遺伝子発現マーカーを使用する、化学療法に対する反応の予測
本発明は、癌患者が化学療法での治療反応に対して有益な反応を有する可能性が高いかどうかを予測するために有用な遺伝子発現情報を提供する。一態様では、本発明は、癌と診断された被験体の化学療法に対する有益な反応の尤度を予測する方法を提供する。被験体は哺乳類、例えば、霊長類、例えば、ヒト患者であることが好ましい。特定の実施形態では、変数（ｉ）〜（ｖ）に含まれるすべての遺伝子またはそれらの発現産物の発現レベルを、１種以上の参照遺伝子またはそれらの発現産物の発現レベルに対して正規化する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、癌患者が化学療法での治療反応に対して有益な反応を有する可能性が高いかどうかを予測するために有用な遺伝子発現情報を提供する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の説明
遺伝子発現研究
癌専門医には、彼らが利用できるいくつかの治療選択肢、例えば、「標準治療」と位置づけられる、化学療法薬の種々の組み合わせ、および個々の癌の治療のための表示事項はないが、その癌における有効性の証拠があるいくつかの薬物がある。良好な治療成果の最良の尤度を得るには、転移性疾患の最高の危険にある患者を同定し、最適な利用可能な癌治療を与えることが必要である。詳しくは、「標準治療」治療薬、例えば、シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、アントラサイクリン、タキサンおよび抗エストロゲン薬、例えば、タモキシフェンに対する患者の反応の尤度を調べることが重要であるが、これは、これらには限定された有効性しかなく、重篤な副作用の範囲を有することも多いからである。したがって、利用可能な薬物を必要とし、これに対して反応する可能性が最も高い、または最も低い患者を同定することにより、より賢明な患者選択によって、これらの薬物が提供しなくてはならない正味の有効性を増大させ、正味の死亡率および毒性を低減することができる。
【０００３】
現在、臨床診療において用いられる診断学的検査は、単一分析物であり、したがって、多くの異なるマーカー間の関係を知るという潜在的価値を獲得するものではない。さらに、診断学的検査は、定量的でない免疫組織化学に基づいたものであることが多い。主に解釈が主観的であるために、免疫組織化学からは、異なる実験室では異なる結果が生じることも多い。ＲＮＡベースの試験は高度に定量的である可能性があるが、ＲＮＡは、ごく普通に調製された、すなわち、ホルマリンで固定され、パラフィンに包埋された（ＦＰＥ）腫瘍試料では破壊されるという認識のために、また、分析のために患者から新鮮組織サンプルを得、保存することは不都合であるために開発されていない。
【０００４】
過去２０年間にわたって、分子生物学および生化学は、その活性が腫瘍細胞の挙動、分化状態および特定の治療薬に対する感受性または耐性に影響を及ぼす何百もの遺伝子を明らかにしてきた。しかし、若干の例外はあるが、これらの遺伝子の状態は、薬物治療に関する臨床決定を日常的に行うことを目的として活用されてこなかった。過去数年の間に、いくつかのグループが、何千もの遺伝子のマイクロアレイ遺伝子発現解析による種々の癌の種類の分類に関する研究を公開した（例えば、Ｇｏｌｕｂ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：５３１−５３７ （１９９９）、Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊａｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９８：１３７９０−１３７９５ （２００１）、Ｃｈｅｎ−Ｈｓｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １７ （Ｓｕｐｐｌ． １）：Ｓ３１６−Ｓ３２２ （２００１）、Ｒａｍａｓｗａｍｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． ＳｃＬ ＵＳＡ ９８：１５１４９−１５１５４ （２００１）、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６０：２２３２−２２３８ （２０００）、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９８：１１４６２−１１４ （２００１）、Ｓｏｒｌｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９８：１０８６９−１０８７４ （２００１）、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６１：８３７５−８３８０ （２００１））参照のこと）。しかし、主に、マイクロアレイが新鮮または凍結組織ＲＮＡを必要とし、そのような試料は、同定される分子署名の臨床評価を可能にするほど十分な量で存在しないという理由で、これらの研究はまだ、臨床診療において日常的に用いられる試験を生み出していない。
【０００５】
過去３年において、ＲＴ−ＰＣＲ技術を用いてホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＰＥ）組織において数百の遺伝子の遺伝子発現をプロファイリングすることが可能となった。感度が高く、正確で、再現性のある方法が記載された（非特許文献１）。何千もの保管されているＦＰＥ臨床組織試料が、関連する臨床記録、例えば、生存、薬物治療暦などとともに存在するので、今や、この種の組織において遺伝子発現を定量的にアッセイする能力によって、特定の遺伝子の発現を、患者の予後および治療に対する反応の尤度と関連付ける迅速な臨床研究が可能となる。臨床事象は歴史的であるので、過去の臨床研究によって作成されたデータを用いて、迅速な結果が可能となる。対照的に、例えば、新しく補充された癌患者に関する生存研究を実施することを望む場合には、通常、統計的に十分な数の死亡が起こる間何年も待つ必要がある。
【０００６】
乳癌
乳癌は、米国では女性の間で最も一般的な種類の癌であり、４０〜５９歳の女性の間では癌による死亡の主要原因である。
【０００７】
現在、乳癌ではいくつかの分子的試験しか日常的に臨床使用されていない。エストロゲン受容体（ＥＳＲ１）およびプロゲステロン受容体（ＰＧＲ）タンパク質の免疫組織化学的アッセイが、抗エストロゲン剤、例えば、タモキシフェン（ＴＡＭ）を用いる治療に対する患者の選択の根拠として用いられている。さらに、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２）免疫化学または蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（それぞれ、タンパク質およびＤＮＡを測定する）が、Ｈｅｒ２アンタゴニスト剤、例えば、トラスツズマブ（ヘルセプチン（登録商標）；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ）を用いる患者を選択するために用いられている。
【０００８】
現在の予後診断のための試験および化学療法に対する反応を予測するための試験が不十分であるために、乳癌治療戦略が癌専門医の間で異なる（Ｓｃｈｏｔｔ ａｎｄ Ｈａｙｅｓ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ＰＭＩＤ １５５０５２７４ （２００４）；非特許文献２）。一般に、腫瘍がＥＳＲ１陽性であるとわかっているリンパ節陰性の患者は、ＴＡＭなどの抗エストロゲン剤で治療され、腫瘍がＥＳＲ１陰性であるとわかっている患者は化学療法で治療される。ＥＳＲ１陽性はまた、癌再発のリスクをやや弱めるために化学療法の毒性副作用を受け入れて、抗エストロゲン療法に加えて化学療法も処方されることが多い。毒性としては、神経障害、悪心およびその他の胃腸症状、脱毛および認知障害が挙げられる。再発性乳癌は、通常、転移性であり、治療に対する反応性が悪いために再発は恐れられるべきものである。再発のリスクがかなりある患者を同定する（すなわち、予後情報を提供する）必要性および化学療法に対して反応する可能性が高い患者を同定する（すなわち、予測情報を提供する）必要性が存在することは明確である。同様に、再発のリスクがあまり高くない患者を同定する必要性または化学療法に対して反応する可能性が低い患者を同定する必要性も存在するが、これは、これらの患者がこれらの毒性薬物に対する不必要な曝露を免れるべきであるからである。
【０００９】
乳癌では、予後因子は治療予測因子とは異なる。予後因子とは、乳癌の自然史に関連している可変のものであり、乳癌にかかった患者の再発率および転帰に影響を及ぼす。悪い予後と関連していた臨床パラメーターとしては、例えば、リンパ節の関与、腫瘍の大きさの増大および高いグレードの腫瘍が挙げられる。予後因子は患者をベースライン再発リスクが異なるサブグループに分類するためによく用いられる。対照的に、治療予測因子は、個々の患者の、抗エストロゲンまたは化学療法などの治療に対する有益な反応の尤度に関連する変数であり、予後とは無関係である。
【００１０】
特定の種類の治療に対する癌患者、例えば、乳癌患者の尤度を確実に予測する、正確で、定量的な試験が大いに必要とされている。このような試験は、開業医が、根拠の確かなリスク有効性分析に基づいて、個々の患者の要求に適応させた、理にかなった治療選択を行うのを補助する。
【非特許文献１】Ｃｒｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．（２００４）１６４：３５−４２
【非特許文献２】Ｈａｙｅｓ， Ｂｒｅａｓｔ（２００３）１２：５４３−９
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一態様では、本発明は、癌と診断された被験体の化学療法に対する有益な反応の尤度を予測する方法であって、
（ａ）前記被験体から得られた癌細胞を含む生体サンプルにおいて、以下の変数のうち１以上の値を定量的に決定する工程を含み、
（ｉ）再発スコア
（ｉｉ）ＥＳＲ１グループスコア
（ｉｉｉ）浸潤グループスコア
（ｉｖ）増殖グループ閾値スコア
（ｖ）ＭＹＢＬ２およびＳＣＵＢＥ２の少なくとも一方のＲＮＡ転写物、または対応する発現産物の発現レベル、
（ｂ１）（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）のうち１以上の値、またはＭＹＢＬ２のＲＮＡ転写物もしくは対応する発現産物の発現レベルの増加のどの単位についても、前記被験体が、前記化学療法に対する有益な反応の比例して増加した尤度を有すると同定され、
（ｂ２）（ｉｉ）の値またはＳＣＵＢＥ２のＲＮＡ転写物もしくは対応する発現産物の発現レベルの増加のどの単位についても、前記被験体が、化学療法に対する有益な反応の比例して減少した尤度を有すると同定され、
（ｂ３）（ｉ）の値の増加のどの単位についても、前記被験体が、化学療法に対する有益な反応の増加した尤度を有すると同定されると、乳癌再発のリスクの低下によって判定され、
ＥＳＲ１グループスコア＝（ＥＳＲ１＋ＰＧＲ＋ＢＣＬ２＋ＳＣＵＢＥ２）／４、
浸潤グループスコア＝（ＣＴＳＬ２＋ＭＭＰ１１）／２、
ＧＲＢ７グループスコア＝０．９×ＧＲＢ７＋０．１×ＥＲＢＢ２、
ＧＲＢ７グループ閾値スコアは、ＧＲＢ７グループスコアが８未満である場合は８に等しく、ＧＲＢ７グループスコアが８以上である場合にはＧＲＢ７グループスコアに等しく、
増殖グループスコア＝（ＢＩＲＣ５＋ＭＫＩ６７＋ＭＹＢＬ２＋ＣＣＮＢ１＋ＳＴＫ６）／５、
増殖グループ閾値スコアは、増殖グループスコアが６．５未満である場合には６．５に等しく、増殖グループスコアが６．５以上である場合には増殖グループスコアに等しく、
【００１２】
【数３】
［式中、
ＲＳｕ＝０．４７×ＧＲＢ７グループ閾値スコア
−０．３４×ＥＳＲ１グループスコア
＋１．０４×増殖グループ閾値スコア
＋０．１０×浸潤グループスコア
＋０．０５×ＣＤ６８
−０．０８×ＧＳＴＭ１
−０．０７×ＢＡＧ１］
等式中の遺伝子記号は、それぞれの遺伝子のＲＮＡ転写物またはその発現産物の発現レベルを表し、変数（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）における遺伝子の個々の寄与は０．５〜１．５の因子によって加重され、
前記変数のいずれか中に存在するあらゆる個々の遺伝子およびあらゆる遺伝子が、ピアソン相関係数≧０．５で前記癌において前記遺伝子と同時に発現する別の遺伝子で置換できる方法に関する。
【００１３】
被験体は哺乳類、例えば、霊長類、例えば、ヒト患者であることが好ましい。
【００１４】
特定の実施形態では、変数（ｉ）〜（ｖ）に含まれるすべての遺伝子またはそれらの発現産物の発現レベルを、１種以上の参照遺伝子またはそれらの発現産物の発現レベルに対して正規化する。例えば、参照遺伝子は、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤ、ＧＵＳＢ、ＲＰＬＰ０およびＴＦＲＣからなる群から選択できる。もう１つの実施形態では、発現レベルをＡＣＴＢ、ＧＡＰＤ、ＧＵＳＢ、ＲＰＬＰ０およびＴＦＲＣ、またはそれらの発現産物の発現レベルの平均に対して正規化する。
【００１５】
さらなる実施形態では、化学療法に対する有益な反応の尤度についての定量値が、連続体にわたって決定される変数または複数の変数の値に直接比例する。
【００１６】
癌は、例えば、充実腫瘍、例えば、乳癌、卵巣癌、胃癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌および肺癌であり得る。乳癌は、それだけには限らないが、浸潤性乳癌、またはステージＩＩもしくはステージＩＩＩ乳癌およびＥＳＲ１陽性乳癌を含む。
【００１７】
患者が、化学療法に対する有益な反応の増加した尤度を有すると決定される場合、本発明の方法は、患者を化学療法を用いて治療する工程をさらに含み得る。化学療法は、アジュバント化学療法またはネオアジュバント化学療法であり得、特定の癌の治療に有効であるとわかっているいずれかの化学療法薬の投与を含む。したがって、化学療法薬としては、アントラサイクリン誘導体、例えばドキソルビシンまたはアドリアマイシン、タキサン誘導体、例えば、パクリタキセルまたはドセタキセル、トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、カンプトセシン、トポテカン、イリノテカン、２０−Ｓ−カンプトセシン、９−ニトロ−カンプトセシン、９−アミノ−カンプトセシンまたはＧＩ１４７２１１およびヌクレオチド生合成の阻害剤、例えば、メトトレキサートおよび／または５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）が挙げられる。
【００１８】
本発明の方法は、列挙した変数のうち少なくとも２つまたは少なくとも３つまたは少なくとも４つまたは５つの決定を含み得る。
【００１９】
特定の実施形態では、本発明の方法は、ＭＹＢＬ２およびＳＣＵＢＥ２またはそれらの発現産物ののうち一方もしくは両方の発現レベルの決定を含む。
【００２０】
生体サンプルは、例えば、癌細胞を含む組織サンプルであり得る。
【００２１】
組織サンプルは、それだけには限らないが、固定され、パラフィンに包埋されているか、新鮮なものであるか、凍結されているものであってよく、例えば、細針生検、コア生検またはその他の種類の生検に由来するものであり得る。特定の実施形態では、組織サンプルは、微細針吸引生検、気管支洗浄または経気管支生検によって得られる。
【００２２】
さらなる実施形態では、前記発現レベルの決定は定量的ＲＴ−ＰＣＲを含む。
【００２３】
異なる実施形態では、列挙した遺伝子の発現産物の発現レベルの決定は免疫組織化学を含む。
【００２４】
さらなる実施形態では、遺伝子発現産物のレベルをプロテオミクス技術によって決定する。
【００２５】
なおさらなる実施形態では、遺伝子の発現レベルを標的遺伝子配列に基づいたプライマーおよびプローブ配列を用いる定量的ＲＴ−ＰＣＲによって決定する。
【００２６】
特定の実施形態では、少なくとも１種の標的遺伝子配列はイントロンに基づく配列であり、イントロンの発現は同一遺伝子のエキソン配列の発現と相関する。
【００２７】
本発明の方法は、前記の有益な反応の尤度を要約する報告書を作製する工程と、場合により、その報告書を、癌と診断された患者および／または患者の医師に個人用ゲノムプロフィールとして提供する工程とを含み得る。
【００２８】
もう１つの態様では、本発明は癌と診断された被験体の個人用ゲノムプロフィールを調製する方法であって、
（ａ）前記被験体から得られた癌細胞を含む生体サンプルにおいて、以下の変数のうち１以上の値を定量的に決定する工程を含み、
（ｉ）再発スコア
（ｉｉ）ＥＳＲ１グループスコア
（ｉｉｉ）浸潤グループスコア
（ｉｖ）増殖グループ閾値スコア
（ｖ）ＭＹＢＬ２およびＳＣＵＢＥ２の少なくとも一方のＲＮＡ転写物の発現レベル、
（ｂ１）（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）のうち１以上の値、またはＭＹＢＬ２のＲＮＡ転写物もしくは対応する発現産物の発現レベルの増加のどの単位についても、前記被験体が、前記化学療法に対する有益な反応の比例して増加した尤度を有すると同定され、
（ｂ２）（ｉｉ）の値またはＳＣＵＢＥ２のＲＮＡ転写物もしくは対応する発現産物の発現レベルの増加のどの単位についても、前記被験体が、化学療法に対する有益な反応の比例して減少した尤度を有すると同定され、
（ｂ３）（ｉ）の値の増加のどの単位についても、前記被験体が、化学療法の不在下で乳癌再発の増加した尤度を有すると同定され、
ＥＳＲ１グループスコア＝（０．８×ＥＳＲ１＋１．２×ＰＧＲ＋ＢＣＬ２＋ＳＣＵＢＥ２）／４、
浸潤グループスコア＝（ＣＴＳＬ２＋ＭＭＰ１１）／２、
ＧＲＢ７グループスコア＝０．９×ＧＲＢ７＋０．１×ＥＲＢＢ２、
ＧＲＢ７グループ閾値スコアは、ＧＲＢ７グループスコアが８未満である場合は８に等しく、ＧＲＢ７グループスコアが８以上である場合にはＧＲＢ７グループスコアに等しく、
増殖グループスコア＝（ＢＩＲＣ５＋ＭＫＩ６７＋ＭＹＢＬ２＋ＣＣＮＢ１＋ＳＴＫ６）／５、
増殖グループ閾値スコアは、増殖グループスコアが６．５未満である場合には６．５に等しく、増殖グループスコアが６．５以上である場合には増殖グループスコアに等しく、
【００２９】
【数４】
［式中、
ＲＳｕ＝０．４７×ＧＲＢ７グループ閾値スコア
−０．３４×ＥＳＲ１グループスコア
＋１．０４×増殖グループ閾値スコア
＋０．１０×浸潤グループスコア
＋０．０５×ＣＤ６８
−０．０８×ＧＳＴＭ１
−０．０７×ＢＡＧ１］
等式中の遺伝子記号は、それぞれの遺伝子のＲＮＡ転写物またはその発現産物の発現レベルを表し、変数（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）における遺伝子の個々の寄与は０．５〜１．５の因子によって加重され、
前記変数のいずれか中に存在するあらゆる個々の遺伝子または遺伝子が、ピアソン相関係数≧０．５で前記癌において前記遺伝子と同時に発現する別の遺伝子で置換でき、
（ｃ）前記遺伝子発現解析によって得られたデータを要約する報告書を作製する工程を含む方法に関する。
【００３０】
特定の実施形態では、（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）のうち１以上の値、またはＭＹＢＬ２のＲＮＡ転写物もしくは対応する発現産物の発現レベルの増加が決定される場合に、前記被験体が、化学療法に対する有益な反応の増加した尤度を有するという予測を前記報告書が含む。この場合、本方法は前記被験体を化学療法薬で治療する工程をさらに含み得る。
【００３１】
さらにもう１つの実施形態では、（ｉｉ）の値またはＳＣＵＢＥ２のＲＮＡ転写物もしくは対応する発現産物の発現レベルの増加が決定される場合に、前記被験体が、化学療法に対する有益な反応の減少した尤度を有するという予測を前記報告書が含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
Ａ．定義
特に断りのない限り、本明細書に用いられる技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に通常理解されているものと同一の意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄ．， Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ １９９４）およびＷｅｂｓｔｅｒ’ｓ Ｎｅｗ ＷｏｒｌｄTM Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｗｉｌｅｙ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．， ２００３が、当業者に本願において用いられる多数の用語の総合手引書を提供している。本発明の目的には、以下に、次の用語を定義する。
【００３３】
用語「マイクロアレイ」とは、基材上の、ハイブリダイズ可能なアレイエレメント、好ましくは、ポリヌクレオチドプローブの規則正しい配列を指す。
【００３４】
用語「ポリヌクレオチド」とは、単数形または複数形で用いられる場合、一般に、いずれかのポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指し、これは、修飾されていないＲＮＡまたはＤＮＡである場合もあるし、修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡである場合もある。したがって、例えば、本明細書において定義されるポリヌクレオチドは、それだけには限らないが、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域を含むＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡならびに一本鎖および二本鎖領域を含むＲＮＡ、一本鎖である場合もあるが、より通常は二本鎖であり、または一本鎖領域と二本鎖領域を含む場合もあるＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を含む。さらに、本明細書において、用語「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの双方を含む三本鎖領域を指す。このような領域中の鎖は同一分子に由来する場合もあるし、異なる分子に由来する場合もある。これらの領域は１種以上の分子のすべてを含む場合もあるが、より通常は、分子の一部の領域のみを含む。トリプルへリックス領域の分子の１種は、オリゴヌクレオチドであることが多い。用語「ポリヌクレオチド」は、具体的にはｃＤＮＡを含む。この用語は、１個以上の修飾された塩基を含むＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）およびＲＮＡを含む。したがって、安定性のため、またはその他の理由で修飾された主鎖を有するＤＮＡまたはＲＮＡは「ポリヌクレオチド」であると、本明細書においては意図される。さらに、普通でない塩基、例えば、イノシンまたは修飾された塩基、例えば、トリチウム化塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書において定義される用語「ポリヌクレオチド」内に含まれる。一般に、用語「ポリヌクレオチド」は、修飾されていないポリヌクレオチドのすべての化学的に、酵素的におよび／または代謝的に修飾された形態、ならびにウイルスおよび細胞、例えば、単純細胞および複雑型細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。
【００３５】
用語「オリゴヌクレオチド」とは、相対的に短いポリヌクレオチド、例えば、それだけには限らないが、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、一本鎖または二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドおよび二本鎖ＤＮＡを指す。オリゴヌクレオチド、例えば、一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドは、化学法によって、例えば、市販の自動化オリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いて合成されることが多い。しかし、オリゴヌクレオチドは種々のその他の方法、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ媒介技術によって、また、細胞および生物におけるＤＮＡの発現によって製造できる。
【００３６】
用語「遺伝子発現」とは、ＤＮＡ遺伝子配列情報の転写ＲＮＡ（最初のスプライシングされていないＲＮＡ転写物または成熟ｍＲＮＡ）またはコードされるタンパク質産物への変換を表す。遺伝子発現は、遺伝子の全ＲＮＡまたはタンパク質産物のいずれかまたはそれらのその後のレベルを測定することによってモニターできる。
【００３７】
ＲＮＡ転写物に関して用語「過剰発現」とは、試料中のすべての測定される転写物であるか、または特定の参照セットのｍＲＮＡであり得る、参照ｍＲＮＡのレベルに対する正規化によって決定される転写物のレベルを指して用いられる。
【００３８】
語句「遺伝子増幅」とは、特定の細胞または細胞株において、遺伝子または遺伝子断片の複数のコピーが形成されるプロセスを指す。複製された領域（ひと続きの増幅されたＤＮＡ）は、「単位複製配列」と呼ばれることが多い。また、通常、産生されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量、すなわち、遺伝子発現レベルは、発現される個々の遺伝子からなるコピー数の割合で増加する。
【００３９】
予後因子とは、乳癌の自然史に関連している可変のものであり、一度乳癌にかかった患者の再発率および転帰に影響を及ぼす。悪い予後と関連していた臨床パラメーターとしては、例えば、リンパ節の関与、腫瘍の大きさの増大および高いグレードの腫瘍が挙げられる。予後因子は患者をベースライン再発リスクが異なるサブグループに分類するためによく用いられる。対照的に、治療予測因子は、個々の患者の、抗エストロゲンまたは化学療法などの治療に対する有益な反応の尤度に関連する変数であり、予後とは無関係である。
【００４０】
本明細書において用語「予後」とは、癌に起因する死亡または癌進行、例えば、乳癌などの新生物性疾患の、その疾患の自然史の間の再発および転移拡散の尤度を指して用いられる。予後因子とは、乳癌などの新生物性疾患の自然史と関連した可変のものであり、一度乳癌などの新生物性疾患にかかった患者の再発率および疾患転帰に影響を及ぼす。これに関連して、「自然転帰」とは、さらなる治療の不在下での転帰を意味する。例えば、乳癌の場合には、「自然転帰」とは、腫瘍を外科的に切除した後の、さらなる治療（例えば、化学療法または放射線治療）の不在下での転帰を意味する。予後因子は患者をベースラインリスク、例えば、ベースライン再発リスクが異なるサブグループに分類するためによく用いられる。
【００４１】
本明細書において用語「予測」とは、患者が薬物または薬物のセットに対して好都合にか、または不都合にのいずれかで反応する尤度、またそれらの反応の程度を指して用いられる。したがって、治療予測因子は、指定の治療に対する個々の患者の反応に関連した可変のものであり、予後とは無関係である。本発明の予測法を臨床的に用いて、いずれかの特定の患者にとって最も適当な治療様式を選択することによって治療法の決定を行うことができる。本発明の予測法は、患者が治療計画、例えば、抗エストロゲン療法、例えば、単独または化学療法および／または放射線療法との組み合わせでのＴＡＭ治療に対して好都合に反応する可能性が高いかどうかを予測するのに有益な手段である。
【００４２】
用語「有益な反応」とは、患者の状態の何らかの尺度、例えば、全生存、長期生存、再発がない生存および遠隔再発のない生存などの当技術分野で通常用いられる尺度の改善を意味する。再発のない生存（ＲＦＳ）とは、手術から最初の局所再発（ｌｏｃａｌ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）、局所再発（ｒｅｇｉｏｎａｌ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）または遠隔再発までの時間（年）を指す。遠隔再発のない生存（ＤＦＲＳ）とは、手術から最初の遠隔再発までの時間（年）を指す。再発とは、その個々の用法によって明らかなようにＲＦＳおよび／またはＤＦＲＳを指す。実際のところは、これらの尺度の算出は、審査される事象または検討されない事象の定義に応じて、研究毎に異なっていることがある。本明細書において用語「長期」生存とは、術後またはその他の治療後、少なくとも３年の、より好ましくは少なくとも８年の、最も好ましくは少なくとも１０年の生存を指して用いられる。
【００４３】
本明細書において用語「腫瘍」とは、悪性であるか良性であるかに関わらず、すべての新生細胞成長および増殖ならびにすべての前癌状態および癌性の細胞および組織を指す。
【００４４】
用語「癌」および「癌性」とは、通常、制御されていない細胞増殖を特徴とする哺乳類における生理学的状態を指すか表す。癌の例としては、それだけには限らないが、乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫および脳癌が挙げられる。
【００４５】
癌の「病状」は、患者の健康を損なうすべての現象を含む。これとしては、それだけには限らないが、異常なまたは制御不能な細胞増殖、転移、隣接する細胞の正常な機能への干渉、異常なレベルのサイトカインまたはその他の分泌産物の放出、炎症反応または免疫反応の抑制または増悪、新生物、前悪性、悪性腫瘍、周囲の組織または遠隔組織または臓器、例えば、リンパ節の浸潤などが挙げられる。
【００４６】
本発明に関連して、いずれかの特定の遺伝子セット中の列挙された遺伝子のうち「少なくとも１種」、「少なくとも２種」、「少なくとも３種」、「少なくとも４種」、「少なくとも５種」などとは、列挙された遺伝子のいずれか１種またはありとあらゆる組み合わせを意味する。
【００４７】
本明細書において用語「リンパ節転移陰性」癌、例えば、「リンパ節転移陰性」乳癌は、流入領域リンパ節に広がっていない癌を指して用いられる。
【００４８】
用語「スプライシング」と「ＲＮＡスプライシング」は、同じ意味で用いられ、イントロンを除去してエキソンをつなげ、連続するコード配列を有する成熟ｍＲＮＡを生成するＲＮＡプロセシングを指し、この成熟ｍＲＮＡが真核細胞の細胞質に移動する。
【００４９】
理論上は、用語「エキソン」とは、成熟ＲＮＡ産物で表される断続性の遺伝子のいずれかのセグメントを指す（Ｂ． Ｌｅｗｉｎ． Ｇｅｎｅｓ ＩＶ Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｍａｓｓ．１９９０）。理論上は、用語「イントロン」とは、エキソンとともにそのいずれかの側に転写されるがスプライシングによって転写物内から除去されるＤＮＡのいずれかのセグメントを指す。操作上は、エキソン配列は、参照配列番号によって定義される遺伝子のｍＲＮＡ配列中に生じる。操作上は、イントロン配列は、エキソン配列によってひとくくりにされ、５’および３’境界にＧＴおよびＡＧスプライシングコンセンサス配列を有する、遺伝子のゲノムＤＮＡ内の介在配列である。
【００５０】
Ｂ．詳細な説明
本発明の実施は、特に断りのない限り、当技術分野の技術の範囲内にある、統計解析、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学および生化学の従来の技術を用いる。このような技術は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９）、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」 （ＭＪ． Ｇａｉｔ， ｅｄ．， １９８４）、「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」 （ＲＩ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， ｅｄ．， １９８７）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」 （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」， ４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｄ．Ｍ． Ｗｅｉｒ ＆ ＣＣ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ， ｅｄｓ．， Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．， １９８７）、「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｎｎａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」（Ｊ．Ｍ． Ｍｉｌｌｅｒ ＆ Ｍ．Ｐ． Ｃａｌｏｓ， ｅｄｓ．， １９８７）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」 （Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， １９８７）、「Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ」， ３ ｅｄｉｔｉｏｎｓ （Ｒ． Ａ． Ｆｉｓｈｅｒ．， １９５６／５９／７４）および「ＰＣＲ： Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ」， （Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， １９９４）などの文献に十分に説明されている。
【００５１】
Ｂ．１ 発明の概要
過去２年間にわたって、Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｅａｌｔｈ， Ｉｎｃおよび共同研究者（Ｅｓｔｅｂａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ａｍ Ｓｏｃ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２２： ｐａｇｅ ８５０， ２００３ （ａｂｓｔｒａｃｔ ３４１６）、Ｓｏｕｌｅ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ Ａｍ Ｓｏｃ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２２： ｐａｇｅ ８６２， ２００３ （ａｂｓｔｒａｃｔ ３４６６）、Ｃｏｂｌｅｉｇｈ ｅｔ ａｌ． Ｓｏｃ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２２： ｐａｇｅ ８５０， ２００３ （ａｂｓｔｒａｃｔ ３４１５）、Ｃｒｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １６４（ｌ）：３５−４２ （２００４））が、再発リスクに対する分子署名を見い出すことを目的として、初期乳癌における遺伝子発現についていくつかの予備的臨床研究を報告した。これらの研究では、定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて、臨床記録と関連付けられた、凍結、パラフィン包埋（ＦＰＥ）組織試料において２５０種の候補遺伝子マーカーが試験された。多様な患者グループにわたって再発のリスクと一貫して関連している遺伝子が同定され得るかどうかを調べるために３つの研究すべてにわたる分析が実施された。これらの一変数の結果に基づいて、複数の遺伝子モデルが設計され、３つの研究にわたって分析された。臨床評価研究において予測的に試験される、１６種の癌関連遺伝子および５種の参照遺伝子からなる、単一の複数遺伝子アッセイが開発された。これら２１種のｍＲＮＡ種の測定値を用い、１００点尺度で再発リスクを報告する、再発スコア（ＲＳ）と呼ばれるアルゴリズムが作製された。
【００５２】
この再発スコア試験およびアルゴリズムの臨床的妥当性を試験するために、予測的に同定されたエンドポイントを有する盲式臨床試験が実施された。この評価試験は、ＮＳＡＢＰ研究Ｂ−１４臨床試験集団の無作為化された登録治療群中のＴＡＭ単独で治療された患者に焦点が当てられた（Ｆｉｓｈｅｒ Ｂ， Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ ＪＰ， Ｒｅｄｍｏｎｄ ＣＫ， ｅｔ ａｌ： Ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ −ｔｒｅａｔｅｄ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ： Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｂｒｅａｓｔ ａｎｄ Ｂｏｗｅｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ （ＮＳＡＢＰ） Ｂ−１４． Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ８６：５２７−５３７ （１９９４））。Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｅａｌｔｈ， Ｉｎｃ．およびＮＳＡＢＰは、これらの患者に由来する６６８の乳癌組織試料で２１種の遺伝子のＲＴ−ＰＣＲアッセイを実施し、各患者の再発スコアを算出した。
【００５３】
再発スコアの事前に指定したカットオフ点によって患者を３つのカテゴリーのうちの１つに分類した：低リスク、中リスクおよび高リスクの遠隔疾患再発。ＲＴ−ＰＣＲアッセイによって低、中および高リスクとして分類された６６８人の患者の割合はそれぞれ、５１％、２３％および２７％であった。１０年での遠隔再発率のカプラン・マイヤー推定値および９５％信頼区間は低、中程度および高リスク群についてそれぞれ、６．８％（４．０％、９．６％）、１４．３％（８．３％、２０．３％）３０．５％（２３．６％、３７．４％）であり、低リスク群の率は高リスク群の率よりも有意に低かった（ｐ＜０．００１）。遠隔再発を再発スコア、年齢および腫瘍の大きさと関連づける多変数Ｃｏｘモデルでは、再発スコアは年齢および腫瘍の大きさを超える有意な（ｐ＜０．００１）予測力を提供する。この研究により、ＥＳＲ１陽性である腫瘍を有し、タモキシフェンで治療された、リンパ節転移がない患者における遠隔再発の強力な予測判断材料としての再発スコアの妥当性が確認された（Ｐａｉｋ ｅｔ ａｌ． Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ８２， Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １ ： ｐａｇｅ Ｓ１０， ２００３ （Ａｂｓｔｒａｃｔ １６）。
【００５４】
本発明は、これらの発見結果の拡大において、ＮＳＡＢＰ研究Ｂ−２０の結果を用いて、化学療法に対する癌、例えば、乳癌患者の反応を予測するのに有用な遺伝子および遺伝子セットを提供する。さらに、本発明は、複数遺伝子ＲＮＡ分析を用いる、化学療法に対する乳癌患者の反応を予測する臨床的に有効な試験を提供する。
【００５５】
詳しくは、本発明者らは、癌患者、例えば、乳癌患者が化学療法に対して有益な反応を示す可能性が高いか否かを予測するのに有用である一連の遺伝子を同定した：ＢＣＬ２、ＳＣＵＢＥ２、ＣＣＮＢ１、ＣＴＳＬ２、ＥＳＲ１、ＭＭＰ１１、ＭＹＢＬ２、ＰＧＲ、ＳＴＫ６、ＢＩＲＣ５およびＭＭＰ１１、ＧＳＴＭ１、ＣＤ６８、ＢＡＧ１、ＧＲＢ７、ＥＲＢＢ２。これらの遺伝子のうちいくつかは、個々に予測的であるが、その他のものは特定の遺伝子群の一部として用いられ、本発明の方法における変数として用いられる。
【００５６】
したがって、本発明の予測法において用いられる独立変数は、（ｉ）再発スコア、（ｉｉ）ＥＳＲ１グループスコア、（ｉｉｉ）浸潤グループスコア、（ｉｖ）増殖グループ閾値スコア、（ｖ）ＭＹＢＬ２およびＳＣＵＢＥ２の少なくとも一方のＲＮＡ転写物の発現レベルのうち１以上を含み、
（ｂ１）（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）のうち１以上の値、またはＭＹＢＬ２のＲＮＡ転写物もしくは対応する発現産物の発現レベルの増加のどの単位についても、患者が、化学療法に対する有益な反応の比例して増加した尤度を有すると同定され、
（ｂ２）（ｉｉ）の値またはＳＣＵＢＥ２のＲＮＡ転写物もしくは対応する発現産物の発現レベルの増加のどの単位についても、患者が、化学療法に対する有益な反応の比例して減少した尤度を有すると同定され、
（ｂ３）（ｉ）の値の増加のどの単位についても、患者が、化学療法の不在下で、乳癌再発の増加した尤度を有すると同定される。
【００５７】
前記の変数において、
ＥＳＲ１グループスコア＝（ＥＳＲ１＋ＰＧＲ＋ＢＣＬ２＋ＳＣＵＢＥ２）／４、
浸潤グループスコア＝（ＣＴＳＬ２＋ＭＭＰ１１）／２、
増殖グループスコア＝（ＢＩＲＣ５＋ＭＫＩ６７＋ＭＹＢＬ２＋ＣＣＮＢ１＋ＳＴＫ６）／５、
増殖グループ閾値スコアは、増殖グループスコアが６．５未満である場合には６．５に等しく、増殖グループスコアが６．５以上である場合には増殖グループスコアに等しく、再発スコア（ＲＳ）は以下のとおりである：
【００５８】
【数５】
［式中、
ＧＲＢ７グループスコア＝０．９×ＧＲＢ７＋０．１×ＥＲＢＢ２である。
【００５９】
ＧＲＢ７グループ閾値スコアは、ＧＲＢ７グループスコアが６．５未満である場合には６．５に等しく、ＧＲＢ７グループ閾値スコアが６．５以上である場合にはＧＲＢ７グループ閾値スコアに一致し、
ＲＳｕ＝０．４７×ＧＲＢ７ グループ閾値スコア
−０．３４×ＥＳＲ１グループスコア
＋１．０４×増殖グループ閾値スコア
＋０．１０×浸潤グループスコア
＋０．０５×ＣＤ６８
−０．０８×ＧＳＴＭ１
−０．０７×ＢＡＧ１］
等式中の遺伝子記号は、それぞれの遺伝子のＲＮＡ転写物またはその発現産物の発現レベルを表し、変数（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）中の遺伝子の個々の寄与は０．５〜１．５の因子によって加重され、
前記変数のいずれか中に存在するあらゆる個々の遺伝子または遺伝子が、ピアソン相関係数≧０．５で前記癌において前記遺伝子と同時に発現する別の遺伝子で置換でき、また前記変数のいずれか中に存在する前記の個々の遺伝子または遺伝子と同時に発現する任意の遺伝子を、それぞれの遺伝子グループに加え、それぞれの変数を算出するために使用でき、これではグループスコアの算出に用いられる分母はグループ中の遺伝子数に等しい。前記の個々の遺伝子を同時発現する遺伝子の付加は新規グループの形成を引き起こす場合があり、０．５〜１．５の間の因子によって同様に加重され得る。
【００６０】
本発明の種々の実施形態では、開示された遺伝子の発現レベルの決定のために種々の技術的アプローチ、例えば、それだけには限らないが、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）および超並列的シグニチャー配列決定（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現解析が利用可能であり、これらは以下で詳細に論じる。特定の実施形態では、各遺伝子の発現レベルは、遺伝子の発現産物の種々の特徴、例えば、エキソン、イントロン、タンパク質エピトープおよびタンパク質活性に関連して測定できる。
【００６１】
Ｂ．２ 遺伝子発現プロファイリング
一般に、遺伝子発現プロファイリング法は２つの大きなグループに分けることができる：ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション分析に基づく方法およびポリヌクレオチドの配列決定に基づく方法。サンプル中のｍＲＮＡ発現の定量化のために当技術分野で公知の最も良く用いられる方法として、ノーザンブロッティングおよびｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション（Ｐａｒｋｅｒ ＆ Ｂａｒｎｅｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０６：２４７−２８３ （１９９９））、ＲＮアーゼ保護アッセイ（Ｈｏｄ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：８５２−８５４ （１９９２））および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｗｅｉｓ ｅｔ ａｌ， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８：２６３−２６４ （１９９２））が挙げられる。あるいは、指定の二本鎖、例えば、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖またはＤＮＡ−タンパク質二本鎖を認識できる抗体を使用することもできる。配列決定に基づく遺伝子発現解析の代表的な方法として、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）および超並列的シグニチャー配列決定（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現解析が挙げられる。
【００６２】
腫瘍形成によく含まれる２つの生物学的過程として、遺伝子増幅とＤＮＡメチル化が挙げられる。両過程とも、腫瘍形成または進行において重要な遺伝子の異常な発現をもたらす。したがって、遺伝子増幅およびＤＮＡメチル化をモニターする方法は、遺伝子発現プロファイリング法の代理となると考えられる。
【００６３】
遺伝子増幅は多数の癌において共通する変化であり、細胞性癌遺伝子の発現の上昇をもたらし得る（Ｍｅｌｔｚｅｒ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ． １９：９３ （１９８６）。乳癌では、ＥＲＢＢ２遺伝子増幅とＥＲＢＢ２過剰発現の間には良好な相関関係がある（Ｎａｇａｉ， Ｍ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ ８：２９ （１９９３）、Ｓａｖｉｎａｉｎｅｎ， Ｋ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １６０：３３９ （２００２））。ＥＲＢＢ２遺伝子の増幅は、その過剰発現をもたらし、不良な予後と相関関係があり（Ｐｒｅｓｓ， Ｍ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． １５：２８９４ （１９９７）、Ｓｌａｍｏｎ， Ｄ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：７０７ （１９８９））、正規化学療法と組み合わせた抗ＨＥＲ２療法に対する反応の予測となる（Ｓｅｉｄｍａｎ， Ａ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． １９：１８６６ （２００１））。
【００６４】
ＤＮＡメチル化も癌においてよくある変化であり、広範な遺伝子の発現の増加または減少をもたらすことがわかっている（Ｊｏｎｅｓ， Ｐ． Ａ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６５：２４６３ （１９９６））。一般に、プロモーター領域および調節エレメント中のＣｐＧ島の低メチル化は、多数の癌遺伝子を含む遺伝子発現の増大をもたらす（Ｈａｎａｄａ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８２：１８２０ （１９９３）、Ｆｅｉｎｂｅｒｇ， Ａ．Ｐ． ａｎｄ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ， Ｂ． Ｎａｔｕｒｅ ３０１：８９ （１９８３））。ＤＮＡメチル化は、多数の癌において特定の遺伝子発現レベルと相関があるので、腫瘍の発現プロファイリンの有用な代理として役立つ（Ｔｏｙｏｔａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９７： ２８２３ （２００１）、Ａｄｏｒｊａｎ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． １０：ｅ２１ （２００２））。
【００６５】
逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）
上記に列挙した技術のうち、最も感度が高く、最も適応性がある定量的な方法は、ＲＴ−ＰＣＲであり、これを用いて種々のサンプル集団において、薬物治療を施したか施していない正常および腫瘍組織において、ｍＲＮＡレベルを比較して、遺伝子発現のパターンを特性決定でき、密接に関連しているｍＲＮＡ間を識別でき、ＲＮＡ構造を解析できる。
【００６６】
第１の工程は標的サンプルからのｍＲＮＡの単離である。出発材料は、通常、ヒト組織または細胞株から単離した全ＲＮＡである。したがって、ＲＮＡは、乳房、肺、結腸、前立腺、脳、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、精巣、卵巣、子宮などをはじめとする種々の原発腫瘍、または腫瘍細胞株から単離できる。ｍＲＮＡの供給源が原発腫瘍である場合には、ｍＲＮＡは、例えば、凍結または保管されたパラフィン−包埋および固定（例えば、ホルマリン固定）組織サンプルから抽出できる。
【００６７】
ｍＲＮＡ抽出のための一般法は当技術分野では周知であり、分子生物学の標準的な教本、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ （１９９７）に開示されている。パラフィン包埋された組織からのＲＮＡ抽出法は、例えば、Ｒｕｐｐ ａｎｄ Ｌｏｃｋｅｒ， Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ． ５６：Ａ （１９８７）およびＤｅ Ａｎｄｒeｓ ｅｔ ａｌ， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １８：４２０４４ （１９９５）に開示されている。詳しくは、ＲＮＡ単離は、民間製造業者、例えば、Ｑｉａｇｅｎ製の精製キット、バッファーセットおよびプロテアーゼを用い、製造業者の使用説明書に従って実施できる。例えば、培養細胞由来の全ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニカラムを用いて単離できる。その他の市販のＲＮＡ単離キットとしては、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ（商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＤＮＡおよびＲＮＡ精製キット（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）およびＰａｒａｆｆｉｎ Ｂｌｏｃｋ ＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ， Ｉｎｃ．）が挙げられる。組織サンプル由来の全ＲＮＡは、ＲＮＡ Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ）を用いて単離できる。腫瘍から調製されたＲＮＡは、例えば、塩化セシウム密度勾配遠心分離によって単離できる。
【００６８】
ＲＮＡはＰＣＲの鋳型としての役割を果たすことはできないので、ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現プロフィールにおける第１の工程は、ＲＮＡ鋳型のｃＤＮＡへの逆転写と、それに続く、ＰＣＲ反応におけるその指数関数的増幅である。２種の最もよく用いられる逆転写酵素として、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）およびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）がある。逆転写工程は通常、状況および発現プロファイリングの目的に応じて、特異的プライマー、ランダムヘキサマーまたはオリゴ−ｄＴプライマーを用いてプライムされる。例えば、抽出したＲＮＡを、ＧｅｎｅＡｍｐ ＲＮＡ ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用い、製造業者の使用説明書に従って逆転写できる。次いで、得られたｃＤＮＡを、その後のＰＣＲ反応において鋳型として使用できる。
【００６９】
ＰＣＲ工程は種々の熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用できるが、通常、５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するが、３’−５’校正エンドヌクレアーゼ活性を欠く、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いる。したがって、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲは、通常、ＴａｑまたはＴｔｈポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を用いて、標的単位複製配列と結合しているハイブリダイゼーションプローブを加水分解するが、同等の５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素はいずれも使用できる。２種のオリゴヌクレオチドプリマーを用いて、ＰＣＲ反応に特有の単位複製配列を作製する。第３のオリゴヌクレオチドまたはプローブは、２種のＰＣＲプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出するよう設計される。プローブは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素によって延長可能ではなく、レポーター蛍光色素およびクエンチャー蛍光色素で標識する。レーザーによって誘導されるレポーター色素からの発光はいずれも、２種の色素が、それらがプローブ上にあるように、接近して位置する場合にはクエンチング色素によってクエンチされる。増幅反応の際、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素は、鋳型依存的にプローブを切断する。得られたプローブ断片は溶液中に解離し、放出されたレポーター色素からのシグナルは第２のフルオロフォアのクエンチング作用を免れる。各新規分子が合成されるごとに、１分子のレポーター色素が遊離され、クエンチされていないレポーター色素の検出が、データの定量的解析の基礎を提供する。
【００７０】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲは、市販の機器、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００（商標）配列検出システム（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ， ＵＳＡ）またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）などを用いて実施できる。好ましい実施形態では、リアルタイム定量的ＰＣＲ装置、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００（商標）配列検出システム（商標）で５’ヌクレアーゼ手順を行う。このシステムは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラおよびコンピュータからなる。このシステムは、サーモサイクラーで９６ウェル形式でサンプルを増幅する。増幅の際、レーザーによって誘導された蛍光シグナルをＣＣＤで検出する。このシステムは、機器を動かすためのソフトウェアおよびデータを分析するためのソフトウェアを含む。
【００７１】
５’ヌクレアーゼアッセイデータは、まず、ＣＴすなわち閾値サイクルとして表される。上記で論じたように、サイクル毎にその間の蛍光値を記録し、これは増幅反応においてその時点までに増幅された生成物の量を表す。蛍光シグナルが、統計的に有意であると最初に記録される時点が閾値サイクル（ＣＴ）である。
【００７２】
誤差およびサンプル間の変化の影響を最小化するために、ＲＴ−ＰＣＲは通常、内部標準を用いて実施する。理想の内部標準は、異なる組織間で一定レベルで発現され、実験処理によって影響を受けない。遺伝子発現のパターンを正規化するために最も頻繁に用いられるＲＮＡとして、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤ）およびβ−アクチン（ＡＣＴＢ）のｍＲＮＡがある。
【００７３】
ＲＴ−ＰＣＲ技術のより最近の変法としてリアルタイム定量的ＰＣＲがあり、これは、二重標識蛍光プローブ（すなわち、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）によってＰＣＲ産物蓄積を測定する。リアルタイムＰＣＲは、正規化のために各標的配列の内部競合物を用いる定量的競合的ＰＣＲと適合し、サンプル内に含まれる正規化遺伝子またはＲＴ−ＰＣＲのためのハウスキーピング遺伝子を用いる定量的比較ＰＣＲとも適合する。さらなる詳細については、例えば、Ｈｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９８６−９９４ （１９９６）参照のこと。
【００７４】
固定され、パラフィン包埋された組織をＲＮＡ供給源として用いる、遺伝子発現をプロファイリングするための代表的なプロトコールの工程、例えば、ｍＲＮＡ単離、精製、プライマー伸長および増幅は、種々の公開学術論文に示されている｛例えば、Ｔ．Ｅ． Ｇｏｄｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ２： ８４−９１ ［２０００］、Ｋ． Ｓｐｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １５８： ４１９−２９ ［２００１］｝。要約すると、代表的なプロセスは、パラフィン包埋した腫瘍組織サンプルの約１０μｍ厚切片を切断することで開始する。次いで、ＲＮＡを抽出し、タンパク質およびＤＮＡを除去する。ＲＮＡ濃度を分析した後、必要に応じてＲＮＡ修復および／または増幅工程が含まれる場合があり、遺伝子特異的プロモーターを用いてＲＮＡを逆転写し、その後ＲＴ−ＰＣＲを行う。
【００７５】
マイクロアレイ
マイクロアレイ技術を用いても、差次的遺伝子発現を同定または確認できる。したがって、乳癌関連遺伝子の発現プロフィールは、マイクロアレイ技術を用いて新鮮腫瘍組織またはパラフィン包埋腫瘍組織のいずれかで測定できる。この方法では、注目するポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む）を、マイクロチップ基材上にプレーティングするか、または配列させる。次いで配列させた配列を、注目する細胞または組織に由来する特異的ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせる。ちょうどＲＴ−ＰＣＲ法におけるように、ｍＲＮＡの供給源は通常、ヒト腫瘍または腫瘍細胞株および対応する正常組織または細胞株から単離した全ＲＮＡである。したがって、ＲＮＡは種々の原発腫瘍または腫瘍細胞株から単離できる。ｍＲＮＡの供給源が原発腫瘍である場合には、ｍＲＮＡは、例えば、毎日の臨床診療において日常的に調製され保存される、凍結または保管されたパラフィン−包埋および固定（例えば、ホルマリン固定）組織サンプルから抽出できる。
【００７６】
マイクロアレイ技術の特定の実施形態では、ｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅されたインサートを、高密度アレイで基材に適用する。基材に対して少なくとも１０，０００ヌクレオチド配列を適用することが好ましい。各１０，０００エレメントでマイクロチップ上に固定された、マイクロアレイされた遺伝子は、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションに適している。蛍光標識したｃＤＮＡプローブは、注目する組織から抽出したＲＮＡの逆転写によって蛍光ヌクレオチドを組み込むことによって作製できる。チップに適用された標識したｃＤＮＡプローブは、特異性をもってアレイ上の各ＤＮＡスポットとハイブリダイズする。非特異的に結合しているプローブを除去するためにストリンジェント洗浄した後、共焦点レーザー顕微鏡法によってか、ＣＣＤカメラなどの別の検出法によってチップをスキャンする。アレイされたエレメント各々のハイブリダイゼーションを定量することにより、対応するｍＲＮＡ量の評価が可能となる。二色蛍光を用い、２種のＲＮＡ供給源から作製した別個に標識したｃＤＮＡプローブをアレイと対でハイブリダイズさせる。このようにして各特定の遺伝子に対応する、２種の供給源に由来する転写物の相対量を同時に求める。小型化されたスケールのハイブリダイゼーションによって、多数の遺伝子の発現パターンの好都合で迅速な評価が可能となる。このような方法は、細胞あたり数コピーで発現される、希少な転写物を検出するのに、また、発現レベルの少なくとも約２倍の差異を再現性よく検出するのに必要な感度を有することがわかっている（Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． ＳｃＬ ＵＳＡ ９３（２）：１０６−１４９ （１９９６））。マイクロアレイ解析は市販の機器により、製造業者のプロトコールに従って、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎＣｈｉｐ技術またはＩｎｃｙｔｅのマイクロアレイ技術を用いることによって実施できる。
【００７７】
遺伝子発現の大規模解析のためのマイクロアレイ法の開発により、種々の腫瘍の種類における癌分類および転帰予測の分子マーカーを系統的に探索することが可能となる。
【００７８】
遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）
遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）は、各転写物に個々のハイブリダイゼーションプローブを提供する必要なく、多数の遺伝子転写物の同時かつ定量的な解析を可能にする方法である。まず、転写物を一意的に同定するのに十分な情報を含む短い配列タグ（約１０から１４ｂｐ）を作製する。ただし、タグは各転写物内の独特の位置から得る。ついで、多数の転写物を互いに結合して長い連続分子を形成するが、これは配列決定でき、複数のタグの同一性を同時に示すことができる。いずれかの転写物の集団の発現パターンは、個々のタグの量を測定することと、各タグに対応する遺伝子を同定することとによって定量的に評価できる。より詳細については、例えば、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４８４−４８７ （１９９５）およびＶｅｌｃｕｌｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ ８８：２４３−５１ （１９９７）参照のこと。
【００７９】
超並列的シグニチャー配列決定（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現解析（ＭＰＳＳ）
Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：６３０−６３４ （２０００）によって記載されたこの方法は、分離している直径５μｍのマイクロビーズ上で非ゲルベースのシグニチャー配列決定（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を、何百万もの鋳型のｉｎ ｖｉｔｒｏクローニングと組み合わせる配列決定アプローチである。まず、ｉｎ ｖｉｔｒｏクローニングによってＤＮＡ鋳型のマイクロビーズライブラリーを構築する。この後、高密度（通常、３×１０６個マイクロビーズ／ｃｍ２より多い）で、フローセルにおいて鋳型を含有するマイクロビーズの平面アレイの構築を行う。各マイクロビーズ上のクローニングされた鋳型の遊離末端を、ＤＮＡ断片の分離を必要としない蛍光ベースのシグニチャー配列決定法を用いて同時に分析する。この方法は、酵母ｃＤＮＡライブラリーから１回の操作で、同時に、正確に何十万の遺伝子のシグニチャー配列を提供することがわかっている。
【００８０】
ｍＲＮＡ単離、精製および増幅についての概要
固定され、パラフィン包埋された組織をＲＮＡ供給源として用いて遺伝子発現をプロファイリングするための代表的なプロトコールの工程、例えば、ｍＲＮＡ単離、精製、プライマー伸長および増幅は、種々の公開学術論文に提供されている（例えば、Ｔ．Ｅ． Ｇｏｄｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ，． Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ２： ８４−９１ ［２０００］；Ｋ． Ｓｐｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １５８： ４１９−２９ ［２００１］））。要約すると、代表的なプロセスは、パラフィン包埋した腫瘍組織サンプルの約１０μｍ厚切片を切断することで開始する。次いで、ＲＮＡを抽出し、タンパク質およびＤＮＡを除去する。ＲＮＡ濃度を分析した後、必要に応じてＲＮＡ修復および／または増幅工程が含まれる場合があり、遺伝子特異的プロモーターを用いてＲＮＡを逆転写し、その後ＲＴ−ＰＣＲを行う。最後に、データを分析して、調べた腫瘍サンプルにおいて同定された特徴的な遺伝子発現パターンに基づき、癌再発の予測される尤度に応じて、患者が利用できる最良の治療選択肢を同定する。
【００８１】
乳癌遺伝子セット、アッセイされる遺伝子部分配列および遺伝子発現データの臨床適用
本発明の重要な態様は、予後情報または予測情報を提供するために乳癌組織による特定の遺伝子の測定された発現を使用することである。この目的には、アッセイされたＲＮＡ量の相違および用いたＲＮＡの質の変動の双方について補正する（正規化する）ことが必要である。したがって、アッセイは、通常、特定の正規化遺伝子、例えば、以下の実施例において示されるように、周知のハウスキーピング遺伝子、例えば、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤ、ＧＵＳＢ、ＲＰＬＯおよびＴＦＲＣの発現を測定し、組み込む。あるいは、正規化は、アッセイされた遺伝子のすべてまたはその大きな部分集合の平均または中央値シグナル（ＣＴ）に基づくものである場合もある（グローバルノーマライゼーションアプローチ）。以下、特に断りのない限り、遺伝子発現とは正規化された発現を意味する。
【００８２】
イントロンベースのＰＣＲプライマーおよびプローブの設計
本発明の一態様によれば、ＰＣＲプライマーおよびプローブは、増幅される遺伝子中に存在するイントロン配列に基づいて設計する。したがって、プライマー／プローブ設計における第１の工程は、遺伝子内のイントロン配列の描写である。これは入手可能な公開ソフトウェア、例えば、Ｋｅｎｔ， Ｗ．Ｊ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １２（４）：６５６−６４ （２００２）によって開発されたＤＮＡ ＢＬＡＴソフトウェアによって、または変法を含むＢＬＡＳＴソフトウェアによって行うことができる。その後の工程は、ＰＣＲプライマーおよびプローブ設計の十分に確立された方法に従う。
【００８３】
プライマーおよびプローブを設計する場合には、非特異的シグナルを避けるために、イントロン内の反復配列をマスクすることが重要である。これは、ベイラー医科大学（ｔｈｅ Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）を通じてオンラインで入手できるＲｅｐｅａｔ Ｍａｓｋｅｒプログラムを用いることによって容易に達成できる。このプログラムは反復エレメントのライブラリーに対してＤＮＡ配列をスクリーニングし、反復エレメントがマスクされたクエリー配列を戻す。次いで、マスクされたイントロン配列を用い、いずれかの市販されているか、あるいは入手可能な公開プライマー／プローブ設計パッケージ、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＭＧＢ ａｓｓａｙ−ｂｙ−ｄｅｓｉｇｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｐｒｉｍｅｒ３（Ｓｔｅｖｅ Ｒｏｚｅｎ ａｎｄ Ｈｅｌｅｎ Ｊ． Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ （２０００） Ｐｒｉｍｅｒ３ ｏｎ ｔｈｅ ＷＷＷ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｌ ｕｓｅｒｓ ａｎｄ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｒｓ． Ｉｎ： Ｋｒａｗｅｔｚ Ｓ， Ｍｉｓｅｎｅｒ Ｓ （ｅｄｓ） Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ， ｐｐ ３６５−３８６）を用いてプライマーおよびプローブ配列を設計できる。
【００８４】
ＰＣＲプライマー設計において考慮される最も重要な因子として、プライマー長、融解温度（Ｔｍ）およびＧ／Ｃ含量、特異性、相補的プライマー配列および３’末端配列が挙げられる。一般に、最適なＰＣＲプライマーは、通常、１７〜３０塩基の長さであり、約２０〜８０％、例えば、約５０〜６０％のＧ＋Ｃ塩基を含む。５０〜８０℃、例えば約５０〜７０℃のＴｍが通常好ましい。
【００８５】
ＰＣＲ プライマーおよびプローブ設計のためのさらなる指針については、例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ， Ｃ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．， 「Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｆｏｒ ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎ」 ｉｎ： ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９５， ｐｐ． １３３−１５５、Ｉｎｎｉｓ ａｎｄ Ｇｅｌｆａｎｄ， 「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲｓ」 ｉｎ： ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ， １９９４， ｐｐ． ５−１１およびＰｌａｓｔｅｒｅｒ， Ｔ．Ｎ． Ｐｒｉｍｅｒｓｅｌｅｃｔ： Ｐｒｉｍｅｒ ａｎｄ ｐｒｏｂｅ ｄｅｓｉｇｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ． ７０：５２０−５２７ （１９９７）参照のこと。なお、その全開示内容は参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【００８６】
Ｂ．３ アルゴリズムおよび統計的手法
本発明は、同時係属出願第１０／８８３，３０３号に記載される特定のアルゴリズムおよび統計的手法を利用する。
【００８７】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を用いてｍＲＮＡレベルを測定する場合には、ｍＲＮＡ量は ＣＴ（閾値サイクル）単位で表される（Ｈｅｌｄ ｅｔ ａｌ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９８６−９９４ （１９９６））。参照ｍＲＮＡ ＣＴの合計の平均をある数、例えば、ゼロに設定し、各測定される試験ｍＲＮＡ ＣＴをこの点と相対的に与える。例えば、特定の患者の腫瘍試料について、５種の参照遺伝子のＣＴの平均が３１であるとわかっており、試験遺伝子ＸのＣＴが３５であると分かっている場合には、遺伝子Ｘの報告される値は−４（すなわち、３１−３５）である。
【００８８】
ｍＲＮＡレベルの定量的測定後の第１の工程として、腫瘍試料において同定され、癌の分子病理学と関連していることがわかっている遺伝子を部分集合にグループ化する。したがって、細胞増殖と関連しているとわかっている遺伝子は、「増殖グループ」（軸、または部分集合）を構成する。隣接組織の癌による浸潤と関連しているとわかっている遺伝子は「浸潤グループ」（軸または部分集合）を構成する。重要な増殖因子受容体シグナル伝達経路と関連している遺伝子は、ＧＲＢ７グループとも呼ばれる、「増殖因子グループ」（軸、部分集合）を構成する。エストロゲン受容体（ＥＳＲ１）を介した活性化またはシグナル伝達に関与しているとわかっている遺伝子は「エストロゲン受容体（ＥＳＲ１）グループ」（軸または部分集合）を構成する、などである。部分集合のこのリストはもちろん制限するものではない。作製される部分集合は、特定の癌、すなわち、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌などに応じて異なる。一般に、発現が互いに相関しているとわかっている遺伝子または同一経路に関与しているとわかっている遺伝子は同一部分集合にグループ化される。
【００８９】
次の工程では、部分集合中の各ｍＲＮＡの測定された腫瘍レベルに、癌再発のリスクに対する相対的セット内寄与を反映する係数を乗じて積を得、この積に、部分集合中のｍＲＮＡレベルとその係数を用いて同様に算出したその他の積を加えて項、例えば、増殖項、浸潤項、増側因子項などを得る。例えば、リンパ節陰性浸潤性乳癌の場合、増殖因子（ＧＲＢ７グループ）項は、（０．４５〜１．３５）×ＧＲＢ７＋（０．０５〜０．１５）×ＥＲＢＢ２、例えば、０．９×ＧＲＢ７＋０．１×ＥＲＢＢ２などである（以下の実施例参照のこと）。
【００９０】
全体の再発スコアへの各項の寄与は、さらなる係数を用いることによって加重する。例えば、リンパ節陰性浸潤性乳癌の場合、ＧＢ７グループ項の係数は０．２３〜０．７０の間であり得る。
【００９１】
さらに、増殖因子および増殖項などのいくつかの項については、さらなる工程を実施する。項と再発のリスクの間の関係が非線形である場合、項の非線形関数変換、例えば、閾値を用いる。
【００９２】
得られた項の合計が再発スコア（ＲＳｕ）を提供し、これが疾患の通常の成り行きにおける癌再発の尤度を予測する。
【００９３】
本発明のアルゴリズムによって生じるＲＳ尺度は種々の方法で調整できる。したがって、尺度が、例えば、０〜１０、０〜５０または０〜１００をとるよう範囲を選択できる。
【００９４】
例えば、以下の実施例において記載される特定のスケーリングアプローチでは、スケーリングされた再発スコアを０〜１００のスケールで算出する。便宜上、各測定されたＣＴ値に１０を加え、スケーリングされていないＲＳを先に記載したように算出する。ＲＳおよびＳＲＳを算出するための等式は以下の実施例において提供する。
【００９５】
再発スコアまたは再発スコアを算出するために用いられるいずれかの変数の算出では、いずれの遺伝子も、ピアソン係数≧０．５で試験される特定の癌において第１の遺伝子と同時発現する別の遺伝子で置換できる。同様に、本発明の予後法および予測法に含まれる、いずれかの個々の遺伝子または遺伝子グループ（部分集合）内の遺伝子も、ピアソン係数≧０．５で試験される特定の癌において第１の遺伝子と同時発現する別の遺伝子で置換できる。
【００９６】
Ｂ．４ 癌化学療法
癌治療に用いられる化学療法薬は、その作用機序に応じていくつかのグループに分けることができる。いくつかの化学療法薬はＤＮＡおよびＲＮＡに直接損傷を与える。このような化学療法薬は、ＤＮＡの複製を混乱させることによって、複製を完全に停止するか、ナンセンスＤＮＡまたはＲＮＡの生成をもたらす。このカテゴリーには、例えば、シスプラチン（プラチノール（登録商標））、ダウノルビシン（セラビジン（Ｃｅｒａｂｉｄｉｎｅ）（登録商標））、ドキソルビシン（アドリアマイシン（登録商標））およびエトポシド（ベペシド（登録商標））が含まれる。癌化学療法薬のもう１つのグループは、ヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの形成を干渉し、その結果ＲＮＡ合成および細胞複製が阻止される。この種類の薬物の例としては、メトトレキサート（アビトレキサート（Ａｂｉｔｒｅｘａｔｅ）（登録商標））、メルカプトプリン（ピュリネソール（登録商標））、フルオロウラシル（アドルシル（登録商標））およびヒドロキシウレア（ハイドレア（登録商標））が挙げられる。第３の種類の化学療法薬は紡錘体の合成または分解を達成し、結果として、細胞分裂を妨げる。この種類の薬物の例としては、ビンブラスチン（ベルバン（Ｖｅｌｂａｎ）（登録商標））、ビンクリスチン（オンコビン（登録商標））およびタキセン、例えば、パクリタキセル（タキソール（登録商標）およびトセタキセル（タキソテール（登録商標））が挙げられる。トセタキセルは、従前の化学療法が失敗した後の局所進行または転移性乳癌の患者および従前の白金ベースの化学療法が失敗した後の局所進行または転移性非小細胞肺癌の患者を治療するために米国で現在認可されている。これらのすべておよびその他の化学療法薬に対する患者の反応の予測は、明確に本発明の範囲内にある。
【００９７】
特定の実施形態では、化学療法はタキサン誘導体を用いる治療を含む。タキサンとしては、それだけには限らないが、パクリタキセル（タキソール（登録商標））およびドセタキセル（タキソテール（登録商標））が挙げられ、これらは癌の治療に広く用いられている。上記で論じたように、タキサンは、細胞機能において重要な役割を果たす微小管と呼ばれる細胞構造に影響を及ぼす。正常な細胞増殖では、微小管は細胞が分裂を開始する時点で形成される。細胞が分裂を停止すると、微小管は分解されるか破壊される。タキサンは微小管が分解されるのを停止し、これによって細胞増殖を阻止する。
【００９８】
もう１つの特定の実施形態では、化学療法はアントラサイクリン誘導体、例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシンおよびアクラシノマイシンなどを用いる治療を含む。
【００９９】
さらに特定の実施形態では、化学療法はトポイソメラーゼ阻害剤、例えば、カンプトセシン、トポテカン、イリノテカン、２０−Ｓ−カンプトセシン、９−ニトロ−カンプトセシン、９−アミノ−カンプトセシンまたはＧＩ１４７２１１などを用いる治療を含む。
【０１００】
これらおよびその他の化学療法薬のいずれかの組み合わせを用いる治療は明確に考慮される。
【０１０１】
ほとんどの患者は、腫瘍を外科的に切除した直後に化学療法を受ける。このアプローチは、一般にアジュバント療法と呼ばれる。しかし、化学療法は、いわゆるネオアジュバント治療として術前にも投与できる。ネオアジュバント化学療法の使用は、進行し、手術不可能な乳癌の治療を起源とするが、その他の種類の癌の治療にも同様に認められるようになった。ネオアジュバント化学療法の有効性はいくつかの臨床試験で試験されてきた。多施設米国乳房および腸外科補助療法プロジェクト（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｂｒｅａｓｔ ａｎｄ Ｂｏｗｅｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ）Ｂ−１８（ＮＳＡＢ Ｂ−１８）試験（Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １５：２００２−２００４ （１９９７）、Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １６：２６７２−２６８５ （１９９８））では、ネオアジュバント療法を、アドリアマイシンおよびシクロホスファミド（「ＡＣ投与計画」）と組み合わせて実施した。別の臨床試験では、ネオアジュバント療法を、５−フルオロウラシル、エピルビシンおよびシクロホスファミドの組み合わせ（「ＦＥＣ投与計画」）を用いて投与した（ｖａｎ Ｄｅｒ Ｈａｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． １９：４２２４−４２３７ （２００１））。また、より新しい臨床試験では、タキサン含有ネオアジュバント治療計画が用いられている。例えば、Ｈｏｌｍｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８３：１７９７−１８０５ （１９９１）およびＭｏｌｉｔｅｒｎｉ ｅｔ ａｌ， Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， ２４：Ｓ１７− １０−Ｓ− １７−１４ （１９９９）参照のこと。乳癌のためのネオアジュバント化学療法についてのさらなる情報については、Ｃｌｅａｔｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃａｎｃｅｒ ９：１８３−１９５ （２００２）参照のこと。
【０１０２】
Ｂ．５ 本発明のキット
本発明の方法に用いる材料は、周知の手順に従って製造されるキットの調製に向いている。したがって、本発明は、予後転帰または治療に対する反応を予測するための開示された遺伝子の発現を定量化するための遺伝子特異的または遺伝子選択的プローブおよび／またはプライマーを含み得る薬剤を含むキットを提供する。このようなキットは、場合により、腫瘍サンプル、詳しくは、固定され、パラフィン包埋された組織サンプルからＲＮＡを抽出するための試薬および／またはＲＮＡ増幅用試薬を含み得る。さらに、本キットは、場合により、本発明の方法におけるその使用に関連する識別説明書または表示または使用説明書を有する試薬を含み得る。本キットは、例えば、既製のマイクロアレイ、バッファー、適当なヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰまたはｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰおよびＵＴＰ）、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼおよび本発明の１種以上のプローブおよびプライマー（例えば、ＲＮＡポリメラーゼに関して反応性であるプロモーターと連結している適当な長さのポリ（Ｔ）、遺伝子特異的またはランダムプライマー）を含む方法において用いられる、各々、１種以上の種々の試薬（通常、濃縮型で）を含む容器（例えば、本方法の自動実行において使用するのに適したマイクロタイタープレート）を含み得る。
【０１０３】
また、本発明によって提供される方法は、全部または一部において自動化できる。
【０１０４】
また、本発明のすべての態様は、開示された遺伝子と同時発現されることが、例えば、高いピアソン相関係数によって証明される、限定された数のさらなる遺伝子が、開示された遺伝子に加えて、および／または開示された遺伝子の代わりに予後または予測試験に含まれるよう実施できる。
【０１０５】
本発明を説明したが、これは、例示目的で提供されるものであって、決して本発明を制限しようとするものではない、以下の実施例を参照することによってより容易に理解される。
【実施例】
【０１０６】
浸潤性乳癌にけるネオアジュバント化学療法の研究：パラフィン包埋コア生検組織の遺伝子発現プロファイリング
この研究は、化学療法に対して感受性がある患者または耐性の患者を予測する遺伝子または遺伝子群を同定するために実施した。本研究では、ＮＳＡＢＰ研究Ｂ−２０「Ａ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ ｔｏ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ Ｗｏｒｔｈ ｏｆ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ ｏｖｅｒ Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ Ａｌｏｎｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ， Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ａｘｉｌｌａｒｙ Ｎｏｄｅｓ ａｎｄ Ｅｓｔｒｏｇｅｎ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｔｕｍｏｒｓ」Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ８９（２２）： １６７３−１６８２ （１９９７）から得た組織およびデータを用いた。
【０１０７】
研究設計
患者組み入れ基準：ＮＳＡＢＰ研究Ｂ−２０に登録されたもの。患者除外基準：ＮＳＡＢＰアーカイブにおける初期診断から利用可能な腫瘍ブロックがないもの、ブロック中に腫瘍がないまたは極めて小さい腫瘍と、病理学者によるＨ＆Ｅスライドの検査によって評価されるもの、ＲＴ−ＰＣＲ解析には不十分なＲＮＡ（＜２７５ｎｇ）、５種の参照遺伝子の平均非正規化ＣＴ＜３５、臨床不適格者または追跡調査がないもの。
【０１０８】
実験室アッセイ
Ｂ−２０研究においてＴＡＭおよび化学療法で研究登録時に治療された最大６００人の患者から得た固定され、パラフィン包埋された乳房腫瘍組織試料を分析した。Ｂ−２０研究においてＴＡＭ単独で研究登録時に治療された最大２５２人の患者から得た固定され、パラフィン包埋された乳房腫瘍組織から先に抽出したＲＮＡを再分析した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲを用い、各患者について、１６種の癌関連遺伝子および５種の参照遺伝子の発現を定量的に評価した。これは反応あたり２ｎｇのＲＮＡインプットを用い３連で実施した。
【０１０９】
この研究では、腫瘍組織のＲＴ−ＰＣＲ分析に先立って予測的に規定した遺伝子発現アルゴリズムを用いて各患者の再発スコアを算出した。
【０１１０】
病理学的検討および調製
グループ１：腫瘍がないか極めて小さい腫瘍（正常上皮、繊維嚢胞性変化またはＤＣＩＳ／ＬＣＩＳなどのその他の上皮要素によって占められる部分と比較した浸潤性癌細胞によって占められる部分が＜５％）を有する場合は研究から除外した。
【０１１１】
グループ２：顕著な非腫瘍要素（例えば、平滑筋、出血、繊維症、過形成、上皮および／または正常乳房、ただし、ＤＣＩＳ、ＬＣＩＳまたは壊死ではない）を有するスライド上の領域を含み、非腫瘍要素がマクロダイセクションを受けられるよう十分に局在化しており、かつ、十分な量である（スライド上の組織全体の＞５０％）場合。これらの場合ではマクロダイセクションを実施した。
【０１１２】
グループ３：すべてのその他の場合はダイセクションせずに分析した。
【０１１３】
患者の生存率
原発分析のために、遠隔再発のない生存率（ＤＲＦＳ）は、手術から最初の遠隔再発までの時間（年）に基づくものとした。対側性疾患、その他の二次原発癌および遠隔再発の前の死亡は打ち切り事象と考えた。
【０１１４】
遺伝子発現
再発スコアの算出に用いた２１種の遺伝子の発現レベルは、ＧＨＩアッセイから得た値として報告した。表１は１６種の試験遺伝子および５種の参照遺伝子の同一性を示す。遺伝子発現値は、５種の参照遺伝子の平均に対して正規化した。参照遺伝子は、乳癌ならびに種々のサンプリングおよび加工条件下において比較的不変であることがわかっており、このために外来作用について正規化するのに有用なものとなっている。参照によって正規化した発現測定値は、通常、１単位増が通常ＲＮＡ量の２倍の増大を反映する、０〜１５の範囲である。解析のために２１種の予め指定した遺伝子を表１に列挙する。
【０１１５】
【表１】
生物統計分析
再発スコアは予後因子および予測因子の両方を含む。乳癌における治療予測遺伝子を同定する目的で、主目的は、治療された患者における遺伝子発現とＤＲＦＳの間の関係を調査することである。このような解析には、治療された患者および治療されていない患者双方から得たデータを用いて、治療予測遺伝子と純粋に予後的な遺伝子を区別した。化学療法治療予測遺伝子を同定するために、ＮＳＡＢＰ研究Ｂ−２０から、ＴＡＭのみで治療された患者とＴＡＭおよび化学療法の両方で治療された患者の双方を含めた。
【０１１６】
Ｃｏｘの比例ハザードモデルを用いて、治療効果と遺伝子発現の間の相互作用を調べた。Ｃｏｘ， Ｊ Ｒｏｙａｌ Ｓｔａｔ Ｓｏｃ Ｓｅｒｉｅｓ Ｂ ３４（２）：１８７−２２０ （１９７２）； Ｔｈｅｒｎｅａｕ ａｎｄ Ｇｒａｍｓｃｈ， Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｄａｔａ： Ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｃｏｘ Ｍｏｄｅｌ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ （２０００） ＩＳＢＮ ０−３８７−９８７８４−３。治療と遺伝子発現の間の相互作用は、治療効果が遺伝子発現レベルに応じて異なる場合に、すなわち、遺伝子発現が治療予測因子である場合に存在する（Ｆｉｓｈｅｒ， Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ， Ｏｌｉｖｅｒ ａｎｄ Ｂｏｙｄ， Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ （１９７４）； Ｓａｖａｇｅ Ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｉｔｉｃｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９６４）。尤度比検定を用い、治療相互作用による遺伝子発現を排除して減少させたモデルを、治療相互作用による遺伝子発現を含む競合的全モデルと比較することによって、統計的に有意な予測治療遺伝子を同定した。
【０１１７】
再発スコア
０〜１００の尺度での再発スコア（ＲＳ）は、以下のように参照によって正規化した発現測定値から導く：
ＲＳｕ＝０．４７×ＧＲＢ７グループ閾値スコア
−０．３４×ＥＳＲ１グループスコア
＋１．０４×増殖グループ閾値スコア
＋０．１０×浸潤グループスコア
＋０．０５×ＣＤ６８
−０．０８×ＧＳＴＭ１
−０．０７×ＢＡＧ１
式中、
【０１１８】
【数６】
次いで、ＲＳｕ（スケーリングしていない再発スコア）を０〜１００の間となるよう再スケーリングする：
【０１１９】
【数７】
３グループへの分類
ＲＳを用いて、各患者の再発リスクグループを決定した。低、中および高リスク再発グループの間のカットオフ点は以下のように定義する：
リスクグループ 再発スコア
低リスクの再発 １８未満
中リスクの再発 １８以上かつ３１未満
高リスクの再発 ３１以上
【０１２０】
結果
表２は、試験した変数のうち６、すなわち、ＲＳ、増殖グループ閾値スコア（Ｐｒｏ１Ｔｈｒｅｓ）、ＭＹＢＬ２、浸潤グループスコア、ＳＣＵＢＥ２およびＥＳＲ１グループスコアが、統計的に有意（Ｐ＜０．１）に有益な化学療法反応と相互作用したことが１０年ＤＲＦＳによって測定されたことを示す。表２中、ＲＳ／５０の項によって示されるように、ＲＳの相互作用分析を全部で１００点の範囲の下方半分にかけて実施した。
【０１２１】
【表２】
表２に示されるように、以下の遺伝子および遺伝子セットの発現の増大が、１０年の遠隔再発のない生存の尤度の増大と相関している：ＲＳ、ＭＹＢＬ２、増殖グループ閾値スコア、浸潤グループスコア。以下の遺伝子の発現の増大は、治療に対する有益な反応の尤度の低下と相関している：ＳＣＵＢＥ２、ＥＳＲ１グループスコア。ＲＳアルゴリズムの個々の重要な構成要素、すなわち、ＰｒｏｌｉｆＡｘｉｓｔｈｒｅｓｈ、浸潤グループおよびＥＳＲ１グループはすべて独立に、化学療法の有効性の尤度の増大に対応してＲＳの上昇と一致する方向で化学療法に対する反応に影響を及ぼすことは注目すべきである。
【０１２２】
図１は、１０年でのＲＳリスクグループカテゴリー（低、中および高リスク）とＮＳＡＢＰ Ｂ−２０集団にわたる化学療法の有効性パーセントとの間の関係を示す。高リスク患者の間での平均有効性（ＲＳ＞３１によって定義される）は約２８％であり、９５％の信頼限界を有し、１２〜４２％にわたっていた。すなわち、このグループでは、平均化学療法で、１０年での再発の絶対リスクが２８％減少した。これは化学療法を受けていない高リスク患者は、平均して、３０％を少し上回る再発の絶対リスクを有し、このことは化学療法はこの患者グループでは再発の相対率を約９０％低減できることを示すことから注目すべきことである。中リスク患者の場合では（１８〜３１の間のＲＳによって定義される）、平均有効性はほとんどゼロであり、９５％の信頼限界を有し、−１０〜＋１０％にわたっていた。低リスク患者の場合には（ＲＳ＜１８によって定義される）平均有効性はほぼゼロであり、９５％信頼限界を有し、−４〜＋４％にわたっていた。
【０１２３】
これらの結果は、ＥＳＲ１陽性初期乳癌患者を化学療法で治療するか否かについての決定を導くための有用性を有する。ＮＳＡＢＰ Ｂ１４ ＴＡＭ治療群における再発スコアアルゴリズムの確証により、高リスクグループの患者は１０年で＞３０％の乳癌再発のリスクを有するということが実証された。本明細書に示されたデータは、この高リスク集団は、化学療法を受けることを選択すれば、化学療法治療に由来する極めて大きな有効性を有し、再発を低リスク患者のものに低減する可能性があることを示す。他方、ＴＡＭ治療を受けた低リスク集団は、化学療法なしで約７％の再発のリスクを有するが、化学療法が相対的に少ないリスクの低減しかもたらさないと予期できる。
【０１２４】
ＲＳは連続変数であるので、所与の患者の正確な数値のＲＳを用いて、化学療法から得られる患者個人の有効性の尤度を示すことができる。これを図２に示す。
【０１２５】
開示内容を通じて引用されたすべての参照文献は、参照により本明細書によって明確に組み込まれる。
【０１２６】
当業者ならば、本発明の実施に使用できる、本明細書に記載されるものと同様または同等の多数の方法および材料を認識するであろう。実際、本発明は、記載される方法および材料に決して制限するものではない。本発明を具体的な実施形態であると考えられるものに関連して説明してきたが、本発明はこのような実施形態に限定されないことは理解されなくてはならない。それとは反対に、本発明は、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲内に含まれる種々の改変および同等物を対象とするものとする。例えば、開示内容は、ＣＭＦ（シクロホスファミド、メトトレキサート、フルオロウラシル）化学療法を用いる治療に対する乳癌患者の有益な反応を予測するのに有用な遺伝子および遺伝子のグループを同定することによって例示されるが、その他の化学療法薬を用いる治療に対する患者の反応を調べる同様の方法、ならびに同様の遺伝子、遺伝子セットおよびその他の種類の癌に関する方法も、明確に本明細書における範囲内にある。
【０１２７】
【表３−１】
【０１２８】
【表３−２】
【０１２９】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】再発スコアによって、低、中または高リスクとして同定されるＮＳＡＢＰ Ｂ−２０患者群内の１０年でのＤＲＥＳによって求められる化学療法の絶対的有効性を示す図である。
【図２】再発スコアによって、連続型変数として同定されるＮＳＡＢＰ Ｂ−２０患者群内の１０年でのＤＲＥＳによって求められる化学療法の絶対的有効性を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、癌患者が化学療法での治療反応に対して有益な反応を有する可能性が高いかどうかを予測するために有用な遺伝子発現情報を提供する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の説明
遺伝子発現研究
癌専門医には、彼らが利用できるいくつかの治療選択肢、例えば、「標準治療」と位置づけられる、化学療法薬の種々の組み合わせ、および個々の癌の治療のための表示事項はないが、その癌における有効性の証拠があるいくつかの薬物がある。良好な治療成果の最良の尤度を得るには、転移性疾患の最高の危険にある患者を同定し、最適な利用可能な癌治療を与えることが必要である。詳しくは、「標準治療」治療薬、例えば、シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、アントラサイクリン、タキサンおよび抗エストロゲン薬、例えば、タモキシフェンに対する患者の反応の尤度を調べることが重要であるが、これは、これらには限定された有効性しかなく、重篤な副作用の範囲を有することも多いからである。したがって、利用可能な薬物を必要とし、これに対して反応する可能性が最も高い、または最も低い患者を同定することにより、より賢明な患者選択によって、これらの薬物が提供しなくてはならない正味の有効性を増大させ、正味の死亡率および毒性を低減することができる。
【０００３】
現在、臨床診療において用いられる診断学的検査は、単一分析物であり、したがって、多くの異なるマーカー間の関係を知るという潜在的価値を獲得するものではない。さらに、診断学的検査は、定量的でない免疫組織化学に基づいたものであることが多い。主に解釈が主観的であるために、免疫組織化学からは、異なる実験室では異なる結果が生じることも多い。ＲＮＡベースの試験は高度に定量的である可能性があるが、ＲＮＡは、ごく普通に調製された、すなわち、ホルマリンで固定され、パラフィンに包埋された（ＦＰＥ）腫瘍試料では破壊されるという認識のために、また、分析のために患者から新鮮組織サンプルを得、保存することは不都合であるために開発されていない。
【０００４】
過去２０年間にわたって、分子生物学および生化学は、その活性が腫瘍細胞の挙動、分化状態および特定の治療薬に対する感受性または耐性に影響を及ぼす何百もの遺伝子を明らかにしてきた。しかし、若干の例外はあるが、これらの遺伝子の状態は、薬物治療に関する臨床決定を日常的に行うことを目的として活用されてこなかった。過去数年の間に、いくつかのグループが、何千もの遺伝子のマイクロアレイ遺伝子発現解析による種々の癌の種類の分類に関する研究を公開した（例えば、Ｇｏｌｕｂ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：５３１−５３７ （１９９９）、Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊａｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９８：１３７９０−１３７９５ （２００１）、Ｃｈｅｎ−Ｈｓｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １７ （Ｓｕｐｐｌ． １）：Ｓ３１６−Ｓ３２２ （２００１）、Ｒａｍａｓｗａｍｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． ＳｃＬ ＵＳＡ ９８：１５１４９−１５１５４ （２００１）、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６０：２２３２−２２３８ （２０００）、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９８：１１４６２−１１４ （２００１）、Ｓｏｒｌｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９８：１０８６９−１０８７４ （２００１）、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６１：８３７５−８３８０ （２００１））参照のこと）。しかし、主に、マイクロアレイが新鮮または凍結組織ＲＮＡを必要とし、そのような試料は、同定される分子署名の臨床評価を可能にするほど十分な量で存在しないという理由で、これらの研究はまだ、臨床診療において日常的に用いられる試験を生み出していない。
【０００５】
過去３年において、ＲＴ−ＰＣＲ技術を用いてホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＰＥ）組織において数百の遺伝子の遺伝子発現をプロファイリングすることが可能となった。感度が高く、正確で、再現性のある方法が記載された（非特許文献１）。何千もの保管されているＦＰＥ臨床組織試料が、関連する臨床記録、例えば、生存、薬物治療暦などとともに存在するので、今や、この種の組織において遺伝子発現を定量的にアッセイする能力によって、特定の遺伝子の発現を、患者の予後および治療に対する反応の尤度と関連付ける迅速な臨床研究が可能となる。臨床事象は歴史的であるので、過去の臨床研究によって作成されたデータを用いて、迅速な結果が可能となる。対照的に、例えば、新しく補充された癌患者に関する生存研究を実施することを望む場合には、通常、統計的に十分な数の死亡が起こる間何年も待つ必要がある。
【０００６】
乳癌
乳癌は、米国では女性の間で最も一般的な種類の癌であり、４０〜５９歳の女性の間では癌による死亡の主要原因である。
【０００７】
現在、乳癌ではいくつかの分子的試験しか日常的に臨床使用されていない。エストロゲン受容体（ＥＳＲ１）およびプロゲステロン受容体（ＰＧＲ）タンパク質の免疫組織化学的アッセイが、抗エストロゲン剤、例えば、タモキシフェン（ＴＡＭ）を用いる治療に対する患者の選択の根拠として用いられている。さらに、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２）免疫化学または蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（それぞれ、タンパク質およびＤＮＡを測定する）が、Ｈｅｒ２アンタゴニスト剤、例えば、トラスツズマブ（ヘルセプチン（登録商標）；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ）を用いる患者を選択するために用いられている。
【０００８】
現在の予後診断のための試験および化学療法に対する反応を予測するための試験が不十分であるために、乳癌治療戦略が癌専門医の間で異なる（Ｓｃｈｏｔｔ ａｎｄ Ｈａｙｅｓ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ＰＭＩＤ １５５０５２７４ （２００４）；非特許文献２）。一般に、腫瘍がＥＳＲ１陽性であるとわかっているリンパ節陰性の患者は、ＴＡＭなどの抗エストロゲン剤で治療され、腫瘍がＥＳＲ１陰性であるとわかっている患者は化学療法で治療される。ＥＳＲ１陽性はまた、癌再発のリスクをやや弱めるために化学療法の毒性副作用を受け入れて、抗エストロゲン療法に加えて化学療法も処方されることが多い。毒性としては、神経障害、悪心およびその他の胃腸症状、脱毛および認知障害が挙げられる。再発性乳癌は、通常、転移性であり、治療に対する反応性が悪いために再発は恐れられるべきものである。再発のリスクがかなりある患者を同定する（すなわち、予後情報を提供する）必要性および化学療法に対して反応する可能性が高い患者を同定する（すなわち、予測情報を提供する）必要性が存在することは明確である。同様に、再発のリスクがあまり高くない患者を同定する必要性または化学療法に対して反応する可能性が低い患者を同定する必要性も存在するが、これは、これらの患者がこれらの毒性薬物に対する不必要な曝露を免れるべきであるからである。
【０００９】
乳癌では、予後因子は治療予測因子とは異なる。予後因子とは、乳癌の自然史に関連している可変のものであり、乳癌にかかった患者の再発率および転帰に影響を及ぼす。悪い予後と関連していた臨床パラメーターとしては、例えば、リンパ節の関与、腫瘍の大きさの増大および高いグレードの腫瘍が挙げられる。予後因子は患者をベースライン再発リスクが異なるサブグループに分類するためによく用いられる。対照的に、治療予測因子は、個々の患者の、抗エストロゲンまたは化学療法などの治療に対する有益な反応の尤度に関連する変数であり、予後とは無関係である。
【００１０】
特定の種類の治療に対する癌患者、例えば、乳癌患者の尤度を確実に予測する、正確で、定量的な試験が大いに必要とされている。このような試験は、開業医が、根拠の確かなリスク有効性分析に基づいて、個々の患者の要求に適応させた、理にかなった治療選択を行うのを補助する。
【非特許文献１】Ｃｒｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．（２００４）１６４：３５−４２
【非特許文献２】Ｈａｙｅｓ， Ｂｒｅａｓｔ（２００３）１２：５４３−９
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一態様では、本発明は、癌と診断された被験体の化学療法に対する有益な反応の尤度を予測する方法であって、
（ａ）前記被験体から得られた癌細胞を含む生体サンプルにおいて、以下の変数のうち１以上の値を定量的に決定する工程を含み、
（ｉ）再発スコア
（ｉｉ）ＥＳＲ１グループスコア
（ｉｉｉ）浸潤グループスコア
（ｉｖ）増殖グループ閾値スコア
（ｖ）ＭＹＢＬ２およびＳＣＵＢＥ２の少なくとも一方のＲＮＡ転写物、または対応する発現産物の発現レベル、
（ｂ１）（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）のうち１以上の値、またはＭＹＢＬ２のＲＮＡ転写物もしくは対応する発現産物の発現レベルの増加のどの単位についても、前記被験体が、前記化学療法に対する有益な反応の比例して増加した尤度を有すると同定され、
（ｂ２）（ｉｉ）の値またはＳＣＵＢＥ２のＲＮＡ転写物もしくは対応する発現産物の発現レベルの増加のどの単位についても、前記被験体が、化学療法に対する有益な反応の比例して減少した尤度を有すると同定され、
（ｂ３）（ｉ）の値の増加のどの単位についても、前記被験体が、化学療法に対する有益な反応の増加した尤度を有すると同定されると、乳癌再発のリスクの低下によって判定され、
ＥＳＲ１グループスコア＝（ＥＳＲ１＋ＰＧＲ＋ＢＣＬ２＋ＳＣＵＢＥ２）／４、
浸潤グループスコア＝（ＣＴＳＬ２＋ＭＭＰ１１）／２、
ＧＲＢ７グループスコア＝０．９×ＧＲＢ７＋０．１×ＥＲＢＢ２、
ＧＲＢ７グループ閾値スコアは、ＧＲＢ７グループスコアが８未満である場合は８に等しく、ＧＲＢ７グループスコアが８以上である場合にはＧＲＢ７グループスコアに等しく、
増殖グループスコア＝（ＢＩＲＣ５＋ＭＫＩ６７＋ＭＹＢＬ２＋ＣＣＮＢ１＋ＳＴＫ６）／５、
増殖グループ閾値スコアは、増殖グループスコアが６．５未満である場合には６．５に等しく、増殖グループスコアが６．５以上である場合には増殖グループスコアに等しく、
【００１２】
【数３】
［式中、
ＲＳｕ＝０．４７×ＧＲＢ７グループ閾値スコア
−０．３４×ＥＳＲ１グループスコア
＋１．０４×増殖グループ閾値スコア
＋０．１０×浸潤グループスコア
＋０．０５×ＣＤ６８
−０．０８×ＧＳＴＭ１
−０．０７×ＢＡＧ１］
等式中の遺伝子記号は、それぞれの遺伝子のＲＮＡ転写物またはその発現産物の発現レベルを表し、変数（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）における遺伝子の個々の寄与は０．５〜１．５の因子によって加重され、
前記変数のいずれか中に存在するあらゆる個々の遺伝子およびあらゆる遺伝子が、ピアソン相関係数≧０．５で前記癌において前記遺伝子と同時に発現する別の遺伝子で置換できる方法に関する。
【００１３】
被験体は哺乳類、例えば、霊長類、例えば、ヒト患者であることが好ましい。
【００１４】
特定の実施形態では、変数（ｉ）〜（ｖ）に含まれるすべての遺伝子またはそれらの発現産物の発現レベルを、１種以上の参照遺伝子またはそれらの発現産物の発現レベルに対して正規化する。例えば、参照遺伝子は、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤ、ＧＵＳＢ、ＲＰＬＰ０およびＴＦＲＣからなる群から選択できる。もう１つの実施形態では、発現レベルをＡＣＴＢ、ＧＡＰＤ、ＧＵＳＢ、ＲＰＬＰ０およびＴＦＲＣ、またはそれらの発現産物の発現レベルの平均に対して正規化する。
【００１５】
さらなる実施形態では、化学療法に対する有益な反応の尤度についての定量値が、連続体にわたって決定される変数または複数の変数の値に直接比例する。
【００１６】
癌は、例えば、充実腫瘍、例えば、乳癌、卵巣癌、胃癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌および肺癌であり得る。乳癌は、それだけには限らないが、浸潤性乳癌、またはステージＩＩもしくはステージＩＩＩ乳癌およびＥＳＲ１陽性乳癌を含む。
【００１７】
患者が、化学療法に対する有益な反応の増加した尤度を有すると決定される場合、本発明の方法は、患者を化学療法を用いて治療する工程をさらに含み得る。化学療法は、アジュバント化学療法またはネオアジュバント化学療法であり得、特定の癌の治療に有効であるとわかっているいずれかの化学療法薬の投与を含む。したがって、化学療法薬としては、アントラサイクリン誘導体、例えばドキソルビシンまたはアドリアマイシン、タキサン誘導体、例えば、パクリタキセルまたはドセタキセル、トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、カンプトセシン、トポテカン、イリノテカン、２０−Ｓ−カンプトセシン、９−ニトロ−カンプトセシン、９−アミノ−カンプトセシンまたはＧＩ１４７２１１およびヌクレオチド生合成の阻害剤、例えば、メトトレキサートおよび／または５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）が挙げられる。
【００１８】
本発明の方法は、列挙した変数のうち少なくとも２つまたは少なくとも３つまたは少なくとも４つまたは５つの決定を含み得る。
【００１９】
特定の実施形態では、本発明の方法は、ＭＹＢＬ２およびＳＣＵＢＥ２またはそれらの発現産物ののうち一方もしくは両方の発現レベルの決定を含む。
【００２０】
生体サンプルは、例えば、癌細胞を含む組織サンプルであり得る。
【００２１】
組織サンプルは、それだけには限らないが、固定され、パラフィンに包埋されているか、新鮮なものであるか、凍結されているものであってよく、例えば、細針生検、コア生検またはその他の種類の生検に由来するものであり得る。特定の実施形態では、組織サンプルは、微細針吸引生検、気管支洗浄または経気管支生検によって得られる。
【００２２】
さらなる実施形態では、前記発現レベルの決定は定量的ＲＴ−ＰＣＲを含む。
【００２３】
異なる実施形態では、列挙した遺伝子の発現産物の発現レベルの決定は免疫組織化学を含む。
【００２４】
さらなる実施形態では、遺伝子発現産物のレベルをプロテオミクス技術によって決定する。
【００２５】
なおさらなる実施形態では、遺伝子の発現レベルを標的遺伝子配列に基づいたプライマーおよびプローブ配列を用いる定量的ＲＴ−ＰＣＲによって決定する。
【００２６】
特定の実施形態では、少なくとも１種の標的遺伝子配列はイントロンに基づく配列であり、イントロンの発現は同一遺伝子のエキソン配列の発現と相関する。
【００２７】
本発明の方法は、前記の有益な反応の尤度を要約する報告書を作製する工程と、場合により、その報告書を、癌と診断された患者および／または患者の医師に個人用ゲノムプロフィールとして提供する工程とを含み得る。
【００２８】
もう１つの態様では、本発明は癌と診断された被験体の個人用ゲノムプロフィールを調製する方法であって、
（ａ）前記被験体から得られた癌細胞を含む生体サンプルにおいて、以下の変数のうち１以上の値を定量的に決定する工程を含み、
（ｉ）再発スコア
（ｉｉ）ＥＳＲ１グループスコア
（ｉｉｉ）浸潤グループスコア
（ｉｖ）増殖グループ閾値スコア
（ｖ）ＭＹＢＬ２およびＳＣＵＢＥ２の少なくとも一方のＲＮＡ転写物の発現レベル、
（ｂ１）（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）のうち１以上の値、またはＭＹＢＬ２のＲＮＡ転写物もしくは対応する発現産物の発現レベルの増加のどの単位についても、前記被験体が、前記化学療法に対する有益な反応の比例して増加した尤度を有すると同定され、
（ｂ２）（ｉｉ）の値またはＳＣＵＢＥ２のＲＮＡ転写物もしくは対応する発現産物の発現レベルの増加のどの単位についても、前記被験体が、化学療法に対する有益な反応の比例して減少した尤度を有すると同定され、
（ｂ３）（ｉ）の値の増加のどの単位についても、前記被験体が、化学療法の不在下で乳癌再発の増加した尤度を有すると同定され、
ＥＳＲ１グループスコア＝（０．８×ＥＳＲ１＋１．２×ＰＧＲ＋ＢＣＬ２＋ＳＣＵＢＥ２）／４、
浸潤グループスコア＝（ＣＴＳＬ２＋ＭＭＰ１１）／２、
ＧＲＢ７グループスコア＝０．９×ＧＲＢ７＋０．１×ＥＲＢＢ２、
ＧＲＢ７グループ閾値スコアは、ＧＲＢ７グループスコアが８未満である場合は８に等しく、ＧＲＢ７グループスコアが８以上である場合にはＧＲＢ７グループスコアに等しく、
増殖グループスコア＝（ＢＩＲＣ５＋ＭＫＩ６７＋ＭＹＢＬ２＋ＣＣＮＢ１＋ＳＴＫ６）／５、
増殖グループ閾値スコアは、増殖グループスコアが６．５未満である場合には６．５に等しく、増殖グループスコアが６．５以上である場合には増殖グループスコアに等しく、
【００２９】
【数４】
［式中、
ＲＳｕ＝０．４７×ＧＲＢ７グループ閾値スコア
−０．３４×ＥＳＲ１グループスコア
＋１．０４×増殖グループ閾値スコア
＋０．１０×浸潤グループスコア
＋０．０５×ＣＤ６８
−０．０８×ＧＳＴＭ１
−０．０７×ＢＡＧ１］
等式中の遺伝子記号は、それぞれの遺伝子のＲＮＡ転写物またはその発現産物の発現レベルを表し、変数（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）における遺伝子の個々の寄与は０．５〜１．５の因子によって加重され、
前記変数のいずれか中に存在するあらゆる個々の遺伝子または遺伝子が、ピアソン相関係数≧０．５で前記癌において前記遺伝子と同時に発現する別の遺伝子で置換でき、
（ｃ）前記遺伝子発現解析によって得られたデータを要約する報告書を作製する工程を含む方法に関する。
【００３０】
特定の実施形態では、（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）のうち１以上の値、またはＭＹＢＬ２のＲＮＡ転写物もしくは対応する発現産物の発現レベルの増加が決定される場合に、前記被験体が、化学療法に対する有益な反応の増加した尤度を有するという予測を前記報告書が含む。この場合、本方法は前記被験体を化学療法薬で治療する工程をさらに含み得る。
【００３１】
さらにもう１つの実施形態では、（ｉｉ）の値またはＳＣＵＢＥ２のＲＮＡ転写物もしくは対応する発現産物の発現レベルの増加が決定される場合に、前記被験体が、化学療法に対する有益な反応の減少した尤度を有するという予測を前記報告書が含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
Ａ．定義
特に断りのない限り、本明細書に用いられる技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に通常理解されているものと同一の意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄ．， Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ １９９４）およびＷｅｂｓｔｅｒ’ｓ Ｎｅｗ ＷｏｒｌｄTM Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｗｉｌｅｙ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．， ２００３が、当業者に本願において用いられる多数の用語の総合手引書を提供している。本発明の目的には、以下に、次の用語を定義する。
【００３３】
用語「マイクロアレイ」とは、基材上の、ハイブリダイズ可能なアレイエレメント、好ましくは、ポリヌクレオチドプローブの規則正しい配列を指す。
【００３４】
用語「ポリヌクレオチド」とは、単数形または複数形で用いられる場合、一般に、いずれかのポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指し、これは、修飾されていないＲＮＡまたはＤＮＡである場合もあるし、修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡである場合もある。したがって、例えば、本明細書において定義されるポリヌクレオチドは、それだけには限らないが、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域を含むＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡならびに一本鎖および二本鎖領域を含むＲＮＡ、一本鎖である場合もあるが、より通常は二本鎖であり、または一本鎖領域と二本鎖領域を含む場合もあるＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を含む。さらに、本明細書において、用語「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの双方を含む三本鎖領域を指す。このような領域中の鎖は同一分子に由来する場合もあるし、異なる分子に由来する場合もある。これらの領域は１種以上の分子のすべてを含む場合もあるが、より通常は、分子の一部の領域のみを含む。トリプルへリックス領域の分子の１種は、オリゴヌクレオチドであることが多い。用語「ポリヌクレオチド」は、具体的にはｃＤＮＡを含む。この用語は、１個以上の修飾された塩基を含むＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）およびＲＮＡを含む。したがって、安定性のため、またはその他の理由で修飾された主鎖を有するＤＮＡまたはＲＮＡは「ポリヌクレオチド」であると、本明細書においては意図される。さらに、普通でない塩基、例えば、イノシンまたは修飾された塩基、例えば、トリチウム化塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書において定義される用語「ポリヌクレオチド」内に含まれる。一般に、用語「ポリヌクレオチド」は、修飾されていないポリヌクレオチドのすべての化学的に、酵素的におよび／または代謝的に修飾された形態、ならびにウイルスおよび細胞、例えば、単純細胞および複雑型細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。
【００３５】
用語「オリゴヌクレオチド」とは、相対的に短いポリヌクレオチド、例えば、それだけには限らないが、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、一本鎖または二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドおよび二本鎖ＤＮＡを指す。オリゴヌクレオチド、例えば、一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドは、化学法によって、例えば、市販の自動化オリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いて合成されることが多い。しかし、オリゴヌクレオチドは種々のその他の方法、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ媒介技術によって、また、細胞および生物におけるＤＮＡの発現によって製造できる。
【００３６】
用語「遺伝子発現」とは、ＤＮＡ遺伝子配列情報の転写ＲＮＡ（最初のスプライシングされていないＲＮＡ転写物または成熟ｍＲＮＡ）またはコードされるタンパク質産物への変換を表す。遺伝子発現は、遺伝子の全ＲＮＡまたはタンパク質産物のいずれかまたはそれらのその後のレベルを測定することによってモニターできる。
【００３７】
ＲＮＡ転写物に関して用語「過剰発現」とは、試料中のすべての測定される転写物であるか、または特定の参照セットのｍＲＮＡであり得る、参照ｍＲＮＡのレベルに対する正規化によって決定される転写物のレベルを指して用いられる。
【００３８】
語句「遺伝子増幅」とは、特定の細胞または細胞株において、遺伝子または遺伝子断片の複数のコピーが形成されるプロセスを指す。複製された領域（ひと続きの増幅されたＤＮＡ）は、「単位複製配列」と呼ばれることが多い。また、通常、産生されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量、すなわち、遺伝子発現レベルは、発現される個々の遺伝子からなるコピー数の割合で増加する。
【００３９】
予後因子とは、乳癌の自然史に関連している可変のものであり、一度乳癌にかかった患者の再発率および転帰に影響を及ぼす。悪い予後と関連していた臨床パラメーターとしては、例えば、リンパ節の関与、腫瘍の大きさの増大および高いグレードの腫瘍が挙げられる。予後因子は患者をベースライン再発リスクが異なるサブグループに分類するためによく用いられる。対照的に、治療予測因子は、個々の患者の、抗エストロゲンまたは化学療法などの治療に対する有益な反応の尤度に関連する変数であり、予後とは無関係である。
【００４０】
本明細書において用語「予後」とは、癌に起因する死亡または癌進行、例えば、乳癌などの新生物性疾患の、その疾患の自然史の間の再発および転移拡散の尤度を指して用いられる。予後因子とは、乳癌などの新生物性疾患の自然史と関連した可変のものであり、一度乳癌などの新生物性疾患にかかった患者の再発率および疾患転帰に影響を及ぼす。これに関連して、「自然転帰」とは、さらなる治療の不在下での転帰を意味する。例えば、乳癌の場合には、「自然転帰」とは、腫瘍を外科的に切除した後の、さらなる治療（例えば、化学療法または放射線治療）の不在下での転帰を意味する。予後因子は患者をベースラインリスク、例えば、ベースライン再発リスクが異なるサブグループに分類するためによく用いられる。
【００４１】
本明細書において用語「予測」とは、患者が薬物または薬物のセットに対して好都合にか、または不都合にのいずれかで反応する尤度、またそれらの反応の程度を指して用いられる。したがって、治療予測因子は、指定の治療に対する個々の患者の反応に関連した可変のものであり、予後とは無関係である。本発明の予測法を臨床的に用いて、いずれかの特定の患者にとって最も適当な治療様式を選択することによって治療法の決定を行うことができる。本発明の予測法は、患者が治療計画、例えば、抗エストロゲン療法、例えば、単独または化学療法および／または放射線療法との組み合わせでのＴＡＭ治療に対して好都合に反応する可能性が高いかどうかを予測するのに有益な手段である。
【００４２】
用語「有益な反応」とは、患者の状態の何らかの尺度、例えば、全生存、長期生存、再発がない生存および遠隔再発のない生存などの当技術分野で通常用いられる尺度の改善を意味する。再発のない生存（ＲＦＳ）とは、手術から最初の局所再発（ｌｏｃａｌ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）、局所再発（ｒｅｇｉｏｎａｌ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）または遠隔再発までの時間（年）を指す。遠隔再発のない生存（ＤＦＲＳ）とは、手術から最初の遠隔再発までの時間（年）を指す。再発とは、その個々の用法によって明らかなようにＲＦＳおよび／またはＤＦＲＳを指す。実際のところは、これらの尺度の算出は、審査される事象または検討されない事象の定義に応じて、研究毎に異なっていることがある。本明細書において用語「長期」生存とは、術後またはその他の治療後、少なくとも３年の、より好ましくは少なくとも８年の、最も好ましくは少なくとも１０年の生存を指して用いられる。
【００４３】
本明細書において用語「腫瘍」とは、悪性であるか良性であるかに関わらず、すべての新生細胞成長および増殖ならびにすべての前癌状態および癌性の細胞および組織を指す。
【００４４】
用語「癌」および「癌性」とは、通常、制御されていない細胞増殖を特徴とする哺乳類における生理学的状態を指すか表す。癌の例としては、それだけには限らないが、乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫および脳癌が挙げられる。
【００４５】
癌の「病状」は、患者の健康を損なうすべての現象を含む。これとしては、それだけには限らないが、異常なまたは制御不能な細胞増殖、転移、隣接する細胞の正常な機能への干渉、異常なレベルのサイトカインまたはその他の分泌産物の放出、炎症反応または免疫反応の抑制または増悪、新生物、前悪性、悪性腫瘍、周囲の組織または遠隔組織または臓器、例えば、リンパ節の浸潤などが挙げられる。
【００４６】
本発明に関連して、いずれかの特定の遺伝子セット中の列挙された遺伝子のうち「少なくとも１種」、「少なくとも２種」、「少なくとも３種」、「少なくとも４種」、「少なくとも５種」などとは、列挙された遺伝子のいずれか１種またはありとあらゆる組み合わせを意味する。
【００４７】
本明細書において用語「リンパ節転移陰性」癌、例えば、「リンパ節転移陰性」乳癌は、流入領域リンパ節に広がっていない癌を指して用いられる。
【００４８】
用語「スプライシング」と「ＲＮＡスプライシング」は、同じ意味で用いられ、イントロンを除去してエキソンをつなげ、連続するコード配列を有する成熟ｍＲＮＡを生成するＲＮＡプロセシングを指し、この成熟ｍＲＮＡが真核細胞の細胞質に移動する。
【００４９】
理論上は、用語「エキソン」とは、成熟ＲＮＡ産物で表される断続性の遺伝子のいずれかのセグメントを指す（Ｂ． Ｌｅｗｉｎ． Ｇｅｎｅｓ ＩＶ Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｍａｓｓ．１９９０）。理論上は、用語「イントロン」とは、エキソンとともにそのいずれかの側に転写されるがスプライシングによって転写物内から除去されるＤＮＡのいずれかのセグメントを指す。操作上は、エキソン配列は、参照配列番号によって定義される遺伝子のｍＲＮＡ配列中に生じる。操作上は、イントロン配列は、エキソン配列によってひとくくりにされ、５’および３’境界にＧＴおよびＡＧスプライシングコンセンサス配列を有する、遺伝子のゲノムＤＮＡ内の介在配列である。
【００５０】
Ｂ．詳細な説明
本発明の実施は、特に断りのない限り、当技術分野の技術の範囲内にある、統計解析、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学および生化学の従来の技術を用いる。このような技術は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９）、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」 （ＭＪ． Ｇａｉｔ， ｅｄ．， １９８４）、「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」 （ＲＩ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， ｅｄ．， １９８７）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」 （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」， ４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｄ．Ｍ． Ｗｅｉｒ ＆ ＣＣ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ， ｅｄｓ．， Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．， １９８７）、「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｎｎａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」（Ｊ．Ｍ． Ｍｉｌｌｅｒ ＆ Ｍ．Ｐ． Ｃａｌｏｓ， ｅｄｓ．， １９８７）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」 （Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， １９８７）、「Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ」， ３ ｅｄｉｔｉｏｎｓ （Ｒ． Ａ． Ｆｉｓｈｅｒ．， １９５６／５９／７４）および「ＰＣＲ： Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ」， （Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， １９９４）などの文献に十分に説明されている。
【００５１】
Ｂ．１ 発明の概要
過去２年間にわたって、Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｅａｌｔｈ， Ｉｎｃおよび共同研究者（Ｅｓｔｅｂａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ａｍ Ｓｏｃ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２２： ｐａｇｅ ８５０， ２００３ （ａｂｓｔｒａｃｔ ３４１６）、Ｓｏｕｌｅ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ Ａｍ Ｓｏｃ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２２： ｐａｇｅ ８６２， ２００３ （ａｂｓｔｒａｃｔ ３４６６）、Ｃｏｂｌｅｉｇｈ ｅｔ ａｌ． Ｓｏｃ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２２： ｐａｇｅ ８５０， ２００３ （ａｂｓｔｒａｃｔ ３４１５）、Ｃｒｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １６４（ｌ）：３５−４２ （２００４））が、再発リスクに対する分子署名を見い出すことを目的として、初期乳癌における遺伝子発現についていくつかの予備的臨床研究を報告した。これらの研究では、定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて、臨床記録と関連付けられた、凍結、パラフィン包埋（ＦＰＥ）組織試料において２５０種の候補遺伝子マーカーが試験された。多様な患者グループにわたって再発のリスクと一貫して関連している遺伝子が同定され得るかどうかを調べるために３つの研究すべてにわたる分析が実施された。これらの一変数の結果に基づいて、複数の遺伝子モデルが設計され、３つの研究にわたって分析された。臨床評価研究において予測的に試験される、１６種の癌関連遺伝子および５種の参照遺伝子からなる、単一の複数遺伝子アッセイが開発された。これら２１種のｍＲＮＡ種の測定値を用い、１００点尺度で再発リスクを報告する、再発スコア（ＲＳ）と呼ばれるアルゴリズムが作製された。
【００５２】
この再発スコア試験およびアルゴリズムの臨床的妥当性を試験するために、予測的に同定されたエンドポイントを有する盲式臨床試験が実施された。この評価試験は、ＮＳＡＢＰ研究Ｂ−１４臨床試験集団の無作為化された登録治療群中のＴＡＭ単独で治療された患者に焦点が当てられた（Ｆｉｓｈｅｒ Ｂ， Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ ＪＰ， Ｒｅｄｍｏｎｄ ＣＫ， ｅｔ ａｌ： Ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ −ｔｒｅａｔｅｄ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ： Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｂｒｅａｓｔ ａｎｄ Ｂｏｗｅｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ （ＮＳＡＢＰ） Ｂ−１４． Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ８６：５２７−５３７ （１９９４））。Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｅａｌｔｈ， Ｉｎｃ．およびＮＳＡＢＰは、これらの患者に由来する６６８の乳癌組織試料で２１種の遺伝子のＲＴ−ＰＣＲアッセイを実施し、各患者の再発スコアを算出した。
【００５３】
再発スコアの事前に指定したカットオフ点によって患者を３つのカテゴリーのうちの１つに分類した：低リスク、中リスクおよび高リスクの遠隔疾患再発。ＲＴ−ＰＣＲアッセイによって低、中および高リスクとして分類された６６８人の患者の割合はそれぞれ、５１％、２３％および２７％であった。１０年での遠隔再発率のカプラン・マイヤー推定値および９５％信頼区間は低、中程度および高リスク群についてそれぞれ、６．８％（４．０％、９．６％）、１４．３％（８．３％、２０．３％）３０．５％（２３．６％、３７．４％）であり、低リスク群の率は高リスク群の率よりも有意に低かった（ｐ＜０．００１）。遠隔再発を再発スコア、年齢および腫瘍の大きさと関連づける多変数Ｃｏｘモデルでは、再発スコアは年齢および腫瘍の大きさを超える有意な（ｐ＜０．００１）予測力を提供する。この研究により、ＥＳＲ１陽性である腫瘍を有し、タモキシフェンで治療された、リンパ節転移がない患者における遠隔再発の強力な予測判断材料としての再発スコアの妥当性が確認された（Ｐａｉｋ ｅｔ ａｌ． Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ８２， Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １ ： ｐａｇｅ Ｓ１０， ２００３ （Ａｂｓｔｒａｃｔ １６）。
【００５４】
本発明は、これらの発見結果の拡大において、ＮＳＡＢＰ研究Ｂ−２０の結果を用いて、化学療法に対する癌、例えば、乳癌患者の反応を予測するのに有用な遺伝子および遺伝子セットを提供する。さらに、本発明は、複数遺伝子ＲＮＡ分析を用いる、化学療法に対する乳癌患者の反応を予測する臨床的に有効な試験を提供する。
【００５５】
詳しくは、本発明者らは、癌患者、例えば、乳癌患者が化学療法に対して有益な反応を示す可能性が高いか否かを予測するのに有用である一連の遺伝子を同定した：ＢＣＬ２、ＳＣＵＢＥ２、ＣＣＮＢ１、ＣＴＳＬ２、ＥＳＲ１、ＭＭＰ１１、ＭＹＢＬ２、ＰＧＲ、ＳＴＫ６、ＢＩＲＣ５およびＭＭＰ１１、ＧＳＴＭ１、ＣＤ６８、ＢＡＧ１、ＧＲＢ７、ＥＲＢＢ２。これらの遺伝子のうちいくつかは、個々に予測的であるが、その他のものは特定の遺伝子群の一部として用いられ、本発明の方法における変数として用いられる。
【００５６】
したがって、本発明の予測法において用いられる独立変数は、（ｉ）再発スコア、（ｉｉ）ＥＳＲ１グループスコア、（ｉｉｉ）浸潤グループスコア、（ｉｖ）増殖グループ閾値スコア、（ｖ）ＭＹＢＬ２およびＳＣＵＢＥ２の少なくとも一方のＲＮＡ転写物の発現レベルのうち１以上を含み、
（ｂ１）（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）のうち１以上の値、またはＭＹＢＬ２のＲＮＡ転写物もしくは対応する発現産物の発現レベルの増加のどの単位についても、患者が、化学療法に対する有益な反応の比例して増加した尤度を有すると同定され、
（ｂ２）（ｉｉ）の値またはＳＣＵＢＥ２のＲＮＡ転写物もしくは対応する発現産物の発現レベルの増加のどの単位についても、患者が、化学療法に対する有益な反応の比例して減少した尤度を有すると同定され、
（ｂ３）（ｉ）の値の増加のどの単位についても、患者が、化学療法の不在下で、乳癌再発の増加した尤度を有すると同定される。
【００５７】
前記の変数において、
ＥＳＲ１グループスコア＝（ＥＳＲ１＋ＰＧＲ＋ＢＣＬ２＋ＳＣＵＢＥ２）／４、
浸潤グループスコア＝（ＣＴＳＬ２＋ＭＭＰ１１）／２、
増殖グループスコア＝（ＢＩＲＣ５＋ＭＫＩ６７＋ＭＹＢＬ２＋ＣＣＮＢ１＋ＳＴＫ６）／５、
増殖グループ閾値スコアは、増殖グループスコアが６．５未満である場合には６．５に等しく、増殖グループスコアが６．５以上である場合には増殖グループスコアに等しく、再発スコア（ＲＳ）は以下のとおりである：
【００５８】
【数５】
［式中、
ＧＲＢ７グループスコア＝０．９×ＧＲＢ７＋０．１×ＥＲＢＢ２である。
【００５９】
ＧＲＢ７グループ閾値スコアは、ＧＲＢ７グループスコアが６．５未満である場合には６．５に等しく、ＧＲＢ７グループ閾値スコアが６．５以上である場合にはＧＲＢ７グループ閾値スコアに一致し、
ＲＳｕ＝０．４７×ＧＲＢ７ グループ閾値スコア
−０．３４×ＥＳＲ１グループスコア
＋１．０４×増殖グループ閾値スコア
＋０．１０×浸潤グループスコア
＋０．０５×ＣＤ６８
−０．０８×ＧＳＴＭ１
−０．０７×ＢＡＧ１］
等式中の遺伝子記号は、それぞれの遺伝子のＲＮＡ転写物またはその発現産物の発現レベルを表し、変数（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）中の遺伝子の個々の寄与は０．５〜１．５の因子によって加重され、
前記変数のいずれか中に存在するあらゆる個々の遺伝子または遺伝子が、ピアソン相関係数≧０．５で前記癌において前記遺伝子と同時に発現する別の遺伝子で置換でき、また前記変数のいずれか中に存在する前記の個々の遺伝子または遺伝子と同時に発現する任意の遺伝子を、それぞれの遺伝子グループに加え、それぞれの変数を算出するために使用でき、これではグループスコアの算出に用いられる分母はグループ中の遺伝子数に等しい。前記の個々の遺伝子を同時発現する遺伝子の付加は新規グループの形成を引き起こす場合があり、０．５〜１．５の間の因子によって同様に加重され得る。
【００６０】
本発明の種々の実施形態では、開示された遺伝子の発現レベルの決定のために種々の技術的アプローチ、例えば、それだけには限らないが、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）および超並列的シグニチャー配列決定（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現解析が利用可能であり、これらは以下で詳細に論じる。特定の実施形態では、各遺伝子の発現レベルは、遺伝子の発現産物の種々の特徴、例えば、エキソン、イントロン、タンパク質エピトープおよびタンパク質活性に関連して測定できる。
【００６１】
Ｂ．２ 遺伝子発現プロファイリング
一般に、遺伝子発現プロファイリング法は２つの大きなグループに分けることができる：ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション分析に基づく方法およびポリヌクレオチドの配列決定に基づく方法。サンプル中のｍＲＮＡ発現の定量化のために当技術分野で公知の最も良く用いられる方法として、ノーザンブロッティングおよびｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション（Ｐａｒｋｅｒ ＆ Ｂａｒｎｅｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０６：２４７−２８３ （１９９９））、ＲＮアーゼ保護アッセイ（Ｈｏｄ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：８５２−８５４ （１９９２））および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｗｅｉｓ ｅｔ ａｌ， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８：２６３−２６４ （１９９２））が挙げられる。あるいは、指定の二本鎖、例えば、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖またはＤＮＡ−タンパク質二本鎖を認識できる抗体を使用することもできる。配列決定に基づく遺伝子発現解析の代表的な方法として、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）および超並列的シグニチャー配列決定（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現解析が挙げられる。
【００６２】
腫瘍形成によく含まれる２つの生物学的過程として、遺伝子増幅とＤＮＡメチル化が挙げられる。両過程とも、腫瘍形成または進行において重要な遺伝子の異常な発現をもたらす。したがって、遺伝子増幅およびＤＮＡメチル化をモニターする方法は、遺伝子発現プロファイリング法の代理となると考えられる。
【００６３】
遺伝子増幅は多数の癌において共通する変化であり、細胞性癌遺伝子の発現の上昇をもたらし得る（Ｍｅｌｔｚｅｒ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ． １９：９３ （１９８６）。乳癌では、ＥＲＢＢ２遺伝子増幅とＥＲＢＢ２過剰発現の間には良好な相関関係がある（Ｎａｇａｉ， Ｍ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ ８：２９ （１９９３）、Ｓａｖｉｎａｉｎｅｎ， Ｋ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １６０：３３９ （２００２））。ＥＲＢＢ２遺伝子の増幅は、その過剰発現をもたらし、不良な予後と相関関係があり（Ｐｒｅｓｓ， Ｍ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． １５：２８９４ （１９９７）、Ｓｌａｍｏｎ， Ｄ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：７０７ （１９８９））、正規化学療法と組み合わせた抗ＨＥＲ２療法に対する反応の予測となる（Ｓｅｉｄｍａｎ， Ａ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． １９：１８６６ （２００１））。
【００６４】
ＤＮＡメチル化も癌においてよくある変化であり、広範な遺伝子の発現の増加または減少をもたらすことがわかっている（Ｊｏｎｅｓ， Ｐ． Ａ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６５：２４６３ （１９９６））。一般に、プロモーター領域および調節エレメント中のＣｐＧ島の低メチル化は、多数の癌遺伝子を含む遺伝子発現の増大をもたらす（Ｈａｎａｄａ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８２：１８２０ （１９９３）、Ｆｅｉｎｂｅｒｇ， Ａ．Ｐ． ａｎｄ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ， Ｂ． Ｎａｔｕｒｅ ３０１：８９ （１９８３））。ＤＮＡメチル化は、多数の癌において特定の遺伝子発現レベルと相関があるので、腫瘍の発現プロファイリンの有用な代理として役立つ（Ｔｏｙｏｔａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９７： ２８２３ （２００１）、Ａｄｏｒｊａｎ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． １０：ｅ２１ （２００２））。
【００６５】
逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）
上記に列挙した技術のうち、最も感度が高く、最も適応性がある定量的な方法は、ＲＴ−ＰＣＲであり、これを用いて種々のサンプル集団において、薬物治療を施したか施していない正常および腫瘍組織において、ｍＲＮＡレベルを比較して、遺伝子発現のパターンを特性決定でき、密接に関連しているｍＲＮＡ間を識別でき、ＲＮＡ構造を解析できる。
【００６６】
第１の工程は標的サンプルからのｍＲＮＡの単離である。出発材料は、通常、ヒト組織または細胞株から単離した全ＲＮＡである。したがって、ＲＮＡは、乳房、肺、結腸、前立腺、脳、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、精巣、卵巣、子宮などをはじめとする種々の原発腫瘍、または腫瘍細胞株から単離できる。ｍＲＮＡの供給源が原発腫瘍である場合には、ｍＲＮＡは、例えば、凍結または保管されたパラフィン−包埋および固定（例えば、ホルマリン固定）組織サンプルから抽出できる。
【００６７】
ｍＲＮＡ抽出のための一般法は当技術分野では周知であり、分子生物学の標準的な教本、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ （１９９７）に開示されている。パラフィン包埋された組織からのＲＮＡ抽出法は、例えば、Ｒｕｐｐ ａｎｄ Ｌｏｃｋｅｒ， Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ． ５６：Ａ （１９８７）およびＤｅ Ａｎｄｒeｓ ｅｔ ａｌ， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １８：４２０４４ （１９９５）に開示されている。詳しくは、ＲＮＡ単離は、民間製造業者、例えば、Ｑｉａｇｅｎ製の精製キット、バッファーセットおよびプロテアーゼを用い、製造業者の使用説明書に従って実施できる。例えば、培養細胞由来の全ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニカラムを用いて単離できる。その他の市販のＲＮＡ単離キットとしては、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ（商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＤＮＡおよびＲＮＡ精製キット（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）およびＰａｒａｆｆｉｎ Ｂｌｏｃｋ ＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ， Ｉｎｃ．）が挙げられる。組織サンプル由来の全ＲＮＡは、ＲＮＡ Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ）を用いて単離できる。腫瘍から調製されたＲＮＡは、例えば、塩化セシウム密度勾配遠心分離によって単離できる。
【００６８】
ＲＮＡはＰＣＲの鋳型としての役割を果たすことはできないので、ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現プロフィールにおける第１の工程は、ＲＮＡ鋳型のｃＤＮＡへの逆転写と、それに続く、ＰＣＲ反応におけるその指数関数的増幅である。２種の最もよく用いられる逆転写酵素として、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）およびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）がある。逆転写工程は通常、状況および発現プロファイリングの目的に応じて、特異的プライマー、ランダムヘキサマーまたはオリゴ−ｄＴプライマーを用いてプライムされる。例えば、抽出したＲＮＡを、ＧｅｎｅＡｍｐ ＲＮＡ ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用い、製造業者の使用説明書に従って逆転写できる。次いで、得られたｃＤＮＡを、その後のＰＣＲ反応において鋳型として使用できる。
【００６９】
ＰＣＲ工程は種々の熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用できるが、通常、５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するが、３’−５’校正エンドヌクレアーゼ活性を欠く、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いる。したがって、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲは、通常、ＴａｑまたはＴｔｈポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を用いて、標的単位複製配列と結合しているハイブリダイゼーションプローブを加水分解するが、同等の５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素はいずれも使用できる。２種のオリゴヌクレオチドプリマーを用いて、ＰＣＲ反応に特有の単位複製配列を作製する。第３のオリゴヌクレオチドまたはプローブは、２種のＰＣＲプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出するよう設計される。プローブは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素によって延長可能ではなく、レポーター蛍光色素およびクエンチャー蛍光色素で標識する。レーザーによって誘導されるレポーター色素からの発光はいずれも、２種の色素が、それらがプローブ上にあるように、接近して位置する場合にはクエンチング色素によってクエンチされる。増幅反応の際、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素は、鋳型依存的にプローブを切断する。得られたプローブ断片は溶液中に解離し、放出されたレポーター色素からのシグナルは第２のフルオロフォアのクエンチング作用を免れる。各新規分子が合成されるごとに、１分子のレポーター色素が遊離され、クエンチされていないレポーター色素の検出が、データの定量的解析の基礎を提供する。
【００７０】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲは、市販の機器、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００（商標）配列検出システム（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ， ＵＳＡ）またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）などを用いて実施できる。好ましい実施形態では、リアルタイム定量的ＰＣＲ装置、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００（商標）配列検出システム（商標）で５’ヌクレアーゼ手順を行う。このシステムは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラおよびコンピュータからなる。このシステムは、サーモサイクラーで９６ウェル形式でサンプルを増幅する。増幅の際、レーザーによって誘導された蛍光シグナルをＣＣＤで検出する。このシステムは、機器を動かすためのソフトウェアおよびデータを分析するためのソフトウェアを含む。
【００７１】
５’ヌクレアーゼアッセイデータは、まず、ＣＴすなわち閾値サイクルとして表される。上記で論じたように、サイクル毎にその間の蛍光値を記録し、これは増幅反応においてその時点までに増幅された生成物の量を表す。蛍光シグナルが、統計的に有意であると最初に記録される時点が閾値サイクル（ＣＴ）である。
【００７２】
誤差およびサンプル間の変化の影響を最小化するために、ＲＴ−ＰＣＲは通常、内部標準を用いて実施する。理想の内部標準は、異なる組織間で一定レベルで発現され、実験処理によって影響を受けない。遺伝子発現のパターンを正規化するために最も頻繁に用いられるＲＮＡとして、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤ）およびβ−アクチン（ＡＣＴＢ）のｍＲＮＡがある。
【００７３】
ＲＴ−ＰＣＲ技術のより最近の変法としてリアルタイム定量的ＰＣＲがあり、これは、二重標識蛍光プローブ（すなわち、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）によってＰＣＲ産物蓄積を測定する。リアルタイムＰＣＲは、正規化のために各標的配列の内部競合物を用いる定量的競合的ＰＣＲと適合し、サンプル内に含まれる正規化遺伝子またはＲＴ−ＰＣＲのためのハウスキーピング遺伝子を用いる定量的比較ＰＣＲとも適合する。さらなる詳細については、例えば、Ｈｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９８６−９９４ （１９９６）参照のこと。
【００７４】
固定され、パラフィン包埋された組織をＲＮＡ供給源として用いる、遺伝子発現をプロファイリングするための代表的なプロトコールの工程、例えば、ｍＲＮＡ単離、精製、プライマー伸長および増幅は、種々の公開学術論文に示されている｛例えば、Ｔ．Ｅ． Ｇｏｄｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ２： ８４−９１ ［２０００］、Ｋ． Ｓｐｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １５８： ４１９−２９ ［２００１］｝。要約すると、代表的なプロセスは、パラフィン包埋した腫瘍組織サンプルの約１０μｍ厚切片を切断することで開始する。次いで、ＲＮＡを抽出し、タンパク質およびＤＮＡを除去する。ＲＮＡ濃度を分析した後、必要に応じてＲＮＡ修復および／または増幅工程が含まれる場合があり、遺伝子特異的プロモーターを用いてＲＮＡを逆転写し、その後ＲＴ−ＰＣＲを行う。
【００７５】
マイクロアレイ
マイクロアレイ技術を用いても、差次的遺伝子発現を同定または確認できる。したがって、乳癌関連遺伝子の発現プロフィールは、マイクロアレイ技術を用いて新鮮腫瘍組織またはパラフィン包埋腫瘍組織のいずれかで測定できる。この方法では、注目するポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む）を、マイクロチップ基材上にプレーティングするか、または配列させる。次いで配列させた配列を、注目する細胞または組織に由来する特異的ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせる。ちょうどＲＴ−ＰＣＲ法におけるように、ｍＲＮＡの供給源は通常、ヒト腫瘍または腫瘍細胞株および対応する正常組織または細胞株から単離した全ＲＮＡである。したがって、ＲＮＡは種々の原発腫瘍または腫瘍細胞株から単離できる。ｍＲＮＡの供給源が原発腫瘍である場合には、ｍＲＮＡは、例えば、毎日の臨床診療において日常的に調製され保存される、凍結または保管されたパラフィン−包埋および固定（例えば、ホルマリン固定）組織サンプルから抽出できる。
【００７６】
マイクロアレイ技術の特定の実施形態では、ｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅されたインサートを、高密度アレイで基材に適用する。基材に対して少なくとも１０，０００ヌクレオチド配列を適用することが好ましい。各１０，０００エレメントでマイクロチップ上に固定された、マイクロアレイされた遺伝子は、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションに適している。蛍光標識したｃＤＮＡプローブは、注目する組織から抽出したＲＮＡの逆転写によって蛍光ヌクレオチドを組み込むことによって作製できる。チップに適用された標識したｃＤＮＡプローブは、特異性をもってアレイ上の各ＤＮＡスポットとハイブリダイズする。非特異的に結合しているプローブを除去するためにストリンジェント洗浄した後、共焦点レーザー顕微鏡法によってか、ＣＣＤカメラなどの別の検出法によってチップをスキャンする。アレイされたエレメント各々のハイブリダイゼーションを定量することにより、対応するｍＲＮＡ量の評価が可能となる。二色蛍光を用い、２種のＲＮＡ供給源から作製した別個に標識したｃＤＮＡプローブをアレイと対でハイブリダイズさせる。このようにして各特定の遺伝子に対応する、２種の供給源に由来する転写物の相対量を同時に求める。小型化されたスケールのハイブリダイゼーションによって、多数の遺伝子の発現パターンの好都合で迅速な評価が可能となる。このような方法は、細胞あたり数コピーで発現される、希少な転写物を検出するのに、また、発現レベルの少なくとも約２倍の差異を再現性よく検出するのに必要な感度を有することがわかっている（Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． ＳｃＬ ＵＳＡ ９３（２）：１０６−１４９ （１９９６））。マイクロアレイ解析は市販の機器により、製造業者のプロトコールに従って、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎＣｈｉｐ技術またはＩｎｃｙｔｅのマイクロアレイ技術を用いることによって実施できる。
【００７７】
遺伝子発現の大規模解析のためのマイクロアレイ法の開発により、種々の腫瘍の種類における癌分類および転帰予測の分子マーカーを系統的に探索することが可能となる。
【００７８】
遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）
遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）は、各転写物に個々のハイブリダイゼーションプローブを提供する必要なく、多数の遺伝子転写物の同時かつ定量的な解析を可能にする方法である。まず、転写物を一意的に同定するのに十分な情報を含む短い配列タグ（約１０から１４ｂｐ）を作製する。ただし、タグは各転写物内の独特の位置から得る。ついで、多数の転写物を互いに結合して長い連続分子を形成するが、これは配列決定でき、複数のタグの同一性を同時に示すことができる。いずれかの転写物の集団の発現パターンは、個々のタグの量を測定することと、各タグに対応する遺伝子を同定することとによって定量的に評価できる。より詳細については、例えば、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４８４−４８７ （１９９５）およびＶｅｌｃｕｌｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ ８８：２４３−５１ （１９９７）参照のこと。
【００７９】
超並列的シグニチャー配列決定（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現解析（ＭＰＳＳ）
Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：６３０−６３４ （２０００）によって記載されたこの方法は、分離している直径５μｍのマイクロビーズ上で非ゲルベースのシグニチャー配列決定（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を、何百万もの鋳型のｉｎ ｖｉｔｒｏクローニングと組み合わせる配列決定アプローチである。まず、ｉｎ ｖｉｔｒｏクローニングによってＤＮＡ鋳型のマイクロビーズライブラリーを構築する。この後、高密度（通常、３×１０６個マイクロビーズ／ｃｍ２より多い）で、フローセルにおいて鋳型を含有するマイクロビーズの平面アレイの構築を行う。各マイクロビーズ上のクローニングされた鋳型の遊離末端を、ＤＮＡ断片の分離を必要としない蛍光ベースのシグニチャー配列決定法を用いて同時に分析する。この方法は、酵母ｃＤＮＡライブラリーから１回の操作で、同時に、正確に何十万の遺伝子のシグニチャー配列を提供することがわかっている。
【００８０】
ｍＲＮＡ単離、精製および増幅についての概要
固定され、パラフィン包埋された組織をＲＮＡ供給源として用いて遺伝子発現をプロファイリングするための代表的なプロトコールの工程、例えば、ｍＲＮＡ単離、精製、プライマー伸長および増幅は、種々の公開学術論文に提供されている（例えば、Ｔ．Ｅ． Ｇｏｄｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ，． Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ２： ８４−９１ ［２０００］；Ｋ． Ｓｐｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １５８： ４１９−２９ ［２００１］））。要約すると、代表的なプロセスは、パラフィン包埋した腫瘍組織サンプルの約１０μｍ厚切片を切断することで開始する。次いで、ＲＮＡを抽出し、タンパク質およびＤＮＡを除去する。ＲＮＡ濃度を分析した後、必要に応じてＲＮＡ修復および／または増幅工程が含まれる場合があり、遺伝子特異的プロモーターを用いてＲＮＡを逆転写し、その後ＲＴ−ＰＣＲを行う。最後に、データを分析して、調べた腫瘍サンプルにおいて同定された特徴的な遺伝子発現パターンに基づき、癌再発の予測される尤度に応じて、患者が利用できる最良の治療選択肢を同定する。
【００８１】
乳癌遺伝子セット、アッセイされる遺伝子部分配列および遺伝子発現データの臨床適用
本発明の重要な態様は、予後情報または予測情報を提供するために乳癌組織による特定の遺伝子の測定された発現を使用することである。この目的には、アッセイされたＲＮＡ量の相違および用いたＲＮＡの質の変動の双方について補正する（正規化する）ことが必要である。したがって、アッセイは、通常、特定の正規化遺伝子、例えば、以下の実施例において示されるように、周知のハウスキーピング遺伝子、例えば、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤ、ＧＵＳＢ、ＲＰＬＯおよびＴＦＲＣの発現を測定し、組み込む。あるいは、正規化は、アッセイされた遺伝子のすべてまたはその大きな部分集合の平均または中央値シグナル（ＣＴ）に基づくものである場合もある（グローバルノーマライゼーションアプローチ）。以下、特に断りのない限り、遺伝子発現とは正規化された発現を意味する。
【００８２】
イントロンベースのＰＣＲプライマーおよびプローブの設計
本発明の一態様によれば、ＰＣＲプライマーおよびプローブは、増幅される遺伝子中に存在するイントロン配列に基づいて設計する。したがって、プライマー／プローブ設計における第１の工程は、遺伝子内のイントロン配列の描写である。これは入手可能な公開ソフトウェア、例えば、Ｋｅｎｔ， Ｗ．Ｊ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １２（４）：６５６−６４ （２００２）によって開発されたＤＮＡ ＢＬＡＴソフトウェアによって、または変法を含むＢＬＡＳＴソフトウェアによって行うことができる。その後の工程は、ＰＣＲプライマーおよびプローブ設計の十分に確立された方法に従う。
【００８３】
プライマーおよびプローブを設計する場合には、非特異的シグナルを避けるために、イントロン内の反復配列をマスクすることが重要である。これは、ベイラー医科大学（ｔｈｅ Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）を通じてオンラインで入手できるＲｅｐｅａｔ Ｍａｓｋｅｒプログラムを用いることによって容易に達成できる。このプログラムは反復エレメントのライブラリーに対してＤＮＡ配列をスクリーニングし、反復エレメントがマスクされたクエリー配列を戻す。次いで、マスクされたイントロン配列を用い、いずれかの市販されているか、あるいは入手可能な公開プライマー／プローブ設計パッケージ、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＭＧＢ ａｓｓａｙ−ｂｙ−ｄｅｓｉｇｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｐｒｉｍｅｒ３（Ｓｔｅｖｅ Ｒｏｚｅｎ ａｎｄ Ｈｅｌｅｎ Ｊ． Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ （２０００） Ｐｒｉｍｅｒ３ ｏｎ ｔｈｅ ＷＷＷ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｌ ｕｓｅｒｓ ａｎｄ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｒｓ． Ｉｎ： Ｋｒａｗｅｔｚ Ｓ， Ｍｉｓｅｎｅｒ Ｓ （ｅｄｓ） Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ， ｐｐ ３６５−３８６）を用いてプライマーおよびプローブ配列を設計できる。
【００８４】
ＰＣＲプライマー設計において考慮される最も重要な因子として、プライマー長、融解温度（Ｔｍ）およびＧ／Ｃ含量、特異性、相補的プライマー配列および３’末端配列が挙げられる。一般に、最適なＰＣＲプライマーは、通常、１７〜３０塩基の長さであり、約２０〜８０％、例えば、約５０〜６０％のＧ＋Ｃ塩基を含む。５０〜８０℃、例えば約５０〜７０℃のＴｍが通常好ましい。
【００８５】
ＰＣＲ プライマーおよびプローブ設計のためのさらなる指針については、例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ， Ｃ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．， 「Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｆｏｒ ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎ」 ｉｎ： ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９５， ｐｐ． １３３−１５５、Ｉｎｎｉｓ ａｎｄ Ｇｅｌｆａｎｄ， 「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲｓ」 ｉｎ： ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ， １９９４， ｐｐ． ５−１１およびＰｌａｓｔｅｒｅｒ， Ｔ．Ｎ． Ｐｒｉｍｅｒｓｅｌｅｃｔ： Ｐｒｉｍｅｒ ａｎｄ ｐｒｏｂｅ ｄｅｓｉｇｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ． ７０：５２０−５２７ （１９９７）参照のこと。なお、その全開示内容は参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【００８６】
Ｂ．３ アルゴリズムおよび統計的手法
本発明は、同時係属出願第１０／８８３，３０３号に記載される特定のアルゴリズムおよび統計的手法を利用する。
【００８７】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を用いてｍＲＮＡレベルを測定する場合には、ｍＲＮＡ量は ＣＴ（閾値サイクル）単位で表される（Ｈｅｌｄ ｅｔ ａｌ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９８６−９９４ （１９９６））。参照ｍＲＮＡ ＣＴの合計の平均をある数、例えば、ゼロに設定し、各測定される試験ｍＲＮＡ ＣＴをこの点と相対的に与える。例えば、特定の患者の腫瘍試料について、５種の参照遺伝子のＣＴの平均が３１であるとわかっており、試験遺伝子ＸのＣＴが３５であると分かっている場合には、遺伝子Ｘの報告される値は−４（すなわち、３１−３５）である。
【００８８】
ｍＲＮＡレベルの定量的測定後の第１の工程として、腫瘍試料において同定され、癌の分子病理学と関連していることがわかっている遺伝子を部分集合にグループ化する。したがって、細胞増殖と関連しているとわかっている遺伝子は、「増殖グループ」（軸、または部分集合）を構成する。隣接組織の癌による浸潤と関連しているとわかっている遺伝子は「浸潤グループ」（軸または部分集合）を構成する。重要な増殖因子受容体シグナル伝達経路と関連している遺伝子は、ＧＲＢ７グループとも呼ばれる、「増殖因子グループ」（軸、部分集合）を構成する。エストロゲン受容体（ＥＳＲ１）を介した活性化またはシグナル伝達に関与しているとわかっている遺伝子は「エストロゲン受容体（ＥＳＲ１）グループ」（軸または部分集合）を構成する、などである。部分集合のこのリストはもちろん制限するものではない。作製される部分集合は、特定の癌、すなわち、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌などに応じて異なる。一般に、発現が互いに相関しているとわかっている遺伝子または同一経路に関与しているとわかっている遺伝子は同一部分集合にグループ化される。
【００８９】
次の工程では、部分集合中の各ｍＲＮＡの測定された腫瘍レベルに、癌再発のリスクに対する相対的セット内寄与を反映する係数を乗じて積を得、この積に、部分集合中のｍＲＮＡレベルとその係数を用いて同様に算出したその他の積を加えて項、例えば、増殖項、浸潤項、増側因子項などを得る。例えば、リンパ節陰性浸潤性乳癌の場合、増殖因子（ＧＲＢ７グループ）項は、（０．４５〜１．３５）×ＧＲＢ７＋（０．０５〜０．１５）×ＥＲＢＢ２、例えば、０．９×ＧＲＢ７＋０．１×ＥＲＢＢ２などである（以下の実施例参照のこと）。
【００９０】
全体の再発スコアへの各項の寄与は、さらなる係数を用いることによって加重する。例えば、リンパ節陰性浸潤性乳癌の場合、ＧＢ７グループ項の係数は０．２３〜０．７０の間であり得る。
【００９１】
さらに、増殖因子および増殖項などのいくつかの項については、さらなる工程を実施する。項と再発のリスクの間の関係が非線形である場合、項の非線形関数変換、例えば、閾値を用いる。
【００９２】
得られた項の合計が再発スコア（ＲＳｕ）を提供し、これが疾患の通常の成り行きにおける癌再発の尤度を予測する。
【００９３】
本発明のアルゴリズムによって生じるＲＳ尺度は種々の方法で調整できる。したがって、尺度が、例えば、０〜１０、０〜５０または０〜１００をとるよう範囲を選択できる。
【００９４】
例えば、以下の実施例において記載される特定のスケーリングアプローチでは、スケーリングされた再発スコアを０〜１００のスケールで算出する。便宜上、各測定されたＣＴ値に１０を加え、スケーリングされていないＲＳを先に記載したように算出する。ＲＳおよびＳＲＳを算出するための等式は以下の実施例において提供する。
【００９５】
再発スコアまたは再発スコアを算出するために用いられるいずれかの変数の算出では、いずれの遺伝子も、ピアソン係数≧０．５で試験される特定の癌において第１の遺伝子と同時発現する別の遺伝子で置換できる。同様に、本発明の予後法および予測法に含まれる、いずれかの個々の遺伝子または遺伝子グループ（部分集合）内の遺伝子も、ピアソン係数≧０．５で試験される特定の癌において第１の遺伝子と同時発現する別の遺伝子で置換できる。
【００９６】
Ｂ．４ 癌化学療法
癌治療に用いられる化学療法薬は、その作用機序に応じていくつかのグループに分けることができる。いくつかの化学療法薬はＤＮＡおよびＲＮＡに直接損傷を与える。このような化学療法薬は、ＤＮＡの複製を混乱させることによって、複製を完全に停止するか、ナンセンスＤＮＡまたはＲＮＡの生成をもたらす。このカテゴリーには、例えば、シスプラチン（プラチノール（登録商標））、ダウノルビシン（セラビジン（Ｃｅｒａｂｉｄｉｎｅ）（登録商標））、ドキソルビシン（アドリアマイシン（登録商標））およびエトポシド（ベペシド（登録商標））が含まれる。癌化学療法薬のもう１つのグループは、ヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの形成を干渉し、その結果ＲＮＡ合成および細胞複製が阻止される。この種類の薬物の例としては、メトトレキサート（アビトレキサート（Ａｂｉｔｒｅｘａｔｅ）（登録商標））、メルカプトプリン（ピュリネソール（登録商標））、フルオロウラシル（アドルシル（登録商標））およびヒドロキシウレア（ハイドレア（登録商標））が挙げられる。第３の種類の化学療法薬は紡錘体の合成または分解を達成し、結果として、細胞分裂を妨げる。この種類の薬物の例としては、ビンブラスチン（ベルバン（Ｖｅｌｂａｎ）（登録商標））、ビンクリスチン（オンコビン（登録商標））およびタキセン、例えば、パクリタキセル（タキソール（登録商標）およびトセタキセル（タキソテール（登録商標））が挙げられる。トセタキセルは、従前の化学療法が失敗した後の局所進行または転移性乳癌の患者および従前の白金ベースの化学療法が失敗した後の局所進行または転移性非小細胞肺癌の患者を治療するために米国で現在認可されている。これらのすべておよびその他の化学療法薬に対する患者の反応の予測は、明確に本発明の範囲内にある。
【００９７】
特定の実施形態では、化学療法はタキサン誘導体を用いる治療を含む。タキサンとしては、それだけには限らないが、パクリタキセル（タキソール（登録商標））およびドセタキセル（タキソテール（登録商標））が挙げられ、これらは癌の治療に広く用いられている。上記で論じたように、タキサンは、細胞機能において重要な役割を果たす微小管と呼ばれる細胞構造に影響を及ぼす。正常な細胞増殖では、微小管は細胞が分裂を開始する時点で形成される。細胞が分裂を停止すると、微小管は分解されるか破壊される。タキサンは微小管が分解されるのを停止し、これによって細胞増殖を阻止する。
【００９８】
もう１つの特定の実施形態では、化学療法はアントラサイクリン誘導体、例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシンおよびアクラシノマイシンなどを用いる治療を含む。
【００９９】
さらに特定の実施形態では、化学療法はトポイソメラーゼ阻害剤、例えば、カンプトセシン、トポテカン、イリノテカン、２０−Ｓ−カンプトセシン、９−ニトロ−カンプトセシン、９−アミノ−カンプトセシンまたはＧＩ１４７２１１などを用いる治療を含む。
【０１００】
これらおよびその他の化学療法薬のいずれかの組み合わせを用いる治療は明確に考慮される。
【０１０１】
ほとんどの患者は、腫瘍を外科的に切除した直後に化学療法を受ける。このアプローチは、一般にアジュバント療法と呼ばれる。しかし、化学療法は、いわゆるネオアジュバント治療として術前にも投与できる。ネオアジュバント化学療法の使用は、進行し、手術不可能な乳癌の治療を起源とするが、その他の種類の癌の治療にも同様に認められるようになった。ネオアジュバント化学療法の有効性はいくつかの臨床試験で試験されてきた。多施設米国乳房および腸外科補助療法プロジェクト（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｂｒｅａｓｔ ａｎｄ Ｂｏｗｅｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ）Ｂ−１８（ＮＳＡＢ Ｂ−１８）試験（Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １５：２００２−２００４ （１９９７）、Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １６：２６７２−２６８５ （１９９８））では、ネオアジュバント療法を、アドリアマイシンおよびシクロホスファミド（「ＡＣ投与計画」）と組み合わせて実施した。別の臨床試験では、ネオアジュバント療法を、５−フルオロウラシル、エピルビシンおよびシクロホスファミドの組み合わせ（「ＦＥＣ投与計画」）を用いて投与した（ｖａｎ Ｄｅｒ Ｈａｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． １９：４２２４−４２３７ （２００１））。また、より新しい臨床試験では、タキサン含有ネオアジュバント治療計画が用いられている。例えば、Ｈｏｌｍｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８３：１７９７−１８０５ （１９９１）およびＭｏｌｉｔｅｒｎｉ ｅｔ ａｌ， Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， ２４：Ｓ１７− １０−Ｓ− １７−１４ （１９９９）参照のこと。乳癌のためのネオアジュバント化学療法についてのさらなる情報については、Ｃｌｅａｔｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃａｎｃｅｒ ９：１８３−１９５ （２００２）参照のこと。
【０１０２】
Ｂ．５ 本発明のキット
本発明の方法に用いる材料は、周知の手順に従って製造されるキットの調製に向いている。したがって、本発明は、予後転帰または治療に対する反応を予測するための開示された遺伝子の発現を定量化するための遺伝子特異的または遺伝子選択的プローブおよび／またはプライマーを含み得る薬剤を含むキットを提供する。このようなキットは、場合により、腫瘍サンプル、詳しくは、固定され、パラフィン包埋された組織サンプルからＲＮＡを抽出するための試薬および／またはＲＮＡ増幅用試薬を含み得る。さらに、本キットは、場合により、本発明の方法におけるその使用に関連する識別説明書または表示または使用説明書を有する試薬を含み得る。本キットは、例えば、既製のマイクロアレイ、バッファー、適当なヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰまたはｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰおよびＵＴＰ）、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼおよび本発明の１種以上のプローブおよびプライマー（例えば、ＲＮＡポリメラーゼに関して反応性であるプロモーターと連結している適当な長さのポリ（Ｔ）、遺伝子特異的またはランダムプライマー）を含む方法において用いられる、各々、１種以上の種々の試薬（通常、濃縮型で）を含む容器（例えば、本方法の自動実行において使用するのに適したマイクロタイタープレート）を含み得る。
【０１０３】
また、本発明によって提供される方法は、全部または一部において自動化できる。
【０１０４】
また、本発明のすべての態様は、開示された遺伝子と同時発現されることが、例えば、高いピアソン相関係数によって証明される、限定された数のさらなる遺伝子が、開示された遺伝子に加えて、および／または開示された遺伝子の代わりに予後または予測試験に含まれるよう実施できる。
【０１０５】
本発明を説明したが、これは、例示目的で提供されるものであって、決して本発明を制限しようとするものではない、以下の実施例を参照することによってより容易に理解される。
【実施例】
【０１０６】
浸潤性乳癌にけるネオアジュバント化学療法の研究：パラフィン包埋コア生検組織の遺伝子発現プロファイリング
この研究は、化学療法に対して感受性がある患者または耐性の患者を予測する遺伝子または遺伝子群を同定するために実施した。本研究では、ＮＳＡＢＰ研究Ｂ−２０「Ａ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ ｔｏ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ Ｗｏｒｔｈ ｏｆ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ ｏｖｅｒ Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ Ａｌｏｎｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ， Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ａｘｉｌｌａｒｙ Ｎｏｄｅｓ ａｎｄ Ｅｓｔｒｏｇｅｎ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｔｕｍｏｒｓ」Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ８９（２２）： １６７３−１６８２ （１９９７）から得た組織およびデータを用いた。
【０１０７】
研究設計
患者組み入れ基準：ＮＳＡＢＰ研究Ｂ−２０に登録されたもの。患者除外基準：ＮＳＡＢＰアーカイブにおける初期診断から利用可能な腫瘍ブロックがないもの、ブロック中に腫瘍がないまたは極めて小さい腫瘍と、病理学者によるＨ＆Ｅスライドの検査によって評価されるもの、ＲＴ−ＰＣＲ解析には不十分なＲＮＡ（＜２７５ｎｇ）、５種の参照遺伝子の平均非正規化ＣＴ＜３５、臨床不適格者または追跡調査がないもの。
【０１０８】
実験室アッセイ
Ｂ−２０研究においてＴＡＭおよび化学療法で研究登録時に治療された最大６００人の患者から得た固定され、パラフィン包埋された乳房腫瘍組織試料を分析した。Ｂ−２０研究においてＴＡＭ単独で研究登録時に治療された最大２５２人の患者から得た固定され、パラフィン包埋された乳房腫瘍組織から先に抽出したＲＮＡを再分析した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲを用い、各患者について、１６種の癌関連遺伝子および５種の参照遺伝子の発現を定量的に評価した。これは反応あたり２ｎｇのＲＮＡインプットを用い３連で実施した。
【０１０９】
この研究では、腫瘍組織のＲＴ−ＰＣＲ分析に先立って予測的に規定した遺伝子発現アルゴリズムを用いて各患者の再発スコアを算出した。
【０１１０】
病理学的検討および調製
グループ１：腫瘍がないか極めて小さい腫瘍（正常上皮、繊維嚢胞性変化またはＤＣＩＳ／ＬＣＩＳなどのその他の上皮要素によって占められる部分と比較した浸潤性癌細胞によって占められる部分が＜５％）を有する場合は研究から除外した。
【０１１１】
グループ２：顕著な非腫瘍要素（例えば、平滑筋、出血、繊維症、過形成、上皮および／または正常乳房、ただし、ＤＣＩＳ、ＬＣＩＳまたは壊死ではない）を有するスライド上の領域を含み、非腫瘍要素がマクロダイセクションを受けられるよう十分に局在化しており、かつ、十分な量である（スライド上の組織全体の＞５０％）場合。これらの場合ではマクロダイセクションを実施した。
【０１１２】
グループ３：すべてのその他の場合はダイセクションせずに分析した。
【０１１３】
患者の生存率
原発分析のために、遠隔再発のない生存率（ＤＲＦＳ）は、手術から最初の遠隔再発までの時間（年）に基づくものとした。対側性疾患、その他の二次原発癌および遠隔再発の前の死亡は打ち切り事象と考えた。
【０１１４】
遺伝子発現
再発スコアの算出に用いた２１種の遺伝子の発現レベルは、ＧＨＩアッセイから得た値として報告した。表１は１６種の試験遺伝子および５種の参照遺伝子の同一性を示す。遺伝子発現値は、５種の参照遺伝子の平均に対して正規化した。参照遺伝子は、乳癌ならびに種々のサンプリングおよび加工条件下において比較的不変であることがわかっており、このために外来作用について正規化するのに有用なものとなっている。参照によって正規化した発現測定値は、通常、１単位増が通常ＲＮＡ量の２倍の増大を反映する、０〜１５の範囲である。解析のために２１種の予め指定した遺伝子を表１に列挙する。
【０１１５】
【表１】
生物統計分析
再発スコアは予後因子および予測因子の両方を含む。乳癌における治療予測遺伝子を同定する目的で、主目的は、治療された患者における遺伝子発現とＤＲＦＳの間の関係を調査することである。このような解析には、治療された患者および治療されていない患者双方から得たデータを用いて、治療予測遺伝子と純粋に予後的な遺伝子を区別した。化学療法治療予測遺伝子を同定するために、ＮＳＡＢＰ研究Ｂ−２０から、ＴＡＭのみで治療された患者とＴＡＭおよび化学療法の両方で治療された患者の双方を含めた。
【０１１６】
Ｃｏｘの比例ハザードモデルを用いて、治療効果と遺伝子発現の間の相互作用を調べた。Ｃｏｘ， Ｊ Ｒｏｙａｌ Ｓｔａｔ Ｓｏｃ Ｓｅｒｉｅｓ Ｂ ３４（２）：１８７−２２０ （１９７２）； Ｔｈｅｒｎｅａｕ ａｎｄ Ｇｒａｍｓｃｈ， Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｄａｔａ： Ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｃｏｘ Ｍｏｄｅｌ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ （２０００） ＩＳＢＮ ０−３８７−９８７８４−３。治療と遺伝子発現の間の相互作用は、治療効果が遺伝子発現レベルに応じて異なる場合に、すなわち、遺伝子発現が治療予測因子である場合に存在する（Ｆｉｓｈｅｒ， Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ， Ｏｌｉｖｅｒ ａｎｄ Ｂｏｙｄ， Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ （１９７４）； Ｓａｖａｇｅ Ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｉｔｉｃｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９６４）。尤度比検定を用い、治療相互作用による遺伝子発現を排除して減少させたモデルを、治療相互作用による遺伝子発現を含む競合的全モデルと比較することによって、統計的に有意な予測治療遺伝子を同定した。
【０１１７】
再発スコア
０〜１００の尺度での再発スコア（ＲＳ）は、以下のように参照によって正規化した発現測定値から導く：
ＲＳｕ＝０．４７×ＧＲＢ７グループ閾値スコア
−０．３４×ＥＳＲ１グループスコア
＋１．０４×増殖グループ閾値スコア
＋０．１０×浸潤グループスコア
＋０．０５×ＣＤ６８
−０．０８×ＧＳＴＭ１
−０．０７×ＢＡＧ１
式中、
【０１１８】
【数６】
次いで、ＲＳｕ（スケーリングしていない再発スコア）を０〜１００の間となるよう再スケーリングする：
【０１１９】
【数７】
３グループへの分類
ＲＳを用いて、各患者の再発リスクグループを決定した。低、中および高リスク再発グループの間のカットオフ点は以下のように定義する：
リスクグループ 再発スコア
低リスクの再発 １８未満
中リスクの再発 １８以上かつ３１未満
高リスクの再発 ３１以上
【０１２０】
結果
表２は、試験した変数のうち６、すなわち、ＲＳ、増殖グループ閾値スコア（Ｐｒｏ１Ｔｈｒｅｓ）、ＭＹＢＬ２、浸潤グループスコア、ＳＣＵＢＥ２およびＥＳＲ１グループスコアが、統計的に有意（Ｐ＜０．１）に有益な化学療法反応と相互作用したことが１０年ＤＲＦＳによって測定されたことを示す。表２中、ＲＳ／５０の項によって示されるように、ＲＳの相互作用分析を全部で１００点の範囲の下方半分にかけて実施した。
【０１２１】
【表２】
表２に示されるように、以下の遺伝子および遺伝子セットの発現の増大が、１０年の遠隔再発のない生存の尤度の増大と相関している：ＲＳ、ＭＹＢＬ２、増殖グループ閾値スコア、浸潤グループスコア。以下の遺伝子の発現の増大は、治療に対する有益な反応の尤度の低下と相関している：ＳＣＵＢＥ２、ＥＳＲ１グループスコア。ＲＳアルゴリズムの個々の重要な構成要素、すなわち、ＰｒｏｌｉｆＡｘｉｓｔｈｒｅｓｈ、浸潤グループおよびＥＳＲ１グループはすべて独立に、化学療法の有効性の尤度の増大に対応してＲＳの上昇と一致する方向で化学療法に対する反応に影響を及ぼすことは注目すべきである。
【０１２２】
図１は、１０年でのＲＳリスクグループカテゴリー（低、中および高リスク）とＮＳＡＢＰ Ｂ−２０集団にわたる化学療法の有効性パーセントとの間の関係を示す。高リスク患者の間での平均有効性（ＲＳ＞３１によって定義される）は約２８％であり、９５％の信頼限界を有し、１２〜４２％にわたっていた。すなわち、このグループでは、平均化学療法で、１０年での再発の絶対リスクが２８％減少した。これは化学療法を受けていない高リスク患者は、平均して、３０％を少し上回る再発の絶対リスクを有し、このことは化学療法はこの患者グループでは再発の相対率を約９０％低減できることを示すことから注目すべきことである。中リスク患者の場合では（１８〜３１の間のＲＳによって定義される）、平均有効性はほとんどゼロであり、９５％の信頼限界を有し、−１０〜＋１０％にわたっていた。低リスク患者の場合には（ＲＳ＜１８によって定義される）平均有効性はほぼゼロであり、９５％信頼限界を有し、−４〜＋４％にわたっていた。
【０１２３】
これらの結果は、ＥＳＲ１陽性初期乳癌患者を化学療法で治療するか否かについての決定を導くための有用性を有する。ＮＳＡＢＰ Ｂ１４ ＴＡＭ治療群における再発スコアアルゴリズムの確証により、高リスクグループの患者は１０年で＞３０％の乳癌再発のリスクを有するということが実証された。本明細書に示されたデータは、この高リスク集団は、化学療法を受けることを選択すれば、化学療法治療に由来する極めて大きな有効性を有し、再発を低リスク患者のものに低減する可能性があることを示す。他方、ＴＡＭ治療を受けた低リスク集団は、化学療法なしで約７％の再発のリスクを有するが、化学療法が相対的に少ないリスクの低減しかもたらさないと予期できる。
【０１２４】
ＲＳは連続変数であるので、所与の患者の正確な数値のＲＳを用いて、化学療法から得られる患者個人の有効性の尤度を示すことができる。これを図２に示す。
【０１２５】
開示内容を通じて引用されたすべての参照文献は、参照により本明細書によって明確に組み込まれる。
【０１２６】
当業者ならば、本発明の実施に使用できる、本明細書に記載されるものと同様または同等の多数の方法および材料を認識するであろう。実際、本発明は、記載される方法および材料に決して制限するものではない。本発明を具体的な実施形態であると考えられるものに関連して説明してきたが、本発明はこのような実施形態に限定されないことは理解されなくてはならない。それとは反対に、本発明は、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲内に含まれる種々の改変および同等物を対象とするものとする。例えば、開示内容は、ＣＭＦ（シクロホスファミド、メトトレキサート、フルオロウラシル）化学療法を用いる治療に対する乳癌患者の有益な反応を予測するのに有用な遺伝子および遺伝子のグループを同定することによって例示されるが、その他の化学療法薬を用いる治療に対する患者の反応を調べる同様の方法、ならびに同様の遺伝子、遺伝子セットおよびその他の種類の癌に関する方法も、明確に本明細書における範囲内にある。
【０１２７】
【表３−１】
【０１２８】
【表３−２】
【０１２９】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】再発スコアによって、低、中または高リスクとして同定されるＮＳＡＢＰ Ｂ−２０患者群内の１０年でのＤＲＥＳによって求められる化学療法の絶対的有効性を示す図である。
【図２】再発スコアによって、連続型変数として同定されるＮＳＡＢＰ Ｂ−２０患者群内の１０年でのＤＲＥＳによって求められる化学療法の絶対的有効性を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌と診断された被験体の化学療法に対する有益な反応の尤度を予測する方法であって、
（ａ）該被験体から得られた癌細胞を含む生体サンプルにおいて、以下の変数のうち１以上の値を定量的に決定する工程を含み、
（ｉ）再発スコア
（ｉｉ）ＥＳＲ１グループスコア
（ｉｉｉ）浸潤グループスコア
（ｉｖ）増殖グループ閾値スコア
（ｖ）ＭＹＢＬ２およびＳＣＵＢＥ２の少なくとも一方のＲＮＡ転写物、または対応する発現産物の発現レベル、
（ｂ１）（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）のうち１以上の値、またはＭＹＢＬ２のＲＮＡ転写物もしくは対応する発現産物の発現レベルの増加分１単位ごとに、前記被験体が、前記化学療法に対する有益な反応の比例して増加した尤度を有すると同定され、
（ｂ２）（ｉｉ）の値またはＳＣＵＢＥ２のＲＮＡ転写物もしくは対応する発現産物の発現レベルの増加分１単位ごとに、前記被験体が、化学療法に対する有益な反応の比例して減少した尤度を有すると同定され、
（ｂ３）（ｉ）の値の増加分１単位ごとに、前記被験体が、化学療法に対する有益な反応の増加した尤度を有すると同定されると乳癌再発のリスクの低下によって判定され、
ＥＳＲ１グループスコア＝（ＥＳＲ１＋ＰＧＲ＋ＢＣＬ２＋ＳＣＵＢＥ２）／４、
浸潤グループスコア＝（ＣＴＳＬ２＋ＭＭＰ１１）／２、
ＧＲＢ７グループスコア＝０．９×ＧＲＢ７＋０．１×ＥＲＢＢ２、
ＧＲＢ７グループ閾値スコアは、ＧＲＢ７グループスコアが８未満である場合は８に等しく、ＧＲＢ７グループスコアが８以上である場合にはＧＲＢ７グループスコアに等しく、
増殖グループスコア＝（ＢＩＲＣ５＋ＭＫＩ６７＋ＭＹＢＬ２＋ＣＣＮＢ１＋ＳＴＫ６）／５、
増殖グループ閾値スコアは、増殖グループスコアが６．５未満である場合には６．５に等しく、増殖グループスコアが６．５以上である場合には増殖グループスコアに等しく、
【数１】
［式中、
ＲＳｕ＝０．４７×ＧＲＢ７グループ閾値スコア
−０．３４×ＥＳＲ１グループスコア
＋１．０４×増殖グループ閾値スコア
＋０．１０×浸潤グループスコア
＋０．０５×ＣＤ６８
−０．０８×ＧＳＴＭ１
−０．０７×ＢＡＧ１］
等式中の遺伝子記号はそれぞれの遺伝子のＲＮＡ転写物またはその発現産物の発現レベルを表し、変数（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）における遺伝子の個々の寄与は０．５〜１．５の因子によって加重され、
あらゆる個々の遺伝子および該変数のいずれか中に存在するあらゆる遺伝子が、ピアソン相関係数≧０．５で該癌において該遺伝子と同時発現する別の遺伝子で置換され得る、方法。
【請求項２】
前記被験体がヒト患者である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
変数（ｉ）〜（ｖ）に含まれるすべての遺伝子またはそれらの発現産物の発現レベルは、１種以上の参照遺伝子またはそれらの発現産物の発現レベルに対して正規化される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記参照遺伝子が、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤ、ＧＵＳＢ、ＲＰＬＰ０およびＴＦＲＣからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記発現レベルは、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤ、ＧＵＳＢ、ＲＰＬＰ０およびＴＦＲＣ、またはそれらの発現産物の発現レベルの平均に対して正規化される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
化学療法に対する有益な反応の尤度についての定量値が、一連の期間にわたって測定した変数の値に直接比例する、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記癌が充実腫瘍である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記癌が乳癌、卵巣癌、胃癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌および肺癌からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記乳癌が浸潤性乳癌またはステージＩＩもしくはステージＩＩＩ乳癌である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記乳癌がＥＳＲ１陽性である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記患者が、化学療法に対する有益な反応の増加した尤度を有すると決定される、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記決定後に、前記患者は化学療法を施される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記化学療法がアジュバント化学療法である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記化学療法がアントラサイクリン誘導体の投与を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記アントラサイクリン誘導体がドキソルビシンまたはアドリアマイシンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記化学療法がタキサン誘導体の投与を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記タキサン誘導体がパクリタキセルまたはドセタキセルである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記化学療法がトポイソメラーゼ阻害剤の投与を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記トポイソメラーゼ阻害剤がカンプトセシン、トポテカン、イリノテカン、２０−Ｓ−カンプトセシン、９−ニトロ−カンプトセシン、９−アミノ−カンプトセシンおよびＧＩ１４７２１１からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記化学療法がヌクレオチド生合成の阻害剤の投与を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記のヌクレオチド生合成の阻害剤がメトトレキサートおよび／または５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記変数のうち少なくとも２つの決定を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２３】
前記変数のうち少なくとも３つの決定を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
前記変数のうち少なくとも４つの決定を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２５】
前記変数のうち少なくとも５つの決定を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２６】
ＭＹＢＬ２およびＳＣＵＢＥ２またはそれらの発現産物のうち一方もしくは両方の発現レベルの決定を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２７】
前記生体サンプルが、癌細胞を含む組織サンプルである、請求項２に記載の方法。
【請求項２８】
前記組織が固定パラフィン包埋されているか、または新鮮なものであるか、または凍結されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項２９】
前記組織が細針生検、コア生検またはその他の種類の生検に由来する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記組織サンプルが微細針吸引生検、気管支洗浄または経気管支生検によって得られる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記発現レベルの決定が定量的ＲＴ−ＰＣＲを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項３２】
前記発現産物の発現レベルの決定が免疫組織化学を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項３３】
前記遺伝子発現産物のレベルがプロテオミクス技術によって決定される、請求項２に記載の方法。
【請求項３４】
前記発現レベルが、標的遺伝子配列に基づいたプライマーおよびプローブ配列を用いる定量的ＲＴ−ＰＣＲによって決定される、請求項２に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも１種の標的遺伝子配列がイントロンに基づく配列であり、該イントロンの発現が該遺伝子のエキソン配列の発現と相関する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３６】
前記有益な反応の尤度を要約する報告書を作製する工程をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項３７】
前記報告書を、癌と診断された患者および／または患者の医師に個人用ゲノムプロフィールとして提供する工程をさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３８】
癌と診断された被験体の個人用ゲノムプロフィールを調製する方法であって、
（ａ）該被験体から得られた癌細胞を含む生体サンプルにおいて、以下の変数のうち１以上の値を定量的に決定する工程を含み、
（ｉ）再発スコア
（ｉｉ）ＥＳＲ１グループスコア
（ｉｉｉ）浸潤グループスコア
（ｉｖ）増殖グループ閾値スコア
（ｖ）ＭＹＢＬ２およびＳＣＵＢＥ２の少なくとも一方のＲＮＡ転写物の発現レベル、
（ｂ１）（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）のうち１以上の値、またはＭＹＢＬ２のＲＮＡ転写物もしくは対応する発現産物の発現レベルの増加分１単位ごとに、該被験体が、化学療法に対する有益な反応の比例して増加した尤度を有すると同定され、
（ｂ２）（ｉｉ）の値またはＳＣＵＢＥ２のＲＮＡ転写物もしくは対応する発現産物の発現レベルの増加分１単位ごとに、該被験体が、化学療法に対する有益な反応の比例して減少した尤度を有すると同定され、
（ｂ３）（ｉ）の値の増加分１単位ごとに、該被験体が、化学療法の不在下で乳癌再発の増加した尤度を有すると同定され、
ＥＳＲ１グループスコア＝（ＥＳＲ１＋ＰＧＲ＋ＢＣＬ２＋ＳＣＵＢＥ２）／４、
浸潤グループスコア＝（ＣＴＳＬ２＋ＭＭＰ１１）／２、
ＧＲＢ７グループスコア＝０．９×ＧＲＢ７＋０．１×ＥＲＢＢ２、
ＧＲＢ７グループ閾値スコアは、ＧＲＢ７グループスコアが８未満である場合は８に等しく、ＧＲＢ７グループスコアが８以上である場合にはＧＲＢ７グループスコアに等しく、
増殖グループスコア＝（ＢＩＲＣ５＋ＭＫＩ６７＋ＭＹＢＬ２＋ＣＣＮＢ１＋ＳＴＫ６）／５、
増殖グループ閾値スコアは、増殖グループスコアが６．５未満である場合には６．５に等しく、増殖グループスコアが６．５以上である場合には増殖グループスコアに等しく、
【数２】
［式中、
ＲＳｕ＝０．４７×ＧＲＢ７ グループ閾値スコア
−０．３４×ＥＳＲ１グループスコア
＋１．０４×増殖グループ閾値スコア
＋０．１０×浸潤グループスコア
＋０．０５×ＣＤ６８
−０．０８×ＧＳＴＭ１
−０．０７×ＢＡＧ１］
等式中の遺伝子記号は、それぞれの遺伝子のＲＮＡ転写物またはその発現産物の発現レベルを表し、変数（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）における遺伝子の個々の寄与は０．５〜１．５の因子によって加重され、
あらゆる個々の遺伝子および該変数のいずれか中に存在する遺伝子が、ピアソン相関係数≧０．５で該癌において前記遺伝子と同時発現する別の遺伝子で置換され得、
（ｃ）前記遺伝子発現解析によって得られたデータを要約する報告書を作製する工程を含む、方法。
【請求項３９】
（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）のうち１以上の値、またはＭＹＢＬ２のＲＮＡ転写物もしくは対応する発現産物の発現レベルの増加が決定される場合に、前記被験体が、化学療法に対する有益な反応の増加した尤度を有するという予測を前記報告書が含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４０】
前記被験体を化学療法薬で治療する工程をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４１】
（ｉｉ）の値またはＳＣＵＢＥ２のＲＮＡ転写物もしくは対応する発現産物の発現レベルの増加が決定される場合に、前記被験体が、化学療法に対する有益な反応の減少した尤度を有するという予測を前記報告書が含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項１】
癌と診断された被験体の化学療法に対する有益な反応の尤度を予測する方法であって、
（ａ）該被験体から得られた癌細胞を含む生体サンプルにおいて、以下の変数のうち１以上の値を定量的に決定する工程を含み、
（ｉ）再発スコア
（ｉｉ）ＥＳＲ１グループスコア
（ｉｉｉ）浸潤グループスコア
（ｉｖ）増殖グループ閾値スコア
（ｖ）ＭＹＢＬ２およびＳＣＵＢＥ２の少なくとも一方のＲＮＡ転写物、または対応する発現産物の発現レベル、
（ｂ１）（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）のうち１以上の値、またはＭＹＢＬ２のＲＮＡ転写物もしくは対応する発現産物の発現レベルの増加分１単位ごとに、前記被験体が、前記化学療法に対する有益な反応の比例して増加した尤度を有すると同定され、
（ｂ２）（ｉｉ）の値またはＳＣＵＢＥ２のＲＮＡ転写物もしくは対応する発現産物の発現レベルの増加分１単位ごとに、前記被験体が、化学療法に対する有益な反応の比例して減少した尤度を有すると同定され、
（ｂ３）（ｉ）の値の増加分１単位ごとに、前記被験体が、化学療法に対する有益な反応の増加した尤度を有すると同定されると乳癌再発のリスクの低下によって判定され、
ＥＳＲ１グループスコア＝（ＥＳＲ１＋ＰＧＲ＋ＢＣＬ２＋ＳＣＵＢＥ２）／４、
浸潤グループスコア＝（ＣＴＳＬ２＋ＭＭＰ１１）／２、
ＧＲＢ７グループスコア＝０．９×ＧＲＢ７＋０．１×ＥＲＢＢ２、
ＧＲＢ７グループ閾値スコアは、ＧＲＢ７グループスコアが８未満である場合は８に等しく、ＧＲＢ７グループスコアが８以上である場合にはＧＲＢ７グループスコアに等しく、
増殖グループスコア＝（ＢＩＲＣ５＋ＭＫＩ６７＋ＭＹＢＬ２＋ＣＣＮＢ１＋ＳＴＫ６）／５、
増殖グループ閾値スコアは、増殖グループスコアが６．５未満である場合には６．５に等しく、増殖グループスコアが６．５以上である場合には増殖グループスコアに等しく、
【数１】
［式中、
ＲＳｕ＝０．４７×ＧＲＢ７グループ閾値スコア
−０．３４×ＥＳＲ１グループスコア
＋１．０４×増殖グループ閾値スコア
＋０．１０×浸潤グループスコア
＋０．０５×ＣＤ６８
−０．０８×ＧＳＴＭ１
−０．０７×ＢＡＧ１］
等式中の遺伝子記号はそれぞれの遺伝子のＲＮＡ転写物またはその発現産物の発現レベルを表し、変数（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）における遺伝子の個々の寄与は０．５〜１．５の因子によって加重され、
あらゆる個々の遺伝子および該変数のいずれか中に存在するあらゆる遺伝子が、ピアソン相関係数≧０．５で該癌において該遺伝子と同時発現する別の遺伝子で置換され得る、方法。
【請求項２】
前記被験体がヒト患者である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
変数（ｉ）〜（ｖ）に含まれるすべての遺伝子またはそれらの発現産物の発現レベルは、１種以上の参照遺伝子またはそれらの発現産物の発現レベルに対して正規化される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記参照遺伝子が、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤ、ＧＵＳＢ、ＲＰＬＰ０およびＴＦＲＣからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記発現レベルは、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤ、ＧＵＳＢ、ＲＰＬＰ０およびＴＦＲＣ、またはそれらの発現産物の発現レベルの平均に対して正規化される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
化学療法に対する有益な反応の尤度についての定量値が、一連の期間にわたって測定した変数の値に直接比例する、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記癌が充実腫瘍である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記癌が乳癌、卵巣癌、胃癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌および肺癌からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記乳癌が浸潤性乳癌またはステージＩＩもしくはステージＩＩＩ乳癌である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記乳癌がＥＳＲ１陽性である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記患者が、化学療法に対する有益な反応の増加した尤度を有すると決定される、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記決定後に、前記患者は化学療法を施される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記化学療法がアジュバント化学療法である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記化学療法がアントラサイクリン誘導体の投与を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記アントラサイクリン誘導体がドキソルビシンまたはアドリアマイシンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記化学療法がタキサン誘導体の投与を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記タキサン誘導体がパクリタキセルまたはドセタキセルである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記化学療法がトポイソメラーゼ阻害剤の投与を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記トポイソメラーゼ阻害剤がカンプトセシン、トポテカン、イリノテカン、２０−Ｓ−カンプトセシン、９−ニトロ−カンプトセシン、９−アミノ−カンプトセシンおよびＧＩ１４７２１１からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記化学療法がヌクレオチド生合成の阻害剤の投与を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記のヌクレオチド生合成の阻害剤がメトトレキサートおよび／または５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記変数のうち少なくとも２つの決定を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２３】
前記変数のうち少なくとも３つの決定を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
前記変数のうち少なくとも４つの決定を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２５】
前記変数のうち少なくとも５つの決定を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２６】
ＭＹＢＬ２およびＳＣＵＢＥ２またはそれらの発現産物のうち一方もしくは両方の発現レベルの決定を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２７】
前記生体サンプルが、癌細胞を含む組織サンプルである、請求項２に記載の方法。
【請求項２８】
前記組織が固定パラフィン包埋されているか、または新鮮なものであるか、または凍結されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項２９】
前記組織が細針生検、コア生検またはその他の種類の生検に由来する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記組織サンプルが微細針吸引生検、気管支洗浄または経気管支生検によって得られる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記発現レベルの決定が定量的ＲＴ−ＰＣＲを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項３２】
前記発現産物の発現レベルの決定が免疫組織化学を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項３３】
前記遺伝子発現産物のレベルがプロテオミクス技術によって決定される、請求項２に記載の方法。
【請求項３４】
前記発現レベルが、標的遺伝子配列に基づいたプライマーおよびプローブ配列を用いる定量的ＲＴ−ＰＣＲによって決定される、請求項２に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも１種の標的遺伝子配列がイントロンに基づく配列であり、該イントロンの発現が該遺伝子のエキソン配列の発現と相関する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３６】
前記有益な反応の尤度を要約する報告書を作製する工程をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項３７】
前記報告書を、癌と診断された患者および／または患者の医師に個人用ゲノムプロフィールとして提供する工程をさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３８】
癌と診断された被験体の個人用ゲノムプロフィールを調製する方法であって、
（ａ）該被験体から得られた癌細胞を含む生体サンプルにおいて、以下の変数のうち１以上の値を定量的に決定する工程を含み、
（ｉ）再発スコア
（ｉｉ）ＥＳＲ１グループスコア
（ｉｉｉ）浸潤グループスコア
（ｉｖ）増殖グループ閾値スコア
（ｖ）ＭＹＢＬ２およびＳＣＵＢＥ２の少なくとも一方のＲＮＡ転写物の発現レベル、
（ｂ１）（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）のうち１以上の値、またはＭＹＢＬ２のＲＮＡ転写物もしくは対応する発現産物の発現レベルの増加分１単位ごとに、該被験体が、化学療法に対する有益な反応の比例して増加した尤度を有すると同定され、
（ｂ２）（ｉｉ）の値またはＳＣＵＢＥ２のＲＮＡ転写物もしくは対応する発現産物の発現レベルの増加分１単位ごとに、該被験体が、化学療法に対する有益な反応の比例して減少した尤度を有すると同定され、
（ｂ３）（ｉ）の値の増加分１単位ごとに、該被験体が、化学療法の不在下で乳癌再発の増加した尤度を有すると同定され、
ＥＳＲ１グループスコア＝（ＥＳＲ１＋ＰＧＲ＋ＢＣＬ２＋ＳＣＵＢＥ２）／４、
浸潤グループスコア＝（ＣＴＳＬ２＋ＭＭＰ１１）／２、
ＧＲＢ７グループスコア＝０．９×ＧＲＢ７＋０．１×ＥＲＢＢ２、
ＧＲＢ７グループ閾値スコアは、ＧＲＢ７グループスコアが８未満である場合は８に等しく、ＧＲＢ７グループスコアが８以上である場合にはＧＲＢ７グループスコアに等しく、
増殖グループスコア＝（ＢＩＲＣ５＋ＭＫＩ６７＋ＭＹＢＬ２＋ＣＣＮＢ１＋ＳＴＫ６）／５、
増殖グループ閾値スコアは、増殖グループスコアが６．５未満である場合には６．５に等しく、増殖グループスコアが６．５以上である場合には増殖グループスコアに等しく、
【数２】
［式中、
ＲＳｕ＝０．４７×ＧＲＢ７ グループ閾値スコア
−０．３４×ＥＳＲ１グループスコア
＋１．０４×増殖グループ閾値スコア
＋０．１０×浸潤グループスコア
＋０．０５×ＣＤ６８
−０．０８×ＧＳＴＭ１
−０．０７×ＢＡＧ１］
等式中の遺伝子記号は、それぞれの遺伝子のＲＮＡ転写物またはその発現産物の発現レベルを表し、変数（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）における遺伝子の個々の寄与は０．５〜１．５の因子によって加重され、
あらゆる個々の遺伝子および該変数のいずれか中に存在する遺伝子が、ピアソン相関係数≧０．５で該癌において前記遺伝子と同時発現する別の遺伝子で置換され得、
（ｃ）前記遺伝子発現解析によって得られたデータを要約する報告書を作製する工程を含む、方法。
【請求項３９】
（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）のうち１以上の値、またはＭＹＢＬ２のＲＮＡ転写物もしくは対応する発現産物の発現レベルの増加が決定される場合に、前記被験体が、化学療法に対する有益な反応の増加した尤度を有するという予測を前記報告書が含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４０】
前記被験体を化学療法薬で治療する工程をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４１】
（ｉｉ）の値またはＳＣＵＢＥ２のＲＮＡ転写物もしくは対応する発現産物の発現レベルの増加が決定される場合に、前記被験体が、化学療法に対する有益な反応の減少した尤度を有するという予測を前記報告書が含む、請求項３９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００８−５２０１９２（Ｐ２００８−５２０１９２Ａ）
【公表日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４０１２２（Ｐ２００７−５４０１２２）
【出願日】平成１７年１１月４日（２００５．１１．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４０２３８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５２８６２
【国際公開日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【出願人】（５０４３４５１２６）ジェノミック ヘルス， インコーポレイテッド (17)
【出願人】（５０７１４５４８８）エヌエスエービーピー ファウンデーション， インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月４日（２００５．１１．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４０２３８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５２８６２
【国際公開日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【出願人】（５０４３４５１２６）ジェノミック ヘルス， インコーポレイテッド (17)
【出願人】（５０７１４５４８８）エヌエスエービーピー ファウンデーション， インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
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