遺伝子変異検出法
ＤＮＡの増幅に用いるプライマーの少なくとも一つが、増幅されたＤＮＡが第１の標識物質により標識されるように第１の標識物質により標識されており、ハイブリダイゼーションプローブが第２の標識物質により標識されるとともに、ＤＮＡの増幅が行われる反応液に含まれており、ハイブリダイゼーションプローブの有する塩基配列が、ＤＮＡの増幅を阻害しないように設定されており、ハイブリッドの検出が第１の標識物質および第２の標識物質を利用してアフィニティークロマトグラフィーにより行われることにより、ＤＮＡの増幅のためのプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブを含む一つの反応系で、ＤＮＡの増幅およびハイブリダイゼーションを順次行い、反応液中のハイブリッドをアフィニティークロマトグラフィーにより検出する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、塩基配列の検出方法に関し、より詳しくは、点変異などの変異部位を含む塩基配列を含む塩基配列を検出することにより遺伝子の変異を検出する方法に関する。
【背景技術】
ゲノム上に数多く存在する遺伝子多型は、疾病への感受性や、薬剤代謝の個人差などに深く関連していると考えられている。これらの遺伝子多型の検出は、いわゆるオーダーメイド医療にとって必須であり、ゲノム科学の臨床応用における最重要研究課題のひとつに挙げられている。なかでも、遺伝子多型マーカーとしてＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一塩基置換による遺伝子多型）は最近とみに注目を浴びており、国際的にも巨額の研究費が投じられている。また一方、分子遺伝学研究の進歩によって、様々な遺伝性疾患における遺伝子変異がデータベースに蓄積されてきている。これを用い、すでに病因であることが明らかにされている既知の遺伝子変異をスクリーニングすることによって、遺伝病の診断や臨床病型の予測をおこなうことが可能となってきている。特に、特定集団内、あるいは人種を超えて高頻度に存在する遺伝子変異の場合、その診断的価値は高い。
以上のような遺伝子多型や遺伝子変異には、塩基置換、欠失、挿入、繰り返し配列数の相違などがあるが、その中で圧倒的に多数を占めているのが、一塩基置換による点変異である。ヒトゲノム研究の成果を臨床の場に還元していくためには、この点変異の簡便かつ迅速な検出法が不可欠である。
これまで点変異の検出法として、様々な手法が考案されてきた（Ｃｏｔｔｏｎ ＲＧＨ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ｐｐ．１−１９８，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｅ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９７参照）。代表的な方法としては、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＡＳＯ）法、対立遺伝子特異的増幅法、制限酵素消化法、リガーゼ連鎖反応、ミニシークエンス法などが挙げられる。これらの手法はいずれも、ＤＮＡ増幅後に、ハイブリダイゼーションや電気泳動をはじめとする煩雑な操作が必要とされる。一方、近年ヒトゲノム解析研究に対応するために開発された、ＴａｑＭａｎ法、インベーダーアッセイ（ｉｎｖａｄｅｐ ａｓｓａｙ）、ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）、質量分析計を用いるＴＯＦ−ＭＡＳＳ法などは、大量検体の処理に秀でているものの、高額の特殊専用機器を必要とし、臨床検査室レベルで簡単に施行できるものではない。また、遺伝子変異のスクリーニング法として広く用いられているＳＳＣＰ法、ケミカルクリーベッジ（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｌｅａｖａｇｅ）法およびＤＨＰＬＣ法は未知の遺伝子変異の大まかなスクリーニングに威力を発揮するが、既知変異の確実な検出には不適切である。さらに、シークエンス法を用いた点変異検出は、操作が複雑でコストも高く、既知変異の検出にはオーバースペックといわざるを得ない。上記のいずれの方法も、現段階では遺伝子解析実験室でおこなわれる特殊検査であり、臨床の現場（ベッドサイド）で迅速に実施することはきわめて困難である。
ＡＳＯ法に使用されるプローブとしては、従来は１５〜２５ｍｅｒが用いられている（Ｓａｉｋｉ ＲＫ，Ｅｒｌｉｃｈ ＨＡ．Ｄｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｓｃｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅｓ．Ｉｎ：Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ．ｐｐ．１１３−１２９，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９８参照）。また、ハイブリダイゼーションにおいて、標識プローブに競合するオリゴヌクレオチドを用いてプローブの特異性を増強させることが報告されている（Ｎｏｚａｒｉ Ｇ，Ｒａｈｂａｒ Ｓ，Ｗａｌｌａｃｅ ＲＢ．Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｏｆ ｔｈｃ ａｌｌｅｉｃ ｈｕｍａｎ β−ｇｌｏｂｉｎ ｇｅｎｅｓ βＡ，βＳ ａｎｄ βＣ ｕｓｉｎｇ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅｓ．Ｇｅｎｅ ４３：２３−２８，１９８６参照）。
【発明の開示】
本発明は、遺伝子の変異の簡便かつ迅速な検出法を提供することを目的とする。
本発明者らは、特定のプライマーおよびプローブを特定の条件で用いると、一つの反応系で核酸の増幅とハイブリダイゼーションを行うことができ、しかもハイブリダイゼーションにより形成したハイブリッドを容易に検出できるという知見を得、この知見に基づき、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下のものを提供する。
（１）ＤＮＡポリメラーゼを用いて、変異部位を含む検出対象塩基配列を含むＤＮＡの増幅を行う工程、増幅されたＤＮＡと、検出対象塩基配列に相補的である塩基配列を有するハイブリダイゼーションプローブとをハイブリダイズさせる工程、および、ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを検出する工程を含む塩基配列の検出方法であって、
ＤＮＡの増幅に用いるプライマーの少なくとも一つは、増幅されたＤＮＡが第１の標識物質により標識されるように第１の標識物質により標識されており、ハイブリダイゼーションプローブは第２の標識物質により標識されるとともに、ＤＮＡの増幅が行われる反応液に含まれており、ハイブリダイゼーションプローブの有する塩基配列は、ＤＮＡの増幅を阻害しないように設定されており、ハイブリッドの検出は第１の標識物質および第２の標識物質を利用してアフィニティークロマトグラフィーにより行われる前記方法。
（２）変異部位が点変異であり、ＤＮＡの増幅が行われる反応液が、増幅されたＤＮＡと標識されたハイブリダイゼーションプローブとのハイブリダイゼーションの特異性を高めるのに十分な量の、標識されたハイブリダイゼーションプローブの塩基配列と点変異の位置で１塩基異なる塩基配列を有しかつ標識されていないオリゴヌクレオチドをさらに含む（１）の方法。
（３）ＤＮＡの増幅がＰＣＲによる増幅である（１）または（２）の方法。
（４）ＤＮＡポリメラーゼを用いて、変異部位を含む検出対象塩基配列を含むＤＮＡの増幅を行うためのプライマーと、検出対象塩基配列に相補的である塩基配列を有するハイブリダイゼーションプローブと、アフィニティークロマトグラフィー用試験片とを含むキットであって、
ＤＮＡの増幅に用いるプライマーの少なくとも一つは、増幅されたＤＮＡが第１の標識物質により標識されるように第１の標識物質により標識されており、ハイブリダイゼーションプローブは第２の標識物質により標識され、ハイブリダイゼーションプローブの有する塩基配列は、ＤＮＡの増幅を阻害しないように設定されており、試験片は第１の標識物質および第２の標識物質を利用して増幅されたＤＮＡとハイブリダイゼーションプローブとのハイブリッドを検出できるものである前記キット。
（５）変異部位が点変異であり、標識されたハイブリダイゼーションプローブの塩基配列と点変異の位置で１塩基異なる塩基配列を有しかつ標識されていないオリゴヌクレオチドをさらに含む（４）のキット。
（６）プライマーがＰＣＲ用プライマーである（４）または（５）のキット。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の検出法の原理（正常ＤＮＡを検体とした場合）の説明図である。
図２は、本発明の検出法の原理（変異ＤＮＡを検体とした場合）の説明図である。
図３は、本発明の検出法の一例の操作の説明図である。
図４は、１７ｍｅｒのハイブリダイゼーションプローブを用いた場合の検出結果（クロマトグラムの写真）を示す。
図５は、１７ｍｅｒのハイブリダイゼーションプローブを用い、競合プローブを添加した場合の検出結果（クロマトグラムの写真）を示す。
図６は、種々の長さのハイブリダイゼーションプローブを用い、競合プローブを添加した場合の検出結果（クロマトグラムの写真）を示す。
図７は、１２ｍｅｒのハイブリダイゼーションプローブを用い、競合プローブを添加した場合の検出結果（クロマトグラムの写真）を示す。
図８は、種々の変異に関する検出結果（クロマトグラムの写真）を示す。
図９は、種々の変異に関する検出結果（クロマトグラムの写真）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
＜１＞本発明の検出法
本発明の検出法は、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、変異部位を含む検出対象塩基配列を含むＤＮＡの増幅を行う工程、増幅されたＤＮＡと、検出対象塩基配列に相補的である塩基配列を有するハイブリダイゼーションプローブとをハイブリダイズさせる工程、および、ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを検出する工程を含む塩基配列の検出方法であって、
ＤＮＡの増幅に用いるプライマーの少なくとも一つは、増幅されたＤＮＡが第１の標識物質により標識されるように第１の標識物質により標識されており、ハイブリダイゼーションプローブは第２の標識物質により標識されるとともに、ＤＮＡの増幅が行われる反応液に含まれており、ハイブリダイゼーションプローブの有する塩基配列は、ＤＮＡの増幅を阻害しないように設定されており、ハイブリッドの検出は第１の標識物質および第２の標識物質を利用してアフィニティークロマトグラフィーにより行われることを特徴とする。以下、各工程毎に説明する。
（１）ＤＮＡの増幅
ＤＮＡの増幅は、ＤＮＡポリメラーゼを用いて行われるものであれば、特に制限されず、ＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡを合成する段階を含む増幅方法を用いることができる。ＤＮＡの増幅の方法の例としては、ＰＣＲ法、ＴＭＡ法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＡＭＰ法などが挙げられる。
ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡを合成する場合には、プライマーが必要となる。プライマーは、増幅の方法および検出対象塩基配列に依存して公知の方法により設定される。本発明においては、ＤＮＡの増幅に用いるプライマーの少なくとも一つは、増幅されたＤＮＡが第１の標識物質により標識されるように第１の標識物質により標識される。
例えば、増幅がＰＣＲ法により行われる場合、プライマー対が用いられるが、少なくともその一方を標識することにより、増幅されたＤＮＡが標識されたものとなる。また、ＮＡＳＢＡ法およびＴＭＡ法により行われる場合には、ＤＮＡ合成段階に働くプライマーを、ＬＡＭＰ法の場合には、片方のインナープライマーを少なくとも標識することにより増幅されたＤＮＡが標識されたものとなる。
プライマーの標識は、ＤＮＡの合成反応を阻害しないように行われる。このような標識は公知の方法に従って行うことができ、通常にはプライマーの５’末端が標識される。
標識に用いられる標識物質は、それに対して生体特異的に結合する物質が存在するものであればよい。このような標識物質と、それに対して生体特異的に結合する物質の組み合わせとしては、抗原と抗体、酵素と阻害剤、糖鎖とレクチン、ホルモンと受容体、金属結合蛋白質と金属元素が挙げられる。具体的には、ジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン抗体、ビオチンとストレプトアビジンなどの組み合わせが挙げられる。これらの組み合わせにおいて、いずれが標識物質となってもよいが、通常には、分子量の小さい方が、標識物質として用いられる。
用いられるプライマーやＤＮＡの増幅の条件は、採用する増幅方法および検出対象配列に基づいて適したものが設定される。例えば、ＰＣＲ法については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄ．），Ｖｏｌｕｍｅ ２，Ｃｈａｐｔｅｒ ８，ｐｐ．８．１−８．１２６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，２００１、ＮＡＳＢＡ法については、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１，２５−３３（１９９１）、ＬＡＭＰ法については、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．１２，ｐｐ．ｉ−ｖｉｉ（２０００）をそれぞれ参照できる。
増幅において、鋳型となる検体ＤＮＡは、検査試料から通常の方法により調製できる。
検出対象配列は、変異部位を含む検出対象配列が特異的に増幅されるように、増幅の方法に合わせて適宜選択される。検出対象配列が含む変異部位は、通常には、遺伝子変異および遺伝子多型として知られている部位である。変異部位は、点変異でもよいし、挿入、欠失などの変異でもよい。
本発明の検出法の検出対象となる遺伝子変異および遺伝子多型の一般的な例としては、糖原病Ｉａ型の日本人患者で高頻度に認められるｇ７２７ｔ変異、中鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症の白人患者で高頻度に認められるａ９８５ｇ変異（Ｌｙｓ３２９Ｇｌｕ変異）、高グリシン血症のフィンランド人患者で高頻度に認められるＧＬＤＣ遺伝子のｇ１６９１ｔ変異（Ｓｅｒ５６４Ｉｌｅ変異）、薬剤代謝酵素遺伝子ＣＹＰ２Ｃ１９における遺伝子多型（ＣＹＰ２Ｃ１９＊２，ｇ６８１ａ）、アルコール代謝の個人差を決定するアルデヒド脱水素酵素２の遺伝子多型（Ｅ４８７Ｋ）、嚢胞性線維症膜貫通型調節蛋白質遺伝子のｄｅｌｔａＦ５０８欠失変異、テイザックス病のＨＥＸＡ遺伝子の１２７７ｉｎｓＴＡＴＣ挿入変異、乳癌のＢＲＣＡ１遺伝子の５３８２ｉｎｓＣ挿入変異、乳癌のＢＲＣＡ２遺伝子の６１７４ｄｅｌＴ欠失変異、血栓症凝固系第Ｖ因子遺伝子のＧ１６９１Ａ点変異などが挙げられるが、本発明の検出法の検出対象はこれらの例に限定されない。
糖原病Ｉａ型はグリコーゲン代謝経路におけるグルコース−６−ホスファターゼの異常によって生じ、主として肝臓に大量のグリコーゲンが蓄積する先天性糖代謝異常症で、常染色体劣性遺伝形式をとる。低血糖、肝腫大、低身長、腎障害、高脂質血症、高尿酸血症などが見られる。この酵素遺伝子におけるｇ７２７ｔ変異は、日本人症例における病因変異の約９０％を占める高頻度変異であり、ｍＲＮＡのスプライシング異常を生じる。ごく最近まで、本症診断には、肝臓組織を用いた酵素活性測定が行われていたが、遺伝子診断の出現によって肝生検が不要となった。本変異の日本人集団における保因者数は、約２００人に１人である。
非ケトーシス型高グリシン血症はグリシン解裂系酵素の異常によって生じ、新生児期にけいれんをはじめとする重篤な神経症状を呈する先天性アミノ酸代謝異常症（常染色体劣性遺伝）である。フィンランド人患者では、グリシン解裂系酵素のうちＧＬＤＣ遺伝子にｇ１６９１ｔ変異が高頻度（変異遺伝子の約７０％）に認められる。本変異はアミノ酸置換Ｓｅｒ５６４Ｉｌｅを生じる。
中鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症は脂肪酸β酸化経路において重要な役割を担う酵素（ｍｅｄｉｕｍ−ｃｈａｉｎ ａｃｙｌ−ＣｏＡ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＭＣＡＤ）の異常によって生じ、空腹・感染時の低血糖・意識障害をひきおこす先天性有機酸代謝異常症（常染色体劣性遺伝）である。しばしば、乳幼児突然死症候群や急性脳症（ライ症候群）と誤診されることが知られている。本酵素遺伝子におけるａ９８５ｇ変異は白人症例における病因変異の約９０％を占める高頻度変異であり、アミノ酸置換Ｌｙｓ３２９Ｇｌｕをひきおこす。また、本遺伝子変異の保因者は、白人集団で高率（英国では４０人に１人）に認められる。欧米では、このａ９８５ｇ変異を検出する遺伝子診断が本症の診断に広く用いられている。
ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子は、オメプラゾール（胃酸分泌抑制剤）などの代謝に重要な役割を果たしている。本遺伝子上のＳＮＰ多型であるＣＹＰ２Ｃ１９＊２は、エキソン５の６８１Ｇ＞Ａ変異によってスプライシング異常を生じるため、これらの薬剤の代謝活性を低下させる。このような多型を持つ人（ｐｏｏｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）では、投薬にあたって減量するする必要があり、投薬前に予め遺伝子型を決定できれば、臨床的に有利である。日本人集団における遺伝子の約２３％に、この遺伝子多型が認められる。
アルデヒド脱水素酵素２の遺伝子多型（Ｇｌｕ４８７Ｌｙｓ）は、東洋人に多く認められるＳＮＰで、アルコール代謝の個人差を決定する。遺伝子多型を有する酵素は活性が低く、アルコールから生じるアセトアルデヒドの代謝が遅くなるため、「酒に弱い」体質となる。日本人集団では約３０％がこの遺伝子多型のヘテロ接合子、約５％がホモ接合子である。
（２）ハイブリダイゼーション
増幅されたＤＮＡと、検出対象塩基配列に相補的である塩基配列を有するハイブリダイゼーションプローブとのハイブリダイゼーションは、特定のハイブリダイゼーションプローブが使用される他は、通常のハイブリダイゼーションと同様に行えばよい。
本発明で使用されるハイブリダイゼーションプローブは、第２の標識物質により標識され、ＤＮＡの増幅が行われる反応液に含まれており、ハイブリダイゼーションプローブの有する塩基配列は、ＤＮＡの増幅を阻害しないように設定される。
第２の標識物質は、第１の標識物質と異なる物質が用いられる他は、第１の標識物質について説明したのと同様である。ハイブリダイゼーションプローブの標識は、ハイブリダイゼーションを妨げないように公知の方法により行うことができる。ハイブリダイゼーションプローブの標識は、３’末端に行うことが好ましい。これによりＤＮＡの増幅反応中のオリゴヌクレオチドの鎖長の進展を防止するためである。鎖長の進展があった場合はＴｍ値が上昇し、たとえミスマッチがあってもハイブリダイズしてしまうおそれがある。
ハイブリダイゼーションプローブの塩基配列を、ＤＮＡの増幅を阻害しないように設定することは、通常には、ハイブリダイゼーションプローブのハイブリダイゼーションがＤＮＡの増幅の条件では生じないようにハイブリダイゼーションプローブの鎖長などを設定することにより行うことができる。
本発明で使用されるハイブリダイゼーションプローブの塩基配列は、ＤＮＡの増幅を阻害しないように設定されるので、ＤＮＡの増幅が行われる反応液に最初から含ませておくことができる。このため、ＤＮＡの増幅が終了した反応液を、そのまま、増幅されたＤＮＡとハイブリダイゼーションプローブとがハイブリダイズするような条件におくことにより、これらをハイブリダイズさせることができる。
ハイブリダイゼーションプローブの鎖長や、ハイブリダイズさせるときの条件は、ＤＮＡの増幅に用いる方法に応じて適宜設定される。ＤＮＡポリメラーゼを用いるＤＮＡの増幅では、ＤＮＡポリメラーゼの活性が発揮されるのに適した温度条件で増幅が行われるので、この温度でハイブリダイゼーションが生じないように鎖長が設定される。また、ハイブリダイゼーションが起こる温度は、ＤＮＡの増幅を妨げない限り、特に限定されないが、生成したハイブリッドが室温で解離しないものであることが好ましい。
ＤＮＡの増幅を阻害しないように塩基配列を設定する条件として具体的には、プライマーのＴｍ値に比べて、プローブのＴｍ値が２５〜４０℃（好ましくは３０〜３５℃）低くなるように設定することが挙げられる。
例えば、ＰＣＲ法の通常の条件を考慮すると、プローブは、通常には、１０ｍｅｒ〜１３ｍｅｒとなる。これは、アレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションのプローブとして、従来用いられている１５ｍｅｒ〜２５ｍｅｒ（上記非特許文献２参照）に比較してかなり短いものである。これまで、より長い鎖長のプローブが多用されてきた背景には、全ゲノム配列（３０億塩基対）の中で、４種塩基の組み合わせによる特異性を持ったプローブを作成するためには、少なくとも４の１５乗くらいが必要であるという論理があった。しかしながら、これは全ゲノム配列を対象にハイブリダイゼーションを行う場合であり、ＰＣＲ増幅された数百塩基のＤＮＡ断片を標的とする場合は、これほどの長さと特異性は要求されないと考えられるので、ハイブリダイゼーションの特異性は十分に維持される。
本発明の検出法を、任意の遺伝子変異や多型の検出に応用するにあたっては、ハイブリダイゼーションプローブを最適の鎖長にすることが必要である。これは、後述の実施例に記載されているように定型的な実験により決定することが可能である。本発明の検出法では、通常、極めて短いプローブを用いることから、１塩基長の差によって劇的な判定線形成の違いが認められる。偽陽性の出現や微弱な陽性反応が認められた場合には、Ｔｍ値をもとに設計したプローブよりも短いプローブあるいは長いプローブを作成し、最適のものを選択することが好ましい。この際、正常塩基配列プローブと変異塩基配列プローブでは、同じ鎖長でも塩基置換によってＴｍ値が異なるため、それぞれに最適な鎖長を独立して設定すべきである。
ハイブリダイゼーションプローブの塩基配列は、変異部位がその中央付近となるように設定することが好ましい。
ハイブリダイゼーションは、通常には、温度を二本鎖ＤＮＡが変性するまで上昇させ、徐々に低下させることによって行なわれる。従って、ＤＮＡの増幅が終わった反応液の温度を変化させる操作のみでハイブリダイゼーションを行うことができ、その他の操作が不要である。プログラム可能なサーマルサイクラーによりＤＮＡの増幅を行う場合には、ＤＮＡの増幅に必要な温度条件に加えて、ハイブリダイゼーションの温度条件もプログラムしておくことにより、試料をサーマルサイクラーにセットした後は、一連の反応として、増幅およびハイブリダイゼーションを行うことができる。
上述のように設定された短いプローブを使用することによって、以下の３つの利点が生じる。１）一塩基のミスマッチがある場合とない場合のＴｍ値の差を、長いプローブに比べて大きくすることができ、プローブの特異性を比較的に増加させることができる。２）プローブのハイブリダイゼーション温度は、従来、３７〜６５℃であるが、本発明の検出方法では、２５℃と低く設定できるため、その後の一連の操作を室温で行うことができる。３）短いプローブはＴｍ値が低く、ＰＣＲ反応中はハイブリダイゼーションしないため、ＰＣＲ反応液中にあらかじめ混和しておいてもＰＣＲ反応に影響を及ぼさない。これによって、ＰＣＲ→熱変性→ハイブリダイゼーションを、途中で、試薬の添加などの操作を新たに加えることなく、一連の反応として行うことができる。これらの利点は、ＰＣＲ法と同様にＤＮＡポリメラーゼの伸長反応を利用する他のＤＮＡ増幅法においても同様に得られる。
（３）ハイブリッド検出
ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドは、第１の標識物質および第２の標識物質の両方を有している。ハイブリッドの検出は第１の標識物質および第２の標識物質を利用してアフィニティークロマトグラフィーにより行われる。
アフィニティークロマトグラフィーは、そのために構成された試験片により行うことができる。２種の標識物質を利用してアフィニティークロマトグラフィーによりハイブリッドを検出することは公知の方法に従って行うことができ、このような方法で使用される試験片も通常の方法に従って構成することができる。
このような試験片の例としては、集積したときに可視的な標識物質（例えば金コロイド）を結合した、第１の標識物質に対して特異的に結合する物質と、ハイブリッドとを反応させ、第２の標識物質に対して特異的に結合する物質を固定したクロマト担体上を移動させ、その固定部位に集積した可視的な標識物質を観察できるように構成された試験片が挙げられる。このような試験片自体は、これまでにも特定遺伝子を簡便に検出する方法などに用いられている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３８：２５２５−２５２９，２０００）。
以下、第１の標識物質がジゴキシゲニン、第２の標識物質がビオチン、集積したときに可視的な標識物質が金コロイドである場合を例にとって具体的な例を説明する。クロマト担体のストリップに、クロマト溶媒に浸漬されることによりクロマト溶媒を供給する浸漬部位、クロマト溶媒中に、金コロイドを結合した抗ジゴキシゲニン抗体を遊離し得るようにこの抗体（複合体）を保持するパッドを付与した複合体保持部位、ハイブリッドを含む反応液を適用する試料適用部位、ストレプトアビジンをクロマト溶媒の移動方向に対して垂直に線状に固定したストレプトアビジン固定部位、抗ジゴキシゲニン抗体に対する抗体を固定した抗体固定部位、および、クロマト溶媒を吸収するパッドを付与した吸収部位が、クロマト溶媒（通常には緩衝液）の移動方向においてこの順に設けられる。この例の試験片の使用方法について説明する。ハイブリッドを含む反応液を試料適用部位に適用し、浸漬部位をクロマト溶媒に浸漬した後、クロマト溶媒から試験片を取り上げ静置する。クロマト溶媒は、クロマト担体を毛細管現象により移動し、複合体保持部位に達すると複合体を含むクロマト溶媒が移動する。このクロマト溶媒が試料適用部位に達すると適用された反応液中のハイブリッドの有するジゴキシゲニンと複合体の抗ジゴキシゲニン抗体が結合し、金コロイドを有するハイブリッドが形成され、クロマト媒体によりさらにクロマト担体上を移動する。ハイブリッドがストレプトアビジン固定部位に達すると、ビオチンとストレプトアビジンとの結合により、このハイブリッドがストレプトアビジン固定部位に集積されるので、ハイブリッドが存在すれば、可視的な信号が現れる。ストレプトアビジン固定部位を通過した複合体は、抗体固定部位に集積され、クロマトグラムが正常に進んだことを示す可視的な信号が現れる。さらに移動したクロマト溶媒は、吸収部位に吸収・保持される。
本発明の検出法において、変異部位が点変異である場合には、ハイブリダイゼーションプローブと共に、増幅されたＤＮＡと標識されたハイブリダイゼーションプローブとのハイブリダイゼーションの特異性を高めるのに十分な量の、標識されたハイブリダイゼーションプローブの塩基配列と点変異の位置で１塩基異なる塩基配列を有しかつ標識されていないオリゴヌクレオチド（以下、「競合プローブ」ともいう）をさらにＤＮＡの増幅を行う反応液に含ませることが好ましい。
競合プローブは、ハイブリダイゼーションプローブと点変異の位置で１塩基異なる他は、ハイブリダイゼーションプローブと同様に設定される。競合プローブはハイブリダイゼーションプローブと長さが異なっていてもよい。
増幅されたＤＮＡと標識されたハイブリダイゼーションプローブとのハイブリダイゼーションの特異性を高めるのに十分な量は、検出対象塩基配列、ハイブリダイゼーションプローブの塩基配列などの条件により変化するが、通常には、ハイブリダイゼーションプローブの等量〜５倍量（モル比）を基本としてよいと思われる。しかしながら、陽性反応を著しく減ずるときは、偽陽性反応が出現しないことを確認したうえで競合プローブを省略する方が最適の結果が得られる場合がある。ハイブリダイゼーションプローブの鎖長と競合プローブの有無が判定線の形成に著しい影響を及ぼすことから、比較的容易に至適反応条件を見出すことができるものと考えられる。
ハイブリダイゼーションに際して、非標識の競合オリゴヌクレオチドを加えることによりハイブリダイゼーションプローブの特異性を増し、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制することができる。
本発明の検出法においては、正常塩基配列検出用ハイブリダイゼーションプローブと変異塩基配列検出用ハイブリダイゼーションプローブの標識に異なる標識物質を用い、正常塩基配列検出用の反応系と変異塩基配列検出用の反応系の２つを１つに統合してもよい。すなわち、正常塩基配列検出用ハイブリダイゼーションプローブと変異塩基配列検出用ハイブリダイゼーションプローブに異なった標識をしておき、１：１の比で混合して互いに競合させながら反応系を一つにまとめることが可能である。反応後、それぞれの標識に対して特異的に結合する物質と、集積したときに可視的な標識との複合体でアフィニティークロマトグラフィーを行って遺伝子型を判定する。
本発明の検出法は、次のような利点を有する。（１）汎用性：検出法として長年にわたって汎用されてきたアレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを基にしているため、点変異はもちろんのこと、挿入・欠失などの塩基配列を伴う広範な変異の検出に対応できる。（２）迅速性：サーマルサイクラーにより実施できる増幅およびハイブリダイゼーションの反応が終わってから、遺伝子型の判定まで１０分以内に実施することができる。核酸増幅にキャピラリータイプのＰＣＲ増幅装置を用いることにより、ＤＮＡ検体があれば１時間以内に全工程を終了することも可能である。（３）簡便性：ＰＣＲ反応後は、肉眼で遺伝子型を判定することができるため、ゲル電気泳動装置や蛍光検出装置などの機器を必要としない。ＰＣＲ反応を行うサーマルサイクラーは、感染症検査などに用いられる汎用臨床検査機器であり、すでに多くの病院に設置されている。また、反応操作は簡便であり、特殊な技能を要しない。上記の利点は、ＰＣＲ以外の核酸増幅反応（ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡ、ＬＡＭＰなど）を用いた場合にも得られる。
本発明の検出法の原理を、ＰＣＲの場合を例として、図１〜３を参照してさらに詳しく説明する。
図１は正常ＤＮＡを検体として用いた場合の反応を示す。反応系１は正常塩基配列検出用ハイブリダイゼーションプローブを添加した系で、反応系２は変異塩基配列検出用ハイブリダイゼーションプローブを添加した系である。図中、黒丸は正常塩基、黒三角は変異塩基、Ｄｉｇはジゴキシゲニン標識、Ｂはビオチン標識、ＧＰは金粒子を意味する。
まず、点変異箇所を含む遺伝子部位（検出対象配列）をＰＣＲによって増幅する。このときに用いる１対のＰＣＲプライマーのうちの一方は、その５’端をあらかじめジゴキシゲニンで標識したものを用いる。ＰＣＲ反応液中には、通常の成分に加えて、さらに２種のオリゴヌクレオチド（ハイブリダイゼーションプローブおよび競合プローブ）を混和しておく。このオリゴヌクレオチドの組み合わせには、正常塩基配列検出用のものと変異塩基配列検出用のものの２種類が存在する。正常塩基配列検出用の組み合わせでは、その一方が正常塩基配列の点変異部位を中央部にもち、かつ３’端をビオチン標識したオリゴヌクレオチド（正常プローブ）であり、他方が、変異塩基配列の点変異部位を中央部にもつ非標識の競合オリゴヌクレオチド（変異プローブ）である。変異塩基配列検出用の組み合わせでは、その一方が、変異塩基配列の点変異部位を中央部にもち、かつ３’端をビオチン標識したオリゴヌクレオチド（変異プローブ）であり、他方が正常塩基配列の点変異部位を中央部にもつ非標識の競合オリゴヌクレオチド（正常プローブ）である。いずれのオリゴヌクレオチドも、ジゴキシゲニンで標職したＰＣＲプライマーとは逆鎖になるように設計する。
ＰＣＲ反応液の組成は、例えば、検体ＤＮＡ５０〜１００ｎｇ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、各２５０μＭのｄＮＴＰ、１μＭ ＰＣＲフォワードプライマー（５’端をジゴキシゲニン標識）、１μＭ ＰＣＲリバースプライマー、６００ｎＭハイブリダイゼーションプローブ（３’端をビオチン標識）、３μＭ競合非標識オリゴヌクレオチド、１．２５Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼとし、反応液量は２０μｌとする。ＰＣＲの条件は、例えば、まず９４℃で２分間加熱し、９８℃１０秒−５５℃３０秒−７２℃３０秒のサイクルを３５回繰り返した後、７２℃３分、９８℃３分、６５℃１分、５５℃１分、４５℃１分、３５℃１分、２５℃１分とする。サイクルを繰り返した後のこの過程で、ジゴキシゲニンで標識されたＰＣＲ産物の持つ塩基配列に完全に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする。例えば、正常塩基配列を持つＤＮＡに対して正常塩基配列検出用のオリゴヌクレオチドを組み合わせた場合は、ジゴキシゲニンで標識されたＰＣＲ産物とビオチンで標識されたオリゴヌクレオチドのハイブリッドが形成される（図１、反応系１）。この溶液５μｌをＤＮＡ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｓｔｒｉｐ（ロシュ社、＃１−９６５−４８４）などの、ストレプトアビジンが固定され、金コロイド標識抗ジゴキシゲニン抗体を展開可能に保持するアフィニティークロマト試験片の試料適用部位にスポットし、下端をバッファーに５秒間浸し、室温のままで５分間放置してバッファーを展開すると、金コロイド標識抗ジゴキシゲニン抗体がジゴキシゲニン標識ＰＣＲ産物−ビオチン標識オリゴヌクレオチドのハイブリッドに結合し、このハイブリッドがさらに試験片に固定されたストレプトアビジンに捕捉され、赤いラインを形成するのを肉眼的にとらえることができる。一方、正常塩基配列を持つＤＮＡに対して変異塩基配列検出用のオリゴヌクレオチドを組み合わせた場合は、ジゴキシゲニンで標識されたＰＣＲ産物と非標識オリゴヌクレオチドのハイブリッドが形成される。この溶液を試験片の試料適用部位にスポットしてバッファーで展開すると、金コロイド標識抗ジゴキシゲニン抗体がジゴキシゲニン標識ＰＣＲ産物−非標識オリゴヌクレオチドのハイブリッドに結合するものの、このハイブリッドは試験片上のストレプトアビジンに捕捉されないため、赤いラインを形成しない（図１、反応系２）。以上のように２種類の反応系のそれぞれにおける赤いラインの形成を肉眼的に観察することにより、検体となるＤＮＡの遺伝子型を判定することが可能となる。変異塩基配列を持つＤＮＡにおいても、同様の反応原理である（図２）。
この態様の操作手順を図３に示す。まず、検体とするＤＮＡと反応試薬をＰＣＲチューブ内で混和し、サーマルサイクラーでプログラムに従い過熱・冷却を行ってＤＮＡの増幅およびハイブリッド形成を行う（ステップ１）。反応液から５μｌをとって、試験片の試料適用部位にスポットし、試験片の下端をバッファーに浸した後、室温に放置する（ステップ２）。５分後、遺伝子型判定ラインの有無によって判定を行う（ステップ３）。アフィニティークロマトグラフィーが正常に完了したか否かはコントロールラインの有無によって確認できる。
本発明の検出法は、遺伝子変異の有無を迅速かつ簡便に、そして特別な装置を用いずに確実に判定できる方法であり、病院の外来診療やベッドサイドで遺伝子検査を行うのに適している。すなわち、ポイント・オブ・ケアとしての遺伝子診断を可能にするものである。具体的には、ＣＹＰ２Ｃ１９をはじめとする薬物代謝酵素の遺伝子多型を判定し、ある薬剤がその患者にとって適切かどうかをその場で判定したり、処方量の調整に役立てたりすることが可能である。この場合、短時間に検査結果が得られることが重要な利点となる。
＜２＞本発明のキット
本発明のキットは、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、変異部位を含む検出対象塩基配列を含むＤＮＡの増幅を行うためのプライマーと、検出対象塩基配列に相補的である塩基配列を有するハイブリダイゼーションプローブと、アフィニティークロマトグラフィー用試験片とを含むキットであって、
ＤＮＡの増幅に用いるプライマーの少なくとも一つは、増幅されたＤＮＡが第１の標識物質により標識されるように第１の標識物質により標識されており、ハイブリダイゼーションプローブは第２の標識物質により標識され、ハイブリダイゼーションプローブの有する塩基配列は、ＤＮＡの増幅を阻害しないように設定されており、試験片は第１の標識物質および第２の標識物質を利用して増幅されたＤＮＡとハイブリダイゼーションプローブとのハイブリッドを検出できるものであることを特徴とする。本発明のキットは、本発明の検出法を実施するために使用できる。
プライマー、ハイブリダイゼーションプローブ、および、アフィニティークロマトグラフィー用試験片は、本発明の検出法に関し上記に説明した通りである。
本発明のキットは、変異部位が点変異である場合には、標識されたハイブリダイゼーションプローブの塩基配列と点変異の位置において１塩基異なる塩基配列を有しかつ標識されていないオリゴヌクレオチド（競合プローブ）をさらに含むことが好ましい。このオリゴヌクレオチドは、本発明の検出法に関し上記に説明したとおりである。
【実施例】
次に、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、下記実施例は本発明について具体的な認識を得る一助としてのみ挙げたものであり、これによって本発明の範囲が何ら限定されるものではない。
実施例１ 糖原病Ｉａ型ｇ７２７ｔ変異の検出
（１）反応系および操作手順
糖原病Ｉａ型ｇ７２７ｔ変異の検出のため、変異部位の周辺の既知の塩基配列に基づき、表１に示すプライマーを調製した。
また、プローブの鎖長の検討のため、ハイブリダイゼーションプローブおよび競合プローブとして表２に示すオリゴヌクレオチドを調製した。
ＰＣＲ反応液の組成は、検体ＤＮＡ５０〜１００ｎｇ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、各２５０μＭのｄＮＴＰ、１μＭ ＰＣＲフォワードプライマー、１μＭ ＰＣＲリバースプライマー（５’端をジゴキシゲニン標識）、６００ｎＭハイブリダイゼーションプローブ（３’端をビオチン標識）、所定濃度の競合非標識オリゴヌクレオチド、１．２５Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼとし、反応液量は２０μｌとした。ＰＣＲの条件は、まず９４℃で２分間加熱し、９８℃１０秒−５５℃３０秒−７２℃３０秒のサイクルを３５回繰り返した後、７２℃３分、９８℃３分、６５℃１分、５５℃１分、４５℃１分、３５℃１分、２５℃１分とした。
この溶液５μｌを試験片（ＤＮＡ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ Ｓｔｒｉｐ、ロシュ社、＃１−９６５−４８４、ストレプトアビジンが固定され、金コロイド標識抗ジゴキシゲニン抗体を展開可能に保持するアフィニティークロマト試験片）の試料適用部位にスポットし、下端をバッファーに５秒間浸し、室温のままで５分間放置してバッファーを展開した。放置後、遺伝子型判定線の有無を肉眼的に判定した。
（２）非標識オリゴヌクレオチドによる競合の検討
標識ハイブリダイゼーションプローブを１７ｍｅｒとし、競合プローブを反応液中に添加せずに検出を行った。検体とするＤＮＡはｇ７２７アレルのホモ接合子（正常ＤＮＡ）とｔ７２７アレルのホモ接合子（変異ＤＮＡ）を用い、ハイブリダイゼーションプローブとしては正常塩基配列検出用のものと変異塩基配列検出用のものを用いた。結果を図４に示す。図中、ＤＮＡに関するＷｔおよびＭｕｔはそれぞれ正常ＤＮＡおよび変異ＤＮＡを示し、ハイブリダイゼーションプローブに関するＷｔおよびＭｕｔはそれぞれ正常塩基検出用および変異塩基配列検出用を示す（以下の図５〜７においても同様である）。
いずれの組み合わせでも赤い反応ラインが認められる偽陽性が出現し、遺伝子型を決定することができなかった（図４、レーン１〜４）。
競合プローブ（１７ｍｅｒ）を反応液中にハイブリダイゼーションプローブの５〜５０倍量（モル濃度）添加して同様の実験を行った。結果を図５に示す。
競合プローブの添加により偽陽性の反応が著しく減少した。すなわち、正常ＤＮＡに対する変異塩基配列検出用プローブの反応系（図５、レーン６〜８）および変異ＤＮＡに対する正常塩基配列検出用プローブの反応系（同、レーン１０〜１２）において、ごくわずかな赤い反応ラインを認めるのみであった。偽陽性反応の抑制効果はいずれの添加量においても差異を認めず、５０倍量の添加でも偽陽性の反応を完全に抑制することはできなかった。一方、２５〜５０倍量の添加では、本来の陽性反応を抑制しやや反応ラインが薄くなる傾向を認めた（同、レーン３、４、１５および１６）。
（３）ハイブリダイゼーションプローブの鎖長の検討
ハイブリダイゼーションプローブおよび競合プローブとして１７ｍｅｒ、１５ｍｅｒ、１３ｍｅｒ、１１ｍｅｒのものを使用して検討を行った。ここでは、競合プローブの反応液添加量をハイブリダイゼーションプローブの３０倍に固定した。結果を図６に示す。
正常ＤＮＡに対する変異塩基配列検出用プローブの反応系において、１５ｍｅｒではわずかな偽陽性が出現し（図６、レーン４）、１３ｍｅｒと１１ｍｅｒでは消失した（同、レーン５および６）。変異ＤＮＡに対する正常塩基配列検出用プローブの反応系では、１５ｍｅｒ、１３ｍｅｒ、１１ｍｅｒのいずれにおいても偽陽性は消失した（同、レーン７〜９）。しかしながら、１１ｍｅｒでは本来の陽性反応が減弱する傾向を認めた（同、レーン３および１２）。
以上の検討に基づいて、ハイブリダイゼーションプローブおよび競合プローブの鎖長を１２ｍｅｒ（表３）とし、競合プローブの添加量を５倍として、正常ＤＮＡ（ｇ７２７アレルのホモ接合子）、保因者ＤＮＡ（ｇ７２７アレルとｔ７２７アレルのヘテロ接合子）、患者ＤＮＡ（ｔ７２７アレルのホモ接合子）を対象に、上記のように検出を行った。結果を図７に示す。
遺伝子型と完全に一致する結果が得られ、十分な陽性の反応ラインが観察された（図７、レーン１および４並びに５および６）一方、偽陽性はまったく認められなかった（レーン２および３）。
実施例２ 中鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症のａ９８５ｇ変異、高グリシン血症ＧＬＤＣ遺伝子のｇ１６９１ｔ変異、薬剤代謝酵素遺伝子ＣＹＰ２Ｃ１９のｇ６８１ａ、アルデヒド脱水素酵素２のＧｌｕ４８７Ｌｙｓ多型の点変異の検出
中鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症のａ９８５ｇ変異、高グリシン血症ＧＬＤＣ遺伝子のｇ１６９１ｔ変異、薬剤代謝酵素遺伝子ＣＹＰ２Ｃ１９のｇ６８１ａ、アルデヒド脱水素酵素２のＧｌｕ４８７Ｌｙｓ多型の点変異について、本発明の検出法による点変異の検出を行った。
それぞれの点変異の存在部位を含む塩基配列を増幅するＰＣＲプライマーは、ＰＣＲ反応におけるアニール温度が５５℃で増幅が行えるように、鎖長を調節した。また、ハイブリダイゼーションプローブは、Ｔｍ値が３５〜４０℃となるように設計した。結果として、鎖長は、１０ｍｅｒ〜１５ｍｅｒとなった。プライマー、ハイブリダイゼーションプローブおよび競合プローブの塩基配列を表４に示す。
上記プライマーおよびプローブを用いることの他のＰＣＲの条件やプローブの濃度等の条件は、上記のいずれの変異の検出においてもすべて実施例１と同じであった。
これらの条件下で、検出を行ったところ、全ての検出系において正しい遺伝子型の判定が可能であった（図８のａ、ｂ、ｃおよびｄ）。アルデヒド脱水素酵素２のＧｌｕ４８７Ｌｙｓ多型検出においては、変異塩基配列を検出するための反応系において反応ラインが薄いため、競合非標識オリゴヌクレオチドを反応系に混和しないようにしたところ、十分な反応ラインの形成が観察された。いずれの反応においても、偽陽性は認められなかった。
サーマルサイクラーにおける反応が終了してから、遺伝子型判定までに要する時間は１０分以内であった。また、この試験片をそのまま乾燥させたものは、室温に保存した場合、少なくとも２年後でも肉眼的な判定が可能であった。
以上の結果から、本発明の検出法によって、プライマーならびにハイブリダイゼーションプローブおよび競合プローブの設計および反応条件は、個々の遺伝子変異に応じて若干の調整が必要であるものの、５つの遺伝子における各変異・多型を、簡便・迅速に検出し、検体ＤＮＡの遺伝子型を確定できることが示された。従って、本発明の検出法は汎用性を持つものであると認められる。
実施例３ 嚢胞性線維症膜貫通型調節蛋白質遺伝子のｄｅｌｔａＦ５０８欠失変異、テイザックス病のＨＥＸＡ遺伝子の１２７７ｉｎｓＴＡＴＣ挿入変異、乳癌のＢＲＣＡ１遺伝子の５３８２ｉｎｓＣ挿入変異、乳癌のＢＲＣＡ２遺伝子の６１７４ｄｅｌＴ欠失変異、血栓症凝固系第Ｖ因子遺伝子のＧ１６９１Ａ点変異の検出
嚢胞性線維症膜貫通型調節蛋白質遺伝子のｄｅｌｔａＦ５０８欠失変異、テイザックス病のＨＥＸＡ遺伝子の１２７７ｉｎｓＴＡＴＣ挿入変異、乳癌のＢＲＣＡ１遺伝子の５３８２ｉｎｓＣ挿入変異、乳癌のＢＲＣＡ２遺伝子の６１７４ｄｅｌＴ欠失変異、血栓症凝固系第Ｖ因子遺伝子のＧ１６９１Ａ点変異について、本発明の検出法による変異の検出を行った。
それぞれの変異の存在部位を含む塩基配列を増幅するＰＣＲプライマーは、ＰＣＲ反応におけるアニール温度が５５℃で増幅が行えるように、鎖長を調節した。また、ハイブリダイゼーションプローブは、Ｔｍ値が３５〜４０℃となるように設計した。結果として、鎖長は、１０ｍｅｒ〜１５ｍｅｒとなった。プライマー、ハイブリダイゼーションプローブおよび競合プローブの塩基配列を表５に示す。なお、１）〜４）はいずれも塩基の欠失又は挿入の変異であるため、競合プローブは用いなかった。また、３）〜５）は、ヘテロ接合子でも症状を示すため、臨床的には正常塩基配列を持つ遺伝子の有無を調べる必要がないので、正常塩基配列検出用プローブは用いなかった。
上記プライマーおよびプローブを用いることの他のＰＣＲの条件やプローブの濃度等の条件は、上記のいずれの変異の検出においてもすべて実施例１と同じであった。
これらの条件下で、検出を行ったところ、全ての検出系において遺伝子型の判定が可能であった（図９）。いずれの反応においても、偽陽性は認められなかった。
サーマルサイクラーにおける反応が終了してから、遺伝子型判定までに要する時間は１０分以内であった。また、この試験片をそのまま乾燥させたものは、室温に保存した場合、少なくとも２年後でも肉眼的な判定が可能であった。
以上の結果から、本発明の検出法によって、プライマーならびにハイブリダイゼーションプローブおよび競合プローブの設計および反応条件は、個々の遺伝子変異に応じて若干の調整が必要であるものの、挿入・欠失変異を含む変異を、簡便・迅速に検出し、検体ＤＮＡの遺伝子型を確定できることが示された。従って、本発明の検出法は汎用性を持つものであると認められる。
【産業上の利用可能性】
本発明によれば、通常のサーマルサイクラー以外に特殊な機器や装置を用いずに、簡便・迅速・確実に、病因遺伝子変異の同定や、疾患関連遺伝子および薬剤代謝酵素遺伝子の多型の検出を行うことができる。本発明の検出法は、ベッドサイドでの検出を可能にし、オーダーメイド医療を容易にする手法であると考えられる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【技術分野】
本発明は、塩基配列の検出方法に関し、より詳しくは、点変異などの変異部位を含む塩基配列を含む塩基配列を検出することにより遺伝子の変異を検出する方法に関する。
【背景技術】
ゲノム上に数多く存在する遺伝子多型は、疾病への感受性や、薬剤代謝の個人差などに深く関連していると考えられている。これらの遺伝子多型の検出は、いわゆるオーダーメイド医療にとって必須であり、ゲノム科学の臨床応用における最重要研究課題のひとつに挙げられている。なかでも、遺伝子多型マーカーとしてＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一塩基置換による遺伝子多型）は最近とみに注目を浴びており、国際的にも巨額の研究費が投じられている。また一方、分子遺伝学研究の進歩によって、様々な遺伝性疾患における遺伝子変異がデータベースに蓄積されてきている。これを用い、すでに病因であることが明らかにされている既知の遺伝子変異をスクリーニングすることによって、遺伝病の診断や臨床病型の予測をおこなうことが可能となってきている。特に、特定集団内、あるいは人種を超えて高頻度に存在する遺伝子変異の場合、その診断的価値は高い。
以上のような遺伝子多型や遺伝子変異には、塩基置換、欠失、挿入、繰り返し配列数の相違などがあるが、その中で圧倒的に多数を占めているのが、一塩基置換による点変異である。ヒトゲノム研究の成果を臨床の場に還元していくためには、この点変異の簡便かつ迅速な検出法が不可欠である。
これまで点変異の検出法として、様々な手法が考案されてきた（Ｃｏｔｔｏｎ ＲＧＨ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ｐｐ．１−１９８，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｅ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９７参照）。代表的な方法としては、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＡＳＯ）法、対立遺伝子特異的増幅法、制限酵素消化法、リガーゼ連鎖反応、ミニシークエンス法などが挙げられる。これらの手法はいずれも、ＤＮＡ増幅後に、ハイブリダイゼーションや電気泳動をはじめとする煩雑な操作が必要とされる。一方、近年ヒトゲノム解析研究に対応するために開発された、ＴａｑＭａｎ法、インベーダーアッセイ（ｉｎｖａｄｅｐ ａｓｓａｙ）、ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）、質量分析計を用いるＴＯＦ−ＭＡＳＳ法などは、大量検体の処理に秀でているものの、高額の特殊専用機器を必要とし、臨床検査室レベルで簡単に施行できるものではない。また、遺伝子変異のスクリーニング法として広く用いられているＳＳＣＰ法、ケミカルクリーベッジ（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｌｅａｖａｇｅ）法およびＤＨＰＬＣ法は未知の遺伝子変異の大まかなスクリーニングに威力を発揮するが、既知変異の確実な検出には不適切である。さらに、シークエンス法を用いた点変異検出は、操作が複雑でコストも高く、既知変異の検出にはオーバースペックといわざるを得ない。上記のいずれの方法も、現段階では遺伝子解析実験室でおこなわれる特殊検査であり、臨床の現場（ベッドサイド）で迅速に実施することはきわめて困難である。
ＡＳＯ法に使用されるプローブとしては、従来は１５〜２５ｍｅｒが用いられている（Ｓａｉｋｉ ＲＫ，Ｅｒｌｉｃｈ ＨＡ．Ｄｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｓｃｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅｓ．Ｉｎ：Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ．ｐｐ．１１３−１２９，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９８参照）。また、ハイブリダイゼーションにおいて、標識プローブに競合するオリゴヌクレオチドを用いてプローブの特異性を増強させることが報告されている（Ｎｏｚａｒｉ Ｇ，Ｒａｈｂａｒ Ｓ，Ｗａｌｌａｃｅ ＲＢ．Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｏｆ ｔｈｃ ａｌｌｅｉｃ ｈｕｍａｎ β−ｇｌｏｂｉｎ ｇｅｎｅｓ βＡ，βＳ ａｎｄ βＣ ｕｓｉｎｇ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅｓ．Ｇｅｎｅ ４３：２３−２８，１９８６参照）。
【発明の開示】
本発明は、遺伝子の変異の簡便かつ迅速な検出法を提供することを目的とする。
本発明者らは、特定のプライマーおよびプローブを特定の条件で用いると、一つの反応系で核酸の増幅とハイブリダイゼーションを行うことができ、しかもハイブリダイゼーションにより形成したハイブリッドを容易に検出できるという知見を得、この知見に基づき、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下のものを提供する。
（１）ＤＮＡポリメラーゼを用いて、変異部位を含む検出対象塩基配列を含むＤＮＡの増幅を行う工程、増幅されたＤＮＡと、検出対象塩基配列に相補的である塩基配列を有するハイブリダイゼーションプローブとをハイブリダイズさせる工程、および、ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを検出する工程を含む塩基配列の検出方法であって、
ＤＮＡの増幅に用いるプライマーの少なくとも一つは、増幅されたＤＮＡが第１の標識物質により標識されるように第１の標識物質により標識されており、ハイブリダイゼーションプローブは第２の標識物質により標識されるとともに、ＤＮＡの増幅が行われる反応液に含まれており、ハイブリダイゼーションプローブの有する塩基配列は、ＤＮＡの増幅を阻害しないように設定されており、ハイブリッドの検出は第１の標識物質および第２の標識物質を利用してアフィニティークロマトグラフィーにより行われる前記方法。
（２）変異部位が点変異であり、ＤＮＡの増幅が行われる反応液が、増幅されたＤＮＡと標識されたハイブリダイゼーションプローブとのハイブリダイゼーションの特異性を高めるのに十分な量の、標識されたハイブリダイゼーションプローブの塩基配列と点変異の位置で１塩基異なる塩基配列を有しかつ標識されていないオリゴヌクレオチドをさらに含む（１）の方法。
（３）ＤＮＡの増幅がＰＣＲによる増幅である（１）または（２）の方法。
（４）ＤＮＡポリメラーゼを用いて、変異部位を含む検出対象塩基配列を含むＤＮＡの増幅を行うためのプライマーと、検出対象塩基配列に相補的である塩基配列を有するハイブリダイゼーションプローブと、アフィニティークロマトグラフィー用試験片とを含むキットであって、
ＤＮＡの増幅に用いるプライマーの少なくとも一つは、増幅されたＤＮＡが第１の標識物質により標識されるように第１の標識物質により標識されており、ハイブリダイゼーションプローブは第２の標識物質により標識され、ハイブリダイゼーションプローブの有する塩基配列は、ＤＮＡの増幅を阻害しないように設定されており、試験片は第１の標識物質および第２の標識物質を利用して増幅されたＤＮＡとハイブリダイゼーションプローブとのハイブリッドを検出できるものである前記キット。
（５）変異部位が点変異であり、標識されたハイブリダイゼーションプローブの塩基配列と点変異の位置で１塩基異なる塩基配列を有しかつ標識されていないオリゴヌクレオチドをさらに含む（４）のキット。
（６）プライマーがＰＣＲ用プライマーである（４）または（５）のキット。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の検出法の原理（正常ＤＮＡを検体とした場合）の説明図である。
図２は、本発明の検出法の原理（変異ＤＮＡを検体とした場合）の説明図である。
図３は、本発明の検出法の一例の操作の説明図である。
図４は、１７ｍｅｒのハイブリダイゼーションプローブを用いた場合の検出結果（クロマトグラムの写真）を示す。
図５は、１７ｍｅｒのハイブリダイゼーションプローブを用い、競合プローブを添加した場合の検出結果（クロマトグラムの写真）を示す。
図６は、種々の長さのハイブリダイゼーションプローブを用い、競合プローブを添加した場合の検出結果（クロマトグラムの写真）を示す。
図７は、１２ｍｅｒのハイブリダイゼーションプローブを用い、競合プローブを添加した場合の検出結果（クロマトグラムの写真）を示す。
図８は、種々の変異に関する検出結果（クロマトグラムの写真）を示す。
図９は、種々の変異に関する検出結果（クロマトグラムの写真）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
＜１＞本発明の検出法
本発明の検出法は、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、変異部位を含む検出対象塩基配列を含むＤＮＡの増幅を行う工程、増幅されたＤＮＡと、検出対象塩基配列に相補的である塩基配列を有するハイブリダイゼーションプローブとをハイブリダイズさせる工程、および、ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを検出する工程を含む塩基配列の検出方法であって、
ＤＮＡの増幅に用いるプライマーの少なくとも一つは、増幅されたＤＮＡが第１の標識物質により標識されるように第１の標識物質により標識されており、ハイブリダイゼーションプローブは第２の標識物質により標識されるとともに、ＤＮＡの増幅が行われる反応液に含まれており、ハイブリダイゼーションプローブの有する塩基配列は、ＤＮＡの増幅を阻害しないように設定されており、ハイブリッドの検出は第１の標識物質および第２の標識物質を利用してアフィニティークロマトグラフィーにより行われることを特徴とする。以下、各工程毎に説明する。
（１）ＤＮＡの増幅
ＤＮＡの増幅は、ＤＮＡポリメラーゼを用いて行われるものであれば、特に制限されず、ＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡを合成する段階を含む増幅方法を用いることができる。ＤＮＡの増幅の方法の例としては、ＰＣＲ法、ＴＭＡ法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＡＭＰ法などが挙げられる。
ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡを合成する場合には、プライマーが必要となる。プライマーは、増幅の方法および検出対象塩基配列に依存して公知の方法により設定される。本発明においては、ＤＮＡの増幅に用いるプライマーの少なくとも一つは、増幅されたＤＮＡが第１の標識物質により標識されるように第１の標識物質により標識される。
例えば、増幅がＰＣＲ法により行われる場合、プライマー対が用いられるが、少なくともその一方を標識することにより、増幅されたＤＮＡが標識されたものとなる。また、ＮＡＳＢＡ法およびＴＭＡ法により行われる場合には、ＤＮＡ合成段階に働くプライマーを、ＬＡＭＰ法の場合には、片方のインナープライマーを少なくとも標識することにより増幅されたＤＮＡが標識されたものとなる。
プライマーの標識は、ＤＮＡの合成反応を阻害しないように行われる。このような標識は公知の方法に従って行うことができ、通常にはプライマーの５’末端が標識される。
標識に用いられる標識物質は、それに対して生体特異的に結合する物質が存在するものであればよい。このような標識物質と、それに対して生体特異的に結合する物質の組み合わせとしては、抗原と抗体、酵素と阻害剤、糖鎖とレクチン、ホルモンと受容体、金属結合蛋白質と金属元素が挙げられる。具体的には、ジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン抗体、ビオチンとストレプトアビジンなどの組み合わせが挙げられる。これらの組み合わせにおいて、いずれが標識物質となってもよいが、通常には、分子量の小さい方が、標識物質として用いられる。
用いられるプライマーやＤＮＡの増幅の条件は、採用する増幅方法および検出対象配列に基づいて適したものが設定される。例えば、ＰＣＲ法については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄ．），Ｖｏｌｕｍｅ ２，Ｃｈａｐｔｅｒ ８，ｐｐ．８．１−８．１２６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，２００１、ＮＡＳＢＡ法については、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１，２５−３３（１９９１）、ＬＡＭＰ法については、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．１２，ｐｐ．ｉ−ｖｉｉ（２０００）をそれぞれ参照できる。
増幅において、鋳型となる検体ＤＮＡは、検査試料から通常の方法により調製できる。
検出対象配列は、変異部位を含む検出対象配列が特異的に増幅されるように、増幅の方法に合わせて適宜選択される。検出対象配列が含む変異部位は、通常には、遺伝子変異および遺伝子多型として知られている部位である。変異部位は、点変異でもよいし、挿入、欠失などの変異でもよい。
本発明の検出法の検出対象となる遺伝子変異および遺伝子多型の一般的な例としては、糖原病Ｉａ型の日本人患者で高頻度に認められるｇ７２７ｔ変異、中鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症の白人患者で高頻度に認められるａ９８５ｇ変異（Ｌｙｓ３２９Ｇｌｕ変異）、高グリシン血症のフィンランド人患者で高頻度に認められるＧＬＤＣ遺伝子のｇ１６９１ｔ変異（Ｓｅｒ５６４Ｉｌｅ変異）、薬剤代謝酵素遺伝子ＣＹＰ２Ｃ１９における遺伝子多型（ＣＹＰ２Ｃ１９＊２，ｇ６８１ａ）、アルコール代謝の個人差を決定するアルデヒド脱水素酵素２の遺伝子多型（Ｅ４８７Ｋ）、嚢胞性線維症膜貫通型調節蛋白質遺伝子のｄｅｌｔａＦ５０８欠失変異、テイザックス病のＨＥＸＡ遺伝子の１２７７ｉｎｓＴＡＴＣ挿入変異、乳癌のＢＲＣＡ１遺伝子の５３８２ｉｎｓＣ挿入変異、乳癌のＢＲＣＡ２遺伝子の６１７４ｄｅｌＴ欠失変異、血栓症凝固系第Ｖ因子遺伝子のＧ１６９１Ａ点変異などが挙げられるが、本発明の検出法の検出対象はこれらの例に限定されない。
糖原病Ｉａ型はグリコーゲン代謝経路におけるグルコース−６−ホスファターゼの異常によって生じ、主として肝臓に大量のグリコーゲンが蓄積する先天性糖代謝異常症で、常染色体劣性遺伝形式をとる。低血糖、肝腫大、低身長、腎障害、高脂質血症、高尿酸血症などが見られる。この酵素遺伝子におけるｇ７２７ｔ変異は、日本人症例における病因変異の約９０％を占める高頻度変異であり、ｍＲＮＡのスプライシング異常を生じる。ごく最近まで、本症診断には、肝臓組織を用いた酵素活性測定が行われていたが、遺伝子診断の出現によって肝生検が不要となった。本変異の日本人集団における保因者数は、約２００人に１人である。
非ケトーシス型高グリシン血症はグリシン解裂系酵素の異常によって生じ、新生児期にけいれんをはじめとする重篤な神経症状を呈する先天性アミノ酸代謝異常症（常染色体劣性遺伝）である。フィンランド人患者では、グリシン解裂系酵素のうちＧＬＤＣ遺伝子にｇ１６９１ｔ変異が高頻度（変異遺伝子の約７０％）に認められる。本変異はアミノ酸置換Ｓｅｒ５６４Ｉｌｅを生じる。
中鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症は脂肪酸β酸化経路において重要な役割を担う酵素（ｍｅｄｉｕｍ−ｃｈａｉｎ ａｃｙｌ−ＣｏＡ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＭＣＡＤ）の異常によって生じ、空腹・感染時の低血糖・意識障害をひきおこす先天性有機酸代謝異常症（常染色体劣性遺伝）である。しばしば、乳幼児突然死症候群や急性脳症（ライ症候群）と誤診されることが知られている。本酵素遺伝子におけるａ９８５ｇ変異は白人症例における病因変異の約９０％を占める高頻度変異であり、アミノ酸置換Ｌｙｓ３２９Ｇｌｕをひきおこす。また、本遺伝子変異の保因者は、白人集団で高率（英国では４０人に１人）に認められる。欧米では、このａ９８５ｇ変異を検出する遺伝子診断が本症の診断に広く用いられている。
ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子は、オメプラゾール（胃酸分泌抑制剤）などの代謝に重要な役割を果たしている。本遺伝子上のＳＮＰ多型であるＣＹＰ２Ｃ１９＊２は、エキソン５の６８１Ｇ＞Ａ変異によってスプライシング異常を生じるため、これらの薬剤の代謝活性を低下させる。このような多型を持つ人（ｐｏｏｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）では、投薬にあたって減量するする必要があり、投薬前に予め遺伝子型を決定できれば、臨床的に有利である。日本人集団における遺伝子の約２３％に、この遺伝子多型が認められる。
アルデヒド脱水素酵素２の遺伝子多型（Ｇｌｕ４８７Ｌｙｓ）は、東洋人に多く認められるＳＮＰで、アルコール代謝の個人差を決定する。遺伝子多型を有する酵素は活性が低く、アルコールから生じるアセトアルデヒドの代謝が遅くなるため、「酒に弱い」体質となる。日本人集団では約３０％がこの遺伝子多型のヘテロ接合子、約５％がホモ接合子である。
（２）ハイブリダイゼーション
増幅されたＤＮＡと、検出対象塩基配列に相補的である塩基配列を有するハイブリダイゼーションプローブとのハイブリダイゼーションは、特定のハイブリダイゼーションプローブが使用される他は、通常のハイブリダイゼーションと同様に行えばよい。
本発明で使用されるハイブリダイゼーションプローブは、第２の標識物質により標識され、ＤＮＡの増幅が行われる反応液に含まれており、ハイブリダイゼーションプローブの有する塩基配列は、ＤＮＡの増幅を阻害しないように設定される。
第２の標識物質は、第１の標識物質と異なる物質が用いられる他は、第１の標識物質について説明したのと同様である。ハイブリダイゼーションプローブの標識は、ハイブリダイゼーションを妨げないように公知の方法により行うことができる。ハイブリダイゼーションプローブの標識は、３’末端に行うことが好ましい。これによりＤＮＡの増幅反応中のオリゴヌクレオチドの鎖長の進展を防止するためである。鎖長の進展があった場合はＴｍ値が上昇し、たとえミスマッチがあってもハイブリダイズしてしまうおそれがある。
ハイブリダイゼーションプローブの塩基配列を、ＤＮＡの増幅を阻害しないように設定することは、通常には、ハイブリダイゼーションプローブのハイブリダイゼーションがＤＮＡの増幅の条件では生じないようにハイブリダイゼーションプローブの鎖長などを設定することにより行うことができる。
本発明で使用されるハイブリダイゼーションプローブの塩基配列は、ＤＮＡの増幅を阻害しないように設定されるので、ＤＮＡの増幅が行われる反応液に最初から含ませておくことができる。このため、ＤＮＡの増幅が終了した反応液を、そのまま、増幅されたＤＮＡとハイブリダイゼーションプローブとがハイブリダイズするような条件におくことにより、これらをハイブリダイズさせることができる。
ハイブリダイゼーションプローブの鎖長や、ハイブリダイズさせるときの条件は、ＤＮＡの増幅に用いる方法に応じて適宜設定される。ＤＮＡポリメラーゼを用いるＤＮＡの増幅では、ＤＮＡポリメラーゼの活性が発揮されるのに適した温度条件で増幅が行われるので、この温度でハイブリダイゼーションが生じないように鎖長が設定される。また、ハイブリダイゼーションが起こる温度は、ＤＮＡの増幅を妨げない限り、特に限定されないが、生成したハイブリッドが室温で解離しないものであることが好ましい。
ＤＮＡの増幅を阻害しないように塩基配列を設定する条件として具体的には、プライマーのＴｍ値に比べて、プローブのＴｍ値が２５〜４０℃（好ましくは３０〜３５℃）低くなるように設定することが挙げられる。
例えば、ＰＣＲ法の通常の条件を考慮すると、プローブは、通常には、１０ｍｅｒ〜１３ｍｅｒとなる。これは、アレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションのプローブとして、従来用いられている１５ｍｅｒ〜２５ｍｅｒ（上記非特許文献２参照）に比較してかなり短いものである。これまで、より長い鎖長のプローブが多用されてきた背景には、全ゲノム配列（３０億塩基対）の中で、４種塩基の組み合わせによる特異性を持ったプローブを作成するためには、少なくとも４の１５乗くらいが必要であるという論理があった。しかしながら、これは全ゲノム配列を対象にハイブリダイゼーションを行う場合であり、ＰＣＲ増幅された数百塩基のＤＮＡ断片を標的とする場合は、これほどの長さと特異性は要求されないと考えられるので、ハイブリダイゼーションの特異性は十分に維持される。
本発明の検出法を、任意の遺伝子変異や多型の検出に応用するにあたっては、ハイブリダイゼーションプローブを最適の鎖長にすることが必要である。これは、後述の実施例に記載されているように定型的な実験により決定することが可能である。本発明の検出法では、通常、極めて短いプローブを用いることから、１塩基長の差によって劇的な判定線形成の違いが認められる。偽陽性の出現や微弱な陽性反応が認められた場合には、Ｔｍ値をもとに設計したプローブよりも短いプローブあるいは長いプローブを作成し、最適のものを選択することが好ましい。この際、正常塩基配列プローブと変異塩基配列プローブでは、同じ鎖長でも塩基置換によってＴｍ値が異なるため、それぞれに最適な鎖長を独立して設定すべきである。
ハイブリダイゼーションプローブの塩基配列は、変異部位がその中央付近となるように設定することが好ましい。
ハイブリダイゼーションは、通常には、温度を二本鎖ＤＮＡが変性するまで上昇させ、徐々に低下させることによって行なわれる。従って、ＤＮＡの増幅が終わった反応液の温度を変化させる操作のみでハイブリダイゼーションを行うことができ、その他の操作が不要である。プログラム可能なサーマルサイクラーによりＤＮＡの増幅を行う場合には、ＤＮＡの増幅に必要な温度条件に加えて、ハイブリダイゼーションの温度条件もプログラムしておくことにより、試料をサーマルサイクラーにセットした後は、一連の反応として、増幅およびハイブリダイゼーションを行うことができる。
上述のように設定された短いプローブを使用することによって、以下の３つの利点が生じる。１）一塩基のミスマッチがある場合とない場合のＴｍ値の差を、長いプローブに比べて大きくすることができ、プローブの特異性を比較的に増加させることができる。２）プローブのハイブリダイゼーション温度は、従来、３７〜６５℃であるが、本発明の検出方法では、２５℃と低く設定できるため、その後の一連の操作を室温で行うことができる。３）短いプローブはＴｍ値が低く、ＰＣＲ反応中はハイブリダイゼーションしないため、ＰＣＲ反応液中にあらかじめ混和しておいてもＰＣＲ反応に影響を及ぼさない。これによって、ＰＣＲ→熱変性→ハイブリダイゼーションを、途中で、試薬の添加などの操作を新たに加えることなく、一連の反応として行うことができる。これらの利点は、ＰＣＲ法と同様にＤＮＡポリメラーゼの伸長反応を利用する他のＤＮＡ増幅法においても同様に得られる。
（３）ハイブリッド検出
ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドは、第１の標識物質および第２の標識物質の両方を有している。ハイブリッドの検出は第１の標識物質および第２の標識物質を利用してアフィニティークロマトグラフィーにより行われる。
アフィニティークロマトグラフィーは、そのために構成された試験片により行うことができる。２種の標識物質を利用してアフィニティークロマトグラフィーによりハイブリッドを検出することは公知の方法に従って行うことができ、このような方法で使用される試験片も通常の方法に従って構成することができる。
このような試験片の例としては、集積したときに可視的な標識物質（例えば金コロイド）を結合した、第１の標識物質に対して特異的に結合する物質と、ハイブリッドとを反応させ、第２の標識物質に対して特異的に結合する物質を固定したクロマト担体上を移動させ、その固定部位に集積した可視的な標識物質を観察できるように構成された試験片が挙げられる。このような試験片自体は、これまでにも特定遺伝子を簡便に検出する方法などに用いられている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３８：２５２５−２５２９，２０００）。
以下、第１の標識物質がジゴキシゲニン、第２の標識物質がビオチン、集積したときに可視的な標識物質が金コロイドである場合を例にとって具体的な例を説明する。クロマト担体のストリップに、クロマト溶媒に浸漬されることによりクロマト溶媒を供給する浸漬部位、クロマト溶媒中に、金コロイドを結合した抗ジゴキシゲニン抗体を遊離し得るようにこの抗体（複合体）を保持するパッドを付与した複合体保持部位、ハイブリッドを含む反応液を適用する試料適用部位、ストレプトアビジンをクロマト溶媒の移動方向に対して垂直に線状に固定したストレプトアビジン固定部位、抗ジゴキシゲニン抗体に対する抗体を固定した抗体固定部位、および、クロマト溶媒を吸収するパッドを付与した吸収部位が、クロマト溶媒（通常には緩衝液）の移動方向においてこの順に設けられる。この例の試験片の使用方法について説明する。ハイブリッドを含む反応液を試料適用部位に適用し、浸漬部位をクロマト溶媒に浸漬した後、クロマト溶媒から試験片を取り上げ静置する。クロマト溶媒は、クロマト担体を毛細管現象により移動し、複合体保持部位に達すると複合体を含むクロマト溶媒が移動する。このクロマト溶媒が試料適用部位に達すると適用された反応液中のハイブリッドの有するジゴキシゲニンと複合体の抗ジゴキシゲニン抗体が結合し、金コロイドを有するハイブリッドが形成され、クロマト媒体によりさらにクロマト担体上を移動する。ハイブリッドがストレプトアビジン固定部位に達すると、ビオチンとストレプトアビジンとの結合により、このハイブリッドがストレプトアビジン固定部位に集積されるので、ハイブリッドが存在すれば、可視的な信号が現れる。ストレプトアビジン固定部位を通過した複合体は、抗体固定部位に集積され、クロマトグラムが正常に進んだことを示す可視的な信号が現れる。さらに移動したクロマト溶媒は、吸収部位に吸収・保持される。
本発明の検出法において、変異部位が点変異である場合には、ハイブリダイゼーションプローブと共に、増幅されたＤＮＡと標識されたハイブリダイゼーションプローブとのハイブリダイゼーションの特異性を高めるのに十分な量の、標識されたハイブリダイゼーションプローブの塩基配列と点変異の位置で１塩基異なる塩基配列を有しかつ標識されていないオリゴヌクレオチド（以下、「競合プローブ」ともいう）をさらにＤＮＡの増幅を行う反応液に含ませることが好ましい。
競合プローブは、ハイブリダイゼーションプローブと点変異の位置で１塩基異なる他は、ハイブリダイゼーションプローブと同様に設定される。競合プローブはハイブリダイゼーションプローブと長さが異なっていてもよい。
増幅されたＤＮＡと標識されたハイブリダイゼーションプローブとのハイブリダイゼーションの特異性を高めるのに十分な量は、検出対象塩基配列、ハイブリダイゼーションプローブの塩基配列などの条件により変化するが、通常には、ハイブリダイゼーションプローブの等量〜５倍量（モル比）を基本としてよいと思われる。しかしながら、陽性反応を著しく減ずるときは、偽陽性反応が出現しないことを確認したうえで競合プローブを省略する方が最適の結果が得られる場合がある。ハイブリダイゼーションプローブの鎖長と競合プローブの有無が判定線の形成に著しい影響を及ぼすことから、比較的容易に至適反応条件を見出すことができるものと考えられる。
ハイブリダイゼーションに際して、非標識の競合オリゴヌクレオチドを加えることによりハイブリダイゼーションプローブの特異性を増し、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制することができる。
本発明の検出法においては、正常塩基配列検出用ハイブリダイゼーションプローブと変異塩基配列検出用ハイブリダイゼーションプローブの標識に異なる標識物質を用い、正常塩基配列検出用の反応系と変異塩基配列検出用の反応系の２つを１つに統合してもよい。すなわち、正常塩基配列検出用ハイブリダイゼーションプローブと変異塩基配列検出用ハイブリダイゼーションプローブに異なった標識をしておき、１：１の比で混合して互いに競合させながら反応系を一つにまとめることが可能である。反応後、それぞれの標識に対して特異的に結合する物質と、集積したときに可視的な標識との複合体でアフィニティークロマトグラフィーを行って遺伝子型を判定する。
本発明の検出法は、次のような利点を有する。（１）汎用性：検出法として長年にわたって汎用されてきたアレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを基にしているため、点変異はもちろんのこと、挿入・欠失などの塩基配列を伴う広範な変異の検出に対応できる。（２）迅速性：サーマルサイクラーにより実施できる増幅およびハイブリダイゼーションの反応が終わってから、遺伝子型の判定まで１０分以内に実施することができる。核酸増幅にキャピラリータイプのＰＣＲ増幅装置を用いることにより、ＤＮＡ検体があれば１時間以内に全工程を終了することも可能である。（３）簡便性：ＰＣＲ反応後は、肉眼で遺伝子型を判定することができるため、ゲル電気泳動装置や蛍光検出装置などの機器を必要としない。ＰＣＲ反応を行うサーマルサイクラーは、感染症検査などに用いられる汎用臨床検査機器であり、すでに多くの病院に設置されている。また、反応操作は簡便であり、特殊な技能を要しない。上記の利点は、ＰＣＲ以外の核酸増幅反応（ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡ、ＬＡＭＰなど）を用いた場合にも得られる。
本発明の検出法の原理を、ＰＣＲの場合を例として、図１〜３を参照してさらに詳しく説明する。
図１は正常ＤＮＡを検体として用いた場合の反応を示す。反応系１は正常塩基配列検出用ハイブリダイゼーションプローブを添加した系で、反応系２は変異塩基配列検出用ハイブリダイゼーションプローブを添加した系である。図中、黒丸は正常塩基、黒三角は変異塩基、Ｄｉｇはジゴキシゲニン標識、Ｂはビオチン標識、ＧＰは金粒子を意味する。
まず、点変異箇所を含む遺伝子部位（検出対象配列）をＰＣＲによって増幅する。このときに用いる１対のＰＣＲプライマーのうちの一方は、その５’端をあらかじめジゴキシゲニンで標識したものを用いる。ＰＣＲ反応液中には、通常の成分に加えて、さらに２種のオリゴヌクレオチド（ハイブリダイゼーションプローブおよび競合プローブ）を混和しておく。このオリゴヌクレオチドの組み合わせには、正常塩基配列検出用のものと変異塩基配列検出用のものの２種類が存在する。正常塩基配列検出用の組み合わせでは、その一方が正常塩基配列の点変異部位を中央部にもち、かつ３’端をビオチン標識したオリゴヌクレオチド（正常プローブ）であり、他方が、変異塩基配列の点変異部位を中央部にもつ非標識の競合オリゴヌクレオチド（変異プローブ）である。変異塩基配列検出用の組み合わせでは、その一方が、変異塩基配列の点変異部位を中央部にもち、かつ３’端をビオチン標識したオリゴヌクレオチド（変異プローブ）であり、他方が正常塩基配列の点変異部位を中央部にもつ非標識の競合オリゴヌクレオチド（正常プローブ）である。いずれのオリゴヌクレオチドも、ジゴキシゲニンで標職したＰＣＲプライマーとは逆鎖になるように設計する。
ＰＣＲ反応液の組成は、例えば、検体ＤＮＡ５０〜１００ｎｇ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、各２５０μＭのｄＮＴＰ、１μＭ ＰＣＲフォワードプライマー（５’端をジゴキシゲニン標識）、１μＭ ＰＣＲリバースプライマー、６００ｎＭハイブリダイゼーションプローブ（３’端をビオチン標識）、３μＭ競合非標識オリゴヌクレオチド、１．２５Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼとし、反応液量は２０μｌとする。ＰＣＲの条件は、例えば、まず９４℃で２分間加熱し、９８℃１０秒−５５℃３０秒−７２℃３０秒のサイクルを３５回繰り返した後、７２℃３分、９８℃３分、６５℃１分、５５℃１分、４５℃１分、３５℃１分、２５℃１分とする。サイクルを繰り返した後のこの過程で、ジゴキシゲニンで標識されたＰＣＲ産物の持つ塩基配列に完全に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする。例えば、正常塩基配列を持つＤＮＡに対して正常塩基配列検出用のオリゴヌクレオチドを組み合わせた場合は、ジゴキシゲニンで標識されたＰＣＲ産物とビオチンで標識されたオリゴヌクレオチドのハイブリッドが形成される（図１、反応系１）。この溶液５μｌをＤＮＡ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｓｔｒｉｐ（ロシュ社、＃１−９６５−４８４）などの、ストレプトアビジンが固定され、金コロイド標識抗ジゴキシゲニン抗体を展開可能に保持するアフィニティークロマト試験片の試料適用部位にスポットし、下端をバッファーに５秒間浸し、室温のままで５分間放置してバッファーを展開すると、金コロイド標識抗ジゴキシゲニン抗体がジゴキシゲニン標識ＰＣＲ産物−ビオチン標識オリゴヌクレオチドのハイブリッドに結合し、このハイブリッドがさらに試験片に固定されたストレプトアビジンに捕捉され、赤いラインを形成するのを肉眼的にとらえることができる。一方、正常塩基配列を持つＤＮＡに対して変異塩基配列検出用のオリゴヌクレオチドを組み合わせた場合は、ジゴキシゲニンで標識されたＰＣＲ産物と非標識オリゴヌクレオチドのハイブリッドが形成される。この溶液を試験片の試料適用部位にスポットしてバッファーで展開すると、金コロイド標識抗ジゴキシゲニン抗体がジゴキシゲニン標識ＰＣＲ産物−非標識オリゴヌクレオチドのハイブリッドに結合するものの、このハイブリッドは試験片上のストレプトアビジンに捕捉されないため、赤いラインを形成しない（図１、反応系２）。以上のように２種類の反応系のそれぞれにおける赤いラインの形成を肉眼的に観察することにより、検体となるＤＮＡの遺伝子型を判定することが可能となる。変異塩基配列を持つＤＮＡにおいても、同様の反応原理である（図２）。
この態様の操作手順を図３に示す。まず、検体とするＤＮＡと反応試薬をＰＣＲチューブ内で混和し、サーマルサイクラーでプログラムに従い過熱・冷却を行ってＤＮＡの増幅およびハイブリッド形成を行う（ステップ１）。反応液から５μｌをとって、試験片の試料適用部位にスポットし、試験片の下端をバッファーに浸した後、室温に放置する（ステップ２）。５分後、遺伝子型判定ラインの有無によって判定を行う（ステップ３）。アフィニティークロマトグラフィーが正常に完了したか否かはコントロールラインの有無によって確認できる。
本発明の検出法は、遺伝子変異の有無を迅速かつ簡便に、そして特別な装置を用いずに確実に判定できる方法であり、病院の外来診療やベッドサイドで遺伝子検査を行うのに適している。すなわち、ポイント・オブ・ケアとしての遺伝子診断を可能にするものである。具体的には、ＣＹＰ２Ｃ１９をはじめとする薬物代謝酵素の遺伝子多型を判定し、ある薬剤がその患者にとって適切かどうかをその場で判定したり、処方量の調整に役立てたりすることが可能である。この場合、短時間に検査結果が得られることが重要な利点となる。
＜２＞本発明のキット
本発明のキットは、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、変異部位を含む検出対象塩基配列を含むＤＮＡの増幅を行うためのプライマーと、検出対象塩基配列に相補的である塩基配列を有するハイブリダイゼーションプローブと、アフィニティークロマトグラフィー用試験片とを含むキットであって、
ＤＮＡの増幅に用いるプライマーの少なくとも一つは、増幅されたＤＮＡが第１の標識物質により標識されるように第１の標識物質により標識されており、ハイブリダイゼーションプローブは第２の標識物質により標識され、ハイブリダイゼーションプローブの有する塩基配列は、ＤＮＡの増幅を阻害しないように設定されており、試験片は第１の標識物質および第２の標識物質を利用して増幅されたＤＮＡとハイブリダイゼーションプローブとのハイブリッドを検出できるものであることを特徴とする。本発明のキットは、本発明の検出法を実施するために使用できる。
プライマー、ハイブリダイゼーションプローブ、および、アフィニティークロマトグラフィー用試験片は、本発明の検出法に関し上記に説明した通りである。
本発明のキットは、変異部位が点変異である場合には、標識されたハイブリダイゼーションプローブの塩基配列と点変異の位置において１塩基異なる塩基配列を有しかつ標識されていないオリゴヌクレオチド（競合プローブ）をさらに含むことが好ましい。このオリゴヌクレオチドは、本発明の検出法に関し上記に説明したとおりである。
【実施例】
次に、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、下記実施例は本発明について具体的な認識を得る一助としてのみ挙げたものであり、これによって本発明の範囲が何ら限定されるものではない。
実施例１ 糖原病Ｉａ型ｇ７２７ｔ変異の検出
（１）反応系および操作手順
糖原病Ｉａ型ｇ７２７ｔ変異の検出のため、変異部位の周辺の既知の塩基配列に基づき、表１に示すプライマーを調製した。
また、プローブの鎖長の検討のため、ハイブリダイゼーションプローブおよび競合プローブとして表２に示すオリゴヌクレオチドを調製した。
ＰＣＲ反応液の組成は、検体ＤＮＡ５０〜１００ｎｇ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、各２５０μＭのｄＮＴＰ、１μＭ ＰＣＲフォワードプライマー、１μＭ ＰＣＲリバースプライマー（５’端をジゴキシゲニン標識）、６００ｎＭハイブリダイゼーションプローブ（３’端をビオチン標識）、所定濃度の競合非標識オリゴヌクレオチド、１．２５Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼとし、反応液量は２０μｌとした。ＰＣＲの条件は、まず９４℃で２分間加熱し、９８℃１０秒−５５℃３０秒−７２℃３０秒のサイクルを３５回繰り返した後、７２℃３分、９８℃３分、６５℃１分、５５℃１分、４５℃１分、３５℃１分、２５℃１分とした。
この溶液５μｌを試験片（ＤＮＡ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ Ｓｔｒｉｐ、ロシュ社、＃１−９６５−４８４、ストレプトアビジンが固定され、金コロイド標識抗ジゴキシゲニン抗体を展開可能に保持するアフィニティークロマト試験片）の試料適用部位にスポットし、下端をバッファーに５秒間浸し、室温のままで５分間放置してバッファーを展開した。放置後、遺伝子型判定線の有無を肉眼的に判定した。
（２）非標識オリゴヌクレオチドによる競合の検討
標識ハイブリダイゼーションプローブを１７ｍｅｒとし、競合プローブを反応液中に添加せずに検出を行った。検体とするＤＮＡはｇ７２７アレルのホモ接合子（正常ＤＮＡ）とｔ７２７アレルのホモ接合子（変異ＤＮＡ）を用い、ハイブリダイゼーションプローブとしては正常塩基配列検出用のものと変異塩基配列検出用のものを用いた。結果を図４に示す。図中、ＤＮＡに関するＷｔおよびＭｕｔはそれぞれ正常ＤＮＡおよび変異ＤＮＡを示し、ハイブリダイゼーションプローブに関するＷｔおよびＭｕｔはそれぞれ正常塩基検出用および変異塩基配列検出用を示す（以下の図５〜７においても同様である）。
いずれの組み合わせでも赤い反応ラインが認められる偽陽性が出現し、遺伝子型を決定することができなかった（図４、レーン１〜４）。
競合プローブ（１７ｍｅｒ）を反応液中にハイブリダイゼーションプローブの５〜５０倍量（モル濃度）添加して同様の実験を行った。結果を図５に示す。
競合プローブの添加により偽陽性の反応が著しく減少した。すなわち、正常ＤＮＡに対する変異塩基配列検出用プローブの反応系（図５、レーン６〜８）および変異ＤＮＡに対する正常塩基配列検出用プローブの反応系（同、レーン１０〜１２）において、ごくわずかな赤い反応ラインを認めるのみであった。偽陽性反応の抑制効果はいずれの添加量においても差異を認めず、５０倍量の添加でも偽陽性の反応を完全に抑制することはできなかった。一方、２５〜５０倍量の添加では、本来の陽性反応を抑制しやや反応ラインが薄くなる傾向を認めた（同、レーン３、４、１５および１６）。
（３）ハイブリダイゼーションプローブの鎖長の検討
ハイブリダイゼーションプローブおよび競合プローブとして１７ｍｅｒ、１５ｍｅｒ、１３ｍｅｒ、１１ｍｅｒのものを使用して検討を行った。ここでは、競合プローブの反応液添加量をハイブリダイゼーションプローブの３０倍に固定した。結果を図６に示す。
正常ＤＮＡに対する変異塩基配列検出用プローブの反応系において、１５ｍｅｒではわずかな偽陽性が出現し（図６、レーン４）、１３ｍｅｒと１１ｍｅｒでは消失した（同、レーン５および６）。変異ＤＮＡに対する正常塩基配列検出用プローブの反応系では、１５ｍｅｒ、１３ｍｅｒ、１１ｍｅｒのいずれにおいても偽陽性は消失した（同、レーン７〜９）。しかしながら、１１ｍｅｒでは本来の陽性反応が減弱する傾向を認めた（同、レーン３および１２）。
以上の検討に基づいて、ハイブリダイゼーションプローブおよび競合プローブの鎖長を１２ｍｅｒ（表３）とし、競合プローブの添加量を５倍として、正常ＤＮＡ（ｇ７２７アレルのホモ接合子）、保因者ＤＮＡ（ｇ７２７アレルとｔ７２７アレルのヘテロ接合子）、患者ＤＮＡ（ｔ７２７アレルのホモ接合子）を対象に、上記のように検出を行った。結果を図７に示す。
遺伝子型と完全に一致する結果が得られ、十分な陽性の反応ラインが観察された（図７、レーン１および４並びに５および６）一方、偽陽性はまったく認められなかった（レーン２および３）。
実施例２ 中鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症のａ９８５ｇ変異、高グリシン血症ＧＬＤＣ遺伝子のｇ１６９１ｔ変異、薬剤代謝酵素遺伝子ＣＹＰ２Ｃ１９のｇ６８１ａ、アルデヒド脱水素酵素２のＧｌｕ４８７Ｌｙｓ多型の点変異の検出
中鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症のａ９８５ｇ変異、高グリシン血症ＧＬＤＣ遺伝子のｇ１６９１ｔ変異、薬剤代謝酵素遺伝子ＣＹＰ２Ｃ１９のｇ６８１ａ、アルデヒド脱水素酵素２のＧｌｕ４８７Ｌｙｓ多型の点変異について、本発明の検出法による点変異の検出を行った。
それぞれの点変異の存在部位を含む塩基配列を増幅するＰＣＲプライマーは、ＰＣＲ反応におけるアニール温度が５５℃で増幅が行えるように、鎖長を調節した。また、ハイブリダイゼーションプローブは、Ｔｍ値が３５〜４０℃となるように設計した。結果として、鎖長は、１０ｍｅｒ〜１５ｍｅｒとなった。プライマー、ハイブリダイゼーションプローブおよび競合プローブの塩基配列を表４に示す。
上記プライマーおよびプローブを用いることの他のＰＣＲの条件やプローブの濃度等の条件は、上記のいずれの変異の検出においてもすべて実施例１と同じであった。
これらの条件下で、検出を行ったところ、全ての検出系において正しい遺伝子型の判定が可能であった（図８のａ、ｂ、ｃおよびｄ）。アルデヒド脱水素酵素２のＧｌｕ４８７Ｌｙｓ多型検出においては、変異塩基配列を検出するための反応系において反応ラインが薄いため、競合非標識オリゴヌクレオチドを反応系に混和しないようにしたところ、十分な反応ラインの形成が観察された。いずれの反応においても、偽陽性は認められなかった。
サーマルサイクラーにおける反応が終了してから、遺伝子型判定までに要する時間は１０分以内であった。また、この試験片をそのまま乾燥させたものは、室温に保存した場合、少なくとも２年後でも肉眼的な判定が可能であった。
以上の結果から、本発明の検出法によって、プライマーならびにハイブリダイゼーションプローブおよび競合プローブの設計および反応条件は、個々の遺伝子変異に応じて若干の調整が必要であるものの、５つの遺伝子における各変異・多型を、簡便・迅速に検出し、検体ＤＮＡの遺伝子型を確定できることが示された。従って、本発明の検出法は汎用性を持つものであると認められる。
実施例３ 嚢胞性線維症膜貫通型調節蛋白質遺伝子のｄｅｌｔａＦ５０８欠失変異、テイザックス病のＨＥＸＡ遺伝子の１２７７ｉｎｓＴＡＴＣ挿入変異、乳癌のＢＲＣＡ１遺伝子の５３８２ｉｎｓＣ挿入変異、乳癌のＢＲＣＡ２遺伝子の６１７４ｄｅｌＴ欠失変異、血栓症凝固系第Ｖ因子遺伝子のＧ１６９１Ａ点変異の検出
嚢胞性線維症膜貫通型調節蛋白質遺伝子のｄｅｌｔａＦ５０８欠失変異、テイザックス病のＨＥＸＡ遺伝子の１２７７ｉｎｓＴＡＴＣ挿入変異、乳癌のＢＲＣＡ１遺伝子の５３８２ｉｎｓＣ挿入変異、乳癌のＢＲＣＡ２遺伝子の６１７４ｄｅｌＴ欠失変異、血栓症凝固系第Ｖ因子遺伝子のＧ１６９１Ａ点変異について、本発明の検出法による変異の検出を行った。
それぞれの変異の存在部位を含む塩基配列を増幅するＰＣＲプライマーは、ＰＣＲ反応におけるアニール温度が５５℃で増幅が行えるように、鎖長を調節した。また、ハイブリダイゼーションプローブは、Ｔｍ値が３５〜４０℃となるように設計した。結果として、鎖長は、１０ｍｅｒ〜１５ｍｅｒとなった。プライマー、ハイブリダイゼーションプローブおよび競合プローブの塩基配列を表５に示す。なお、１）〜４）はいずれも塩基の欠失又は挿入の変異であるため、競合プローブは用いなかった。また、３）〜５）は、ヘテロ接合子でも症状を示すため、臨床的には正常塩基配列を持つ遺伝子の有無を調べる必要がないので、正常塩基配列検出用プローブは用いなかった。
上記プライマーおよびプローブを用いることの他のＰＣＲの条件やプローブの濃度等の条件は、上記のいずれの変異の検出においてもすべて実施例１と同じであった。
これらの条件下で、検出を行ったところ、全ての検出系において遺伝子型の判定が可能であった（図９）。いずれの反応においても、偽陽性は認められなかった。
サーマルサイクラーにおける反応が終了してから、遺伝子型判定までに要する時間は１０分以内であった。また、この試験片をそのまま乾燥させたものは、室温に保存した場合、少なくとも２年後でも肉眼的な判定が可能であった。
以上の結果から、本発明の検出法によって、プライマーならびにハイブリダイゼーションプローブおよび競合プローブの設計および反応条件は、個々の遺伝子変異に応じて若干の調整が必要であるものの、挿入・欠失変異を含む変異を、簡便・迅速に検出し、検体ＤＮＡの遺伝子型を確定できることが示された。従って、本発明の検出法は汎用性を持つものであると認められる。
【産業上の利用可能性】
本発明によれば、通常のサーマルサイクラー以外に特殊な機器や装置を用いずに、簡便・迅速・確実に、病因遺伝子変異の同定や、疾患関連遺伝子および薬剤代謝酵素遺伝子の多型の検出を行うことができる。本発明の検出法は、ベッドサイドでの検出を可能にし、オーダーメイド医療を容易にする手法であると考えられる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡポリメラーゼを用いて、変異部位を含む検出対象塩基配列を含むＤＮＡの増幅を行う工程、増幅されたＤＮＡと、検出対象塩基配列に相補的である塩基配列を有するハイブリダイゼーションプローブとをハイブリダイズさせる工程、および、ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを検出する工程を含む塩基配列の検出方法であって、
ＤＮＡの増幅に用いるプライマーの少なくとも一つは、増幅されたＤＮＡが第１の標識物質により標識されるように第１の標識物質により標識されており、ハイブリダイゼーションプローブは第２の標識物質により標識されるとともに、ＤＮＡの増幅が行われる反応液に含まれており、ハイブリダイゼーションプローブの有する塩基配列は、ＤＮＡの増幅を阻害しないように設定されており、ハイブリッドの検出は第１の標識物質および第２の標識物質を利用してアフィニティークロマトグラフィーにより行われる前記方法。
【請求項２】
変異部位が点変異であり、ＤＮＡの増幅が行われる反応液が、増幅されたＤＮＡと標識されたハイブリダイゼーションプローブとのハイブリダイゼーションの特異性を高めるのに十分な量の、標識されたハイブリダイゼーションプローブの塩基配列と点変異の位置で１塩基異なる塩基配列を有しかつ標識されていないオリゴヌクレオチドをさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＤＮＡの増幅がＰＣＲによる増幅である請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ＤＮＡポリメラーゼを用いて、変異部位を含む検出対象塩基配列を含むＤＮＡの増幅を行うためのプライマーと、検出対象塩基配列に相補的である塩基配列を有するハイブリダイゼーションプローブと、アフィニティークロマトグラフィー用試験片とを含むキットであって、
ＤＮＡの増幅に用いるプライマーの少なくとも一つは、増幅されたＤＮＡが第１の標識物質により標識されるように第１の標識物質により標識されており、ハイブリダイゼーションプローブは第２の標識物質により標識され、ハイブリダイゼーションプローブの有する塩基配列は、ＤＮＡの増幅を阻害しないように設定されており、試験片は第１の標識物質および第２の標識物質を利用して増幅されたＤＮＡとハイブリダイゼーションプローブとのハイブリッドを検出できるものである前記キット。
【請求項５】
変異部位が点変異であり、標識されたハイブリダイゼーションプローブの塩基配列と点変異の位置で１塩基異なる塩基配列を有しかつ標識されていないオリゴヌクレオチドをさらに含む請求項４記載のキット。
【請求項６】
プライマーがＰＣＲ用プライマーである請求項４または５記載のキット。
【請求項１】
ＤＮＡポリメラーゼを用いて、変異部位を含む検出対象塩基配列を含むＤＮＡの増幅を行う工程、増幅されたＤＮＡと、検出対象塩基配列に相補的である塩基配列を有するハイブリダイゼーションプローブとをハイブリダイズさせる工程、および、ハイブリダイゼーションにより形成されたハイブリッドを検出する工程を含む塩基配列の検出方法であって、
ＤＮＡの増幅に用いるプライマーの少なくとも一つは、増幅されたＤＮＡが第１の標識物質により標識されるように第１の標識物質により標識されており、ハイブリダイゼーションプローブは第２の標識物質により標識されるとともに、ＤＮＡの増幅が行われる反応液に含まれており、ハイブリダイゼーションプローブの有する塩基配列は、ＤＮＡの増幅を阻害しないように設定されており、ハイブリッドの検出は第１の標識物質および第２の標識物質を利用してアフィニティークロマトグラフィーにより行われる前記方法。
【請求項２】
変異部位が点変異であり、ＤＮＡの増幅が行われる反応液が、増幅されたＤＮＡと標識されたハイブリダイゼーションプローブとのハイブリダイゼーションの特異性を高めるのに十分な量の、標識されたハイブリダイゼーションプローブの塩基配列と点変異の位置で１塩基異なる塩基配列を有しかつ標識されていないオリゴヌクレオチドをさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＤＮＡの増幅がＰＣＲによる増幅である請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ＤＮＡポリメラーゼを用いて、変異部位を含む検出対象塩基配列を含むＤＮＡの増幅を行うためのプライマーと、検出対象塩基配列に相補的である塩基配列を有するハイブリダイゼーションプローブと、アフィニティークロマトグラフィー用試験片とを含むキットであって、
ＤＮＡの増幅に用いるプライマーの少なくとも一つは、増幅されたＤＮＡが第１の標識物質により標識されるように第１の標識物質により標識されており、ハイブリダイゼーションプローブは第２の標識物質により標識され、ハイブリダイゼーションプローブの有する塩基配列は、ＤＮＡの増幅を阻害しないように設定されており、試験片は第１の標識物質および第２の標識物質を利用して増幅されたＤＮＡとハイブリダイゼーションプローブとのハイブリッドを検出できるものである前記キット。
【請求項５】
変異部位が点変異であり、標識されたハイブリダイゼーションプローブの塩基配列と点変異の位置で１塩基異なる塩基配列を有しかつ標識されていないオリゴヌクレオチドをさらに含む請求項４記載のキット。
【請求項６】
プライマーがＰＣＲ用プライマーである請求項４または５記載のキット。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４２０５７
【国際公開日】平成１６年５月２１日（２００４．５．２１）
【発行日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５４９６４０（Ｐ２００４−５４９６４０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１４２０４
【国際出願日】平成１５年１１月７日（２００３．１１．７）
【出願人】（５０２４０３６２６）
【出願人】（５０２４０４９１１）
【出願人】（３９００３７３２７）第一化学薬品株式会社 (111)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年５月２１日（２００４．５．２１）
【発行日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１４２０４
【国際出願日】平成１５年１１月７日（２００３．１１．７）
【出願人】（５０２４０３６２６）
【出願人】（５０２４０４９１１）
【出願人】（３９００３７３２７）第一化学薬品株式会社 (111)
【Ｆターム（参考）】
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