遺伝子検出方法
【課題】 特定の遺伝子配列を、挿入剤を用いて検出する遺伝子検出方法に関し、１本鎖の核酸プローブや電極表面に非特異的に吸着する挿入剤によるバックグランドノイズの影響を無くする。
【解決手段】 検出すべき遺伝子配列に相補的なプローブ核酸を基板に固定するステップと、プローブ核酸と１本鎖に変性された検体核酸とをハイブリダイズ反応させるステップと、ハイブリダイズされた２本鎖核酸に特異的な２本鎖核酸挿入部位と、電気化学活性を有する電気化学活性部位と、両部位を連結する連結部位とからなる挿入剤を添加し、第１の波長の光照射により２本鎖核酸挿入部位と２本鎖核酸を共有結合させるステップと、２本鎖核酸を電解液で満たし、第２の波長の光照射により、共有結合された２本鎖核酸挿入部位を２本鎖核酸から分離するステップと、挿入剤が分離した電解溶液中に電極部を配置し、分離された挿入剤を電気化学的に検出するステップとを有する。
【解決手段】 検出すべき遺伝子配列に相補的なプローブ核酸を基板に固定するステップと、プローブ核酸と１本鎖に変性された検体核酸とをハイブリダイズ反応させるステップと、ハイブリダイズされた２本鎖核酸に特異的な２本鎖核酸挿入部位と、電気化学活性を有する電気化学活性部位と、両部位を連結する連結部位とからなる挿入剤を添加し、第１の波長の光照射により２本鎖核酸挿入部位と２本鎖核酸を共有結合させるステップと、２本鎖核酸を電解液で満たし、第２の波長の光照射により、共有結合された２本鎖核酸挿入部位を２本鎖核酸から分離するステップと、挿入剤が分離した電解溶液中に電極部を配置し、分離された挿入剤を電気化学的に検出するステップとを有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に存在する特定の遺伝子配列を高感度に検出するための遺伝子検出方法に関し、より詳細には、挿入剤により電気化学的に遺伝子を検出する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の、電気化学的に特定の遺伝子配列を検出するＤＮＡチップは、検出すべき目的遺伝子に対して相補的な塩基配列を有する１本鎖のプローブ核酸を電極表面に固定し、プローブ核酸と１本鎖に変性された遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせた後、２本鎖核酸に特異的に結合しかつ電気化学的に活性な挿入剤をプローブ核酸と遺伝子サンプルとの反応系に添加し、電極を介した電気化学的な測定によりプローブ核酸と目的遺伝子サンプルとの２本鎖核酸に結合した挿入剤を検出し、これによりプローブ核酸とハイブリダイズした目的遺伝子サンプルの存在を検出している（特許文献１及び特許文献２）。
【０００３】
ここで、挿入剤は、２本鎖の核酸を認識し、特異的に結合する物質を指す。挿入剤は、何れも分子中にフェニル基等の平板状挿入基を有し、挿入基が２本鎖核酸の塩基対と塩基対の間に介入することによって、２本鎖核酸と結合する。この挿入剤は、２本鎖核酸と一定の速度で塩基対間への挿入、および塩基対間からの離脱が繰り返されている平衡反応による結合である。
さらに、挿入剤として電気的に可逆な酸化還元反応を起こす挿入剤を用いることにより、電気化学的変化の測定によって、２本鎖核酸に結合した挿入剤を検出することができる。電気化学的変化の測定としては、酸化還元時に発生する電流や発光を検出する方法がある。
【０００４】
以上のように、前記検出方法においては、前記挿入剤が２本鎖核酸にのみ特異的に結合すること、また、前記２本鎖核酸に結合した挿入剤の量を検出することが重要となる。しかし、前記挿入剤は、１本鎖の核酸プローブや、該核酸プローブが固定される電極表面にも非特異的に吸着してしまう。そして、この非特異的に吸着した挿入剤は、前記２本鎖核酸に結合した挿入剤の量の検出時に、バックグランドノイズとなり、検出感度を低下させる原因となる。
【０００５】
これを解消するため、前記検出方法においては、前記挿入剤の添加後に、前記１本鎖の核酸プローブ及び電極表面に非特異的な吸着をしている挿入剤を除去するための洗浄が必要となっている。
【特許文献１】特許第２５７４４４３号公報
【特許文献２】特許第３２３３８５１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来の検出方法では、挿入剤と２本鎖核酸間の結合は静電気的相互作用あるいは疎水的相互作用によるものであって、結合力が弱いため、前述したように、前記１本鎖の核酸プローブや、該核酸プローブが固定される電極表面に非特異的に吸着した挿入剤を除去する洗浄工程の際に、２本鎖核酸に挿入させた挿入剤も解離してしまい、逆に検出感度を低下させてしまう、という課題がある。
【０００７】
一方、前記２本鎖核酸に結合した挿入剤が解離しないように考慮した前記洗浄では、該非特異的に吸着した挿入剤の除去が不十分となるため、バックグランドノイズが増加してしまい、検出感度の低下につながる、という課題がある。
【０００８】
本発明は、前記課題を解決するためになされたものであって、挿入剤の電気化学測定を行うための電極表面に１本鎖の核酸プローブを固定するのではなく、電極とは別の基板上に１本鎖の核酸プローブを固定化しておき、この１本鎖の核酸プローブと目的遺伝子サンプルをハイブリタイズさせた２本鎖核酸に対して、一旦、挿入剤を強固に結合させ、その後、強固に結合された挿入剤のみを分離させる操作を行い、この分離された挿入剤を電気化学的に検出することで、従来の非特異的に吸着する挿入剤によるバックグランドノイズの影響や、洗浄工程による検出感度の低下の問題を無くし、目的遺伝子サンプルとハイブリダイズした前記核酸プローブを高感度に検出可能な遺伝子検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題に鑑みて、本発明の遺伝子検出方法は、検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブ核酸を基板に固定させるステップと、
該プローブ核酸と１本鎖に変性された検体核酸とをハイブリダイズ反応させるステップと、
前記ハイブリダイズ反応により形成された２本鎖核酸に対し、前記２本鎖核酸に特異的な光架橋性化合物である２本鎖核酸挿入部位と、電気化学活性を有する電気化学活性部位と、前記２本鎖核酸挿入部位と前記電気化学活性部位とを連結する連結部位と、を有する化合物からなる挿入剤を添加した後、第１の波長の光照射により前記２本鎖核酸挿入部位と２本鎖核酸を共有結合させるステップと、
前記ステップの後、２本鎖核酸の周囲を電解溶液で満たし、第２の波長の光照射により、共有結合された２本鎖核酸挿入部位を２本鎖核酸から分離させるステップと、
挿入剤が分離した電解溶液中に電極部を配置し、電解溶液中に分離された前記挿入剤の存在を、前記電極部を介した電気化学的な測定により検出するステップと、
を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
以上のように本発明の遺伝子検出方法は、挿入剤の電気化学測定を行うための電極とは別の基板上に１本鎖の核酸プローブを固定化しておき、この１本鎖の核酸プローブと目的遺伝子サンプルをハイブリタイズさせた２本鎖核酸に対して、一旦、挿入剤を強固に結合させ、その後、強固に結合された挿入剤のみを電解溶液中に分離させる操作を行うようにしている。そして、電解溶液中に分離された挿入剤を電極にて電気化学発光させて、電気化学的に測定することで目的遺伝子を検出するようにしている。このため従来問題となっていた、１本鎖の核酸プローブや電極表面に非特異的な吸着をしていた挿入剤によるバックグランド電流やバックグランド発光の影響を無くすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に、本発明の遺伝子検出法の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【００１２】
まず、検体から遺伝子サンプルを抽出する前処理を行う。検体は、痰、血液、糞便、精液、唾液、培養細胞、組織細胞、その他遺伝子を有する試料を超音波、振とうなどの物理手段、核酸抽出溶液を用いる化学的手段を用いて抽出する。
【００１３】
試料中の細胞の破壊は、常法により行うことができ、例えば、振とう、超音波等の物理的作用を外部から加えて行うことができる。また、核酸抽出溶液（例えば、ＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、Ｔｗｅｅｎ−２０等の界面活性剤、又はサポニン、ＥＤＴＡ、プロテア−ゼ等を含む溶液等）を用いて、細胞から核酸を遊離させることもできる。
【００１４】
抽出された長鎖の２本鎖核酸は制限酵素、あるいは超音波などの物理的手段によって任意の長さに切断される。切断された２本鎖核酸は熱処理、あるいはアルカリ変性により１本鎖核酸に分離される。これらの工程により遺伝子サンプルを得る。遺伝子サンプルは、電気泳動による分離等で精製した核酸断片でもよい。
【００１５】
プローブ核酸は、検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する１本鎖のプローブ核酸であり、生物試料から抽出した核酸を制限酵素で切断し、電気泳動による分離等で精製した核酸、あるいは化学合成で得られた１本鎖の核酸を用いることができる。生物試料から抽出した核酸の場合には、熱処理あるいはアルカリ処理によって、１本鎖の核酸に解離させておくことが好ましい。
【００１６】
このようにして得られたプローブ核酸を固定部に固定する。固定化方法としては、公知の方法が用いられる。例えば固定部がグラシーカーボンである場合、グラシーカーボンを過マンガン酸カリウムで酸化することによって、固定部表面にカルボン酸基を導入する。次いで、該核酸は、末端にアミノ基を有することにより、アミド結合により固定部表面に固定される。実際の固定化方法については、文献（ケー． エム． ミラン（Ｋ．Ｍ．Ｍｉｌｌａｎ）外， アナリティカル ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），６５巻，２３１７頁，１９９３年）に詳細が記載されている。また、マイクロアレイで用いられる公知の結合方法（例えばシランカップリング法）を用いることができる。
【００１７】
本発明で用いる固定部材料はプローブ核酸の固定方法によって選択され、金属、半導体、高分子材料など特に限定しないが、挿入剤と吸着もしくは結合を起こさないように親水処理若しくは無電荷状態に保っていることが好ましい。
【００１８】
より具体的には、親水性を有する酸化シリコン、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛のような酸化物、或いは高分子材料である、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、テフロン（登録商標）、ポリフッ化エチレン、メラミン、ナイロン等が挙げられる。
【００１９】
本発明で用いる電極部は特に限定されるものではなく、使用可能な電極材料としては、例えば金、白金、白金黒、パラジウム、ロジウムのような貴金属電極、グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カ―ボンペ―スト、カ―ボンファイバ―のような炭素電極、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛のような酸化物電極、Ｓｉ、Ｇｅ、 ＺｎＯ、 ＣｄＳ、ＴｉＯ、ＧａＡｓのような半導体電極等が挙げられる。
【００２０】
上記で得られた、プローブ核酸が結合した固定部を、遺伝子サンプルを含む溶液に接触させることにより、プローブ核酸と相補的な配列を有する遺伝子サンプルがハイブリダイズし、２本鎖核酸が形成されるが、ハイブリダイズさせる方法は周知である。
【００２１】
このように２本鎖核酸を形成した後、挿入剤を添加し、２本鎖核酸に挿入させる。その後、光照射を行い、２本鎖核酸と挿入剤との間で共有結合を形成させる。なお、挿入剤の添加は、ハイブリダイゼ−ション反応前に検体試料中に添加することもできる。
【００２２】
上記のような特性を満たす挿入剤は、２本鎖核酸に特異的に挿入し、かつ光照射により２本鎖核酸と共有結合できる２本鎖核酸結合部位と、電気化学活性を有する電気化学活性部位と、前記２本鎖核酸結合部位と前記電気化学活性部位とを連結する連結部位を有する化合物である、ことを特徴とする。
【００２３】
例えば、下記一般式（１）で表すことができる。
【００２４】
一般式（１）Ｆ − Ｌ − Ｉ
［但し、Ｆは電気化学活性基、Ｌは連結基、そしてＩは２本鎖核酸挿入基であって、Ｉは光照射により２本鎖核酸と光反応する部位を有する］。
【００２５】
一般式（１）において、Ｉで示される物質は、２本鎖核酸に特異的に挿入し、かつ光照射の波長により２本鎖核酸と共有結合、または切断できる物質であり、感光性挿入剤と呼ばれる物質を用いることができる。
【００２６】
このような感光性挿入剤としては、例えば、フロクマリン誘導体が挙げられ、特にソラレン誘導体が好ましい。ソラレン誘導体は、２本鎖核酸に挿入し非共有的相互作用を起こし、長波長紫外線（３１０〜３９０ｎｍ）を照射すると安定な共有結合を形成する。さらに、短波長紫外線（２１０〜２９０ｎｍ）を照射すると共有結合が切断され、感光性挿入剤は２本鎖核酸から解離する。
【００２７】
ソラレン誘導体の具体的な例としては、ソラレン、メトキシソラレン、トリメチルソラレン等が挙げられる。
【００２８】
一般式（１）において、Ｆで示される物質は、電気化学活性を有する物質であり、電気化学的に検出可能な物質であれば、限定されるものではない。例えば、酸化還元性を有する化合物を挙げることができ、可逆な酸化還元反応時に生じる酸化還元電流を測定することで検出が可能である。
【００２９】
このような酸化還元性を有する化合物としては、例えば、フェロセン、カテコールアミン、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエンもしくはビオローゲン等がある。
【００３０】
さらに、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエンには、酸化還元反応時に電気化学発光を生じるものもあり、その発光を測定することで検出を行うこともできる。
【００３１】
そして特に、中心金属がルテニウム、オスニウムである錯体は良好な電気化学発光特性を有し、このような良好な電気化学発光特性を有する物質としては、例えば、ルテニウムビピリジン錯体、ルテニウムフェナントロリン錯体、オスニウムビピリジン錯体、オスニウムフェナントロリン錯体等を挙げることができる。
【００３２】
さらに、前記一般式（１）において、連結基Ｌとして用いることができる基としては、前記電気化学活性基Ｆと前記２本鎖核酸挿入基Ｉとを連結するものであれば、そのリンカー配列は特に制限されるものではなく、例えば、アルキル基、−Ｏ−基、−ＣＯ−基、−ＮＨ−基、リン酸基、又はこれらの組み合わせから成る基などを挙げることができる。
【００３３】
以上に説明したような挿入剤を、前記遺伝子サンプルと固定部に固定された前記プローブ核酸をハイブリダイズさせる前もしくは後に添加し、該プローブ核酸と遺伝子サンプルとがハイブリダイズした２本鎖核酸と前記挿入剤とを長波長紫外線照射により共有結合させる。
【００３４】
長波長紫外線の照射により２本鎖核酸への挿入したソラレン部が強固に２本鎖核酸と共有結合するようになり、引き続いて、１本鎖の核酸プローブや、固定部の他の表面に、非特異的に吸着した挿入剤を洗浄したとしても、洗浄等の操作によって抜け落ちることがなくなる。
【００３５】
長波長紫外線の照射後、未反応の挿入剤を含む溶液を除く。さらに、酸化生成した電気化学活性基と電気化学的反応を示す物質、例えばトリプロピルアミンやトリエチルアミンを含む電解溶液中で短波長紫外線照射工程を行う。短波長紫外線は２本鎖核酸に特異的に結合している挿入剤とのみ解離反応を起こし、２本鎖核酸から挿入剤が分離される。
【００３６】
さらにこの電解液中に含まれる挿入剤由来の電気化学的な信号を電極にて測定することにより、２本鎖核酸の存在を高感度に検出することができる。
【００３７】
前記挿入剤由来の電気化学的な信号は、添加する挿入剤の種類により異なるが、酸化還元電流を生じる挿入剤を用いた場合には、ポテンショスタット、ファンクションジェネレータ等からなる計測系で測定できる。一方、電気化学発光を生じる挿入剤を用いた場合には、光電子増倍管等の光検知器を用いて計測が可能である。
【００３８】
図１は、本発明の一実施の形態における遺伝子検出方法の概略を示したものである。固定部１に固定されたプローブ核酸２と検体核酸３をハイブリダイズ反応させ、２本鎖核酸にする（図１（ａ））。２本鎖核酸に挿入剤を添加し（図１（ｂ））、長波長紫外線５を照射することで挿入剤は特異的に２本鎖核酸と結合する。固定部外の表面に挿入剤が非特異吸着しない場合、挿入剤６は２本鎖核酸にのみ結合する（図１（ｃ））。未反応の挿入剤を洗い流した後、電解溶液中で短波長紫外線７を照射し、２本鎖核酸と結合している挿入剤を解離させる（図１（ｄ））。この解離した挿入剤８由来の電気化学的信号を測定することで、２本鎖核酸を検知することが可能となる。
【００３９】
固定部外の表面に挿入剤が非特異吸着する場合、長波長紫外線１０を照射することにより２本鎖核酸と結合した挿入剤１１と、固定部外の表面に非特異に飽和吸着する挿入剤９が存在する（図１（ｃ´））。未反応の挿入剤を洗い流した後、電解溶液中で短波長紫外線１２を照射し、２本鎖核酸と結合している挿入剤を解離させる（図１（ｄ´））。このとき、基板は挿入剤９が飽和吸着しており、基板解離した挿入剤１３は表面へ再吸着することなく電解溶液に拡散される。この挿入剤１３由来の電気化学的信号を測定することで、２本鎖核酸を検知することが可能となる。
【００４０】
いずれの場合においても、２本鎖の核酸プローブを測定電極ではなく固定部に固定化し、長波長紫外線で共有結合させ、後に短波長紫外線で分離した挿入剤を固定部と別に設けた電極で検出することで、従来の電極への非特異吸着した挿入剤をバックグラウンドノイズとして検知することなく、非常に高感度な２本鎖核酸検出が可能となる。
【実施例１】
【００４１】
本発明による、挿入剤を用いた遺伝子検出方法についてオリゴヌクレオチドを用いて例示する。
（１）プローブ核酸の固定
基板上に、プローブ核酸を固定させるための固定部を設ける。固定部基板上にグラッシーカーボンを配置し、過マンガン酸カリウムで酸化することによって、カーボン表面にカルボン酸基を導入する。
【００４２】
プローブ核酸には、ヒト由来Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０の遺伝子配列の５´末端より６２９−６６８番目に位置するＣＣＣＣＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＡＴＧＣＡＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＣＡＣＴＡＴＣＡＴの配列を有する、５´末端のリン酸基を介してアミノヘキシル基を修飾した４０塩基のオリゴヌクレオチド（タカラバイオ製、配列表中、ＳｅｑｕｅｎｃｅＮａｍｅ１の部分に該当）を使用した。なお、オリゴヌクレオチドの配列のＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃは、アデニン、グアニン、チミン、シトシンの各塩基を示す。
【００４３】
上記プローブ核酸を、１０ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、及び５０ｍＭの２−モルホリノエタンスルフォン酸−水酸化ナトリウムの反応混合液（ｐＨ５．５）に溶解し、１０μＭに調整した。その後、固定部領域内に滴下、室温で一昼夜反応させ、主鎖の５´末端に存在するアミノ基と基板表面に存在するカルボキシル基とを共有結合させた。一昼夜反応後、反応混合液を除去し、２００ｍＭの２−アミノエタノール、１０ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、及び５０ｍＭの２−モルホリノエタンスルフォン酸−水酸化ナトリウムの反応混合液（ｐＨ５．５）を５０μｌ滴下し、室温で２時間反応させ、遊離状態のカルボキシル基を遮蔽させた。
（２）ハイブリダイゼーション
遺伝子サンプルには、上記プローブ核酸と相補的な５´末端からＡＴＧＡＴＡＧＴＧＧＧＡＡＡＡＴＴＡＴＴＧＣＡＴＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＧＧＧＧの配列を有するオリゴデオキシヌクレオチド（タカラバイオ製、配列表中、ＳｅｑｕｅｎｃｅＮａｍｅ２の部分に該当）を使用した。
【００４４】
遺伝子サンプルは、２×ＳＳＣを混合したハイブリダイゼーション溶液に溶解させ、２０μＭに調整した。この調整した溶液を、プローブ核酸を固定した固定部上に滴下し、６０℃の恒温槽内で４時間反応させ、２本鎖核酸を形成させた。
【００４５】
また、上記プローブ核酸と非相補的な配列を有する遺伝子サンプルとして、５´末端のリン酸基を介してアミノヘキシル基を修飾した４０塩基のＰｏｌｙ−Ａ配列を有する非相補ＤＮＡ（５´末端からＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ、タカラバイオ製、配列表中、ＳｅｑｕｅｎｃｅＮａｍｅ３の部分に該当）を用意し比較を行った。
（３）挿入剤の添加
挿入剤には、下記の（化１）に示すソラレン修飾ルテニウム錯体を使用した。
【００４６】
【化１】
【００４７】
ソラレン修飾ルテニウム錯体の合成は、以下手順により得ることができる。
【００４８】
まず、公知の方法（バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１６巻，６号，１０５８頁， １９７７年）により合成した４’−クロロメチル−４，５，８−トリメチルソラレン（０．５ｇ、１．８１ｍｍｏｌ）を、水酸化ナトリウム溶解 ジメチルホルムアミド（乾燥）に溶かし、１６０℃で撹拌しながら１，４−ジアミノブタン（０．３２ｇ、３．６３ｍｍｏｌ）を滴下し１２時間反応させた。溶媒を留去した後、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー処理により精製し、生成物Ａを得た（収率４０％）。
【００４９】
次に、ＴＨＦ６０．０ｍＬに溶解させた４，４’−ジメチル−２，２’ビピリジン２．５０ｇ（１．３５×１０−２ｍｏｌ）溶液を窒素雰囲気の容器に注入した後、リチウムジイソプロピルアミド２Ｍ溶液１６．９ｍＬ（２．７０×１０−２ｍｏｌ）を滴下し、冷却しながら３０分撹拌した。一方、同様に窒素気流中で乾燥させた容器に、１，２−ジブロモエタン７．６１ｇ（４．０５×１０−２ｍｏｌ）とＴＨＦ１０ｍＬとを加え、冷却しながら撹拌させた。
【００５０】
この１，２−ジブロモエタンとＴＨＦとが挿入された容器に、先程の、ＴＨＦに溶解させた４，４’−ジメチル−２，２’ビピリジン溶液とリチウムジイソプロピルアミド２Ｍ溶液とを反応させた反応液をゆっくり滴下させ、２．５時間反応させた。そして、この反応溶液を、２Ｎの塩酸で中和して、ＴＨＦを留去した後、クロロホルムで抽出し、さらに、前記溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、生成物Ｂを得た（収率４７％）。
【００５１】
そして、前記生成物Ａ（０．５０ｇ、１．５２ｍｍｏｌ）と前記生成物Ｂ（０．４９ｇ、１．６８ｍｍｏｌ）とを、水酸化ナトリウム溶解ジメチルホルムアミド（乾燥）に溶かし、１６０℃で１８時間撹拌させた。そして、この攪拌した溶媒を留去した後、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー処理により精製し、生成物Ｃを得た（収率３８％）。
【００５２】
さらに、塩化ルテニウム（ＩＩＩ）（２．９８ｇ、０．０１ｍｏｌ）、及び２，２’−ビピリジン（３．４４ｇ、０．０２２ｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（８０．０ｍＬ）中で６時間還流した後、溶媒を留去した。その後、アセトンを加え、一晩冷却することで得られた黒色沈殿物を採取し、エタノール水溶液１７０ｍＬ（エタノール：水＝１：１）を加え、１時間加熱還流を行った。ろ過後、塩化リチウムを２０ｇ加え、エタノールを留去し、さらに一晩冷却した。析出した黒色物質は、吸引ろ過で採取し、生成物Ｄを得た（収率６８．２％）。
【００５３】
そして、前記生成物Ｃ（０．３０ｇ、０．５６ｍｍｏｌ）と前記生成物Ｄ（０．３２ｇ、０．６６ｍｍｏｌ）とを、ジメチルホルムアミドに溶かして６時間還流し、反応後、溶媒を留去させて得た黒紫色の物質に蒸留水を加えて溶解させ、未反応錯体をろ過により除去した後、溶媒を留去した。
【００５４】
得られた粗生成物は、シリカゲルクロマトグラフィー処理により精製し、ソラレン修飾ルテニウム錯体を得た（収率６８％）。表１は、前述のようにして得たソラレン修飾ルテニウム錯体の１Ｈ−ＮＭＲ結果である。
【００５５】
（表１）
１Ｈ-ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯｄ−６）
σ：
・ ４〜１．８ （６Ｈ，ｍ）
・ ４〜２．６ （１２Ｈ，ｍ）
２．７４ （２Ｈ，ｔ）
・ ８〜３．１ （６Ｈ，ｍ）
・ ３１ （２Ｈ，ｓ）
６．３２ （１Ｈ，ｓ）
７．３８ （２Ｈ，ｄ）
７．５４ （７Ｈ，ｍ）
７．７７ （４Ｈ，ｍ）
８．１６ （４Ｈ，ｔ）
８．７０ （２Ｈ，ｄ）
８．８８ （４Ｈ，ｄ）
このようにして得られたソラレン修飾ルテニウム錯体を、１０ｍＭのリン酸バッファで２μＭに調整した。
【００５６】
この調整した溶液を、２本鎖核酸が形成した固定部に添加し、３０分間４℃の冷蔵庫内で暗反応を行った。３０分後、長波長紫外光源（ＵＶＰ製ＣＬ１０００Ｌ型）を用いて波長３６５ｎｍ、５ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１０分間照射し、ソラレンと２本鎖核酸を共有結合させた。共有結合後、固定部を１０ｍＭのリン酸バッファで１分間洗い流した。
（４）電気化学発光測定
本実施例における遺伝子検出方法について、図２を用いて説明する。上記工程の後、固定部基板２４と作用極、対極、参照極の電極２１を配置した電極基板２２を、０.１Ｍのリン酸バッファおよび０．１Ｍのトリエチルアミンを混合した電解溶液２５に満たす。ここで参照極は、基準電位を求めるためのものである。溶液内で固定部２３に対して、短波長紫外光源２６（ＵＶＰ製ＣＬ１０００型）を用いて波長２６５ｎｍ、５ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１０分間照射し、挿入剤を２本鎖核酸から分離させ電解溶液に拡散させた。分離した挿入剤を電解溶液中に均一に拡散させるため、電解溶液を軽く攪拌した。
【００５７】
その後、電極２１にポテンショスタット２９から電圧を印加し、この時に生じた挿入剤由来の電気化学発光の測定を光電子増倍管２７（浜松ホトニクス製Ｈ７３６０−０１）を用いて行った。なお、電圧の印加は、０Ｖから１．３Ｖまで５秒間走査し、電圧走査中における最大発光量を測定した。挿入剤由来の発光量はフォトカウンター２８でカウントされ、得られたデータはコントローラＰＣ３０に格納される。また、電圧、電流、発光量等のデータはモニタ３１でモニタリングすることができる。
【００５８】
図３に本実施例で得られた電気化学発光測定による挿入剤の発光量を示したものである。図３において、相補的な、つまり２本鎖核酸由来の発光量は、非相補的な、２本鎖核酸を形成していない１本鎖核酸由来の発光量と比較して著しく高い値となっており、高感度に２本鎖核酸の検出が可能であることがわかる。また、核酸のない場合はほとんど発光が見られないことから、バックグラウンド発光はほとんど生じないことは明らかである。
【実施例２】
【００５９】
本発明による、挿入剤を用いた遺伝子検出方法についてオリゴヌクレオチドを用いて例示する。
（１）〜（３）は実施例１に同じ。
（４）電気化学発光測定
本実施例における遺伝子検出方法について、図４を用いて説明する。固定部基板４４を、０.１Ｍのリン酸バッファおよび０．１Ｍのトリエチルアミンを混合した電解溶液４５に満たす。溶液内で固定部４３に対して、短波長紫外光源４６（ＵＶＰ製ＣＬ１０００型）を用いて波長２６５ｎｍ、５ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１０分間照射し、挿入剤を２本鎖核酸から分離させ電解溶液に拡散させた。挿入剤が拡散した電解溶液を取り出し、作用極、対極、参照極の電極４１を配置した電極基板４２上に滴下する。
【００６０】
その後、電極４１にポテンショスタット４９から電圧を印加し、この時に生じた挿入剤由来の電気化学発光の測定を光電子増倍管４７（浜松ホトニクス製Ｈ７３６０−０１）を用いて行った。なお、電圧の印加は、０Ｖから１．３Ｖまで５秒間走査し、電圧走査中における最大発光量を測定した。挿入剤由来の発光量はフォトカウンター４８でカウントされ、得られたデータはコントローラＰＣ５０に格納される。また、電圧、電流、発光量等のデータはモニタ５１でモニタリングすることができる。本実施例により、図３と同様な結果が示された。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明にかかる遺伝子検出方法は、光照射による簡便な作業性と、測定のバックグラウンドノイズが極力低減可能であるため、非常に高感度に目的遺伝子を検出可能である。このため、高感度測定が必要な１塩基変異多型や細菌検査、ウイルス検査に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本発明の実施の形態に係る遺伝子検出方法の概略図
【図２】本発明の実施例１に係る遺伝子検出装置の概略図
【図３】本発明の実施例に係る遺伝子検出方法により検出した遺伝子サンプルからの最大発光量の測定図
【図４】本発明の実施例２に係る遺伝子検出装置の概略図
【符号の説明】
【００６３】
１，２３，４３ 固定部
２ プローブ核酸
３ 検体核酸
４ 挿入剤
５，１０ 長波長紫外線
６，１１ ２本鎖核酸に結合した挿入剤
７，１２ 短波長紫外線
８，１３ ２本鎖核酸から分離した挿入剤
９ 固定部に非特異に飽和吸着した挿入剤
２１，４１ 電極
２２，４２ 電極基板
２４，４４ 固定部用基板
２５，４５ 電解溶液
２６，４６ 紫外光源
２７，４７ 光電子増倍管
２８，４８ フォトカウンター
２９，４９ ポテンショスタット
３０，５０ コントローラＰＣ
３１，５１ モニタ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に存在する特定の遺伝子配列を高感度に検出するための遺伝子検出方法に関し、より詳細には、挿入剤により電気化学的に遺伝子を検出する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の、電気化学的に特定の遺伝子配列を検出するＤＮＡチップは、検出すべき目的遺伝子に対して相補的な塩基配列を有する１本鎖のプローブ核酸を電極表面に固定し、プローブ核酸と１本鎖に変性された遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせた後、２本鎖核酸に特異的に結合しかつ電気化学的に活性な挿入剤をプローブ核酸と遺伝子サンプルとの反応系に添加し、電極を介した電気化学的な測定によりプローブ核酸と目的遺伝子サンプルとの２本鎖核酸に結合した挿入剤を検出し、これによりプローブ核酸とハイブリダイズした目的遺伝子サンプルの存在を検出している（特許文献１及び特許文献２）。
【０００３】
ここで、挿入剤は、２本鎖の核酸を認識し、特異的に結合する物質を指す。挿入剤は、何れも分子中にフェニル基等の平板状挿入基を有し、挿入基が２本鎖核酸の塩基対と塩基対の間に介入することによって、２本鎖核酸と結合する。この挿入剤は、２本鎖核酸と一定の速度で塩基対間への挿入、および塩基対間からの離脱が繰り返されている平衡反応による結合である。
さらに、挿入剤として電気的に可逆な酸化還元反応を起こす挿入剤を用いることにより、電気化学的変化の測定によって、２本鎖核酸に結合した挿入剤を検出することができる。電気化学的変化の測定としては、酸化還元時に発生する電流や発光を検出する方法がある。
【０００４】
以上のように、前記検出方法においては、前記挿入剤が２本鎖核酸にのみ特異的に結合すること、また、前記２本鎖核酸に結合した挿入剤の量を検出することが重要となる。しかし、前記挿入剤は、１本鎖の核酸プローブや、該核酸プローブが固定される電極表面にも非特異的に吸着してしまう。そして、この非特異的に吸着した挿入剤は、前記２本鎖核酸に結合した挿入剤の量の検出時に、バックグランドノイズとなり、検出感度を低下させる原因となる。
【０００５】
これを解消するため、前記検出方法においては、前記挿入剤の添加後に、前記１本鎖の核酸プローブ及び電極表面に非特異的な吸着をしている挿入剤を除去するための洗浄が必要となっている。
【特許文献１】特許第２５７４４４３号公報
【特許文献２】特許第３２３３８５１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来の検出方法では、挿入剤と２本鎖核酸間の結合は静電気的相互作用あるいは疎水的相互作用によるものであって、結合力が弱いため、前述したように、前記１本鎖の核酸プローブや、該核酸プローブが固定される電極表面に非特異的に吸着した挿入剤を除去する洗浄工程の際に、２本鎖核酸に挿入させた挿入剤も解離してしまい、逆に検出感度を低下させてしまう、という課題がある。
【０００７】
一方、前記２本鎖核酸に結合した挿入剤が解離しないように考慮した前記洗浄では、該非特異的に吸着した挿入剤の除去が不十分となるため、バックグランドノイズが増加してしまい、検出感度の低下につながる、という課題がある。
【０００８】
本発明は、前記課題を解決するためになされたものであって、挿入剤の電気化学測定を行うための電極表面に１本鎖の核酸プローブを固定するのではなく、電極とは別の基板上に１本鎖の核酸プローブを固定化しておき、この１本鎖の核酸プローブと目的遺伝子サンプルをハイブリタイズさせた２本鎖核酸に対して、一旦、挿入剤を強固に結合させ、その後、強固に結合された挿入剤のみを分離させる操作を行い、この分離された挿入剤を電気化学的に検出することで、従来の非特異的に吸着する挿入剤によるバックグランドノイズの影響や、洗浄工程による検出感度の低下の問題を無くし、目的遺伝子サンプルとハイブリダイズした前記核酸プローブを高感度に検出可能な遺伝子検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題に鑑みて、本発明の遺伝子検出方法は、検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブ核酸を基板に固定させるステップと、
該プローブ核酸と１本鎖に変性された検体核酸とをハイブリダイズ反応させるステップと、
前記ハイブリダイズ反応により形成された２本鎖核酸に対し、前記２本鎖核酸に特異的な光架橋性化合物である２本鎖核酸挿入部位と、電気化学活性を有する電気化学活性部位と、前記２本鎖核酸挿入部位と前記電気化学活性部位とを連結する連結部位と、を有する化合物からなる挿入剤を添加した後、第１の波長の光照射により前記２本鎖核酸挿入部位と２本鎖核酸を共有結合させるステップと、
前記ステップの後、２本鎖核酸の周囲を電解溶液で満たし、第２の波長の光照射により、共有結合された２本鎖核酸挿入部位を２本鎖核酸から分離させるステップと、
挿入剤が分離した電解溶液中に電極部を配置し、電解溶液中に分離された前記挿入剤の存在を、前記電極部を介した電気化学的な測定により検出するステップと、
を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
以上のように本発明の遺伝子検出方法は、挿入剤の電気化学測定を行うための電極とは別の基板上に１本鎖の核酸プローブを固定化しておき、この１本鎖の核酸プローブと目的遺伝子サンプルをハイブリタイズさせた２本鎖核酸に対して、一旦、挿入剤を強固に結合させ、その後、強固に結合された挿入剤のみを電解溶液中に分離させる操作を行うようにしている。そして、電解溶液中に分離された挿入剤を電極にて電気化学発光させて、電気化学的に測定することで目的遺伝子を検出するようにしている。このため従来問題となっていた、１本鎖の核酸プローブや電極表面に非特異的な吸着をしていた挿入剤によるバックグランド電流やバックグランド発光の影響を無くすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に、本発明の遺伝子検出法の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【００１２】
まず、検体から遺伝子サンプルを抽出する前処理を行う。検体は、痰、血液、糞便、精液、唾液、培養細胞、組織細胞、その他遺伝子を有する試料を超音波、振とうなどの物理手段、核酸抽出溶液を用いる化学的手段を用いて抽出する。
【００１３】
試料中の細胞の破壊は、常法により行うことができ、例えば、振とう、超音波等の物理的作用を外部から加えて行うことができる。また、核酸抽出溶液（例えば、ＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、Ｔｗｅｅｎ−２０等の界面活性剤、又はサポニン、ＥＤＴＡ、プロテア−ゼ等を含む溶液等）を用いて、細胞から核酸を遊離させることもできる。
【００１４】
抽出された長鎖の２本鎖核酸は制限酵素、あるいは超音波などの物理的手段によって任意の長さに切断される。切断された２本鎖核酸は熱処理、あるいはアルカリ変性により１本鎖核酸に分離される。これらの工程により遺伝子サンプルを得る。遺伝子サンプルは、電気泳動による分離等で精製した核酸断片でもよい。
【００１５】
プローブ核酸は、検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する１本鎖のプローブ核酸であり、生物試料から抽出した核酸を制限酵素で切断し、電気泳動による分離等で精製した核酸、あるいは化学合成で得られた１本鎖の核酸を用いることができる。生物試料から抽出した核酸の場合には、熱処理あるいはアルカリ処理によって、１本鎖の核酸に解離させておくことが好ましい。
【００１６】
このようにして得られたプローブ核酸を固定部に固定する。固定化方法としては、公知の方法が用いられる。例えば固定部がグラシーカーボンである場合、グラシーカーボンを過マンガン酸カリウムで酸化することによって、固定部表面にカルボン酸基を導入する。次いで、該核酸は、末端にアミノ基を有することにより、アミド結合により固定部表面に固定される。実際の固定化方法については、文献（ケー． エム． ミラン（Ｋ．Ｍ．Ｍｉｌｌａｎ）外， アナリティカル ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），６５巻，２３１７頁，１９９３年）に詳細が記載されている。また、マイクロアレイで用いられる公知の結合方法（例えばシランカップリング法）を用いることができる。
【００１７】
本発明で用いる固定部材料はプローブ核酸の固定方法によって選択され、金属、半導体、高分子材料など特に限定しないが、挿入剤と吸着もしくは結合を起こさないように親水処理若しくは無電荷状態に保っていることが好ましい。
【００１８】
より具体的には、親水性を有する酸化シリコン、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛のような酸化物、或いは高分子材料である、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、テフロン（登録商標）、ポリフッ化エチレン、メラミン、ナイロン等が挙げられる。
【００１９】
本発明で用いる電極部は特に限定されるものではなく、使用可能な電極材料としては、例えば金、白金、白金黒、パラジウム、ロジウムのような貴金属電極、グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カ―ボンペ―スト、カ―ボンファイバ―のような炭素電極、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛のような酸化物電極、Ｓｉ、Ｇｅ、 ＺｎＯ、 ＣｄＳ、ＴｉＯ、ＧａＡｓのような半導体電極等が挙げられる。
【００２０】
上記で得られた、プローブ核酸が結合した固定部を、遺伝子サンプルを含む溶液に接触させることにより、プローブ核酸と相補的な配列を有する遺伝子サンプルがハイブリダイズし、２本鎖核酸が形成されるが、ハイブリダイズさせる方法は周知である。
【００２１】
このように２本鎖核酸を形成した後、挿入剤を添加し、２本鎖核酸に挿入させる。その後、光照射を行い、２本鎖核酸と挿入剤との間で共有結合を形成させる。なお、挿入剤の添加は、ハイブリダイゼ−ション反応前に検体試料中に添加することもできる。
【００２２】
上記のような特性を満たす挿入剤は、２本鎖核酸に特異的に挿入し、かつ光照射により２本鎖核酸と共有結合できる２本鎖核酸結合部位と、電気化学活性を有する電気化学活性部位と、前記２本鎖核酸結合部位と前記電気化学活性部位とを連結する連結部位を有する化合物である、ことを特徴とする。
【００２３】
例えば、下記一般式（１）で表すことができる。
【００２４】
一般式（１）Ｆ − Ｌ − Ｉ
［但し、Ｆは電気化学活性基、Ｌは連結基、そしてＩは２本鎖核酸挿入基であって、Ｉは光照射により２本鎖核酸と光反応する部位を有する］。
【００２５】
一般式（１）において、Ｉで示される物質は、２本鎖核酸に特異的に挿入し、かつ光照射の波長により２本鎖核酸と共有結合、または切断できる物質であり、感光性挿入剤と呼ばれる物質を用いることができる。
【００２６】
このような感光性挿入剤としては、例えば、フロクマリン誘導体が挙げられ、特にソラレン誘導体が好ましい。ソラレン誘導体は、２本鎖核酸に挿入し非共有的相互作用を起こし、長波長紫外線（３１０〜３９０ｎｍ）を照射すると安定な共有結合を形成する。さらに、短波長紫外線（２１０〜２９０ｎｍ）を照射すると共有結合が切断され、感光性挿入剤は２本鎖核酸から解離する。
【００２７】
ソラレン誘導体の具体的な例としては、ソラレン、メトキシソラレン、トリメチルソラレン等が挙げられる。
【００２８】
一般式（１）において、Ｆで示される物質は、電気化学活性を有する物質であり、電気化学的に検出可能な物質であれば、限定されるものではない。例えば、酸化還元性を有する化合物を挙げることができ、可逆な酸化還元反応時に生じる酸化還元電流を測定することで検出が可能である。
【００２９】
このような酸化還元性を有する化合物としては、例えば、フェロセン、カテコールアミン、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエンもしくはビオローゲン等がある。
【００３０】
さらに、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエンには、酸化還元反応時に電気化学発光を生じるものもあり、その発光を測定することで検出を行うこともできる。
【００３１】
そして特に、中心金属がルテニウム、オスニウムである錯体は良好な電気化学発光特性を有し、このような良好な電気化学発光特性を有する物質としては、例えば、ルテニウムビピリジン錯体、ルテニウムフェナントロリン錯体、オスニウムビピリジン錯体、オスニウムフェナントロリン錯体等を挙げることができる。
【００３２】
さらに、前記一般式（１）において、連結基Ｌとして用いることができる基としては、前記電気化学活性基Ｆと前記２本鎖核酸挿入基Ｉとを連結するものであれば、そのリンカー配列は特に制限されるものではなく、例えば、アルキル基、−Ｏ−基、−ＣＯ−基、−ＮＨ−基、リン酸基、又はこれらの組み合わせから成る基などを挙げることができる。
【００３３】
以上に説明したような挿入剤を、前記遺伝子サンプルと固定部に固定された前記プローブ核酸をハイブリダイズさせる前もしくは後に添加し、該プローブ核酸と遺伝子サンプルとがハイブリダイズした２本鎖核酸と前記挿入剤とを長波長紫外線照射により共有結合させる。
【００３４】
長波長紫外線の照射により２本鎖核酸への挿入したソラレン部が強固に２本鎖核酸と共有結合するようになり、引き続いて、１本鎖の核酸プローブや、固定部の他の表面に、非特異的に吸着した挿入剤を洗浄したとしても、洗浄等の操作によって抜け落ちることがなくなる。
【００３５】
長波長紫外線の照射後、未反応の挿入剤を含む溶液を除く。さらに、酸化生成した電気化学活性基と電気化学的反応を示す物質、例えばトリプロピルアミンやトリエチルアミンを含む電解溶液中で短波長紫外線照射工程を行う。短波長紫外線は２本鎖核酸に特異的に結合している挿入剤とのみ解離反応を起こし、２本鎖核酸から挿入剤が分離される。
【００３６】
さらにこの電解液中に含まれる挿入剤由来の電気化学的な信号を電極にて測定することにより、２本鎖核酸の存在を高感度に検出することができる。
【００３７】
前記挿入剤由来の電気化学的な信号は、添加する挿入剤の種類により異なるが、酸化還元電流を生じる挿入剤を用いた場合には、ポテンショスタット、ファンクションジェネレータ等からなる計測系で測定できる。一方、電気化学発光を生じる挿入剤を用いた場合には、光電子増倍管等の光検知器を用いて計測が可能である。
【００３８】
図１は、本発明の一実施の形態における遺伝子検出方法の概略を示したものである。固定部１に固定されたプローブ核酸２と検体核酸３をハイブリダイズ反応させ、２本鎖核酸にする（図１（ａ））。２本鎖核酸に挿入剤を添加し（図１（ｂ））、長波長紫外線５を照射することで挿入剤は特異的に２本鎖核酸と結合する。固定部外の表面に挿入剤が非特異吸着しない場合、挿入剤６は２本鎖核酸にのみ結合する（図１（ｃ））。未反応の挿入剤を洗い流した後、電解溶液中で短波長紫外線７を照射し、２本鎖核酸と結合している挿入剤を解離させる（図１（ｄ））。この解離した挿入剤８由来の電気化学的信号を測定することで、２本鎖核酸を検知することが可能となる。
【００３９】
固定部外の表面に挿入剤が非特異吸着する場合、長波長紫外線１０を照射することにより２本鎖核酸と結合した挿入剤１１と、固定部外の表面に非特異に飽和吸着する挿入剤９が存在する（図１（ｃ´））。未反応の挿入剤を洗い流した後、電解溶液中で短波長紫外線１２を照射し、２本鎖核酸と結合している挿入剤を解離させる（図１（ｄ´））。このとき、基板は挿入剤９が飽和吸着しており、基板解離した挿入剤１３は表面へ再吸着することなく電解溶液に拡散される。この挿入剤１３由来の電気化学的信号を測定することで、２本鎖核酸を検知することが可能となる。
【００４０】
いずれの場合においても、２本鎖の核酸プローブを測定電極ではなく固定部に固定化し、長波長紫外線で共有結合させ、後に短波長紫外線で分離した挿入剤を固定部と別に設けた電極で検出することで、従来の電極への非特異吸着した挿入剤をバックグラウンドノイズとして検知することなく、非常に高感度な２本鎖核酸検出が可能となる。
【実施例１】
【００４１】
本発明による、挿入剤を用いた遺伝子検出方法についてオリゴヌクレオチドを用いて例示する。
（１）プローブ核酸の固定
基板上に、プローブ核酸を固定させるための固定部を設ける。固定部基板上にグラッシーカーボンを配置し、過マンガン酸カリウムで酸化することによって、カーボン表面にカルボン酸基を導入する。
【００４２】
プローブ核酸には、ヒト由来Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０の遺伝子配列の５´末端より６２９−６６８番目に位置するＣＣＣＣＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＡＴＧＣＡＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＣＡＣＴＡＴＣＡＴの配列を有する、５´末端のリン酸基を介してアミノヘキシル基を修飾した４０塩基のオリゴヌクレオチド（タカラバイオ製、配列表中、ＳｅｑｕｅｎｃｅＮａｍｅ１の部分に該当）を使用した。なお、オリゴヌクレオチドの配列のＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃは、アデニン、グアニン、チミン、シトシンの各塩基を示す。
【００４３】
上記プローブ核酸を、１０ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、及び５０ｍＭの２−モルホリノエタンスルフォン酸−水酸化ナトリウムの反応混合液（ｐＨ５．５）に溶解し、１０μＭに調整した。その後、固定部領域内に滴下、室温で一昼夜反応させ、主鎖の５´末端に存在するアミノ基と基板表面に存在するカルボキシル基とを共有結合させた。一昼夜反応後、反応混合液を除去し、２００ｍＭの２−アミノエタノール、１０ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、及び５０ｍＭの２−モルホリノエタンスルフォン酸−水酸化ナトリウムの反応混合液（ｐＨ５．５）を５０μｌ滴下し、室温で２時間反応させ、遊離状態のカルボキシル基を遮蔽させた。
（２）ハイブリダイゼーション
遺伝子サンプルには、上記プローブ核酸と相補的な５´末端からＡＴＧＡＴＡＧＴＧＧＧＡＡＡＡＴＴＡＴＴＧＣＡＴＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＧＧＧＧの配列を有するオリゴデオキシヌクレオチド（タカラバイオ製、配列表中、ＳｅｑｕｅｎｃｅＮａｍｅ２の部分に該当）を使用した。
【００４４】
遺伝子サンプルは、２×ＳＳＣを混合したハイブリダイゼーション溶液に溶解させ、２０μＭに調整した。この調整した溶液を、プローブ核酸を固定した固定部上に滴下し、６０℃の恒温槽内で４時間反応させ、２本鎖核酸を形成させた。
【００４５】
また、上記プローブ核酸と非相補的な配列を有する遺伝子サンプルとして、５´末端のリン酸基を介してアミノヘキシル基を修飾した４０塩基のＰｏｌｙ−Ａ配列を有する非相補ＤＮＡ（５´末端からＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ、タカラバイオ製、配列表中、ＳｅｑｕｅｎｃｅＮａｍｅ３の部分に該当）を用意し比較を行った。
（３）挿入剤の添加
挿入剤には、下記の（化１）に示すソラレン修飾ルテニウム錯体を使用した。
【００４６】
【化１】
【００４７】
ソラレン修飾ルテニウム錯体の合成は、以下手順により得ることができる。
【００４８】
まず、公知の方法（バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１６巻，６号，１０５８頁， １９７７年）により合成した４’−クロロメチル−４，５，８−トリメチルソラレン（０．５ｇ、１．８１ｍｍｏｌ）を、水酸化ナトリウム溶解 ジメチルホルムアミド（乾燥）に溶かし、１６０℃で撹拌しながら１，４−ジアミノブタン（０．３２ｇ、３．６３ｍｍｏｌ）を滴下し１２時間反応させた。溶媒を留去した後、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー処理により精製し、生成物Ａを得た（収率４０％）。
【００４９】
次に、ＴＨＦ６０．０ｍＬに溶解させた４，４’−ジメチル−２，２’ビピリジン２．５０ｇ（１．３５×１０−２ｍｏｌ）溶液を窒素雰囲気の容器に注入した後、リチウムジイソプロピルアミド２Ｍ溶液１６．９ｍＬ（２．７０×１０−２ｍｏｌ）を滴下し、冷却しながら３０分撹拌した。一方、同様に窒素気流中で乾燥させた容器に、１，２−ジブロモエタン７．６１ｇ（４．０５×１０−２ｍｏｌ）とＴＨＦ１０ｍＬとを加え、冷却しながら撹拌させた。
【００５０】
この１，２−ジブロモエタンとＴＨＦとが挿入された容器に、先程の、ＴＨＦに溶解させた４，４’−ジメチル−２，２’ビピリジン溶液とリチウムジイソプロピルアミド２Ｍ溶液とを反応させた反応液をゆっくり滴下させ、２．５時間反応させた。そして、この反応溶液を、２Ｎの塩酸で中和して、ＴＨＦを留去した後、クロロホルムで抽出し、さらに、前記溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、生成物Ｂを得た（収率４７％）。
【００５１】
そして、前記生成物Ａ（０．５０ｇ、１．５２ｍｍｏｌ）と前記生成物Ｂ（０．４９ｇ、１．６８ｍｍｏｌ）とを、水酸化ナトリウム溶解ジメチルホルムアミド（乾燥）に溶かし、１６０℃で１８時間撹拌させた。そして、この攪拌した溶媒を留去した後、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー処理により精製し、生成物Ｃを得た（収率３８％）。
【００５２】
さらに、塩化ルテニウム（ＩＩＩ）（２．９８ｇ、０．０１ｍｏｌ）、及び２，２’−ビピリジン（３．４４ｇ、０．０２２ｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（８０．０ｍＬ）中で６時間還流した後、溶媒を留去した。その後、アセトンを加え、一晩冷却することで得られた黒色沈殿物を採取し、エタノール水溶液１７０ｍＬ（エタノール：水＝１：１）を加え、１時間加熱還流を行った。ろ過後、塩化リチウムを２０ｇ加え、エタノールを留去し、さらに一晩冷却した。析出した黒色物質は、吸引ろ過で採取し、生成物Ｄを得た（収率６８．２％）。
【００５３】
そして、前記生成物Ｃ（０．３０ｇ、０．５６ｍｍｏｌ）と前記生成物Ｄ（０．３２ｇ、０．６６ｍｍｏｌ）とを、ジメチルホルムアミドに溶かして６時間還流し、反応後、溶媒を留去させて得た黒紫色の物質に蒸留水を加えて溶解させ、未反応錯体をろ過により除去した後、溶媒を留去した。
【００５４】
得られた粗生成物は、シリカゲルクロマトグラフィー処理により精製し、ソラレン修飾ルテニウム錯体を得た（収率６８％）。表１は、前述のようにして得たソラレン修飾ルテニウム錯体の１Ｈ−ＮＭＲ結果である。
【００５５】
（表１）
１Ｈ-ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯｄ−６）
σ：
・ ４〜１．８ （６Ｈ，ｍ）
・ ４〜２．６ （１２Ｈ，ｍ）
２．７４ （２Ｈ，ｔ）
・ ８〜３．１ （６Ｈ，ｍ）
・ ３１ （２Ｈ，ｓ）
６．３２ （１Ｈ，ｓ）
７．３８ （２Ｈ，ｄ）
７．５４ （７Ｈ，ｍ）
７．７７ （４Ｈ，ｍ）
８．１６ （４Ｈ，ｔ）
８．７０ （２Ｈ，ｄ）
８．８８ （４Ｈ，ｄ）
このようにして得られたソラレン修飾ルテニウム錯体を、１０ｍＭのリン酸バッファで２μＭに調整した。
【００５６】
この調整した溶液を、２本鎖核酸が形成した固定部に添加し、３０分間４℃の冷蔵庫内で暗反応を行った。３０分後、長波長紫外光源（ＵＶＰ製ＣＬ１０００Ｌ型）を用いて波長３６５ｎｍ、５ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１０分間照射し、ソラレンと２本鎖核酸を共有結合させた。共有結合後、固定部を１０ｍＭのリン酸バッファで１分間洗い流した。
（４）電気化学発光測定
本実施例における遺伝子検出方法について、図２を用いて説明する。上記工程の後、固定部基板２４と作用極、対極、参照極の電極２１を配置した電極基板２２を、０.１Ｍのリン酸バッファおよび０．１Ｍのトリエチルアミンを混合した電解溶液２５に満たす。ここで参照極は、基準電位を求めるためのものである。溶液内で固定部２３に対して、短波長紫外光源２６（ＵＶＰ製ＣＬ１０００型）を用いて波長２６５ｎｍ、５ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１０分間照射し、挿入剤を２本鎖核酸から分離させ電解溶液に拡散させた。分離した挿入剤を電解溶液中に均一に拡散させるため、電解溶液を軽く攪拌した。
【００５７】
その後、電極２１にポテンショスタット２９から電圧を印加し、この時に生じた挿入剤由来の電気化学発光の測定を光電子増倍管２７（浜松ホトニクス製Ｈ７３６０−０１）を用いて行った。なお、電圧の印加は、０Ｖから１．３Ｖまで５秒間走査し、電圧走査中における最大発光量を測定した。挿入剤由来の発光量はフォトカウンター２８でカウントされ、得られたデータはコントローラＰＣ３０に格納される。また、電圧、電流、発光量等のデータはモニタ３１でモニタリングすることができる。
【００５８】
図３に本実施例で得られた電気化学発光測定による挿入剤の発光量を示したものである。図３において、相補的な、つまり２本鎖核酸由来の発光量は、非相補的な、２本鎖核酸を形成していない１本鎖核酸由来の発光量と比較して著しく高い値となっており、高感度に２本鎖核酸の検出が可能であることがわかる。また、核酸のない場合はほとんど発光が見られないことから、バックグラウンド発光はほとんど生じないことは明らかである。
【実施例２】
【００５９】
本発明による、挿入剤を用いた遺伝子検出方法についてオリゴヌクレオチドを用いて例示する。
（１）〜（３）は実施例１に同じ。
（４）電気化学発光測定
本実施例における遺伝子検出方法について、図４を用いて説明する。固定部基板４４を、０.１Ｍのリン酸バッファおよび０．１Ｍのトリエチルアミンを混合した電解溶液４５に満たす。溶液内で固定部４３に対して、短波長紫外光源４６（ＵＶＰ製ＣＬ１０００型）を用いて波長２６５ｎｍ、５ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１０分間照射し、挿入剤を２本鎖核酸から分離させ電解溶液に拡散させた。挿入剤が拡散した電解溶液を取り出し、作用極、対極、参照極の電極４１を配置した電極基板４２上に滴下する。
【００６０】
その後、電極４１にポテンショスタット４９から電圧を印加し、この時に生じた挿入剤由来の電気化学発光の測定を光電子増倍管４７（浜松ホトニクス製Ｈ７３６０−０１）を用いて行った。なお、電圧の印加は、０Ｖから１．３Ｖまで５秒間走査し、電圧走査中における最大発光量を測定した。挿入剤由来の発光量はフォトカウンター４８でカウントされ、得られたデータはコントローラＰＣ５０に格納される。また、電圧、電流、発光量等のデータはモニタ５１でモニタリングすることができる。本実施例により、図３と同様な結果が示された。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明にかかる遺伝子検出方法は、光照射による簡便な作業性と、測定のバックグラウンドノイズが極力低減可能であるため、非常に高感度に目的遺伝子を検出可能である。このため、高感度測定が必要な１塩基変異多型や細菌検査、ウイルス検査に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本発明の実施の形態に係る遺伝子検出方法の概略図
【図２】本発明の実施例１に係る遺伝子検出装置の概略図
【図３】本発明の実施例に係る遺伝子検出方法により検出した遺伝子サンプルからの最大発光量の測定図
【図４】本発明の実施例２に係る遺伝子検出装置の概略図
【符号の説明】
【００６３】
１，２３，４３ 固定部
２ プローブ核酸
３ 検体核酸
４ 挿入剤
５，１０ 長波長紫外線
６，１１ ２本鎖核酸に結合した挿入剤
７，１２ 短波長紫外線
８，１３ ２本鎖核酸から分離した挿入剤
９ 固定部に非特異に飽和吸着した挿入剤
２１，４１ 電極
２２，４２ 電極基板
２４，４４ 固定部用基板
２５，４５ 電解溶液
２６，４６ 紫外光源
２７，４７ 光電子増倍管
２８，４８ フォトカウンター
２９，４９ ポテンショスタット
３０，５０ コントローラＰＣ
３１，５１ モニタ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブ核酸を基板に固定させるステップと、
該プローブ核酸と１本鎖に変性された検体核酸とをハイブリダイズ反応させるステップと、
前記ハイブリダイズ反応により形成された２本鎖核酸に対し、前記２本鎖核酸に特異的な光架橋性化合物である２本鎖核酸挿入部位と、電気化学活性を有する電気化学活性部位と、前記２本鎖核酸挿入部位と前記電気化学活性部位とを連結する連結部位と、を有する化合物からなる挿入剤を添加した後、第１の波長の光照射により前記２本鎖核酸挿入部位と２本鎖核酸を共有結合させるステップと、
前記ステップの後、２本鎖核酸の周囲を電解溶液で満たし、第２の波長の光照射により、共有結合された２本鎖核酸挿入部位を２本鎖核酸から分離させるステップと、
挿入剤が分離した電解溶液中に電極部を配置し、電解溶液中に分離された前記挿入剤の存在を、前記電極部を介した電気化学的な測定により検出するステップと、
を有することを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項２】
請求項１記載の第１の波長が３１０〜３９０ｎｍの波長を有する光波であり、第２の波長が２１０〜２９０ｎｍの波長を有する光波であることを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項３】
請求項１記載の光架橋性化合物が、フロクマリン誘導体であることを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項４】
請求項３記載のフロクマリン誘導体が、ソラレン誘導体であることを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項５】
請求項１記載の電極部が、作用電極と対電極とからなることを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項６】
請求項１記載の挿入剤中の電気化学発光を示す化合物が、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエンであることを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項７】
請求項６記載の配位子に複素環系化合物を有する金属錯体が、配位子にピリジン部位を有する金属錯体であることを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項８】
請求項７記載の配位子にピリジン部位を有する金属錯体が、金属ビピリジン錯体、金属フェナントロリン錯体であることを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項９】
請求項８記載の配位子に複素環系化合物を有する金属錯体の中心金属が、ルテニウム、またはオスニウムであることを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項１】
検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブ核酸を基板に固定させるステップと、
該プローブ核酸と１本鎖に変性された検体核酸とをハイブリダイズ反応させるステップと、
前記ハイブリダイズ反応により形成された２本鎖核酸に対し、前記２本鎖核酸に特異的な光架橋性化合物である２本鎖核酸挿入部位と、電気化学活性を有する電気化学活性部位と、前記２本鎖核酸挿入部位と前記電気化学活性部位とを連結する連結部位と、を有する化合物からなる挿入剤を添加した後、第１の波長の光照射により前記２本鎖核酸挿入部位と２本鎖核酸を共有結合させるステップと、
前記ステップの後、２本鎖核酸の周囲を電解溶液で満たし、第２の波長の光照射により、共有結合された２本鎖核酸挿入部位を２本鎖核酸から分離させるステップと、
挿入剤が分離した電解溶液中に電極部を配置し、電解溶液中に分離された前記挿入剤の存在を、前記電極部を介した電気化学的な測定により検出するステップと、
を有することを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項２】
請求項１記載の第１の波長が３１０〜３９０ｎｍの波長を有する光波であり、第２の波長が２１０〜２９０ｎｍの波長を有する光波であることを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項３】
請求項１記載の光架橋性化合物が、フロクマリン誘導体であることを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項４】
請求項３記載のフロクマリン誘導体が、ソラレン誘導体であることを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項５】
請求項１記載の電極部が、作用電極と対電極とからなることを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項６】
請求項１記載の挿入剤中の電気化学発光を示す化合物が、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエンであることを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項７】
請求項６記載の配位子に複素環系化合物を有する金属錯体が、配位子にピリジン部位を有する金属錯体であることを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項８】
請求項７記載の配位子にピリジン部位を有する金属錯体が、金属ビピリジン錯体、金属フェナントロリン錯体であることを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項９】
請求項８記載の配位子に複素環系化合物を有する金属錯体の中心金属が、ルテニウム、またはオスニウムであることを特徴とする遺伝子検出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００６−６１０６１（Ｐ２００６−６１０６１Ａ）
【公開日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２４６６５６（Ｐ２００４−２４６６５６）
【出願日】平成１６年８月２６日（２００４．８．２６）
【出願人】（０００００５８２１）松下電器産業株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月２６日（２００４．８．２６）
【出願人】（０００００５８２１）松下電器産業株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
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