複数の成分検出のための共振エネルギ転移アッセイ・システム
本発明は分子集合を検出するためのシステムに関する。
特に、本発明は以下の構成からなる複数の成分の検出システムと関連がある:
i).第1のタグが第1の活性化されたタグを生じる基質またはエネルギ源により活性化すると第1の波長の光を発する直接または間接的に第1のタグに連結する第1の相互作用している基からなる第1の媒介物、
ii).第1および第2の相互作用している基が関連し、第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、このことにより、第2の波長の光を発する第2の活性化されたタグを生じる場合、第2のタグは第1のタグからエネルギを受け入れることができる直接または間接的に第2のタグに連結する第2の相互作用している基からなる第2の媒介物、
iii).第1のおよび第3の相互作用している基が関連し、第3の波長の光を発する第3の活性化されたタグを生じるため、第1のタグに適切な基質またはエネルギ供給源が存在する場合、直接または間接的に第1の活性化されたタグからエネルギを受け入れることができる第3のタグに連結する第3の相互作用している基からなる第3の媒介物、
iv).第1のタグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、
および、v).前記発せられた光を検出する手段。
特に、本発明は以下の構成からなる複数の成分の検出システムと関連がある:
i).第1のタグが第1の活性化されたタグを生じる基質またはエネルギ源により活性化すると第1の波長の光を発する直接または間接的に第1のタグに連結する第1の相互作用している基からなる第1の媒介物、
ii).第1および第2の相互作用している基が関連し、第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、このことにより、第2の波長の光を発する第2の活性化されたタグを生じる場合、第2のタグは第1のタグからエネルギを受け入れることができる直接または間接的に第2のタグに連結する第2の相互作用している基からなる第2の媒介物、
iii).第1のおよび第3の相互作用している基が関連し、第3の波長の光を発する第3の活性化されたタグを生じるため、第1のタグに適切な基質またはエネルギ供給源が存在する場合、直接または間接的に第1の活性化されたタグからエネルギを受け入れることができる第3のタグに連結する第3の相互作用している基からなる第3の媒介物、
iv).第1のタグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、
および、v).前記発せられた光を検出する手段。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、分子集合を検出するためのシステムに関する。特に、本発明は複数の成分検出システムに関連があり、そこにおいて、2つまたはそれ以上の成分の分子集合が検出される。
【背景技術】
【0002】
ポスト・ゲノム時代において、プロテオミクスはより重要になった。それは、セルにおいて発現されるゲノムによってコード化されるすべてのタンパクの確認、および、発現、相互作用および機能性を含むそれらの挙動の説明を含む。
【0003】
タンパクは、セルにおいて単離して作用せず、むしろ安定性があるかまたは一時的な複合体であり、タンパク‐タンパク相互作用は、タンパク機能の鍵となる決定因子である。(アウアーバッハ他(2002)、プロテオミクス、2、611‐623)さらに、タンパクおよびタンパク複合体は、デオキシリボ核酸、リボゾームリボ核酸および小型分子のように他の細胞成分と相互作用する。これらの相互作用に関係する個別のタンパク質類を解明かつ解剖することは、生物学的プロセスを理解するために重要である。
【0004】
このために、多くの分析(アッセイ)技術は、生物相互作用の決定を援助するために長年にわたって開発されてきた。しかしながら、これらの技術の多くは、高スループット・スクリーニングに適さず、費用のかかる手順を含む。例えば、例えば免疫共沈降技術が、タンパク‐タンパク相互作用を確認するために長年用いられてきた;しかしながら、この技術は、自動操作または高スループット・スクリーニングに従わない。マススペクトル分析と結合した免疫共沈降のような他の技術は、(アンダーソン及びマン(2000)FEBS Lett、(480、25‐31))薬剤スクリーニング・プログラムで使用するにはあまりに複雑で、時間がかかり、費用がかかる。表面プラスモン共振(SPR)は、高感受性があり、生物相互作用を検出することができる正確な技術である。しかしながら、この技術は、センサー表面に固定される十分な量の精製された標的タンパク質を必要とし、分子の複雑な混合物においてそれと結合する配位子の識別におけるいかなる情報も生じない。
【0005】
開発された他の技術は、高感受性があり、用途が広いが精製された状態において利用できる相互作用する分子を必要とするアルファスクリーンシステム(登録商標)、高スループット・スクリーニングにおいて有用であるが、多数の誤った結果を生じ、ダイナミックレンジが制限された蛍光偏光および蛍光異方性(ポープ他(1999)、Drug Disc Today、4、350‐362)、および、広いダイナミックレンジを有するが、しかし、相互作用パートナー間の質量差は大きくなければならず、分析が複雑である蛍光相関分光法(ポープ他(1999)、Drug Disc Today、4、350‐362)を含む。
【0006】
さらに重要なことに、すべての上記の方法は、検出が試験管内でのみ発生するという大きな不都合を共有する。この人工の状態は、タンパクが多くの異なるパートナーと相互作用し、クロストークする細胞内生育環境を正確に反映するわけではない。また、相互作用はバッファ状態次第であり、不適当な状態の選択によって相互作用は、完全に破壊または初期化され、したがって、疑陽性および疑陰性の数および可能性を増加させる結果を生じる。
【0007】
結果として、多くの検出システムは、‘生体内’でのタンパク‐タンパク相互作用を検出するために開発された。例えば、酵母2ハイブリッドシステム(フィールズおよびソング(1989)NATURE、340、245‐246)が、広く使われている。しかしながら、この技術は、生体酵母細胞の細胞核内部のタンパク‐タンパク相互作用の監視ができるだけである。それゆえに、哺乳動物の細胞に特定の膜タンパク質の重要な種類および翻訳後修飾は分析することができない。
【0008】
蛍光共振エネルギ転移(FRET)は、‘生体内’でのタンパク‐タンパク反応を検出することができる別の検出システムである(フォースター(1948)Ann.Phys.2、57‐75)。この技術は、緑蛍光タンパク(GFP)および異なる分光特性を有するその変異体のクローンがつくられた場合、生細胞の分析に特に魅力的であり、適用可能になった。これは、コード化しているDNAの塩基配列を融合させることによって、いかなる標的タンパク質へのGFPおよびその変種の遺伝子的結合を可能にした。(エイム他(1994)PNAS.USA.91、12501‐12504)。酵母2ハイブリッドシステムと比較して、FRETは監視された相互作用が細胞内部のどこにでも発生することができる利点を有する。FRETは、いかなる細胞のタイプ(哺乳動物、酵母、細菌など)、または、無細胞系においても決定することができる。それは、蛍光分光学法、蛍光顕微鏡法および蛍光活性化細胞選別(FACS)によって検出することができる。しかしながら、後述するように、FRETは一つの大きな欠点を有する、それは単一の相互作用を検出するためのみに用いることができるということである。
【0009】
生物発光共振エネルギ転移(BRET)は、生体内のタンパク‐タンパク相互作用/反応を研究するために開発された別の技術である(スー他(1999)、PNAS.USA、96、151‐156;エイデン他(2002)Trends Endocrin.Metabol.13、415‐421)FRETに類似して、この技術は、検出が生細胞内で起こり、特定の細胞の仕切りに制限されない利点を有する。加えて、それはFRETのいくつかの潜在的な制限を克服する:光がルシフェラーゼによって本質的に生成するので、検出システムは、共振エネルギ転移から生じる同等に弱い信号と強い励起光源とを区別する必要はない。さらに、細胞の蛍光および自己蛍光のフォトブリーチングは観察されない。
【0010】
しかしながら、FRETの様に、BRETの大きな制限は、単一の、1対1の相互作用のみが検出できるということである。しかしながら、大部分のタンパクが1つ以上の潜在性結合パートナーを有することが広く認められる。他のものは2つまたはそれ以上のより大きい複合体において作用し、特定のタンパクの機能は、他のタンパクの複合体の存在に極めて依存する。したがって、単一の相互作用に注目することは、特定のタンパクの多数の機能の状況、特異性、および、交差反応性について言及するわけではない。
【0011】
したがって、試験管内のおよび生体内の多数のタンパク‐タンパク集合を検出することができる複数の成分検出システムの必要がある。さらに重要なことに、スループットを増加させ、時間およびコストを減らすように同時に多数の集合を分析することができるシステム、および、複数の成分分子の付随物の一部としてタンパクおよび他の生物学上関連した分子を分析することができるシステムの必要がある。
【発明の開示】
【0012】
発明者は、試験管内のおよび生体内の多数の相互作用を検出することができる一方、従来技術のシステムにおいて識別されるいくつかの問題を解決してまたは少なくとも軽減することができる複数の成分検出システムを開発した。
【0013】
したがって、第1の態様において、以下の構成からなる複数の成分検出システムが提供される:i).第1のタグが第1の作動タグを生じる基質またはエネルギ源によって活性化されると第1の波長の光を発する、直接または間接的に第1のタグに連結する第1の相互作用している基からなる第1の媒介物、ii).第1および第2の相互作用している基が関連し、第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、第2の波長の光を発する第2の活性化タグをこのことにより生じる場合、第2のタグは第1のタグからエネルギを受け入れることができる直接または間接的に第2のタグに連結する第2の相互作用している基からなる第2の媒介物、iii).第1および第3の相互作用している基が関連し、第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、第3の波長の光を発する第3の活性化タグをこのことにより生じる場合、直接または間接的に第1の活性化されたタグからエネルギを受け入れることができる第3のタグに連結する第3の相互作用している基からなる第3の媒介物、iv).第1のタグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、および、v).前記発せられた光を検出する手段。
【0014】
第2の態様において、以下の構成からなる複数の成分検出システムが提供される:i).第1のタグが第1の作動タグを生じる基質またはエネルギ源によって活性化されると第1の波長の光を発する、直接または間接的に第1のタグに連結する第1の相互作用している基からなる第1の媒介物、ii).第1および第2の相互作用している基が関連し、i)における第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、第2の波長の光を発する第2の活性化タグをこのことにより生じる場合、第2のタグはi)における第1のタグからエネルギを受け入れることができる直接または間接的に第2のタグに連結する第2の相互作用している基からなる第2の媒介物、iii).第1、第2、および第3の相互作用している基が関連し、i)の第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が第3の波長の光を発する第3の活性化されたタグを生じるために存在するが、第1のおよび第3の相互に作用している基だけが関連する場合、前記第3のタグはi)の第1の活性化されたタグによって本質的に活性化されない直接または間接的にii)の第2の活性化されたタグから、エネルギを受け入れることができる第3のタグに連結する第3の相互作用している基からなる第3の媒介物、iv).i)においてタグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、および、v).前記発せられた光を検出する手段。
【0015】
第3の態様において、以下の構成からなる複数の成分検出システムが提供される:i).第1のタグが第1の作動タグを生じる基質またはエネルギ源によって活性化されると第1の波長の光を発する、直接または間接的に第1のタグに連結する第1の相互作用している基からなる第1の媒介物、ii).第1および第2の相互作用している基が関連し、i)における第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、第2の波長の光を発する第2の活性化タグをこのことにより生じる場合、第2のタグはi)における第1のタグからエネルギを受け入れることができる直接または間接的に第2のタグに連結する第2の相互作用している基からなる第2の媒介物、iii).第1および第3の相互作用している基が関連し、およびi)の第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、ii)において第2の活性化されたタグからのエネルギ受け入れる場合、および、第2および第3の相互に作用している基が関連し、第3の波長の光を発する第3の活性化されたタグを生じるためにii)において第2のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在する場合、直接または間接的にi)の第1の活性化されたタグから、エネルギを受け入れることができる第3のタグに連結する第3の相互作用している基からなる第3の媒介物、iv).i)およびii)においてタグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、および、v).前記発された光を検出する手段。
【0016】
第4の態様において、以下の構成からなる複数の成分検出システムが提供される:i).第1のタグが第1の作動タグを生じる基質またはエネルギ源によって活性化されると第1の波長の光を発する、直接または間接的に第1のタグに連結する第1の相互作用している基からなる第1の媒介物、ii).第1および第2の相互作用している基が関連し、i)における第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、第2の波長の光を発する第2の活性化タグをこのことにより生じる場合、第2のタグはi)における第1のタグからエネルギを受け入れることができる直接または間接的に第2のタグに連結する第2の相互作用している基からなる第2の媒介物、iii).a).第1および第3の相互作用している基が関連する場合、第1の活性化タグ;および/または、b).第2および第3の相互作用している基が関連し、そして第1および/または第2のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、それによって、第1および/または第2の活性化タグからの光放射は減少する場合、第2の活性化タグからエネルギを受け入れることができる非蛍光性失活剤分子からなる第3のタグに直接または間接的に連結する第3の相互作用している基からなる第3の媒介物、iv).i)およびii)のタグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、および、v).前記発された光を検出する手段。
【0017】
第5の態様において、以下の構成からなる複数の成分検出システムが提供される:i).第1のタグが第1の活性化タグを生じる基質またはエネルギ源によって活性化されると第1の波長の光を発する、直接または間接的に第1のタグに連結する第1の相互作用している基からなる第1の媒介物、ii).第2の活性化タグを生じる基質またはエネルギ源により活性化されると第2のタグは第2の波長の光を発する直接または間接的に第2のタグに連結する第2の相互作用している基、iii).第1のおよび第3の相互作用している基が関連し、第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源は、第3の波長の光を発する第3の活性化タグを生じるために存在する場合、第3のタグが第1の活性化されたタグからエネルギを受け入れることができる直接または間接的に第3のタグに連結する第3の相互作用している基からなる第3の媒介物、iv).第2および第4の相互作用している基が関連し、第2のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源は、第4の波長の光を発する第4の活性化タグを生じるために存在する場合、第4のタグが第2の活性化されたタグからエネルギを受け入れることができる直接または間接的に第4のタグに連結する第4の相互作用している基からなる第4の媒介物、v).第1および第2のタグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、およびvi).前記発された光を検出する手段。
【0018】
第6の態様において、以下の構成からなる複数の成分検出システムが提供される:i).第1のタグが第1の活性化タグを生じる基質またはエネルギー源によって活性化されると第1の波長の光を発する、直接または間接的に第1のタグに連結する第1の相互作用している基からなる第1の媒介物、ii).第1および第2の相互に作用している基が関連し、第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、第2の波長の光を発する第2の活性化タグをこのことにより生じる場合、第2のタグは第1のタグからエネルギを受け入れることができる直接または間接的に第2のタグに連結する第2の相互作用している基からなる第2の媒介物、iii).第1の1つまたはそれ以上のさらなる相互作用している基が関連し、および第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が、1つまたはそれ以上のさらなる波長の光を発する1つまたはそれ以上のさらなる活性化されたタグを生じるために存在し、ここにおいてさらなる波長は、第1または第2の波長とは異なる場合、第1の活性化タグからエネルギを受け入れることができる1つまたはそれ以上のさらなるタグに直接または間接的に連結する1つまたはそれ以上のさらなる相互作用している基からなる1つまたはそれ以上のさらなる媒介物、iv).第1のタグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、およびv).前記発された光を検出する手段。
【0019】
実施例において、相互作用している基は、1つまたはそれ以上の他の相互作用している基と関連することができる。これらの集合は、同一の相互作用している基の間または異なる相互作用している基の間またはその組合せであってもよい。
【0020】
好ましくは、相互作用している基は、化合物、タンパク、タンパク・ドメイン、タンパク・ループ、タンパク末端、ペプチド、ホルモン、脂質、炭水化物、核酸、オリゴヌクレオチド、薬剤媒介物、薬剤ターゲット、抗体、抗原物質、ウイルス、バクテリアおよび細胞、またはその集合またはその複合体、からなる基から選択されている。
【0021】
相互作用している基が核酸分子である場合、核酸分子のいかなる形状も使われる。例えば、核酸分子は、ゲノム・デオキシ核酸(DNA)、組換えDNA、相補デオキシリボ核酸(cDNA)、ペプチド核酸(PNA)、リボゾームリボ核酸(RNA)を含み、リボゾームリボ核酸は、異種核RNA(hnRNA)運搬RNA(tRNA)、小型妨害リボゾームリボ核酸(siRNA)、メッセンジャーRNA(mRNA)またはリボソームRNA(rRNA)およびそのハイブリッド分子を含む。
【0022】
実施例において、外部刺激は、相互作用している基の集合および/または配座を直接または間接的に調整するために適用される。好ましくは、刺激はいかなる周知の分子、有機物または無機物、タンパクまたは非タンパク、配位子、抗体、酵素、核酸、炭水化物、脂質、薬剤化合物、作動体、拮抗体、逆作動体またはその化合物または複合体、または温度、イオン強度またはpHを含む状態の変化、を含む試薬である。
【0023】
本発明によるタグは、赤外範囲に近いものから紫外線に近いものまでの光または吸収光を含むエネルギまたは、蛍光またはリン光を発することができるいかなる周知の分子、有機物または無機物、タンパクまたは非タンパク、またはその複合体であってもよい。好ましくは、タグは生物発光タンパク、蛍光タンパク、蛍光部分または非蛍光性失活剤である。
【0024】
好ましくは、生物発光タンパクは、適切な基質がある場合には、ルシフェラーゼ、ガラクトシダーゼ、ラクタマーゼ、ペルオキシダーゼ、または発光ができるいかなるタンパクからなる基から選択される。
【0025】
好ましくは、蛍光タンパクは、緑の蛍光タンパク(GFP)またはその変種、GFP(BFP)の青色の蛍光変種、GFP(CFP)のシアン蛍光変種、GFP(YFP)の黄色の蛍光変種、強化されたGFP(EGFP)、強化されたCFP(ECFP)、強化されたYFP(EYFP)、GFPS65T、エメラルド、トパーズ、GFPuv、不安定化EGFP(dEGFP)、不安定化ECFP(dECFP)、不安定化EYFP(dEYFP)、HcRed、t‐HcRed、DsRed、DsRed2、dimer2、t‐dimer2 (12)、mRFP1、ポシロポリン、ウミシイタケGFP、奇形GFP、paGFP、kaedeタンパクおよびキンドリング・タンパク、B‐フィコエリトリン、R‐フィコエリトリンおよびアロフィコシアニンを含むフィコビリタンパク質およびフィコビリタンパク質結合体、または蛍光またはリン光を発する他のいかなるタンパクからなる基から選ばれる。
【0026】
蛍光部分は、いかなる周知の蛍光部分であってもよい。好ましくは、蛍光部分は、Alexaフルーア色素および派生物、Bodipy色素および派生物、Cy色素および派生物、フルオレセインおよび派生物、ウンベリフェロン、蛍光および発光のミクロスフィア、蛍光ナノクリスタル、マリーナブルー、カスケードブルー、カスケードイエロー、パシフィックブルー、オレゴングリーンおよび派生物、テトラメチルローダミンおよび派生物、ローダミンおよび派生物、テキサスレッドおよび派生物、希土類元素キレートまたはその化合またはその派生物、または蛍光特性を有する他のいかなる分子からなる基から選択される。
【0027】
一実施例において、タグのうちの少なくとも1つは、非蛍光性失活剤である。非蛍光性失活剤は、光の吸収および蛍光および/または発光を抑える能力を有するいかなる周知の非蛍光性発色団であってもよい。非蛍光性失活剤はそれゆえに、いかなる周知のタンパク性のまたは非タンパク性の分子であってもよい。好ましくは、非蛍光性失活剤は、ダブシル、非蛍光性ポシロポリン、QSY‐7、QSY‐9、QSY‐21、QSY‐35、BHQ‐1、BHQ‐2およびBHQ‐3からなる基から選択される。
【0028】
タグおよび相互作用している基は、直接または間接的に連結される。好ましくは、直接のまたは間接的な連結は、2つの分子を連結する周知の共有結合または非共有結合手段でもある。より好ましくは、相互作用している基およびタグの直接のまたは間接的な連結は、化学的架橋、タンパクの化学修飾、アミノ酸の化学修飾、核酸の化学修飾、炭水化物の化学修飾、脂質または他のいかなる有機または無機分子の化学修飾、ビオチン‐アビジンを含む非共有結合の相互作用、抗原抗体または核酸ハイブリダイゼーションからなる基から選択される。
【0029】
好ましい実施例では、相互作用している基およびタグは、同じポリペプチド鎖の部分である。例えば、タンパク性の相互作用している基およびタンパク性のタグの核酸分子のコード付けは、(i)融解構造物の親和力純化のために使用されるペプチド配列のための配列コード付け;および/または(ii)真核細胞の細胞小器官仕切りに、融解構造物を導くペプチド配列のための配列コード付け、および/または(iii)、相互作用している基、タグおよび前記ペプチド(複数のペプチド)の融合タンパクを生じるために真核細胞薄膜の貫通を容易にするペプチド配列のための配列コード付けに、任意に融合する。
【発明を実施するための最良の形態】
【0030】
詳細に本発明を記載する前に、本発明は、本願明細書において開示される特に例証された生物発光または蛍光タンパク、分析または方法に制限されず、それは、もちろん変化すると理解される。本願明細書において用いられる専門用語は、発明の具体例のみを記載するためであり、それは添付の請求の範囲のみによって制限され、限定する意図を有さないとまた理解される。
【0031】
本願明細書において引用したすべての出版物、特許および特許出願は、以前にまたは以後であるにせよ、それらの全部において本願明細書に引用したものとする。しかしながら、本願明細書において言及される出版物は、出版物において報告され、発明と関連して使われる手順、試薬およびベクターを記載しておよび開示するために引用される。発明が従来の発明によってこのような開示に先だつ権利がないという承認として本願明細書において解釈されるわけではない。
【0032】
さらに本発明の実行は、特に明記しない限り、当業者の技術の範囲内で従来の分子生物学、化学および蛍光技術を使う。このような技術は当業者にとって周知であり、例えば以下の文献、コリガン、ダン、プロー、スパイカーおよびウィングフィールド「タンパク質科学の現行の手順」(1999)IおよびII(ジョン・ワイリー社);およびベイリー、J.E.、および、オリス、D.F.)「生物化学工学の基本」マグロウヒル社、ニューヨーク、1986;ラコウィッツ、J.R.「蛍光分光学法の原理」ニューヨーク:蛍光技術総会の出版物(1983)において完全に説明される。
【0033】
本願明細書および添付の請求の範囲において使われる単数形「a」、「an」および「the」は、文脈が別途明確に命ずる以外は複数の参照を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば「タンパク」の参照は、複数のこのようなタンパクを含み、および、「検体」に対する参照は、1つまたはそれ以上の検体に対する参照である。別途定義されない限り、本願明細書において用いられる技術的および科学的な用語のすべては、一般に本発明が属している技術の当業者によってよく理解されているものと同じ意味を有する。本願明細書において記載されるものと類似または同等のいかなる材料および方法が本発明の実行または検査に使用されるが、好適な材料および方法は、次に記載される。
【0034】
本発明は、多数の分子集合を検出するためのシステムに関連がある。本願明細書において使われる用語「分子集合」または「集合」は、いかなる周知の直接的または間接的な安定原子、または分子のレベル相互作用、またはそのいかなる連結を経て関連する相互作用するグループ2つまたはそれ以上の連結を参照する。ここで、相互作用は、例えば共有結合形成、イオン結合、水素結合、共座標結合または他のいかなる分子の結合相互作用のような結合相互作用、静電的相互作用、極性または疎水性の相互作用、または他のいかなる典型的または量子機械的な安定原子または分子の相互作用が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【0035】
実施例において、分子集合は、1つまたはそれ以上の相互作用している基(IG)からなる1つまたはそれ以上の媒介物の間にあり、そこにおいて、IGは、直接または間接的に1つまたはそれ以上タグの(「DT」)に連結する。本願明細書において使われる用語「媒介物」または「IG‐DT媒介物」、IGおよびタグ「DT」間の複合体を参照する。すなわち、IGは直接または間接的にDTに連結する。媒介物は、それらの純化を容易にする(i)および/または、成熟核宿主細胞の細胞小器官仕切りに、それらをターゲットにする(ii)および/または、細胞を囲む培地に加えられた場合、それらが真核細胞の細胞膜を貫通することを可能にする(iii)化学基、ペプチド配列、タンパクまたは核酸分子を含むように設計または修正される。
【0036】
実施例において、検出システムが多くの分子の集合を識別することができるという点で、媒介物は複数の媒介物であってもよい。しかしながら、他の実施例では、発明の検出システムは、本質的に第1、第2および第3の媒介物から構成されている。
【0037】
したがって、用語「集合」も、付近に被結合タグを導く相互作用している基を含むいかなる相互作用または配座の変化を参照する。タグ間の遠位は好ましくは、1から10ナノメートルの間の範囲である。IG‐DT媒介物間の直接の物理的な接触は必要とされず、1つまたはそれ以上の追加的な分子(複数)および/または1つまたはそれ以上の追加的な相互作用している基(複数)によって媒介される。
【0038】
本願明細書において使われる用語「相互作用している基」または「IG」は、化合物、タンパク、タンパク・ドメイン、タンパク・ループ、タンパク‐末端、ペプチド、ホルモン、タンパク‐脂質複合体、脂質、炭水化物、炭水化物含有化合物、核酸、オリゴヌクレオチド、薬剤媒介物、薬剤ターゲット、抗体、抗原物質、ウイルス、バクテリアおよび細胞またはそのいかなる複合体を含む。本質的に、相互作用している基は1つまたはそれ以上の実在物と複合体を形成することができる実在物である。例えば、複合体を抗原により形成することができるという点で、本発明の文脈の抗体は、第1のIGである。ここにおいて、抗原は第2のIG(下に示す)である。本発明のIGの別例は、複合体をリセプタで形成することができる配位子である。さらなる例は、その基質と酵素との相互作用である。加えて、IGは同じ分子の部分であってもよい。したがって例えば、Gタンパク被結合リセプタの第3の細胞内ループは、第1のIGであり、同じリセプタのC末端は、リセプタが活性化または非活性化された場合、結び付く第2のIGであってもよい。
【0039】
一実施例において、外部刺激は、直接または間接的に相互作用している基の集合および/または配座を調整するために適用される。本願明細書において使われる用語「刺激」は、いかなる周知の分子、有機物または無機物、タンパクまたは非タンパク、配位子、抗体、酵素、薬剤化合物、作動体、拮抗体、逆作動体、化合物またはその複合体も含む試薬を参照する。それはさらに温度、イオン強度またはpHを含む外部条件の変更を参照する。刺激は、直接または間接的に作用することができる。例えば、刺激が試薬である場合、それらは物理的に相互作用している基と結合する可能性があり、従ってそれらの集合の媒介となるまたは妨げる。これは例えば、リセプタの二量体化またはリセプタ内の配座の変化を生じる配位子であってもよい。間接的に作用する刺激の例は、IGは細胞酵素によって修正される、例えばリン酸化され;修正は交替でIGの集合を変えるという結果を有する細胞内の信号送信経路を活性化する試薬または状態の変更である。
【0040】
本願明細書において使われる用語「タグ」は、生物発光タンパク、蛍光タンパク、蛍光部分および非蛍光性失活剤を含む。要するに、あらゆる周知の分子、有機物または無機物、タンパクまたは非タンパク、またはその複合体は、光のようなエネルギを発する、または、赤外範囲に近い紫外線の光を吸収する、または、蛍光またはリン光を発することができる。
【0041】
本願明細書において使われる用語「生物発光タンパク」は、発光を生成することができるいかなるタンパクを参照する。生物発光タンパクはバクテリア、菌類、昆虫および海洋生物において発見されたルシフェラーゼを含む。それらは、光放射(ヘイスティングズ(1996)Gene 173、5‐11)の下で特定の基質(ルシフェリンとして周知の)の酸化を触媒する。最も広く周知の基質は、刺胞動物、カイアシ、毛顎動物、クシクラゲ、十脚甲殻類、アミ、放散虫およびいくつかの魚分類群において発生するコエレンレラジンである(グリーアおよびシャーレイ(2002)ルミネッセンス、17,43‐74)。最も広く使われているルシフェラーゼのうちの2つは、以下の通りである:
(i)ウミシイタケ・ルシフェラーゼ(R. レニフォルミスから)、基質としてコエレンレラジンを使用し、480ナノメートルで光を発する35kDaタンパク(ローレンツ他(1991)、PNAS. USA、88,4438‐4442);および、(ii) ホタル・ルシフェラーゼ(特異性ホタルから)、基質としてルシフェリンを使用し、560ナノメートルで光を発する61kDaタンパク(デウェット他(1987)、Mol. Cell.2987,725‐737)。
【0042】
近年、Gaussiaルシフェラーゼ(コペポーダから)が、生化学アッセイにおいて使われた(ヴェルハーゲン他(2002)Anal.Chem,74:4378‐4385)。Gaussiaルシフェラーゼは、470ナノメートルの光放射において生じる高速反応でコエレンタラジンを酸化させる20kDaタンパクである。
【0043】
一実施例において、基質がある限り、本発明で使用される生物発光タンパクは強い一定の光放射を呈する。生物発光タンパクがIGに連結するので、立体障害のためにIG間の相互作用の阻害を妨げるため低分子量を有する生物発光タンパクの使用は好ましい。生物発光タンパクは、IG‐DT媒介物の容易な製造を容易にするために好ましくは単一のポリペプチド鎖から構成されている。また、生物発光タンパクは、被結合IGの機能性を抑制してしまうオリゴマーまたは骨材を好ましくは形成しない。生物発光タンパク・ウミシイタケ・ルシフェラーゼ、Gaussiaルシフェラーゼおよびホタル・ルシフェラーゼは、これらの基準のすべてまたは大部分を満たす。
【0044】
本願明細書において使われる用語「基質」は、生物発光タンパクと共に発光を生成または吸収するために用いることができるいかなる分子をも参照する。
【0045】
基質の選択は、生物発光タンパクによって生成される光の波長および輝度に影響を与える。ウミシイタケ・ルシフェラーゼでは例えば、コエレンテラジン類似体が利用でき、418および512ナノメートルの間での光放射を生じる(イノウエ他(1997)Biochem. J.、233、349‐353)。コエレンテラジン類似体(400A、『ディープブルーC』)は、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ(PCT出願WO01/46691)で400ナノメートルで光を発することが記載された。
【0046】
本発明によって使用される基質は、好ましくは細胞透過性であり、細胞内生物発光タンパクに利用できるように細胞薄膜を通過することが可能である。コエレンテラジンおよび大部分のその派生物は、高浸透性の細胞であり(シモムラ他(1997)Biochem. J.326:297‐298)、一方、ルシフェリンは効率的に哺乳動物細胞の薄膜と交差しない。しかしながら、細胞膜を通過し、細胞酵素または紫外線光によって細胞原形質内部で放出される閉じ込められたルシフェリン化合物は開発された(ヤン他(1993)Biotechniques、15,848‐850)。
【0047】
本願明細書において使われる用語「蛍光タンパク」、蛍光またはリン光を発することができるいかなるタンパクをも参照する。本発明において採用された、異なる多くの蛍光タンパクがある。例えば、分子および細胞生物学で最も広く使われている蛍光タンパクは、クラゲビクトリア(チェン(1998)Annu.Rev. Biochem.67,509‐544)からの緑の蛍光タンパク(GFP)およびその配列から導かれる変種である。『強化された』蛍光タンパク(例えばEGFP)は、溶解性および蛍光を増加させ、タンパク質の折畳みを加速する点変異によって開発された(ゼルニッカ‐ゲッツ他(1997)Development(124,1133‐1137)。位置64におけるPheからLeuへの点変異は37℃でタンパクの安定度を増加させ、位置65におけるSerからThrへの変異は、蛍光を増加させる結果を生じる(オカベ他(1997)FEBS会報、407,313‐319;クロンテック社、パロアルト、カリフォルニア)。クロンテックから市販されているEGFPは、人間化されたコドン利用を組み込み、それが哺乳類の転写機構に「より異種でなく」なるようにさせ、最大限の遺伝子形質発現を保証する。加えて、緑の蛍光タンパクのスペクトル特性は特定のアミノ酸の部位特異的突然変異によって変えられることができ、例えば、EGFPの青(EBFP)、シアン(ECFP)および黄色の(EYFP)変異体が生じられた(チャンほか(2002)Nat. Rev. Mol.CellBiol.、3,906‐918)。蛍光タンパクの重要な他の種類は、サンゴの生物種のイソギンチャク(DsRed)からの赤い蛍光タンパク(RFP)(マッツほか(1999)Nature Biotechnol. 17,969‐973)、およびシライトイソギンチャク(HcRed)(グルスカヤ他(2001)、FEBS会報、507,16‐20))である。
【0048】
好ましくは高い蛍光量子収率を有する蛍光タンパクが、本発明で使われる。
【0049】
好ましくは、本発明で使用される蛍光タンパク質類の分子量は、IG間の立体障害を避けるのに十分小さくなくてはならない。
【0050】
好ましくは、単量体のタンパクは、被結合IGの機能との集合および干渉を避けるために用いられる。GFPは弱い二量体を形成する、しかし、二量化への傾向は二量体化インタフェース(ザカリア他(2002)、Science、296,913‐916)の疎水性アミノ酸の突然変異によって最小化することができる。赤い蛍光タンパクDsRedは、必須の四量体タンパクである。最近、DsRedを二量体タンパク(dimer2)に再生するDsRed配列の17の点変異が記述された。二量体のサブユニットは、モノマーとして物理的に作用する縄でつながれた二量体(t‐dimer2 (12))を形成するためにペプチド・リンカーを経て連結することができる。追加的な16の点変異は、dimer2を単量体の変種(mRFP1)に変換する(キャンベル他(2002)PNAS. USA(99,7877‐7882))。赤い蛍光タンパクHcRedは、二量体タンパクであって、モノマーとして蛍光を生じない。しかしながら、2つのサブユニットは、第2のN‐末端と第1のサブユニットのC末端を連結している短いペプチド・リンカーによって融合することができる。この融合タンパク質(t‐HcRed)は、t‐dimer2 (12)に類似した単量体のユニットとして効果的に作用する(フラドコフ他(2002)Biochem. J.(368,17‐21))。
【0051】
好ましくは、本発明によって使用される蛍光タンパクは、それらのフルオロフォア形成のため、短い成熟時間を呈する。これらの分子のフルオロフォアは、ポリペプチド鎖の特定の再配列によって形成される。このプロセスは、1時間未満から24時間以上かかる(チャン他(2002)、Nat.Rev. Mol. Cell 3,906‐918)。遅い成熟過程が機能的なDTの有効度および濃縮を制限するので、迅速に成熟するタンパクの使用が好まれる。迅速に成熟する蛍光タンパクは、例えば緑の蛍光タンパクEGFPおよびその色の変種、および赤い蛍光タンパクt‐dimer2およびmRFP1である。遅く成熟するタンパクは、例えばDsRedおよびHcRedである。
【0052】
「蛍光部分」または「複数の蛍光部分」は、本願明細書において取換可能に使われ、蛍光を生成することができる非タンパク性の分子を参照する。非タンパク性の蛍光分子は、他の分子に付着することができる通常小さい分子である。各々の非タンパク性の蛍光分子は、特定の分光特性を有する。本発明において使われることができる多くの異なる蛍光部分が存在する。非制限的な例は、ローダミン、ローダミン派生物、ダンシル、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセイン派生物、オレゴングリーン、テキサスレッド、Alexaフルーア色素およびCy色素を含む。本発明に関する蛍光部分のきわめて魅力的な種類は、蛍光ナノクリスタルである(ブルーチェス他(1998)Science、281,2013‐2016)。蛍光ナノクリスタルは強い蛍光を呈し、それらの蛍光発光は1000ナノメートル以上の波長範囲サイズの結晶によって調整することができる。全てのナノクリスタルの励起は、それらの蛍光発光から独立している同じ波長で発生する。それゆえに、様々なナノクリスタルは、同じ光源または同じ生物発光タンパクまたは蛍光分子からのRETを経て励起させられることができる。
【0053】
好ましくは、高い蛍光量子収率を有する蛍光部分が使われる。
【0054】
新しいタイプの蛍光部分は、最近報告され、タンパク性および非タンパク性の両方の成分を含む(グリフィン他(1998)、Science、281,269‐272;アダムズ他(2002)、J. Am.Chem.124,6063‐6076)。重ヒ素化合物テトラシステイン・システムは、標的タンパク質にペプチドを含む短いテトラシステインを融合させる。このペプチドは、安定性のある、蛍光複合体を細胞浸透性のある非蛍光性の重ヒ素化合物色素により形成する。色素の分子構造に従い、異なるフルオロフォアが得られる。
【0055】
本願明細書において使われる用語「エネルギ源」は、特定のフルオロフォアを活性化することができるいかなるエネルギ源をも参照する。好ましい実施例では、エネルギ源は光である。光源の非制限的な例は、レーザー、水銀ランプまたはキセノンランプを含む。光源は、発された光を特定の波長または特定の範囲の波長に制限する手段をさらに有する。例えば、これはフィルタ・ホイールまたはフィルタ・スライドに取り付けられる適切なフィルタ、単一の波長の光を生じるのみであるモノクロメータまたはレーザーである。
【0056】
用語「非蛍光性失活剤」は、それ自体が光を発することなく蛍光光を吸収することができるいかなる周知のタンパク性のまたは非タンパク性の分子をも参照する。非制限する例は、ダブシル、QSY失活剤、BHQ失活剤および非蛍光性ポシロポリン色素タンパクである。
【0057】
本発明に関して、生物発光、蛍光タンパクまたは蛍光部分は、特定の物理的な特性と同様に共振エネルギ転移(RET)のための適切なスペクトル特性を有しなければならない。必要な基質がある限り、それらの光放射は好ましくは強く、一定でなければならない。生物発光タンパクおよび/または蛍光部分が直接または間接的にIGに連結することができるので、立体障害によるIG間の相互作用の阻害を妨げるため、小さい生物発光および蛍光タンパクを使用することは、最も望ましい。
【0058】
本願明細書において使用される用語「直接または間接的に連結された」は、分析または検出することができる媒介物を形成するため、タグがIGに付着または関連することを意味する。連結の好適な方法は、IGおよびDTの性質によって決定される。
【0059】
生物発光または蛍光タンパクは、直接または間接的に(例えば、リンカー基を経て)適切なIGに(例えば、共有結合で)連結する。媒介物に生物発光または蛍光タンパクを連結する手段は、公知技術である。タンパク性のIGおよびタンパク性のDTを直接連結する方法の例は遺伝子の融解であり、ここにおいて、IGおよび生物発光または蛍光タンパクをコード化している遺伝子は、単一のポリペプチド鎖を生じるために融合する。
【0060】
直接的な連結方法の別の例は共役であり、ここにおいて、フルオロフォアとIGの連結には、例えばリガーゼ、ヒドロラーゼ、特にホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ、またはオキシドリダクターゼ、特にペルオキシダーゼのような酵素を使用する。
【0061】
蛍光部分および非タンパク性の、非蛍光失活剤は、タンパク性のIGへのそれらの取付けは、よりむずかしく、タンパク性のIGに遺伝的に融合することができるタンパク性の蛍光部分とは対照的に、生体細胞内部で発生させることができないという不都合を有する。非タンパク性の蛍光部分および非蛍光失活剤のIGへの直接の連結の例は、共有結合をIGの特定の化学基により形成することできる反作用基に共有結合される部分を含む。例は、システイン残基のSH基に化学反応するヨードアセトアミドおよびマレイミド、およびリジン残基のNH3+‐基に化学反応するスクシンイミドのエステル、カルボン酸およびスルフォニルクロリドである(イシイ他.(1986)、Biophys. J. 50、75‐89;スタロス他(1986)、Anal. Biochem. 156、220‐222;ルフェーブル他.(1996).Bioconjug.Chem.7,482‐489)。
【0062】
一般的に蛍光部分または非蛍光失活剤をIGに付着させる別の周知の方法は、蛍光部分をIGに移植すること、またはその合成の間、蛍光部分をIGに組み込むことを含む。標識をつけられたIGは、例えばリセプタまたは核酸に対する選択的な結合、特定の酵素の活性化または阻害、または生物学的製剤薄膜に組み込む能力のような標識を外されたIGの臨界特性を保持することは重要である。例えば、ジピロメテンボロン二フッ化色素、ローダミン、ローダミン派生物、テキサスレッド、ダンシル、ウンベリフェロンなどの利用できる様々な蛍光部分が存在する。使われる様々な標識化の再調査または信号生成システムについては、米国特許No.4,391,904を参照のこと。
【0063】
蛍光部分または非蛍光性失活剤を例えばタンパクまたは核酸のようなIGに連結する間接的な方法の一つの例は、ビオチンを結合することができる、アビジンのようなタンパクへの蛍光部分または非蛍光性失活剤の共有結合形成を含む。ここにおいて、ビオチンは、IGおよび蛍光部分または非蛍光性失活剤は、ビオチンおよびアビジン間の相互作用を経て間接的に一緒に連結されるようにIGに共有結合する。
【0064】
IGおよび生物発光または蛍光タンパクの連結の間接的な方法の他の例は、リンカー基を経たものである。リンカー基は、結合能力との干渉を避けるため、媒介物から生物発光または蛍光タンパクを隔てるためにスペーサとして機能することができる。リンカー基はまた、媒介物上の置換基の化学的な反応性を増加させるのに役立ち、したがって連結効率を増加させる。化学的な反応性の増加はまた、別の方法では可能でない媒介物または媒介物上の官能基の使用を容易にする。
【0065】
ホモおよびヘテロの両方の二官能性または多官能性の様々な試薬がリンカー基として使われることは、(イリノイ州・ロックフォードのピアスケミカル社のカタログに記載されるように)当業者に明らかである。例えば、連結はアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基または酸化された炭水化物残基で生じる。このような方法論を記載している米国特許No.4,671,958のような多数の参照が存在する。
【0066】
一実施例において、タンパク性のDTまたはタンパク性のIGは、当業者にとって周知の標準分子生物学技術による発現ベクトルにDTまたはIGをコード化するDNAの塩基配列を挿入することによって組み換えられて生じる。DNAの塩基配列は、使用可能な状態で適切な転写または翻訳調整要素に連結される。DNAの発現の原因となる調整要素は、第1のポリペチドをコード化しているDNA配列の5’に位置するのみである。同様に、端部翻訳および転写終結信号に必要とされるストップコードンは、第2のポリペチドをコード化しているDNA配列の3’に存在するのみである。融合されたDTおよびIGのポリペチドは、適切な宿主において発現される。従来技術における当業者にとって公知の様々な発現ベクトルのいずれかが本発明の明確な組換え型ポリペチドに使われる。組換え型ポリペチドをコード化するDNA分子を含む発現ベクトルによって変換またはトランスフェクションされた適切な宿主細胞において、発現は達成される。適切な宿主細胞は、原核生物、酵母および高等真核細胞を含む。好ましくは、使われる宿主細胞は、大腸菌、酵母、または、CHO細胞のような哺乳動物細胞系である。
【0067】
別の実施例では、タンパク性のIG‐DT媒介物は、融解構造物として組み換えられて生じる。本発明の融合タンパク質をコード化しているDNAの配列は、適切な発現ベクトルにタンパク性のDTポリペチドおよびIGポリペチドをコード化する別々のDNAの塩基配列を組み立てるために周知の組換えDNA技術を使用して構成される。第1のDNA配列の3’末端は、ペプチド・リンカーの有無にかかわらず第2のDNA配列の5’末端に結紮されるので、両方の配列の解読枠は、DTおよびIGの生物学的活性度を保持する単一の融合タンパク質への2つのDNA配列のmRNAの翻訳を許容するように同調している。融解構造物内のDTおよびIGの配向は、その機能または発現を増加させるために交換される。
【0068】
ペプチド・リンカー配列は、各々のポリペチドがその第2および第3期構造に折り畳まれることを保証するために十分な距離によって、生物発光タンパクおよびIGポリペチドを分離するために使われる。このようなペプチド・リンカー配列は、公知である標準技術を用いて融合タンパク質に組み込まれる。適切なペプチド・リンカー配列は、以下の要因に基づいて選択される:(1)それらの可撓性の延長された配座を採用する能力;(2)生物発光タンパクまたはIG上の機能的なエピトープと相互作用することができるそれらの二次構造を採用することの不能性;および、(3)ポリペチド機能的なエピトープと化学反応、または融合タンパク質の溶解性を減少させるかもしれない疎水性または充電される残基の欠如。好適なペプチド・リンカー配列は、Gly、AsnおよびSer残基を含む。他の中性に近いアミノ酸、例えばThrおよびAlaもまた、リンカー配列において使われる。リンカーとして有効に使われるアミノ酸配列は、マラテア他(1985)Gene、40、39‐46;マーフィー他(1986)PNAS. USA、83,8258‐8262;米国特許No.4、935、233および4、751、180において開示されるものを含む。リンカー配列は、長さにおいて1から約50のアミノ酸である。生物発光タンパクまたはIGが必須ではない機能的なドメインを分離しておよび立体障害を妨げるために用いることができるN末端アミノ酸領域を有する場合、ペプチド配列は必要とされない。
【0069】
結紮されたDNA配列は、使用可能な状態で適切な転写または翻訳調整要素に連結される。DNAの発現の原因となる調整要素は、第1のポリペチドをコード化しているDNA配列の5’にのみ位置する。同様に、端部翻訳および転写終結信号に必要とされるストップコードンは、第2のポリペチドをコード化しているDNA配列の3’にのみ存在する。
【0070】
一実施例において、組換え型ポリペチドをコード化している配列は、アフィニティークロマトグラフィを経て融解構造物の純化を容易にするペプチドをコード化する配列にさらに遺伝的に融合する。この例は、ヒスチジン・タグ、マルトース‐結合タンパク質タグ、セルロース‐結合タンパク質タグ、インテインタグ、S‐タグおよびGSTタグを含む。
【0071】
もう一つの実施例では、組換え型ポリペチドをコード化している配列は、成熟核宿主細胞のまたは周囲培地への分泌のための特定の細胞小器官仕切りへの融解構造物のターゲッティングを容易にするペプチドをコード化する配列に遺伝的に融合する。この例は、核局在化信号、ミトコンドリアインポート配列、小胞的な細網をターゲットにしたKDEL配列、およびエクスポート信号を含む。
【0072】
さらにもう一つの実施例において、組換え型ポリペチドをコード化している配列は、真核細胞薄膜の貫通、およびしたがって細胞への融解構造物の取込みを容易にするペプチドをコード化する配列に遺伝的に融合する。(シュワルツ他.(2000)Curr. Opin. Mol. Ther. 2,162‐167)。この例は、HIV Tatタンパク、ペルペス単式ウイルスVP22およびカポジFGF‐4から導かれるペプチド配列を含む。
【0073】
組換えの方法の代替として、ポリペチドおよびオリゴペプチドが化学的に合成することができる。このような方法は、一般的に固体アプローチを含むが、また、溶液ベースの化学反応および連結または固体および溶液アプローチの組合せを利用することができる。タンパクを合成するための固体物理方法論の例は、メリフィールド(1964)J.Am.Chem.Soc.,85、2149;およびホートン(1985)PNAS. USA.82,5132によって記載される。
【0074】
IGが上記の通りのタグで標識がつけられるならば、それらは、それからそれに付着した1つまたはそれ以上のタグを有する1つまたはそれ以上の他のIGと作用することができる。
【0075】
一実施例において、すべてのIG‐DT媒介物は、タンパク性であり、適切な宿主細胞のIG‐DT融解構造物を発現するために遺伝子の融解によって連結される。DTの活性化および検出は、IGの集合と同様に生体宿主細胞内部、内部の細胞オルガネラ、細胞膜内部、またはその表面で発生する。
【0076】
他の実施例では、IG‐DT媒介物のサブセットは、タンパク性であり、適切な宿主細胞のIG‐DT融解構造物を発現するため、遺伝子の融解により連結される。IG‐DT媒介物の他のサブセット、タンパク性、非タンパク性のまたはその組合せが、宿主細胞薄膜を貫通する任意の能力を有して宿主細胞に加えられる。DTの活性化および検出は、IGの集合と同様に生体宿主細胞内部、内部の細胞オルガネラ、細胞膜内部、またはその表面で発生する。
【0077】
また別の実施例ではIG−DT媒介物はそれらの性質および準備方法に関係なく適切な緩衝物質を含む溶液で提供される。IG−DT媒介物は細胞抽出物、細胞片又は合成混合物の一部であり、又は少なくとも純度約90%であり、最も好ましくは少なくとも純度約99%である。
純化は、アンモニウム硫酸塩沈降、アフィニティーカラム、イオン交換、および/またはサイズ排除および/または疎水的相互作用クロマトグラフィ、HPLC、FPLC、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動法などを含む技術の標準的な手順で発生する。(スコープス(1982)タンパク純化、スプリンガー‐オーバーフラグ、N. Y.、ドイツ、酵素学における方法vol.182:タンパク純化のガイドアカデミック・プレス社、ニューヨーク(1990)参照のこと)
【0078】
本発明は、供給体および/または受容基分子であることができるDTの対の連結を含む。したがって、本発明によって使われることができるDTは、その物性に基づいて選ばれることができ、共振エネルギ転移(RET)術では周知のように、2つが選ばれるので、それらは、一緒にRET対の供給体および受容基分子を構成する。RET対の内のDTの1つが生物発光タンパクである場合、RETは生物発光RET(BRET)として公知である。RET対を形成しているDTの両方がフルオロフォアである場合、生じるRETは蛍光RET(FRET)として公知である。周知の適切な供給体および受容基対の例は、以下からなる:ウミシイタケ・ルシフェラーゼおよび黄色の蛍光タンパク;ウミシイタケ・ルシフェラーゼおよび緑の蛍光タンパク;シアン蛍光タンパクおよび黄色の蛍光タンパク;フルオレセインおよびテトラメチルローダミン;および5‐2'‐アミノエチル)アミノナフタレン‐1‐スルホン酸(EDANS)およびフルオレセイン。
【0079】
R.ハウグランド、蛍光プローブおよび調査用化学薬品のハンドブック(第6版、1995年)を一般に参照する。フルオロフォアの一方または両方は、緑の蛍光タンパクのような蛍光タンパクである可能性があり、試験化合物および蛍光タンパクの融合タンパク質を準備することにより、試験化合物がタンパクまたはペプチドである場合、それは、特にフルオロフォアとして蛍光タンパクを使うために都合が良い。
【0080】
本発明は、多数のRET信号の同時的な検出、および、選択されなければならない特定の分光特性と生物発光または蛍光部分の組合せを含む。異なる実施例によるこれらの生物発光または蛍光部分の組合せのための一般のスペクトル必要条件および例は、用途の例と同様に以下に記載される:
(i)複合検出システム‐‘OR’アッセイ
【0081】
一実施例において、第1の受容基タグ(DT1)の発光スペクトルは、第2のタグ(DT2)および次のタグ(DT3+)の励起スペクトルに十分に重なり、一方で、DT1、DT2およびDT3の発光最大量は、それらの別々の検出(図1および表1参照)を可能にするために十分に異なる。
表1
適切な基質または励起光によるDT1の活性化のアッセイのタイプおよび予想される信号
* 数は、このDTの増加した信号を示す。
【0082】
DTの適切な組合せの例は、EGFPまたはEYFP(DT2)およびDsRed、dimer2またはt‐dimer2 (12)(DT3)との組合せでDT1として使用される(460‐490ナノメートルで発する)ウミシイタケ・ルシフェラーゼまたはECFPである。DsRedおよび二量体変種は500ナノメートル以下の弱いものだけを吸収するにもかかわらず、それらは、驚くほど強いRET受容基を形成する。代替的に、重ヒ素化合物色素FlAsHおよびReAsHが、DT2およびDT3として使われる(アダムズ他(2002)J.Am.Chem.Soc.,124、6063‐6076)。DT2およびDT3のための他の代替物は、EGFPまたはEYFPおよびDsRedに類似したスペクトル特性を有する蛍光部分である。その例は、Alexaフルーア488、オレゴングリーン514およびAlexaフルーア546を含む。DT2およびDT3のためのさらにもう一つの代替物は、蛍光ナノクリスタルである。すべてのナノクリスタルは、それらの発光波長から独立して、500ナノメートル以下で光を吸収し(ブルーチェス他(1998)、Science、281,2013‐2016)、それらをこの種のアッセイのために理想的なRET受容基にする。
【0083】
この実施例の変種は、ペアをなす相互作用、すなわちIG1:IG2およびIG3:IG4が可能であるIGを含む2つの独立した相互作用のモニタを可能にする。本実施例において、DT1は直接または間接的にIG1およびIG3に連結され、一方でDT2がIG2に、DT3がIG4に連結される。DTのスペクトルの必要条件は変わらず残る。
【0084】
本発明の本実施例の用途の一つの例は、信号伝達経路のモニタである。大部分の細胞信号送信イベントは、相互作用し、細胞核における遺伝子転写を通常含む応答へのリセプタからの信号を中継するタンパクのネットワークを含む。IGは、IG2およびIG3間の信号リンクとして作用するIG2およびIG3またはIG1に信号を中継しているIG1との信号送信経路の成分である。IGが導かれることができる分子の信号送信の例は、rasおよびrafタンパク、プロテインキナーゼC、MEKタンパクなどである(ディキク他(1999)Cell Biochem. Biophys.、30、369‐387;ガトキンド他(1988)Oncogene、17,1331‐1342;ラトレル他(1999)Curr. Opin. Cell Biol. 11,177‐183;ローゼンガルト他(1998)J. Cell physio. 177,507‐517)。
【0085】
別の例は、遺伝子形質発現の転写調整である。これらの複合体の多重たんぱく質‐DNA複合体および組成物の転写因子行為は、それらの特異性および活性を決定する(ウォルベルガー他 (1999)、Ann.Rev. Biophys. Biomol. Struct.、28、29‐56)。例えば、転写因子Fosは、細胞識別、成長、外部刺激などにしたがって、転写因子Jun系統の異なる構成メンバでヘテロダイマを形成する(チネノブ他(2001)、Oncogene、20,2438‐2452)。IGは、選択的にこれらの重要な転写調節因子の状態および活性をモニタするFosおよびJun系統から導かれることができる。
【0086】
本発明の本実施例の用途のさらなる例は、細胞信号伝達カスケードの2つの異なる部分のモニタである。信号は、活性化されたリセプタから相互作用し、互いにタンパクを活性化または停止するカスケードを経てそれらの効果的細胞内部位まで中継される。都合よく特徴を描写された例は、MAPK/Erk経路である(コブ他(1999)Prog. Biophys. Mol. 71: 479‐500;ルイス他(1998)Adv. Cancer Res. 74,49‐139)。MAPK/Erk信号送信カスケードは、リセプタ・チロシンキナーゼ(RTKs)、インテグリンおよびイオンチャネルを含む成長および識別に関係している様々なリセプタによって活性化される。IGの対は、カスケードの信号送信分子の異なる相互作用している対から導かれる。各々の相互作用している対は、特定の段の活性化を示している特定のRET信号(DT1‐IG1:IG2‐DT2およびDT1‐IG3:IG4‐DT3)を提供する。これは、カスケードの上流の段(例えば、SOS‐Ras)とさらに下流の段(例えば MEK‐Erk)との同時的なモニタを可能にする。この種のアッセイは、2つの検出された段の間にあるカスケードの成分を識別するために有用である。高スループット・スクリーニングおよび薬剤発見において、それが、2つの検出された段間の分子を操作している薬剤の確認のために使われる。
【0087】
別の例では、アッセイは通常のタンパク対変異体の機能性を区別するために用いられる。腫瘍形成における変異体が活性化された受容体タンパク質‐チロシンキナーゼ(PTKs)の役割は、確立している。リセプタPTKの活性化の重要な原則は、配位子が媒介となった二量体化である。増加した証拠は、リセプタPTKの腫瘍形成活性化は、構成要素の二量体化に導く突然変異および細胞質の触媒ドメインの活性化を通じて発生することを示す(ハンター他(1997)、Cell、88,333‐346)。一つの例は、慢性骨髄単球性白血病においてt(5:12)トランスロケーションによって生成されたTel‐PDGFbリセプタ融解である。TelのN末端部分、Ets系統転写因子は、二量体化および構成要素のPTK活性化において生じるPDGFbリセプタPTK遺伝子の全体の細胞質のドメイン全体と結合される(ゴーラブ他(1994)Cell、77,307‐316)。本発明において提供されるアッセイ・システムは、リセプタ成分からIGを導き、不完全(変異体)なもの、および野性‐タイプ(通常)リセプタPTKの両方の活性をモニタする。したがって、高スループット・スクリーニングおよび薬剤発見化合物において、通常の受容体機能を妨害せずに変異体リセプタを特に目標として識別することができる。これは、第1の主要なスクリーニング段の間、高度に特殊な化合物の識別を可能にする。
【0088】
さらにもう一つの例において、この種のアッセイは、高スループット・スクリーニングにおいて使用される化合物のための内蔵制御を提供するために用いられる。一般に特に標的タンパク質の機能よりむしろタンパク機能を妨害する化合物は、疑陽性信号を生じることは共通の問題である。本発明によって提供されるアッセイ・システムについては、共通の相互作用しているパートナーとともに2つの異なる分子の機能性、例えば2つの異なる相互作用、それらに共通の下流のエフェクタ・タンパクβ‐アレスチンから独立したGPCRは、モニタされる。それゆえに、目標とされた相互作用は、一つのRETの対(DT1‐IG1:IG2‐DT2)によってモニタされる。第2の、関連する相互作用は、並列に(DT1‐IG1:IG3‐DT3)モニタされる。第1の対にのみ効果を呈し、第2の対に効果を呈さない化合物は、ターゲット特有である。両方のターゲット上の効果を有する化合物は、特定ではない効果を経て作用する。
【0089】
さらにもう一つの例において、この種のアッセイは、他のものでな特定の生命体のための物質中毒性、すなわち宿主以外の寄生生物を殺す物質を識別するために用いられる。極めて重要なタンパク‐タンパク相互作用は、寄生生物のタンパクから導かれるIGによってモニタされる。同時に、宿主生物から導かれるIGと同等の相互作用は、モニタされる。アッセイは、寄生生物および宿主のタンパクを区別することが可能である物質の識別を可能にする。
【0090】
概して高いスループット・スクリーニングのために、この種のアッセイは、他方(IG1:IG3)でなく、一方の相互作用(例えば IG1:IG2)を特に抑制または開始する化合物を発見するために用いることができる。第1の相互作用によって、1つのみが薬剤の所望の効果である第2のものと異なる細胞効果が生じるのでこれは重要である。それゆえに、この種のアッセイは、高度に細胞効果のために特定の薬剤の発生を容易にする。また、2つの異なる相互作用および機能性が同時に選び出されるので、この種のアッセイはスループットを増加させるために用いる。これは、試薬、コストおよび時間の有意な節減を生じる。
【0091】
上記の分子の相互作用の状況は、多数の細胞機能性において重要な役割を果たし、例において記載されるものに限られないことは当業者に明らかである。
(ii) 複合体分子の付随物のための単純な検出システム‐‘AND’アッセイ。
【0092】
一実施例において、DT1の発光スペクトルは、DT3ではなくDT2の励起スペクトルと十分に重なる。DT3の励起スペクトルは、十分にDT2の発光スペクトルと重なり、一方でDT1、DT2およびDT3の発光最大量は、それらの別々の検出を可能にするために十分に異なる(図2および表1)。DTの適切な組合せの例は、EGFPまたはEYFP(DT2)およびmRFP1(DT3)と結合するDT1として標準コエレンテラジン基質(460‐480ナノメートルで発する)を使用したウミシイタケ・ルシフェラーゼである。代替的に、DT2としてのEGFPまたはEYFPは、類似したスペクトル特性を有する重ヒ素化合物色素FlAsHまたは蛍光部分で置換される。その例は、Alexaフルーア488およびオレゴングリーン514を含む。赤の蛍光タンパクmRFP1は、類似したスペクトル特性を有する他の蛍光タンパクまたは蛍光部分で置換される。
【0093】
この実施例の用途の例は、薬剤ターゲットの重要な種類を表す核受容器の活性のモニタである。一般に、核受容器は、それらの配位子が結合すると二量体化し、そして転写を活性化または抑制するDNAに結合する(ツァイ、M. J.およびオマリーB. W.(1994)Annu. Rev. Biochem. 63: 451‐486)。この発明によると、核受容器二量体のサブユニットは、核受容器複合体の結合部を含む二本鎖DNA破片と同様にDTで標識をつけることができる。自然な配位子または合成化合物によるリセプタが活性化すると、三量体のタンパク‐DNA複合体が形成され、DTはその近くに導かれ、DT1の活性化は、付随物の形成、したがってリセプタの活性化を示すDT3からの信号を生じる。代替的に、リセプタを活性化している配位子または化合物は、DTにリンクすることができる。化合物が二量体化を誘発し、したがってリセプタを活性化する場合のみ、DT3からの信号が得られる。リセプタを活性化することのないリセプタ・サブユニットに結合するのみの望まれていない化合物は、それゆえに除外される。分子の相互作用を検出する現行のシステムでは、この区別は可能ではない。
【0094】
一般に本発明の本実施例は、複合体分子の付随物上での形成に対する単純な答えが望まれ、部分的に形成された付随物についての情報は重要でない場合、有用である。この実施例および次の実施例の多くの用途が重複し、そのシステムが特定の用途の複雑度の必要とされたレベル次第で選択される。
【0095】
上記の分子の相互作用の状況は、数多くの細胞機能性において重要な役割を果たし、例に記載されるものだけに限られないことは、当業者に明らかである。
(iii) 複合体分子の付随物のための検出システム‐‘組合せ’アッセイ。
【0096】
もう一つの実施例では、DT1の発光スペクトルは、DT2およびDT3の励起スペクトルと十分に重なり、一方で、DT3の励起スペクトルもまた十分にDT2の発光スペクトルと重なる。したがって、DT1‐DT2、DT1‐DT3およびDT2‐DT3は、すべて適切なRET対(図3および表2)を形成する。前述の実施例とは対照的に、本実施例における検出は、適切な基質またはエネルギ源によってDT1を順番に活性化し、DT1、DT2およびDT3の発光を検出し、そして、適切なエネルギ源によりDT2を活性化し、DT2およびDT3の発光を検出することによって発生する。代替的に、RETが発生する場合、DT3はDT1およびDT2の減少した信号において生じる非蛍光性失活剤であってもよい。個別の信号の不在、存在または強度の組み合わされた表示は、複合体分子の付随物(表2)の組成物上の正確な情報を提供する。
【0097】
短い一本鎖のオリゴヌクレオチドにすべて連結される3つの蛍光部分を含むFRETシステムは、最近報告された(トン他(2001)J. Am. Chem. Soc. 123,12923‐12924;米国特許No.6,627,748;ホースティン他(2003)Chemphyschem. 4,745‐748)。それらのDNA分子は、単一の蛍光部分だけから構成されるラベルとは別の新規な蛍光ラベルを有するプローブとして作用する。FRETは、両方の第1および第2のフルオロフォアから、第3のフルオロフォアから得られる信号を増加させる第3のフルオロフォアまで発生する。類似したシステムは、短い二本鎖DNA分子内で配座の変化をモニタするために適用された(リュー他(2002)J. Am. Chem. Soc.124,15208‐15216)。本発明においてしかしながら、一連の活性化および検出イベントと組み合わさられる3つの異なる標識は、これらの従来技術システムによって可能でなかった分子の相互作用の複雑な動的なシステムを分析するために用いられる。
【0098】
適切なDTの例は、DT1としてECFP、DT2としてEYFP、およびDT3としてmRFP1を含む。代替的に、DTのいずれかは、類似したスペクトル特性を有し、互いに適切なRET対を形成する蛍光部分で置換される。上記例においてmRFP1は、Alexaフルーア555によって置換され、ECFPおよびEYFPと連動して使われることができる。
【0099】
発明のこの実施例および前述の実施例の用途の一つの例は、サイトカイン受容体信号の分析である。サイトカイン受容体は、それらの配位子の結合によって活性化される場合、薄膜に結び付いたサブユニットのヘテロダイマを形成する。一つのサブユニットは、通常配位子に特定であり、一方で、他方は信号伝達の原因となり、他の配位子‐特定のサブユニットによって共有される。活性化されたリセプタは、信号トランスデューサおよび転写(STAT)タンパクのアクティベータの類の細胞内タンパクと相互作用する(イシハラ他(2002)、Biochim. Biophys. Acta、1592、281‐296)。したがって、サイトカイン受容体信号は、分子を変換する信号のネットワーク、および、多くの重なり合い、冗長な機能性を有するリセプタ分子を含む。特定の効果を特定の分子またはリセプタの動作に帰するのは、多くの場合、難しい。IGは、リセプタが活性化され、二量体化する場合、適切なRET対(DT1‐IG1:IG2‐DT2)を形成しているリセプタ・サブユニットから導かれることができる。
表2
DTとして非蛍光性失活剤、および、適切な基質または励起光によってDTの活性化の予想される信号を含むアッセイ。数はこのDTの増加した信号を示し、ダッシュは他のDTの減少された信号/活性化なしを示す。
【0100】
リセプタによってさらに特定の信号トランスデューサの活性化をモニタするため、第3のIGは信号変換タンパク(IG3‐DT3)から導かれる。この分子が活性化されたリセプタと相互作用する場合、合成したエネルギはDT2からDT3まで伝導され、特定の波長の光はDT3から発し、DT2および/またはDT1からの信号は抑えられる。この信号は、この特定のサイトカイン受容体による特定の経路の活性化のために特定である。同じサイトカイン受容体による他の経路の活性化は、受容体活性化のための信号を生ずるが、特定の信号送信経路ではない。他のサイトカイン受容体経由の同じ経路の活性化は、信号を提供しない。
【0101】
別の例は、ホモまたはヘテロダイマを形成するG‐タンパク被結合リセプタ(GPCR)の分析である。最近の研究は、GPCRはモノマーとして作用するだけでなく、変えられた配位子結合、信号送信およびエンドサイトーシスを生じさせホモおよびヘテロダイマとして作用することを示した(リオス他(2000) Pharmacol. Ther. 92,71‐87)。特定のリセプタの作動体または拮抗体として作用する薬剤の効果は、それゆえにこのリセプタの結合パートナー次第である。特定のリセプタ二量体によって媒介される細胞の反応に、薬剤の効果を制限することは、望ましい。本発明によって提供されるシステムは、特定のGPCR二量体の活性をモニタする。GPCRそれ自体は、IGとして作用し、DT(IG2‐DT2、IG3‐DT3)に付着される。配位子(例えばβ‐アレスチン)が結合すると、GPCRと相互作用する分子から、第3のIG(IG1‐DT1)は導かれる。検出システムは、リセプタ・ヘテロダイマの形成を検出するだけでなく、配位子または薬剤は、リセプタ・ヘテロダイマ、それぞれのホモダイマまたはその組合せを活性化(またはブロック)するかどうかを区別することができる。
【0102】
別の例は、遺伝子形質発現の転写調整である。多重たんぱく質‐DNA複合体において作用する転写因子およびこれらの複合体の組成物は、それらの特異性および活性を決定する(ウォルベルガー他(1999) Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28,29‐56)。例えば、転写因子Fosは、Jun転写因子系統の構成メンバとともにヘテロダイマとして活性するのみである(チネノブ他(2001)、Oncogene、20,2438‐2452)。Fos/Jun二量体は、数多くの遺伝子の転写を活性化または抑制することができる。複合体の特異性および活性は、ETS転写因子、NF‐ATまたはSmadタンパクのような二量体と相互作用している追加的なタンパクによって調整される(ワン他(1994) Mol. Cell Biol. 14,1153‐1159;ストラニック他(1994) J. Biol. Chem. 272,16453‐16465;チャン他(1998) Nature 394,909‐913)。IGは、適切なRET対(DT1‐IG1:IG2‐DT2を形成するDTに付着したFosおよびJunタンパクから導かれることができる。このRET信号は、特定のFos/Jun組合せの機能的な二量体を示す。第3のIGは、Fos/Jun複合体と相互作用している転写調節因子から導かれる。このIGは、IG3がIG1:IG2複合体と相互作用する場合、DT2から伝導される光を発するまたは抑える第3のDT(IG3‐DT3)に付着される。この信号は、タンパクの特定の組合せを含む三量体の複合体の活性のために特定である。他の調節因子との相互作用によるFos/Junの活性化、または、同じ調節因子との異なるFos/Jun複合体の活性化は、異なる信号を生じる。
【0103】
別の例は、新規な抗ウイルス剤の発達である。HIVおよび他のウイルスのための治療の大きな問題は、これまで開発されてきたすべての薬剤に対し段階的に抵抗力をつけるようなウィルスタンパク質の点変異によるウイルスの適応力である。ウイルス性ライフサイクルにおける多数のイベントをターゲットにした治療は、それゆえにより功を奏し、異なる薬剤の混合物、いわゆる併用療法は、広い臨床における広い用途を発見された。有望な、新規な反レトロウイルスの薬剤は、ウイルス侵入機構インヒビターである(スター‐スピア他(2002)Clin. Lab. Med. 22,681‐701)。HIVウイルス粒子の侵入機構は、CD4およびCXCR4またはウイルス菌株次第である2つの細胞レセプタを経て媒介とされる。ウイルス表面が変化すると、ウイルス‐CD4相互作用をブロックしているだけの抗体または薬剤は、迅速にそれらの効率を緩める。本発明によって提供されるシステムは、両方のリセプタに結合するウイルスの同時的な検出を可能にする。2つのリセプタさらにウイルス性表面タンパク質は、三量体の複合体が形成される場合、特定の信号を生じるDTで標識をつけることができる。したがって、両方のリセプタと結合するウィルスタンパク質の配座の変化に必要とされた相互作用または阻害の両方とも効率的にブロックする化合物は、識別することができる。2つの極めて重要な相互作用が同時に目標とされるので、抵抗力のあるウイルスの出現はありそうもない。
【0104】
別の例では、発明は組成物、配座、大きい、安定性のある分子複合体の構築または解離を分析するために用いられる。異なるRET信号の有無は、複合体の構築および機能、または複合体中の配座の変化/動き、または複合体の成分を示す。複合体の例は、転写因子複合体、リボソーム、プロテアソーム、シャペロン、オリゴマー・リセプタ、イオンチャネルなどを含む。
【0105】
概して、高スループット・スクリーニングおよび薬剤発見のために、この種のアッセイは、特定の複数成分分子の付随物の範囲内で、その環境において分子の機能性を抑制または活性化している化合物を発見するために用いることができる。他の付随物内の同じ分子の機能性は、影響を受ける可能性はない。
【0106】
上記の分子の相互作用の状況は、数多くの細胞機能性において重要な役割を果たし、例に記載されるものに限られていないことは当業者に明らかである。
【0107】
本願明細書において使われる用語「発された光を検出する」は、量的方法において特定の波長の光子を検出することができるいかなる検出装置をも参照する。この例は、光電子倍増管またはCCDカメラを含む。検出器は、検出された光を特定の波長または波長の特定の範囲に制限する手段をさらに備える。これは例えば、フィルタ・ホイールまたはフィルタ・スライドまたはモノクロメータに取り付けられたフィルタに適切である。
【0108】
一実施例において、第1のDTはこのDTに特定の励起光によって活性化され、このDTおよび他のDTによって発される光が検出される。それから、第2のDTは活性化され、このDTおよび他のDTの発光は検出などをされる。表2において要約されるように、これらの配列の表示によって提供される組み合わせられた情報は、IG間の集合の情報を提供する。活性化および検出のこの配列は、運動データを得るために時間間隔をおいて反復される。この検出のいかなる時間においても、配列物質は加えられ、または、IGの集合に影響する状態は、変わる。
【0109】
もう一つの実施例では、適切な基質は、第1のDTの活性化のために加えられる。励起光がオフにされる、または、遮断される一方、このDTおよび他のDTの発光は検出される。それから、第2のDTの活性化に特定の励起光はオンにされ、このDTおよび他のDTの発光は検出される。運動データを得るために、光源はそれぞれオフおよびオンにされ、検出モードは発光および蛍光検出の間で絶えず切替えることができる。この検出のいかなる時間においても、配列物質は加えられ、または、IGの集合に影響する状態は、変わる。
【0110】
さらにもう一つの実施例において、第1のDTのために適切な基質が加えられる。励起光がオフにされる、または、遮断される一方、このDTおよび他のDTの発光は検出される。この第1の基質が使い果たされ、第1のDTからの光放射が中断される場合、第2のDTに適切な第2の基質が加えられる。励起光がオフにされる、または、遮断される一方、このDTおよび他のDTの発光は検出される。この検出のいかなる時間においても、配列物質は加えられ、または、IGの集合に影響する状態は、変わる。
【0111】
発明は、次に以下の非制限的な例のみを参照してさらに記載される。しかしながら、以下の例は例証のためのみであって、上記した発明の大部分における制限としての方法とは考えられないと理解されなければならない。特に、発明が特定のタグおよび相互作用している基の用途に関して詳述する一方、本願明細書における結果がこれらのタグまたは相互作用している基に限られていないことは、明確に理解されるべきである。
例1
タンパク性のFRET対の分析
【0112】
この発明のアッセイのため、RETが発生しないように十分に分離されるRET対および他のものを形成するように、十分なスペクトル重複を持つタグを有することは重要である。RETの効率は、フェルスター半径R0によって記載することができる。R0はエネルギ転移が50%有効である距離である。すなわち励起した供給体のFRETによって非活性化する。R0の大きさは、供給体および受容基色素のスペクトル特性に大部分を依存している:
R0=〔8.8×1023*k2*n‐4*QYD*J(ラムダ)〕1/6 oA
【0113】
ここで、k2は双極子方向係数(範囲0から4:2/3はランダムな配向)、QYDは受容基の非存在下で供給体の蛍光量子収率または生物発光タンパクの発光容量、nは屈折率(水は1.33であり、温度、イオン強度次第である)、J(ラムダ)は整数のスペクトル重複である。
【0114】
RETの効率を調整するため、高量子収率および十分なスペクトル重複(すなわち、J(ラムダ)が大きい)を有する色素の選択は、最も重要な可変部分である。この発明のアッセイは生体分子に適切な水の培地において発生し、それゆえに、屈折率nの変異はほとんどない。色素の幾何学的配向、すなわち双極子方向係数k2は、大部分の状態において、ランダムに方位に合わせられた分子のための数値である2/3に近い。これは、DTとして大きな蛍光タンパクの用途が回転の自由を制限するにもかかわらず、標識付けは、付着された相互作用している基と関連する多少自由な色素の回転を可能にする可撓性のリンカーおよびスペーシング基で起こるからである。
【0115】
したがって、既存の蛍光タンパクのスペクトル特性およびこの発明のDTとしてのそれらの用途が検査された。潜在性RETを調査する相互作用のための単純なモデル系として、タンパク性のDTの融合タンパク質は、生成された。これは最も理想的である、永久的な相互作用であり、したがって、RETが発生することができる大きさを定義するのに適する。7‐18アミノ酸の長さを有したリンカーによって、DTサブユニットは分離された。リンカー配列は最大の可撓性のため、大部分はセリンおよびグリシン残基を含んだ。これは、互いへのサブユニットの自由な回転を可能にし、好ましくない幾何学的配向によるRET信号の減失を妨げた。
【0116】
mRFP1、t‐dimer2 (12)、ECFP、EGFPおよびEYFPの暗号配列は、以下のオリゴヌクレオチド(表3):mRFP1‐fw/re、テンプレート:pRSETB‐mREP1(キャンベル他(2002)PNAS.USA、99、7877‐7882);t‐dimer2 (12):mRFP1‐fw/t dimer2 (12)‐re、テンプレート:pRSETB‐t‐dimer2 (12)(キャンベル他(2002)PNAS.USA、99、7877‐7882;EGFP‐P3‐fw/re、テンプレート:pECFP‐N1(クロンテック);EGFP‐P2‐fw/re、テンプレート:でPCRを経て増幅された:
表3
オリゴヌクレオチド配列
【0117】
pEGFP‐N1 (クロンテック);EGFP‐P2‐fw/re、テンプレートpEYFP‐N1(クロンテック)。図4で概説されるように、生成物の端部は適切な制限酵素によって切断され、ベクターpETDuet‐1にクローンをつくられた。必要であれば、ペプチド・スペーサをコード化して、オリゴヌクレオチド・リンカーは、サブユニットの間で挿入された。これは、以下の構造物を生じた:pET‐mRFP1、pET‐t dimer2 (12)、pET‐ECFP、pET‐EGFP、pET‐EYFP ECFPおよびpET‐t‐dimer2(12)‐12‐ECFP。ここで、サブユニット間の数はリンカー(図4)の長さおよび位置を表す。
【0118】
大腸菌ロゼッタ細胞(ノバジェン)は、これらのプラスミドによって変換され、OD600=0.7に達するまで、100mlの培養液において37℃で成長させた。合計0.5mMのIPTGが加えられ、培養液は朝まで20℃で撹拌器において培養された。細胞は、3500x gで30分間の遠心沈殿法によって集められた。細胞ペレットの半分は、後に使用するため‐80℃で冷凍された。もう半分は、製造業者の説明書にしたがって800μl(マイクロリットル)のBugBuster試薬(ノバジェン)によって溶解された。タンパクは、製造業者の説明書にしたがって300μl(マイクロリットル)のHisMag磁性ビーズ(ノバジェン)を用いてそれらのN末端His‐タグを経た純粋な溶菌液から精製された。タンパクのスペクトル特性は、ケアリー・エクリプス蛍光分光計(バリアン)によって決定された。
【0119】
mRFP1、t‐dimer2 (12)、ECFP、EGFPおよびEYFPのスペクトル特性およびスペクトル重複は、図5において示される。すべてのスペクトルは、それらの最大励起および発光(任意の値‘1’)に標準化された。ECFPおよびEGFPは大きいスペクトル重複を示すが、それらの励起スペクトルの区別はほとんど示さない、一方、mRFP1励起は蛍光発光(図5a)との重複をほとんど有しない。特徴を描写されたFRET対ECFP‐EYFPは、供給体発光および受容基励起間の有意な重複を示す、一方で供給体および受容基励起が十分に分離される。EYFPまたmRFP1励起とよく重なり、EYFPおよびmRFP1は適切なRET対(図5b)を形成することが可能であることを示唆する。発光最大量の大きい分離にもかかわらず、ECFPおよびt‐dimer2 (12)は、驚くほど大きいスペクトル重複を示し、それは、ECFP‐EYFP対(図5c)とは別のスペクトルである発光を有する適切なRET対の潜在性形成を示す。
【0120】
次に、融合タンパク質のサブユニット間のRETが分析された(図6)。EYFP‐12‐ECFPおよびt‐dimer2(12)‐12‐ECFP融合タンパク質は440nmで励起され、発光は460および700nmの間でスキャンされた。同じスキャンは、EYFPおよびt‐dimer2 (12)タンパクで実行された。さらなるスキャンは、融合タンパク質および蛍光タンパク・スペクトルからバックグラウンドとして減じられた空の孔で実行された。供給体フルオロフォアを励起しないより長い波長、すなわち、EYFPには490nm、t‐dimer2 (12)には540nmの励起光を使用して、それらの受容基フルオロフォア発光に標準化した後、EYFPスペクトルをEYFP‐12‐ECFPスペクトルから、t‐dimer2 (12)スペクトルをt‐dimer2(12)‐12‐ECFPスペクトルから減ずることによって、スペクトルは、光源による受容基フルオロフォアの直接の励起のための光放射のためにさらに修正された。最後に、修正されたFRETスペクトルは、データ(図6)の比較を可能にするため、最大発光が480nmのECFPで任意の値‘1’に標準化された。有意なFRET信号は、受容基フルオロフォアとしてEYFPおよびt‐dimer2 (12)の両方で観察された。物理的に供給体DTにより近いために1つの蛍光基のみがRET信号にかなり関与する一方、t‐dimer2 (12)蛍光タンパクは、直接の励起バックグラウンド信号を2倍にする2つの蛍光基を効果的に含むのでこのことは注目に値する。それゆえに、t‐dimer2 (12)としての類似したスペクトル特性を有する純種の単量体の蛍光タンパクまたは非タンパクのフルオロフォアを用いて、検出システムはさらに改良することができた。
例2
タンパク性のBRET対の分析
【0121】
DTとしての生物発光タンパクの使用は、発光に十分なスペクトル重複をもつ蛍光DTを必要とする。生物発光タンパクDTとしてウミシイタケ・ルシフェラーゼ(Rluc)、タンパク性のDT EGFP、EYFP、t‐dimer2 (12)およびmRFP1の間のRETへの潜在性が調査された。また、相互作用のための単純なモデル系として、Rlucおよびタンパク性のDT間の融合タンパク質は、生成された。
【0122】
Rlucのための遺伝子は、以下のオリゴ、Rluc‐P3‐fw/re、テンプレートphRL‐CMV(プロメガ)でPCRを経て増幅された:適切な制限酵素を使用して、PCR生成物は例1からのベクターにクローンをつくられ、構造物pET‐Rluc、pET‐EGFP‐15‐Rluc、pET‐EYFP‐7 Rluc、pET‐t‐dimer2(12)‐15‐RlucおよびpET‐mRFP1‐15‐Rlucを生じる。ここで、サブユニット間の数がリンカー(図4)の長さおよび位置を表す。
【0123】
実施例1にて説明されたように、タンパクは大腸菌ロゼッタ細胞において発現され、精製された。発光スペクトルは、Rluc(図7)のための基質としての5μMのコエレンテラジンhを加えた後、ケアリー・エクリプス発光分光計(バリアン)によって記録された。スペクトルは、それらの発光最大量(任意の数値‘1’)に標準化された。Rlucと比較して発生している追加的なピークは、RETによるものであり、すべての受容基DTと共に観察された。
【0124】
スペクトルから、RET比率(RR)は、RET(図8)のための度量衡単位として算出された。RET比率はまた距離の指標であり、DT間の配向である。比率は、次のように算出された:
【0125】
発光ピークは、この範囲内で発光数値を加えることによって、DTの発光最大量に適用される10‐20nmのウインドウにおいて一体化された。
【0126】
黄色および赤色のチャネルの単純なRET比率(RR)は、算出された:
RRY=yellow/blue
RRR=red/blue
ここで、青色はRluc発光ピーク下のピーク面積であり、黄色はEGFPまたはEYFP発光ピーク下のピーク面積であり、赤色はt‐dimer2 (12)またはmRFP1発光ピーク下のピーク面積である。スペクトルが集積化の前に第1の(供給体)DT発光最大量に標準化される場合、受容基DT下のピーク面積の値、および、RET比率は、相関的な関係における用語の同一の結果を提供する。
【0127】
標準化されたRET比率(RRnorm)は、エネルギ供給体のみによって得られた信号のために修正された比率である。
RRYnorm=RRY‐RRY0;RRY0=yellow0/blue0
RRRnorm=RRR‐RRR0;RRR0=red0/blue0
ここで、blue0、yellow0、および、red0は、相互作用がない場合、第1の(供給体)DTおよび他のDTを有するRETの同等のピーク下の領域である。
【0128】
結果(図8)は、標準EYFP受容基DTより良好な信号対雑音比を達成する一方、t‐dimer2 (12)発光は、EGFPまたはEYFP発光のいずれからも驚くべきことによく区別されることを示した。EGFPおよびEYFPは、t‐dimer2 (12)およびmRFP1と同様に、明確に分離することができず、それぞれのチャネル間で有意な‘漏出現象’を示した。mRFP1発光がEGFPから100ナノメートル分離されたにもかかわらず、Rlucが本質的にmRFP1を活性化することができず、結果として、弱い赤い蛍光信号のみが検出されるので、信号分離はそれでも欠陥があった。
例3
非タンパク性のBRET対の分析
【0129】
DTの選択は、タンパク性の分子に制限されない。スペクトル特性のより広い範囲で利用でき、それらの小型サイズにより付着された相互作用している基の機能性を妨害する可能性が減るので、DTとして小型蛍光分子が多くの用途のための利点に提供する。生物相互作用のためのモデル系として、ビオチン基に対するタンパク・ストレプトアビジンの強い親和力が使用された。ストレプトアビジンは、多くの異なる小型分子蛍光色素を有する結合体として利用できる。
【0130】
ATPがある場合には、‘大腸菌酵素ビオチン・リガーゼ(birA)が、‘avitag’と呼ばれる特定の13‐アミノ酸ペプチド配列のリジン残基に対するビオチン基の付着の媒介となる(シャッツ(1993)Bio/Technology、11,1138‐1143)。avitagの暗号配列は、交雑されたオリゴヌクレオチドAvitagN‐fw/re(表3)からなるリンカーとして、構造物pET‐Rlucに挿入された。リンカーは、この構造物の位置1(図4)にクローンをつくられた。ビオチン・リガーゼのための暗号配列は、テンプレートとして大腸菌Top10株を使用してオリゴヌクレオチドbirA‐fw/reによって増幅された。birA遺伝子は、標的配列の量的ビオチン化のためにビオチン・リガーゼを共発現するため、構造物(図4)の位置4にクローンをつくられた。ビオチニル化されたRlucタンパクの発現のために生じた構造物は、pET‐Avi‐15‐Rluc/birAと呼ばれた。
【0131】
例1にて説明されたように、タンパクは大腸菌ロゼッタ細胞において発現され、精製された。タンパクのはっきりしない相互作用を妨げるため、ビオチン‐Rlucタンパク溶液にBSAが2mg/mlの終末濃度に加えられた。ストレプトアビジン結合体のほぼ等モル量が溶液に加えられ、Rluc(図9)のための基質としての5コエレンテラジンhの添加の後、ケアリー・エクリプス(バリアン)発光分光計で発光スペクトルが記録された。スペクトルは、それらの発光最大量(任意の値‘1’)に標準化された。
【0132】
すべての小型蛍光色素はDTとして適切であり、基質コエレンテラジンh(図9)がある場合には、RET信号を生じた。Alexaフルーア488は、Rluc発光との最大のスペクトル重複を有して、したがって最も高いRET信号を示した。驚くことに、しかしながら使用されるスペクトルで最も遠い色素であるAlexaフルーア594は、類似したまたは、スペクトルでより重なり合う色素Alexaフルーア555およびAlexaフルーア568よりも大きなRET信号を生じた。非ビオチニル化されたRlucが逆制御として使われ、類似した濃縮のストレプトアビジン結合体がある場合にはRET信号を生じず、ビオチン‐ストレプトアビジン・モデル相互作用の特異性を確認した。
【0133】
この発明のアッセイの重要な側面は、それらが量的および感受性がある度量衡単位を生物相互作用に提供するということである。ストレプトアビジン結合体の系列希釈は、ビオチニル化されたRlucさらに2mg/mlのBSAによって培養された。5 μMのコエレンテラジンhを加えた後、発光スペクトルは記録され、RET比率は、それぞれの色素の発光最大量の集積化範囲を調整して実施例2からの方程式を使用して算出された。図10は、オレゴングリーンおよびAlexaフルーア594の両方の結合体を示し、ストレプトアビジン結合体濃度に関連づけられるRET比率は検出システムが量的度量衡単位を相互作用に提供したことを証明する。Rluc発光との小さいスペクトル重複にもかかわらず、Alexaフルーア594は、ビオチン‐ストレプトアビジン相互作用を検出する際、より多く重なり合うオレゴングリーンと同じように感受性があることはまた注目に値した。
例4
同時的な複合RET検出
【0134】
本発明によれば多数の生物相互作用が同時にかつ量的方法で(‘多重化で’)検出することができる。この可能性を調査するため、実施例2および3において使用されたモデル系は、それらの多重化能力を検査された。
【0135】
例2において、タンパク性のDT、EGFPおよびt‐dimer2 (12)は、それらの発光最大量間の十分なスペクトル解像度のために、多重の組合せの潜在性DTと確認された。EGFP‐15‐Rlucおよびt‐dimer2(12)‐15‐Rluc融合タンパク質の濃度は、類似した濃度に調整された。タンパク溶液は、段階を追って5:0、4:1・・・1:4、0:5の比率で混合された。Rluc基質コエレンテラジンhは5μMの終末濃度に加えられ、発光スペクトルは記録された。RET比率は算出され、2つのチャネル(図11a)のより容易な比較のため、最高値(任意の値‘1’)に標準化された。
【0136】
多重検出は、ビオチン‐ストレプトアビジン相互作用モデルを使用して、さらに検査された。ビオチニル化されたRlucさらに2mg/mlのBSAは、一つのチューブで等モル量のストレプトアビジン‐オレゴングリーン、分離したチューブでストレプトアビジン‐Alexaフルーア594と混合された。溶液は、5:0、4:1・・・1:4、0:5の比率で段階を追って混合された。Rluc基質コエレンテラジンhは5μMの終末濃度に加えられ、発光スペクトルは記録された。RET比率は算出され、2つのチャネル(図11b)のより容易な比較のため、最高値(任意の値‘1’)に標準化された。
【0137】
両方の実験において、正確な多重化が達成された:両方のチャネルの信号は独立して検出され、異なる複合体および混合物内で相互作用に関する正確な情報を提供した。
【0138】
要約すると、この例は、本発明が様々な用途および実施例の生物相互作用の多重検出を可能にすることを証明する。これは、使用するモデルから独立し、かつ、DTの性質から独立していることを示した。
例5
哺乳動物細胞の多重検出(1)
【0139】
Gタンパク被結合リセプタ(GPCRs)の機能性の重要な側面は、ホモ二量体型複合体を形成するそれらの能力である。この例では、本発明のアッセイ・システムは、複数リセプタ‐リセプタ相互作用を検出するために検査された。リセプタが膜タンパク質であるので、それらの機能的な抽出および精製は、しばしば困難または不可能である。それゆえに、この発明のアッセイ・システムがまた、生体の哺乳動物細胞において使われた。
【0140】
オリゴヌクレオチドMCS‐linker‐fwおよびMCS‐linker‐re(表3)は交雑され、プラスミドpcDNA3.1(‐)(インビトロジェン)のNheIおよびXhoI制限サイトにクローンをつくり、ベクターpcDNA‐MCSを生じる結果になった。リンカーは、翻訳開始部位およびオープンリーディングフレームの始まりと同様に、タンパクの高度発現に最適なコザック配列を提供した。
【0141】
実施例1にて説明したように、蛍光タンパクECFP、EYFPおよびt‐dimer2 (12)をコード化している相補DNAは、オリゴ EGFP‐P1‐fw/ECFP‐P3‐rc(EGFPまたはEYFP)およびmRFP‐fw/t‐dimer2(12)‐P3‐re(t‐dimer2(12))を使用して、PCRによって増幅された。PCR生成物は、ベクターpcDNA‐MCS‐ECFP、pcDNA‐MCS‐EYFP、pcDNA‐t‐dimer2 (12)を生じているプラスミドpcDNA‐MCSにクローンをつくられ、各々は哺乳動物細胞の蛍光タンパクを発現することができる。CCR2リセプタをコード化している相補DNAは、オリゴCCR2‐fw/CCR2‐reを用いてPCRによって増幅された。相補DNAテンプレートは、ガスリー研究所(米国)で得られた。PCR生成物は、蛍光タンパクを有するリセプタのC末端融解の発現構造物を組み立てるため、プラスミドpcDNA‐MCS‐ECFP、pcDNA‐MCS‐EYFPおよびpcDNA‐MCS‐t‐dimer2 (12)へ蛍光タンパク5’のクローンをつくられた。TRHR GPCRは、制限酵素Hind IIIおよびNotIを使用して、pcDNA3‐TRHR/Rlucベクターから切除された(クルーガー他(2001)J. Biol. Chem., 276:12736‐12741))。この破片は、pcDNA‐MCS‐ECFP、pcDNA‐MCE‐EYFPおよびpcDNA‐MCS‐t‐dimer2 (12)ベクターにクローンをつくられた。結果として生じた最終のプラスミドは、pcDNA‐CCR2 ECFP、pcDNA‐CCR2 EYFP、pcDNA‐CCR2‐t‐dimer2 (12)、pcDNA‐TRHR ECFP、pcDNA‐TRHR EYFP、pcDNA‐TRHR‐t‐dimer2 (12)と名付けられた。
【0142】
粘着性の哺乳動物細胞系Cos‐7 細胞は、リセプタ融解構造物を発現するために用いられた。細胞は、標準培養条件の下で約60%の合流密度に成長された。細胞は、製造業者の手順によってGenejuice(ノバジェン)トランスフェクション試薬を用いて、1つまたはいくつかの発現ベクトル組合せによってトランスフェクションされた。標準培養条件下での2日のインキュベーション後、細胞はトリプシン処理され、細胞懸濁液の濃度はPBSにおいて約50000の細胞に調整された。
【0143】
これらの細胞懸濁液は、バリアン・エクリプス蛍光分光計(バリアン)を用いて蛍光分光学法によって分析された。サンプルはECFPの励起最大量の440nmで励起され、蛍光発光は、460および700nmの間で記録された。受容基フルオロフォア(EYFPまたはt‐dimer2(12))の直接の励起のための発光は、実施例1にて説明されたように、スペクトルから減じられた。修正スペクトルは、ECFP(任意の値‘1’)の発光最大量に、さらに標準化され、リセプタ‐ECFP融合タンパク質(図12)のみを発現するサンプルに比較された。ホモダイマ形成は、両方のRET対によって両方のリセプタのために検出された。ホモダイマ形成は、個別にまたは同時に検出することができた(図12b)。
【0144】
結果を数量化するため、例2にて説明されたように、スペクトルは一体化され、受容基ピークのピーク面積は算出された。図13は、黄色および赤色のチャネルが多重システムのために必要に応じて独立して検出することができることを示す。それは、TRHRホモダイマ複合体の範囲内で、相互作用はより強い、または、DTはCCR2複合体と比較してより良好な配向に配置されることをさらに示す。より弱い相互作用にもかかわらず、CCR2ホモダイマ相互作用は、RET受容基(図13a)として、EYFPまたはt‐dimer2 (12)を使用することにより容易に検出された。2つのホモダイマ相互作用が同時に検出された場合、絶対的な信号は各々の個別的な信号より低いが、バックグラウンド信号(図13b)よりは上であった。これは、3倍対二重共トランスフェクション細胞のより低い数において生じるここで使用される一時的なトランスフェクション・システムのためであった。
【0145】
要約すると、この例は、本発明に記載される検出システムが、生体哺乳動物細胞における膜タンパク質中の相互作用の量的、複合検出のために有用なアッセイを提供することを証明する。生体細胞の代わりに、薄膜調製または膜分画が膜タンパク質の分析のために使われることができるのは明らかである。
例6
哺乳動物細胞の多重検出(2)
【0146】
細胞信号は、薄膜に結合した細胞表面リセプタと細胞質のタンパクの相互作用を含む。GPCRのため、細胞質のタンパクβ‐アレスチンン‐2との相互作用は、配位子による活性化の後、リセプタ除感作およびインターナリゼーションのための重要な役割を果たす。この例では、異なるリセプタの活性化は、リセプタβ‐アレスチンン‐2相互作用を検出するために多重アッセイ・システムにおいて検査された。これは、β‐アレスチンン‐2と相互作用するため、配位子結合後、リセプタが細胞キナーゼによって修正されなければならないので生体哺乳動物細胞において実行された。また、機能的な薄膜結合リセプタの単離は達成するのが困難である。
【0147】
Rluc(Rluc‐Barr2)に融合するN‐末端のウシ属のβ‐アレスチンン‐2の発現のための構造物は、Barr2‐fwおよびBarr2‐reプライマを用いてPCRによってウシ属のβ‐アレスチンン‐2の暗号配列の増幅によって構成された。(テンプレート:pcDNA3(インビトロジェン)のウシ属のβ‐アレスチンン‐2を含む構造物。)使用された5’および3’のプライマは、制限酵素部位EcoRVおよびNotIをそれぞれ含有した。Rlucのための暗号配列を含む第2のPCR生成物は、テンプレートとしてプラスミドpRL‐CMV(Promega)を使用して、プライマRluc‐fwおよびRluc‐reでRluc相補DNA配列を増幅されて生成された。この第2のPCR生成物は、5’および3’末端でHindIIおよびEcoRV制限部位をそれぞれ含有した。両方のPCR生成物は、それからpcDNA3(インビトロジェン)のHindIII/NotI部位に、一緒にクローンをつくられた。Rluc‐β‐アレスチンン‐2融合タンパク質の哺乳動物発現のために生じたプラスミドは、pcDNA‐Rluc Barr2と名付けられた。
【0148】
哺乳類の細胞系Co‐7は、pcDNA‐Rluc Barr2、pcDNA‐TRHR EYFPおよびpcDNA‐CCR2‐t‐dimer2 (12)、または、pcDNA‐Rluc‐Barr2、pcDNA‐TRHR‐t‐dimer2 (12)およびpcDNA‐CCR2 EYFPの3つのプラスミドによって同時にトランスフェクションされた。トランスフェクションは、製造業者の指示にしたがってGenejuice(ノバジェン)を使用して実行された。トランスフェクション後、細胞は標準状態の下で2日培養された。細胞はそれからトリプシン処理され、PBSの細胞懸濁液は50μlに50000の細胞の濃度に調整された。
【0149】
配位子または配位子の組合せは、TRHには1μMの終末濃度、MCP1には0.1μM、TRHRおよびCCR2リセプタのための固有の配位子がそれぞれサンプルに加えられた。配位子の添加の後、細胞はβ‐アレスチンン‐2リセプタ相互作用の発生が可能になるように10分間、37℃で培養された。コエレンテラジンh(分子プローブ)が5μMの終末濃度にサンプルへ加えられた後、バリアン・エクリプス蛍光分光計(バリアン)は400‐700nm の間の範囲の発光スペクトルを記録するために用いられた。
【0150】
発光スペクトルは、リセプタおよびその配位子(図14)にしたがい、またはそれに選択的な特定のβ‐アレスチンン‐2リセプタ相互作用を示した。両方の配位子が加えられる場合、両方のリセプタはβ‐アレスチンン‐2と関連し、両方のリセプタの同時的な活性化を示す。この結果は、標識がいずれのリセプタのいずれに付けられるかとは独立していて、EYFPおよびt‐dimer2 (12)を交換しても本質的に同じ結果(図14)を生じた。
【0151】
スペクトルはEYFPのピーク面積を一体化することによってさらに分析され、t‐dimer2 (12)発光は例2にて説明したように、ピークに達する。ピーク面積は、配位子(図15)の存在を明確に表し、TRHRおよびβ‐アレスチンン‐2間の相互作用がより強い、またはCCR2とのそれより良好な配向にあることをさらに示した。多重検出システムのために必要とされているように、両方の相互作用の独立した検出は達成された。
【0152】
全体に、この例は、動的な、誘導できるシステムにおける異なるタンパク‐タンパク相互作用の多重検出を証明する。関係するタンパクは薄膜に結合したリセプタから細胞質のタンパクまで変動し、検出は生体の哺乳動物細胞において発生することができる。
例7
分子の付随物の簡略化された検出
【0153】
中間体または他の部分的な付随物に関係なく、特定の複合体分子の付随物が形成される場合のみに信号を生じる単純な検出システムは、いくつかの用途のためにきわめて有用である。3つの成分の付随物内の相互作用のためのモデルとして3つのDTの融合タンパク質が分析された。
【0154】
EGFPおよびRlucの暗号配列は、以下のオリゴヌクレオチド(表3)でPCRを経て増幅された:EGFP‐P2‐fw/re、テンプレート:pEGFP‐N1(クロンテック);Rluc‐P3‐fw/re、テンプレートphRL‐CMV(プロメガ)。生成物の端部は適切な制限酵素によって切断され、サブユニット間のペプチド・スペーサをコード化して、オリゴヌクレオチド・リンカーと共にベクターpET‐mRFP1にクローンをつくられる。これは、以下の構造物を生じる結果になった:PET‐MRFP1、PET‐MRFP1 12‐EGFPおよびpET‐mRFP1‐12‐EGFP‐Rluc(図4)。タンパクは、実施例1にて説明されたように、大腸菌ロゼッタ細胞において発現され、精製された。
【0155】
EGFPおよびmRFP1間のFRETは、480nmの光でmRFP1‐12‐EGFP‐Rluc融合タンパク質を励起することによって分析された。実施例1(図16a)にて説明されたように、直接の励起が減じられたので、FRET信号は、mRFP1発光の後検出された。次に、mRFP1‐12‐EGFP‐Rlucの発光スペクトルは、5μMのコエレンテラジンh(図16b)の添加の後、記録された。Rlucは、600‐650nm間の赤色の蛍光の増加した活性化と同様、510nmで緑色の蛍光の活性化で生じるmRFP1を交替で活性化するEGFPを活性化した。EGFPサブユニットを含まないmRFP1‐15‐Rluc構造物と比較して、観察されたmRFP1蛍光発光は、より高かった。
【0156】
総合すれば、これらの結果は、Rluc(DT1)が活性化すると、付随物内に同時にEGFP(DT2)が存在し、三量体の複合体の形成を示す場合、増加したmRFP1(DT3)発光が検出されることを証明する。
例8
複合体分子の付随物の相互作用
【0157】
2つ以上の成分を含む複合体分子の付随物の分析は、付随物内での成分の可能な組合せのための異なった信号を生ずる検出システムを必要とする。3つの成分の付随物内の相互作用のための第1のモデルとして、3つのDTの融合タンパク質が分析された。
【0158】
ECFPEおよびEYFPの暗号配列は、以下のオリゴヌクレオチド(表3)でPCRを経て増幅された:EGFP‐P2‐fw/re、テンプレート:pEGFP‐N1(クロンテック);EGFP‐P2‐fw/re, template: pEYFP‐N1 (クロンテック)。生成物の端部は適切な制限酵素によって切断され、サブユニット間のペプチド・スペーサをコード化して、オリゴヌクレオチド・リンカーと共にベクターpET‐mRFP1にクローンをつくられる。これは、以下の構造物を生じる結果になった:pET‐mRFP1‐12‐EYFP, pET‐mRFP1‐15‐ECFP and pET‐ mRFP1‐12‐EYFP‐ECFP (図4)。タンパクは、実施例1にて説明されたように、大腸菌ロゼッタ細胞において発現され、精製された。
【0159】
440nmでのmRFP‐12‐EYFP‐ECFP構造物の励起は、RET(図17a)のためにEYFPおよびmRFP1と同様にECFPからの発光において生じた。mRFP1‐15‐ECFP構成物を用いてEYFPの非存在下で、RETもECFPからmRFP1まで発生した。付随物においてECFPの存在なしでは、EYFPおよびmRFP1は、440nm励起光(図17a)によって、有意に活性化されなかった。励起光を490nmに変え、活性化されたEYFPおよび生じたRETを構造物mRFP1‐12‐EYFPおよびmRFP1‐12‐EYFP‐ECFPにおいてmRFP1に変え、一方でmRFP1およびmRFP1‐15‐ECFP(図17b)で観察されたように、mRFP1はEYFPの非存在下で有意に活性化されなかった。したがって、DT1(ECFP)およびDT2(EYFP)の一連の活性化、および、すべてのDTの発光の検出は、分子付随物の組成物上の正確な情報を提供した。
【0160】
分子の複合体のための第2のモデル系として、タンパク融解の組合せと関連し、ビオチンおよびストレプトアビジン間の高い親和力相互作用が分析された。
【0161】
例3に類似して、avitagの暗号配列は、交雑されたオリゴヌクレオチドAvitagN‐fw/re(表3)からなるリンカーとして、構造物pET‐EYFP‐ECFPに挿入された。リンカーは、この構造物の位置1(図4)にクローンをつくられた。ビオチン・リガーゼのための暗号配列は、テンプレートとして大腸菌Top10を用いてオリゴヌクレオチドbirA‐fw/reで増幅された。birA遺伝子は、標的タンパク質に付いたavitagペプチド配列の量的ビオチン化のためのビオチン・リガーゼを共発現するため、構造物(図4)の位置4にクローンをつくられた。ビオチニル化されたEYFP‐ECFP融合タンパク質の発現のために生じた構造物は、pET‐Avi‐EYFP‐ECFP/birAと呼ばれる。タンパクは、実施例1にて説明されたように、大腸菌ロゼッタ細胞において発現され、精製された。
【0162】
Alexaフルーア555およびAlexaフルーア568の結合体は、それらの励起スペクトルとしてDT3sがEYFPおよびECFP(図18a)の発光スペクトルとよく重なるように、検査された。ビオチニル化されたEYFP‐ECFP融合タンパク質は、大体同等の量蛍光接合されたストレプトアビジンと混合された。制御として、ストレプトアビジン結合体の添加前にビオチニル化されたEYFP‐ECFPタンパクは、共役でない、非蛍光ストレプトアビジンで前もって培養された。したがって、融合タンパク質および蛍光ストレプトアビジン間の相互作用は、ブロックされた。混合物は440nmで励起され、蛍光発光はスキャンされた。RETは、EYFPからECFPに、さらにAlexaフルーア555またはAlexaフルーア568(図d)に観察された。色素の直接の励起による光源によって、制御反作用においてAlexaフルーア555の色素からいくつかの発光が存在した。この発光は、しかしながらAlexaフルーア555‐ストレプトアビジン:EYFP‐ECFP付随物からの発光より有意に小さかった。励起光に対するより大きなスペクトル距離のため、Alexaフルーア568の色素の直接の励起は観察されなかった。同じサンプルが490nmで励起された場合、色素‐ストレプトアビジン:EYFP‐ECFP相互作用が抑制された(図e)時に部分的に(Alexaフルーア555)または完全に(Alexaフルーア568)遮断するEYFPおよびAlexaフルーア555またはAlexaフルーア568間のRETが観察された。
【0163】
次に、RET比率が図18のb‐eのスペクトルから算出された。比率は、検出システムが分子の付随物内で正確に相互作用を決定するというさらなる証拠を提供した。Alexa Fluor‐streptavidinのためのRET比率:EYFP‐ECFP複合体は、この相互作用がブロックされた(図19)場合の制御よりも有意に高かった。これは、EYFPおよびAlexaフルーア(490nmの励起)間のRETと同様にECFPおよびAlexaフルーア(440nmの励起)間のRETに観察された。Alexaフルーア555によって得られる比率は、Alexaフルーア568での比率と比較してより高かった。しかしながら、より大きなスペクトル分離、したがってより低いバックグラウンド信号によりダイナミックレンジおよび信号対雑音比は、Alexaフルーア568においてはより良好であった。
【0164】
総合すれば、この例は、DT1およびDT2の一連の励起、および、DT1、DT2およびDT3またはDT2およびDT3のそれぞれの光放射の検出と結合する3つの適切なDTは、複合体分子の付随物の組成物の正確な検出のためのシステムを表すことを証明する。
例9
哺乳動物細胞の複合体分子の付随物の検出
【0165】
Gタンパク被結合リセプタ(GPCR)の機能の重要な側面は、ホモおよびヘテロ・オリゴマー複合体を形成するそれらの能力である(例えば、クルーガー他(2003)Frontiers Neuroendocrinol., 24: 254‐278参照)。この例では、本発明のアッセイ・システムは、リセプタ‐リセプタ複合体の様々な組合せを検出するために検査された。この複合体の形成および次の検出は、生体の哺乳動物細胞の薄膜において発生した。
【0166】
蛍光タンパクmRFP1をコード化している相補DNAは、例1にて説明されたように、オリゴmRFP1‐fw/mRFP1‐P3‐reを使用してPCRによって増幅された。PCR生成物は、哺乳動物細胞の蛍光タンパクを発現するためにできたベクターにおいて生じたプラスミドpcDNA‐MCS(例5)にクローンをつくられた。mRFP1でCCR2リセプタのC末端融解の発現構成物を組み立てるため、CCR2相補DNA配列(例5)を含むPCR生成物はmRFP1の5’でプラスミドpcDNA‐MCS‐mRFP1にクローンをつくった。生じている最終的なプラスミドは、pcDNA‐CCR2 mRFP1と名付けられた。加えて、実施例5からのプラスミドpcDNA‐CCR2‐ECFPおよびpcDNA‐CCR2 EYFPが、ここで使われた。
【0167】
Co‐7細胞は、製造業者の手順に従い、例5に記載されたように、Genejuice(ノバジェン)トランスフェクション試薬を使用して発現ベクトルの1つまたは組合せによってトランスフェクションされた。標準培養条件下の2日の培養後、細胞はトリプシン処理され、細胞懸濁液の濃度は50μlの PBSにおいて約50000の細胞になるように調整された。
【0168】
これらの細胞懸濁液は、バリアン・エクリプス蛍光分光計(バリアン)を用いて蛍光分光学法によって分析された。まず、サンプルは440nmで励起され、ECFPの励起最大量および蛍光発光は460および700nm間で記録された。それから、励起波長は490nmに変えられ、EYFPの励起最大量および蛍光発光は500および700nm間で記録された。実施例1にて説明されたように、すべてのスペクトルは光源による受容基フルオロフォアの直接励起のために修正された。スペクトルは、それらの発光最大量(任意の値‘1’)(図20a(b))に、さらに標準化された。これらのスペクトルは、また、実施例2(図20c)にて説明したように、それぞれの発光ピーク面積の集積化によって数量化された。
【0169】
RETは、ECFP‐EYFPおよびECFP‐mRFP1の間で観察されたが、発光ピークの増加によって示されたように、mRFP1はまたこの実験におけるEYFPの適切なエネルギ受容基であった。これは、また、バックグラウンド制御より上の信号増加を示すそれぞれのピーク領域の集積化によって確認された。したがって、システムは正確にすべての可能な二量体リセプタ複合体を検出することが可能であった:CCR2‐ECFP/CCR2 EYFP、CCR2‐ECFP/CCR2‐mRFP1およびCCR2‐EYFP/CCR2/mRFP1。
【0170】
これは、実施例4‐6で図示される多重検出システムおよび実施例7に記載される単純な検出システムと異なり、前者は多数の相互作用を同時に検出し、後者は特に同時にすべての成分を含む複合体を同時に検出する。ここ(例8+9)で証明されたように、どちらもすべての起こりうる対の集合を検出することができない。
【0171】
要約すると、この例は、本発明が生体哺乳動物細胞における動的な、合成された分子集合を検出することができるシステムを提供することを証明する。これは、評判のとおり分析するのが困難である薄膜に結び付いたタンパク含むことができるが、明らかにそれに制限されることはない。
【図面の簡単な説明】
【0172】
【図1】複合相互作用アッセイの基礎をなしている原理を示す。
【0173】
【図2】分子の複合体が関連する簡略化された検出システムを示す。DT1およびDT2が両方とも付随物に含まれる場合、DT3からの信号が検出されるだけである。
【0174】
【図3】分子の複合体が関連する検出システムの原理を示す。DT2がまたDT3のエネルギ供給体である一方で、DT1はDT2およびDT3のためのエネルギ供給体である。DT2およびDT3またはDT3からの発光を検出する一方で、DT1およびDT2の一連の励起はそれぞれ、付随物の動的な組成物上の情報を生ずる。
【0175】
【図4】融合タンパク質の構成を示し、pETDuet‐1(ノバジェン)の多回クローニングサイトの概略図である。PCR生成物は、4つの異なる部位へクローンをつくられたインフレームである。12‐or 18‐アミノ酸スペーサのためのオリゴヌクレオチド・リンカー符号化は、サブユニット1および2の間で挿入することができる。ベクターの多回クローニングサイトによってコード化されるオープンリーディングフレームは、サブユニット1および3間の15‐アミノ酸スペーサおよびサブユニット2および3間の7‐アミノ酸スペーサを備える。
【0176】
【図5】タンパク性のDTのスペクトル特性を示す。ECFP、EGFPおよびmRFP1 (a)の蛍光スペクトルは、ECFPおよびEGFP間の大きいスペクトル重複およびECFPおよびmRFP1間のいくつかの重複を示した。有意なスペクトル重複が、ECFPおよびEYFP、さらにはEYFPおよびmRFP1(b)の間にあった。ECFP発光は、驚くほど都合よくt‐dimer2 (12)励起(c)と重なった。
【0177】
【図6】タンパク性のDT間のFRETを示す。440nmで励起された場合、EYFP‐12‐ECFP (a)およびt‐dimer2 (12)‐12‐ECFP(b)融合タンパク質は、共振エネルギ転移のために追加的な光を発した。スペクトルは供給体発光最高に標準化され、光源による受容基フルオロフォアの直接の励起からの発光は減じられた。
【0178】
【図7】ウミシイタケ・ルシフェラーゼ(Rluc)、生物発光タンパクおよびタンパク性のDT間のRETを示す:(a) DTなし;(b)EGFP;(c) EYFP;(d)t‐dimer2 (12)および(e)mRFP1。スペクトルは、発光最大まで標準化された。
【0179】
【図8】様々な融合タンパク質のためのRET比率を示す。示されているのはEGFPおよびEYFPチャネル(a)およびt‐dimer2 (12)およびmRFP1チャネル(b)のための比率である。良好な分離は、EGFP‐t‐dimer2 (12)およびEYFP‐t‐dimer2 (12)の間で達成された、一方、EGFP‐EYFPおよびt‐dimer2(12)‐mRFP1は、独立した、同時的な検出のためにはあまりにも近接している。mRFP1が都合よくEGFPおよびEYFPから分離されたにもかかわらず、それは、弱いRET信号だけにおいて生じるRlucにより本質的に活性化されなかった。
【0180】
【図9】非タンパク性のDTでのRETの分析を示す。ビオチニル化されたRlucは、様々なストレプトアビジン結合体と混合された。発光スペクトルは黒色において示され、それぞれ、接合される色素の蛍光発光および励起スペクトルは、灰色の立体および破線のラインにおいて示される。以下の結合体が使われた:(a) Alexaフルーア488、(b)オレゴングリーン、(c) Alexaフルーア555、(d)Alexaフルーア568および(e)Alexaフルーア594。逆制御として、非ビオチニル化されたRlucが使用され、RET信号を生じなかった(f)。
【0181】
【図10】非タンパク性のDTの濃度に依存するRET比率を示す。異なる量のストレプトアビジン‐オレゴングリーンまたはストレプトアビジン‐Alexaフルーア594と混合されたビオチニル化されたRlucを含む解法が分析された。濃度は、ストレプトアビジン結合なしで、等モル量のストレプトアビジンおよびビオチン‐Rlucから、ビオチン‐Rlucまで変動した。両方の結合体のために、RET比率は、最も低い濃縮でさえバックグラウンド比率より上であることがわかった。
【0182】
【図11】試験管内の複合浸水検出を示す。EGFP‐15‐Rluc/t‐dimer2 (12)‐15‐Rluc (a)およびストレプトアビジン‐オレゴングリーン/ストレプトアビジン‐Alexaフルーア594(b)の混合物が分析された。両方のモデルにおいて、2つのチャネルは、同時に分析され、独立して数量化することができた。2つのラベルのRET比率は、第1の(供給体)DTが第2のおよび/または第3のDTと相互作用する範囲を表した。
【0183】
【図12】互いにG‐タンパク結合リセプタ(GPCRs)の集合を決定するための細胞ベースのアッセイのスペクトルFRET検出を示す。ECFP、EYFPまたはt‐dimer2 (12)にC‐末端で融合したリセプタを使用して、CCR2リセプタ(a)およびTRHリセプタ(b)間のホモ二量体化は、モニタされた。ホモダイマを形成した両方のリセプタはRETのためにEYFPまたはt‐dimer2 (12)発光の増加によって検出された。両方の信号は、減光装置の連結またはより大きいオリゴマー複合体(b)の形成を表しているすべての3つの融解構造物がある場合には、同時に検出された。スペクトルは、最大480ナノメートルでECFP発光に標準化され、光源による受容基フルオロフォアの直接の励起からの発光は減じられた。
【0184】
【図13】生体哺乳動物細胞のホモダイマ複合体のGPCRs間のFRETの数値解析を示す。EYFPおよびt‐dimer2 (12)のピーク面積は、蛍光発光スペクトル(図12)の集積化によって算出された。ホモダイマ複合体は、受容基DTのいずれかを使用してCCR2 (a)およびTRHR(b)のために検出された。低い同時トランスフェクション効率において生じる一時的なトランスフェクション・システムにより、3つのすべての融解構造物(b)がある場合に得られた絶対停止信号は、それでもバックグラウンドより上ではあるが、低い。CCR2リセプタ間の相互作用がより弱いまたは良好でない配座であっても、それは、容易に検出された。
【0185】
【図14】細胞ベースであって、下流のエフェクタ・タンパクであるβ‐アレスチン‐2と異なるGPCRs間の配位子誘導相互作用の検出のための複合アッセイのスペクトル分析を示す。β‐アレスチン‐2、Rlucに融合するN‐末端は、適切な配位子の添加後、TRHRおよびCCR2と相互作用する。TRHRは、C‐末端でt‐dimer2 (12) (a)に融合するEYFPおよびCCR2であり、その逆も同じ(b)である。TRHの添加、TRHRのために特定の配位子は、TRHRに特定のRETである:β‐アレスチン‐2相互作用である。このリセプタを活性化したMCP1の添加、CCR2のために特定の配位子は、β‐アレスチン‐2と共にそれぞれのRET信号の増加において観察された。両方の配位子の添加により両方のリセプタを活性化させ、β‐アレスチン‐2と相互作用している両方のリセプタを生じ、したがって、2つのRET信号は検出された。
【0186】
【図15】下流のエフェクタ・タンパクであるβ‐アレスチン‐2と異なるGPCRs間の配位子誘導相互作用の検出のための複合アッセイの細胞ベースの数値解析を示す。図14からの発光スペクトルは、EYFPおよびt‐dimer2 (12)ピークのピーク面積を決定するため一体化された。配位子の存在次第で、β‐アレスチン‐2:TRHRおよびβ‐アレスチン‐2:CCR2は、TRHR‐EYFPおよびCCR2‐t‐dimer2 (12) (a)のC‐末端の融解を使用し、またはその逆も同じく(b)独立して検出された。
【0187】
【図16】Rluc、EGFPおよびmRFP1からなる融合タンパク質によって例証される複合体分子の付随物のための簡略化された検出システムを示す。RETは、融合タンパク質が480nm (a)に励起された場合EGFPおよびmRFP1の間で観察された。600‐650nm(b)間のより高い発光によって示されたように、RlucからmRFP1へのエネルギ転移は、EGFPがある場合には、より高かった。
【0188】
【図17】蛍光タンパクの融解によって例証される複合体分子の付随物のための検出システムを示す。ECFPは、EYFPおよびmRFP1 (a)を活性化することが可能であり、EYFPもmRFPl(b)を活性化した。
【0189】
【図18】タンパク性および非タンパク性の、小型分子色素の連結を使用している検出システムを示す。Alexaフルーア555およびAlexaフルーア568の励起スペクトルは、都合よくECFPおよびEYFP (a)の発光スペクトルに重ねられた。このモデル系において、DT1およびDT2は、ECFPのビオチニル化された融合タンパク質および色素に接合されるストレプトアビジンと相互に作用するEYFPとして存在した。Alexaフルーア555は、ECFP(b)およびEYFP (c)によって活性化された。制御として、ビオチン・ストレプトアビジン‐共役相互作用は、Alexaフルーア発光を非常に減少させた余分な複合していないストレプトアビジンを使用しているプレインキュベーションによってブロックされた。同じ効果は、よりブルーにシフトしたAlexaフルーア555と比較して、より弱い信号とより良いスペクトル解像度を生じるECFP(d)およびEYFP(e)によって活性化されたAlexaフルーア568の結合体を使用して観察された。より大きなスペクトル解像度のため、光源による直接の励起のためのAlexaフルーア568の発光は、また、複合していないストレプトアビジンを含む制御において減らされた。
【0190】
【図19】スペクトル・ピークおよびRET比率の計算の集積化によって、ECFP、EYFPおよびAlexaフルーア555(a)またはAlexaフルーア568(b)間のFRETの数値解析を示す。バックグラウンドの上の信号は、ビオチン‐ストレプトアビジン相互作用と同様にECFP‐EYFP相互作用のために観察された。440nmでの励起のAlexaフルーアおよびEYFP信号の存在は、490nmでの励起のAlexaフルーア信号の存在と同様に、すべてのDTを含む複合体が形成されたことを示す。
【0191】
【図20】生体哺乳動物細胞の細胞膜に存在するタグを付けられたリセプタによって例証される複合体分子の付随物のための検出システムを示す。ECFPが440nmで励起状態であった場合、ECFPからEYFPおよびECFPからECFPへのRETが観察され、CCR2リセプタ(a)間のホモダイマ形成を示した。RETはまた、EYFPがさらに490nmで励起状態であった場合、EYFPおよびmRFP1の間で観察され、CCR2‐EYFPの集合を示した。ピーク面積の数値解析は、信号の増加が分子集合(c)を正確に反映することを示した。(略語)BRET 生物発光共振エネルギ転移CCR2 ケモカイン(ccモチーフ)リセプタ2。DT タグまたは検出タグ。DT‐IG 相互作用している基に付着されるタグまたは検出タグ。ECFP ビクトリアグリーンの蛍光タンパク質遺伝子(GFP)の変種である強化されたシアン蛍光タンパク。EGFP 野生型GFPの赤にシフトされた変種である強化された緑の蛍光タンパク。EYFP 強化された黄色の蛍光タンパク。FRET 蛍光共振エネルギ転移。GPCRs G‐タンパク被結合リセプタ。His(6) 6つの連続的なヒスチジン残基からなるヒスチジン・タグ。IG 相互作用している基。mRFP1 単量体の赤い蛍光タンパク。RET 共振エネルギ転移。Rluc ウミシイタケ・ルシフェラーゼ。T7prom T7促進剤配列。T7stop T7ターミネータ配列。
【技術分野】
【0001】
本発明は、分子集合を検出するためのシステムに関する。特に、本発明は複数の成分検出システムに関連があり、そこにおいて、2つまたはそれ以上の成分の分子集合が検出される。
【背景技術】
【0002】
ポスト・ゲノム時代において、プロテオミクスはより重要になった。それは、セルにおいて発現されるゲノムによってコード化されるすべてのタンパクの確認、および、発現、相互作用および機能性を含むそれらの挙動の説明を含む。
【0003】
タンパクは、セルにおいて単離して作用せず、むしろ安定性があるかまたは一時的な複合体であり、タンパク‐タンパク相互作用は、タンパク機能の鍵となる決定因子である。(アウアーバッハ他(2002)、プロテオミクス、2、611‐623)さらに、タンパクおよびタンパク複合体は、デオキシリボ核酸、リボゾームリボ核酸および小型分子のように他の細胞成分と相互作用する。これらの相互作用に関係する個別のタンパク質類を解明かつ解剖することは、生物学的プロセスを理解するために重要である。
【0004】
このために、多くの分析(アッセイ)技術は、生物相互作用の決定を援助するために長年にわたって開発されてきた。しかしながら、これらの技術の多くは、高スループット・スクリーニングに適さず、費用のかかる手順を含む。例えば、例えば免疫共沈降技術が、タンパク‐タンパク相互作用を確認するために長年用いられてきた;しかしながら、この技術は、自動操作または高スループット・スクリーニングに従わない。マススペクトル分析と結合した免疫共沈降のような他の技術は、(アンダーソン及びマン(2000)FEBS Lett、(480、25‐31))薬剤スクリーニング・プログラムで使用するにはあまりに複雑で、時間がかかり、費用がかかる。表面プラスモン共振(SPR)は、高感受性があり、生物相互作用を検出することができる正確な技術である。しかしながら、この技術は、センサー表面に固定される十分な量の精製された標的タンパク質を必要とし、分子の複雑な混合物においてそれと結合する配位子の識別におけるいかなる情報も生じない。
【0005】
開発された他の技術は、高感受性があり、用途が広いが精製された状態において利用できる相互作用する分子を必要とするアルファスクリーンシステム(登録商標)、高スループット・スクリーニングにおいて有用であるが、多数の誤った結果を生じ、ダイナミックレンジが制限された蛍光偏光および蛍光異方性(ポープ他(1999)、Drug Disc Today、4、350‐362)、および、広いダイナミックレンジを有するが、しかし、相互作用パートナー間の質量差は大きくなければならず、分析が複雑である蛍光相関分光法(ポープ他(1999)、Drug Disc Today、4、350‐362)を含む。
【0006】
さらに重要なことに、すべての上記の方法は、検出が試験管内でのみ発生するという大きな不都合を共有する。この人工の状態は、タンパクが多くの異なるパートナーと相互作用し、クロストークする細胞内生育環境を正確に反映するわけではない。また、相互作用はバッファ状態次第であり、不適当な状態の選択によって相互作用は、完全に破壊または初期化され、したがって、疑陽性および疑陰性の数および可能性を増加させる結果を生じる。
【0007】
結果として、多くの検出システムは、‘生体内’でのタンパク‐タンパク相互作用を検出するために開発された。例えば、酵母2ハイブリッドシステム(フィールズおよびソング(1989)NATURE、340、245‐246)が、広く使われている。しかしながら、この技術は、生体酵母細胞の細胞核内部のタンパク‐タンパク相互作用の監視ができるだけである。それゆえに、哺乳動物の細胞に特定の膜タンパク質の重要な種類および翻訳後修飾は分析することができない。
【0008】
蛍光共振エネルギ転移(FRET)は、‘生体内’でのタンパク‐タンパク反応を検出することができる別の検出システムである(フォースター(1948)Ann.Phys.2、57‐75)。この技術は、緑蛍光タンパク(GFP)および異なる分光特性を有するその変異体のクローンがつくられた場合、生細胞の分析に特に魅力的であり、適用可能になった。これは、コード化しているDNAの塩基配列を融合させることによって、いかなる標的タンパク質へのGFPおよびその変種の遺伝子的結合を可能にした。(エイム他(1994)PNAS.USA.91、12501‐12504)。酵母2ハイブリッドシステムと比較して、FRETは監視された相互作用が細胞内部のどこにでも発生することができる利点を有する。FRETは、いかなる細胞のタイプ(哺乳動物、酵母、細菌など)、または、無細胞系においても決定することができる。それは、蛍光分光学法、蛍光顕微鏡法および蛍光活性化細胞選別(FACS)によって検出することができる。しかしながら、後述するように、FRETは一つの大きな欠点を有する、それは単一の相互作用を検出するためのみに用いることができるということである。
【0009】
生物発光共振エネルギ転移(BRET)は、生体内のタンパク‐タンパク相互作用/反応を研究するために開発された別の技術である(スー他(1999)、PNAS.USA、96、151‐156;エイデン他(2002)Trends Endocrin.Metabol.13、415‐421)FRETに類似して、この技術は、検出が生細胞内で起こり、特定の細胞の仕切りに制限されない利点を有する。加えて、それはFRETのいくつかの潜在的な制限を克服する:光がルシフェラーゼによって本質的に生成するので、検出システムは、共振エネルギ転移から生じる同等に弱い信号と強い励起光源とを区別する必要はない。さらに、細胞の蛍光および自己蛍光のフォトブリーチングは観察されない。
【0010】
しかしながら、FRETの様に、BRETの大きな制限は、単一の、1対1の相互作用のみが検出できるということである。しかしながら、大部分のタンパクが1つ以上の潜在性結合パートナーを有することが広く認められる。他のものは2つまたはそれ以上のより大きい複合体において作用し、特定のタンパクの機能は、他のタンパクの複合体の存在に極めて依存する。したがって、単一の相互作用に注目することは、特定のタンパクの多数の機能の状況、特異性、および、交差反応性について言及するわけではない。
【0011】
したがって、試験管内のおよび生体内の多数のタンパク‐タンパク集合を検出することができる複数の成分検出システムの必要がある。さらに重要なことに、スループットを増加させ、時間およびコストを減らすように同時に多数の集合を分析することができるシステム、および、複数の成分分子の付随物の一部としてタンパクおよび他の生物学上関連した分子を分析することができるシステムの必要がある。
【発明の開示】
【0012】
発明者は、試験管内のおよび生体内の多数の相互作用を検出することができる一方、従来技術のシステムにおいて識別されるいくつかの問題を解決してまたは少なくとも軽減することができる複数の成分検出システムを開発した。
【0013】
したがって、第1の態様において、以下の構成からなる複数の成分検出システムが提供される:i).第1のタグが第1の作動タグを生じる基質またはエネルギ源によって活性化されると第1の波長の光を発する、直接または間接的に第1のタグに連結する第1の相互作用している基からなる第1の媒介物、ii).第1および第2の相互作用している基が関連し、第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、第2の波長の光を発する第2の活性化タグをこのことにより生じる場合、第2のタグは第1のタグからエネルギを受け入れることができる直接または間接的に第2のタグに連結する第2の相互作用している基からなる第2の媒介物、iii).第1および第3の相互作用している基が関連し、第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、第3の波長の光を発する第3の活性化タグをこのことにより生じる場合、直接または間接的に第1の活性化されたタグからエネルギを受け入れることができる第3のタグに連結する第3の相互作用している基からなる第3の媒介物、iv).第1のタグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、および、v).前記発せられた光を検出する手段。
【0014】
第2の態様において、以下の構成からなる複数の成分検出システムが提供される:i).第1のタグが第1の作動タグを生じる基質またはエネルギ源によって活性化されると第1の波長の光を発する、直接または間接的に第1のタグに連結する第1の相互作用している基からなる第1の媒介物、ii).第1および第2の相互作用している基が関連し、i)における第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、第2の波長の光を発する第2の活性化タグをこのことにより生じる場合、第2のタグはi)における第1のタグからエネルギを受け入れることができる直接または間接的に第2のタグに連結する第2の相互作用している基からなる第2の媒介物、iii).第1、第2、および第3の相互作用している基が関連し、i)の第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が第3の波長の光を発する第3の活性化されたタグを生じるために存在するが、第1のおよび第3の相互に作用している基だけが関連する場合、前記第3のタグはi)の第1の活性化されたタグによって本質的に活性化されない直接または間接的にii)の第2の活性化されたタグから、エネルギを受け入れることができる第3のタグに連結する第3の相互作用している基からなる第3の媒介物、iv).i)においてタグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、および、v).前記発せられた光を検出する手段。
【0015】
第3の態様において、以下の構成からなる複数の成分検出システムが提供される:i).第1のタグが第1の作動タグを生じる基質またはエネルギ源によって活性化されると第1の波長の光を発する、直接または間接的に第1のタグに連結する第1の相互作用している基からなる第1の媒介物、ii).第1および第2の相互作用している基が関連し、i)における第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、第2の波長の光を発する第2の活性化タグをこのことにより生じる場合、第2のタグはi)における第1のタグからエネルギを受け入れることができる直接または間接的に第2のタグに連結する第2の相互作用している基からなる第2の媒介物、iii).第1および第3の相互作用している基が関連し、およびi)の第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、ii)において第2の活性化されたタグからのエネルギ受け入れる場合、および、第2および第3の相互に作用している基が関連し、第3の波長の光を発する第3の活性化されたタグを生じるためにii)において第2のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在する場合、直接または間接的にi)の第1の活性化されたタグから、エネルギを受け入れることができる第3のタグに連結する第3の相互作用している基からなる第3の媒介物、iv).i)およびii)においてタグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、および、v).前記発された光を検出する手段。
【0016】
第4の態様において、以下の構成からなる複数の成分検出システムが提供される:i).第1のタグが第1の作動タグを生じる基質またはエネルギ源によって活性化されると第1の波長の光を発する、直接または間接的に第1のタグに連結する第1の相互作用している基からなる第1の媒介物、ii).第1および第2の相互作用している基が関連し、i)における第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、第2の波長の光を発する第2の活性化タグをこのことにより生じる場合、第2のタグはi)における第1のタグからエネルギを受け入れることができる直接または間接的に第2のタグに連結する第2の相互作用している基からなる第2の媒介物、iii).a).第1および第3の相互作用している基が関連する場合、第1の活性化タグ;および/または、b).第2および第3の相互作用している基が関連し、そして第1および/または第2のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、それによって、第1および/または第2の活性化タグからの光放射は減少する場合、第2の活性化タグからエネルギを受け入れることができる非蛍光性失活剤分子からなる第3のタグに直接または間接的に連結する第3の相互作用している基からなる第3の媒介物、iv).i)およびii)のタグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、および、v).前記発された光を検出する手段。
【0017】
第5の態様において、以下の構成からなる複数の成分検出システムが提供される:i).第1のタグが第1の活性化タグを生じる基質またはエネルギ源によって活性化されると第1の波長の光を発する、直接または間接的に第1のタグに連結する第1の相互作用している基からなる第1の媒介物、ii).第2の活性化タグを生じる基質またはエネルギ源により活性化されると第2のタグは第2の波長の光を発する直接または間接的に第2のタグに連結する第2の相互作用している基、iii).第1のおよび第3の相互作用している基が関連し、第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源は、第3の波長の光を発する第3の活性化タグを生じるために存在する場合、第3のタグが第1の活性化されたタグからエネルギを受け入れることができる直接または間接的に第3のタグに連結する第3の相互作用している基からなる第3の媒介物、iv).第2および第4の相互作用している基が関連し、第2のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源は、第4の波長の光を発する第4の活性化タグを生じるために存在する場合、第4のタグが第2の活性化されたタグからエネルギを受け入れることができる直接または間接的に第4のタグに連結する第4の相互作用している基からなる第4の媒介物、v).第1および第2のタグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、およびvi).前記発された光を検出する手段。
【0018】
第6の態様において、以下の構成からなる複数の成分検出システムが提供される:i).第1のタグが第1の活性化タグを生じる基質またはエネルギー源によって活性化されると第1の波長の光を発する、直接または間接的に第1のタグに連結する第1の相互作用している基からなる第1の媒介物、ii).第1および第2の相互に作用している基が関連し、第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、第2の波長の光を発する第2の活性化タグをこのことにより生じる場合、第2のタグは第1のタグからエネルギを受け入れることができる直接または間接的に第2のタグに連結する第2の相互作用している基からなる第2の媒介物、iii).第1の1つまたはそれ以上のさらなる相互作用している基が関連し、および第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が、1つまたはそれ以上のさらなる波長の光を発する1つまたはそれ以上のさらなる活性化されたタグを生じるために存在し、ここにおいてさらなる波長は、第1または第2の波長とは異なる場合、第1の活性化タグからエネルギを受け入れることができる1つまたはそれ以上のさらなるタグに直接または間接的に連結する1つまたはそれ以上のさらなる相互作用している基からなる1つまたはそれ以上のさらなる媒介物、iv).第1のタグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、およびv).前記発された光を検出する手段。
【0019】
実施例において、相互作用している基は、1つまたはそれ以上の他の相互作用している基と関連することができる。これらの集合は、同一の相互作用している基の間または異なる相互作用している基の間またはその組合せであってもよい。
【0020】
好ましくは、相互作用している基は、化合物、タンパク、タンパク・ドメイン、タンパク・ループ、タンパク末端、ペプチド、ホルモン、脂質、炭水化物、核酸、オリゴヌクレオチド、薬剤媒介物、薬剤ターゲット、抗体、抗原物質、ウイルス、バクテリアおよび細胞、またはその集合またはその複合体、からなる基から選択されている。
【0021】
相互作用している基が核酸分子である場合、核酸分子のいかなる形状も使われる。例えば、核酸分子は、ゲノム・デオキシ核酸(DNA)、組換えDNA、相補デオキシリボ核酸(cDNA)、ペプチド核酸(PNA)、リボゾームリボ核酸(RNA)を含み、リボゾームリボ核酸は、異種核RNA(hnRNA)運搬RNA(tRNA)、小型妨害リボゾームリボ核酸(siRNA)、メッセンジャーRNA(mRNA)またはリボソームRNA(rRNA)およびそのハイブリッド分子を含む。
【0022】
実施例において、外部刺激は、相互作用している基の集合および/または配座を直接または間接的に調整するために適用される。好ましくは、刺激はいかなる周知の分子、有機物または無機物、タンパクまたは非タンパク、配位子、抗体、酵素、核酸、炭水化物、脂質、薬剤化合物、作動体、拮抗体、逆作動体またはその化合物または複合体、または温度、イオン強度またはpHを含む状態の変化、を含む試薬である。
【0023】
本発明によるタグは、赤外範囲に近いものから紫外線に近いものまでの光または吸収光を含むエネルギまたは、蛍光またはリン光を発することができるいかなる周知の分子、有機物または無機物、タンパクまたは非タンパク、またはその複合体であってもよい。好ましくは、タグは生物発光タンパク、蛍光タンパク、蛍光部分または非蛍光性失活剤である。
【0024】
好ましくは、生物発光タンパクは、適切な基質がある場合には、ルシフェラーゼ、ガラクトシダーゼ、ラクタマーゼ、ペルオキシダーゼ、または発光ができるいかなるタンパクからなる基から選択される。
【0025】
好ましくは、蛍光タンパクは、緑の蛍光タンパク(GFP)またはその変種、GFP(BFP)の青色の蛍光変種、GFP(CFP)のシアン蛍光変種、GFP(YFP)の黄色の蛍光変種、強化されたGFP(EGFP)、強化されたCFP(ECFP)、強化されたYFP(EYFP)、GFPS65T、エメラルド、トパーズ、GFPuv、不安定化EGFP(dEGFP)、不安定化ECFP(dECFP)、不安定化EYFP(dEYFP)、HcRed、t‐HcRed、DsRed、DsRed2、dimer2、t‐dimer2 (12)、mRFP1、ポシロポリン、ウミシイタケGFP、奇形GFP、paGFP、kaedeタンパクおよびキンドリング・タンパク、B‐フィコエリトリン、R‐フィコエリトリンおよびアロフィコシアニンを含むフィコビリタンパク質およびフィコビリタンパク質結合体、または蛍光またはリン光を発する他のいかなるタンパクからなる基から選ばれる。
【0026】
蛍光部分は、いかなる周知の蛍光部分であってもよい。好ましくは、蛍光部分は、Alexaフルーア色素および派生物、Bodipy色素および派生物、Cy色素および派生物、フルオレセインおよび派生物、ウンベリフェロン、蛍光および発光のミクロスフィア、蛍光ナノクリスタル、マリーナブルー、カスケードブルー、カスケードイエロー、パシフィックブルー、オレゴングリーンおよび派生物、テトラメチルローダミンおよび派生物、ローダミンおよび派生物、テキサスレッドおよび派生物、希土類元素キレートまたはその化合またはその派生物、または蛍光特性を有する他のいかなる分子からなる基から選択される。
【0027】
一実施例において、タグのうちの少なくとも1つは、非蛍光性失活剤である。非蛍光性失活剤は、光の吸収および蛍光および/または発光を抑える能力を有するいかなる周知の非蛍光性発色団であってもよい。非蛍光性失活剤はそれゆえに、いかなる周知のタンパク性のまたは非タンパク性の分子であってもよい。好ましくは、非蛍光性失活剤は、ダブシル、非蛍光性ポシロポリン、QSY‐7、QSY‐9、QSY‐21、QSY‐35、BHQ‐1、BHQ‐2およびBHQ‐3からなる基から選択される。
【0028】
タグおよび相互作用している基は、直接または間接的に連結される。好ましくは、直接のまたは間接的な連結は、2つの分子を連結する周知の共有結合または非共有結合手段でもある。より好ましくは、相互作用している基およびタグの直接のまたは間接的な連結は、化学的架橋、タンパクの化学修飾、アミノ酸の化学修飾、核酸の化学修飾、炭水化物の化学修飾、脂質または他のいかなる有機または無機分子の化学修飾、ビオチン‐アビジンを含む非共有結合の相互作用、抗原抗体または核酸ハイブリダイゼーションからなる基から選択される。
【0029】
好ましい実施例では、相互作用している基およびタグは、同じポリペプチド鎖の部分である。例えば、タンパク性の相互作用している基およびタンパク性のタグの核酸分子のコード付けは、(i)融解構造物の親和力純化のために使用されるペプチド配列のための配列コード付け;および/または(ii)真核細胞の細胞小器官仕切りに、融解構造物を導くペプチド配列のための配列コード付け、および/または(iii)、相互作用している基、タグおよび前記ペプチド(複数のペプチド)の融合タンパクを生じるために真核細胞薄膜の貫通を容易にするペプチド配列のための配列コード付けに、任意に融合する。
【発明を実施するための最良の形態】
【0030】
詳細に本発明を記載する前に、本発明は、本願明細書において開示される特に例証された生物発光または蛍光タンパク、分析または方法に制限されず、それは、もちろん変化すると理解される。本願明細書において用いられる専門用語は、発明の具体例のみを記載するためであり、それは添付の請求の範囲のみによって制限され、限定する意図を有さないとまた理解される。
【0031】
本願明細書において引用したすべての出版物、特許および特許出願は、以前にまたは以後であるにせよ、それらの全部において本願明細書に引用したものとする。しかしながら、本願明細書において言及される出版物は、出版物において報告され、発明と関連して使われる手順、試薬およびベクターを記載しておよび開示するために引用される。発明が従来の発明によってこのような開示に先だつ権利がないという承認として本願明細書において解釈されるわけではない。
【0032】
さらに本発明の実行は、特に明記しない限り、当業者の技術の範囲内で従来の分子生物学、化学および蛍光技術を使う。このような技術は当業者にとって周知であり、例えば以下の文献、コリガン、ダン、プロー、スパイカーおよびウィングフィールド「タンパク質科学の現行の手順」(1999)IおよびII(ジョン・ワイリー社);およびベイリー、J.E.、および、オリス、D.F.)「生物化学工学の基本」マグロウヒル社、ニューヨーク、1986;ラコウィッツ、J.R.「蛍光分光学法の原理」ニューヨーク:蛍光技術総会の出版物(1983)において完全に説明される。
【0033】
本願明細書および添付の請求の範囲において使われる単数形「a」、「an」および「the」は、文脈が別途明確に命ずる以外は複数の参照を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば「タンパク」の参照は、複数のこのようなタンパクを含み、および、「検体」に対する参照は、1つまたはそれ以上の検体に対する参照である。別途定義されない限り、本願明細書において用いられる技術的および科学的な用語のすべては、一般に本発明が属している技術の当業者によってよく理解されているものと同じ意味を有する。本願明細書において記載されるものと類似または同等のいかなる材料および方法が本発明の実行または検査に使用されるが、好適な材料および方法は、次に記載される。
【0034】
本発明は、多数の分子集合を検出するためのシステムに関連がある。本願明細書において使われる用語「分子集合」または「集合」は、いかなる周知の直接的または間接的な安定原子、または分子のレベル相互作用、またはそのいかなる連結を経て関連する相互作用するグループ2つまたはそれ以上の連結を参照する。ここで、相互作用は、例えば共有結合形成、イオン結合、水素結合、共座標結合または他のいかなる分子の結合相互作用のような結合相互作用、静電的相互作用、極性または疎水性の相互作用、または他のいかなる典型的または量子機械的な安定原子または分子の相互作用が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【0035】
実施例において、分子集合は、1つまたはそれ以上の相互作用している基(IG)からなる1つまたはそれ以上の媒介物の間にあり、そこにおいて、IGは、直接または間接的に1つまたはそれ以上タグの(「DT」)に連結する。本願明細書において使われる用語「媒介物」または「IG‐DT媒介物」、IGおよびタグ「DT」間の複合体を参照する。すなわち、IGは直接または間接的にDTに連結する。媒介物は、それらの純化を容易にする(i)および/または、成熟核宿主細胞の細胞小器官仕切りに、それらをターゲットにする(ii)および/または、細胞を囲む培地に加えられた場合、それらが真核細胞の細胞膜を貫通することを可能にする(iii)化学基、ペプチド配列、タンパクまたは核酸分子を含むように設計または修正される。
【0036】
実施例において、検出システムが多くの分子の集合を識別することができるという点で、媒介物は複数の媒介物であってもよい。しかしながら、他の実施例では、発明の検出システムは、本質的に第1、第2および第3の媒介物から構成されている。
【0037】
したがって、用語「集合」も、付近に被結合タグを導く相互作用している基を含むいかなる相互作用または配座の変化を参照する。タグ間の遠位は好ましくは、1から10ナノメートルの間の範囲である。IG‐DT媒介物間の直接の物理的な接触は必要とされず、1つまたはそれ以上の追加的な分子(複数)および/または1つまたはそれ以上の追加的な相互作用している基(複数)によって媒介される。
【0038】
本願明細書において使われる用語「相互作用している基」または「IG」は、化合物、タンパク、タンパク・ドメイン、タンパク・ループ、タンパク‐末端、ペプチド、ホルモン、タンパク‐脂質複合体、脂質、炭水化物、炭水化物含有化合物、核酸、オリゴヌクレオチド、薬剤媒介物、薬剤ターゲット、抗体、抗原物質、ウイルス、バクテリアおよび細胞またはそのいかなる複合体を含む。本質的に、相互作用している基は1つまたはそれ以上の実在物と複合体を形成することができる実在物である。例えば、複合体を抗原により形成することができるという点で、本発明の文脈の抗体は、第1のIGである。ここにおいて、抗原は第2のIG(下に示す)である。本発明のIGの別例は、複合体をリセプタで形成することができる配位子である。さらなる例は、その基質と酵素との相互作用である。加えて、IGは同じ分子の部分であってもよい。したがって例えば、Gタンパク被結合リセプタの第3の細胞内ループは、第1のIGであり、同じリセプタのC末端は、リセプタが活性化または非活性化された場合、結び付く第2のIGであってもよい。
【0039】
一実施例において、外部刺激は、直接または間接的に相互作用している基の集合および/または配座を調整するために適用される。本願明細書において使われる用語「刺激」は、いかなる周知の分子、有機物または無機物、タンパクまたは非タンパク、配位子、抗体、酵素、薬剤化合物、作動体、拮抗体、逆作動体、化合物またはその複合体も含む試薬を参照する。それはさらに温度、イオン強度またはpHを含む外部条件の変更を参照する。刺激は、直接または間接的に作用することができる。例えば、刺激が試薬である場合、それらは物理的に相互作用している基と結合する可能性があり、従ってそれらの集合の媒介となるまたは妨げる。これは例えば、リセプタの二量体化またはリセプタ内の配座の変化を生じる配位子であってもよい。間接的に作用する刺激の例は、IGは細胞酵素によって修正される、例えばリン酸化され;修正は交替でIGの集合を変えるという結果を有する細胞内の信号送信経路を活性化する試薬または状態の変更である。
【0040】
本願明細書において使われる用語「タグ」は、生物発光タンパク、蛍光タンパク、蛍光部分および非蛍光性失活剤を含む。要するに、あらゆる周知の分子、有機物または無機物、タンパクまたは非タンパク、またはその複合体は、光のようなエネルギを発する、または、赤外範囲に近い紫外線の光を吸収する、または、蛍光またはリン光を発することができる。
【0041】
本願明細書において使われる用語「生物発光タンパク」は、発光を生成することができるいかなるタンパクを参照する。生物発光タンパクはバクテリア、菌類、昆虫および海洋生物において発見されたルシフェラーゼを含む。それらは、光放射(ヘイスティングズ(1996)Gene 173、5‐11)の下で特定の基質(ルシフェリンとして周知の)の酸化を触媒する。最も広く周知の基質は、刺胞動物、カイアシ、毛顎動物、クシクラゲ、十脚甲殻類、アミ、放散虫およびいくつかの魚分類群において発生するコエレンレラジンである(グリーアおよびシャーレイ(2002)ルミネッセンス、17,43‐74)。最も広く使われているルシフェラーゼのうちの2つは、以下の通りである:
(i)ウミシイタケ・ルシフェラーゼ(R. レニフォルミスから)、基質としてコエレンレラジンを使用し、480ナノメートルで光を発する35kDaタンパク(ローレンツ他(1991)、PNAS. USA、88,4438‐4442);および、(ii) ホタル・ルシフェラーゼ(特異性ホタルから)、基質としてルシフェリンを使用し、560ナノメートルで光を発する61kDaタンパク(デウェット他(1987)、Mol. Cell.2987,725‐737)。
【0042】
近年、Gaussiaルシフェラーゼ(コペポーダから)が、生化学アッセイにおいて使われた(ヴェルハーゲン他(2002)Anal.Chem,74:4378‐4385)。Gaussiaルシフェラーゼは、470ナノメートルの光放射において生じる高速反応でコエレンタラジンを酸化させる20kDaタンパクである。
【0043】
一実施例において、基質がある限り、本発明で使用される生物発光タンパクは強い一定の光放射を呈する。生物発光タンパクがIGに連結するので、立体障害のためにIG間の相互作用の阻害を妨げるため低分子量を有する生物発光タンパクの使用は好ましい。生物発光タンパクは、IG‐DT媒介物の容易な製造を容易にするために好ましくは単一のポリペプチド鎖から構成されている。また、生物発光タンパクは、被結合IGの機能性を抑制してしまうオリゴマーまたは骨材を好ましくは形成しない。生物発光タンパク・ウミシイタケ・ルシフェラーゼ、Gaussiaルシフェラーゼおよびホタル・ルシフェラーゼは、これらの基準のすべてまたは大部分を満たす。
【0044】
本願明細書において使われる用語「基質」は、生物発光タンパクと共に発光を生成または吸収するために用いることができるいかなる分子をも参照する。
【0045】
基質の選択は、生物発光タンパクによって生成される光の波長および輝度に影響を与える。ウミシイタケ・ルシフェラーゼでは例えば、コエレンテラジン類似体が利用でき、418および512ナノメートルの間での光放射を生じる(イノウエ他(1997)Biochem. J.、233、349‐353)。コエレンテラジン類似体(400A、『ディープブルーC』)は、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ(PCT出願WO01/46691)で400ナノメートルで光を発することが記載された。
【0046】
本発明によって使用される基質は、好ましくは細胞透過性であり、細胞内生物発光タンパクに利用できるように細胞薄膜を通過することが可能である。コエレンテラジンおよび大部分のその派生物は、高浸透性の細胞であり(シモムラ他(1997)Biochem. J.326:297‐298)、一方、ルシフェリンは効率的に哺乳動物細胞の薄膜と交差しない。しかしながら、細胞膜を通過し、細胞酵素または紫外線光によって細胞原形質内部で放出される閉じ込められたルシフェリン化合物は開発された(ヤン他(1993)Biotechniques、15,848‐850)。
【0047】
本願明細書において使われる用語「蛍光タンパク」、蛍光またはリン光を発することができるいかなるタンパクをも参照する。本発明において採用された、異なる多くの蛍光タンパクがある。例えば、分子および細胞生物学で最も広く使われている蛍光タンパクは、クラゲビクトリア(チェン(1998)Annu.Rev. Biochem.67,509‐544)からの緑の蛍光タンパク(GFP)およびその配列から導かれる変種である。『強化された』蛍光タンパク(例えばEGFP)は、溶解性および蛍光を増加させ、タンパク質の折畳みを加速する点変異によって開発された(ゼルニッカ‐ゲッツ他(1997)Development(124,1133‐1137)。位置64におけるPheからLeuへの点変異は37℃でタンパクの安定度を増加させ、位置65におけるSerからThrへの変異は、蛍光を増加させる結果を生じる(オカベ他(1997)FEBS会報、407,313‐319;クロンテック社、パロアルト、カリフォルニア)。クロンテックから市販されているEGFPは、人間化されたコドン利用を組み込み、それが哺乳類の転写機構に「より異種でなく」なるようにさせ、最大限の遺伝子形質発現を保証する。加えて、緑の蛍光タンパクのスペクトル特性は特定のアミノ酸の部位特異的突然変異によって変えられることができ、例えば、EGFPの青(EBFP)、シアン(ECFP)および黄色の(EYFP)変異体が生じられた(チャンほか(2002)Nat. Rev. Mol.CellBiol.、3,906‐918)。蛍光タンパクの重要な他の種類は、サンゴの生物種のイソギンチャク(DsRed)からの赤い蛍光タンパク(RFP)(マッツほか(1999)Nature Biotechnol. 17,969‐973)、およびシライトイソギンチャク(HcRed)(グルスカヤ他(2001)、FEBS会報、507,16‐20))である。
【0048】
好ましくは高い蛍光量子収率を有する蛍光タンパクが、本発明で使われる。
【0049】
好ましくは、本発明で使用される蛍光タンパク質類の分子量は、IG間の立体障害を避けるのに十分小さくなくてはならない。
【0050】
好ましくは、単量体のタンパクは、被結合IGの機能との集合および干渉を避けるために用いられる。GFPは弱い二量体を形成する、しかし、二量化への傾向は二量体化インタフェース(ザカリア他(2002)、Science、296,913‐916)の疎水性アミノ酸の突然変異によって最小化することができる。赤い蛍光タンパクDsRedは、必須の四量体タンパクである。最近、DsRedを二量体タンパク(dimer2)に再生するDsRed配列の17の点変異が記述された。二量体のサブユニットは、モノマーとして物理的に作用する縄でつながれた二量体(t‐dimer2 (12))を形成するためにペプチド・リンカーを経て連結することができる。追加的な16の点変異は、dimer2を単量体の変種(mRFP1)に変換する(キャンベル他(2002)PNAS. USA(99,7877‐7882))。赤い蛍光タンパクHcRedは、二量体タンパクであって、モノマーとして蛍光を生じない。しかしながら、2つのサブユニットは、第2のN‐末端と第1のサブユニットのC末端を連結している短いペプチド・リンカーによって融合することができる。この融合タンパク質(t‐HcRed)は、t‐dimer2 (12)に類似した単量体のユニットとして効果的に作用する(フラドコフ他(2002)Biochem. J.(368,17‐21))。
【0051】
好ましくは、本発明によって使用される蛍光タンパクは、それらのフルオロフォア形成のため、短い成熟時間を呈する。これらの分子のフルオロフォアは、ポリペプチド鎖の特定の再配列によって形成される。このプロセスは、1時間未満から24時間以上かかる(チャン他(2002)、Nat.Rev. Mol. Cell 3,906‐918)。遅い成熟過程が機能的なDTの有効度および濃縮を制限するので、迅速に成熟するタンパクの使用が好まれる。迅速に成熟する蛍光タンパクは、例えば緑の蛍光タンパクEGFPおよびその色の変種、および赤い蛍光タンパクt‐dimer2およびmRFP1である。遅く成熟するタンパクは、例えばDsRedおよびHcRedである。
【0052】
「蛍光部分」または「複数の蛍光部分」は、本願明細書において取換可能に使われ、蛍光を生成することができる非タンパク性の分子を参照する。非タンパク性の蛍光分子は、他の分子に付着することができる通常小さい分子である。各々の非タンパク性の蛍光分子は、特定の分光特性を有する。本発明において使われることができる多くの異なる蛍光部分が存在する。非制限的な例は、ローダミン、ローダミン派生物、ダンシル、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセイン派生物、オレゴングリーン、テキサスレッド、Alexaフルーア色素およびCy色素を含む。本発明に関する蛍光部分のきわめて魅力的な種類は、蛍光ナノクリスタルである(ブルーチェス他(1998)Science、281,2013‐2016)。蛍光ナノクリスタルは強い蛍光を呈し、それらの蛍光発光は1000ナノメートル以上の波長範囲サイズの結晶によって調整することができる。全てのナノクリスタルの励起は、それらの蛍光発光から独立している同じ波長で発生する。それゆえに、様々なナノクリスタルは、同じ光源または同じ生物発光タンパクまたは蛍光分子からのRETを経て励起させられることができる。
【0053】
好ましくは、高い蛍光量子収率を有する蛍光部分が使われる。
【0054】
新しいタイプの蛍光部分は、最近報告され、タンパク性および非タンパク性の両方の成分を含む(グリフィン他(1998)、Science、281,269‐272;アダムズ他(2002)、J. Am.Chem.124,6063‐6076)。重ヒ素化合物テトラシステイン・システムは、標的タンパク質にペプチドを含む短いテトラシステインを融合させる。このペプチドは、安定性のある、蛍光複合体を細胞浸透性のある非蛍光性の重ヒ素化合物色素により形成する。色素の分子構造に従い、異なるフルオロフォアが得られる。
【0055】
本願明細書において使われる用語「エネルギ源」は、特定のフルオロフォアを活性化することができるいかなるエネルギ源をも参照する。好ましい実施例では、エネルギ源は光である。光源の非制限的な例は、レーザー、水銀ランプまたはキセノンランプを含む。光源は、発された光を特定の波長または特定の範囲の波長に制限する手段をさらに有する。例えば、これはフィルタ・ホイールまたはフィルタ・スライドに取り付けられる適切なフィルタ、単一の波長の光を生じるのみであるモノクロメータまたはレーザーである。
【0056】
用語「非蛍光性失活剤」は、それ自体が光を発することなく蛍光光を吸収することができるいかなる周知のタンパク性のまたは非タンパク性の分子をも参照する。非制限する例は、ダブシル、QSY失活剤、BHQ失活剤および非蛍光性ポシロポリン色素タンパクである。
【0057】
本発明に関して、生物発光、蛍光タンパクまたは蛍光部分は、特定の物理的な特性と同様に共振エネルギ転移(RET)のための適切なスペクトル特性を有しなければならない。必要な基質がある限り、それらの光放射は好ましくは強く、一定でなければならない。生物発光タンパクおよび/または蛍光部分が直接または間接的にIGに連結することができるので、立体障害によるIG間の相互作用の阻害を妨げるため、小さい生物発光および蛍光タンパクを使用することは、最も望ましい。
【0058】
本願明細書において使用される用語「直接または間接的に連結された」は、分析または検出することができる媒介物を形成するため、タグがIGに付着または関連することを意味する。連結の好適な方法は、IGおよびDTの性質によって決定される。
【0059】
生物発光または蛍光タンパクは、直接または間接的に(例えば、リンカー基を経て)適切なIGに(例えば、共有結合で)連結する。媒介物に生物発光または蛍光タンパクを連結する手段は、公知技術である。タンパク性のIGおよびタンパク性のDTを直接連結する方法の例は遺伝子の融解であり、ここにおいて、IGおよび生物発光または蛍光タンパクをコード化している遺伝子は、単一のポリペプチド鎖を生じるために融合する。
【0060】
直接的な連結方法の別の例は共役であり、ここにおいて、フルオロフォアとIGの連結には、例えばリガーゼ、ヒドロラーゼ、特にホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ、またはオキシドリダクターゼ、特にペルオキシダーゼのような酵素を使用する。
【0061】
蛍光部分および非タンパク性の、非蛍光失活剤は、タンパク性のIGへのそれらの取付けは、よりむずかしく、タンパク性のIGに遺伝的に融合することができるタンパク性の蛍光部分とは対照的に、生体細胞内部で発生させることができないという不都合を有する。非タンパク性の蛍光部分および非蛍光失活剤のIGへの直接の連結の例は、共有結合をIGの特定の化学基により形成することできる反作用基に共有結合される部分を含む。例は、システイン残基のSH基に化学反応するヨードアセトアミドおよびマレイミド、およびリジン残基のNH3+‐基に化学反応するスクシンイミドのエステル、カルボン酸およびスルフォニルクロリドである(イシイ他.(1986)、Biophys. J. 50、75‐89;スタロス他(1986)、Anal. Biochem. 156、220‐222;ルフェーブル他.(1996).Bioconjug.Chem.7,482‐489)。
【0062】
一般的に蛍光部分または非蛍光失活剤をIGに付着させる別の周知の方法は、蛍光部分をIGに移植すること、またはその合成の間、蛍光部分をIGに組み込むことを含む。標識をつけられたIGは、例えばリセプタまたは核酸に対する選択的な結合、特定の酵素の活性化または阻害、または生物学的製剤薄膜に組み込む能力のような標識を外されたIGの臨界特性を保持することは重要である。例えば、ジピロメテンボロン二フッ化色素、ローダミン、ローダミン派生物、テキサスレッド、ダンシル、ウンベリフェロンなどの利用できる様々な蛍光部分が存在する。使われる様々な標識化の再調査または信号生成システムについては、米国特許No.4,391,904を参照のこと。
【0063】
蛍光部分または非蛍光性失活剤を例えばタンパクまたは核酸のようなIGに連結する間接的な方法の一つの例は、ビオチンを結合することができる、アビジンのようなタンパクへの蛍光部分または非蛍光性失活剤の共有結合形成を含む。ここにおいて、ビオチンは、IGおよび蛍光部分または非蛍光性失活剤は、ビオチンおよびアビジン間の相互作用を経て間接的に一緒に連結されるようにIGに共有結合する。
【0064】
IGおよび生物発光または蛍光タンパクの連結の間接的な方法の他の例は、リンカー基を経たものである。リンカー基は、結合能力との干渉を避けるため、媒介物から生物発光または蛍光タンパクを隔てるためにスペーサとして機能することができる。リンカー基はまた、媒介物上の置換基の化学的な反応性を増加させるのに役立ち、したがって連結効率を増加させる。化学的な反応性の増加はまた、別の方法では可能でない媒介物または媒介物上の官能基の使用を容易にする。
【0065】
ホモおよびヘテロの両方の二官能性または多官能性の様々な試薬がリンカー基として使われることは、(イリノイ州・ロックフォードのピアスケミカル社のカタログに記載されるように)当業者に明らかである。例えば、連結はアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基または酸化された炭水化物残基で生じる。このような方法論を記載している米国特許No.4,671,958のような多数の参照が存在する。
【0066】
一実施例において、タンパク性のDTまたはタンパク性のIGは、当業者にとって周知の標準分子生物学技術による発現ベクトルにDTまたはIGをコード化するDNAの塩基配列を挿入することによって組み換えられて生じる。DNAの塩基配列は、使用可能な状態で適切な転写または翻訳調整要素に連結される。DNAの発現の原因となる調整要素は、第1のポリペチドをコード化しているDNA配列の5’に位置するのみである。同様に、端部翻訳および転写終結信号に必要とされるストップコードンは、第2のポリペチドをコード化しているDNA配列の3’に存在するのみである。融合されたDTおよびIGのポリペチドは、適切な宿主において発現される。従来技術における当業者にとって公知の様々な発現ベクトルのいずれかが本発明の明確な組換え型ポリペチドに使われる。組換え型ポリペチドをコード化するDNA分子を含む発現ベクトルによって変換またはトランスフェクションされた適切な宿主細胞において、発現は達成される。適切な宿主細胞は、原核生物、酵母および高等真核細胞を含む。好ましくは、使われる宿主細胞は、大腸菌、酵母、または、CHO細胞のような哺乳動物細胞系である。
【0067】
別の実施例では、タンパク性のIG‐DT媒介物は、融解構造物として組み換えられて生じる。本発明の融合タンパク質をコード化しているDNAの配列は、適切な発現ベクトルにタンパク性のDTポリペチドおよびIGポリペチドをコード化する別々のDNAの塩基配列を組み立てるために周知の組換えDNA技術を使用して構成される。第1のDNA配列の3’末端は、ペプチド・リンカーの有無にかかわらず第2のDNA配列の5’末端に結紮されるので、両方の配列の解読枠は、DTおよびIGの生物学的活性度を保持する単一の融合タンパク質への2つのDNA配列のmRNAの翻訳を許容するように同調している。融解構造物内のDTおよびIGの配向は、その機能または発現を増加させるために交換される。
【0068】
ペプチド・リンカー配列は、各々のポリペチドがその第2および第3期構造に折り畳まれることを保証するために十分な距離によって、生物発光タンパクおよびIGポリペチドを分離するために使われる。このようなペプチド・リンカー配列は、公知である標準技術を用いて融合タンパク質に組み込まれる。適切なペプチド・リンカー配列は、以下の要因に基づいて選択される:(1)それらの可撓性の延長された配座を採用する能力;(2)生物発光タンパクまたはIG上の機能的なエピトープと相互作用することができるそれらの二次構造を採用することの不能性;および、(3)ポリペチド機能的なエピトープと化学反応、または融合タンパク質の溶解性を減少させるかもしれない疎水性または充電される残基の欠如。好適なペプチド・リンカー配列は、Gly、AsnおよびSer残基を含む。他の中性に近いアミノ酸、例えばThrおよびAlaもまた、リンカー配列において使われる。リンカーとして有効に使われるアミノ酸配列は、マラテア他(1985)Gene、40、39‐46;マーフィー他(1986)PNAS. USA、83,8258‐8262;米国特許No.4、935、233および4、751、180において開示されるものを含む。リンカー配列は、長さにおいて1から約50のアミノ酸である。生物発光タンパクまたはIGが必須ではない機能的なドメインを分離しておよび立体障害を妨げるために用いることができるN末端アミノ酸領域を有する場合、ペプチド配列は必要とされない。
【0069】
結紮されたDNA配列は、使用可能な状態で適切な転写または翻訳調整要素に連結される。DNAの発現の原因となる調整要素は、第1のポリペチドをコード化しているDNA配列の5’にのみ位置する。同様に、端部翻訳および転写終結信号に必要とされるストップコードンは、第2のポリペチドをコード化しているDNA配列の3’にのみ存在する。
【0070】
一実施例において、組換え型ポリペチドをコード化している配列は、アフィニティークロマトグラフィを経て融解構造物の純化を容易にするペプチドをコード化する配列にさらに遺伝的に融合する。この例は、ヒスチジン・タグ、マルトース‐結合タンパク質タグ、セルロース‐結合タンパク質タグ、インテインタグ、S‐タグおよびGSTタグを含む。
【0071】
もう一つの実施例では、組換え型ポリペチドをコード化している配列は、成熟核宿主細胞のまたは周囲培地への分泌のための特定の細胞小器官仕切りへの融解構造物のターゲッティングを容易にするペプチドをコード化する配列に遺伝的に融合する。この例は、核局在化信号、ミトコンドリアインポート配列、小胞的な細網をターゲットにしたKDEL配列、およびエクスポート信号を含む。
【0072】
さらにもう一つの実施例において、組換え型ポリペチドをコード化している配列は、真核細胞薄膜の貫通、およびしたがって細胞への融解構造物の取込みを容易にするペプチドをコード化する配列に遺伝的に融合する。(シュワルツ他.(2000)Curr. Opin. Mol. Ther. 2,162‐167)。この例は、HIV Tatタンパク、ペルペス単式ウイルスVP22およびカポジFGF‐4から導かれるペプチド配列を含む。
【0073】
組換えの方法の代替として、ポリペチドおよびオリゴペプチドが化学的に合成することができる。このような方法は、一般的に固体アプローチを含むが、また、溶液ベースの化学反応および連結または固体および溶液アプローチの組合せを利用することができる。タンパクを合成するための固体物理方法論の例は、メリフィールド(1964)J.Am.Chem.Soc.,85、2149;およびホートン(1985)PNAS. USA.82,5132によって記載される。
【0074】
IGが上記の通りのタグで標識がつけられるならば、それらは、それからそれに付着した1つまたはそれ以上のタグを有する1つまたはそれ以上の他のIGと作用することができる。
【0075】
一実施例において、すべてのIG‐DT媒介物は、タンパク性であり、適切な宿主細胞のIG‐DT融解構造物を発現するために遺伝子の融解によって連結される。DTの活性化および検出は、IGの集合と同様に生体宿主細胞内部、内部の細胞オルガネラ、細胞膜内部、またはその表面で発生する。
【0076】
他の実施例では、IG‐DT媒介物のサブセットは、タンパク性であり、適切な宿主細胞のIG‐DT融解構造物を発現するため、遺伝子の融解により連結される。IG‐DT媒介物の他のサブセット、タンパク性、非タンパク性のまたはその組合せが、宿主細胞薄膜を貫通する任意の能力を有して宿主細胞に加えられる。DTの活性化および検出は、IGの集合と同様に生体宿主細胞内部、内部の細胞オルガネラ、細胞膜内部、またはその表面で発生する。
【0077】
また別の実施例ではIG−DT媒介物はそれらの性質および準備方法に関係なく適切な緩衝物質を含む溶液で提供される。IG−DT媒介物は細胞抽出物、細胞片又は合成混合物の一部であり、又は少なくとも純度約90%であり、最も好ましくは少なくとも純度約99%である。
純化は、アンモニウム硫酸塩沈降、アフィニティーカラム、イオン交換、および/またはサイズ排除および/または疎水的相互作用クロマトグラフィ、HPLC、FPLC、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動法などを含む技術の標準的な手順で発生する。(スコープス(1982)タンパク純化、スプリンガー‐オーバーフラグ、N. Y.、ドイツ、酵素学における方法vol.182:タンパク純化のガイドアカデミック・プレス社、ニューヨーク(1990)参照のこと)
【0078】
本発明は、供給体および/または受容基分子であることができるDTの対の連結を含む。したがって、本発明によって使われることができるDTは、その物性に基づいて選ばれることができ、共振エネルギ転移(RET)術では周知のように、2つが選ばれるので、それらは、一緒にRET対の供給体および受容基分子を構成する。RET対の内のDTの1つが生物発光タンパクである場合、RETは生物発光RET(BRET)として公知である。RET対を形成しているDTの両方がフルオロフォアである場合、生じるRETは蛍光RET(FRET)として公知である。周知の適切な供給体および受容基対の例は、以下からなる:ウミシイタケ・ルシフェラーゼおよび黄色の蛍光タンパク;ウミシイタケ・ルシフェラーゼおよび緑の蛍光タンパク;シアン蛍光タンパクおよび黄色の蛍光タンパク;フルオレセインおよびテトラメチルローダミン;および5‐2'‐アミノエチル)アミノナフタレン‐1‐スルホン酸(EDANS)およびフルオレセイン。
【0079】
R.ハウグランド、蛍光プローブおよび調査用化学薬品のハンドブック(第6版、1995年)を一般に参照する。フルオロフォアの一方または両方は、緑の蛍光タンパクのような蛍光タンパクである可能性があり、試験化合物および蛍光タンパクの融合タンパク質を準備することにより、試験化合物がタンパクまたはペプチドである場合、それは、特にフルオロフォアとして蛍光タンパクを使うために都合が良い。
【0080】
本発明は、多数のRET信号の同時的な検出、および、選択されなければならない特定の分光特性と生物発光または蛍光部分の組合せを含む。異なる実施例によるこれらの生物発光または蛍光部分の組合せのための一般のスペクトル必要条件および例は、用途の例と同様に以下に記載される:
(i)複合検出システム‐‘OR’アッセイ
【0081】
一実施例において、第1の受容基タグ(DT1)の発光スペクトルは、第2のタグ(DT2)および次のタグ(DT3+)の励起スペクトルに十分に重なり、一方で、DT1、DT2およびDT3の発光最大量は、それらの別々の検出(図1および表1参照)を可能にするために十分に異なる。
表1
適切な基質または励起光によるDT1の活性化のアッセイのタイプおよび予想される信号
* 数は、このDTの増加した信号を示す。
【0082】
DTの適切な組合せの例は、EGFPまたはEYFP(DT2)およびDsRed、dimer2またはt‐dimer2 (12)(DT3)との組合せでDT1として使用される(460‐490ナノメートルで発する)ウミシイタケ・ルシフェラーゼまたはECFPである。DsRedおよび二量体変種は500ナノメートル以下の弱いものだけを吸収するにもかかわらず、それらは、驚くほど強いRET受容基を形成する。代替的に、重ヒ素化合物色素FlAsHおよびReAsHが、DT2およびDT3として使われる(アダムズ他(2002)J.Am.Chem.Soc.,124、6063‐6076)。DT2およびDT3のための他の代替物は、EGFPまたはEYFPおよびDsRedに類似したスペクトル特性を有する蛍光部分である。その例は、Alexaフルーア488、オレゴングリーン514およびAlexaフルーア546を含む。DT2およびDT3のためのさらにもう一つの代替物は、蛍光ナノクリスタルである。すべてのナノクリスタルは、それらの発光波長から独立して、500ナノメートル以下で光を吸収し(ブルーチェス他(1998)、Science、281,2013‐2016)、それらをこの種のアッセイのために理想的なRET受容基にする。
【0083】
この実施例の変種は、ペアをなす相互作用、すなわちIG1:IG2およびIG3:IG4が可能であるIGを含む2つの独立した相互作用のモニタを可能にする。本実施例において、DT1は直接または間接的にIG1およびIG3に連結され、一方でDT2がIG2に、DT3がIG4に連結される。DTのスペクトルの必要条件は変わらず残る。
【0084】
本発明の本実施例の用途の一つの例は、信号伝達経路のモニタである。大部分の細胞信号送信イベントは、相互作用し、細胞核における遺伝子転写を通常含む応答へのリセプタからの信号を中継するタンパクのネットワークを含む。IGは、IG2およびIG3間の信号リンクとして作用するIG2およびIG3またはIG1に信号を中継しているIG1との信号送信経路の成分である。IGが導かれることができる分子の信号送信の例は、rasおよびrafタンパク、プロテインキナーゼC、MEKタンパクなどである(ディキク他(1999)Cell Biochem. Biophys.、30、369‐387;ガトキンド他(1988)Oncogene、17,1331‐1342;ラトレル他(1999)Curr. Opin. Cell Biol. 11,177‐183;ローゼンガルト他(1998)J. Cell physio. 177,507‐517)。
【0085】
別の例は、遺伝子形質発現の転写調整である。これらの複合体の多重たんぱく質‐DNA複合体および組成物の転写因子行為は、それらの特異性および活性を決定する(ウォルベルガー他 (1999)、Ann.Rev. Biophys. Biomol. Struct.、28、29‐56)。例えば、転写因子Fosは、細胞識別、成長、外部刺激などにしたがって、転写因子Jun系統の異なる構成メンバでヘテロダイマを形成する(チネノブ他(2001)、Oncogene、20,2438‐2452)。IGは、選択的にこれらの重要な転写調節因子の状態および活性をモニタするFosおよびJun系統から導かれることができる。
【0086】
本発明の本実施例の用途のさらなる例は、細胞信号伝達カスケードの2つの異なる部分のモニタである。信号は、活性化されたリセプタから相互作用し、互いにタンパクを活性化または停止するカスケードを経てそれらの効果的細胞内部位まで中継される。都合よく特徴を描写された例は、MAPK/Erk経路である(コブ他(1999)Prog. Biophys. Mol. 71: 479‐500;ルイス他(1998)Adv. Cancer Res. 74,49‐139)。MAPK/Erk信号送信カスケードは、リセプタ・チロシンキナーゼ(RTKs)、インテグリンおよびイオンチャネルを含む成長および識別に関係している様々なリセプタによって活性化される。IGの対は、カスケードの信号送信分子の異なる相互作用している対から導かれる。各々の相互作用している対は、特定の段の活性化を示している特定のRET信号(DT1‐IG1:IG2‐DT2およびDT1‐IG3:IG4‐DT3)を提供する。これは、カスケードの上流の段(例えば、SOS‐Ras)とさらに下流の段(例えば MEK‐Erk)との同時的なモニタを可能にする。この種のアッセイは、2つの検出された段の間にあるカスケードの成分を識別するために有用である。高スループット・スクリーニングおよび薬剤発見において、それが、2つの検出された段間の分子を操作している薬剤の確認のために使われる。
【0087】
別の例では、アッセイは通常のタンパク対変異体の機能性を区別するために用いられる。腫瘍形成における変異体が活性化された受容体タンパク質‐チロシンキナーゼ(PTKs)の役割は、確立している。リセプタPTKの活性化の重要な原則は、配位子が媒介となった二量体化である。増加した証拠は、リセプタPTKの腫瘍形成活性化は、構成要素の二量体化に導く突然変異および細胞質の触媒ドメインの活性化を通じて発生することを示す(ハンター他(1997)、Cell、88,333‐346)。一つの例は、慢性骨髄単球性白血病においてt(5:12)トランスロケーションによって生成されたTel‐PDGFbリセプタ融解である。TelのN末端部分、Ets系統転写因子は、二量体化および構成要素のPTK活性化において生じるPDGFbリセプタPTK遺伝子の全体の細胞質のドメイン全体と結合される(ゴーラブ他(1994)Cell、77,307‐316)。本発明において提供されるアッセイ・システムは、リセプタ成分からIGを導き、不完全(変異体)なもの、および野性‐タイプ(通常)リセプタPTKの両方の活性をモニタする。したがって、高スループット・スクリーニングおよび薬剤発見化合物において、通常の受容体機能を妨害せずに変異体リセプタを特に目標として識別することができる。これは、第1の主要なスクリーニング段の間、高度に特殊な化合物の識別を可能にする。
【0088】
さらにもう一つの例において、この種のアッセイは、高スループット・スクリーニングにおいて使用される化合物のための内蔵制御を提供するために用いられる。一般に特に標的タンパク質の機能よりむしろタンパク機能を妨害する化合物は、疑陽性信号を生じることは共通の問題である。本発明によって提供されるアッセイ・システムについては、共通の相互作用しているパートナーとともに2つの異なる分子の機能性、例えば2つの異なる相互作用、それらに共通の下流のエフェクタ・タンパクβ‐アレスチンから独立したGPCRは、モニタされる。それゆえに、目標とされた相互作用は、一つのRETの対(DT1‐IG1:IG2‐DT2)によってモニタされる。第2の、関連する相互作用は、並列に(DT1‐IG1:IG3‐DT3)モニタされる。第1の対にのみ効果を呈し、第2の対に効果を呈さない化合物は、ターゲット特有である。両方のターゲット上の効果を有する化合物は、特定ではない効果を経て作用する。
【0089】
さらにもう一つの例において、この種のアッセイは、他のものでな特定の生命体のための物質中毒性、すなわち宿主以外の寄生生物を殺す物質を識別するために用いられる。極めて重要なタンパク‐タンパク相互作用は、寄生生物のタンパクから導かれるIGによってモニタされる。同時に、宿主生物から導かれるIGと同等の相互作用は、モニタされる。アッセイは、寄生生物および宿主のタンパクを区別することが可能である物質の識別を可能にする。
【0090】
概して高いスループット・スクリーニングのために、この種のアッセイは、他方(IG1:IG3)でなく、一方の相互作用(例えば IG1:IG2)を特に抑制または開始する化合物を発見するために用いることができる。第1の相互作用によって、1つのみが薬剤の所望の効果である第2のものと異なる細胞効果が生じるのでこれは重要である。それゆえに、この種のアッセイは、高度に細胞効果のために特定の薬剤の発生を容易にする。また、2つの異なる相互作用および機能性が同時に選び出されるので、この種のアッセイはスループットを増加させるために用いる。これは、試薬、コストおよび時間の有意な節減を生じる。
【0091】
上記の分子の相互作用の状況は、多数の細胞機能性において重要な役割を果たし、例において記載されるものに限られないことは当業者に明らかである。
(ii) 複合体分子の付随物のための単純な検出システム‐‘AND’アッセイ。
【0092】
一実施例において、DT1の発光スペクトルは、DT3ではなくDT2の励起スペクトルと十分に重なる。DT3の励起スペクトルは、十分にDT2の発光スペクトルと重なり、一方でDT1、DT2およびDT3の発光最大量は、それらの別々の検出を可能にするために十分に異なる(図2および表1)。DTの適切な組合せの例は、EGFPまたはEYFP(DT2)およびmRFP1(DT3)と結合するDT1として標準コエレンテラジン基質(460‐480ナノメートルで発する)を使用したウミシイタケ・ルシフェラーゼである。代替的に、DT2としてのEGFPまたはEYFPは、類似したスペクトル特性を有する重ヒ素化合物色素FlAsHまたは蛍光部分で置換される。その例は、Alexaフルーア488およびオレゴングリーン514を含む。赤の蛍光タンパクmRFP1は、類似したスペクトル特性を有する他の蛍光タンパクまたは蛍光部分で置換される。
【0093】
この実施例の用途の例は、薬剤ターゲットの重要な種類を表す核受容器の活性のモニタである。一般に、核受容器は、それらの配位子が結合すると二量体化し、そして転写を活性化または抑制するDNAに結合する(ツァイ、M. J.およびオマリーB. W.(1994)Annu. Rev. Biochem. 63: 451‐486)。この発明によると、核受容器二量体のサブユニットは、核受容器複合体の結合部を含む二本鎖DNA破片と同様にDTで標識をつけることができる。自然な配位子または合成化合物によるリセプタが活性化すると、三量体のタンパク‐DNA複合体が形成され、DTはその近くに導かれ、DT1の活性化は、付随物の形成、したがってリセプタの活性化を示すDT3からの信号を生じる。代替的に、リセプタを活性化している配位子または化合物は、DTにリンクすることができる。化合物が二量体化を誘発し、したがってリセプタを活性化する場合のみ、DT3からの信号が得られる。リセプタを活性化することのないリセプタ・サブユニットに結合するのみの望まれていない化合物は、それゆえに除外される。分子の相互作用を検出する現行のシステムでは、この区別は可能ではない。
【0094】
一般に本発明の本実施例は、複合体分子の付随物上での形成に対する単純な答えが望まれ、部分的に形成された付随物についての情報は重要でない場合、有用である。この実施例および次の実施例の多くの用途が重複し、そのシステムが特定の用途の複雑度の必要とされたレベル次第で選択される。
【0095】
上記の分子の相互作用の状況は、数多くの細胞機能性において重要な役割を果たし、例に記載されるものだけに限られないことは、当業者に明らかである。
(iii) 複合体分子の付随物のための検出システム‐‘組合せ’アッセイ。
【0096】
もう一つの実施例では、DT1の発光スペクトルは、DT2およびDT3の励起スペクトルと十分に重なり、一方で、DT3の励起スペクトルもまた十分にDT2の発光スペクトルと重なる。したがって、DT1‐DT2、DT1‐DT3およびDT2‐DT3は、すべて適切なRET対(図3および表2)を形成する。前述の実施例とは対照的に、本実施例における検出は、適切な基質またはエネルギ源によってDT1を順番に活性化し、DT1、DT2およびDT3の発光を検出し、そして、適切なエネルギ源によりDT2を活性化し、DT2およびDT3の発光を検出することによって発生する。代替的に、RETが発生する場合、DT3はDT1およびDT2の減少した信号において生じる非蛍光性失活剤であってもよい。個別の信号の不在、存在または強度の組み合わされた表示は、複合体分子の付随物(表2)の組成物上の正確な情報を提供する。
【0097】
短い一本鎖のオリゴヌクレオチドにすべて連結される3つの蛍光部分を含むFRETシステムは、最近報告された(トン他(2001)J. Am. Chem. Soc. 123,12923‐12924;米国特許No.6,627,748;ホースティン他(2003)Chemphyschem. 4,745‐748)。それらのDNA分子は、単一の蛍光部分だけから構成されるラベルとは別の新規な蛍光ラベルを有するプローブとして作用する。FRETは、両方の第1および第2のフルオロフォアから、第3のフルオロフォアから得られる信号を増加させる第3のフルオロフォアまで発生する。類似したシステムは、短い二本鎖DNA分子内で配座の変化をモニタするために適用された(リュー他(2002)J. Am. Chem. Soc.124,15208‐15216)。本発明においてしかしながら、一連の活性化および検出イベントと組み合わさられる3つの異なる標識は、これらの従来技術システムによって可能でなかった分子の相互作用の複雑な動的なシステムを分析するために用いられる。
【0098】
適切なDTの例は、DT1としてECFP、DT2としてEYFP、およびDT3としてmRFP1を含む。代替的に、DTのいずれかは、類似したスペクトル特性を有し、互いに適切なRET対を形成する蛍光部分で置換される。上記例においてmRFP1は、Alexaフルーア555によって置換され、ECFPおよびEYFPと連動して使われることができる。
【0099】
発明のこの実施例および前述の実施例の用途の一つの例は、サイトカイン受容体信号の分析である。サイトカイン受容体は、それらの配位子の結合によって活性化される場合、薄膜に結び付いたサブユニットのヘテロダイマを形成する。一つのサブユニットは、通常配位子に特定であり、一方で、他方は信号伝達の原因となり、他の配位子‐特定のサブユニットによって共有される。活性化されたリセプタは、信号トランスデューサおよび転写(STAT)タンパクのアクティベータの類の細胞内タンパクと相互作用する(イシハラ他(2002)、Biochim. Biophys. Acta、1592、281‐296)。したがって、サイトカイン受容体信号は、分子を変換する信号のネットワーク、および、多くの重なり合い、冗長な機能性を有するリセプタ分子を含む。特定の効果を特定の分子またはリセプタの動作に帰するのは、多くの場合、難しい。IGは、リセプタが活性化され、二量体化する場合、適切なRET対(DT1‐IG1:IG2‐DT2)を形成しているリセプタ・サブユニットから導かれることができる。
表2
DTとして非蛍光性失活剤、および、適切な基質または励起光によってDTの活性化の予想される信号を含むアッセイ。数はこのDTの増加した信号を示し、ダッシュは他のDTの減少された信号/活性化なしを示す。
【0100】
リセプタによってさらに特定の信号トランスデューサの活性化をモニタするため、第3のIGは信号変換タンパク(IG3‐DT3)から導かれる。この分子が活性化されたリセプタと相互作用する場合、合成したエネルギはDT2からDT3まで伝導され、特定の波長の光はDT3から発し、DT2および/またはDT1からの信号は抑えられる。この信号は、この特定のサイトカイン受容体による特定の経路の活性化のために特定である。同じサイトカイン受容体による他の経路の活性化は、受容体活性化のための信号を生ずるが、特定の信号送信経路ではない。他のサイトカイン受容体経由の同じ経路の活性化は、信号を提供しない。
【0101】
別の例は、ホモまたはヘテロダイマを形成するG‐タンパク被結合リセプタ(GPCR)の分析である。最近の研究は、GPCRはモノマーとして作用するだけでなく、変えられた配位子結合、信号送信およびエンドサイトーシスを生じさせホモおよびヘテロダイマとして作用することを示した(リオス他(2000) Pharmacol. Ther. 92,71‐87)。特定のリセプタの作動体または拮抗体として作用する薬剤の効果は、それゆえにこのリセプタの結合パートナー次第である。特定のリセプタ二量体によって媒介される細胞の反応に、薬剤の効果を制限することは、望ましい。本発明によって提供されるシステムは、特定のGPCR二量体の活性をモニタする。GPCRそれ自体は、IGとして作用し、DT(IG2‐DT2、IG3‐DT3)に付着される。配位子(例えばβ‐アレスチン)が結合すると、GPCRと相互作用する分子から、第3のIG(IG1‐DT1)は導かれる。検出システムは、リセプタ・ヘテロダイマの形成を検出するだけでなく、配位子または薬剤は、リセプタ・ヘテロダイマ、それぞれのホモダイマまたはその組合せを活性化(またはブロック)するかどうかを区別することができる。
【0102】
別の例は、遺伝子形質発現の転写調整である。多重たんぱく質‐DNA複合体において作用する転写因子およびこれらの複合体の組成物は、それらの特異性および活性を決定する(ウォルベルガー他(1999) Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28,29‐56)。例えば、転写因子Fosは、Jun転写因子系統の構成メンバとともにヘテロダイマとして活性するのみである(チネノブ他(2001)、Oncogene、20,2438‐2452)。Fos/Jun二量体は、数多くの遺伝子の転写を活性化または抑制することができる。複合体の特異性および活性は、ETS転写因子、NF‐ATまたはSmadタンパクのような二量体と相互作用している追加的なタンパクによって調整される(ワン他(1994) Mol. Cell Biol. 14,1153‐1159;ストラニック他(1994) J. Biol. Chem. 272,16453‐16465;チャン他(1998) Nature 394,909‐913)。IGは、適切なRET対(DT1‐IG1:IG2‐DT2を形成するDTに付着したFosおよびJunタンパクから導かれることができる。このRET信号は、特定のFos/Jun組合せの機能的な二量体を示す。第3のIGは、Fos/Jun複合体と相互作用している転写調節因子から導かれる。このIGは、IG3がIG1:IG2複合体と相互作用する場合、DT2から伝導される光を発するまたは抑える第3のDT(IG3‐DT3)に付着される。この信号は、タンパクの特定の組合せを含む三量体の複合体の活性のために特定である。他の調節因子との相互作用によるFos/Junの活性化、または、同じ調節因子との異なるFos/Jun複合体の活性化は、異なる信号を生じる。
【0103】
別の例は、新規な抗ウイルス剤の発達である。HIVおよび他のウイルスのための治療の大きな問題は、これまで開発されてきたすべての薬剤に対し段階的に抵抗力をつけるようなウィルスタンパク質の点変異によるウイルスの適応力である。ウイルス性ライフサイクルにおける多数のイベントをターゲットにした治療は、それゆえにより功を奏し、異なる薬剤の混合物、いわゆる併用療法は、広い臨床における広い用途を発見された。有望な、新規な反レトロウイルスの薬剤は、ウイルス侵入機構インヒビターである(スター‐スピア他(2002)Clin. Lab. Med. 22,681‐701)。HIVウイルス粒子の侵入機構は、CD4およびCXCR4またはウイルス菌株次第である2つの細胞レセプタを経て媒介とされる。ウイルス表面が変化すると、ウイルス‐CD4相互作用をブロックしているだけの抗体または薬剤は、迅速にそれらの効率を緩める。本発明によって提供されるシステムは、両方のリセプタに結合するウイルスの同時的な検出を可能にする。2つのリセプタさらにウイルス性表面タンパク質は、三量体の複合体が形成される場合、特定の信号を生じるDTで標識をつけることができる。したがって、両方のリセプタと結合するウィルスタンパク質の配座の変化に必要とされた相互作用または阻害の両方とも効率的にブロックする化合物は、識別することができる。2つの極めて重要な相互作用が同時に目標とされるので、抵抗力のあるウイルスの出現はありそうもない。
【0104】
別の例では、発明は組成物、配座、大きい、安定性のある分子複合体の構築または解離を分析するために用いられる。異なるRET信号の有無は、複合体の構築および機能、または複合体中の配座の変化/動き、または複合体の成分を示す。複合体の例は、転写因子複合体、リボソーム、プロテアソーム、シャペロン、オリゴマー・リセプタ、イオンチャネルなどを含む。
【0105】
概して、高スループット・スクリーニングおよび薬剤発見のために、この種のアッセイは、特定の複数成分分子の付随物の範囲内で、その環境において分子の機能性を抑制または活性化している化合物を発見するために用いることができる。他の付随物内の同じ分子の機能性は、影響を受ける可能性はない。
【0106】
上記の分子の相互作用の状況は、数多くの細胞機能性において重要な役割を果たし、例に記載されるものに限られていないことは当業者に明らかである。
【0107】
本願明細書において使われる用語「発された光を検出する」は、量的方法において特定の波長の光子を検出することができるいかなる検出装置をも参照する。この例は、光電子倍増管またはCCDカメラを含む。検出器は、検出された光を特定の波長または波長の特定の範囲に制限する手段をさらに備える。これは例えば、フィルタ・ホイールまたはフィルタ・スライドまたはモノクロメータに取り付けられたフィルタに適切である。
【0108】
一実施例において、第1のDTはこのDTに特定の励起光によって活性化され、このDTおよび他のDTによって発される光が検出される。それから、第2のDTは活性化され、このDTおよび他のDTの発光は検出などをされる。表2において要約されるように、これらの配列の表示によって提供される組み合わせられた情報は、IG間の集合の情報を提供する。活性化および検出のこの配列は、運動データを得るために時間間隔をおいて反復される。この検出のいかなる時間においても、配列物質は加えられ、または、IGの集合に影響する状態は、変わる。
【0109】
もう一つの実施例では、適切な基質は、第1のDTの活性化のために加えられる。励起光がオフにされる、または、遮断される一方、このDTおよび他のDTの発光は検出される。それから、第2のDTの活性化に特定の励起光はオンにされ、このDTおよび他のDTの発光は検出される。運動データを得るために、光源はそれぞれオフおよびオンにされ、検出モードは発光および蛍光検出の間で絶えず切替えることができる。この検出のいかなる時間においても、配列物質は加えられ、または、IGの集合に影響する状態は、変わる。
【0110】
さらにもう一つの実施例において、第1のDTのために適切な基質が加えられる。励起光がオフにされる、または、遮断される一方、このDTおよび他のDTの発光は検出される。この第1の基質が使い果たされ、第1のDTからの光放射が中断される場合、第2のDTに適切な第2の基質が加えられる。励起光がオフにされる、または、遮断される一方、このDTおよび他のDTの発光は検出される。この検出のいかなる時間においても、配列物質は加えられ、または、IGの集合に影響する状態は、変わる。
【0111】
発明は、次に以下の非制限的な例のみを参照してさらに記載される。しかしながら、以下の例は例証のためのみであって、上記した発明の大部分における制限としての方法とは考えられないと理解されなければならない。特に、発明が特定のタグおよび相互作用している基の用途に関して詳述する一方、本願明細書における結果がこれらのタグまたは相互作用している基に限られていないことは、明確に理解されるべきである。
例1
タンパク性のFRET対の分析
【0112】
この発明のアッセイのため、RETが発生しないように十分に分離されるRET対および他のものを形成するように、十分なスペクトル重複を持つタグを有することは重要である。RETの効率は、フェルスター半径R0によって記載することができる。R0はエネルギ転移が50%有効である距離である。すなわち励起した供給体のFRETによって非活性化する。R0の大きさは、供給体および受容基色素のスペクトル特性に大部分を依存している:
R0=〔8.8×1023*k2*n‐4*QYD*J(ラムダ)〕1/6 oA
【0113】
ここで、k2は双極子方向係数(範囲0から4:2/3はランダムな配向)、QYDは受容基の非存在下で供給体の蛍光量子収率または生物発光タンパクの発光容量、nは屈折率(水は1.33であり、温度、イオン強度次第である)、J(ラムダ)は整数のスペクトル重複である。
【0114】
RETの効率を調整するため、高量子収率および十分なスペクトル重複(すなわち、J(ラムダ)が大きい)を有する色素の選択は、最も重要な可変部分である。この発明のアッセイは生体分子に適切な水の培地において発生し、それゆえに、屈折率nの変異はほとんどない。色素の幾何学的配向、すなわち双極子方向係数k2は、大部分の状態において、ランダムに方位に合わせられた分子のための数値である2/3に近い。これは、DTとして大きな蛍光タンパクの用途が回転の自由を制限するにもかかわらず、標識付けは、付着された相互作用している基と関連する多少自由な色素の回転を可能にする可撓性のリンカーおよびスペーシング基で起こるからである。
【0115】
したがって、既存の蛍光タンパクのスペクトル特性およびこの発明のDTとしてのそれらの用途が検査された。潜在性RETを調査する相互作用のための単純なモデル系として、タンパク性のDTの融合タンパク質は、生成された。これは最も理想的である、永久的な相互作用であり、したがって、RETが発生することができる大きさを定義するのに適する。7‐18アミノ酸の長さを有したリンカーによって、DTサブユニットは分離された。リンカー配列は最大の可撓性のため、大部分はセリンおよびグリシン残基を含んだ。これは、互いへのサブユニットの自由な回転を可能にし、好ましくない幾何学的配向によるRET信号の減失を妨げた。
【0116】
mRFP1、t‐dimer2 (12)、ECFP、EGFPおよびEYFPの暗号配列は、以下のオリゴヌクレオチド(表3):mRFP1‐fw/re、テンプレート:pRSETB‐mREP1(キャンベル他(2002)PNAS.USA、99、7877‐7882);t‐dimer2 (12):mRFP1‐fw/t dimer2 (12)‐re、テンプレート:pRSETB‐t‐dimer2 (12)(キャンベル他(2002)PNAS.USA、99、7877‐7882;EGFP‐P3‐fw/re、テンプレート:pECFP‐N1(クロンテック);EGFP‐P2‐fw/re、テンプレート:でPCRを経て増幅された:
表3
オリゴヌクレオチド配列
【0117】
pEGFP‐N1 (クロンテック);EGFP‐P2‐fw/re、テンプレートpEYFP‐N1(クロンテック)。図4で概説されるように、生成物の端部は適切な制限酵素によって切断され、ベクターpETDuet‐1にクローンをつくられた。必要であれば、ペプチド・スペーサをコード化して、オリゴヌクレオチド・リンカーは、サブユニットの間で挿入された。これは、以下の構造物を生じた:pET‐mRFP1、pET‐t dimer2 (12)、pET‐ECFP、pET‐EGFP、pET‐EYFP ECFPおよびpET‐t‐dimer2(12)‐12‐ECFP。ここで、サブユニット間の数はリンカー(図4)の長さおよび位置を表す。
【0118】
大腸菌ロゼッタ細胞(ノバジェン)は、これらのプラスミドによって変換され、OD600=0.7に達するまで、100mlの培養液において37℃で成長させた。合計0.5mMのIPTGが加えられ、培養液は朝まで20℃で撹拌器において培養された。細胞は、3500x gで30分間の遠心沈殿法によって集められた。細胞ペレットの半分は、後に使用するため‐80℃で冷凍された。もう半分は、製造業者の説明書にしたがって800μl(マイクロリットル)のBugBuster試薬(ノバジェン)によって溶解された。タンパクは、製造業者の説明書にしたがって300μl(マイクロリットル)のHisMag磁性ビーズ(ノバジェン)を用いてそれらのN末端His‐タグを経た純粋な溶菌液から精製された。タンパクのスペクトル特性は、ケアリー・エクリプス蛍光分光計(バリアン)によって決定された。
【0119】
mRFP1、t‐dimer2 (12)、ECFP、EGFPおよびEYFPのスペクトル特性およびスペクトル重複は、図5において示される。すべてのスペクトルは、それらの最大励起および発光(任意の値‘1’)に標準化された。ECFPおよびEGFPは大きいスペクトル重複を示すが、それらの励起スペクトルの区別はほとんど示さない、一方、mRFP1励起は蛍光発光(図5a)との重複をほとんど有しない。特徴を描写されたFRET対ECFP‐EYFPは、供給体発光および受容基励起間の有意な重複を示す、一方で供給体および受容基励起が十分に分離される。EYFPまたmRFP1励起とよく重なり、EYFPおよびmRFP1は適切なRET対(図5b)を形成することが可能であることを示唆する。発光最大量の大きい分離にもかかわらず、ECFPおよびt‐dimer2 (12)は、驚くほど大きいスペクトル重複を示し、それは、ECFP‐EYFP対(図5c)とは別のスペクトルである発光を有する適切なRET対の潜在性形成を示す。
【0120】
次に、融合タンパク質のサブユニット間のRETが分析された(図6)。EYFP‐12‐ECFPおよびt‐dimer2(12)‐12‐ECFP融合タンパク質は440nmで励起され、発光は460および700nmの間でスキャンされた。同じスキャンは、EYFPおよびt‐dimer2 (12)タンパクで実行された。さらなるスキャンは、融合タンパク質および蛍光タンパク・スペクトルからバックグラウンドとして減じられた空の孔で実行された。供給体フルオロフォアを励起しないより長い波長、すなわち、EYFPには490nm、t‐dimer2 (12)には540nmの励起光を使用して、それらの受容基フルオロフォア発光に標準化した後、EYFPスペクトルをEYFP‐12‐ECFPスペクトルから、t‐dimer2 (12)スペクトルをt‐dimer2(12)‐12‐ECFPスペクトルから減ずることによって、スペクトルは、光源による受容基フルオロフォアの直接の励起のための光放射のためにさらに修正された。最後に、修正されたFRETスペクトルは、データ(図6)の比較を可能にするため、最大発光が480nmのECFPで任意の値‘1’に標準化された。有意なFRET信号は、受容基フルオロフォアとしてEYFPおよびt‐dimer2 (12)の両方で観察された。物理的に供給体DTにより近いために1つの蛍光基のみがRET信号にかなり関与する一方、t‐dimer2 (12)蛍光タンパクは、直接の励起バックグラウンド信号を2倍にする2つの蛍光基を効果的に含むのでこのことは注目に値する。それゆえに、t‐dimer2 (12)としての類似したスペクトル特性を有する純種の単量体の蛍光タンパクまたは非タンパクのフルオロフォアを用いて、検出システムはさらに改良することができた。
例2
タンパク性のBRET対の分析
【0121】
DTとしての生物発光タンパクの使用は、発光に十分なスペクトル重複をもつ蛍光DTを必要とする。生物発光タンパクDTとしてウミシイタケ・ルシフェラーゼ(Rluc)、タンパク性のDT EGFP、EYFP、t‐dimer2 (12)およびmRFP1の間のRETへの潜在性が調査された。また、相互作用のための単純なモデル系として、Rlucおよびタンパク性のDT間の融合タンパク質は、生成された。
【0122】
Rlucのための遺伝子は、以下のオリゴ、Rluc‐P3‐fw/re、テンプレートphRL‐CMV(プロメガ)でPCRを経て増幅された:適切な制限酵素を使用して、PCR生成物は例1からのベクターにクローンをつくられ、構造物pET‐Rluc、pET‐EGFP‐15‐Rluc、pET‐EYFP‐7 Rluc、pET‐t‐dimer2(12)‐15‐RlucおよびpET‐mRFP1‐15‐Rlucを生じる。ここで、サブユニット間の数がリンカー(図4)の長さおよび位置を表す。
【0123】
実施例1にて説明されたように、タンパクは大腸菌ロゼッタ細胞において発現され、精製された。発光スペクトルは、Rluc(図7)のための基質としての5μMのコエレンテラジンhを加えた後、ケアリー・エクリプス発光分光計(バリアン)によって記録された。スペクトルは、それらの発光最大量(任意の数値‘1’)に標準化された。Rlucと比較して発生している追加的なピークは、RETによるものであり、すべての受容基DTと共に観察された。
【0124】
スペクトルから、RET比率(RR)は、RET(図8)のための度量衡単位として算出された。RET比率はまた距離の指標であり、DT間の配向である。比率は、次のように算出された:
【0125】
発光ピークは、この範囲内で発光数値を加えることによって、DTの発光最大量に適用される10‐20nmのウインドウにおいて一体化された。
【0126】
黄色および赤色のチャネルの単純なRET比率(RR)は、算出された:
RRY=yellow/blue
RRR=red/blue
ここで、青色はRluc発光ピーク下のピーク面積であり、黄色はEGFPまたはEYFP発光ピーク下のピーク面積であり、赤色はt‐dimer2 (12)またはmRFP1発光ピーク下のピーク面積である。スペクトルが集積化の前に第1の(供給体)DT発光最大量に標準化される場合、受容基DT下のピーク面積の値、および、RET比率は、相関的な関係における用語の同一の結果を提供する。
【0127】
標準化されたRET比率(RRnorm)は、エネルギ供給体のみによって得られた信号のために修正された比率である。
RRYnorm=RRY‐RRY0;RRY0=yellow0/blue0
RRRnorm=RRR‐RRR0;RRR0=red0/blue0
ここで、blue0、yellow0、および、red0は、相互作用がない場合、第1の(供給体)DTおよび他のDTを有するRETの同等のピーク下の領域である。
【0128】
結果(図8)は、標準EYFP受容基DTより良好な信号対雑音比を達成する一方、t‐dimer2 (12)発光は、EGFPまたはEYFP発光のいずれからも驚くべきことによく区別されることを示した。EGFPおよびEYFPは、t‐dimer2 (12)およびmRFP1と同様に、明確に分離することができず、それぞれのチャネル間で有意な‘漏出現象’を示した。mRFP1発光がEGFPから100ナノメートル分離されたにもかかわらず、Rlucが本質的にmRFP1を活性化することができず、結果として、弱い赤い蛍光信号のみが検出されるので、信号分離はそれでも欠陥があった。
例3
非タンパク性のBRET対の分析
【0129】
DTの選択は、タンパク性の分子に制限されない。スペクトル特性のより広い範囲で利用でき、それらの小型サイズにより付着された相互作用している基の機能性を妨害する可能性が減るので、DTとして小型蛍光分子が多くの用途のための利点に提供する。生物相互作用のためのモデル系として、ビオチン基に対するタンパク・ストレプトアビジンの強い親和力が使用された。ストレプトアビジンは、多くの異なる小型分子蛍光色素を有する結合体として利用できる。
【0130】
ATPがある場合には、‘大腸菌酵素ビオチン・リガーゼ(birA)が、‘avitag’と呼ばれる特定の13‐アミノ酸ペプチド配列のリジン残基に対するビオチン基の付着の媒介となる(シャッツ(1993)Bio/Technology、11,1138‐1143)。avitagの暗号配列は、交雑されたオリゴヌクレオチドAvitagN‐fw/re(表3)からなるリンカーとして、構造物pET‐Rlucに挿入された。リンカーは、この構造物の位置1(図4)にクローンをつくられた。ビオチン・リガーゼのための暗号配列は、テンプレートとして大腸菌Top10株を使用してオリゴヌクレオチドbirA‐fw/reによって増幅された。birA遺伝子は、標的配列の量的ビオチン化のためにビオチン・リガーゼを共発現するため、構造物(図4)の位置4にクローンをつくられた。ビオチニル化されたRlucタンパクの発現のために生じた構造物は、pET‐Avi‐15‐Rluc/birAと呼ばれた。
【0131】
例1にて説明されたように、タンパクは大腸菌ロゼッタ細胞において発現され、精製された。タンパクのはっきりしない相互作用を妨げるため、ビオチン‐Rlucタンパク溶液にBSAが2mg/mlの終末濃度に加えられた。ストレプトアビジン結合体のほぼ等モル量が溶液に加えられ、Rluc(図9)のための基質としての5コエレンテラジンhの添加の後、ケアリー・エクリプス(バリアン)発光分光計で発光スペクトルが記録された。スペクトルは、それらの発光最大量(任意の値‘1’)に標準化された。
【0132】
すべての小型蛍光色素はDTとして適切であり、基質コエレンテラジンh(図9)がある場合には、RET信号を生じた。Alexaフルーア488は、Rluc発光との最大のスペクトル重複を有して、したがって最も高いRET信号を示した。驚くことに、しかしながら使用されるスペクトルで最も遠い色素であるAlexaフルーア594は、類似したまたは、スペクトルでより重なり合う色素Alexaフルーア555およびAlexaフルーア568よりも大きなRET信号を生じた。非ビオチニル化されたRlucが逆制御として使われ、類似した濃縮のストレプトアビジン結合体がある場合にはRET信号を生じず、ビオチン‐ストレプトアビジン・モデル相互作用の特異性を確認した。
【0133】
この発明のアッセイの重要な側面は、それらが量的および感受性がある度量衡単位を生物相互作用に提供するということである。ストレプトアビジン結合体の系列希釈は、ビオチニル化されたRlucさらに2mg/mlのBSAによって培養された。5 μMのコエレンテラジンhを加えた後、発光スペクトルは記録され、RET比率は、それぞれの色素の発光最大量の集積化範囲を調整して実施例2からの方程式を使用して算出された。図10は、オレゴングリーンおよびAlexaフルーア594の両方の結合体を示し、ストレプトアビジン結合体濃度に関連づけられるRET比率は検出システムが量的度量衡単位を相互作用に提供したことを証明する。Rluc発光との小さいスペクトル重複にもかかわらず、Alexaフルーア594は、ビオチン‐ストレプトアビジン相互作用を検出する際、より多く重なり合うオレゴングリーンと同じように感受性があることはまた注目に値した。
例4
同時的な複合RET検出
【0134】
本発明によれば多数の生物相互作用が同時にかつ量的方法で(‘多重化で’)検出することができる。この可能性を調査するため、実施例2および3において使用されたモデル系は、それらの多重化能力を検査された。
【0135】
例2において、タンパク性のDT、EGFPおよびt‐dimer2 (12)は、それらの発光最大量間の十分なスペクトル解像度のために、多重の組合せの潜在性DTと確認された。EGFP‐15‐Rlucおよびt‐dimer2(12)‐15‐Rluc融合タンパク質の濃度は、類似した濃度に調整された。タンパク溶液は、段階を追って5:0、4:1・・・1:4、0:5の比率で混合された。Rluc基質コエレンテラジンhは5μMの終末濃度に加えられ、発光スペクトルは記録された。RET比率は算出され、2つのチャネル(図11a)のより容易な比較のため、最高値(任意の値‘1’)に標準化された。
【0136】
多重検出は、ビオチン‐ストレプトアビジン相互作用モデルを使用して、さらに検査された。ビオチニル化されたRlucさらに2mg/mlのBSAは、一つのチューブで等モル量のストレプトアビジン‐オレゴングリーン、分離したチューブでストレプトアビジン‐Alexaフルーア594と混合された。溶液は、5:0、4:1・・・1:4、0:5の比率で段階を追って混合された。Rluc基質コエレンテラジンhは5μMの終末濃度に加えられ、発光スペクトルは記録された。RET比率は算出され、2つのチャネル(図11b)のより容易な比較のため、最高値(任意の値‘1’)に標準化された。
【0137】
両方の実験において、正確な多重化が達成された:両方のチャネルの信号は独立して検出され、異なる複合体および混合物内で相互作用に関する正確な情報を提供した。
【0138】
要約すると、この例は、本発明が様々な用途および実施例の生物相互作用の多重検出を可能にすることを証明する。これは、使用するモデルから独立し、かつ、DTの性質から独立していることを示した。
例5
哺乳動物細胞の多重検出(1)
【0139】
Gタンパク被結合リセプタ(GPCRs)の機能性の重要な側面は、ホモ二量体型複合体を形成するそれらの能力である。この例では、本発明のアッセイ・システムは、複数リセプタ‐リセプタ相互作用を検出するために検査された。リセプタが膜タンパク質であるので、それらの機能的な抽出および精製は、しばしば困難または不可能である。それゆえに、この発明のアッセイ・システムがまた、生体の哺乳動物細胞において使われた。
【0140】
オリゴヌクレオチドMCS‐linker‐fwおよびMCS‐linker‐re(表3)は交雑され、プラスミドpcDNA3.1(‐)(インビトロジェン)のNheIおよびXhoI制限サイトにクローンをつくり、ベクターpcDNA‐MCSを生じる結果になった。リンカーは、翻訳開始部位およびオープンリーディングフレームの始まりと同様に、タンパクの高度発現に最適なコザック配列を提供した。
【0141】
実施例1にて説明したように、蛍光タンパクECFP、EYFPおよびt‐dimer2 (12)をコード化している相補DNAは、オリゴ EGFP‐P1‐fw/ECFP‐P3‐rc(EGFPまたはEYFP)およびmRFP‐fw/t‐dimer2(12)‐P3‐re(t‐dimer2(12))を使用して、PCRによって増幅された。PCR生成物は、ベクターpcDNA‐MCS‐ECFP、pcDNA‐MCS‐EYFP、pcDNA‐t‐dimer2 (12)を生じているプラスミドpcDNA‐MCSにクローンをつくられ、各々は哺乳動物細胞の蛍光タンパクを発現することができる。CCR2リセプタをコード化している相補DNAは、オリゴCCR2‐fw/CCR2‐reを用いてPCRによって増幅された。相補DNAテンプレートは、ガスリー研究所(米国)で得られた。PCR生成物は、蛍光タンパクを有するリセプタのC末端融解の発現構造物を組み立てるため、プラスミドpcDNA‐MCS‐ECFP、pcDNA‐MCS‐EYFPおよびpcDNA‐MCS‐t‐dimer2 (12)へ蛍光タンパク5’のクローンをつくられた。TRHR GPCRは、制限酵素Hind IIIおよびNotIを使用して、pcDNA3‐TRHR/Rlucベクターから切除された(クルーガー他(2001)J. Biol. Chem., 276:12736‐12741))。この破片は、pcDNA‐MCS‐ECFP、pcDNA‐MCE‐EYFPおよびpcDNA‐MCS‐t‐dimer2 (12)ベクターにクローンをつくられた。結果として生じた最終のプラスミドは、pcDNA‐CCR2 ECFP、pcDNA‐CCR2 EYFP、pcDNA‐CCR2‐t‐dimer2 (12)、pcDNA‐TRHR ECFP、pcDNA‐TRHR EYFP、pcDNA‐TRHR‐t‐dimer2 (12)と名付けられた。
【0142】
粘着性の哺乳動物細胞系Cos‐7 細胞は、リセプタ融解構造物を発現するために用いられた。細胞は、標準培養条件の下で約60%の合流密度に成長された。細胞は、製造業者の手順によってGenejuice(ノバジェン)トランスフェクション試薬を用いて、1つまたはいくつかの発現ベクトル組合せによってトランスフェクションされた。標準培養条件下での2日のインキュベーション後、細胞はトリプシン処理され、細胞懸濁液の濃度はPBSにおいて約50000の細胞に調整された。
【0143】
これらの細胞懸濁液は、バリアン・エクリプス蛍光分光計(バリアン)を用いて蛍光分光学法によって分析された。サンプルはECFPの励起最大量の440nmで励起され、蛍光発光は、460および700nmの間で記録された。受容基フルオロフォア(EYFPまたはt‐dimer2(12))の直接の励起のための発光は、実施例1にて説明されたように、スペクトルから減じられた。修正スペクトルは、ECFP(任意の値‘1’)の発光最大量に、さらに標準化され、リセプタ‐ECFP融合タンパク質(図12)のみを発現するサンプルに比較された。ホモダイマ形成は、両方のRET対によって両方のリセプタのために検出された。ホモダイマ形成は、個別にまたは同時に検出することができた(図12b)。
【0144】
結果を数量化するため、例2にて説明されたように、スペクトルは一体化され、受容基ピークのピーク面積は算出された。図13は、黄色および赤色のチャネルが多重システムのために必要に応じて独立して検出することができることを示す。それは、TRHRホモダイマ複合体の範囲内で、相互作用はより強い、または、DTはCCR2複合体と比較してより良好な配向に配置されることをさらに示す。より弱い相互作用にもかかわらず、CCR2ホモダイマ相互作用は、RET受容基(図13a)として、EYFPまたはt‐dimer2 (12)を使用することにより容易に検出された。2つのホモダイマ相互作用が同時に検出された場合、絶対的な信号は各々の個別的な信号より低いが、バックグラウンド信号(図13b)よりは上であった。これは、3倍対二重共トランスフェクション細胞のより低い数において生じるここで使用される一時的なトランスフェクション・システムのためであった。
【0145】
要約すると、この例は、本発明に記載される検出システムが、生体哺乳動物細胞における膜タンパク質中の相互作用の量的、複合検出のために有用なアッセイを提供することを証明する。生体細胞の代わりに、薄膜調製または膜分画が膜タンパク質の分析のために使われることができるのは明らかである。
例6
哺乳動物細胞の多重検出(2)
【0146】
細胞信号は、薄膜に結合した細胞表面リセプタと細胞質のタンパクの相互作用を含む。GPCRのため、細胞質のタンパクβ‐アレスチンン‐2との相互作用は、配位子による活性化の後、リセプタ除感作およびインターナリゼーションのための重要な役割を果たす。この例では、異なるリセプタの活性化は、リセプタβ‐アレスチンン‐2相互作用を検出するために多重アッセイ・システムにおいて検査された。これは、β‐アレスチンン‐2と相互作用するため、配位子結合後、リセプタが細胞キナーゼによって修正されなければならないので生体哺乳動物細胞において実行された。また、機能的な薄膜結合リセプタの単離は達成するのが困難である。
【0147】
Rluc(Rluc‐Barr2)に融合するN‐末端のウシ属のβ‐アレスチンン‐2の発現のための構造物は、Barr2‐fwおよびBarr2‐reプライマを用いてPCRによってウシ属のβ‐アレスチンン‐2の暗号配列の増幅によって構成された。(テンプレート:pcDNA3(インビトロジェン)のウシ属のβ‐アレスチンン‐2を含む構造物。)使用された5’および3’のプライマは、制限酵素部位EcoRVおよびNotIをそれぞれ含有した。Rlucのための暗号配列を含む第2のPCR生成物は、テンプレートとしてプラスミドpRL‐CMV(Promega)を使用して、プライマRluc‐fwおよびRluc‐reでRluc相補DNA配列を増幅されて生成された。この第2のPCR生成物は、5’および3’末端でHindIIおよびEcoRV制限部位をそれぞれ含有した。両方のPCR生成物は、それからpcDNA3(インビトロジェン)のHindIII/NotI部位に、一緒にクローンをつくられた。Rluc‐β‐アレスチンン‐2融合タンパク質の哺乳動物発現のために生じたプラスミドは、pcDNA‐Rluc Barr2と名付けられた。
【0148】
哺乳類の細胞系Co‐7は、pcDNA‐Rluc Barr2、pcDNA‐TRHR EYFPおよびpcDNA‐CCR2‐t‐dimer2 (12)、または、pcDNA‐Rluc‐Barr2、pcDNA‐TRHR‐t‐dimer2 (12)およびpcDNA‐CCR2 EYFPの3つのプラスミドによって同時にトランスフェクションされた。トランスフェクションは、製造業者の指示にしたがってGenejuice(ノバジェン)を使用して実行された。トランスフェクション後、細胞は標準状態の下で2日培養された。細胞はそれからトリプシン処理され、PBSの細胞懸濁液は50μlに50000の細胞の濃度に調整された。
【0149】
配位子または配位子の組合せは、TRHには1μMの終末濃度、MCP1には0.1μM、TRHRおよびCCR2リセプタのための固有の配位子がそれぞれサンプルに加えられた。配位子の添加の後、細胞はβ‐アレスチンン‐2リセプタ相互作用の発生が可能になるように10分間、37℃で培養された。コエレンテラジンh(分子プローブ)が5μMの終末濃度にサンプルへ加えられた後、バリアン・エクリプス蛍光分光計(バリアン)は400‐700nm の間の範囲の発光スペクトルを記録するために用いられた。
【0150】
発光スペクトルは、リセプタおよびその配位子(図14)にしたがい、またはそれに選択的な特定のβ‐アレスチンン‐2リセプタ相互作用を示した。両方の配位子が加えられる場合、両方のリセプタはβ‐アレスチンン‐2と関連し、両方のリセプタの同時的な活性化を示す。この結果は、標識がいずれのリセプタのいずれに付けられるかとは独立していて、EYFPおよびt‐dimer2 (12)を交換しても本質的に同じ結果(図14)を生じた。
【0151】
スペクトルはEYFPのピーク面積を一体化することによってさらに分析され、t‐dimer2 (12)発光は例2にて説明したように、ピークに達する。ピーク面積は、配位子(図15)の存在を明確に表し、TRHRおよびβ‐アレスチンン‐2間の相互作用がより強い、またはCCR2とのそれより良好な配向にあることをさらに示した。多重検出システムのために必要とされているように、両方の相互作用の独立した検出は達成された。
【0152】
全体に、この例は、動的な、誘導できるシステムにおける異なるタンパク‐タンパク相互作用の多重検出を証明する。関係するタンパクは薄膜に結合したリセプタから細胞質のタンパクまで変動し、検出は生体の哺乳動物細胞において発生することができる。
例7
分子の付随物の簡略化された検出
【0153】
中間体または他の部分的な付随物に関係なく、特定の複合体分子の付随物が形成される場合のみに信号を生じる単純な検出システムは、いくつかの用途のためにきわめて有用である。3つの成分の付随物内の相互作用のためのモデルとして3つのDTの融合タンパク質が分析された。
【0154】
EGFPおよびRlucの暗号配列は、以下のオリゴヌクレオチド(表3)でPCRを経て増幅された:EGFP‐P2‐fw/re、テンプレート:pEGFP‐N1(クロンテック);Rluc‐P3‐fw/re、テンプレートphRL‐CMV(プロメガ)。生成物の端部は適切な制限酵素によって切断され、サブユニット間のペプチド・スペーサをコード化して、オリゴヌクレオチド・リンカーと共にベクターpET‐mRFP1にクローンをつくられる。これは、以下の構造物を生じる結果になった:PET‐MRFP1、PET‐MRFP1 12‐EGFPおよびpET‐mRFP1‐12‐EGFP‐Rluc(図4)。タンパクは、実施例1にて説明されたように、大腸菌ロゼッタ細胞において発現され、精製された。
【0155】
EGFPおよびmRFP1間のFRETは、480nmの光でmRFP1‐12‐EGFP‐Rluc融合タンパク質を励起することによって分析された。実施例1(図16a)にて説明されたように、直接の励起が減じられたので、FRET信号は、mRFP1発光の後検出された。次に、mRFP1‐12‐EGFP‐Rlucの発光スペクトルは、5μMのコエレンテラジンh(図16b)の添加の後、記録された。Rlucは、600‐650nm間の赤色の蛍光の増加した活性化と同様、510nmで緑色の蛍光の活性化で生じるmRFP1を交替で活性化するEGFPを活性化した。EGFPサブユニットを含まないmRFP1‐15‐Rluc構造物と比較して、観察されたmRFP1蛍光発光は、より高かった。
【0156】
総合すれば、これらの結果は、Rluc(DT1)が活性化すると、付随物内に同時にEGFP(DT2)が存在し、三量体の複合体の形成を示す場合、増加したmRFP1(DT3)発光が検出されることを証明する。
例8
複合体分子の付随物の相互作用
【0157】
2つ以上の成分を含む複合体分子の付随物の分析は、付随物内での成分の可能な組合せのための異なった信号を生ずる検出システムを必要とする。3つの成分の付随物内の相互作用のための第1のモデルとして、3つのDTの融合タンパク質が分析された。
【0158】
ECFPEおよびEYFPの暗号配列は、以下のオリゴヌクレオチド(表3)でPCRを経て増幅された:EGFP‐P2‐fw/re、テンプレート:pEGFP‐N1(クロンテック);EGFP‐P2‐fw/re, template: pEYFP‐N1 (クロンテック)。生成物の端部は適切な制限酵素によって切断され、サブユニット間のペプチド・スペーサをコード化して、オリゴヌクレオチド・リンカーと共にベクターpET‐mRFP1にクローンをつくられる。これは、以下の構造物を生じる結果になった:pET‐mRFP1‐12‐EYFP, pET‐mRFP1‐15‐ECFP and pET‐ mRFP1‐12‐EYFP‐ECFP (図4)。タンパクは、実施例1にて説明されたように、大腸菌ロゼッタ細胞において発現され、精製された。
【0159】
440nmでのmRFP‐12‐EYFP‐ECFP構造物の励起は、RET(図17a)のためにEYFPおよびmRFP1と同様にECFPからの発光において生じた。mRFP1‐15‐ECFP構成物を用いてEYFPの非存在下で、RETもECFPからmRFP1まで発生した。付随物においてECFPの存在なしでは、EYFPおよびmRFP1は、440nm励起光(図17a)によって、有意に活性化されなかった。励起光を490nmに変え、活性化されたEYFPおよび生じたRETを構造物mRFP1‐12‐EYFPおよびmRFP1‐12‐EYFP‐ECFPにおいてmRFP1に変え、一方でmRFP1およびmRFP1‐15‐ECFP(図17b)で観察されたように、mRFP1はEYFPの非存在下で有意に活性化されなかった。したがって、DT1(ECFP)およびDT2(EYFP)の一連の活性化、および、すべてのDTの発光の検出は、分子付随物の組成物上の正確な情報を提供した。
【0160】
分子の複合体のための第2のモデル系として、タンパク融解の組合せと関連し、ビオチンおよびストレプトアビジン間の高い親和力相互作用が分析された。
【0161】
例3に類似して、avitagの暗号配列は、交雑されたオリゴヌクレオチドAvitagN‐fw/re(表3)からなるリンカーとして、構造物pET‐EYFP‐ECFPに挿入された。リンカーは、この構造物の位置1(図4)にクローンをつくられた。ビオチン・リガーゼのための暗号配列は、テンプレートとして大腸菌Top10を用いてオリゴヌクレオチドbirA‐fw/reで増幅された。birA遺伝子は、標的タンパク質に付いたavitagペプチド配列の量的ビオチン化のためのビオチン・リガーゼを共発現するため、構造物(図4)の位置4にクローンをつくられた。ビオチニル化されたEYFP‐ECFP融合タンパク質の発現のために生じた構造物は、pET‐Avi‐EYFP‐ECFP/birAと呼ばれる。タンパクは、実施例1にて説明されたように、大腸菌ロゼッタ細胞において発現され、精製された。
【0162】
Alexaフルーア555およびAlexaフルーア568の結合体は、それらの励起スペクトルとしてDT3sがEYFPおよびECFP(図18a)の発光スペクトルとよく重なるように、検査された。ビオチニル化されたEYFP‐ECFP融合タンパク質は、大体同等の量蛍光接合されたストレプトアビジンと混合された。制御として、ストレプトアビジン結合体の添加前にビオチニル化されたEYFP‐ECFPタンパクは、共役でない、非蛍光ストレプトアビジンで前もって培養された。したがって、融合タンパク質および蛍光ストレプトアビジン間の相互作用は、ブロックされた。混合物は440nmで励起され、蛍光発光はスキャンされた。RETは、EYFPからECFPに、さらにAlexaフルーア555またはAlexaフルーア568(図d)に観察された。色素の直接の励起による光源によって、制御反作用においてAlexaフルーア555の色素からいくつかの発光が存在した。この発光は、しかしながらAlexaフルーア555‐ストレプトアビジン:EYFP‐ECFP付随物からの発光より有意に小さかった。励起光に対するより大きなスペクトル距離のため、Alexaフルーア568の色素の直接の励起は観察されなかった。同じサンプルが490nmで励起された場合、色素‐ストレプトアビジン:EYFP‐ECFP相互作用が抑制された(図e)時に部分的に(Alexaフルーア555)または完全に(Alexaフルーア568)遮断するEYFPおよびAlexaフルーア555またはAlexaフルーア568間のRETが観察された。
【0163】
次に、RET比率が図18のb‐eのスペクトルから算出された。比率は、検出システムが分子の付随物内で正確に相互作用を決定するというさらなる証拠を提供した。Alexa Fluor‐streptavidinのためのRET比率:EYFP‐ECFP複合体は、この相互作用がブロックされた(図19)場合の制御よりも有意に高かった。これは、EYFPおよびAlexaフルーア(490nmの励起)間のRETと同様にECFPおよびAlexaフルーア(440nmの励起)間のRETに観察された。Alexaフルーア555によって得られる比率は、Alexaフルーア568での比率と比較してより高かった。しかしながら、より大きなスペクトル分離、したがってより低いバックグラウンド信号によりダイナミックレンジおよび信号対雑音比は、Alexaフルーア568においてはより良好であった。
【0164】
総合すれば、この例は、DT1およびDT2の一連の励起、および、DT1、DT2およびDT3またはDT2およびDT3のそれぞれの光放射の検出と結合する3つの適切なDTは、複合体分子の付随物の組成物の正確な検出のためのシステムを表すことを証明する。
例9
哺乳動物細胞の複合体分子の付随物の検出
【0165】
Gタンパク被結合リセプタ(GPCR)の機能の重要な側面は、ホモおよびヘテロ・オリゴマー複合体を形成するそれらの能力である(例えば、クルーガー他(2003)Frontiers Neuroendocrinol., 24: 254‐278参照)。この例では、本発明のアッセイ・システムは、リセプタ‐リセプタ複合体の様々な組合せを検出するために検査された。この複合体の形成および次の検出は、生体の哺乳動物細胞の薄膜において発生した。
【0166】
蛍光タンパクmRFP1をコード化している相補DNAは、例1にて説明されたように、オリゴmRFP1‐fw/mRFP1‐P3‐reを使用してPCRによって増幅された。PCR生成物は、哺乳動物細胞の蛍光タンパクを発現するためにできたベクターにおいて生じたプラスミドpcDNA‐MCS(例5)にクローンをつくられた。mRFP1でCCR2リセプタのC末端融解の発現構成物を組み立てるため、CCR2相補DNA配列(例5)を含むPCR生成物はmRFP1の5’でプラスミドpcDNA‐MCS‐mRFP1にクローンをつくった。生じている最終的なプラスミドは、pcDNA‐CCR2 mRFP1と名付けられた。加えて、実施例5からのプラスミドpcDNA‐CCR2‐ECFPおよびpcDNA‐CCR2 EYFPが、ここで使われた。
【0167】
Co‐7細胞は、製造業者の手順に従い、例5に記載されたように、Genejuice(ノバジェン)トランスフェクション試薬を使用して発現ベクトルの1つまたは組合せによってトランスフェクションされた。標準培養条件下の2日の培養後、細胞はトリプシン処理され、細胞懸濁液の濃度は50μlの PBSにおいて約50000の細胞になるように調整された。
【0168】
これらの細胞懸濁液は、バリアン・エクリプス蛍光分光計(バリアン)を用いて蛍光分光学法によって分析された。まず、サンプルは440nmで励起され、ECFPの励起最大量および蛍光発光は460および700nm間で記録された。それから、励起波長は490nmに変えられ、EYFPの励起最大量および蛍光発光は500および700nm間で記録された。実施例1にて説明されたように、すべてのスペクトルは光源による受容基フルオロフォアの直接励起のために修正された。スペクトルは、それらの発光最大量(任意の値‘1’)(図20a(b))に、さらに標準化された。これらのスペクトルは、また、実施例2(図20c)にて説明したように、それぞれの発光ピーク面積の集積化によって数量化された。
【0169】
RETは、ECFP‐EYFPおよびECFP‐mRFP1の間で観察されたが、発光ピークの増加によって示されたように、mRFP1はまたこの実験におけるEYFPの適切なエネルギ受容基であった。これは、また、バックグラウンド制御より上の信号増加を示すそれぞれのピーク領域の集積化によって確認された。したがって、システムは正確にすべての可能な二量体リセプタ複合体を検出することが可能であった:CCR2‐ECFP/CCR2 EYFP、CCR2‐ECFP/CCR2‐mRFP1およびCCR2‐EYFP/CCR2/mRFP1。
【0170】
これは、実施例4‐6で図示される多重検出システムおよび実施例7に記載される単純な検出システムと異なり、前者は多数の相互作用を同時に検出し、後者は特に同時にすべての成分を含む複合体を同時に検出する。ここ(例8+9)で証明されたように、どちらもすべての起こりうる対の集合を検出することができない。
【0171】
要約すると、この例は、本発明が生体哺乳動物細胞における動的な、合成された分子集合を検出することができるシステムを提供することを証明する。これは、評判のとおり分析するのが困難である薄膜に結び付いたタンパク含むことができるが、明らかにそれに制限されることはない。
【図面の簡単な説明】
【0172】
【図1】複合相互作用アッセイの基礎をなしている原理を示す。
【0173】
【図2】分子の複合体が関連する簡略化された検出システムを示す。DT1およびDT2が両方とも付随物に含まれる場合、DT3からの信号が検出されるだけである。
【0174】
【図3】分子の複合体が関連する検出システムの原理を示す。DT2がまたDT3のエネルギ供給体である一方で、DT1はDT2およびDT3のためのエネルギ供給体である。DT2およびDT3またはDT3からの発光を検出する一方で、DT1およびDT2の一連の励起はそれぞれ、付随物の動的な組成物上の情報を生ずる。
【0175】
【図4】融合タンパク質の構成を示し、pETDuet‐1(ノバジェン)の多回クローニングサイトの概略図である。PCR生成物は、4つの異なる部位へクローンをつくられたインフレームである。12‐or 18‐アミノ酸スペーサのためのオリゴヌクレオチド・リンカー符号化は、サブユニット1および2の間で挿入することができる。ベクターの多回クローニングサイトによってコード化されるオープンリーディングフレームは、サブユニット1および3間の15‐アミノ酸スペーサおよびサブユニット2および3間の7‐アミノ酸スペーサを備える。
【0176】
【図5】タンパク性のDTのスペクトル特性を示す。ECFP、EGFPおよびmRFP1 (a)の蛍光スペクトルは、ECFPおよびEGFP間の大きいスペクトル重複およびECFPおよびmRFP1間のいくつかの重複を示した。有意なスペクトル重複が、ECFPおよびEYFP、さらにはEYFPおよびmRFP1(b)の間にあった。ECFP発光は、驚くほど都合よくt‐dimer2 (12)励起(c)と重なった。
【0177】
【図6】タンパク性のDT間のFRETを示す。440nmで励起された場合、EYFP‐12‐ECFP (a)およびt‐dimer2 (12)‐12‐ECFP(b)融合タンパク質は、共振エネルギ転移のために追加的な光を発した。スペクトルは供給体発光最高に標準化され、光源による受容基フルオロフォアの直接の励起からの発光は減じられた。
【0178】
【図7】ウミシイタケ・ルシフェラーゼ(Rluc)、生物発光タンパクおよびタンパク性のDT間のRETを示す:(a) DTなし;(b)EGFP;(c) EYFP;(d)t‐dimer2 (12)および(e)mRFP1。スペクトルは、発光最大まで標準化された。
【0179】
【図8】様々な融合タンパク質のためのRET比率を示す。示されているのはEGFPおよびEYFPチャネル(a)およびt‐dimer2 (12)およびmRFP1チャネル(b)のための比率である。良好な分離は、EGFP‐t‐dimer2 (12)およびEYFP‐t‐dimer2 (12)の間で達成された、一方、EGFP‐EYFPおよびt‐dimer2(12)‐mRFP1は、独立した、同時的な検出のためにはあまりにも近接している。mRFP1が都合よくEGFPおよびEYFPから分離されたにもかかわらず、それは、弱いRET信号だけにおいて生じるRlucにより本質的に活性化されなかった。
【0180】
【図9】非タンパク性のDTでのRETの分析を示す。ビオチニル化されたRlucは、様々なストレプトアビジン結合体と混合された。発光スペクトルは黒色において示され、それぞれ、接合される色素の蛍光発光および励起スペクトルは、灰色の立体および破線のラインにおいて示される。以下の結合体が使われた:(a) Alexaフルーア488、(b)オレゴングリーン、(c) Alexaフルーア555、(d)Alexaフルーア568および(e)Alexaフルーア594。逆制御として、非ビオチニル化されたRlucが使用され、RET信号を生じなかった(f)。
【0181】
【図10】非タンパク性のDTの濃度に依存するRET比率を示す。異なる量のストレプトアビジン‐オレゴングリーンまたはストレプトアビジン‐Alexaフルーア594と混合されたビオチニル化されたRlucを含む解法が分析された。濃度は、ストレプトアビジン結合なしで、等モル量のストレプトアビジンおよびビオチン‐Rlucから、ビオチン‐Rlucまで変動した。両方の結合体のために、RET比率は、最も低い濃縮でさえバックグラウンド比率より上であることがわかった。
【0182】
【図11】試験管内の複合浸水検出を示す。EGFP‐15‐Rluc/t‐dimer2 (12)‐15‐Rluc (a)およびストレプトアビジン‐オレゴングリーン/ストレプトアビジン‐Alexaフルーア594(b)の混合物が分析された。両方のモデルにおいて、2つのチャネルは、同時に分析され、独立して数量化することができた。2つのラベルのRET比率は、第1の(供給体)DTが第2のおよび/または第3のDTと相互作用する範囲を表した。
【0183】
【図12】互いにG‐タンパク結合リセプタ(GPCRs)の集合を決定するための細胞ベースのアッセイのスペクトルFRET検出を示す。ECFP、EYFPまたはt‐dimer2 (12)にC‐末端で融合したリセプタを使用して、CCR2リセプタ(a)およびTRHリセプタ(b)間のホモ二量体化は、モニタされた。ホモダイマを形成した両方のリセプタはRETのためにEYFPまたはt‐dimer2 (12)発光の増加によって検出された。両方の信号は、減光装置の連結またはより大きいオリゴマー複合体(b)の形成を表しているすべての3つの融解構造物がある場合には、同時に検出された。スペクトルは、最大480ナノメートルでECFP発光に標準化され、光源による受容基フルオロフォアの直接の励起からの発光は減じられた。
【0184】
【図13】生体哺乳動物細胞のホモダイマ複合体のGPCRs間のFRETの数値解析を示す。EYFPおよびt‐dimer2 (12)のピーク面積は、蛍光発光スペクトル(図12)の集積化によって算出された。ホモダイマ複合体は、受容基DTのいずれかを使用してCCR2 (a)およびTRHR(b)のために検出された。低い同時トランスフェクション効率において生じる一時的なトランスフェクション・システムにより、3つのすべての融解構造物(b)がある場合に得られた絶対停止信号は、それでもバックグラウンドより上ではあるが、低い。CCR2リセプタ間の相互作用がより弱いまたは良好でない配座であっても、それは、容易に検出された。
【0185】
【図14】細胞ベースであって、下流のエフェクタ・タンパクであるβ‐アレスチン‐2と異なるGPCRs間の配位子誘導相互作用の検出のための複合アッセイのスペクトル分析を示す。β‐アレスチン‐2、Rlucに融合するN‐末端は、適切な配位子の添加後、TRHRおよびCCR2と相互作用する。TRHRは、C‐末端でt‐dimer2 (12) (a)に融合するEYFPおよびCCR2であり、その逆も同じ(b)である。TRHの添加、TRHRのために特定の配位子は、TRHRに特定のRETである:β‐アレスチン‐2相互作用である。このリセプタを活性化したMCP1の添加、CCR2のために特定の配位子は、β‐アレスチン‐2と共にそれぞれのRET信号の増加において観察された。両方の配位子の添加により両方のリセプタを活性化させ、β‐アレスチン‐2と相互作用している両方のリセプタを生じ、したがって、2つのRET信号は検出された。
【0186】
【図15】下流のエフェクタ・タンパクであるβ‐アレスチン‐2と異なるGPCRs間の配位子誘導相互作用の検出のための複合アッセイの細胞ベースの数値解析を示す。図14からの発光スペクトルは、EYFPおよびt‐dimer2 (12)ピークのピーク面積を決定するため一体化された。配位子の存在次第で、β‐アレスチン‐2:TRHRおよびβ‐アレスチン‐2:CCR2は、TRHR‐EYFPおよびCCR2‐t‐dimer2 (12) (a)のC‐末端の融解を使用し、またはその逆も同じく(b)独立して検出された。
【0187】
【図16】Rluc、EGFPおよびmRFP1からなる融合タンパク質によって例証される複合体分子の付随物のための簡略化された検出システムを示す。RETは、融合タンパク質が480nm (a)に励起された場合EGFPおよびmRFP1の間で観察された。600‐650nm(b)間のより高い発光によって示されたように、RlucからmRFP1へのエネルギ転移は、EGFPがある場合には、より高かった。
【0188】
【図17】蛍光タンパクの融解によって例証される複合体分子の付随物のための検出システムを示す。ECFPは、EYFPおよびmRFP1 (a)を活性化することが可能であり、EYFPもmRFPl(b)を活性化した。
【0189】
【図18】タンパク性および非タンパク性の、小型分子色素の連結を使用している検出システムを示す。Alexaフルーア555およびAlexaフルーア568の励起スペクトルは、都合よくECFPおよびEYFP (a)の発光スペクトルに重ねられた。このモデル系において、DT1およびDT2は、ECFPのビオチニル化された融合タンパク質および色素に接合されるストレプトアビジンと相互に作用するEYFPとして存在した。Alexaフルーア555は、ECFP(b)およびEYFP (c)によって活性化された。制御として、ビオチン・ストレプトアビジン‐共役相互作用は、Alexaフルーア発光を非常に減少させた余分な複合していないストレプトアビジンを使用しているプレインキュベーションによってブロックされた。同じ効果は、よりブルーにシフトしたAlexaフルーア555と比較して、より弱い信号とより良いスペクトル解像度を生じるECFP(d)およびEYFP(e)によって活性化されたAlexaフルーア568の結合体を使用して観察された。より大きなスペクトル解像度のため、光源による直接の励起のためのAlexaフルーア568の発光は、また、複合していないストレプトアビジンを含む制御において減らされた。
【0190】
【図19】スペクトル・ピークおよびRET比率の計算の集積化によって、ECFP、EYFPおよびAlexaフルーア555(a)またはAlexaフルーア568(b)間のFRETの数値解析を示す。バックグラウンドの上の信号は、ビオチン‐ストレプトアビジン相互作用と同様にECFP‐EYFP相互作用のために観察された。440nmでの励起のAlexaフルーアおよびEYFP信号の存在は、490nmでの励起のAlexaフルーア信号の存在と同様に、すべてのDTを含む複合体が形成されたことを示す。
【0191】
【図20】生体哺乳動物細胞の細胞膜に存在するタグを付けられたリセプタによって例証される複合体分子の付随物のための検出システムを示す。ECFPが440nmで励起状態であった場合、ECFPからEYFPおよびECFPからECFPへのRETが観察され、CCR2リセプタ(a)間のホモダイマ形成を示した。RETはまた、EYFPがさらに490nmで励起状態であった場合、EYFPおよびmRFP1の間で観察され、CCR2‐EYFPの集合を示した。ピーク面積の数値解析は、信号の増加が分子集合(c)を正確に反映することを示した。(略語)BRET 生物発光共振エネルギ転移CCR2 ケモカイン(ccモチーフ)リセプタ2。DT タグまたは検出タグ。DT‐IG 相互作用している基に付着されるタグまたは検出タグ。ECFP ビクトリアグリーンの蛍光タンパク質遺伝子(GFP)の変種である強化されたシアン蛍光タンパク。EGFP 野生型GFPの赤にシフトされた変種である強化された緑の蛍光タンパク。EYFP 強化された黄色の蛍光タンパク。FRET 蛍光共振エネルギ転移。GPCRs G‐タンパク被結合リセプタ。His(6) 6つの連続的なヒスチジン残基からなるヒスチジン・タグ。IG 相互作用している基。mRFP1 単量体の赤い蛍光タンパク。RET 共振エネルギ転移。Rluc ウミシイタケ・ルシフェラーゼ。T7prom T7促進剤配列。T7stop T7ターミネータ配列。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数の成分の検出システムであって、:
i).第1のタグが第1の活性化されたタグを生じる基質またはエネルギ供給源によって活性化する第1の波長の光を発する直接または間接的に第1のタグに連結する第1の相互作用する基からなる第1の媒介物、
ii).前記第1および第2の相互作用している基が関連し、前記第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、このことにより第2の波長の光を発する第2の活性化されたタグを生じる場合、第2のタグが前記第1のタグからエネルギを受け入れることができる直接または間接的に第2のタグに連結する第2の相互作用している基からなる第2の媒介物、
iii).前記第1および第3の相互作用している基が関連し、前記第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が、第3の波長の光を発する第3の活性化されたタグを生じるために存在する場合、直接または間接的に前記第1の活性化されたタグから前記エネルギを受け入れることができる第3のタグに連結する第3の相互作用している基からなる第3の媒介物、
iv).前記第1のタグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、
および、v).前記発された光を検出する手段からなる検出システム。
【請求項2】
複数の成分の検出システムであって、:
i).第1のタグが第1の活性化されたタグを生じる基質またはエネルギ供給源によって活性化する第1の波長の光を発する直接または間接的に第1のタグに連結する第1の相互作用する基からなる第1の媒介物、
ii).前記第1および第2の相互作用している基が関連し、i)における前記第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、このことにより第2の波長の光を発する第2の活性化されたタグを生じる場合、i)における第2のタグが前記第1のタグからエネルギを受け入れることができる直接または間接的に第2のタグに連結する第2の相互作用している基からなる第2の媒介物、
iii).前記第1の、第2および第3の相互作用している基が関連し、i)における前記第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が、第3の波長の光を発する第3の活性化されたタグを生じるために存在するが、前記第1および第3の相互作用している基のみが関連する場合は前記第3のタグはi)における前記第1の活性化されたタグによって本質的に活性化されない場合、ii)における前記第2の活性化されたタグから、前記エネルギを受け入れることができる第3のタグに直接または間接的に連結する第3の相互に作用している基からなる第3の媒介物、
iv).i)における前記タグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、
および、v).前記発された光を検出する手段からなる検出システム。
【請求項3】
複数の成分の検出システムであって、:
i).第1のタグが第1の活性化されたタグを生じる基質またはエネルギ供給源によって活性化する第1の波長の光を発する直接または間接的に第1のタグに連結する第1の相互作用する基からなる第1の媒介物、
ii).前記第1および第2の相互作用している基が関連し、i)における前記第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、このことにより第2の波長の光を発する第2の活性化されたタグを生じる場合、i)における第2のタグが前記第1のタグからエネルギを受け入れることができる直接または間接的に第2のタグに連結する第2の相互作用している基からなる第2の媒介物、
iii).前記第1のおよび第3の相互作用している基が関連し、i)における前記第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在する場合、i)における前記第1の活性化されたタグから、前記エネルギを受け入れることができ、前記第2および第3の相互作用している基が関連し、第3の波長の光を発する第3の活性化されたタグを生じるため、ii)における前記第2のタグのため適切な基質またはエネルギ供給源が存在する場合、ii)の前記第二に活性化されたタグから、前記エネルギを受け入れることができる第3のタグに直接または間接的に連結する第3の相互作用している基からなる第3の媒介物、
iv).i)およびii)における前記タグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、
および、v).前記発された光を検出する手段からなる検出システム。
【請求項4】
複数の成分の検出システムであって、:
i).第1のタグが第1の活性化されたタグを生じる基質またはエネルギ供給源によって活性化する第1の波長の光を発する直接または間接的に第1のタグに連結する第1の相互作用する基からなる第1の媒介物、
ii).前記第1および第2の相互作用している基が関連し、i)における前記第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、このことにより第2の波長の光を発する第2の活性化されたタグを生じる場合、i)における第2のタグが前記第1のタグからエネルギを受け入れることができる直接または間接的に第2のタグに連結する第2の相互作用している基からなる第2の媒介物、
iii).a).前記第1および第3の相互作用している基が関連する場合、前記第1の活性化したタグおよび/またはb).前記第2および第3に相互作用している基が関連する場合、第2の活性化したタグから前記エネルギを直接または間接的に受け入れることができ、前記第1および/または第2のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、それによって前記第1および/または第2の活性化されたタグからの前記光放射が減少する非蛍光性失活剤分子からなる第3のタグに連結する第3の相互作用している基からなる第3の媒介物、
iv).i)およびii)における前記タグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、
および、v).前記発された光を検出する手段からなる検出システム。
【請求項5】
複数の成分の検出システムであって、:
i).第1の活性化されたタグを生じる基質またはエネルギ供給源により活性化すると、第1のタグは第1の波長の光を発する第1のタグに直接または間接的に連結する第1の相互作用している基からなる第1の媒介物、
ii).第2の活性化されたタグを生じる基質またはエネルギ供給源により活性化すると、第2のタグは第2の波長の光を発する第1のタグに直接または間接的に連結する第2の相互作用している基からなる第2の媒介物、
iii).前記第1のおよび第3の相互作用している基が関連し、第3の波長の光を発する第3の活性化されたタグを生じるために前記第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在する場合、第3のタグが前記第1の活性化されたタグから前記エネルギを受け入れることができる第3のタグに直接または間接的に連結する第3の相互作用している基からなる第3の媒介物、
iv).前記第2および第4の相互作用している基が関連し、第4の波長の光を発する第4の活性化されたタグを生じるため、前記第2のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在する場合、第4のタグが前記第2の活性化されたタグから前記エネルギを受け入れることができる直接または間接的に第4のタグに連結する第4の相互に作用している基から成っている第4の媒介物、
v).前記第1および第2のタグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、
vi).前記発された光を検出する手段からなる検出システム。
【請求項6】
複数の成分の検出システムであって、:
i).第1の活性化されたタグを生じる基質またはエネルギ供給源により活性化すると、第1のタグは第1の波長の光を発する第1のタグに直接または間接的に連結する第1の相互作用している基からなる第1の媒介物、
ii).前記第1および第2の相互に作用している基が関連し、および前記第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、このことにより第2の波長の光を発する第2の活性化されたタグを生じる場合、第2のタグは前記第1のタグから前記エネルギを受け入れることができる第2のタグに直接または間接的に連結する第2の相互作用している基からなる第2の媒介物、
iii).前記第1のおよび1つまたはそれ以上のさらなる相互作用している基が関連し、1つまたはそれ以上のさらなる波長の光を発するため、前記第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が1つまたはそれ以上のさらなる活性化されたタグを生じるために存在し、ここにおいて、前記さらなる波長は、前記第1または第2の波長と異なる場合、前記第1の活性化されたタグから前記エネルギを受け入れることができる1つまたはそれ以上のさらなるタグに直接または間接的に連結する1つまたはそれ以上のさらなる相互作用している基からなる1つまたはそれ以上のさらなる媒介物、
iv).前記第1のタグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、
および、v).前記発された光を検出する手段からなる検出システム。
【請求項7】
請求項1から6のいずれか1つに記載のシステムであって、前記相互作用している基は、化合物、タンパク、タンパク・ドメイン、タンパク・ループ、タンパク末端、ペプチド、ホルモン、タンパク‐脂質複合体、脂質、炭水化物、炭水化物含有化合物、核酸、オリゴヌクレオチド、薬剤媒介物、薬剤ターゲット、抗体、抗原物質、ウイルス、バクテリアおよび細胞から構成される前記基から選択されるシステム。
【請求項8】
請求項1から6のいずれか1つに記載のシステムであって、前記相互作用している基は、炭水化物、タンパク、薬剤、発色団、抗原、キレート化している化合物、分子識別複合体およびその連結からなる前記基から選択されるシステム。
【請求項9】
請求項7に記載のシステムであって、前記核酸分子が、一本鎖および二本鎖DNAを含むDNA、不均一リボ核酸(異種核RNA)を含むRNA、転移リボ核酸(運搬RNA)、メッセンジャーRNA(メッセンジャーRNA)、またはリボソームRNA(rRNA)からなるシステム。
【請求項10】
請求項1から9のいずれか1つに記載のシステムであって、外部刺激は、直接または間接的に相互作用している基の前記集合を調整するために適用されるシステム。
【請求項11】
請求項10に記載のシステムであって、前記外部刺激は、有機および無機分子、タンパク、核酸、炭水化物、脂質、配位子、薬剤化合物、作動体、拮抗体、逆作動体または化合物からなる試薬であるシステム。
【請求項12】
請求項10に記載のシステムであって、前記外部刺激は、温度、イオン強度またはpHを含む状態の変化であるシステム。
【請求項13】
請求項1から12のいずれか1つに記載のシステムであって、前記検出タグは、生物発光タンパク、蛍光タンパク、蛍光部分または非蛍光性失活剤からなる前記基から選択されるシステム。
【請求項14】
請求項13に記載のシステムであって、前記生物発光タンパクは、適切な基質がある場合には、ルシフェラーゼ、ガラクトシダーゼ、ラクタマーゼ、ペルオキシダーゼまたは発光することができるいかなるタンパクからなる前記基から選択されるシステム。
【請求項15】
請求項13に記載のシステムであって、前記基から選択される前記蛍光タンパクは、緑の蛍光タンパク(GFP)またはその変種、GFP(BFP)の青色の蛍光変種、GFP(CFP)のシアン蛍光変種、GFP(YFP)の黄色の蛍光変種、強化されたGFP(EGFP)、強化されたCFP(ECFP)、強化されたYFP(EYFP)、GFPS65T、エメラルド、トパーズ、GFPuv、不安定化EGFP(dEGFP)、不安定化ECFP(dECFP)、不安定化EYFP(dEYFP)、HcRed、t‐HcRed、DsRed、DsRed2、dimer2、t‐dimer2 (12)、mRFP1、ポシロポリン、ウミシイタケGFP、奇形GFP、paGFP、kaedeタンパクおよびキンドリング・タンパク、B‐フィコエリトリン、R‐フィコエリトリンおよびアロフィコシアニンを含むフィコビリタンパク質およびフィコビリタンパク質結合体、または、蛍光を発することができる他のいかなるタンパクから構成されるシステム。
【請求項16】
請求項13に記載のシステムであって、前記蛍光部分は、Alexaフルーア色素および派生物、Bodipy色素および派生物、Cy色素および派生物、フルオレセインおよび派生物、ダンシル、ウンベリフェロン、蛍光および発光のミクロスフィア、蛍光ナノクリスタル、マリーナブルー、カスケードブルー、カスケードイエロー、パシフィックブルー、オレゴングリーンおよび派生物、テトラメチルローダミンおよび派生物、ローダミンおよび派生物、テキサスレッドおよび派生物、希土類元素キレートまたはその化合またはその派生物、または蛍光特性を有する他のいかなる分子から構成される前記基から選択されるシステム。
【請求項17】
請求項13に記載のシステムであって、前記非蛍光性失活剤は、光を吸収し、蛍光および/または発光を抑える能力を有するダブシル、非蛍光性ポシロポリン、QSY‐7、QSY‐9、QSY‐21、QSY‐35、BHQ‐1、BHQ‐2およびBHQ‐3、またはいかなる周知の非蛍光性発色団からなる前記基から選択されるシステム。
【請求項18】
請求項1から6のいずれか1つに記載のシステムであって、前記活性化エネルギは、レーザー、水銀ランプ、キセノンランプ、およびハロゲン・ランプまたはいかなる発光デバイスを含む光源によって生成され、前記生成された光は、レーザー・ライン、バンドパスフィルタ、ショートパス・フィルタ、モノクロメータまたはスペクトルで前記発された光を制限するいかなる装置を含む適切な手段によって特定の波長または波長範囲に制限されるシステム。
【請求項19】
請求項1から6のいずれか1つに記載のシステムであって、前記第1の活性化エネルギは、コエレンテラジンおよびルシフェリンまたはそこから導かれる派生物から構成される前記基から選ばれる適切な酵素基質から生成されるシステム。
【請求項20】
請求項3に記載のシステムであって、前記第1の検出タグは順番に活性化され、前記第1、第2および第3の検出タグから発される前記光が検出され、そして前記第2の検出タグは活性化され、前記第2および第3の検出タグから発される前記光が検出されるシステム。
【請求項21】
請求項1から6のいずれか1つに記載のシステムであって、前記第1の検出タグは順番に活性化され、前記第1および第2の検出タグから発される前記光が検出され、そして前記第2の検出タグは活性化され、前記第2の検出タグから発される前記光は検出されるシステム。
【請求項22】
請求項19および20に記載のシステムであって、活性化および検出の前記順序は、時間的情報を生ずるため反復されるシステム。
【請求項23】
請求項1から21のいずれか1つに記載のシステムであって、前記相互作用している基およびタグは、融合タンパク質構成において符号化されるシステム。
【請求項24】
融合タンパク質構造をコード化する請求項22に記載の組換えDNA。
【請求項25】
請求項23に記載の組換えDNAからなる融合遺伝子。
【請求項26】
請求項22から24のいずれか1つに記載の1つまたはそれ以上の融解タンパク質遺伝子に使用可能な状態で連結される促進剤からなるDNAカセット。
【請求項27】
請求項25に記載の融合遺伝子からなるベクター。
【請求項28】
請求項26に記載のベクターによって一時的にまたは安定して変換またはトランスフェクションする宿主細胞。
【請求項29】
請求項27に記載の宿主細胞であって、前記細胞は、人間、哺乳動物、昆虫、植物、細菌または酵母である宿主細胞。
【請求項30】
請求項26に記載のベクターであって、前記遺伝子構造物は、構成する促進剤の制御下にあるベクター。
【請求項31】
請求項26に記載のベクターであって、前記遺伝子構造物は、誘導可能な促進剤の制御下にあるベクター。
【請求項32】
請求項29に記載のベクターであって、変換またはトランスフェクションする前記細胞は哺乳動物である場合、前記構成要素の促進剤は、CMV、SV40、RSV、EF‐1a、Tkから構成される前記基から選択されるベクター。
【請求項33】
請求項29に記載のベクターであって、変換またはトランスフェクションする前記細胞は菌体である場合、前記構成要素の促進剤が、T7、AraBAD、trc、pL、tacおよびlacからなる前記基から選択されるベクター。
【請求項34】
請求項29に記載のベクターであって、変換またはトランスフェクションする前記細胞はイースト細胞である場合、前記構成要素の促進剤が、nmtl、gall、gallO、TEF1、AOX1、GAPおよびADH1からなる前記基から選択されるベクター。
【請求項35】
請求項25に記載の融合遺伝子からなるウイルス。
【請求項36】
請求項35に記載の細菌によって感染する宿主細胞。
【請求項37】
請求項1から22のいずれか1つに記載の複数成分検出システムのアポトーシスに関するセンサーとしての使用であって、前記媒介物のうちの少なくとも1つは、カスパーゼ切断部位である使用。
【請求項38】
請求項1から22のいずれか1つに記載の複数成分検出システムのキナーゼ活性を検出するための使用であって、前記媒介物のうちの少なくとも1つは、リン酸化部位である使用。
【請求項39】
細胞が固定されていないシステムにおけるエネルギ転移を検出するための請求項1から22のいずれか1つに記載の複数成分検出システムの使用。
【請求項40】
請求項24に記載の融合遺伝子を生体細胞に導入することによる宿主細胞における請求項1から22のいずれか1つに記載の複数成分検出システムの使用。
【請求項41】
生体外または生体内でのタンパク‐タンパク相互作用をモニタするための請求項1から22のいずれか1つに記載の複数成分検出システムの使用。
【請求項42】
生体外または生体内の酵素活性をモニタするための請求項1から22のいずれか1つに記載の複数成分検出システムの使用。
【請求項43】
生体外または生体内の膜タンパク質間の相互作用をモニタするための請求項1から22のいずれか1つに記載の複数成分検出システムの使用。
【請求項44】
生体外または生体内の膜タンパク質および非膜結合タンパク間の相互作用をモニタするための請求項1から22のいずれか1つに記載の複数成分検出システムの使用。
【請求項45】
生体外または生体内のタンパク‐核酸相互作用をモニタするための請求項1から22のいずれか1つに記載の複数成分検出システムの使用。
【請求項1】
複数の成分の検出システムであって、:
i).第1のタグが第1の活性化されたタグを生じる基質またはエネルギ供給源によって活性化する第1の波長の光を発する直接または間接的に第1のタグに連結する第1の相互作用する基からなる第1の媒介物、
ii).前記第1および第2の相互作用している基が関連し、前記第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、このことにより第2の波長の光を発する第2の活性化されたタグを生じる場合、第2のタグが前記第1のタグからエネルギを受け入れることができる直接または間接的に第2のタグに連結する第2の相互作用している基からなる第2の媒介物、
iii).前記第1および第3の相互作用している基が関連し、前記第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が、第3の波長の光を発する第3の活性化されたタグを生じるために存在する場合、直接または間接的に前記第1の活性化されたタグから前記エネルギを受け入れることができる第3のタグに連結する第3の相互作用している基からなる第3の媒介物、
iv).前記第1のタグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、
および、v).前記発された光を検出する手段からなる検出システム。
【請求項2】
複数の成分の検出システムであって、:
i).第1のタグが第1の活性化されたタグを生じる基質またはエネルギ供給源によって活性化する第1の波長の光を発する直接または間接的に第1のタグに連結する第1の相互作用する基からなる第1の媒介物、
ii).前記第1および第2の相互作用している基が関連し、i)における前記第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、このことにより第2の波長の光を発する第2の活性化されたタグを生じる場合、i)における第2のタグが前記第1のタグからエネルギを受け入れることができる直接または間接的に第2のタグに連結する第2の相互作用している基からなる第2の媒介物、
iii).前記第1の、第2および第3の相互作用している基が関連し、i)における前記第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が、第3の波長の光を発する第3の活性化されたタグを生じるために存在するが、前記第1および第3の相互作用している基のみが関連する場合は前記第3のタグはi)における前記第1の活性化されたタグによって本質的に活性化されない場合、ii)における前記第2の活性化されたタグから、前記エネルギを受け入れることができる第3のタグに直接または間接的に連結する第3の相互に作用している基からなる第3の媒介物、
iv).i)における前記タグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、
および、v).前記発された光を検出する手段からなる検出システム。
【請求項3】
複数の成分の検出システムであって、:
i).第1のタグが第1の活性化されたタグを生じる基質またはエネルギ供給源によって活性化する第1の波長の光を発する直接または間接的に第1のタグに連結する第1の相互作用する基からなる第1の媒介物、
ii).前記第1および第2の相互作用している基が関連し、i)における前記第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、このことにより第2の波長の光を発する第2の活性化されたタグを生じる場合、i)における第2のタグが前記第1のタグからエネルギを受け入れることができる直接または間接的に第2のタグに連結する第2の相互作用している基からなる第2の媒介物、
iii).前記第1のおよび第3の相互作用している基が関連し、i)における前記第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在する場合、i)における前記第1の活性化されたタグから、前記エネルギを受け入れることができ、前記第2および第3の相互作用している基が関連し、第3の波長の光を発する第3の活性化されたタグを生じるため、ii)における前記第2のタグのため適切な基質またはエネルギ供給源が存在する場合、ii)の前記第二に活性化されたタグから、前記エネルギを受け入れることができる第3のタグに直接または間接的に連結する第3の相互作用している基からなる第3の媒介物、
iv).i)およびii)における前記タグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、
および、v).前記発された光を検出する手段からなる検出システム。
【請求項4】
複数の成分の検出システムであって、:
i).第1のタグが第1の活性化されたタグを生じる基質またはエネルギ供給源によって活性化する第1の波長の光を発する直接または間接的に第1のタグに連結する第1の相互作用する基からなる第1の媒介物、
ii).前記第1および第2の相互作用している基が関連し、i)における前記第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、このことにより第2の波長の光を発する第2の活性化されたタグを生じる場合、i)における第2のタグが前記第1のタグからエネルギを受け入れることができる直接または間接的に第2のタグに連結する第2の相互作用している基からなる第2の媒介物、
iii).a).前記第1および第3の相互作用している基が関連する場合、前記第1の活性化したタグおよび/またはb).前記第2および第3に相互作用している基が関連する場合、第2の活性化したタグから前記エネルギを直接または間接的に受け入れることができ、前記第1および/または第2のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、それによって前記第1および/または第2の活性化されたタグからの前記光放射が減少する非蛍光性失活剤分子からなる第3のタグに連結する第3の相互作用している基からなる第3の媒介物、
iv).i)およびii)における前記タグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、
および、v).前記発された光を検出する手段からなる検出システム。
【請求項5】
複数の成分の検出システムであって、:
i).第1の活性化されたタグを生じる基質またはエネルギ供給源により活性化すると、第1のタグは第1の波長の光を発する第1のタグに直接または間接的に連結する第1の相互作用している基からなる第1の媒介物、
ii).第2の活性化されたタグを生じる基質またはエネルギ供給源により活性化すると、第2のタグは第2の波長の光を発する第1のタグに直接または間接的に連結する第2の相互作用している基からなる第2の媒介物、
iii).前記第1のおよび第3の相互作用している基が関連し、第3の波長の光を発する第3の活性化されたタグを生じるために前記第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在する場合、第3のタグが前記第1の活性化されたタグから前記エネルギを受け入れることができる第3のタグに直接または間接的に連結する第3の相互作用している基からなる第3の媒介物、
iv).前記第2および第4の相互作用している基が関連し、第4の波長の光を発する第4の活性化されたタグを生じるため、前記第2のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在する場合、第4のタグが前記第2の活性化されたタグから前記エネルギを受け入れることができる直接または間接的に第4のタグに連結する第4の相互に作用している基から成っている第4の媒介物、
v).前記第1および第2のタグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、
vi).前記発された光を検出する手段からなる検出システム。
【請求項6】
複数の成分の検出システムであって、:
i).第1の活性化されたタグを生じる基質またはエネルギ供給源により活性化すると、第1のタグは第1の波長の光を発する第1のタグに直接または間接的に連結する第1の相互作用している基からなる第1の媒介物、
ii).前記第1および第2の相互に作用している基が関連し、および前記第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が存在し、このことにより第2の波長の光を発する第2の活性化されたタグを生じる場合、第2のタグは前記第1のタグから前記エネルギを受け入れることができる第2のタグに直接または間接的に連結する第2の相互作用している基からなる第2の媒介物、
iii).前記第1のおよび1つまたはそれ以上のさらなる相互作用している基が関連し、1つまたはそれ以上のさらなる波長の光を発するため、前記第1のタグのための適切な基質またはエネルギ供給源が1つまたはそれ以上のさらなる活性化されたタグを生じるために存在し、ここにおいて、前記さらなる波長は、前記第1または第2の波長と異なる場合、前記第1の活性化されたタグから前記エネルギを受け入れることができる1つまたはそれ以上のさらなるタグに直接または間接的に連結する1つまたはそれ以上のさらなる相互作用している基からなる1つまたはそれ以上のさらなる媒介物、
iv).前記第1のタグを活性化する適切な基質またはエネルギ供給源、
および、v).前記発された光を検出する手段からなる検出システム。
【請求項7】
請求項1から6のいずれか1つに記載のシステムであって、前記相互作用している基は、化合物、タンパク、タンパク・ドメイン、タンパク・ループ、タンパク末端、ペプチド、ホルモン、タンパク‐脂質複合体、脂質、炭水化物、炭水化物含有化合物、核酸、オリゴヌクレオチド、薬剤媒介物、薬剤ターゲット、抗体、抗原物質、ウイルス、バクテリアおよび細胞から構成される前記基から選択されるシステム。
【請求項8】
請求項1から6のいずれか1つに記載のシステムであって、前記相互作用している基は、炭水化物、タンパク、薬剤、発色団、抗原、キレート化している化合物、分子識別複合体およびその連結からなる前記基から選択されるシステム。
【請求項9】
請求項7に記載のシステムであって、前記核酸分子が、一本鎖および二本鎖DNAを含むDNA、不均一リボ核酸(異種核RNA)を含むRNA、転移リボ核酸(運搬RNA)、メッセンジャーRNA(メッセンジャーRNA)、またはリボソームRNA(rRNA)からなるシステム。
【請求項10】
請求項1から9のいずれか1つに記載のシステムであって、外部刺激は、直接または間接的に相互作用している基の前記集合を調整するために適用されるシステム。
【請求項11】
請求項10に記載のシステムであって、前記外部刺激は、有機および無機分子、タンパク、核酸、炭水化物、脂質、配位子、薬剤化合物、作動体、拮抗体、逆作動体または化合物からなる試薬であるシステム。
【請求項12】
請求項10に記載のシステムであって、前記外部刺激は、温度、イオン強度またはpHを含む状態の変化であるシステム。
【請求項13】
請求項1から12のいずれか1つに記載のシステムであって、前記検出タグは、生物発光タンパク、蛍光タンパク、蛍光部分または非蛍光性失活剤からなる前記基から選択されるシステム。
【請求項14】
請求項13に記載のシステムであって、前記生物発光タンパクは、適切な基質がある場合には、ルシフェラーゼ、ガラクトシダーゼ、ラクタマーゼ、ペルオキシダーゼまたは発光することができるいかなるタンパクからなる前記基から選択されるシステム。
【請求項15】
請求項13に記載のシステムであって、前記基から選択される前記蛍光タンパクは、緑の蛍光タンパク(GFP)またはその変種、GFP(BFP)の青色の蛍光変種、GFP(CFP)のシアン蛍光変種、GFP(YFP)の黄色の蛍光変種、強化されたGFP(EGFP)、強化されたCFP(ECFP)、強化されたYFP(EYFP)、GFPS65T、エメラルド、トパーズ、GFPuv、不安定化EGFP(dEGFP)、不安定化ECFP(dECFP)、不安定化EYFP(dEYFP)、HcRed、t‐HcRed、DsRed、DsRed2、dimer2、t‐dimer2 (12)、mRFP1、ポシロポリン、ウミシイタケGFP、奇形GFP、paGFP、kaedeタンパクおよびキンドリング・タンパク、B‐フィコエリトリン、R‐フィコエリトリンおよびアロフィコシアニンを含むフィコビリタンパク質およびフィコビリタンパク質結合体、または、蛍光を発することができる他のいかなるタンパクから構成されるシステム。
【請求項16】
請求項13に記載のシステムであって、前記蛍光部分は、Alexaフルーア色素および派生物、Bodipy色素および派生物、Cy色素および派生物、フルオレセインおよび派生物、ダンシル、ウンベリフェロン、蛍光および発光のミクロスフィア、蛍光ナノクリスタル、マリーナブルー、カスケードブルー、カスケードイエロー、パシフィックブルー、オレゴングリーンおよび派生物、テトラメチルローダミンおよび派生物、ローダミンおよび派生物、テキサスレッドおよび派生物、希土類元素キレートまたはその化合またはその派生物、または蛍光特性を有する他のいかなる分子から構成される前記基から選択されるシステム。
【請求項17】
請求項13に記載のシステムであって、前記非蛍光性失活剤は、光を吸収し、蛍光および/または発光を抑える能力を有するダブシル、非蛍光性ポシロポリン、QSY‐7、QSY‐9、QSY‐21、QSY‐35、BHQ‐1、BHQ‐2およびBHQ‐3、またはいかなる周知の非蛍光性発色団からなる前記基から選択されるシステム。
【請求項18】
請求項1から6のいずれか1つに記載のシステムであって、前記活性化エネルギは、レーザー、水銀ランプ、キセノンランプ、およびハロゲン・ランプまたはいかなる発光デバイスを含む光源によって生成され、前記生成された光は、レーザー・ライン、バンドパスフィルタ、ショートパス・フィルタ、モノクロメータまたはスペクトルで前記発された光を制限するいかなる装置を含む適切な手段によって特定の波長または波長範囲に制限されるシステム。
【請求項19】
請求項1から6のいずれか1つに記載のシステムであって、前記第1の活性化エネルギは、コエレンテラジンおよびルシフェリンまたはそこから導かれる派生物から構成される前記基から選ばれる適切な酵素基質から生成されるシステム。
【請求項20】
請求項3に記載のシステムであって、前記第1の検出タグは順番に活性化され、前記第1、第2および第3の検出タグから発される前記光が検出され、そして前記第2の検出タグは活性化され、前記第2および第3の検出タグから発される前記光が検出されるシステム。
【請求項21】
請求項1から6のいずれか1つに記載のシステムであって、前記第1の検出タグは順番に活性化され、前記第1および第2の検出タグから発される前記光が検出され、そして前記第2の検出タグは活性化され、前記第2の検出タグから発される前記光は検出されるシステム。
【請求項22】
請求項19および20に記載のシステムであって、活性化および検出の前記順序は、時間的情報を生ずるため反復されるシステム。
【請求項23】
請求項1から21のいずれか1つに記載のシステムであって、前記相互作用している基およびタグは、融合タンパク質構成において符号化されるシステム。
【請求項24】
融合タンパク質構造をコード化する請求項22に記載の組換えDNA。
【請求項25】
請求項23に記載の組換えDNAからなる融合遺伝子。
【請求項26】
請求項22から24のいずれか1つに記載の1つまたはそれ以上の融解タンパク質遺伝子に使用可能な状態で連結される促進剤からなるDNAカセット。
【請求項27】
請求項25に記載の融合遺伝子からなるベクター。
【請求項28】
請求項26に記載のベクターによって一時的にまたは安定して変換またはトランスフェクションする宿主細胞。
【請求項29】
請求項27に記載の宿主細胞であって、前記細胞は、人間、哺乳動物、昆虫、植物、細菌または酵母である宿主細胞。
【請求項30】
請求項26に記載のベクターであって、前記遺伝子構造物は、構成する促進剤の制御下にあるベクター。
【請求項31】
請求項26に記載のベクターであって、前記遺伝子構造物は、誘導可能な促進剤の制御下にあるベクター。
【請求項32】
請求項29に記載のベクターであって、変換またはトランスフェクションする前記細胞は哺乳動物である場合、前記構成要素の促進剤は、CMV、SV40、RSV、EF‐1a、Tkから構成される前記基から選択されるベクター。
【請求項33】
請求項29に記載のベクターであって、変換またはトランスフェクションする前記細胞は菌体である場合、前記構成要素の促進剤が、T7、AraBAD、trc、pL、tacおよびlacからなる前記基から選択されるベクター。
【請求項34】
請求項29に記載のベクターであって、変換またはトランスフェクションする前記細胞はイースト細胞である場合、前記構成要素の促進剤が、nmtl、gall、gallO、TEF1、AOX1、GAPおよびADH1からなる前記基から選択されるベクター。
【請求項35】
請求項25に記載の融合遺伝子からなるウイルス。
【請求項36】
請求項35に記載の細菌によって感染する宿主細胞。
【請求項37】
請求項1から22のいずれか1つに記載の複数成分検出システムのアポトーシスに関するセンサーとしての使用であって、前記媒介物のうちの少なくとも1つは、カスパーゼ切断部位である使用。
【請求項38】
請求項1から22のいずれか1つに記載の複数成分検出システムのキナーゼ活性を検出するための使用であって、前記媒介物のうちの少なくとも1つは、リン酸化部位である使用。
【請求項39】
細胞が固定されていないシステムにおけるエネルギ転移を検出するための請求項1から22のいずれか1つに記載の複数成分検出システムの使用。
【請求項40】
請求項24に記載の融合遺伝子を生体細胞に導入することによる宿主細胞における請求項1から22のいずれか1つに記載の複数成分検出システムの使用。
【請求項41】
生体外または生体内でのタンパク‐タンパク相互作用をモニタするための請求項1から22のいずれか1つに記載の複数成分検出システムの使用。
【請求項42】
生体外または生体内の酵素活性をモニタするための請求項1から22のいずれか1つに記載の複数成分検出システムの使用。
【請求項43】
生体外または生体内の膜タンパク質間の相互作用をモニタするための請求項1から22のいずれか1つに記載の複数成分検出システムの使用。
【請求項44】
生体外または生体内の膜タンパク質および非膜結合タンパク間の相互作用をモニタするための請求項1から22のいずれか1つに記載の複数成分検出システムの使用。
【請求項45】
生体外または生体内のタンパク‐核酸相互作用をモニタするための請求項1から22のいずれか1つに記載の複数成分検出システムの使用。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5a】
【図5b】
【図5c】
【図6a】
【図6b】
【図7a】
【図7b】
【図7c】
【図7d】
【図7e】
【図8a】
【図8b】
【図9a】
【図9b】
【図9c】
【図9d】
【図9e】
【図9f】
【図10】
【図11a】
【図11b】
【図12a】
【図12b】
【図13a】
【図13b】
【図14a】
【図14b】
【図15a】
【図15b】
【図16a】
【図16b】
【図17a】
【図17b】
【図18a】
【図18b】
【図18c】
【図18d】
【図18e】
【図19a】
【図19b】
【図20a】
【図20b】
【図20c】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5a】
【図5b】
【図5c】
【図6a】
【図6b】
【図7a】
【図7b】
【図7c】
【図7d】
【図7e】
【図8a】
【図8b】
【図9a】
【図9b】
【図9c】
【図9d】
【図9e】
【図9f】
【図10】
【図11a】
【図11b】
【図12a】
【図12b】
【図13a】
【図13b】
【図14a】
【図14b】
【図15a】
【図15b】
【図16a】
【図16b】
【図17a】
【図17b】
【図18a】
【図18b】
【図18c】
【図18d】
【図18e】
【図19a】
【図19b】
【図20a】
【図20b】
【図20c】
【公表番号】特表2007−511226(P2007−511226A)
【公表日】平成19年5月10日(2007.5.10)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2006−540078(P2006−540078)
【出願日】平成16年11月18日(2004.11.18)
【国際出願番号】PCT/AU2004/001598
【国際公開番号】WO2005/050182
【国際公開日】平成17年6月2日(2005.6.2)
【出願人】(506168657)ディメリックス バイオサイエンス ピーティーワイ リミテッド (1)
【Fターム(参考)】
【公表日】平成19年5月10日(2007.5.10)
【国際特許分類】
【出願日】平成16年11月18日(2004.11.18)
【国際出願番号】PCT/AU2004/001598
【国際公開番号】WO2005/050182
【国際公開日】平成17年6月2日(2005.6.2)
【出願人】(506168657)ディメリックス バイオサイエンス ピーティーワイ リミテッド (1)
【Fターム(参考)】
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