赤血球の長期貯蔵
【課題】ＲＢＣ貯蔵懸濁物を直接ヒトに輸血できるようにし、かつ容認できるＲＢＣのインビボ回復の維持を可能にすると同時に、従来の溶液およびプロセスを超える、ヒトＲＢＣの貯蔵時間を増加させる改善された添加溶液およびプロセスの必要性が依然としてある。
【解決手段】冷蔵条件下でヒト赤血球（ＲＢＣ）の貯蔵に有用な新規な添加物溶液が開示される。適切な容量のこの添加物溶液を使用して、約１〜６℃にて１０週間までＲＢＣを保存する方法もまた開示される。本発明に従う添加物溶液およびプロセスは、ヒトにおいて直接的に注入可能である溶液において延長された時間、ヒトＲＢＣの生存可能な貯蔵を可能にする。
【解決手段】冷蔵条件下でヒト赤血球（ＲＢＣ）の貯蔵に有用な新規な添加物溶液が開示される。適切な容量のこの添加物溶液を使用して、約１〜６℃にて１０週間までＲＢＣを保存する方法もまた開示される。本発明に従う添加物溶液およびプロセスは、ヒトにおいて直接的に注入可能である溶液において延長された時間、ヒトＲＢＣの生存可能な貯蔵を可能にする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（諸言）
全血貯蔵は、１９１７年にＲｅｂｅｒｔｓｏｎにより初めて示された。酸−クエン酸塩−デキストロース（ＡＣＤ）およびクエン酸塩−リン酸塩−デキストロース溶液（ＣＰＤ）は、引き続き、血液の２１日間の貯蔵を立証した。アデニンを有するＣＰＤ（ＣＰＤ−１）が後に導入され、そして貯蔵血液の有効期間を５週間まで延長するために使用された。これらの溶液中で貯蔵された赤血球（ＲＢＣ）は、ヒトドナーに再注入して戻して２４時間後に、このような細胞が循環中で生存できなかったことにより決定されるように、約５〜６週間後に確実に劣化を示した。代謝老廃物（すなわち、乳酸および水素イオン）の濃度が増加するにつれ、連続した冷蔵貯蔵の間に漸減速度でグルコースが消費されることが観察された。このようなグルコース代謝速度の減少は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の枯渇を導く。このことは、この細胞が循環中に戻されたときのＲＢＣの回復と直接、相関する。
【背景技術】
【０００２】
全血から赤血球（ＲＢＣ）を分離した後に、それらを保存するための添加溶液を開発することにより、特にＲＢＣの必要性に合わせて調整される処方物の設計が可能になった。添加溶液（例えば、Ａｄｓｏｌ（登録商標）（ＡＳ−１）、Ｎｕｔｒｉｃｅｌ（登録商標）（ＡＳ−３）、Ｏｐｔｏｓｏｌ（登録商標）（ＡＳ−５）およびＥｒｙｔｈｒｏ−Ｓｏｌ（登録商標））は、４℃でのＲＢＣの貯蔵を延長するために設計された。
【０００３】
いまや、採取された全血のほとんど全ては、成分に分けられ、そしてＲＢＣ画分は、濃縮ＲＢＣとして貯蔵される。添加溶液系中に引き上げられた血液に関しては、ＲＢＣは、遠心分離により濃縮され、血漿は、ＲＢＣの容積を８０％にするように取り除かれ、次いで、１００ｍｌの添加溶液が無菌的に添加される。得られた懸濁液は約５５％のＲＢＣ容積画分を有する。従来のＦＤＡ認可添加溶液中に貯蔵されたＲＢＣは、容認され得る（ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）２４時間でのインビボ回復に対しては、６週間だけ貯蔵できる。
【０００４】
液体保存においてＲＢＣのインビボ回復特性を増大させるために、添加溶液および貯蔵プロセスを改善する試みが行われた。「Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｉｎ Ｒｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｅｖａｔｉｏｎ−７．Ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｗｉｔｈ Ａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ａｄｄｉｔｉｖｅ Ｓｏｌｉｔｉｏｎ」、Ｇｒｅｅｎｗａｌｔら、Ｖｏｘ．Ｓａｎｇ．：６５．８７−９４（１９９３）において、その著者らは、ｍＭ濃度で以下を含む実験的添加溶液（ＥＡＳ−２）が、ヒトＲＢＣの貯蔵有効期間を、現在の標準である５〜６週間から改善れた標準である８〜９週間まで延長することにおいて有用であることを決定した：２０ ＮＨ4Ｃｌ、３０ Ｎａ2ＨＰＯ4、２ アデニン、１１０ デキストロース、５５ マンニトール、ｐＨ７．１５。しかし、媒質中で貯蔵された濃縮ＲＢＣは、直接注入可能ではなく、添加溶液中のアンモニウムの存在に起因して、輸血の前に洗浄工程を用いた上清の除去が必要であった。
【０００５】
「Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｉｎ Ｒｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｅｖａｔｉｏｎ−８．Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ Ｒｅｄ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ａｄｄｉｔｉｖｅ Ｓｏｌｉｔｉｏｎ」、Ｖｏｘ．Ｓａｎｇ．６７：１３９−１４３（１９９４）において、Ｇｒｅｅｎｗａｌｔらは、９週間で濃縮赤血球の７３％の回復を可能にした実験的添加溶液（ＥＡＳ−２５）を記載した。しかし、得られたＲＢＣユニットは約１％のグリセロールを含んでいたため、ヒトにおいて大量に輸血するためには安全ではなかった。
【０００６】
「Ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ Ｒｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｔ ４℃」、Ｔｒａｎｓｆｕｓ．Ｓｃｉ．１５：１０５−１１５（１９９４）、Ｍｅｒｙｍａｎらにおいて、２７週間程度の期間にわたって低ヘマトクリットで非常に希釈された懸濁物中で貯蔵したＲＢＣの容認され得る生存性が決定された。しかし、このような貯蔵ＲＢＣ懸濁物は、それらのカリウムおよびアンモニウムの高含有量、ならびにそれらのＲＢＣの低容積画分に起因して、直接輸血するには容認できなかった。
【０００７】
結論として、ＲＢＣ貯蔵懸濁物を直接ヒトに輸血できるようにし、かつ容認できるＲＢＣのインビボ回復の維持を可能にすると同時に、従来の溶液およびプロセスを超える、ヒトＲＢＣの貯蔵時間を増加させる改善された添加溶液およびプロセスの必要性が依然としてある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、上記で議論した必要性を満たす。本発明は、冷蔵条件下でヒト赤血球（ＲＢＣ）の貯蔵に有用な新規な添加物溶液に関する。本発明はまた、この添加物溶液を使用して、約１〜６℃にて約１０週間までＲＢＣを保存する方法に関する。
【０００９】
本発明に従う添加物溶液およびプロセスは、ヒトにおいては直接的には注入可能な溶液において延長された時間、ヒトＲＢＣの生存可能な貯蔵を可能にする。
【００１０】
それゆえ、本発明の目的は、ヒトＲＢＣの貯蔵のための添加物溶液を提供することであり、この溶液は、ＲＢＣの容認され得る回復を維持しながら、約１〜約６℃でのＲＢＣの貯蔵時間を実質的に増加する。
【００１１】
本発明の目的はまた、ヒトＲＢＣの貯蔵のための添加物溶液を提供することであり、この溶液は、生理学的に安全であり、かつ莫大な量でのヒトへの直接注入に適切である。
【００１２】
本発明のなお別の目的は、ヒトＲＢＣを約９〜約１０週間、約１〜約６℃にて、ＲＢＣの容認され得る２４時間インビボ部分回復（２４−ｈｏｕｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ）を伴って貯蔵する方法を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的はまた、約１〜約６℃での約９〜１０週間の貯蔵後には、ヒトに直接的に注入可能である、新規なＲＢＣ貯蔵懸濁物を提供することである。
【００１４】
本発明の目的に従って前述および他の目的を達成するために、本発明者らは、ＲＢＣを保存するための新規な添加物溶液を開発した。この溶液は、ＲＢＣを保存するに十分な量のアデニン、デキストロース、Ｎａ2ＨＰＯ4、マンニトール、および少なくとも１つの生理学的に受容可能なナトリウム塩を含む水溶液を含む。この添加物溶液は、ＲＢＣを貯蔵するための方法に有用であり、この方法は以
下の工程を含む：
（ａ）ＲＢＣおよび血漿を含む全血のサンプルを抗凝固剤溶液と混合し、それにより全血の懸濁物を形成する工程；
（ｂ）全血懸濁物を処理して、血漿からＲＢＣを分離し、それにより濃縮ＲＢＣを形成する工程；
（ｃ）本発明に従って、濃縮ＲＢＣを、適切な量の添加物溶液と混合し、それによりＲＢＣの懸濁物を形成する工程；
（ｄ）ＲＢＣの懸濁物を、約１〜約６℃まで冷却する工程；ならびに （ｅ）冷却したＲＢＣの懸濁物を、標準的な血液バンク手順に従って、約９〜約１０週間貯蔵する工程。
【００１５】
本発明に従って生成されたＲＢＣ懸濁物は、貯蔵の約９〜約１０週後に、治療的に十分な量の回復可能なＲＢＣを提供し、そしてＲＢＣの輸血のために確立された公知の標準に従うさらなる処理をせずに、ヒトに直接的に注入可能である。
（項目１） 約１〜６℃での赤血球の長期貯蔵のための添加物溶液であって、該溶液は、約１〜３ｍＭのアデニン、約２０〜１１５ｍＭのデキストロース
、約４〜１５ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、約１５〜６０ｍＭのマンニトール、および約２０〜１３０ｍＭの生理学的に受容可能なナトリウム塩を含む、添加物溶液。
（項目２） 前記溶液が、約２００〜約３１０の浸透圧モル濃度を有する、項目１に記載の懸濁媒質。
（項目３） 前記浸透圧モル濃度が、約２２１から約２８０ｍＯｓｍである、項目２に記載の懸濁媒質。
（項目４） 前記浸透圧モル濃度が、約２４０から２５６ｍＯｓｍである、項目３に記載の懸濁媒質。
（項目５） ｐＨが約７〜約９である、項目１に記載の懸濁媒質。
（項目６） 前記ｐＨが約８．０〜約８．８である、項目５に記載の懸濁媒質。
（項目７） 前記ｐＨが約８．４〜８．６である、項目６に記載の懸濁媒質。
（項目８） 赤血球（ＲＢＣ）を延長した時間保存する方法であって、以下：
（ａ）貯蔵されるべき該ＲＢＣおよび血漿を含む全血のサンプルを抗凝固剤溶液と混合し、それにより全血の懸濁物を形成する工程；
（ｂ）該全血懸濁物を処理して、該血漿から該ＲＢＣを濃縮し、それにより濃縮ＲＢＣを形成する工程；
（ｃ）該濃縮ＲＢＣを、適切な量の添加物溶液と混合し、それによりＲＢＣの懸濁物を形成する工程であって、該溶液は、約１〜３ｍＭのアデニン、約２０〜１１５ｍＭのデキストロース、約４〜１５ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、約１５〜６０ｍＭのマンニトール、および約２０〜１３０ｍＭの生理学的に受容可能なナトリウム塩を含み、約２００〜約３１０ｍＯｓｍの浸透圧モル濃度および約７〜約９のｐＨを有する、工程；
（ｄ）該ＲＢＣの懸濁物を、約１〜約６℃まで冷却する工程；ならびに （ｅ）該冷却したＲＢＣの懸濁物を、標準的な血液バンク手順に従って、約９〜約１０週間貯蔵する工程、
を包含する、方法。
（項目９） 前記浸透圧モル濃度が、約２２１から２８０ｍＯｓｍである、項目８に記載の方法。
（項目１０） 前記浸透圧モル濃度が、約２４０から２５６ｍＯｓｍである、項目９に記載の方法。
（項目１１） 前記ｐＨが約８．０〜８．８である、項目８に記載の方法。
（項目１２） 前記ｐＨが約８．４〜８．６である、項目１１に記載の方法。
（項目１３） 前記ＲＢＣ懸濁物におけるＲＢＣの濃度が、全懸濁物の約２５〜約５０％である、項目８に記載の方法。
（項目１４） 前記ＲＢＣ懸濁物におけるＲＢＣの濃度が、全懸濁物の３５〜約４５である、項目１３に記載の方法。
（項目１５） 前記ＲＢＣ懸濁物におけるＲＢＣの濃度が、全懸濁物の約４３％である、項目１３に記載の方法。
（項目１６） 赤血球（ＲＢＣ）の貯蔵懸濁物であって、該懸濁物は、溶液中に懸濁された赤血球（ＲＢＣ）を含み、該溶液は、約１〜３ｍＭのアデニン、約２０〜１１５ｍＭのデキストロース、約４〜１５ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、約１５〜６０ｍＭのマンニトール、および約２０〜１３０ｍＭの生理学的に受容可能なナトリウム塩を含む、貯蔵懸濁物。
（項目１７） 前記溶液が、約２００〜約３１０ｍＯｓｍの浸透圧モル濃度および約７〜約９のｐＨを有し、該溶液中に懸濁されたＲＢＣの容量割合が、総溶液の２５〜５０％である、項目１６に記載の赤血球（ＲＢＣ）の貯蔵懸濁物。
（項目１８） 前記懸濁物が、約１〜約６℃の温度にて約８〜約９週間貯蔵されている、項目１７に記載の懸濁物。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、５〜８週の範囲の期間の種々の溶液中に貯蔵されたＲＢＣの２４時間インビボ回復を実証する。
【図２】図２は、８〜９週の範囲の期間のＥＡＳ−６１（本発明に従う添加物溶液）中に貯蔵されたＲＢＣの２４時間インビボ回復を実証する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（発明の詳細な説明）
本発明の目的に関して、用語「回復」は、ヒトドナーに再注入した後の２４時間にわたり、循環中に留まる貯蔵ＲＢＣの画分を示すために、本明細書中で使用される。
【００１８】
用語「長期化した」または「延長した」貯蔵は、６週間より長く約１０週間までの期間にわたって、容認されるＲＢＣの回復を伴う、ＲＢＣの保存または貯蔵を示すために本明細書中で使用される。
【００１９】
本発明に従う添加溶液は、ＲＢＣを保存するに適切な濃度の、アデニン、デキストロース、Ｎａ2ＨＰＯ4、マンニトール、および少なくとも１つの生理学的に受容可能なナトリウム塩の水溶液を含む。概して、この溶液は、約１〜３ｍＭのアデニン、約２０〜１１５ｍＭのデキストロース、約４〜１５ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、約１５〜６０ｍＭのマンニトール、および約２０〜１３０ｍＭの、少なくとも１つの生理学的に受容可能なナトリウム塩を含む。好ましくは、アデニンは、約２ｍＭであり、デキストロースは約５０〜１１０ｍＭであり、Ｎａ2ＨＰＯ4は約９〜１２ｍＭであり、マンニトールは約２０〜５０ｍＭであり、そして少なくとも１つの生理学的に受容可能なナトリウム塩は約２５〜７５ｍＭである。Ｎａ2ＨＰＯ4およびＮａＨ2ＰＯ4の組み合わせもまた使用され得る。
【００２０】
本発明の媒質において有用な適切なナトリウム塩としては、ヒトにおいて生理学的に受容可能なナトリウム陽イオンを含有する塩化合物が挙げられる。好ましいナトリウム塩としては、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。最も好ましくは、この媒質は、約２０〜１００ｍＭの塩化ナトリウムおよび０〜５３ｍＭの酢酸ナトリウムを含む。
【００２１】
添加溶液のｐＨは、室温で約７〜９の範囲に維持される。好ましくは、本発明の添加溶液のｐＨは、約８〜８．８の範囲にある。最も好ましくは、この添加溶液のｐＨは、約８．４〜８．６である。
【００２２】
本発明の懸濁媒質の浸透圧モル濃度は、約２００〜３１０ ｍＯｓｍの範囲にある。好ましくは、この浸透圧モル濃度は、約２２１〜２８０ｍＯｓｍの範囲にある。最も好ましくは、この添加溶液の浸透圧モル濃度は、約２４０〜２５６ｍＯｓｍである。
【００２３】
本発明において有用なＲＢＣは、血漿から分離され、かつ成分製造（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ）の通常過程で抗凝固溶液中に再懸濁されたＲＢＣである。簡潔に述べると、ＲＢＣおよび血漿を含む標準的全血サンプル（４５０±５０ｍｌ）を抗凝固溶液（約６３ｍｌ）と混合して、全血の懸濁物を形成する。その後、この全血懸濁物を遠心分離して、ＲＢＣと血漿とを分離し、このことによって濃縮ＲＢＣを形成する。
【００２４】
適切な抗凝固剤としては、ＲＢＣの貯蔵に関して公知の従来の抗凝固剤が挙げられる。好ましくは、この抗凝固剤は、５．５〜８．０のｐＨを有するクエン酸塩抗凝固剤（例えば、ＣＰＤ、半強度の（ｈａｌｆ−ｓｔｒｅｎｇｔｈ）ＣＰＤなどが挙げられる。最も好ましい抗凝固剤は、ＣＰＤである。
【００２５】
本発明の方法に従って、添加溶液は、細胞懸濁物において回復可能なＲＢＣの治療的に有効な量を提供するに十分な量で、濃縮ＲＢＣ懸濁物に添加される。好ましくは、この添加溶液は、約１４０ｍｌ〜約４００ｍｌの範囲の容量、好ましくは約１８０ｍｌ〜約３００ｍｌの容量、最も好ましくは約２００ｍｌの容量で添加される。
【００２６】
細胞懸濁物（すなわち、添加溶液の添加後）中のＲＢＣ容積画分は、総懸濁物の約２７〜５０％である。より好ましくは、細胞懸濁物中のＲＢＣ容積画分は、約３５〜４５％である。最も好ましくは、細胞懸濁物中のＲＢＣ容積画分は、総懸濁物の約４３％である。
【００２７】
次いで、ＲＢＣ懸濁液を、保留したアリコートの容量に依存して、異なるサイズの収集バックまたはＰＶＣ輸送パックのいずれかを使用して、標準的なポリビニルクロライド（ＰＶＣ）血液保留バックに保留する。このＲＢＣ懸濁液を、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｓｆｕｃｉｏｎ（編集者ら：Ｐｅｔｚ＆Ｓｗｉｓｈｅｒ、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ−Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．１９８１）に記載されるような標準的な血液バンク手順に従って、約１〜６℃で保留する。本明細書中の以下および先に引用される全ての文献は、本明細書によって、本明細書に対する参考として援用される。
【００２８】
任意の特定の理論または説明に縛られることなく、本発明に従う高容量の添加溶液中に保留される場合、漸増容量の栄養溶液は、漸増質量の基質が、代謝性消費産物の希釈のために溶質を提供しそれによってグルコース代謝のフィードバック阻害を低下させつつ、受容可能な濃度にて送達されることを可能にする。
【００２９】
本発明の添加溶液の別の特徴は、それらが保留の間に初めにＲＢＣの腫脹、次いで赤血球容量の緩やかな減少を生じることであるとさらに仮定される。このようなプロセスは、「容量減少の調節」と呼ばれている。このプロセスの間、ＲＢＣに存在するチロシンホスファターゼ活性が抑制されるか、またはチロシンキナーゼが活性化されるかのいずれかであると想定される。これらの酵素の両方は、これらの細胞の膜に豊富であることが実証されている（Ｚｉｐｓｅｒ，Ｙ．およびＫｏｓｏｗｅｒ，Ｎ．Ｓ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１４：８８１；Ｍａｌｌｏｚｚｉ Ｃ．ら（１９９７）ＦＡＳＥＢ Ｊ．１１：１２８１）。ＲＢＣ膜におけるバンド３タンパク質の正味のリン酸化は、バンド３に対するそれらの結合状態からの細胞質におけるホスホフルクトキナーゼ、アルドラーゼおよびグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼの放出を生じると予測される（Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｍ．Ｌ．ら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：４１０６；Ｃｏｓｓｉｎｓ，Ａ．Ｒ．およびＧｉｂｓｏｎ Ｊ．Ｓ．（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐｅｒ．Ｂｉｏｌ．２００：３４３；Ｌｏｗ，Ｐ．Ｓ．ら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１４６２７；Ｌｏｗ，Ｐ．Ｓ．ら（１９９５）Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ １８４：１９６）。解糖経路におけるこれらの３つの酵素のアベイラビリティーは、ＲＢＣによるグルコース代謝を増大させ、それによってＲＢＣにおける受容可能なレベルのＡＴＰレベルを促進すると予期される。
【００３０】
本明細書中に記載される実施例および実施態様は、例示の目的のみのためであり、そしてそれらを鑑みる種々の改変または変化は、本出願および添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれるべきであることが理解される。
【００３１】
以下の材料および方法を、以下の実施例に使用した。
【００３２】
（添加溶液の調製）本発明に従う添加溶液を、水溶液中で成分を混合することによって調製した。アデニンを、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）から得た。使用された他の化学物質は、ＡＣＳグレードであり、そしてＦｉｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）から得た。この添加溶液の無菌性を、充填ベル（ｆｉｌｌｉｎｇ ｂｅｌｌ）を有する０．２２μｍフィルター（Ｓｔｅｒｉｖｅｘ−ＧＸ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を通じて１Ｌの無菌輸送パック（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＩＬ）中に濾過することによって達成
した。無菌性を培養によって確認した。
【００３３】
Ｏｒｉｏｎ ｐＨメーター（Ｍｏｄｅｌ ９００Ａ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｏｒｉｏｎ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用して、ｐＨを測定した。浸透圧モル濃度を、凝固点降下によって測定した（Ｏｓｍｅｔｔｅ ＴＭ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｕｄｂｕｒｙ，ＭＡ）。
【００３４】
（血液サンプル）血液バンクアメリカ協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋｓ）ならびに食品医薬品局の基準により容認され得る血液ドナーを使用した。血液の標準的なユニット（４５０ｍｌ）を、６３ｍｌのＣＰＤ ポリビニル−クロライドバックを用いて収集した。血液全体の各ユニットを遠心分離し、そして血小板に富む血漿を、サテライトバックに急いで移した。規定された容量における添加溶液を添加し、そしてこのユニットを、規定された期間にわたって１〜６℃で保留した。
【００３５】
（インビボ試験）保留後、二重放射性同位体手順（Ｍｏｒｏｆｆ，Ｇ．ら（１９８４）Ｔｒａｎｓｆｕｃｉｏｎ ２４：１０９〜１１４；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｓｔａｎｄａｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ．Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅ Ｒｅｄ−Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ（１９８０）４５：６５９〜６６６））を使用して、インビボでのＲＢＣ回復を、自系での再注入の２４時間後に測定した。簡潔には、保留された血液サンプルを、51Ｃｒで標識した。同時に、新鮮な血液サンプルを、ボランティアから収集し、そして99mＴｃ（テクネチウムＴｃ−９９ｍで標識された赤血球パッケージインサートの調製のためのＵｌｔｒａｔａｇ ＲＢＣキット、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で標識した。放射性標識された赤血球の注意深く測定されたアリコートを混合し、そして迅速に再注入した。血液サンプルを、再注入のすぐ後に６０分間の定期間隔で、そして再度２４時間で収集した。このサンプルの放射活性を、γカウンター（Ｗａｌｌａｃ ＣＬＩＮＧＡＭＭＡ Ｔｗｉｎ ２、Ｍｏｄｅｌ １２７２、Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ）で測定した。99ｍＴｃ放射性標識細胞からのγ射出を、再注入の後３０分間で収集したサンプルにおいて測定し、独立したＲＢＣ容量を決定するために使用した。51Ｃｒ標識細胞からの活性を、遅延したサンプルにおいて測定し、そして使用して、輸注したＲＢＣの回復を算定した。この結果を、インビボでの２４時間ＲＢＣ回復百分率として表した。
【００３６】
（実施例Ｉ）
保留後のＲＢＣ回復を、自系２４時間回復画分として測定した。ＣＰＤＡ−１に５週間保留された全血、ＣＰＤＡ−１に５週間保留された濃縮赤血球、ＡＳ−３溶液に６および７週間保留された濃縮赤血球を、ＥＡＳ−６１（本発明に従う添加溶液）中に７〜８週間保留された濃縮赤血球と比較した。
【００３７】
ＥＡＳ−６１の成分を、以下の表１に記載する。この溶液の室温でのｐＨは、８．５８であり、そしてこの測定された総浸透圧モル濃度は、２５６ｍＯｓｍ／Ｋｇ Ｈ2Ｏであった。
【００３８】
【表１】
１０のボランティアは、添加溶液ＥＡＳ−１中に７週間保留し、そして１０人は、８週間であった。
【００３９】
結果（図１に示される）は、本発明の２００ｍｌの添加溶液中に保留された、インビボでの２４時間ＲＢＣ回復百分率が、７および８週間の保留後に８０％を超えることを示す。比較によって、７週間の保留後の、１００ｍｌのＡＳ−３におけるＲＢＣ回復百分率は、約７０％未満であり、そして添加溶液がないＣＰＤＡー１では、濃縮ＲＢＣの５週間のみの保留後には、８０％未満であった。許可された溶液の値は、図１の説明文に見出される参照文献からである。
【００４０】
（実施例２）
ＥＡＳ−１中での８および９週間の保留後のＲＢＣ回復もまた、決定した。２００ｍｌの添加溶液を、１ユニットの血液に由来する濃縮細胞に添加し、そして１〜６℃で保留した。１０ユニットの８週間での、および１０ユニットの９週間でのインビボ試験の結果を、ＲＢＣのインビボでの２４時間回復百分率として表し、そして図２に記録する。
【００４１】
図２に示されるように、本発明の２００ｍｌの添加溶液中に保留されたＲＢＣの百分率回復は、９週間の保留後には８１％であった。
【００４２】
結果は、ＲＢＣが本発明に従う２００ｍｌの添加溶液中で少なくとも９週間保留され得ること示し、これは、インビボでの満足のいく回復である。
【００４３】
（実施例３）
保留されたＲＢＣの有用な貯蔵期限を増大させる試みは、添加溶液の容量を増大させることによって、およびこの溶液において異なる塩（すなわち、ＮａＣｌおよび酢酸Ｎａ）の濃度を変更することによっての両方で進行中である。
【００４４】
インビトロ試験を、本発明に従う添加溶液で、種々の容量レベルにて実行する。インビトロ測定には、スパンへマトクリット、上清ヘモグロブリン、溶血百分率、添加溶液を血液と混合した後の添加溶液および上清のミリ浸透圧モル濃度、完全血球数（ＣＢＣ）、平均血球容積（ＭＣＶ）、平均血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）、血球外ｐＨおよび血球内ｐＨ、アデノシン−５−トリホスフェート（ＡＴＰ）、ＤＰＧ（２，３−ジホスホグリセレート）、グルコース、カリウム、無機リン酸（Ｐｉ）および乳酸の定量、ならびにＲＢＣ形態が含まれる。
以下の表２に記載されるような、漸増容量の添加溶液を使用するインビトロ研究は、現在進行中である。
【００４５】
４００ｍｌまでの漸増容量のＥＡＳ−６４中でのＲＢＣの３週間までの保留についてのデータ（表３〜６に要約される）は、表２に記載される本発明に従う添加溶液が、ＡＴＰ値の低下ならびに低い溶血およびカリウム漏出により示されるような保留の改善を示唆する。
【００４６】
【表２】
【００４７】
【表３】
【００４８】
【表４】
【００４９】
【表５】
【００５０】
【表６】
これらの結果は、希釈が本発明の添加溶液で達成された優れた回復を少なくとも部分的に担うことを示す。さらに、インビトロおよびインビボ研究は、約１１週間までのＲＢＣの保留に最良の容量および組成を決定するために進行中である。
【技術分野】
【０００１】
（諸言）
全血貯蔵は、１９１７年にＲｅｂｅｒｔｓｏｎにより初めて示された。酸−クエン酸塩−デキストロース（ＡＣＤ）およびクエン酸塩−リン酸塩−デキストロース溶液（ＣＰＤ）は、引き続き、血液の２１日間の貯蔵を立証した。アデニンを有するＣＰＤ（ＣＰＤ−１）が後に導入され、そして貯蔵血液の有効期間を５週間まで延長するために使用された。これらの溶液中で貯蔵された赤血球（ＲＢＣ）は、ヒトドナーに再注入して戻して２４時間後に、このような細胞が循環中で生存できなかったことにより決定されるように、約５〜６週間後に確実に劣化を示した。代謝老廃物（すなわち、乳酸および水素イオン）の濃度が増加するにつれ、連続した冷蔵貯蔵の間に漸減速度でグルコースが消費されることが観察された。このようなグルコース代謝速度の減少は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の枯渇を導く。このことは、この細胞が循環中に戻されたときのＲＢＣの回復と直接、相関する。
【背景技術】
【０００２】
全血から赤血球（ＲＢＣ）を分離した後に、それらを保存するための添加溶液を開発することにより、特にＲＢＣの必要性に合わせて調整される処方物の設計が可能になった。添加溶液（例えば、Ａｄｓｏｌ（登録商標）（ＡＳ−１）、Ｎｕｔｒｉｃｅｌ（登録商標）（ＡＳ−３）、Ｏｐｔｏｓｏｌ（登録商標）（ＡＳ−５）およびＥｒｙｔｈｒｏ−Ｓｏｌ（登録商標））は、４℃でのＲＢＣの貯蔵を延長するために設計された。
【０００３】
いまや、採取された全血のほとんど全ては、成分に分けられ、そしてＲＢＣ画分は、濃縮ＲＢＣとして貯蔵される。添加溶液系中に引き上げられた血液に関しては、ＲＢＣは、遠心分離により濃縮され、血漿は、ＲＢＣの容積を８０％にするように取り除かれ、次いで、１００ｍｌの添加溶液が無菌的に添加される。得られた懸濁液は約５５％のＲＢＣ容積画分を有する。従来のＦＤＡ認可添加溶液中に貯蔵されたＲＢＣは、容認され得る（ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）２４時間でのインビボ回復に対しては、６週間だけ貯蔵できる。
【０００４】
液体保存においてＲＢＣのインビボ回復特性を増大させるために、添加溶液および貯蔵プロセスを改善する試みが行われた。「Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｉｎ Ｒｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｅｖａｔｉｏｎ−７．Ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｗｉｔｈ Ａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ａｄｄｉｔｉｖｅ Ｓｏｌｉｔｉｏｎ」、Ｇｒｅｅｎｗａｌｔら、Ｖｏｘ．Ｓａｎｇ．：６５．８７−９４（１９９３）において、その著者らは、ｍＭ濃度で以下を含む実験的添加溶液（ＥＡＳ−２）が、ヒトＲＢＣの貯蔵有効期間を、現在の標準である５〜６週間から改善れた標準である８〜９週間まで延長することにおいて有用であることを決定した：２０ ＮＨ4Ｃｌ、３０ Ｎａ2ＨＰＯ4、２ アデニン、１１０ デキストロース、５５ マンニトール、ｐＨ７．１５。しかし、媒質中で貯蔵された濃縮ＲＢＣは、直接注入可能ではなく、添加溶液中のアンモニウムの存在に起因して、輸血の前に洗浄工程を用いた上清の除去が必要であった。
【０００５】
「Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｉｎ Ｒｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｅｖａｔｉｏｎ−８．Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ Ｒｅｄ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ａｄｄｉｔｉｖｅ Ｓｏｌｉｔｉｏｎ」、Ｖｏｘ．Ｓａｎｇ．６７：１３９−１４３（１９９４）において、Ｇｒｅｅｎｗａｌｔらは、９週間で濃縮赤血球の７３％の回復を可能にした実験的添加溶液（ＥＡＳ−２５）を記載した。しかし、得られたＲＢＣユニットは約１％のグリセロールを含んでいたため、ヒトにおいて大量に輸血するためには安全ではなかった。
【０００６】
「Ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ Ｒｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｔ ４℃」、Ｔｒａｎｓｆｕｓ．Ｓｃｉ．１５：１０５−１１５（１９９４）、Ｍｅｒｙｍａｎらにおいて、２７週間程度の期間にわたって低ヘマトクリットで非常に希釈された懸濁物中で貯蔵したＲＢＣの容認され得る生存性が決定された。しかし、このような貯蔵ＲＢＣ懸濁物は、それらのカリウムおよびアンモニウムの高含有量、ならびにそれらのＲＢＣの低容積画分に起因して、直接輸血するには容認できなかった。
【０００７】
結論として、ＲＢＣ貯蔵懸濁物を直接ヒトに輸血できるようにし、かつ容認できるＲＢＣのインビボ回復の維持を可能にすると同時に、従来の溶液およびプロセスを超える、ヒトＲＢＣの貯蔵時間を増加させる改善された添加溶液およびプロセスの必要性が依然としてある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、上記で議論した必要性を満たす。本発明は、冷蔵条件下でヒト赤血球（ＲＢＣ）の貯蔵に有用な新規な添加物溶液に関する。本発明はまた、この添加物溶液を使用して、約１〜６℃にて約１０週間までＲＢＣを保存する方法に関する。
【０００９】
本発明に従う添加物溶液およびプロセスは、ヒトにおいては直接的には注入可能な溶液において延長された時間、ヒトＲＢＣの生存可能な貯蔵を可能にする。
【００１０】
それゆえ、本発明の目的は、ヒトＲＢＣの貯蔵のための添加物溶液を提供することであり、この溶液は、ＲＢＣの容認され得る回復を維持しながら、約１〜約６℃でのＲＢＣの貯蔵時間を実質的に増加する。
【００１１】
本発明の目的はまた、ヒトＲＢＣの貯蔵のための添加物溶液を提供することであり、この溶液は、生理学的に安全であり、かつ莫大な量でのヒトへの直接注入に適切である。
【００１２】
本発明のなお別の目的は、ヒトＲＢＣを約９〜約１０週間、約１〜約６℃にて、ＲＢＣの容認され得る２４時間インビボ部分回復（２４−ｈｏｕｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ）を伴って貯蔵する方法を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的はまた、約１〜約６℃での約９〜１０週間の貯蔵後には、ヒトに直接的に注入可能である、新規なＲＢＣ貯蔵懸濁物を提供することである。
【００１４】
本発明の目的に従って前述および他の目的を達成するために、本発明者らは、ＲＢＣを保存するための新規な添加物溶液を開発した。この溶液は、ＲＢＣを保存するに十分な量のアデニン、デキストロース、Ｎａ2ＨＰＯ4、マンニトール、および少なくとも１つの生理学的に受容可能なナトリウム塩を含む水溶液を含む。この添加物溶液は、ＲＢＣを貯蔵するための方法に有用であり、この方法は以
下の工程を含む：
（ａ）ＲＢＣおよび血漿を含む全血のサンプルを抗凝固剤溶液と混合し、それにより全血の懸濁物を形成する工程；
（ｂ）全血懸濁物を処理して、血漿からＲＢＣを分離し、それにより濃縮ＲＢＣを形成する工程；
（ｃ）本発明に従って、濃縮ＲＢＣを、適切な量の添加物溶液と混合し、それによりＲＢＣの懸濁物を形成する工程；
（ｄ）ＲＢＣの懸濁物を、約１〜約６℃まで冷却する工程；ならびに （ｅ）冷却したＲＢＣの懸濁物を、標準的な血液バンク手順に従って、約９〜約１０週間貯蔵する工程。
【００１５】
本発明に従って生成されたＲＢＣ懸濁物は、貯蔵の約９〜約１０週後に、治療的に十分な量の回復可能なＲＢＣを提供し、そしてＲＢＣの輸血のために確立された公知の標準に従うさらなる処理をせずに、ヒトに直接的に注入可能である。
（項目１） 約１〜６℃での赤血球の長期貯蔵のための添加物溶液であって、該溶液は、約１〜３ｍＭのアデニン、約２０〜１１５ｍＭのデキストロース
、約４〜１５ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、約１５〜６０ｍＭのマンニトール、および約２０〜１３０ｍＭの生理学的に受容可能なナトリウム塩を含む、添加物溶液。
（項目２） 前記溶液が、約２００〜約３１０の浸透圧モル濃度を有する、項目１に記載の懸濁媒質。
（項目３） 前記浸透圧モル濃度が、約２２１から約２８０ｍＯｓｍである、項目２に記載の懸濁媒質。
（項目４） 前記浸透圧モル濃度が、約２４０から２５６ｍＯｓｍである、項目３に記載の懸濁媒質。
（項目５） ｐＨが約７〜約９である、項目１に記載の懸濁媒質。
（項目６） 前記ｐＨが約８．０〜約８．８である、項目５に記載の懸濁媒質。
（項目７） 前記ｐＨが約８．４〜８．６である、項目６に記載の懸濁媒質。
（項目８） 赤血球（ＲＢＣ）を延長した時間保存する方法であって、以下：
（ａ）貯蔵されるべき該ＲＢＣおよび血漿を含む全血のサンプルを抗凝固剤溶液と混合し、それにより全血の懸濁物を形成する工程；
（ｂ）該全血懸濁物を処理して、該血漿から該ＲＢＣを濃縮し、それにより濃縮ＲＢＣを形成する工程；
（ｃ）該濃縮ＲＢＣを、適切な量の添加物溶液と混合し、それによりＲＢＣの懸濁物を形成する工程であって、該溶液は、約１〜３ｍＭのアデニン、約２０〜１１５ｍＭのデキストロース、約４〜１５ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、約１５〜６０ｍＭのマンニトール、および約２０〜１３０ｍＭの生理学的に受容可能なナトリウム塩を含み、約２００〜約３１０ｍＯｓｍの浸透圧モル濃度および約７〜約９のｐＨを有する、工程；
（ｄ）該ＲＢＣの懸濁物を、約１〜約６℃まで冷却する工程；ならびに （ｅ）該冷却したＲＢＣの懸濁物を、標準的な血液バンク手順に従って、約９〜約１０週間貯蔵する工程、
を包含する、方法。
（項目９） 前記浸透圧モル濃度が、約２２１から２８０ｍＯｓｍである、項目８に記載の方法。
（項目１０） 前記浸透圧モル濃度が、約２４０から２５６ｍＯｓｍである、項目９に記載の方法。
（項目１１） 前記ｐＨが約８．０〜８．８である、項目８に記載の方法。
（項目１２） 前記ｐＨが約８．４〜８．６である、項目１１に記載の方法。
（項目１３） 前記ＲＢＣ懸濁物におけるＲＢＣの濃度が、全懸濁物の約２５〜約５０％である、項目８に記載の方法。
（項目１４） 前記ＲＢＣ懸濁物におけるＲＢＣの濃度が、全懸濁物の３５〜約４５である、項目１３に記載の方法。
（項目１５） 前記ＲＢＣ懸濁物におけるＲＢＣの濃度が、全懸濁物の約４３％である、項目１３に記載の方法。
（項目１６） 赤血球（ＲＢＣ）の貯蔵懸濁物であって、該懸濁物は、溶液中に懸濁された赤血球（ＲＢＣ）を含み、該溶液は、約１〜３ｍＭのアデニン、約２０〜１１５ｍＭのデキストロース、約４〜１５ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、約１５〜６０ｍＭのマンニトール、および約２０〜１３０ｍＭの生理学的に受容可能なナトリウム塩を含む、貯蔵懸濁物。
（項目１７） 前記溶液が、約２００〜約３１０ｍＯｓｍの浸透圧モル濃度および約７〜約９のｐＨを有し、該溶液中に懸濁されたＲＢＣの容量割合が、総溶液の２５〜５０％である、項目１６に記載の赤血球（ＲＢＣ）の貯蔵懸濁物。
（項目１８） 前記懸濁物が、約１〜約６℃の温度にて約８〜約９週間貯蔵されている、項目１７に記載の懸濁物。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、５〜８週の範囲の期間の種々の溶液中に貯蔵されたＲＢＣの２４時間インビボ回復を実証する。
【図２】図２は、８〜９週の範囲の期間のＥＡＳ−６１（本発明に従う添加物溶液）中に貯蔵されたＲＢＣの２４時間インビボ回復を実証する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（発明の詳細な説明）
本発明の目的に関して、用語「回復」は、ヒトドナーに再注入した後の２４時間にわたり、循環中に留まる貯蔵ＲＢＣの画分を示すために、本明細書中で使用される。
【００１８】
用語「長期化した」または「延長した」貯蔵は、６週間より長く約１０週間までの期間にわたって、容認されるＲＢＣの回復を伴う、ＲＢＣの保存または貯蔵を示すために本明細書中で使用される。
【００１９】
本発明に従う添加溶液は、ＲＢＣを保存するに適切な濃度の、アデニン、デキストロース、Ｎａ2ＨＰＯ4、マンニトール、および少なくとも１つの生理学的に受容可能なナトリウム塩の水溶液を含む。概して、この溶液は、約１〜３ｍＭのアデニン、約２０〜１１５ｍＭのデキストロース、約４〜１５ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、約１５〜６０ｍＭのマンニトール、および約２０〜１３０ｍＭの、少なくとも１つの生理学的に受容可能なナトリウム塩を含む。好ましくは、アデニンは、約２ｍＭであり、デキストロースは約５０〜１１０ｍＭであり、Ｎａ2ＨＰＯ4は約９〜１２ｍＭであり、マンニトールは約２０〜５０ｍＭであり、そして少なくとも１つの生理学的に受容可能なナトリウム塩は約２５〜７５ｍＭである。Ｎａ2ＨＰＯ4およびＮａＨ2ＰＯ4の組み合わせもまた使用され得る。
【００２０】
本発明の媒質において有用な適切なナトリウム塩としては、ヒトにおいて生理学的に受容可能なナトリウム陽イオンを含有する塩化合物が挙げられる。好ましいナトリウム塩としては、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。最も好ましくは、この媒質は、約２０〜１００ｍＭの塩化ナトリウムおよび０〜５３ｍＭの酢酸ナトリウムを含む。
【００２１】
添加溶液のｐＨは、室温で約７〜９の範囲に維持される。好ましくは、本発明の添加溶液のｐＨは、約８〜８．８の範囲にある。最も好ましくは、この添加溶液のｐＨは、約８．４〜８．６である。
【００２２】
本発明の懸濁媒質の浸透圧モル濃度は、約２００〜３１０ ｍＯｓｍの範囲にある。好ましくは、この浸透圧モル濃度は、約２２１〜２８０ｍＯｓｍの範囲にある。最も好ましくは、この添加溶液の浸透圧モル濃度は、約２４０〜２５６ｍＯｓｍである。
【００２３】
本発明において有用なＲＢＣは、血漿から分離され、かつ成分製造（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ）の通常過程で抗凝固溶液中に再懸濁されたＲＢＣである。簡潔に述べると、ＲＢＣおよび血漿を含む標準的全血サンプル（４５０±５０ｍｌ）を抗凝固溶液（約６３ｍｌ）と混合して、全血の懸濁物を形成する。その後、この全血懸濁物を遠心分離して、ＲＢＣと血漿とを分離し、このことによって濃縮ＲＢＣを形成する。
【００２４】
適切な抗凝固剤としては、ＲＢＣの貯蔵に関して公知の従来の抗凝固剤が挙げられる。好ましくは、この抗凝固剤は、５．５〜８．０のｐＨを有するクエン酸塩抗凝固剤（例えば、ＣＰＤ、半強度の（ｈａｌｆ−ｓｔｒｅｎｇｔｈ）ＣＰＤなどが挙げられる。最も好ましい抗凝固剤は、ＣＰＤである。
【００２５】
本発明の方法に従って、添加溶液は、細胞懸濁物において回復可能なＲＢＣの治療的に有効な量を提供するに十分な量で、濃縮ＲＢＣ懸濁物に添加される。好ましくは、この添加溶液は、約１４０ｍｌ〜約４００ｍｌの範囲の容量、好ましくは約１８０ｍｌ〜約３００ｍｌの容量、最も好ましくは約２００ｍｌの容量で添加される。
【００２６】
細胞懸濁物（すなわち、添加溶液の添加後）中のＲＢＣ容積画分は、総懸濁物の約２７〜５０％である。より好ましくは、細胞懸濁物中のＲＢＣ容積画分は、約３５〜４５％である。最も好ましくは、細胞懸濁物中のＲＢＣ容積画分は、総懸濁物の約４３％である。
【００２７】
次いで、ＲＢＣ懸濁液を、保留したアリコートの容量に依存して、異なるサイズの収集バックまたはＰＶＣ輸送パックのいずれかを使用して、標準的なポリビニルクロライド（ＰＶＣ）血液保留バックに保留する。このＲＢＣ懸濁液を、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｓｆｕｃｉｏｎ（編集者ら：Ｐｅｔｚ＆Ｓｗｉｓｈｅｒ、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ−Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．１９８１）に記載されるような標準的な血液バンク手順に従って、約１〜６℃で保留する。本明細書中の以下および先に引用される全ての文献は、本明細書によって、本明細書に対する参考として援用される。
【００２８】
任意の特定の理論または説明に縛られることなく、本発明に従う高容量の添加溶液中に保留される場合、漸増容量の栄養溶液は、漸増質量の基質が、代謝性消費産物の希釈のために溶質を提供しそれによってグルコース代謝のフィードバック阻害を低下させつつ、受容可能な濃度にて送達されることを可能にする。
【００２９】
本発明の添加溶液の別の特徴は、それらが保留の間に初めにＲＢＣの腫脹、次いで赤血球容量の緩やかな減少を生じることであるとさらに仮定される。このようなプロセスは、「容量減少の調節」と呼ばれている。このプロセスの間、ＲＢＣに存在するチロシンホスファターゼ活性が抑制されるか、またはチロシンキナーゼが活性化されるかのいずれかであると想定される。これらの酵素の両方は、これらの細胞の膜に豊富であることが実証されている（Ｚｉｐｓｅｒ，Ｙ．およびＫｏｓｏｗｅｒ，Ｎ．Ｓ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１４：８８１；Ｍａｌｌｏｚｚｉ Ｃ．ら（１９９７）ＦＡＳＥＢ Ｊ．１１：１２８１）。ＲＢＣ膜におけるバンド３タンパク質の正味のリン酸化は、バンド３に対するそれらの結合状態からの細胞質におけるホスホフルクトキナーゼ、アルドラーゼおよびグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼの放出を生じると予測される（Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｍ．Ｌ．ら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：４１０６；Ｃｏｓｓｉｎｓ，Ａ．Ｒ．およびＧｉｂｓｏｎ Ｊ．Ｓ．（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐｅｒ．Ｂｉｏｌ．２００：３４３；Ｌｏｗ，Ｐ．Ｓ．ら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１４６２７；Ｌｏｗ，Ｐ．Ｓ．ら（１９９５）Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ １８４：１９６）。解糖経路におけるこれらの３つの酵素のアベイラビリティーは、ＲＢＣによるグルコース代謝を増大させ、それによってＲＢＣにおける受容可能なレベルのＡＴＰレベルを促進すると予期される。
【００３０】
本明細書中に記載される実施例および実施態様は、例示の目的のみのためであり、そしてそれらを鑑みる種々の改変または変化は、本出願および添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれるべきであることが理解される。
【００３１】
以下の材料および方法を、以下の実施例に使用した。
【００３２】
（添加溶液の調製）本発明に従う添加溶液を、水溶液中で成分を混合することによって調製した。アデニンを、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）から得た。使用された他の化学物質は、ＡＣＳグレードであり、そしてＦｉｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）から得た。この添加溶液の無菌性を、充填ベル（ｆｉｌｌｉｎｇ ｂｅｌｌ）を有する０．２２μｍフィルター（Ｓｔｅｒｉｖｅｘ−ＧＸ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を通じて１Ｌの無菌輸送パック（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＩＬ）中に濾過することによって達成
した。無菌性を培養によって確認した。
【００３３】
Ｏｒｉｏｎ ｐＨメーター（Ｍｏｄｅｌ ９００Ａ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｏｒｉｏｎ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用して、ｐＨを測定した。浸透圧モル濃度を、凝固点降下によって測定した（Ｏｓｍｅｔｔｅ ＴＭ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｕｄｂｕｒｙ，ＭＡ）。
【００３４】
（血液サンプル）血液バンクアメリカ協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋｓ）ならびに食品医薬品局の基準により容認され得る血液ドナーを使用した。血液の標準的なユニット（４５０ｍｌ）を、６３ｍｌのＣＰＤ ポリビニル−クロライドバックを用いて収集した。血液全体の各ユニットを遠心分離し、そして血小板に富む血漿を、サテライトバックに急いで移した。規定された容量における添加溶液を添加し、そしてこのユニットを、規定された期間にわたって１〜６℃で保留した。
【００３５】
（インビボ試験）保留後、二重放射性同位体手順（Ｍｏｒｏｆｆ，Ｇ．ら（１９８４）Ｔｒａｎｓｆｕｃｉｏｎ ２４：１０９〜１１４；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｓｔａｎｄａｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ．Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅ Ｒｅｄ−Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ（１９８０）４５：６５９〜６６６））を使用して、インビボでのＲＢＣ回復を、自系での再注入の２４時間後に測定した。簡潔には、保留された血液サンプルを、51Ｃｒで標識した。同時に、新鮮な血液サンプルを、ボランティアから収集し、そして99mＴｃ（テクネチウムＴｃ−９９ｍで標識された赤血球パッケージインサートの調製のためのＵｌｔｒａｔａｇ ＲＢＣキット、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で標識した。放射性標識された赤血球の注意深く測定されたアリコートを混合し、そして迅速に再注入した。血液サンプルを、再注入のすぐ後に６０分間の定期間隔で、そして再度２４時間で収集した。このサンプルの放射活性を、γカウンター（Ｗａｌｌａｃ ＣＬＩＮＧＡＭＭＡ Ｔｗｉｎ ２、Ｍｏｄｅｌ １２７２、Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ）で測定した。99ｍＴｃ放射性標識細胞からのγ射出を、再注入の後３０分間で収集したサンプルにおいて測定し、独立したＲＢＣ容量を決定するために使用した。51Ｃｒ標識細胞からの活性を、遅延したサンプルにおいて測定し、そして使用して、輸注したＲＢＣの回復を算定した。この結果を、インビボでの２４時間ＲＢＣ回復百分率として表した。
【００３６】
（実施例Ｉ）
保留後のＲＢＣ回復を、自系２４時間回復画分として測定した。ＣＰＤＡ−１に５週間保留された全血、ＣＰＤＡ−１に５週間保留された濃縮赤血球、ＡＳ−３溶液に６および７週間保留された濃縮赤血球を、ＥＡＳ−６１（本発明に従う添加溶液）中に７〜８週間保留された濃縮赤血球と比較した。
【００３７】
ＥＡＳ−６１の成分を、以下の表１に記載する。この溶液の室温でのｐＨは、８．５８であり、そしてこの測定された総浸透圧モル濃度は、２５６ｍＯｓｍ／Ｋｇ Ｈ2Ｏであった。
【００３８】
【表１】
１０のボランティアは、添加溶液ＥＡＳ−１中に７週間保留し、そして１０人は、８週間であった。
【００３９】
結果（図１に示される）は、本発明の２００ｍｌの添加溶液中に保留された、インビボでの２４時間ＲＢＣ回復百分率が、７および８週間の保留後に８０％を超えることを示す。比較によって、７週間の保留後の、１００ｍｌのＡＳ−３におけるＲＢＣ回復百分率は、約７０％未満であり、そして添加溶液がないＣＰＤＡー１では、濃縮ＲＢＣの５週間のみの保留後には、８０％未満であった。許可された溶液の値は、図１の説明文に見出される参照文献からである。
【００４０】
（実施例２）
ＥＡＳ−１中での８および９週間の保留後のＲＢＣ回復もまた、決定した。２００ｍｌの添加溶液を、１ユニットの血液に由来する濃縮細胞に添加し、そして１〜６℃で保留した。１０ユニットの８週間での、および１０ユニットの９週間でのインビボ試験の結果を、ＲＢＣのインビボでの２４時間回復百分率として表し、そして図２に記録する。
【００４１】
図２に示されるように、本発明の２００ｍｌの添加溶液中に保留されたＲＢＣの百分率回復は、９週間の保留後には８１％であった。
【００４２】
結果は、ＲＢＣが本発明に従う２００ｍｌの添加溶液中で少なくとも９週間保留され得ること示し、これは、インビボでの満足のいく回復である。
【００４３】
（実施例３）
保留されたＲＢＣの有用な貯蔵期限を増大させる試みは、添加溶液の容量を増大させることによって、およびこの溶液において異なる塩（すなわち、ＮａＣｌおよび酢酸Ｎａ）の濃度を変更することによっての両方で進行中である。
【００４４】
インビトロ試験を、本発明に従う添加溶液で、種々の容量レベルにて実行する。インビトロ測定には、スパンへマトクリット、上清ヘモグロブリン、溶血百分率、添加溶液を血液と混合した後の添加溶液および上清のミリ浸透圧モル濃度、完全血球数（ＣＢＣ）、平均血球容積（ＭＣＶ）、平均血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）、血球外ｐＨおよび血球内ｐＨ、アデノシン−５−トリホスフェート（ＡＴＰ）、ＤＰＧ（２，３−ジホスホグリセレート）、グルコース、カリウム、無機リン酸（Ｐｉ）および乳酸の定量、ならびにＲＢＣ形態が含まれる。
以下の表２に記載されるような、漸増容量の添加溶液を使用するインビトロ研究は、現在進行中である。
【００４５】
４００ｍｌまでの漸増容量のＥＡＳ−６４中でのＲＢＣの３週間までの保留についてのデータ（表３〜６に要約される）は、表２に記載される本発明に従う添加溶液が、ＡＴＰ値の低下ならびに低い溶血およびカリウム漏出により示されるような保留の改善を示唆する。
【００４６】
【表２】
【００４７】
【表３】
【００４８】
【表４】
【００４９】
【表５】
【００５０】
【表６】
これらの結果は、希釈が本発明の添加溶液で達成された優れた回復を少なくとも部分的に担うことを示す。さらに、インビトロおよびインビボ研究は、約１１週間までのＲＢＣの保留に最良の容量および組成を決定するために進行中である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１０−２６０８７２（Ｐ２０１０−２６０８７２Ａ）
【公開日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１７９０６８（Ｐ２０１０−１７９０６８）
【出願日】平成２２年８月９日（２０１０．８．９）
【分割の表示】特願２０００−５７１０１４（Ｐ２０００−５７１０１４）の分割
【原出願日】平成１１年８月３０日（１９９９．８．３０）
【出願人】（５０１０５９５７８）ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ アズ リプレゼンティド バイ ザ セクレタリー オブ ジ アーミイ，ウォルター リード アーミー インスティテュート オブ リサーチ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月９日（２０１０．８．９）
【分割の表示】特願２０００−５７１０１４（Ｐ２０００−５７１０１４）の分割
【原出願日】平成１１年８月３０日（１９９９．８．３０）
【出願人】（５０１０５９５７８）ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ アズ リプレゼンティド バイ ザ セクレタリー オブ ジ アーミイ，ウォルター リード アーミー インスティテュート オブ リサーチ (1)
【Ｆターム（参考）】
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