮＡＲＥモチーフに由来する１本のポリペプチドヘリックスを含んでなり；ここで、４本のポリペプチドヘリックスが安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成する。本発明のヘリックスは、ＳＮＡＲＥタンパク質からのＳＮＡＲＥモチーフまたはドメインと同じ長さである必要があるとは限らない。本発明の他のヘリックスと複合体を形成するときに、それが安定したＳＮＡＲＥ複合体をまだ形成できている限り、それは長さがもっと短くてもよい。
【００１４】
２本のポリペプチドヘリックスがそれに由来するＳＮＡＰタンパク質は、ＳＮＡＲＥ複合体の一部を形成できるあらゆるＳＮＡＰタンパク質であることができる。当業者は、ＳＮＡＲＥ複合体の一部を形成できるさまざまなＳＮＡＰタンパク質を知っている。例えば、ＳＮＡＰタンパク質は、ＳＮＡＰ−２５Ａ、ＳＮＡＰ−２５Ｂ、ＳＮＡＰ−２３（シンデット（syndet）としても知られている）、またはＳＮＡＰ−２９であり得る。好ましくは、ＳＮＡＰタンパク質はα−ＳＮＡＰではない。好ましくは、ＳＮＡＰタンパク質は、ＳＮＡＰ−２５、すなわち、ＳＮＡＰ−２５ＡまたはＳＮＡＰ−２５Ｂである。ＳＮＡＰタンパク質は２つのＳＮＡＲＥモチーフを含んでいる。そのため、２本のポリペプチドヘリックスが、特定のＳＮＡＰタンパク質内の２つのＳＮＡＲＥモチーフに由来することもある。あるいは、２本のポリペプチドヘリックスが、異なったＳＮＡＰタンパク質に由来することもある。好ましくは、それらは同じＳＮＡＰタンパク質に由来する。
【００１５】
ポリペプチドヘリックスがそれに由来するシンタキシン・タンパク質は、ＳＮＡＲＥ複合体の一部を形成できるあらゆるシンタキシン・タンパク質であることができる。当業者は、ＳＮＡＲＥ複合体の一部を形成できるさまざまなシンタキシン・タンパク質を知っている。例えば、シンタキシン・タンパク質は、シンタキシン１Ａ、シンタキシン１Ｂ、シンタキシン２（エピモルフィン（epimorphin）としても知られている）、シンタキシン３およびシンタキシン４、シンタキシン５、シンタキシン６、シンタキシン７、シンタキシン８、シンタキシン１０、シンタキシン１１、シンタキシン１３、シンタキシン１７またはシンタキシン１８から選択され得る。好ましくは、シンタキシン・タンパク質は、シンタキシン１Ａまたは３である。
【００１６】
ポリペプチドヘリックスがそれに由来するシナプトブレビン・タンパク質またはその相同体は、ＳＮＡＲＥ複合体の一部を形成できるあらゆるシナプトブレビン・タンパク質またはその相同体であることができる。当業者は、ＳＮＡＲＥ複合体の一部を形成できるさまざまなシナプトブレビン・タンパク質とその相同体を知っている。シナプトブレビンは、小胞結合膜タンパク質（ＶＡＭＰ）ファミリーのメンバーである。他のＶＡＭＰタンパク質がＳＮＡＲＥ複合体を形成できることは知られているので、そのため、ポリペプチドヘリックスを得ることができる基礎を提供するのに好適であり得る。一実施形態において、シナプトブレビンの相同体は、ＳＮＡＲＥ複合体の一部を形成できるＶＡＭＰタンパク質である。そういったＶＡＭＰタンパク質は、当業者に周知である。シナプトブレビン・タンパク質またはその相同体は、シナプトブレビン１、シナプトブレビン２、シナプトブレビン３（セルブレビンとしても知られている）およびシナプトブレビン７（ＴＩ−ＶＡＭＰとしても知られている）から選択され得る。好ましくは、ポリペプチドヘリックスは、シナプトブレビン・タンパク質に由来する。好ましくは、シナプトブレビン・タンパク質は、シナプトブレビン１、２または３である。
【００１７】
ＳＮＡＲＥタンパク質の起源である生物体は、ＳＮＡＲＥ複合体が利用されているあらゆる好適な生物体であることができる。例えば、そのタンパク質は：哺乳動物、例えばヒトなど、霊長動物、齧歯動物；魚類；および無脊椎動物、例えばハエなどが起源であり得る。任意に、ＳＮＡＲＥタンパク質は酵母由来であってもよい（Rossi G et al.（1997））。ＳＮＡＲＥタンパク質の起源である生物体は、複合体形成系の適用によって決まることもある。例えば、医療応用のためには、ＳＮＡＲＥタンパク質はヒト起源であることが好ましい。
【００１８】
本発明の４本のポリペプチドヘリックスは、ＳＮＡＲＥ複合体を形成するＳＮＡＲＥタンパク質に由来する。ＳＮＡＲＥ複合体を形成するＳＮＡＲＥタンパク質のＳＮＡＲＥモチーフまたはドメインのヘリックスは、通常長さが約６０〜７０アミノ酸である。先に示したとおり、本発明の４本のポリペプチドヘリックスは、ＳＮＡＲＥタンパク質のＳＮＡＲＥモチーフまたはＳＮＡＲＥドメインに由来する。「由来する」という用語は、ポリペプチドヘリックスの配列が、それが安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成することができるようなＳＮＡＲＥドメイン／モチーフの配列またはその一部と実質的に同じであることを意味する。好ましくは、ポリペプチドヘリックスの配列は、選択されたＳＮＡＲＥドメイン／モチーフまたはその一部の配列と少なくとも約８０％の配列同一性を有するべきである。より好ましくは、配列同一性は、少なくとも約８５％、そしてよりいっそう好ましくは少なくとも約９０％であるべきである。一実施形態において、配列同一性は、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％であり得るか、または１００％でさえあり得る。しかしながら、いくつかの実施形態において、選択されたＳＮＡＲＥドメイン／モチーフまたはその一部の配列と異なっていることがポリペプチドヘリックスの配列にとって望ましいこともある。これは、タンパク質の発現、タンパク質の精製または下流適用に関して有益であり得る。例えば、そして限定することなしに、これには、精製できるようにするための配列のいずれかの末端におけるヒスチジン残基の付加、または表面またはカーゴへのペプチドの機能性結合のための追加のリジンまたはシステイン残基の組み込みが含まれ得る。
【００１９】
２つのＳＮＡＰ由来ヘリックスは、配列番号１、２、５、６、２４、４１、４８、４９、５０、５１、６４および６５から選択される配列を含み得る。
シンタキシン由来ヘリックスは、配列番号３、７、９、２５、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４６、４７、６０、６１、６２および６６から選択される配列を含み得る。
シナプトブレビンもしくはその相同体に由来するヘリックスは、配列番号４、８、２７、２８、２９、３０、３１、４２、４３、４４、４５、５２、５３、６７、６８および６９から選択される配列を含み得る。
さらに、ＳＮＡＲＥタンパク質に由来するヘリックスは、先の配列から成ることができる。
加えて、本発明のヘリックスは、配列番号１〜９、１２〜１５および１８〜６９から選択される配列を含み得るか、またはそれらから成ることができる。
【００２０】
それぞれのポリペプチドヘリックスは、それが他のヘリックスと相互作用して安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成するために十分に長くなくてはならない。実際には、このことは、ポリペプチドヘリックスが安定したＳＮＡＲＥ複合体の形成を可能にするのに十分に長いＳＮＡＲＥモチーフ／ドメイン部に由来しなければならないことを意味する。安定したＳＮＡＲＥ複合体の形成を可能にするのに十分に長いポリペプチドヘリックスか否かを試験することは、比較的に単純であり、そして十分に当業者の能力の範疇にある。これは、ポリペプチドヘリックスを他の３本のポリペプチドヘリックスと複合体形成させ、そして得られたＳＮＡＲＥ複合体が悪条件下で解離するか否か調べるために試験することによって行うことができる。悪条件は、一般に、タンパク質複合体やタンパク質−タンパク質相互作用の解離を引き起こす条件である。そういった条件は当業者にはすぐに分かるであろう。例えば、そういった悪条件は、複合体を強い界面活性剤または破壊性の界面活性剤（disrupting detergent）に晒すことであり得る。一実施形態において、ＳＮＡＲＥ複合体は、それが変性ＳＤＳ濃度（＞０．０２％）の存在下で実施されるＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用することによって安定しているか否かを測定するために試験されることができる。もし複合体がその構成要素に分かれるようにゲル中のＳＤＳによって解離されるのであれば、このＳＮＡＲＥ複合体は安定していないかもしれない。しかしながら、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを通して移動させ、そして、例えばクーマシー染色を使用するなどして検出できたときに、ＳＮＡＲＥ複合体が解離せずに、単一の実体として残っているのであれば、それは安定していると見なされることができる。そのため、一実施形態において、ＳＮＡＲＥ複合体がＳＤＳを使用しても解離しないのであれば、安定していると見なされることができる。好ましくは、ＳＮＡＲＥ複合体は、約２％のＳＤＳを含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のゲルサンプルバッファーを使用した場合でも安定している。より好ましくは、ＳＮＡＲＥ複合体は、約０．１％のＳＤＳを含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のゲルを使用した場合でも安定している。これは、約０．１％のＳＤＳを含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のゲルを使用して行われることができる。
【００２１】
あるいは、ＳＮＡＲＥ複合体の安定性は、ビーズ・プルダウン法によって確かめられる。もし複合体形成系の一成分が化学量論的様式ですべての相互作用パートナーを沈降させるのであれば、ＳＮＡＲＥ複合体が安定していると見なされる。ビーズ・プルダウン法は、当業者に周知である（Rickman C. et al.（2004））。
タンパク質−タンパク質相互作用の表面プラズモン共鳴測定もまた、使用され、そして当業者に周知である（Karlsson & Falt（1997））。表面プラズモン共鳴法を使用した場合、当業者が表面プラズモン共鳴シグナルの減少によって証明される解離を観察しなければ、ＳＮＡＲＥ複合体が安定していると見なされる。
【００２２】
ＳＮＡＲＥ複合体が安定しているか否かを測定する別の方法は、複合体の解離定数を測定することである。これは複合体からの１本のヘリックスの解離に関する解離定数である。安定したＳＮＡＲＥ複合体は、１０^-7Ｍ未満の解離定数を有するはずである。特定の実施形態において、安定したＳＮＡＲＥ複合体は、１０^-8、１０^-9、１０^-10、１０^-11、１０^-12、１０^-13、１０^-14、または１０^-15Ｍ未満の解離定数を有するべきである。複合体形成系が使用される適用によって、異なった解離定数を有することが有益である可能性がある。そのため、いくつかの実施形態において、解離定数は、１０^-7Ｍ〜１０^-11Ｍまたは１０^-7Ｍ〜１０^-10Ｍであり得る。あるいは、解離定数は、抗体解離定数（６〜１０×１０^-8Ｍ）に匹敵し得る。
ＳＮＡＲＥ複合体形成はさらに、完全に形成されたＳＮＡＲＥ複合体に結合するコンプレキシンに結合することによって評価されることもできる（Hu et al.（2002））。
【００２３】
一実施形態において、本発明のポリペプチドヘリックスは、長さが少なくとも約２５アミノ酸である。そういったヘリックスを使用したＳＮＡＲＥ複合体は、溶液中で形成できる。しかしながら、それらはＳＤＳ抵抗性でない可能性がある。好ましくは、本発明のポリペプチドヘリックスは、長さが少なくとも約３０または約３５アミノ酸である。より好ましくは、本発明のポリペプチドヘリックスは、長さが少なくとも約４０アミノ酸である。そういったヘリックスを使用して形成されたＳＮＡＲＥ複合体は、ほとんどの場合、ＳＤＳ抵抗性である。あるいは、ポリペプチドヘリックスは、長さが少なくとも約４５アミノ酸であり得る。
【００２４】
一実施形態において、ポリペプチドヘリックスのうちの少なくとも１本が、５０アミノ酸未満の長さである。この利点は、長さが５０アミノ酸未満のポリペプチドを人工的に製造することの方がずっと容易であるという点である。５０アミノ酸未満であるポリペプチドヘリックスは、いずれのポリペプチドヘリックスでもあり得る。好ましくは、ポリペプチドヘリックスのうちの少なくとも２本が、５０アミノ酸未満の長さである。好ましくは、それらは、シンタキシンおよびシナプトブレビンもしくはその相同体に由来するポリペプチドヘリックスである。
【００２５】
代替の実施形態において、ポリペプチドヘリックスのうちの３または４本が、５０アミノ酸未満の長さであり得る。そういった実施形態において、あらゆるヘリックスの組み合わせが、５０アミノ酸未満の長さであり得る。発明者らは、それぞれのＳＮＡＲＥタンパク質のＳＮＡＲＥモチーフの最小ペプチド配列で高親和性の安定した４本ヘリックス束ＳＮＡＲＥ複合体を形成するのに十分であることを驚いたことに見出した。このことは、ペプチドの製造の容易さに関して有利である。さらに、各最小配列はカーゴを運搬できるので、それは機能性を保持している。
【００２６】
２本のポリペプチドヘリックスが５０アミノ酸未満の長さである場合には、好ましくは、それは、５０アミノ酸未満の長さである、シンタキシンに由来するヘリックスおよびシナプトブレビンもしくはその相同体に由来するヘリックスである。
【００２７】
本発明の４本のポリペプチドヘリックスは、ほぼ同じ長さであっても、異なる長さであってもよい。例えば、一実施形態において、それらはすべて約４５アミノ酸の長さであり得る。あるいは、ポリペプチドヘリックスは異なった長さであり得る。
【００２８】
本発明の一実施形態において、シンタキシンに由来するポリペプチド、および／またはシナプトブレビンもしくはその相同体に由来するポリペプチドは、膜または脂質二重層へのＳＮＡＲＥ複合体の固定化を可能にする膜結合配列をさらに含み得る。そういった膜結合配列は、当業者に周知である。例えば、シンタキシンとシナプトブレビンの天然配列は、タンパク質が小胞や細胞膜に結合できるようにする膜貫通部分を含んでいる（Kasai and Akagawa（2001）およびLaage et al.（2000））。そのため、一実施形態において、シンタキシンに由来するポリペプチドヘリックスは、該ポリペプチドヘリックスを膜または脂質二重層に固定するためのシンタキシン膜貫通ドメインに由来する膜結合配列をさらに含み得る。同様に、シナプトブレビンもしくはその相同体に由来するポリペプチドヘリックスは、該ポリペプチドヘリックスを膜または脂質二重層に固定化するためのシナプトブレビンもしくはその相同体の膜貫通ドメインに由来する膜結合配列をさらに含み得る。
【００２９】
安定したＳＮＡＲＥ複合体は、通常タンパク質複合体およびタンパク質−タンパク質相互作用の解離を引き起こす悪条件下でも分離しないものである。これは、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ビーズ・プルダウン法、固定化されたタンパク質の表面プラズモン共鳴法、解離定数またはコンプレキシン結合を使用して計測することができる。このことについては、先にさらに詳細に議論している。
【００３０】
ＳＮＡＲＥ複合体はよく研究され、そして当業者に周知であるので、当業者は、特定のタンパク質が本発明における使用に好適であるかどうか、そして安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成するように本発明のポリペプチドヘリックスを作り出すために、どのようにこれらのタンパク質およびそれらの配列を操作するかを確立することができるであろう。
【００３１】
１もしくは複数のカーゴ部分は、当業者がポリペプチドヘリックスに結合させたい可能性があるあらゆる成分であり得る。１もしくは複数のカーゴ部分は、複合体形成系の中のヘリックスの末端に結合させるのが好ましい。カーゴ部分は、小分子、小分子、ポリペプチド、タンパク質、核酸または誘導体を含む重合体、および粒子またはナノ粒子から選択され得る。例えば、カーゴ部分は、以下のとおりであり得る：
【００３２】
１．小分子、または小分子を含む重合体、例えば以下のものなど：
−アフィニティータグ、例えばビオチン；
−治療薬、例えば毒素または薬物；
−更なる／下流の架橋、重合および更なる誘導体化のための反応基、例えばアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、グアニジン基、フェノール基、チオエーテル基、イミダゾール基、インドール基など；
−更なる修飾形態に好適な自発的反応基、例えばＳＨ基を架橋するためのマレイミドもしくは誘導体、または架橋するのに好適なその他の化学物質；
−表面に直接結合させるための分子、例えば金属面への結合のためのＳＨ含有分子；
【００３３】
−造影試薬、例えばＵＶ、ＶＩＳ、ＩＲ、ラマン、ＮＭＲ、ＭＲＩ、ＰＥＴ、Ｘ線または他の造影法のための蛍光または吸収性の成分；
−生物学的関連リガンド、例えば受容体結合性／標的化に関するもの；
−生物学的関連基質、例えばリン酸化または他のＰＴＭ部位；
−生物学的関連分子、例えば脂質または炭水化物；
−保護基または分子、例えばＰＥＧ；
−金属キレート化化合物；
【００３４】
２．ポリペプチドまたはタンパク質、例えば以下のものなど：
−結合ペプチド、ホルモン、毒素など；
−機能性部位、例えばプロテアーゼ消化部位、を含むポリペプチドまたはタンパク質；
−標的化機能性ペプチド、例えば異なったオルガネラの標的化、（トランスフェクションのための）核標的化、（薬物送達のための）細胞内標的化などのためのもの；
−ペプチド親和性タグ、例えばＦｌａｇ、Ｍｙｃ、ＶＳＶ、ＨＡ、６ｘＨｉｓ、８ｘｈｉｓ、ポリ−Ｈｉｓなど；
【００３５】
−タンパク質−タンパク質相互作用を形成することができるポリペプチドまたはタンパク質、例えばＰＤＺ、ＳＨ２／３；
−抗体、抗体フラグメント、抗体模倣物、ＲＮＡもしくはペプチド・ベースのアプタマー、または別のアフィニティー試薬（タンパク質性または非タンパク質性のもの）；
−酵素、例えば研究、診断（一部の適用のために複合体形成系が酵素を固定化するために使用できる）および治療への適用のためのもの、プロモーター、ポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、または他の修飾酵素を含めた核酸合成または増幅のためのもの；
【００３６】
３．核酸または誘導体、例えば以下のものなど：
−検出、固定化、ハイブリダイゼーション、合成プライマー、合成および増幅、標識化、シグナル検出およびシグナル増幅、転写ならびに翻訳のためのＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＰＮＡ；そして
【００３７】
４．粒子またはナノ粒子、例えば以下のものなど：
−強磁性粒子またはナノ粒子（分離のためのもの）；
−デンドリマー（標識化のためのもの）；
−金属粒子またはナノ粒子、例えば染色もしくは標識化のための金または銀；
−半導体粒子またはナノ粒子、例えば標識化および検出のための量子ドット；
−重合体マイクロまたはナノ粒子、例えば樹脂、ゲルなど；
−カーボンナノチューブまたはナノワイヤー。
【００３８】
一実施形態において、多数のカーゴ部分をポリペプチドヘリックス末端に結合させることができる。ポリペプチドヘリックス末端に結合させることができるカーゴ部分の数は、ヘリックスにいくつの遊離末端が存在しているかによるであろう。例えば、複合体形成系が４つの別々のポリペプチドヘリックスを含む場合には、該ヘリックスは８つの遊離末端（それぞれのヘリックスの各末端に１つずつ）を持つであろう。そのため、８つの遊離末端のそれぞれにカーゴ部分を結合させることが可能である。このことは、１、２、３、４、５、６、７または８個のカーゴ部分をヘリックスの遊離末端に結合させることができることを意味する。一部のヘリックスに遊離末端がない場合には、例えばヘリックスのうちの２本が１本になっているかまたは１本のヘリックスが基材に結合されているのであれば、遊離末端の数は少なくなる。このことは、ヘリックス末端に結合できるカーゴ部分の数を少なくするであろう。一実施形態において、２個以上のカーゴ部分をヘリックス末端に結合することができる。
【００３９】
特定の実施形態において、第１のカーゴ部分を第１のヘリックス末端に結合させ、そして第２のカーゴ部分を第２のヘリックス末端に結合させる。そういったある実施形態において、第１および第２のカーゴ部分は、同じヘリックスまたはヘリックス含有成分に一緒に結合させるべきでない。それらは、別個のヘリックスまたはヘリックス含有成分に結合させるべきである。例えば、２つのカーゴ部分を、２つの単一の独立したヘリックスに結合させることができる。
【００４０】
シンタキシンに由来するポリペプチドヘリックスが、シナプトブレビンもしくはその相同体に由来するポリペプチドヘリックスと連結されている場合（後でより詳細に記載する）、第１および第２のカーゴ部分を共に、この二重らせん成分に結合させるべきでない。代わりに、第１のカーゴ部分をシナプトブレビン／シンタキシン融合タンパク質に結合させることができ、そして第２のカーゴ部分をＳＮＡＰタンパク質に由来するヘリックスのうちの一方に結合させることができる。
【００４１】
複合体形成系の４本のポリペプチドヘリックスが一体化して、２本のヘリックス含有成分（後で詳細に記載する）を形成している場合、第１のカーゴ部分は第１のヘリックス含有成分に結合させるべきであり、そして第２のカーゴ部分は第２のヘリックス含有成分に結合させるべきである。
【００４２】
一実施形態において、第１のカーゴ部分は、酵素的または造影成分である。他の実施形態において、第２のカーゴ部分は、特定の標的、例えば特定の細胞型または特定の受容体に対して複合体形成系を標的化するためのリガンドである。好ましくは、同じ実施形態において、第１のカーゴ部分は、酵素的または造影成分であり、そして第２のカーゴ部分は、特定の標的、例えば特定の細胞型または特定の受容体に対して複合体形成系を標的化するためのリガンドである。
【００４３】
酵素的作用物質または造影剤は、あらゆる好適な作用物質であり得る。造影剤は、ヘリックスに結合でき、そしてヘリックスの位置を画像化できるようにするあらゆる作用物質、例えばＧＦＰ蛍光タグ、蛍光標識ペプチド、およびＭＲＩ造影剤、である。酵素的作用物質は、酵素またはその機能部のいずれかであることができる。一実施形態において、酵素的作用物質または造影剤は酵素的作用物質である。具体的な実施形態において、酵素的作用物質は、ボツリヌス毒素の軽鎖またはその機能部を含んでなる。ボツリヌス毒素の軽鎖の機能は、エンドペプチダーゼとしての機能である。そのため、ボツリヌス毒素の軽鎖の機能部は、エンドペプチダーゼ活性を保持する部分である。好ましくは、酵素的作用物質はボツリヌス毒素の軽鎖を含んでなる。ボツリヌス毒素の軽鎖は、あらゆるボツリヌス毒素からのものであり得る。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧ型の７つの異なる型のボツリヌス毒素が存在する。好ましくは、軽鎖はボツリヌス毒素ＡまたはＥ型からのものであり、そしてより好ましくは、軽鎖はボツリヌス毒素Ａ型からのものである。
【００４４】
好ましくは酵素的作用物質は、ボツリヌス毒素の軽鎖またはその機能部およびボツリヌス毒素の重鎖の転座部（translocation portion）を含んでなる。ボツリヌス毒素の重鎖の転座部は、それに付随している軽鎖が小胞から細胞のサイトゾル内に放出されるようにする。当業者は、「ボツリヌス毒素の重鎖の転座部」という用語が何を意味するか容易に理解し、そしてそれはまた、転座ドメインと呼ばれることもある。ボツリヌス毒素の重鎖の転座部は、あらゆるボツリヌス毒素からのものであり得る。好ましくは、転座部は、ボツリヌス毒素ＡまたはＥ型、そしてより好ましくはボツリヌス毒素Ａ型からのものである。軽鎖またはその機能部および転座部は、同じであるかまたは異なるボツリヌス毒素からのものであることができる。好ましくは、軽鎖またはその機能部および転座部は、同じボツリヌス毒素からのものである。軽鎖またはその機能部および転座部は、任意の好適な方法で連結されていてもよい。好ましくは、それらは、天然に存在するボツリヌス毒素のように、ジスルフィド結合形成を介して連結されている。ボツリヌス毒素の軽鎖またはその機能部およびボツリヌス毒素の重鎖の転座部がアミノ酸鎖間のペプチド結合によって連結されているのであれば、好ましくは、ボツリヌス毒素の軽鎖またはその機能部とボツリヌス毒素の重鎖の転座部の間のアミノ酸配列に、２つの部分の間のアミノ酸配列の開裂を引き起こすようにプロテアーゼによって認識されるニッキング部位が存在する。一実施形態において、ニッキング部位は、トロンビンによって開裂されることができるトロンビン部位である。ボツリヌス毒素の軽鎖またはその機能部およびボツリヌス毒素の重鎖の転座部は、ＳＮＡＰタンパク質に由来するポリペプチドヘリックスのうちの一方に結合され得る。
【００４５】
ボツリヌス毒素の軽鎖の配列は、配列番号７０に示されている配列を含み得る。
ボツリヌス毒素の重鎖の転座部の配列は、配列番号７１に示されている配列を含み得る。
【００４６】
カーゴ部分がリガンドである場合には、それは、特定の標的、例えば特定の細胞型または特定の受容体、に対して複合体形成系を標的化するための好適なリガンドのいずれかである。当業者にとって、そういったリガンドは周知である。例えば、リガンドは、細胞表面受容体に結合することを可能にし得る。そういったリガンドには、神経ペプチド、例えばサブスタンスＰ、神経ペプチドＹおよびＶＩＰなど、増殖因子、例えばＮＧＦやＢＤＮＦなど、ならびにホルモン、例えば下垂体ホルモン（例えばＡＣＴＨ、ＴＳＨ、ＰＲＬ、ＧＨ、エンドルフィン、ＦＳＨ、ＬＨ、オキシトシン、ＡＤＨおよびＡＶＰ）、ＧＮＲＨおよびＣＧＲＰなどを含むことができた。特定の実施形態において、リガンドは、ソマトスタチン・ペプチドであるか、またはソマトスタチン・ペプチドがソマトスタチン受容体に結合できるようにするその機能部である。他の実施形態において、リガンドは、サブスタンスＰペプチドであるか、またはサブスタンスＰペプチドがニューロキニン受容体に結合できるようにするその機能部であり得るか、あるいは、ＡＶＰペプチドであるか、またはＡＶＰペプチドがＡＶＰ受容体に結合できるようにするその機能部であり得る。代替の実施形態において、リガンドは、ボツリヌス毒素の重鎖の受容体結合部であってもよい。ボツリヌス毒素の重鎖の受容体結合部は、ニューロンのガングリオシドの認識に関与し、そしてシナプス小胞受容体であるＳＶ２Ｃに結合し、そして毒素が細胞内に取り込まれるようにする。「ボツリヌス毒素の重鎖の受容体結合部」という用語は、当業者に容易に理解されるであろうし、また受容体結合ドメインとも呼ばれている。受容体結合部は、あらゆるボツリヌス毒素からのものであることができる。好ましくは、受容体結合部は、ボツリヌス毒素ＡまたはＥ型からのものであり、そしてより好ましくは、受容体結合部は、ボツリヌス毒素Ａ型からのものである。一実施形態において、ボツリヌス毒素の重鎖の受容体結合部を、シナプトブレビンもしくはその相同体に由来するポリペプチドヘリックスに結合させる。
【００４７】
ボツリヌス毒素の重鎖の受容体結合部の配列は、配列番号７２に示されている配列を含み得る。
本発明はさらに、治療法および／または診断での使用のための先の複合体を提供する。治療法および／または診断の正確な性質は、リガンドと酵素的作用物質／造影剤の素性によるであろう。
【００４８】
第１のカーゴ部分が第１のヘリックスの末端に結合され、そして第２のカーゴ部分が第２のヘリックス末端に結合されている一実施形態において、第１のカーゴ部分は、ボツリヌス毒素の軽鎖またはその機能部を含んでなる酵素的作用物質およびボツリヌス毒素の重鎖の転座部であり、そして第２のカーゴ部分は、ボツリヌス毒素の重鎖の受容体結合部であるリガンドである。代替の実施形態において、第１のカーゴ部分は、ボツリヌス毒素の軽鎖またはその機能部を含んでなる酵素的作用物質およびボツリヌス毒素の重鎖の転座部であり、そして第２のカーゴ部分は、ソマトスタチン・ペプチドまたはその機能部であるリガンドである。
【００４９】
１もしくは複数のカーゴ部分は、ヘリックス末端に直接連結されていても、リンカーを介して結合されていてもよい。好適なリンカーは当業者に周知である。例えば、これは、化学的に行われ得るか、またはカーゴ部分がタンパク質またはポリペプチドであれば、遺伝子組み換えによって行われ得る。カーゴ部分は、リンカーを介して結合させることもできる。そういったリンカーは当業者に周知である。
【００５０】
４本のポリペプチドヘリックスは、それらがＳＮＡＲＥ複合体を形成するまではどのような形であっても一体化されない４本の別々のヘリックスであり得る。一実施形態において、複合体形成系が３つの別個の成分を含んでなるように（以下、三成分系とも呼ばれる）、ヘリックスのうちの２本が一体化され得る。前記２本のヘリックスは、その２本のヘリックスが同じ安定したＳＮＡＲＥ複合体に集合できる限り、あらゆる好適な方法で一体化され得る。前記２本のヘリックスは、遺伝子組み換え手段によって一体化され得るか、または化学的にカップリングされ得る。２本のヘリックスは、リンカーを介して一体化され得る。「連結」という用語は、ヘリックスの線状結合を意味する（これは「ジッパリング（zippering）」と同様の平行方向で起こるヘリックスの結合とは対照的である）。２本のヘリックスが一体化することは、複合体形成系を簡素化するのに役立つ。いずれの２本のヘリックスも一体化され得る。一実施形態において、ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックスが、一体化される。この利点は、そのタンパク質内に２本のポリペプチドＳＮＡＲＥヘリックスを含んでなる完全長ＳＮＡＰタンパク質、例えば完全長ＳＮＡＰ−２５タンパク質が使用できるという点である。あるいは、シンタキシンに由来するポリペプチドヘリックスが、シナプトブレビンもしくはその相同体に由来するポリペプチドヘリックスに連結され得る。
【００５１】
他の実施形態において、２本のヘリックスが一体化されていると同時に、他の２本のヘリックスもまた一体化されている。これは、２つの別個の成分を含んでなる複合体形成系（以下、二成分系とも呼ばれる）を作り出し、そして系をさらに簡素化する。二組のヘリックスは、それらが安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成し続けられる限り、あらゆる好適な方法で一体化され得る。例えば、二組のヘリックスは、遺伝子組み換え手段によって一体化され得るか、または化学的にカップリングされ得る。一組または双方のヘリックスは、リンカーを介して一体化され得る。あらゆるヘリックスの組み合わせでも、一体化されて、二組の２本のヘリックスを形成できる。好ましくは、ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックスが一体化され、そしてシンタキシンとシナプトブレビンもしくはその相同体に由来するヘリックスが一体化される。このことは、完全長ＳＮＡＰタンパク質、例えばＳＮＡＰ−２５などを使用できるようにする。
【００５２】
代替の二成分系では、ヘリックスのうちの３本を一体化できる。３本のヘリックスは、それらが第４のヘリックスと安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成し続けられる限り、あらゆる好適な方法で一体化され得る。例えば、３本のヘリックスは、遺伝子組み換え手段によって一体化され得るか、または化学的にカップリングされ得る。３本のヘリックスを、２本のヘリックスまたは３本のヘリックスすべての間のリンカーと一体化し得る。いずれの３本のヘリックスも一体化し得る。好ましくは、ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックスが、第３のヘリックス、すなわち、シンタキシンに由来するヘリックスまたはシナプトブレビンもしくはその相同体に由来するヘリックス、と共に一体化される。特定の実施形態において、ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックスが、シナプトブレビンもしくはその相同体に由来するポリペプチドヘリックスと共に一体化される。代替の実施形態において、ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックスが、シンタキシンに由来するポリペプチドヘリックスと共に一体化される。一実施形態において、カーゴ部分を、第４の単一のヘリックスに結合させる、例えばＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックスがシナプトブレビンもしくはその相同体に由来するポリペプチドヘリックスと共に一体化される場合には、シンタキシンに結合させる。
【００５３】
これらの二成分系が抗体−抗原相互作用に類似した親和性適用に使用できる二成分試薬であることは、当業者にはすぐに分かるであろう。例えば、ＦＬＡＧエピトープを着目のタンパク質に結合させ、そしてその同族抗体によって認識されることができるのと同程度に、シンタキシン由来タグを着目のタンパク質に結合させ、そしてＳＮＡＰ−２５とシナプトブレビン・ヘリックスから成る三重らせん構築物によって認識させることができる。三重らせんＳＮＡＲＥ構築物と単独のＳＮＡＲＥタグとの相互作用の親和性は、タンパク質の固定化できる程度であり得るか、他の適用のために可逆的であり得る。三重らせん構築物が抗体よりも安価に構築できるので、このことは有利である。
【００５４】
シンタキシン３のヘッドドメインがＳＮＡＲＥ集合からそのＳＮＡＲＥモチーフを保護することが知られているが、特定の界面活性剤および／または脂質はＳＮＡＲＥ集合のためにシンタキシンを「開状態にする」ことができる（Darios and Davletov（2006）；Rickman and Davletov（2005））。そのため、シンタキシン由来ヘリックスがそれに結合しているシンタキシン・ヘッドドメインを持っている一実施形態において、その系は、界面活性剤、好ましくは弱い界面活性剤、例えば安定したＳＮＡＲＥ複合体の形成を可能にするようにシンタキシン分子を開状態にするオクチルグルコピラノシドなど、をさらに含んでなる。これは、シンタキシンＳＮＡＲＥモチーフを制御することを可能にし、そのため、ＳＮＡＲＥ複合体の形成の調整を可能にする。
【００５５】
さらに、前記の系は、シンタキシン３のヘッドドメインがシンタキシンに由来するポリペプチドに結合されているかどうかにかかわらず、界面活性剤をさらに含み得る。発明者らは、界面活性剤の存在が、本発明のＳＮＡＲＥ複合体の集合の促進を助長することを見出した。好ましくは、その界面活性剤は弱い界面活性剤である。一部の集合は、界面活性剤の不存在下でも起こるが、界面活性剤の存在がＳＮＡＲＥ複合体のより効果的な集合を促進する。好ましくは、界面活性剤は、界面活性剤がミセルを形成し始める濃度である臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を超える濃度にて存在する。好ましくは、界面活性剤には、７〜１２個の炭素原子の長さを有する炭素鎖がある。好ましくは、界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００でもＴｈｅｓｉｔでもない。好適な界面活性剤は、ＭＥＧＡ８、Ｃ−ＨＥＧＡ１０、Ｃ−ＨＥＧＡ１１、ＨＥＧＡ９、ヘプチルグルコピラノシド、オクチルグルコピラノシド、ノニルグルコピラノシド、zwittergent 3-08、zwittergent 3-10、およびzwittergent 3-12から成る群から選択できる。好ましくは、界面活性剤はオクチルグルコピラノシドである。界面活性剤、そして特に弱い界面活性剤を含んでなる系の利点は、ＳＮＡＲＥ複合体の制御された、より速い集合を可能にする点である。他のタンパク質の相互作用が界面活性剤によって乱されるので、界面活性剤の存在はさらにＳＮＡＲＥ複合体の形成が優先的に助長できた。
【００５６】
一実施形態において、ヘリックスのうちの１本は、基材上に固定化されることができる。好ましくは、ヘリックスは基材上に固定化される。ヘリックスはいずれの好適な方法でも固定化でき、そしてそういった方法は当業者に周知である。ヘリックスは、リンカーを介して固定化することもできる。基材は、ヘリックスを固定化するのに好適なあらゆる基材であることができる。例えば、基材は、表面、マトリックス、ビーズ、量子ドット、樹脂、ガラス、金属、重合体、顕微鏡用スライド、アレイまたはナノチューブ、例えばカーボンナノチューブなどであり得る。一実施形態において、基材上に固定化されたヘリックスには、カーゴ部分が結合されない。
【００５７】
他の実施形態において、複合体形成系は、コンプレキシンに由来する１本のポリペプチドヘリックスをさらに含むことができる。ポリペプチドヘリックスそこから得られるコンプレキシンタンパク質は、ＳＮＡＲＥ複合体に結合できるあらゆるコンプレキシンタンパク質であることができる。当業者は、ＳＮＡＲＥ複合体に結合できるさまざまなコンプレキシンタンパク質を知っている。例えば、コンプレキシンタンパク質は、哺乳動物のコンプレキシン１またはコンプレキシン２アイソフォームから選択され得る。コンプレキシンタンパク質に由来するヘリックスの他の望ましい特徴および特性（例えばサイズ）は、他のヘリックスに関するものと同じである。コンプレキシンに由来するヘリックスは、任意に１または２個のカーゴ部分を運搬し得る。また、コンプレキシン部分は形成されたＳＮＡＲＥ複合体に結合するだけなので、それはまた集合した複合体を特異的に精製するのに使用することもできる。
【００５８】
コンプレキシンに由来するヘリックスは、配列番号６３に示されている配列を含むこともできる。コンプレキシンに由来するヘリックスは、この配列から成ることもできる。
【００５９】
本発明の代替の実施形態は、シンタキシンに由来するポリペプチドヘリックスが、シナプトブレビンもしくはその相同体に由来するポリペプチドヘリックスに連結されたＳＮＡＲＥ複合体に向けられる。この実施形態において、分子足場を形成するための複合体形成系を提供するが、その系は：
ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックス；
シンタキシンに由来する１本のポリペプチドヘリックス；
シナプトブレビンもしくはその相同体に由来する１本のポリペプチドヘリックス；および
該ポリペプチドヘリックスに結合させた１もしくは複数のカーゴ部分、
を含んでなり、ここで、４本のポリペプチドヘリックスが安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成することができ、そしてここで、シンタキシンに由来するポリペプチドヘリックスがシナプトブレビンもしくはその相同体に由来するポリペプチドヘリックスに連結される。
【００６０】
本発明のこの実施形態は、シンタキシンに由来するポリペプチドヘリックスが、シナプトブレビンもしくはその相同体に由来するポリペプチドヘリックスに連結される、先に記載の三成分系に向けられる。５０アミノ酸未満の長さのヘリックスを含む複合体形成系の制限および望ましい特徴に関する先の記載のほとんどすべてが、シナプトブレビンもしくはその相同体に由来するポリペプチドヘリックスに連結されたシンタキシンに由来するポリペプチドヘリックスを含む先の系に対しても同じように適切であることは、当業者にはすぐに分かる。例えば、また、この系のＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のヘリックスもまた、二成分系を生じるように先に記載のとおり一体化され得る。当業者は、ヘリックスのうちの２本が、５０アミノ酸未満の長さである必要がないことを理解するであろう。
【００６１】
先に記載の２つの二成分系に向けられる本発明の他の実施形態において、分子足場を形成するための複合体形成系が提供されるが、その系は：
ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックス；
シンタキシンに由来する１本のポリペプチドヘリックス；
シナプトブレビンもしくはその相同体に由来する１本のポリペプチドヘリックス；および
該ポリペプチドヘリックスに結合させた１もしくは複数のカーゴ部分、
を含んでなり、ここで、４本のポリペプチドヘリックスが安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成し、かつ、ここで、ポリペプチドヘリックスが一体化されて、２本のヘリックス含有成分を形成する。
【００６２】
先に記載のとおり、二成分系を２つの方法で形成することができる。まず１つ目は、それぞれ２本のヘリックスを含んでなる２つの成分を形成するように、ヘリックスのうちの２本を一体化することができ、そして他の２本のヘリックスを一体化することができる。あるいは、ヘリックスのうちの３本を、１本の残ったヘリックスとＳＮＡＲＥ複合体を形成できる３本のヘリックスを含む成分を得るように、一体化することができる。
５０アミノ酸未満の長さであるヘリックスを含む複合体形成系についての前記の制限のほとんどすべてが、二成分を含む先の系に対しても同じように適切である。どのパーツが二成分系に適切であるかは、当業者には明らかである。例えば、二成分系は、５０アミノ酸未満の長さである２本のヘリックスを持つ必要はない。
【００６３】
他の実施形態において、本発明は、２つのカーゴ部分を含んでなる二成分化合物を形成するための複合体形成系を提供するが、その複合体形成系は：
ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックス；
シンタキシンに由来する１本のポリペプチドヘリックス；および
シナプトブレビンもしくはその相同体に由来する１本のポリペプチドヘリックス、
を含んでなり、ここで、４本のポリペプチドヘリックスが安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成し、ここで、第１のカーゴ部分を第１のヘリックスに結合させ、かつ、第２のカーゴ部分を第２の別個のヘリックスに結合させ、そしてここで、ＳＮＡＲＥ複合体の形成が二成分化合物の形成を引き起こす。
【００６４】
「二成分化合物」という用語は、２つのパーツが一つにまとまったとき、化合物がその機能を果たすことができるような、２つの別個の成分（カーゴ部分）から作られた化合物を意味する。化合物の機能は、化合物の２個の別個のパーツの機能または素性に依存するであろう。好ましくは、第１のカーゴ部分には第１の機能があり、そして第２のカーゴ部分には第２の機能がある。先に述べたように、第１のカーゴ部分は酵素的または造影機能を有することができ、第２のカーゴ部分は標的化機能を有することができる。これは、酵素的または造影成分がその機能を果たすことができる特定の位置を化合物の標的とすることを可能にする。
【００６５】
一実施形態において、二成分化合物は、異なるユニットから形成されるポリペプチドであり得る。そのポリペプチドは、異なるユニットから形成される毒素であり得る。好適な毒素は、ボツリヌス毒素、ジフテリア毒素、破傷風毒素およびリシンである。どのペプチドや毒素が本発明の系での使用に好適であるかは、当業者にはすぐに分かるであろう。例えば、ボツリヌス毒素は、３つの異なる部分：受容体結合部；転座部；および酵素部、から作られている。そのため、それらが複合体形成系によって一つにまとめられたとき、機能性ボツリヌス毒素を形成するように、酵素部と転座部で一つの部分（カーゴ部分）を形成でき、そして受容体結合部で第二の部分（カーゴ部分）を形成できる。同様に、それらが一つにまとめられたとき、機能性毒素が形成されるように、破傷風、リシンおよびジフテリア毒素は、２つのパーツに切り離されることができる。
【００６６】
一実施形態において、第１のカーゴ部分には第１の機能があって、第２のカーゴ部分には第２の機能があって、そしてそれが一つにまとめられたとき、完全機能性ペプチド、例えば毒素を形成する。異なるユニットから形成され、そして先に記載の方法で使用できるペプチドの選択は、十分に当業者の能力の範疇にある。例えば、US2009/0035822には、別個のパーツからの機能性タンパク質の形成が記載されている。
【００６７】
ジフテリア毒素、破傷風毒素、およびリシンは、治療法、例えば新生物疾患の処置で使用できる。そのため、これらのポリペプチドにかかわる複合体形成系は、治療法および新生物疾患の処置に使用できる。それらはさらに、対象に複合体形成系を含んでなる組成物の有効量を投与することを含む治療法で使用できる。
【００６８】
本発明はさらに、２つのカーゴ部分を含んでなる二成分化合物を形成するためのＳＮＡＲＥ複合体を形成する方法を提供するが、その方法は：
ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックスと、シンタキシンに由来する１本のポリペプチドヘリックスと、シナプトブレビンまたはその相同体に由来する１本のポリペプチドヘリックスとを一つに結合して、安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成することを含んでなり、ここで、第１のカーゴ部分を第１のヘリックスに結合させ、かつ、第２のカーゴ部分を第２の別個のヘリックスに結合させ、そしてここで、ＳＮＡＲＥ複合体の形成が二成分化合物の形成を引き起こす。
【００６９】
別の特定の実施形態において、本発明は、ボツリヌス毒素を形成するための複合体形成系であって、以下の：
ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックス；
シンタキシンに由来する１本のポリペプチドヘリックス；
シナプトブレビンもしくはその相同体に由来する１本のポリペプチドヘリックス、
を含んでなり、ここで、４本のポリペプチドヘリックスが安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成し、ここで、第１のカーゴ部分を第１のヘリックスに結合させ、かつ、第２のカーゴ部分を第２の別個のヘリックスに結合させ、そしてここで、第１のカーゴ部分がボツリヌス毒素の軽鎖またはその機能部およびボツリヌス毒素の重鎖の転座部を含んでなり、かつ、第２のカーゴ部分がボツリヌス毒素の重鎖の受容体結合部を含んでなる複合体形成系を提供する。
【００７０】
本発明のこの実施形態は、ボツリヌス毒素を別個のパーツで作り出すことができ、その結果、製造工程中の完全な毒素に関連するあらゆるリスクも回避できる、ＳＮＡＲＥ複合体集合の特定の適用に向けられる。その後、２つのパーツが、ＳＮＡＲＥ複合体の形成を使用して組み合わせれて、機能性ボツリヌス毒素を形成する。
本発明はさらに、先に記載した複合体形成系の使用を提供する。さらに、本発明は、神経シナプスの阻害によって緩和される疾患や身体状態の処置における使用、さらに処置における使用のための先に記載した複合体形成系を提供する。
【００７１】
ボツリヌス毒素Ａの使用は多年にわたり医学および美容療法のために広く使用されてきたので、当業者は、神経シナプスの阻害によって緩和される疾患または身体状態を十分に認識するであろう（例えばJankovic（2004）Botulinum in clinical practice. J Neurol Neurosurg Psychiatry 75 951-957を参照のこと）。特に、神経シナプスの阻害によって緩和される疾患または身体状態のいくつかは：発汗過多、唾液分泌過多、ジストニア、胃腸障害、泌尿器疾患、顔面けいれん、斜視、脳性麻痺、吃音、慢性緊張型頭痛、涙液分泌過剰、多汗症、下咽頭収縮筋のけいれん、痙性膀胱、疼痛、片頭痛、および例えばしわ取り、額のしわ取りなどの美容整形術から成る群から選択される。
【００７２】
治療法をさらに提供するが、その方法は、対象に先に記載した複合体形成系の有効量を投与することを含んでなる。
本発明はさらに、ボツリヌス毒素を形成するためのＳＮＡＲＥ複合体を形成する方法を提供するが、その方法は：
ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックス、シンタキシンに由来する１本のポリペプチドヘリックス、およびシナプトブレビンまたはその相同体に由来する１本のポリペプチドヘリックスを一つに結合させて、安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成することを含んでなり、ここで、第１のカーゴ部分を第１のヘリックスに結合させ、かつ、第２のカーゴ部分を第２の別個のヘリックスに結合させ、ここで、第１のカーゴ部分がボツリヌス毒素の軽鎖またはその機能部およびボツリヌス毒素の重鎖の転座部を含んでなり、かつ、第２のカーゴ部分がボツリヌス毒素の重鎖の受容体結合部を含んでなる。
この方法は、一つに結合させるべきボツリヌス毒素の２つのパーツをもたらし、こうして完全機能性ボツリヌス毒素を作り出す。
【００７３】
さらに、本発明は、ボツリヌス毒素を形成するための成分を提供するが、その成分には：ＳＮＡＰタンパク質；シンタキシン；またはシナプトブレビンもしくはその相同体に由来するポリペプチドヘリックスが含まれ、ここで、ポリペプチドヘリックスにはボツリヌス毒素の軽鎖またはその機能部およびボツリヌス毒素の重鎖の転座部を含んでなるカーゴ部分を結合される。また、ボツリヌス毒素を形成するための成分も本発明によって提供されるが、その成分は：ＳＮＡＰタンパク質；シンタキシン；またはシナプトブレビンもしくはその相同体に由来するポリペプチドヘリックスを含んでなり、ここで、ポリペプチドヘリックスにはボツリヌス毒素の重鎖の受容体結合部を含んでなるカーゴ部分を結合させる。
【００７４】
加えて、本発明は、先の成分の使用、ならびにＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックス：シンタキシンに由来する１本のポリペプチドヘリックス：およびシナプトブレビンもしくはその相同体に由来する１本のポリペプチドヘリックスを含んでなり、ここで、４本のポリペプチドヘリックスが安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成し、ここで、第１のカーゴ部分を第１のヘリックスに結合させ、かつ、第２のカーゴ部分を第２の別個のヘリックスに結合させ、そしてここで、第１のカーゴ部分がボツリヌス毒素の軽鎖またはその機能部およびボツリヌス毒素の重鎖の転座部を含んでなり、かつ、第２のカーゴ部分がボツリヌス毒素の重鎖の受容体結合部を含んでなるキットの使用を提供する。
【００７５】
ボツリヌス毒素に関連する先に記載した実施形態が更なる制限を含んでなり、そして本発明の他の態様および実施形態に関して他のところに記載した制限がこれらのボツリヌス毒素の実施形態に同じように適切であることは、当業者に理解されるであろう。
【００７６】
界面活性剤に関連する１つの特定の実施形態において、本発明は分子足場を形成するための複合体形成系を提供するが、その系は：
ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックス；
シンタキシンに由来する１本のポリペプチドヘリックス；
シナプトブレビンもしくはその相同体に由来する１本のポリペプチドヘリックス；そして
該ポリペプチドヘリックスに結合させた１もしくは複数のカーゴ部分、
を含んでなり、ここで、４本のポリペプチドヘリックスが安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成し、そしてここで、該ＳＮＡＲＥ複合体が界面活性剤の存在下で形成される。
【００７７】
先に記載した複合体形成系に関連するさまざまな特徴および制限は、本発明のこの実施形態に対しても同じように適切である。
以前、アラキドン酸がＭｕｎｃ１８の存在下でＳＮＡＲＥ複合体形成を可能にすることが示された（Rickman C and Davletov B（2005））。Ｍｕｎｃ１８はＳＮＡＲＥ複合体形成の負の調節因子であると考えられている。発明者らは、Ｍｕｎｃ１８の不存在下、界面活性剤がより良好なＳＮＡＲＥ複合体形成を可能にするという驚くべき発見をした。好ましくは、界面活性剤の存在に関連する系において、その系はＭｕｎｃ１８タンパク質を含んでいない。前記の系はＭｕｎｃ１８を含まない系である。
【００７８】
本発明はさらに、Ｍｕｎｃ１８の不存在下、ＳＮＡＲＥ複合体の集合を促進するための界面活性剤の使用も提供する。好ましくは、前記界面活性剤は弱い界面活性剤である。好ましくは、前記界面活性剤は合成界面活性剤である。一実施形態において、界面活性剤には、７〜１２個の炭素原子の炭素鎖長がある。
先に記載した本発明のすべての実施形態は、単一の安定したＳＮＡＲＥ複合体がそのＳＮＡＲＥ複合体に結合している１もしくは複数のカーゴ部分により作り出される複合体形成系に関連する。これは多くの適用、例えば診断に有用である。前記の系にはさらに、標識タンパク質の親和性精製、タンパク質もしくは細胞の固定化、または標識タンパク質の識別（ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット）のためのタグ付与用途における適用がある。基材上へのカーゴの固定化は、診断およびマイクロアレイ用途において役に立つ。ＳＮＡＲＥ複合体の安定性がマイクロ流体または連続フロー用途におけるカーゴの固定化に特に役に立つであろうことは、当業者にはすぐに分かるであろう。更なる用途を以下に記載する：
【００７９】
溶液中での用途：
−コンビナトリアル集合、ポリ−、ホモ−、およびヘテロ−オリゴマー化を含めた遺伝子組み換えによる親和性試薬の構築；
−機能性カーゴの標的を定めた送達、例えばカーゴと標的シグナルや内在性シグナルとの集合のための、例えば薬物送達（薬物＝小分子、核酸、タンパク質）；
【００８０】
−タンパク質分子、タンパク質分子を含む分子複合体、タンパク質分子を含む細胞、組織、臓器、および生物体のタグ付与および標識化。
−二成分化合物の構築に関する、例えば機能タンパク質、酵素、因子、補因子、（およびその他の機能タンパク質）、ＦＲＥＴ標識、二成分無機化合物および小分子、二成分有機化合物；
−自己集合構築物の表面上へのタンパク質の集合後固定化のための自己集合タンパク質構築物とタンパク質を含むより複雑な集合体（例えば胞子）。
【００８１】
固体表面用途：
−アレイ、表面固定化；
−免疫アッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）ウェルプレートの表面修飾とタンパク質固定化；
−ＢＩＡコアおよび他のＳＰＲ（表面プラズモン共鳴法）器具の表面修飾とタンパク質固定化；
−ＱＣＭ（水晶振動子マイクロバランス）器具の表面修飾とタンパク質固定化；
【００８２】
−ＭＡＬＤＩ質量分析プレートの表面修飾とタンパク質固定化；
−マイクロ流体器具の表面修飾とタンパク質固定化；
−毛細管電気泳動の表面修飾とタンパク質固定化；
−クロマトグラフィーカラムおよび固定化媒体（例えばビーズ）の表面修飾とタンパク質固定化；
−走査型プローブ顕微鏡法の表面およびチップ修飾とタンパク質固定化；
−マイクロおよびナノ熱量測定の器具センサーの表面修飾とタンパク質固定化；
−マイクロおよびナノ粒子の表面修飾；
−固体表面（例えば金メッキしたガラススライド）、薄膜、ワイヤー（例えばナノワイヤー）、およびナノチューブの表面修飾。
【００８３】
他の用途：
−ナノバイオテクノロジー、例えば自己集合「接着剤」ベースの生分解性タンパク質と表面の接着；
−タンパク質ベースの繊維および重合体；
−組織足場と再生医療。
【００８４】
さらに、本発明は、先に記載した複合体形成系の実施形態のいずれかの使用、そして特に、先に記載した用途のいずれかにおけるものを提供する。例えば、本発明は、診断における複合体形成系の使用、例えばアレイ、アッセイ、マイクロ流体デバイス、ＳＰＲ器具、ＱＣＭ器具、質量分析計、電気泳動器具、クロマトグラフィーカラム、走査型プローブ顕微鏡、または熱量測定器具などを提供する。例えば、複合体形成系は、抗体を基材に固定化するためにアレイで使用することもできる。
【００８５】
一実施形態において、本発明は、その上に安定したＳＮＡＲＥ複合体を固定化した装置を提供するが、そのＳＮＡＲＥ複合体は：
ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックス；
シンタキシンに由来する１本のポリペプチドヘリックス；
シナプトブレビンもしくはその相同体に由来する１本のポリペプチドヘリックス；および
ポリペプチドヘリックスに結合させた１もしくは複数のカーゴ部分、
を含んでなり、ここで、前記の装置は、アレイ、アッセイ、マイクロ流体デバイス、ＳＰＲ器具、ＱＣＭ器具、質量分析計、電気泳動器具、クロマトグラフィーカラム、走査型プローブ顕微鏡、および熱量測定器具から選択される。
【００８６】
本発明はさらに、１もしくは複数のカーゴ部分を保有するＳＮＡＲＥ複合体を形成する方法を提供するが、その方法は：
ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックス、シンタキシンに由来する１本のポリペプチドヘリックス、およびシナプトブレビンまたはその相同体に由来する１本のポリペプチドヘリックスを一つに結合させて、安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成することを含み、ここで、１もしくは複数のカーゴ部分を該ポリペプチドヘリックスに結合させ、そしてここで：
（ｉ）シンタキシンに由来するポリペプチドヘリックスを、シナプトブレビンもしくはその相同体に由来するポリペプチドヘリックスに連結するか；
（ｉｉ）該ポリペプチドヘリックスを一体化して、２本のヘリックスを含む成分を形成するか；または
（ｉｉｉ）該ポリペプチドヘリックスのうち少なくとも２本が、５０アミノ酸未満の長さである。
【００８７】
本発明の系および制限に関連する先の記載は、先の方法に対しても同じように適切である。
本発明はさらに、ポリペプチドがシナプトブレビンもしくはその相同体に由来するポリペプチドヘリックスに連結されたシンタキシンに由来するヘリックスを含んでなる成分であって、そしてここで、連結された２本のヘリックスが安定したＳＮＡＲＥ複合体の一部を形成できるものを提供する。一実施形態において、前記の２本のヘリックスは、それらが同じ安定したＳＮＡＲＥ複合体に集合できるように一体化されることもできる。あるいは、前記の２本のヘリックスは、それらが同じ安定したＳＮＡＲＥ複合体に集合できないよう一体化されることもできる。この代替の実施形態において、２本のヘリックスは、異なる安定したＳＮＡＲＥ複合体に集合できなくてはならない。シンタキシンに由来するヘリックスとシナプトブレビンまたはその相同体に由来するヘリックスを含んでなる本発明の２ヘリックス成分は、配列番号１２、１３、１４、および７３に示した以下の配列：
【００８８】
シンタキシン３（１−２６０）／シナプトブレビン２（１−８４）（ヘッドドメインとリンカーを含むシンタキシン）−配列番号１２
シンタキシン３（１９５−２５３）／シナプトブレビン２（１−８４）（ヘッドドメインを含まないがリンカーを含むシンタキシン）−配列番号１３
シンタキシン３（１−２５３）／シナプトブレビン２（２９−８４）（ヘッドドメインを含みリンカーが無いシンタキシン）−配列番号１４
シンタキシン３（１９５−２５３）／シナプトブレビン２（２９−８４）（ヘッドドメインを含まずリンカーも無いシンタキシン）−配列番号７３、
のうちの１つを含み得る。
【００８９】
シンタキシンに由来するヘリックスとシナプトブレビンまたはその相同体に由来するヘリックスを含んでなる本発明の２ヘリックス成分は、先の配列のうちの１つから成ることもできる。
前記２ヘリックス成分は、ポリペプチドヘリックスに連結された１もしくは複数のカーゴ部分をさらに含んでなることもできる。
【００９０】
本発明はさらに、ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックスとシナプトブレビンに由来するポリペプチドヘリックスまたはシンタキシンに由来するポリペプチドヘリックスのいずれかを含んでなる成分であって、ここで、３本のヘリックスが三重らせん成分を形成するように一体化され、そしてここで、該連結された３本のヘリックスが安定したＳＮＡＲＥ複合体の一部を形成できる成分を提供する。一実施形態において、第３のヘリックスは、シナプトブレビンに由来する。他の実施形態において、３本のヘリックスは、それらが同じ安定したＳＮＡＲＥ複合体に集合できるように、一体化され得る。
【００９１】
ＳＮＡＰ−２５ヘリックスとシナプトブレビンもしくはその相同体に由来するヘリックスとを含んでなる本発明の三重らせん成分は、配列番号１５を含んでなることもできる。さらに、前記三重らせん成分は、この配列から成ることもできる。
【００９２】
あるいは、３本のヘリックスは、２本のＳＮＡＰヘリックスが同じ安定したＳＮＡＲＥ複合体に集合できるが、第３のヘリックスが該２本のヘリックスと同じ安定したＳＮＡＲＥ複合体に集合できないように、一体化されることもできる。この代替の実施形態において、第３のヘリックスは、２本のＳＮＡＰヘリックスと異なる安定したＳＮＡＲＥ複合体に集合できるようにすべきである。三重らせん成分は、ポリペプチドヘリックスに結合した１もしくは複数のカーゴ部分をさらに含んでなることもできる。
【００９３】
さらに、本発明は、例えば分子足場を形成するための安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成するような先の成分の使用を提供する。
本発明は、シナプトブレビンもしくはその相同体に由来するポリペプチドヘリックスに連結されたシンタキシンに由来するポリペプチドヘリックスを含んでなる成分を含んでなるキットであって、そしてここで、連結された２本のヘリックスが安定したＳＮＡＲＥ複合体の一部を形成できるキットをさらに提供する。
【００９４】
前記キットは、シンタキシン／シナプトブレビンに由来するヘリックスと安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成できるＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックスをさらに含んでなることもできる。２本のＳＮＡＰヘリックスを一体化し得る。
【００９５】
代替の実施形態において、本発明は、ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックスおよびシンタキシンに由来するポリペプチドヘリックスまたはシナプトブレビンに由来するポリペプチドヘリックスのいずれかを含んでなる成分を含んでなるキットであって、ここで、３本のヘリックスが一体化されて、三重らせん成分を形成し、そしてここで、該連結された３本のヘリックスが安定したＳＮＡＲＥ複合体の一部を形成できるキットを提供する。
【００９６】
前記キットは、第４のＳＮＡＲＥタンパク質に由来する単一ポリペプチドヘリックスをさらに含むこともできる。そのため、前記三重らせん成分が２本のＳＮＡＰ由来ヘリックスおよびシナプトブレビンもしくは相同体由来ヘリックスを含んでなるのであれば、キットは、連結されたＳＮＡＰ／シナプトブレビン由来ヘリックスと安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成できるシンタキシンに由来する単一ポリペプチドヘリックスをさらに含み得る。あるいは、三重らせん成分が２本のＳＮＡＰ由来ヘリックスおよびシンタキシン由来ヘリックスを含んでなるのであれば、キットは、連結されたＳＮＡＰ／シンタキシン由来ヘリックスと安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成できるシナプトブレビンもしくはその相同体に由来する単一ポリペプチドヘリックスをさらに含み得る。
【００９７】
本発明のキットは、該キットと使用するのに好適な試薬をさらに含み得る。
キットのヘリックスおよびＳＮＡＲＥ複合体の更なる特徴は、先に記載したとおりのものである。
【００９８】
複合体形成系はさらに、ＳＮＡＲＥ複合体の多量体を形成するのに使用されることもできる。これは、一体化された複数のＳＮＡＲＥ複合体である。一実施形態において、ヘリックスのうちの２本が、同じ複合体として安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成できないような方法で一体化される。しかしながら、２本のヘリックスは、異なるＳＮＡＲＥ複合体ではあるがそれらが安定したＳＮＡＲＥ複合体をそれぞれ形成できるような方法で一体化されるべきである。これは、２本のヘリックスが同じＳＮＡＲＥ複合体で正しい立体構造をとることができないように、いずれの種類のリンカーも用いずにヘリックスを直接一体化することによって行われ得る。代わりに、そういった２本らせん連結構築物の各ヘリックスは、３本の他のポリペプチドヘリックスと複合体を形成して、２つの安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成できる。その２本のヘリックスは、任意の好適な方法、例えば遺伝子組み換え手段または化学的カップリングによって、一体化できる。例えば、ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のヘリックスが一体化され、そしてシンタキシンおよびシナプトブレビンに由来する２本のヘリックスが、同じＳＮＡＲＥ複合体に集合できないような制限された様式で連結される二成分系を採用すること。シンタキシン−シナプトブレビン融合タンパク質から開始すると、ＳＮＡＰ融合タンパク質はシンタキシン・ヘリックスと複合体を形成するであろう。別のシンタキシン−シナプトブレビン融合タンパク質からのシナプトブレビン・ヘリックスは、次いで、ＳＮＡＰ−シンタキシン複合体に結合して、４本らせんＳＮＡＲＥ複合体を形成するであろう。この複合体には、そこから突出したシンタキシン・ヘリックスおよびシナプトブレビン・ヘリックス、すなわち、それぞれのシンタキシン−シナプトブレビン融合タンパク質から一本ずつが存在するであろう。これらの単一ヘリックスの突出が、更なるＳＮＡＲＥ複合体の形成の基礎となることができる。そのため、ＳＮＡＲＥ複合体の多量体が形成される。先の例において、ＳＮＡＰヘリックスは一体化される必要はない。さらに、安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成するためにそれらの両方が同じ複合体に集合できない限り、あらゆる２本のヘリックスを、系が機能するように一体化できた。
【００９９】
本発明はさらに、先の系によって作り出される多量体も提供する。
あるいは、多量体は、系の反応条件を制御することによって形成できる。系のヘリックスのうちの２本が一体化されなければならない。これは、任意の好適な方法で行われることができる。２本のヘリックスが、先の例のようにいずれかの方法で制限される必要はないが、しかし、所望であれば、それらを制限することもできる。前記の系は、連結された２本のヘリックスの一方と同じＳＮＡＲＥタンパク質に由来する単一のヘリックスをさらに含んでなる。例えば、シンタキシン−シナプトブレビン融合タンパク質を含んでなる系では、その系は、単一のシンタキシン・ヘリックスをさらに含んでなる。多量体を作り出すために、単一のシンタキシン・ヘリックスを溶液中に導入する。この単一のヘリックスは、先に述べたように、溶液中で遊離していても、基材上に固定化されていてもよい。ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のヘリックス（連結されていても、連結いなくてもよい）が、溶液中に加えられる。これらはシンタキシン・ヘリックスに結合して、シンタキシン−ＳＮＡＰ三重らせん複合体を形成する。この後、シンタキシン−シナプトブレビン融合タンパク質が溶液中に加えられる。この融合タンパク質からのシナプトブレビン・ヘリックスは、三重らせん複合体に結合して、安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成する一方で、シンタキシン・ヘリックスは結合しないままで残り、そしてＳＮＡＲＥ複合体から突出するであろう。先のとおり繰り返して同じステップを経ることによって、このシンタキシン突出は、更なるＳＮＡＲＥ複合体を形成するために使用され、こうして多量体が作り出される。先の系はヘリックスが特定の順序で加えられることを必要とするので、特定のステップ後に、好ましくない分子が存在しないことを確実にする必要があり得る。これは、例えば単一のシンタキシン・ヘリックスを固定化し、そしてそれぞれの結合ステップ後に洗浄を実施することによって行われることができる。本発明はさらに、先の系によって作り出される多量体も提供する。
【０１００】
さらに、本発明は、一体化された複数の安定したＳＮＡＲＥ複合体を含んでなる多量体を提供するが、ここで、各ＳＮＡＲＥ複合体は：
ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックス；
シンタキシンに由来する１本のポリペプチドヘリックス；および
シナプトブレビンもしくはその相同体に由来する１本のポリペプチドヘリックス、
を含んでなり、ここで、あるＳＮＡＲＥ複合体からのヘリックスが、別のＳＮＡＲＥ複合体からヘリックスに連結されて、それらのＳＮＡＲＥ複合体を一体化し、かつ、ここで、１もしくは複数のカーゴ部分をポリペプチドヘリックスに結合させる。
【０１０１】
本発明の多量体は線状であることができる。それが線状であれば、各ＳＮＡＲＥ複合体は、両側で他の２つのＳＮＡＲＥ複合体に結合されて、一連のビーズに似た長い線状鎖を形成する。こうして、ＳＮＡＲＥ複合体内の２本のヘリックスが、２つの異なるＳＮＡＲＥ複合体内のヘリックスに結合される。明らかに、鎖の末端のＳＮＡＲＥ複合体は、１本のポリペプチドヘリックスによって他の１つのＳＮＡＲＥ複合体にしか結合されない。
【０１０２】
あるいは、前記多量体は分岐していてもよい。これは、例えばシナプトブレビン由来ヘリックスに２本のシンタキシン由来ヘリックスが任意の順序で連結されることによって行われ得る。この三重連結された構築物からのシナプトブレビン由来ヘリックスは、シンタキシン／ＳＮＡＰ由来三重らせん中間体に結合して、結合しないまま残っていた２本のシンタキシン由来ヘリックスとＳＮＡＲＥ複合体を形成する。ＳＮＡＰ由来ヘリックス、例えばＳＮＡＰ−２５、が加えられた場合には、２つの連結シンタキシン／ＳＮＡＰ−２５中間体が形成される。「定常状態の」シナプトブレビン−シンタキシン（２本らせん）由来構築物の添加によって、２つのシンタキシン由来ヘリックスが突出している２つの連結ＳＮＡＲＥ複合体を形成する。これは、更なる伸長のための２つの分岐を導入する。こうして、３本のヘリックスを連結することで、（線状重合に使用される連結された２本のヘリックスとは対照的に）分岐が可能になる。こうして、多量体を分岐させるのであれば、多量体内のあるＳＮＡＲＥ複合体を、線状鎖のように２つの他のＳＮＡＲＥ複合体に結合させるよりむしろ３つの他のＳＮＡＲＥ複合体に結合させて、分岐点を形成させる。ＳＮＡＲＥ複合体内のヘリックスのうちの３本を、分岐点において３つの異なるＳＮＡＲＥ複合体内のヘリックスに結合させる。
【０１０３】
多量体は、それぞれヘリックスの末端に結合させたカーゴ部分を持つことができる。多量体は、ヘリックスの末端で多量体に結合した複数のカーゴ部分を持つことができる。一実施形態において、多量体は、各ＳＮＡＲＥ複合体上にカーゴ部分を持ち得る。多量体は、各ＳＮＡＲＥ複合体に結合させた複数のカーゴ部分を持ち得る。多量体が複数のカーゴ部分を持つのであれば、これらは、同じであっても、異なっていてもよい。それぞれの洗浄ステップ後に異なるカーゴを保有するＳＮＡＲＥドメインを提供することによって、複数のカーゴの付加および規則配列を制御できる。
【０１０４】
本発明はさらに、多量体を作り出す方法を提供するが、その方法は以下のステップ：
１）第１のＳＮＡＲＥヘリックスに由来する第１のポリペプチドヘリックスを提供し；
２）第２および第３のポリペプチドヘリックスを、第１のポリペプチドヘリックスに結合させて、三重らせん中間複合体を形成し、ここで、第２および第３のポリペプチドヘリックスが第２および第３のＳＮＡＲＥヘリックスに由来し；
３）第４のポリペプチド・ヘリックスを３本ヘリックス束に結合させて、安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成させ、ここで、第４のポリペプチドヘリックスが第４のＳＮＡＲＥヘリックスに由来し、そしてここで、第４のポリペプチドヘリックスが第１のＳＮＡＲＥヘリックスに由来する第５のポリペプチドヘリックスに連結され；そして
４）ステップ２）および３）を繰り返して、多量体を形成する、ここで、１もしくは複数のカーゴ部分をポリペプチドヘリックスに結合させる、
を含んでなる。
【０１０５】
複合体形成系、多量体、およびさまざまな制限に関連する先の記載もまた、先の方法に適切である。
ステップ２）および３）は、必要な長さの多量体を作り出すのに必要なのと同じ回数だけ繰り返すことができる。
【０１０６】
先の方法は、第１、第２、第３、および第４のＳＮＡＲＥヘリックスに言及する。先に記載のように、ＳＮＡＲＥ複合体は４本のヘリックスから形成される。これらのヘリックスのうちの２本はＳＮＡＰタンパク質によってもたらされ、１本はシンタキシンによってもたらされ、そして１本はシナプトブレビンもしくはその相同体によってもたらされる。そのため、先の方法において、これらの４本のヘリックスは、特に決まった順番はなく、第１、第２、第３および第４のＳＮＡＲＥヘリックスである。これは、４本のヘリックスがＳＮＡＲＥ複合体に使用される限り、特定のヘリックスの素性が重要でないからである。任意に、ＳＮＡＲＥ複合体はまた、先に記載のようにコンプレキシンに結合されることもできる。
【０１０７】
一実施形態において、第１のヘリックスはシンタキシン由来ヘリックスであり；第２のヘリックスはＳＮＡＰ由来ヘリックスであり；第３のヘリックスはＳＮＡＰ由来ヘリックスであり；第４のヘリックスはシナプトブレビン由来ヘリックスであり；そして第５のヘリックスはシンタキシン由来ヘリックスである。
【０１０８】
4本のヘリックスが順不同でＳＮＡＲＥ複合体に使用されるという事実により、第5のポリペプチドヘリックスは、最初のポリペプチドヘリックスと同じＳＮＡＲＥヘリックスに由来する必要はない。同様に、前記方法のステップとして、多量体の状態での第２、第３、第４、第５、第６のＳＮＡＲＥ複合体などの形成が繰り返される場合、第２、第３および第４のポリペプチドヘリックスが、第１のＳＮＡＲＥ複合体内の第２、第３および第４のポリペプチドヘリックスと同じＳＮＡＲＥヘリックスに由来する必要性はない。唯一の要件は、４つのＳＮＡＲＥヘリックスのすべてが、安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成するように各ＳＮＡＲＥ複合体に対応するということである。
【０１０９】
先の方法が多段階プロセスを伴うので、それらが安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成する限り、これは、第１ステップと比較して、その後の反復ステップで異なるポリペプチドヘリックスを導入する可能性を認める。例えば、ステップの最初のサイクルでは、ＳＮＡＰタンパク質に由来するポリペプチドヘリックスのうちの１つが、完全長ＳＮＡＰ−２５ヘリックスであり得るのに対し、ステップの次のサイクルでは、このポリペプチドヘリックスが４５アミノ酸の長さのＳＮＡＰ−２５ヘリックスであり得る。重要な態様は、４つのＳＮＡＲＥヘリックスすべてがＳＮＡＲＥ複合体に対応するように、両ポリペプチドヘリックスが同じＳＮＡＲＥヘリックス、例えば特定のＳＮＡＰヘリックスに由来することである。
【０１１０】
得られた多量体がそこに結合させたカーゴ部分を持つように、１もしくは複数のカーゴ部分をポリペプチドヘリックスに結合させる。これは、その方法で使用される前にカーゴ部分をポリペプチドヘリックスに結合させることによって行うことができる。好ましくは、カーゴ部分をポリペプチドヘリックス末端に結合させる。複数のカーゴ部分を多量体内に導入できる。これは、先の方法を使用することで多量体内にその後組み込まれる多くのポリペプチドヘリックスにカーゴ部分を結合させることによって行うことができる。前記カーゴ部分は同じであっても、異なっていてもよい。
【０１１１】
方法をより簡単にするために、第１、第２、第３、および第４のＳＮＡＲＥヘリックスの固有性が反復ステップにおいて維持されることが望ましい。そのため、例えば第１のＳＮＡＲＥ複合体が生じるステップの最初のサイクルでは、第１のＳＮＡＲＥヘリックスがシンタキシンであれば、第２および第３のＳＮＡＲＥヘリックスはＳＮＡＰタンパク質に由来し、かつ、第４のＳＮＡＲＥヘリックスはシナプトブレビンもしくはその相同体である、そして更なるＳＮＡＲＥ複合体を生じるステップのその後のサイクルでは、第１のＳＮＡＲＥヘリックスは常にシンタキシンであり、第２および第３のＳＮＡＲＥヘリックスは常にＳＮＡＰタンパク質に由来し、かつ、第４のＳＮＡＲＥヘリックスは常にシナプトブレビンまたはその相同体である。
【０１１２】
さらに、第２、第３、第４および第５のポリペプチドヘリックスの固有性が反復ステップにおいて維持されることが望ましい。そのため、例えば第１のＳＮＡＲＥ複合体を生じるステップの最初のサイクルでは、第２および第３のＳＮＡＲＥヘリックスはＳＮＡＰタンパク質に由来し、第４のＳＮＡＲＥヘリックスはシナプトブレビンＳＮＡＲＥヘリックスに由来し、かつ、第５のポリペプチドヘリックスはシンタキシンに由来する、そして更なるＳＮＡＲＥ複合体を生じるステップのその後のサイクルでは、（次のＳＮＡＲＥ複合体で第１のヘリックスを形成する）第５のポリペプチドヘリックスは常にシンタキシンであり、第２および第３のＳＮＡＲＥヘリックスは常にＳＮＡＰ−２５に由来し、かつ、第４のＳＮＡＲＥヘリックスは常にシナプトブレビンＳＮＡＲＥヘリックスである。
【０１１３】
一実施形態において、第２と第３のポリペプチドヘリックスは、それらが同じＳＮＡＲＥ複合体で一緒に集合できるように一体化される。好ましくは、第２および第３のポリペプチドヘリックスは、完全長ＳＮＡＰタンパク質、例えばＳＮＡＰ−２５である。
ポリペプチドヘリックスの固有性がその後のステップのすべてで同じであり、かつ、第２と第３のポリペプチドヘリックスが一体化されるとき、このことは、２つのビルディングブロックだけを使用した急速な多量体形成を可能にする。
【０１１４】
他の実施形態において、第１のポリペプチドヘリックスが基材上に固定化される。好適な基材は、当業者に周知であり、そして先に議論されている。
前記方法は、あらゆる非結合ヘリックスを取り除くために、それぞれの結合ステップ後の洗浄ステップをさらに含み得る。このことは、これらの非結合ヘリックスがその後のステップで多量体の形成を妨害できないことを確実にする。好ましくは、前記方法によって形成された多量体は、洗浄ステップが使用される前に固定化される。
【０１１５】
前記方法は、多量体に分岐を導入するために変更され得る。こうするために、第１のＳＮＡＲＥヘリックスに由来する第６のポリペプチドヘリックスが、第２、第３、第４または第５のポリペプチドヘリックスのうちの１つに連結されて、それによって別の安定したＳＮＡＲＥ複合体が形成されるヘリックスを提供する。一実施形態において、第６のポリペプチドヘリックスは、第２または第３のポリペプチドヘリックスに連結される。代替の実施形態において、第６のポリペプチドヘリックスは、第４または第５のポリペプチドヘリックスに連結される。このことは、２つの更なるＳＮＡＲＥ複合体が特定のＳＮＡＲＥ複合体に由来することを可能にし、その結果、その多量体に分岐を導入する。
【０１１６】
これは、先に述べたように、例えばシナプトブレビン由来ヘリックスを２本のシンタキシン由来ヘリックスに順不同で連結することによって行うことができる。あるいは、シンタキシン・ヘリックスは（第２および第３のヘリックスである）ＳＮＡＰ−２５に連結されて、起源となるＳＮＡＲＥ複合体からの第２のＳＮＡＲＥ複合体の形成を開始させるので、起源となるＳＮＡＲＥ複合体を他の３つのＳＮＡＲＥ複合体全部に結合させて、分岐点を形成することを意味している。
【０１１７】
さらに、多重分岐は、ＳＮＡＲＥ複合体の他のヘリックスに連結される第６のヘリックスに加えて、更なるヘリックスを特定のＳＮＡＲＥ複合体に導入することによって導入できる。例えば、シナプトブレビン由来ヘリックスを、３本以上のシンタキシン由来ヘリックスに順不同で連結できる。あるいは、２本以上のシンタキシン・ヘリックスは（第２および第３のヘリックスである）ＳＮＡＰ−２５に連結されて、起源となるＳＮＡＲＥ複合体からの第３、第４のＳＮＡＲＥ複合体などの形成を開始させることができるので、起源となるＳＮＡＲＥ複合体を４つ以上の他のＳＮＡＲＥ複合体全部に結合させて、多重分岐点を形成することを意味している。
【０１１８】
必要とする数の分岐を、１か所の特定の点にて、そして多量体の全長にわたって多量体内に導入できる。
本発明はさらに、先の方法によって作り出した多量体も提供する。
先に記載した多量体は、多くの用途、例えば診断、および以下に記載した用途において有用である：
【０１１９】
溶液中での用途：
−コンビナトリアル集合、ポリ−、ホモ−、およびヘテロ−オリゴマー化を含めた遺伝子組み換えによる親和性試薬の構築；
−機能性カーゴの標的を定めた送達、例えばカーゴと標的シグナルや内在性シグナルとの集合のための、例えば薬物送達（薬物＝小分子、核酸、タンパク質）；
−タンパク質分子、タンパク質分子を含む分子複合体、タンパク質分子を含む細胞、組織、臓器、および生物体のタグ付与および標識化。
−多元化合物の構築に関する、例えば機能タンパク質、酵素、因子、補因子、（およびその他の機能タンパク質）、ＦＲＥＴ標識、多元無機化合物および小分子、多元有機化合物；
−自己集合構築物の表面上へのタンパク質の集合後固定化のための自己集合タンパク質構築物とタンパク質を含むより複雑な集合体（例えば胞子）。
【０１２０】
固体表面用途：
−アレイ、表面固定化；
−免疫アッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）ウェルプレートの表面修飾とタンパク質固定化；
−ＢＩＡコアおよび他のＳＰＲ（表面プラズモン共鳴法）器具の表面修飾とタンパク質固定化；
−ＱＣＭ（水晶振動子マイクロバランス）器具の表面修飾とタンパク質固定化；
【０１２１】
−ＭＡＬＤＩ質量分析プレートの表面修飾とタンパク質固定化；
−マイクロ流体器具の表面修飾とタンパク質固定化；
−毛細管電気泳動の表面修飾とタンパク質固定化；
−クロマトグラフィーカラムおよび固定化媒体（例えばビーズ）の表面修飾とタンパク質固定化；
−走査型プローブ顕微鏡法の表面およびチップ修飾とタンパク質固定化；
−マイクロおよびナノ熱量測定の器具センサーの表面修飾とタンパク質固定化；
−マイクロおよびナノ粒子の表面修飾；
−固体表面（例えば金メッキしたガラススライド）、薄膜、ワイヤー（例えばナノワイヤー）、およびナノチューブの表面修飾。
【０１２２】
他の用途：
−ナノバイオテクノロジー、例えば自己集合「接着剤」ベースの生分解性タンパク質と表面の接着；
−タンパク質ベースの繊維および重合体；
−組織足場と再生医療。
ここでは、例証のみを目的として、図面を参照して、本発明を詳細に説明する：
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】神経伝達物質放出における小胞融合を駆動する分子機構の略図である。コアＳＮＡＲＥ複合体は、シナプトブレビン、シンタキシン、およびＳＮＡＰ−２５によってもたらされる４本のα−ヘリックスによって形成されている。シナプトタグミンは、カルシウムセンサーとして機能し、小胞融合中にＳＮＡＲＥジッピング（zipping）を緊密に調整している。
【図２】束状または線状多量体として不可逆的かつ部位選択的様式で多機能ユニットの結合の略図である。矢印は結合足場を表す；機能ユニットは幾何学的図形で表されている。
【図３Ａ】少なくとも８０アミノ酸の長さを有する４つのポリペプチドからできている４本らせんＳＮＡＲＥ束を示す（Button et al., 1998）。
【図３Ｂ】４０と４５アミノ酸のペプチドの設計に使用したＳＮＡＲＥモチーフを示している。網掛け部分が疎水性層であり、濃い灰色で強調した中心層がある。
【図４】４５アミノ酸のポリペプチドが不可逆的なＳＮＡＲＥ複合体を形成できが（パネルＡ）、その一方で４０アミノ酸のペプチドができない（パネルＢ）ことを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。簡潔にするために、発明者らはこの集合体をＴｅｔｒｉＣＳ（四本らせんコンビナトリアル足場）と呼ぶ。
【図５】ストレプトアビジンが非常に特異的な様式でグルタチオン・ビーズまたはニッケル・ビーズのいずれかに結合した４５ａａのＴｅｔｒｉｃｓペプチドに結合することができたことを示すグラフである。
【図６】２本のＳＮＡＲＥヘリックスを持つ完全長のＳＮＡＰ−２５分子（第１−２０６アミノ酸）、ならびに別個のシンタキシンおよびシナプトブレビンＳＮＡＲＥヘリックスを含んでなる三成分ＳＮＡＲＥ束の略図である。
【図７】４０（パネルＡ）および４５ａａ（パネルＢ）のペプチドの両方がＳＮＡＰ２５Ｂと集合できるので、三成分系において、完全長のＳＮＡＰ−２５への不可逆的結合には４０ａａの長さのペプチドで十分であることを実証するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示している。
【図８】ビーズ上のＧＳＴ−ＳＮＡＰ２５単体を用いた対照反応がごくわずかな結合しか示さないのに対して、それぞれＭｙｃタグおよびＳタグを持つ４０ａａのシンタキシンおよびシナプトブレビン・ペプチドの添加が、グルタチオン・ビーズへの抗Ｍｙｃ抗体およびＳタンパク質の両方の強固な結合によって証明される三成分複合体の形成につながることを示すグラフである。
【図９】固定化されたＳＮＡＰ２５Ｂへの４０ａａのシンタキシンおよびシナプトブレビン・ペプチドの結合を示すセンソグラム（sensogram）である。抗ｍｙｃ抗体（Ｍｙｃ）は、シンタキシン−ｍｙｃエピトープに結合するが、０．１％のＳＤＳで溶出できる。結合したシンタキシン／シナプトブレビン・ペプチドは、ＳＤＳによって分離できない。
【図１０】２つのＳＮＡＲＥヘリックスを持つＳＮＡＰ−２５分子とシンタキシン／シナプトブレビン融合タンパク質を含んでなる二成分ＳＮＡＲＥ束の略図である。
【図１１】灰色の矢印によって示されるラット・シンタキシン１Ａ ＳＮＡＲＥモチーフ（第１９５−２５４アミノ酸）の、ラット・シナプトブレビン２ＳＮＡＲＥモチーフ（第２５−８４ａａ）との結合を示す略図である。
【図１２】シンタキシン３−シナプトブレビン２融合タンパク質とラットＳＮＡＰ−２５Ｂの不可逆的な複合体への素早い集合を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。
【図１３】ラット・シナプトブレビン２配列１−８４を短い一続きのアミノ酸を介して融合させたラット・シンタキシン３のヘッドドメインおよびＳＮＡＲＥモチーフ（第１−２６０アミノ酸）を示す略図である。
【図１４Ａ】オクチルグルコピラノシドが、シンタキシン３分子を「開状態にする」ことができて、二成分集合体の形成を可能にすることを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。
【図１４Ｂ】オクチルグルコピラノシド界面活性剤が、ＣＭＣ（臨界ミセル濃度−この界面活性剤に関して、ＣＭＣは０．６％である）を超える濃度にて密なＳＮＡＲＥ複合体の集合を促進することを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。一部の集合は界面活性剤の不存在下で行われるが、効果的な集合には、二成分集合の形成を可能にするために、シンタキシン３分子を「開状態にする」ための洗剤、オクチルグルコピラノシドを必要とする。
【図１５】シンタキシン−シナプトブレビン融合タンパク質（^*）の結合、およびシンタキシン／シナプトブレビン融合タンパク質とＣＭ５チップ上に固定化されたＳＮＡＰ−２５の間の集合に関する独特な抵抗を示す表面プラズモン共鳴センソグラムである。２ＭのＮａＣｌ（１）、グリシン ｐＨ２．５（２）、１％のＳＤＳ（３）、０．１ＭのＮａＯＨ（４）、０．１Ｍのリン酸（５）を使用した洗浄では、二成分捕獲試薬を壊すことができない。注記、ステップ３を２度繰り返した。
【図１６Ａ】３本らせん分子（黒色）と第４のヘリックス（灰色）を含んでなる二成分ＳＮＡＲＥ束の略図である。
【図１６Ｂ】４０および４５ａａのシンタキシン１Ａペプチドの両方が、ＳＮＡＰ−２５Ｂおよびシナプトブレビン２（ＳＮＡＰ−２５Ｂ（２２−２０６）／Ｓｙｂ２（１−８４））で構成される３本らせん融合タンパク質と集合できることを示して、二成分系において、不可逆的ＳＮＡＲＥ複合体の形成には、４０ａａの長さのペプチドで十分であることを実証するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。注記、ＳＤＳ抵抗性複合体は、おそらくそのコンパクトな構造のためＳＤＳゲル内で３本らせんタンパク質より速く移動する。
【図１７】ＧＳＴ−ＳＮＡＰ２５が、シンタキシン３／シナプトブレビン２融合タンパク質を持つセファロースビーズに非常に特異的な様式で結合することを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。注記、シンタキシン３／シナプトブレビン２融合タンパク質がＢｒＣＮ−セファロースビーズに共有結合されおり、そのためＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で溶出および可視化できない。レーン１−zwittergent 3-08を使用して作られた細菌抽出物。レーン２−シンタキシン３／シナプトブレビン２融合タンパク質を持つビーズにより精製したＧＳＴ−ＳＮＡＰ−２５。
【図１８】ＳＮＡＲＥタンパク質によって形成された無限長の強固な線状多量体の形態の超分子デバイスの略図である。
【図１９】ＳＮＡＲＥタンパク質を使用した長い線状多量体を形成する工程の略図である。
【図２０】（Ａ）ビーズに結合したシンタキシン３−シナプトブレビン２融合およびＳＮＡＰ−２５の両方の量の段階的な増加を示すクーマシー染色ゲル。注記、ビーズへの付加に使用されるＧＳＴ−シンタキシン３の量が一定のままであるが、一方で結合したＳＮＡＰ−２５およびシンタキシン３−シナプトブレビン２融合タンパク質の量には漸増がある。結合材料の量を示すために、サンプルを煮沸して、集合のＳＤＳ抵抗性の性質を破壊した。（Ｂ）パネルＡと同様だが、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ前に煮沸しなかった。注記、追加の重合ステップと合致しているＳＤＳ抵抗性重合体の分子量の増加。
【図２１】ＳＮＡＲＥタンパク質から形成された分岐多量体の略図である。
【図２２】シナプトブレビン２残基（２９−８４）（リンカーなし）に直接的融合させたシンタキシン残基（１−２５３）から形成された融合構築物の略図である。
【図２３】簡単な混合によって溶液中でＳＮＡＲＥ束が多量体化できることを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。
【図２４】ＳＮＡＲＥタグ付与が、神経終末へのＨｃ介在量子ドットの送達を可能にすることを示している。ａ．ＢｏＮＴ／ＡのＨｃ部とＬｃＨＮ部のＳＮＡＲＥ結合を示す図解。個々のサブユニットは、構造モデルと同じように示されている（出典Lacy et al, 1998）。ｂ．ボツリヌス神経毒素（Ｈｃ）のＳＶ２Ｃ結合部とストレプトアビジン・コートした量子ドットの結合のためのＳＮＡＲＥタグ付与スキームを示す図解。ビオチン（星印）−シンタキシン・ペプチド（青色）は、量子ドットのＳＮＡＲＥタグ付与を可能にするが、ＨｃはシナプトブレビンＳＮＡＲＥモチーフ（紫色）に融合される。ＳＮＡＰ２５（緑色と赤色）はＨｃへのＱ−ドットの結合を可能にする。ｃ．Ｈｃ−シナプトブレビン、ＳＮＡＰ２５およびビオチン化シンタキシン３ペプチドの、ＳＤＳ抵抗性複合体であるＨｃ−ＳＮＡＲＥ−ビオチンへの不可逆的な集合を示すクーマシー染色したＳＤＳゲル。ｄ．Ｈｃ−ＳＮＡＲＥ−Ｑ−ドットは、培養海馬ニューロンの軸索伸長時にシナプス小胞マーカーであるシナプトフィジンの免疫染色によって証明されるシナプス結合を示している。集合中のＳＮＡＰ２５の脱落は、シナプス末端へのＱ−ドットの標的化を妨げる。
【図２５】ＳＮＡＲＥタグ付与がＢｏＮＴ／Ａの個々のパーツの、単一の分子実体への段階的な集合を可能にすることを示している。ａ．ＬｃＨＮとＢｏＮＴ／ＡのＨｃ成分のジスルフィド結合およびＳＮＡＲＥタグ付与の位置を示す略図。ｂ．ＳＮＡＰ２５でタグ付与したＬｃＨＮは、精製され、そして５０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）での処理の後にＬｃとＨＮ−ＳＮＡＰ２５に分解され得る。クーマシー染色したＳＤＳゲル。ｃ．クーマシー染色し、そして蛍光的に像を得たＳＤＳゲルによって証明されるように、シンタキシン３ペプチドの付加により、シナプトブレビンでタグ付与したＨｃと結合し得る、ＳＮＡＰ２５でタグ付与したＬｃＨＮ。
【図２６】ＳＮＡＲＥ結合ボツリヌス神経毒素が、シナプス局在性を示し、そしてそのシナプス内標的を開裂することを示している。ａ．フルオレセイン標識ＬｃＨＮ−ＳＮＡＲＥ−Ｈｃは、海馬ニューロンの軸索伸長部に結合する。抗シナプトフィジン抗体を用いた免疫染色で、培養海馬ニューロンのシナプス前末端を明らかにする。ｂ．天然のＢｏＮＴ／Ａに類似した様式での集合した神経毒によるシナプス内ＳＮＡＰ２５の開裂を示す免疫ブロット。
【図２７】ＳＮＡＲＥ結合ボツリヌス神経毒素が、神経伝達物質放出を阻害することを示している。ａ．分離したラット脳神経終末（シナプトソーム）からのグルタミン酸放出に関する蛍光分析測定は、ＬｃＨＮ−ＳＮＡＲＥ−ＨｃとＢｏＮＴ／Ａの間の同程度の阻害を示している。毒素とのシナプトソームの１時間のインキュベーションに続いて、リアルタイム・グルタミン酸放出グラフ（上のパネル）および用量依存性グラフ（下のパネル、３５ｍＭのＫＣｌおよび２ｍＭのＣａＣｌ₂での１５分間の刺激後に評価した）を得た。ｂ．１５分間の刺激後に評価されるとおり、個々のＳＮＡＲＥタグ付与した神経毒のパーツは、シナプトソームとの１時間のインキュベーション後に、グルタミン酸放出を妨げることはない。ｃ．ＬｃＨＮ−ＳＮＡＲＥ−Ｈｃによるマウス横隔膜の等尺性収縮の用量依存的阻害を示すグラフ。エラーバーはＳＥＭ；ｎ＝３を表す。
【図２８】ＬｃＨｎをシンタキシン（１９５−２５３）でタグ付与したが、Ｈｃをシナプトブレビン（２５−８４）でタグ付与したことを示している。２つのボツリヌスのパーツを、ＳＮＡＰ−２５の存在下で混合し、そして毒素形成をクーマシー染色したＳＤＳ−ゲル上で可視化した。
【図２９】パネルＡからのＬｃＨｎＳｙｘ３−ＳＮＡＰ２５−シナプトブレビンＨｃ毒素との１時間のインキュベーション後に、ラット脳シナプトソームからのグルタミン酸放出の遮断を評価したことを示している。
【図３０】海馬ニューロンに対してパネルＡからの毒素ＬｃＨｎＳｙｘ３−ＳＮＡＰ２５−シナプトブレビンＨｃＡの適用後の触媒パートＬｃの神経細胞内標的の開裂を、抗ＳＮＡＰ−２５抗体を使用した免疫ブロッティングによって評価したことを示している。再集合した毒素は、ＳＮＡＰ−２５を開裂する際に天然ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ／ａ）と類似した活性を有する。注記、このニューロン・アッセイにおいて、ＬｃＨｎＳｙｘ３−ＳＮＡＰ２５−シナプトブレビンＨｃＡが、ＬｃＨｎＳｙｘ３−ＳＮＡＰ２５−シナプトブレビンＨｃＤより効果的である。
【図３１】ソマトスタチン・ペプチドＡｃ−ＲＬＱＱＴＱＡＱＶＤＥＶＶＤＩＭＲＶＮＶＤＫＶＬＥＲＤＱＫＬＳＥＬＤＤＲＡＤＡＬ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ＡＧＣＫＮＦＦＷＫＴＦＴＳＣ−ＯＨを持つシナプトブレビン４０アミノ酸モチーフのＳＮＡＲＥタグ付与が、ソマトスタチン−量子ドットの作成を可能にすることを示している。ストレプトアビジン・コートした量子ドットを、ビオチン化シンタキシン・ペプチドと共にインキュベートし、次いでソマトスタチン−シナプトブレビンおよびＳＮＡＰ−２５と混合した。集合したソマトスタチン−Ｑ−ドットを培養海馬ニューロンに適用し、そしてそれらの神経性細胞への侵入を、Ｑ−ドットの蛍光発光と、たくさんの神経細胞内タンパク質を標識する抗ＳＮＡＰ−２５抗体を用いた対比染色によって可視化した。
【図３２】ソマトスタチン・ペプチドを用いたシナプトブレビン４０アミノ酸モチーフのＳＮＡＲＥタグ付与が、ＬｃＨｎシンタキシン３およびＳＮＡＰ−２５との混合後に機能性ソマトスタチン−ボツリヌス構築物の作成を可能にすることを示している。ＬｃＨｎシンタキシン３−ＳＮＡＰ２５−シナプトブレビン・ソマトスタチン（ＳＳ−ＬｃＨＮ）の活性を、集合した毒素の２０時間の適用後の培養海馬ニューロンにおけるＳＮＡＰ−２５の開裂によって評価した。
【図３３】Ｎ末端切断のあるＳＮＡＲＥモチーフを使用した安定したＳＤＳ抵抗性複合体の形成を示すＳＤＳゲルである。
【図３４】Ｃ末端切断のあるＳＮＡＲＥモチーフを使用した安定したＳＤＳ抵抗性複合体の形成を示すＳＤＳゲルである。
【図３５】内部メチオニンが非易酸化性（non-oxidizable）ノルロイシンに置き換えられているシンタキシンＳＮＡＲＥペプチドを使用した安定したＳＤＳ抵抗性複合体の形成を示すＳＤＳゲルである。
【図３６】さまざまな異なるＳＮＡＲＥペプチドを使用した安定したＳＤＳ抵抗性複合体の形成を示す多くのＳＤＳゲルである。
【図３７】短縮型ＳＮＡＲＥペプチドを使用した安定したＳＤＳ抵抗性複合体の形成を示すＳＤＳゲルである。
【図３８】短縮型ＳＮＡＲＥペプチドを使用した安定したＳＤＳ抵抗性複合体の形成を示すＳＤＳゲルである。
【図３９】短縮型ＳＮＡＲＥペプチドを使用した安定したＳＤＳ抵抗性複合体の形成を示すＳＤＳゲルである。
【図４０】神経ペプチドがＳＮＡＲＥペプチドのうちの１つと複合体形成した場合の、安定したＳＤＳ抵抗性複合体の形成を示すＳＤＳゲルである。
【図４１】アルギニン／バソプレッシンペプチド（ＡＶＰ）がシンタキシン・ペプチドのＮ末端またはＣ末端と複合体形成した場合の、安定したＳＤＳ抵抗性複合体の形成を示すＳＤＳゲルである。
【図４２】４０個未満のアミノ酸しか含まないＳＮＡＲＥペプチドを使用した安定した複合体の形成を示すＳＤＳゲルである。
【図４３】ＳＮＡＲＥペプチドに対するタンパク質のマレイミドベースの架橋を示すＳＤＳゲルである。
【図４４】ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）基材に関する６５０ｎｍにおける吸光度を示している。
【図４５】発光を示すフィルムの一部である。
【図４６】原文説明なし。
【図４７】原文説明なし。
【実施例】
【０１２４】
序論
機能ユニットの制御された、不可逆的な、非化学的結合のためにＳＮＡＲＥ由来ポリペプチドで作られた束状または線状形状の足場。
【０１２５】
発明者らは、簡単な混合によって機能性または構造ユニットを結合する方法を開発した。自己集合によるナノメートルサイズの明確に定義された、機能性超分子構造の創出は、生命生物科学、薬学およびナノ技術においてプログラムされた作業を実施するための手段を提供する。具体的には、本発明は、図２に示されている束状または線状多量体の不可逆的かつ部位選択的様式での複数の機能ユニットの制御された結合に関する、まだ満たされていない要求に関する。この新技術の核心部は、タンパク質ドメインの結合に関するＳＮＡＲＥタンパク質、および実際には任意の想定される化学物質の特有の性質の活用にある。本来は、これらのタンパク質は、シンタキシン、ＳＮＡＰ−２５、およびシナプトブレビンで構成された三部分複合体（ＶＡＭＰ−小胞結合膜タンパク質としても知られている）を形成することによって原形質膜への小胞の融合を駆動する。このＳＮＡＲＥ複合体は、ＳＮＡＰ−２５からの２本のヘリックス、シンタキシンからの１本のヘリックスおよびシナプトブレビンからの１本のヘリックスを含んでなり；それぞれのヘリックスの長さが〜６０−７０アミノ酸である（Jahn and Scheller（2006））４本らせんのコイルドコイル束である（図３）。この４本ヘリックス束は、ＳＤＳ中でさえ異常に安定している−ＳＮＡＲＥ集合の不可逆的性質の直接的な指標である（Hu, K et al., 2002）。
【０１２６】
リガンドと他の官能基の二量体化、オリゴマー化、多量体化のために、これまでさまざまなストラテジーが用いられてきた。このうち、小さな（＜５ｋＤａ）ペプチドの化学的架橋（Pillai et al., 2006；Tweedle, 2006）、トランスグルタミナーゼ触媒ヘテロ二量化（Tanaka et al., 2004）、およびビオチン化リガンドの四量体ストレプトアビジン結合（Leisner et al., 2008）が、機能ユニットを結合に関するいくつかの例を示している。加えて、コイルドコイルは、タンパク質工学、生物工学、生体材料、基礎研究および薬学を含めたさまざまな用途におけるオリゴマー化のためのデザイン雛型として相当な興味を引いた（Engel and Kammerer, 2000；O'Shea et al., 1993；Scherr et al., 2007）。有用なオリゴマー化ドメインの例は、平行なコイルドコイル・ホモ二量体を形成する３３残基と４６残基のホモ五量体コイルドコイルＣＯＭＰｃｃを含んでなるＧＣＮ４のロイシンジッパーである（Engel and Kammerer, 2000）。さまざまな用途のためのコイルドコイルの選択は、いくつかの特徴：コイルドコイル・ポリペプチドの長さ、それらの溶解性、ホモまたはヘテロ・オリゴマー化を可能にするそれらの能力；およびコイルドコイルの濃度、すなわち、定常および不利な条件下で解離に耐える能力、に依存する。
【０１２７】
ＳＮＡＲＥコイルドコイル束の独特の性質、例えばヘテロ四量体化やＳＮＡＲＥ集合の不可逆的性質などは、利用に関してまだ考慮されていない。ＳＮＡＲＥ束の使用の核となる概念は、異なるカーゴ（蛍光、放射性、免疫、化学的、親和性など）の組み合わせを運ばなければならない診断的／治療的／生物工学的タンパク質を生じさせる手段に関する。発明者らは、異なる個々の成分から自己集合が可能な、明確に定義された、組織化されたヘテロ四量体超分子構造の製造のための、シンタキシン、ＳＮＡＰ−２５およびシナプトブレビン・タンパク質ベースの遺伝子操作されたポリペプチドの使用を提案した。発明者らは、最初に、四および三成分束の最小限のコアを規定し；２番目に、発明者らは、不可逆的結合のための二成分捕捉系を説明し；そして３番目に、発明者らは、線状多量体を製造する上でのＳＮＡＲＥ束の有用性を示している。
【０１２８】
実施例１：四成分束
発明者らは、短縮型ＳＮＡＲＥヘリックスが、四成分束としての機能ユニットの集合に使用できることを示している。短縮型ＳＮＡＲＥヘリックスの使用は、合成経路を介したＳＮＡＲＥペプチドへの化学物質の付加に不可欠である。現在のところ、ペプチド合成は、〜５０アミノ酸については十分信頼でき、かつ、金銭的にも実現可能である。そのため、ＳＮＡＲＥヘリックスが短縮されるのであれば、更なるペプチド配列または他の化学物質の付加を可能にする上で有利であろう。単一ＳＮＡＲＥモチーフを短縮することが不可逆的なＳＮＡＲＥ集合の崩壊に通じることが知られている（Hao et al., 1997）。発明者らは、（１）４本のヘリックスすべての４５アミノ酸ペプチドへの切断でも、安定した４本ヘリックス複合体がまだ可能なままであること、および（２）さまざまな官能基がこれらのペプチドのいずれの末端にも付加できることが分かった。このことが、（リガンドのアレイの提示、または受容体の多量体化が所望される）親和性試薬とキットまたは多価治療薬を含めたさまざまな用途に向けた束における多価複合体の簡単な製作を可能にする。４本の個別のヘリックスの遊離末端は、合成または遺伝子組み換え手段によって、望ましい空間的な組み合わせによる最大８つの別個のものの付加に使用できる。
簡潔にするために、発明者らは、不可逆的なヘテロオリゴマータンパク質複合体を４本ヘリックスコンビナトリアル足場（ＴｅｔｒｉＣＳ）と呼ぶ。
【０１２９】
発明者らは、４０個または４５個のアミノ酸のいずれかを含むＴｅｔｒｉＣＳペプチドを合成した。
４０アミノ酸（ａａ）：
ラット・ＳＮＡＰ２５Ａヘリックス１（第２８−６７アミノ酸）ビオチン含有：
ＳＴＲＲＭＬＱＬＶＥＥＳＫＤＡＧＩＲＴＬＶＭＬＤＥＱＧＥＱＬＤＲＶＥＥＧＭＮＨＩＧＳＧＧＧ−ビオチン（配列番号１）
（４０アミノ酸のＳＮＡＲＥ配列がボールド体）；
ラット・ＳＮＡＰ２５Ａヘリックス２（第１４９−１８８アミノ酸）６−ヒスチジン標識含有：
ＮＬＥＱＶＳＧＩＩＧＮＬＲＨＭＡＬＤＭＧＮＥＩＤＴＱＮＲＱＩＤＲＩＭＥＫＡＤＳＮＧＳＧＧＧＨＨＨＨＨＨ（配列番号２）
（４０アミノ酸のＳＮＡＲＥ配列がボールド体）；
【０１３０】
ラット・シンタキシン・１Ａ（第２０１−２４０アミノ酸）６−ヒスチジン標識およびシステイン含有：
ＥＩＩＫＬＥＮＳＩＲＥＬＨＤＭＦＭＤＭＡＭＬＶＥＳＱＧＥＭＩＤＲＩＥＹＮＶＥＨＡＧＳＧＧＧＨＨＨＨＨＨＣ（配列番号３）
（４０アミノ酸のシンタキシン配列がボールド体）；
ラット・シナプトブレビン−２（アミノ酸３１−７０）モノクローナル抗体認識のためのＳタグエピトープ含有：
ＲＬＱＱＴＱＡＱＶＤＥＶＶＤＩＭＲＶＮＶＤＫＶＬＥＲＤＱＫＬＳＥＬＤＤＲＡＤＡＬＧＳＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ（配列番号４）
（４０アミノ酸のＳＮＡＲＥ配列がボールド体）；
【０１３１】
平行して、発明者らは、４５アミノ酸の長さのＴｅｔｒｉＣＳペプチドを試験した：
ラット・ＳＮＡＰ２５Ａヘリックス１（第２８−７２アミノ酸）ビオチン含有：
ビオチン−ＳＴＲＲＭＬＱＬＶＥＥＳＫＤＡＧＩＲＴＬＶＭＬＤＥＱＧＥＱＬＤＲＶＥＥＧＭＮＨＩＮＱＤＭＫＣ（配列番号５）
（４５アミノ酸のＳＮＡＲＥ配列がボールド体）；
ラット・ＳＮＡＰ２５Ａヘリックス２（第１４９−１９３アミノ酸）システインおよび６−ヒスチジン標識含有：
ＣＮＥＭＤＥＮＬＥＱＶＳＧＩＩＧＮＬＲＨＭＡＬＤＭＧＮＥＩＤＴＱＮＲＱＩＤＲＩＭＥＫＡＤＳＮＫＴＲＩＤＧＧＨＨＨＨＨＨ（配列番号６）
（４５アミノ酸のＳＮＡＲＥ配列がボールド体）；
【０１３２】
ラット・シンタキシン・１Ａ（第２０１−２４５アミノ酸）Ｎ末端抗体エピトープおよびシステイン含有：
Ａｃ−ＡＥＤＡＥＩＩＫＬＥＮＳＩＲＥＬＨＤＭＦＭＤＭＡＭＬＶＥＳＱＧＥＭＩＤＲＩＥＹＮＶＥＨＡＶＤＹＶＥＣ（配列番号７）
（４５アミノ酸のＳＮＡＲＥ配列がボールド体）；
ラット・シナプトブレビン２（第３１−７５アミノ酸）抗体認識のためのＮ末端エピトープ含有：
ＭＳＡＴＡＡＴＶＰＰＡＡＰＡＧＥＧＧＰＰＡＰＰＰＮＬＴＳＮＲＲＬＱＱＴＱＡＱＶＤＥＶＶＤＩＭＲＶＮＶＤＫＶＬＥＲＤＱＫＬＳＥＬＤＤＲＡＤＡＬＱＡＧＡＳ（配列番号８）
（４５アミノ酸のＳＮＡＲＥ配列がボールド体）。
【０１３３】
４０または４５アミノ酸ペプチドを、２０℃にて６０分間インキュベートし、そしてそれらの集合をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。図４は、４５アミノ酸Ｔｅｔｒｉｃｓペプチドが不可逆的なＳＮＡＲＥ複合体を形成することができた（パネルＡ）一方で、４０アミノ酸ペプチドがそうでなかった（パネルＢ）ことを示している。
【０１３４】
集合体の機能性をプルダウン実験で試験した。発明者ら、機能ユニットとして、ＧＳＴタグ付与したシナプトブレビン（４５アミノ酸ＳＮＡＲＥ配列、細菌において遺伝子組み換えにより作製した）、ＳＮＡＰ−２５のヘリックス１に化学的に結合させたビオチンおよびＳＮＡＰ−２５のヘリックス２に結合させた６−ヒスチジン・タグを使用した。発明者らは、グルタチオン・ビーズ（ＧＳＴ結合について）またはニッケル・ビーズ（６−ヒスチジン・タグの結合について）へのＴｅｔｒｉＣＳ集合体の結合と、それに続く蛍光ストレプトアビジン（ビオチンへの結合について）の結合を試験した。図５は、ストレプトアビジンが、グルタチオンまたはニッケル・ビーズのいずれかに非常に特異的な様式で結合した４５ａａ ＴｅｔｒｉＣＳに結合できたことを示している。
【０１３５】
これらの結果は、４５ａａ ＴｅｔｒｉＣＳペプチドがさまざまな官能基の結合に、それらの機能特性を損ねることなしに使用できることを示している。４つのＴｅｔｒｉｃｓペプチドには８つの遊離末端があるので、８つの異なる基を結合することが可能である。よって、ＴｅｔｒｉＣＳは、所定の作用を実施する適当に設計された分子成分から構築した構造的に組織化されていて、機能的に統合されている系と規定される機能性超分子デバイスの開発を可能にする（Lehn, 2007）。
【０１３６】
実施例２：三成分束
８つ未満の基を結合させるべき場合では、簡易型ＴｅｔｒｉＣＳ集合を持っていることは有用である。実際、既に２つのＳＮＡＲＥヘリックスを持つ完全長ＳＮＡＰ−２５分子（第１−２０６アミノ酸）を利用することが可能である（図６を参照のこと）。
そのため、発明者らは、先に記載した４０、４５ａａラット・シンタキシン１Ａおよびシナプトブレビン２ペプチドが完全長のラットＳＮＡＰ−２５Ｂと不可逆的な集合体を形成できるかどうか試験した。図７は、４０（パネルＡ）と４５ａａ（パネルＢ）ペプチドの両方がＳＮＡＰ２５Ｂと集合できることを示し、そして三成分系において、４０ａａ長のペプチドでも完全長のＳＮＡＰ−２５への不可逆的結合に十分であることを実証している。
【０１３７】
発明者らは、以下のものを含有する４０ａａ Ｔｅｔｒｉｃｓ集合体の機能性を試験した：
（ｉ）完全長のラットＳＮＡＰ２５Ｂ（第１−２０６アミノ酸）システイン８４、８５、９０、９２のアラニンへの置換を含む。これは、ＳＮＡＰ−２５の発現と精製に役立つことが知られている（Fasshauer et al., 1999）。
（ｉｉ）合成シンタキシン−ｍｙｃペプチド（４０アミノ酸のシンタキシン配列がボールド体）
ＥＩＩＫＬＥＮＳＩＲＥＬＨＤＭＦＭＤＭＡＭＬＶＥＳＱＧＥＭＩＤＲＩＥＹＮＶＥＨＡ−ＧＳＧＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＣ（配列番号９）。
（ｉｉｉ）合成シナプトブレビン−Ｓタグペプチド（４０アミノ酸のシナプトブレビン配列がボールド体）
ＲＬＱＱＴＱＡＱＶＤＥＶＶＤＩＭＲＶＮＶＤＫＶＬＥＲＤＱＫＬＳＥＬＤＤＲＡＤＡＬ−ＧＳＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ（配列番号４）。
【０１３８】
ＧＳＴ融合ＳＮＡＰ−２５のグルタチオン・ビーズへの結合に続いて、集合した三成分ＴｅｔｒｉＣＳが蛍光抗Ｍｙｃ抗体および蛍光Ｓ−タンパク質に結合する能力によって、集合体の機能性を試験した（図８）。ビーズ上の単独のＧＳＴ−ＳＮＡＰ−２５を用いた対照反応はわずかな結合しか示さなかったが、その一方で、４０ａａシンタキシンおよびシナプトブレビン・ペプチドの付加は、抗Ｍｙｃ抗体およびＳ−タンパク質の両方のグルタチオン・ビーズへの強固な結合によって証明されるように、三成分ＴｅｔｒｉＣＳの形成をもたらした。
【０１３９】
発明者らは、４０ａａ合成ペプチドが単一の不可逆的な複合体内でさまざまなタグの集合を可能にするとの結論を下した。その三成分系は、２つ短いポリペプチドとＳＮＡＰ−２５分子との自己集合セットを意味し、そしてタンパク質の簡単な６通りの多機能タグ付与を可能にする。
【０１４０】
次に、発明者らは、厳しい処理に耐える４０ａａ三成分ＴｅｔｒｉＣＳの能力を試験するために表面プラズモン共鳴法を使用した。発明者らは、Biacore CM5チップにＧＳＴタグ付与ＳＮＡＰ−２５Ｂを化学的に結合させ、続いて４０ａａシンタキシンおよびシナプトブレビン・ペプチドを結合させ、次いで抗体を結合させた。図９は、ペプチドの結合が安定しており、かつ、チップの表面への抗ｍｙｃ抗体の結合を可能にすることを示している。０．１％のＳＤＳの添加では、抗体は外れたが、固定化したＳＮＡＰ−２５からペプチドは外れなかった。
【０１４１】
実施例３：二成分束
発明者らはさらに、不可逆的なＳＮＡＲＥ集合体を二成分系に簡素化した。二成分の親和性ベースのツールは、すべての基礎研究の基礎となり、そして薬物および診断法の開発において非常に貴重である（Uhlen, 2008）。用途には、親和性クロマトグラフィー、マイクロアレイ技術、マイクロプレート・ベースのスクリーン、および多くのバイオテクノロジー工程が含まれる。これらの用途で成功を収める主な要因は、固体表面または三次元マトリックスのいずれかにおいて規定された配向でタンパク質の堅く、不可逆的な固定化に依存する。いくつかの最近の総説は、既存の固定化技術の多くの不都合を明らかにした（Kohn, 2009； Tomizaki et al., 2005）。例えば、化学的なタンパク質カップリングの場合には、当業者は不可逆的な表面固定化を実現できるが、生成物は、配向性の問題や化学修飾のため無機能の状態である可能性もある。対照的に、タンパク質をさまざまなタグ（ＧＳＴ、Ｈｉｓタグ、抗ｍｙｃおよび他の抗体認識エピトープ）を使用した部位選択性の方法により対応する表面（グルタチオン、金属、抗体で覆われたもの）に結合させることが可能であるが、しかし、これらの場合のすべてで、固定化は永久的でない（既存のペプチド親和性タグのすべては解離する）および／または非常に高価である（抗体ベースの親和性表面）。明らかなことには、理想的な固定化技術は、標的タンパク質の不可逆的なカップリングと部位選択的配向の両方を可能にするべきであり、加えて、現在の抗体ベースのアプローチに比べてかなり安くなくてはいけない。別個には、機能性配向での２つのタンパク質の不可逆的な結合は、それらが不可逆的に結合するペプチドを伴って発現されれば、可能になる。
【０１４２】
二成分系のために、発明者らは２本らせんＳＮＡＰ−２５と一緒に、新たに設計したシンタキシン／シナプトブレビン融合タンパク質を使用した（図１０を参照のこと）。
【０１４３】
第一の実施形態において、発明者らは、図１１で例示されるように、ラット・シンタキシン１Ａ ＳＮＡＲＥモチーフ（第１９５−２５４アミノ酸）をラット・シナプトブレビン２ＳＮＡＲＥモチーフ（第２５−８４ａａ）と結合させた。シンタキシンとシナプトブレビン配列の間の短い一連のアミノ酸（ＧＩＬＤＳＭＧＲＬＥＬＫＬ（配列番号１０）、小さい矢印）は、ハイブリッドプラスミドの多重クローニング部位のためである。
【０１４４】
発明者らは、融合タンパク質を精製したが、それにはＳＮＡＰ−２５とのＳＮＡＲＥ複合体の形成を妨げるシンタキシン１モチーフを介して凝集する傾向があることが分かった。次に、発明者らは、シナプトブレビン２とラット・シンタキシン３の融合を生じさせた。このキメラ内で、発明者らは、短い一連のアミノ酸を介してラット・シンタキシン３のＳＮＡＲＥモチーフ（第１９５−２５３アミノ酸）をラット・シナプトブレビン２配列１−８４に融合させた。シンタキシンとシナプトブレビン配列の間の短い一連のアミノ酸（ＧＩＬＤＳＭＧＲＬＥＬＫＬ）は、シンタキシン３とシナプトブレビン２の間の機能ユニットの挿入を可能にするハイブリッドプラスミドの多重クローニング部位のためである。ラットＳＮＡＰ−２５Ｂと混合した場合、このシンタキシン３−シナプトブレビン２融合タンパク質は、図１２で例示されるように、不可逆的な複合体に素早く集合した。
【０１４５】
次のキメラにおいて、発明者らは、短い一連のアミノ酸を介してラット・シナプトブレビン２配列１−８４に融合されたラット・シンタキシン３のヘッドドメインとＳＮＡＲＥモチーフの両方（第１−２６０アミノ酸）を使用した（図１３を参照のこと）。シンタキシンとシナプトブレビン配列の間の短い一連のアミノ酸（ＧＩＬＤＳＭＧＲＬＥＬＫＬ（配列番号１０））は、シンタキシン３とシナプトブレビン２の間の機能ユニットの挿入を可能にするハイブリッドプラスミドの多重クローニング部位のためである。
【０１４６】
シンタキシン３のヘッドドメインはＳＮＡＲＥ集合からＳＮＡＲＥモチーフを保護するが、特定の脂質はＳＮＡＲＥ集合のためにシンタキシンを「開状態にする」ことができると知られている（Darios and Davletov, 2006；Rickman and Davletov, 2005）。発明者らによる未発表の研究は、オクチルグルコピラノシドと呼ばれる弱い界面活性剤が、シンタキシン３分子を「開状態にする」こともできると示した。よって、発明者らは、シンタキシンＳＮＡＲＥモチーフを制御でき、かつ、制御された様式でＳＮＡＲＥ複合体を形成できる。図１４Ａは、ＳＤＳゲルにおいて試験されるような制御された二成分集合の一例を示している。発明者らはさらに、他の界面活性剤または類似した脂質化合物、例えばＭＥＧＡ８、Ｃ−ＨＥＧＡ１０、Ｃ−ＨＥＧＡ１１、ＨＥＧＡ９、ヘプチルグルコピラノシド、オクチルグルコピラノシド、ノニルグルコピラノシド、zwittergent 3-08、zwittergent 3-10およびzwittergent 3-12などには同じ効果があることがわかった。
【０１４７】
表面プラズモン共鳴実験は、さまざまな破壊剤（disrupting agents）に対するこの二成分集合の優れた抵抗性を実証した（図１５）。
代替の二成分系として、発明者らは、一つの小さいタグを含む二成分親和性試薬を作り出したが、その試薬では、短いシンタキシン・ヘリックス（＜５ｋＤａ）が図１６Ａに図式的に示した新たに設計した三重らせんＳＮＡＲＥ融合タンパク質（〜２７−３１ｋＤａ）に不可逆的に結合できる。このキメラにおいて、発明者らは、２本のＳＮＡＰ−２５ＳＮＡＲＥヘリックス（第２２−２０６アミノ酸）をシナプトブレビン２配列のＳＮＡＲＥモチーフ１−８４に融合した。ＳＮＡＰ−２５とシナプトブレビン配列の間のリンカーＧＳＧＳＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧ（配列番号１１）は、ｍｙｃタグエピトープを持つ。先に記載したシンタキシンの４０または４５アミノ酸ペプチドと混合した場合、三重らせん融合タンパク質は、図１６Ｂに例示されるように、素早く不可逆的な複合体に集合した。
【０１４８】
これらの二成分系は、現在の親和性タグに対する有用な代替手段である（Terpe, 2003）。二成分捕捉系の両方のタグは、細菌において発現され、そして部位選択的様式で、遺伝子組み換え製造のために任意のタンパク質に容易に付加される−これは、ビオチン／ストレプトアビジンまたは類似した非常に高い親和性の系と異なっている（ビオチンをタンパク質の一部として発現させることはできない）。高度に希釈した溶液からの迅速な捕獲は、二成分親和性試薬の不可逆的性質のため現在可能であるが−他のそういった系は現在存在しない。必要な場合には、二成分系内のタグのいずれかを、ビーズ、チップ、マイクロアレイプレートの表面に化学的に結合でき、そして官能基の化学的または遺伝子組み換えによる導入によって修飾できる。
【０１４９】
細菌抽出物からのタンパク質の精製のために二成分系を使用する例として、発明者らは、最初に、短い一連のアミノ酸を介してラット・シナプトブレビン２配列１−８４（前記）に融合したラット・シンタキシン３のＳＮＡＲＥモチーフ（第１９５−２５３アミノ酸）を含む２本らせん融合タンパク質を、ＢｒＣＮ−セファロースビーズに固定化した。発明者らはさらに、ＳＮＡＰ−２５Ｂにグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と呼ばれる酵素を融合させ、そして大腸菌において後者の融合タンパク質を発現させた。2%の界面活性剤（zwittergent 3-08と呼ばれるもの）を使用した細菌細胞膜の崩壊後に、細菌抽出物を、シンタキシン３／シナプトブレビン２融合タンパク質を含有するセファロース・ビーズ上に投入した。洗浄後に、ビーズをＳＤＳ−ＰＡＧＥとクーマシー染色によって分析した。図１７は、ＧＳＴ−ＳＮＡＰ２５が、シンタキシン３／シナプトブレビン２融合タンパク質を持つセファロース・ビーズに非常に特異的な様式で結合することを示している。
【０１５０】
実施例４：制御された線状重合反応
束形状での複数の基の結合に加えて、ＳＮＡＲＥタンパク質はまた、図１８で示されるような無限長の強固な線状多量体の形態で高度な超分子デバイスを生じさせる可能性も提供する。
そういった方向性において、発明者らの集合は、生体材料が新規線状超分子構造を生じるように分子単位で集合する、独特なアプローチを意味する（応用の可能性の総説について（Hinman et al, 2000；Lehn, 2007；Ryadnov and Woolfson, 2003； Zhang, 2003））。
【０１５１】
この場合、発明者らは、二成分系のために先に記載したシンタキシン３−シナプトブレビン２融合タンパク質を使用した（短い一連のアミノ酸を介してラット・シナプトブレビン２配列１−８４に融合したラット・シンタキシン３（第１−２６０アミノ酸））。しかしながら、溶液中でＳＮＡＰ−２５とシンタキシン３−シナプトブレビン２融合体を混合する代わりに、発明者らは、重合反応を開始するのにヘッドドメインを含む単独のシンタキシン３ポリペプチド（ＧＳＴに融合した第１−２６０アミノ酸）を伴った固体支持体を使用した。発明者らは、最初に、ＧＳＴタグを介してグルタチオン・ビーズにＧＳＴ−シンタキシン３分子単体を固定化した。次いで、発明者らは、０．８％のオクチルグルコピラノシドの存在下で、シンタキシン３／ＳＮＡＰ−２５二成分複合体の形成を可能にするＳＮＡＰ２５Ｂ分子（第１−２０６アミノ酸）を加えた。結合していないＳＮＡＰ−２５を取り除くためのビーズ洗浄後に、発明者らはシンタキシン３−シナプトブレビン２融合タンパク質を加えた。２つのビルディングブロックを加えるこの工程を、必要な回数だけ繰り返した。その工程を図１９に示す。
【０１５２】
図２０Ａは、先の工程の経過と共にシンタキシン３−シナプトブレビン２融合体とＳＮＡＰ−２５の両方の量が段階的に増加することを示している。ビーズへの結合に使用されるＧＳＴ−シンタキシン３の量が一定のままであるのに対して、結合したＳＮＡＰ−２５およびシンタキシン３−シナプトブレビン２融合タンパク質の量は漸増する。結合した物質の量を示すため、集合体のＳＤＳ抵抗性の性質を乱すために、サンプルを煮沸した。図２０Ｂは、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ前に煮沸しなかったとき、追加の重合ステップに沿ったＳＤＳ抵抗性重合体の分子量の増大を示している。
【０１５３】
先の工程においてステップごとに制御されているので、望ましい位置に必要なカーゴを、個別のＳＮＡＰ−２５またはシンタキシン３−シナプトブレビン融合タンパク質に任意の重合ステップで加えることが可能である。ＳＮＡＰ−２５およびシンタキシン３−シナプトブレビンは、さまざまの分子構造の制御された製作のためのビルディングブロックである。用途には、機能性化したナノ繊維、複数のリガンドマイクロアレイ、スーパー分子酵素集合体、新しい電子デバイスおよびバイオテクノロジーや薬学における使用のための生体材料の製作が含まれる（応用の可能性の総説について（Zhang, 2003））。
【０１５４】
先に記載のように、シンタキシン−シナプトブレビン−シンタキシンまたはＳＮＡＰ２５−シンタキシン融合タンパク質を使用して、図２１で示されるように特定の地点にて線状足場内の分岐を形成することも可能である。
最終的に、発明者らは、表面上ではなく、溶液中で２つの成分を単純に混合することによって線状重合体を作ることの可能性を探った。発明者らは、２つのＳＮＡＲＥタンパク質間のリンカー領域を取り除いたシンタキシン３−シナプトブレビン２融合タンパク質の修飾型を利用した。この融合構築物には、シナプトブレビン２残基（２９−８４）に直接融合したシンタキシン３残基（１−２５３）がある。図２２を参照のこと。
【０１５５】
発明者らは、ラットＳＮＡＰ−２５Ｂ（第１−２０６ａａ）と融合タンパク質とを混合し、そして６０分間の反応をＳＤＳゲル電気泳動によって分析した。図２３は、ＳＮＡＲＥ束が溶液中での簡単な混合によって多量体化できることを示している。
そのため、先に記載した二成分系は、溶液中での多量体化が可能であり、それは１〜４個のタンパク質機能ドメインを線状の形状で結合する方法を提供する。加えて、完全にＳＤＳ抵抗性の線状重合体のタンパク質ベースの製作は、ジョロウグモの多成分系集合体または現在のコイルドコイル・ナノ繊維より優れた特性を有する生分解性繊維の構築に使用できる。総説について、Hinman et al., 2000；Ryadnov and Woolfson, 2003を参照のこと。
【０１５６】
実施例１−４で使用したポリペプチドの配列（対応する図面の表示つき）：
Ｓｙｘ３（１−２６０）／Ｓｙｂ２（１−８４）（図１３、１４および２０）（ヘッドドメインとリンカーを含むシンタキシン）−配列番号１２
Ｓｙｘ３（１９５−２５３）／Ｓｙｂ２（１−８４）（図１２および１７）（ヘッドドメインは無いがリンカーを含むシンタキシン）−配列番号１３
Ｓｙｘ３（１−２５３）／Ｓｙｂ２（２９−８４）（図２２）（ヘッドドメインを含むがリンカーが無いシンタキシン）−配列番号１４
ＳＮＡＰ−２５Ｂ（２０−２０６）／Ｓｙｂ２（１−８４）（図１６Ｂ）−配列番号１５
【０１５７】
実施例５：ＳＮＡＲＥタグ付与は、ボツリヌス神経毒素の段階的な集合を可能にする
概要
好適なビルディングブロックの制御された結合によるナノメートルサイズの規定された、機能性超分子構造の創出は、医学と応用技術に新展望を提供し得る。現在の結合ストラテジーは、制限がある化学的方法に頼ることが多く、そして組み換え技術のすべての利点を得ることができていない。ここで、発明者らは、遺伝子組み換えおよび合成の機能ユニットの不可逆的な結合のための万能タグとして、細胞内膜の融合を駆動するための安定した４本ヘリックス複合体を形成する３つのＳＮＡＲＥタンパク質を利用した。発明者らは、ＳＮＡＲＥタグ付与が、機能性超分子である医学用毒素、BOTOXとして一般的に知られているボツリヌス神経毒素Ａ型の段階的な製造を可能にすることを示している。受容体結合領域とシナプトブレビンＳＮＡＲＥモチーフとの融合は、ニューロン内への、ＳＮＡＰ２５でタグ付与したボツリヌス神経毒素の作用パーツの送達を可能にした。データは、ＳＮＡＲＥタグ付与毒素が、その神経細胞内分子標的を開裂し、そして神経伝達物質の放出を阻害することができたことを示している。これらの結果は、ＳＮＡＲＥ４本ヘリックス・コイルドコイルが、さまざまなビルディングブロックの機能性ナノマシンへの制御された結合を可能にすることを実証している。
【０１５８】
序論
分子生物学とタンパク質の遺伝子組み換え製造の出現が科学を変革した。組み換えポリペプチド、タンパク質の機能性フラグメントおよび全酵素の使用は、薬剤、診断、ナノ技術、および消費者バイオ産業において現在広まっている。組み換え技術の明らかな成功にもかかわらず、タンパク質サイズは、単一の機能ユニットとしてより高性能なタンパク質を作り出すための障害のままで残っている。個々のタンパク質にというよりむしろ、超分子ユニットに複数の機能を組み合わせることで、我々はこのボトルネックを克服することが可能になると考えている。明らかに、ナノファクトリーまたはナノマシンの構築に関するこうした目的の達成は、要求に応じて、かつ、高精度でさまざまな機能ユニットを結合できる我々の能力に大きく依存する。この有望な分野における現在の取り組みが数十年間前に発明された結合技術：ビオチン−ストレプトアビジン対合、抗体−エピトープ認識、アミノ基およびスルホヒドリル基による化学的結合、にまだ頼っていることは、驚くべきことである。これらのアプローチは、組み換えタンパク質の化学修飾の必要性または抗体ベースの技術の複雑さのため制限していることが多い。最近開発された「クリック」化学反応がこれらの問題のいくつかに対処しているが、無機化合物に頼っているままであり、そして所定の超分子集合体への組み換えタンパク質の結合はこれまで達成されなかった。ＤＮＡの自己集合またはポリペプチドのオリゴマー化に基づく代替アプローチはさらに、多機能の遺伝子組み換え集合を設計する際にそれらの制限を受ける。ここで、発明者らは、機能ユニットへの組み換えポリペプチドの不可逆的な結合を達成するために、２０年近く前に発見されたＳＮＡＲＥ（可溶性Ｎ−エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体）タンパク質集合の使用の可能性を探った。
【０１５９】
ＳＮＡＲＥタンパク質は、ヘテロメリック４本ヘリックスコイルドコイルを形成することによってあらゆる真核細胞内で細胞膜の融合を駆動している。脳由来ＳＮＡＲＥ複合体は、３つのタンパク質：シナプトブレビン、シンタキシンおよびＳＮＡＰ２５、から成る。シンタキシンとシナプトブレビンがそれぞれ単一のヘリックスをもたらすのに対して、ＳＮＡＰ２５は２本のヘリックスをもたらして、四量体コイルドコイルを形成する。４つのＳＮＡＲＥモチーフは、５５アミノ酸の長さであり、８つの特徴的なヘプタデ（heptade）反復を持つ。脳のＳＮＡＲＥ複合体は、その安定性が並はずれており、カオトロピック試薬、強い界面活性剤、プロテアーゼ、および高温に対して抵抗性を示している。発明者らは、組み換えタンパク質にＳＮＡＲＥを融合することで超分子実体の制御された構築が可能になるかどうか調査することを決めた。
【０１６０】
多機能分子の例として、発明者らは、「認識、トラフィッキング、アンフォールディング、転座、再フォールディングおよび触媒作用を兼ね備えたナノマシン」と記述したボツリヌス神経毒素に注目した。ボツリヌス神経毒素Ａ型、（ＢｏＮＴ／Ａ）は、微量（１ｐＭの濃度）の局所注入により非常に長い間神経筋麻痺を引き起こす能力のため、すばらしい医学的重要性があると証明された（Montecucco, C. et al.（2009））。ＢｏＮＴ／Ａは、３つの主なモジュールから成る１５０ｋＤａタンパク質である：ジスルフィド架橋を介して、いわゆる重鎖に連結されている５０ｋＤａの触媒パート（軽鎖、Ｌｃ）、そして該重鎖は、結果としてＮ末端の５０ｋＤａの転座パート（ＨＮ）とＣ末端５０ｋＤａのパート（Ｈｃ）からできており、後者は神経性ガングリオシドとシナプス小胞受容体ＳＶ２Ｃの認識に関与している（Mahrhold, S. et al.（2006）およびDong, M. et al.（2006））。その３つの主なモジュールは、Ｘ線モデルにおいて別個の構造ユニットとして認識される（出典、Lacy et al.（1998）、図２４ａ）。前記触媒パートは、シナプスサイトゾル内にあるとき、優れた特異性でその神経細胞内標的であるＳＮＡＰ２５をタンパク質分解するので、神経伝達の長時間遮断につながる（Schiavo, G. et al.（1993）およびBlasi, J. et al.（1993））。ＳＮＡＰ２５のＣ端末側終端からの９つのアミノ酸のＢｏＮＴ／Ａ介在除去は、シンタキシンとシナプトブレビンを用いたＳＮＡＲＥ集合の安定性を低下させない（Hayashi, T. et al.（1994））。
【０１６１】
結果
発明者らは、最初に、ＳＶ２結合パート（Ｈｃ）をシナプトブレビンに融合させ（図２４ｂ）、そしてこの融合体が量子ドット（Ｑ−ドット）を神経終末内に運ぶことができるか否かを試験した。Ｈｃ−シナプトブレビン融合体は、ＳＮＡＰ２５、およびストレプトアビジンでコートしたＱ−ドットへの結合のためにビオチンで標識した５２アミノ酸シンタキシン３ペプチドとＳＮＡＲＥ複合体を形成することができた。我々は、シンタキシン１よりむしろシンタキシン３ＳＮＡＲＥモチーフを使用することを選んだ。なぜならば、シンタキシン１にはホモオリゴマー化する傾向があるためである。図２４ｃは、Ｈｃ−シナプトブレビン融合体が、修飾シンタキシン３モチーフがあったとしても、ＳＮＡＰ２５の存在下で不可逆的な（ＳＤＳ抵抗性の）ＳＮＡＲＥ複合体を形成することができたことを示している。ビオチン化シンタキシン・ペプチドと前もって結合させたＱ−ドットを、ＳＮＡＰ２５の存在下でＨｃ−シナプトブレビンと共にインキュベートし、そして神経終末内へのＱ−ドットの送達をマウスに由来する海馬ニューロンの培養物において評価した。Ｑ−ドット保有Ｈｃ−ＳＮＡＲＥは、小胞タンパク質のシナプトフィジンでの染色によって確認されるように、シナプス接触点に蓄積した（図２４ｄ）。これは、ＢｏＮＴ／Ａの標的化パートがそのシナプス受容体をまだ認識でき、かつ、ＳＮＡＲＥタグとの遺伝子組み換え融合後に大きなカーゴを保有することができることを示している。
【０１６２】
次に、発明者らは、酵素パート、転座パートおよびＳＮＡＰ２５の融合体を調製した（図２５ａ）。我々は、酵素パート（Ｌｃ）と転座パート（ＨＮ）の間に（天然のトリプシン感受性部位の代わりに）トロンビン開裂を導入し、単離手順中に、ジスルフィド結合によってまだ結合されたままであるこれらの２つのパート間の開裂を容易にする。ＬｃＨＮ−ＳＮＡＰ２５融合体をＥ．コリにおいて首尾よく発現させ、そして均質に精製することができた。ジチオスレイトールで処理した場合に、この融合体は重要なジスルフィド結合の機能性を示す２つのパートに分かれた（図２５ｂ）。次いで、我々は、ＳＮＡＲＥタグがＬｃＨＮパートとＨｃパートの単一体への集合を可能にするか否かを試験した。図２５ｃは、シンタキシン・ペプチドの存在下では、２つの遺伝子組み換え融合体の組み合わせが、ＳＤＳゲルによって証明されるとおり、新規分子実体ＬｃＨＮ−ＳＮＡＲＥ−Ｈｃの６０分以内に出現につながったが、シンタキシン・ペプチドの不存在下ではそうならなかったことを示している。再集合ＢｏＮＴの標的化の視覚化に役立つように、我々は、シンタキシン・ペプチドのフルオレセイン標識バージョンを使用し、そして実際にＬｃＨＮ−ＳＮＡＲＥ−Ｈｃが蛍光タンパク質として可視化できた（図２５ｃ）。
【０１６３】
ＬｃＨＮ−ＳＮＡＲＥ−Ｈｃが培養海馬ニューロンに適用された場合、蛍光分子が小胞マーカーであるシナプトフィジンと共に有意な程度まで共局在化し、ＢｏＮＴ／Ａの天然標的への結合を示した（図２６ａ）。重要なことに、抗ＳＮＡＰ２５抗体で処理したニューロンの免疫ブロッティングは、ニューロンが天然のＢｏＮＴ／Ａ分子で処理されたときと同じ様式で、ＳＮＡＰ２５が開裂を受けたことを実証した（図２６ｂ）。これは、酵素パートがシナプス小胞内へのＬｃＨＮ−ＳＮＡＲＥ−Ｈｃの侵入時に首尾よく神経サイトゾル内に放出されたことを示している。神経伝達物質放出に対するＬｃＨＮ−ＳＮＡＲＥ−Ｈｃの効果を試験するために、我々は多重因子の同時比較を可能にする９６ウェル・グルタミン酸放出試験を使用した（Darios, F. et al.（2009））。図２７ａは、ＬｃＨＮ−ＳＮＡＲＥ−Ｈｃが天然のＢｏＮＴ／Ａに類似した用量依存性を有する、単離した脳の神経終末からのグルタミン酸のカルシウムおよびＫＣｌ依存性放出を阻害することができたことを示している。中枢神経終末からのグルタミン酸放出の阻害の程度は、以前に得た値とよく一致し（McMahon, H. T. et al.,（1992））そしてすべての中枢シナプスがＢｏＮＴ／Ａに対するＳＶ２Ｃ受容体を保有するわけではないことを示唆している（Dong, M. et al.,（2006））。重要なことに、結合シンタキシン・ペプチドの不存在下でのＳＮＡＲＥタグ付与ＬｃＨＮとＨｃとの混合では不活性な分子が得られ、遺伝子組み換えパーツの機能性実体への結合において、完全なＳＮＡＲＥ集合が重要な要因であることを裏付けている（図２７ｂ）。ＬｃＨＮ−ＳＮＡＲＥ−Ｈｃのジチオスレイトールでの処理が、集合毒素を不活性したので、ＬｃとＨＮの間のジスルフィド結合の機能性を示唆している（図２７ｂ）。最後に、我々は、筋肉を麻痺させるＬｃＨＮ−ＳＮＡＲＥ−Ｈｃの能力を試験した。我々は、単離したマウス横隔膜上にいくつかの濃度の集合神経毒を適用し、そして横隔神経の麻痺応答を試験した。振幅が初期値の５０％まで減少するのに必要な時間（麻痺半減期）を測定した。図２７ｃは、ＬｃＨＮ−ＳＮＡＲＥ−Ｈｃが、ナノモル未満の濃度（１９０ｐＭ）にて７２分以内に横隔膜筋を麻痺させることを示している。結合シンタキシン・ペプチドの不存在下では、麻痺は観察されなかった（データ未掲載）。
【０１６４】
ここで、発明者らは、ＳＮＡＲＥタグ付与が、BOTOXとして一般的に知られている医学用毒素、ＢｏＮＴ／Ａの段階的な集合を可能にすることを実証した（Davletov, B. et al.（2005））。神経筋ジャンクションの遮断におけるＬｃＨＮ−ＳＮＡＲＥ−Ｈｃの有効性は天然のＢｏＮＴ／Ａより低かったが（Mahrhold, S. et al.（2006））、これは、長い神経筋ジャンクション内で遠方の活性領域に到達することに関して拡張型毒素の能力が低いか、または有効性低下につながる横隔膜筋における大量のシナプス前末端によるかのいずれかで説明できる。しかしながら、ニューロン間のシナプス接触との関連において、我々は、ＬｃＨＮ−ＳＮＡＲＥ−Ｈｃと天然神経毒の間に類似した有効性を観察した。神経筋ジャンクションではなく、ニューロン間シナプスの阻害に対するそういった優先的効果は、筋を麻痺させる副作用を避ける疼痛阻害治療の開発に有利であり得る。我々の観察の意味はたくさんあるが、ここでいくつかを列挙する。一つ目に、安全な方法で細菌によるマルチモジュール型医学用毒素の活性形態を発現することが、現在可能である；実際には、我々の「ロッキング（locking）」ペプチドの使用は、追加的な安全機能を可能にする。また、造影剤や将来的な治療薬を提供するために、ＳＮＡＲＥ対応物でそれらにタグ付与することによって、ＳＮＡＲＥタグ付与Ｈｃパートを利用することも可能である（Binz, T et al.（2009））。さらに、抗ボツリヌス血清を作製する場合に、より強い免疫応答を引き出すためにＨｃパートをオリゴマー化することも可能である（Webb, R. P. et al.（2007））。ＬｃＨＮパートのＳＮＡＲＥタグ付与はさらに、特定の神経内分泌細胞に対するＢｏＮＴ／Ａの有効成分の容易な再標的化を可能にするであろう（Dolly, J. O. et al.（2009））。ここで、当業者は、対応するＳＮＡＲＥタグ付与リガンドを作製することによって神経ペプチドまたは増殖因子受容体を標的化できる。そういったＳＮＡＲＥタグ付与は、特定のニューロンのサブセットをサイレンス化するのに最も有益な（単数もしくは複数の）組み合わせを見つけ出す目的を有するさまざまな機能ユニットの簡便なコンビナトリアル混合を可能にする（Foster, K. A.（2009））。
【０１６５】
発明者らは、洗練された「ナノマシン」の例としてＢｏＮＴ／Ａを使用したが、ＳＮＡＲＥタグ付与が、高度に制御された様式において、多くの更なる超分子集合を構築する際に使用できることは明らかである。好適なビルディングブロックの制御された結合によるナノメートルサイズの十分に定義された、機能性超分子構造の創出は、多くの分野に新展望を提供すると思われる（Lehn, J. M.（2007））。ボツリヌス神経毒素の集合時のビオチンとフルオレセインの取り込みによって証明されるように、比較的短いＳＮＡＲＥモチーフは、遺伝子組み換えによって作り出されたポリペプチドと無機分子の両方の組み合わせを可能にする。ＳＮＡＲＥコイルドコイルの最大の利点は、最大８つの異なる機能の結合を可能にしているそのヘテロ四量体の性質である。この能力は、将来的な医学と応用技術においてこれから利用される。
【０１６６】
方法
プラスミドとタンパク質反応。すべてのタンパク質を、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合体としてＥ．コリのＢＬ２１菌株で発現させた。ＬｃＨＮ−ＳＮＡＰ２５の発現のためのプラスミドを、以下のとおり作製した：ＢｏＮＴ／ＡのＬｃ（第１−４４９アミノ酸）のｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、そしてｐＧＥＸ−ＫＧベクターでＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位内に挿入した（Guan, K. L. et al.（1991））。ＢｏＮＴ／Ａの転座ドメインＨＮ（第４５０−８７２アミノ酸、ATG Biosynthetics、Germany製）のコドン最適化ｃＤＮＡを、軽鎖の３末端に挿入した。トロンビン開裂部位（アミノ酸ＬＶＰＲＧＳ（配列番号１６））を、軽鎖とＢｏＮＴ／Ａの転座ドメインの間に挿入した。最後に、ラットＳＮＡＰ２５Ｂ（第１−２０６ａａ）のｃＤＮＡをＨＮの３’末端に挿入した。Ｈｃ−Ｓｙｂの発現を可能にするプラスミドを、以下のとおり作製した：ラット・シナプトブレビン（第２５−８４アミノ酸）のｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、そしてｐＧＥＸ−ＫＧベクターのＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ部位の間に挿入した。ＢｏＮＴ／Ａ重鎖（第８７６−１２９６アミノ酸）のｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、シナプトブレビンの３’末端に挿入した。シンタキシンＳＮＡＲＥモチーフ（第２００−２５０アミノ酸）のペプチドを、ビオチンまたはフルオレセインのいずれかと共に化学的に合成した（Peptide Synthetics、UK）。ＧＳＴに融合したタンパク質を、グルタチオン・セファロース・ビーズ（GE Healhcare、USA）により精製し、そしてトロンビンを使用して２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．３、１００ｍＭのＮａＣｌ中にビーズから溶出した。ＳＮＡＲＥタグ付与タンパク質をシンタキシン・ペプチドと２２℃にて１時間混合することによって、超分子複合体を集合させた。
【０１６７】
神経の造影と免疫ブロッティング。マウス抗シナプトフィジン抗体（クローン７．２）はSynaptic Systems製であり、そしてマウス抗ＳＮＡＰ２５抗体（クローンＳＭＩ８１）はSternberger Monoclonals製である。ストレプトアビジン共役Ｑ−ドット５２５は、Invitrogen製である。海馬ニューロンの初代培養を、記載のとおり調製し（Ｄａｒｉｏｓ、Ｆ．ら（２００９））、そして７〜１０日後にインビトロにおいて使用した。ニューロンを、ＳＮＡＲＥタグ付与または天然の毒素に２時間晒し、４％のＰＦＡで固定化し、次いで抗シナプトフィジン抗体で免疫染色した。蛍光発光を、Nikon Eclipse蛍光顕微鏡に連動させたRadiance Confocalシステム（Zeiss/Bio-Rad；Hemel Hempstead, Herts.、U.K.）により観察した。あるいは、ニューロンを、集合毒素または天然のＢｏＮＴ／Ａと共に２０時間インキュベートし、６０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ６．８、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、２％のＳＤＳ、ベンゾナーゼ（Novagen、２５０Ｕ／ｍｌ）中で溶解し、そしてＳＮＡＰ２５開裂を抗ＳＮＡＰ２５抗体を使用した免疫ブロッティングによって分析した。
【０１６８】
神経伝達物質放出の遮断。ラット脳シナプトソームを、記載のとおり新たに単離した（Darios, F. et al.（2009））。シナプトソーム（０．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質）を、指示した濃度のＬｃＨＮ−ＳＮＡＲＥ−Ｈｃを含むバッファーＡ（ｍＭ単位で１３２のＮａＣｌ、５のＫＣｌ、２０のＨＥＰＥＳ、１．２のＮａＨ₂ＰＯ₄、１．３のＭｇＣｌ₂、０．１５のＮａ₂ＥＧＴＡ、１のＭｇＳＯ₄、５のＮａＨＣＯ₃、１０のＤ−グルコース）中、３７℃にて１時間インキュベートした。
【０１６９】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（１５ユニット／ｍｌ、Sigma）および３ｍＭのＮＡＤＰ（Sigma）を含有する等量のバッファーＡを１０分間かけて加えた。グルタミン酸放出を、２ｍＭのＣａＣｌ₂の存在下、ＫＣｌ（３５ｍＭ）の添加によって誘発し、そして蛍光発光を追って観察した（Ｅｘｃ．３４０ｎｍ、Ｅｍ．４６０ｎｍ）（Darios, F. et al.（2009）およびMcMahon, H. T. et al.（1992））。Phrenic Nerve半横隔膜アッセイを、先に記載のように実施した（Mahrhold, S. et al.（2006））。マウス横隔神経を、Naval Medical Research Institute（ＮＭＲＩ）マウスから得た。横隔神経を、５〜２５ｍＡにて１Ｈｚの周波数、０．１ｍｓのパルス幅で連続的に刺激した。等尺性収縮を、力変換器を使用して変換し、そしてVitroDat Onlineソフトウェア（FMI GmbH）で記録した。初期値の５０％まで振幅が減少するのに必要な時間（麻痺半減期）を測定した。
【０１７０】
追加情報
ボツリヌス神経毒素は、自然が作り出した中で最も強力な毒素である。これらの毒素は、持続的な麻痺と死亡を引き起こすようにクロストリジウム属（Clostridium）細菌によって産生される。ここ３０年間にわたり、ボツリヌス・ファミリーの一部のメンバー、例えばBOTOXとしても知られているボツリヌス神経毒素Ａ型（ＢｏＮＴ／Ａ）を、医学および美容目的のためにうまく利用してきた。これらの毒素は、神経筋ジャンクションをサイレント化し、そして多くのタイプのニューロンからの神経伝達物質放出を遮断できる。実際に、脳以外の人体のあらゆる部分がBOTOXによって処置できる。神経筋ジャンクションの麻痺は可逆的なので、筋の持続的な緩和には３〜４カ月毎の反復注射を必要とする。ＢｏＮＴ／Ａは、横紋筋だけではなく、平滑筋についても神経支配を遮断する。さらに、発汗、唾液分泌および他のタイプの分泌を制御する自律神経系のコリン作動性ジャンクションは、神経筋ジャンクションのようにBOTOXに対して感受性がある。そのため、BOTOXベースの処置は、最近、みごとなまでにずらりと並んでいる、ジストニアから胃腸や尿の障害までの１００近い病状を含むまでに拡大した。
【０１７１】
臨床医学におけるＢｏＮＴ／Ａの有効性が、ボツリヌス・ファミリーの他のメンバーへの着目の高まりにつながった。比較研究では、ＢｏＮＴｓ（Ａ−Ｇ）の７つの免疫学的に異なる抗原型の中で、ＢｏＮＴ／Ａが最も長い麻痺効果を有することが実証されたので、そのため、神経障害の処置において特にＢｏＮＴ／Ａの有用性が実証された。すべてのＢｏＮＴｓは、１５０ｋＤａの分子量を有する単一のポリペプチド鎖として細菌によって合成される。細菌の死滅と溶解に続いて、毒素は、細菌のプロテアーゼによって「切れ目が入れられて」、ジスルフィド結合によってつなぎとめられている５０ｋＤａの軽鎖と１００ｋＤａの重鎖を生じる。ジスルフィド結合によってまだ結合されている２本の鎖は、トランスサイトーシスによって小腸上皮細胞を横断し、血流に入り、そして最終的に末梢のコリン作動性神経終末に結合する。
【０１７２】
ＢｏＮＴｓの強烈な毒性は、末梢神経終末がＢｏＮＴｓの高親和性受容体として機能できる分子を保有することを示している。実際、いくつかのシナプス小胞タンパク質が、ＢｏＮＴｓの受容体として機能することが示された。重鎖が神経終末へのＢｏＮＴｓの結合に関与するとはいえ、軽鎖は、小胞融合機構を攻撃する強力なエンドペプチダーゼなので、そのため神経終末の内側に入らなければならない。ＢｏＮＴｓは、小胞エンドサイトーシス経路を乗っ取ることによってこの役割を達成する。リサイクリング小胞内部のｐＨが下がるに従って、ＢｏＮＴｓは大きな立体構造変化を受ける。これは、部分的に折り畳まれていない軽鎖がサイトゾル内に滑り込むことによって、重鎖の転座パート（ＨＮとして知られている）が小胞膜を横切る推定チャンネルを形成することを可能にする。サイトゾル内への侵入により、ジスルフィド結合の還元で軽鎖が重鎖から解放される。
【０１７３】
ＢｏＮＴ軽鎖は、小胞融合を媒介し、それにより経伝達物質放出する３つのＳＮＡＲＥタンパク質の多くのアイソフォームを攻撃する強力なエンドペプチダーゼである。ＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／ＥがＳＮＡＰ−２５をタンパク質分解し、ＢｏＮＴｓのＢ、Ｄ、ＦおよびＧがシナプス小胞上のＶＡＭＰを開裂することが現在知られている。ＢｏＮＴ／Ａによって９つのアミノ酸まで短縮されたＳＮＡＰ−２５は、原形質膜のシンタキシンおよび小胞のシナプトブレビンと相互作用する能力を維持しているが、正常な小胞融合工程を媒介することはできない。ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴｓ）に関する詳細は、以下で見出すことができる：Davletov, B., Bajohrs, M. and Binz, T., Trends Neurosci 28, 446-452（2005）；Johnson, E.A.（1999）Annu Rev Microbiol 53, 551-575；Jankovic, J.（2004）J Neurol Neurosurg Psychiatry 75（7）, 951-957；Aoki, K,R. and Guyer, B.（2001）Eur J Neurol 8 Suppl 5, 21-29；Simpson, L.L.（2004）Annu Rev Pharmacol Toxicol 44,167-193；Dolly, O.（2003）Headache 43 Suppl 1, SI6-24；およびMontecucco, C. and Schiavo, G.（1993）Trends Biochem Sci 18（9）, 324-327。ＢｏＮＴ／Ａ（BOTOX）の完全な配列情報は、Binz, T. et al.（1990）JBiol Chem 265（16）, 9153-9158に公表された。
【０１７４】
再標的化ストラテジー：
これまで、ＢｏＮＴｓの恩恵は、神経筋疾患や自律神経系の障害の処置に限定されてきた。しかしながら、ＢｏＮＴｓはさらに、中枢ニューロンの神経伝達物質放出も遮断できるので、実験神経科学や高次脳機能を扱う将来の神経学においてそれらを利用することを可能にさせる。脳切片、培養ニューロンおよびシナプトソームに関する研究は、ＢｏＮＴｓがアセチルコリンだけではなく、グルタミン酸、グリシン、ノルアドレナリン、ドーパミン、セロトニン、ＡＴＰおよびさまざまな神経ペプチドなどの神経伝達物質の放出も止めることができること実証した（Ashton et al.（1988）、Capogna, M. et al.（1997）、Sanchez-Prieto, J. et al.（1987）、Verderio, C. et al.（2004）、Luvisetto, S. et al.（2004）、およびCostantin, L. et al.（2005））。ＢｏＮＴｓの軽鎖は、天然では、それらのパートナー重鎖によって送達されるが、リポソームや遺伝子組み換え融合構築物などの代替の送達手段もまた効果的である（de Paiva, A. et al.（1990）、Chaddock, J.A. et al.（2004）、およびDuggan, M.J. et al.（2002））。ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖を伴ったレクチンの遺伝子組み換えキメラは、最近、侵害受容求心神経または背根神経節内へのＢｏＮＴ／Ａ軽鎖の送達を可能にした（Chaddock, J.A. et al.（2004））。重要なことに、送達有効性は、軽鎖がＧＦＰ蛍光標識に融合されるのであれば、容易に追跡できるので、サイレント化細胞のマーキングを可能になる。ＢｏＮＴｓの重鎖がシナプスを標的化し、そして神経終末にそれらの軽鎖を輸送する能力は、神経生物学で利用できる別のツールを提供する（Goodnough, M.C. et al.（2002）およびBade, S. et al.（2004））。ＢｏＮＴ重鎖を使用したさまざまな分子、特に酵素の送達は、シナプス生理学の操作のために実現可能であり得る。実際に、ＢｏＮＴ／Ｄが遺伝子組み換えにより結合させた酵素を神経終末に送達できることが最近実証された（Bade, S. et al.（2004））。
【０１７５】
発明者らは、以下の２つのパーツ：
転座ドメイン（ＨＮ）を含む軽鎖（ＬＣ）、ここで、転座ドメインはそのＣ末端にＳＮＡＲＥタグ（シンタキシン、ＳＮＡＰ−２５またはシナプトブレビン）を保有する；および
そのＮ末端にＳＮＡＲＥタグ（シンタキシン、ＳＮＡＰ２５またはシナプトブレビン）を保有する重鎖（ＨＣ成分）の受容体結合パート、
から毒素を再結合させることによって機能性ボツリヌス神経毒素を得ることが可能であることを示した。
【０１７６】
ＳＮＡＲＥタグは、機能ユニットの不可逆的な結合を可能にする。
これらの２つのパーツ（ＬＣＨＮおよびＨＣ）は、健康を損なう恐れなしに、タンパク質産生菌株において別個に産生されことができる。各パートは、安全な方法によって精製できる。２つのパーツが混合される場合、それらは、活性な神経毒を１時間以内に生じる。前記神経毒は、晒されたニューロンにおいてその分子標的であるＳＮＡＰ−２５を開裂し、そして神経終末からの神経伝達物質放出を遮断することもできる。
【０１７７】
ＳＮＡＲＥタグを伴ったＬＣＨＮパートは機能性であるので（すなわち、ＳＮＡＰ−２５神経開裂および神経伝達物質放出の遮断が観察される）、ＬＣＨＮ／リガンド部分の不可逆的な集合のためにＳＮＡＲＥタグを伴ったリガンドを加えることによって、特定のニューロンまたは内分泌細胞にこの作用パーツを向けることが可能である。一例は、ＳＮＡＲＥタグに結合したソマトスタチン・ペプチドである。意図した細胞へのリガンドの結合は、その後の軽鎖の放出を伴った該細胞内へのＬＣＨＮの転送と、それによる、その後の神経伝達物質またはホルモン放出の停止を伴ったＳＮＡＰ−２５の損傷をもたらすことができる。
【０１７８】
ＳＮＡＲＥタグを伴ったＨＣ成分は機能性であるので（すなわち、ＬＣＨＮ／ＳＮＡＲＥタグ付与体の結合後の神経伝達物質放出の遮断の観察）、ニューロン内への他の酵素または造影部分の送達にＳＮＡＲＥタグ付与ＨＣパートを使用することが可能である。必要な受容体を保有する特定の細胞内に薬物、造影試薬などを送達するために、ＳＮＡＲＥタグを伴った他の受容体結合化合物（例えばソマトスタチン神経ペプチド）を使用することもまた可能である。
【０１７９】
ＳＮＡＲＥモチーフでタグ付与したＬＣＨＮの配列およびＳＮＡＲＥモチーフでタグ付与したＨＣの配列を以下に示す：
ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖（第１−４４９ａａ）、転座ドメイン（第４４９−８７２ａａ）およびＳＮＡＲＥタンパク質をコードするｃＤＮＡを、分子生物学技術によって融合した。トロンビン部位ＬＶＰＲ−ＧＳ（配列番号１７）を、ＢｏＮＴ／Ａの軽鎖（ＬＣ）と転座ドメイン（ＨＮ）の間に挿入して、トリプシンによって毒素の天然のニッキングを模倣した（先の配列内に「−」で表した）。ＧＳＴに融合したタンパク質を記載のように精製した。そのタンパク質を、トロンビンを使用してビーズから２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．３、１００ｍＭのＮａＣｌ中に溶出した。シナプトブレビン２（２５−８４）ＢｏＮＴ／Ａ Ｈｃ（８７６−１２９６）の場合には、０．８％のオクチルグルコシドが溶出緩衝液中に存在していた。溶出後に、我々は以下の配列を有するタンパク質を得た：
【０１８０】
ＬｃＨＮ−ＳＮＡＰ２５：ＢｏＮＴ／Ａ Ｌｃ（１−４４９）Ｔｈｒｏｍｂｉｎ ＨＮ（４４９−８７２）−ＳＮＡＰ２５Ｂ（ＣからＡ）−配列番号１８
ＬｃＨＮ−Ｓｙｘ：ＢｏＮＴ／Ａ Ｌｃ（１−４４９）Ｔｈｒｏｍｂｉｎ ＨＮ（４４９−８７２）−Ｓｙｘ３（１９５−２５３）−配列番号１９
ＬｃＨＮ−Ｓｙｂ：ＢｏＮＴ／Ａ Ｌｃ（１−４４９）Ｔｈｒｏｍｂｉｎ ＨＮ（４４９−８７２）−Ｓｙｂ２（１−９６；ＷＷＫ−ＡＡＡ）−配列番号２０
【０１８１】
Ｓｙｂ−ＨｃＡ：Ｓｙｂ２（２５−８４）ＢｏＮＴ／Ａ Ｈｃ（８７６−１２９６）−配列番号２１
Ｓｙｂ ＨｃＤ：Ｓｙｂ２（２５−８４）ＢｏＮＴ／Ｄ Ｈｃ（８６３−１２７６）−配列番号２２
ナノロッキングＨｃＡ：Ｓｙｘ３（１９５−２５３）Ｓｙｂ２（１−８４）ＢｏＮＴ／Ａ Ｈｃ（８７６−１２９６）−配列番号２３
ＳＮＡＰ２５Ｂ（ＣからＡ）−配列番号２４
シンタキシン３（１９５−２５３）−配列番号２５
【０１８２】
細菌による産生（すべて上記）によって得られた組み換えタンパク質に加えて、以下の合成ペプチドもまた使用した：
Ｓｙｘ３ペプチド（４５ａａ、５２ａａ−ＦＩＴＣ）
ソマトスタチン−シナプトブレビン・ペプチド
ソマトスタチン−シンタキシン・ペプチド
ソマトスタチン・ペプチド−配列番号２６
Ａｃ−ＲＬＱＱＴＱＡＱＶＤＥＶＶＤＩＭＲＶＮＶＤＫＶＬＥＲＤＱＫＬＳＥＬＤＤＲＡＤＡＬ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ＡＧＣＫＮＦＦＷＫＴＦＴＳＣ−ＯＨ。
【０１８３】
触媒パートを受容体結合部に結合させるために、発明者らは、１つのＳＮＡＲＥタンパク質に融合させた作用パート（ＬｃＨＮ−Ｓｙｘ、ＬｃＨＮ−ＳＮＡＰ２５またはＬｃＨＮ−Ｓｙｂ）を、第２のＳＮＡＲＥタンパク質を含む受容体結合パートと一緒に１時間混合した。集合を、第３のＳＮＡＲＥパートナーの添加によってロックした。組み合わせの例を、以下の表中に示す：
【０１８４】
【表１】

【０１８５】
実施例６
以下の実施例は、ＳＮＡＲＥモチーフのＮ端末側終端を切断することによって安定したＳＤＳ抵抗性複合体を得る可能性を示す：
シナプトブレビン２の完全なＳＮＡＲＥモチーフ（Ｎ末端からＣ末端）：
ＲＬＱＱＴＱＡＱＶＤＥＶＶＤＩＭＲＶＮＶＤＫＶＬＥＲＤＱＫＬＳＥＬＤＤＲＡＤＡＬＱＡＧＡＳＱＦＥＴＳＡＡＫＬＡ（配列番号２７）
シナプトブレビン２のＳＮＡＲＥモチーフのＮ末端切断である以下の合成シナプトブレビン・ペプチドを試験した：
１）ＦＩＴＣ−Ａｈｘ−ＡＱＶＤＥＶＶＤＩＭＲＶＮＶＤＫＶＬＥＲＤＱＫＬＳＥＬＤＤＲＡＤＡＬＱＡＧＡＳＱＦＥＴＳＡＡＫＬＡ（配列番号２８）（４９個のアミノ酸）；
【０１８６】
２）ＦＩＴＣ−Ａｈｘ−ＤＩＭＲＶＮＶＤＫＶＬＥＲＤＱＫＬＳＥＬＤＤＲＡＤＡＬＱＡＧＡＳＱＦＥＴＳＡＡＫＬＡ（配列番号２９）（４２個のアミノ酸）；
３）ＦＩＴＣ−Ａｈｘ−ＤＫＶＬＥＲＤＱＫＬＳＥＬＤＤＲＡＤＡＬＱＡＧＡＳＱＦＥＴＳＡＡＫＬＡ（配列番号３０）（３５個のアミノ酸）；および
４）ＦＩＴＣ−Ａｈｘ−ＫＬＳＥＬＤＤＲＡＤＡＬＱＡＧＡＳＱＦＥＴＳＡＡＫＬＡ（配列番号３１）（２７個のアミノ酸）。
【０１８７】
図３３は、シナプトブレビンＳＮＡＲＥモチーフは、４２個のアミノ酸まで削減されることができるので、それでもまだシンタキシン１（ｓｔｘ１）およびＳＮＡＰ２５（Ｓ２５）と共にＳＤＳ抵抗性複合体を形成することを示している。３５アミノ酸シナプトブレビンＳＮＡＲＥモチーフもまた、複合体を形成するが、それはゲル電気泳動中に「融解する」。
【０１８８】
実施例７
シンタキシンＳＮＡＲＥモチーフの短縮によって例示されるように、ＳＮＡＲＥモチーフはさらに、ＮおよびＣ末端の両方から削減することも可能である。加えて、内部残基の置換は、オーダーメイドの適用のためのＳＮＡＲＥ集合に寛容である。
【０１８９】
シンタキシン１の完全なＳＮＡＲＥモチーフ：
ＥＩＩＫＬＥＮＳＩＲＥＬＨＤＭＦＭＤＭＡＭＬＶＥＳＱＧＥＭＩＤＲＩＥＹＮＶＥＨＡＶＤＹＶＥＲＡＶＳＤＴＫＫＡ（配列番号３２）。
【０１９０】
以下の合成シンタキシン・ペプチドを試験した：
１）ＦＩＴＣ−Ａｈｘ−ＥＩＩＲＬＥＮＳＩＲＥＬＨＤＭＦＭＤＭＡＭＬＶＥＳＱＧＥＭＩＤＲＩＥＹＮＶＥＨＡＶＤＹＶＥＲＡ−Ａｈｘ−ＫＫ−ＮＨ₂（配列番号３３）（４７個のアミノ酸）；
２）Ａｃ−ＨＨＨＨＨＨ−Ａｈｘ−ＥＩＩＲＬＥＮＳＩＲＥＬＨＤＭＦＭＤＭＡＭＬＶＥＳＱＧＥＭＩＤＲＩＥＹＮＶＥＨＡＶＤＹＶＥＣ（配列番号３４）（４５個のアミノ酸）；
３）ＥＩＩＫＬＥＮＳＩＲＥＬＨＤＭＦＭＤＭＡＭＬＶＥＳＱＧＥＭＩＤＲＩＥＹＮＶＥＨＡＧＳＧＧＧＨＨＨＨＨＨＣ（配列番号３５）（４０個のアミノ酸）；
【０１９１】
４）Ｆｌｕ−ＧＧＥＩＩＲＬＥＮＳＩＲＥＬＨＤＭＦＭＤＭＡＭＬＶＥＳＱＧＥＭＩＤ（配列番号３６）（３１個のアミノ酸）；
５）ＥＩＩＲＬＥＮＳＩＲＥＬＨＤＭＦＭＤＭＡＭＬＶＥＳＴＧＥＭＩＤＲＩＥＹＮＶＥＨＡ−ＮＨ₂（配列番号３７）（４０個のアミノ酸）；および
６）Ｂｉｏ−ＮＳＩＲＥＬＨＤＭＦＭＤＭＡＭＬＶＥＳＱＧＥＭＩＤＲＩＥＹＮＶＥＨＡＶＤＹＶＥＣ（配列番号３８）（３９のアミノ酸）。
【０１９２】
結果を図３４に示す。４０個のアミノ酸を持つシンタキシン１は、複合体形成に十分である。両末端から短縮され、そしてＮ末端にビオチンと更なる修飾に有用な追加のシステインを保有する３９アミノ酸ペプチドは、ＳＤＳゲルにより示されるような安定した複合体を形成する。注記、シンタキシンの内部リジン（Ｋ２０４）をアルギニンと置き換えることが可能であり、それでもＳＮＡＰ２５およびシナプトブレビンと共に強い複合体形成が維持できる。そういった置換は、ペプチド修飾または表面上への固定化のためにリジンがＮまたはＣ末端上に付加されるべきであれば、有利である。
【０１９３】
シンタキシンＳＮＡＲＥペプチドの安定バージョンを得るために、すべての内部メチオニンを非易酸化性ノルロイシンで置き換えることもまた可能である：
野生型（Ｍｅｔ）−ＦＩＴＣ−Ａｈｘ−ＥＩＩＫＬＥＮＳＩＲＥＬＨＤＭＦＭＤＭＡＭＬＶＥＳＱＧＥＭＩＤＲＩＥＹＮＶＥＨＡＶＤＹＶＥ−ＮＨ₂（配列番号３９）
ノルロイシン・ペプチド−ＦＩＴＣ−Ａｈｘ−ＥＩＩＫＬＥＮＳＩＲＥＬＨＤｎＦｎＤｎＡｎＬＶＥＳＱＧＥｎＩＤＲＩＥＹＮＶＥＨＡＶＤＹＶＥ−ＮＨ₂（配列番号４０）。
【０１９４】
図３５のＳＤＳゲルは、匹敵する集合体が、ＳＮＡＰ−２５、シナプトブレビン４５ａａペプチド、および前記の２本のシンタキシン・ペプチドから作製できることを示している。
【０１９５】
実施例８
ＳＮＡＲＥモチーフの多くの組み合わせが、複合体形成系に利用できる。図３６に示したＳＤＳゲルで可視化されているように、安定したＳＤＳ抵抗性複合体の例およびそれらの融解温度（Ｔｍ）を、遺伝子組み換えシンタキシン１および３、ＳＮＡＰ２３およびＳＮＡＰ２５、ならびにＶＡＭＰｓ２、４、５、７および８でできたＳＮＡＲＥ複合体について提供する。
最も強固な複合体（より高い融解温度、Ｔｍ）は、シンタキシン１、ＶＡＭＰ２およびＳＮＡＰ２５またはＳＮＡＰ２３のいずれかを用いて得られる。
【０１９６】
細菌により産生され、そしてここで使用した追加のＳＮＡＲＥアイソフォームのアミノ酸配列は、以下のとおりである：
ＳＮＡＰ−２３−配列番号４１
ＶＡＭＰ４−配列番号４２
ＶＡＭＰ５−配列番号４３
ＶＡＭＰ７−配列番号４４
ＶＡＭＰ８−配列番号４５。
【０１９７】
実施例９Ａ
複合体形成系は、３つの別個の短縮型ポリペプチドＳＮＡＲＥモチーフを結合させる。
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼに融合した遺伝子組み換えシナプトブレビン（ＶＡＭＰ２）は、４０および４５アミノ酸シンタキシン１ならびにＳＮＡＰ２５ペプチドと結合できる。ＳＮＡＰ２５ペプチドを、ヘリックス１（Ｓ２５Ｈ１）やヘリックス２（Ｓ２５Ｈ２）と示す。
Ｓｙｘ１ ４５ａａ：配列番号４６；
Ｓｙｘ１ ４０ａａ：配列番号４７；
Ｓ２５Ｈ１ ４５ａａ：配列番号４８；
Ｓ２５Ｈ１ ４０ａａ：配列番号４９；
Ｓ２５Ｈ２ ４５ａａ：配列番号５０；および
Ｓ２５Ｈ２ ４０ａａ：配列番号５１。
結果を図３７に示すが、その中で、＋の印を付けたレーンはＳＤＳ中で煮沸したサンプルを含み、そして−の印を付けたレーンはＳＤＳ中で煮沸していないサンプルを含む。
【０１９８】
実施例９Ｂ
遺伝子組み換えＳ２５Ｈ２タンパク質は、４０および４５アミノ酸シンタキシン１、ＶＡＭＰ２、ならびにＳ２５Ｈ１ペプチドと結合できる。
Ｓ２５Ｈ１ ４５ａａ：配列番号４８；
Ｓ２５Ｈ１ ４０ａａ：配列番号４９；
Ｓｙｘ１ ４５ａａ：配列番号４６；
Ｓｙｘ１ ４０ａａ：配列番号４７；
Ｓｙｂ２ ４５ａａ：配列番号５２；および
Ｓｙｂ２ ４０ａａ：配列番号５３。
結果を図３８に示すが、その中で、＋の印を付けたレーンはＳＤＳ中で煮沸したサンプルを含み、そして−の印を付けたレーンはＳＤＳ中で煮沸していないサンプルを含む。
【０１９９】
実施例９Ｃ
遺伝子組み換えＳ２５Ｈ１タンパク質は、４０および４５アミノ酸シンタキシン１、ＶＡＭＰ２、ならびにＳ２５Ｈ２ペプチドと結合できる。
Ｓ２５Ｈ２ ４５ａａ：配列番号５０；
Ｓ２５Ｈ２ ４０ａａ：配列番号５１；
Ｓｙｘ１ ４５ａａ：配列番号４６；
Ｓｙｘ１ ４０ａａ：配列番号４７；
Ｓｙｂ２ ４５ａａ：配列番号５２；および
Ｓｙｂ２ ４０ａａ：配列番号５３。
結果を図３９に示すが、その中で、＋の印を付けたレーンはＳＤＳ中で煮沸したサンプルを含み、そして−の印を付けたレーンはＳＤＳ中で煮沸していないサンプルを含む。
【０２００】
実施例１０
神経ペプチドの複合体形成は、さまざまな組み合わせで達成できる。
以下のペプチドを使用して例を提供する：
シンタキシン・タグ−ソマトスタチン：（配列番号５４）
Ａｃ−ＥＩＩＫＬＥＮＳＩＲＥＬＨＤＭＦＭＤＭＡＭＬＶＥＳＱＧＥＭＩＤＲＩＥＹＮＶＥＨＡ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ＡＧＣＫＮＦＦＷＫＴＦＴＳＣ−ＯＨ
ブレビン・タグ−ソマトスタチン：（配列番号５５）
Ａｃ−ＲＬＱＱＴＱＡＱＶＤＥＶＶＤＩＭＲＶＮＶＤＫＶＬＥＲＤＱＫＬＳＥＬＤＤＲＡＤＡＬ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ＡＧＣＫＮＦＦＷＫＴＦＴＳＣ−ＯＨ
【０２０１】
シンタキシン・タグ−サブスタンスＰ：（配列番号５６）
Ａｃ−ＥＩＩＫＬＥＮＳＩＲＥＬＨＤＭＦＭＤＭＡＭＬＶＥＳＱＧＥＭＩＤＲＩＥＹＮＶＥＨＡＶＤＹＶＥ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ＲＰＫＰＱＱＦＦＧＬＭ−ＮＨ₂
ブレビン・タグ−サブスタンスＰ：（配列番号５７）
Ａｃ−ＲＬＱＱＴＱＡＱＶＤＥＶＶＤＩＭＲＶＮＶＤＫＶＬＥＲＤＱＫＬＳＥＬＤＤＲＡＤＡＬＱＡＧＡＳ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ＲＰＫＰＱＱＦＦＧＬＭ−ＮＨ₂。
【０２０２】
これらのペプチドを組み合わせることで、図４０で例示されるような代替の安定した組み合わせを提供する。図４０において、レーン１および２：ブレビン・タグ−サブスタンスＰを、ＳＮＡＰ２５の存在下でシンタキシン・タグ−ソマトスタチンと混合した。安定した複合体は、サブスタンスＰとソマトスタチンの両方を含んでいる（ヘテロ二量体ペプチド）。レーン３および４：ブレビン・タグ−ソマトスタチンを、ＳＮＡＰ２５の存在下でシンタキシン・タグ−ソマトスタチンと混合した。安定した複合体は、２つのソマトスタチンを含んでいる（ホモ二量体ペプチド）。注記、レーン１および３は、タグ付与した神経ペプチドを使用した安定した複合体を示した。
【０２０３】
実施例１１
神経ペプチドは、細胞表面受容体への結合やペプチドの転座に影響を及ぼし得る異なる配向で、他の機能性基、例えばボツリヌス神経毒素パーツなどと結合できる。この実施例では、以下の配列を使用した：
４５ａａシンタキシン・モチーフ−アルギニン／バソプレッシン・ペプチド（ＡＶＰ）（配列番号５８）
Ａｃ−ＡＥＩＩＫＬＥＮＳＩＲＥＬＨＤＭＦＭＤＭＡＭＬＶＥＳＱＧＥＭＩＤＲＩＥＹＮＶＥＨＡＶＤＹＶＥＲ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ＣＹＦＱＮＣＰＲＧ−ＮＨ₂
アルギニン／バソプレッシン・ペプチド−４５ａａシンタキシン・モチーフ（配列番号５９）
ＣＹＦＱＮＣＰＲＧ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−ＡＥＩＩＫＬＥＮＳＩＲＥＬＨＤＭＦＭＤＭＡＭＬＶＥＳＱＧＥＭＩＤＲＩＥＹＮＶＥＨＡＶＤＹＶＥ−ＮＨ₂
【０２０４】
これらのペプチドをボツリヌス毒素ＡのＬｃＨｎパートと組み合わせることで、図４１のＳＤＳゲルで可視化された代替の安定した組み合わせを提供する。
レーン１および２：シンタキシン−ＡＶＰを、ＳＮＡＰ−２５の存在下でＬｃＨｎ−ブレビンと共に６０分間インキュベートした。安定した複合体は、ＬｃＨｎ−ＳＮＡＲＥ−ＡＶＰを含んでいる（ＡＶＰはＳＮＡＲＥリンカーのＣ端末側終端に存在する）。
レーン３および４：ＡＶＰ−シンタキシンを、ＳＮＡＰ−２５の存在下でＬｃＨｎ−ブレビンと共に６０分間インキュベートした。安定した複合体は、ＬｃＨｎ−ＡＶＰ−ＳＮＡＲＥを含んでいる（ＡＶＰはＳＮＡＲＥリンカーのＮ端末側終端に存在する）。
【０２０５】
実施例１２
４０より短いペプチドでも、まだ安定した複合体を形成できる（しかしＳＤＳ抵抗性ではない）。使用した配列：
ビオチン−Ａｈｘ−ＥＩＩＲＬＥＮＳＩＲＥＬＨＤＭＦＭＤＭＡＭＬＶＥＳＱＧ−ＮＨ₂（配列番号６０）−２７ａａシンタキシン１ペプチド
ビオチン−Ａｈｘ−ＥＩＩＫＬＥＮＳＩＲＥＬＨＤＭＦＭＤＭＡＭＬＶＥＳＱＧＥＭＩＤ−ＮＨ₂（配列番号６１）−３１ａａシンタキシン・ペプチド
ペプチドの結合を、グルタチオン・ビーズ上に固定化したＧＳＴ−ＳＮＡＰ２５リンカー・シナプトブレビン・タンパク質（三重らせん構築物）を使用したプルダウン実験において観察した。結合は２５℃にて３０分間であり、それに続いてバッファーＡ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ）中で洗浄する。タンパク質とペプチドをＳＤＳゲル上で可視化した（４２図）。ビーズに結合したビオチン化ペプチドを、ＳＤＳゲルの底に見ることができる。
【０２０６】
実施例１３
ＳＮＡＲＥペプチドは、そのタンパク質を遺伝子組み換えによって発現できないときに、タンパク質を化学的に架橋することができる。そのペプチドはＳＮＡＲＥ複合体を形成するそれらの能力を保有し、そして修飾タンパク質はそれらの活性を保有する。使用される配列：
４５ａａシンタキシン１ペプチド
Ａｃ−ＡＥＤＡＥＩＩＫＬＥＮＳＩＲＥＬＨＤＭＦＭＤＭＡＭＬＶＥＳＱＧＥＭＩＤＲＩＥＹＮＶＥＨＡＶＤＹＶＥＣ（配列番号６２）
【０２０７】
先のペプチドをMaleimide-Horse Radish Peroxidaseに架橋した（Sigma-Aldrich Co.）。
図４３は、マレイミド・ベースの架橋を示しているＳＤＳゲルである。
架橋シンタキシン−ＨＲＰは、グルタチオン・ビーズ上に固定化されたＧＳＴ−三重らせん（Ｓｎａｐ２５−ブレビン、Ｓ−Ｂ）に結合できる。結果を、図４４および４５に示す。図４４は、ＴＭＢ基材の６５０ｎｍにおける吸光度を示している。図４５は、フィルム上で発光により可視化したものの発光を示している。注記、ＧＳＴ−三重らせん（Ｓ−Ｂ）を含まない対照グルタチオン・ビーズが、シンタキシン−ＨＲＰのバックグラウンド結合のみを示す。
【０２０８】
実施例１４
２９アミノ酸コンプレキシン１ペプチドは、ＳＮＡＲＥ集合と相互作用できる。このペプチドは、その固定化後の精製、またはＳＮＡＲＥベースの集合における追加担体として使用できる。
コンプレキシンペプチド：
Ａｃ−ＥＲＫＡＫＹＡＫＭＥＡＥＲＥＶＭＲＱＧＩＲＤＫＹＧＩＫＫＧＳＧＳＧＧＩＫＶＡＶ−ＮＨ₂（配列番号６３）。
【０２０９】
図４６は、Ｎｉ２＋ビーズ上に固定化されたタンパク質を追跡することによるコンプレキシン・ペプチドのプルダウンを示すＳＤＳゲルである。
Ａ．完全長ＨＩＳ−ＳＮＡＰ２５（ＳＮＡＲＥ複合体なし）
Ｂ．完全長ＨＩＳ−ＳＮＡＰ２５＋完全長シンタキシン１＋完全長シナプトブレビン２
Ｃ．完全長ＨＩＳ−ＳＮＡＰ２５＋完全長シンタキシン１＋シナプトブレビン２ ４５ａａペプチド
Ｄ．完全長ＨＩＳ−ＳＮＡＰ２５＋シンタキシン１ ４５ａａペプチド＋完全長シナプトブレビン２
Ｅ．完全長ＨＩＳ−ＳＮＡＰ２５＋シンタキシン１ ４５ａａペプチド＋シナプトブレビン２ ４５ａａペプチド。
特に、レーンＥは、１つの組み換えタンパク質が３つの合成ペプチド（そのうち１つがコンプレキシン・ペプチドである）と結合する生成物を表す。
【０２１０】
実施例１５
ＳＮＡＲＥ集合は、血清の存在下で達成できる。特定の用途では、ＳＮＡＲＥベースの薬剤は、血液中への注射後に新たに相互作用が求められるであろう。ＦＩＴＣ蛍光タグを持つ４５アミノ酸シンタキシン１ペプチドを、１００％の仔ウシ血清の存在下、グルタチオン・ビーズ上に固定化したＧＳＴ−三重らせんタンパク質（シナプトブレビンに結合させたＳＮＡＰ−２５、ＳＢタンパク質）への結合について試験した。結果を図４７に示す。注記、ビーズ上の三重らせんタンパク質の存在が、血清存在下でのシンタキシン蛍光ペプチドのプルダウンをもたらす。縦軸は相対蛍光単位を表す。
参考文献：
【０２１１】
【化１】

【０２１２】
【化２】

【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子足場を形成するための複合体形成系であって、以下の：
ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックス；
シンタキシンに由来する１本のポリペプチドヘリックス；
シナプトブレビンもしくはその相同体に由来する１本のポリペプチドヘリックス；および
該ポリペプチドヘリックスに結合させた１もしくは複数のカーゴ部分、
を含んでなり、ここで、４本のポリペプチドヘリックスが安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成でき、かつ、ここで、シンタキシンに由来するポリペプチドヘリックスはシナプトブレビンもしくはその相同体に由来するポリペプチドヘリックスと一体化している、前記複合体形成系。
【請求項２】
分子足場を形成するための複合体形成系であって、以下の：
ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックス；
シンタキシンに由来する１本のポリペプチドヘリックス；
シナプトブレビンもしくはその相同体に由来する１本のポリペプチドヘリックス；および
該ポリペプチドヘリックスに結合させた１もしくは複数のカーゴ部分、
を含んでなり、ここで、上記４本のポリペプチドヘリックスが安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成でき、かつ、ここで、上記ポリペプチドヘリックスは一体化して、２つのヘリックス含有成分を形成する、前記複合体形成系。
【請求項３】
前記ヘリックスのうちの２本が、両ヘリックスが同一の安定したＳＮＡＲＥ複合体に集合できるように一体化している、請求項１に記載の系。
【請求項４】
他の２本のヘリックスが、両ヘリックスが同一の安定したＳＮＡＲＥ複合体に集合できるように一体化している、請求項３に記載の系。
【請求項５】
前記ヘリックスのうちの３本が、３本のヘリックスすべてが同一の安定したＳＮＡＲＥ複合体に集合できるように一体化している、請求項２に記載の系。
【請求項６】
前記のＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックスと：シンタキシンに由来するポリペプチドヘリックス；またはシナプトブレビンもしくはその相同体に由来するポリペプチドヘリックスのいずれかとが一体化している、請求項５に記載の系。
【請求項７】
前記ヘリックスのうちの１本が、基材上に固定化されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の系。
【請求項８】
前記ＳＮＡＰタンパク質が、ＳＮＡＰ−２５である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の系。
【請求項９】
前記ポリペプチドヘリックスが、シナプトブレビンに由来する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の系。
【請求項１０】
各ヘリックスが、少なくとも約４０アミノ酸の長さである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の系。
【請求項１１】
前記ポリペプチドヘリックスのそれぞれの配列が、該ポリペプチドヘリックスを得たタンパク質またはタンパク質の一部の配列と少なくとも約８０％の同一性を有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の系。
【請求項１２】
ボツリヌス毒素の軽鎖またはその機能部、およびボツリヌス毒素の重鎖の転座部を含むカーゴ部分を含んでなる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の系。
【請求項１３】
ボツリヌス毒素の重鎖の受容体結合部、またはソマトスタチン・ペプチドもしくはその機能部を含むカーゴ部分を含んでなる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の系。
【請求項１４】
別個のヘリックスまたはヘリックス含有成分に結合させた第１および第２のカーゴ部分を含んでなり、ここで、第１のカーゴ部分がボツリヌス毒素の軽鎖またはその機能部およびボツリヌス毒素の重鎖の転座部を含み、かつ、第２のカーゴ部分がボツリヌス毒素の重鎖の受容体結合部またはソマトスタチン・ペプチドもしくはその機能部を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の系。
【請求項１５】
前記第２のカーゴ部分が、ボツリヌス毒素の重鎖の受容体結合部を含む、請求項１４に記載の系。
【請求項１６】
ＳＮＡＲＥ複合体に結合できるコンプレキシンに由来する１本のポリペプチドヘリックスをさらに含んでなる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の系。
【請求項１７】
界面活性剤をさらに含んでなる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の系。
【請求項１８】
前記界面活性剤が、ＭＥＧＡ８、Ｃ−ＨＥＧＡ１０、Ｃ−ＨＥＧＡ１１、ＨＥＧＡ９、ヘプチルグルコピラノシド、オクチルグルコピラノシド、ノニルグルコピラノシド、zwittergent 3-08、zwittergent 3-10およびzwittergent 3-12から選択される、請求項１７に記載の系。
【請求項１９】
前記界面活性剤が、オクチルグルコピラノシドである、請求項１７または１８に記載の系。
【請求項２０】
前記ヘリックスのうちの２本が、両ヘリックスが同一のＮＡＲＥ複合体に集合できないように一体化している、請求項１または２に記載の系。
【請求項２１】
前記ヘリックスのうちの２本が一体化している、請求項１または２に記載の系であって、そしてここで、一体化された２本のヘリックスのうちの１本と同一のタンパク質に由来する単一ポリペプチドヘリックスをさらに含んでなる前記系。
【請求項２２】
前記単一ポリペプチドヘリックスを、基材上に固定化する、請求項２１に記載の系。
【請求項２３】
請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の系によって作り出される多量体。
【請求項２４】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の複合体形成系の使用。
【請求項２５】
診断における、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の複合体形成系の使用。
【請求項２６】
その上に安定したＳＮＡＲＥ複合体を固定化した装置であって、該ＳＮＡＲＥ複合体が、以下の：
ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックス；
シンタキシンに由来する１本のポリペプチドヘリックス；
シナプトブレビンもしくはその相同体に由来する１本のポリペプチドヘリックス；および
該ポリペプチドヘリックスに結合させた１もしくは複数のカーゴ部分、
を含んでなり、ここで、アレイ、アッセイ、マイクロ流体デバイス、ＳＰＲ器具、ＱＣＭ器具、質量分析計、電気泳動器具、クロマトグラフィーカラム、走査型プローブ顕微鏡、および熱量測定器具から選択される前記装置。
【請求項２７】
１もしくは複数のカーゴ部分を保有するＳＮＡＲＥ複合体を形成する方法であって、以下のステップ：
ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックス、シンタキシンに由来する１本のポリペプチドヘリックス、およびシナプトブレビンまたはその相同体に由来する１本のポリペプチドヘリックスを一つに結合させて、安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成する、
を含み、ここで、１もしくは複数のカーゴ部分を該ポリペプチドヘリックスに結合させ、そしてここで：
（ｉ）シンタキシンに由来するポリペプチドヘリックスを、シナプトブレビンもしくはその相同体に由来するポリペプチドヘリックスに連結するか；または
（ｉｉ）該ポリペプチドヘリックスを一体化して、２本のヘリックス含有成分を形成する前記方法。
【請求項２８】
分子足場を形成するための成分であって、シナプトブレビンもしくはその相同体に由来するポリペプチドヘリックスに連結されたシンタキシンに由来するポリペプチドヘリックスを含み、ここで、連結された２本のヘリックスが安定したＳＮＡＲＥ複合体の一部を形成できる前記成分。
【請求項２９】
配列番号１２、１３、１４および７３から選択される配列を含む、請求項２８に記載の成分。
【請求項３０】
ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックスと、シンタキシンに由来するポリペプチドヘリックスまたはシナプトブレビンに由来するポリペプチドヘリックスのいずれかを含んでなる分子足場を形成するための成分であって、ここで、３本のヘリックスが一体化されて、三重らせん成分を形成し、そしてここで、該連結された３本のヘリックスが安定したＳＮＡＲＥ複合体の一部を形成できる前記成分。
【請求項３１】
配列番号１５の配列を含んでなる、請求項３０に記載の成分。
【請求項３２】
請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の成分の使用。
【請求項３３】
シナプトブレビンもしくはその相同体に由来するポリペプチドヘリックスに連結されたシンタキシンに由来するポリペプチドヘリックスを含む成分を含んでなるキットであって、ここで、連結された２本のヘリックスが安定したＳＮＡＲＥ複合体の一部を形成できる前記キット。
【請求項３４】
シンタキシン／シナプトブレビン由来ヘリックスと安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成できる、ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックスをさらに含んでなる、請求項３３のキット。
【請求項３５】
ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックスと、シンタキシンに由来するポリペプチドヘリックスまたはシナプトブレビンに由来するポリペプチドヘリックスのいずれかを含む成分を含んでなるキットであって、ここで、３本のヘリックスが一体化されて、三重らせん成分を形成し、そしてここで、該連結された３本のヘリックスが安定したＳＮＡＲＥ複合体の一部を形成できる前記キット。
【請求項３６】
シナプトブレビンもしくはその相同体またはシンタキシンのいずれかである第４のＳＮＡＲＥタンパク質に由来する単一ポリペプチドヘリックスをさらに含んでなり、ここで、単一ポリペプチドヘリックスが三重らせん成分と安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成できる、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
分子足場を形成するための複合体形成系であって、以下の：
ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックス；
シンタキシンに由来する１本のポリペプチドヘリックス；
シナプトブレビンもしくはその相同体に由来する１本のポリペプチドヘリックス；および
該ポリペプチドヘリックスに結合させた１もしくは複数のカーゴ部分、
を含んでなり、ここで、４本のポリペプチドヘリックスが安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成でき、そしてここで、該ＳＮＡＲＥ複合体が界面活性剤の存在下で形成される前記複合体形成系。
【請求項３８】
前記系が、Ｍｕｎｃ１８タンパク質を含まない、請求項３７に記載の系。
【請求項３９】
Ｍｕｎｃ１８タンパク質の不存在下、ＳＮＡＲＥ複合体の集合を促進するための界面活性剤の使用。
【請求項４０】
一つに連結された複数の安定したＳＮＡＲＥ複合体を含んでなる多量体であって、ここで、各ＳＮＡＲＥ複合体が、以下の：
ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックス；
シンタキシンに由来する１本のポリペプチドヘリックス；および
シナプトブレビンもしくはその相同体に由来する１本のポリペプチドヘリックス、
を含んでなり、ここで、あるＳＮＡＲＥ複合体からのヘリックスが、別のＳＮＡＲＥ複合体からヘリックスに連結されて、それらのＳＮＡＲＥ複合体を一体化し、かつ、ここで、１もしくは複数のカーゴ部分をポリペプチドヘリックスに結合させる前記多量体。
【請求項４１】
あるＳＮＡＲＥ複合体からの３本のヘリックスを、３つの異なるＳＮＡＲＥ複合体内のヘリックスに結合させた分岐をさらに含んでなる、請求項４０の多量体。
【請求項４２】
以下のステップ：
１）第１のＳＮＡＲＥヘリックスに由来する第１のポリペプチドヘリックスを提供し；
２）第２および第３のポリペプチドヘリックスを、第１のポリペプチドヘリックスに結合させて、三重らせん複合体を形成し、ここで、第２および第３のポリペプチドヘリックスが第２および第３のＳＮＡＲＥヘリックスに由来し；
３）第４のポリペプチドヘリックスを、３本ヘリックス束に結合させて、安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成させ、ここで、第４のポリペプチドヘリックスが第４のＳＮＡＲＥヘリックスに由来し、そしてここで、第４のポリペプチドヘリックスが、第１のＳＮＡＲＥヘリックスに由来する第５のポリペプチドヘリックスに連結され；そして
４）ステップ２）および３）を繰り返して、多量体を形成する、ここで、１もしくは複数のカーゴ部分をポリペプチドヘリックスに結合させる、
を含んでなる多量体を作り出す方法。
【請求項４３】
前記第２、第３、第４および第５のポリペプチドヘリックスの固有性が反復ステップにおいて維持される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記第２および第３のポリペプチドヘリックスを、それらが同一のＳＮＡＲＥ複合体に一緒に集合できるように一つに連結する、請求項４２または４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記第１のポリペプチドヘリックスを、基材上に固定化する、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
すべての非結合ヘリックスを取り除くために、それぞれの結合ステップ後に洗浄ステップをさらに含む、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
第１のＳＮＡＲＥヘリックスに由来する第６のポリペプチドヘリックスを使用することによって多量体内に分岐を導入する、ここで、第６のポリペプチドヘリックスを第２、第３、第４または第５のポリペプチドヘリックスのうちの１本に結合させる、請求項４２〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
請求項４２〜４７のいずれか１項に記載の方法によって作り出される多量体。
【請求項４９】
２つのカーゴ部分を含んでなる二成分化合物を形成するための複合体形成系であって、以下の：
ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックス；
シンタキシンに由来する１本のポリペプチドヘリックス；そして
シナプトブレビンもしくはその相同体に由来する１本のポリペプチドヘリックス、
を含んでなり、ここで、４本のポリペプチドヘリックスが安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成でき、ここで、第１のカーゴ部分を第１のヘリックスに結合させ、かつ、第２のカーゴ部分を第２の別個のヘリックスに結合させ、そしてここで、ＳＮＡＲＥ複合体の形成が二成分化合物の形成を引き起こす前記複合体形成系。
【請求項５０】
前記二成分化合物が、毒素である、請求項４９に記載の複合体形成系。
【請求項５１】
前記毒素が、ボツリヌス毒素、ジフテリア毒素、破傷風毒素およびリシンから選択される、請求項５０に記載の複合体形成系。
【請求項５２】
前記毒素が、ボツリヌス毒素である、請求項５１に記載の複合体形成系。
【請求項５３】
以下の：
ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックス；
シンタキシンに由来する１本のポリペプチドヘリックス；および
シナプトブレビンもしくはその相同体に由来する１本のポリペプチドヘリックス、
を含んでなり、ここで、４本のポリペプチドヘリックスが安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成でき、ここで、第１のカーゴ部分を第１のヘリックスに結合させ、かつ、第２のカーゴ部分を第２の別個のヘリックスに結合させ、そしてここで、第１のカーゴ部分がボツリヌス毒素の軽鎖またはその機能部およびボツリヌス毒素の重鎖の転座部を含んでなり、かつ、第２のカーゴ部分がボツリヌス毒素の重鎖の受容体結合部を含んでなる、請求項５２に記載の複合体形成系。
【請求項５４】
請求項４９〜５３のいずれか１項に記載の複合体形成系の使用。
【請求項５５】
治療法における使用のための、請求項５０〜５３のいずれか１項に記載の複合体形成系。
【請求項５６】
前記毒素が、新生物疾患の処置における使用のためのジフテリア毒素およびリシンから選択される、請求項５１に記載の複合体形成系。
【請求項５７】
神経シナプスの阻害によって緩和される疾患または身体状態の処置における使用のための、請求項５２または５３に記載の複合体形成系。
【請求項５８】
神経シナプスの阻害によって緩和される疾患または身体状態が、発汗過多、唾液分泌過多、ジストニア、胃腸障害、泌尿器疾患、顔面けいれん、斜視、脳性麻痺、吃音、慢性緊張型頭痛、涙液分泌過剰、多汗症、下咽頭収縮筋のけいれん、痙性膀胱、疼痛、片頭痛、および例えばしわ取り、額のしわ取りなどの美容整形術から成る群から選択される、請求項５７に記載の複合体形成系。
【請求項５９】
神経シナプスの阻害によって緩和される疾患または身体状態を処置する方法であって、請求項５２または５３に記載の系を含んでなる組成物の有効量の投与を含んでなる前記方法。
【請求項６０】
２つのカーゴ部分を含んでなる二成分化合物を形成するためのＳＮＡＲＥ複合体を形成する方法であって、以下のステップ：
ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックス、シンタキシンに由来する１本のポリペプチドヘリックス、およびシナプトブレビンまたはその相同体に由来する１本のポリペプチドヘリックスを一体化させて、安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成する、
を含んでなり、ここで、第１のカーゴ部分を第１のヘリックスに結合させ、かつ、第２のカーゴ部分を第２の別個のヘリックスに結合させ、そしてここで、ＳＮＡＲＥ複合体の形成が二成分化合物の形成を引き起こす前記方法。
【請求項６１】
前記二成分化合物が、毒素である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記毒素が、ボツリヌス毒素、ジフテリア毒素、破傷風毒素およびリシンから選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記毒素が、ボツリヌス毒素である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
以下のステップ：
ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックス、シンタキシンに由来する１本のポリペプチドヘリックス、およびシナプトブレビンもしくはその相同体に由来する１本のポリペプチドヘリックスを一体化させて、安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成する、
を含んでなり、ここで、第１のカーゴ部分を第１のヘリックスに結合させ、かつ、第２のカーゴ部分を第２の別個のヘリックスに結合させ、ここで、第１のカーゴ部分がボツリヌス毒素の軽鎖またはその機能部およびボツリヌス毒素の重鎖の転座部を含んでなり、かつ、第２のカーゴ部分がボツリヌス毒素の重鎖の受容体結合部を含んでなる、請求項６３に記載のボツリヌス毒素を形成するための方法。
【請求項６５】
ＳＮＡＰタンパク質；シンタキシン；またはシナプトブレビンもしくはその相同体に由来するポリペプチドヘリックスを含んでなり、ここで、ポリペプチドヘリックスには、ボツリヌス毒素の軽鎖またはその機能部およびボツリヌス毒素の重鎖の転座部を含んでなるカーゴ部分を結合させる、ボツリヌス毒素を形成するための成分。
【請求項６６】
ＳＮＡＰタンパク質；シンタキシン；またはシナプトブレビンもしくはその相同体に由来するポリペプチドヘリックスを含んでなり、ここで、ポリペプチドヘリックスには、ボツリヌス毒素の重鎖の受容体結合部を含んでなるカーゴ部分を結合させる、ボツリヌス毒素を形成するための成分。
【請求項６７】
請求項６５または６６に記載の成分の使用。
【請求項６８】
ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックス；シンタキシンに由来する１本のポリペプチドヘリックス；およびシナプトブレビンもしくはその相同体に由来する１本のポリペプチドヘリックスを含んでなり、ここで、４本のポリペプチドヘリックスが安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成し、ここで、第１のカーゴ部分を第１のヘリックスに結合させ、かつ、第２のカーゴ部分を第２の別個のヘリックスに結合させ、そしてここで、第１のカーゴ部分がボツリヌス毒素の軽鎖またはその機能部およびボツリヌス毒素の重鎖の転座部を含んでなり、かつ、第２のカーゴ部分がボツリヌス毒素の重鎖の受容体結合部を含んでなるキット。
【請求項６９】
分子足場を形成するための複合体形成系であって、以下の：
ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックス；
シンタキシンに由来する１本のポリペプチドヘリックス；
シナプトブレビンもしくはその相同体に由来する１本のポリペプチドヘリックス；および
該ポリペプチドヘリックスに結合させた１もしくは複数のカーゴ部分、
を含んでなり、ここで、４本のポリペプチドヘリックスが安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成し、かつ、ここで、ポリペプチドヘリックスのうちの少なくとも２本が５０アミノ酸未満の長さである前記複合体形成系。
【請求項７０】
１もしくは複数のカーゴ部分を保有するＳＮＡＲＥ複合体を形成する方法であって、以下のステップ：ＳＮＡＰタンパク質に由来する２本のポリペプチドヘリックス、シンタキシンに由来する１本のポリペプチドヘリックス、およびシナプトブレビンまたはその相同体に由来する１本のポリペプチドヘリックスを一体化させて、安定したＳＮＡＲＥ複合体を形成する、を含み、ここで、１もしくは複数のカーゴ部分をポリペプチドヘリックスに結合させ、そしてここで、ポリペプチドヘリックスのうちの少なくとも２本が５０アミノ酸未満の長さである前記方法。

【図１】

【図２】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４Ａ】

【図１４Ｂ】

【図１５】

【図１６Ａ】

【図１６Ｂ】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【図３９】

【図４０】

【図４１】

【図４２】

【図４３】

【図４４】

【図４５】

【図４６】

【図４７】

【公表番号】特表２０１３−５０１７７１（Ｐ２０１３−５０１７７１Ａ）
【公表日】平成２５年１月１７日（２０１３．１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２４２９３（Ｐ２０１２−５２４２９３）
【出願日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／０５１３３６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１８６６５
【国際公開日】平成２３年２月１７日（２０１１．２．１７）
【出願人】（５０３２７６９９７）メディカル　リサーチ　カウンシル (10)
【Ｆターム（参考）】