遺伝子治療用のエステル結合したジェミニ界面活性剤化合物
本発明は、新規同定された、式（Ｉ）［ここで、ＹはＨまたは（Ａａ）ｘであり、（Ａａ）ｘが塩基性アミノ酸であり、ｘが１〜６である］のエステル結合したジェミニ界面活性剤化合物、かかる化合物の使用およびそれらの調製方法に関する。本発明は、ポリヌクレオチドの細胞への移入を容易にするためのエステル結合したジェミニ界面活性剤化合物の使用にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規同定されたエステル結合した界面活性剤化合物、かかる化合物の使用、およびそれらの調製に関する。本発明は、薬剤送達のために細胞中への化合物の移入を容易にするための、エステル結合した界面活性剤化合物の使用にも関する。多くの場合、本発明の化合物の特性に関連する特性を有する化合物はジェミニ界面活性剤と呼ばれる。
【背景技術】
【０００２】
界面活性剤は、低濃度でさえも、液体の界面特性に著しい影響を与える物質である。例えば、界面活性剤は、水または水溶液に溶解された場合に、表面張力を有意に低下させ得、２種の液体または液体および固体間の界面張力を低下させ得る。界面活性剤分子のこの特性は、工業的に、特に、洗剤および油脂産業において広く利用されている。１９７０年代に、新たなクラスの界面活性剤分子が報告され、疎水性ブリッジにより結合された極性頭部を有する２個の疎水性鎖により特徴付けられた(Deinega, Y et al., Kolloidn. Zh. 36,649,1974)。これらの分子は「ジェミニ」と呼ばれ(Menger, FM and Littau,CA,J. Am. Chem. Soc. 113,1451,1991)、それらのモノマー等価物に勝る非常に好ましい特性を有する。例えば、それらは油および水に基づく液体間の界面張力の低下に非常に有効であり、非常に低い臨界ミセル濃度を有する(Menger, FM and Keiper,JS,Angewandte. Chem. Int. Ed. Engl.,2000,39,1906)。
【０００３】
カチオン性界面活性剤は、とりわけ、培養細胞中へのポリヌクレオチドのトランスフェクションに使用されており、遺伝子工学の科学者に市販されているかかる物質の例としては、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．ＷＩ，ＵＳＡから市販されている真核細胞のトランスフェクション用のＴｆｘ（登録商標）−５０試薬が挙げられる。
【０００４】
遺伝子治療またはアンチセンス療法のためのインビボにおけるＤＮＡの細胞への有効な送達は、ここ数年間の主要な目標である。多くの注目は、送達用ビヒクルとしてのウイルスの使用に集中し、例えば、嚢胞性線維症（ＣＦ）の修正的遺伝子治療を目的とする呼吸管上皮細胞へのアデノウイルスの適用が挙げられる。しかし、ＣＦ患者における遺伝子移入成功の証拠が幾つかあるにも関わらず、アデノウイルス経由には、炎症性副作用および移入された遺伝子の一時的発現に起因する問題が依然存在する。カチオン性界面活性剤を用いる研究を含む、インビボ遺伝子送達のための幾つかの代替的方法が研究されている。Gao, X et al. Gene Ther. 2,710-722,1995は、アミン担持カチオン性脂質を用いてＣＦ膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）に関する正常ヒト遺伝子をＣＦマウスの呼吸器上皮に導入する、このアプローチの実行可能性を示した。このグループは、その後、リポソームＣＦ遺伝子治療を試みたところ、部分的に成功し、ヒトにおけるこのアプローチの可能性が示された(Caplen, NJ. et al., Nature Medicine,1,39-46,1995)。より最近になって、他のグループは、遺伝子送達のための他のカチオン性脂質(Miller,A,Angew. Int. Ed. Engl.,37,1768-1785,1998)、例えば、コレステロール誘導体(Oudrhiri, N et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 94,1651-1656,1997)の可能性を研究した。この限定的な研究は、インビトロおよびインビボの両方における上皮細胞への遺伝子移入を容易にするというこれらのコレステロールに基づく化合物の能力を示し、それ故に、この一般的アプローチの正当性が支持された。
【０００５】
最近、遺伝子トランスフェクションのための非ウイルス性（カチオン性脂質）ベクターの使用が報告された。D. Niculescu-Duvaz, J. Heyes and C. J. Springer,Curr. Med. Chem.,2003,10,1233を参照のこと。
【０００６】
これらの研究および他の研究は、細胞に基づく実験におけるトランスフェクションのためにインビトロにおいて、ならびに遺伝子治療およびアンチセンス療法のためにインビボにおいて、ポリヌクレオチドの細胞中への効果的な移入を容易にするために低毒性の界面活性剤分子を開発することがこの新規研究分野において引き続き必要とされていることを示す。システイン（ＷＯ ９９／２９７１２）またはスペルミン（ＷＯ ００／７７０３２）またはジアミン（ＷＯ ００／７６９５４）に基づくジェミニ界面活性剤が既に作製されている。ジェミニ界面活性剤の他の例は、ＷＯ ００／２７７９５、ＷＯ ０２／３０９５７、ＷＯ ０２／５０１００、ＷＯ ０３／８２８０９、ＧＢ０４２５５５５．０およびＧＢ０４２５５５６．８において見出される。ポリヌクレオチドベクターとしてのジェミニ界面活性剤の使用は最近報告された（A. J. Kirby,P. Camilleri,J. B. F. N. Engberts, M. C. Feiters, R. J. M. Nolte, O. Soederman, M. Bergsma, P. C. Bell, M. L. Fielden, C. L. Garciea Rodrieguez, Philippe Guedat, A. Kremer, C. McGregor, C. Perrin, G. Ronsin and M. C. P. van Eijk, Angew. Chem. Int. Ed., 2003, 42, 1448, R. Zana and J. Xia, Gemini Surfactants, Marcel Dekker, NY, 2004も参照のこと）。
【０００７】
最近開発された技法は、遺伝子機能を一時的に抑制するための合成低分子干渉（ｓｉ）２本鎖ＲＮＡ分子の使用を含む。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のこの技法は、元々、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓらの研究から生み出され（A. Fire, rends Genet.,1999,15(9),358）、後に、哺乳類細胞へ適用可能なように開発された（S. M. Elbashir, J. Harborth, W. Lendeckel, A. Yalcin, K.Weber, T. Tuschl, Nature, 2001,411,494）。これらのｓｉＲＮＡエフェクター分子を送達して細胞集団の大部分の位置を修正する能力は、この技法の効果的な利用において重要な段階である。一旦、正確に局在すると、２本鎖ＲＮＡのアンチセンス鎖は、標的化メッセンジャー（ｍ）ＲＮＡ（目的の標的をコードする）の相補的領域に結合し、ｍＲＮＡの加水分解、次いで、その分解をもたらす。ｍＲＮＡのこの一時的な減少は、標的遺伝子発現の一時的な減少をもたらす。非常に効果的な送達および正確な局在化は、標的の機能が解明可能なレベルまで標的の遺伝子発現を軽減するのに必要とされる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は既存の化合物の特性の改良に努める。
【０００９】
本発明は、一般構造式（Ｉ）：
【化１】
［式中、
ＹはＨまたは（Ａａ）xのいずれかであり、ここで、（Ａａ）は塩基性アミノ酸であり、ｘは１〜６であり；
Ｒ1およびＲ2は、同一または異なっていてもよく、２４個までの炭素原子からなる飽和または不飽和の直鎖または分岐した炭化水素鎖であり；
ｎは１〜１０であり；および
ｐは１〜６である］
で示される化合物またはその医薬上許容される塩に関する。
【００１０】
一の好ましい実施態様において、Ｒ1またはＲ2は、２４個までの炭素原子からなる飽和または不飽和の直鎖または分岐した炭化水素鎖であり、１０個以上の炭素原子、例えば１２個以上の、例えば１４個以上の、例えば１６個以上の炭素原子を有する。さらなる好ましい一の実施態様において、Ｒ1またはＲ2は、２４個までの炭素原子からなる飽和または不飽和の直鎖または分岐した炭化水素鎖であり：
−（ＣＨ2）10ＣＨ3
−（ＣＨ2）12ＣＨ3
−（ＣＨ2）14ＣＨ3
−（ＣＨ2）16ＣＨ3
−（ＣＨ2）18ＣＨ3
−（ＣＨ2）20ＣＨ3
−（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3 天然混合物
−（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）5ＣＨ3 天然混合物
−（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）5ＣＨ3 シス
−（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3 シス
−（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）5ＣＨ3 トランス
−（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3 トランス
−（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）4ＣＨ3
−（ＣＨ2）7（ＣＨ＝ＣＨＣＨ2）3ＣＨ3
−（ＣＨ2）3ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ）3（ＣＨ2）4ＣＨ3
−（ＣＨ2）7ＣＨＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3
−ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）［ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）］3ＣＨ3
または−（ＣＨ2）22ＣＨ3：
から選択される。
【００１１】
最も好ましくは、炭化水素鎖は、（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3天然混合物、（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3シスおよび（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3トランスから選択される。
【００１２】
好ましくは、ｎは３〜６である。最も好ましくは、ｎは４である。
【００１３】
好ましくは、ｐは１〜４である。最も好ましくは、ｐは２である。
【００１４】
好ましくは、Ｙは（Ａａ）である。
【００１５】
各場合において、（Ａａ）xは、同一または異なっていてもよく、直鎖または分岐した様式で連結したｘ個の天然または非天然アミノ酸であり；（Ａａ）は塩基性アミノ酸、好ましくは、セリン（ｓｅｒ）、リジン（ｌｙｓ）、オルニチン（ｏｒｎ）、ジアミノ酪酸（ｄａｂ）またはジアミノプロピオン酸（ｄａｐ）のＬまたはＤエナンチオマーである。ｘは１〜６であり；好ましくは、１〜３である。最も好ましくは、ｘは１である。
【００１６】
（Ａａ）基は、Ｎとアミノ酸残基上のカルボキシ基との間のペプチド（アミド）結合により、式（Ｉ）中のＮに結合する。
【００１７】
一の実施態様において、本発明の化合物は、所謂「ジェミニ」界面活性剤化合物である。すなわち、本化合物は、各Ｙが同一であり、Ｒ1およびＲ2が同一という点で、対称である。本発明の文脈において、かかる化合物を「エステルジェミニ」と称する。
【００１８】
最も好ましい一の実施態様において、エステルジェミニは：
【化２】
；
【化３】
；
【化４】
；および
【化５】
からなる群より選択される。
【００１９】
本発明の化合物は、当業者によく知られている合成化学を用いて、容易に入手可能な出発物質から調製されてもよい。図１は、本発明の好ましい化合物［ここで、ｐ＝２である］の合成のための一般的スキームを示す。ｐ＝１または３〜６である化合物については、当該分野においてよく知られている技法、例えば、ｐ＝１では、Jaine, N et al. ;Journal of Inorganic Biochemistry 1994,53(2),79-94；ｐ＝３では、Reppe et al. ;JLACBF ;Justus Liebigs Ann. Chem.;596;1955;1,215；およびｐ＝４では、Gautier;Renault;Recl. Trav. Chim. Pays-Bas;69;1950;421,426の技法を用いて、他のジカルボン酸（図１の中間体３）を出発物質として用いてもよい。
【００２０】
様々な代替的戦略が当業者には知られており、適切な戦略は、所望する特定の最終的な置換パターンについて考案されてもよい。非対称置換パターンについては、生成物または中間体の物理的分離が必要とされてもよい。クロマトグラフィー法のごとき適切な分離方法は当業者によく知られている。
【００２１】
本発明に基づく分子の塩は、標準的な技法により調製されてもよい。
【００２２】
本発明の別の態様は、エステル結合した界面活性剤化合物を用いる方法に関する。かかる使用は、生物全体におけるアンチセンス、遺伝子治療および（抗体産生のための）遺伝子免疫のために、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの細胞中への移入を容易にすることを含む。他の使用は、かかる移入が例えば特に遺伝子発現研究およびアンチセンス制御実験において必要とされる場合に、培養細胞中へのポリヌクレオチドのトランスフェクションを容易にするための本発明の化合物の使用を含む。かかるポリヌクレオチドおよびアンチセンス分子の調製のためのプロトコルは当該分野においてよく知られている（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989), Cohen, JS ed. Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL(1989)）。ポリヌクレオチドを化合物と混合し、細胞に添加し、インキュベートし、ポリヌクレオチドを摂取させることができる。さらなるインキュベーションの後、トランスフェクトされたＤＮＡにより得られた表現型形質について細胞をアッセイでき、或いは該ＤＮＡから発現されるｍＲＮＡのレベルは、ノーザンブロッティングによってか、またはＴａｑｍａｎ（登録商標）方法（Perkin Elmer, Connecticut, USA）のごときＰＣＲに基づく定量法により測定され得る。本発明の化合物は、従前の技術における化合物と比較して、培養細胞中のＤＮＡの細胞取り込み効率において有意な改善、典型的には３〜６倍の改善をもたらす。トランスフェクションプロトコルにおいて、スペルミジン界面活性剤化合物を１個または複数の添加物質と併用して、トランスフェクション効率を増大させてもよい。かかる添加物質は、例えば：
（ｉ）中性担体、例えば、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）（Farhood, H., et al(1985)Biochim. Biophys. Acta,1235-1289）；
（ｉｉ）複合体形成試薬、例えば、市販のＰＬＵＳ試薬（Life Technologies Inc. Maryland, USA）またはペプチド、例えば、ポリリジンまたはポリオルニチンペプチド、或いはリジン、オルニチンおよび／またはアルギニンのごとき塩基性アミノ酸を主に含むがこれらに限定されないペプチド：
から選択されてもよい。上記リストは全てを網羅するものではなく、トランスフェクション効率を増大する他の添加物質も本発明の範囲内となる。
【００２３】
さらなる別の態様において、本発明は、遺伝子治療における本発明の化合物を用いる遺伝物質の移入に関する。例えば、当業者は、当該分野においてよく知られているプロトコルを用いて、本発明のスペルミジン界面活性剤化合物の使用を含む遺伝子治療における使用のための遺伝子送達方法を開発できよう。例えば、遺伝子移入ベクターの肺への送達のための界面活性剤の使用は、Weiss, DJ(2002)Molecular Therapy 6(2) pp148-152において概説されている。
【００２４】
本発明のさらなる別の態様は、本発明の化合物を用いるインビトロおよびインビボにおける細胞中への非ヌクレオチドに基づく薬剤化合物の送達を実施するための方法に関する。
【００２５】
以下の定義は、本明細書で頻繁に使用される特定の用語の理解を容易にするために提供されるものである。
【００２６】
「アミノ酸」は、＋Ｈ３ＮＣＨ（Ｒ）ＣＯ2−形態の双極イオン（双性イオン）を言う。それらはＲ基の性質により分類され、Ｒが水素とは異なる場合、それらは非対称であり得、ＤおよびＬ体を形成する。２０種の天然アミノ酸が存在し、例えば、Ｒ基は無極性（例えば、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン）または極性（例えば、グルタミン酸、ヒスチジン、アルギニンおよびリジン）であり得る。非天然アミノ酸の場合、Ｒは天然に見出されるアミノ酸中に見出されない任意の他の基であり得る。
【００２７】
一般的に、「ポリヌクレオチド」は、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを言い、それらは非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであってもよい。「ポリヌクレオチド」は、１本鎖および２本鎖ＤＮＡ、１本鎖および２本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、１本鎖および２本鎖ＲＮＡ、ならびに１本鎖および２本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、１本鎖もしくはより典型的には２本鎖または１本鎖および２本鎖領域の混合物であってもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を含むが、これらに限定されない。加えて、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む３本鎖領域を言う。ポリヌクレオチドなる用語は、１個または複数の修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡのもの、ならびに安定性または他の理由で骨格が修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡのものも包含する。「修飾」塩基は、例えば、トリチル化塩基および独特な塩基、例えば、イノシンを包含する。種々の修飾がＤＮＡおよびＲＮＡになされてもよく；故に、「ポリヌクレオチド」は、典型的に天然において見出されるポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、ならびにウイルスおよび細胞のＤＮＡおよびＲＮＡ特徴を有する化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」は、比較的短いポリヌクレオチドも包含し、それらは多くの場合オリゴヌクレオチドと言われる。
【００２８】
「トランスフェクション」は、化学的または物理的手段のいずれかによる細胞膜の修飾を含む方法を用いる、ポリヌクレオチドの培養細胞中への導入を言う。かかる方法は、例えば、Sambrook et al., MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989）において記載されている。ポリヌクレオチドは、直鎖状または環状、１本鎖または２本鎖であってもよく、ポリヌクレオチドの複製或いはポリヌクレオチドの一部を含み得る同種または異種遺伝子の発現を調節するエレメントを含んでもよい。
【００２９】
医薬上許容される酸付加塩は、所望により、有機溶媒のごとき適切な溶媒中、式（Ｉ）の化合物を適切な無機または有機酸（例えば、臭化水素酸、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、コハク酸、マレイン酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、クエン酸、洒石酸、乳酸、安息香酸、サリチル酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、ベンゼンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、例えば、２−ナフタレンスルホン酸またはヘキサン酸）と反応させることにより形成され得、得られた塩は、通常、例えば、結晶化および濾過により単離される。式（Ｉ）の化合物の医薬上許容される酸付加塩は、例えば、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、洒石酸塩、乳酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩（例えば、２−ナフタレンスルホン酸塩）またはヘキサン酸塩を含み得る。
【００３０】
本発明は、その範囲内に、水和物および溶媒和物を含む式（Ｉ）の化合物の塩の全ての可能な化学量論的および非化学量論的形態を包含する。
【００３１】
式（Ｉ）の特定化合物は、化学量論的形態にて存在し得る。本発明がこれらの化合物の全ての幾何異性体および光学異性体ならびにラセミ体を含むそれらの混合物を包含することが理解されよう。互変体も本発明の態様を構成する。
【００３２】
ここで、本発明は以下の実施例により説明され得る。実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００３３】
実施例
記載例１：Ｎ，Ｎ’−ビス−（２−シアノエチル）−１，４−ジアミノブタン（２）
【化６】
【００３４】
０℃で、１，４−ジアミノブタン１（ｎ＝４；２５．０ｇ，０．２８ｍｏｌ）のメタノール（５０ｍＬ）中溶液へ、アクリロニトリル（３１．６ｇ，０．６０ｍｍｏｌ）のメタノール（２５ｍＬ）中溶液を滴下して加えた。添加後、混合物を室温に到達させておき、次いで、１８時間攪拌した。最後に、溶媒を真空除去し、ジアミン２を淡黄色液体（５７．０ｇ，定量）として得た。
Ｒｆシリカ：０．６０（ＭｅＯＨ−０．８８ＮＨ3 ９５：５）
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δH２．８８（ｍ，４Ｈ），２．６０（ｍ，４Ｈ），２．４６（ｍ，４Ｈ），１．４５（ｍ，４Ｈ）
【００３５】
記載例２：Ｎ，Ｎ’−ビス−（２−カルボエトキシエチル）−１，４−ジアミノブタン二塩酸塩（３）
【化７】
【００３６】
２（ｎ＝４；１０．０ｇ，５１．５ｍｍｏｌ）の６ＮのＨＣｌ（８０ｍＬ）中溶液を１８時間加熱還流し、次いで、室温に冷却させておき、溶媒を部分的に真空蒸発させておいた。残りの溶液へＥｔＯＨ（４０ｍＬ）を加え、沈殿した固体を濾過で取り出し、ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）で洗浄し、ジ−カルボン酸３を白色固体（１７．４ｇ，定量）として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ｄ6 ＤＭＳＯ）：δH １２．７０（ｂｒｓ，２Ｈ），３．０５（ｔ，Ｊ＝７．５，４Ｈ），２．８８（ｍ，４Ｈ），２．７２（ｔ，４Ｈ），１．６５（ｍ，４Ｈ）
【００３７】
記載例３：Ｎ，Ｎ’−ビス−（２−カルボエトキシエチル）−Ｎ，Ｎ’−ビス−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−１，４−ジアミノブタン（４）
【化８】
【００３８】
３（ｎ＝４；１９．９ｇ，６５．３ｍｍｏｌ）の１ＮのＮａＯＨ（３５０ｍＬ）中溶液へ、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（５７．０ｇ，２６１ｍｍｏｌ）のジオキサン（３５０ｍＬ）中溶液を加えた。混合物を室温で１８時間攪拌し、次いで、容量が半分になるまで濃縮した。残りをｐＨ３〜４に調整し、次いで、ジクロロメタン（２５０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機抽出物をブライン（１５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、真空濃縮し、カルバマート４を白色粉末（２４．４ｇ，８７％）として得た。
Ｒｆシリカ：０．３１（ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ ２：１）．
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝４．０４分（ｍ／ｚ＝４３３．１［Ｍ＋Ｈ＋］）
【００３９】
記載例４：３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−｛４−［ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−（２−オクタデカ−８−エニルオキシカルボニル−エチル）−アミノ］−ブチル｝−アミノ）−プロピオン酸オクタデカ−８−エニルエステル（５）
【化９】
【００４０】
０℃で、Ｎ−保護アミノ酸４（ｎ＝４；１５．２ｇ，３５．１ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（１．７０ｇ，１４．０ｍｍｏｌ）およびオレイルアルコール（１８．４ｇ，６８．４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２００ｍＬ）中溶液へ、ＥＤＣＩ（１３．１ｇ，６８．４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（５０ｍＬ）中溶液を加えた。得られた混合物を室温に温めておき、次いで、Ｎ2下で１８時間攪拌した。ジクロロメタン（２５０ｍＬ）を加え、混合物をブライン（４×２００ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、真空濃縮し、油状物を得、これを、ヘキサン中のＣＨ2Ｃｌ2（５０〜９０％）の溶媒勾配で溶離するカラムクロマトグラフィーにより精製し、エステル５を無色油状物（１３．０ｇ，４０％）として得た。
【００４１】
Ｒｆシリカ：０．６１（Ｈｅｘ−ＥｔＯＡｃ ７：３）．
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δH ５．３２（ｍ，４Ｈ），４．０５（ｔ，Ｊ＝７．０，４Ｈ），３．４２（ｂｒｓ，４Ｈ），３．１８（ｂｒｓ，４Ｈ），２．５３（ｂｒｓ，４Ｈ），１．９８（ｍ，８Ｈ），１．６０（ｍ，６Ｈ），１．４２（ｍ，２２Ｈ），１．４０−１．２０（ｍ，４０Ｈ），０．８６（ｔ，Ｊ＝７．０，６Ｈ）
【００４２】
記載例５：３−［４−（２−オクタデカ−９−エニルオキシカルボニル−エチルアミノ）−ブチルアミノ］−プロピオン酸オクタデカ−９−エニルエステルビス塩酸塩（６）
【化１０】
【００４３】
エステル５（ｎ＝４，Ｒ＝オレイル；１３．０ｇ，１３．９ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（７０ｍＬ）中に溶解し、ＥｔＯＡｃ（１４０ｍＬ）中４ＭのＨＣｌで処理した。得られた混合物を室温で２時間攪拌し、次いで、溶媒を真空除去し、残りを無水ジエチルエーテル（１５０ｍＬ）でトリチュレートし、固体を得、これを真空乾燥し、ビス塩酸塩６を白色粉末（１０．２３ｇ，９１％）として得た。
Ｒｆシリカ：０．４６（ＭｅＯＨ−０．８８ＮＨ3 ９７：３）．
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝８．０７分（ｍ／ｚ＝７３３．６［Ｍ＋Ｈ＋］）
【００４４】
記載例６：界面活性剤（８ａ〜ｄ）調製のための一般的手順
Ｎ−末端−保護アミノ酸（０．４１ｍｍｏｌ，２．６当量）、ＨＣＴＵ（１６８ｍｇ，０．４１ｍｍｏｌ，２．６当量）およびジイソプロピルエチルアミン（０．１９ｍＬ，１．１０ｍｍｏｌ，７．０当量）を、アミン塩酸塩６（ｎ＝４，Ｒ＝オレイル；１５０ｍｇ，０．１５６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ−ＣＨ2Ｃｌ2［１：１］（４．０ｍＬ）中溶液へ加えた。Ｎ2下、混合物を室温で１８時間攪拌し、次いで、混合物を低容量に濃縮し、ＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）を加えた。有機溶液を５％水性ＫＨＳＯ4溶液（３×８ｍＬ）、５％水性Ｋ2ＣＯ3溶液（３×８ｍＬ）およびブライン（３×１０ｍＬ）で連続して洗浄し、次いで、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、真空濃縮した。残りを、水中のＭｅＯＨ（５０〜１００％）の溶媒勾配で溶離する逆相カラムクロマトグラフィーにより、次いで、ヘキサン中のＥｔＯＡｃ（２０〜４０％）の溶媒勾配で溶離するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。残りをＥｔＯＡｃ（２．０ｍＬ）中に溶解し、ＥｔＯＡｃ（３．０ｍＬ）中の５．０ＮのＨＣｌを加えた。得られた混合物を室温で２時間攪拌し、次いで、真空濃縮し、固体残渣をジエチルエーテル（５．０ｍＬ）でトリチュレートし、界面活性剤８ａ〜ｄを白色粉末（７５〜９３％）として得た。
【実施例】
【００４５】
実施例１（８ａ）
【化１１】
【００４６】
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１２．１８分（ｍ／ｚ＝９３３．８［Ｍ＋Ｈ］＋（１００％））；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ 計算値（Ｃ54Ｈ105Ｎ6Ｏ6）９３３．８０９６，測定値 ９３３．８０９６［Ｍ＋Ｈ］＋
【００４７】
実施例２（８ｂ）
【化１２】
【００４８】
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１２．１５分（ｍ／ｚ＝９６１．８［Ｍ＋Ｈ］＋（１００％））；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ 計算値（Ｃ56Ｈ109Ｎ6Ｏ6）９６１．８４０９，測定値 ９３３．８４００［Ｍ＋Ｈ］＋
【００４９】
実施例３（８ｃ）
【化１３】
【００５０】
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１２．１８分（ｍ／ｚ＝９８９．９［Ｍ＋Ｈ］＋（１００％））；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ 計算値（Ｃ58Ｈ113Ｎ6Ｏ6）９８９．８７２２，測定値 ９８９．８７１８［Ｍ＋Ｈ］＋
【００５１】
実施例４（８ｄ）
【化１４】
【００５２】
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１２．２０分（ｍ／ｚ＝９８９．９［Ｍ＋Ｈ］＋（１００％））；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ 計算値（Ｃ58Ｈ113Ｎ6Ｏ6）９８９．８７２２，測定値 ９８９．８７２９［Ｍ＋Ｈ］＋
【００５３】
実施例５：エステル結合した界面活性剤化合物を用いる、ＧＦＰ発現組換えプラスミドの細胞へのトランスフェクション
接着細胞株ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＶ１、ＨｅｐＧ２、１３２１Ｎ１およびＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いてトランスフェクション研究を実施した。完全培地は、１０％ｖ／ｖのウシ胎仔血清および１×Ｌ−グルタミンを補足したＦ１２（ＣＨＯ−Ｋ１について）およびＤＭＥＭ（ＣＶ１，ＨｅｐＧ２，１３２１Ｎ１およびＮＩＨ３Ｔ３について）培地から構成された。全培地および添加物質はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した。
【００５４】
インビトロ遺伝子トランスフェクション
トランスフェクションの１６〜１８時間前に、約２×１０4細胞／ウェルの密度で細胞を組織培養処理された９６−ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に播種した。０．０２５μｇ／μｌのプラスミド溶液をＯｐｔｉｍｅｍ中で調製した。用いたプラスミドはＣｌｏｎｔｅｃｈから得たｐＣＭＶ−ｅＧＦＰだった。エステル結合した界面活性剤化合物を１０×濃度としてＯｐｔｉｍｅｍ中に溶解し、最終反応混合物中２０、１０、５および２．５μｇ／ｍｌの最終濃度とした。各ウェルにつき、１０μｌのエステル結合した界面活性剤化合物を１０ｕｌのプラスミドと混合した。複合体を室温で１０分間インキュベートした。培地をプレート中の細胞から除去し、細胞を１００μｌのＰＢＳで１回洗浄した。複合体（２０μｌ）を各ウェルへ加え、次いで、８０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ（血清不含）または成長培地（血清）を加えて、最終容量を１００μｌとした。血清不含プロトコルでは、次いで、プレートを６時間３７℃でインキュベートし、次いで、培地を除去し、新鮮な完全培地を各ウェルへ加え、さらに１８時間インキュベーションを続けた。血清プロトコルでは、プレートを２４時間３７℃でインキュベートした。
【００５５】
製造元（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）のガイドラインに従ってレポーター遺伝子アッセイを行った。培地をプレートから除去し、細胞を１００μｌのＰＢＳで１回洗浄した。次いで、１００μｌのレポーター溶解バッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５，２ｍＭのＥＤＴＡ，０．０５％のトリトン ×１００，２ｍＭのＤＴＴ）を各ウェルに加えた。次いで、プレートを−８０℃で１５分間放置し、次いで、室温で溶解させておいた。次いで、標準的なプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｕｌｔｒａ，Ｔｅｃａｎ）を用いて、励起波長４８５ｎｍおよび放射波長５２０ｎｍでの蛍光を測定した。
【００５６】
結果を図３（ＣＨＯ−Ｋ１）、４（ＨｅｐＧ２）、５（ＣＶ−１）、６（１３２１Ｎ１）および７（ＮＩＨ−３Ｔ３）に示す。結果は、試験した３つのエステルジェミニ化合物全てが、リポフェクタミン２０００よりは効率は低かったが、ＧＦＰプラスミドのＣＨＯ−Ｋ１細胞中へのトランスフェクションにおいて有効であったことを示す。しかし、ＨｅｐＧ２細胞では、３つの試験ジェミニ化合物は全て、最適濃度においては、５ｕｇ／ｍｌのリポフェクタミン２０００よりも有効だった。
【００５７】
ＣＶ−１細胞では、実施例１のジェミニ化合物は、全濃度のリポフェクタミン２０００と比較すると、１０および２０ｕｇ／ｍｌにおいて優れていた。実施例３および４のジェミニ化合物は、実施例１のものより低い効率であるがリポフェクタミン２０００と同程度の効率で、ＣＶ−１細胞にトランスフェクトするようだった。
【００５８】
１３２１Ｎ１細胞については、実施例１および２のジェミニ化合物は各々ほぼ５および６倍だけリポフェクタミン２０００より有効だった。これらの両場合において、ジェミニ化合物の最も有効な濃度は試験した最低濃度の２．５ｕｇ／ｍｌであることが見出された。実施例４のジェミニ化合物は１３２１Ｎ１細胞へのトランスフェクションにおいて有効ではなかった。
【００５９】
ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を用いて試験した全てのジェミニ化合物は、試験したほとんどの濃度においてリポフェクタミン２０００より有効だった。実施例４は最良の効果を示した。
【００６０】
これらの結果、特に１３２１Ｎ１およびＮＩＨ−３Ｔ３細胞についての結果は、高効率なトランスフェクションのために、各細胞型について最適なジェミニ化合物が存在することを示す。故に、１３２１Ｎ１細胞については、実施例１の化合物および実施例２の化合物の両方が非常に有効なトランスフェクション物質であり、一方、実施例４の化合物は全く有効ではなかった。対照的に、実施例４の化合物はＮＩＨ−３Ｔ３細胞へのトランスフェクションについては非常に有効であることが見出され、一方、実施例１および２の化合物は有意に効果が低かった。
【００６１】
故に、当業者は、本実施例において詳述したプロトコルを用いて、簡単な実験により、本明細書中例示した化合物であろうと、或いは例示されていないが上記した合成プロトコルに従って製造され得る化合物であろうとも、どのエステルジェミニ化合物が特定の細胞株のトランスフェクションに最も適するかを容易に決定することができる。
【００６２】
実施例６：エステル結合した界面活性剤化合物を用いる、細胞中へのｓｉＲＮＡのトランスフェクション
接着細胞株Ａ５４９、ＣＶ１およびＣａｃｏ２を用いて、ノックダウン研究を行った。完全培地は、１０％ｖ／ｖのウシ胎仔血清および１×Ｌ−グルタミンを補足したＤＭＥＭ（Ａ５４９およびＣＶ１ｔについて）およびＥＭＥＭ（Ｃａｃｏ２について）培地から構成された。全培地および添加物質はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した。
【００６３】
インビトロｓｉＲＮＡトランスフェクション
トランスフェクションの１６〜１８時間前に、約２×１０4細胞／ウェルの密度で細胞を組織培養処理された９６−ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に播種した。Ｄｈａｒｍａｃｏｎから購入したｓｉＲＮＡ（標的ＪＮＫ１または非標的対照）の１μＭ溶液をＯｐｔｉｍｅｍ中で調製した。エステル結合した界面活性剤を１０×濃度としてＯｐｔｉｍｅｍ中に溶解し、最終反応混合物中、５μｇ／ｍｌの最終濃度とした。市販のリポフェクタミン２０００試薬を２．５μｇ／ｍｌの最終濃度で用い、ｓｉＬｅｎｔＦｅｃｔは１μｇ／ｍｌおよびＸ−ｔｒｅｍｅＧｅｎｅは０．５μｌ／ウェルで用いた。各ウェルにつき、エステル結合した界面活性剤（市販）脂質の１０μｌ試料を１０μｌのｓｉＲＮＡと混合した。複合体を室温で１０分間インキュベートした。培地をプレート中の細胞から除去し、細胞を１００μｌのＰＢＳで１回洗浄した。複合体（２０μｌ）を各ウェルに加え、次いで、８０μｌの成長培地を加え、１００μｌの最終容量とし、プレートを２４時間３７℃でインキュベートした。この時点で、１００μｌのＰＢＳを用いて細胞を１回洗浄し、次いで、１００μｌのＲＮＡ溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に溶解した。標準的な定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ）を実施して、ＪＮＫ１ ｓｉＲＮＡ標的化および非標的化細胞双方におけるハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨと比較したＪＮＫ１の相対存在量を測定した。ノックダウンの程度は、Ｊｎｎｋ１の対照（非標的化）コピーに対するＪＮＫ１の処置（ＪＮＫ１）コピーの比として示した。
【００６４】
結果を図２に示す。試験した３つの細胞型全てにおいて、本発明のジェミニ化合物を用いてｓｉＲＮＡ２本鎖を細胞中へトランスフェクトした場合に、Ｊｎｋ１のレベルが非標的化対照細胞と比較して有意に減少したことが示され得る。Ｊｎｋ１の発現レベルは、未処理細胞において観察されるものよりも７０〜８５％だけ低かった。同様のノックダウン効果は、リポフェクタミン２０００を用いてｓｉＲＮＡ２本鎖をトランスフェクトした細胞において示されたが、全細胞型において、その効果はエステルジェミニ化合物を用いて観察されたものよりも著しく低かった（未処理対照よりも６５〜７９％低い）。
【００６５】
特許、特許出願を含め、本明細書中に引用した全ての文献は、出典明示によりその全てが本明細書の一部となる。
【００６６】
図面の説明
図１は、エステル結合した界面活性剤の合成のための一般的スキームを示す。
【００６７】
図２は、ｓｉＲＮＡ２本鎖を用いるＪｎｋ１発現のノックダウンを示す。細胞型をＸ軸に示し、ＪＮＫ１の対照（非標的化）コピーに対するＪｎｋ１の処置（ＪＮＫ１）コピーの比をＹ軸に示す。斜線を引いた棒は実施例１のエステルジェミニで処理した細胞に関し、破線で横線を引いた棒はリポフェクタミン２０００で処理した場合の細胞（実施例６）に関する。
【００６８】
図３および４は、エステルジェミニを用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞（図３）およびＨｅｐＧ２細胞（図４）中へｐＣＭＶ−ｅＧＦＰ、ＧＦＰ−発現プラスミドをトランスフェクションした後の細胞における緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）発現を示す。細胞中のＧＦＰ発現レベルは、リポフェクタミン２０００を用いて成し遂げられた発現レベルの％として示す。データを４つの棒からなる３つのブロックにて示す。各ブロックは特定のエステルジェミニに関する。４つの棒の第一のブロックは実施例１のエステルジェミニを用いるトランスフェクション効率を示す；第２のブロックは実施例３に対応し、第３のブロックは実施例４に対応する。ジェミニを４濃度：２０ｕｇ／ｍｌ（左上から右下への斜線）；１０ｕｇ／ｍｌ（右上から左下への斜線）、５ｕｇ／ｍｌ（破線の横線）および２．５ｕｇ／ｍｌ（実線の横線）にて用いた。５ｕｇ／ｍｌのリポフェクタミンは単一の棒（ＬＰ２Ｋ）として示す。
【００６９】
図５、６および７は、エステルジェミニを用いてＣＶ−１細胞（図５）、１３２１Ｎ１細胞（図６）およびＮＩＨ−３Ｔ３細胞（図７）中へｐＣＭＶ−ｅＧＦＰ、ＧＦＰ−発現プラスミドをトランスフェクションした後の細胞における緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）発現を示す。細胞中のＧＦＰ発現レベルは、リポフェクタミン２０００を用いて成し遂げられた発現レベルの％として示す。データを４つの棒からなる４つのブロックにて示す。各ブロックは特定のエステルジェミニに関する。４つの棒の第一のブロックは実施例１のエステルジェミニを用いるトランスフェクション効率を示す；第２のブロックは実施例３に対応し、第３のブロックは実施例４に対応し、第４のブロックはリポフェクタミン２０００（Ｌ２Ｋ）に対応する。エステルジェミニおよびリポフェクタミン２０００を４濃度：２０ｕｇ／ｍｌ（左上から右下への斜線）；１０ｕｇ／ｍｌ（右上から左下への斜線）、５ｕｇ／ｍｌ（破線の横線）および２．５ｕｇ／ｍｌ（実線の横線）にて用いた。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】エステル結合した界面活性剤の合成のための一般的スキームを示す。
【図２】ｓｉＲＮＡ２本鎖を用いるＪｎｋ１発現のノックダウンを示す。細胞型をＸ軸に示し、ＪＮＫ１の対照（非標的化）コピーに対するＪｎｋ１の処置（ＪＮＫ１）コピーの比をＹ軸に示す。斜線を引いた棒は実施例１のエステルジェミニで処理した細胞に関し、破線で横線を引いた棒はリポフェクタミン２０００（実施例６）で処理した場合の細胞に関する。
【図３】エステルジェミニを用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞中へｐＣＭＶ−ｅＧＦＰ、ＧＦＰ−発現プラスミドをトランスフェクションした後の細胞における緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）発現を示す。細胞中のＧＦＰ発現レベルは、リポフェクタミン２０００を用いて成し遂げられた発現レベルの％として示す。
【図４】エステルジェミニを用いてＨｅｐＧ２細胞中へｐＣＭＶ−ｅＧＦＰ、ＧＦＰ−発現プラスミドをトランスフェクションした後の細胞における緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）発現を示す。細胞中のＧＦＰ発現レベルは、リポフェクタミン２０００を用いて成し遂げられた発現レベルの％として示す。
【図５】エステルジェミニを用いてＣＶ−１細胞中へｐＣＭＶ−ｅＧＦＰ、ＧＦＰ−発現プラスミドをトランスフェクションした後の細胞における緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）発現を示す。細胞中のＧＦＰ発現レベルは、リポフェクタミン２０００を用いて成し遂げられた発現レベルの％として示す。
【図６】エステルジェミニを用いて１３２１Ｎ１細胞中へｐＣＭＶ−ｅＧＦＰ、ＧＦＰ−発現プラスミドをトランスフェクションした後の細胞における緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）発現を示す。細胞中のＧＦＰ発現レベルは、リポフェクタミン２０００を用いて成し遂げられた発現レベルの％として示す。
【図７】エステルジェミニを用いてＮＩＨ−３Ｔ３細胞中へｐＣＭＶ−ｅＧＦＰ、ＧＦＰ−発現プラスミドをトランスフェクションした後の細胞における緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）発現を示す。細胞中のＧＦＰ発現レベルは、リポフェクタミン２０００を用いて成し遂げられた発現レベルの％として示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規同定されたエステル結合した界面活性剤化合物、かかる化合物の使用、およびそれらの調製に関する。本発明は、薬剤送達のために細胞中への化合物の移入を容易にするための、エステル結合した界面活性剤化合物の使用にも関する。多くの場合、本発明の化合物の特性に関連する特性を有する化合物はジェミニ界面活性剤と呼ばれる。
【背景技術】
【０００２】
界面活性剤は、低濃度でさえも、液体の界面特性に著しい影響を与える物質である。例えば、界面活性剤は、水または水溶液に溶解された場合に、表面張力を有意に低下させ得、２種の液体または液体および固体間の界面張力を低下させ得る。界面活性剤分子のこの特性は、工業的に、特に、洗剤および油脂産業において広く利用されている。１９７０年代に、新たなクラスの界面活性剤分子が報告され、疎水性ブリッジにより結合された極性頭部を有する２個の疎水性鎖により特徴付けられた(Deinega, Y et al., Kolloidn. Zh. 36,649,1974)。これらの分子は「ジェミニ」と呼ばれ(Menger, FM and Littau,CA,J. Am. Chem. Soc. 113,1451,1991)、それらのモノマー等価物に勝る非常に好ましい特性を有する。例えば、それらは油および水に基づく液体間の界面張力の低下に非常に有効であり、非常に低い臨界ミセル濃度を有する(Menger, FM and Keiper,JS,Angewandte. Chem. Int. Ed. Engl.,2000,39,1906)。
【０００３】
カチオン性界面活性剤は、とりわけ、培養細胞中へのポリヌクレオチドのトランスフェクションに使用されており、遺伝子工学の科学者に市販されているかかる物質の例としては、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．ＷＩ，ＵＳＡから市販されている真核細胞のトランスフェクション用のＴｆｘ（登録商標）−５０試薬が挙げられる。
【０００４】
遺伝子治療またはアンチセンス療法のためのインビボにおけるＤＮＡの細胞への有効な送達は、ここ数年間の主要な目標である。多くの注目は、送達用ビヒクルとしてのウイルスの使用に集中し、例えば、嚢胞性線維症（ＣＦ）の修正的遺伝子治療を目的とする呼吸管上皮細胞へのアデノウイルスの適用が挙げられる。しかし、ＣＦ患者における遺伝子移入成功の証拠が幾つかあるにも関わらず、アデノウイルス経由には、炎症性副作用および移入された遺伝子の一時的発現に起因する問題が依然存在する。カチオン性界面活性剤を用いる研究を含む、インビボ遺伝子送達のための幾つかの代替的方法が研究されている。Gao, X et al. Gene Ther. 2,710-722,1995は、アミン担持カチオン性脂質を用いてＣＦ膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）に関する正常ヒト遺伝子をＣＦマウスの呼吸器上皮に導入する、このアプローチの実行可能性を示した。このグループは、その後、リポソームＣＦ遺伝子治療を試みたところ、部分的に成功し、ヒトにおけるこのアプローチの可能性が示された(Caplen, NJ. et al., Nature Medicine,1,39-46,1995)。より最近になって、他のグループは、遺伝子送達のための他のカチオン性脂質(Miller,A,Angew. Int. Ed. Engl.,37,1768-1785,1998)、例えば、コレステロール誘導体(Oudrhiri, N et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 94,1651-1656,1997)の可能性を研究した。この限定的な研究は、インビトロおよびインビボの両方における上皮細胞への遺伝子移入を容易にするというこれらのコレステロールに基づく化合物の能力を示し、それ故に、この一般的アプローチの正当性が支持された。
【０００５】
最近、遺伝子トランスフェクションのための非ウイルス性（カチオン性脂質）ベクターの使用が報告された。D. Niculescu-Duvaz, J. Heyes and C. J. Springer,Curr. Med. Chem.,2003,10,1233を参照のこと。
【０００６】
これらの研究および他の研究は、細胞に基づく実験におけるトランスフェクションのためにインビトロにおいて、ならびに遺伝子治療およびアンチセンス療法のためにインビボにおいて、ポリヌクレオチドの細胞中への効果的な移入を容易にするために低毒性の界面活性剤分子を開発することがこの新規研究分野において引き続き必要とされていることを示す。システイン（ＷＯ ９９／２９７１２）またはスペルミン（ＷＯ ００／７７０３２）またはジアミン（ＷＯ ００／７６９５４）に基づくジェミニ界面活性剤が既に作製されている。ジェミニ界面活性剤の他の例は、ＷＯ ００／２７７９５、ＷＯ ０２／３０９５７、ＷＯ ０２／５０１００、ＷＯ ０３／８２８０９、ＧＢ０４２５５５５．０およびＧＢ０４２５５５６．８において見出される。ポリヌクレオチドベクターとしてのジェミニ界面活性剤の使用は最近報告された（A. J. Kirby,P. Camilleri,J. B. F. N. Engberts, M. C. Feiters, R. J. M. Nolte, O. Soederman, M. Bergsma, P. C. Bell, M. L. Fielden, C. L. Garciea Rodrieguez, Philippe Guedat, A. Kremer, C. McGregor, C. Perrin, G. Ronsin and M. C. P. van Eijk, Angew. Chem. Int. Ed., 2003, 42, 1448, R. Zana and J. Xia, Gemini Surfactants, Marcel Dekker, NY, 2004も参照のこと）。
【０００７】
最近開発された技法は、遺伝子機能を一時的に抑制するための合成低分子干渉（ｓｉ）２本鎖ＲＮＡ分子の使用を含む。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のこの技法は、元々、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓらの研究から生み出され（A. Fire, rends Genet.,1999,15(9),358）、後に、哺乳類細胞へ適用可能なように開発された（S. M. Elbashir, J. Harborth, W. Lendeckel, A. Yalcin, K.Weber, T. Tuschl, Nature, 2001,411,494）。これらのｓｉＲＮＡエフェクター分子を送達して細胞集団の大部分の位置を修正する能力は、この技法の効果的な利用において重要な段階である。一旦、正確に局在すると、２本鎖ＲＮＡのアンチセンス鎖は、標的化メッセンジャー（ｍ）ＲＮＡ（目的の標的をコードする）の相補的領域に結合し、ｍＲＮＡの加水分解、次いで、その分解をもたらす。ｍＲＮＡのこの一時的な減少は、標的遺伝子発現の一時的な減少をもたらす。非常に効果的な送達および正確な局在化は、標的の機能が解明可能なレベルまで標的の遺伝子発現を軽減するのに必要とされる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は既存の化合物の特性の改良に努める。
【０００９】
本発明は、一般構造式（Ｉ）：
【化１】
［式中、
ＹはＨまたは（Ａａ）xのいずれかであり、ここで、（Ａａ）は塩基性アミノ酸であり、ｘは１〜６であり；
Ｒ1およびＲ2は、同一または異なっていてもよく、２４個までの炭素原子からなる飽和または不飽和の直鎖または分岐した炭化水素鎖であり；
ｎは１〜１０であり；および
ｐは１〜６である］
で示される化合物またはその医薬上許容される塩に関する。
【００１０】
一の好ましい実施態様において、Ｒ1またはＲ2は、２４個までの炭素原子からなる飽和または不飽和の直鎖または分岐した炭化水素鎖であり、１０個以上の炭素原子、例えば１２個以上の、例えば１４個以上の、例えば１６個以上の炭素原子を有する。さらなる好ましい一の実施態様において、Ｒ1またはＲ2は、２４個までの炭素原子からなる飽和または不飽和の直鎖または分岐した炭化水素鎖であり：
−（ＣＨ2）10ＣＨ3
−（ＣＨ2）12ＣＨ3
−（ＣＨ2）14ＣＨ3
−（ＣＨ2）16ＣＨ3
−（ＣＨ2）18ＣＨ3
−（ＣＨ2）20ＣＨ3
−（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3 天然混合物
−（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）5ＣＨ3 天然混合物
−（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）5ＣＨ3 シス
−（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3 シス
−（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）5ＣＨ3 トランス
−（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3 トランス
−（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）4ＣＨ3
−（ＣＨ2）7（ＣＨ＝ＣＨＣＨ2）3ＣＨ3
−（ＣＨ2）3ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ）3（ＣＨ2）4ＣＨ3
−（ＣＨ2）7ＣＨＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3
−ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）［ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）］3ＣＨ3
または−（ＣＨ2）22ＣＨ3：
から選択される。
【００１１】
最も好ましくは、炭化水素鎖は、（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3天然混合物、（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3シスおよび（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3トランスから選択される。
【００１２】
好ましくは、ｎは３〜６である。最も好ましくは、ｎは４である。
【００１３】
好ましくは、ｐは１〜４である。最も好ましくは、ｐは２である。
【００１４】
好ましくは、Ｙは（Ａａ）である。
【００１５】
各場合において、（Ａａ）xは、同一または異なっていてもよく、直鎖または分岐した様式で連結したｘ個の天然または非天然アミノ酸であり；（Ａａ）は塩基性アミノ酸、好ましくは、セリン（ｓｅｒ）、リジン（ｌｙｓ）、オルニチン（ｏｒｎ）、ジアミノ酪酸（ｄａｂ）またはジアミノプロピオン酸（ｄａｐ）のＬまたはＤエナンチオマーである。ｘは１〜６であり；好ましくは、１〜３である。最も好ましくは、ｘは１である。
【００１６】
（Ａａ）基は、Ｎとアミノ酸残基上のカルボキシ基との間のペプチド（アミド）結合により、式（Ｉ）中のＮに結合する。
【００１７】
一の実施態様において、本発明の化合物は、所謂「ジェミニ」界面活性剤化合物である。すなわち、本化合物は、各Ｙが同一であり、Ｒ1およびＲ2が同一という点で、対称である。本発明の文脈において、かかる化合物を「エステルジェミニ」と称する。
【００１８】
最も好ましい一の実施態様において、エステルジェミニは：
【化２】
；
【化３】
；
【化４】
；および
【化５】
からなる群より選択される。
【００１９】
本発明の化合物は、当業者によく知られている合成化学を用いて、容易に入手可能な出発物質から調製されてもよい。図１は、本発明の好ましい化合物［ここで、ｐ＝２である］の合成のための一般的スキームを示す。ｐ＝１または３〜６である化合物については、当該分野においてよく知られている技法、例えば、ｐ＝１では、Jaine, N et al. ;Journal of Inorganic Biochemistry 1994,53(2),79-94；ｐ＝３では、Reppe et al. ;JLACBF ;Justus Liebigs Ann. Chem.;596;1955;1,215；およびｐ＝４では、Gautier;Renault;Recl. Trav. Chim. Pays-Bas;69;1950;421,426の技法を用いて、他のジカルボン酸（図１の中間体３）を出発物質として用いてもよい。
【００２０】
様々な代替的戦略が当業者には知られており、適切な戦略は、所望する特定の最終的な置換パターンについて考案されてもよい。非対称置換パターンについては、生成物または中間体の物理的分離が必要とされてもよい。クロマトグラフィー法のごとき適切な分離方法は当業者によく知られている。
【００２１】
本発明に基づく分子の塩は、標準的な技法により調製されてもよい。
【００２２】
本発明の別の態様は、エステル結合した界面活性剤化合物を用いる方法に関する。かかる使用は、生物全体におけるアンチセンス、遺伝子治療および（抗体産生のための）遺伝子免疫のために、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの細胞中への移入を容易にすることを含む。他の使用は、かかる移入が例えば特に遺伝子発現研究およびアンチセンス制御実験において必要とされる場合に、培養細胞中へのポリヌクレオチドのトランスフェクションを容易にするための本発明の化合物の使用を含む。かかるポリヌクレオチドおよびアンチセンス分子の調製のためのプロトコルは当該分野においてよく知られている（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989), Cohen, JS ed. Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL(1989)）。ポリヌクレオチドを化合物と混合し、細胞に添加し、インキュベートし、ポリヌクレオチドを摂取させることができる。さらなるインキュベーションの後、トランスフェクトされたＤＮＡにより得られた表現型形質について細胞をアッセイでき、或いは該ＤＮＡから発現されるｍＲＮＡのレベルは、ノーザンブロッティングによってか、またはＴａｑｍａｎ（登録商標）方法（Perkin Elmer, Connecticut, USA）のごときＰＣＲに基づく定量法により測定され得る。本発明の化合物は、従前の技術における化合物と比較して、培養細胞中のＤＮＡの細胞取り込み効率において有意な改善、典型的には３〜６倍の改善をもたらす。トランスフェクションプロトコルにおいて、スペルミジン界面活性剤化合物を１個または複数の添加物質と併用して、トランスフェクション効率を増大させてもよい。かかる添加物質は、例えば：
（ｉ）中性担体、例えば、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）（Farhood, H., et al(1985)Biochim. Biophys. Acta,1235-1289）；
（ｉｉ）複合体形成試薬、例えば、市販のＰＬＵＳ試薬（Life Technologies Inc. Maryland, USA）またはペプチド、例えば、ポリリジンまたはポリオルニチンペプチド、或いはリジン、オルニチンおよび／またはアルギニンのごとき塩基性アミノ酸を主に含むがこれらに限定されないペプチド：
から選択されてもよい。上記リストは全てを網羅するものではなく、トランスフェクション効率を増大する他の添加物質も本発明の範囲内となる。
【００２３】
さらなる別の態様において、本発明は、遺伝子治療における本発明の化合物を用いる遺伝物質の移入に関する。例えば、当業者は、当該分野においてよく知られているプロトコルを用いて、本発明のスペルミジン界面活性剤化合物の使用を含む遺伝子治療における使用のための遺伝子送達方法を開発できよう。例えば、遺伝子移入ベクターの肺への送達のための界面活性剤の使用は、Weiss, DJ(2002)Molecular Therapy 6(2) pp148-152において概説されている。
【００２４】
本発明のさらなる別の態様は、本発明の化合物を用いるインビトロおよびインビボにおける細胞中への非ヌクレオチドに基づく薬剤化合物の送達を実施するための方法に関する。
【００２５】
以下の定義は、本明細書で頻繁に使用される特定の用語の理解を容易にするために提供されるものである。
【００２６】
「アミノ酸」は、＋Ｈ３ＮＣＨ（Ｒ）ＣＯ2−形態の双極イオン（双性イオン）を言う。それらはＲ基の性質により分類され、Ｒが水素とは異なる場合、それらは非対称であり得、ＤおよびＬ体を形成する。２０種の天然アミノ酸が存在し、例えば、Ｒ基は無極性（例えば、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン）または極性（例えば、グルタミン酸、ヒスチジン、アルギニンおよびリジン）であり得る。非天然アミノ酸の場合、Ｒは天然に見出されるアミノ酸中に見出されない任意の他の基であり得る。
【００２７】
一般的に、「ポリヌクレオチド」は、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを言い、それらは非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであってもよい。「ポリヌクレオチド」は、１本鎖および２本鎖ＤＮＡ、１本鎖および２本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、１本鎖および２本鎖ＲＮＡ、ならびに１本鎖および２本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、１本鎖もしくはより典型的には２本鎖または１本鎖および２本鎖領域の混合物であってもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を含むが、これらに限定されない。加えて、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む３本鎖領域を言う。ポリヌクレオチドなる用語は、１個または複数の修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡのもの、ならびに安定性または他の理由で骨格が修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡのものも包含する。「修飾」塩基は、例えば、トリチル化塩基および独特な塩基、例えば、イノシンを包含する。種々の修飾がＤＮＡおよびＲＮＡになされてもよく；故に、「ポリヌクレオチド」は、典型的に天然において見出されるポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、ならびにウイルスおよび細胞のＤＮＡおよびＲＮＡ特徴を有する化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」は、比較的短いポリヌクレオチドも包含し、それらは多くの場合オリゴヌクレオチドと言われる。
【００２８】
「トランスフェクション」は、化学的または物理的手段のいずれかによる細胞膜の修飾を含む方法を用いる、ポリヌクレオチドの培養細胞中への導入を言う。かかる方法は、例えば、Sambrook et al., MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989）において記載されている。ポリヌクレオチドは、直鎖状または環状、１本鎖または２本鎖であってもよく、ポリヌクレオチドの複製或いはポリヌクレオチドの一部を含み得る同種または異種遺伝子の発現を調節するエレメントを含んでもよい。
【００２９】
医薬上許容される酸付加塩は、所望により、有機溶媒のごとき適切な溶媒中、式（Ｉ）の化合物を適切な無機または有機酸（例えば、臭化水素酸、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、コハク酸、マレイン酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、クエン酸、洒石酸、乳酸、安息香酸、サリチル酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、ベンゼンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、例えば、２−ナフタレンスルホン酸またはヘキサン酸）と反応させることにより形成され得、得られた塩は、通常、例えば、結晶化および濾過により単離される。式（Ｉ）の化合物の医薬上許容される酸付加塩は、例えば、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、洒石酸塩、乳酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩（例えば、２−ナフタレンスルホン酸塩）またはヘキサン酸塩を含み得る。
【００３０】
本発明は、その範囲内に、水和物および溶媒和物を含む式（Ｉ）の化合物の塩の全ての可能な化学量論的および非化学量論的形態を包含する。
【００３１】
式（Ｉ）の特定化合物は、化学量論的形態にて存在し得る。本発明がこれらの化合物の全ての幾何異性体および光学異性体ならびにラセミ体を含むそれらの混合物を包含することが理解されよう。互変体も本発明の態様を構成する。
【００３２】
ここで、本発明は以下の実施例により説明され得る。実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００３３】
実施例
記載例１：Ｎ，Ｎ’−ビス−（２−シアノエチル）−１，４−ジアミノブタン（２）
【化６】
【００３４】
０℃で、１，４−ジアミノブタン１（ｎ＝４；２５．０ｇ，０．２８ｍｏｌ）のメタノール（５０ｍＬ）中溶液へ、アクリロニトリル（３１．６ｇ，０．６０ｍｍｏｌ）のメタノール（２５ｍＬ）中溶液を滴下して加えた。添加後、混合物を室温に到達させておき、次いで、１８時間攪拌した。最後に、溶媒を真空除去し、ジアミン２を淡黄色液体（５７．０ｇ，定量）として得た。
Ｒｆシリカ：０．６０（ＭｅＯＨ−０．８８ＮＨ3 ９５：５）
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δH２．８８（ｍ，４Ｈ），２．６０（ｍ，４Ｈ），２．４６（ｍ，４Ｈ），１．４５（ｍ，４Ｈ）
【００３５】
記載例２：Ｎ，Ｎ’−ビス−（２−カルボエトキシエチル）−１，４−ジアミノブタン二塩酸塩（３）
【化７】
【００３６】
２（ｎ＝４；１０．０ｇ，５１．５ｍｍｏｌ）の６ＮのＨＣｌ（８０ｍＬ）中溶液を１８時間加熱還流し、次いで、室温に冷却させておき、溶媒を部分的に真空蒸発させておいた。残りの溶液へＥｔＯＨ（４０ｍＬ）を加え、沈殿した固体を濾過で取り出し、ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）で洗浄し、ジ−カルボン酸３を白色固体（１７．４ｇ，定量）として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ｄ6 ＤＭＳＯ）：δH １２．７０（ｂｒｓ，２Ｈ），３．０５（ｔ，Ｊ＝７．５，４Ｈ），２．８８（ｍ，４Ｈ），２．７２（ｔ，４Ｈ），１．６５（ｍ，４Ｈ）
【００３７】
記載例３：Ｎ，Ｎ’−ビス−（２−カルボエトキシエチル）−Ｎ，Ｎ’−ビス−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−１，４−ジアミノブタン（４）
【化８】
【００３８】
３（ｎ＝４；１９．９ｇ，６５．３ｍｍｏｌ）の１ＮのＮａＯＨ（３５０ｍＬ）中溶液へ、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（５７．０ｇ，２６１ｍｍｏｌ）のジオキサン（３５０ｍＬ）中溶液を加えた。混合物を室温で１８時間攪拌し、次いで、容量が半分になるまで濃縮した。残りをｐＨ３〜４に調整し、次いで、ジクロロメタン（２５０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機抽出物をブライン（１５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、真空濃縮し、カルバマート４を白色粉末（２４．４ｇ，８７％）として得た。
Ｒｆシリカ：０．３１（ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ ２：１）．
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝４．０４分（ｍ／ｚ＝４３３．１［Ｍ＋Ｈ＋］）
【００３９】
記載例４：３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−｛４−［ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−（２−オクタデカ−８−エニルオキシカルボニル−エチル）−アミノ］−ブチル｝−アミノ）−プロピオン酸オクタデカ−８−エニルエステル（５）
【化９】
【００４０】
０℃で、Ｎ−保護アミノ酸４（ｎ＝４；１５．２ｇ，３５．１ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（１．７０ｇ，１４．０ｍｍｏｌ）およびオレイルアルコール（１８．４ｇ，６８．４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２００ｍＬ）中溶液へ、ＥＤＣＩ（１３．１ｇ，６８．４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（５０ｍＬ）中溶液を加えた。得られた混合物を室温に温めておき、次いで、Ｎ2下で１８時間攪拌した。ジクロロメタン（２５０ｍＬ）を加え、混合物をブライン（４×２００ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、真空濃縮し、油状物を得、これを、ヘキサン中のＣＨ2Ｃｌ2（５０〜９０％）の溶媒勾配で溶離するカラムクロマトグラフィーにより精製し、エステル５を無色油状物（１３．０ｇ，４０％）として得た。
【００４１】
Ｒｆシリカ：０．６１（Ｈｅｘ−ＥｔＯＡｃ ７：３）．
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δH ５．３２（ｍ，４Ｈ），４．０５（ｔ，Ｊ＝７．０，４Ｈ），３．４２（ｂｒｓ，４Ｈ），３．１８（ｂｒｓ，４Ｈ），２．５３（ｂｒｓ，４Ｈ），１．９８（ｍ，８Ｈ），１．６０（ｍ，６Ｈ），１．４２（ｍ，２２Ｈ），１．４０−１．２０（ｍ，４０Ｈ），０．８６（ｔ，Ｊ＝７．０，６Ｈ）
【００４２】
記載例５：３−［４−（２−オクタデカ−９−エニルオキシカルボニル−エチルアミノ）−ブチルアミノ］−プロピオン酸オクタデカ−９−エニルエステルビス塩酸塩（６）
【化１０】
【００４３】
エステル５（ｎ＝４，Ｒ＝オレイル；１３．０ｇ，１３．９ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（７０ｍＬ）中に溶解し、ＥｔＯＡｃ（１４０ｍＬ）中４ＭのＨＣｌで処理した。得られた混合物を室温で２時間攪拌し、次いで、溶媒を真空除去し、残りを無水ジエチルエーテル（１５０ｍＬ）でトリチュレートし、固体を得、これを真空乾燥し、ビス塩酸塩６を白色粉末（１０．２３ｇ，９１％）として得た。
Ｒｆシリカ：０．４６（ＭｅＯＨ−０．８８ＮＨ3 ９７：３）．
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝８．０７分（ｍ／ｚ＝７３３．６［Ｍ＋Ｈ＋］）
【００４４】
記載例６：界面活性剤（８ａ〜ｄ）調製のための一般的手順
Ｎ−末端−保護アミノ酸（０．４１ｍｍｏｌ，２．６当量）、ＨＣＴＵ（１６８ｍｇ，０．４１ｍｍｏｌ，２．６当量）およびジイソプロピルエチルアミン（０．１９ｍＬ，１．１０ｍｍｏｌ，７．０当量）を、アミン塩酸塩６（ｎ＝４，Ｒ＝オレイル；１５０ｍｇ，０．１５６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ−ＣＨ2Ｃｌ2［１：１］（４．０ｍＬ）中溶液へ加えた。Ｎ2下、混合物を室温で１８時間攪拌し、次いで、混合物を低容量に濃縮し、ＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）を加えた。有機溶液を５％水性ＫＨＳＯ4溶液（３×８ｍＬ）、５％水性Ｋ2ＣＯ3溶液（３×８ｍＬ）およびブライン（３×１０ｍＬ）で連続して洗浄し、次いで、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、真空濃縮した。残りを、水中のＭｅＯＨ（５０〜１００％）の溶媒勾配で溶離する逆相カラムクロマトグラフィーにより、次いで、ヘキサン中のＥｔＯＡｃ（２０〜４０％）の溶媒勾配で溶離するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。残りをＥｔＯＡｃ（２．０ｍＬ）中に溶解し、ＥｔＯＡｃ（３．０ｍＬ）中の５．０ＮのＨＣｌを加えた。得られた混合物を室温で２時間攪拌し、次いで、真空濃縮し、固体残渣をジエチルエーテル（５．０ｍＬ）でトリチュレートし、界面活性剤８ａ〜ｄを白色粉末（７５〜９３％）として得た。
【実施例】
【００４５】
実施例１（８ａ）
【化１１】
【００４６】
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１２．１８分（ｍ／ｚ＝９３３．８［Ｍ＋Ｈ］＋（１００％））；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ 計算値（Ｃ54Ｈ105Ｎ6Ｏ6）９３３．８０９６，測定値 ９３３．８０９６［Ｍ＋Ｈ］＋
【００４７】
実施例２（８ｂ）
【化１２】
【００４８】
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１２．１５分（ｍ／ｚ＝９６１．８［Ｍ＋Ｈ］＋（１００％））；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ 計算値（Ｃ56Ｈ109Ｎ6Ｏ6）９６１．８４０９，測定値 ９３３．８４００［Ｍ＋Ｈ］＋
【００４９】
実施例３（８ｃ）
【化１３】
【００５０】
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１２．１８分（ｍ／ｚ＝９８９．９［Ｍ＋Ｈ］＋（１００％））；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ 計算値（Ｃ58Ｈ113Ｎ6Ｏ6）９８９．８７２２，測定値 ９８９．８７１８［Ｍ＋Ｈ］＋
【００５１】
実施例４（８ｄ）
【化１４】
【００５２】
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１２．２０分（ｍ／ｚ＝９８９．９［Ｍ＋Ｈ］＋（１００％））；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ 計算値（Ｃ58Ｈ113Ｎ6Ｏ6）９８９．８７２２，測定値 ９８９．８７２９［Ｍ＋Ｈ］＋
【００５３】
実施例５：エステル結合した界面活性剤化合物を用いる、ＧＦＰ発現組換えプラスミドの細胞へのトランスフェクション
接着細胞株ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＶ１、ＨｅｐＧ２、１３２１Ｎ１およびＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いてトランスフェクション研究を実施した。完全培地は、１０％ｖ／ｖのウシ胎仔血清および１×Ｌ−グルタミンを補足したＦ１２（ＣＨＯ−Ｋ１について）およびＤＭＥＭ（ＣＶ１，ＨｅｐＧ２，１３２１Ｎ１およびＮＩＨ３Ｔ３について）培地から構成された。全培地および添加物質はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した。
【００５４】
インビトロ遺伝子トランスフェクション
トランスフェクションの１６〜１８時間前に、約２×１０4細胞／ウェルの密度で細胞を組織培養処理された９６−ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に播種した。０．０２５μｇ／μｌのプラスミド溶液をＯｐｔｉｍｅｍ中で調製した。用いたプラスミドはＣｌｏｎｔｅｃｈから得たｐＣＭＶ−ｅＧＦＰだった。エステル結合した界面活性剤化合物を１０×濃度としてＯｐｔｉｍｅｍ中に溶解し、最終反応混合物中２０、１０、５および２．５μｇ／ｍｌの最終濃度とした。各ウェルにつき、１０μｌのエステル結合した界面活性剤化合物を１０ｕｌのプラスミドと混合した。複合体を室温で１０分間インキュベートした。培地をプレート中の細胞から除去し、細胞を１００μｌのＰＢＳで１回洗浄した。複合体（２０μｌ）を各ウェルへ加え、次いで、８０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ（血清不含）または成長培地（血清）を加えて、最終容量を１００μｌとした。血清不含プロトコルでは、次いで、プレートを６時間３７℃でインキュベートし、次いで、培地を除去し、新鮮な完全培地を各ウェルへ加え、さらに１８時間インキュベーションを続けた。血清プロトコルでは、プレートを２４時間３７℃でインキュベートした。
【００５５】
製造元（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）のガイドラインに従ってレポーター遺伝子アッセイを行った。培地をプレートから除去し、細胞を１００μｌのＰＢＳで１回洗浄した。次いで、１００μｌのレポーター溶解バッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５，２ｍＭのＥＤＴＡ，０．０５％のトリトン ×１００，２ｍＭのＤＴＴ）を各ウェルに加えた。次いで、プレートを−８０℃で１５分間放置し、次いで、室温で溶解させておいた。次いで、標準的なプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｕｌｔｒａ，Ｔｅｃａｎ）を用いて、励起波長４８５ｎｍおよび放射波長５２０ｎｍでの蛍光を測定した。
【００５６】
結果を図３（ＣＨＯ−Ｋ１）、４（ＨｅｐＧ２）、５（ＣＶ−１）、６（１３２１Ｎ１）および７（ＮＩＨ−３Ｔ３）に示す。結果は、試験した３つのエステルジェミニ化合物全てが、リポフェクタミン２０００よりは効率は低かったが、ＧＦＰプラスミドのＣＨＯ−Ｋ１細胞中へのトランスフェクションにおいて有効であったことを示す。しかし、ＨｅｐＧ２細胞では、３つの試験ジェミニ化合物は全て、最適濃度においては、５ｕｇ／ｍｌのリポフェクタミン２０００よりも有効だった。
【００５７】
ＣＶ−１細胞では、実施例１のジェミニ化合物は、全濃度のリポフェクタミン２０００と比較すると、１０および２０ｕｇ／ｍｌにおいて優れていた。実施例３および４のジェミニ化合物は、実施例１のものより低い効率であるがリポフェクタミン２０００と同程度の効率で、ＣＶ−１細胞にトランスフェクトするようだった。
【００５８】
１３２１Ｎ１細胞については、実施例１および２のジェミニ化合物は各々ほぼ５および６倍だけリポフェクタミン２０００より有効だった。これらの両場合において、ジェミニ化合物の最も有効な濃度は試験した最低濃度の２．５ｕｇ／ｍｌであることが見出された。実施例４のジェミニ化合物は１３２１Ｎ１細胞へのトランスフェクションにおいて有効ではなかった。
【００５９】
ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を用いて試験した全てのジェミニ化合物は、試験したほとんどの濃度においてリポフェクタミン２０００より有効だった。実施例４は最良の効果を示した。
【００６０】
これらの結果、特に１３２１Ｎ１およびＮＩＨ−３Ｔ３細胞についての結果は、高効率なトランスフェクションのために、各細胞型について最適なジェミニ化合物が存在することを示す。故に、１３２１Ｎ１細胞については、実施例１の化合物および実施例２の化合物の両方が非常に有効なトランスフェクション物質であり、一方、実施例４の化合物は全く有効ではなかった。対照的に、実施例４の化合物はＮＩＨ−３Ｔ３細胞へのトランスフェクションについては非常に有効であることが見出され、一方、実施例１および２の化合物は有意に効果が低かった。
【００６１】
故に、当業者は、本実施例において詳述したプロトコルを用いて、簡単な実験により、本明細書中例示した化合物であろうと、或いは例示されていないが上記した合成プロトコルに従って製造され得る化合物であろうとも、どのエステルジェミニ化合物が特定の細胞株のトランスフェクションに最も適するかを容易に決定することができる。
【００６２】
実施例６：エステル結合した界面活性剤化合物を用いる、細胞中へのｓｉＲＮＡのトランスフェクション
接着細胞株Ａ５４９、ＣＶ１およびＣａｃｏ２を用いて、ノックダウン研究を行った。完全培地は、１０％ｖ／ｖのウシ胎仔血清および１×Ｌ−グルタミンを補足したＤＭＥＭ（Ａ５４９およびＣＶ１ｔについて）およびＥＭＥＭ（Ｃａｃｏ２について）培地から構成された。全培地および添加物質はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した。
【００６３】
インビトロｓｉＲＮＡトランスフェクション
トランスフェクションの１６〜１８時間前に、約２×１０4細胞／ウェルの密度で細胞を組織培養処理された９６−ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に播種した。Ｄｈａｒｍａｃｏｎから購入したｓｉＲＮＡ（標的ＪＮＫ１または非標的対照）の１μＭ溶液をＯｐｔｉｍｅｍ中で調製した。エステル結合した界面活性剤を１０×濃度としてＯｐｔｉｍｅｍ中に溶解し、最終反応混合物中、５μｇ／ｍｌの最終濃度とした。市販のリポフェクタミン２０００試薬を２．５μｇ／ｍｌの最終濃度で用い、ｓｉＬｅｎｔＦｅｃｔは１μｇ／ｍｌおよびＸ−ｔｒｅｍｅＧｅｎｅは０．５μｌ／ウェルで用いた。各ウェルにつき、エステル結合した界面活性剤（市販）脂質の１０μｌ試料を１０μｌのｓｉＲＮＡと混合した。複合体を室温で１０分間インキュベートした。培地をプレート中の細胞から除去し、細胞を１００μｌのＰＢＳで１回洗浄した。複合体（２０μｌ）を各ウェルに加え、次いで、８０μｌの成長培地を加え、１００μｌの最終容量とし、プレートを２４時間３７℃でインキュベートした。この時点で、１００μｌのＰＢＳを用いて細胞を１回洗浄し、次いで、１００μｌのＲＮＡ溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に溶解した。標準的な定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ）を実施して、ＪＮＫ１ ｓｉＲＮＡ標的化および非標的化細胞双方におけるハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨと比較したＪＮＫ１の相対存在量を測定した。ノックダウンの程度は、Ｊｎｎｋ１の対照（非標的化）コピーに対するＪＮＫ１の処置（ＪＮＫ１）コピーの比として示した。
【００６４】
結果を図２に示す。試験した３つの細胞型全てにおいて、本発明のジェミニ化合物を用いてｓｉＲＮＡ２本鎖を細胞中へトランスフェクトした場合に、Ｊｎｋ１のレベルが非標的化対照細胞と比較して有意に減少したことが示され得る。Ｊｎｋ１の発現レベルは、未処理細胞において観察されるものよりも７０〜８５％だけ低かった。同様のノックダウン効果は、リポフェクタミン２０００を用いてｓｉＲＮＡ２本鎖をトランスフェクトした細胞において示されたが、全細胞型において、その効果はエステルジェミニ化合物を用いて観察されたものよりも著しく低かった（未処理対照よりも６５〜７９％低い）。
【００６５】
特許、特許出願を含め、本明細書中に引用した全ての文献は、出典明示によりその全てが本明細書の一部となる。
【００６６】
図面の説明
図１は、エステル結合した界面活性剤の合成のための一般的スキームを示す。
【００６７】
図２は、ｓｉＲＮＡ２本鎖を用いるＪｎｋ１発現のノックダウンを示す。細胞型をＸ軸に示し、ＪＮＫ１の対照（非標的化）コピーに対するＪｎｋ１の処置（ＪＮＫ１）コピーの比をＹ軸に示す。斜線を引いた棒は実施例１のエステルジェミニで処理した細胞に関し、破線で横線を引いた棒はリポフェクタミン２０００で処理した場合の細胞（実施例６）に関する。
【００６８】
図３および４は、エステルジェミニを用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞（図３）およびＨｅｐＧ２細胞（図４）中へｐＣＭＶ−ｅＧＦＰ、ＧＦＰ−発現プラスミドをトランスフェクションした後の細胞における緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）発現を示す。細胞中のＧＦＰ発現レベルは、リポフェクタミン２０００を用いて成し遂げられた発現レベルの％として示す。データを４つの棒からなる３つのブロックにて示す。各ブロックは特定のエステルジェミニに関する。４つの棒の第一のブロックは実施例１のエステルジェミニを用いるトランスフェクション効率を示す；第２のブロックは実施例３に対応し、第３のブロックは実施例４に対応する。ジェミニを４濃度：２０ｕｇ／ｍｌ（左上から右下への斜線）；１０ｕｇ／ｍｌ（右上から左下への斜線）、５ｕｇ／ｍｌ（破線の横線）および２．５ｕｇ／ｍｌ（実線の横線）にて用いた。５ｕｇ／ｍｌのリポフェクタミンは単一の棒（ＬＰ２Ｋ）として示す。
【００６９】
図５、６および７は、エステルジェミニを用いてＣＶ−１細胞（図５）、１３２１Ｎ１細胞（図６）およびＮＩＨ−３Ｔ３細胞（図７）中へｐＣＭＶ−ｅＧＦＰ、ＧＦＰ−発現プラスミドをトランスフェクションした後の細胞における緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）発現を示す。細胞中のＧＦＰ発現レベルは、リポフェクタミン２０００を用いて成し遂げられた発現レベルの％として示す。データを４つの棒からなる４つのブロックにて示す。各ブロックは特定のエステルジェミニに関する。４つの棒の第一のブロックは実施例１のエステルジェミニを用いるトランスフェクション効率を示す；第２のブロックは実施例３に対応し、第３のブロックは実施例４に対応し、第４のブロックはリポフェクタミン２０００（Ｌ２Ｋ）に対応する。エステルジェミニおよびリポフェクタミン２０００を４濃度：２０ｕｇ／ｍｌ（左上から右下への斜線）；１０ｕｇ／ｍｌ（右上から左下への斜線）、５ｕｇ／ｍｌ（破線の横線）および２．５ｕｇ／ｍｌ（実線の横線）にて用いた。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】エステル結合した界面活性剤の合成のための一般的スキームを示す。
【図２】ｓｉＲＮＡ２本鎖を用いるＪｎｋ１発現のノックダウンを示す。細胞型をＸ軸に示し、ＪＮＫ１の対照（非標的化）コピーに対するＪｎｋ１の処置（ＪＮＫ１）コピーの比をＹ軸に示す。斜線を引いた棒は実施例１のエステルジェミニで処理した細胞に関し、破線で横線を引いた棒はリポフェクタミン２０００（実施例６）で処理した場合の細胞に関する。
【図３】エステルジェミニを用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞中へｐＣＭＶ−ｅＧＦＰ、ＧＦＰ−発現プラスミドをトランスフェクションした後の細胞における緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）発現を示す。細胞中のＧＦＰ発現レベルは、リポフェクタミン２０００を用いて成し遂げられた発現レベルの％として示す。
【図４】エステルジェミニを用いてＨｅｐＧ２細胞中へｐＣＭＶ−ｅＧＦＰ、ＧＦＰ−発現プラスミドをトランスフェクションした後の細胞における緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）発現を示す。細胞中のＧＦＰ発現レベルは、リポフェクタミン２０００を用いて成し遂げられた発現レベルの％として示す。
【図５】エステルジェミニを用いてＣＶ−１細胞中へｐＣＭＶ−ｅＧＦＰ、ＧＦＰ−発現プラスミドをトランスフェクションした後の細胞における緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）発現を示す。細胞中のＧＦＰ発現レベルは、リポフェクタミン２０００を用いて成し遂げられた発現レベルの％として示す。
【図６】エステルジェミニを用いて１３２１Ｎ１細胞中へｐＣＭＶ−ｅＧＦＰ、ＧＦＰ−発現プラスミドをトランスフェクションした後の細胞における緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）発現を示す。細胞中のＧＦＰ発現レベルは、リポフェクタミン２０００を用いて成し遂げられた発現レベルの％として示す。
【図７】エステルジェミニを用いてＮＩＨ−３Ｔ３細胞中へｐＣＭＶ−ｅＧＦＰ、ＧＦＰ−発現プラスミドをトランスフェクションした後の細胞における緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）発現を示す。細胞中のＧＦＰ発現レベルは、リポフェクタミン２０００を用いて成し遂げられた発現レベルの％として示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般構造式（Ｉ）：
【化１】
［式中、ＹはＨまたは（Ａａ）xであり、ここで、（Ａａ）は塩基性アミノ酸であり、ｘは１〜６であり；
Ｒ1およびＲ2は、同一または異なっていてもよく、２４個までの炭素原子からなる飽和または不飽和の直鎖または分岐した炭化水素鎖であり；
ｎは１〜１０であり；および
ｐは１〜６である］
で示される化合物またはその医薬上許容される塩。
【請求項２】
ｎが４である、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
ｐが２である、請求項１記載の化合物。
【請求項４】
Ｙが（Ａａ）である、請求項１〜３いずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
アミノ酸（Ａａ）がセリン、リジン、オルニチン、ジアミノ酪酸またはｄａｐから選択される、請求項４記載の化合物。
【請求項６】
ｘが１〜３である、請求項５記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ1およびＲ2が：
−（ＣＨ2）10ＣＨ3
−（ＣＨ2）12ＣＨ3
−（ＣＨ2）14ＣＨ3
−（ＣＨ2）16ＣＨ3
−（ＣＨ2）18ＣＨ3
−（ＣＨ2）20ＣＨ3
−（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3 天然混合物
−（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）5ＣＨ3 天然混合物
−（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）5ＣＨ3 シス
−（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3 シス
−（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）5ＣＨ3 トランス
−（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3 トランス
−（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）4ＣＨ3
−（ＣＨ2）7（ＣＨ＝ＣＨＣＨ2）3ＣＨ3
−（ＣＨ2）3ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ）3（ＣＨ2）4ＣＨ3
−（ＣＨ2）7ＣＨＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3
−ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）［ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）］3ＣＨ3
または−（ＣＨ2）22ＣＨ3
から選択される、請求項１〜６いずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ1およびＲ2が：
（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3 天然混合物、
（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3 シスおよび
（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3 トランス
から選択される、請求項７記載の化合物。
【請求項９】
式：
【化２】
で示される化合物。
【請求項１０】
式：
【化３】
で示される化合物。
【請求項１１】
式：
【化４】
で示される化合物。
【請求項１２】
式：
【化５】
で示される化合物。
【請求項１３】
インビボまたはインビトロにおける真核または原核細胞中へのＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそれらのアナログのトランスフェクションを行う際の、請求項１〜１２いずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項１４】
（ｉ）中性担体；または
（ｉｉ）複合体形成試薬
からなる群より選択される１個または複数の添加物質と併用される、請求項１３記載の化合物の使用。
【請求項１５】
中性担体がジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、請求項１４記載の使用。
【請求項１６】
複合体形成試薬がＰＬＵＳ試薬である、請求項１４または１５記載の使用。
【請求項１７】
複合体形成試薬が主に塩基性アミノ酸を含むペプチドである、請求項１４または１５記載の使用。
【請求項１８】
ペプチドが塩基性アミノ酸からなる、請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
塩基性アミノ酸がリジンおよびアルギニンから選択される、請求項１８記載の使用。
【請求項２０】
ペプチドがポリリジンまたはポリオルニチンである、請求項１８記載の使用。
【請求項２１】
遺伝子治療のためにインビボにおいてポリヌクレオチドを細胞中へトランスフェクトする方法であって、遺伝子治療ベクターと共にまたは別々に請求項１〜１２いずれか１項に記載の化合物を投与することを含む、方法。
【請求項２２】
抗感染治療用ポリヌクレオチドまたは抗感染化合物の原核または真核生物への移入を容易にするための、請求項１〜１２いずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項１】
一般構造式（Ｉ）：
【化１】
［式中、ＹはＨまたは（Ａａ）xであり、ここで、（Ａａ）は塩基性アミノ酸であり、ｘは１〜６であり；
Ｒ1およびＲ2は、同一または異なっていてもよく、２４個までの炭素原子からなる飽和または不飽和の直鎖または分岐した炭化水素鎖であり；
ｎは１〜１０であり；および
ｐは１〜６である］
で示される化合物またはその医薬上許容される塩。
【請求項２】
ｎが４である、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
ｐが２である、請求項１記載の化合物。
【請求項４】
Ｙが（Ａａ）である、請求項１〜３いずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
アミノ酸（Ａａ）がセリン、リジン、オルニチン、ジアミノ酪酸またはｄａｐから選択される、請求項４記載の化合物。
【請求項６】
ｘが１〜３である、請求項５記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ1およびＲ2が：
−（ＣＨ2）10ＣＨ3
−（ＣＨ2）12ＣＨ3
−（ＣＨ2）14ＣＨ3
−（ＣＨ2）16ＣＨ3
−（ＣＨ2）18ＣＨ3
−（ＣＨ2）20ＣＨ3
−（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3 天然混合物
−（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）5ＣＨ3 天然混合物
−（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）5ＣＨ3 シス
−（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3 シス
−（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）5ＣＨ3 トランス
−（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3 トランス
−（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）4ＣＨ3
−（ＣＨ2）7（ＣＨ＝ＣＨＣＨ2）3ＣＨ3
−（ＣＨ2）3ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ）3（ＣＨ2）4ＣＨ3
−（ＣＨ2）7ＣＨＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3
−ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）［ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）］3ＣＨ3
または−（ＣＨ2）22ＣＨ3
から選択される、請求項１〜６いずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ1およびＲ2が：
（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3 天然混合物、
（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3 シスおよび
（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＨ3 トランス
から選択される、請求項７記載の化合物。
【請求項９】
式：
【化２】
で示される化合物。
【請求項１０】
式：
【化３】
で示される化合物。
【請求項１１】
式：
【化４】
で示される化合物。
【請求項１２】
式：
【化５】
で示される化合物。
【請求項１３】
インビボまたはインビトロにおける真核または原核細胞中へのＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそれらのアナログのトランスフェクションを行う際の、請求項１〜１２いずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項１４】
（ｉ）中性担体；または
（ｉｉ）複合体形成試薬
からなる群より選択される１個または複数の添加物質と併用される、請求項１３記載の化合物の使用。
【請求項１５】
中性担体がジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、請求項１４記載の使用。
【請求項１６】
複合体形成試薬がＰＬＵＳ試薬である、請求項１４または１５記載の使用。
【請求項１７】
複合体形成試薬が主に塩基性アミノ酸を含むペプチドである、請求項１４または１５記載の使用。
【請求項１８】
ペプチドが塩基性アミノ酸からなる、請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
塩基性アミノ酸がリジンおよびアルギニンから選択される、請求項１８記載の使用。
【請求項２０】
ペプチドがポリリジンまたはポリオルニチンである、請求項１８記載の使用。
【請求項２１】
遺伝子治療のためにインビボにおいてポリヌクレオチドを細胞中へトランスフェクトする方法であって、遺伝子治療ベクターと共にまたは別々に請求項１〜１２いずれか１項に記載の化合物を投与することを含む、方法。
【請求項２２】
抗感染治療用ポリヌクレオチドまたは抗感染化合物の原核または真核生物への移入を容易にするための、請求項１〜１２いずれか１項に記載の化合物の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００９−５２５２５９（Ｐ２００９−５２５２５９Ａ）
【公表日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５３５５０（Ｐ２００７−５５３５５０）
【出願日】平成１８年２月３日（２００６．２．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０００９９８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８２０８８
【国際公開日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【出願人】（３９７００９９３４）グラクソ グループ リミテッド (832)
【氏名又は名称原語表記】ＧＬＡＸＯ ＧＲＯＵＰ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｈｏｕｓｅ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｖｅｎｕｅ Ｇｒｅｅｎｆｏｒｄ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ ＵＢ６ ０ＮＮ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月３日（２００６．２．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０００９９８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８２０８８
【国際公開日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【出願人】（３９７００９９３４）グラクソ グループ リミテッド (832)
【氏名又は名称原語表記】ＧＬＡＸＯ ＧＲＯＵＰ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｈｏｕｓｅ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｖｅｎｕｅ Ｇｒｅｅｎｆｏｒｄ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ ＵＢ６ ０ＮＮ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ
【Ｆターム（参考）】
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