診断及び治療用標的としての低分子量タンパク質チロシンホスファターゼ（ＬＭＷ−ＰＴＰ）
低分子量タンパク質チロシンホスファターゼ（ＬＭＷ−ＰＴＰ）を、ガンの診断、予後及び処置における新規診断及び治療用標的として同定する。本発明は、ＬＭＷ−ＰＴＰ及び、任意に、ＥｐｈＡ２受容体を発現しているガンとの関連において有用な診断及び処置の方法を提供する。発ガンタンパク質ＥｐｈＡ２を有効にターゲティングする候補のガン治療物質を同定するためにＬＭＷ−ＰＴＰの量及び／又は活性の変化を利用するスクリーニング方法も提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、引用によってその全体が本明細書に組み入れられる２００２年５月２３日出願の米国仮出願番号第６０／３８２，９８８号の利益を主張するものである。
【０００２】
本願はまた、以下の米国特許出願を引用することによってそれらの全体を本明細書に組み入れる：２０００年８月１７日出願の第０９／６４０，９５２号；２０００年８月１７日出願の第０９／６４０，９３５号；及び２００１年９月１２日出願の第０９／９５２，５６０号。
【背景技術】
【０００３】
ガンは、細胞群が不適切に増殖し、そして生存する能力を獲得したときに生じる。これらの生物学的挙動はしばしば、悪性細胞の当該不適切な増殖及び生存を促進する特定のシグナル伝達経路を引き起こすよう一緒に働く遺伝的且つ環境的異常性に起因する。特に、タンパク質のチロシンリン酸化は、細胞の挙動の多くの異なる側面を支配する強力なシグナルを惹起すると考えられている。一般的なパラダイムは、チロシンキナーゼとホスファターゼ活性との平衡が、タンパク質チロシンのリン酸化の細胞レベルを決定する役割を果たし、それによって増殖、生存及び浸潤に関する細胞の決定を支配することを示唆している。このパラダイムは、概して、チロシンキナーゼが発ガン性であろうという一方、チロシンホスファターゼが悪性転換をネガティブに制御することを推定する。この部分は概して正しいが、明るみになってきた事実は、より複雑なものがチロシンキナーゼとホスファターゼとの間で相互作用していることを明らかにしている。例えば、ＰＴＰＣＡＡＸチロシンホスファターゼは、強力な発ガン遺伝子として機能することが近年証明されてきた。更に、Ｓｒｃファミリーキナーゼの酵素活性は、重要なチロシン残基のホスファターゼ媒介脱リン酸によって解放される。後者の状況においては、ホスファターゼは、キナーゼの酵素活性を増大させることによってタンパク質チロシンリン酸化を実際にアップレギュレートしうる。
【０００４】
ＥｐｈＡ２受容体チロシンキナーゼは、多数のヒトのガンにおいて過剰発現する。高レベルのＥｐｈＡ２は、多数の異なるガン、例えば乳ガン、前立腺ガン、大腸ガン及び肺ガン並びに転移性黒色腫に当てはまる。更に、最高レベルのＥｐｈＡ２が一貫してヒトのガンの最も攻撃的な細胞モデル上で見られる。ＥｐｈＡ２は、ＥｐｈＡ２の異所的な過剰発現が非形質転換上皮細胞に腫瘍原性及び転移性を賦与するのに十分であるので、単なる悪性疾患のマーカーではない。
【０００５】
ガン細胞はまた、非形質転換上皮細胞と比較した場合に、ＥｐｈＡ２機能の差異を示す。非形質転換上皮細胞において比較的低レベルで存在するにも関わらず、これらの細胞中のＥｐｈＡ２は、顕著にチロシンリン酸化される。対照的に、悪性細胞中のＥｐｈＡ２は、それがこれらの細胞においてひどく過剰発現するにも関わらず、チロシンリン酸化されない。ＥｐｈＡ２のホスホチロシン含量におけるこれらの差異は重要であり、それはチロシンリン酸化されたＥｐｈＡ２がネガティブに腫瘍細胞の増殖及び浸潤を制御し、一方、リン酸化されてないＥｐｈＡ２が悪性細胞におけるこれらの同一の挙動を促進するためである。ＥｐｈＡ２と悪性との関連は、国際特許出願ＷＯ０１／１２１７２及びＷＯ０１／１２８０４において更に詳述されている。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、ガンの診断、予後及び処置における新規診断及び治療用標的としての低分子量タンパク質チロシンホスファターゼ（ＬＭＷ−ＰＴＰ）を同定する。従って、本発明は、新規なガンの診断、予後及び処置の方法を提供する。
【０００７】
１つの側面において、本発明は、哺乳類、好ましくはヒトにおけるガンの処置方法を提供する。本発明の処置方法の１つの態様において、当該方法は哺乳類におけるガンを処置するのに有用であり、ここで、当該ガン細胞は、低分子量タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＭＷ−ＰＴＰ）を発現する。当該処置方法は、ＬＭＷ−ＰＴＰの活性を阻害するのに有効な処置物質を哺乳類に投与することを包含する。
【０００８】
本発明の処置方法の別の態様において、当該方法は哺乳類におけるガンを処置するのに有用であり、ここで、当該がん細胞は低分子量タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＭＷ−ＰＴＰ）及びＥｐｈＡ２受容体分子を発現する。当該処置方法は、ＬＭＷ−ＰＴＰの活性を阻害するのに有効な第一の処置物質及び当該ＥｐｈＡ２受容体分子の生体活性を望ましく変化させるのに有効な第二の処置物質を哺乳類に投与することを包含する。好ましくは、ＥｐｈＡ２の生体活性は、ＥｐｈＡ２受容体分子のホスホチロシン含量を増大させることによって望ましく変化する。
【０００９】
本発明の方法を用いて処置されるガンは、好ましくは転移性ガン腫である。任意には、本発明の処置方法において、前記処置物質は、細胞毒性物質と共有結合する。
【００１０】
ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現は、哺乳類におけるガン細胞の存在を示唆する。従って、別の側面において、本発明は、ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現に基づいた、哺乳類におけるガンの診断方法を提供する。１つの態様において、本発明の当該診断方法は、哺乳類から得られる生体材料中の細胞を可溶化して細胞可溶化物を生成せしめ；当該細胞可溶化物を、ＬＭＷ−ＰＴＰに結合する診断物質と接触させて結合複合体を形成せしめ；そしてＬＭＷ−ＰＴＰが非ガン性の生体材料と比較して、前記生体材料中で過剰発現しているか否かを決定すること、を包含する。任意に、当該方法はまた、哺乳類から前記生体材料を得ることを含む。本発明の当該診断方法の別の態様において、ＬＭＷ−ＰＴＰの発現レベルは、前記生体材料をアッセイして、ＬＭＷ−ＰＴＰが、非ガン性生体試料と比較して前記生体材料中で過剰発現しているか否かを決定することによって解析される。この診断方法は、哺乳類において、又は哺乳類の外側で実施されうる。哺乳類のあらゆる生体材料を解析することができ、例えば哺乳類の組織、器官又は体液である。
【００１１】
更に別の側面において、本発明は、Ｅｐは２受容体分子をターゲティングする候補のガン治療物質の有効性を評価するためのスクリーニング方法を提供する。１つの態様において、当該スクリーニング方法は、ＥｐｈＡ２受容体分子及びＬＭＷ−ＰＴＰを発現するガン細胞を、候補の治療物質と接触させて処置されたガン細胞を生成せしめ；当該処置されたガン細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの量又は活性を決定し；そして当該処置されたガン細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの量又は活性と、類似の未処置のガン細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの量又は活性と比較すること、を包含する。当該処置された細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの量又は活性の低下は、前記候補の治療物質のＥｐｈＡ２ターゲティングの有効性を示唆する。
【００１２】
好ましい態様の詳細な説明
チロシンリン酸化は、細胞膜チロシンキナーゼ（すなわち、他のタンパク質又はペプチドをリン酸化する酵素）によって制御され、そしてチロシンキナーゼの発現の増大は、転移性のガン細胞において生じることが知られている。しかしながら、我々は、その逆の反応である脱リン酸を触媒する酵素が強力な発ガン性タンパク質であるという驚くべき発見をした。この酵素は、低分子量のタンパク質チロシンホスファターゼ（ＬＭＷ−ＰＴＰ）であり、そしてその発ガン性の能力は、少なくとも場合によっては受容体チロシンキナーゼＥｐｈＡ２に関連しており、これはまた、発ガン及び転移に関与している。
【００１３】
従って、ＬＭＷ−ＰＴＰは、ガン治療を対象とする処置方法のための新規で且つこれまでにない標的として確立される。ＬＭＷ−ＰＴＰは、単独で、又はＥｐｈＡ２、他の発ガン性チロシンキナーゼ、あるいは他の発ガン性遺伝子又は発ガン性タンパク質を標的とする処置と組み合わせて、標的となり得る。ＬＭＷ−ＰＴＰレベルはまた、ガンの検出におけるマーカーとして、あるいはＥｐｈＡ２又はガンの発生若しくは進行に関連する他のチロシンキナーゼを標的とする処理の影響を解析するための代理のマーカーとしての役割を果たし得る。
【００１４】
低分子量タンパク質チロシンホスファターゼ
タンパク質チロシンホスファターゼ（時にホスホチロシンホスファターゼとも称される）は、ＰＴＰアーゼとして知られており、リン酸一エステルの加水分解、具体的にはタンパク質ホスホチロシル残基の脱リン酸を触媒する。３つの主要なＰＴＰアーゼのクラス；二重特異性ＰＴＰアーゼ、高分子量ＰＴＰアーゼ及び低分子量ＰＴＰアーゼがある（Zhang, M. , Stauffacher, C. , and Van Etten, R. L. (1995), "The Three Dimensional Structure, Chemical Mechanism and Function of the Low Molecular Weight Protein Tyrosine Phosphatase," Adv. Prot. Phosphatases 9, 1-23）。複数の異なる頭字語が、低分子量（ＬＭＷ）ＰＴＰアーゼについて交換可能に使用されており、それらにはＬＭＷ−ＰＴＰ、ＬＭＷＰＴＰ、ＬＭＷ−ＰＴＰアーゼ及びＬＭＷＰＴＰアーゼが含まれる。
【００１５】
ＬＭＷ−ＰＴＰは、多数の異なる生物から単離されたメンバーを含むＰＴＰアーゼファミリーを表す。それらは、典型的に約１８ｋＤの相対分子量を有する。高等生物に見られるＬＭＷ−ＰＴＰファミリーのメンバーには、ウシ(Heinrikson, R. L. (1969), “Purification and Characterization of a Low Molecular Weight Acid Phosphatase from Bovine Liver,” J Biol Chem. 244, 299-307)、エルウィニア(Erwinia)(Burgert, P. and Geider, K. (1997), “Characterization of the ams I Gene Product as a Low Molecular Weight Acid Phosphatase Controlling Exoplysaccharide Synthesis of Erwinia Amylovora,” FEBS Lett. 400, 252-256)、出芽酵母(Ltp1)( Ostanin, K., Pokalsky, C., Wang, S., and Van Etten, RL., “Cloning and Charaterization of a Saccharomyces cerevisiae Gene Encoding the Low Molecular Weight Protein Tyrosine Phosphatase,” J. Biol. Chem., 270, 18491-18499)、分裂酵母(Stpq)(Mondesert, O., Moreno, S. and Russell, P. (1994), ”Low molecular weight protein-tyrosine phosphatases are highly conserved between fission yeast and man,“ J. Biol. Chem. 269, 27996-27999)、ラットACP1及びACP２イソ酵素(Manao G, Pazzagli L, Cirri P, Caselli A, Camici G, Cappugi G, Saeed A, Ramponi G (1992), “Rat liver low Mr phosphotyrosine protein phosphatase isoenzymes purification and amino acid sequences,” J. Prot. Chem. 11, 333-345)、ヒト（HPTP）(Wo, Y.-Y. P., Zhou, M.-M., Stevis, P., Davis, J. P., Zhang, Z. Y., and Van Etten, R. L. (1992), “Cloning, expression, and catalytic mechanism of the low molecular weight phosphotyrosyl protein phosphatase from bovine heart”, Biochemistry 31, 1712-21; Dissing J, and Svensmark O. (1990)“Human red cell acid phosphatase: purification and properties of A, B and C isozymes,” Biochem. Biophys. Acta.1041:232-242; Waheed, A., Laidler, P. M., Wo, Y.-Y. P., and Van Etten, R. L., (1988)“Purification and physicochemical characterization of a human placental acid phosphatase possessing phosphotyrosyl protein phosphatase activity,” Biochemistry. 1988 Jun 14;27(12):4265-73; Boivin, P. and Galand, C. (1986), “The human red cell acid phosphatase is a phosphotyrosine protein phosphatase which dephosphorylates the membrane protein band 3. Biochem Biophys Res Commun 1986 Jan 29;134(2):557-564)、及びBPTP(Zhang, Z-Y. and Van Etten, R. L. (1990), “Purification and characterization of a low-molecular-weight acid phosphatase--a phosphotyrosyl-protein phosphatase from bovine heart,” 282, 39-49; Chernoff, J. and Li, H.-C. (1985), “A major phosphotyrosyl-protein phosphatase from bovine heart is associated with a low-molecular-weight acid phosphatase,” Arch Biochem Biophys. 240, 135-45) が含まれる。これらのタンパク質は、他のＰＴＰアーゼと同様に、共通の活性部位配列モチーフであるＣｙｓ−（Ｘａａ）5−Ａｒｇを共有する。高等脊椎動物の酵素との高度の配列同一性を共有する幾つかのタンパク質には、エスケリッチャ・コリ(Escherichia coli)(Stevenson, G. Andrianopopoulos, K. Hobbs, M. , and Reeves, P. R. (1996), "Organization of the Escherichia coli K-12 Gene Cluster Responsible for Production of the Extracellular Polysaccharide Colanic Acid," J. Bact. 178, 4885-4893)、クレブシエラ属(Klebsiella)(Arakawa, Y. , Washarotayankun, R., Nagatsuka, T. , Ito, H. , Kato, N. , and Ohta, M. (1995), "Genomic Organization of the Klebsiella pneumoniae CPS Region Responsible for Serotype K2 Capsular Polysaccharide Synthesis in the Virulent Strain Chedid, "J. Bacteriol. 177, 1788-1796)、シネココッカス(Synechococcus)(Wilbanks, S. M. and Glazer, A. N. (1993), "Rod Structure of a Phycoerythrin D-containing Phycobilisdome.I. Organization and Sequence of the Gene Cluster Encoding the Major Phycobilirotein Rod Components in the Genome of Marine Synechococcus sp. WH8020, "J. Biol. Chem. 268, 1226-1234)、及びトリトリコモナスフォエタス(Tritrichomonasfoetus)(gb U66070)が含まれる。
【００１６】
幾つかの哺乳類低分子量ＰＴＰアーゼがイソ酵素として存在する。特定の種内で、当該イソ酵素間のアミノ酸配列同一性は９５％超である。１つのそのような種はヒトであり、ここではヒト赤血球タンパク質チロシンホスファターゼ（ＨＰＴＰ）が発現している。このタンパク質の２つの形態Ａ（ファスト）及びＢ（スロー）は、デンプンゲル電気泳動の間に分離した場合にそれらの電気泳動の移動度において異なる。可変領域である残基４０−７３を除き、当該イソ酵素は同一のアミノ酸配列を有する。
【００１７】
ヒトイソ酵素（Ａ及びＢ）は、ＢＰＴＰと比較した場合に、それぞれ８１％及び９４％という高レベルのアミノ酸配列同一性を有する。低分子量ＰＴＰアーゼのプロトタイプであるＢＰＴＰの結晶構造が解明されている（Zhang, M. , Van Etten, R. L. , and Stauffacher, C. V. (1994), "Crystal Structure of Bovine Heart Phosphotyrosyl Phosphatase at 2.2-A Resolution,"Biochemistry 33,11097-11105）。当該構造は、四本鎖の中心の平行β−シートの両側にα−ヘリックスという構造から成る。この構造は、２つの右巻きのβαβモチーフ部分に存する古典的なヌクレオチド結合フォールドであるロスマンフォールドの部分を組み込んでいる。ＨＰＴＰ−Ａ及び酵母ＬＴＰ１の結晶構造が解明されており(Wang, S. , Stauffacher, C. and Van Etten, R. L. (2000), "Structural and Mechanistic Basis for the Activation of a Low Molecular Weight Protein Tyrosine Phosphatase by Adenine," Biochemistry 39,1234-1242 ; Zhang, M. (1995), Ph. D. Thesis, Purdue University)、そしてＢＰＴＰに似ている。低分子量ＰＴＰアーゼは、８個の保存されたシステイン（全て遊離チオール型）、７個の保存されたアルギニン、及び２個の保存されたヒスチジンを有する(Davis JP, Zhou, MM, and Van Etten RL.(1994), "Kinetic and site-directed mutagenesis studies of the cysteine residues of bovine low molecular weight phosphotyrosyl protein phosphatase." J. Biol. Chem. 269, 8734-8740)。
【００１８】
チロシンリン酸化されるタンパク質及びペプチド、並びにより単純な分子、ホスホチロシン及びｐＮＰＰは、全て、低分子量ＰＴＰアーゼの基質の候補である。
【００１９】
これらの酵素の天然阻害剤及び合成阻害剤も存在している。低分子量ＰＴＰアーゼの最も強力な阻害剤には、イオンのバナジウム酸塩、タングステン酸塩、及びモリブデン酸塩がある。
【００２０】
ＥｐｈＡ２受容体チロシンキナーゼ
ＥｐｈＡ２は１３０ｋＤのタンパク質であり、受容体チロシンキナーゼの最大のファミリーのメンバーである(Andres AC; Reid HH; Zurcher G; Blaschke RJ; Albrecht D; Ziemiecki A. (1994), "Expression of two novel eph-related receptor protein tyrosine kinases in mammary gland development and carcinogenesis," Oncogene 9, 1461-1467; Lidberg et al., Mol. Cell. Biol. 10:6316-6324(1990))。それは主に、上皮細胞起源、例えば乳房、肺、卵巣、結腸等の細胞において発現している。このタンパク質は、ＥＣＫ、Ｍｙｋ２、及びＳｅｋ２としても知られており、エリスロポエチン産生肝細胞性のガン腫細胞系から単離された(Hirai, H., Maru, Y., Hagiwara, K., Nishida, J. and Takaku, F. (1987) "A novel putative tyrosine kinase receptor encoded by the eph gene," Science 238:1717-1720)。多数の名前及び、異なるが関連しているＥｐｈタンパク質の増大しているファミリー、に起因して、命名委員は、前記タンパク質を公的に命名するために会合した(Flanaga JG, Gale NW, Hunter T, Pasquale EB, Tessier-Lavigne M)(1997), "Unified nomenclature for Eph family receptors and their ligands, the Ephrins," Cell 90:403-404)。前記タンパク質は、それらがＧＰＩ連結型又は膜貫通であるリガンドに結合するか否かに依存して、それぞれＥｐｈＡ又はＥｐｈＢと命名された。ＥｐｈＡタンパク質は、エフリン−Ａリガンドに結合し、一方、ＥｐｈＢタンパク質はエフリン−Ｂリガンドに結合する。番号は、それらが発見された順番を表す。
【００２１】
異なる方法がＥｐｈＡ２を単離するために使用されている。初めに、ハイブリダイゼーション技術がＤＮＡライブラリーからＥｐｈＡ２を単離するために使用された (Lindberg et al., Mol. Cell. Biol. 10: 6316-6324 (1990); Hirai, H. , Maru, Y. , Hagiwara, K., Nishida, J. , and Takaku, F. (1987), "A Novel Putative Tyrosine Kinase Receptor Encoded by the Eph Gene,"Science 238, 1717-1720)。次に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が、当該キナーゼのドメインのためのプライマーを用いて利用された(Andres, A. C. , Reid, H. H. , Zurcher, G. , Blaschke, R. J. , Albrecht, D., and Ziemiecki, A. (1994), "Expression of Two Novel eph-related Receptor Protein Tyrosine Kinases in Mammary Gland Development and Carcinogenesis,"Oncogene 9,1461-1467 ; Gilardi-Hebenstreit, P. , Nieto, M. A., Frain, M., Mattei, M. G. , Chestier, A. , Wilkinson, D. G. , and Charnay, P. (1992), "An Eph-related Receptor Protein Tyrosine Kinase Gene Segmentally Expressed in the Developing Mouse Hindbrain, "oncogene 7, 1499-2506)。次に、ｃＤＮＡ発現ライブラリーがホスホチロシン特異的抗体でプローブされた(Zhou, R., Copeland, T. D., Kromer, L. F., and Schultz, N. T. (1994), "Isolation and Characterization of Bsk, a Growth Receptor-like Tyrosine Kinase Associated with the Limblic system," J. Neuro. Res. 37, 129-143)。最後に、モノクローナル抗体が、発ガン性に形質転換している細胞において、チロシンリン酸化されているタンパク質に対してスクリーニングされた(Zantek, N. D. (1999), Ph. D. Thesis, Purdue University)。
【００２２】
ＥｐｈＡ２は、エフリンＡとして知られているリガンドと、エフリンＡ１として同定されている生理学的リガンドと一緒に結合する。リガンド結合は、Ｅｐｈタンパク質のチロシンリン酸化を誘導する。ＥｐｈＡ２は、特に、５個の異なるエフリンリガンドに結合することができる。
【００２３】
ＥｐｈＡ２は、正常な乳房上皮と形質転換した乳房上皮とで特徴的な差異を有する(Zantek, N. D. (1999), Ph. D. Thesis, Purdue University)。正常な乳房上皮において、ＥｐｈＡ２は低いタンパク質レベルで存在し、それがチロシンリン酸化され、そして、最終的に、細胞間接着部位において局在する。形質転換した乳房上皮において、高タンパク質レベルのＥｐｈＡ２が存在しており、それはもはやチロシンリン酸化されず、そして膜ラッフル内に局在する。
【００２４】
ＥｐｈＡ２は、ガンにおいて機能的な役割を有することが明らかとなっている。過剰発現した場合、ＥｐｈＡ２は強力な発ガン性タンパク質である (Zelinski, D. P. , Zantek, N. D., Stewart, J. , Irizarry, A. & Kinch, M. S. (2001) Cancer Res 61, 2301-2306)。ＭＣＦ−１０Ａ細胞におけるＥｐｈＡ２の過剰発現は、悪性転換をもたらす。また、これらの過剰発現細胞のヌードマウスへの注入は腫瘍を引き起こす。興味深いことに、ガン細胞及びＥｐｈＡ２過剰発現細胞におけるＥｐｈＡ２は、チロシンリン酸化されず、一方、非形質転換細胞におけるＥｐｈＡ２はチロシンリン酸化される。
【００２５】
ＥｐｈＡ２を制御することが本明細書で証明されているＬＭＷ−ＰＴＰはまた、Ｅｐｈファミリーの別のメンバーであるＥｐｈＢ１と相互作用することが証明されている(Stein, E. , Lane, A. A., Cerretti, D. P. , Schoecklmann, H. O., Schroff, A. D. , Van Etten, R. L. , and Daniel, T. O. (1998), "Eph Receptors Discriminate Specific Ligand Oligomers to Determine Alternative Signaling Complexes, Attachment, and Assembly Responses," Genes & Dev. 12,667-678)。
【００２６】
ＬＭＷ−ＰＴＰ活性の治療的阻害
低分子量タンパク質チロシンホスファターゼ（ＬＭＷ−ＰＴＰ）は、多数の腫瘍細胞において過剰発現している。以下の例は、ＥｐｈＡ２のホスホチロシン含量はＬＭＷ−ＰＴＰによってネガティブに制御され、発ガンにおけるこのホスファターゼの役割を確立していることを示している。それらは更に、ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現が、ＥｐｈＡ２のレベルの同時の増大を誘導し、且つ非形質転換上皮細胞に悪性転換を賦与するのに十分であることを示している。ＬＭＷ−ＰＴＰの増大した活性化又は発現と関連している発ガン（ガン細胞がＥｐｈＡ２を発現するか否か）は、本発明に従いＬＭＷ−ＰＴＰの活性を阻害することによって処置又は予防されうる。
【００２７】
これらの発見は、予防方法及び治療方法の標的としてＬＭＷ−ＰＴＰを確立する。ＬＭＷ−ＰＴＰの活性を阻害することによって、ＥｐｈＡ２の脱リン酸は遅延又は予防され、それによって望ましくはＥｐｈＡ２の活性を変化させ、そしてガンの進行を予防又は逆転しうる。
【００２８】
ＬＭＷ−ＰＴＰの活性の阻害をもたらす処置は、それ故に、ガン患者の病状における望ましい変化を伴うことが予期される。ガン患者の病状における望ましい変化には、例えば全身腫瘍組織量(tumor burden)の減少、腫瘍増殖の遅延、病期の進行の予防又は繰延及び転移の予防又は繰延、が含まれる。患者の病状の望ましい変化は、Ｘ線撮影、断層撮影、生化学的アッセイ等を含む任意な常用の方法を用いて検出されうる。
【００２９】
従って、本発明は、哺乳類、好ましくはヒトのガンを処置する方法を提供する。当該方法はまた、脊椎動物への応用、例えば、ペット、例えばネコ又はイヌのガンの処置、に良く適している。当該方法は、ＬＭＷ−ＰＴＰを過剰発現する細胞、特に、過剰発現し、又は機能的に変化したＥｐｈＡ２チロシンキナーゼ受容体を更に有する乳房、前立腺、結腸、肺、膀胱、卵巣、膵臓及び皮膚（黒色腫）の転移性ガン腫細胞、を特徴とするガンを処置するのに有効である（例えば、Kinch et al., Clin. Cancer Res. , 2003,9 (2): 613-618 ; Kinch et al. , Clin. Exp. Metastasis, 2003,20 (1) : 59-68; Walker-Daniels et al. , Am J. Pathol. , 2003, 162 (4): 1037-1042; Zelinski, D. P. , Zantek, N. D. , Stewart, J., Irizarry, A. & Kinch, M. S. (2001) Cancer Res 61, 2301-2306; Zantek, N. D. (1999), Ph. D. Thesis, Purdue Universityを参照のこと）。ＬＭＷ−ＰＴＰの生体活性を阻害する処置物質は、哺乳類に対し、全身的に又はガン腫瘍部位に、ＥｐｈＡ２の生体活性を阻害するのに有効な量で導入される。任意には、当該処置物質は薬物、好ましくは細胞毒性薬と連結されることがあり、それによって、ＬＭＷ−ＰＴＰを阻害し、且つ当該細胞毒性薬のためのキャリヤー分子として役割を果たすという二重の活性を有する。生じた分子複合体が開裂可能な治療物質を含む場合、処置には、開裂を達成するための更に別の物質の送達が含まれることがある。
【００３０】
ＬＭＷ−ＰＴＰ活性の「阻害」は、処置の前のＬＭＷ−ＰＴＰ活性と比較して評価されうる。典型的に、これは、細胞系、例えば以下の実施例に記載のものを用いて、研究室の設定において評価される。ヒトのガン研究において慣習的に使用されるモデル系の研究室の設定においてＬＭＷ−ＰＴＰ活性の阻害を引き起こす処置物質の、患者に対する投与は、in vivoでの患者の細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰ活性の阻害をもたらすことが十分に予期される。本発明の方法が、ＬＭＷ−ＰＴＰ活性が標的細胞において阻害される方法、又はその範囲に限定されないことを理解すべきである。
【００３１】
ＬＭＷ−ＰＴＰ活性の阻害方法には、例えば１又は複数のＬＭＷ−ＰＴＰ酵素（例えばＨＰＴＰ−Ａ及びＨＰＴＰ−Ｂ）をコードする遺伝子に直接働くもの、当該遺伝子によって産生されるｍＲＮＡ転写物、当該ｍＲＮＡ転写物の前記タンパク質への翻訳を妨害するもの、及び当該翻訳タンパク質の活性を直接損なうもの、が含まれる。
【００３２】
遺伝子の転写は、前記細胞をアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡ分子あるいは二本鎖ＲＮＡ分子を送達することによって妨害されうる。例としてはｓｉＲＮＡ及びｉＲＮＡがある。酵素活性を阻害し得る別の方法は、前記遺伝子のｍＲＮＡ転写産物を妨害することによるものである。例えば、リボザイム（又はリボザイムを作用可能にコードするＤＮＡベクター）は、標的ｍＲＮＡを開裂するよう前記細胞に送達されうる。アンチセンス核酸及び二本鎖ＲＮＡはまた、翻訳を妨害するために使用されることもある。
【００３３】
本発明は、前記処置物質を送達するために使用される方法に限定されない。当該処置物質がポリペプチド、例えばＤ１２９Ａ ＬＭＷ−ＰＴＰである場合、それは、都合よくは、細胞に一旦送達されると転写され、そして翻訳するように作用可能に前記処置物質をコードするＤＮＡ分子を当該細胞内に導入することによって、遺伝子治療の態様で送達されうる。ＤＮＡは裸のＤＮＡであってもよく、あるいはそれはベクターの一部として準備されてもよい。ベクターは、ウイルス性又は非ウイルス性のものでもよく（例えば、プラスミド又はコスミド）、組込み又は非組込みのものであってもよい。ウイルスベクターの例には、レトロウイルスベクター及びアデノウイルスベクターが含まれる。
【００３４】
ペプチド、リガンド、リガンドミミック、ペプチドミメティック化合物及び他の小分子は、前記翻訳タンパク質の活性を直接損なわせるのに使用されうるものの例である。任意には、これらの物質は、送達担体、例えばリポソームを用いて導入され得る。あるいは、ＬＭＷ−ＰＴＰの活性を阻害するタンパク質性の細胞内物質は、核酸、例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、又はそれらのアナログ又は組み合わせとして、常用の方法を用いて送達されることがあり、ここで、治療用ポリペプチドは前記核酸によってコードされ、そして標的哺乳類細胞において発現するよう作用可能に制御因子に連結している。
【００３５】
ＬＭＷ−ＰＴＰ活性の阻害における使用に好ましい処置物質には、小分子、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及び基質ミミック（例えば、非加水分解性又は基質捕捉性阻害剤）が含まれる。処置物質は、基質に似ているアンタゴニスト、又はＬＭＷ−ＰＴＰがその基質に結合するのを妨害するアンタゴニスト、特にＥｐｈＡ２−ＬＭＷ−ＰＴＰの相互作用を妨害するもの、を含むことがある。リン酸ピロドキサールに似ている小分子が特に好ましく、例えば、リン酸ピロドキサールのリン酸基をホスホン酸又はスルホン酸で置換しているものである。ＬＭＷ−ＰＴＰの活性部位が標的となることもあり、特にＴｙｒ１３１、Ｔｙｒ１３２及びＡｓｐ１２９である。例えば、以下の実施例において示すように、基質捕捉変異体であるＬＭＷ−ＰＴＰタンパク質Ｄ１２９Ａ（１２９位のＡｓｐがＡｌａ）は、野生型ＬＭＷ−ＰＴＰに対して有効に競合して、正常な上皮の形態を形質転換した細胞に対し戻す。ＢＰＴＰのＸ線結晶構造が解明されているので、特に治療的に有用であることが予期されるＬＭＷ−ＰＴＰの高度に特異的な阻害剤を同定し、又は設計するための合理的な薬物設計が使用されうる。
【００３６】
前記処置方法の好ましい態様には、ＬＭＷ−ＰＴＰを標的とする第一の処置物質及びＥｐｈＡ２を標的とする第二の処置物質をガン患者に投与することを含む。当該処置物質は、任意の順番で投与されてもよく、あるいは同時に投与されてもよい（同時投与）。ＬＭＷ−ＰＴＰ又はＥｐｈＡ２を標的とする多数の処置物質が投与されることもある。
【００３７】
ＥｐｈＡ２を標的とする処置物質は、例えば抗体、小分子、ペプチド、リガンド若しくはリガンドミミック、又はアンチセンス核酸であってもよい。前記方法の１つの側面において、前記第二の処置物質は、受容体分子上に細胞外エピトープを結合させることによってＥｐｈＡ２を「活性化」する。リガンドを媒介する活性化は、ＥｐｈＡ２のホスホチロシン含量の増大を特徴とし、そしてＥｐｈＡ２活性の望ましい変化を伴う。「ＥｐｈＡ２活性の望ましい変化」とは、細胞増殖を抑止又は反転させるような、あるいはガン細胞の死滅を惹起又は生じさせるような、ガン細胞におけるＥｐｈＡ２受容体の活性、数字（すなわちタンパク質レベル）及び／又は機能、の変化を意味する。細胞増殖(growth)又は増殖(proliferation)の抑止又は反転は、ガン細胞における種々の表現型の変化、例えば分化の増大、ＥＣＭタンパク質についての親和性の低下、細胞間接着の増大、増殖速度の遅延、ＥｐｈＡ２の数の低下及び／又はＥｐｈＡ２の局在化の増大、細胞遊走又は浸潤の低下、によって証明することができ、そして直接的又は間接的に引き起こされうる。任意に、第二の処置物質はＥｐｈＡ２架橋、及び／又はＥｐｈＡ２の分解の加速、をもたらす。本発明の別の側面において、当該第二の処置物質は、標的のガン又は前ガン性の細胞におけるＥｐｈＡ２の発現を、ＤＮＡ／ＲＮＡレベルで、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合を介して低下させる。
【００３８】
ガン又は前ガン性の症状の検出
ＬＭＷ−ＰＴＰはまた、哺乳類、好ましくはヒトにおけるガン又は前ガン性の症状のマーカーとしての役割を果たすことがある。本発明は、それ故に、生体試料中のＬＭＷ−ＰＴＰを検出し、そして、任意にそれらの量又は活性を定量することによって、ガン性又は前ガン性の症状を診断し、あるいはガンを病期決定(staging)する方法も含む。本発明の診断方法は、ガンの最初の診断を得て、又はそれを確認し、あるいはガンの局在、ガンの転移、又はガンの予後についての情報を提供するために使用されることもある。前記方法は、ヒト及び獣医学的な使用にも応用可能である。
【００３９】
前記診断方法の１つの態様において、哺乳類から得られた生体試料、例えば組織、器官又は体液が解析される。当該方法は、任意に、哺乳類から生体材料を取り出す段階を含む。当該生体材料中に存在する細胞は可溶化され、そして当該可溶化物は、ポリクローナル又はモノクローナルＬＭＷ−ＰＴＰ抗体と接触される。生じた抗体／ＬＭＷ−ＰＴＰ結合複合体は、それ自体検出可能であるか、あるいは別の化合物と会合して検出可能な複合体を形成することができる。結合抗体は、ＥＬＩＳＡ又は類似のアッセイで直接検出することができ；あるいは、診断物質が検出可能な標識を含んで成ることがあり、そして当該検出可能な標識は、当業界で知られている方法を用いて検出されることがある。
【００４０】
ＬＭＷ−ＰＴＰが検出可能に標識された診断物質、例えば抗体、の結合を介して検出される診断方法の態様において、好ましい標識には、色素生産性色素、蛍光標識及び放射性標識が含まれる。最も一般的に使用されるものには、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）及び３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（ＤＡＢ）がある。これらは光学顕微鏡を用いて検出されうる。
【００４１】
最も一般的に使用される蛍光標識化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド(phthaldehyde)及びフルオレサミンである。化学発光及び生物発光化合物、例えばルミノール、イソルミノール、セロマティック(theromatic)アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステル、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、及びエクオリンも使用されうる。蛍光標識抗体が適切な波長の光に曝露される場合、その存在はその蛍光により検出されうる。
【００４２】
本発明の抗体の標識に特に有用な放射性同位体には、3Ｈ、125Ｉ、131Ｉ、35Ｓ、32Ｐ、及び14Ｃが含まれる。放射性同位体は、ガンマカウンター、シンチレーションカウンターのような手段によって、又はオートラジオグラフィーによって検出されうる。
【００４３】
抗体−抗原複合体は、ウェスタンブロッティング、ドットブロッティング、沈殿、凝集、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学、in situハイブリダイゼーション、様々な組織又は体液に対するフローサイトメトリー及び様々なサンドウィッチアッセイ、を用いて検出されうる。これらの技術は当業界で周知である。例えば、引用によって本明細書に組み入れられる、米国特許第５，８７６，９４９号を参照のこと。酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）において、酵素は、その後その基質に曝露される場合、当該基質と反応し、そして、例えば分光光度的、蛍光光度的、又は視覚的手段によって検出され得る化学的部分を生成させる。検出可能に抗体を標識するために使用されうる酵素には、限定しないが、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカルヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、及びアセチルコリンステラーゼが含まれる。抗体を標識し、そして検出する他の方法は当業界で知られており、そして本発明の範囲内にある。
【００４４】
前記診断方法の別の態様において、生体材料は、ＬＭＷ−ＰＴＰホスファターゼ活性についてアッセイされる。使用するアッセイに依存して、この方法は、哺乳類に存在するか、又は哺乳類から取り出された生体材料上で実施されうる。例えば、哺乳類から得られる生体材料は、ＬＭＷ−ＰＴＰホスファターゼ活性についての生化学的アッセイにかけられることがある。検出はまた、ＬＭＷ−ＰＴＰタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡに結合する検出可能な試薬を用いることによって達成されうる。
【００４５】
ＬＭＷ−ＰＴＰは、ガン、前ガン性又は転移性疾患のためのマーカーとして、広範な組織試料、例えば、生検された腫瘍組織及び広範な体液試料、例えば血液、血漿、髄液、唾液、及び尿において使用されることがある。
【００４６】
ガンの存在又は不在及び病状に関する更なる情報を提供するために、他の抗体が、ＬＭＷ−ＰＴＰに結合する抗体と組み合わせて使用されることもある。例えば、抗ＥｐｈＡ２又はホスホチロシン特異的抗体の使用は、悪性度をの検出又は評価を決定するための追加のデータを提供する。
【００４７】
ガンの処置の有効性の指標としてのＬＭＷ−ＰＴＰ活性
ＬＭＷ−ＰＴＰは、ガンの治療剤、特にＥｐｈＡ２を標的とするものの有効性を評価するための代理マーカーとしての役割を果たすことがある。ＬＭＷ−ＰＴＰを過剰発現するガン細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの量又は活性（コントロール）は、候補の治療剤で処置された類似のガン細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの量又は活性と比較される。処置された細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの量又は活性の低下は、有効なガンの処置を示唆するものである。
【００４８】
本発明は、以下の実施例によって例示される。特定の例、材料、量及び手順が、本明細書に記載のような本発明の範囲及び精神に従い広く解釈されるべきであると理解されるべきである。
【実施例】
【００４９】
実施例Ｉ．低分子量タンパク質チロシンホスファターゼ及びＥｐｈＡ２を包含するタンパク質間相互作用
材料と方法
タンパク質の産生。アンピシリン、Ｎ−Ｚ−アミンＡ（カゼイン加水分解産物）、ＩＰＴＧ、及びＳＰ−セファデックスＣ−５０は全てＳｉｇｍａから入手した。ＳＰ−セファデックスＧ−５０は、Ｐｈａｒｍａｃｉａから購入した。ＹＭ３膜はＡｍｉｃｏｎから入手した。全ての他の材料は、Ｓｉｇｍａ又はＢｉｏＲａｄのいずれかから購入した。
【００５０】
細胞系。この研究に使用した細胞モデルは、乳房上皮である。この研究室において一般的に使用される細胞系はＭＣＦ−１０Ａである。この細胞系は、ＭＣＦ−１０細胞のファミリーの一部であり、これは樹立された不死化ヒト乳腺上皮細胞系である。ＭＣＦ−１０細胞は、線維嚢胞性疾患の成人女性の乳腺組織から単離された。ＭＣＦ−１０Ａ細胞は、接着細胞として増殖する。ＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞系は、ネオマイシン耐性遺伝子を有する親細胞系のＭＣＦ−１０Ａ細胞である。MDA-MB-２３１細胞系は高度に浸潤性で且つ転移性の乳腺細胞系である。これらの細胞は、乳ガンを有する成人女性から単離された。
【００５１】
これらの細胞の世話は、２日毎に、培地を新しくし、又はそれらを分割することによりそれらを扱うことから成る。当該細胞を分割するために、培地は吸引によって最初に除去した。細胞を２〜３ｍｌのＰＢＳ中で洗浄し、続いてトリプシン溶液（ＰＢＳ中で１：５０に希釈した２〜３ｍｌのもの）を添加し、そしてプレートを３７℃のインキュベーター内に１０〜３０分間据えた。次に、２〜３ｍｌの培地を各プレートに添加した。ＰＢＳ／トリプシン溶液及び培地中の細胞を、卓上遠心機で遠心してペレットにした。ＰＢＳ／トリプシン溶液及び培地を吸引し、そして細胞を培地中で再懸濁した。細胞を続いて組織培養ディッシュにプレーティングした。
【００５２】
ＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞の増殖培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、５．６％ウマ血清、２０ｎｇ／ｍｌの上皮増殖因子（これらは全て、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ．， Ｉｎｃ．から購入）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、１０μｇ／ｍｌのインスリン（Ｓｉｇｍａ）、０．２５μｇ／ｍｌのフンジゾン(fungizone)、及び２ｎＭのＬ−グルタミンから成る。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の増殖培地は、ＲＰＭＩ、２ｎＭのＬ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び１００ユニット／ｍｌのペニシリンから成る。
【００５３】
抗体。ＥＰｈＡ２の細胞内ドメインを認識する抗体はＤ７である（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ニューヨーク）。このモノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、Zantek, N. D. (1999), Ph. D. Thesis, Purdue Universityにおいて述べられているように、バルクの培養物から産生された。この抗体による免疫沈降のために、３０μｌを使用した。イムノブロットのために、ＴＢＳＴＢ（３０ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６、１ｍｌのＴｗｅｅｎ−２０、１ｇのＢＳＡ、及び９２０ｍｌの蒸留水）中で１：１希釈したものを使用した。免疫蛍光顕微鏡のために、抗体は希釈せずに使用した。
【００５４】
ＨＰＴＰに対するモノクローナル抗体（１０．１及び７．１）は、Alfred Schroff, Ph. D. Thesis, Purdue Universityにおいて述べられているように開発した。免疫沈降の場合、１０．１（α−ＨＰＴＰ−Ｂ）を１０μｌ使用した。イムノブロッティングの場合、当該抗体はＴＢＳＴＢ中で１：１００に希釈した。免疫蛍光顕微鏡の場合、当該抗体はＰＢＳ中で１：１０に希釈した。同一の条件を、ＨＰＴＰに対する外のＭＡｂ、７．１（α−ＨＰＴＰ−Ａ／Ｂ）に使用した。ＨＰＴＰに対するポリクローナル抗体の場合、１０μｌの抗体を免疫沈降に使用した。イムノブロッティングの場合、当該抗体はＴＢＳＴＢ中に１：２０００で希釈した。免疫蛍光顕微鏡の場合、当該抗体は、ＰＢＳ中で１：１００に希釈した。
【００５５】
ホスホチロシンを検出するために、４Ｇ１０として知られている抗体を使用した。この抗体は、大量培養で産生した。イムノブロッティングの場合、ＴＢＳＴＢ中での１：１希釈を使用した。免疫蛍光顕微鏡に使用した二次抗体は、PBS中で１：４０希釈したＤＡＲ−Ｆ１及び／又は１：００希釈したＤＡＭ−Ｒｈであった。イムノブロッティング実験の場合、ヤギ抗マウス（ＭＡｂ用）又はヤギ抗ウサギ（ＰＡｂ用）をＴＢＳＴＢ中で１：１０，０００希釈して使用した。
【００５６】
アフィニティーマトリックス。プロテイン−ＡセファロースをＳｉｇｍａから購入した。Ａｆｆｉ−ゲル１０はＢｉｏＲａｄから購入した。
【００５７】
他の材料。他の材料は、Ｆｉｓｈｅｒ、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｍａｌｉｎｃｋｒｏｄｔ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＱＩＡＧＥＮ、及びＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから購入した。
【００５８】
ＬＭＷ−ＰＴＰの発現及び精製。増殖培地（Ｍ９ＺＢ）は以下のように調製した：４Ｌのフラスコ中、２０ｇのＮ−ＺアミンＡ（カゼイン加水分解産物）、１０ｇのＮａＣｌ、２ｇのＮＨ4Ｃｌ、６ｇのＫＨ2ＰＯ4、及び１２ｇのＮａ2ＨＰＯ4Ｈ2Ｏを２Ｌの蒸留水中に溶解した。培地のｐＨを続いてＮａＯＨのペレットで７．４に調整した。５００ｍｌのフラスコに対し、２００ｍｌのＭ９ＺＢ溶液を注いだ。培地の２つの容器を続いて２０分間オートクレーブした。室温に冷却した後、ろ過滅菌した、２０ｍＬの４０％グルコース及び２ｍＬの１ＭＭｇＳＯ4溶液を２Ｌの培地当たり添加した。播種直前に、２００μｌの５０ｍｇ／ｍＬアンピシリンを、２００ｍｌ（Ｍ９ＺＢ）培地を含むフラスコに添加した。注目の遺伝子を有する組換えプラスミドを含むＥ．コリのＢＬ２１株の２００ｍｌの培養物を、２５０〜３００ｒｐｍ、３７℃に設定した旋回シェーカー上で一晩生育させた。
【００５９】
次の日、１．８ｍｌの５０ｍｇ／ｍｌアンピシリンを残りの１．８Ｌの新鮮な培地に添加した。一晩経過した培地を、続いて新鮮な（Ｍ９ＺＢ）培地中で１：１０に希釈し、そして細胞を更に３時間増殖させた。６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ600）が０．６〜１．０の間に達したとき、２ｍｌの４ｍＭＩＰＴＧを添加してタンパク質発現を誘導した。培養物は、ＷＴ−ＰＴＰアーゼの場合には更に３時間、又は変異体ＰＴＰアーゼの場合には更に６時間、３７℃でインキュベートした。細胞は、５０００ｒｐｍで１５分間の冷却遠心によって収集した。上清を４Ｌのフラスコに注いで戻し、続いて廃棄する前に２０分間オートクレーブした。細胞ペレットを１０ｍＬの０．８５％ＮａＣｌ中で再懸濁し、そして洗浄し、再び５００ｒｐｍで遠心してペレットにし、続いて２ｍＬの０．８５％ＮａＣｌ中で再懸濁した。混合物を小さい遠心管中に据え、続いて５０００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を捨て、そしてペレットを−２０℃で一晩保存するか、又は直ちに可溶化した。
【００６０】
細胞ペレットを融解し（妥当ならば）、続いて１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１ｍＭ ＤＴＴを含む、ｐＨ５．０の１００ｍＭ ＣＨ3ＣＯＯＮａ緩衝液中で再懸濁した。ＤＴＴを使用直前に添加した。細胞は、それらを、１００ｐｓｉの圧力ゲージに設定した予め冷やした、フレンチプレッシャーセルに２回かけることによって破壊した。可溶化物は、１６，０００ｒｐｍで１５分間、冷却遠心機内で遠心してペレットにした。上清を新しい遠心管中に注ぎ、続いて、３０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び６０ｍＭ ＮａＣｌを含む、ｐＨ４．８の１０ｍＭ ＣＨ3ＣＯＯＮａ緩衝液で予め平衡化したＳＰ−セファデックスＣ−５０陽イオン交換カラム（１．５ｘ３０ｃｍ）に添加した。
【００６１】
Ｃ−５０カラムを、１０倍量の総容積の１０ｍＭ ＣＨ3ＣＯＯＮａ緩衝液で、Ａ280が大体ゼロになるまで洗浄した。続いて、高塩濃度の溶液である、ｐＨ５．１の３００ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4及び１ｍＭ ＥＤＴＡでタンパク質を溶出した。流速は３０〜４０ｍＬ／時間に設定した。回収した各画分には約６ｍｌ含まれていた。最高のＡ280を有する画分を、タンパク質純度を得るために、１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離した。最も純粋な画分をまとめ、続いてＡｍｉｃｏｎ限外ろ過装置を用いて大体５ｍｌに濃縮した。濃縮液は、３０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び６０ｍＭ ＮａＣｌを含む、ｐＨ４．８の１０ｍＭ ＣＨ3ＣＯＯＮａ緩衝液で予め平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０サイズ排除カラムに添加した。流速は１５〜２５ｍｌ／時間に設定し、そして約６ｍＬの画分を回収した。最高のＡ280を有する画分を、タンパク質純度を得るために１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で試験した。最も純粋な画分をまとめ、そしてＧ−５０緩衝液中で４℃で保存した。
【００６２】
免疫蛍光顕微鏡。最大５枚のカバーガラスを３．５ｃｍディッシュ上に据えた。特定の研究に適切な細胞系を、使用の２４時間前にこれらのディッシュ内に据えた。細胞は通常この時間までに６０〜７０％コンフルエントに達した。細胞を３．７％ホルムアルデヒド溶液中に２分間固定し、続いて１％Ｔｒｉｔｏｎ中で５分間透過処理し、そしてユニバーサルバッファー（ＵＢ）中で５分間洗浄した。細胞は、続いて室温で一次抗体と３０分間インキュベートした。次に、細胞をＵＢ（１２ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６、４ｍｌの１０％アジド）中で５分間洗浄した。細胞は続いて２次抗体と一緒に３０分間インキュベートした。蒸留水中で簡単に５秒間洗浄した後、カバーガラスを、表を下にして、スライドガラス上の約５μｌのＦｌｕｏｒＳａｖｅ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の上に据えた。細胞を室温で約１５分間乾燥させ；続いて、それらを「Ｌｏｗ」に設定したヘアドライヤーのもと、更に１５分間又は乾くまで静置した。細胞は、蛍光顕微鏡の油浸レンズ（６０ｘ）で観察した。
【００６３】
免疫沈降。モノクローナル抗体による免疫沈降（ＩＰ）の場合、ウサギ抗マウスプロテインＡセファロース（ＲＡＭＰＡＳ）を使用した。ポリクローナル抗体によるものの場合、プロテインＡセファロース（ＰＡＳ）を使用した。ビーズは、最初に、プロテインＡセファロースを、１．５ｍＬの遠心管の１００μｌの印まで添加することによって調製した。次に、１ｍｌのＵＢを添加してビーズを膨潤させた。ＲＡＭＰＡＳの場合、５０μｌ／ｍｌのウサギ抗マウス（ＲＡＭ）ＩｇＧもビーズとＵＢの遠心管に添加した。混合物は、者移転スターラー上で一晩４℃で回転させた。次の日、ビーズを３回１ｍｌのＵＢ中で洗浄した。続いて、ビーズをＵＢ中５０％のスラリーにした。
【００６４】
細胞のプレートを氷上に据えた。細胞を２〜３ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した。その後、細胞は、１ｍＭのＮａ3ＶＯ4、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、及び１０μｇ／ｍｌのアプロチニンを含む、１％Ｔｒｉｔｏｎ可溶化緩衝液（５ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６、３ｍｌの５ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍｌの１０％ＮａＮ3、１ｍｌの２００ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍｌの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、８０ｍｌの蒸留水）又はＲＩＰＡ可溶化緩衝液（５ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６、３ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍｌの１０％ ＮａＮ3、１ｍｌの２００ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍｌの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５ｍｌの１０％デオキシコール酸、５００μｌの２０％ ＳＤＳ、７４．５ｍｌの蒸留水）中、氷上で５分間可溶化した。可溶化物を回収し、そして各組の可溶化物を、クーマシータンパク質アッセイ試薬を用いて等しいタンパク質含量に標準化した。５９０ｎｍの吸光度を測定するためにプレートリーダーを使用した。前記可溶化物を適切な可溶化緩衝液で平衡化した後、試料を調製した。
【００６５】
各試料につき、３０μｌのＰＡＳ（又はＲＡＭＰＡＳ）を各試料チューブに添加した。次に、一次抗体を添加した。最後に、前記可溶化物の１５０〜２００μｌ部分を添加した。試料を４℃で１．５時間又は一晩回転させた。試料は、続いて、細胞を可溶化するのに使用したものと同じ、１ｍｌの可溶化緩衝液中で洗浄した。最後の洗浄の後、１５μＬのＬａｅｍｍｌｉ緩衝液をペレット化したビーズに添加し、そして試料を１０分間沸騰させた。その後、試料は、２２０Ｖに設定した１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上に添加して１．７５時間分離した。タンパク質分離の後、タンパク質をニトロセルロースに一晩かけて移した。
【００６６】
基質捕捉。精製した、触媒として不活性のＬＭＷ−ＰＴＰ組換え変異体であるＤ１２９Ａ−ＢＰＴＰ及びＣ１２Ａ−ＢＰＴＰを、潜在的な基質捕捉を作り出すために使用した。アフィニティーサポートは、最初に１〜１．５ｍｌのＡｆｆｉゲル１０を、複数の容積の冷却した蒸留水中で洗浄することによって調製した。次に、モイストゲルを、５ｍｇ／ｍｌの純粋なＰＴＰアーゼと一緒に１５ｍｌのコニカルチューブに添加した。当該チューブを４℃で４時間回転させ、そしてタンパク質をビーズに結合させた。その後、１ｍｌのＡｆｆｉゲル当たり１００μｌのエタノールアミンを添加して、タンパク質と結合しなかった反応性ゲル部位をブロックし、つづいて当該チューブを更に１時間回転させた。スラリーを小さいプラスチックカラム内に注いだ。ビーズをカラム内に静置させ、それらを続いて２０ｍｌの蒸留水で洗浄した。洗浄液のｐＨを測定した。７以上である場合、ｐＨを１ｍＭのＨＣｌで調整した。次に、Ａ280を測定した。ゼロ付近でない場合、Ａ280がゼロ付近に達するまで洗浄を続けた。カラムは、使用するまで４℃で保存した。
【００６７】
前記可溶化物を利用する前に、カラムを１０ｍｌの蒸留水で３回洗浄し、続いて適切な可溶化緩衝液中で平衡化した。細胞は、適切な可溶化緩衝液中で５分間、氷上で可溶化した。可溶化物を回収し、そしてカラムに添加して様々な時間４℃でインキュベートした。続いて、ビーズを適切な可溶化緩衝液中で３回洗浄した。Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液をビーズに添加し、これを１０分間煮沸した。試料を１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離し、そして最終的にニトロセルロースに一晩かけて移した。
【００６８】
脱リン酸。ＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞を８０％コンフルエントにまで増殖させた。細胞を１％Ｔｒｉｔｏｎ可溶化緩衝液中、５分間氷上で可溶化した。可溶化物を回収し、一まとめにした。ＥｐｈＡ２ ＩＰを調製した：３０μｌのＤ７、３０μｌのＲＡＭＰＡＳ、及び２００μｌの可溶化物。当該ＩＰを１．５時間４℃で混合した。それらを５００μｌのＴｒｉｔｏｎ可溶化緩衝液中で２回洗浄し、続いて５００μｌの蒸留水中で２回洗浄した。各ペレットを１０ｍＭの５０μｌ ＣＨ3ＣＯＯＮａ緩衝液中で再懸濁し、そしてチューブを３７℃のウォーターバス内に５分間据えて温度を生理学的条件に調整した。次に、選択した濃度の５００μｌのＰＴＰアーゼ溶液をチューブに添加し、ＥｐｈＡ２と選択した時間反応させた。当該反応終了時に、ビーズをペレット化し、そして上清を吸引によって除去した。Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液を各試料に添加し、そしてそれらを１０分間煮沸した。最後に、タンパク質を１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離し、そして一晩かけてニトロセルロース膜上に移した。
【００６９】
イムノブロッティング。前記ニトロセルロース膜をＰｏｎｃｅａｕ Ｓで染色して、分子量マーカーの位置を同定して印をつけた。当該膜を複数回蒸留水中ですすぎ、色素を除いた。当該膜上の非特異的部位を、Ｔｅｌｅｏｓｔｅａｎゼラチン（５０ｍｌのＴＢＳＴＢ及び「茶」色を呈すのに十分なゼラチン）溶液でブロッキングした。当該膜を当該ブロッキング溶液中、室温で３０分間インキュベートした。次に、当該膜を一次抗体と一緒に３０分間インキュベートした。当該膜を３回、それぞれＴＢＳＴＢ中で１０分間洗浄し、これに続き、二次抗体と一緒に３０分間インキュベートした。その後、当該膜を３回、ＴＢＳＴＢ中でそれぞれ８分間インキュベートし、続いて２回、ＴＢＳ（３０ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６、９２０ｍｌの蒸留水）中でそれぞれ６分間インキュベートした。次に、化学発光試薬を膜に添加した（１：１）。最後に、フィルムを膜に曝露し、これをサランラップで包み、そして現像した。
【００７０】
小規模のＤＮＡ精製。ＨＰＴＰ遺伝子を含むプラスミドｐＥＴ−１１ｄを、ＱＩＡＧＥＮから市販されているＱＩＡｐｒｅｐ Ｍｉｎｉｐｒｅｐを用いてＥ．コリのＢＬ２１株から精製した。ＨＰＴＰ−Ａ及びＨＰＴＰ−Ｂを含むＥ．コリをいずれも、しかし別々に、ＬＢ／Ａｍｐプレート上にストリーキングした。両プレートを３７℃のインキュベーター内に一晩据えた。次の日、３ｍｌのＬＢ培地及び６μｌのアンピシリンを２つの滅菌スナップトップチューブ内に据えた。当該チューブを、続いてＨＰＴＰ−Ａ又はＨＰＴＰ−Ｂとラベルした。各プレート由来の１つのコロニーを使用し、それぞれラベルしたチューブに、ＨＰＴＰ−Ａ遺伝子又はＨＰＴＰ−Ｂ遺伝子を含むコロニーを播種した。当該チューブを、２５０ｒｐｍに設定したシェーカー上に一晩（１２〜１６時間）載せた。次の日、培地を遠心してペレットにし、そして上清を吸引で除去した。
【００７１】
ＱＩＡｐｒｅｐ Ｍｉｎｉｐｒｅｐプロトコールを用いて、細菌のペレットからＤＮＡを精製するために、細菌のペレットを２５０μｌの緩衝化ＲＮアーゼＡ溶液（緩衝液Ｐ１）中で再懸濁した。次に、細胞懸濁液をマイクロチューブ内に据え、そして、ＮａＯＨ及びＳＤＳを含む２５０μｌのアルカリ性可溶化緩衝液（緩衝液Ｐ２）中に据えた。当該チューブを穏やかに５回反転させた。可溶化は５分間実施した。混合物は、つづいて、３５０μｌの中和緩衝液（緩衝液Ｎ３）を添加することによって中和した。
【００７２】
当該チューブを１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、情勢をＱＩＡｐｒｅｐスピンカラムに移した。当該スピンカラムを２ｍｌの回収チューブ内に据えた。一緒に、それらを遠心機に据え、そして１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。フロースルーを廃棄した。次に、当該スピンカラムを７５０μｌの緩衝液ＰＥで洗浄し、そして１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。フロースルーの廃棄後、当該スピンカラムを１回以上１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。当該スピンカラムを、きれいなマイクロチューブ内に据え、そしてＤＮＡを６０μｌの緩衝液ＥＢで溶出し、そして−２０℃で保存した。
【００７３】
コード領域の増幅。ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、遺伝子のコード領域を増幅させた。フォワード鎖のために設計したプライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含む：AAT TTA AAG CTT CCA TGG CGG AAC AGG CTA CCA AG（配列番号１）。リバース鎖のために設計したプライマーは、ＥｃｏＲＩ制限部位を含む：CGT TCT TGG AGA AGG CCC ACT GAG AAT TCT TCG T（配列番号２）。リバース鎖のために設計した追加のプライマーは、ＢａｍＨ Ｉ制限部位を含む：GCG CGC GGA TCC TCA GTG GGC CTT CTC C（配列番号３）。
【００７４】
要約すると、４０μｌの蒸留水、５μｌの１０ｘ緩衝液、１μｌのフォワードプライマー、１μｌのリバースプライマー、１μｌのｄＮＴＰ及び１μｌのｐｆｕポリメラーゼから成る５０μｌの反応混合物を調製した。反応混合物は、以下のサイクルに設定したサーマルサイクラー内に据えた：９４℃で２分間、９４℃で１分間、５５℃で１分間、６５℃で１分間、６５℃で１０分間、続いて４℃で維持。２〜４のステップを、次の６５℃で１０分間のステップに進む前に３０回繰り返した。
【００７５】
前記サイクルが終了してから、ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル（６００ｍｇのアガロース、１．２ｍｌの５０Ｘ ＴＡＥ、５８．８ｍｌの蒸留水）上で解析した。当該ＰＣＲ産物は、続いて、ＱＩＡＧＥＮから市販されているＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。要約すると、５倍量の緩衝液ＰＢを１倍量のＰＣＲ産物反応混合物に添加し、そして簡単に混合した。混合物をＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラムに添加し、そして１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。フロースルーの廃棄後、７５０μｌのＰＥ緩衝液を当該カラムに添加し、そして１３，０００ｒｐｍで１分以上遠心した。当該カラムをきれいなマイクロチューブ内に据え、そして３０μｌの緩衝液ＥＢを当該カラムに添加した。カラムを室温で１分間、前記緩衝液と一緒にインキュベートし、その後１３，０００ｒｐｍで１分間遠心してＤＮＡを溶出した。
【００７６】
伸長の除去。ＰＣＲ産物の反応混合物を消化のために調製した：５μｌのＰＣＲ産物、１μｌのＮＥＢバッファー２、１μｌの１０Ｘ ＢＳＡ、及び０．９μｌのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩストック。ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐｃＤＮＡ３ベクター（図１）の消化のための反応混合物を調製した：１μｌのｐｃＤＮＡ３、１．５μｌのＮＥＢバッファー２、１．５μｌの１０Ｘ ＢＳＡ、０．５μｌのＨｉｎｄＩＩＩ、及び０．５μｌのＢａｍＨＩ。プラスミドｐｃＤＮＡ３は、５．４ｋｂの哺乳類発現ベクターである。ＨＰＴＰ遺伝子は、このベクターのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ部位内にクローニングし、そして当該遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーターによって駆動させた。ＰＣＲ産物及び哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３を３７℃で２．５時間消化した。消化産物を１％アガロースゲル上で解析した。分離後、ゲルの写真を撮った。ＰＣＲ産物及びｐｃＤＮＡ３の消化は、それぞれ４９１ｂｐ及び５，４２８ｂｐであるフラグメントを生成することが予想された。
【００７７】
消化産物を含むゲルの断片を、当該ゲルから除去し、そしてマイクロチューブ内に据えた。ゲルから消化産物を除去するために、ＱＩＡＧＥＮから市販されているＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用した。要約すると、２１０μｌの緩衝液ＱＧをチューブに添加した。当該チューブを５０℃のウォーターバス内に約１０分間、２〜３分おきに混合して静置した。次に、７０μｌのイソプロパノールを当該チューブに添加し、そして混合した。試料を続いて回収チューブとくっつけたカラム内に据え、そして１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。フロースルーの廃棄後、５００μｌの緩衝液ＱＧをカラムに添加し、そして当該カラムを１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。フロースルーを廃棄し、そしてカラムを７５０μｌの緩衝液ＰＥで洗浄し、続いて１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。フロースルーを廃棄し、そしてカラムを１回以上１３，０００ｒｐｍで１分間遠心して、ＤＮＡを溶出させた。ＤＮＡは−２０℃で保存した。
【００７８】
ライゲーション及び形質転換。増幅したＨＰＴＰ−Ａ及びＨＰＴＰ−Ｂ遺伝子はいずれも、しかし別々に、ｐｃＤＮＡ２ベクターとライゲーションした。ライゲーション反応混合物を調製した：１０μｌのインサート、５μｌのベクター、２μｌの１０Ｘライゲーションバッファー、２μｌの１０Ｘ ＡＴＰ、及び１μｌのリガーゼ。ライゲーション混合物を１６℃に設定したサーマルサイクラー内に１８時間据え、続いて温度を４℃に維持した。
【００７９】
コンピテントＥ．コリＥＨα５株を、ライゲーション混合物で形質転換させた。それぞれ２００μｌのコンピテントＥ．コリ（ＤＨα５）を含む２つのマイクロチューブを氷上で融解させた。ライゲーション混合物を、細胞の各チューブに添加し、当該チューブを簡単にボルテックスにかけ、そして次に、氷上で２０分間インキュベートした。チューブを４２℃のウォーターバス内に１．５分間据え、続いて氷上に２分間据えた。チューブの中身を、１ｍｌのＬＢを含むチューブ内に別々に据えた。混合物を２５０ｒｐｍに設定したシェーカー上に４５分間据えた。次に、２００μｌの各培地を２つのＬＢ／Ａｍｐプレート上に蒔いた。プレートは、蓋を上にして３７℃のインキュベーター内に１０分間据え、続いて蓋を下にして一晩（１６〜１８時間）据えた。
【００８０】
コロニーのスクリーニング。ＱＩＡｐｒｅｐ Ｍｉｎｉｐｒｅｐプロトコールを使用し、６つの細菌培養物それぞれからＤＮＡを精製した。精製したＤＮＡを含むチューブを適当にラベルした：コロニーＡ１、コロニーＡ２、コロニーＢ１、コロニーＢ１、コロニーＢ２等。コロニーをスクリーニングするために、それぞれに由来する精製ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ；ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩ；並びにＡｃｃＩで消化した。ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ消化反応液を調製した：５μｌのベクター／インサート、１μｌのＮＥＥＢバッファー２、１μｌの１０Ｘ ＢＳＡ、１．８μｌのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩストック、６．２μｌの蒸留水。ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩストックは以下の様に調製した：７．２μｌのＢａｍＨＩをを９．６μｌのＨｉｎｄＩＩＩに添加した。次に、ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ消化反応液を調整した：５μｌのベクター／インサート、０．５μｌのＥｃｏＲＩ、０．３μｌのＮｄｅＩ、１．５μｌのＮＥＢバッファー４、７．７μｌの蒸留水。最後に、ＡｃｃＩ消化反応液を調製した：５μｌのベクター／インサート、０．５μｌのＡｃｃＩ、１．５μｌのＮＥＢバッファー３、及び８μｌの蒸留水。全ての消化は、３７℃で一晩行った。消化物は、１％アガロースゲル上で分離し、そしてゲルの写真を撮った。
【００８１】
中規模のＤＮＡ精製。６時間たった５ｍｌの培養物を２５０ｒｐｍに設定したシェーカー上で３７℃で増殖させた。５ｍｌの培地を５０ｍｌのＬＢで希釈した。チューブをシェーカー上に据えた。次の日、４０ｍｌの一晩たった培養物を、５ｍｌのネジ口遠心管に移し、そして５０００ｒｐｍで５分間の遠心によってペレット化した。ＢｉｏＲａｄから市販されているＱＵＡＮＴＵＭ ＭｉｄｉＰｒｅｐを使用し、中規模にＤＮＡを精製した。要約すると、上清を流し捨て、そして５ｍｌの細胞再懸濁溶液を細胞のペレットに添加した。チューブをボルテックスにかけ、細胞を再懸濁した。次に、５ｍｌの細胞可溶化物をチューブに添加し、続いて６〜８回反転させた。混合物を、５ｍｌの中和溶液を添加することによって中和し、続いてチューブを６〜８回反転させて当該溶液を中和した。混合物を８０００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を、１ｍｌのＱｕａｎｔｕｍＰｒｅｐマトリックスと一緒に新しいチューブに移した。混合物を穏やかに１５〜３０秒間回転させ、続いて８０００ｒｐｍで２分間遠心した。ペレットから洗浄緩衝液を排出した後、６００μｌの洗浄緩衝液をマトリックスに添加し、そして振とうによって混合した。チューブを８０００ｒｐｍで２分間遠心した。ペレットから洗浄緩衝液を排出し、６００μｌの洗浄緩衝液をチューブに添加してペレットを再懸濁した。スピンカラムをマイクロチューブに取り付け、そして穴をマイクロチューブの蓋に開けた。チューブを１２，０００ｒｐｍで３０秒間遠心した後、フロースルーを廃棄した。次に、５００μｌの洗浄緩衝液をチューブに添加し、そして当該チューブを１２，０００ｒｐｍで３０秒間遠心した。フロースルーを廃棄し、続いて当該カラムを１２，０００ｒｐｍで２分以上遠心し、残りの洗浄緩衝液を除去した。カラムをきれいな遠心管に移した。ＤＮＡを６００μｌのＴＥ（ｐＨ８）で溶出させた。
【００８２】
次に、ＤＮＡは、１／１０量の５Ｍ ＮａＣｌ、続いて合計量（ＮａＣｌ＋ＤＮＡ）の２倍の１００％エタノールを添加することによってエタノール沈殿した。マイクロチューブを数回穏やかに反転させ、そして−２０℃で２０分間インキュベートした。ＤＮＡを１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心してペレットにした。滅菌条件下、エタノール／ＮａＣｌをペレットから吸引した。ペレットをフード内で風乾するまで放置した。その後、ＤＮＡを１００μｌの滅菌ＴＥ（ｐＨ８）中で再懸濁した。ＤＮＡ試料の濃度を決定するために２６０ｎｍの吸光度（Ａ260）を測定した。ＤＮＡは−２０℃で保存した。
【００８３】
トランスフェクション。ＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞系においてＨＰＴＰを発現させるために、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから市販されているＦｕＧＥＮＥ(商標)トランスフェクションキットを使用した。細胞を、使用前に６穴プレートに１８時間プレーティングし、それらのコンフルエントがトランスフェクションの日に５０％となるようにした。マイクロチューブ内で、９７μｌの無血清希釈培地を３μｌのＦｕＧＥＮＥ試薬に添加した。希釈したＦｕＧＥＮＥを室温で５分間インキュベートした。次に、１μｇのＤＮＡを第二のマイクロチューブに添加した。一滴ずつ、希釈したＦｕＧＥＮＥ試薬をＤＮＡに添加した。当該チューブを穏やかにたたき、チューブの中身を混合した。チューブは、続いて室温で１５分間インキュベートした。細胞上の培地に、２ｍｌの新鮮な培地を再び据えた。一滴ずつ、ＦｕＧＥＮＥ／培養液をプレーティングされた細胞に添加し、続いてプレートを回転させてプレートの周りに中身を分配した。細胞は３７℃で３６〜４８時間インキュベートした。
【００８４】
解析の日に、細胞を１％Ｔｒｉｔｏｎ可溶化緩衝液中で可溶化し、ＨＰＴＰ及びＤ７の免疫沈降を行った。試料は、最終的に１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離し、続いてニトロセルロースに一晩かけて移した。次の日、イムノブロッティングが、ＥｐｈＡ２、ＨＰＴＰ、及びホスホチロシンに対する抗体により行われた。
【００８５】
結果
ＬＭＷ−ＰＴＰの発現及び精製
ＬＭＷ−ＰＴＰは、陽イオン交換クロマトグラフィー（典型的に、ＳＰ−セファデックスＣ−５０カラムを用いる）、続いて、サイズ排除クロマトグラフィー（典型的に、セファデックスＧ５０カラムを用いる）、を包含する二段階の精製スキームを用いて精製されうる。組換えタンパク質（Ｅ．コリにおける発現の後に単離されたもの）と、天然のウシ又はヒトのタンパク質との間の軽微な差異は、組換えタンパク質が、天然の組織タンパク質のように、Ｎ末端のアラニン残基上でアセチル化されていないことである。この実施例において、ＷＴ−ＢＰＴＰ、Ｄ１２９Ａ−ＢＰＴＰ、及びＣ１２Ａ−ＢＰＴＰが、ｐＥＴ−１１発現系を用いて発現し、そして精製された。精製タンパク質、ＨＰＴＰ−Ａ及びＨＰＴＰ−Ｂのストックの補給品は既に手元にあった。
【００８６】
Ｅ．コリからのＷＴ−ＢＰＴＰの発現及び精製は容易に行われ、そして良好な品質のタンパク質を生成させた（発現培地１Ｌ当たり４０〜５０ｍｇ）。組換え体、変異ＰＴＰアーゼの発現は、あまりタンパク質をもたらさなかった（発現培地１Ｌ当たり１０〜１５ｍｇ）。Ｄ１２９Ａウシ変異体の場合、インキュベーション期間は６時間に増大され、そして洗浄緩衝液を１ｍＭのＥＤＴＡに変えて変異体タンパク質とＣ５０カラムとの結合を増大させた。一旦精製した後、タンパク質はリン酸緩衝液中−２０℃で数ヶ月間安定であった。
【００８７】
ＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）とＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系におけるＬＭＷ−ＰＴＰの比較。
タンパク質レベル。ＥｐｈＡ２は非形質転換ＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞系においてチロシンリン酸化されるが、悪性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系においてはされない。
【００８８】
ＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）とＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系におけるＬＭＷ−ＰＴＰの内因性タンパク質レベルは、最初にイムノブロッティング解析によって比較された。その結果は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系におけるタンパク質レベルと比較して、ＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞系におけるＬＭＷ−ＰＴＰのタンパク質レベルが低いことを明らかにした。このことは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系で観察される、ＬＭＷ−ＰＴＰのより高いタンパク質レベルが、ＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞系と比較した細胞系において実質的により脱リン酸されているＥｐｈＡ２と相関しうることを示唆している。
【００８９】
ＥｐｈＡ２はＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞系においてチロシンリン酸化されるが、当該細胞のより高レベルのチロシンリン酸化でさえも、ＥｐｈＡ２がそのリガンドの可溶性形態で処理され、又は細胞表面で人工的に活性化される場合には達成されうる(Zantek, N. D. (1999), Ph. D. Thesis, Purdue University)。このことを考慮して、ＬＭＷ−ＰＴＰがＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞においてＥｐｈＡ２を脱リン酸するが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞と同程度まではしないことも示唆されうる。ＥｐｈＡ２のリン酸化と脱リン酸の間には競合があるようであり、そしてＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において、そのバランスは脱リン酸の方へ傾くようである。しかしながら、ＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞においては、そのバランスは一方向又は他に実質的に傾かない。その結果、ＥｐｈＡ２はＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞系において幾つかのそのチロシンリン酸化を残す。
【００９０】
細胞内局在。全てがＬＭＷ−ＰＴＰに対するポリクローナル及びモノクローナル抗体のパネルは、ＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を染色するために使用した。ＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの細胞内局在を決定するために、細胞をカバーグラス上で一晩増殖させた。固定及び透過処理後、細胞を一次抗体で染色してＬＭＷ−ＰＴＰを検出した。二次抗体に付着させた蛍光タグは、蛍光顕微鏡でのＬＭＷ−ＰＴＰの細胞内局在の観察を容易にした。ＬＭＷ−ＰＴＰは、拡散してＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞内に広く分布することが明らかとなった。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が染色された場合、ＬＭＷ−ＰＴＰは、膜ラッフルに局在していることが明らかとなった。このことは興奮するような発見であり、何故ならば、ＥｐｈＡ２は、同様に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系において膜ラッフル内に局在することが知られていたからである(Zantek, N. D. (1999), Ph. D. Thesis, Purdue University)。
【００９１】
ＬＭＷ−ＰＴＰとＥｐｈＡ２との間でのin vitroでのタンパク質間相互作用
免疫共沈降。２つのタンパク質を、いずれかのタンパク質に対する別々の抗体により免疫共沈降する試みがなされた。ＬＭＷ−ＰＴＰの免疫共沈降は、Ｄ７のＥｐｈＡ２特異的抗体で免疫沈降し、続いて７．１又は１０．０ＬＭＷ−ＰＴＰ抗体でイムノブロッティング解析をした場合、容易に検出可能であった。免疫共沈降は、１０．１抗体でブロッティングした場合、より明らかであった。ＬＭＷ−ＰＴＰの相対的なタンパク質レベル解析から予想されるように、ＬＭＷ−ＰＴＰは、ＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞系からより、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系からより免疫共沈降した。７．１又は１０．１項体のいずれかで免疫共沈降し、続いて、Ｄ７抗体でイムノブロッティングした場合、あまり劇的でない結果が得られた。Ｄ７ ＩＰコントロールのものと大体共線性のバンドが、７．１及び１０．１ＩＰのレーンにおいて見られた。このことは、これらのバンドがＥｐｈＡ２を表しているであろうことを示唆している。
【００９２】
タンパク質の免疫共沈降が我々の細胞系の両方で生じたことはやや驚くべくことであった。相互作用が検出されうることが予想されたが、これは、ＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞系においてより可能性があると予想され、何故ならば、ＥｐｈＡ２がそこでチロシンリン酸化されるためである。しかしながら、ホスファターゼとその基質との相互作用はかなり一過性であるか、又はかなり弱いので、相互作用は容易には検出されえないとも考えられた。我々の件では、相互作用は両細胞系で検出された。
【００９３】
In vitroでの脱リン酸
基質捕捉において、ＥｐｈＡ２とＬＭＷ−ＰＴＰとの間での直接的な相互作用を検出する試みは失敗したので、代わりにin vitroでの試験が実施された。我々は、純粋なＬＭＷ−ＰＴＰが、免疫沈降によって単離されたＥｐｈＡ２を脱リン酸する能力を試験した。我々は、ＬＭＷ−ＰＴＰがＥｐｈＡ２を酵素濃度依存的に且つ時間依存的に脱リン酸したことに気付いた。
【００９４】
予想されるように、ＬＭＷ−ＰＴＰによるＥｐｈＡ２の脱リン酸の範囲は、大量のホスファターゼが使用された場合に、少量使用された場合よりもより大きいことが明らかとなった。ＬＭＷ−ＰＴＰによる、酵素濃度依存性のＥｐｈＡ２の脱リン酸は、高レベルのＬＭＷ−ＰＴＰがＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のチロシンリン酸化を抑制するという仮定と一致している。より高いＬＭＷ−ＰＴＰレベルがこれらの細胞におけるＥｐｈＡ２の実質的な脱リン酸を引き起こすと考えられている。ＥｐｈＡ２の酵素濃度依存性の脱リン酸は、基本的な速度論的挙動に従う。反応速度は、酵素濃度が増大するにつれて増大する。その結果、単位時間当たりより大きなターンオーバーが存在する。当該反応の進行がより長期間にわたり研究される場合、より高い酵素濃度が、より低い酵素濃度と比較して、ＥｐｈＡ２を脱リン酸し続けることがわかる。観察される脱リン酸の安定化は、当該タンパク質が非常に薄い条件下で不安定であることに起因するようである。
【００９５】
ＬＭＷ−ＰＴＰとＥｐｈＡ２との間のin vivoでのタンパク質間相互作用
ベクターの構築。ＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞系においてＬＭＷ−ＰＴＰを過剰発現する効果を検討するために、ＬＭＷ−ＰＴＰのコード領域を含むｐｃＤＮＡ３真核生物発現ベクターが構築された。マイクログラム単位の量のｐＥＴ−１１ｄプラスミドが、市販のＤＮＡ精製キットを用いて容易に単離された。プライマーは、ＬＭＷ−ＰＴＰのＡ−及びＢ−イソ型のコード領域を増幅するよう設計され、そして使用された。
【００９６】
ＰＣＲ産物は、ＱＩＡＧＥＮから市販されているＰＣＲ産物精製キットを用いて精製された。ＬＭＷ−ＰＴＰイソ酵素の増幅されたコード領域は、伸長を除去するためにＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化された。生成した「粘着末端」は、哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３におけるインサートのディレクショナルクローニングを可能にし、これはまた、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消化された。イソ酵素の消化は、４９１ｂｐのフラグメントを生成した。ｐｃＤＮＡ３の消化は、環状ベクターよりも１８少ない塩基対を有する、開いたベクターを生成させた。
【００９７】
細胞の形質転換の後、構築されたベクターが細胞から単離され、そして制限酵素群を用いてスクリーニングされ、ＬＭＷ−ＰＴＰのヒトＡ−及びＢ−イソ酵素のコード領域が、当該制限酵素によって生じた切断により示されるとおりに、それらの各ベクター内に存在していたか否かを決定した。
【００９８】
ＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現
ＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現が、ＥｐｈＡ２のチロシンリン酸化状態に対する、ホスファターゼのタンパク質の増大効果を検討するために試みられた。大量の前記構築ベクターが、市販のＤＮＡ精製キットを用いて、高度に純粋な形態で単離された。この手順を用いたベクターの単離は、大きな困難なしに行われた。市販のトランスフェクションキットＦｕＧＥＮＥは、それぞれ、「空の」ｐｃＤＮＡ３、ＨＰＴＰ−Ａ／ｐｃＤＮＡ３及びＨＰＴＰ−Ｂ／ｐｃＤＮＡ３でＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞系をトランスフェクションするために使用された。当該「空の」ベクターは本実験におけるコントロールとしての役割を果たし、その結果、ＥｐｈＡ２のチロシンリン酸化状態のあらゆる変化が、ＬＭＷ−ＰＴＰレベルの増大に起因し、そして当該哺乳類発現ベクターには起因しないと考えられるはずである。
【００９９】
ＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞系におけるＨＰＴＰ−Ｂの過剰発現は、ＥｐｈＡ２のチロシンリン酸化レベルの低下をもたらした。ＥｐｈＡ２のチロシンリン酸化における知覚可能な差異は、ＨＰＴＰ−Ａが同一の細胞系で過剰発現した場合には見られなかった。この情報から、ＥｐｈＡ２とＬＭＷ−ＰＴＰの相互作用はイソ酵素特異的であると結論付けることができ、これは不合理な可能性ではない。前記イソ酵素のアミノ酸配列における差異は、なぜ一つのイソ酵素だけが優先的にＥｐｈＡ２と相互作用するように見えるかということの潜在的な理由となりうる。しかしながら、同様に前記差異を説明する多数の他の理由が存在する。
【０１００】
考察
形質転換した乳房上皮、例えばＭＤＡ−ＭＢ−２３１において、ＥｐｈＡ２はチロシンリン酸化されない。しかしながら、ＥｐｈＡ２のチロシンリン酸化の回復は、これらの細胞が過酸化バナジン酸(pervanadate)イオンで処理される場合に生じる(Zantek, N. D. (1999), Ph. D. Thesis, Purdue University)。このことは、ＰＴＰアーゼがＥｐｈＡ２のチロシンリン酸化の減少を引き起こしていることを強力に示唆するものである。あた、エフリンＡ１リガンドの可溶性形態によるＥｐｈＡ２の処理及び細胞表面でのＥｐｈＡ２の架橋は、ＥｐｈＡ２の一過性チロシンリン酸化を引き起こす。これらの処理により時間とともに生じるＥｐｈＡ２のチロシンリン酸化の減少は、ＥｐｈＡ２とのＰＴＰアーゼの相互作用に起因すると思われる。
【０１０１】
実施例ＩＩ．低分子量タンパク質チロシンホスファターゼによるＥｐｈＡ２の制御
材料と方法
細胞系及び抗体。ヒト乳房（ＭＣＦ−１０Ａ、ＭＣＦ １０Ａ ＳＴ、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＳＫ−ＢＲ−３）上皮細胞は、実施例Ｉに記載及び概説(Paine, T. M. , Soule, H. D., Pauley, R. J. & Dawson, P. J. (1992) Int J Cancer 50,463-473 ; Jacob, A. N., Kalapurakal, J. , Davidson, W. R. , Kandpal, G. , Dunson, N. , Prashar, Y. & Kandpal, R. P. (1999) Cancer Detection & Prevention 23,325-332 ; Shevrin, D. H. , Gorny, K. 1. & Kukreja, S. C. (1989) Prostate 15,187-194)のように培養した。ホスホチロシン（ＰＹ２０）及びβ−カテニン特異的なモノクローナル抗体は、Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＫＹ）から購入した。ホスホチロシン（４Ｇ１０）及びＥｐｈＡ２（クローンＤ７）特異的モノクローナル抗体は、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）から購入した。ビンキュリンに対するモノクローナル抗体は、ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）から購入した。
【０１０２】
細胞可溶化物。細胞可溶化物を収集し、そして概説のように等しい添加のために標準かされた(Kinch, M. S. Clark, G. J, Der, C. J. & Burridge, K. (1995) J Cell Biol 130, 461-471)。等しい添加を確認するために、ブロットは概説のとおりストリッピングされ、そしてβ−カテニン又はビンキュリン特異的な抗体で再プローブされた(Kinch, M. S. Clark, G. J, Der, C. J. & Burridge, K. (1995) J Cell Biol 130, 461-471)。
【０１０３】
免疫沈降及びウェスタンブロット解析：ＥｐｈＡ２又はＬＭＷ−ＰＴＰの免疫沈降は、ウサギ抗マウス（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）複合プロテインＡセファロース（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて、既述のとおり実施された(Zantek, N. D. , Azimi, M. , Fedor-Chaiken, M. , Wang, B. , Brackenbury, R. & Kinch, M. S. (1999) Cell Growth & Differentiation 10,629-638)。等しい添加を確認するために、ブロットは概説のようにストリッピングされ(Kinch, M. S. Clark, G. J, Der, C. J. & Burridge, K. (1995) J Cell Biol 130, 461-471)、ＥｐｈＡ２又はＬＭＷ−ＰＴＰ特異的抗体で再プローブされた。ウェスタンブロット解析は、標準化された細胞可溶化物で実施され、そして免疫沈降は、Zantek, N. D. , Azimi, M. , Fedor-Chaiken, M. , Wang, B. , Brackenbury, R. & Kinch, M. S. (1999) Cell Growth & Differentiation 10,629-638において詳述されているように実施された。抗体の結合は、高感度ケミルミネッセンス（ＥＣＬ；Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって検出し、そしてオートラジオグラフィー（Ｋｏｄａｋ Ｘ−ＯＭＡＴ；Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）によって可視化した。
【０１０４】
ＥＧＴＡ及び過酸化バナジン酸処理。「カルシウムスイッチ」実験を概説のとおり(Zantek, N. D. , Azimi, M. , FedorChaiken, M. , Wang, B. , Brackenbury, R. & Kinch, M. S. (1999) Cell Growth & Differentiation 10,629-638)、７０％コンフルエントに増殖したＭＣＦ−１０Ａ細胞及び終濃度４ｍＭのＥＧＴＡを含む培地を用いて実施した。過酸化バナジン酸は、０，１，１０又は１００ｍＭの終濃度で、単層培地中のＭＤＡ−ＭＢ−２３１に添加され、そして当該処理は、３７℃、５％ＣＯ2で１０分間インキュベートしてもよい。組み合わせたＥＧＴＡ−過酸化バナジン酸処理の場合、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は最初に１００ｍＭ過酸化バナジン酸で処理され、続いてＥＧＴＡ処理にかけられた。
【０１０５】
in vitroキナーゼ及びホスファターゼ処理。ＥｐｈＡ２に対するＬＭＷ−ＰＴＰ活性を評価するために、ＥｐｈＡ２はＭＣＦ−１０Ａ細胞から免疫沈降され、そして０．４５，７．８，又は２６．５ｍｇ／ｍＬの濃度の精製ＬＭＷ−ＰＴＰタンパク質と一緒に、０．５，１５，又は３０分間インキュベートされた。本アッセイは、Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファーの添加を介して終了した。当該処理におけるＥｐｈＡ２のホスホチロシン含量は、続いて、ホスホチロシン特異的抗体を用いるウェスタンブロットを用いて観察された。in vitroでの自己リン酸化活性を決定するために、免疫沈降したＥｐｈＡ２は、Zantek, N. D. , Azimi, M. , FedorChaiken, M. , Wang, B. , Brackenbury, R. & Kinch, M. S. (1999) Cell Growth & Differentiation 10,629-638において詳述されているようにin vitroキナーゼアッセイを用いて評価した。
【０１０６】
トランスフェクション及び選択。ＭＣＦ−１０Ａ細胞の単層は、３０〜５０％コンフルエントにまで増殖され、そして、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＰＬＵＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１−ＬＭＷ−ＰＴＰ又はｐｃＤＮＡ３．１−Ｄ１２９Ａ−ＬＭＷ−ＰＴＰをトランスフェクションされた。当該トランスフェクション手順のコントロールとして、空のｐｃＤＮＡ３．１ベクターを同一の細胞系に平行してトランスフェクションした。一過性トランスフェクションは、トランスフェクション後４８時間増殖させてもよい。安定な系の場合、ネオマイシン耐性細胞が、１６ｍｇ／ｍＬのネオマイシンを含む増殖培地（Ｍｅｄｉｓｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）中で選択された。ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現を確認するために、ウェスタンブロット解析が、ＬＭＷ−ＰＴＰ特異的抗体を用いて実施された。親細胞及び空のｐｃＤＮＡ３．１ベクターをトランスフェクションした細胞は、ネガティブコントロールとして使用した。
【０１０７】
増殖アッセイ。単層アッセイを用いて細胞増殖を評価するために、１ｘ１０5個の細胞を、組織培養処理した多数の穴のディッシュ内に１，２，４又は６日間、３回一組の実験において播種した。細胞数は、試料をトリプシン懸濁し、続いて、血球計数器を用いて顕微鏡により評価することによって評価した。ソフトアガーでのコロニー形成は、Zelinski, D. P. , Zantek, N. D. , Stewart, J. , Irizarry, A. & Kinch, M. S. (2001) Cancer Res 61,2301-2306) ; Clark, G. J. , Kinch, M. S. , Gilmer, T. M., Burridge, K. & Der, C. J. (1996) Oncogene 12,169-176において詳述されているように実施され、そして定量された。ＥｐｈＡ２アンチセンスを用いる実験の場合、細胞は、ソフトアガー中での懸濁の前に、オリゴヌクレオチドと一緒にインキュベートした。示したデータは、少なくとも３つの異なる実験の代表的なものである。
【０１０８】
アンチセンス処理。ＭＣＦ−１０Ａ Ｎｅｏ細胞及び安定してＬＭＷ−ＰＴＰを過剰発現しているＭＣＦ−１０Ａ細胞の単層は、３０％コンフルエントにまで増殖され、そして詳述されているとおりに、ＥｐｈＡ２アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクションされた。逆位のＥｐｈＡ２オリゴヌクレオチド又はトランスフェクション試薬単独でトランスフェクションされた試料は、ネガティブコントロールを提供した。
【０１０９】
結果
ＥｐｈＡ２は関連のチロシンホスファターゼによって制御される。
複数の独立した調査系は、ＥｐｈＡ２が関連のチロシンホスファターゼによって制御されることを示唆した。最初に、ＥｐｈＡ２は、非形質転換上皮細胞において迅速に脱リン酸されうる。ホスホチロシン抗体（ＰＹ２０又は４Ｇ１０）を用いたウェスタンブロット解析は、ＥｐｈＡ２−リガンド結合のＥＧＴＡ媒介型の破壊後５分以内に、より低レベルのＥｐｈＡ２ホスホチロシン含量を示した（図２Ａ）。同様に、ＥｐｈＡ２のチロシンリン酸化は、非形質転換上皮細胞の、ＥｐｈＡ２−リガンド結合のドミナントネガティブインヒビター（例えばＥｐｈＡ２−Ｆｃ）とのインキュベーション後に低下した。同一の結果が、ＭＣＦ−１２Ａ、ＭＣＦ１０−２、ＨＥＫ２９３、ＭＤＣＫ及びＭＤＢＫ細胞を含む、多数の非形質転換上皮細胞系を用いて得られた。これらの知見を基に、我々は、チロシンホスファターゼインヒビターが、ＥＧＴＡ処理に応じてのＥｐｈＡ２ホスホチロシン含量の減少を防ぎ得るかを問うた。事実、インヒビター、例えばオルトバナジン酸ナトリウムは、ＥＧＴＡによるＭＣＦ−１０Ａ細胞の処理の後、ＥｐｈＡ２ホスホチロシンの低下を防いだ（図２Ｂ）。
【０１１０】
我々の研究所によるこれまでの研究は、ＥｐｈＡ２のホスホチロシン含量が、非形質転換上皮細胞と比較して、悪性上皮細胞において大きく低下することを示した(Zelinski, D. P. , Zantek, N. D., Stewart, J. , Irizarry, A. & Kinch, M. S. (2001) Cancer Res 61, 2301-2306; Zantek, N. D. , Azimi, M. , Fedor-Chaiken, M. , Wang, B. , Brackenbury, R. & Kinch, M. S. (1999) Cell Growth & Differentiation 10,629-638)。従って、我々は、チロシンホスファターゼ活性が、悪性細胞におけるＥｐｈＡ２のホスホチロシン含量の低下に寄与し得るか否かを問うた。ＥｐｈＡ２は悪性乳ガン細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＣＦｎｅｏＳＴ、又はＰＣ−３細胞）においてチロシンリン酸化されなかったが、オルトバナジン酸ナトリウム濃度の増大を伴うインキュベーションは、ＥｐｈＡ２のチロシンリン酸化を迅速且つ激しく低下させた（図２Ｃ）。細胞のバナジン酸塩処理がしばしば生理学的に無関係な部位の誇大なリン酸化を導き得るので、我々は、３２Ｐ−ＡＴＰで標識されたＥｐｈＡ２を用いて、ホスホペプチドマッピング研究をin vitro又はin vivoのいずれかで実施した。これらの研究は、非形質転換ＭＣＦ−１０Ａ細胞及びバナジン酸塩処理ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるチロシンリン酸化の同一パターンを解明した。細胞質ドメインは、無差別にリン酸化されているかもしれない多数の部位を含むが、これらは本明細書で利用した条件下ではリン酸化されず、このことは、バナジン酸塩が無関係の部位のリン酸化を増大させなかったことを示唆している。要するに、これらの結果は、ＥｐｈＡ２が、悪性細胞においてＥｐｈＡ２ホスホチロシン含量を抑制する関連のホスファターゼによって制御されることを示す。
【０１１１】
ＬＭＷ−ＰＴＰはＥｐｈＡ２と相互作用し、そしてそれを脱リン酸する
悪性細胞においてＥｐｈＡ２を制御し得るチロシンホスファターゼを同定するために、我々は、ＬＭＷ−ＰＴＰが関連分子ＥｐｈＢ４を制御するという最近の報告(Jacob, A. N., Kalapurakal, J. , Davidson, W. R. , Kandpal, G. , Dunson, N. , Prashar, Y. & Kandpal, R. P. (1999) Cancer Detection & Prevention 23,325-332)を検討した。我々の最初の実験は、非形質転換（ＭＣＦ−１０Ａ Ｎｅｏ）及び悪性（ＭＣＦ−７，ＳＫ−ＢＲ−３，ＭＤＡ−ＭＢ−４３５，ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）の哺乳類上皮細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの発現及び機能の目録を作成することから開始した（図３）。全細胞可溶化物のウェスタンブロット解析は、非形質転換ＭＣＦ−１０Ａ哺乳類上皮細胞と比較した場合の、腫瘍由来乳ガン細胞における比較的高レベルのＬＭＷ−ＰＴＰを解明した。等しい試料の添加を確認するために、膜をストリッピングし、そしてコントロールタンパク質（ビンキュリン）に対する抗体で再プローブして、高レベルのＬＭＷ−ＰＴＰが添加の間違い又は悪性細胞におけるタンパク質レベルの一般化された増大を反映しなかったことを証明した。ＭＣＦ−１０の悪性変異体ＭＣＦｎｅｏＳＴも、ＬＭＷ−ＰＴＰ発現の増大を示し、これは、ＥｐｈＡ２がこれらの細胞においてチロシンリン酸化されないという最近の報告(Zantek, N. D., Walker-Daniels, J. , Stewart, J. C. , Hansen, R. K. , Robinson, D., Miao, H. , Wang, B. , Kung, H. J. , Bissell, M. J. & Kinch, M. S. (2001) Clin Cancer Res 7,3640-3648)に基づくと興味深いものであった。遺伝的に適合した系の使用も、細胞期限又は培養条件に起因する潜在的な差異を排除した。従って、最高レベルのＬＭＷ−ＰＴＰが悪性上皮細胞において一貫して見られ、そしてＥｐｈＡ２ホスホチロシン含量に反比例していた。
【０１１２】
上文の結果は、ＬＭＷ−ＰＴＰが腫瘍細胞においてＥｐｈＡ２のホスホチロシン含量をネガティブに制御し得るという、示唆的な、しかし間接的な証拠を提示した。この仮説を更に検討するために、我々は最初に、前記２つの分子がin vivoで相互作用するか否かを問うた。ＥｐｈＡ２は、特異的抗体（クローンＤ７）を用いてＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から免疫沈降され、そしてこれらの複合体はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離された。次に、ウェスタンブロット解析により、ＬＭＷ−ＰＴＰがＥｐｈＡ２免疫複合体内で顕著に見られたことを明らかにした（図４Ａ）。反対の実験により、ＥｐｈＡ２が免疫沈降したＬＭＷ−ＰＴＰの複合体において同様に検出されうることを確認した（図４Ｂ）。無関係の抗体によるコントロールの免疫沈降により、前記２つの分子の相互作用の特異性を確認した。
【０１１３】
免疫共沈降では、ＥｐｈＡ２がＬＭＷ−ＰＴＰの基質としての役割を果たし得るか否かを明らかにできなかった。このことに直接取り組むために、ＥｐｈＡ２は、通常チロシンリン酸化されているＭＣＦ−１０Ａ細胞から免疫沈降された。精製したＥｐｈＡ２は、続いて、異なる濃度の精製ＬＭＷ−ＰＴＰと一緒にインキュベートされ、その後、ホスホチロシン特異的抗体（ＰＹ２０及び４Ｇ１０）によるＥｐｈＡ２のウェスタンブロット解析を行った。これらの実験は、精製したＬＭＷ−ＰＴＰが、用量及び時間依存的にＥｐｈＡ２を脱リン酸し得ることを示した（図５Ａ）。
【０１１４】
in vitroでの研究は、ＥｐｈＡ２がＬＭＷ−ＰＴＰによってin vitroでリン酸化されうることを示したが、我々は、in vitroでの研究がin vivoでの類似の状況を常に表すものではないと認識した。従って、ＬＭＷ−ＰＴＰは、ＭＣＦ−１０Ａ細胞において異所的に過剰発現した。この特定の細胞系は、非形質転換ＭＣＦ−１０Ａ細胞が低レベルの内因性ＬＭＷ−ＰＴＰを有し、且つこれらの非形質転換上皮細胞におけるＥｐｈＡ２が通常チロシンリン酸化されないために選択された。ＬＭＷ−ＰＴＰの異所的な過剰発現は、特異的な抗体を用いたウェスタンブロット解析によって決定した場合（図６Ａ）、安定なトランスフェクションによって達成された。重要なことに、ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現は、ベクターをトランスフェクションしたネガティブコントロールと比較して、ＥｐｈＡ２のホスホチロシン含量を低下させるのに十分であった（図６Ａ）。同一な結果が、異なる実験を使用し、異なるトランスフェクタントを用い、且つ安定及び一過性トランスフェクションした両試料において得られ、その結果、クローンのバリエーションについての潜在的な関心を排除した。更に、低下したホスホチロシン含量は、ＬＭＷ−ＰＴＰを過剰発現している細胞のホスホチロシン含量が概して低下したように、ＥｐｈＡ２特異的であった（図６Ｂ）。
【０１１５】
ＬＭＷ−ＰＴＰ過剰発現細胞は上皮細胞の悪性転換を引き起こす
チロシンリン酸化ＥｐｈＡ２は、腫瘍細胞の増殖をネガティブに制御し、一方、リン酸化されてないＥｐｈＡ２は、強力な発ガンタンパク質として働く(Zelinski, D. P. , Zantek, N. D., Stewart, J. , Irizarry, A. & Kinch, M. S. (2001) Cancer Res 61, 2301-2306; Zantek, N. D. , Azimi, M. , Fedor-Chaiken, M. , Wang, B. , Brackenbury, R. & Kinch, M. S. (1999) Cell Growth & Differentiation 10,629-638)。従って、我々は、ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現が悪性転換を誘導するのに十分であるか否かを問うた。この疑問に取り組むために、我々は上述のＭＣＦ−１０Ａ細胞を利用し、これを野生型ＬＭＷ−ＰＴＰ又はベクターコントロールのいずれかでトランスフェクションした。我々の最初の研究は、単層培養におけるコントロール及びＬＭＷ−ＰＴＰ過剰発現細胞の増殖速度を評価した。標準的な２次元培養条件を用いて評価した場合、ＬＭＷ−ＰＴＰを過剰発現しているＭＣＦ−１０Ａ細胞の増殖速度は、対応するコントロールの増殖速度よりも有意に遅かった（Ｐ＜０．０５）（図７Ａ）。
【０１１６】
増殖の２次元的な評価はしばしば、腫瘍細胞の悪性の特徴を反映しなかった。その代わりに、ソフトアガー及び再構成した基底膜を用いた細胞挙動の３次元的解析は、悪性の挙動を評価する、更に関連している方法を提供し得る。ベクターをトランスフェクションしたＭＣＦ−１０Ａ細胞は、大部分ソフトアガーにコロニー形成することができないが、ＬＭＷ−ＰＴＰを過剰発現している細胞は、強拡大の顕微鏡１視野当たり平均４．９コロニーを形成した（Ｐ＜０．０１；図７Ｂ）。他の３次元アッセイ系を用いた最近の知見に基づき、我々はまた、３次元の再構成した基底膜を用いて、細胞の挙動を評価した。更に攻撃的な表現型と一致して、マトリゲルにおける細胞挙動の顕微鏡による評価は、ＬＭＷ−ＰＴＰ過剰発現細胞の悪性の特徴を確認した。マトリゲルの上に又はその中に、ＬＭＷ−ＰＴＰ過剰発現細胞は、ベクターをトランスフェクションした細胞よりも大きなコロニーを形成した。つまり、多数の且つ異なる系と一致した結果が、ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現が悪性転換を誘導するのに十分であることを示唆する。
【０１１７】
ＬＭＷ−ＰＴＰ過剰発現細胞の発ガン性の表現型はＥｐｈＡ２発現に関連している
ＥｐｈＡ２のチロシンリン酸化は、その内部移行及び分解を誘導する。従って、我々は、ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現が、ＥｐｈＡ２のタンパク質レベルを増大させうると仮定した。事実、全細胞可溶化物のウェスタンブロット解析は、ベクターをトランスフェクションしたコントロールと比較した場合の、ＬＭＷ−ＰＴＰを過剰発現するＭＣＦ−１０Ａ細胞におけるより高レベルのＥｐｈＡ２を明らかにした（図６Ａ）。更に、このＥｐｈＡ２は、チロシンリン酸化されなかった（図６Ｂ）。しかしながら、ウェスタンブロット解析は、ホスホチロシンの通常のレベルがＬＭＷ−ＰＴＰ形質転換細胞において変化しなかったので、低下したホスホチロシン含量がＥｐｈＡ２にとって選択的であったことを明らかにした（図６Ｃ）。
【０１１８】
ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現がＥｐｈＡ２発現を増大させ、そしてそのホスホチロシン含量を低下させたという発見が興味深いのは、この表現型が、高度に攻撃的な腫瘍細胞の暗示であったためである(Zelinski, D. P. , Zantek, N. D., Stewart, J. , Irizarry, A. & Kinch, M. S. (2001) Cancer Res 61, 2301-2306; Zantek, N. D. , Azimi, M. , Fedor-Chaiken, M. , Wang, B. , Brackenbury, R. & Kinch, M. S. (1999) Cell Growth & Differentiation 10,629-638)。従って、我々は、悪性細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの選択的なターゲティングがＥｐｈＡ２に影響を与えるか否かを問うた。これを達成するために、触媒として不活性なＬＭＷ−ＰＴＰの酵素的な変異体（Ｄ１２９Ａ）(Zhang, Z. , Harms, E. & Van Etten, R. L. (1994) Journal of Biological Chemistry 269,25947-25950)は、高レベルの野生型ＬＭＷ−ＰＴＰを有し（図３）、且つリン酸化されてないＥｐｈＡ２を過剰発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において過剰発現した。ＬＭＷ−ＰＴＰＤ１２９Ａの異所的な過剰発現は、ＥｐｈＡ２のレベルを低下させることが明らかとなった。更に、免疫沈降した材料のウェスタンブロット解析は、このＥｐｈＡ２がチロシンリン酸化されたことを明らかにした（図６Ｃ）。従って、一致した結果が、野生型ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現が、腫瘍由来細胞において観察されているＥｐｈＡ２の過剰発現及び機能的変化を付与するのに必要且つ十分であることを示している。
【０１１９】
ＬＭＷ−ＰＴＰを過剰発現しているＭＣＦ−１０Ａ細胞におけるＥｐｈＡ２はチロシンリン酸化されなかったが、それは酵素活性を保持していた。in vitroでのキナーゼアッセイは、ＬＭＷ−ＰＴＰ形質転換ＭＣＦ−１０Ａ細胞由来のＥｐｈＡ２が、ベクターをトランスフェクションしたコントロールに匹敵したレベルの酵素活性を有していたことを証明した（図８Ａ）。等しい試料添加を確認するために、２つのコントロールが実施された。等量のインプットの可溶化物は、β−カゼイン抗体を用いたウェスタンブロット解析によって確認した。更に、免疫沈降したＥｐｈＡ２を分割し、そしてその材料の半分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてＥｐｈＡ２及びホスホチロシン特異的抗体を用いたウェスタンブロット解析によって解析した（図８Ｂ）。従って、リン酸化ＥｐｈＡ２及び非リン酸化ＥｐｈＡ２はいずれも酵素活性があった。
【０１２０】
ＥｐｈＡ２のレベルがＬＭＷ−ＰＴＰ形質転換細胞において上昇したので、我々は、ＥｐｈＡ２の発ガン活性が、この表現型に寄与し得るか否かを問うた。このことに取り組むために、我々はアンチセンスストラテジーによる我々の経験を利用し、ＬＭＷ−ＰＴＰ形質転換細胞におけるＥｐｈＡ２発現を選択的に低下させた(Hess A. R., Seftor, E. A. , Gardner, L. M. , Carles-Kinch, K., Schneider, G. B. , Seftor, R. E. , Kinch, M. S. & Hendrix, M. J. C. (2001) Cancer Res 61,3250-3255.)。我々は、ウェスタンブロット解析により、これらのストラテジーの成功を検証し（図９Ａ）、そして次に、ＥｐｈＡ２発現の低下がソフトアガーのコロニー形成を変化させるか否かを問うた。事実、ＥｐｈＡ２アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたトランスフェクションは、ＬＭＷ−ＰＴＰ形質転換ＭＣＦ−１０Ａ細胞のソフトアガーコロニー形成を少なくとも８７％に低下させた（Ｐ＜０．０１；図９Ｂ）。対照的に、逆位のアンチセンスコントロールヌクレオチドコントロールによるこれらの細胞のトランスフェクションは、ソフトアガーでのコロニー形成を有意に変化させなかった。従って、我々は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる結果が、トランスフェクション手順によって生じた非特異的な毒性からもたらされたということを排除することができた。つまり、我々の結果は、ＥｐｈＡ２を発現する細胞において、過剰発現したＬＭＷ−ＰＴＰの発ガン性の作用が高レベルのＥｐｈＡ２を必要とすることを示す。
【０１２１】
考察
我々による本研究の主要な発見は、ＥｐｈＡ２が関連のチロシンホスファターゼによって制御されるということであり、そして我々は、ＬＭＷ−ＰＴＰをＥｐｈＡ２のチロシンリン酸化の必須の制御因子として同定している。我々はまた、ＬＭＷ−ＰＴＰが転移性ガン細胞において過剰発現し、そしてＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現が非形質転換上皮細胞モデルに対し悪性転換を付与するのに十分であることも証明する。最後に、我々は、ＬＭＷ−ＰＴＰがＥｐｈＡ２の発現をアップレギュレートし、そしてＬＭＷ−ＰＴＰの発ガン活性がＥｐｈＡ２のこの過剰発現を必要とすることを証明する。
【０１２２】
我々の研究所及び他者からの最近の報告は、多数の悪性上皮細胞が、チロシンリン酸化されていない高レベルのＥｐｈＡ２を発現することを示した。これまで、我々は、これらの抑制されたレベルのＥｐｈＡ２チロシンリン酸化を、低下したリガンド結合と関連付けていた。悪性細胞はしばしば不安定な細胞間接触を有しており、そして我々は、このことが、ＥｐｈＡ２が、隣接細胞の膜に結合したそのリガンドと安定的に相互作用する能力を低下させると仮定していた。部分的に、我々の本データは、ＥｐｈＡ２のホスホチロシン含量も、悪性細胞において過剰発現している関連のチロシンホスファターゼによってネガティブに制御されるという新しいパラダイムを示唆する。ＥｐｈＡ２のリン酸化と細胞間接着との関係を考慮すると、我々は、細胞間接触もＬＭＷ−ＰＴＰの発現及び機能を制御し得るということを排除できず、これは、将来の研究により、この可能性について対処されるべきである。
【０１２３】
高レベルのＬＭＷ−ＰＴＰが、悪性ガンの複数の異なる細胞モデルにおいて観察されたという事実は、ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現が悪性転換を付与するのに十分であることを考慮するならば注目すべきである。ＬＭＷ−ＰＴＰを過剰発現している細胞は、ソフトアガーにコロニー形成する能力を手に入れ、そして、３次元の基底膜。例えばマトリゲルにおいて培養した場合、悪性の表現型を獲得する。しかしながら、特にＬＭＷ−ＰＴＰを過剰発現しているＭＣＦ−１０Ａ上皮細胞は細胞増殖の２次元アッセイを用いて測定した場合に細胞増殖速度の低下を示した。この後者の観察は、高レベルのＬＭＷ−ＰＴＰが他の細胞型の単層での増殖速度を同様に低下させるという最近の報告と一致している(Shimizu, H. , Shiota, M. , Yamada, N., Miyazaki, K. , Ishida, N., Kim, S. & Miyazaki, H. (2001) Biochemical & Biophysical Research Communications 289, 602-607; Fiaschi, T. , Chiarugi, P., Buricchi, F., Giannoni, E. , Taddei, M. L. , Talini, D. , Cozzi, G. , ZecchiOrlandini, S. , Raugei, G. & Ramponi, G. (2001) Journal of Biological Chemistry 276,49156-49163)。そのような発見は、ＬＭＷ−ＰＴＰが悪性転換をネガティブに制御し得るということを示唆すると解釈されたが、我々の発見は、非常に異なる結論を支持している。これと一致して、我々の研究所及び他者による最近の研究は、ＭＣＦ−１０Ａ細胞の悪性転換がしばしば単層での増殖速度の低下を伴い、そしてＭＣＦ−１０Ａの最も攻撃的な変異体が、in vivoで、単層培養において最も遅い増殖を示すことを証明している。これらの発見は、非形質転換上皮細胞系を用いた場合の発ガン遺伝子の機能の設計及び解釈に影響を与える。
【０１２４】
ＥｐｈＡ２チロシンリン酸化の生化学的な結論は、大部分が不明確なままである。自己リン酸が酵素活性に必要な他の受容体チロシンキナーゼと異なり、ＥｐｈＡ２のチロシンリン酸化は、その酵素活性に必要ではない。我々による本結果と一致して、ＥｐｈＡ２は、そのホスホチロシン含量における劇的な差異にも関わらず、非形質転換細胞及び腫瘍由来細胞において、匹敵するレベルの酵素活性を保持している(Zantek, N. D. , Azimi, M. , Fedor-Chaiken, M. , Wang, B. , Brackenbury, R. & Kinch, M. S. (1999) Cell Growth & Differentiation 10,629-638)。同様に、ＥｐｈＡ２の自己リン酸の抗体を媒介する刺激は、ＥｐｈＡ２の酵素活性レベルを変化させない。ＥｐｈＡ２細胞質ドメインのホスホペプチド解析は、１つの可能性のある説明を提供する。ＥｐｈＡ２は、残基７７２に推定上の活性化ループチロシンを有するが(Lindberg, R. A. & Hunter, T. (1990) Molecular & Cellular Biology 10,6316-6324)、in vitro又はin vivoのいずれのホスホペプチド解析も、この部位が正常な細胞モデルにおいてリン酸化されず、又は悪性細胞モデルにおいて外因性リガンドに応答しないことを明らかにした。従って、共通の活性化ループチロシンの欠如は、チロシンリン酸化されない、細胞におけるＥｐｈＡ２の酵素活性の保持を説明することができる。
【０１２５】
ＥｐｈＡ２のチロシンリン酸化はその固有の酵素活性に必要であるようには見えないが、リガンド媒介型のチロシンリン酸化は、ＥｐｈＡ２タンパク質の安定性を制御する。具体的には、チロシンリン酸化は、ｃ−Ｃｂｌアダプタータンパク質と相互作用し、そして次に内部移行してプロテオソーム内で分解されるようＥｐｈＡ２を運命付ける(J. Walker-Daniels et al. , Mol. Cancer Res. 2002 Nov; 1 (1) : 79-87)。結果的に、ＬＭＷ−ＰＴＰのホスファターゼ活性は、ＥｐｈＡ２タンパク質の安定性を増大させることが予想される。事実、最高レベルのＥｐｈＡ２が、高レベルのＬＭＷ−ＰＴＰを有する細胞において一貫して見られる。この発見の１つの興味深い暗示は、それがＥｐｈＡ２の遺伝的制御から独立した機構を提供し、なぜ高レベルのＥｐｈＡ２が多数の異なる腫瘍において見られるかを説明する。別の可能性は、ＬＭＷ−ＰＴＰがＥｐｈＡ２の遺伝子発現をアップレギュレートし、そして、我々による本発見はこの可能性を形式的には排除しない。ＥｐｈＡ２インヒビターがＬＭＷ−ＰＴＰを過剰発現する細胞の悪性の特徴を逆転させたという事実は、ＥｐｈＡ２のアップレギュレーションがＬＭＷ−ＰＴＰを媒介する形質転換の細胞性挙動に関連することを示唆している。
【０１２６】
要約すると、我々による本研究は、この実施例及びKikawa et al. , J. Biol. Chem. 277 (42): 39274-39279 (2002)に記載のように、腫瘍由来ガン腫細胞において過剰発現する新規発ガン遺伝子としてＬＭＷ−ＰＴＰを同定する。我々はまた、ＥｐｈＡ２と同様に、過剰発現したＬＭＷ−ＰＴＰの生化学的作用と生物学的作用を関連付ける。これらの発見は、上皮細胞の転移の進行に寄与する生化学的機構及び生物学的機構の理解に影響を与える。更に、我々による本研究は、ＥｐｈＡ２又はＬＭＷ−ＰＴＰを過剰発現する多数のガン細胞を標的とする機会を最終的に提供する重要なシグナル伝達系を同定する。
【０１２７】
実施例ＩＩＩ．ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現の効果
細胞系及び試薬は、実施例ＩＩに記載のものを使用した(Kikawa et al. , J. Biol. Chem. 277 (42): 39274-39279 (2002))。細胞の可溶化物の生成方並びに免疫沈降及びウェスタンブロット（イムノブロット）解析、ＥＧＴＡ及び過酸化バナジン酸処理、トランスフェクション及び選択、並びに増殖アッセイ、を実施する方法も、実施例ＩＩに記載の通りである(Kikawa et al. , J. Biol. Chem. 277 (42): 39274-39279 (2002))。
【０１２８】
非形質転換細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰ過剰発現の形態学的効果
野生型ヒトＬＭＷ−ＰＴＰ、又は対応するベクターコントロールで安定的にトランスフェクションされたＭＣＦ−１０Ａ細胞の単層培養物を、顕微鏡にかけた（６００ｘ）（図１０）。非形質転換（ベクター）細胞は、特徴的な上皮の形態を保持したが、ＬＭＷ−ＰＴＰをトランスフェクションした細胞は、悪性上皮細胞の特徴である間充織の表現型の形をとった。従って、ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現は、細胞の２次元的な形態を変化することが観察された。
【０１２９】
ＬＭＷ−ＰＴＰをトランスフェクションしたＭＣＦ−１０Ａ細胞は、更に、高細胞密度で培養した場合、悪性転換の特徴である３次元的な病巣を形成することが観察された（図１１）。
【０１３０】
形質転換細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰ不活性化効果
腫瘍細胞においてＬＭＷ−ＰＴＰを阻害するという生物学的な結果を評価するために、高度に浸潤性のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞がＬＭＷ−ＰＴＰ変異体（Ｄ１２９Ａ）で安定的にトランスフェクションされた。Ｄ１２９Ａは基質捕捉変異体として機能し、それにより腫瘍細胞において内因性ＬＭＷ−ＰＴＰの活性と離れて競合する。それは、形質転換細胞においてＬＭＷ−ＰＴＰを効果的に不活性化する。
【０１３１】
Ｄ１２９Ａをトランスフェクションした細胞は、対応する（ベクター）コントロールと比較して、ソフトアガーにおけるコロニー形成の低下を示した（図１２）。従って、形質転換細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの不活性化は、ソフトアガーでのコロニー形成の減少をもたらす。このことは、ＬＭＷ−ＰＴＰが、悪性細胞の特徴である足場依存性の細胞増殖及び／又は生存に必要であることを示す。
【０１３２】
また、ＬＭＷ−ＰＴＰの不活性化が、形質転換細胞における２次元の形態及びＥｐｈＡ２分布を変化させることが明らかとなった。ドミナントネガティブなＬＭＷ−ＰＴＰ（Ｄ１２９Ａ）又は対応するベクターコントロールを発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の形態は、標識したＥｐｈＡ２の免疫蛍光形態学によって評価した（図１３）。コントロール培養物ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、通常、ＥｐｈＡ２が膜ラッフルに拡散して分布し又はそこに豊富に存在している、間充織の形態をとる。対照的に、Ｄ１２９Ａをトランスフェクションした細胞は、細胞間接触部位内にＥｐｈＡ２が豊富に存在する、特徴的な上皮の形態を示す。
【０１３３】
Ｄ１２９Ａ ＬＭＷ−ＰＴＰ ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、ＥｐｈＡ２のリン酸化状態に対するその効果を決定するために、ＥＧＴＡで処理された。５ｘ１０6個のコントロール及びＤ１２９ＡをトランスフェクションしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞からの洗剤抽出は、実施例Ｉ及びＩＩに記載のように収集した。Ｄ７抗体でＥｐｈＡ２を免疫沈降した後、試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、そしてホスホチロシン特異的（４Ｇ１０）抗体を用いたウェスタンブロット解析にかけられた。Ｄ１２９Ａをトランスフェクションした細胞におけるＥｐｈＡ２は、ＥＧＴＡによる処理後であっても、より高度にチロシンリン酸化されることが明らかとなった（図１４）。ＥＧＴＡは、細胞間接触を不安定化し、それにより、リガンド結合の損失の後であっても、ＥｐｈＡ２が脱リン酸されるのを防ぐ。
【０１３４】
図１５は、ＬＭＷ−ＰＴＰをトランスフェクションしたＭＣＦ−１０Ａ細胞及びＤ１２９ＡをトランスフェクションしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１（形質転換した）細胞を用いた免疫蛍光顕微鏡研究に由来する証拠を要約する表である。ＬＭＷ−ＰＴＰをトランスフェクションしたＭＣＦ−１０Ａ細胞の変化した形態及びマーカーは、悪性転換と一致している。更に、Ｄ１２９Ａを過剰発現する細胞の形態は、あまり攻撃的でない（より分化した）表現型と一致する。
【０１３５】
形質転換細胞及び非形質転換細胞におけるＥｐｈＡ２及びＬＭＷ−ＰＴＰの共存
コントロール及びＬＭＷをトランスフェクションしたＭＣＦ−１０Ａ細胞におけるＥｐｈＡ２（Ｄ７抗体を用いる）及びＬＭＷ−ＰＴＰ（ウサギポリクローナル血清を用いる）の細胞内局在は、ホルマリン固定し（３．７％、２分）、洗剤で透過処理した（０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を含むＰＢＳ）、カバーガラス上で培養した単層において評価した。イメージ（図１６Ａ）はニコン社製顕微鏡（６００ｘ）を用いて視覚化し、そしてイメージはニコン社製デジタルカメラ及びソフトウェアを用いて捕らえた。
【０１３６】
野生型ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現は、ストレスファイバーの形成を引き起こすことが明らかとなった（コントロールの細胞において優勢な接着帯と対照的）。反対の状況において、ＬＭＷ−ＰＴＰのドミナントネガティブなインヒビター（Ｄ１２９Ａ）は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１におけるストレスファイバーの数を減少させる。これらの観察は、野生型ＬＭＷ−ＰＴＰが悪性（遊走性及び浸潤性）の表現型を促進し、一方、ＬＭＷ−ＰＴＰの阻害は攻撃的な表現型を逆転させるのに十分であるという仮説と一致している。
【０１３７】
局所接着に対するＬＭＷ−ＰＴＰ過剰発現の効果
局所接着の機構は、パキシリン特異的抗体を用いて決定した場合、更に免疫蛍光顕微鏡によりＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において評価された。パキシリンの細胞内局在は、ホルマリン固定し（３．７％、２分）、洗剤で透過処理した（０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を含むＰＢＳ）カバーガラス上で培養した単層において評価した。イメージ（図１８）はニコン社製顕微鏡（６００ｘ）を用いて視覚化し、そしてイメージはニコン社製デジタルカメラ及びソフトウェアを用いて捕らえた。
【０１３８】
野生型ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現は、特に細胞遊走及び浸潤の最前線での、局所接着の突出を増大させ、このことは、より攻撃的な表現型と一致している。反対の状況において、ＬＭＷ−ＰＴＰのドミナントネガティブなインヒビター（Ｄ１２９Ａ）は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１における局所接着の突出を低下させ、局所接着の（局在化というよりむしろ）散在性の分布をもたらし、このことは細胞遊走又は浸潤と一致している。
【０１３９】
悪性の特徴の病理学的マーカー
サイトケラチン（図１９）及びビメンチン（図２０）の発現は、免疫蛍光顕微鏡を用いて評価した。サイトケラチン及びビメンチンの染色は、ホルマリン固定し（３．７％、２分）、洗剤で透過処理した（０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を含むＰＢＳ）、カバーガラス上で培養した単層において評価した。イメージ（図１８）はニコン社製顕微鏡（６００ｘ）を用いて視覚化し、そしてイメージはニコン社製デジタルカメラ及びソフトウェアを用いて捕らえた。
【０１４０】
野生型ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現は、サイトケラチンの発現を減少させるが、ビメンチンの発現を増大させることが明らかとなった。これらの結果は、中間径フィラメントタンパク質の発現におけるこれらの変化が、ガンの診断及び分類の病理学者によってしばしば使用されることを考慮すると、注目すべきことである。
【０１４１】
実施例ＩＶ．非形質転換上皮細胞の腫瘍形成能に対するＬＭＷ−ＰＴＰ過剰発現の効果
細胞（ＭＣＦ−１０Ａ、ＭＣＦ−１０Ａ Ｎｅｏ（コントロール）及び安定的に野生型ＬＭＷ−ＰＴＰを過剰発現する、トランスフェクションしたＭＣＦ−１０Ａ細胞）を、皮下注射を介してマウスに導入した。２つの投与量レベルを使用した：約２００万個及び５００万個の細胞。３匹のマウスを各グループに含めた。マウスは注射してから２０日目に観察され、そして腫瘍（存在する場合）のサイズを測定した。
【０１４２】
図２１は、注射後２０日目に観察した、５ｘ１０6個の細胞を注射したマウスについての腫瘍測定データを示す。親ＭＣＦ−１０Ａ細胞又はコントロールベクターを注射したマウスのいずれも、注射部位での腫瘍形成を示さなかった。しかしながら、安定的に野生型ＬＭＷ−ＰＴＰを過剰発現するＭＣＦ−１０Ａ細胞を注射したマウスは、５００万個の細胞を注射したマウスのうち３匹全てが、そして１００万個の細胞を注射した３匹のマウスのうち２匹が、有意な増殖を示した。これらの結果は、ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現が、非形質転換上皮細胞に腫瘍形成能を付与するのに十分であることを示唆している。ＥｐｈＡ２は、我々が、非形質転換上皮細胞に対して腫瘍形成能を付与することができることに気付いた唯一の他の発ガン遺伝子である。
【０１４３】
本明細書で引用した、全ての特許、特許出願、及び刊行物、及び電子的に入手可能な材料（例えば、ヌクレオチド配列の、例えばＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑへの提出、並びにアミノ酸配列の、例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢへの提出、並びにＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑにおける注釈付きのコード領域からの翻訳、を含む）は、引用によって組み入れられる。前述の詳細な説明及び例は、理解を明確にするためだけに示したものである。不必要な限定がそれらから理解されるべきではない。本発明は、特許請求の範囲内に含まれるであろう当業者にとって自明な変動について示し、そして説明した正確な詳細に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】図１は、５．４ｋｂの哺乳類発現ベクターである真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３の模式的なマップを示す。独特の制限部位を示す。HPTP遺伝子はこのベクターのHind III/BamH I部位内にクローニングした。
【図２】図２は、ＥｐｈＡ２が関連のホスファターゼによって制御されることを示す。（Ａ）ＭＣＦ−１０Ａヒト哺乳類上皮細胞の単層を、４ｍＭのＥＧＴＡの存在下又は不在下（「Ｃ」としてコントロールを表す）、洗浄剤抽出の前に２０分間インキュベートした。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、そしてホスホチロシン特異的抗体（ＰＹ２０及び４Ｇ１０；上段）でプローブした。膜をストリッピングし、そしてＥｐｈＡ２特異的抗体で再プローブして等しいサンプル添加を確認した（下段）。（Ｂ）ＭＣＦ−１０Ａ細胞は、ＥＧＴＡを用いて、ＮａＶＯ4の存在下又は不在下で、上文で詳述したように処理してホスファターゼ活性を阻害した。（Ｂ）ＥｐｈＡ２は、指定の濃度のＮａＶＯ4の存在下で３７℃で１０分間インキュベートしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から免疫沈降された。
【図３】図３は、ＬＭＷ−ＰＴＰタンパク質レベルが悪性細胞系において上昇することを示す。洗浄剤可溶化物（２〜７レーン）を非形質転換型（ＭＣＦ−１０Ａｎｅｏ）、発ガン遺伝子形質転換型（ＭＣＦ−１０ＡｎｅｏＳＴ）、及び腫瘍由来型（ＭＣＦ−７，ＳＫ−ＢＲ−３，ＭＤＡ−ＭＢ−４３５，ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）の哺乳類上皮細胞から収集した。この試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてＬＭＷ−ＰＴＰ特異的抗体を用いたウェスタンブロットにかけた（上段）。精製したＬＭＷ−ＰＴＰ（レーン１）は、ウェスタンブロット解析のためのポジティブコントロールを提供した。続いて膜をストリッピングし、そしてビンキュリン特異的抗体で再プローブして試料の添加を評価した（下段）。注目すべきは、ＬＭＷ−ＰＴＰが、非形質転換（ＭＣＦ−１０Ａｎｅｏ）試料の相対的に過剰な添加にも関わらず、腫瘍由来細胞において過剰発現しているということである。
【図４】図４は、ＥｐｈＡ２及びＬＭＷ−ＰＴＰがin vivoで分子複合体を形成することを示す。（Ａ）ＥｐｈＡ２の複合体は、５ｘ１０6のＭＣＦ−１０Ａ又はＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から免疫沈降し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてＬＭＷ−ＰＴＰ特異的抗体を用いてウェスタンブロット解析にかけた。（Ｂ）複合体の形成を確認するために、ＬＭＷ−ＰＴＰの複合体を同様に免疫沈降によって単離し、そしてＥｐｈＡ２特異的抗体でプローブした。
【図５】図５は、ＥｐｈＡ２は、in vitroでＬＭＷ−ＰＴＰの基質としての役割を果たし得ることを示す。ＥｐｈＡ２は、指定量のＬＭＷ−ＰＴＰタンパク質との３７℃での０〜３０分間のインキュベーション前に、５ｘ１０6のＭＣＦ−１０Ａ細胞から免疫沈降した。続いて、この試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてホスホチロシン特異的抗体によるウェスタンブロット解析にかけた。膜をストリッピングし、そしてＥｐｈＡ２特異的抗体で再プローブして等量のサンプル添加を確認した。
【図６】図６は、ＬＭＷ−ＰＴＰがＥｐｈＡ２をin vivoで脱リン酸することを示す。（Ａ）ＭＣＦ−１０Ａ細胞は、野生型ＬＭＷ−ＰＴＰをコードする発現ベクターで安定的にトランスフェクションした。洗浄剤可溶化物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そして、ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現を確認するために、ＬＭＷ−ＰＴＰ抗体と、ポジティブコントロールを提供する精製ＬＭＷ−ＰＴＰとを用いたウェスタンブロットにかけた。続いて、対応する試料を、添加用コントロールとしてのβ−カゼイン特異的抗体でプローブした。（Ｂ）ＥｐｈＡ２を免疫沈降し、そしてＥｐｈＡ２（上段）及びＰ−Ｔｙｒ（下段）特異的抗体を用いてウェスタンブロットを実施した。（Ｃ）コントロール及びＬＭＷ−ＰＴＰをトランスフェクションした細胞におけるホスホチロシンの全体レベルは、特異的な抗体を用いて比較した。注目すべきは、内因性のＥｐｈＡ２発現の差異を克服するために、等量のＥｐｈＡ２がこれらの結果のために利用されたことである（項目Ｂと対照的）。（Ｄ）ＬＭＷ−ＰＴＰのドミナントネガティブ型（Ｄ１２９Ａ）又は対応するベクターのコントロールをトランスフェクションしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＥｐｈＡ２のタンパク質レベル（上段）及びホスホチロシン含量は、ウェスタンブロット解析によって評価した。ＬＭＷ−ＰＴＰ活性がＥｐは２ホスホチロシン含量の低下及びＥｐｈＡ２タンパク質レベルの増大に関連するという一貫した発見に注目すべきである。
【図７】図７は、ＬＭＷ−ＰＴＰが悪性の特徴を増強することを示す。（Ａ）足場依存性の細胞増殖を評価するために、１ｘ１０5個のコントロール又はＬＭＷ−ＰＴＰをトランスフェクションしたＭＣＦ−１０Ａ細胞を単層培地内に播種し、そして細胞数を顕微鏡により示した間隔で評価した。（Ｂ）平行の研究において、コントロール及びＬＭＷ−ＰＴＰをトランスフェクションした細胞をソフトアガー中で懸濁した。３７℃での５日間のインキュベーション後のコロニー形成（強拡大１視野当たりのもの）を示す。これらの結果は、少なくとも別々の実験の代表例を示した。*はｐ＜０．０１を示す。
【図８】図８は、ＥｐｈＡ２がＬＭＷ−ＰＴＰ形質転換細胞において酵素活性を保持することを示す。等量のＥｐｈＡ２をコントロール又はＬＭＷ−ＰＴＰ形質転ＭＣＦ−１０Ａ細胞から免疫沈降し、そしてin vitroでのキナーゼアッセイにかけた。（Ａ）γ−32Ｐ標識ＡＴＰによる自己リン酸化は、オートラジオグラフィーによって評価した。等量の試料添加を確認するために、免疫沈降した材料の一部を（Ｂ）ＥｐｈＡ２又は（Ｃ）ホスホチロシン抗体を用いるウェスタンブロット解析によって評価した。ＥｐｈＡ２はＬＭＷ−ＰＴＰ形質転換細胞においてチロシンリン酸化されないが、それは酵素活性を保持している。内因性のＥｐｈＡ２発現の差異を克服するために、等量のＥｐｈＡ２がこれらの結果に利用されたことに注目すべきである（例えば、図５Ｂを参照のこと）。
【図９】図９は、ＬＭＷ−ＰＴＰによる悪性転換がＥｐｈＡ２の過剰発現に関連することを示す。ＭＣＦ−１０Ａ細胞を、ＥｐｈＡ２アンチセンス（ＡＳ）オリゴヌクレオチド、逆方向のアンチセンス（ＩＡＳ）オリゴヌクレオチド又はネガティブコントロールを提供するためのトランスフェクション試薬単独、を用いて処理した。（Ａ）ＥｐｈＡ２特異的抗体を用いるウェスタンブロット解析は、当該アンチセンス処理がＥｐｈＡ２のタンパク質レベルを低下させたことを確認した（上段）。続いて膜をストリッピングし、そしてβ−カテニンについて再プローブして等しい試料添加を確認した（下段）。（Ｂ）平行の試料を懸濁し、そしてソフトアガー中で５日間インキュベートした。強拡大の顕微鏡１視野当たり（ＨＰＦ）の平均コロニー数を示す。*はｐ＜０．０１を示す。
【図１０】図１０は、ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現がトランスフェクションしたＭＣＦ−１０Ａ細胞の２次元的な形態を変化させることを示す。
【図１１】図１１は、ＬＭＷ−ＰＴＰを過剰発現する、トランスフェクションされたＭＣＦ−１０Ａ細胞が高い細胞密度で病巣を形成することを示す。
【図１２】図１２は、形質転換細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの不活性化が、ソフトアガーでのコロニー形成の低下をもたらすことを示す。
【図１３】図１３は、形質転換細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの不活性化が、２次元的な形態及びＥｐｈＡ２の分布を変化させることを示す。
【図１４】図１４は、ＬＭＷ−ＰＴＰを不活性化させるためにＤ１２９Ａをトランスフェクションした形質転換細胞のＥＧＴＡ処理の結果を示す。
【図１５】図１５は、免疫蛍光の発見の要約を示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、コントロール及びトランスフェクションされたＭＣＦ−１０Ａ細胞におけるＥｐｈＡ２とＬＭＷ−ＰＴＰの共存を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、ＬＭＷ−ＰＴＰを不活性化させるためにＤ１２９Ａをトランスフェクションした形質転換細胞におけるＥｐｈＡ２とＬＭＷ−ＰＴＰの共存を示す。
【図１７】図１７は、アクチン骨格の変化した構成がＬＭＷ−ＰＴＰの発現及び機能に関連することを示す。
【図１８】図１８は、変化した局所接着の形成が、ＬＭＷ−ＰＴＰの発現及び機能に関連することを示す。
【図１９】図１９は、ＬＭＷ−ＰＴＰによって変化したサイトケラチンの発現を示す。
【図２０】図２０は、ＬＭＷ−ＰＴＰ発現によって変化したビメンチンの発現を示す。
【図２１】図２１は、５ｘ１０6個のＥｐｈＡ２過剰発現ＭＣＦ−１０Ａ細胞及びコントロールを注射したマウスにおける、注射後２０日目の腫瘍の発生に関連するデータを示す。
【技術分野】
【０００１】
本願は、引用によってその全体が本明細書に組み入れられる２００２年５月２３日出願の米国仮出願番号第６０／３８２，９８８号の利益を主張するものである。
【０００２】
本願はまた、以下の米国特許出願を引用することによってそれらの全体を本明細書に組み入れる：２０００年８月１７日出願の第０９／６４０，９５２号；２０００年８月１７日出願の第０９／６４０，９３５号；及び２００１年９月１２日出願の第０９／９５２，５６０号。
【背景技術】
【０００３】
ガンは、細胞群が不適切に増殖し、そして生存する能力を獲得したときに生じる。これらの生物学的挙動はしばしば、悪性細胞の当該不適切な増殖及び生存を促進する特定のシグナル伝達経路を引き起こすよう一緒に働く遺伝的且つ環境的異常性に起因する。特に、タンパク質のチロシンリン酸化は、細胞の挙動の多くの異なる側面を支配する強力なシグナルを惹起すると考えられている。一般的なパラダイムは、チロシンキナーゼとホスファターゼ活性との平衡が、タンパク質チロシンのリン酸化の細胞レベルを決定する役割を果たし、それによって増殖、生存及び浸潤に関する細胞の決定を支配することを示唆している。このパラダイムは、概して、チロシンキナーゼが発ガン性であろうという一方、チロシンホスファターゼが悪性転換をネガティブに制御することを推定する。この部分は概して正しいが、明るみになってきた事実は、より複雑なものがチロシンキナーゼとホスファターゼとの間で相互作用していることを明らかにしている。例えば、ＰＴＰＣＡＡＸチロシンホスファターゼは、強力な発ガン遺伝子として機能することが近年証明されてきた。更に、Ｓｒｃファミリーキナーゼの酵素活性は、重要なチロシン残基のホスファターゼ媒介脱リン酸によって解放される。後者の状況においては、ホスファターゼは、キナーゼの酵素活性を増大させることによってタンパク質チロシンリン酸化を実際にアップレギュレートしうる。
【０００４】
ＥｐｈＡ２受容体チロシンキナーゼは、多数のヒトのガンにおいて過剰発現する。高レベルのＥｐｈＡ２は、多数の異なるガン、例えば乳ガン、前立腺ガン、大腸ガン及び肺ガン並びに転移性黒色腫に当てはまる。更に、最高レベルのＥｐｈＡ２が一貫してヒトのガンの最も攻撃的な細胞モデル上で見られる。ＥｐｈＡ２は、ＥｐｈＡ２の異所的な過剰発現が非形質転換上皮細胞に腫瘍原性及び転移性を賦与するのに十分であるので、単なる悪性疾患のマーカーではない。
【０００５】
ガン細胞はまた、非形質転換上皮細胞と比較した場合に、ＥｐｈＡ２機能の差異を示す。非形質転換上皮細胞において比較的低レベルで存在するにも関わらず、これらの細胞中のＥｐｈＡ２は、顕著にチロシンリン酸化される。対照的に、悪性細胞中のＥｐｈＡ２は、それがこれらの細胞においてひどく過剰発現するにも関わらず、チロシンリン酸化されない。ＥｐｈＡ２のホスホチロシン含量におけるこれらの差異は重要であり、それはチロシンリン酸化されたＥｐｈＡ２がネガティブに腫瘍細胞の増殖及び浸潤を制御し、一方、リン酸化されてないＥｐｈＡ２が悪性細胞におけるこれらの同一の挙動を促進するためである。ＥｐｈＡ２と悪性との関連は、国際特許出願ＷＯ０１／１２１７２及びＷＯ０１／１２８０４において更に詳述されている。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、ガンの診断、予後及び処置における新規診断及び治療用標的としての低分子量タンパク質チロシンホスファターゼ（ＬＭＷ−ＰＴＰ）を同定する。従って、本発明は、新規なガンの診断、予後及び処置の方法を提供する。
【０００７】
１つの側面において、本発明は、哺乳類、好ましくはヒトにおけるガンの処置方法を提供する。本発明の処置方法の１つの態様において、当該方法は哺乳類におけるガンを処置するのに有用であり、ここで、当該ガン細胞は、低分子量タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＭＷ−ＰＴＰ）を発現する。当該処置方法は、ＬＭＷ−ＰＴＰの活性を阻害するのに有効な処置物質を哺乳類に投与することを包含する。
【０００８】
本発明の処置方法の別の態様において、当該方法は哺乳類におけるガンを処置するのに有用であり、ここで、当該がん細胞は低分子量タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＭＷ−ＰＴＰ）及びＥｐｈＡ２受容体分子を発現する。当該処置方法は、ＬＭＷ−ＰＴＰの活性を阻害するのに有効な第一の処置物質及び当該ＥｐｈＡ２受容体分子の生体活性を望ましく変化させるのに有効な第二の処置物質を哺乳類に投与することを包含する。好ましくは、ＥｐｈＡ２の生体活性は、ＥｐｈＡ２受容体分子のホスホチロシン含量を増大させることによって望ましく変化する。
【０００９】
本発明の方法を用いて処置されるガンは、好ましくは転移性ガン腫である。任意には、本発明の処置方法において、前記処置物質は、細胞毒性物質と共有結合する。
【００１０】
ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現は、哺乳類におけるガン細胞の存在を示唆する。従って、別の側面において、本発明は、ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現に基づいた、哺乳類におけるガンの診断方法を提供する。１つの態様において、本発明の当該診断方法は、哺乳類から得られる生体材料中の細胞を可溶化して細胞可溶化物を生成せしめ；当該細胞可溶化物を、ＬＭＷ−ＰＴＰに結合する診断物質と接触させて結合複合体を形成せしめ；そしてＬＭＷ−ＰＴＰが非ガン性の生体材料と比較して、前記生体材料中で過剰発現しているか否かを決定すること、を包含する。任意に、当該方法はまた、哺乳類から前記生体材料を得ることを含む。本発明の当該診断方法の別の態様において、ＬＭＷ−ＰＴＰの発現レベルは、前記生体材料をアッセイして、ＬＭＷ−ＰＴＰが、非ガン性生体試料と比較して前記生体材料中で過剰発現しているか否かを決定することによって解析される。この診断方法は、哺乳類において、又は哺乳類の外側で実施されうる。哺乳類のあらゆる生体材料を解析することができ、例えば哺乳類の組織、器官又は体液である。
【００１１】
更に別の側面において、本発明は、Ｅｐは２受容体分子をターゲティングする候補のガン治療物質の有効性を評価するためのスクリーニング方法を提供する。１つの態様において、当該スクリーニング方法は、ＥｐｈＡ２受容体分子及びＬＭＷ−ＰＴＰを発現するガン細胞を、候補の治療物質と接触させて処置されたガン細胞を生成せしめ；当該処置されたガン細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの量又は活性を決定し；そして当該処置されたガン細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの量又は活性と、類似の未処置のガン細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの量又は活性と比較すること、を包含する。当該処置された細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの量又は活性の低下は、前記候補の治療物質のＥｐｈＡ２ターゲティングの有効性を示唆する。
【００１２】
好ましい態様の詳細な説明
チロシンリン酸化は、細胞膜チロシンキナーゼ（すなわち、他のタンパク質又はペプチドをリン酸化する酵素）によって制御され、そしてチロシンキナーゼの発現の増大は、転移性のガン細胞において生じることが知られている。しかしながら、我々は、その逆の反応である脱リン酸を触媒する酵素が強力な発ガン性タンパク質であるという驚くべき発見をした。この酵素は、低分子量のタンパク質チロシンホスファターゼ（ＬＭＷ−ＰＴＰ）であり、そしてその発ガン性の能力は、少なくとも場合によっては受容体チロシンキナーゼＥｐｈＡ２に関連しており、これはまた、発ガン及び転移に関与している。
【００１３】
従って、ＬＭＷ−ＰＴＰは、ガン治療を対象とする処置方法のための新規で且つこれまでにない標的として確立される。ＬＭＷ−ＰＴＰは、単独で、又はＥｐｈＡ２、他の発ガン性チロシンキナーゼ、あるいは他の発ガン性遺伝子又は発ガン性タンパク質を標的とする処置と組み合わせて、標的となり得る。ＬＭＷ−ＰＴＰレベルはまた、ガンの検出におけるマーカーとして、あるいはＥｐｈＡ２又はガンの発生若しくは進行に関連する他のチロシンキナーゼを標的とする処理の影響を解析するための代理のマーカーとしての役割を果たし得る。
【００１４】
低分子量タンパク質チロシンホスファターゼ
タンパク質チロシンホスファターゼ（時にホスホチロシンホスファターゼとも称される）は、ＰＴＰアーゼとして知られており、リン酸一エステルの加水分解、具体的にはタンパク質ホスホチロシル残基の脱リン酸を触媒する。３つの主要なＰＴＰアーゼのクラス；二重特異性ＰＴＰアーゼ、高分子量ＰＴＰアーゼ及び低分子量ＰＴＰアーゼがある（Zhang, M. , Stauffacher, C. , and Van Etten, R. L. (1995), "The Three Dimensional Structure, Chemical Mechanism and Function of the Low Molecular Weight Protein Tyrosine Phosphatase," Adv. Prot. Phosphatases 9, 1-23）。複数の異なる頭字語が、低分子量（ＬＭＷ）ＰＴＰアーゼについて交換可能に使用されており、それらにはＬＭＷ−ＰＴＰ、ＬＭＷＰＴＰ、ＬＭＷ−ＰＴＰアーゼ及びＬＭＷＰＴＰアーゼが含まれる。
【００１５】
ＬＭＷ−ＰＴＰは、多数の異なる生物から単離されたメンバーを含むＰＴＰアーゼファミリーを表す。それらは、典型的に約１８ｋＤの相対分子量を有する。高等生物に見られるＬＭＷ−ＰＴＰファミリーのメンバーには、ウシ(Heinrikson, R. L. (1969), “Purification and Characterization of a Low Molecular Weight Acid Phosphatase from Bovine Liver,” J Biol Chem. 244, 299-307)、エルウィニア(Erwinia)(Burgert, P. and Geider, K. (1997), “Characterization of the ams I Gene Product as a Low Molecular Weight Acid Phosphatase Controlling Exoplysaccharide Synthesis of Erwinia Amylovora,” FEBS Lett. 400, 252-256)、出芽酵母(Ltp1)( Ostanin, K., Pokalsky, C., Wang, S., and Van Etten, RL., “Cloning and Charaterization of a Saccharomyces cerevisiae Gene Encoding the Low Molecular Weight Protein Tyrosine Phosphatase,” J. Biol. Chem., 270, 18491-18499)、分裂酵母(Stpq)(Mondesert, O., Moreno, S. and Russell, P. (1994), ”Low molecular weight protein-tyrosine phosphatases are highly conserved between fission yeast and man,“ J. Biol. Chem. 269, 27996-27999)、ラットACP1及びACP２イソ酵素(Manao G, Pazzagli L, Cirri P, Caselli A, Camici G, Cappugi G, Saeed A, Ramponi G (1992), “Rat liver low Mr phosphotyrosine protein phosphatase isoenzymes purification and amino acid sequences,” J. Prot. Chem. 11, 333-345)、ヒト（HPTP）(Wo, Y.-Y. P., Zhou, M.-M., Stevis, P., Davis, J. P., Zhang, Z. Y., and Van Etten, R. L. (1992), “Cloning, expression, and catalytic mechanism of the low molecular weight phosphotyrosyl protein phosphatase from bovine heart”, Biochemistry 31, 1712-21; Dissing J, and Svensmark O. (1990)“Human red cell acid phosphatase: purification and properties of A, B and C isozymes,” Biochem. Biophys. Acta.1041:232-242; Waheed, A., Laidler, P. M., Wo, Y.-Y. P., and Van Etten, R. L., (1988)“Purification and physicochemical characterization of a human placental acid phosphatase possessing phosphotyrosyl protein phosphatase activity,” Biochemistry. 1988 Jun 14;27(12):4265-73; Boivin, P. and Galand, C. (1986), “The human red cell acid phosphatase is a phosphotyrosine protein phosphatase which dephosphorylates the membrane protein band 3. Biochem Biophys Res Commun 1986 Jan 29;134(2):557-564)、及びBPTP(Zhang, Z-Y. and Van Etten, R. L. (1990), “Purification and characterization of a low-molecular-weight acid phosphatase--a phosphotyrosyl-protein phosphatase from bovine heart,” 282, 39-49; Chernoff, J. and Li, H.-C. (1985), “A major phosphotyrosyl-protein phosphatase from bovine heart is associated with a low-molecular-weight acid phosphatase,” Arch Biochem Biophys. 240, 135-45) が含まれる。これらのタンパク質は、他のＰＴＰアーゼと同様に、共通の活性部位配列モチーフであるＣｙｓ−（Ｘａａ）5−Ａｒｇを共有する。高等脊椎動物の酵素との高度の配列同一性を共有する幾つかのタンパク質には、エスケリッチャ・コリ(Escherichia coli)(Stevenson, G. Andrianopopoulos, K. Hobbs, M. , and Reeves, P. R. (1996), "Organization of the Escherichia coli K-12 Gene Cluster Responsible for Production of the Extracellular Polysaccharide Colanic Acid," J. Bact. 178, 4885-4893)、クレブシエラ属(Klebsiella)(Arakawa, Y. , Washarotayankun, R., Nagatsuka, T. , Ito, H. , Kato, N. , and Ohta, M. (1995), "Genomic Organization of the Klebsiella pneumoniae CPS Region Responsible for Serotype K2 Capsular Polysaccharide Synthesis in the Virulent Strain Chedid, "J. Bacteriol. 177, 1788-1796)、シネココッカス(Synechococcus)(Wilbanks, S. M. and Glazer, A. N. (1993), "Rod Structure of a Phycoerythrin D-containing Phycobilisdome.I. Organization and Sequence of the Gene Cluster Encoding the Major Phycobilirotein Rod Components in the Genome of Marine Synechococcus sp. WH8020, "J. Biol. Chem. 268, 1226-1234)、及びトリトリコモナスフォエタス(Tritrichomonasfoetus)(gb U66070)が含まれる。
【００１６】
幾つかの哺乳類低分子量ＰＴＰアーゼがイソ酵素として存在する。特定の種内で、当該イソ酵素間のアミノ酸配列同一性は９５％超である。１つのそのような種はヒトであり、ここではヒト赤血球タンパク質チロシンホスファターゼ（ＨＰＴＰ）が発現している。このタンパク質の２つの形態Ａ（ファスト）及びＢ（スロー）は、デンプンゲル電気泳動の間に分離した場合にそれらの電気泳動の移動度において異なる。可変領域である残基４０−７３を除き、当該イソ酵素は同一のアミノ酸配列を有する。
【００１７】
ヒトイソ酵素（Ａ及びＢ）は、ＢＰＴＰと比較した場合に、それぞれ８１％及び９４％という高レベルのアミノ酸配列同一性を有する。低分子量ＰＴＰアーゼのプロトタイプであるＢＰＴＰの結晶構造が解明されている（Zhang, M. , Van Etten, R. L. , and Stauffacher, C. V. (1994), "Crystal Structure of Bovine Heart Phosphotyrosyl Phosphatase at 2.2-A Resolution,"Biochemistry 33,11097-11105）。当該構造は、四本鎖の中心の平行β−シートの両側にα−ヘリックスという構造から成る。この構造は、２つの右巻きのβαβモチーフ部分に存する古典的なヌクレオチド結合フォールドであるロスマンフォールドの部分を組み込んでいる。ＨＰＴＰ−Ａ及び酵母ＬＴＰ１の結晶構造が解明されており(Wang, S. , Stauffacher, C. and Van Etten, R. L. (2000), "Structural and Mechanistic Basis for the Activation of a Low Molecular Weight Protein Tyrosine Phosphatase by Adenine," Biochemistry 39,1234-1242 ; Zhang, M. (1995), Ph. D. Thesis, Purdue University)、そしてＢＰＴＰに似ている。低分子量ＰＴＰアーゼは、８個の保存されたシステイン（全て遊離チオール型）、７個の保存されたアルギニン、及び２個の保存されたヒスチジンを有する(Davis JP, Zhou, MM, and Van Etten RL.(1994), "Kinetic and site-directed mutagenesis studies of the cysteine residues of bovine low molecular weight phosphotyrosyl protein phosphatase." J. Biol. Chem. 269, 8734-8740)。
【００１８】
チロシンリン酸化されるタンパク質及びペプチド、並びにより単純な分子、ホスホチロシン及びｐＮＰＰは、全て、低分子量ＰＴＰアーゼの基質の候補である。
【００１９】
これらの酵素の天然阻害剤及び合成阻害剤も存在している。低分子量ＰＴＰアーゼの最も強力な阻害剤には、イオンのバナジウム酸塩、タングステン酸塩、及びモリブデン酸塩がある。
【００２０】
ＥｐｈＡ２受容体チロシンキナーゼ
ＥｐｈＡ２は１３０ｋＤのタンパク質であり、受容体チロシンキナーゼの最大のファミリーのメンバーである(Andres AC; Reid HH; Zurcher G; Blaschke RJ; Albrecht D; Ziemiecki A. (1994), "Expression of two novel eph-related receptor protein tyrosine kinases in mammary gland development and carcinogenesis," Oncogene 9, 1461-1467; Lidberg et al., Mol. Cell. Biol. 10:6316-6324(1990))。それは主に、上皮細胞起源、例えば乳房、肺、卵巣、結腸等の細胞において発現している。このタンパク質は、ＥＣＫ、Ｍｙｋ２、及びＳｅｋ２としても知られており、エリスロポエチン産生肝細胞性のガン腫細胞系から単離された(Hirai, H., Maru, Y., Hagiwara, K., Nishida, J. and Takaku, F. (1987) "A novel putative tyrosine kinase receptor encoded by the eph gene," Science 238:1717-1720)。多数の名前及び、異なるが関連しているＥｐｈタンパク質の増大しているファミリー、に起因して、命名委員は、前記タンパク質を公的に命名するために会合した(Flanaga JG, Gale NW, Hunter T, Pasquale EB, Tessier-Lavigne M)(1997), "Unified nomenclature for Eph family receptors and their ligands, the Ephrins," Cell 90:403-404)。前記タンパク質は、それらがＧＰＩ連結型又は膜貫通であるリガンドに結合するか否かに依存して、それぞれＥｐｈＡ又はＥｐｈＢと命名された。ＥｐｈＡタンパク質は、エフリン−Ａリガンドに結合し、一方、ＥｐｈＢタンパク質はエフリン−Ｂリガンドに結合する。番号は、それらが発見された順番を表す。
【００２１】
異なる方法がＥｐｈＡ２を単離するために使用されている。初めに、ハイブリダイゼーション技術がＤＮＡライブラリーからＥｐｈＡ２を単離するために使用された (Lindberg et al., Mol. Cell. Biol. 10: 6316-6324 (1990); Hirai, H. , Maru, Y. , Hagiwara, K., Nishida, J. , and Takaku, F. (1987), "A Novel Putative Tyrosine Kinase Receptor Encoded by the Eph Gene,"Science 238, 1717-1720)。次に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が、当該キナーゼのドメインのためのプライマーを用いて利用された(Andres, A. C. , Reid, H. H. , Zurcher, G. , Blaschke, R. J. , Albrecht, D., and Ziemiecki, A. (1994), "Expression of Two Novel eph-related Receptor Protein Tyrosine Kinases in Mammary Gland Development and Carcinogenesis,"Oncogene 9,1461-1467 ; Gilardi-Hebenstreit, P. , Nieto, M. A., Frain, M., Mattei, M. G. , Chestier, A. , Wilkinson, D. G. , and Charnay, P. (1992), "An Eph-related Receptor Protein Tyrosine Kinase Gene Segmentally Expressed in the Developing Mouse Hindbrain, "oncogene 7, 1499-2506)。次に、ｃＤＮＡ発現ライブラリーがホスホチロシン特異的抗体でプローブされた(Zhou, R., Copeland, T. D., Kromer, L. F., and Schultz, N. T. (1994), "Isolation and Characterization of Bsk, a Growth Receptor-like Tyrosine Kinase Associated with the Limblic system," J. Neuro. Res. 37, 129-143)。最後に、モノクローナル抗体が、発ガン性に形質転換している細胞において、チロシンリン酸化されているタンパク質に対してスクリーニングされた(Zantek, N. D. (1999), Ph. D. Thesis, Purdue University)。
【００２２】
ＥｐｈＡ２は、エフリンＡとして知られているリガンドと、エフリンＡ１として同定されている生理学的リガンドと一緒に結合する。リガンド結合は、Ｅｐｈタンパク質のチロシンリン酸化を誘導する。ＥｐｈＡ２は、特に、５個の異なるエフリンリガンドに結合することができる。
【００２３】
ＥｐｈＡ２は、正常な乳房上皮と形質転換した乳房上皮とで特徴的な差異を有する(Zantek, N. D. (1999), Ph. D. Thesis, Purdue University)。正常な乳房上皮において、ＥｐｈＡ２は低いタンパク質レベルで存在し、それがチロシンリン酸化され、そして、最終的に、細胞間接着部位において局在する。形質転換した乳房上皮において、高タンパク質レベルのＥｐｈＡ２が存在しており、それはもはやチロシンリン酸化されず、そして膜ラッフル内に局在する。
【００２４】
ＥｐｈＡ２は、ガンにおいて機能的な役割を有することが明らかとなっている。過剰発現した場合、ＥｐｈＡ２は強力な発ガン性タンパク質である (Zelinski, D. P. , Zantek, N. D., Stewart, J. , Irizarry, A. & Kinch, M. S. (2001) Cancer Res 61, 2301-2306)。ＭＣＦ−１０Ａ細胞におけるＥｐｈＡ２の過剰発現は、悪性転換をもたらす。また、これらの過剰発現細胞のヌードマウスへの注入は腫瘍を引き起こす。興味深いことに、ガン細胞及びＥｐｈＡ２過剰発現細胞におけるＥｐｈＡ２は、チロシンリン酸化されず、一方、非形質転換細胞におけるＥｐｈＡ２はチロシンリン酸化される。
【００２５】
ＥｐｈＡ２を制御することが本明細書で証明されているＬＭＷ−ＰＴＰはまた、Ｅｐｈファミリーの別のメンバーであるＥｐｈＢ１と相互作用することが証明されている(Stein, E. , Lane, A. A., Cerretti, D. P. , Schoecklmann, H. O., Schroff, A. D. , Van Etten, R. L. , and Daniel, T. O. (1998), "Eph Receptors Discriminate Specific Ligand Oligomers to Determine Alternative Signaling Complexes, Attachment, and Assembly Responses," Genes & Dev. 12,667-678)。
【００２６】
ＬＭＷ−ＰＴＰ活性の治療的阻害
低分子量タンパク質チロシンホスファターゼ（ＬＭＷ−ＰＴＰ）は、多数の腫瘍細胞において過剰発現している。以下の例は、ＥｐｈＡ２のホスホチロシン含量はＬＭＷ−ＰＴＰによってネガティブに制御され、発ガンにおけるこのホスファターゼの役割を確立していることを示している。それらは更に、ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現が、ＥｐｈＡ２のレベルの同時の増大を誘導し、且つ非形質転換上皮細胞に悪性転換を賦与するのに十分であることを示している。ＬＭＷ−ＰＴＰの増大した活性化又は発現と関連している発ガン（ガン細胞がＥｐｈＡ２を発現するか否か）は、本発明に従いＬＭＷ−ＰＴＰの活性を阻害することによって処置又は予防されうる。
【００２７】
これらの発見は、予防方法及び治療方法の標的としてＬＭＷ−ＰＴＰを確立する。ＬＭＷ−ＰＴＰの活性を阻害することによって、ＥｐｈＡ２の脱リン酸は遅延又は予防され、それによって望ましくはＥｐｈＡ２の活性を変化させ、そしてガンの進行を予防又は逆転しうる。
【００２８】
ＬＭＷ−ＰＴＰの活性の阻害をもたらす処置は、それ故に、ガン患者の病状における望ましい変化を伴うことが予期される。ガン患者の病状における望ましい変化には、例えば全身腫瘍組織量(tumor burden)の減少、腫瘍増殖の遅延、病期の進行の予防又は繰延及び転移の予防又は繰延、が含まれる。患者の病状の望ましい変化は、Ｘ線撮影、断層撮影、生化学的アッセイ等を含む任意な常用の方法を用いて検出されうる。
【００２９】
従って、本発明は、哺乳類、好ましくはヒトのガンを処置する方法を提供する。当該方法はまた、脊椎動物への応用、例えば、ペット、例えばネコ又はイヌのガンの処置、に良く適している。当該方法は、ＬＭＷ−ＰＴＰを過剰発現する細胞、特に、過剰発現し、又は機能的に変化したＥｐｈＡ２チロシンキナーゼ受容体を更に有する乳房、前立腺、結腸、肺、膀胱、卵巣、膵臓及び皮膚（黒色腫）の転移性ガン腫細胞、を特徴とするガンを処置するのに有効である（例えば、Kinch et al., Clin. Cancer Res. , 2003,9 (2): 613-618 ; Kinch et al. , Clin. Exp. Metastasis, 2003,20 (1) : 59-68; Walker-Daniels et al. , Am J. Pathol. , 2003, 162 (4): 1037-1042; Zelinski, D. P. , Zantek, N. D. , Stewart, J., Irizarry, A. & Kinch, M. S. (2001) Cancer Res 61, 2301-2306; Zantek, N. D. (1999), Ph. D. Thesis, Purdue Universityを参照のこと）。ＬＭＷ−ＰＴＰの生体活性を阻害する処置物質は、哺乳類に対し、全身的に又はガン腫瘍部位に、ＥｐｈＡ２の生体活性を阻害するのに有効な量で導入される。任意には、当該処置物質は薬物、好ましくは細胞毒性薬と連結されることがあり、それによって、ＬＭＷ−ＰＴＰを阻害し、且つ当該細胞毒性薬のためのキャリヤー分子として役割を果たすという二重の活性を有する。生じた分子複合体が開裂可能な治療物質を含む場合、処置には、開裂を達成するための更に別の物質の送達が含まれることがある。
【００３０】
ＬＭＷ−ＰＴＰ活性の「阻害」は、処置の前のＬＭＷ−ＰＴＰ活性と比較して評価されうる。典型的に、これは、細胞系、例えば以下の実施例に記載のものを用いて、研究室の設定において評価される。ヒトのガン研究において慣習的に使用されるモデル系の研究室の設定においてＬＭＷ−ＰＴＰ活性の阻害を引き起こす処置物質の、患者に対する投与は、in vivoでの患者の細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰ活性の阻害をもたらすことが十分に予期される。本発明の方法が、ＬＭＷ−ＰＴＰ活性が標的細胞において阻害される方法、又はその範囲に限定されないことを理解すべきである。
【００３１】
ＬＭＷ−ＰＴＰ活性の阻害方法には、例えば１又は複数のＬＭＷ−ＰＴＰ酵素（例えばＨＰＴＰ−Ａ及びＨＰＴＰ−Ｂ）をコードする遺伝子に直接働くもの、当該遺伝子によって産生されるｍＲＮＡ転写物、当該ｍＲＮＡ転写物の前記タンパク質への翻訳を妨害するもの、及び当該翻訳タンパク質の活性を直接損なうもの、が含まれる。
【００３２】
遺伝子の転写は、前記細胞をアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡ分子あるいは二本鎖ＲＮＡ分子を送達することによって妨害されうる。例としてはｓｉＲＮＡ及びｉＲＮＡがある。酵素活性を阻害し得る別の方法は、前記遺伝子のｍＲＮＡ転写産物を妨害することによるものである。例えば、リボザイム（又はリボザイムを作用可能にコードするＤＮＡベクター）は、標的ｍＲＮＡを開裂するよう前記細胞に送達されうる。アンチセンス核酸及び二本鎖ＲＮＡはまた、翻訳を妨害するために使用されることもある。
【００３３】
本発明は、前記処置物質を送達するために使用される方法に限定されない。当該処置物質がポリペプチド、例えばＤ１２９Ａ ＬＭＷ−ＰＴＰである場合、それは、都合よくは、細胞に一旦送達されると転写され、そして翻訳するように作用可能に前記処置物質をコードするＤＮＡ分子を当該細胞内に導入することによって、遺伝子治療の態様で送達されうる。ＤＮＡは裸のＤＮＡであってもよく、あるいはそれはベクターの一部として準備されてもよい。ベクターは、ウイルス性又は非ウイルス性のものでもよく（例えば、プラスミド又はコスミド）、組込み又は非組込みのものであってもよい。ウイルスベクターの例には、レトロウイルスベクター及びアデノウイルスベクターが含まれる。
【００３４】
ペプチド、リガンド、リガンドミミック、ペプチドミメティック化合物及び他の小分子は、前記翻訳タンパク質の活性を直接損なわせるのに使用されうるものの例である。任意には、これらの物質は、送達担体、例えばリポソームを用いて導入され得る。あるいは、ＬＭＷ−ＰＴＰの活性を阻害するタンパク質性の細胞内物質は、核酸、例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、又はそれらのアナログ又は組み合わせとして、常用の方法を用いて送達されることがあり、ここで、治療用ポリペプチドは前記核酸によってコードされ、そして標的哺乳類細胞において発現するよう作用可能に制御因子に連結している。
【００３５】
ＬＭＷ−ＰＴＰ活性の阻害における使用に好ましい処置物質には、小分子、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及び基質ミミック（例えば、非加水分解性又は基質捕捉性阻害剤）が含まれる。処置物質は、基質に似ているアンタゴニスト、又はＬＭＷ−ＰＴＰがその基質に結合するのを妨害するアンタゴニスト、特にＥｐｈＡ２−ＬＭＷ−ＰＴＰの相互作用を妨害するもの、を含むことがある。リン酸ピロドキサールに似ている小分子が特に好ましく、例えば、リン酸ピロドキサールのリン酸基をホスホン酸又はスルホン酸で置換しているものである。ＬＭＷ−ＰＴＰの活性部位が標的となることもあり、特にＴｙｒ１３１、Ｔｙｒ１３２及びＡｓｐ１２９である。例えば、以下の実施例において示すように、基質捕捉変異体であるＬＭＷ−ＰＴＰタンパク質Ｄ１２９Ａ（１２９位のＡｓｐがＡｌａ）は、野生型ＬＭＷ−ＰＴＰに対して有効に競合して、正常な上皮の形態を形質転換した細胞に対し戻す。ＢＰＴＰのＸ線結晶構造が解明されているので、特に治療的に有用であることが予期されるＬＭＷ−ＰＴＰの高度に特異的な阻害剤を同定し、又は設計するための合理的な薬物設計が使用されうる。
【００３６】
前記処置方法の好ましい態様には、ＬＭＷ−ＰＴＰを標的とする第一の処置物質及びＥｐｈＡ２を標的とする第二の処置物質をガン患者に投与することを含む。当該処置物質は、任意の順番で投与されてもよく、あるいは同時に投与されてもよい（同時投与）。ＬＭＷ−ＰＴＰ又はＥｐｈＡ２を標的とする多数の処置物質が投与されることもある。
【００３７】
ＥｐｈＡ２を標的とする処置物質は、例えば抗体、小分子、ペプチド、リガンド若しくはリガンドミミック、又はアンチセンス核酸であってもよい。前記方法の１つの側面において、前記第二の処置物質は、受容体分子上に細胞外エピトープを結合させることによってＥｐｈＡ２を「活性化」する。リガンドを媒介する活性化は、ＥｐｈＡ２のホスホチロシン含量の増大を特徴とし、そしてＥｐｈＡ２活性の望ましい変化を伴う。「ＥｐｈＡ２活性の望ましい変化」とは、細胞増殖を抑止又は反転させるような、あるいはガン細胞の死滅を惹起又は生じさせるような、ガン細胞におけるＥｐｈＡ２受容体の活性、数字（すなわちタンパク質レベル）及び／又は機能、の変化を意味する。細胞増殖(growth)又は増殖(proliferation)の抑止又は反転は、ガン細胞における種々の表現型の変化、例えば分化の増大、ＥＣＭタンパク質についての親和性の低下、細胞間接着の増大、増殖速度の遅延、ＥｐｈＡ２の数の低下及び／又はＥｐｈＡ２の局在化の増大、細胞遊走又は浸潤の低下、によって証明することができ、そして直接的又は間接的に引き起こされうる。任意に、第二の処置物質はＥｐｈＡ２架橋、及び／又はＥｐｈＡ２の分解の加速、をもたらす。本発明の別の側面において、当該第二の処置物質は、標的のガン又は前ガン性の細胞におけるＥｐｈＡ２の発現を、ＤＮＡ／ＲＮＡレベルで、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合を介して低下させる。
【００３８】
ガン又は前ガン性の症状の検出
ＬＭＷ−ＰＴＰはまた、哺乳類、好ましくはヒトにおけるガン又は前ガン性の症状のマーカーとしての役割を果たすことがある。本発明は、それ故に、生体試料中のＬＭＷ−ＰＴＰを検出し、そして、任意にそれらの量又は活性を定量することによって、ガン性又は前ガン性の症状を診断し、あるいはガンを病期決定(staging)する方法も含む。本発明の診断方法は、ガンの最初の診断を得て、又はそれを確認し、あるいはガンの局在、ガンの転移、又はガンの予後についての情報を提供するために使用されることもある。前記方法は、ヒト及び獣医学的な使用にも応用可能である。
【００３９】
前記診断方法の１つの態様において、哺乳類から得られた生体試料、例えば組織、器官又は体液が解析される。当該方法は、任意に、哺乳類から生体材料を取り出す段階を含む。当該生体材料中に存在する細胞は可溶化され、そして当該可溶化物は、ポリクローナル又はモノクローナルＬＭＷ−ＰＴＰ抗体と接触される。生じた抗体／ＬＭＷ−ＰＴＰ結合複合体は、それ自体検出可能であるか、あるいは別の化合物と会合して検出可能な複合体を形成することができる。結合抗体は、ＥＬＩＳＡ又は類似のアッセイで直接検出することができ；あるいは、診断物質が検出可能な標識を含んで成ることがあり、そして当該検出可能な標識は、当業界で知られている方法を用いて検出されることがある。
【００４０】
ＬＭＷ−ＰＴＰが検出可能に標識された診断物質、例えば抗体、の結合を介して検出される診断方法の態様において、好ましい標識には、色素生産性色素、蛍光標識及び放射性標識が含まれる。最も一般的に使用されるものには、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）及び３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（ＤＡＢ）がある。これらは光学顕微鏡を用いて検出されうる。
【００４１】
最も一般的に使用される蛍光標識化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド(phthaldehyde)及びフルオレサミンである。化学発光及び生物発光化合物、例えばルミノール、イソルミノール、セロマティック(theromatic)アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステル、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、及びエクオリンも使用されうる。蛍光標識抗体が適切な波長の光に曝露される場合、その存在はその蛍光により検出されうる。
【００４２】
本発明の抗体の標識に特に有用な放射性同位体には、3Ｈ、125Ｉ、131Ｉ、35Ｓ、32Ｐ、及び14Ｃが含まれる。放射性同位体は、ガンマカウンター、シンチレーションカウンターのような手段によって、又はオートラジオグラフィーによって検出されうる。
【００４３】
抗体−抗原複合体は、ウェスタンブロッティング、ドットブロッティング、沈殿、凝集、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学、in situハイブリダイゼーション、様々な組織又は体液に対するフローサイトメトリー及び様々なサンドウィッチアッセイ、を用いて検出されうる。これらの技術は当業界で周知である。例えば、引用によって本明細書に組み入れられる、米国特許第５，８７６，９４９号を参照のこと。酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）において、酵素は、その後その基質に曝露される場合、当該基質と反応し、そして、例えば分光光度的、蛍光光度的、又は視覚的手段によって検出され得る化学的部分を生成させる。検出可能に抗体を標識するために使用されうる酵素には、限定しないが、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカルヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、及びアセチルコリンステラーゼが含まれる。抗体を標識し、そして検出する他の方法は当業界で知られており、そして本発明の範囲内にある。
【００４４】
前記診断方法の別の態様において、生体材料は、ＬＭＷ−ＰＴＰホスファターゼ活性についてアッセイされる。使用するアッセイに依存して、この方法は、哺乳類に存在するか、又は哺乳類から取り出された生体材料上で実施されうる。例えば、哺乳類から得られる生体材料は、ＬＭＷ−ＰＴＰホスファターゼ活性についての生化学的アッセイにかけられることがある。検出はまた、ＬＭＷ−ＰＴＰタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡに結合する検出可能な試薬を用いることによって達成されうる。
【００４５】
ＬＭＷ−ＰＴＰは、ガン、前ガン性又は転移性疾患のためのマーカーとして、広範な組織試料、例えば、生検された腫瘍組織及び広範な体液試料、例えば血液、血漿、髄液、唾液、及び尿において使用されることがある。
【００４６】
ガンの存在又は不在及び病状に関する更なる情報を提供するために、他の抗体が、ＬＭＷ−ＰＴＰに結合する抗体と組み合わせて使用されることもある。例えば、抗ＥｐｈＡ２又はホスホチロシン特異的抗体の使用は、悪性度をの検出又は評価を決定するための追加のデータを提供する。
【００４７】
ガンの処置の有効性の指標としてのＬＭＷ−ＰＴＰ活性
ＬＭＷ−ＰＴＰは、ガンの治療剤、特にＥｐｈＡ２を標的とするものの有効性を評価するための代理マーカーとしての役割を果たすことがある。ＬＭＷ−ＰＴＰを過剰発現するガン細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの量又は活性（コントロール）は、候補の治療剤で処置された類似のガン細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの量又は活性と比較される。処置された細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの量又は活性の低下は、有効なガンの処置を示唆するものである。
【００４８】
本発明は、以下の実施例によって例示される。特定の例、材料、量及び手順が、本明細書に記載のような本発明の範囲及び精神に従い広く解釈されるべきであると理解されるべきである。
【実施例】
【００４９】
実施例Ｉ．低分子量タンパク質チロシンホスファターゼ及びＥｐｈＡ２を包含するタンパク質間相互作用
材料と方法
タンパク質の産生。アンピシリン、Ｎ−Ｚ−アミンＡ（カゼイン加水分解産物）、ＩＰＴＧ、及びＳＰ−セファデックスＣ−５０は全てＳｉｇｍａから入手した。ＳＰ−セファデックスＧ−５０は、Ｐｈａｒｍａｃｉａから購入した。ＹＭ３膜はＡｍｉｃｏｎから入手した。全ての他の材料は、Ｓｉｇｍａ又はＢｉｏＲａｄのいずれかから購入した。
【００５０】
細胞系。この研究に使用した細胞モデルは、乳房上皮である。この研究室において一般的に使用される細胞系はＭＣＦ−１０Ａである。この細胞系は、ＭＣＦ−１０細胞のファミリーの一部であり、これは樹立された不死化ヒト乳腺上皮細胞系である。ＭＣＦ−１０細胞は、線維嚢胞性疾患の成人女性の乳腺組織から単離された。ＭＣＦ−１０Ａ細胞は、接着細胞として増殖する。ＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞系は、ネオマイシン耐性遺伝子を有する親細胞系のＭＣＦ−１０Ａ細胞である。MDA-MB-２３１細胞系は高度に浸潤性で且つ転移性の乳腺細胞系である。これらの細胞は、乳ガンを有する成人女性から単離された。
【００５１】
これらの細胞の世話は、２日毎に、培地を新しくし、又はそれらを分割することによりそれらを扱うことから成る。当該細胞を分割するために、培地は吸引によって最初に除去した。細胞を２〜３ｍｌのＰＢＳ中で洗浄し、続いてトリプシン溶液（ＰＢＳ中で１：５０に希釈した２〜３ｍｌのもの）を添加し、そしてプレートを３７℃のインキュベーター内に１０〜３０分間据えた。次に、２〜３ｍｌの培地を各プレートに添加した。ＰＢＳ／トリプシン溶液及び培地中の細胞を、卓上遠心機で遠心してペレットにした。ＰＢＳ／トリプシン溶液及び培地を吸引し、そして細胞を培地中で再懸濁した。細胞を続いて組織培養ディッシュにプレーティングした。
【００５２】
ＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞の増殖培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、５．６％ウマ血清、２０ｎｇ／ｍｌの上皮増殖因子（これらは全て、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ．， Ｉｎｃ．から購入）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、１０μｇ／ｍｌのインスリン（Ｓｉｇｍａ）、０．２５μｇ／ｍｌのフンジゾン(fungizone)、及び２ｎＭのＬ−グルタミンから成る。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の増殖培地は、ＲＰＭＩ、２ｎＭのＬ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び１００ユニット／ｍｌのペニシリンから成る。
【００５３】
抗体。ＥＰｈＡ２の細胞内ドメインを認識する抗体はＤ７である（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ニューヨーク）。このモノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、Zantek, N. D. (1999), Ph. D. Thesis, Purdue Universityにおいて述べられているように、バルクの培養物から産生された。この抗体による免疫沈降のために、３０μｌを使用した。イムノブロットのために、ＴＢＳＴＢ（３０ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６、１ｍｌのＴｗｅｅｎ−２０、１ｇのＢＳＡ、及び９２０ｍｌの蒸留水）中で１：１希釈したものを使用した。免疫蛍光顕微鏡のために、抗体は希釈せずに使用した。
【００５４】
ＨＰＴＰに対するモノクローナル抗体（１０．１及び７．１）は、Alfred Schroff, Ph. D. Thesis, Purdue Universityにおいて述べられているように開発した。免疫沈降の場合、１０．１（α−ＨＰＴＰ−Ｂ）を１０μｌ使用した。イムノブロッティングの場合、当該抗体はＴＢＳＴＢ中で１：１００に希釈した。免疫蛍光顕微鏡の場合、当該抗体はＰＢＳ中で１：１０に希釈した。同一の条件を、ＨＰＴＰに対する外のＭＡｂ、７．１（α−ＨＰＴＰ−Ａ／Ｂ）に使用した。ＨＰＴＰに対するポリクローナル抗体の場合、１０μｌの抗体を免疫沈降に使用した。イムノブロッティングの場合、当該抗体はＴＢＳＴＢ中に１：２０００で希釈した。免疫蛍光顕微鏡の場合、当該抗体は、ＰＢＳ中で１：１００に希釈した。
【００５５】
ホスホチロシンを検出するために、４Ｇ１０として知られている抗体を使用した。この抗体は、大量培養で産生した。イムノブロッティングの場合、ＴＢＳＴＢ中での１：１希釈を使用した。免疫蛍光顕微鏡に使用した二次抗体は、PBS中で１：４０希釈したＤＡＲ−Ｆ１及び／又は１：００希釈したＤＡＭ−Ｒｈであった。イムノブロッティング実験の場合、ヤギ抗マウス（ＭＡｂ用）又はヤギ抗ウサギ（ＰＡｂ用）をＴＢＳＴＢ中で１：１０，０００希釈して使用した。
【００５６】
アフィニティーマトリックス。プロテイン−ＡセファロースをＳｉｇｍａから購入した。Ａｆｆｉ−ゲル１０はＢｉｏＲａｄから購入した。
【００５７】
他の材料。他の材料は、Ｆｉｓｈｅｒ、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｍａｌｉｎｃｋｒｏｄｔ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＱＩＡＧＥＮ、及びＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから購入した。
【００５８】
ＬＭＷ−ＰＴＰの発現及び精製。増殖培地（Ｍ９ＺＢ）は以下のように調製した：４Ｌのフラスコ中、２０ｇのＮ−ＺアミンＡ（カゼイン加水分解産物）、１０ｇのＮａＣｌ、２ｇのＮＨ4Ｃｌ、６ｇのＫＨ2ＰＯ4、及び１２ｇのＮａ2ＨＰＯ4Ｈ2Ｏを２Ｌの蒸留水中に溶解した。培地のｐＨを続いてＮａＯＨのペレットで７．４に調整した。５００ｍｌのフラスコに対し、２００ｍｌのＭ９ＺＢ溶液を注いだ。培地の２つの容器を続いて２０分間オートクレーブした。室温に冷却した後、ろ過滅菌した、２０ｍＬの４０％グルコース及び２ｍＬの１ＭＭｇＳＯ4溶液を２Ｌの培地当たり添加した。播種直前に、２００μｌの５０ｍｇ／ｍＬアンピシリンを、２００ｍｌ（Ｍ９ＺＢ）培地を含むフラスコに添加した。注目の遺伝子を有する組換えプラスミドを含むＥ．コリのＢＬ２１株の２００ｍｌの培養物を、２５０〜３００ｒｐｍ、３７℃に設定した旋回シェーカー上で一晩生育させた。
【００５９】
次の日、１．８ｍｌの５０ｍｇ／ｍｌアンピシリンを残りの１．８Ｌの新鮮な培地に添加した。一晩経過した培地を、続いて新鮮な（Ｍ９ＺＢ）培地中で１：１０に希釈し、そして細胞を更に３時間増殖させた。６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ600）が０．６〜１．０の間に達したとき、２ｍｌの４ｍＭＩＰＴＧを添加してタンパク質発現を誘導した。培養物は、ＷＴ−ＰＴＰアーゼの場合には更に３時間、又は変異体ＰＴＰアーゼの場合には更に６時間、３７℃でインキュベートした。細胞は、５０００ｒｐｍで１５分間の冷却遠心によって収集した。上清を４Ｌのフラスコに注いで戻し、続いて廃棄する前に２０分間オートクレーブした。細胞ペレットを１０ｍＬの０．８５％ＮａＣｌ中で再懸濁し、そして洗浄し、再び５００ｒｐｍで遠心してペレットにし、続いて２ｍＬの０．８５％ＮａＣｌ中で再懸濁した。混合物を小さい遠心管中に据え、続いて５０００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を捨て、そしてペレットを−２０℃で一晩保存するか、又は直ちに可溶化した。
【００６０】
細胞ペレットを融解し（妥当ならば）、続いて１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１ｍＭ ＤＴＴを含む、ｐＨ５．０の１００ｍＭ ＣＨ3ＣＯＯＮａ緩衝液中で再懸濁した。ＤＴＴを使用直前に添加した。細胞は、それらを、１００ｐｓｉの圧力ゲージに設定した予め冷やした、フレンチプレッシャーセルに２回かけることによって破壊した。可溶化物は、１６，０００ｒｐｍで１５分間、冷却遠心機内で遠心してペレットにした。上清を新しい遠心管中に注ぎ、続いて、３０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び６０ｍＭ ＮａＣｌを含む、ｐＨ４．８の１０ｍＭ ＣＨ3ＣＯＯＮａ緩衝液で予め平衡化したＳＰ−セファデックスＣ−５０陽イオン交換カラム（１．５ｘ３０ｃｍ）に添加した。
【００６１】
Ｃ−５０カラムを、１０倍量の総容積の１０ｍＭ ＣＨ3ＣＯＯＮａ緩衝液で、Ａ280が大体ゼロになるまで洗浄した。続いて、高塩濃度の溶液である、ｐＨ５．１の３００ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4及び１ｍＭ ＥＤＴＡでタンパク質を溶出した。流速は３０〜４０ｍＬ／時間に設定した。回収した各画分には約６ｍｌ含まれていた。最高のＡ280を有する画分を、タンパク質純度を得るために、１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離した。最も純粋な画分をまとめ、続いてＡｍｉｃｏｎ限外ろ過装置を用いて大体５ｍｌに濃縮した。濃縮液は、３０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び６０ｍＭ ＮａＣｌを含む、ｐＨ４．８の１０ｍＭ ＣＨ3ＣＯＯＮａ緩衝液で予め平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０サイズ排除カラムに添加した。流速は１５〜２５ｍｌ／時間に設定し、そして約６ｍＬの画分を回収した。最高のＡ280を有する画分を、タンパク質純度を得るために１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で試験した。最も純粋な画分をまとめ、そしてＧ−５０緩衝液中で４℃で保存した。
【００６２】
免疫蛍光顕微鏡。最大５枚のカバーガラスを３．５ｃｍディッシュ上に据えた。特定の研究に適切な細胞系を、使用の２４時間前にこれらのディッシュ内に据えた。細胞は通常この時間までに６０〜７０％コンフルエントに達した。細胞を３．７％ホルムアルデヒド溶液中に２分間固定し、続いて１％Ｔｒｉｔｏｎ中で５分間透過処理し、そしてユニバーサルバッファー（ＵＢ）中で５分間洗浄した。細胞は、続いて室温で一次抗体と３０分間インキュベートした。次に、細胞をＵＢ（１２ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６、４ｍｌの１０％アジド）中で５分間洗浄した。細胞は続いて２次抗体と一緒に３０分間インキュベートした。蒸留水中で簡単に５秒間洗浄した後、カバーガラスを、表を下にして、スライドガラス上の約５μｌのＦｌｕｏｒＳａｖｅ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の上に据えた。細胞を室温で約１５分間乾燥させ；続いて、それらを「Ｌｏｗ」に設定したヘアドライヤーのもと、更に１５分間又は乾くまで静置した。細胞は、蛍光顕微鏡の油浸レンズ（６０ｘ）で観察した。
【００６３】
免疫沈降。モノクローナル抗体による免疫沈降（ＩＰ）の場合、ウサギ抗マウスプロテインＡセファロース（ＲＡＭＰＡＳ）を使用した。ポリクローナル抗体によるものの場合、プロテインＡセファロース（ＰＡＳ）を使用した。ビーズは、最初に、プロテインＡセファロースを、１．５ｍＬの遠心管の１００μｌの印まで添加することによって調製した。次に、１ｍｌのＵＢを添加してビーズを膨潤させた。ＲＡＭＰＡＳの場合、５０μｌ／ｍｌのウサギ抗マウス（ＲＡＭ）ＩｇＧもビーズとＵＢの遠心管に添加した。混合物は、者移転スターラー上で一晩４℃で回転させた。次の日、ビーズを３回１ｍｌのＵＢ中で洗浄した。続いて、ビーズをＵＢ中５０％のスラリーにした。
【００６４】
細胞のプレートを氷上に据えた。細胞を２〜３ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した。その後、細胞は、１ｍＭのＮａ3ＶＯ4、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、及び１０μｇ／ｍｌのアプロチニンを含む、１％Ｔｒｉｔｏｎ可溶化緩衝液（５ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６、３ｍｌの５ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍｌの１０％ＮａＮ3、１ｍｌの２００ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍｌの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、８０ｍｌの蒸留水）又はＲＩＰＡ可溶化緩衝液（５ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６、３ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍｌの１０％ ＮａＮ3、１ｍｌの２００ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍｌの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５ｍｌの１０％デオキシコール酸、５００μｌの２０％ ＳＤＳ、７４．５ｍｌの蒸留水）中、氷上で５分間可溶化した。可溶化物を回収し、そして各組の可溶化物を、クーマシータンパク質アッセイ試薬を用いて等しいタンパク質含量に標準化した。５９０ｎｍの吸光度を測定するためにプレートリーダーを使用した。前記可溶化物を適切な可溶化緩衝液で平衡化した後、試料を調製した。
【００６５】
各試料につき、３０μｌのＰＡＳ（又はＲＡＭＰＡＳ）を各試料チューブに添加した。次に、一次抗体を添加した。最後に、前記可溶化物の１５０〜２００μｌ部分を添加した。試料を４℃で１．５時間又は一晩回転させた。試料は、続いて、細胞を可溶化するのに使用したものと同じ、１ｍｌの可溶化緩衝液中で洗浄した。最後の洗浄の後、１５μＬのＬａｅｍｍｌｉ緩衝液をペレット化したビーズに添加し、そして試料を１０分間沸騰させた。その後、試料は、２２０Ｖに設定した１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上に添加して１．７５時間分離した。タンパク質分離の後、タンパク質をニトロセルロースに一晩かけて移した。
【００６６】
基質捕捉。精製した、触媒として不活性のＬＭＷ−ＰＴＰ組換え変異体であるＤ１２９Ａ−ＢＰＴＰ及びＣ１２Ａ−ＢＰＴＰを、潜在的な基質捕捉を作り出すために使用した。アフィニティーサポートは、最初に１〜１．５ｍｌのＡｆｆｉゲル１０を、複数の容積の冷却した蒸留水中で洗浄することによって調製した。次に、モイストゲルを、５ｍｇ／ｍｌの純粋なＰＴＰアーゼと一緒に１５ｍｌのコニカルチューブに添加した。当該チューブを４℃で４時間回転させ、そしてタンパク質をビーズに結合させた。その後、１ｍｌのＡｆｆｉゲル当たり１００μｌのエタノールアミンを添加して、タンパク質と結合しなかった反応性ゲル部位をブロックし、つづいて当該チューブを更に１時間回転させた。スラリーを小さいプラスチックカラム内に注いだ。ビーズをカラム内に静置させ、それらを続いて２０ｍｌの蒸留水で洗浄した。洗浄液のｐＨを測定した。７以上である場合、ｐＨを１ｍＭのＨＣｌで調整した。次に、Ａ280を測定した。ゼロ付近でない場合、Ａ280がゼロ付近に達するまで洗浄を続けた。カラムは、使用するまで４℃で保存した。
【００６７】
前記可溶化物を利用する前に、カラムを１０ｍｌの蒸留水で３回洗浄し、続いて適切な可溶化緩衝液中で平衡化した。細胞は、適切な可溶化緩衝液中で５分間、氷上で可溶化した。可溶化物を回収し、そしてカラムに添加して様々な時間４℃でインキュベートした。続いて、ビーズを適切な可溶化緩衝液中で３回洗浄した。Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液をビーズに添加し、これを１０分間煮沸した。試料を１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離し、そして最終的にニトロセルロースに一晩かけて移した。
【００６８】
脱リン酸。ＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞を８０％コンフルエントにまで増殖させた。細胞を１％Ｔｒｉｔｏｎ可溶化緩衝液中、５分間氷上で可溶化した。可溶化物を回収し、一まとめにした。ＥｐｈＡ２ ＩＰを調製した：３０μｌのＤ７、３０μｌのＲＡＭＰＡＳ、及び２００μｌの可溶化物。当該ＩＰを１．５時間４℃で混合した。それらを５００μｌのＴｒｉｔｏｎ可溶化緩衝液中で２回洗浄し、続いて５００μｌの蒸留水中で２回洗浄した。各ペレットを１０ｍＭの５０μｌ ＣＨ3ＣＯＯＮａ緩衝液中で再懸濁し、そしてチューブを３７℃のウォーターバス内に５分間据えて温度を生理学的条件に調整した。次に、選択した濃度の５００μｌのＰＴＰアーゼ溶液をチューブに添加し、ＥｐｈＡ２と選択した時間反応させた。当該反応終了時に、ビーズをペレット化し、そして上清を吸引によって除去した。Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液を各試料に添加し、そしてそれらを１０分間煮沸した。最後に、タンパク質を１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離し、そして一晩かけてニトロセルロース膜上に移した。
【００６９】
イムノブロッティング。前記ニトロセルロース膜をＰｏｎｃｅａｕ Ｓで染色して、分子量マーカーの位置を同定して印をつけた。当該膜を複数回蒸留水中ですすぎ、色素を除いた。当該膜上の非特異的部位を、Ｔｅｌｅｏｓｔｅａｎゼラチン（５０ｍｌのＴＢＳＴＢ及び「茶」色を呈すのに十分なゼラチン）溶液でブロッキングした。当該膜を当該ブロッキング溶液中、室温で３０分間インキュベートした。次に、当該膜を一次抗体と一緒に３０分間インキュベートした。当該膜を３回、それぞれＴＢＳＴＢ中で１０分間洗浄し、これに続き、二次抗体と一緒に３０分間インキュベートした。その後、当該膜を３回、ＴＢＳＴＢ中でそれぞれ８分間インキュベートし、続いて２回、ＴＢＳ（３０ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６、９２０ｍｌの蒸留水）中でそれぞれ６分間インキュベートした。次に、化学発光試薬を膜に添加した（１：１）。最後に、フィルムを膜に曝露し、これをサランラップで包み、そして現像した。
【００７０】
小規模のＤＮＡ精製。ＨＰＴＰ遺伝子を含むプラスミドｐＥＴ−１１ｄを、ＱＩＡＧＥＮから市販されているＱＩＡｐｒｅｐ Ｍｉｎｉｐｒｅｐを用いてＥ．コリのＢＬ２１株から精製した。ＨＰＴＰ−Ａ及びＨＰＴＰ−Ｂを含むＥ．コリをいずれも、しかし別々に、ＬＢ／Ａｍｐプレート上にストリーキングした。両プレートを３７℃のインキュベーター内に一晩据えた。次の日、３ｍｌのＬＢ培地及び６μｌのアンピシリンを２つの滅菌スナップトップチューブ内に据えた。当該チューブを、続いてＨＰＴＰ−Ａ又はＨＰＴＰ−Ｂとラベルした。各プレート由来の１つのコロニーを使用し、それぞれラベルしたチューブに、ＨＰＴＰ−Ａ遺伝子又はＨＰＴＰ−Ｂ遺伝子を含むコロニーを播種した。当該チューブを、２５０ｒｐｍに設定したシェーカー上に一晩（１２〜１６時間）載せた。次の日、培地を遠心してペレットにし、そして上清を吸引で除去した。
【００７１】
ＱＩＡｐｒｅｐ Ｍｉｎｉｐｒｅｐプロトコールを用いて、細菌のペレットからＤＮＡを精製するために、細菌のペレットを２５０μｌの緩衝化ＲＮアーゼＡ溶液（緩衝液Ｐ１）中で再懸濁した。次に、細胞懸濁液をマイクロチューブ内に据え、そして、ＮａＯＨ及びＳＤＳを含む２５０μｌのアルカリ性可溶化緩衝液（緩衝液Ｐ２）中に据えた。当該チューブを穏やかに５回反転させた。可溶化は５分間実施した。混合物は、つづいて、３５０μｌの中和緩衝液（緩衝液Ｎ３）を添加することによって中和した。
【００７２】
当該チューブを１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、情勢をＱＩＡｐｒｅｐスピンカラムに移した。当該スピンカラムを２ｍｌの回収チューブ内に据えた。一緒に、それらを遠心機に据え、そして１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。フロースルーを廃棄した。次に、当該スピンカラムを７５０μｌの緩衝液ＰＥで洗浄し、そして１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。フロースルーの廃棄後、当該スピンカラムを１回以上１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。当該スピンカラムを、きれいなマイクロチューブ内に据え、そしてＤＮＡを６０μｌの緩衝液ＥＢで溶出し、そして−２０℃で保存した。
【００７３】
コード領域の増幅。ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、遺伝子のコード領域を増幅させた。フォワード鎖のために設計したプライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含む：AAT TTA AAG CTT CCA TGG CGG AAC AGG CTA CCA AG（配列番号１）。リバース鎖のために設計したプライマーは、ＥｃｏＲＩ制限部位を含む：CGT TCT TGG AGA AGG CCC ACT GAG AAT TCT TCG T（配列番号２）。リバース鎖のために設計した追加のプライマーは、ＢａｍＨ Ｉ制限部位を含む：GCG CGC GGA TCC TCA GTG GGC CTT CTC C（配列番号３）。
【００７４】
要約すると、４０μｌの蒸留水、５μｌの１０ｘ緩衝液、１μｌのフォワードプライマー、１μｌのリバースプライマー、１μｌのｄＮＴＰ及び１μｌのｐｆｕポリメラーゼから成る５０μｌの反応混合物を調製した。反応混合物は、以下のサイクルに設定したサーマルサイクラー内に据えた：９４℃で２分間、９４℃で１分間、５５℃で１分間、６５℃で１分間、６５℃で１０分間、続いて４℃で維持。２〜４のステップを、次の６５℃で１０分間のステップに進む前に３０回繰り返した。
【００７５】
前記サイクルが終了してから、ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル（６００ｍｇのアガロース、１．２ｍｌの５０Ｘ ＴＡＥ、５８．８ｍｌの蒸留水）上で解析した。当該ＰＣＲ産物は、続いて、ＱＩＡＧＥＮから市販されているＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。要約すると、５倍量の緩衝液ＰＢを１倍量のＰＣＲ産物反応混合物に添加し、そして簡単に混合した。混合物をＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラムに添加し、そして１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。フロースルーの廃棄後、７５０μｌのＰＥ緩衝液を当該カラムに添加し、そして１３，０００ｒｐｍで１分以上遠心した。当該カラムをきれいなマイクロチューブ内に据え、そして３０μｌの緩衝液ＥＢを当該カラムに添加した。カラムを室温で１分間、前記緩衝液と一緒にインキュベートし、その後１３，０００ｒｐｍで１分間遠心してＤＮＡを溶出した。
【００７６】
伸長の除去。ＰＣＲ産物の反応混合物を消化のために調製した：５μｌのＰＣＲ産物、１μｌのＮＥＢバッファー２、１μｌの１０Ｘ ＢＳＡ、及び０．９μｌのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩストック。ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐｃＤＮＡ３ベクター（図１）の消化のための反応混合物を調製した：１μｌのｐｃＤＮＡ３、１．５μｌのＮＥＢバッファー２、１．５μｌの１０Ｘ ＢＳＡ、０．５μｌのＨｉｎｄＩＩＩ、及び０．５μｌのＢａｍＨＩ。プラスミドｐｃＤＮＡ３は、５．４ｋｂの哺乳類発現ベクターである。ＨＰＴＰ遺伝子は、このベクターのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ部位内にクローニングし、そして当該遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーターによって駆動させた。ＰＣＲ産物及び哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３を３７℃で２．５時間消化した。消化産物を１％アガロースゲル上で解析した。分離後、ゲルの写真を撮った。ＰＣＲ産物及びｐｃＤＮＡ３の消化は、それぞれ４９１ｂｐ及び５，４２８ｂｐであるフラグメントを生成することが予想された。
【００７７】
消化産物を含むゲルの断片を、当該ゲルから除去し、そしてマイクロチューブ内に据えた。ゲルから消化産物を除去するために、ＱＩＡＧＥＮから市販されているＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用した。要約すると、２１０μｌの緩衝液ＱＧをチューブに添加した。当該チューブを５０℃のウォーターバス内に約１０分間、２〜３分おきに混合して静置した。次に、７０μｌのイソプロパノールを当該チューブに添加し、そして混合した。試料を続いて回収チューブとくっつけたカラム内に据え、そして１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。フロースルーの廃棄後、５００μｌの緩衝液ＱＧをカラムに添加し、そして当該カラムを１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。フロースルーを廃棄し、そしてカラムを７５０μｌの緩衝液ＰＥで洗浄し、続いて１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。フロースルーを廃棄し、そしてカラムを１回以上１３，０００ｒｐｍで１分間遠心して、ＤＮＡを溶出させた。ＤＮＡは−２０℃で保存した。
【００７８】
ライゲーション及び形質転換。増幅したＨＰＴＰ−Ａ及びＨＰＴＰ−Ｂ遺伝子はいずれも、しかし別々に、ｐｃＤＮＡ２ベクターとライゲーションした。ライゲーション反応混合物を調製した：１０μｌのインサート、５μｌのベクター、２μｌの１０Ｘライゲーションバッファー、２μｌの１０Ｘ ＡＴＰ、及び１μｌのリガーゼ。ライゲーション混合物を１６℃に設定したサーマルサイクラー内に１８時間据え、続いて温度を４℃に維持した。
【００７９】
コンピテントＥ．コリＥＨα５株を、ライゲーション混合物で形質転換させた。それぞれ２００μｌのコンピテントＥ．コリ（ＤＨα５）を含む２つのマイクロチューブを氷上で融解させた。ライゲーション混合物を、細胞の各チューブに添加し、当該チューブを簡単にボルテックスにかけ、そして次に、氷上で２０分間インキュベートした。チューブを４２℃のウォーターバス内に１．５分間据え、続いて氷上に２分間据えた。チューブの中身を、１ｍｌのＬＢを含むチューブ内に別々に据えた。混合物を２５０ｒｐｍに設定したシェーカー上に４５分間据えた。次に、２００μｌの各培地を２つのＬＢ／Ａｍｐプレート上に蒔いた。プレートは、蓋を上にして３７℃のインキュベーター内に１０分間据え、続いて蓋を下にして一晩（１６〜１８時間）据えた。
【００８０】
コロニーのスクリーニング。ＱＩＡｐｒｅｐ Ｍｉｎｉｐｒｅｐプロトコールを使用し、６つの細菌培養物それぞれからＤＮＡを精製した。精製したＤＮＡを含むチューブを適当にラベルした：コロニーＡ１、コロニーＡ２、コロニーＢ１、コロニーＢ１、コロニーＢ２等。コロニーをスクリーニングするために、それぞれに由来する精製ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ；ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩ；並びにＡｃｃＩで消化した。ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ消化反応液を調製した：５μｌのベクター／インサート、１μｌのＮＥＥＢバッファー２、１μｌの１０Ｘ ＢＳＡ、１．８μｌのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩストック、６．２μｌの蒸留水。ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩストックは以下の様に調製した：７．２μｌのＢａｍＨＩをを９．６μｌのＨｉｎｄＩＩＩに添加した。次に、ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ消化反応液を調整した：５μｌのベクター／インサート、０．５μｌのＥｃｏＲＩ、０．３μｌのＮｄｅＩ、１．５μｌのＮＥＢバッファー４、７．７μｌの蒸留水。最後に、ＡｃｃＩ消化反応液を調製した：５μｌのベクター／インサート、０．５μｌのＡｃｃＩ、１．５μｌのＮＥＢバッファー３、及び８μｌの蒸留水。全ての消化は、３７℃で一晩行った。消化物は、１％アガロースゲル上で分離し、そしてゲルの写真を撮った。
【００８１】
中規模のＤＮＡ精製。６時間たった５ｍｌの培養物を２５０ｒｐｍに設定したシェーカー上で３７℃で増殖させた。５ｍｌの培地を５０ｍｌのＬＢで希釈した。チューブをシェーカー上に据えた。次の日、４０ｍｌの一晩たった培養物を、５ｍｌのネジ口遠心管に移し、そして５０００ｒｐｍで５分間の遠心によってペレット化した。ＢｉｏＲａｄから市販されているＱＵＡＮＴＵＭ ＭｉｄｉＰｒｅｐを使用し、中規模にＤＮＡを精製した。要約すると、上清を流し捨て、そして５ｍｌの細胞再懸濁溶液を細胞のペレットに添加した。チューブをボルテックスにかけ、細胞を再懸濁した。次に、５ｍｌの細胞可溶化物をチューブに添加し、続いて６〜８回反転させた。混合物を、５ｍｌの中和溶液を添加することによって中和し、続いてチューブを６〜８回反転させて当該溶液を中和した。混合物を８０００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を、１ｍｌのＱｕａｎｔｕｍＰｒｅｐマトリックスと一緒に新しいチューブに移した。混合物を穏やかに１５〜３０秒間回転させ、続いて８０００ｒｐｍで２分間遠心した。ペレットから洗浄緩衝液を排出した後、６００μｌの洗浄緩衝液をマトリックスに添加し、そして振とうによって混合した。チューブを８０００ｒｐｍで２分間遠心した。ペレットから洗浄緩衝液を排出し、６００μｌの洗浄緩衝液をチューブに添加してペレットを再懸濁した。スピンカラムをマイクロチューブに取り付け、そして穴をマイクロチューブの蓋に開けた。チューブを１２，０００ｒｐｍで３０秒間遠心した後、フロースルーを廃棄した。次に、５００μｌの洗浄緩衝液をチューブに添加し、そして当該チューブを１２，０００ｒｐｍで３０秒間遠心した。フロースルーを廃棄し、続いて当該カラムを１２，０００ｒｐｍで２分以上遠心し、残りの洗浄緩衝液を除去した。カラムをきれいな遠心管に移した。ＤＮＡを６００μｌのＴＥ（ｐＨ８）で溶出させた。
【００８２】
次に、ＤＮＡは、１／１０量の５Ｍ ＮａＣｌ、続いて合計量（ＮａＣｌ＋ＤＮＡ）の２倍の１００％エタノールを添加することによってエタノール沈殿した。マイクロチューブを数回穏やかに反転させ、そして−２０℃で２０分間インキュベートした。ＤＮＡを１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心してペレットにした。滅菌条件下、エタノール／ＮａＣｌをペレットから吸引した。ペレットをフード内で風乾するまで放置した。その後、ＤＮＡを１００μｌの滅菌ＴＥ（ｐＨ８）中で再懸濁した。ＤＮＡ試料の濃度を決定するために２６０ｎｍの吸光度（Ａ260）を測定した。ＤＮＡは−２０℃で保存した。
【００８３】
トランスフェクション。ＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞系においてＨＰＴＰを発現させるために、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから市販されているＦｕＧＥＮＥ(商標)トランスフェクションキットを使用した。細胞を、使用前に６穴プレートに１８時間プレーティングし、それらのコンフルエントがトランスフェクションの日に５０％となるようにした。マイクロチューブ内で、９７μｌの無血清希釈培地を３μｌのＦｕＧＥＮＥ試薬に添加した。希釈したＦｕＧＥＮＥを室温で５分間インキュベートした。次に、１μｇのＤＮＡを第二のマイクロチューブに添加した。一滴ずつ、希釈したＦｕＧＥＮＥ試薬をＤＮＡに添加した。当該チューブを穏やかにたたき、チューブの中身を混合した。チューブは、続いて室温で１５分間インキュベートした。細胞上の培地に、２ｍｌの新鮮な培地を再び据えた。一滴ずつ、ＦｕＧＥＮＥ／培養液をプレーティングされた細胞に添加し、続いてプレートを回転させてプレートの周りに中身を分配した。細胞は３７℃で３６〜４８時間インキュベートした。
【００８４】
解析の日に、細胞を１％Ｔｒｉｔｏｎ可溶化緩衝液中で可溶化し、ＨＰＴＰ及びＤ７の免疫沈降を行った。試料は、最終的に１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離し、続いてニトロセルロースに一晩かけて移した。次の日、イムノブロッティングが、ＥｐｈＡ２、ＨＰＴＰ、及びホスホチロシンに対する抗体により行われた。
【００８５】
結果
ＬＭＷ−ＰＴＰの発現及び精製
ＬＭＷ−ＰＴＰは、陽イオン交換クロマトグラフィー（典型的に、ＳＰ−セファデックスＣ−５０カラムを用いる）、続いて、サイズ排除クロマトグラフィー（典型的に、セファデックスＧ５０カラムを用いる）、を包含する二段階の精製スキームを用いて精製されうる。組換えタンパク質（Ｅ．コリにおける発現の後に単離されたもの）と、天然のウシ又はヒトのタンパク質との間の軽微な差異は、組換えタンパク質が、天然の組織タンパク質のように、Ｎ末端のアラニン残基上でアセチル化されていないことである。この実施例において、ＷＴ−ＢＰＴＰ、Ｄ１２９Ａ−ＢＰＴＰ、及びＣ１２Ａ−ＢＰＴＰが、ｐＥＴ−１１発現系を用いて発現し、そして精製された。精製タンパク質、ＨＰＴＰ−Ａ及びＨＰＴＰ−Ｂのストックの補給品は既に手元にあった。
【００８６】
Ｅ．コリからのＷＴ−ＢＰＴＰの発現及び精製は容易に行われ、そして良好な品質のタンパク質を生成させた（発現培地１Ｌ当たり４０〜５０ｍｇ）。組換え体、変異ＰＴＰアーゼの発現は、あまりタンパク質をもたらさなかった（発現培地１Ｌ当たり１０〜１５ｍｇ）。Ｄ１２９Ａウシ変異体の場合、インキュベーション期間は６時間に増大され、そして洗浄緩衝液を１ｍＭのＥＤＴＡに変えて変異体タンパク質とＣ５０カラムとの結合を増大させた。一旦精製した後、タンパク質はリン酸緩衝液中−２０℃で数ヶ月間安定であった。
【００８７】
ＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）とＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系におけるＬＭＷ−ＰＴＰの比較。
タンパク質レベル。ＥｐｈＡ２は非形質転換ＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞系においてチロシンリン酸化されるが、悪性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系においてはされない。
【００８８】
ＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）とＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系におけるＬＭＷ−ＰＴＰの内因性タンパク質レベルは、最初にイムノブロッティング解析によって比較された。その結果は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系におけるタンパク質レベルと比較して、ＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞系におけるＬＭＷ−ＰＴＰのタンパク質レベルが低いことを明らかにした。このことは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系で観察される、ＬＭＷ−ＰＴＰのより高いタンパク質レベルが、ＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞系と比較した細胞系において実質的により脱リン酸されているＥｐｈＡ２と相関しうることを示唆している。
【００８９】
ＥｐｈＡ２はＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞系においてチロシンリン酸化されるが、当該細胞のより高レベルのチロシンリン酸化でさえも、ＥｐｈＡ２がそのリガンドの可溶性形態で処理され、又は細胞表面で人工的に活性化される場合には達成されうる(Zantek, N. D. (1999), Ph. D. Thesis, Purdue University)。このことを考慮して、ＬＭＷ−ＰＴＰがＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞においてＥｐｈＡ２を脱リン酸するが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞と同程度まではしないことも示唆されうる。ＥｐｈＡ２のリン酸化と脱リン酸の間には競合があるようであり、そしてＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において、そのバランスは脱リン酸の方へ傾くようである。しかしながら、ＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞においては、そのバランスは一方向又は他に実質的に傾かない。その結果、ＥｐｈＡ２はＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞系において幾つかのそのチロシンリン酸化を残す。
【００９０】
細胞内局在。全てがＬＭＷ−ＰＴＰに対するポリクローナル及びモノクローナル抗体のパネルは、ＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を染色するために使用した。ＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの細胞内局在を決定するために、細胞をカバーグラス上で一晩増殖させた。固定及び透過処理後、細胞を一次抗体で染色してＬＭＷ−ＰＴＰを検出した。二次抗体に付着させた蛍光タグは、蛍光顕微鏡でのＬＭＷ−ＰＴＰの細胞内局在の観察を容易にした。ＬＭＷ−ＰＴＰは、拡散してＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞内に広く分布することが明らかとなった。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が染色された場合、ＬＭＷ−ＰＴＰは、膜ラッフルに局在していることが明らかとなった。このことは興奮するような発見であり、何故ならば、ＥｐｈＡ２は、同様に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系において膜ラッフル内に局在することが知られていたからである(Zantek, N. D. (1999), Ph. D. Thesis, Purdue University)。
【００９１】
ＬＭＷ−ＰＴＰとＥｐｈＡ２との間でのin vitroでのタンパク質間相互作用
免疫共沈降。２つのタンパク質を、いずれかのタンパク質に対する別々の抗体により免疫共沈降する試みがなされた。ＬＭＷ−ＰＴＰの免疫共沈降は、Ｄ７のＥｐｈＡ２特異的抗体で免疫沈降し、続いて７．１又は１０．０ＬＭＷ−ＰＴＰ抗体でイムノブロッティング解析をした場合、容易に検出可能であった。免疫共沈降は、１０．１抗体でブロッティングした場合、より明らかであった。ＬＭＷ−ＰＴＰの相対的なタンパク質レベル解析から予想されるように、ＬＭＷ−ＰＴＰは、ＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞系からより、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系からより免疫共沈降した。７．１又は１０．１項体のいずれかで免疫共沈降し、続いて、Ｄ７抗体でイムノブロッティングした場合、あまり劇的でない結果が得られた。Ｄ７ ＩＰコントロールのものと大体共線性のバンドが、７．１及び１０．１ＩＰのレーンにおいて見られた。このことは、これらのバンドがＥｐｈＡ２を表しているであろうことを示唆している。
【００９２】
タンパク質の免疫共沈降が我々の細胞系の両方で生じたことはやや驚くべくことであった。相互作用が検出されうることが予想されたが、これは、ＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞系においてより可能性があると予想され、何故ならば、ＥｐｈＡ２がそこでチロシンリン酸化されるためである。しかしながら、ホスファターゼとその基質との相互作用はかなり一過性であるか、又はかなり弱いので、相互作用は容易には検出されえないとも考えられた。我々の件では、相互作用は両細胞系で検出された。
【００９３】
In vitroでの脱リン酸
基質捕捉において、ＥｐｈＡ２とＬＭＷ−ＰＴＰとの間での直接的な相互作用を検出する試みは失敗したので、代わりにin vitroでの試験が実施された。我々は、純粋なＬＭＷ−ＰＴＰが、免疫沈降によって単離されたＥｐｈＡ２を脱リン酸する能力を試験した。我々は、ＬＭＷ−ＰＴＰがＥｐｈＡ２を酵素濃度依存的に且つ時間依存的に脱リン酸したことに気付いた。
【００９４】
予想されるように、ＬＭＷ−ＰＴＰによるＥｐｈＡ２の脱リン酸の範囲は、大量のホスファターゼが使用された場合に、少量使用された場合よりもより大きいことが明らかとなった。ＬＭＷ−ＰＴＰによる、酵素濃度依存性のＥｐｈＡ２の脱リン酸は、高レベルのＬＭＷ−ＰＴＰがＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のチロシンリン酸化を抑制するという仮定と一致している。より高いＬＭＷ−ＰＴＰレベルがこれらの細胞におけるＥｐｈＡ２の実質的な脱リン酸を引き起こすと考えられている。ＥｐｈＡ２の酵素濃度依存性の脱リン酸は、基本的な速度論的挙動に従う。反応速度は、酵素濃度が増大するにつれて増大する。その結果、単位時間当たりより大きなターンオーバーが存在する。当該反応の進行がより長期間にわたり研究される場合、より高い酵素濃度が、より低い酵素濃度と比較して、ＥｐｈＡ２を脱リン酸し続けることがわかる。観察される脱リン酸の安定化は、当該タンパク質が非常に薄い条件下で不安定であることに起因するようである。
【００９５】
ＬＭＷ−ＰＴＰとＥｐｈＡ２との間のin vivoでのタンパク質間相互作用
ベクターの構築。ＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞系においてＬＭＷ−ＰＴＰを過剰発現する効果を検討するために、ＬＭＷ−ＰＴＰのコード領域を含むｐｃＤＮＡ３真核生物発現ベクターが構築された。マイクログラム単位の量のｐＥＴ−１１ｄプラスミドが、市販のＤＮＡ精製キットを用いて容易に単離された。プライマーは、ＬＭＷ−ＰＴＰのＡ−及びＢ−イソ型のコード領域を増幅するよう設計され、そして使用された。
【００９６】
ＰＣＲ産物は、ＱＩＡＧＥＮから市販されているＰＣＲ産物精製キットを用いて精製された。ＬＭＷ−ＰＴＰイソ酵素の増幅されたコード領域は、伸長を除去するためにＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化された。生成した「粘着末端」は、哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３におけるインサートのディレクショナルクローニングを可能にし、これはまた、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消化された。イソ酵素の消化は、４９１ｂｐのフラグメントを生成した。ｐｃＤＮＡ３の消化は、環状ベクターよりも１８少ない塩基対を有する、開いたベクターを生成させた。
【００９７】
細胞の形質転換の後、構築されたベクターが細胞から単離され、そして制限酵素群を用いてスクリーニングされ、ＬＭＷ−ＰＴＰのヒトＡ−及びＢ−イソ酵素のコード領域が、当該制限酵素によって生じた切断により示されるとおりに、それらの各ベクター内に存在していたか否かを決定した。
【００９８】
ＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現
ＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現が、ＥｐｈＡ２のチロシンリン酸化状態に対する、ホスファターゼのタンパク質の増大効果を検討するために試みられた。大量の前記構築ベクターが、市販のＤＮＡ精製キットを用いて、高度に純粋な形態で単離された。この手順を用いたベクターの単離は、大きな困難なしに行われた。市販のトランスフェクションキットＦｕＧＥＮＥは、それぞれ、「空の」ｐｃＤＮＡ３、ＨＰＴＰ−Ａ／ｐｃＤＮＡ３及びＨＰＴＰ−Ｂ／ｐｃＤＮＡ３でＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞系をトランスフェクションするために使用された。当該「空の」ベクターは本実験におけるコントロールとしての役割を果たし、その結果、ＥｐｈＡ２のチロシンリン酸化状態のあらゆる変化が、ＬＭＷ−ＰＴＰレベルの増大に起因し、そして当該哺乳類発現ベクターには起因しないと考えられるはずである。
【００９９】
ＭＣＦ−１０Ａ（Ｎｅｏ）細胞系におけるＨＰＴＰ−Ｂの過剰発現は、ＥｐｈＡ２のチロシンリン酸化レベルの低下をもたらした。ＥｐｈＡ２のチロシンリン酸化における知覚可能な差異は、ＨＰＴＰ−Ａが同一の細胞系で過剰発現した場合には見られなかった。この情報から、ＥｐｈＡ２とＬＭＷ−ＰＴＰの相互作用はイソ酵素特異的であると結論付けることができ、これは不合理な可能性ではない。前記イソ酵素のアミノ酸配列における差異は、なぜ一つのイソ酵素だけが優先的にＥｐｈＡ２と相互作用するように見えるかということの潜在的な理由となりうる。しかしながら、同様に前記差異を説明する多数の他の理由が存在する。
【０１００】
考察
形質転換した乳房上皮、例えばＭＤＡ−ＭＢ−２３１において、ＥｐｈＡ２はチロシンリン酸化されない。しかしながら、ＥｐｈＡ２のチロシンリン酸化の回復は、これらの細胞が過酸化バナジン酸(pervanadate)イオンで処理される場合に生じる(Zantek, N. D. (1999), Ph. D. Thesis, Purdue University)。このことは、ＰＴＰアーゼがＥｐｈＡ２のチロシンリン酸化の減少を引き起こしていることを強力に示唆するものである。あた、エフリンＡ１リガンドの可溶性形態によるＥｐｈＡ２の処理及び細胞表面でのＥｐｈＡ２の架橋は、ＥｐｈＡ２の一過性チロシンリン酸化を引き起こす。これらの処理により時間とともに生じるＥｐｈＡ２のチロシンリン酸化の減少は、ＥｐｈＡ２とのＰＴＰアーゼの相互作用に起因すると思われる。
【０１０１】
実施例ＩＩ．低分子量タンパク質チロシンホスファターゼによるＥｐｈＡ２の制御
材料と方法
細胞系及び抗体。ヒト乳房（ＭＣＦ−１０Ａ、ＭＣＦ １０Ａ ＳＴ、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＳＫ−ＢＲ−３）上皮細胞は、実施例Ｉに記載及び概説(Paine, T. M. , Soule, H. D., Pauley, R. J. & Dawson, P. J. (1992) Int J Cancer 50,463-473 ; Jacob, A. N., Kalapurakal, J. , Davidson, W. R. , Kandpal, G. , Dunson, N. , Prashar, Y. & Kandpal, R. P. (1999) Cancer Detection & Prevention 23,325-332 ; Shevrin, D. H. , Gorny, K. 1. & Kukreja, S. C. (1989) Prostate 15,187-194)のように培養した。ホスホチロシン（ＰＹ２０）及びβ−カテニン特異的なモノクローナル抗体は、Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＫＹ）から購入した。ホスホチロシン（４Ｇ１０）及びＥｐｈＡ２（クローンＤ７）特異的モノクローナル抗体は、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）から購入した。ビンキュリンに対するモノクローナル抗体は、ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）から購入した。
【０１０２】
細胞可溶化物。細胞可溶化物を収集し、そして概説のように等しい添加のために標準かされた(Kinch, M. S. Clark, G. J, Der, C. J. & Burridge, K. (1995) J Cell Biol 130, 461-471)。等しい添加を確認するために、ブロットは概説のとおりストリッピングされ、そしてβ−カテニン又はビンキュリン特異的な抗体で再プローブされた(Kinch, M. S. Clark, G. J, Der, C. J. & Burridge, K. (1995) J Cell Biol 130, 461-471)。
【０１０３】
免疫沈降及びウェスタンブロット解析：ＥｐｈＡ２又はＬＭＷ−ＰＴＰの免疫沈降は、ウサギ抗マウス（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）複合プロテインＡセファロース（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて、既述のとおり実施された(Zantek, N. D. , Azimi, M. , Fedor-Chaiken, M. , Wang, B. , Brackenbury, R. & Kinch, M. S. (1999) Cell Growth & Differentiation 10,629-638)。等しい添加を確認するために、ブロットは概説のようにストリッピングされ(Kinch, M. S. Clark, G. J, Der, C. J. & Burridge, K. (1995) J Cell Biol 130, 461-471)、ＥｐｈＡ２又はＬＭＷ−ＰＴＰ特異的抗体で再プローブされた。ウェスタンブロット解析は、標準化された細胞可溶化物で実施され、そして免疫沈降は、Zantek, N. D. , Azimi, M. , Fedor-Chaiken, M. , Wang, B. , Brackenbury, R. & Kinch, M. S. (1999) Cell Growth & Differentiation 10,629-638において詳述されているように実施された。抗体の結合は、高感度ケミルミネッセンス（ＥＣＬ；Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって検出し、そしてオートラジオグラフィー（Ｋｏｄａｋ Ｘ−ＯＭＡＴ；Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）によって可視化した。
【０１０４】
ＥＧＴＡ及び過酸化バナジン酸処理。「カルシウムスイッチ」実験を概説のとおり(Zantek, N. D. , Azimi, M. , FedorChaiken, M. , Wang, B. , Brackenbury, R. & Kinch, M. S. (1999) Cell Growth & Differentiation 10,629-638)、７０％コンフルエントに増殖したＭＣＦ−１０Ａ細胞及び終濃度４ｍＭのＥＧＴＡを含む培地を用いて実施した。過酸化バナジン酸は、０，１，１０又は１００ｍＭの終濃度で、単層培地中のＭＤＡ−ＭＢ−２３１に添加され、そして当該処理は、３７℃、５％ＣＯ2で１０分間インキュベートしてもよい。組み合わせたＥＧＴＡ−過酸化バナジン酸処理の場合、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は最初に１００ｍＭ過酸化バナジン酸で処理され、続いてＥＧＴＡ処理にかけられた。
【０１０５】
in vitroキナーゼ及びホスファターゼ処理。ＥｐｈＡ２に対するＬＭＷ−ＰＴＰ活性を評価するために、ＥｐｈＡ２はＭＣＦ−１０Ａ細胞から免疫沈降され、そして０．４５，７．８，又は２６．５ｍｇ／ｍＬの濃度の精製ＬＭＷ−ＰＴＰタンパク質と一緒に、０．５，１５，又は３０分間インキュベートされた。本アッセイは、Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファーの添加を介して終了した。当該処理におけるＥｐｈＡ２のホスホチロシン含量は、続いて、ホスホチロシン特異的抗体を用いるウェスタンブロットを用いて観察された。in vitroでの自己リン酸化活性を決定するために、免疫沈降したＥｐｈＡ２は、Zantek, N. D. , Azimi, M. , FedorChaiken, M. , Wang, B. , Brackenbury, R. & Kinch, M. S. (1999) Cell Growth & Differentiation 10,629-638において詳述されているようにin vitroキナーゼアッセイを用いて評価した。
【０１０６】
トランスフェクション及び選択。ＭＣＦ−１０Ａ細胞の単層は、３０〜５０％コンフルエントにまで増殖され、そして、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＰＬＵＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１−ＬＭＷ−ＰＴＰ又はｐｃＤＮＡ３．１−Ｄ１２９Ａ−ＬＭＷ−ＰＴＰをトランスフェクションされた。当該トランスフェクション手順のコントロールとして、空のｐｃＤＮＡ３．１ベクターを同一の細胞系に平行してトランスフェクションした。一過性トランスフェクションは、トランスフェクション後４８時間増殖させてもよい。安定な系の場合、ネオマイシン耐性細胞が、１６ｍｇ／ｍＬのネオマイシンを含む増殖培地（Ｍｅｄｉｓｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）中で選択された。ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現を確認するために、ウェスタンブロット解析が、ＬＭＷ−ＰＴＰ特異的抗体を用いて実施された。親細胞及び空のｐｃＤＮＡ３．１ベクターをトランスフェクションした細胞は、ネガティブコントロールとして使用した。
【０１０７】
増殖アッセイ。単層アッセイを用いて細胞増殖を評価するために、１ｘ１０5個の細胞を、組織培養処理した多数の穴のディッシュ内に１，２，４又は６日間、３回一組の実験において播種した。細胞数は、試料をトリプシン懸濁し、続いて、血球計数器を用いて顕微鏡により評価することによって評価した。ソフトアガーでのコロニー形成は、Zelinski, D. P. , Zantek, N. D. , Stewart, J. , Irizarry, A. & Kinch, M. S. (2001) Cancer Res 61,2301-2306) ; Clark, G. J. , Kinch, M. S. , Gilmer, T. M., Burridge, K. & Der, C. J. (1996) Oncogene 12,169-176において詳述されているように実施され、そして定量された。ＥｐｈＡ２アンチセンスを用いる実験の場合、細胞は、ソフトアガー中での懸濁の前に、オリゴヌクレオチドと一緒にインキュベートした。示したデータは、少なくとも３つの異なる実験の代表的なものである。
【０１０８】
アンチセンス処理。ＭＣＦ−１０Ａ Ｎｅｏ細胞及び安定してＬＭＷ−ＰＴＰを過剰発現しているＭＣＦ−１０Ａ細胞の単層は、３０％コンフルエントにまで増殖され、そして詳述されているとおりに、ＥｐｈＡ２アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクションされた。逆位のＥｐｈＡ２オリゴヌクレオチド又はトランスフェクション試薬単独でトランスフェクションされた試料は、ネガティブコントロールを提供した。
【０１０９】
結果
ＥｐｈＡ２は関連のチロシンホスファターゼによって制御される。
複数の独立した調査系は、ＥｐｈＡ２が関連のチロシンホスファターゼによって制御されることを示唆した。最初に、ＥｐｈＡ２は、非形質転換上皮細胞において迅速に脱リン酸されうる。ホスホチロシン抗体（ＰＹ２０又は４Ｇ１０）を用いたウェスタンブロット解析は、ＥｐｈＡ２−リガンド結合のＥＧＴＡ媒介型の破壊後５分以内に、より低レベルのＥｐｈＡ２ホスホチロシン含量を示した（図２Ａ）。同様に、ＥｐｈＡ２のチロシンリン酸化は、非形質転換上皮細胞の、ＥｐｈＡ２−リガンド結合のドミナントネガティブインヒビター（例えばＥｐｈＡ２−Ｆｃ）とのインキュベーション後に低下した。同一の結果が、ＭＣＦ−１２Ａ、ＭＣＦ１０−２、ＨＥＫ２９３、ＭＤＣＫ及びＭＤＢＫ細胞を含む、多数の非形質転換上皮細胞系を用いて得られた。これらの知見を基に、我々は、チロシンホスファターゼインヒビターが、ＥＧＴＡ処理に応じてのＥｐｈＡ２ホスホチロシン含量の減少を防ぎ得るかを問うた。事実、インヒビター、例えばオルトバナジン酸ナトリウムは、ＥＧＴＡによるＭＣＦ−１０Ａ細胞の処理の後、ＥｐｈＡ２ホスホチロシンの低下を防いだ（図２Ｂ）。
【０１１０】
我々の研究所によるこれまでの研究は、ＥｐｈＡ２のホスホチロシン含量が、非形質転換上皮細胞と比較して、悪性上皮細胞において大きく低下することを示した(Zelinski, D. P. , Zantek, N. D., Stewart, J. , Irizarry, A. & Kinch, M. S. (2001) Cancer Res 61, 2301-2306; Zantek, N. D. , Azimi, M. , Fedor-Chaiken, M. , Wang, B. , Brackenbury, R. & Kinch, M. S. (1999) Cell Growth & Differentiation 10,629-638)。従って、我々は、チロシンホスファターゼ活性が、悪性細胞におけるＥｐｈＡ２のホスホチロシン含量の低下に寄与し得るか否かを問うた。ＥｐｈＡ２は悪性乳ガン細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＣＦｎｅｏＳＴ、又はＰＣ−３細胞）においてチロシンリン酸化されなかったが、オルトバナジン酸ナトリウム濃度の増大を伴うインキュベーションは、ＥｐｈＡ２のチロシンリン酸化を迅速且つ激しく低下させた（図２Ｃ）。細胞のバナジン酸塩処理がしばしば生理学的に無関係な部位の誇大なリン酸化を導き得るので、我々は、３２Ｐ−ＡＴＰで標識されたＥｐｈＡ２を用いて、ホスホペプチドマッピング研究をin vitro又はin vivoのいずれかで実施した。これらの研究は、非形質転換ＭＣＦ−１０Ａ細胞及びバナジン酸塩処理ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるチロシンリン酸化の同一パターンを解明した。細胞質ドメインは、無差別にリン酸化されているかもしれない多数の部位を含むが、これらは本明細書で利用した条件下ではリン酸化されず、このことは、バナジン酸塩が無関係の部位のリン酸化を増大させなかったことを示唆している。要するに、これらの結果は、ＥｐｈＡ２が、悪性細胞においてＥｐｈＡ２ホスホチロシン含量を抑制する関連のホスファターゼによって制御されることを示す。
【０１１１】
ＬＭＷ−ＰＴＰはＥｐｈＡ２と相互作用し、そしてそれを脱リン酸する
悪性細胞においてＥｐｈＡ２を制御し得るチロシンホスファターゼを同定するために、我々は、ＬＭＷ−ＰＴＰが関連分子ＥｐｈＢ４を制御するという最近の報告(Jacob, A. N., Kalapurakal, J. , Davidson, W. R. , Kandpal, G. , Dunson, N. , Prashar, Y. & Kandpal, R. P. (1999) Cancer Detection & Prevention 23,325-332)を検討した。我々の最初の実験は、非形質転換（ＭＣＦ−１０Ａ Ｎｅｏ）及び悪性（ＭＣＦ−７，ＳＫ−ＢＲ−３，ＭＤＡ−ＭＢ−４３５，ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）の哺乳類上皮細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの発現及び機能の目録を作成することから開始した（図３）。全細胞可溶化物のウェスタンブロット解析は、非形質転換ＭＣＦ−１０Ａ哺乳類上皮細胞と比較した場合の、腫瘍由来乳ガン細胞における比較的高レベルのＬＭＷ−ＰＴＰを解明した。等しい試料の添加を確認するために、膜をストリッピングし、そしてコントロールタンパク質（ビンキュリン）に対する抗体で再プローブして、高レベルのＬＭＷ−ＰＴＰが添加の間違い又は悪性細胞におけるタンパク質レベルの一般化された増大を反映しなかったことを証明した。ＭＣＦ−１０の悪性変異体ＭＣＦｎｅｏＳＴも、ＬＭＷ−ＰＴＰ発現の増大を示し、これは、ＥｐｈＡ２がこれらの細胞においてチロシンリン酸化されないという最近の報告(Zantek, N. D., Walker-Daniels, J. , Stewart, J. C. , Hansen, R. K. , Robinson, D., Miao, H. , Wang, B. , Kung, H. J. , Bissell, M. J. & Kinch, M. S. (2001) Clin Cancer Res 7,3640-3648)に基づくと興味深いものであった。遺伝的に適合した系の使用も、細胞期限又は培養条件に起因する潜在的な差異を排除した。従って、最高レベルのＬＭＷ−ＰＴＰが悪性上皮細胞において一貫して見られ、そしてＥｐｈＡ２ホスホチロシン含量に反比例していた。
【０１１２】
上文の結果は、ＬＭＷ−ＰＴＰが腫瘍細胞においてＥｐｈＡ２のホスホチロシン含量をネガティブに制御し得るという、示唆的な、しかし間接的な証拠を提示した。この仮説を更に検討するために、我々は最初に、前記２つの分子がin vivoで相互作用するか否かを問うた。ＥｐｈＡ２は、特異的抗体（クローンＤ７）を用いてＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から免疫沈降され、そしてこれらの複合体はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離された。次に、ウェスタンブロット解析により、ＬＭＷ−ＰＴＰがＥｐｈＡ２免疫複合体内で顕著に見られたことを明らかにした（図４Ａ）。反対の実験により、ＥｐｈＡ２が免疫沈降したＬＭＷ−ＰＴＰの複合体において同様に検出されうることを確認した（図４Ｂ）。無関係の抗体によるコントロールの免疫沈降により、前記２つの分子の相互作用の特異性を確認した。
【０１１３】
免疫共沈降では、ＥｐｈＡ２がＬＭＷ−ＰＴＰの基質としての役割を果たし得るか否かを明らかにできなかった。このことに直接取り組むために、ＥｐｈＡ２は、通常チロシンリン酸化されているＭＣＦ−１０Ａ細胞から免疫沈降された。精製したＥｐｈＡ２は、続いて、異なる濃度の精製ＬＭＷ−ＰＴＰと一緒にインキュベートされ、その後、ホスホチロシン特異的抗体（ＰＹ２０及び４Ｇ１０）によるＥｐｈＡ２のウェスタンブロット解析を行った。これらの実験は、精製したＬＭＷ−ＰＴＰが、用量及び時間依存的にＥｐｈＡ２を脱リン酸し得ることを示した（図５Ａ）。
【０１１４】
in vitroでの研究は、ＥｐｈＡ２がＬＭＷ−ＰＴＰによってin vitroでリン酸化されうることを示したが、我々は、in vitroでの研究がin vivoでの類似の状況を常に表すものではないと認識した。従って、ＬＭＷ−ＰＴＰは、ＭＣＦ−１０Ａ細胞において異所的に過剰発現した。この特定の細胞系は、非形質転換ＭＣＦ−１０Ａ細胞が低レベルの内因性ＬＭＷ−ＰＴＰを有し、且つこれらの非形質転換上皮細胞におけるＥｐｈＡ２が通常チロシンリン酸化されないために選択された。ＬＭＷ−ＰＴＰの異所的な過剰発現は、特異的な抗体を用いたウェスタンブロット解析によって決定した場合（図６Ａ）、安定なトランスフェクションによって達成された。重要なことに、ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現は、ベクターをトランスフェクションしたネガティブコントロールと比較して、ＥｐｈＡ２のホスホチロシン含量を低下させるのに十分であった（図６Ａ）。同一な結果が、異なる実験を使用し、異なるトランスフェクタントを用い、且つ安定及び一過性トランスフェクションした両試料において得られ、その結果、クローンのバリエーションについての潜在的な関心を排除した。更に、低下したホスホチロシン含量は、ＬＭＷ−ＰＴＰを過剰発現している細胞のホスホチロシン含量が概して低下したように、ＥｐｈＡ２特異的であった（図６Ｂ）。
【０１１５】
ＬＭＷ−ＰＴＰ過剰発現細胞は上皮細胞の悪性転換を引き起こす
チロシンリン酸化ＥｐｈＡ２は、腫瘍細胞の増殖をネガティブに制御し、一方、リン酸化されてないＥｐｈＡ２は、強力な発ガンタンパク質として働く(Zelinski, D. P. , Zantek, N. D., Stewart, J. , Irizarry, A. & Kinch, M. S. (2001) Cancer Res 61, 2301-2306; Zantek, N. D. , Azimi, M. , Fedor-Chaiken, M. , Wang, B. , Brackenbury, R. & Kinch, M. S. (1999) Cell Growth & Differentiation 10,629-638)。従って、我々は、ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現が悪性転換を誘導するのに十分であるか否かを問うた。この疑問に取り組むために、我々は上述のＭＣＦ−１０Ａ細胞を利用し、これを野生型ＬＭＷ−ＰＴＰ又はベクターコントロールのいずれかでトランスフェクションした。我々の最初の研究は、単層培養におけるコントロール及びＬＭＷ−ＰＴＰ過剰発現細胞の増殖速度を評価した。標準的な２次元培養条件を用いて評価した場合、ＬＭＷ−ＰＴＰを過剰発現しているＭＣＦ−１０Ａ細胞の増殖速度は、対応するコントロールの増殖速度よりも有意に遅かった（Ｐ＜０．０５）（図７Ａ）。
【０１１６】
増殖の２次元的な評価はしばしば、腫瘍細胞の悪性の特徴を反映しなかった。その代わりに、ソフトアガー及び再構成した基底膜を用いた細胞挙動の３次元的解析は、悪性の挙動を評価する、更に関連している方法を提供し得る。ベクターをトランスフェクションしたＭＣＦ−１０Ａ細胞は、大部分ソフトアガーにコロニー形成することができないが、ＬＭＷ−ＰＴＰを過剰発現している細胞は、強拡大の顕微鏡１視野当たり平均４．９コロニーを形成した（Ｐ＜０．０１；図７Ｂ）。他の３次元アッセイ系を用いた最近の知見に基づき、我々はまた、３次元の再構成した基底膜を用いて、細胞の挙動を評価した。更に攻撃的な表現型と一致して、マトリゲルにおける細胞挙動の顕微鏡による評価は、ＬＭＷ−ＰＴＰ過剰発現細胞の悪性の特徴を確認した。マトリゲルの上に又はその中に、ＬＭＷ−ＰＴＰ過剰発現細胞は、ベクターをトランスフェクションした細胞よりも大きなコロニーを形成した。つまり、多数の且つ異なる系と一致した結果が、ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現が悪性転換を誘導するのに十分であることを示唆する。
【０１１７】
ＬＭＷ−ＰＴＰ過剰発現細胞の発ガン性の表現型はＥｐｈＡ２発現に関連している
ＥｐｈＡ２のチロシンリン酸化は、その内部移行及び分解を誘導する。従って、我々は、ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現が、ＥｐｈＡ２のタンパク質レベルを増大させうると仮定した。事実、全細胞可溶化物のウェスタンブロット解析は、ベクターをトランスフェクションしたコントロールと比較した場合の、ＬＭＷ−ＰＴＰを過剰発現するＭＣＦ−１０Ａ細胞におけるより高レベルのＥｐｈＡ２を明らかにした（図６Ａ）。更に、このＥｐｈＡ２は、チロシンリン酸化されなかった（図６Ｂ）。しかしながら、ウェスタンブロット解析は、ホスホチロシンの通常のレベルがＬＭＷ−ＰＴＰ形質転換細胞において変化しなかったので、低下したホスホチロシン含量がＥｐｈＡ２にとって選択的であったことを明らかにした（図６Ｃ）。
【０１１８】
ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現がＥｐｈＡ２発現を増大させ、そしてそのホスホチロシン含量を低下させたという発見が興味深いのは、この表現型が、高度に攻撃的な腫瘍細胞の暗示であったためである(Zelinski, D. P. , Zantek, N. D., Stewart, J. , Irizarry, A. & Kinch, M. S. (2001) Cancer Res 61, 2301-2306; Zantek, N. D. , Azimi, M. , Fedor-Chaiken, M. , Wang, B. , Brackenbury, R. & Kinch, M. S. (1999) Cell Growth & Differentiation 10,629-638)。従って、我々は、悪性細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの選択的なターゲティングがＥｐｈＡ２に影響を与えるか否かを問うた。これを達成するために、触媒として不活性なＬＭＷ−ＰＴＰの酵素的な変異体（Ｄ１２９Ａ）(Zhang, Z. , Harms, E. & Van Etten, R. L. (1994) Journal of Biological Chemistry 269,25947-25950)は、高レベルの野生型ＬＭＷ−ＰＴＰを有し（図３）、且つリン酸化されてないＥｐｈＡ２を過剰発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において過剰発現した。ＬＭＷ−ＰＴＰＤ１２９Ａの異所的な過剰発現は、ＥｐｈＡ２のレベルを低下させることが明らかとなった。更に、免疫沈降した材料のウェスタンブロット解析は、このＥｐｈＡ２がチロシンリン酸化されたことを明らかにした（図６Ｃ）。従って、一致した結果が、野生型ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現が、腫瘍由来細胞において観察されているＥｐｈＡ２の過剰発現及び機能的変化を付与するのに必要且つ十分であることを示している。
【０１１９】
ＬＭＷ−ＰＴＰを過剰発現しているＭＣＦ−１０Ａ細胞におけるＥｐｈＡ２はチロシンリン酸化されなかったが、それは酵素活性を保持していた。in vitroでのキナーゼアッセイは、ＬＭＷ−ＰＴＰ形質転換ＭＣＦ−１０Ａ細胞由来のＥｐｈＡ２が、ベクターをトランスフェクションしたコントロールに匹敵したレベルの酵素活性を有していたことを証明した（図８Ａ）。等しい試料添加を確認するために、２つのコントロールが実施された。等量のインプットの可溶化物は、β−カゼイン抗体を用いたウェスタンブロット解析によって確認した。更に、免疫沈降したＥｐｈＡ２を分割し、そしてその材料の半分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてＥｐｈＡ２及びホスホチロシン特異的抗体を用いたウェスタンブロット解析によって解析した（図８Ｂ）。従って、リン酸化ＥｐｈＡ２及び非リン酸化ＥｐｈＡ２はいずれも酵素活性があった。
【０１２０】
ＥｐｈＡ２のレベルがＬＭＷ−ＰＴＰ形質転換細胞において上昇したので、我々は、ＥｐｈＡ２の発ガン活性が、この表現型に寄与し得るか否かを問うた。このことに取り組むために、我々はアンチセンスストラテジーによる我々の経験を利用し、ＬＭＷ−ＰＴＰ形質転換細胞におけるＥｐｈＡ２発現を選択的に低下させた(Hess A. R., Seftor, E. A. , Gardner, L. M. , Carles-Kinch, K., Schneider, G. B. , Seftor, R. E. , Kinch, M. S. & Hendrix, M. J. C. (2001) Cancer Res 61,3250-3255.)。我々は、ウェスタンブロット解析により、これらのストラテジーの成功を検証し（図９Ａ）、そして次に、ＥｐｈＡ２発現の低下がソフトアガーのコロニー形成を変化させるか否かを問うた。事実、ＥｐｈＡ２アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたトランスフェクションは、ＬＭＷ−ＰＴＰ形質転換ＭＣＦ−１０Ａ細胞のソフトアガーコロニー形成を少なくとも８７％に低下させた（Ｐ＜０．０１；図９Ｂ）。対照的に、逆位のアンチセンスコントロールヌクレオチドコントロールによるこれらの細胞のトランスフェクションは、ソフトアガーでのコロニー形成を有意に変化させなかった。従って、我々は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる結果が、トランスフェクション手順によって生じた非特異的な毒性からもたらされたということを排除することができた。つまり、我々の結果は、ＥｐｈＡ２を発現する細胞において、過剰発現したＬＭＷ−ＰＴＰの発ガン性の作用が高レベルのＥｐｈＡ２を必要とすることを示す。
【０１２１】
考察
我々による本研究の主要な発見は、ＥｐｈＡ２が関連のチロシンホスファターゼによって制御されるということであり、そして我々は、ＬＭＷ−ＰＴＰをＥｐｈＡ２のチロシンリン酸化の必須の制御因子として同定している。我々はまた、ＬＭＷ−ＰＴＰが転移性ガン細胞において過剰発現し、そしてＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現が非形質転換上皮細胞モデルに対し悪性転換を付与するのに十分であることも証明する。最後に、我々は、ＬＭＷ−ＰＴＰがＥｐｈＡ２の発現をアップレギュレートし、そしてＬＭＷ−ＰＴＰの発ガン活性がＥｐｈＡ２のこの過剰発現を必要とすることを証明する。
【０１２２】
我々の研究所及び他者からの最近の報告は、多数の悪性上皮細胞が、チロシンリン酸化されていない高レベルのＥｐｈＡ２を発現することを示した。これまで、我々は、これらの抑制されたレベルのＥｐｈＡ２チロシンリン酸化を、低下したリガンド結合と関連付けていた。悪性細胞はしばしば不安定な細胞間接触を有しており、そして我々は、このことが、ＥｐｈＡ２が、隣接細胞の膜に結合したそのリガンドと安定的に相互作用する能力を低下させると仮定していた。部分的に、我々の本データは、ＥｐｈＡ２のホスホチロシン含量も、悪性細胞において過剰発現している関連のチロシンホスファターゼによってネガティブに制御されるという新しいパラダイムを示唆する。ＥｐｈＡ２のリン酸化と細胞間接着との関係を考慮すると、我々は、細胞間接触もＬＭＷ−ＰＴＰの発現及び機能を制御し得るということを排除できず、これは、将来の研究により、この可能性について対処されるべきである。
【０１２３】
高レベルのＬＭＷ−ＰＴＰが、悪性ガンの複数の異なる細胞モデルにおいて観察されたという事実は、ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現が悪性転換を付与するのに十分であることを考慮するならば注目すべきである。ＬＭＷ−ＰＴＰを過剰発現している細胞は、ソフトアガーにコロニー形成する能力を手に入れ、そして、３次元の基底膜。例えばマトリゲルにおいて培養した場合、悪性の表現型を獲得する。しかしながら、特にＬＭＷ−ＰＴＰを過剰発現しているＭＣＦ−１０Ａ上皮細胞は細胞増殖の２次元アッセイを用いて測定した場合に細胞増殖速度の低下を示した。この後者の観察は、高レベルのＬＭＷ−ＰＴＰが他の細胞型の単層での増殖速度を同様に低下させるという最近の報告と一致している(Shimizu, H. , Shiota, M. , Yamada, N., Miyazaki, K. , Ishida, N., Kim, S. & Miyazaki, H. (2001) Biochemical & Biophysical Research Communications 289, 602-607; Fiaschi, T. , Chiarugi, P., Buricchi, F., Giannoni, E. , Taddei, M. L. , Talini, D. , Cozzi, G. , ZecchiOrlandini, S. , Raugei, G. & Ramponi, G. (2001) Journal of Biological Chemistry 276,49156-49163)。そのような発見は、ＬＭＷ−ＰＴＰが悪性転換をネガティブに制御し得るということを示唆すると解釈されたが、我々の発見は、非常に異なる結論を支持している。これと一致して、我々の研究所及び他者による最近の研究は、ＭＣＦ−１０Ａ細胞の悪性転換がしばしば単層での増殖速度の低下を伴い、そしてＭＣＦ−１０Ａの最も攻撃的な変異体が、in vivoで、単層培養において最も遅い増殖を示すことを証明している。これらの発見は、非形質転換上皮細胞系を用いた場合の発ガン遺伝子の機能の設計及び解釈に影響を与える。
【０１２４】
ＥｐｈＡ２チロシンリン酸化の生化学的な結論は、大部分が不明確なままである。自己リン酸が酵素活性に必要な他の受容体チロシンキナーゼと異なり、ＥｐｈＡ２のチロシンリン酸化は、その酵素活性に必要ではない。我々による本結果と一致して、ＥｐｈＡ２は、そのホスホチロシン含量における劇的な差異にも関わらず、非形質転換細胞及び腫瘍由来細胞において、匹敵するレベルの酵素活性を保持している(Zantek, N. D. , Azimi, M. , Fedor-Chaiken, M. , Wang, B. , Brackenbury, R. & Kinch, M. S. (1999) Cell Growth & Differentiation 10,629-638)。同様に、ＥｐｈＡ２の自己リン酸の抗体を媒介する刺激は、ＥｐｈＡ２の酵素活性レベルを変化させない。ＥｐｈＡ２細胞質ドメインのホスホペプチド解析は、１つの可能性のある説明を提供する。ＥｐｈＡ２は、残基７７２に推定上の活性化ループチロシンを有するが(Lindberg, R. A. & Hunter, T. (1990) Molecular & Cellular Biology 10,6316-6324)、in vitro又はin vivoのいずれのホスホペプチド解析も、この部位が正常な細胞モデルにおいてリン酸化されず、又は悪性細胞モデルにおいて外因性リガンドに応答しないことを明らかにした。従って、共通の活性化ループチロシンの欠如は、チロシンリン酸化されない、細胞におけるＥｐｈＡ２の酵素活性の保持を説明することができる。
【０１２５】
ＥｐｈＡ２のチロシンリン酸化はその固有の酵素活性に必要であるようには見えないが、リガンド媒介型のチロシンリン酸化は、ＥｐｈＡ２タンパク質の安定性を制御する。具体的には、チロシンリン酸化は、ｃ−Ｃｂｌアダプタータンパク質と相互作用し、そして次に内部移行してプロテオソーム内で分解されるようＥｐｈＡ２を運命付ける(J. Walker-Daniels et al. , Mol. Cancer Res. 2002 Nov; 1 (1) : 79-87)。結果的に、ＬＭＷ−ＰＴＰのホスファターゼ活性は、ＥｐｈＡ２タンパク質の安定性を増大させることが予想される。事実、最高レベルのＥｐｈＡ２が、高レベルのＬＭＷ−ＰＴＰを有する細胞において一貫して見られる。この発見の１つの興味深い暗示は、それがＥｐｈＡ２の遺伝的制御から独立した機構を提供し、なぜ高レベルのＥｐｈＡ２が多数の異なる腫瘍において見られるかを説明する。別の可能性は、ＬＭＷ−ＰＴＰがＥｐｈＡ２の遺伝子発現をアップレギュレートし、そして、我々による本発見はこの可能性を形式的には排除しない。ＥｐｈＡ２インヒビターがＬＭＷ−ＰＴＰを過剰発現する細胞の悪性の特徴を逆転させたという事実は、ＥｐｈＡ２のアップレギュレーションがＬＭＷ−ＰＴＰを媒介する形質転換の細胞性挙動に関連することを示唆している。
【０１２６】
要約すると、我々による本研究は、この実施例及びKikawa et al. , J. Biol. Chem. 277 (42): 39274-39279 (2002)に記載のように、腫瘍由来ガン腫細胞において過剰発現する新規発ガン遺伝子としてＬＭＷ−ＰＴＰを同定する。我々はまた、ＥｐｈＡ２と同様に、過剰発現したＬＭＷ−ＰＴＰの生化学的作用と生物学的作用を関連付ける。これらの発見は、上皮細胞の転移の進行に寄与する生化学的機構及び生物学的機構の理解に影響を与える。更に、我々による本研究は、ＥｐｈＡ２又はＬＭＷ−ＰＴＰを過剰発現する多数のガン細胞を標的とする機会を最終的に提供する重要なシグナル伝達系を同定する。
【０１２７】
実施例ＩＩＩ．ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現の効果
細胞系及び試薬は、実施例ＩＩに記載のものを使用した(Kikawa et al. , J. Biol. Chem. 277 (42): 39274-39279 (2002))。細胞の可溶化物の生成方並びに免疫沈降及びウェスタンブロット（イムノブロット）解析、ＥＧＴＡ及び過酸化バナジン酸処理、トランスフェクション及び選択、並びに増殖アッセイ、を実施する方法も、実施例ＩＩに記載の通りである(Kikawa et al. , J. Biol. Chem. 277 (42): 39274-39279 (2002))。
【０１２８】
非形質転換細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰ過剰発現の形態学的効果
野生型ヒトＬＭＷ−ＰＴＰ、又は対応するベクターコントロールで安定的にトランスフェクションされたＭＣＦ−１０Ａ細胞の単層培養物を、顕微鏡にかけた（６００ｘ）（図１０）。非形質転換（ベクター）細胞は、特徴的な上皮の形態を保持したが、ＬＭＷ−ＰＴＰをトランスフェクションした細胞は、悪性上皮細胞の特徴である間充織の表現型の形をとった。従って、ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現は、細胞の２次元的な形態を変化することが観察された。
【０１２９】
ＬＭＷ−ＰＴＰをトランスフェクションしたＭＣＦ−１０Ａ細胞は、更に、高細胞密度で培養した場合、悪性転換の特徴である３次元的な病巣を形成することが観察された（図１１）。
【０１３０】
形質転換細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰ不活性化効果
腫瘍細胞においてＬＭＷ−ＰＴＰを阻害するという生物学的な結果を評価するために、高度に浸潤性のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞がＬＭＷ−ＰＴＰ変異体（Ｄ１２９Ａ）で安定的にトランスフェクションされた。Ｄ１２９Ａは基質捕捉変異体として機能し、それにより腫瘍細胞において内因性ＬＭＷ−ＰＴＰの活性と離れて競合する。それは、形質転換細胞においてＬＭＷ−ＰＴＰを効果的に不活性化する。
【０１３１】
Ｄ１２９Ａをトランスフェクションした細胞は、対応する（ベクター）コントロールと比較して、ソフトアガーにおけるコロニー形成の低下を示した（図１２）。従って、形質転換細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの不活性化は、ソフトアガーでのコロニー形成の減少をもたらす。このことは、ＬＭＷ−ＰＴＰが、悪性細胞の特徴である足場依存性の細胞増殖及び／又は生存に必要であることを示す。
【０１３２】
また、ＬＭＷ−ＰＴＰの不活性化が、形質転換細胞における２次元の形態及びＥｐｈＡ２分布を変化させることが明らかとなった。ドミナントネガティブなＬＭＷ−ＰＴＰ（Ｄ１２９Ａ）又は対応するベクターコントロールを発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の形態は、標識したＥｐｈＡ２の免疫蛍光形態学によって評価した（図１３）。コントロール培養物ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、通常、ＥｐｈＡ２が膜ラッフルに拡散して分布し又はそこに豊富に存在している、間充織の形態をとる。対照的に、Ｄ１２９Ａをトランスフェクションした細胞は、細胞間接触部位内にＥｐｈＡ２が豊富に存在する、特徴的な上皮の形態を示す。
【０１３３】
Ｄ１２９Ａ ＬＭＷ−ＰＴＰ ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、ＥｐｈＡ２のリン酸化状態に対するその効果を決定するために、ＥＧＴＡで処理された。５ｘ１０6個のコントロール及びＤ１２９ＡをトランスフェクションしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞からの洗剤抽出は、実施例Ｉ及びＩＩに記載のように収集した。Ｄ７抗体でＥｐｈＡ２を免疫沈降した後、試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、そしてホスホチロシン特異的（４Ｇ１０）抗体を用いたウェスタンブロット解析にかけられた。Ｄ１２９Ａをトランスフェクションした細胞におけるＥｐｈＡ２は、ＥＧＴＡによる処理後であっても、より高度にチロシンリン酸化されることが明らかとなった（図１４）。ＥＧＴＡは、細胞間接触を不安定化し、それにより、リガンド結合の損失の後であっても、ＥｐｈＡ２が脱リン酸されるのを防ぐ。
【０１３４】
図１５は、ＬＭＷ−ＰＴＰをトランスフェクションしたＭＣＦ−１０Ａ細胞及びＤ１２９ＡをトランスフェクションしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１（形質転換した）細胞を用いた免疫蛍光顕微鏡研究に由来する証拠を要約する表である。ＬＭＷ−ＰＴＰをトランスフェクションしたＭＣＦ−１０Ａ細胞の変化した形態及びマーカーは、悪性転換と一致している。更に、Ｄ１２９Ａを過剰発現する細胞の形態は、あまり攻撃的でない（より分化した）表現型と一致する。
【０１３５】
形質転換細胞及び非形質転換細胞におけるＥｐｈＡ２及びＬＭＷ−ＰＴＰの共存
コントロール及びＬＭＷをトランスフェクションしたＭＣＦ−１０Ａ細胞におけるＥｐｈＡ２（Ｄ７抗体を用いる）及びＬＭＷ−ＰＴＰ（ウサギポリクローナル血清を用いる）の細胞内局在は、ホルマリン固定し（３．７％、２分）、洗剤で透過処理した（０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を含むＰＢＳ）、カバーガラス上で培養した単層において評価した。イメージ（図１６Ａ）はニコン社製顕微鏡（６００ｘ）を用いて視覚化し、そしてイメージはニコン社製デジタルカメラ及びソフトウェアを用いて捕らえた。
【０１３６】
野生型ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現は、ストレスファイバーの形成を引き起こすことが明らかとなった（コントロールの細胞において優勢な接着帯と対照的）。反対の状況において、ＬＭＷ−ＰＴＰのドミナントネガティブなインヒビター（Ｄ１２９Ａ）は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１におけるストレスファイバーの数を減少させる。これらの観察は、野生型ＬＭＷ−ＰＴＰが悪性（遊走性及び浸潤性）の表現型を促進し、一方、ＬＭＷ−ＰＴＰの阻害は攻撃的な表現型を逆転させるのに十分であるという仮説と一致している。
【０１３７】
局所接着に対するＬＭＷ−ＰＴＰ過剰発現の効果
局所接着の機構は、パキシリン特異的抗体を用いて決定した場合、更に免疫蛍光顕微鏡によりＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において評価された。パキシリンの細胞内局在は、ホルマリン固定し（３．７％、２分）、洗剤で透過処理した（０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を含むＰＢＳ）カバーガラス上で培養した単層において評価した。イメージ（図１８）はニコン社製顕微鏡（６００ｘ）を用いて視覚化し、そしてイメージはニコン社製デジタルカメラ及びソフトウェアを用いて捕らえた。
【０１３８】
野生型ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現は、特に細胞遊走及び浸潤の最前線での、局所接着の突出を増大させ、このことは、より攻撃的な表現型と一致している。反対の状況において、ＬＭＷ−ＰＴＰのドミナントネガティブなインヒビター（Ｄ１２９Ａ）は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１における局所接着の突出を低下させ、局所接着の（局在化というよりむしろ）散在性の分布をもたらし、このことは細胞遊走又は浸潤と一致している。
【０１３９】
悪性の特徴の病理学的マーカー
サイトケラチン（図１９）及びビメンチン（図２０）の発現は、免疫蛍光顕微鏡を用いて評価した。サイトケラチン及びビメンチンの染色は、ホルマリン固定し（３．７％、２分）、洗剤で透過処理した（０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を含むＰＢＳ）、カバーガラス上で培養した単層において評価した。イメージ（図１８）はニコン社製顕微鏡（６００ｘ）を用いて視覚化し、そしてイメージはニコン社製デジタルカメラ及びソフトウェアを用いて捕らえた。
【０１４０】
野生型ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現は、サイトケラチンの発現を減少させるが、ビメンチンの発現を増大させることが明らかとなった。これらの結果は、中間径フィラメントタンパク質の発現におけるこれらの変化が、ガンの診断及び分類の病理学者によってしばしば使用されることを考慮すると、注目すべきことである。
【０１４１】
実施例ＩＶ．非形質転換上皮細胞の腫瘍形成能に対するＬＭＷ−ＰＴＰ過剰発現の効果
細胞（ＭＣＦ−１０Ａ、ＭＣＦ−１０Ａ Ｎｅｏ（コントロール）及び安定的に野生型ＬＭＷ−ＰＴＰを過剰発現する、トランスフェクションしたＭＣＦ−１０Ａ細胞）を、皮下注射を介してマウスに導入した。２つの投与量レベルを使用した：約２００万個及び５００万個の細胞。３匹のマウスを各グループに含めた。マウスは注射してから２０日目に観察され、そして腫瘍（存在する場合）のサイズを測定した。
【０１４２】
図２１は、注射後２０日目に観察した、５ｘ１０6個の細胞を注射したマウスについての腫瘍測定データを示す。親ＭＣＦ−１０Ａ細胞又はコントロールベクターを注射したマウスのいずれも、注射部位での腫瘍形成を示さなかった。しかしながら、安定的に野生型ＬＭＷ−ＰＴＰを過剰発現するＭＣＦ−１０Ａ細胞を注射したマウスは、５００万個の細胞を注射したマウスのうち３匹全てが、そして１００万個の細胞を注射した３匹のマウスのうち２匹が、有意な増殖を示した。これらの結果は、ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現が、非形質転換上皮細胞に腫瘍形成能を付与するのに十分であることを示唆している。ＥｐｈＡ２は、我々が、非形質転換上皮細胞に対して腫瘍形成能を付与することができることに気付いた唯一の他の発ガン遺伝子である。
【０１４３】
本明細書で引用した、全ての特許、特許出願、及び刊行物、及び電子的に入手可能な材料（例えば、ヌクレオチド配列の、例えばＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑへの提出、並びにアミノ酸配列の、例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢへの提出、並びにＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑにおける注釈付きのコード領域からの翻訳、を含む）は、引用によって組み入れられる。前述の詳細な説明及び例は、理解を明確にするためだけに示したものである。不必要な限定がそれらから理解されるべきではない。本発明は、特許請求の範囲内に含まれるであろう当業者にとって自明な変動について示し、そして説明した正確な詳細に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】図１は、５．４ｋｂの哺乳類発現ベクターである真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３の模式的なマップを示す。独特の制限部位を示す。HPTP遺伝子はこのベクターのHind III/BamH I部位内にクローニングした。
【図２】図２は、ＥｐｈＡ２が関連のホスファターゼによって制御されることを示す。（Ａ）ＭＣＦ−１０Ａヒト哺乳類上皮細胞の単層を、４ｍＭのＥＧＴＡの存在下又は不在下（「Ｃ」としてコントロールを表す）、洗浄剤抽出の前に２０分間インキュベートした。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、そしてホスホチロシン特異的抗体（ＰＹ２０及び４Ｇ１０；上段）でプローブした。膜をストリッピングし、そしてＥｐｈＡ２特異的抗体で再プローブして等しいサンプル添加を確認した（下段）。（Ｂ）ＭＣＦ−１０Ａ細胞は、ＥＧＴＡを用いて、ＮａＶＯ4の存在下又は不在下で、上文で詳述したように処理してホスファターゼ活性を阻害した。（Ｂ）ＥｐｈＡ２は、指定の濃度のＮａＶＯ4の存在下で３７℃で１０分間インキュベートしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から免疫沈降された。
【図３】図３は、ＬＭＷ−ＰＴＰタンパク質レベルが悪性細胞系において上昇することを示す。洗浄剤可溶化物（２〜７レーン）を非形質転換型（ＭＣＦ−１０Ａｎｅｏ）、発ガン遺伝子形質転換型（ＭＣＦ−１０ＡｎｅｏＳＴ）、及び腫瘍由来型（ＭＣＦ−７，ＳＫ−ＢＲ−３，ＭＤＡ−ＭＢ−４３５，ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）の哺乳類上皮細胞から収集した。この試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてＬＭＷ−ＰＴＰ特異的抗体を用いたウェスタンブロットにかけた（上段）。精製したＬＭＷ−ＰＴＰ（レーン１）は、ウェスタンブロット解析のためのポジティブコントロールを提供した。続いて膜をストリッピングし、そしてビンキュリン特異的抗体で再プローブして試料の添加を評価した（下段）。注目すべきは、ＬＭＷ−ＰＴＰが、非形質転換（ＭＣＦ−１０Ａｎｅｏ）試料の相対的に過剰な添加にも関わらず、腫瘍由来細胞において過剰発現しているということである。
【図４】図４は、ＥｐｈＡ２及びＬＭＷ−ＰＴＰがin vivoで分子複合体を形成することを示す。（Ａ）ＥｐｈＡ２の複合体は、５ｘ１０6のＭＣＦ−１０Ａ又はＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から免疫沈降し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてＬＭＷ−ＰＴＰ特異的抗体を用いてウェスタンブロット解析にかけた。（Ｂ）複合体の形成を確認するために、ＬＭＷ−ＰＴＰの複合体を同様に免疫沈降によって単離し、そしてＥｐｈＡ２特異的抗体でプローブした。
【図５】図５は、ＥｐｈＡ２は、in vitroでＬＭＷ−ＰＴＰの基質としての役割を果たし得ることを示す。ＥｐｈＡ２は、指定量のＬＭＷ−ＰＴＰタンパク質との３７℃での０〜３０分間のインキュベーション前に、５ｘ１０6のＭＣＦ−１０Ａ細胞から免疫沈降した。続いて、この試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてホスホチロシン特異的抗体によるウェスタンブロット解析にかけた。膜をストリッピングし、そしてＥｐｈＡ２特異的抗体で再プローブして等量のサンプル添加を確認した。
【図６】図６は、ＬＭＷ−ＰＴＰがＥｐｈＡ２をin vivoで脱リン酸することを示す。（Ａ）ＭＣＦ−１０Ａ細胞は、野生型ＬＭＷ−ＰＴＰをコードする発現ベクターで安定的にトランスフェクションした。洗浄剤可溶化物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そして、ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現を確認するために、ＬＭＷ−ＰＴＰ抗体と、ポジティブコントロールを提供する精製ＬＭＷ−ＰＴＰとを用いたウェスタンブロットにかけた。続いて、対応する試料を、添加用コントロールとしてのβ−カゼイン特異的抗体でプローブした。（Ｂ）ＥｐｈＡ２を免疫沈降し、そしてＥｐｈＡ２（上段）及びＰ−Ｔｙｒ（下段）特異的抗体を用いてウェスタンブロットを実施した。（Ｃ）コントロール及びＬＭＷ−ＰＴＰをトランスフェクションした細胞におけるホスホチロシンの全体レベルは、特異的な抗体を用いて比較した。注目すべきは、内因性のＥｐｈＡ２発現の差異を克服するために、等量のＥｐｈＡ２がこれらの結果のために利用されたことである（項目Ｂと対照的）。（Ｄ）ＬＭＷ−ＰＴＰのドミナントネガティブ型（Ｄ１２９Ａ）又は対応するベクターのコントロールをトランスフェクションしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＥｐｈＡ２のタンパク質レベル（上段）及びホスホチロシン含量は、ウェスタンブロット解析によって評価した。ＬＭＷ−ＰＴＰ活性がＥｐは２ホスホチロシン含量の低下及びＥｐｈＡ２タンパク質レベルの増大に関連するという一貫した発見に注目すべきである。
【図７】図７は、ＬＭＷ−ＰＴＰが悪性の特徴を増強することを示す。（Ａ）足場依存性の細胞増殖を評価するために、１ｘ１０5個のコントロール又はＬＭＷ−ＰＴＰをトランスフェクションしたＭＣＦ−１０Ａ細胞を単層培地内に播種し、そして細胞数を顕微鏡により示した間隔で評価した。（Ｂ）平行の研究において、コントロール及びＬＭＷ−ＰＴＰをトランスフェクションした細胞をソフトアガー中で懸濁した。３７℃での５日間のインキュベーション後のコロニー形成（強拡大１視野当たりのもの）を示す。これらの結果は、少なくとも別々の実験の代表例を示した。*はｐ＜０．０１を示す。
【図８】図８は、ＥｐｈＡ２がＬＭＷ−ＰＴＰ形質転換細胞において酵素活性を保持することを示す。等量のＥｐｈＡ２をコントロール又はＬＭＷ−ＰＴＰ形質転ＭＣＦ−１０Ａ細胞から免疫沈降し、そしてin vitroでのキナーゼアッセイにかけた。（Ａ）γ−32Ｐ標識ＡＴＰによる自己リン酸化は、オートラジオグラフィーによって評価した。等量の試料添加を確認するために、免疫沈降した材料の一部を（Ｂ）ＥｐｈＡ２又は（Ｃ）ホスホチロシン抗体を用いるウェスタンブロット解析によって評価した。ＥｐｈＡ２はＬＭＷ−ＰＴＰ形質転換細胞においてチロシンリン酸化されないが、それは酵素活性を保持している。内因性のＥｐｈＡ２発現の差異を克服するために、等量のＥｐｈＡ２がこれらの結果に利用されたことに注目すべきである（例えば、図５Ｂを参照のこと）。
【図９】図９は、ＬＭＷ−ＰＴＰによる悪性転換がＥｐｈＡ２の過剰発現に関連することを示す。ＭＣＦ−１０Ａ細胞を、ＥｐｈＡ２アンチセンス（ＡＳ）オリゴヌクレオチド、逆方向のアンチセンス（ＩＡＳ）オリゴヌクレオチド又はネガティブコントロールを提供するためのトランスフェクション試薬単独、を用いて処理した。（Ａ）ＥｐｈＡ２特異的抗体を用いるウェスタンブロット解析は、当該アンチセンス処理がＥｐｈＡ２のタンパク質レベルを低下させたことを確認した（上段）。続いて膜をストリッピングし、そしてβ−カテニンについて再プローブして等しい試料添加を確認した（下段）。（Ｂ）平行の試料を懸濁し、そしてソフトアガー中で５日間インキュベートした。強拡大の顕微鏡１視野当たり（ＨＰＦ）の平均コロニー数を示す。*はｐ＜０．０１を示す。
【図１０】図１０は、ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現がトランスフェクションしたＭＣＦ−１０Ａ細胞の２次元的な形態を変化させることを示す。
【図１１】図１１は、ＬＭＷ−ＰＴＰを過剰発現する、トランスフェクションされたＭＣＦ−１０Ａ細胞が高い細胞密度で病巣を形成することを示す。
【図１２】図１２は、形質転換細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの不活性化が、ソフトアガーでのコロニー形成の低下をもたらすことを示す。
【図１３】図１３は、形質転換細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの不活性化が、２次元的な形態及びＥｐｈＡ２の分布を変化させることを示す。
【図１４】図１４は、ＬＭＷ−ＰＴＰを不活性化させるためにＤ１２９Ａをトランスフェクションした形質転換細胞のＥＧＴＡ処理の結果を示す。
【図１５】図１５は、免疫蛍光の発見の要約を示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、コントロール及びトランスフェクションされたＭＣＦ−１０Ａ細胞におけるＥｐｈＡ２とＬＭＷ−ＰＴＰの共存を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、ＬＭＷ−ＰＴＰを不活性化させるためにＤ１２９Ａをトランスフェクションした形質転換細胞におけるＥｐｈＡ２とＬＭＷ−ＰＴＰの共存を示す。
【図１７】図１７は、アクチン骨格の変化した構成がＬＭＷ−ＰＴＰの発現及び機能に関連することを示す。
【図１８】図１８は、変化した局所接着の形成が、ＬＭＷ−ＰＴＰの発現及び機能に関連することを示す。
【図１９】図１９は、ＬＭＷ−ＰＴＰによって変化したサイトケラチンの発現を示す。
【図２０】図２０は、ＬＭＷ−ＰＴＰ発現によって変化したビメンチンの発現を示す。
【図２１】図２１は、５ｘ１０6個のＥｐｈＡ２過剰発現ＭＣＦ−１０Ａ細胞及びコントロールを注射したマウスにおける、注射後２０日目の腫瘍の発生に関連するデータを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
低分子量タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＭＷ−ＰＴＰ）を発現するガン細胞を含んで成る哺乳類のガンの処置方法であって、当該哺乳類に、ＬＭＷ−ＰＴＰの活性を阻害するのに有効な処置物質を投与することを含んで成る方法。
【請求項２】
低分子量タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＭＷ−ＰＴＰ）及びＥｐｈＡ２受容体分子を発現するガン細胞を含んで成る哺乳類のガンの処置方法であって、当該哺乳類に、ＬＭＷ−ＰＴＰの活性を阻害するのに有効な第一の処置物質及びＥｐｈＡ２受容体分子の生体活性を望ましく変化させるのに有効な第二の処置物質を投与することを含んで成る方法。
【請求項３】
第一及び第二の処置物質が同時に送達される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第一の処置物質が第二の処置物質の前に送達される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
第二の処置物質が第一の処置物質の前に送達される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
ＥｐｈＡ２受容体分子の生体活性を望ましく変化させることが、ＥｐｈＡ２受容体分子のホスホチロシン含量を増大させることを含んで成る、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つの処置物質が細胞毒性物質と共有結合している、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
ガン細胞が転移性ガン腫細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９】
哺乳類のガンの診断方法であって：
当該哺乳類から得られる生体材料中の細胞を可溶化して細胞可溶化物を生成せしめ；
当該細胞可溶化物を、ＬＭＷ−ＰＴＰと結合する診断物質と接触させて結合複合体を形成せしめ；
当該結合複合体を検出し；そして
ＬＭＷ−ＰＴＰが、前記生体材料において、非ガン性生体材料と比較して過剰発現しているか否かを決定すること、を含んで成り、
ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現が当該哺乳類におけるガン細胞の存在の指標である、方法。
【請求項１０】
哺乳類のガンの診断方法であって：
ＬＭＷ−ＰＴＰ活性について、当該哺乳類の生体材料をアッセイし；そして
ＬＭＷ−ＰＴＰが、前記生体材料において、非ガン性生体材料と比較して過剰発現しているか否かを決定すること、を含んで成り、
ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現が当該哺乳類におけるガン細胞の存在の指標である、方法。
【請求項１１】
前記生体材料が前記哺乳類中のものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記生体材料が、前記哺乳類の組織、器官又は体液を含んで成る、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記生体材料が前記哺乳類から得られる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記哺乳類から前記生体材料を得ることを更に含んで成る、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＥｐｈＡ２受容体分子を標的とする候補のガン治療物質の有効性を評価する方法であって：
ＥｐｈＡ２受容体分子及びＬＭＷ−ＰＴＰを発現しているガン細胞を、候補の治療物質と接触させ、処置された細胞を生成せしめ；
当該処置されたガン細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの量又は活性を決定し；
当該処置されたガン細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの量又は活性を、類似の未処置のガン細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの量又は活性と比較すること、
を含んで成り、
当該処置された細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの量又は活性の低下が、前記候補の治療物質のＥｐｈＡ２ターゲティングの有効性の指標である、方法。
【請求項１】
低分子量タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＭＷ−ＰＴＰ）を発現するガン細胞を含んで成る哺乳類のガンの処置方法であって、当該哺乳類に、ＬＭＷ−ＰＴＰの活性を阻害するのに有効な処置物質を投与することを含んで成る方法。
【請求項２】
低分子量タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＭＷ−ＰＴＰ）及びＥｐｈＡ２受容体分子を発現するガン細胞を含んで成る哺乳類のガンの処置方法であって、当該哺乳類に、ＬＭＷ−ＰＴＰの活性を阻害するのに有効な第一の処置物質及びＥｐｈＡ２受容体分子の生体活性を望ましく変化させるのに有効な第二の処置物質を投与することを含んで成る方法。
【請求項３】
第一及び第二の処置物質が同時に送達される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第一の処置物質が第二の処置物質の前に送達される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
第二の処置物質が第一の処置物質の前に送達される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
ＥｐｈＡ２受容体分子の生体活性を望ましく変化させることが、ＥｐｈＡ２受容体分子のホスホチロシン含量を増大させることを含んで成る、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つの処置物質が細胞毒性物質と共有結合している、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
ガン細胞が転移性ガン腫細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９】
哺乳類のガンの診断方法であって：
当該哺乳類から得られる生体材料中の細胞を可溶化して細胞可溶化物を生成せしめ；
当該細胞可溶化物を、ＬＭＷ−ＰＴＰと結合する診断物質と接触させて結合複合体を形成せしめ；
当該結合複合体を検出し；そして
ＬＭＷ−ＰＴＰが、前記生体材料において、非ガン性生体材料と比較して過剰発現しているか否かを決定すること、を含んで成り、
ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現が当該哺乳類におけるガン細胞の存在の指標である、方法。
【請求項１０】
哺乳類のガンの診断方法であって：
ＬＭＷ−ＰＴＰ活性について、当該哺乳類の生体材料をアッセイし；そして
ＬＭＷ−ＰＴＰが、前記生体材料において、非ガン性生体材料と比較して過剰発現しているか否かを決定すること、を含んで成り、
ＬＭＷ−ＰＴＰの過剰発現が当該哺乳類におけるガン細胞の存在の指標である、方法。
【請求項１１】
前記生体材料が前記哺乳類中のものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記生体材料が、前記哺乳類の組織、器官又は体液を含んで成る、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記生体材料が前記哺乳類から得られる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記哺乳類から前記生体材料を得ることを更に含んで成る、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＥｐｈＡ２受容体分子を標的とする候補のガン治療物質の有効性を評価する方法であって：
ＥｐｈＡ２受容体分子及びＬＭＷ−ＰＴＰを発現しているガン細胞を、候補の治療物質と接触させ、処置された細胞を生成せしめ；
当該処置されたガン細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの量又は活性を決定し；
当該処置されたガン細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの量又は活性を、類似の未処置のガン細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの量又は活性と比較すること、
を含んで成り、
当該処置された細胞におけるＬＭＷ−ＰＴＰの量又は活性の低下が、前記候補の治療物質のＥｐｈＡ２ターゲティングの有効性の指標である、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【公表番号】特表２００６−５０１１５３（Ｐ２００６−５０１１５３Ａ）
【公表日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５０６８３７（Ｐ２００４−５０６８３７）
【出願日】平成１５年５月２２日（２００３．５．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０１６２６９
【国際公開番号】ＷＯ２００３／０９９３１３
【国際公開日】平成１５年１２月４日（２００３．１２．４）
【出願人】（５９８０６３２０３）パーデュー・リサーチ・ファウンデーション (59)
【氏名又は名称原語表記】ＰＵＲＤＵＥ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年５月２２日（２００３．５．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０１６２６９
【国際公開番号】ＷＯ２００３／０９９３１３
【国際公開日】平成１５年１２月４日（２００３．１２．４）
【出願人】（５９８０６３２０３）パーデュー・リサーチ・ファウンデーション (59)
【氏名又は名称原語表記】ＰＵＲＤＵＥ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
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