遺伝子発現をノックダウンするため、そして固形臓器および細胞の移植を改善するためにｓｉＲＮＡを使用する組成物および方法
本発明は、移植の成功率を向上するための、移植された臓器もしくは組織の細胞において発現される種々の遺伝子、および／または、宿主において発現される遺伝子を標的とするためにｓｉＲＮＡを用いる、組成物および方法を記載する。本発明は、レシピエントに移植される臓器の細胞中に存在する免疫調節遺伝子または免疫エフェクター遺伝子を標的とする、ターゲティングポリヌクレオチドを提供する。本発明のターゲティングポリヌクレオチドは、例えば、Ｃ３、ＩＣＡＭ１、ＶＣＡＭ−１、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ−ＩＩ、ＭＨＣ−Ｉ、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４またはＰＶ−Ｂ１９の遺伝子中の配列を標的とし得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国仮出願第６０／７４１，１５７号（この出願の全開示は、本明細書中に参考として援用される）の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ｓｉＲＮＡ媒介性の遺伝子発現のダウンレギュレーションを用いた、固形臓器または組織の移植における、同種移植片拒絶反応または異種移植片拒絶反応、および虚血／再潅流傷害を防止するための組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
固形臓器移植は、末期の臓器不全の処置のための唯一の有効な治療である（非特許文献１、非特許文献２）。世界中の移植プログラムはますます首尾よくなってきており、そして、このような手術は、ますます慣用的になりつつある（非特許文献３、非特許文献４）。１年の生存率という印象的な結果にもかかわらず、臓器移植は、依然として、大きな問題に直面している。免疫系が、移植された臓器の長期間の生存に対して最も大きな障壁を呈する。免疫応答を溝（ｂａｙ）に維持するための強力な免疫抑制剤を用いた一生の処置なしでは、臓器移植片は、常に拒絶反応を受ける。しかし、現在の抗拒絶反応薬は、全身の免疫を非選択的に低下させ、そして、長期にわたる日和見感染および腫瘍発生の危険を増加させる。したがって、代替的な戦略が求められている。
【０００４】
過去１０年間にわたる分子生物学的技術の進歩は、免疫応答および虚血／再潅流傷害の両方を誘発するために必要とされるシグナルの我々の理解を向上させた。これらの新規シグナルを標的とするように設計された薬剤は、最終的には、移植された臓器の長期にわたる、薬物なしでの受容を可能にするという望みを提供する。
【０００５】
移植免疫学は、同種移植片または異種移植片がドナーから摘出され、次いで、レシピエントに移植された後に生じる、包括的な事象の連続を指す。組織は、移植片および移植部位の両方において損傷を与えられる。直ちに、生化学カスケードの活性化として、炎症性反応が起こる。抗原が認識されると、一連の特異的および非特異的な細胞の応答が続いて起こる。最終的には、損傷は、組織の修復および強化により制御される；損傷が病的でない場合、移植片は生き延びる。
【０００６】
組織損傷の抗原非依存性の原因（すなわち、虚血、低体温、再潅流傷害）は、移植片が採取されるときの、機械的な外傷ならびに血液供給の崩壊の結果である。
【０００７】
対照的に、組織損傷の抗原依存性の原因は、免疫媒介性の損傷を伴う。マクロファージは、サイトカイン（例えば、腫瘍壊死因子、インターロイキン−１）を放出し、これは、炎症性の内皮応答を刺激することによって、炎症の強度を強める；これらの内皮の変化は、多数のＴ細胞を移植部位へと補充するのに役立つ。損傷を受けた組織は、いくつかの生化学カスケードを引き起こす炎症促進性メディエーター（例えば、ハーゲマン因子［第ＸＩＩ因子］）を放出する。血液凝固カスケードは、フィブリンといくつかの関連の線維素ペプチドを誘導し、そして、局所的な血管浸透性を促進し、好中球およびマクロファージを引き付ける。キニンカスケードは主に、ブラジキニンを生成し、血管拡張、平滑筋収縮を促進し、血管浸透性を増大させる。
【０００８】
抗体−抗原複合体（すなわち、免疫複合体）の形成は、補体系の古典的な経路を活性化する。Ｃ１ｑは、古典的な経路を介して免疫複合体内の抗体上にドッキングすると、活性化プロセスを引き起こし、一方で、補体因子Ｃ３は、代替的な経路の活性化のためのアクセプターとして、損傷を受けた細胞表面を認識し得る。活性化された補体は、膜攻撃複合体（例えば、Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９）および細胞結合リガンド（例えば、Ｃ４ｂおよびＣ３ｂ）の堆積により損傷を引き起こし、補体レセプターを有する白血球を活性化する。さらに、生物活性アナフィラトキシンＣ５ａおよびＣ３ａの生成は、炎症性細胞の流入および活性化を引き起こす。これらの化学走性誘引物質はまた、肥満細胞の脱顆粒を開始し、いくつかのメディエーターを放出する。ヒスタミンおよび５−ヒドロキシトリプタミンは、血管浸透性を増大させる。プロスタグランジンＥ２は、血管拡張および血管浸透性を促進する。ロイコトリエンＢ４およびＤ２は、白血球の蓄積および血管浸透性を促進する。補体芽活性化される別の手段は、組織の虚血および再潅流によるものであり、リン脂質およびミトコンドリアのタンパク質を露出する。これらの副産物は、Ｃ１ｑ、または、マンノース結合レクチン、または、因子Ｃ３ｂを結合することによって、直接補体を活性化する。
【０００９】
現在、同種移植片の首尾良い移植は、免疫抑制薬の全身性の使用を必要とする。これらは、その毒性と、癌および感染症に対する感受性の増加とに起因して、深刻な病的状態を引き起こし得る。移植部位に限定された免疫抑制性分子の局所的な生成は、従来の、全身性の免疫抑制療法の必要性を減少し、したがって、引き起こされる副作用が少なくなる。これは、１型糖尿病（すぐに生命に危険があるわけではないが、膵島の同種移植片が治癒を達成し得る）のような疾患において特に顕著である。抗ＣＤ４戦略は、抗体の組み合わせが使用される場合、なおより効果的であり得る；同様の戦略もまた、異種移植片の拒絶反応を防止し得る。宿主の免疫応答を抑制することもまた、癌の危険を増大させる。移植片拒絶および対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を回避する目的で免疫応答を抑制する試みは、感染因子（例えば、細菌、ウイルス、真菌など）と闘う身体の能力を減弱させる。
【００１０】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）化合物、中程度の低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）は、同じ処置において、複数の疾患の原因となる遺伝子を標的とするために、複数のｓｉＲＮＡ二重鎖の組み合わせを使用するための独特の戦略を提供する。というのも、全てのｓｉＲＮＡ二重鎖は、同じ起源および同じ製造プロセスを用いる場合、化学的に均質であるからである（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。このようなｓｉＲＮＡインヒビターは、毒性および安全性の問題が最小でありつつ、かなり良好な臨床上の有効性を有するものと期待される。遺伝的修飾は、臓器移植のための有望な治療戦略である。特定の遺伝子発現をサイレンシングするためのＲＮＡ干渉の魅力的な技術（非特許文献９、非特許文献１０）に基づいて、ｓｉＲＮＡ治療は、移植を受けたレシピエントにおける虚血／再潅流傷害ならびに臓器の拒絶反応の防止における、魅力的かつ強力なアプローチを体現し得る。
【非特許文献１】Ｓｕｂｔｉｒｅｌｕ ＭＭ ｅｔ ａｌ．Ａｃｕｔｅ ｒｅｎａｌ ｆａｉｌｕｒｅ ｉｎ ａ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｆｏｒ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ Ｂ１９ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｕｒｅ ｒｅｄ ｃｅｌｌ ａｐｌａｓｉａ．Ｐｅｄｉａｔｒ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２００５ Ｄｅｃ；９（６）：８０１−４．
【非特許文献２】Ｓａｍｐｉｅｔｒｏ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｈｅｐａｔｉｃ ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｐｏｏｌ ｕｓｉｎｇ ｓｐｌｉｔ ｌｉｖｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ａｃｔａ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｂｅｌｇ．２００５ Ｊｕｌ−Ｓｅｐ；６８（３）：３６９−７５．
【非特許文献３】Ｃｈａｌｅｒｍｓｋｕｌｒａｔ Ｗ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｄｏｎｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉ−ＣＤ１５４ ｔｈｅｒａｐｙ ａｃｈｉｅｖｅｓ ａｉｒｗａｙ ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．Ｔｈｏｒａｘ．２００５ Ｏｃｔ ２７；［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］．
【非特許文献４】Ｏｌｉｖｅｉｒａ ＪＧ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｆｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｙ ａｃｕｔｅ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｓ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ ｍｏｆｅｔｉｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｔｒａｎｓｐｌ Ｉｎｔ．２００５ Ｎｏｖ；１８（１１）：１２８６−９１．
【非特許文献５】ＭｃＭａｎｕｓ，Ｍ．Ｔ．ａｎｄ Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（２００２）Ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｍａｍｍａｌｓ ｂｙ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．３（１０）：７３７−７４７．
【非特許文献６】Ｌｕ，Ｐ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００３）ｓｉＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｔａｒｇｅｔ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．５（３）：２２５−２３４．
【非特許文献７】Ｌｕ，Ｐ．Ｙ．ｅｔ ａｌ（２００２）Ｔｕｍｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｂｙ ＲＮＡｉ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ＶＥＧＦ ａｎｄ ＶＥＧＦＲ２ ｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．１０（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ））Ｓ４．
【非特許文献８】Ｋｉｍ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｏｃｕｌａｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｓｉＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｐａｔｈｗａｙ ｇｅｎｅｓ；ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｈｅｒｐｅｔｉｃ ｓｔｒｏｍａｌ ｋｅｒａｔｉｔｉｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６５（６）：２１７７−８５．
【非特許文献９】Ｌｕ，Ｐ．Ｙ．ａｎｄ Ｍ．Ｗｏｏｄｌｅ（２００５）Ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ ｓｉＲＮＡ ｉｎ ｖｉｖｏ Ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｃａｎ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｉｎ ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．Ｐ ３０３−３１７．
【非特許文献１０】Ｌｕ，Ｐ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈ ｓｉＲＮＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｏｒ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１１（３），１０４−１３．
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、レシピエントに移植される臓器の細胞中に存在する免疫調節遺伝子または免疫エフェクター遺伝子を標的とする、ターゲティングポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドのための標的は、表１〜１５に列挙される免疫調節遺伝子および免疫エフェクター遺伝子の配列から誘導され得る（以下を参照のこと）。例えば、ターゲティングポリヌクレオチドは、Ｃ３、ＩＣＡＭ１、ＶＣＡＭ−１、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ−ＩＩ、ＭＨＣ−Ｉ、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４またはＰＶ−Ｂ１９の遺伝子中の配列を標的とし得る。ターゲティングポリヌクレオチドは、表１〜１５に列挙される配列の１以上を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖を含み得る。ターゲティングポリヌクレオチドは、一本鎖の直鎖状ポリヌクレオチド、二本鎖の直鎖状ポリヌクレオチド、またはヘアピンポリヌクレオチドであり得る。
【００１２】
本発明はまた、臓器をレシピエントに移植する前に、臓器と本発明のターゲティングポリヌクレオチドを含有する組成物とを接触させることによって、移植された臓器の拒絶反応を抑制する方法を提供する。この方法は、移植前の保管の間に、臓器または臓器の細胞における標的の免疫調節遺伝子または免疫エフェクター遺伝子の発現をダウンレギュレートまたは阻害するのに有効であり得る。一実施形態において、臓器は、本発明のターゲティングポリヌクレオチドを含有する組成物を灌流させられる。別の実施形態において、臓器は、本発明のターゲティングポリヌクレオチドを含有する組成物中に漬けられるか、または浸される。組成物はまた、臓器のレシピエントに投与され得る。本発明のいくつかの実施形態において、臓器は、レシピエント自身の臓器であり得る。上記臓器のレシピエントはヒトであり得る。本発明のターゲティングポリヌクレオチドを含有する組成物に接触される臓器、組織および細胞としては、腎臓、肝臓、肺、膵臓、心臓、小腸、角膜、上皮細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、および移植時に臓器中に存在するパッセンジャー白血球が挙げられる。
【００１３】
本発明のターゲティングポリヌクレオチドを含有する組成物はまた、キャリアを含有し得、このキャリアとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：潅流液、Ｈｙｐｅｒ Ｏｓｍｏｌａｒ Ｃｉｔｒａｔｅ溶液、ＰｏｌｙＴｒａｎポリマー溶液、ＴａｒｇｅＴｒａｎナノ粒子溶液、またはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ溶液。組成物はまた、低分子薬物、モノクローナル抗体薬物、および他の免疫調節因子を含有し得る。いくつかの実施形態において、組成物は、複数の本発明のターゲティングポリヌクレオチドを含み得る。組成物は、複数の遺伝子配列を標的とし得る複数の本発明のターゲティングポリヌクレオチドを含み得る。一実施形態において、ターゲティングポリヌクレオチドは、Ｃ３遺伝子配列、ＴＮＦ−α遺伝子配列およびＩＬ−８遺伝子配列を標的とするカクテルである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本明細書において使用される場合、「オリゴヌクレオチド」およびこれに基づく類似用語は、直前の段落に記載されるように、天然に存在するヌクレオチド、ならびに、合成または修飾ヌクレオチドから構成されるポリマーに関する。オリゴヌクレオチドは、１０以上のヌクレオチド長、または１５以上のヌクレオチド長、または１６以上のヌクレオチド長、または１７以上のヌクレオチド長、または１８以上のヌクレオチド長、または１９以上のヌクレオチド長、または２０以上のヌクレオチド長、または２１以上のヌクレオチド長、または２２以上のヌクレオチド長、または２３以上のヌクレオチド長、または２４以上のヌクレオチド長、または２５以上のヌクレオチド長、または２６以上のヌクレオチド長、または２７以上のヌクレオチド長、または２８以上のヌクレオチド長、または２９以上のヌクレオチド長、または３０以上のヌクレオチド長、または３５以上のヌクレオチド長、または４０以上のヌクレオチド長、または４５以上のヌクレオチド長、または、約５０までのヌクレオチド長であり得る。ｓｉＲＮＡであるオリゴヌクレオチドは、１５ヌクレオチドと３０ヌクレオチドとの間の任意の数のヌクレオチドを有し得る。多くの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、２１ヌクレオチドと２５ヌクレオチドとの間の任意の数のヌクレオチドを有し得る。
【００１５】
多くの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、２つの平滑末端を有しても、２つの突出末端を有しても、１つの平滑末端と１つの突出末端を有しても、１つのオーバーハングを有する末端を有してもよい。このオーバーハングヌクレオチドは、１〜４以上の範囲であり得る。
【００１６】
（ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ））
本発明によれば、免疫調節遺伝子標的または免疫エフェクター遺伝子標的の遺伝子発現は、ＲＮＡ干渉により減弱される。免疫調節遺伝子または免疫エフェクター遺伝子の発現生成物は、この免疫調節遺伝子または免疫エフェクター遺伝子の標的配列の少なくとも一セグメントに対して相補的である、特異的な二本鎖ｓｉＲＮＡヌクレオチド配列により標的とされ、この二本鎖ｓｉＲＮＡヌクレオチド配列は、１５ヌクレオチドと３０ヌクレオチドとの間の任意に数のヌクレオチドを含むか、または、多くの場合、２１ヌクレオチドと２５ヌクレオチドとの間の任意の数のヌクレオチドまたはそれ以上の数のヌクレオチドを含む。標的は、コード配列中の５’非翻訳（ＵＴ）領域、または、３’ＵＴ領域中に存在し得る。例えば、ＰＣＴ出願公開ＷＯ００／４４８９５、ＷＯ９９／３２６１９、ＷＯ０１／７５１６４、ＷＯ０１／９２５１３、ＷＯ０１／２９０５８、ＷＯ０１／８９３０４、ＷＯ０２／１６６２０およびＷＯ０２／２９８５８（この各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【００１７】
本発明の方法によれば、免疫調節遺伝子または免疫エフェクター遺伝子の発現、および、これによる、有害な免疫学的反応に起因した虚血／再潅流傷害または臓器移植の拒絶反応は、ｓｉＲＮＡを用いて抑制される。本発明によるターゲティングポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。このようなｓｉＲＮＡはまた、意図される配列と同一であるかまたはこれに類似するヌクレオチド配列の化学合成によって調製され得る。例えば、Ｔｕｓｃｈｌ、Ｚａｍｏｒｅ、Ｌｅｈｍａｎｎ、ＢａｒｔｅｌおよびＳｈａｒｐ（１９９９）、Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．１３：３１９１−３１９７（その全体が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。あるいは、ターゲティングｓｉＲＮＡは、例えば、細胞を含まない系（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ抽出物であるが、これに限定されない）において免疫調節リボポリヌクレオチド配列または免疫エフェクターリボポリヌクレオチド配列を消化することによって、または、組換え二本鎖ｃＲＮＡの転写によって、ターゲティングポリヌクレオチド配列を用いて得られ得る。
【００１８】
効率的なサイレンシングは、一般に、同じ長さの１６〜３０ｎｔのセンス鎖および１６〜３０ｎｔのアンチセンス鎖から構成されるｓｉＲＮＡ二重鎖を用いて観察される。多くの実施形態において、ｓｉＲＮＡ対二重鎖の各鎖は、さらに、３’末端に２ｎｔのオーバーハングを有する。この２ｎｔの３’オーバーハングの配列は、ｓｉＲＮＡの標的認識特異性に対して、わずかではあるが、さらなる助力となる。一実施形態において、３’オーバーハング内のヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。代替的な実施形態において、３’オーバーハング内のヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドである。３’デオキシリボヌクレオチドの使用は、細胞内安定性の増大をもたらす。
【００１９】
本発明の組換え発現ベクターは、細胞内に導入されると、プロセシングを受けて、臓器内の免疫調節遺伝子または免疫エフェクター遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ配列を含むＲＮＡを提供する。このようなベクターは、発現を可能にする様式で、免疫調節遺伝子または免疫エフェクター遺伝子に隣接する、作動可能に連結された調節配列を含む発現ベクター内にクローニングされたＤＮＡ分子であり得る。このベクターから、標的ＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子が、第一のプロモーター（例えば、クローニングされたＤＮＡの３’側にあるプロモーター配列）により転写され、そして、ＲＮＡ標的に対してセンス鎖であるＲＮＡ分子が、第二のプロモーター（例えば、クローニングされたＤＮＡの５’側にあるプロモーター配列）により転写される。これらのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、次いで、インビボでハイブリダイズして、免疫調節遺伝子または免疫エフェクター遺伝子の配列を標的とするｓｉＲＮＡ構築物を生成する。あるいは、ｓｉＲＮＡ構築物のセンス鎖およびアンチセンス鎖を作製するために、２つの構築物が利用され得る。さらに、クローニングされたＤＮＡは、二次構造を有する転写体をコードし得、ここで、単一の転写体が、標的遺伝子からのセンス配列および相補的なアンチセンス配列の両方を有する。この実施形態の一例において、ヘアピンＲＮＡｉ生成物は、標的遺伝子の全体または一部分に類似する。別の例において、ヘアピンＲＮＡｉ生成物はｓｉＲＮＡである。免疫調節遺伝子または免疫エフェクター遺伝子の配列に隣接する調節配列は、同一であっても異なっていてもよく、その結果、これらの発現は、独立して調節されても、時間的もしくは空間的な様式で調節されてもよい。
【００２０】
特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、免疫調節遺伝子または免疫エフェクター遺伝子の配列を、例えば、低分子核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）Ｕ６またはヒトＲＮａｓｅ Ｐ ＲＮＡ Ｈ１に由来するＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩ転写ユニットを含むベクター内にクローニングすることによって、細胞内で転写される。ベクターシステムの一例は、ＧｅｎｅＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒＴＭＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅキット（Ｉｍｇｅｎｅｘ Ｃｏｒｐ．）である。Ｕ６プロモーターおよびＨ１プロモーターは、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターのＩＩＩ型クラスのメンバーである。Ｕ６様プロモーターの＋１ヌクレオチドは、常にグアノシンであり、一方で、Ｈ１プロモーターの＋１ヌクレオチドはアデノシンである。これらのプロモーターについての終止シグナルは、５つの連続するチミジンにより規定される。転写体は、代表的に、二番目のウリジンの後に切断される。この位置での切断は、発現されるｓｉＲＮＡにおける３’ＵＵオーバーハングを生じ、これは、合成ｓｉＲＮＡの３’オーバーハングに類似する。４００ヌクレオチド長未満の任意の配列が、これらのプロモーターにより転写され得、それゆえ、これらは、理論上、例えば、約５０ヌクレオチドＲＮＡのステムループ転写体における、およそ２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡの発現に適している。ＲＮＡｉの特徴およびｓｉＲＮＡの効率に影響を及ぼす要因の特徴が研究されている（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ、ＬｅｎｄｅｃｋｅｌおよびＴｕｓｃｈｌ（２００１）．Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．１５：１８８−２００を参照のこと）。
【００２１】
ターゲティングポリヌクレオチドは、一般に、３００ヌクレオチド長以下であり、そして、移植臓器の細胞中、または、移植臓器に付随するパッセンジャー細胞（一度ドナーから摘出され、そして、移植臓器がレシピエントの被験体内に導入されたときに、免疫調節性または免疫エフェクター性の応答に関与する）中に存在する遺伝子配列を標的とする第一のヌクレオチド配列を含む。ポリヌクレオチドにおいて、あらゆるＴ（チミジン）またはあらゆるＵ（ウリジン）は、必要に応じてもう一方で置換され得る。さらに、ポリヌクレオチドにおいて、第一のヌクレオチド配列は、ａ）その長さが１５ヌクレオチド〜３０ヌクレオチドまたはそれ以上の任意の数である配列、またはｂ）ａ）に与えられる配列の相補鎖から構成される。このようなポリヌクレオチドは、本明細補において、直鎖状ポリヌクレオチドと命名され得る。一本鎖ポリヌクレオチドは、しばしば、二本鎖ｓｉＲＮＡのうちの一方の鎖である。
【００２２】
関連する局面において、上記ポリヌクレオチドはさらに、ループ配列により第一のヌクレオチド配列から間隔を空けられた第二のヌクレオチド配列を含み、その結果、第二のヌクレオチド配列は、
ａ）第一のヌクレオチド配列と実質的に同じ長さを有し、そして
ｂ）第一のヌクレオチド配列に対し実質的に相補的である。
【００２３】
この、ヘアピンポリヌクレオチドと命名された後者の構造において、第一のヌクレオチド配列は、第二のヌクレオチド配列とハイブリダイズしてヘアピンを形成し、このヘアピンの相補配列が、ループ配列により連結される。ヘアピンポリヌクレオチドは、細胞内で消化されて、二本鎖ｓｉＲＮＡを形成する。
【００２４】
多くの実施形態において、直鎖状ポリヌクレオチドの標的およびヘアピンポリヌクレオチドの標的は、移植臓器の細胞中、または、移植臓器に付随するパッセンジャー細胞中に存在する遺伝子配列であり、そして、第一のヌクレオチド配列は、以下のいずれかである：
ａ）本明細書に添付される表１〜１５に与えられる配列から選択される配列を標的とするターゲティング配列；
ｂ）項目ａ）に与えられる配列よりも長く、表１〜１５から選択される配列を標的とするターゲティング配列；
ｃ）少なくとも１５ヌクレオチド長であり、最大でも選択される配列より１塩基短い、連続塩基配列から構成される、項目ａ）またはｂ）に与えられる配列のフラグメント；
ｄ）ａ）〜ｃ）に与えられる配列と、最大５ヌクレオチド異なるターゲティング配列；または
ｅ）ａ）〜ｄ）に与えられる任意の配列の相補体。
【００２５】
直鎖状ポリヌクレオチドまたはヘアピンポリヌクレオチドの種々の実施形態において、第一のヌクレオチド配列の長さは、２１ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドの任意の数である。
【００２６】
多くの実施形態において、直鎖状ポリヌクレオチドまたはヘアピンポリヌクレオチドは、表１〜１５から選択される配列を標的とするターゲティング配列から構成され、そして、必要に応じて、その選択される配列の３’に結合したジヌクレオチドのオーバーハングを含む。直鎖状ポリヌクレオチドまたはヘアピンポリヌクレオチドのなおさらなる実施形態において、第一のヌクレオチド配列の３’末端にあるジヌクレオチド配列は、ＴＴ、ＴＵ、ＵＴまたはＵＵであり、そして、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、または、その両方を含む。種々のさらなる実施形態において、直鎖状ポリヌクレオチドまたはヘアピンポリヌクレオチドは、ＤＮＡであっても、ＲＮＡであっても、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの両方から構成されてもよい。
【００２７】
特定のヒト遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡオリゴの例示的な配列を、以下の表１ａ〜１５ｂに列挙する。これらの表は、列挙される全遺伝子について、オーバーハングをもつ２１マーと、平滑末端をもつ２５マーとの両方を含む。移植ドナーである他の哺乳動物の遺伝子に対して特異的である可能性のあるｓｉＲＮＡオリゴの配列は、対応するヒト遺伝子を参照して、だが、これらの動物の遺伝子配列を心に留めて設計されるべきである。
【００２８】
表１：
Ｃ３遺伝子におけるｓｉＲＮＡの標的配列：
Ｃ３遺伝子：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ補体成分３（Ｃ３）、
アクセッション番号：ＮＭ＿００００６４、遺伝子ＩＤ：４５５７３８４、
以下の遺伝子配列を標的とする２５のｓｉＲＮＡ候補を選択した：
【００２９】
【表１ａ】
【００３０】
【表１ｂ】
表２：
ＩＣＡＭ１遺伝子におけるｓｉＲＮＡの標的配列：
ＩＣＡＭ１遺伝子：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ細胞間接着分子１（ＣＤ５４）、ヒトライノウイルスレセプター（ＩＣＡＭ１）、
アクセッション番号：ＮＭ＿０００２０１、遺伝子ＩＤ：４５５７８７７、
以下の遺伝子配列を標的とする１９のｓｉＲＮＡ候補を選択した：
【００３１】
【表２ａ】
【００３２】
【表２ｂ】
表３：
ＶＣＡＭ１遺伝子におけるｓｉＲＮＡの標的配列：
ＶＣＡＭ１遺伝子：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ１）、転写改変体２、ｍＲＮＡ。
アクセッション番号 ＮＭ＿０８０６８２。ＧＩ：１８２０１９０８；転写改変体１、ｍＲＮＡ。アクセッション番号 ＮＭ＿００１０７８、ＧＩ：１８２０１９０７；ヒト血管細胞接着分子１ ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ
ｇｉ｜１７９８８５｜ｇｂ｜Ｍ３０２５７．１｜ＨＵＭＣＡＭ１Ｖ［１７９８８５］、ヒト血管細胞接着分子１ ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ、
ｇｉ｜３４０１９３｜ｇｂ｜Ｍ６０３３５．１｜
ＨＵＭＶＣＡＭ１［３４０１９３］、ヒト血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ１）遺伝子、完全ＣＤＳ、
ｇｉ｜３４０１９５｜ｇｂ｜Ｍ７３２５５．１｜
ＨＵＭＶＣＡＭ１Ａ［３４０１９５］、血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）についてのヒトｍＲＮＡ、
ｇｉ｜３７６４８｜ｅｍｂ｜Ｘ５３０５１．１｜ＨＳＶＣＡＭ１［３７６４８］
以下の遺伝子配列を標的とする２５のｓｉＲＮＡ候補を選択した：
【００３３】
【表３ａ】
【００３４】
【表３ｂ】
表４：
ヒトＩＦＮ−γを標的とするｓｉＲＮＡ配列（アクセッション番号ＮＭ＿０００６１９）：
【００３５】
【表４ａ】
【００３６】
【表４ｂ】
表５：
ヒトＩＬ−１を標的とするｓｉＲＮＡ配列（アクセッション番号：ＮＭ＿０３３２９２）：
【００３７】
【表５ａ】
【００３８】
【表５ｂ】
表６：
ヒトＩＬ−６を標的とするｓｉＲＮＡ配列（アクセッション番号ＮＭ＿０００６００）：
【００３９】
【表６ａ】
【００４０】
【表６ｂ】
表７：
ヒトＩＬ−８を標的とするｓｉＲＮＡ配列（アクセッション番号：ＮＭ＿０００５８４）：
【００４１】
【表７ａ】
【００４２】
【表７ｂ】
表８：
ヒトＴＮＦ−αを標的とするｓｉＲＮＡ配列（アクセッション番号：ＮＭ＿００４８６２）：
【００４３】
【表８ａ】
【００４４】
【表８ｂ】
表９：
ヒトＣＤ８０を標的とするｓｉＲＮＡ配列（アクセッション番号：ＮＭ＿００５１９１）：
【００４５】
【表９ａ】
【００４６】
【表９ｂ】
表１０：
ヒトＣＤ８６を標的とするｓｉＲＮＡ配列（アクセッション番号：ＮＭ＿１７５８６２）：
【００４７】
【表１０ａ】
【００４８】
【表１０ｂ】
表１１：
ヒトＭＨＣ−ＩＩを標的とするｓｉＲＮＡ配列（アクセッション番号：ＮＭ＿００２１１９）：
【００４９】
【表１１ａ】
【００５０】
【表１１ｂ】
表１２：
ヒトＭＨＣ−Ｉを標的とするｓｉＲＮＡ配列（アクセッション番号：ＮＭ＿００５５１６）
【００５１】
【表１２ａ】
【００５２】
【表１２ｂ】
表１３：
ヒトＣＤ２８を標的とするｓｉＲＮＡ配列（アクセッション番号：ＮＭ＿００６１３９）：
【００５３】
【表１３ａ】
【００５４】
【表１３ｂ】
表１４：
ヒトＣＴＬＡ４を標的とするｓｉＲＮＡ配列（アクセッション番号：ＡＦ４１４１２０）：
【００５５】
【表１４ａ】
【００５６】
【表１４ｂ】
表１５：
ヒトパルボウイルスＢ１９を標的とするｓｉＲＮＡ配列（アクセッション番号：ＡＹ９０３４３７）：
【００５７】
【表１５ａ】
【００５８】
【表１５ｂ】
。
【００５９】
一実施形態において、平滑末端をもつ２５塩基対のｓｉＲＮＡ二重鎖は、インビトロおよびインビボの両方において、両方の３’末端にオーバーハングをもつ１９塩基対のｓｉＲＮＡ二重鎖よりも強力な遺伝子ノックダウン効率を示す。
【００６０】
さらなる局面において、本発明は、上記の第一の直鎖状ポリヌクレオチド鎖および第二のポリヌクレオチド鎖を含む二本鎖ポリヌクレオチドを提供し、第二のポリヌクレオチド鎖は、第一の鎖の少なくとも第一のヌクレオチド配列に対して相補的であり、第一のポリヌクレオチド鎖にハイブリダイズして二本鎖ｓｉＲＮＡ組成物を形成する。
【００６１】
（処方物）
種々のキャリアは、ｓｉＲＮＡを含有する処方物または薬学的組成物を調製するのに役立つ。いくつかの実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、例えば、市販の試薬または技術（例えば、ＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅＴＭ試薬、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ ２０００ＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いることによる、リポソーム媒介性のトランスフェクションによって、ならびに、エレクトロポレーションおよび類似の技術によって、培養物中、または、移植を待つ臓器の細胞中に送達される。
【００６２】
ｓｉＲＮＡを含有する薬学的組成物は、ｓｉＲＮＡの安定性を保護するか、ｓｉＲＮＡの寿命を延長するか、ｓｉＲＮＡの機能を助長するか、または、特定の組織／細胞へとｓｉＲＮＡを標的化する、さらなる成分を含む。これらとしては、以下が挙げられる：種々の生分解性ポリマー、カチオン性ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン）、カチオン性コポリペプチド（例えば、ヒスチジン−リジン（ＨＫ）ポリペプチド、例えば、Ｍｉｘｓｏｎらに対するＰＣＴ公開ＷＯ ０１／４７４９６、Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘに対するＷＯ ０２／０９６９４１およびＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙに対するＷＯ ９９／４２０９１を参照のこと；ＰＥＧ化カチオン性ポリペプチドおよびリガンドを組み込んだポリマーなど）、正電荷ポリペプチド、ＰｏｌｙＴｒａｎ溶液（ＨＫポリマーおよび多糖類（例えば、天然の多糖類、スクレログルカン（ｓｃｌｅｒｏｇｌｕｃａｎ）としても知られる）の生理食塩水溶液または水溶液）、ＴａｒｇｅＴｒａｎ（ターゲティングリガンドを含む結合体化されたＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＥＩポリマーから構成されるナノ粒子の生理食塩水または水性懸濁液）、界面活性剤（Ｉｎｆａｓｕｒｆ；Ｆｏｒｅｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．；ＯＮＹ Ｉｎｃ．）およびカチオン性ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン）。Ｉｎｆａｓｕｒｆ（登録商標）（カルファクタント）は、気管内点滴注入において使用するための、仔ウシの肺から単離した天然の肺サーファクタントである；これは、リン脂質、中性脂質および疎水性サーファクタントが会合したプロテインＢおよびプロテインＣを含む。
【００６３】
このポリマーは、単一の寸法または複数の寸法のいずれかであり得、そしてまた、２０ミクロン未満、２０ミクロンと１００ミクロンとの間、または１００ミクロンを上回る直系を有するマイクロ粒子またはナノ粒子であり得る。上記ポリマーは、特定の組織または細胞のレセプターまたは分子に特異的なリガンド分子を有し得、したがって、ｓｉＲＮＡの標的化された送達のために使用され得る。ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドはまた、カチオン性リポソームベースのキャリア（例えば、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＡＰ／コレステロール（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．））および他の型の脂質水溶液によって送達される。さらに、低濃度（５〜１０％）のグルコース水溶液およびＩｎｆａｓｕｒｆは、ｓｉＲＮＡの気道送達のための有効なキャリアである（Ｌｉ Ｂ．Ｊ．ら、２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１１，９４４−９５１）。
【００６４】
さらに、キャリアとしては、Ｈｙｐｅｒ Ｏｓｍｏｌａｒ Ｃｉｔｒａｔｅ溶液（５６０ｍＯｓｍ／ｋｇの塩酸メグルミン溶液、５６０ｍＯｓｍ／ｋｇのメグルミンイオキサグレート、および６００ｍＯｓｍ／ｋｇのナトリウムイオキサグレートなど）が挙げられ得る。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ溶液は、心臓、腎臓、肺および肝臓の保存を増強および延長する能力を有する。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ溶液は、膵島を単離する予定のヒトドナー膵臓の冷蔵保存および運搬に広く受け入れられる。
【００６５】
組成物はさらに、ポリマー性キャリアを含み得る。ポリマー性キャリアは、ＲＮＡ分子に結合するカチオン性ポリマーを含み得る。カチオン性ポリマーは、例えば、ヒスチジン残基およびリジン残基を含むアミノ酸コポリマーであり得る。ポリマーは、分枝ポリマーを含み得る。
【００６６】
組成物は、標的化された合成ベクターを含み得る。合成ベクターは、カチオン性ポリマー、親水性ポリマーおよびターゲティングリガンドを含み得る。ポリマーはポリエチレンイミンを含み得、親水性ポリマーはポリエチレングリコールまたはポリアセタールを含み得、そして、ターゲティングリガンドは、ＲＧＤ配列を含むペプチドを含み得る。
【００６７】
ｓｉＲＮＡ／キャリアは、非特異的な様式の保存溶液もしくは灌流媒体のいずれかで、または、標的化された送達系の全身循環により、処方され得る。
【００６８】
（固形腫瘍および細胞の移植の改善）
本発明は、ＲＮＡ干渉（ｓｉＲＮＡ）を導入することで、標的遺伝子の発現をサイレンシングまたはダウンレギュレートすることによって、固形臓器移植における同種移植片拒絶反応および虚血／再潅流傷害を防止するための方法を提供する。本発明の方法において、ｓｉＲＮＡは、臓器保存溶液の形態で、すなわち、ドナーからの摘出後、かつ、レシピエントへと運搬される間に、移植が意図される臓器に対して適用される。移植される臓器、組織および／または細胞のドナーまたはレシピエントは、哺乳動物であり得、これには、ヒト、非ヒト哺乳動物、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ブタ、イヌ、ウシおよびウマが含まれるがこれらに限定されない。移植が予定される臓器は、１つのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド、または、複数のｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドをカクテルとして含む臓器保存溶液によって維持される。ｓｉＲＮＡは、ドナーの臓器および細胞に容易にかつ選択的に到達し得、有害である可能性のある副作用の減少を容易にする。
【００６９】
現在の実務において、ドナーの臓器は、細片を洗浄して除き、そして、運搬の間の損傷を少なくするために、静止状態または再循環系において、低体温条件（ヒトについては、３７℃未満（例えば、４℃））または正常体温条件（ヒトについては、３７℃）において、特別に処方された溶液（臓器保存溶液）において、洗浄（ｆｌｕｓｈｉｎｇ）および保存に供される。本発明の方法は、臓器保存の間のドナーの臓器および細胞のｓｉＲＮＡトランスフェクションを包含する。これは、魅力的な方法である。というのも、移植される予定の臓器に対してエキソビボで適用されたｓｉＲＮＡは、臓器のレシピエントに全身投与されず、そして、この処置は、炎症部位に対して特異的に送達され得るからである。この方法は、全身性の有害な作用なしに、移植片の不全を防止するために有用であり得る。
【００７０】
ｓｉＲＮＡトランスフェクション処方物は、固形のドナー臓器をインサイチュおよび／またはエキソビボで洗浄するため、そして、静止状態または機械式潅流による臓器保存のために使用される。処方された溶液は、固形臓器内への局所注射のため、そして、ｓｉＲＮＡ処方物中に固形臓器を浸すことによってこの固形臓器全体を漬けるための両方に有用である。
【００７１】
ｓｉＲＮＡ剤は、移植された臓器（組織）および細胞の処置のためのトランスフェクションキャリアを用いてか、または用いずに、単一または複数の遺伝子を標的とする、単一または複数のいずれかの二重鎖として使用され得る。トランスフェクション剤としては、合成ポリマー、リポソームおよび糖類などが挙げられるがこれらに限定されない。ｓｉＲＮＡ剤はまた、低分子インヒビターおよびモノクローナル抗体インヒビター、免疫も銃れーターおよび他の型のオリゴヌクレオチドのような他の薬剤と共に使用され得る。移植用の臓器にｓｉＲＮＡ／キャリア溶液を注射することおよび移植用の臓器をｓｉＲＮＡ／キャリア溶液に浸すことは、組織の損傷と宿主の拒絶反応を最小にし、それ故、臓器の機能および生存の観点での移植される臓器の成功と、同時の病的状態の最小化を高める。
【００７２】
また、本発明において、種々の臓器および細胞が、移植プロセスの間に、ｓｉＲＮＡ／キャリア処方物により処置され得る。あらゆる固形臓器移植は、本質的に、ドナーの外科的準備を必要とし、これは、身体、または、移植に使用される特定の臓器の洗浄性の灌流を含み得る。灌流は、１種以上の流体で行われ得る。臓器は、レシピエントへの運搬の間の保存のために摘出され、そして、臓器が、レシピエントへと外科的に移植される。本発明の方法において有用な臓器としては、腎臓、肝臓、心臓、膵臓、膵島、小腸、肺、角膜、四肢および皮膚、ならびに、これらの臓器の各々に対応する培養細胞が挙げられるがこれらに限定されない。一つの例である、肝細胞株は、単離された肝細胞の移植のための普遍的なドナーとして開発され始めており、これは、代謝性肝疾患の処置のための正常位での肝移植よりも侵襲性の少ない方法である。ＣＤ２８／Ｂ７またはＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌのような経路を介する同時刺激は、このような移植の成功のための主要な問題である（２）。したがって、ＣＤ２８またはＣＤ４０経路の両方をサイレンシングするためにｓｉＲＮＡ／キャリア処方物を用いることは、移植の成功率を改善するための良好な戦略である。
【００７３】
腎臓移植の失敗についての別の例は、固形臓器移植後のパルボウイルスＢ１９（ＰＶ−Ｂ１９）感染であり、これは、赤芽球ろう（ＰＲＣＡ）を引き起こし得る。免疫抑制された移植レシピエントにおけるＰＶ−Ｂ１９感染は、有意な病的状態を伴う（１）。ＰＶ−Ｂ１９または任意の他のウイルスの感染および複製を阻害するためにｓｉＲＮＡを用いることは、移植の初期段階の間に、ドナーの臓器および移植レシピエントの両方を処置することによって、腎臓移植を改善するための補助治療である。
【００７４】
この局面の別の局面において、本発明は、１以上のｓｉＲＮＡ二重鎖を含有する組成物を提供し、この組成物において、ｓｉＲＮＡは、同種移植片または異種移植片の拒絶反応または虚血／再潅流傷害に関与するいくつかの遺伝子を同時に標的とし得る。複数のｓｉＲＮＡ二重鎖の組み合わせは、同種移植片の拒絶反応または虚血／再潅流傷害の阻害により有効であり得る。
【００７５】
免疫調節プロセスは、本発明の方法を用いたｓｉＲＮＡサイレンシングのための過多の分子標的を提供する：例えば、（１）活性化に関連するリンパ球上の分子；（２）ＭＨＣクラスＩＩのようなリンパ球を刺激する抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の分子および同時刺激性の分子；（３）可溶性分子シグナル（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８のようなサイトカイン）；（４）血管細胞接着分子−１、細胞間接着分子−１のような、リンパ球の血管外遊出およびホーミングに関連する分子；ならびに（５）免疫のエフェクター分子（例えば、補体因子Ｃ３であるがこれに限定されない）。さらなる候補標的遺伝子としては、細胞間接着分子−１、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ、ＩＦＮ−γ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌが挙げられる。
【００７６】
本発明はまた、ｓｉＲＮＡオリゴカクテル（ｓｉＲＮＡ−ＯＣ）を本発明の方法に有用な治療剤、または、癌および炎症の処置のためのより強力な抗血管新生効率を達成するための治療剤として使用するための方法および組成物を提供する。このｓｉＲＮＡオリゴカクテルは、少なくとも３つのｍＲＮＡ標的を標的とする、少なくとも３つの二重鎖を含む。ｓｉＲＮＡオリゴカクテルは、表１〜１５に列挙されるｓｉＲＮＡ配列のいずれかを含み得る。一実施形態において、ｓｉＲＮＡオリゴカクテルは、補体Ｃ３、ＭＨＣ−ＩＩおよびＩＦＮγに対して特異的なｓｉＲＮＡを含む。本発明は、２つの重要な局面に基づく：第一に、ｓｉＲＮＡ二重鎖は、非常に強力な遺伝子発現インヒビターであり、そして、各ｓｉＲＮＡ分子は、同じ化学特性をもつ短い二本鎖ＲＮＡオリゴ（２１〜２３ｎｔ、または２４〜２５ｎｔ、または２６〜２９ｎｔ）から作製される；第二に、同種移植片または異種移植片の拒絶反応および虚血／再潅流傷害は、部分的に、内因性遺伝子の過剰発現に関連する。したがって、複数の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ−ＯＣを用いることは、ｓｉＲＮＡ二重鎖の化学的均一性と、複数の疾患または損傷を引き起こす遺伝子のダウンレギュレーションからの相乗作用とに起因して、有益な治療的アプローチを体現する。本発明は、ｓｉＲＮＡ−ＯＣは、少なくとも３つの遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖の組み合わせであり、種々の割合で、種々の物理的形状であり、そして、同時に同じ経路を介して、または、異なる経路および時間を介して疾患組織へと適用されるものと規定する。
【００７７】
ｓｉＲＮＡにより媒介されるサイレンシングは、１つのこのような遺伝子を標的とする単一のｓｉＲＮＡ、または、同じ遺伝子内のいくつかの標的配列を標的とするか、もしくは、この段落において同定されるもののような異なるカテゴリーに由来する種々の遺伝子を標的とする複数のｓｉＲＮＡの組み合わせのいずれかを用いて適用され得る。例えば、複数のｓｉＲＮＡ二重鎖を含む組成物は、各々が、同じまたは異なる割合で存在し得る。したがって、３つのｓｉＲＮＡ混合物において、二重鎖Ｉ、二重鎖ＩＩおよび二重鎖ＩＩＩは、非限定的な例として、各々が、総ｓｉＲＮＡ剤の各々の３３．３％（ｗ／ｗ）で存在し得るか、それぞれ、２０％、４５％および３５％で存在し得るかのいずれかである。
【００７８】
そうでないと規定されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。例示的な方法および材料が以下に記載されるが、本明細書に記載される方法および材料に類似するかまたはこれらと等価な方法および材料もまた、本発明の実施または試験において使用され得る。本明細書において言及されるあらゆる刊行物および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。矛盾する場合は、定義を含め、本明細書が支配する。多数の文献が本明細書において引用されているが、この引用は、これらの文献のいずれかが、当該分野の一般的な知識の一部を形成するという容認を構成するものではない。本明細書および特許請求の範囲の全体にわたり、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のようなバリエーションは、述べられる整数の包摂、または、整数群を意味すると理解されるが、任意の他の整数または整数群を除外するものとは理解されない。材料、方法および実施例は、例示に過ぎず、限定するものと意図されない。
【実施例】
【００７９】
（実施例１：インビトロにおけるｓｉＲＮＡ媒介性のＣ３発現のノックダウン）
ＲＮＡ干渉は、その配列の小さな独特のセグメントにしたがって、遺伝子発現をブロックする。この生来のプロセスは、特定の遺伝子の転写を減らすために利用され得る。転写において、ドナー由来の補体Ｃ３が、虚血／再潅流傷害（Ｉ／ＲＩ）において迅速にアップレギュレートされ、組織の損傷に寄与することが確立されている。補体Ｃ３は、種々の形態の傷害および免疫調節の局所的なメディエーターとして記載され、そして、同種異系免疫の調節においても十分に補助し得る、移植による虚血／再潅流傷害後の遺伝子ノックダウンについての有効な標的である。この研究は、ドナーの臓器においてＣ３遺伝子の発現をノックダウンするためにｓｉＲＮＡを利用することを試みた。
【００８０】
ラット腎臓上皮細胞株を、１０μｇ／ｍｌ ＩＬ−１および０．１μｇ／ｍｌ ＩＬ−６で刺激して、Ｃ３遺伝子の発現をアップレギュレートした。刺激から７２時間後、これらの細胞を、Ｃ３特異的ｓｉＲＮＡのパネルのうち１つでトランスフェクトした。
【００８１】
【表１６】
。
【００８２】
４８時間後、Ｃ３の発現を、リアルタイムＰＣＲにより決定した。結果は、Ｃ３の発現が、刺激後に、トランスフェクトしていない細胞においてアップレギュレートされたことを示した（図１）。ｓｉＲＮＡで処理した細胞は、ｓｉＲＮＡで処理していないコントロール細胞と比較して、Ｃ３の発現の６０％までの減少を示した。これらの実験は、ｓｉＲＮＡの潜在的なオフターゲット作用（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔ）である、ＩＦＮγのアップレギュレーションを非特異的に誘導しなかった、パネルからの最も効率的なＣ３ ｓｉＲＮＡを同定した（図１において、Ｃ３−３ ｓｉＲＮＡとラベルした）。
【００８３】
先の実験において得た候補のＣ３ ｓｉＲＮＡを、上記のようにＣ３を発現するように刺激したラット腎臓上皮細胞中にトランスフェクトした。このＣ３特異的なｓｉＲＮＡの濃度の範囲は、リアルタイムＰＣＲにより測定したとき、有意な（Ｐ＜０．０５）Ｃ３ ｍＲＮＡのノックダウンをもたらした（図２）。この実験は、インビボ試験について同定されたＣ３ ｓｉＲＮＡ配列の技術的な実現可能性および有効性を実証する。
【００８４】
（実施例２：インビボにおけるｓｉＲＮＡ媒介性のＣ３発現のノックダウン）
先の実施例において決定した最も効率的なＣ３ ｓｉＲＮＡを、次いで、インビボｓｉＲＮＡトランスフェクションを容易にする、合成ポリカチオン性ナノ粒子内にパッケージングした。このナノ粒子は、ＰｏｌｙＴｒａｎから構成され、このＰｏｌｙＴｒａｎは、分枝ヒスチジン（Ｈ）およびリジン（Ｋ）ポリマーのファミリーで、インビトロ、インビボおよびエキソビボでのｓｉＲＮＡの移送に有効である。これらのコア配列は以下の通りである：Ｒ−ＫＲ−ＫＲ−ＫＲ、ここで、Ｒ＝［ＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ］２ＫＨ４ＮＨ４である。インビボ実験について、最初に、以下の分枝ＨＫポリマーを、同種移植片細胞内へとｓｉＲＮＡを送達する効率について調べた：Ｈ３Ｋ４ｂ。この分枝ポリマーは、Ｒ分枝が異なることを除いて、上記のものと同じコアおよび構造を有する：Ｒ＝ＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫ。このポリマーは、異なる核酸形態についてのそのインビトロまたはインビボでの効率に基づいて選択した。分枝ＨＫポリマーを、水溶液中に溶解し、次いで、列挙した質量比でｓｉＲＮＡ水溶液と混合し、直径１５０〜２００ｎｍの平均サイズのナノ粒子を形成した。ＨＫＰ−ｓｉＲＮＡ水溶液は、沈殿物の目立った凝集もなく、半透明であった。これらの溶液は、少なくとも３ヶ月間、４℃に保存可能である。
【００８５】
このナノ粒子を、Ｈｙｐｅｒ Ｏｓｍｏｌａｒ Ｃｉｔｒａｔｅ灌流液に加え、そして、ドナーのラット腎臓に投与した。４時間の低温虚血の後、この腎臓を、同系の宿主へと移植した。２日後、この腎臓を摘出し、そして、リアルタイムＰＣＲによりＣ３遺伝子の発現を決定した。移植していない非処理の腎臓をネガティブコントロールとして用い（図３においてＮＫＣとラベルした）、一方、灌流し、移植したが、ｓｉＲＮＡで処理していない腎臓を、ポジティブコントロールとして用いた（図３においてＩＳＣＨとラベルした）。ｓｉＲＮＡ処理した腎臓におけるレベルを、移植していない非処理の腎臓におけるｍＲＮＡレベルに対して正規化した。結果を図３に示す。
【００８６】
結果は、Ｃ３−ｓｉＲＮＡが、移植後のＣ３遺伝子発現を、非処理の移植物と比較して６２．５６％（Ｐ＜０．０５、ｎ＝４）低下させ、これは、正常な腎臓において検出されるレベルより低かったことを示す。ＦＩＴＣ標識スクランブルｓｉＲＮＡコントロールに対して比較すると、Ｃ３遺伝子の発現は、７３．３４％減少した（Ｐ＜０．０５、ｎ＝４）。ＦＩＴＣ標識スクランブルｓｉＲＮＡコントロールは、非処理の腎臓を上回るＣ３遺伝子発現のアップレギュレーションを示し、これは、オフターゲット作用を示唆するものであった。組織学は、移植前にＣ３ ｓｉ ＲＮＡで処理した腎臓における虚血／再潅流傷害（Ｉ／ＲＩ）からの異化抑制（ｓｐａｒｉｎｇ）を示した（図４）が、ＦＩＴＣ標識スクランブルｓｉＲＮＡを用いた、灌流した細胞および組織の直接蛍光顕微鏡法は、組織における検出可能なｓｉＲＮＡを含まなかった。
【００８７】
まとめると、Ｃ３遺伝子発現のｓｉＲＮＡによる阻害は、コントロールと比較して、局所的なＣ３の活性を効率的に減少した。ナノ粒子の戦略は、効率的なｓｉＲＮＡ送達の問題を克服するようである。ここで、従来の免疫抑制または寛容導入に対する補助療法として、特異的なｓｉＲＮＡのアレイを開発して、ドナー臓器における炎症促進性遺伝子の発現を減少させることが可能であるようである。
【００８８】
（実施例３：ファージディスプレイによる、移植された腎臓において濃縮されたペプチド配列の決定）
ｓｉＲＮＡ含有ナノ粒子に臓器標的特異性を与えるために、目的の臓器において濃縮されるペプチドを、ファージディスプレイにより同定し得る。この方法を用いて、上記の腎臓移植のラットモデルにおいて、候補の標的ペプチドを同定した。ドナーの腎臓を、Ｈｙｐｅｒ Ｏｓｍｏｌａｒ Ｃｉｔｒａｔｅで灌流し、そして、同系宿主への移植前に、４℃にて４時間保存した。４８時間後、レシピエントに麻酔をかけ、そして、調製したシステイン拘束した７マーのファージライブラリー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を尾静脈から注射した。５分後、移植した腎臓を摘出し、そして、「インビボ生体パニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）」の最初のラウンドにおいて、この腎臓からファージを抽出した。この抽出したファージを、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌において増殖させ、その後、別の腎臓移植レシピエントに注射した。この生体パニングを、合計３ラウンド繰り返した。各ラウンド後、ファージのサンプルを採って、移植した腎臓中に存在する数を見積もった。各増殖の後、ファージが単離され得、そして、発現されたライブラリーペプチドのＤＮＡ配列が決定され得るように、ファージのサンプルを、寒天プレート上の細菌コロニー内で増大させた。図５（下パネル）は、コントロールのターゲティングストレプトアビジン（Ｒ３ｖｓＳｔｒｅｐ）と比較したときの、生体パニングの各ラウンド後に移植した腎臓から回収したファージ（ランダムファージ）の数の増大を示す。腎臓において濃縮された、同定されたペプチド配列の例は、Ｃ−ＬＰＳＰＫＲＴ−Ｃ、Ｃ−ＬＰＳＰＫＫＴ−Ｃ、Ｃ−ＰＴＳＶＰＫＴ−Ｃである。３ラウンドの生体パニングの後、移植された腎臓においてファージが濃縮され、そして、このファージは、レシピエントの他の臓器においてもかなり少ない数が見られる（図５、下パネル）。この候補ペプチドは、移植された臓器に対するｓｉＲＮＡターゲティングに特異性を与えるために、ＴｒａｇｅＴｒａｎナノ粒子内へと組み込まれ得る。
【００８９】
（文献）
１．Ｓｕｂｔｉｒｅｌｕ ＭＭ ｅｔ ａｌ．Ａｃｕｔｅ ｒｅｎａｌ ｆａｉｌｕｒｅ ｉｎ ａ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｆｏｒ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ Ｂ１９ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｕｒｅ ｒｅｄ ｃｅｌｌ ａｐｌａｓｉａ．Ｐｅｄｉａｔｒ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２００５ Ｄｅｃ；９（６）：８０１−４
２．Ｓａｍｐｉｅｔｒｏ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｈｅｐａｔｉｃ ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｐｏｏｌ ｕｓｉｎｇ ｓｐｌｉｔ ｌｉｖｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ａｃｔａ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｂｅｌｇ．２００５ Ｊｕｌ−Ｓｅｐ；６８（３）：３６９−７５
３．Ｃｈａｌｅｒｍｓｋｕｌｒａｔ Ｗ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｄｏｎｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉ−ＣＤ１５４ ｔｈｅｒａｐｙ ａｃｈｉｅｖｅｓ ａｉｒｗａｙ ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．Ｔｈｏｒａｘ．２００５ Ｏｃｔ ２７；［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］
４．Ｏｌｉｖｅｉｒａ ＪＧ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｆｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｙ ａｃｕｔｅ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｓ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ ｍｏｆｅｔｉｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｔｒａｎｓｐｌ Ｉｎｔ．２００５ Ｎｏｖ；１８（１１）：１２８６−９１
５．ＭｃＭａｎｕｓ，Ｍ．Ｔ．ａｎｄ Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（２００２）Ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｍａｍｍａｌｓ ｂｙ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．３（１０）：７３７−７４７
６．Ｌｕ，Ｐ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００３）ｓｉＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｔａｒｇｅｔ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．５（３）：２２５−２３４
７．Ｌｕ，Ｐ．Ｙ．ｅｔ ａｌ（２００２）Ｔｕｍｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｂｙ ＲＮＡｉ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ＶＥＧＦ ａｎｄ ＶＥＧＦＲ２ ｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．１０（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ））Ｓ４
８．Ｋｉｍ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｏｃｕｌａｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｓｉＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｐａｔｈｗａｙ ｇｅｎｅｓ；ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｈｅｒｐｅｔｉｃ ｓｔｒｏｍａｌ ｋｅｒａｔｉｔｉｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６５（６）：２１７７−８５
９．Ｌｕ，Ｐ．Ｙ．ａｎｄ Ｍ．Ｗｏｏｄｌｅ（２００５）Ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ ｓｉＲＮＡ ｉｎ ｖｉｖｏ Ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｃａｎ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｉｎ ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．Ｐ ３０３−３１７
１０．Ｌｕ，Ｐ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈ ｓｉＲＮＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｏｒ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１１（３），１０４−１３。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】図１は、ラット腎臓細胞におけるＣ３ ｍＲＮＡの相対的な発現を示す棒グラフである。これらの細胞を、ＩＬ−１およびＩＬ−６で刺激して、Ｃ３発現を増加させた。３つの候補Ｃ３ ｓｉＲＮＡ配列（Ｃ３−１、Ｃ３−２、Ｃ３−３）、または、ＦＩＴＣ標識スクランブルｓｉＲＮＡを、種々の濃度にてこの細胞にトランスフェクトした。細胞の一方のセットは、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅありかつｓｉＲＮＡなしで処理し（＋ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、一方、もう一方のセットは、Ｃ３を生成するよう刺激し、そして、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅもｓｉＲＮＡもなしで処理した（−ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）。トランスフェクションから４８時間後に、細胞におけるＣ３ ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲにより測定した。点線は、非刺激の細胞のＣ３発現を示す。この実験は、ｓｉＲＮＡによる遺伝子ノックダウンの実現可能性および有効性を示した。Ｃ３−３ ｓｉＲＮＡを候補として選択し、さらなる実験において使用した。
【図２】図２は、ＩＬ−１およびＩＬ−６で刺激してＣ３発現を増加させたラット腎臓細胞におけるＣ３ ｍＲＮＡの相対的な発現を示す棒グラフである。これらの細胞もまた、種々の濃度のＣ３−３候補配列でトランスフェクトした。刺激から４８時間後のＣ３ ｍＲＮＡ発現についてのリアルタイムＰＣＲは、このｓｉＲＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡなしで処理した刺激細胞と比較して、Ｃ３発現の減少をもたらすことを示した。測定は、非刺激の細胞におけるＣ３ ｍＲＮＡ発現（点線）に対して正規化した。
【図３】図３は、移植したラット腎臓におけるＣ３ ｍＲＮＡレベルの相対的な発現を示す棒グラフである。腎臓を、移植前に、処理しなかったか、あるいは、種々の量の、スクランブルｓｉＲＮＡ、またはＣ３特異的なｓｉＲＮＡを含むナノ粒子で処理した。各データ点は、４つの別々の腎臓からのデータを含み、そして、各ＰＣＲ反応を、３連で行った。これらの実験条件におけるＣ３ ｍＲＮＡレベルを、正常な移植していない腎臓（ＮＫＣ、正常腎臓コントロール）、およびｓｉＲＮＡで処理していない移植した腎臓（ＩＳＣＨ、虚血性コントロール）におけるＣ３ ｍＲＮＡレベルと比較した。この図面は、Ｃ３ ｍＲＮＡレベルが、正常な移植していない腎臓、およびＣ３特異的なｓｉＲＮＡで処理していない移植した腎臓におけるＣ３ ｍＲＮＡレベルと比較して、移植前にＣ３特異的なｓｉＲＮＡで処理した腎臓においてより低いことを示す。Ｃ３特異的なｓｉＲＮＡを、種々の割合のＰｏｌｙＴｒａｎでパッケージングし、図１において以下のようにラベルした：Ｃ３、１：４．５でＰｏｌｙＴｒａｎ中に存在する１０μｇのＣ３ ｓｉＲＮＡ；Ｃ３ ｎａｋｅｄ、ＰｏｌｙＴｒａｎなしで、１０μｇのＣ３ ｓｉＲＮＡ；Ｃ３ ３：１、１：３でＰｏｌｙＴｒａｎ中に存在する１０μｇのＣ３ ｓｉＲＮＡ；Ｃ３ １．５：１、１：１．５でＰｏｌｙＴｒａｎ中に存在する１０μｇのＣ３ ｓｉＲＮＡ。ｓｉＲＮＡの特異性についての要件を調べるために、２セットの腎臓を、移植前に、スクランブルｓｉＲＮＡで処理した：ＦＩＴＣ、１０μｇのＦＩＴＣ標識スクランブルｓｉＲＮＡ；ＳＣＲＡＭ ＣＯＮ、１０μｇの非標識スクランブルｓｉＲＮＡ。
【図４】図４は、移植したラット腎臓の組織学的解析を示す２つのパネルのセットである。上側のパネルは、移植から４８時間後の非処理腎臓を示す。組織病理学は、急性の尿細管壊死（ＡＴＮ）の兆候である、広範囲に及ぶ尿細管の減衰と尿細管の拡大とを示す。この特定の病理学は、移植後の移植された組織の初期の機能不全（ｎｏｎ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ）に関連する。下パネルは、移植から４８時間後の、Ｃ３ ｓｉＲＮＡ（ＰｏｌｙＴｒａｎと１：４．５の比で存在）で前処理した腎臓を示す。この腎臓の組織病理学は、より少ない量のＡＴＮを示す。
【図５】図５は、ｓｉＲＮＡ含有ナノ粒子を特定の臓器へと標的化させるために使用され得る短いペプチドを同定するように機能する実験の結果を表す、２つの棒グラフを示す。ファージディスプレイを用いて、移植された腎臓において濃縮される候補ペプチドを同定した。図５の上パネルは、１つの実験についての代表的なデータを示し、３ラウンドのファージライブラリーの注射、回収および増大の後に、腎臓から回収したファージの濃度（組織１グラムあたりのプラーク形成単位で表示）が増加している。コントロール実験においては、ストレプトアビジン（Ｒ３ｖｓＳｔｒｅｐ）をファージ結合のための標的として用いた。図５の下パネルは、レシピエントの移植した腎臓（Ｔｘ腎臓）、正常腎臓（Ｎ腎臓）、膵臓、心臓および肺における３ラウンドの生体パニングの後に回収したファージの数を示す。このデータは、他の臓器から回収したファージの数と比較して、移植された腎臓内へのファージのホーミングにおける選択性を示す。
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国仮出願第６０／７４１，１５７号（この出願の全開示は、本明細書中に参考として援用される）の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ｓｉＲＮＡ媒介性の遺伝子発現のダウンレギュレーションを用いた、固形臓器または組織の移植における、同種移植片拒絶反応または異種移植片拒絶反応、および虚血／再潅流傷害を防止するための組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
固形臓器移植は、末期の臓器不全の処置のための唯一の有効な治療である（非特許文献１、非特許文献２）。世界中の移植プログラムはますます首尾よくなってきており、そして、このような手術は、ますます慣用的になりつつある（非特許文献３、非特許文献４）。１年の生存率という印象的な結果にもかかわらず、臓器移植は、依然として、大きな問題に直面している。免疫系が、移植された臓器の長期間の生存に対して最も大きな障壁を呈する。免疫応答を溝（ｂａｙ）に維持するための強力な免疫抑制剤を用いた一生の処置なしでは、臓器移植片は、常に拒絶反応を受ける。しかし、現在の抗拒絶反応薬は、全身の免疫を非選択的に低下させ、そして、長期にわたる日和見感染および腫瘍発生の危険を増加させる。したがって、代替的な戦略が求められている。
【０００４】
過去１０年間にわたる分子生物学的技術の進歩は、免疫応答および虚血／再潅流傷害の両方を誘発するために必要とされるシグナルの我々の理解を向上させた。これらの新規シグナルを標的とするように設計された薬剤は、最終的には、移植された臓器の長期にわたる、薬物なしでの受容を可能にするという望みを提供する。
【０００５】
移植免疫学は、同種移植片または異種移植片がドナーから摘出され、次いで、レシピエントに移植された後に生じる、包括的な事象の連続を指す。組織は、移植片および移植部位の両方において損傷を与えられる。直ちに、生化学カスケードの活性化として、炎症性反応が起こる。抗原が認識されると、一連の特異的および非特異的な細胞の応答が続いて起こる。最終的には、損傷は、組織の修復および強化により制御される；損傷が病的でない場合、移植片は生き延びる。
【０００６】
組織損傷の抗原非依存性の原因（すなわち、虚血、低体温、再潅流傷害）は、移植片が採取されるときの、機械的な外傷ならびに血液供給の崩壊の結果である。
【０００７】
対照的に、組織損傷の抗原依存性の原因は、免疫媒介性の損傷を伴う。マクロファージは、サイトカイン（例えば、腫瘍壊死因子、インターロイキン−１）を放出し、これは、炎症性の内皮応答を刺激することによって、炎症の強度を強める；これらの内皮の変化は、多数のＴ細胞を移植部位へと補充するのに役立つ。損傷を受けた組織は、いくつかの生化学カスケードを引き起こす炎症促進性メディエーター（例えば、ハーゲマン因子［第ＸＩＩ因子］）を放出する。血液凝固カスケードは、フィブリンといくつかの関連の線維素ペプチドを誘導し、そして、局所的な血管浸透性を促進し、好中球およびマクロファージを引き付ける。キニンカスケードは主に、ブラジキニンを生成し、血管拡張、平滑筋収縮を促進し、血管浸透性を増大させる。
【０００８】
抗体−抗原複合体（すなわち、免疫複合体）の形成は、補体系の古典的な経路を活性化する。Ｃ１ｑは、古典的な経路を介して免疫複合体内の抗体上にドッキングすると、活性化プロセスを引き起こし、一方で、補体因子Ｃ３は、代替的な経路の活性化のためのアクセプターとして、損傷を受けた細胞表面を認識し得る。活性化された補体は、膜攻撃複合体（例えば、Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９）および細胞結合リガンド（例えば、Ｃ４ｂおよびＣ３ｂ）の堆積により損傷を引き起こし、補体レセプターを有する白血球を活性化する。さらに、生物活性アナフィラトキシンＣ５ａおよびＣ３ａの生成は、炎症性細胞の流入および活性化を引き起こす。これらの化学走性誘引物質はまた、肥満細胞の脱顆粒を開始し、いくつかのメディエーターを放出する。ヒスタミンおよび５−ヒドロキシトリプタミンは、血管浸透性を増大させる。プロスタグランジンＥ２は、血管拡張および血管浸透性を促進する。ロイコトリエンＢ４およびＤ２は、白血球の蓄積および血管浸透性を促進する。補体芽活性化される別の手段は、組織の虚血および再潅流によるものであり、リン脂質およびミトコンドリアのタンパク質を露出する。これらの副産物は、Ｃ１ｑ、または、マンノース結合レクチン、または、因子Ｃ３ｂを結合することによって、直接補体を活性化する。
【０００９】
現在、同種移植片の首尾良い移植は、免疫抑制薬の全身性の使用を必要とする。これらは、その毒性と、癌および感染症に対する感受性の増加とに起因して、深刻な病的状態を引き起こし得る。移植部位に限定された免疫抑制性分子の局所的な生成は、従来の、全身性の免疫抑制療法の必要性を減少し、したがって、引き起こされる副作用が少なくなる。これは、１型糖尿病（すぐに生命に危険があるわけではないが、膵島の同種移植片が治癒を達成し得る）のような疾患において特に顕著である。抗ＣＤ４戦略は、抗体の組み合わせが使用される場合、なおより効果的であり得る；同様の戦略もまた、異種移植片の拒絶反応を防止し得る。宿主の免疫応答を抑制することもまた、癌の危険を増大させる。移植片拒絶および対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を回避する目的で免疫応答を抑制する試みは、感染因子（例えば、細菌、ウイルス、真菌など）と闘う身体の能力を減弱させる。
【００１０】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）化合物、中程度の低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）は、同じ処置において、複数の疾患の原因となる遺伝子を標的とするために、複数のｓｉＲＮＡ二重鎖の組み合わせを使用するための独特の戦略を提供する。というのも、全てのｓｉＲＮＡ二重鎖は、同じ起源および同じ製造プロセスを用いる場合、化学的に均質であるからである（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。このようなｓｉＲＮＡインヒビターは、毒性および安全性の問題が最小でありつつ、かなり良好な臨床上の有効性を有するものと期待される。遺伝的修飾は、臓器移植のための有望な治療戦略である。特定の遺伝子発現をサイレンシングするためのＲＮＡ干渉の魅力的な技術（非特許文献９、非特許文献１０）に基づいて、ｓｉＲＮＡ治療は、移植を受けたレシピエントにおける虚血／再潅流傷害ならびに臓器の拒絶反応の防止における、魅力的かつ強力なアプローチを体現し得る。
【非特許文献１】Ｓｕｂｔｉｒｅｌｕ ＭＭ ｅｔ ａｌ．Ａｃｕｔｅ ｒｅｎａｌ ｆａｉｌｕｒｅ ｉｎ ａ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｆｏｒ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ Ｂ１９ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｕｒｅ ｒｅｄ ｃｅｌｌ ａｐｌａｓｉａ．Ｐｅｄｉａｔｒ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２００５ Ｄｅｃ；９（６）：８０１−４．
【非特許文献２】Ｓａｍｐｉｅｔｒｏ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｈｅｐａｔｉｃ ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｐｏｏｌ ｕｓｉｎｇ ｓｐｌｉｔ ｌｉｖｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ａｃｔａ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｂｅｌｇ．２００５ Ｊｕｌ−Ｓｅｐ；６８（３）：３６９−７５．
【非特許文献３】Ｃｈａｌｅｒｍｓｋｕｌｒａｔ Ｗ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｄｏｎｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉ−ＣＤ１５４ ｔｈｅｒａｐｙ ａｃｈｉｅｖｅｓ ａｉｒｗａｙ ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．Ｔｈｏｒａｘ．２００５ Ｏｃｔ ２７；［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］．
【非特許文献４】Ｏｌｉｖｅｉｒａ ＪＧ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｆｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｙ ａｃｕｔｅ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｓ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ ｍｏｆｅｔｉｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｔｒａｎｓｐｌ Ｉｎｔ．２００５ Ｎｏｖ；１８（１１）：１２８６−９１．
【非特許文献５】ＭｃＭａｎｕｓ，Ｍ．Ｔ．ａｎｄ Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（２００２）Ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｍａｍｍａｌｓ ｂｙ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．３（１０）：７３７−７４７．
【非特許文献６】Ｌｕ，Ｐ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００３）ｓｉＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｔａｒｇｅｔ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．５（３）：２２５−２３４．
【非特許文献７】Ｌｕ，Ｐ．Ｙ．ｅｔ ａｌ（２００２）Ｔｕｍｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｂｙ ＲＮＡｉ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ＶＥＧＦ ａｎｄ ＶＥＧＦＲ２ ｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．１０（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ））Ｓ４．
【非特許文献８】Ｋｉｍ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｏｃｕｌａｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｓｉＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｐａｔｈｗａｙ ｇｅｎｅｓ；ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｈｅｒｐｅｔｉｃ ｓｔｒｏｍａｌ ｋｅｒａｔｉｔｉｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６５（６）：２１７７−８５．
【非特許文献９】Ｌｕ，Ｐ．Ｙ．ａｎｄ Ｍ．Ｗｏｏｄｌｅ（２００５）Ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ ｓｉＲＮＡ ｉｎ ｖｉｖｏ Ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｃａｎ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｉｎ ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．Ｐ ３０３−３１７．
【非特許文献１０】Ｌｕ，Ｐ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈ ｓｉＲＮＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｏｒ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１１（３），１０４−１３．
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、レシピエントに移植される臓器の細胞中に存在する免疫調節遺伝子または免疫エフェクター遺伝子を標的とする、ターゲティングポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドのための標的は、表１〜１５に列挙される免疫調節遺伝子および免疫エフェクター遺伝子の配列から誘導され得る（以下を参照のこと）。例えば、ターゲティングポリヌクレオチドは、Ｃ３、ＩＣＡＭ１、ＶＣＡＭ−１、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ−ＩＩ、ＭＨＣ−Ｉ、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４またはＰＶ−Ｂ１９の遺伝子中の配列を標的とし得る。ターゲティングポリヌクレオチドは、表１〜１５に列挙される配列の１以上を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖を含み得る。ターゲティングポリヌクレオチドは、一本鎖の直鎖状ポリヌクレオチド、二本鎖の直鎖状ポリヌクレオチド、またはヘアピンポリヌクレオチドであり得る。
【００１２】
本発明はまた、臓器をレシピエントに移植する前に、臓器と本発明のターゲティングポリヌクレオチドを含有する組成物とを接触させることによって、移植された臓器の拒絶反応を抑制する方法を提供する。この方法は、移植前の保管の間に、臓器または臓器の細胞における標的の免疫調節遺伝子または免疫エフェクター遺伝子の発現をダウンレギュレートまたは阻害するのに有効であり得る。一実施形態において、臓器は、本発明のターゲティングポリヌクレオチドを含有する組成物を灌流させられる。別の実施形態において、臓器は、本発明のターゲティングポリヌクレオチドを含有する組成物中に漬けられるか、または浸される。組成物はまた、臓器のレシピエントに投与され得る。本発明のいくつかの実施形態において、臓器は、レシピエント自身の臓器であり得る。上記臓器のレシピエントはヒトであり得る。本発明のターゲティングポリヌクレオチドを含有する組成物に接触される臓器、組織および細胞としては、腎臓、肝臓、肺、膵臓、心臓、小腸、角膜、上皮細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、および移植時に臓器中に存在するパッセンジャー白血球が挙げられる。
【００１３】
本発明のターゲティングポリヌクレオチドを含有する組成物はまた、キャリアを含有し得、このキャリアとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：潅流液、Ｈｙｐｅｒ Ｏｓｍｏｌａｒ Ｃｉｔｒａｔｅ溶液、ＰｏｌｙＴｒａｎポリマー溶液、ＴａｒｇｅＴｒａｎナノ粒子溶液、またはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ溶液。組成物はまた、低分子薬物、モノクローナル抗体薬物、および他の免疫調節因子を含有し得る。いくつかの実施形態において、組成物は、複数の本発明のターゲティングポリヌクレオチドを含み得る。組成物は、複数の遺伝子配列を標的とし得る複数の本発明のターゲティングポリヌクレオチドを含み得る。一実施形態において、ターゲティングポリヌクレオチドは、Ｃ３遺伝子配列、ＴＮＦ−α遺伝子配列およびＩＬ−８遺伝子配列を標的とするカクテルである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本明細書において使用される場合、「オリゴヌクレオチド」およびこれに基づく類似用語は、直前の段落に記載されるように、天然に存在するヌクレオチド、ならびに、合成または修飾ヌクレオチドから構成されるポリマーに関する。オリゴヌクレオチドは、１０以上のヌクレオチド長、または１５以上のヌクレオチド長、または１６以上のヌクレオチド長、または１７以上のヌクレオチド長、または１８以上のヌクレオチド長、または１９以上のヌクレオチド長、または２０以上のヌクレオチド長、または２１以上のヌクレオチド長、または２２以上のヌクレオチド長、または２３以上のヌクレオチド長、または２４以上のヌクレオチド長、または２５以上のヌクレオチド長、または２６以上のヌクレオチド長、または２７以上のヌクレオチド長、または２８以上のヌクレオチド長、または２９以上のヌクレオチド長、または３０以上のヌクレオチド長、または３５以上のヌクレオチド長、または４０以上のヌクレオチド長、または４５以上のヌクレオチド長、または、約５０までのヌクレオチド長であり得る。ｓｉＲＮＡであるオリゴヌクレオチドは、１５ヌクレオチドと３０ヌクレオチドとの間の任意の数のヌクレオチドを有し得る。多くの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、２１ヌクレオチドと２５ヌクレオチドとの間の任意の数のヌクレオチドを有し得る。
【００１５】
多くの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、２つの平滑末端を有しても、２つの突出末端を有しても、１つの平滑末端と１つの突出末端を有しても、１つのオーバーハングを有する末端を有してもよい。このオーバーハングヌクレオチドは、１〜４以上の範囲であり得る。
【００１６】
（ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ））
本発明によれば、免疫調節遺伝子標的または免疫エフェクター遺伝子標的の遺伝子発現は、ＲＮＡ干渉により減弱される。免疫調節遺伝子または免疫エフェクター遺伝子の発現生成物は、この免疫調節遺伝子または免疫エフェクター遺伝子の標的配列の少なくとも一セグメントに対して相補的である、特異的な二本鎖ｓｉＲＮＡヌクレオチド配列により標的とされ、この二本鎖ｓｉＲＮＡヌクレオチド配列は、１５ヌクレオチドと３０ヌクレオチドとの間の任意に数のヌクレオチドを含むか、または、多くの場合、２１ヌクレオチドと２５ヌクレオチドとの間の任意の数のヌクレオチドまたはそれ以上の数のヌクレオチドを含む。標的は、コード配列中の５’非翻訳（ＵＴ）領域、または、３’ＵＴ領域中に存在し得る。例えば、ＰＣＴ出願公開ＷＯ００／４４８９５、ＷＯ９９／３２６１９、ＷＯ０１／７５１６４、ＷＯ０１／９２５１３、ＷＯ０１／２９０５８、ＷＯ０１／８９３０４、ＷＯ０２／１６６２０およびＷＯ０２／２９８５８（この各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【００１７】
本発明の方法によれば、免疫調節遺伝子または免疫エフェクター遺伝子の発現、および、これによる、有害な免疫学的反応に起因した虚血／再潅流傷害または臓器移植の拒絶反応は、ｓｉＲＮＡを用いて抑制される。本発明によるターゲティングポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。このようなｓｉＲＮＡはまた、意図される配列と同一であるかまたはこれに類似するヌクレオチド配列の化学合成によって調製され得る。例えば、Ｔｕｓｃｈｌ、Ｚａｍｏｒｅ、Ｌｅｈｍａｎｎ、ＢａｒｔｅｌおよびＳｈａｒｐ（１９９９）、Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．１３：３１９１−３１９７（その全体が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。あるいは、ターゲティングｓｉＲＮＡは、例えば、細胞を含まない系（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ抽出物であるが、これに限定されない）において免疫調節リボポリヌクレオチド配列または免疫エフェクターリボポリヌクレオチド配列を消化することによって、または、組換え二本鎖ｃＲＮＡの転写によって、ターゲティングポリヌクレオチド配列を用いて得られ得る。
【００１８】
効率的なサイレンシングは、一般に、同じ長さの１６〜３０ｎｔのセンス鎖および１６〜３０ｎｔのアンチセンス鎖から構成されるｓｉＲＮＡ二重鎖を用いて観察される。多くの実施形態において、ｓｉＲＮＡ対二重鎖の各鎖は、さらに、３’末端に２ｎｔのオーバーハングを有する。この２ｎｔの３’オーバーハングの配列は、ｓｉＲＮＡの標的認識特異性に対して、わずかではあるが、さらなる助力となる。一実施形態において、３’オーバーハング内のヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。代替的な実施形態において、３’オーバーハング内のヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドである。３’デオキシリボヌクレオチドの使用は、細胞内安定性の増大をもたらす。
【００１９】
本発明の組換え発現ベクターは、細胞内に導入されると、プロセシングを受けて、臓器内の免疫調節遺伝子または免疫エフェクター遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ配列を含むＲＮＡを提供する。このようなベクターは、発現を可能にする様式で、免疫調節遺伝子または免疫エフェクター遺伝子に隣接する、作動可能に連結された調節配列を含む発現ベクター内にクローニングされたＤＮＡ分子であり得る。このベクターから、標的ＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子が、第一のプロモーター（例えば、クローニングされたＤＮＡの３’側にあるプロモーター配列）により転写され、そして、ＲＮＡ標的に対してセンス鎖であるＲＮＡ分子が、第二のプロモーター（例えば、クローニングされたＤＮＡの５’側にあるプロモーター配列）により転写される。これらのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、次いで、インビボでハイブリダイズして、免疫調節遺伝子または免疫エフェクター遺伝子の配列を標的とするｓｉＲＮＡ構築物を生成する。あるいは、ｓｉＲＮＡ構築物のセンス鎖およびアンチセンス鎖を作製するために、２つの構築物が利用され得る。さらに、クローニングされたＤＮＡは、二次構造を有する転写体をコードし得、ここで、単一の転写体が、標的遺伝子からのセンス配列および相補的なアンチセンス配列の両方を有する。この実施形態の一例において、ヘアピンＲＮＡｉ生成物は、標的遺伝子の全体または一部分に類似する。別の例において、ヘアピンＲＮＡｉ生成物はｓｉＲＮＡである。免疫調節遺伝子または免疫エフェクター遺伝子の配列に隣接する調節配列は、同一であっても異なっていてもよく、その結果、これらの発現は、独立して調節されても、時間的もしくは空間的な様式で調節されてもよい。
【００２０】
特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、免疫調節遺伝子または免疫エフェクター遺伝子の配列を、例えば、低分子核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）Ｕ６またはヒトＲＮａｓｅ Ｐ ＲＮＡ Ｈ１に由来するＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩ転写ユニットを含むベクター内にクローニングすることによって、細胞内で転写される。ベクターシステムの一例は、ＧｅｎｅＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒＴＭＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅキット（Ｉｍｇｅｎｅｘ Ｃｏｒｐ．）である。Ｕ６プロモーターおよびＨ１プロモーターは、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターのＩＩＩ型クラスのメンバーである。Ｕ６様プロモーターの＋１ヌクレオチドは、常にグアノシンであり、一方で、Ｈ１プロモーターの＋１ヌクレオチドはアデノシンである。これらのプロモーターについての終止シグナルは、５つの連続するチミジンにより規定される。転写体は、代表的に、二番目のウリジンの後に切断される。この位置での切断は、発現されるｓｉＲＮＡにおける３’ＵＵオーバーハングを生じ、これは、合成ｓｉＲＮＡの３’オーバーハングに類似する。４００ヌクレオチド長未満の任意の配列が、これらのプロモーターにより転写され得、それゆえ、これらは、理論上、例えば、約５０ヌクレオチドＲＮＡのステムループ転写体における、およそ２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡの発現に適している。ＲＮＡｉの特徴およびｓｉＲＮＡの効率に影響を及ぼす要因の特徴が研究されている（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ、ＬｅｎｄｅｃｋｅｌおよびＴｕｓｃｈｌ（２００１）．Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．１５：１８８−２００を参照のこと）。
【００２１】
ターゲティングポリヌクレオチドは、一般に、３００ヌクレオチド長以下であり、そして、移植臓器の細胞中、または、移植臓器に付随するパッセンジャー細胞（一度ドナーから摘出され、そして、移植臓器がレシピエントの被験体内に導入されたときに、免疫調節性または免疫エフェクター性の応答に関与する）中に存在する遺伝子配列を標的とする第一のヌクレオチド配列を含む。ポリヌクレオチドにおいて、あらゆるＴ（チミジン）またはあらゆるＵ（ウリジン）は、必要に応じてもう一方で置換され得る。さらに、ポリヌクレオチドにおいて、第一のヌクレオチド配列は、ａ）その長さが１５ヌクレオチド〜３０ヌクレオチドまたはそれ以上の任意の数である配列、またはｂ）ａ）に与えられる配列の相補鎖から構成される。このようなポリヌクレオチドは、本明細補において、直鎖状ポリヌクレオチドと命名され得る。一本鎖ポリヌクレオチドは、しばしば、二本鎖ｓｉＲＮＡのうちの一方の鎖である。
【００２２】
関連する局面において、上記ポリヌクレオチドはさらに、ループ配列により第一のヌクレオチド配列から間隔を空けられた第二のヌクレオチド配列を含み、その結果、第二のヌクレオチド配列は、
ａ）第一のヌクレオチド配列と実質的に同じ長さを有し、そして
ｂ）第一のヌクレオチド配列に対し実質的に相補的である。
【００２３】
この、ヘアピンポリヌクレオチドと命名された後者の構造において、第一のヌクレオチド配列は、第二のヌクレオチド配列とハイブリダイズしてヘアピンを形成し、このヘアピンの相補配列が、ループ配列により連結される。ヘアピンポリヌクレオチドは、細胞内で消化されて、二本鎖ｓｉＲＮＡを形成する。
【００２４】
多くの実施形態において、直鎖状ポリヌクレオチドの標的およびヘアピンポリヌクレオチドの標的は、移植臓器の細胞中、または、移植臓器に付随するパッセンジャー細胞中に存在する遺伝子配列であり、そして、第一のヌクレオチド配列は、以下のいずれかである：
ａ）本明細書に添付される表１〜１５に与えられる配列から選択される配列を標的とするターゲティング配列；
ｂ）項目ａ）に与えられる配列よりも長く、表１〜１５から選択される配列を標的とするターゲティング配列；
ｃ）少なくとも１５ヌクレオチド長であり、最大でも選択される配列より１塩基短い、連続塩基配列から構成される、項目ａ）またはｂ）に与えられる配列のフラグメント；
ｄ）ａ）〜ｃ）に与えられる配列と、最大５ヌクレオチド異なるターゲティング配列；または
ｅ）ａ）〜ｄ）に与えられる任意の配列の相補体。
【００２５】
直鎖状ポリヌクレオチドまたはヘアピンポリヌクレオチドの種々の実施形態において、第一のヌクレオチド配列の長さは、２１ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドの任意の数である。
【００２６】
多くの実施形態において、直鎖状ポリヌクレオチドまたはヘアピンポリヌクレオチドは、表１〜１５から選択される配列を標的とするターゲティング配列から構成され、そして、必要に応じて、その選択される配列の３’に結合したジヌクレオチドのオーバーハングを含む。直鎖状ポリヌクレオチドまたはヘアピンポリヌクレオチドのなおさらなる実施形態において、第一のヌクレオチド配列の３’末端にあるジヌクレオチド配列は、ＴＴ、ＴＵ、ＵＴまたはＵＵであり、そして、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、または、その両方を含む。種々のさらなる実施形態において、直鎖状ポリヌクレオチドまたはヘアピンポリヌクレオチドは、ＤＮＡであっても、ＲＮＡであっても、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの両方から構成されてもよい。
【００２７】
特定のヒト遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡオリゴの例示的な配列を、以下の表１ａ〜１５ｂに列挙する。これらの表は、列挙される全遺伝子について、オーバーハングをもつ２１マーと、平滑末端をもつ２５マーとの両方を含む。移植ドナーである他の哺乳動物の遺伝子に対して特異的である可能性のあるｓｉＲＮＡオリゴの配列は、対応するヒト遺伝子を参照して、だが、これらの動物の遺伝子配列を心に留めて設計されるべきである。
【００２８】
表１：
Ｃ３遺伝子におけるｓｉＲＮＡの標的配列：
Ｃ３遺伝子：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ補体成分３（Ｃ３）、
アクセッション番号：ＮＭ＿００００６４、遺伝子ＩＤ：４５５７３８４、
以下の遺伝子配列を標的とする２５のｓｉＲＮＡ候補を選択した：
【００２９】
【表１ａ】
【００３０】
【表１ｂ】
表２：
ＩＣＡＭ１遺伝子におけるｓｉＲＮＡの標的配列：
ＩＣＡＭ１遺伝子：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ細胞間接着分子１（ＣＤ５４）、ヒトライノウイルスレセプター（ＩＣＡＭ１）、
アクセッション番号：ＮＭ＿０００２０１、遺伝子ＩＤ：４５５７８７７、
以下の遺伝子配列を標的とする１９のｓｉＲＮＡ候補を選択した：
【００３１】
【表２ａ】
【００３２】
【表２ｂ】
表３：
ＶＣＡＭ１遺伝子におけるｓｉＲＮＡの標的配列：
ＶＣＡＭ１遺伝子：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ１）、転写改変体２、ｍＲＮＡ。
アクセッション番号 ＮＭ＿０８０６８２。ＧＩ：１８２０１９０８；転写改変体１、ｍＲＮＡ。アクセッション番号 ＮＭ＿００１０７８、ＧＩ：１８２０１９０７；ヒト血管細胞接着分子１ ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ
ｇｉ｜１７９８８５｜ｇｂ｜Ｍ３０２５７．１｜ＨＵＭＣＡＭ１Ｖ［１７９８８５］、ヒト血管細胞接着分子１ ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ、
ｇｉ｜３４０１９３｜ｇｂ｜Ｍ６０３３５．１｜
ＨＵＭＶＣＡＭ１［３４０１９３］、ヒト血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ１）遺伝子、完全ＣＤＳ、
ｇｉ｜３４０１９５｜ｇｂ｜Ｍ７３２５５．１｜
ＨＵＭＶＣＡＭ１Ａ［３４０１９５］、血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）についてのヒトｍＲＮＡ、
ｇｉ｜３７６４８｜ｅｍｂ｜Ｘ５３０５１．１｜ＨＳＶＣＡＭ１［３７６４８］
以下の遺伝子配列を標的とする２５のｓｉＲＮＡ候補を選択した：
【００３３】
【表３ａ】
【００３４】
【表３ｂ】
表４：
ヒトＩＦＮ−γを標的とするｓｉＲＮＡ配列（アクセッション番号ＮＭ＿０００６１９）：
【００３５】
【表４ａ】
【００３６】
【表４ｂ】
表５：
ヒトＩＬ−１を標的とするｓｉＲＮＡ配列（アクセッション番号：ＮＭ＿０３３２９２）：
【００３７】
【表５ａ】
【００３８】
【表５ｂ】
表６：
ヒトＩＬ−６を標的とするｓｉＲＮＡ配列（アクセッション番号ＮＭ＿０００６００）：
【００３９】
【表６ａ】
【００４０】
【表６ｂ】
表７：
ヒトＩＬ−８を標的とするｓｉＲＮＡ配列（アクセッション番号：ＮＭ＿０００５８４）：
【００４１】
【表７ａ】
【００４２】
【表７ｂ】
表８：
ヒトＴＮＦ−αを標的とするｓｉＲＮＡ配列（アクセッション番号：ＮＭ＿００４８６２）：
【００４３】
【表８ａ】
【００４４】
【表８ｂ】
表９：
ヒトＣＤ８０を標的とするｓｉＲＮＡ配列（アクセッション番号：ＮＭ＿００５１９１）：
【００４５】
【表９ａ】
【００４６】
【表９ｂ】
表１０：
ヒトＣＤ８６を標的とするｓｉＲＮＡ配列（アクセッション番号：ＮＭ＿１７５８６２）：
【００４７】
【表１０ａ】
【００４８】
【表１０ｂ】
表１１：
ヒトＭＨＣ−ＩＩを標的とするｓｉＲＮＡ配列（アクセッション番号：ＮＭ＿００２１１９）：
【００４９】
【表１１ａ】
【００５０】
【表１１ｂ】
表１２：
ヒトＭＨＣ−Ｉを標的とするｓｉＲＮＡ配列（アクセッション番号：ＮＭ＿００５５１６）
【００５１】
【表１２ａ】
【００５２】
【表１２ｂ】
表１３：
ヒトＣＤ２８を標的とするｓｉＲＮＡ配列（アクセッション番号：ＮＭ＿００６１３９）：
【００５３】
【表１３ａ】
【００５４】
【表１３ｂ】
表１４：
ヒトＣＴＬＡ４を標的とするｓｉＲＮＡ配列（アクセッション番号：ＡＦ４１４１２０）：
【００５５】
【表１４ａ】
【００５６】
【表１４ｂ】
表１５：
ヒトパルボウイルスＢ１９を標的とするｓｉＲＮＡ配列（アクセッション番号：ＡＹ９０３４３７）：
【００５７】
【表１５ａ】
【００５８】
【表１５ｂ】
。
【００５９】
一実施形態において、平滑末端をもつ２５塩基対のｓｉＲＮＡ二重鎖は、インビトロおよびインビボの両方において、両方の３’末端にオーバーハングをもつ１９塩基対のｓｉＲＮＡ二重鎖よりも強力な遺伝子ノックダウン効率を示す。
【００６０】
さらなる局面において、本発明は、上記の第一の直鎖状ポリヌクレオチド鎖および第二のポリヌクレオチド鎖を含む二本鎖ポリヌクレオチドを提供し、第二のポリヌクレオチド鎖は、第一の鎖の少なくとも第一のヌクレオチド配列に対して相補的であり、第一のポリヌクレオチド鎖にハイブリダイズして二本鎖ｓｉＲＮＡ組成物を形成する。
【００６１】
（処方物）
種々のキャリアは、ｓｉＲＮＡを含有する処方物または薬学的組成物を調製するのに役立つ。いくつかの実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、例えば、市販の試薬または技術（例えば、ＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅＴＭ試薬、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ ２０００ＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いることによる、リポソーム媒介性のトランスフェクションによって、ならびに、エレクトロポレーションおよび類似の技術によって、培養物中、または、移植を待つ臓器の細胞中に送達される。
【００６２】
ｓｉＲＮＡを含有する薬学的組成物は、ｓｉＲＮＡの安定性を保護するか、ｓｉＲＮＡの寿命を延長するか、ｓｉＲＮＡの機能を助長するか、または、特定の組織／細胞へとｓｉＲＮＡを標的化する、さらなる成分を含む。これらとしては、以下が挙げられる：種々の生分解性ポリマー、カチオン性ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン）、カチオン性コポリペプチド（例えば、ヒスチジン−リジン（ＨＫ）ポリペプチド、例えば、Ｍｉｘｓｏｎらに対するＰＣＴ公開ＷＯ ０１／４７４９６、Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘに対するＷＯ ０２／０９６９４１およびＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙに対するＷＯ ９９／４２０９１を参照のこと；ＰＥＧ化カチオン性ポリペプチドおよびリガンドを組み込んだポリマーなど）、正電荷ポリペプチド、ＰｏｌｙＴｒａｎ溶液（ＨＫポリマーおよび多糖類（例えば、天然の多糖類、スクレログルカン（ｓｃｌｅｒｏｇｌｕｃａｎ）としても知られる）の生理食塩水溶液または水溶液）、ＴａｒｇｅＴｒａｎ（ターゲティングリガンドを含む結合体化されたＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＥＩポリマーから構成されるナノ粒子の生理食塩水または水性懸濁液）、界面活性剤（Ｉｎｆａｓｕｒｆ；Ｆｏｒｅｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．；ＯＮＹ Ｉｎｃ．）およびカチオン性ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン）。Ｉｎｆａｓｕｒｆ（登録商標）（カルファクタント）は、気管内点滴注入において使用するための、仔ウシの肺から単離した天然の肺サーファクタントである；これは、リン脂質、中性脂質および疎水性サーファクタントが会合したプロテインＢおよびプロテインＣを含む。
【００６３】
このポリマーは、単一の寸法または複数の寸法のいずれかであり得、そしてまた、２０ミクロン未満、２０ミクロンと１００ミクロンとの間、または１００ミクロンを上回る直系を有するマイクロ粒子またはナノ粒子であり得る。上記ポリマーは、特定の組織または細胞のレセプターまたは分子に特異的なリガンド分子を有し得、したがって、ｓｉＲＮＡの標的化された送達のために使用され得る。ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドはまた、カチオン性リポソームベースのキャリア（例えば、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＡＰ／コレステロール（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．））および他の型の脂質水溶液によって送達される。さらに、低濃度（５〜１０％）のグルコース水溶液およびＩｎｆａｓｕｒｆは、ｓｉＲＮＡの気道送達のための有効なキャリアである（Ｌｉ Ｂ．Ｊ．ら、２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１１，９４４−９５１）。
【００６４】
さらに、キャリアとしては、Ｈｙｐｅｒ Ｏｓｍｏｌａｒ Ｃｉｔｒａｔｅ溶液（５６０ｍＯｓｍ／ｋｇの塩酸メグルミン溶液、５６０ｍＯｓｍ／ｋｇのメグルミンイオキサグレート、および６００ｍＯｓｍ／ｋｇのナトリウムイオキサグレートなど）が挙げられ得る。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ溶液は、心臓、腎臓、肺および肝臓の保存を増強および延長する能力を有する。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ溶液は、膵島を単離する予定のヒトドナー膵臓の冷蔵保存および運搬に広く受け入れられる。
【００６５】
組成物はさらに、ポリマー性キャリアを含み得る。ポリマー性キャリアは、ＲＮＡ分子に結合するカチオン性ポリマーを含み得る。カチオン性ポリマーは、例えば、ヒスチジン残基およびリジン残基を含むアミノ酸コポリマーであり得る。ポリマーは、分枝ポリマーを含み得る。
【００６６】
組成物は、標的化された合成ベクターを含み得る。合成ベクターは、カチオン性ポリマー、親水性ポリマーおよびターゲティングリガンドを含み得る。ポリマーはポリエチレンイミンを含み得、親水性ポリマーはポリエチレングリコールまたはポリアセタールを含み得、そして、ターゲティングリガンドは、ＲＧＤ配列を含むペプチドを含み得る。
【００６７】
ｓｉＲＮＡ／キャリアは、非特異的な様式の保存溶液もしくは灌流媒体のいずれかで、または、標的化された送達系の全身循環により、処方され得る。
【００６８】
（固形腫瘍および細胞の移植の改善）
本発明は、ＲＮＡ干渉（ｓｉＲＮＡ）を導入することで、標的遺伝子の発現をサイレンシングまたはダウンレギュレートすることによって、固形臓器移植における同種移植片拒絶反応および虚血／再潅流傷害を防止するための方法を提供する。本発明の方法において、ｓｉＲＮＡは、臓器保存溶液の形態で、すなわち、ドナーからの摘出後、かつ、レシピエントへと運搬される間に、移植が意図される臓器に対して適用される。移植される臓器、組織および／または細胞のドナーまたはレシピエントは、哺乳動物であり得、これには、ヒト、非ヒト哺乳動物、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ブタ、イヌ、ウシおよびウマが含まれるがこれらに限定されない。移植が予定される臓器は、１つのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド、または、複数のｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドをカクテルとして含む臓器保存溶液によって維持される。ｓｉＲＮＡは、ドナーの臓器および細胞に容易にかつ選択的に到達し得、有害である可能性のある副作用の減少を容易にする。
【００６９】
現在の実務において、ドナーの臓器は、細片を洗浄して除き、そして、運搬の間の損傷を少なくするために、静止状態または再循環系において、低体温条件（ヒトについては、３７℃未満（例えば、４℃））または正常体温条件（ヒトについては、３７℃）において、特別に処方された溶液（臓器保存溶液）において、洗浄（ｆｌｕｓｈｉｎｇ）および保存に供される。本発明の方法は、臓器保存の間のドナーの臓器および細胞のｓｉＲＮＡトランスフェクションを包含する。これは、魅力的な方法である。というのも、移植される予定の臓器に対してエキソビボで適用されたｓｉＲＮＡは、臓器のレシピエントに全身投与されず、そして、この処置は、炎症部位に対して特異的に送達され得るからである。この方法は、全身性の有害な作用なしに、移植片の不全を防止するために有用であり得る。
【００７０】
ｓｉＲＮＡトランスフェクション処方物は、固形のドナー臓器をインサイチュおよび／またはエキソビボで洗浄するため、そして、静止状態または機械式潅流による臓器保存のために使用される。処方された溶液は、固形臓器内への局所注射のため、そして、ｓｉＲＮＡ処方物中に固形臓器を浸すことによってこの固形臓器全体を漬けるための両方に有用である。
【００７１】
ｓｉＲＮＡ剤は、移植された臓器（組織）および細胞の処置のためのトランスフェクションキャリアを用いてか、または用いずに、単一または複数の遺伝子を標的とする、単一または複数のいずれかの二重鎖として使用され得る。トランスフェクション剤としては、合成ポリマー、リポソームおよび糖類などが挙げられるがこれらに限定されない。ｓｉＲＮＡ剤はまた、低分子インヒビターおよびモノクローナル抗体インヒビター、免疫も銃れーターおよび他の型のオリゴヌクレオチドのような他の薬剤と共に使用され得る。移植用の臓器にｓｉＲＮＡ／キャリア溶液を注射することおよび移植用の臓器をｓｉＲＮＡ／キャリア溶液に浸すことは、組織の損傷と宿主の拒絶反応を最小にし、それ故、臓器の機能および生存の観点での移植される臓器の成功と、同時の病的状態の最小化を高める。
【００７２】
また、本発明において、種々の臓器および細胞が、移植プロセスの間に、ｓｉＲＮＡ／キャリア処方物により処置され得る。あらゆる固形臓器移植は、本質的に、ドナーの外科的準備を必要とし、これは、身体、または、移植に使用される特定の臓器の洗浄性の灌流を含み得る。灌流は、１種以上の流体で行われ得る。臓器は、レシピエントへの運搬の間の保存のために摘出され、そして、臓器が、レシピエントへと外科的に移植される。本発明の方法において有用な臓器としては、腎臓、肝臓、心臓、膵臓、膵島、小腸、肺、角膜、四肢および皮膚、ならびに、これらの臓器の各々に対応する培養細胞が挙げられるがこれらに限定されない。一つの例である、肝細胞株は、単離された肝細胞の移植のための普遍的なドナーとして開発され始めており、これは、代謝性肝疾患の処置のための正常位での肝移植よりも侵襲性の少ない方法である。ＣＤ２８／Ｂ７またはＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌのような経路を介する同時刺激は、このような移植の成功のための主要な問題である（２）。したがって、ＣＤ２８またはＣＤ４０経路の両方をサイレンシングするためにｓｉＲＮＡ／キャリア処方物を用いることは、移植の成功率を改善するための良好な戦略である。
【００７３】
腎臓移植の失敗についての別の例は、固形臓器移植後のパルボウイルスＢ１９（ＰＶ−Ｂ１９）感染であり、これは、赤芽球ろう（ＰＲＣＡ）を引き起こし得る。免疫抑制された移植レシピエントにおけるＰＶ−Ｂ１９感染は、有意な病的状態を伴う（１）。ＰＶ−Ｂ１９または任意の他のウイルスの感染および複製を阻害するためにｓｉＲＮＡを用いることは、移植の初期段階の間に、ドナーの臓器および移植レシピエントの両方を処置することによって、腎臓移植を改善するための補助治療である。
【００７４】
この局面の別の局面において、本発明は、１以上のｓｉＲＮＡ二重鎖を含有する組成物を提供し、この組成物において、ｓｉＲＮＡは、同種移植片または異種移植片の拒絶反応または虚血／再潅流傷害に関与するいくつかの遺伝子を同時に標的とし得る。複数のｓｉＲＮＡ二重鎖の組み合わせは、同種移植片の拒絶反応または虚血／再潅流傷害の阻害により有効であり得る。
【００７５】
免疫調節プロセスは、本発明の方法を用いたｓｉＲＮＡサイレンシングのための過多の分子標的を提供する：例えば、（１）活性化に関連するリンパ球上の分子；（２）ＭＨＣクラスＩＩのようなリンパ球を刺激する抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の分子および同時刺激性の分子；（３）可溶性分子シグナル（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８のようなサイトカイン）；（４）血管細胞接着分子−１、細胞間接着分子−１のような、リンパ球の血管外遊出およびホーミングに関連する分子；ならびに（５）免疫のエフェクター分子（例えば、補体因子Ｃ３であるがこれに限定されない）。さらなる候補標的遺伝子としては、細胞間接着分子−１、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ、ＩＦＮ−γ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌが挙げられる。
【００７６】
本発明はまた、ｓｉＲＮＡオリゴカクテル（ｓｉＲＮＡ−ＯＣ）を本発明の方法に有用な治療剤、または、癌および炎症の処置のためのより強力な抗血管新生効率を達成するための治療剤として使用するための方法および組成物を提供する。このｓｉＲＮＡオリゴカクテルは、少なくとも３つのｍＲＮＡ標的を標的とする、少なくとも３つの二重鎖を含む。ｓｉＲＮＡオリゴカクテルは、表１〜１５に列挙されるｓｉＲＮＡ配列のいずれかを含み得る。一実施形態において、ｓｉＲＮＡオリゴカクテルは、補体Ｃ３、ＭＨＣ−ＩＩおよびＩＦＮγに対して特異的なｓｉＲＮＡを含む。本発明は、２つの重要な局面に基づく：第一に、ｓｉＲＮＡ二重鎖は、非常に強力な遺伝子発現インヒビターであり、そして、各ｓｉＲＮＡ分子は、同じ化学特性をもつ短い二本鎖ＲＮＡオリゴ（２１〜２３ｎｔ、または２４〜２５ｎｔ、または２６〜２９ｎｔ）から作製される；第二に、同種移植片または異種移植片の拒絶反応および虚血／再潅流傷害は、部分的に、内因性遺伝子の過剰発現に関連する。したがって、複数の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ−ＯＣを用いることは、ｓｉＲＮＡ二重鎖の化学的均一性と、複数の疾患または損傷を引き起こす遺伝子のダウンレギュレーションからの相乗作用とに起因して、有益な治療的アプローチを体現する。本発明は、ｓｉＲＮＡ−ＯＣは、少なくとも３つの遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖の組み合わせであり、種々の割合で、種々の物理的形状であり、そして、同時に同じ経路を介して、または、異なる経路および時間を介して疾患組織へと適用されるものと規定する。
【００７７】
ｓｉＲＮＡにより媒介されるサイレンシングは、１つのこのような遺伝子を標的とする単一のｓｉＲＮＡ、または、同じ遺伝子内のいくつかの標的配列を標的とするか、もしくは、この段落において同定されるもののような異なるカテゴリーに由来する種々の遺伝子を標的とする複数のｓｉＲＮＡの組み合わせのいずれかを用いて適用され得る。例えば、複数のｓｉＲＮＡ二重鎖を含む組成物は、各々が、同じまたは異なる割合で存在し得る。したがって、３つのｓｉＲＮＡ混合物において、二重鎖Ｉ、二重鎖ＩＩおよび二重鎖ＩＩＩは、非限定的な例として、各々が、総ｓｉＲＮＡ剤の各々の３３．３％（ｗ／ｗ）で存在し得るか、それぞれ、２０％、４５％および３５％で存在し得るかのいずれかである。
【００７８】
そうでないと規定されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。例示的な方法および材料が以下に記載されるが、本明細書に記載される方法および材料に類似するかまたはこれらと等価な方法および材料もまた、本発明の実施または試験において使用され得る。本明細書において言及されるあらゆる刊行物および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。矛盾する場合は、定義を含め、本明細書が支配する。多数の文献が本明細書において引用されているが、この引用は、これらの文献のいずれかが、当該分野の一般的な知識の一部を形成するという容認を構成するものではない。本明細書および特許請求の範囲の全体にわたり、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のようなバリエーションは、述べられる整数の包摂、または、整数群を意味すると理解されるが、任意の他の整数または整数群を除外するものとは理解されない。材料、方法および実施例は、例示に過ぎず、限定するものと意図されない。
【実施例】
【００７９】
（実施例１：インビトロにおけるｓｉＲＮＡ媒介性のＣ３発現のノックダウン）
ＲＮＡ干渉は、その配列の小さな独特のセグメントにしたがって、遺伝子発現をブロックする。この生来のプロセスは、特定の遺伝子の転写を減らすために利用され得る。転写において、ドナー由来の補体Ｃ３が、虚血／再潅流傷害（Ｉ／ＲＩ）において迅速にアップレギュレートされ、組織の損傷に寄与することが確立されている。補体Ｃ３は、種々の形態の傷害および免疫調節の局所的なメディエーターとして記載され、そして、同種異系免疫の調節においても十分に補助し得る、移植による虚血／再潅流傷害後の遺伝子ノックダウンについての有効な標的である。この研究は、ドナーの臓器においてＣ３遺伝子の発現をノックダウンするためにｓｉＲＮＡを利用することを試みた。
【００８０】
ラット腎臓上皮細胞株を、１０μｇ／ｍｌ ＩＬ−１および０．１μｇ／ｍｌ ＩＬ−６で刺激して、Ｃ３遺伝子の発現をアップレギュレートした。刺激から７２時間後、これらの細胞を、Ｃ３特異的ｓｉＲＮＡのパネルのうち１つでトランスフェクトした。
【００８１】
【表１６】
。
【００８２】
４８時間後、Ｃ３の発現を、リアルタイムＰＣＲにより決定した。結果は、Ｃ３の発現が、刺激後に、トランスフェクトしていない細胞においてアップレギュレートされたことを示した（図１）。ｓｉＲＮＡで処理した細胞は、ｓｉＲＮＡで処理していないコントロール細胞と比較して、Ｃ３の発現の６０％までの減少を示した。これらの実験は、ｓｉＲＮＡの潜在的なオフターゲット作用（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔ）である、ＩＦＮγのアップレギュレーションを非特異的に誘導しなかった、パネルからの最も効率的なＣ３ ｓｉＲＮＡを同定した（図１において、Ｃ３−３ ｓｉＲＮＡとラベルした）。
【００８３】
先の実験において得た候補のＣ３ ｓｉＲＮＡを、上記のようにＣ３を発現するように刺激したラット腎臓上皮細胞中にトランスフェクトした。このＣ３特異的なｓｉＲＮＡの濃度の範囲は、リアルタイムＰＣＲにより測定したとき、有意な（Ｐ＜０．０５）Ｃ３ ｍＲＮＡのノックダウンをもたらした（図２）。この実験は、インビボ試験について同定されたＣ３ ｓｉＲＮＡ配列の技術的な実現可能性および有効性を実証する。
【００８４】
（実施例２：インビボにおけるｓｉＲＮＡ媒介性のＣ３発現のノックダウン）
先の実施例において決定した最も効率的なＣ３ ｓｉＲＮＡを、次いで、インビボｓｉＲＮＡトランスフェクションを容易にする、合成ポリカチオン性ナノ粒子内にパッケージングした。このナノ粒子は、ＰｏｌｙＴｒａｎから構成され、このＰｏｌｙＴｒａｎは、分枝ヒスチジン（Ｈ）およびリジン（Ｋ）ポリマーのファミリーで、インビトロ、インビボおよびエキソビボでのｓｉＲＮＡの移送に有効である。これらのコア配列は以下の通りである：Ｒ−ＫＲ−ＫＲ−ＫＲ、ここで、Ｒ＝［ＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ］２ＫＨ４ＮＨ４である。インビボ実験について、最初に、以下の分枝ＨＫポリマーを、同種移植片細胞内へとｓｉＲＮＡを送達する効率について調べた：Ｈ３Ｋ４ｂ。この分枝ポリマーは、Ｒ分枝が異なることを除いて、上記のものと同じコアおよび構造を有する：Ｒ＝ＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫ。このポリマーは、異なる核酸形態についてのそのインビトロまたはインビボでの効率に基づいて選択した。分枝ＨＫポリマーを、水溶液中に溶解し、次いで、列挙した質量比でｓｉＲＮＡ水溶液と混合し、直径１５０〜２００ｎｍの平均サイズのナノ粒子を形成した。ＨＫＰ−ｓｉＲＮＡ水溶液は、沈殿物の目立った凝集もなく、半透明であった。これらの溶液は、少なくとも３ヶ月間、４℃に保存可能である。
【００８５】
このナノ粒子を、Ｈｙｐｅｒ Ｏｓｍｏｌａｒ Ｃｉｔｒａｔｅ灌流液に加え、そして、ドナーのラット腎臓に投与した。４時間の低温虚血の後、この腎臓を、同系の宿主へと移植した。２日後、この腎臓を摘出し、そして、リアルタイムＰＣＲによりＣ３遺伝子の発現を決定した。移植していない非処理の腎臓をネガティブコントロールとして用い（図３においてＮＫＣとラベルした）、一方、灌流し、移植したが、ｓｉＲＮＡで処理していない腎臓を、ポジティブコントロールとして用いた（図３においてＩＳＣＨとラベルした）。ｓｉＲＮＡ処理した腎臓におけるレベルを、移植していない非処理の腎臓におけるｍＲＮＡレベルに対して正規化した。結果を図３に示す。
【００８６】
結果は、Ｃ３−ｓｉＲＮＡが、移植後のＣ３遺伝子発現を、非処理の移植物と比較して６２．５６％（Ｐ＜０．０５、ｎ＝４）低下させ、これは、正常な腎臓において検出されるレベルより低かったことを示す。ＦＩＴＣ標識スクランブルｓｉＲＮＡコントロールに対して比較すると、Ｃ３遺伝子の発現は、７３．３４％減少した（Ｐ＜０．０５、ｎ＝４）。ＦＩＴＣ標識スクランブルｓｉＲＮＡコントロールは、非処理の腎臓を上回るＣ３遺伝子発現のアップレギュレーションを示し、これは、オフターゲット作用を示唆するものであった。組織学は、移植前にＣ３ ｓｉ ＲＮＡで処理した腎臓における虚血／再潅流傷害（Ｉ／ＲＩ）からの異化抑制（ｓｐａｒｉｎｇ）を示した（図４）が、ＦＩＴＣ標識スクランブルｓｉＲＮＡを用いた、灌流した細胞および組織の直接蛍光顕微鏡法は、組織における検出可能なｓｉＲＮＡを含まなかった。
【００８７】
まとめると、Ｃ３遺伝子発現のｓｉＲＮＡによる阻害は、コントロールと比較して、局所的なＣ３の活性を効率的に減少した。ナノ粒子の戦略は、効率的なｓｉＲＮＡ送達の問題を克服するようである。ここで、従来の免疫抑制または寛容導入に対する補助療法として、特異的なｓｉＲＮＡのアレイを開発して、ドナー臓器における炎症促進性遺伝子の発現を減少させることが可能であるようである。
【００８８】
（実施例３：ファージディスプレイによる、移植された腎臓において濃縮されたペプチド配列の決定）
ｓｉＲＮＡ含有ナノ粒子に臓器標的特異性を与えるために、目的の臓器において濃縮されるペプチドを、ファージディスプレイにより同定し得る。この方法を用いて、上記の腎臓移植のラットモデルにおいて、候補の標的ペプチドを同定した。ドナーの腎臓を、Ｈｙｐｅｒ Ｏｓｍｏｌａｒ Ｃｉｔｒａｔｅで灌流し、そして、同系宿主への移植前に、４℃にて４時間保存した。４８時間後、レシピエントに麻酔をかけ、そして、調製したシステイン拘束した７マーのファージライブラリー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を尾静脈から注射した。５分後、移植した腎臓を摘出し、そして、「インビボ生体パニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）」の最初のラウンドにおいて、この腎臓からファージを抽出した。この抽出したファージを、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌において増殖させ、その後、別の腎臓移植レシピエントに注射した。この生体パニングを、合計３ラウンド繰り返した。各ラウンド後、ファージのサンプルを採って、移植した腎臓中に存在する数を見積もった。各増殖の後、ファージが単離され得、そして、発現されたライブラリーペプチドのＤＮＡ配列が決定され得るように、ファージのサンプルを、寒天プレート上の細菌コロニー内で増大させた。図５（下パネル）は、コントロールのターゲティングストレプトアビジン（Ｒ３ｖｓＳｔｒｅｐ）と比較したときの、生体パニングの各ラウンド後に移植した腎臓から回収したファージ（ランダムファージ）の数の増大を示す。腎臓において濃縮された、同定されたペプチド配列の例は、Ｃ−ＬＰＳＰＫＲＴ−Ｃ、Ｃ−ＬＰＳＰＫＫＴ−Ｃ、Ｃ−ＰＴＳＶＰＫＴ−Ｃである。３ラウンドの生体パニングの後、移植された腎臓においてファージが濃縮され、そして、このファージは、レシピエントの他の臓器においてもかなり少ない数が見られる（図５、下パネル）。この候補ペプチドは、移植された臓器に対するｓｉＲＮＡターゲティングに特異性を与えるために、ＴｒａｇｅＴｒａｎナノ粒子内へと組み込まれ得る。
【００８９】
（文献）
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４．Ｏｌｉｖｅｉｒａ ＪＧ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｆｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｙ ａｃｕｔｅ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｓ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ ｍｏｆｅｔｉｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｔｒａｎｓｐｌ Ｉｎｔ．２００５ Ｎｏｖ；１８（１１）：１２８６−９１
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７．Ｌｕ，Ｐ．Ｙ．ｅｔ ａｌ（２００２）Ｔｕｍｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｂｙ ＲＮＡｉ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ＶＥＧＦ ａｎｄ ＶＥＧＦＲ２ ｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．１０（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ））Ｓ４
８．Ｋｉｍ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｏｃｕｌａｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｓｉＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｐａｔｈｗａｙ ｇｅｎｅｓ；ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｈｅｒｐｅｔｉｃ ｓｔｒｏｍａｌ ｋｅｒａｔｉｔｉｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６５（６）：２１７７−８５
９．Ｌｕ，Ｐ．Ｙ．ａｎｄ Ｍ．Ｗｏｏｄｌｅ（２００５）Ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ ｓｉＲＮＡ ｉｎ ｖｉｖｏ Ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｃａｎ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｉｎ ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．Ｐ ３０３−３１７
１０．Ｌｕ，Ｐ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈ ｓｉＲＮＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｏｒ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１１（３），１０４−１３。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】図１は、ラット腎臓細胞におけるＣ３ ｍＲＮＡの相対的な発現を示す棒グラフである。これらの細胞を、ＩＬ−１およびＩＬ−６で刺激して、Ｃ３発現を増加させた。３つの候補Ｃ３ ｓｉＲＮＡ配列（Ｃ３−１、Ｃ３−２、Ｃ３−３）、または、ＦＩＴＣ標識スクランブルｓｉＲＮＡを、種々の濃度にてこの細胞にトランスフェクトした。細胞の一方のセットは、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅありかつｓｉＲＮＡなしで処理し（＋ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、一方、もう一方のセットは、Ｃ３を生成するよう刺激し、そして、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅもｓｉＲＮＡもなしで処理した（−ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）。トランスフェクションから４８時間後に、細胞におけるＣ３ ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲにより測定した。点線は、非刺激の細胞のＣ３発現を示す。この実験は、ｓｉＲＮＡによる遺伝子ノックダウンの実現可能性および有効性を示した。Ｃ３−３ ｓｉＲＮＡを候補として選択し、さらなる実験において使用した。
【図２】図２は、ＩＬ−１およびＩＬ−６で刺激してＣ３発現を増加させたラット腎臓細胞におけるＣ３ ｍＲＮＡの相対的な発現を示す棒グラフである。これらの細胞もまた、種々の濃度のＣ３−３候補配列でトランスフェクトした。刺激から４８時間後のＣ３ ｍＲＮＡ発現についてのリアルタイムＰＣＲは、このｓｉＲＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡなしで処理した刺激細胞と比較して、Ｃ３発現の減少をもたらすことを示した。測定は、非刺激の細胞におけるＣ３ ｍＲＮＡ発現（点線）に対して正規化した。
【図３】図３は、移植したラット腎臓におけるＣ３ ｍＲＮＡレベルの相対的な発現を示す棒グラフである。腎臓を、移植前に、処理しなかったか、あるいは、種々の量の、スクランブルｓｉＲＮＡ、またはＣ３特異的なｓｉＲＮＡを含むナノ粒子で処理した。各データ点は、４つの別々の腎臓からのデータを含み、そして、各ＰＣＲ反応を、３連で行った。これらの実験条件におけるＣ３ ｍＲＮＡレベルを、正常な移植していない腎臓（ＮＫＣ、正常腎臓コントロール）、およびｓｉＲＮＡで処理していない移植した腎臓（ＩＳＣＨ、虚血性コントロール）におけるＣ３ ｍＲＮＡレベルと比較した。この図面は、Ｃ３ ｍＲＮＡレベルが、正常な移植していない腎臓、およびＣ３特異的なｓｉＲＮＡで処理していない移植した腎臓におけるＣ３ ｍＲＮＡレベルと比較して、移植前にＣ３特異的なｓｉＲＮＡで処理した腎臓においてより低いことを示す。Ｃ３特異的なｓｉＲＮＡを、種々の割合のＰｏｌｙＴｒａｎでパッケージングし、図１において以下のようにラベルした：Ｃ３、１：４．５でＰｏｌｙＴｒａｎ中に存在する１０μｇのＣ３ ｓｉＲＮＡ；Ｃ３ ｎａｋｅｄ、ＰｏｌｙＴｒａｎなしで、１０μｇのＣ３ ｓｉＲＮＡ；Ｃ３ ３：１、１：３でＰｏｌｙＴｒａｎ中に存在する１０μｇのＣ３ ｓｉＲＮＡ；Ｃ３ １．５：１、１：１．５でＰｏｌｙＴｒａｎ中に存在する１０μｇのＣ３ ｓｉＲＮＡ。ｓｉＲＮＡの特異性についての要件を調べるために、２セットの腎臓を、移植前に、スクランブルｓｉＲＮＡで処理した：ＦＩＴＣ、１０μｇのＦＩＴＣ標識スクランブルｓｉＲＮＡ；ＳＣＲＡＭ ＣＯＮ、１０μｇの非標識スクランブルｓｉＲＮＡ。
【図４】図４は、移植したラット腎臓の組織学的解析を示す２つのパネルのセットである。上側のパネルは、移植から４８時間後の非処理腎臓を示す。組織病理学は、急性の尿細管壊死（ＡＴＮ）の兆候である、広範囲に及ぶ尿細管の減衰と尿細管の拡大とを示す。この特定の病理学は、移植後の移植された組織の初期の機能不全（ｎｏｎ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ）に関連する。下パネルは、移植から４８時間後の、Ｃ３ ｓｉＲＮＡ（ＰｏｌｙＴｒａｎと１：４．５の比で存在）で前処理した腎臓を示す。この腎臓の組織病理学は、より少ない量のＡＴＮを示す。
【図５】図５は、ｓｉＲＮＡ含有ナノ粒子を特定の臓器へと標的化させるために使用され得る短いペプチドを同定するように機能する実験の結果を表す、２つの棒グラフを示す。ファージディスプレイを用いて、移植された腎臓において濃縮される候補ペプチドを同定した。図５の上パネルは、１つの実験についての代表的なデータを示し、３ラウンドのファージライブラリーの注射、回収および増大の後に、腎臓から回収したファージの濃度（組織１グラムあたりのプラーク形成単位で表示）が増加している。コントロール実験においては、ストレプトアビジン（Ｒ３ｖｓＳｔｒｅｐ）をファージ結合のための標的として用いた。図５の下パネルは、レシピエントの移植した腎臓（Ｔｘ腎臓）、正常腎臓（Ｎ腎臓）、膵臓、心臓および肺における３ラウンドの生体パニングの後に回収したファージの数を示す。このデータは、他の臓器から回収したファージの数と比較して、移植された腎臓内へのファージのホーミングにおける選択性を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体に移植される臓器の細胞中に存在する免疫調節遺伝子または免疫エフェクター遺伝子を標的とする、ターゲティングポリヌクレオチド。
【請求項２】
一本鎖の直鎖状ポリヌクレオチド、二本鎖の直鎖状ポリヌクレオチド、または、ヘアピンポリヌクレオチドである、請求項１に記載のターゲティングポリヌクレオチド。
【請求項３】
表１〜１５に開示される配列から選択される配列を標的とする第一のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のターゲティングポリヌクレオチド。
【請求項４】
移植された臓器の、該臓器のレシピエントによる拒絶反応を抑制する方法であって、該方法は、該臓器を該レシピエントに移植する前に、該臓器を、請求項１に記載のターゲティングポリヌクレオチドを含有する組成物と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項５】
前記組成物が、請求項２に記載のターゲティングポリヌクレオチドを含有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記組成物が、請求項３に記載のターゲティングポリヌクレオチドを含有する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記接触させる工程が、前記臓器に前記組成物を灌流させる工程を包含する、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記接触させる工程が、前記臓器を前記組成物中に漬けるか、または、浸す工程を包含する、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物が、複数の請求項１に記載のターゲティングポリヌクレオチドを含有する、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記接触させる工程が、被験体への移植前の臓器保管の間に、前記免疫調節標的遺伝子または免疫エフェクター標的遺伝子をダウンレギュレートするのに有効である、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドが、前記臓器の細胞内の前記標的遺伝子の発現を阻害する、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記臓器がドナーの臓器である、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
前記臓器が腎臓である、請求項４に記載の方法。
【請求項１４】
前記臓器が肝臓である、請求項４に記載の方法。
【請求項１５】
前記移植される臓器が肺である、請求項４に記載の方法。
【請求項１６】
前記臓器が膵臓である、請求項４に記載の方法。
【請求項１７】
前記臓器が心臓である、請求項４に記載の方法。
【請求項１８】
前記臓器が小腸である、請求項４に記載の方法。
【請求項１９】
前記臓器が角膜である、請求項４に記載の方法。
【請求項２０】
前記臓器が、上皮細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞（心臓）、および移植時に該臓器中に存在するパッセンジャー白血球からなる群より選択される細胞を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項２１】
前記レシピエントがヒトである、請求項４に記載の方法。
【請求項２２】
前記ターゲティングポリヌクレオチドが、表１に列挙される配列から選択されるＣ３（補体Ｃ３）配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項２３】
前記ターゲティングポリヌクレオチドが、表２に列挙される配列から選択されるＩＣＡＭ１（細胞間接着分子−１）配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項２４】
前記ターゲティングポリヌクレオチドが、表３に列挙される配列から選択されるＶＣＡＭ−１（血管細胞接着分子−１）配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項２５】
前記ターゲティングポリヌクレオチドが、表４に列挙される配列から選択されるＩＦＮ−γ（インターフェロンガンマ）配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項２６】
前記ターゲティングポリヌクレオチドが、表５に列挙される配列から選択されるＩＬ−１（インターロイキン−１）配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項２７】
前記ターゲティングポリヌクレオチドが、表６に列挙される配列から選択されるＩＬ−６（インターロイキン−６）配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ターゲティングポリヌクレオチドが、表７に列挙される配列から選択されるＩＬ−８（インターロイキン−８）配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ターゲティングポリヌクレオチドが、表８に列挙される配列から選択されるＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子−アルファ）配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項３０】
前記ターゲティングポリヌクレオチドが、表９に列挙される配列から選択されるＣＤ８０配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項３１】
前記ターゲティングポリヌクレオチドが、表１０に列挙される配列から選択されるＣＤ８６配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項３２】
前記ターゲティングポリヌクレオチドが、表１１に列挙される配列から選択されるＭＨＣ−ＩＩ（主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ）配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項３３】
前記ターゲティングポリヌクレオチドが、表１２に列挙される配列から選択されるＭＨＣ−Ｉ（主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ）配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項３４】
前記ターゲティングポリヌクレオチドが、表１３に列挙される配列から選択されるＣＤ２８配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項３５】
前記ターゲティングポリヌクレオチドが、表１４に列挙される配列から選択されるＣＴＬＡ−４配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項３６】
前記ターゲティングポリヌクレオチドが、表１５に列挙される配列から選択されるＰＶ−Ｂ１９配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項３７】
前記組成物がさらに灌流液を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項３８】
前記組成物がさらにＰｏｌｙＴｒａｎポリマー溶液を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項３９】
前記組成物がさらにＴａｒｇｅＴｒａｎナノ粒子溶液を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項４０】
前記灌流液が、Ｈｙｐｅｒ Ｏｓｍｏｌａｒ Ｃｉｔｒａｔｅ溶液またはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ溶液である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記ターゲティングポリヌクレオチドが、１以上の遺伝子配列に対する１以上のｓｉＲＮＡ二重鎖を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項４２】
前記ターゲティングポリヌクレオチドが、低分子薬物、モノクローナル抗体薬物、または他の免疫調節因子と組み合わせて使用される、請求項４に記載の方法。
【請求項４３】
前記組成物が複数のターゲティングポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドが、複数の遺伝子配列を標的とする、請求項４に記載の方法。
【請求項４４】
前記ターゲティングポリヌクレオチドが、Ｃ３遺伝子配列、ＴＮＦ−α遺伝子配列およびＩＬ−８遺伝子配列を標的とするカクテルである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記組成物がさらに前記臓器のレシピエントに投与される、請求項４に記載の方法。
【請求項１】
被験体に移植される臓器の細胞中に存在する免疫調節遺伝子または免疫エフェクター遺伝子を標的とする、ターゲティングポリヌクレオチド。
【請求項２】
一本鎖の直鎖状ポリヌクレオチド、二本鎖の直鎖状ポリヌクレオチド、または、ヘアピンポリヌクレオチドである、請求項１に記載のターゲティングポリヌクレオチド。
【請求項３】
表１〜１５に開示される配列から選択される配列を標的とする第一のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のターゲティングポリヌクレオチド。
【請求項４】
移植された臓器の、該臓器のレシピエントによる拒絶反応を抑制する方法であって、該方法は、該臓器を該レシピエントに移植する前に、該臓器を、請求項１に記載のターゲティングポリヌクレオチドを含有する組成物と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項５】
前記組成物が、請求項２に記載のターゲティングポリヌクレオチドを含有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記組成物が、請求項３に記載のターゲティングポリヌクレオチドを含有する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記接触させる工程が、前記臓器に前記組成物を灌流させる工程を包含する、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記接触させる工程が、前記臓器を前記組成物中に漬けるか、または、浸す工程を包含する、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物が、複数の請求項１に記載のターゲティングポリヌクレオチドを含有する、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記接触させる工程が、被験体への移植前の臓器保管の間に、前記免疫調節標的遺伝子または免疫エフェクター標的遺伝子をダウンレギュレートするのに有効である、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドが、前記臓器の細胞内の前記標的遺伝子の発現を阻害する、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記臓器がドナーの臓器である、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
前記臓器が腎臓である、請求項４に記載の方法。
【請求項１４】
前記臓器が肝臓である、請求項４に記載の方法。
【請求項１５】
前記移植される臓器が肺である、請求項４に記載の方法。
【請求項１６】
前記臓器が膵臓である、請求項４に記載の方法。
【請求項１７】
前記臓器が心臓である、請求項４に記載の方法。
【請求項１８】
前記臓器が小腸である、請求項４に記載の方法。
【請求項１９】
前記臓器が角膜である、請求項４に記載の方法。
【請求項２０】
前記臓器が、上皮細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞（心臓）、および移植時に該臓器中に存在するパッセンジャー白血球からなる群より選択される細胞を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項２１】
前記レシピエントがヒトである、請求項４に記載の方法。
【請求項２２】
前記ターゲティングポリヌクレオチドが、表１に列挙される配列から選択されるＣ３（補体Ｃ３）配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項２３】
前記ターゲティングポリヌクレオチドが、表２に列挙される配列から選択されるＩＣＡＭ１（細胞間接着分子−１）配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項２４】
前記ターゲティングポリヌクレオチドが、表３に列挙される配列から選択されるＶＣＡＭ−１（血管細胞接着分子−１）配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項２５】
前記ターゲティングポリヌクレオチドが、表４に列挙される配列から選択されるＩＦＮ−γ（インターフェロンガンマ）配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項２６】
前記ターゲティングポリヌクレオチドが、表５に列挙される配列から選択されるＩＬ−１（インターロイキン−１）配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項２７】
前記ターゲティングポリヌクレオチドが、表６に列挙される配列から選択されるＩＬ−６（インターロイキン−６）配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ターゲティングポリヌクレオチドが、表７に列挙される配列から選択されるＩＬ−８（インターロイキン−８）配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ターゲティングポリヌクレオチドが、表８に列挙される配列から選択されるＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子−アルファ）配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項３０】
前記ターゲティングポリヌクレオチドが、表９に列挙される配列から選択されるＣＤ８０配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項３１】
前記ターゲティングポリヌクレオチドが、表１０に列挙される配列から選択されるＣＤ８６配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項３２】
前記ターゲティングポリヌクレオチドが、表１１に列挙される配列から選択されるＭＨＣ−ＩＩ（主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ）配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項３３】
前記ターゲティングポリヌクレオチドが、表１２に列挙される配列から選択されるＭＨＣ−Ｉ（主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ）配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項３４】
前記ターゲティングポリヌクレオチドが、表１３に列挙される配列から選択されるＣＤ２８配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項３５】
前記ターゲティングポリヌクレオチドが、表１４に列挙される配列から選択されるＣＴＬＡ−４配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項３６】
前記ターゲティングポリヌクレオチドが、表１５に列挙される配列から選択されるＰＶ−Ｂ１９配列を標的とする、請求項６に記載の方法。
【請求項３７】
前記組成物がさらに灌流液を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項３８】
前記組成物がさらにＰｏｌｙＴｒａｎポリマー溶液を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項３９】
前記組成物がさらにＴａｒｇｅＴｒａｎナノ粒子溶液を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項４０】
前記灌流液が、Ｈｙｐｅｒ Ｏｓｍｏｌａｒ Ｃｉｔｒａｔｅ溶液またはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ溶液である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記ターゲティングポリヌクレオチドが、１以上の遺伝子配列に対する１以上のｓｉＲＮＡ二重鎖を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項４２】
前記ターゲティングポリヌクレオチドが、低分子薬物、モノクローナル抗体薬物、または他の免疫調節因子と組み合わせて使用される、請求項４に記載の方法。
【請求項４３】
前記組成物が複数のターゲティングポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドが、複数の遺伝子配列を標的とする、請求項４に記載の方法。
【請求項４４】
前記ターゲティングポリヌクレオチドが、Ｃ３遺伝子配列、ＴＮＦ−α遺伝子配列およびＩＬ−８遺伝子配列を標的とするカクテルである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記組成物がさらに前記臓器のレシピエントに投与される、請求項４に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００９−５１８００８（Ｐ２００９−５１８００８Ａ）
【公表日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４３４７６（Ｐ２００８−５４３４７６）
【出願日】平成１８年１１月３０日（２００６．１１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４５９３３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６４８４６
【国際公開日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【出願人】（５０７３３８５３０）イントラディグム コーポレイション (2)
【出願人】（５０８１６０３４７）ユニバーシティー オブ リーズ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月３０日（２００６．１１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４５９３３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６４８４６
【国際公開日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【出願人】（５０７３３８５３０）イントラディグム コーポレイション (2)
【出願人】（５０８１６０３４７）ユニバーシティー オブ リーズ (1)
【Ｆターム（参考）】
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