酵素が固定されている支持体、印刷物、試薬キット、該支持体の製造法、酵素の保存法及び酵素の再生法
酵素を簡便な方法で保存可能とする。 酵素と当該酵素の保護剤とが固定されている支持体。該支持体を含む印刷物及び試薬キット。該支持体を製造する方法。該支持体に固定された酵素を再生する方法。酵素を保護剤との混合物として支持体に固定した状態で保存する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素が固定されている支持体、印刷物、試薬キット、該支持体の製造法、酵素の保存法及び酵素の再生法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素は触媒活性を有するタンパク質であり、種々の生体反応を司ることにより、生命の維持に貢献している。
【０００３】
酵素は、水分を含有した状態では室温で不安定である。それ故、凍結状態で保存されるか、あるいは−２０℃以下の温度で安定化剤とともに液体中で保存される。
【０００４】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＤＮＡポリメラーゼという酵素により触媒される核酸増幅反応であるが、ＤＮＡポリメラーゼは通常バッファー中で−２０℃の温度で保存される。このような保存のためには、冷凍庫が必要である。また、この酵素が供給者から使用者に配送されるにあたっては、ドライアイスとともに発泡スチロールなどの容器に箱詰めされる。これらの保存・配送方法は、特別の設備や作業を要するため、操作が煩雑で費用のかかるものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、酵素を保存するための簡便な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ＤＮＡポリメラーゼをトレハロースと混合した状態で支持体に固定して保存した後、ＰＣＲを行ったところ、ＰＣＲ反応が進行することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
本発明の要旨は以下の通りである。
【０００８】
（１） 酵素と当該酵素の保護剤とが固定されている支持体。
【０００９】
（２） 上記保護剤がトレハロース及びその誘導体からなる化合物群より選択される少なくとも一種類の化合物である（１）記載の支持体。
【００１０】
（３） 酵素反応の促進剤をさらに含む（１）又は（２）に記載の支持体。
【００１１】
（４） 上記酵素に対するアプタマーをさらに含む（１）ないし（３）の何れか一項に記載の支持体。
【００１２】
（５） 酵素と当該酵素に対するアプタマーとが固定されている支持体。
【００１３】
（６） 上記酵素がＤＮＡポリメラーゼである（１）ないし（５）の何れか一項に記載の支持体。
【００１４】
（７） さらに、上記ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸増幅反応で目的とする核酸を増幅するためのプライマーを含んでなる（６）記載の支持体。
【００１５】
（８） さらに、上記ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸増幅反応の鋳型となる核酸、当該核酸を増幅するためのプライマー、及び核酸増幅反応のためのバッファーから選択される少なくとも一つを含んでなる（６）に記載の支持体。
【００１６】
（９） （１）ないし（８）の何れか一項に記載の支持体を含む印刷物。
【００１７】
（１０） （１）ないし（８）の何れか一項に記載の支持体を含む試薬キット。
【００１８】
（１１） （１）記載の支持体を製造する方法であって、酵素及び保護剤の混合溶液を調製し、該溶液を支持体に適用し、該支持体を乾燥することにより、前記酵素及び保護剤の混合物を支持体に固定することを含む前記の方法。
【００１９】
（１２） （１）ないし（８）の何れか一項に記載の支持体を液体に浸漬させることにより、該液体中に酵素を溶出させることを含む、支持体に固定された酵素を再生する方法。
【００２０】
（１３） （６）ないし（８）の何れか一項に記載の支持体を液体中に配置して当該支持体よりＤＮＡポリメラ−ゼを溶出させる工程と、当該ＤＮＡポリメラ−ゼを用いて核酸増幅反応を行うことを特徴とする、核酸の増幅方法。
【００２１】
また、本発明は、酵素を保護剤との混合物として支持体に固定した状態で保存する方法を提供する。
【００２２】
さらに、本発明は、上記（７）に記載の支持体を液体中に配置して当該支持体よりＤＮＡポリメラ−ゼと、鋳型となる核酸、当該核酸を増幅するためのプライマー及び核酸増幅反応のためのバッファーから選択される少なくとも一つとを溶出させる工程と、当該ＤＮＡポリメラ−ゼと鋳型となる核酸および／またはプライマーとを用いて核酸増幅反応を行うことを特徴とする、核酸の増幅方法を提供する。
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２４】
本発明は、酵素と当該酵素の保護剤とが固定されている支持体を提供する。
【００２５】
酵素は、何らかの触媒活性を有するものであればいかなるものであってもよく、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＲＮａｓｅ、制限酵素、メチラーゼ、修飾酵素、ライゲース、プロテアーゼ、キナーゼ、フォスファターゼ、トランスフェラーゼ、グリコシラーゼ、トポイソメラーゼ、クロナーゼなどを例示することができるが、これらに限定されることはない。
【００２６】
保護剤は、酵素を乾燥から保護し、安定に保存できるものであればいかなるものであってもよく、トレハロース及びその誘導体、多糖類、ＰＥＧ、デキストラン、Ｆｉｃｏｌ、グリセロール、界面活性剤、ＰＶＡ及びその誘導体などを例示することができる。このうち、トレハロース及びその誘導体が効果的である。
【００２７】
保護剤は市販されているものであっても、公知の方法に従って合成したものであってもよい。
【００２８】
トレハロースは、２分子のＤ−グルコースが１，１結合した非還元性二糖であり、結合様式としては、α，α−、α，β−、β，β−の３種の異性体がある。
【００２９】
トレハロースの誘導体としては、トレハロースの酸エステル（例えば、ラウリン酸エステル、オレイン酸エステル、リノール酸エステル、リノレン酸エステル、ステアリン酸エステル、パルミチン酸エステル、ミリスチン酸エステルなどの脂肪酸エステル、酢酸エステル、安息香酸エステルなどのカルボン酸エステル、硫酸エステルなど）、アルキルエーテル（例えば、炭素数８〜２５のアルキルとのエーテルなど）、ハライド、含窒素誘導体、含硫黄誘導体などを例示することができるが、これらに限定されることはない。
【００３０】
トレハロース及びその誘導体は市販されているが、公知の方法で製造してもよい。トレハロース及びその誘導体の製法は、シー・ケー・リー『デベロップメンツ・イン・フード・カルボハイドレート』、１９８０年、アプライッド・サイエンス・パブリッシャーズ社発行、第１乃至８９頁やケー・ヨシモトら『ケミカル・アンド・ファーマシューティカル・ブレティン』、第３０巻、第４号、第１，１６９乃至１，１７４頁（１９８２年）、特開平８−１５７４９１号などに記載されている。
【００３１】
酵素１Ｕに対して、１０−５〜１０１Ｍ、好ましくは、１０−４〜１０−１Ｍの保護剤を添加して混合するとよい。
【００３２】
支持体には、さらに、酵素反応の促進剤が固定されていてもよい。酵素反応の促進剤は、酵素反応を促進する効果がある物質であればよく、酵素反応を促進する効果には、酵素反応阻害を抑制する効果も含まれる。酵素反応の促進剤としては、例えば、シュウ酸ナトリウム、シュウ酸カリウム、マソン酸ナトリウム、マレイン酸ナトリウム、ジメチルスルホキシド、ベタイン、グリセロール、アルブミン、界面活性剤（例えば、ｔｗｅｅｎ２０，Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００，ＮＰ４０など）、ポリアミン（例えばエチレンジアミン、トリメチレンジアミン、スペルミン、スペルミジン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミン、１，４−ビス（３−アミノプロピル）−ピペラジン、１−（２−アミノエチル）ピペラジン、１−（２−アミノエチル）ピペリジン、１，４，１０，１３−テトラオキサ−７，１６−ディアザサイクロオクタデカンおよびトリス（２−アミノエチル）アミンなど）、糖類（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マルトース、スクロース、ラクトース、その他多糖など）、硫酸化多糖およびその塩類（例えば、ヘパリン，デキストランサルフェイトなど）、ジチオスレイトール、ポリアニオン（例えばＤＮＡ，ＲＮＡなど）、多価アルコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール、ヘキサンジオール、オクタンジオール、グリセリン、ソルビタン、トリメチロールプロパン、ネオペンチルグリコールなどの脂肪族多価アルコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等）、硫酸アンモニウム、第四級アンモニウム塩（例えば、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルピリジニウムクロライド、ヘキサジメチリンブロミド、ヘキサフルオレニウムブロミド、メチルアゾリニウムブロミドなど）などを例示することができるが、これらに限定されることはない。酵素反応促進剤としては、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（島津製作所社製）などが挙げられ、ＤＮＡポリメラーゼの反応促進に有効である。
【００３３】
酵素反応促進剤は、反応液中に、例えばポリアミンであれば、１０〜０．０１ｍＭ程度、好ましくは２〜０．５ｍＭで存在するように、適当な量の酵素反応促進剤を支持体に固定するとよい。酵素反応促進剤は、酵素及び保護剤の混合物と同じ位置で支持体上に固定されてもよいし、酵素及び保護剤とは異なる位置で支持体に固定されてもよい。
【００３４】
支持体は、酵素及び保護剤の混合物を固定できるものであればいかなるものであってもよく、例えば、紙（例えば、６０ＭＤＰ紙（三島製紙製）、コピー用紙、上質紙、中質紙、ケント紙、画用紙、クラフト紙、インクジェット専用紙、トレーシングペーパー、和紙、ボール紙、濾紙など）、ガラス基板、シリコン基板、ビース、カラム充填剤、シリカゲル、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ＰＶＡ膜などを例示することができるが、これらに限定されることはない。
【００３５】
支持体の厚さは、例えば、１ｍｍ以下とすることができる。この厚さを非常に薄くすれば（例えば０．１ｍｍ程度）、酵素及び保護剤を固定した支持体を多数枚積層して配布する場合にも、嵩張らないので、その作業性は向上する。
【００３６】
支持体には、酵素及び保護剤の他、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの誘導体、修飾体など）、オリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの誘導体、修飾体など）、タンパク質（例えば、抗体、ホルモンなど）、ポリペプチド、オリゴペプチド、多糖、オリゴ糖、ＰＮＡ、低分子化合物（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＣＲ用バッファー組成に含まれる塩、Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰ混合物など）、それらの混合物などが固定されていてもよい。酵素及び保護剤以外の成分は、酵素及び保護剤の混合物と同じ位置で支持体上に固定されてもよいし、酵素及び保護剤とは異なる位置で支持体に固定されてもよい。特に、酵素に対するアプタマーが支持体に固定されているとよく、本発明は、酵素と当該酵素に対するアプタマーとが固定されている支持体も提供するものである。
【００３７】
本発明の好ましい態様の一つにおいて、支持体は、ＤＮＡポリメラーゼと当該ＤＮＡポリメラーゼの保護剤の他、当該ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸増幅反応で目的とする核酸を増幅するためのプライマーを含む。このような支持体は、ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇや種の同定などに使用することができる。支持体は、さらに、酵素反応の促進剤を含んでもよい。
【００３８】
本発明の別の好ましい態様の一つにおいて、支持体は、ＤＮＡポリメラーゼと当該ＤＮＡポリメラーゼの保護剤の他、当該ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸増幅反応（ＰＣＲなど）の鋳型となる核酸、当該核酸を増幅するためのプライマー、及び核酸増幅反応のためのバッファーから選択される少なくとも一つを含む。支持体は、さらに、酵素反応の促進剤を含んでもよい。
【００３９】
例えば、ＤＮＡポリメラーゼを紙（支持体）に固定して保存する場合には、紙には、ＤＮＡポリメラーゼ及び保護剤の他、プライマーセット（オリゴヌクレオチド）、ＰＣＲ反応の鋳型となるＤＮＡ（合成の１本鎖又は２本鎖ＤＮＡでもよいし、ｃＤＮＡをクローニングしたベクターでもよい）、ＤＮＡポリメラーゼに対するアプタマー（機能性ＲＮＡ）、ＰＣＲ反応溶液中の各成分（すなわち、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ、ｄＮＴＰ混合物など）、ＥＤＴＡなどを固定してもよい。この場合、（１）ＤＮＡポリメラーゼ、保護剤及びプライマーセットを１スポットとして、ＰＣＲ反応の鋳型となるＤＮＡ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ及びＥＤＴＡを別のスポットとして紙に固定してもよいし、（２）ＤＮＡポリメラーゼ、保護剤及びプライマーセット、必要により、ＤＮＡポリメラーゼに対するアプタマーを１スポットとして紙に固定してもよいし、（３）ＰＣＲ反応に必要なすべての成分（すなわち、ＰＣＲ反応の鋳型となるＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマーセット、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ、ｄＮＴＰ混合物など、必要により、ＤＮＡポリメラーゼに対するアプタマー）を保護剤とともに１スポットとして紙に固定してもよい。紙にＤＮＡポリメラーゼなどの成分がスポッティングされていることがわかるように、スポッティングする成分に色素を添加しておくとよい。色素としては、クレゾールレッド、ブロモフェノールブルー、キシレンシアノールなどを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
【００４０】
支持体に固定する酵素の量は、目的とする酵素反応が行われるように適宜調整するとよい。例えば、ＰＣＲ反応が行われるようにするためには、１スポット当たり５ｎｇ以上のＤＮＡポリメラーゼが固定されるとよい。
【００４１】
酵素及び当該酵素の保護剤の混合物が固定されている支持体は以下のようにして製造することができる。まず、酵素及び保護剤の混合溶液を調製する。酵素と保護剤の混合比は上記の通りである。溶媒は水であるとよい。さらに、この混合溶液に、酵素及び保護剤以外の上記の成分を添加してもよい。次いで、酵素及び保護剤の混合溶液を支持体に適用する。例えば、支持体が紙である場合には、スポイト、９６ ｐｉｎ−ｔｏｏｌ（Ｍｕｌｔｉ ９６−ｍｕｌｔｉｂｌｏｔ ｒｅｐｌｉｃａｔｏｒ ＶＰ４０９，Ｂｉｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，ＵＳ）、ディスポーザブルタイプのｐｉｎ−ｔｏｏｌなどを用いて、混合溶液を紙にスポッティングすることができる。その後、支持体を乾燥することにより、酵素及び保護剤の混合物を支持体に固定する。酵素及び保護剤の混合物を固定した支持体は実質的に水を含まないものであるとよい。
【００４２】
上記のように、酵素を保護剤との混合物として支持体に固定した状態にすることによって、酵素を安定に保存することができる。保存条件としては、室温で、高湿度を避け、遮光下に保存することが好ましい。例えば、酵素がＤＮＡポリメラーゼである場合、ＤＮＡポリメラーゼをトレハロースとの混合物として６０ＭＤＰ紙に固定した状態で室温で保存したとき、少なくとも６か月半の保存寿命が確認されている（現在、まだ保存試験は続行中である）。
【００４３】
上記のように、保護剤との混合物として支持体に固定した酵素を再生するには、酵素と保護剤との混合物を固定した支持体を液体に浸漬させ、該液体中に酵素を溶出させればよい。支持体を浸漬させる液体は、酵素の再生を可能とするものであればいかなるものであってもよいが、例えば、水、水以外の成分を含有する水溶液などを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。例えば、支持体に固定した酵素がＤＮＡポリメラーゼである場合、支持体を浸漬させる液体は、水、ＰＣＲ反応溶液（すなわち、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ、ｄＮＴＰ混合物などを含有する水溶液）などであるとよい。浸漬は、室温にて大気圧下で、１〜３分間行えばよい。
【００４４】
支持体にＤＮＡポリメラーゼが固定されている場合には、この支持体を液体中に配置して当該支持体よりＤＮＡポリメラ−ゼを溶出させ、当該ＤＮＡポリメラ−ゼを用いて核酸増幅反応を行うことにより、核酸を増幅することができる。
【００４５】
また、本発明は、酵素と当該酵素の保護剤とが固定されている支持体を含む印刷物を提供する。
【００４６】
印刷物としては、教科書などの成書、ハンドブック、カタログ、定期刊行物、雑誌、論文、冊子、小冊子、リーフレット、パンフレット、報告書、ポスター、カード、ラベルなどを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
【００４７】
図１は、本発明の印刷物における、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）及びトレハロースの混合物がスポッティングされている紙（支持体）の一例を示す。紙６には、ＤＮＡポリメラーゼ及びトレハロースが、プライマーセット、ＰＣＲ反応の鋳型となるｃＤＮＡクローン及びその他のＰＣＲ反応に必要な成分（すなわち、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ、各ｄＮＴＰ、必要により、ＤＮＡポリメラーゼに対するアプタマー）とともにスポッティングされている（以下、このスポットを「ＤＮＡ Ｓｐｏｔ」１という）。紙６には、ＤＮＡ Ｓｐｏｔ１の他に、ｃＤＮＡクローンがコードするタンパク質の名前２（ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅなど）、ｃＤＮＡクローンの識別番号３（Ｃｌｏｎｅ ＩＤ）、ｃＤＮＡクローンの塩基配列４（ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、実験（ＰＣＲ反応）の手順の説明文５（Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）が印刷されている。
【００４８】
図２は、図１に示すＤＮＡ Ｓｐｏｔ１を有する紙６を別紙として添付している学術論文１２が掲載されている雑誌１３を示す。
【００４９】
図３は、図１に示すＤＮＡ Ｓｐｏｔ１を有する紙６を綴じ込んだ書籍２２を示す。この書籍には、さらに、目次が含まれているとよい。
【００５０】
図４は、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）及びトレハロースの混合物がスポッティングされている紙（支持体）を綴じ込んだ書籍の別の態様を示す。酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）及びトレハロースの混合物がスポッティングされている頁３４の各格子には、ＤＮＡポリメラーゼ及びトレハロースが、プライマーセット、ＰＣＲ反応の鋳型となるｃＤＮＡクローン及びその他のＰＣＲ反応に必要な成分（すなわち、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ、各ｄＮＴＰ、必要により、ＤＮＡポリメラーゼに対するアプタマー）とともに、スポッティングされている（以下、このスポットを「ＤＮＡ Ｓｐｏｔ」３１という。）。これらのスポット３１を有する頁３４には、スポットを識別するための記号（列番号）３２及び（行番号）３３が印刷されている。さらに、ＤＮＡをスッポッティングした頁の識別番号３０（Ｒｅａｒｒａｙ ＰＬＡＴＥ ＩＤ）が印刷されている。スポッティングされているｃＤＮＡクローンに関する情報（例えば、ｃＤＮＡクローンがコードする酵素のＥＣ ｎｕｍｂｅｒ、ｃＤＮＡクローンがコードする酵素の名前（Ｇｅｎｅ ｎａｍｅ）、クローンのＩＤ番号（ＲＩＫＥＮ Ｃｌｏｎｅ ＩＤ）、寄託番号（Ａｃｃｅｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ）、ｃＤＮＡクローンインサートの長さ（ｃＤＮＡ Ｉｎｓｅｒｔ）、ＰＣＲ反応産物の長さ（Ａｆｔｅｒ ＰＣＲ）、ｃＤＮＡクローンがコードする酵素が関与する反応の説明など）及びプライマーセットに関する情報（例えば、プライマーの塩基配列など）はＣＤ−ＲＯＭ３６（ＣＤ−ＲＯＭの代わりにＦＤ、ＭＯなどの媒体でもよい）に記録されており、これらの記録媒体が書籍に付録として添付されている（図５）。図５においては、ＣＤ−ＲＯＭ３６は袋３７に入れられ、シール３８で封をした状態で書籍３５に添付されている。この書籍には、さらに、目次、ｃＤＮＡクローン及びプライマーセットを含むスポットの使用説明、記録媒体に記録されている情報へのアクセス方法が印刷されている頁が含まれているとよい。
【００５１】
印刷物の形態としては、１）百科事典タイプの網羅的なもの（例えば、ＦＡＮＴＯＭクローン、ヒトメタボロームなど）、２）分野ごと（例えば、機能別或いは臓器別等）の分冊型、３）更にテーマというか内容を細分化した１ページから数ページのもの（例えば、ルーズリーフタイプ）、４）より少数の貼付物を想定したカードタイプを例示することができる。
【００５２】
さらに、本発明は、酵素と当該酵素の保護剤とが固定されている支持体を含む試薬キットを提供する。
【００５３】
本発明の試薬キットは、核酸増幅反応（例えば、ＰＣＲ）キット、蛋白発生キット、抗体キット、その他のキットとして、種々の実験、検査、診断などに利用することができる。
【００５４】
本発明の試薬キットは、上記のような印刷物の形態をとってもよいが、それ以外の形態の例を図６〜９に示す。
【００５５】
図６は、本発明の試薬キットにおける、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）及びトレハロースの混合物がスポッティングされている紙（支持体）の一例を示す。この紙には、ＤＮＡポリメラーゼ及びトレハロースが、プライマーセット、その他のＰＣＲ反応に必要な成分（すなわち、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ、各ｄＮＴＰ、必要により、ＤＮＡポリメラーゼに対するアプタマー）とともに、紙の適当な位置にスポッティングされている（以下、このスポットを「ＤＮＡ Ｓｐｏｔ」４１という）。
【００５６】
図７は、図６に示すＤＮＡ Ｓｐｏｔ４１を有する紙４２を含む試薬キットの一例を示す。ＤＮＡ Ｓｐｏｔ４１を有する紙４２は遮光ビン５１に入れられ、蓋５２で密栓をして保管あるいは流通される。試薬キットには、さらに、キットの内容（例えば、キットに含まれる成分・分量、使用目的、保管方法・有効期限、包装単位など）、使用方法、使用上及び取扱い上の注意、問合せ先などの情報が記載された説明書５３を含むとよい。説明書５３は遮光ビン５１に入れてもよいし、遮光ビン５１を入れた包装箱（図示せず）に入れてもよい。あるいは、説明書をラベルに印刷して、このラベルを遮光ビン５１に貼り付けてもよい。
【００５７】
図８は、本発明の試薬キットにおける、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）及びトレハロースの混合物がスポッティングされている紙（支持体）の一例を示す。この紙６２には、ＤＮＡポリメラーゼ及びトレハロースが、プライマーセット、その他のＰＣＲ反応に必要な成分（すなわち、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ、各ｄＮＴＰ、必要により、ＤＮＡポリメラーゼに対するアプタマー）とともに、紙の適当な位置にスポッティングされている（以下、このスポットを「ＤＮＡ Ｓｐｏｔ」６１という）。
【００５８】
図９は、ＤＮＡ Ｓｐｏｔ６１を有する紙６２を含む試薬キットの一例を示す。ＤＮＡ Ｓｐｏｔ６１を有する紙６２は包装パック７１に入れられ、密封して保管あるいは流通される。試薬キットには、さらに、キットの内容（例えば、キットに含まれる成分・分量、使用目的、保管方法・有効期限、包装単位など）、使用方法、使用上及び取扱い上の注意、問合せ先などの情報が記載された説明書７２を含むとよい。説明書７２は包装パック７１に入れてもよいし、包装パック７１を入れた包装箱（図示せず）に入れてもよい。あるいは、説明書７２をラベルに印刷して、このラベルを包装パック７１又は包装箱に貼り付けてもよい。
【００５９】
以上、ＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡと組み合わせた態様について、本発明を説明したが、本発明はこの態様に限定されるわけではなく、種々の酵素への適用が可能である。
【００６０】
なお、本明細書において、「〜」はその前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示す。
【発明の効果】
【００６１】
本発明により、酵素を保存するための簡便な方法が提供された。
【００６２】
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願２００３−３３９５４２号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】ＤＮＡポリメラーゼ及びトレハロースの混合物がＤＮＡ（ｃＤＮＡ、プライマー、アプタマーなど）とともにスポッティングされている紙（支持体）の一例を示す。
【図２】ＤＮＡポリメラーゼ及びトレハロースの混合物がＤＮＡ（ｃＤＮＡ、プライマー、アプタマーなど）とともにスポッティングされた紙が別紙として添付された学術論文が掲載されている雑誌を示す。
【図３】ＤＮＡポリメラーゼ及びトレハロースの混合物がＤＮＡ（ｃＤＮＡ、プライマー、アプタマーなど）とともにスポッティングされた紙を綴じ込んだ書籍の一例を示す。
【図４】ＤＮＡポリメラーゼ及びトレハロースの混合物がＤＮＡ（ｃＤＮＡ、プライマー、アプタマーなど）とともにスポッティングされている紙（支持体）を綴じ込んだ書籍の別の態様を示す。
【図５】図４の紙にスポッティングされているｃＤＮＡに関する情報が記録されているＣＤ−ＲＯＭが袋に入れられ、シールで封をした状態で書籍に添付されている形態を示す。
【図６】ＤＮＡポリメラーゼ及びトレハロースの混合物がＤＮＡ（ｃＤＮＡ、プライマー、アプタマーなど）とともにスポッティングされている紙（支持体）の一例を示す。
【図７】図６の紙を含む試薬キットの一例を示す。
【図８】ＤＮＡポリメラーゼ及びトレハロースの混合物がＤＮＡ（ｃＤＮＡ、プライマー、アプタマーなど）とともにスポッティングされている紙（支持体）の一例を示す。
【図９】図８の紙を含む試薬キットの一例を示す。
【図１０】マウスリンゴ酸脱水素酵素のｃＤＮＡをクローニングしたｐＦＬＣベクターの構成を示す。
【図１１】マウスリンゴ酸脱水素酵素のｃＤＮＡ溶液のスポット及びポリメラーゼ＋プライマー溶液のスポットを有する６０ＭＤＰ紙を示す。
【図１２】図１１のスポットを用いて行ったＰＣＲ反応の反応生成物を電気泳動した結果を示す。
【図１３】プライマー＋アプタマー＋ポリメラーゼ溶液のスポットを有する６０ＭＤＰ紙を示す。
【図１４】図１３のスポットを用いて行ったＰＣＲ反応の反応生成物を電気泳動した結果を示す。
【図１５】マウスリンゴ酸脱水素酵素、マウスイソクエン酸脱水素酵素（ＮＡＤＰ）、マウスイソクエン酸脱水素酵素（ＮＡＤ）又はマウスオキソグルタル酸脱水素酵素のｃＤＮＡ＋プライマー＋アプタマー＋ポリメラーゼ＋ＰＣＲ用バッファー組成溶液のスポットを有する６０ＭＤＰ紙を示す。
【図１６】図１５のスポットを用いて行ったＰＣＲ反応の反応生成物を電気泳動した結果を示す。
【図１７】ｃＤＮＡ＋プライマー＋反応促進剤（スペルミジン）＋ポリメラーゼ＋ＰＣＲ用バッファー組成溶液のスポットを用いて行ったＰＣＲ反応の反応生成物を電気泳動した結果を示す。
【符号の説明】
【００６４】
１：ＤＮＡ Ｓｐｏｔｓ
２：ｃＤＮＡクローンがコードするタンパク質（ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅなどの酵素）の名前
３：ｃＤＮＡクローンの識別番号
４：ｃＤＮＡクローンの塩基配列
５：実験の手順の説明文
６：ＤＮＡポリメラーゼ及びトレハロースの混合物がＤＮＡ（ｃＤＮＡ、プライマー、アプタマーなど）とともにスポッティングされている紙
１２：学術論文
１３：雑誌
２２：書籍
３０：ＤＮＡがスポッティングされている頁の識別番号
３１：ＤＮＡ Ｓｐｏｔｓ
３２：スポットを認識するための記号１（列番号）
３３：スポットを認識するための記号２（行番号）
３４：ＤＮＡポリメラーゼ及びトレハロースの混合物がＤＮＡ（ｃＤＮＡ、プライマー、アプタマーなど）とともにスポッティングされている頁
３５：書籍
３６：ＣＤ−ＲＯＭ
３７：袋
３８：シール
４１：ＤＮＡ Ｓｐｏｔ
４２：紙（支持体）
５１：遮光ビン
５２：蓋
５３：説明書
６１：ＤＮＡ Ｓｐｏｔｓ
６２：紙（支持体）
７１：包装パック
７２：説明書
【発明を実施するための最良の形態】
【００６５】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００６６】
［実施例１］
ｃＤＮＡクローンとポリメラーゼをスポットしたＤＮＡブック
《プライマーの合成》
下記配列のプライマーセットを従来法により合成した。
プライマーセット１
−２１Ｍ１３：５’−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’（配列番号１）
１２３３−Ｒｖ：５’−ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡ−３’（配列番号２）
《ｃＤＮＡ溶液の調整》
理研クローン（ｈｔｔｐ：／／ｆａｎｔｏｍ．ｇｓｃ．ｒｉｋｅｎ．ｇｏ．ｊｐ／）の中から下記の塩基配列で表されるマウスリンゴ酸脱水素酵素のｃＤＮＡ（クローンＩＤ：１５０００１２Ｍ１５，１７５８ｂｐ）をクローニングしたｐＦＬＣベクター（図１０）を０．１μｇ／μｌとなるようにＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した。
《ポリメラーゼ＋プライマー溶液の調整》
ＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡製），トレハロース，プライマーセット１を混合し，最終濃度２５Ｕ／μｌ ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、０．１Ｍトレハロース，２μＭプライマーセット１となるように調整した。
《ＤＮＡのスポッティング》
６０ＭＤＰ紙（三島製紙製）に調整したｃＤＮＡ溶液とポリメラーゼ＋プライマー溶液を９６ ｐｉｎ−ｔｏｏｌ（Ｍｕｌｔｉ ９６−ｍｕｌｔｉｂｌｏｔ ｒｅｐｌｉｃａｔｏｒ ＶＰ４０９，Ｂｉｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，ＵＳ）を用いて，図１１に示すように，スポットの位置および種類が判別できるようにスポットした。ｃＤＮＡ溶液は０．５μｌ／スポット，ポリメラーゼ＋プライマー溶液は１μｌ／スポットとなるようにした。
《ＤＮＡの回収と増幅》
スポッティングした用紙を３０分以上室温にて乾燥させた後，スポットしたｃＤＮＡおよびポリメラーゼ＋プライマーを含むようにそれぞれ４ｍｍ ｘ ４ｍｍの大きさに６０ＭＤＰ紙を切り取りＰＣＲ用マイクロチューブに入れた。ＰＣＲ反応溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０ｍＭ ＫＣｌ，５．３ｍＭ ＭｇＣｌ，２００μＭ各ｄＮＴＰ）２５μｌをチューブに加え，次の条件でＰＣＲを行った。
２ｍｉｎ ａｔ ９４℃
（１ｍｉｎ ａｔ ９４℃，１ｍｉｎ ａｔ ５５℃，７５ｓｅｃ ａｔ ６８℃）２９サイクル
１５ｍｉｎ ａｔ ７４℃
反応後のチューブより適量を取り，１％アガロースゲルで電気泳動した結果を図１２に示す。１８００ｂｐ付近に見られるバンドが目的とする断片と考えられ，６０ＭＤＰ紙からＤＮＡが溶出し，そのＤＮＡはＰＣＲにより増幅可能であることが判った。
［実施例２］
＃黄体ホルモン遺伝子を使ったアプタマー＋ポリメラーゼの実験
《プライマーの合成》
下記配列のプライマーを従来法により合成した。
プライマーセット１（ヒト黄体形成ホルモン遺伝子エクソン１増幅するプライマーセット）
ＨｓＬＨ１Ｆ：ＣＣＡＧＧＧＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＧ（配列番号４）
ＨｓＬＨ１Ｒ：ＣＡＴＧＧＴＧＧＧＧＣＡＧＴＡＧＣＣ（配列番号５）
プライマーセット２（ヒト黄体形成ホルモン遺伝子エクソン２増幅するプライマーセット）
ＨｓＬＨ２Ｆ：ＡＴＧＣＧＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＧＣＧ（配列番号６）
ＨｓＬＨ２Ｒ：ＴＧＣＧＧＡＴＴＧＡＧＡＡＧＣＣＴＴＴＡＴＴＧ（配列番号７）
《アプタマーの合成》
次に既知のＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに対するアプタマー（Ｙｕｎ Ｌｉｎ，Ｓｕｍｅｄｈａ Ｄ．Ｊａｙａｓｅｎａ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ ｂｙ ａ Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ａｐｔａｍｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９７），Ｖｏｌ．２７，Ｉｓｓｕｅ １，ｐａｇｅｓ １００−１１）である下記配列を持つオリゴヌクレオチドを従来法により合成した。
ＧＣＣＧＧＣＣＡＡＴＧＴＡＣＡＧＴＡＴＴＧＧＣＣＧＧＣ（配列番号８）
《プライマー＋アプタマー＋ポリメラーゼ溶液の調整》
２種類のスポッティング用溶液を調整した。
上記のプライマーセット，Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに対するアプタマー，およびＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅａｒｓｅを最終濃度，２μＭプライマーセット，２μＭ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに対するアプタマー，２５Ｕ／μｌ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，０．１Ｍトレハロースとなるように混合，調整したした溶液，およびこの組成よりＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに対するアプタマーのみを除いた組成の溶液を調整した。
《ＤＮＡのスポッティング》
６０ＭＤＰ紙（三島製紙製）に上記により調整したプライマー＋アプタマー＋ポリメラーゼ溶液を９６ ｐｉｎ−ｔｏｏｌ（Ｍｕｌｔｉ ９６−ｍｕｌｔｉｂｌｏｔ ｒｅｐｌｉｃａｔｏｒ ＶＰ４０９，Ｂｉｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，ＵＳ）を用いて，図１３に示すように，スポットの位置および種類が判別できるようにスポットした。スポッティング用溶液は１μｌ／スポットとなるようにした。
《ＤＮＡの増幅》
スポッティングした用紙を３０分以上室温にて乾燥させた後，スポット部分を含むように４ｍｍ ｘ ４ｍｍの大きさに６０ＭＤＰ紙を切り取りＰＣＲ用マイクロチューブに入れた。ＰＣＲ反応溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０ｍＭ ＫＣｌ，５．３ｍＭ ＭｇＣｌ，２００μＭ各ｄＮＴＰ）２５μｌと５０ｎｇテンプレートＤＮＡ（ヒトゲノムＤＮＡ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＵＳ社製）をチューブに加え，次の条件でＰＣＲを行った。
３ｍｉｎ ａｔ ９４℃
（３０ｓｅｃ ａｔ ９４℃，３０ｓｅｃ ａｔ ４０℃，３０ｓｅｃ ａｔ ７２℃）５０サイクル
１５ｍｉｎ ａｔ ７２℃
反応後のチューブより適量を取り，１％アガロースゲルで電気泳動した結果を図１４に示す。１８４ｂｐおよび３４３ｂｐ付近に見られるバンドがそれぞれエクソン１および２の目的とするＤＮＡ断片と考えられ，６０ＭＤＰ紙に固定されたプライマーを用いてテンプレートＤＮＡからＰＣＲにより目的とする断片を増幅可能であることが判った。また，Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに対するアプタマーの有無を比較すると，アプタマーを含む反応の方が非特異的な増幅を抑えることが出来ることが判った。
［実施例３］
＃理研ｃＤＮＡクローン＋ＰＣＲ溶液をスポットしたＤＮＡブック
《プライマーの合成》
下記配列のプライマーセットを従来法により合成した。
プライマーセット１
−２１Ｍ１３：５’−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’（配列番号１）
１２３３−Ｒｖ：５’−ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡ−３’（配列番号２）
《ｃＤＮＡ溶液の調整》
理研クローン（ｈｔｔｐ：／／ｆａｎｔｏｍ．ｇｓｃ．ｒｉｋｅｎ．ｇｏ．ｊｐ／）の中から下記の塩基配列で表されるマウスリンゴ酸脱水素酵素のｃＤＮＡ（クローンＩＤ：１５０００１２Ｍ１５，１７５８ｂｐ），マウスイソクエン酸脱水素酵素（ＮＡＤＰ）（クローンＩＤ：１５０００１２Ｅ０４，２４４０ｂｐ），マウスイソクエン酸脱水素酵素（ＮＡＤ）（クローンＩＤ：Ｅ０３００２４Ｊ０３，２１６０ｂｐ），マウスオキソグルタル酸脱水素酵素（クローンＩＤ：Ｅ４３００２０Ｎ１２，３５５４ｂｐ）をクローニングしたｐＦＬＣベクター（図１０）を１μｇ／μｌとなるようにＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した。
《ｃＤＮＡ＋プライマー＋アプタマー＋ポリメラーゼ＋ＰＣＲ用バッファー組成溶液の調整》
上記ｃＤＮＡ，プライマーセット１，Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに対するアプタマー，およびＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅａｒｓｅを最終濃度，５μＭプライマーセット１，５μＭ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに対するアプタマー，５０Ｕ／μｌ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，０．１Ｍトレハロース，２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），１．２５Ｍ ＫＣｌ，１３２．５ｍＭ ＭｇＣｌ，５μＭ各ｄＮＴＰとなるように調整した。
《ＤＮＡのスポッティング》
６０ＭＤＰ紙（三島製紙製）に上記により調整した溶液を９６ ｐｉｎ−ｔｏｏｌ（Ｍｕｌｔｉ ９６−ｍｕｌｔｉｂｌｏｔ ｒｅｐｌｉｃａｔｏｒ ＶＰ４０９，Ｂｉｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，ＵＳ）を用いて，図１５に示すように，スポットの位置および種類が判別できるようにスポットした。スポッティング用溶液は１μｌ／スポットとなるようにした。
《ＤＮＡの増幅》
スポッティングした用紙を３０分以上室温にて乾燥させた後，スポット部分を含むように４ｍｍ ｘ ４ｍｍの大きさに６０ＭＤＰ紙を切り取りＰＣＲ用マイクロチューブに入れ，そこに水２５μｌを加え，次の条件でＰＣＲを行った。
２ｍｉｎ ａｔ ９４℃
（１ｍｉｎ ａｔ ９４℃，１ｍｉｎ ａｔ ５５℃，７５ｓｅｃ ａｔ ６８℃）２９サイクル
１５ｍｉｎ ａｔ ７４℃
反応後のチューブより適量を取り，１％アガロースゲルで電気泳動した結果を図１６に示す。Ｌａｎｅ１はリンゴ酸脱水素酵素のｃＤＮＡ、Ｌａｎｅ２はイソクエンサン脱水素酵素（ＮＡＤＰ）のｃＤＮＡ、Ｌａｎｅ３はイソクエンサン脱水素酵素（ＮＡＤ）のｃＤＮＡ、Ｌａｎｅ４はオキソグルタル酸脱水素酵素のｃＤＮＡ、左端はサイズマーカーを示す。４種類のｃＤＮＡについてそれぞれ目的とする長さの断片が得られ，６０ＭＤＰ紙に固定したｃＤＮＡ，プライマー，アプタマー，ポリメラーゼ，およびＰＣＲ用バッファー組成物に水のみを加えることによりＰＣＲ増幅が可能であることが判った。
反応後のチューブより適量を取り，１％アガロースゲルで電気泳動した結果を１０８に示す。１８４ｂｐおよび３４３ｂｐ付近に見られるバンドがそれぞれエクソン１および２の目的とするＤＮＡ断片と考えられ，６０ＭＤＰ紙に固定されたプライマーを用いてテンプレートＤＮＡからＰＣＲにより目的とする断片を増幅可能であることが判った。また，Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに対するアプタマーの有無を比較すると，アプタマーを含む反応の方が非特異的な増幅を抑えることが出来ることが判った。
［実施例４］
《ｃＤＮＡ溶液の調整》
実施例３で使用したのと同じマウスリンゴ酸脱水素酵素のｃＤＮＡクローン（クローンＩＤ：１５０００１２Ｍ１５，１７５８ｂｐ）をクローニングしたｐＦＬＣベクター（図１０）を１μｇ／μｌとなるようにＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した。
《ｃＤＮＡ＋プライマー＋反応促進剤（スペルミジン）＋ポリメラーゼ＋ＰＣＲ用バッファー組成溶液の調整》
上記ｃＤＮＡ，プライマーセット１，スペルミジンおよびＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅａｒｓｅを最終濃度，ｃＤＮＡ ０．００５μｇ／μｌ，５μＭプライマーセット，５０Ｕ／μｌ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，スペルミジン１００ｍＭ，０．１Ｍトレハロース，２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），１．２５Ｍ ＫＣｌ，１３２．５ｍＭ ＭｇＣｌ，５μＭ各ｄＮＴＰとなるように調整した。
《ＤＮＡのスポッティング》
６０ＭＤＰ紙（三島製紙製）に上記により調整した溶液を９６ ｐｉｎ−ｔｏｏｌ（Ｍｕｌｔｉ ９６−ｍｕｌｔｉｂｌｏｔ ｒｅｐｌｉｃａｔｏｒ ＶＰ４０９，Ｂｉｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，ＵＳ）を用いて，図１５に示すように，スポットの位置および種類が判別できるようにスポットした。スポッティング用溶液は１μｌ／スポットとなるようにした。
《ＤＮＡの増幅》
スポッティングした用紙を３０分以上室温にて乾燥させた後，スポット部分を含むように４ｍｍ ｘ ４ｍｍの大きさに６０ＭＤＰ紙を切り取りＰＣＲ用マイクロチューブに入れ，そこに水２５μｌを加え，次の条件でＰＣＲを行った。
２ｍｉｎ ａｔ ９４℃
（１ｍｉｎ ａｔ ９４℃，１ｍｉｎ ａｔ ５５℃，７５ｓｅｃ ａｔ ６８℃）２９サイクル
１５ｍｉｎ ａｔ ７４℃
反応後のチューブより適量を取り，１％アガロースゲルで電気泳動した結果を図１７に示す。Ｌａｎｅ１および２はｃＤＮＡ，プライマー，ポリメラーゼ，反応促進剤としてポリアミンの一種であるスペルミジン，およびＰＣＲ用バッファー組成物を６０ＭＤＰ紙固定したサンプルで，Ｌａｎｅ３はスペルミジンのみ除いた組成を固定したサンプルである。どちらも，水を加えることにより，固定されたＤＮＡを増幅することが可能であり，また，反応促進剤を固定したサンプルでは，増幅反応が促進されていることが判った。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明の支持体は、酵素の保存や流通に利用することができる。また、印刷物及び試薬キットへの応用も可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００６８】
配列番号１は、プライマー−２１Ｍ１３の塩基配列を示す。
配列番号２は、プライマー１２３３−Ｒｖの塩基配列を示す。
配列番号３は、マウスリンゴ酸脱水素酵素のｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号４は、プライマーＨｓＬＨ１Ｆの塩基配列を示す。
配列番号５は、プライマーＨｓＬＨ１Ｒの塩基配列を示す。
配列番号６は、プライマーＨｓＬＨ２Ｆの塩基配列を示す。
配列番号７は、プライマーＨｓＬＨ２Ｒの塩基配列を示す。
配列番号８は、Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに対するアプタマーの塩基配列を示す。
配列番号９は、マウスイソクエン酸脱水素酵素（ＮＡＤＰ）のｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号１０は、マウスイソクエン酸脱水素酵素（ＮＡＤ）のｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号１１は、マウスオキソグルタル酸脱水素酵素のｃＤＮＡの塩基配列を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素が固定されている支持体、印刷物、試薬キット、該支持体の製造法、酵素の保存法及び酵素の再生法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素は触媒活性を有するタンパク質であり、種々の生体反応を司ることにより、生命の維持に貢献している。
【０００３】
酵素は、水分を含有した状態では室温で不安定である。それ故、凍結状態で保存されるか、あるいは−２０℃以下の温度で安定化剤とともに液体中で保存される。
【０００４】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＤＮＡポリメラーゼという酵素により触媒される核酸増幅反応であるが、ＤＮＡポリメラーゼは通常バッファー中で−２０℃の温度で保存される。このような保存のためには、冷凍庫が必要である。また、この酵素が供給者から使用者に配送されるにあたっては、ドライアイスとともに発泡スチロールなどの容器に箱詰めされる。これらの保存・配送方法は、特別の設備や作業を要するため、操作が煩雑で費用のかかるものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、酵素を保存するための簡便な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ＤＮＡポリメラーゼをトレハロースと混合した状態で支持体に固定して保存した後、ＰＣＲを行ったところ、ＰＣＲ反応が進行することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
本発明の要旨は以下の通りである。
【０００８】
（１） 酵素と当該酵素の保護剤とが固定されている支持体。
【０００９】
（２） 上記保護剤がトレハロース及びその誘導体からなる化合物群より選択される少なくとも一種類の化合物である（１）記載の支持体。
【００１０】
（３） 酵素反応の促進剤をさらに含む（１）又は（２）に記載の支持体。
【００１１】
（４） 上記酵素に対するアプタマーをさらに含む（１）ないし（３）の何れか一項に記載の支持体。
【００１２】
（５） 酵素と当該酵素に対するアプタマーとが固定されている支持体。
【００１３】
（６） 上記酵素がＤＮＡポリメラーゼである（１）ないし（５）の何れか一項に記載の支持体。
【００１４】
（７） さらに、上記ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸増幅反応で目的とする核酸を増幅するためのプライマーを含んでなる（６）記載の支持体。
【００１５】
（８） さらに、上記ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸増幅反応の鋳型となる核酸、当該核酸を増幅するためのプライマー、及び核酸増幅反応のためのバッファーから選択される少なくとも一つを含んでなる（６）に記載の支持体。
【００１６】
（９） （１）ないし（８）の何れか一項に記載の支持体を含む印刷物。
【００１７】
（１０） （１）ないし（８）の何れか一項に記載の支持体を含む試薬キット。
【００１８】
（１１） （１）記載の支持体を製造する方法であって、酵素及び保護剤の混合溶液を調製し、該溶液を支持体に適用し、該支持体を乾燥することにより、前記酵素及び保護剤の混合物を支持体に固定することを含む前記の方法。
【００１９】
（１２） （１）ないし（８）の何れか一項に記載の支持体を液体に浸漬させることにより、該液体中に酵素を溶出させることを含む、支持体に固定された酵素を再生する方法。
【００２０】
（１３） （６）ないし（８）の何れか一項に記載の支持体を液体中に配置して当該支持体よりＤＮＡポリメラ−ゼを溶出させる工程と、当該ＤＮＡポリメラ−ゼを用いて核酸増幅反応を行うことを特徴とする、核酸の増幅方法。
【００２１】
また、本発明は、酵素を保護剤との混合物として支持体に固定した状態で保存する方法を提供する。
【００２２】
さらに、本発明は、上記（７）に記載の支持体を液体中に配置して当該支持体よりＤＮＡポリメラ−ゼと、鋳型となる核酸、当該核酸を増幅するためのプライマー及び核酸増幅反応のためのバッファーから選択される少なくとも一つとを溶出させる工程と、当該ＤＮＡポリメラ−ゼと鋳型となる核酸および／またはプライマーとを用いて核酸増幅反応を行うことを特徴とする、核酸の増幅方法を提供する。
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２４】
本発明は、酵素と当該酵素の保護剤とが固定されている支持体を提供する。
【００２５】
酵素は、何らかの触媒活性を有するものであればいかなるものであってもよく、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＲＮａｓｅ、制限酵素、メチラーゼ、修飾酵素、ライゲース、プロテアーゼ、キナーゼ、フォスファターゼ、トランスフェラーゼ、グリコシラーゼ、トポイソメラーゼ、クロナーゼなどを例示することができるが、これらに限定されることはない。
【００２６】
保護剤は、酵素を乾燥から保護し、安定に保存できるものであればいかなるものであってもよく、トレハロース及びその誘導体、多糖類、ＰＥＧ、デキストラン、Ｆｉｃｏｌ、グリセロール、界面活性剤、ＰＶＡ及びその誘導体などを例示することができる。このうち、トレハロース及びその誘導体が効果的である。
【００２７】
保護剤は市販されているものであっても、公知の方法に従って合成したものであってもよい。
【００２８】
トレハロースは、２分子のＤ−グルコースが１，１結合した非還元性二糖であり、結合様式としては、α，α−、α，β−、β，β−の３種の異性体がある。
【００２９】
トレハロースの誘導体としては、トレハロースの酸エステル（例えば、ラウリン酸エステル、オレイン酸エステル、リノール酸エステル、リノレン酸エステル、ステアリン酸エステル、パルミチン酸エステル、ミリスチン酸エステルなどの脂肪酸エステル、酢酸エステル、安息香酸エステルなどのカルボン酸エステル、硫酸エステルなど）、アルキルエーテル（例えば、炭素数８〜２５のアルキルとのエーテルなど）、ハライド、含窒素誘導体、含硫黄誘導体などを例示することができるが、これらに限定されることはない。
【００３０】
トレハロース及びその誘導体は市販されているが、公知の方法で製造してもよい。トレハロース及びその誘導体の製法は、シー・ケー・リー『デベロップメンツ・イン・フード・カルボハイドレート』、１９８０年、アプライッド・サイエンス・パブリッシャーズ社発行、第１乃至８９頁やケー・ヨシモトら『ケミカル・アンド・ファーマシューティカル・ブレティン』、第３０巻、第４号、第１，１６９乃至１，１７４頁（１９８２年）、特開平８−１５７４９１号などに記載されている。
【００３１】
酵素１Ｕに対して、１０−５〜１０１Ｍ、好ましくは、１０−４〜１０−１Ｍの保護剤を添加して混合するとよい。
【００３２】
支持体には、さらに、酵素反応の促進剤が固定されていてもよい。酵素反応の促進剤は、酵素反応を促進する効果がある物質であればよく、酵素反応を促進する効果には、酵素反応阻害を抑制する効果も含まれる。酵素反応の促進剤としては、例えば、シュウ酸ナトリウム、シュウ酸カリウム、マソン酸ナトリウム、マレイン酸ナトリウム、ジメチルスルホキシド、ベタイン、グリセロール、アルブミン、界面活性剤（例えば、ｔｗｅｅｎ２０，Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００，ＮＰ４０など）、ポリアミン（例えばエチレンジアミン、トリメチレンジアミン、スペルミン、スペルミジン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミン、１，４−ビス（３−アミノプロピル）−ピペラジン、１−（２−アミノエチル）ピペラジン、１−（２−アミノエチル）ピペリジン、１，４，１０，１３−テトラオキサ−７，１６−ディアザサイクロオクタデカンおよびトリス（２−アミノエチル）アミンなど）、糖類（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マルトース、スクロース、ラクトース、その他多糖など）、硫酸化多糖およびその塩類（例えば、ヘパリン，デキストランサルフェイトなど）、ジチオスレイトール、ポリアニオン（例えばＤＮＡ，ＲＮＡなど）、多価アルコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール、ヘキサンジオール、オクタンジオール、グリセリン、ソルビタン、トリメチロールプロパン、ネオペンチルグリコールなどの脂肪族多価アルコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等）、硫酸アンモニウム、第四級アンモニウム塩（例えば、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルピリジニウムクロライド、ヘキサジメチリンブロミド、ヘキサフルオレニウムブロミド、メチルアゾリニウムブロミドなど）などを例示することができるが、これらに限定されることはない。酵素反応促進剤としては、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（島津製作所社製）などが挙げられ、ＤＮＡポリメラーゼの反応促進に有効である。
【００３３】
酵素反応促進剤は、反応液中に、例えばポリアミンであれば、１０〜０．０１ｍＭ程度、好ましくは２〜０．５ｍＭで存在するように、適当な量の酵素反応促進剤を支持体に固定するとよい。酵素反応促進剤は、酵素及び保護剤の混合物と同じ位置で支持体上に固定されてもよいし、酵素及び保護剤とは異なる位置で支持体に固定されてもよい。
【００３４】
支持体は、酵素及び保護剤の混合物を固定できるものであればいかなるものであってもよく、例えば、紙（例えば、６０ＭＤＰ紙（三島製紙製）、コピー用紙、上質紙、中質紙、ケント紙、画用紙、クラフト紙、インクジェット専用紙、トレーシングペーパー、和紙、ボール紙、濾紙など）、ガラス基板、シリコン基板、ビース、カラム充填剤、シリカゲル、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ＰＶＡ膜などを例示することができるが、これらに限定されることはない。
【００３５】
支持体の厚さは、例えば、１ｍｍ以下とすることができる。この厚さを非常に薄くすれば（例えば０．１ｍｍ程度）、酵素及び保護剤を固定した支持体を多数枚積層して配布する場合にも、嵩張らないので、その作業性は向上する。
【００３６】
支持体には、酵素及び保護剤の他、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの誘導体、修飾体など）、オリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの誘導体、修飾体など）、タンパク質（例えば、抗体、ホルモンなど）、ポリペプチド、オリゴペプチド、多糖、オリゴ糖、ＰＮＡ、低分子化合物（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＣＲ用バッファー組成に含まれる塩、Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰ混合物など）、それらの混合物などが固定されていてもよい。酵素及び保護剤以外の成分は、酵素及び保護剤の混合物と同じ位置で支持体上に固定されてもよいし、酵素及び保護剤とは異なる位置で支持体に固定されてもよい。特に、酵素に対するアプタマーが支持体に固定されているとよく、本発明は、酵素と当該酵素に対するアプタマーとが固定されている支持体も提供するものである。
【００３７】
本発明の好ましい態様の一つにおいて、支持体は、ＤＮＡポリメラーゼと当該ＤＮＡポリメラーゼの保護剤の他、当該ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸増幅反応で目的とする核酸を増幅するためのプライマーを含む。このような支持体は、ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇや種の同定などに使用することができる。支持体は、さらに、酵素反応の促進剤を含んでもよい。
【００３８】
本発明の別の好ましい態様の一つにおいて、支持体は、ＤＮＡポリメラーゼと当該ＤＮＡポリメラーゼの保護剤の他、当該ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸増幅反応（ＰＣＲなど）の鋳型となる核酸、当該核酸を増幅するためのプライマー、及び核酸増幅反応のためのバッファーから選択される少なくとも一つを含む。支持体は、さらに、酵素反応の促進剤を含んでもよい。
【００３９】
例えば、ＤＮＡポリメラーゼを紙（支持体）に固定して保存する場合には、紙には、ＤＮＡポリメラーゼ及び保護剤の他、プライマーセット（オリゴヌクレオチド）、ＰＣＲ反応の鋳型となるＤＮＡ（合成の１本鎖又は２本鎖ＤＮＡでもよいし、ｃＤＮＡをクローニングしたベクターでもよい）、ＤＮＡポリメラーゼに対するアプタマー（機能性ＲＮＡ）、ＰＣＲ反応溶液中の各成分（すなわち、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ、ｄＮＴＰ混合物など）、ＥＤＴＡなどを固定してもよい。この場合、（１）ＤＮＡポリメラーゼ、保護剤及びプライマーセットを１スポットとして、ＰＣＲ反応の鋳型となるＤＮＡ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ及びＥＤＴＡを別のスポットとして紙に固定してもよいし、（２）ＤＮＡポリメラーゼ、保護剤及びプライマーセット、必要により、ＤＮＡポリメラーゼに対するアプタマーを１スポットとして紙に固定してもよいし、（３）ＰＣＲ反応に必要なすべての成分（すなわち、ＰＣＲ反応の鋳型となるＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマーセット、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ、ｄＮＴＰ混合物など、必要により、ＤＮＡポリメラーゼに対するアプタマー）を保護剤とともに１スポットとして紙に固定してもよい。紙にＤＮＡポリメラーゼなどの成分がスポッティングされていることがわかるように、スポッティングする成分に色素を添加しておくとよい。色素としては、クレゾールレッド、ブロモフェノールブルー、キシレンシアノールなどを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
【００４０】
支持体に固定する酵素の量は、目的とする酵素反応が行われるように適宜調整するとよい。例えば、ＰＣＲ反応が行われるようにするためには、１スポット当たり５ｎｇ以上のＤＮＡポリメラーゼが固定されるとよい。
【００４１】
酵素及び当該酵素の保護剤の混合物が固定されている支持体は以下のようにして製造することができる。まず、酵素及び保護剤の混合溶液を調製する。酵素と保護剤の混合比は上記の通りである。溶媒は水であるとよい。さらに、この混合溶液に、酵素及び保護剤以外の上記の成分を添加してもよい。次いで、酵素及び保護剤の混合溶液を支持体に適用する。例えば、支持体が紙である場合には、スポイト、９６ ｐｉｎ−ｔｏｏｌ（Ｍｕｌｔｉ ９６−ｍｕｌｔｉｂｌｏｔ ｒｅｐｌｉｃａｔｏｒ ＶＰ４０９，Ｂｉｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，ＵＳ）、ディスポーザブルタイプのｐｉｎ−ｔｏｏｌなどを用いて、混合溶液を紙にスポッティングすることができる。その後、支持体を乾燥することにより、酵素及び保護剤の混合物を支持体に固定する。酵素及び保護剤の混合物を固定した支持体は実質的に水を含まないものであるとよい。
【００４２】
上記のように、酵素を保護剤との混合物として支持体に固定した状態にすることによって、酵素を安定に保存することができる。保存条件としては、室温で、高湿度を避け、遮光下に保存することが好ましい。例えば、酵素がＤＮＡポリメラーゼである場合、ＤＮＡポリメラーゼをトレハロースとの混合物として６０ＭＤＰ紙に固定した状態で室温で保存したとき、少なくとも６か月半の保存寿命が確認されている（現在、まだ保存試験は続行中である）。
【００４３】
上記のように、保護剤との混合物として支持体に固定した酵素を再生するには、酵素と保護剤との混合物を固定した支持体を液体に浸漬させ、該液体中に酵素を溶出させればよい。支持体を浸漬させる液体は、酵素の再生を可能とするものであればいかなるものであってもよいが、例えば、水、水以外の成分を含有する水溶液などを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。例えば、支持体に固定した酵素がＤＮＡポリメラーゼである場合、支持体を浸漬させる液体は、水、ＰＣＲ反応溶液（すなわち、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ、ｄＮＴＰ混合物などを含有する水溶液）などであるとよい。浸漬は、室温にて大気圧下で、１〜３分間行えばよい。
【００４４】
支持体にＤＮＡポリメラーゼが固定されている場合には、この支持体を液体中に配置して当該支持体よりＤＮＡポリメラ−ゼを溶出させ、当該ＤＮＡポリメラ−ゼを用いて核酸増幅反応を行うことにより、核酸を増幅することができる。
【００４５】
また、本発明は、酵素と当該酵素の保護剤とが固定されている支持体を含む印刷物を提供する。
【００４６】
印刷物としては、教科書などの成書、ハンドブック、カタログ、定期刊行物、雑誌、論文、冊子、小冊子、リーフレット、パンフレット、報告書、ポスター、カード、ラベルなどを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
【００４７】
図１は、本発明の印刷物における、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）及びトレハロースの混合物がスポッティングされている紙（支持体）の一例を示す。紙６には、ＤＮＡポリメラーゼ及びトレハロースが、プライマーセット、ＰＣＲ反応の鋳型となるｃＤＮＡクローン及びその他のＰＣＲ反応に必要な成分（すなわち、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ、各ｄＮＴＰ、必要により、ＤＮＡポリメラーゼに対するアプタマー）とともにスポッティングされている（以下、このスポットを「ＤＮＡ Ｓｐｏｔ」１という）。紙６には、ＤＮＡ Ｓｐｏｔ１の他に、ｃＤＮＡクローンがコードするタンパク質の名前２（ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅなど）、ｃＤＮＡクローンの識別番号３（Ｃｌｏｎｅ ＩＤ）、ｃＤＮＡクローンの塩基配列４（ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、実験（ＰＣＲ反応）の手順の説明文５（Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）が印刷されている。
【００４８】
図２は、図１に示すＤＮＡ Ｓｐｏｔ１を有する紙６を別紙として添付している学術論文１２が掲載されている雑誌１３を示す。
【００４９】
図３は、図１に示すＤＮＡ Ｓｐｏｔ１を有する紙６を綴じ込んだ書籍２２を示す。この書籍には、さらに、目次が含まれているとよい。
【００５０】
図４は、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）及びトレハロースの混合物がスポッティングされている紙（支持体）を綴じ込んだ書籍の別の態様を示す。酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）及びトレハロースの混合物がスポッティングされている頁３４の各格子には、ＤＮＡポリメラーゼ及びトレハロースが、プライマーセット、ＰＣＲ反応の鋳型となるｃＤＮＡクローン及びその他のＰＣＲ反応に必要な成分（すなわち、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ、各ｄＮＴＰ、必要により、ＤＮＡポリメラーゼに対するアプタマー）とともに、スポッティングされている（以下、このスポットを「ＤＮＡ Ｓｐｏｔ」３１という。）。これらのスポット３１を有する頁３４には、スポットを識別するための記号（列番号）３２及び（行番号）３３が印刷されている。さらに、ＤＮＡをスッポッティングした頁の識別番号３０（Ｒｅａｒｒａｙ ＰＬＡＴＥ ＩＤ）が印刷されている。スポッティングされているｃＤＮＡクローンに関する情報（例えば、ｃＤＮＡクローンがコードする酵素のＥＣ ｎｕｍｂｅｒ、ｃＤＮＡクローンがコードする酵素の名前（Ｇｅｎｅ ｎａｍｅ）、クローンのＩＤ番号（ＲＩＫＥＮ Ｃｌｏｎｅ ＩＤ）、寄託番号（Ａｃｃｅｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ）、ｃＤＮＡクローンインサートの長さ（ｃＤＮＡ Ｉｎｓｅｒｔ）、ＰＣＲ反応産物の長さ（Ａｆｔｅｒ ＰＣＲ）、ｃＤＮＡクローンがコードする酵素が関与する反応の説明など）及びプライマーセットに関する情報（例えば、プライマーの塩基配列など）はＣＤ−ＲＯＭ３６（ＣＤ−ＲＯＭの代わりにＦＤ、ＭＯなどの媒体でもよい）に記録されており、これらの記録媒体が書籍に付録として添付されている（図５）。図５においては、ＣＤ−ＲＯＭ３６は袋３７に入れられ、シール３８で封をした状態で書籍３５に添付されている。この書籍には、さらに、目次、ｃＤＮＡクローン及びプライマーセットを含むスポットの使用説明、記録媒体に記録されている情報へのアクセス方法が印刷されている頁が含まれているとよい。
【００５１】
印刷物の形態としては、１）百科事典タイプの網羅的なもの（例えば、ＦＡＮＴＯＭクローン、ヒトメタボロームなど）、２）分野ごと（例えば、機能別或いは臓器別等）の分冊型、３）更にテーマというか内容を細分化した１ページから数ページのもの（例えば、ルーズリーフタイプ）、４）より少数の貼付物を想定したカードタイプを例示することができる。
【００５２】
さらに、本発明は、酵素と当該酵素の保護剤とが固定されている支持体を含む試薬キットを提供する。
【００５３】
本発明の試薬キットは、核酸増幅反応（例えば、ＰＣＲ）キット、蛋白発生キット、抗体キット、その他のキットとして、種々の実験、検査、診断などに利用することができる。
【００５４】
本発明の試薬キットは、上記のような印刷物の形態をとってもよいが、それ以外の形態の例を図６〜９に示す。
【００５５】
図６は、本発明の試薬キットにおける、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）及びトレハロースの混合物がスポッティングされている紙（支持体）の一例を示す。この紙には、ＤＮＡポリメラーゼ及びトレハロースが、プライマーセット、その他のＰＣＲ反応に必要な成分（すなわち、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ、各ｄＮＴＰ、必要により、ＤＮＡポリメラーゼに対するアプタマー）とともに、紙の適当な位置にスポッティングされている（以下、このスポットを「ＤＮＡ Ｓｐｏｔ」４１という）。
【００５６】
図７は、図６に示すＤＮＡ Ｓｐｏｔ４１を有する紙４２を含む試薬キットの一例を示す。ＤＮＡ Ｓｐｏｔ４１を有する紙４２は遮光ビン５１に入れられ、蓋５２で密栓をして保管あるいは流通される。試薬キットには、さらに、キットの内容（例えば、キットに含まれる成分・分量、使用目的、保管方法・有効期限、包装単位など）、使用方法、使用上及び取扱い上の注意、問合せ先などの情報が記載された説明書５３を含むとよい。説明書５３は遮光ビン５１に入れてもよいし、遮光ビン５１を入れた包装箱（図示せず）に入れてもよい。あるいは、説明書をラベルに印刷して、このラベルを遮光ビン５１に貼り付けてもよい。
【００５７】
図８は、本発明の試薬キットにおける、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）及びトレハロースの混合物がスポッティングされている紙（支持体）の一例を示す。この紙６２には、ＤＮＡポリメラーゼ及びトレハロースが、プライマーセット、その他のＰＣＲ反応に必要な成分（すなわち、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ、各ｄＮＴＰ、必要により、ＤＮＡポリメラーゼに対するアプタマー）とともに、紙の適当な位置にスポッティングされている（以下、このスポットを「ＤＮＡ Ｓｐｏｔ」６１という）。
【００５８】
図９は、ＤＮＡ Ｓｐｏｔ６１を有する紙６２を含む試薬キットの一例を示す。ＤＮＡ Ｓｐｏｔ６１を有する紙６２は包装パック７１に入れられ、密封して保管あるいは流通される。試薬キットには、さらに、キットの内容（例えば、キットに含まれる成分・分量、使用目的、保管方法・有効期限、包装単位など）、使用方法、使用上及び取扱い上の注意、問合せ先などの情報が記載された説明書７２を含むとよい。説明書７２は包装パック７１に入れてもよいし、包装パック７１を入れた包装箱（図示せず）に入れてもよい。あるいは、説明書７２をラベルに印刷して、このラベルを包装パック７１又は包装箱に貼り付けてもよい。
【００５９】
以上、ＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡと組み合わせた態様について、本発明を説明したが、本発明はこの態様に限定されるわけではなく、種々の酵素への適用が可能である。
【００６０】
なお、本明細書において、「〜」はその前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示す。
【発明の効果】
【００６１】
本発明により、酵素を保存するための簡便な方法が提供された。
【００６２】
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願２００３−３３９５４２号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】ＤＮＡポリメラーゼ及びトレハロースの混合物がＤＮＡ（ｃＤＮＡ、プライマー、アプタマーなど）とともにスポッティングされている紙（支持体）の一例を示す。
【図２】ＤＮＡポリメラーゼ及びトレハロースの混合物がＤＮＡ（ｃＤＮＡ、プライマー、アプタマーなど）とともにスポッティングされた紙が別紙として添付された学術論文が掲載されている雑誌を示す。
【図３】ＤＮＡポリメラーゼ及びトレハロースの混合物がＤＮＡ（ｃＤＮＡ、プライマー、アプタマーなど）とともにスポッティングされた紙を綴じ込んだ書籍の一例を示す。
【図４】ＤＮＡポリメラーゼ及びトレハロースの混合物がＤＮＡ（ｃＤＮＡ、プライマー、アプタマーなど）とともにスポッティングされている紙（支持体）を綴じ込んだ書籍の別の態様を示す。
【図５】図４の紙にスポッティングされているｃＤＮＡに関する情報が記録されているＣＤ−ＲＯＭが袋に入れられ、シールで封をした状態で書籍に添付されている形態を示す。
【図６】ＤＮＡポリメラーゼ及びトレハロースの混合物がＤＮＡ（ｃＤＮＡ、プライマー、アプタマーなど）とともにスポッティングされている紙（支持体）の一例を示す。
【図７】図６の紙を含む試薬キットの一例を示す。
【図８】ＤＮＡポリメラーゼ及びトレハロースの混合物がＤＮＡ（ｃＤＮＡ、プライマー、アプタマーなど）とともにスポッティングされている紙（支持体）の一例を示す。
【図９】図８の紙を含む試薬キットの一例を示す。
【図１０】マウスリンゴ酸脱水素酵素のｃＤＮＡをクローニングしたｐＦＬＣベクターの構成を示す。
【図１１】マウスリンゴ酸脱水素酵素のｃＤＮＡ溶液のスポット及びポリメラーゼ＋プライマー溶液のスポットを有する６０ＭＤＰ紙を示す。
【図１２】図１１のスポットを用いて行ったＰＣＲ反応の反応生成物を電気泳動した結果を示す。
【図１３】プライマー＋アプタマー＋ポリメラーゼ溶液のスポットを有する６０ＭＤＰ紙を示す。
【図１４】図１３のスポットを用いて行ったＰＣＲ反応の反応生成物を電気泳動した結果を示す。
【図１５】マウスリンゴ酸脱水素酵素、マウスイソクエン酸脱水素酵素（ＮＡＤＰ）、マウスイソクエン酸脱水素酵素（ＮＡＤ）又はマウスオキソグルタル酸脱水素酵素のｃＤＮＡ＋プライマー＋アプタマー＋ポリメラーゼ＋ＰＣＲ用バッファー組成溶液のスポットを有する６０ＭＤＰ紙を示す。
【図１６】図１５のスポットを用いて行ったＰＣＲ反応の反応生成物を電気泳動した結果を示す。
【図１７】ｃＤＮＡ＋プライマー＋反応促進剤（スペルミジン）＋ポリメラーゼ＋ＰＣＲ用バッファー組成溶液のスポットを用いて行ったＰＣＲ反応の反応生成物を電気泳動した結果を示す。
【符号の説明】
【００６４】
１：ＤＮＡ Ｓｐｏｔｓ
２：ｃＤＮＡクローンがコードするタンパク質（ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅなどの酵素）の名前
３：ｃＤＮＡクローンの識別番号
４：ｃＤＮＡクローンの塩基配列
５：実験の手順の説明文
６：ＤＮＡポリメラーゼ及びトレハロースの混合物がＤＮＡ（ｃＤＮＡ、プライマー、アプタマーなど）とともにスポッティングされている紙
１２：学術論文
１３：雑誌
２２：書籍
３０：ＤＮＡがスポッティングされている頁の識別番号
３１：ＤＮＡ Ｓｐｏｔｓ
３２：スポットを認識するための記号１（列番号）
３３：スポットを認識するための記号２（行番号）
３４：ＤＮＡポリメラーゼ及びトレハロースの混合物がＤＮＡ（ｃＤＮＡ、プライマー、アプタマーなど）とともにスポッティングされている頁
３５：書籍
３６：ＣＤ−ＲＯＭ
３７：袋
３８：シール
４１：ＤＮＡ Ｓｐｏｔ
４２：紙（支持体）
５１：遮光ビン
５２：蓋
５３：説明書
６１：ＤＮＡ Ｓｐｏｔｓ
６２：紙（支持体）
７１：包装パック
７２：説明書
【発明を実施するための最良の形態】
【００６５】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００６６】
［実施例１］
ｃＤＮＡクローンとポリメラーゼをスポットしたＤＮＡブック
《プライマーの合成》
下記配列のプライマーセットを従来法により合成した。
プライマーセット１
−２１Ｍ１３：５’−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’（配列番号１）
１２３３−Ｒｖ：５’−ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡ−３’（配列番号２）
《ｃＤＮＡ溶液の調整》
理研クローン（ｈｔｔｐ：／／ｆａｎｔｏｍ．ｇｓｃ．ｒｉｋｅｎ．ｇｏ．ｊｐ／）の中から下記の塩基配列で表されるマウスリンゴ酸脱水素酵素のｃＤＮＡ（クローンＩＤ：１５０００１２Ｍ１５，１７５８ｂｐ）をクローニングしたｐＦＬＣベクター（図１０）を０．１μｇ／μｌとなるようにＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した。
《ポリメラーゼ＋プライマー溶液の調整》
ＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡製），トレハロース，プライマーセット１を混合し，最終濃度２５Ｕ／μｌ ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、０．１Ｍトレハロース，２μＭプライマーセット１となるように調整した。
《ＤＮＡのスポッティング》
６０ＭＤＰ紙（三島製紙製）に調整したｃＤＮＡ溶液とポリメラーゼ＋プライマー溶液を９６ ｐｉｎ−ｔｏｏｌ（Ｍｕｌｔｉ ９６−ｍｕｌｔｉｂｌｏｔ ｒｅｐｌｉｃａｔｏｒ ＶＰ４０９，Ｂｉｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，ＵＳ）を用いて，図１１に示すように，スポットの位置および種類が判別できるようにスポットした。ｃＤＮＡ溶液は０．５μｌ／スポット，ポリメラーゼ＋プライマー溶液は１μｌ／スポットとなるようにした。
《ＤＮＡの回収と増幅》
スポッティングした用紙を３０分以上室温にて乾燥させた後，スポットしたｃＤＮＡおよびポリメラーゼ＋プライマーを含むようにそれぞれ４ｍｍ ｘ ４ｍｍの大きさに６０ＭＤＰ紙を切り取りＰＣＲ用マイクロチューブに入れた。ＰＣＲ反応溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０ｍＭ ＫＣｌ，５．３ｍＭ ＭｇＣｌ，２００μＭ各ｄＮＴＰ）２５μｌをチューブに加え，次の条件でＰＣＲを行った。
２ｍｉｎ ａｔ ９４℃
（１ｍｉｎ ａｔ ９４℃，１ｍｉｎ ａｔ ５５℃，７５ｓｅｃ ａｔ ６８℃）２９サイクル
１５ｍｉｎ ａｔ ７４℃
反応後のチューブより適量を取り，１％アガロースゲルで電気泳動した結果を図１２に示す。１８００ｂｐ付近に見られるバンドが目的とする断片と考えられ，６０ＭＤＰ紙からＤＮＡが溶出し，そのＤＮＡはＰＣＲにより増幅可能であることが判った。
［実施例２］
＃黄体ホルモン遺伝子を使ったアプタマー＋ポリメラーゼの実験
《プライマーの合成》
下記配列のプライマーを従来法により合成した。
プライマーセット１（ヒト黄体形成ホルモン遺伝子エクソン１増幅するプライマーセット）
ＨｓＬＨ１Ｆ：ＣＣＡＧＧＧＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＧ（配列番号４）
ＨｓＬＨ１Ｒ：ＣＡＴＧＧＴＧＧＧＧＣＡＧＴＡＧＣＣ（配列番号５）
プライマーセット２（ヒト黄体形成ホルモン遺伝子エクソン２増幅するプライマーセット）
ＨｓＬＨ２Ｆ：ＡＴＧＣＧＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＧＣＧ（配列番号６）
ＨｓＬＨ２Ｒ：ＴＧＣＧＧＡＴＴＧＡＧＡＡＧＣＣＴＴＴＡＴＴＧ（配列番号７）
《アプタマーの合成》
次に既知のＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに対するアプタマー（Ｙｕｎ Ｌｉｎ，Ｓｕｍｅｄｈａ Ｄ．Ｊａｙａｓｅｎａ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ ｂｙ ａ Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ａｐｔａｍｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９７），Ｖｏｌ．２７，Ｉｓｓｕｅ １，ｐａｇｅｓ １００−１１）である下記配列を持つオリゴヌクレオチドを従来法により合成した。
ＧＣＣＧＧＣＣＡＡＴＧＴＡＣＡＧＴＡＴＴＧＧＣＣＧＧＣ（配列番号８）
《プライマー＋アプタマー＋ポリメラーゼ溶液の調整》
２種類のスポッティング用溶液を調整した。
上記のプライマーセット，Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに対するアプタマー，およびＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅａｒｓｅを最終濃度，２μＭプライマーセット，２μＭ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに対するアプタマー，２５Ｕ／μｌ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，０．１Ｍトレハロースとなるように混合，調整したした溶液，およびこの組成よりＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに対するアプタマーのみを除いた組成の溶液を調整した。
《ＤＮＡのスポッティング》
６０ＭＤＰ紙（三島製紙製）に上記により調整したプライマー＋アプタマー＋ポリメラーゼ溶液を９６ ｐｉｎ−ｔｏｏｌ（Ｍｕｌｔｉ ９６−ｍｕｌｔｉｂｌｏｔ ｒｅｐｌｉｃａｔｏｒ ＶＰ４０９，Ｂｉｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，ＵＳ）を用いて，図１３に示すように，スポットの位置および種類が判別できるようにスポットした。スポッティング用溶液は１μｌ／スポットとなるようにした。
《ＤＮＡの増幅》
スポッティングした用紙を３０分以上室温にて乾燥させた後，スポット部分を含むように４ｍｍ ｘ ４ｍｍの大きさに６０ＭＤＰ紙を切り取りＰＣＲ用マイクロチューブに入れた。ＰＣＲ反応溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０ｍＭ ＫＣｌ，５．３ｍＭ ＭｇＣｌ，２００μＭ各ｄＮＴＰ）２５μｌと５０ｎｇテンプレートＤＮＡ（ヒトゲノムＤＮＡ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＵＳ社製）をチューブに加え，次の条件でＰＣＲを行った。
３ｍｉｎ ａｔ ９４℃
（３０ｓｅｃ ａｔ ９４℃，３０ｓｅｃ ａｔ ４０℃，３０ｓｅｃ ａｔ ７２℃）５０サイクル
１５ｍｉｎ ａｔ ７２℃
反応後のチューブより適量を取り，１％アガロースゲルで電気泳動した結果を図１４に示す。１８４ｂｐおよび３４３ｂｐ付近に見られるバンドがそれぞれエクソン１および２の目的とするＤＮＡ断片と考えられ，６０ＭＤＰ紙に固定されたプライマーを用いてテンプレートＤＮＡからＰＣＲにより目的とする断片を増幅可能であることが判った。また，Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに対するアプタマーの有無を比較すると，アプタマーを含む反応の方が非特異的な増幅を抑えることが出来ることが判った。
［実施例３］
＃理研ｃＤＮＡクローン＋ＰＣＲ溶液をスポットしたＤＮＡブック
《プライマーの合成》
下記配列のプライマーセットを従来法により合成した。
プライマーセット１
−２１Ｍ１３：５’−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’（配列番号１）
１２３３−Ｒｖ：５’−ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡ−３’（配列番号２）
《ｃＤＮＡ溶液の調整》
理研クローン（ｈｔｔｐ：／／ｆａｎｔｏｍ．ｇｓｃ．ｒｉｋｅｎ．ｇｏ．ｊｐ／）の中から下記の塩基配列で表されるマウスリンゴ酸脱水素酵素のｃＤＮＡ（クローンＩＤ：１５０００１２Ｍ１５，１７５８ｂｐ），マウスイソクエン酸脱水素酵素（ＮＡＤＰ）（クローンＩＤ：１５０００１２Ｅ０４，２４４０ｂｐ），マウスイソクエン酸脱水素酵素（ＮＡＤ）（クローンＩＤ：Ｅ０３００２４Ｊ０３，２１６０ｂｐ），マウスオキソグルタル酸脱水素酵素（クローンＩＤ：Ｅ４３００２０Ｎ１２，３５５４ｂｐ）をクローニングしたｐＦＬＣベクター（図１０）を１μｇ／μｌとなるようにＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した。
《ｃＤＮＡ＋プライマー＋アプタマー＋ポリメラーゼ＋ＰＣＲ用バッファー組成溶液の調整》
上記ｃＤＮＡ，プライマーセット１，Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに対するアプタマー，およびＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅａｒｓｅを最終濃度，５μＭプライマーセット１，５μＭ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに対するアプタマー，５０Ｕ／μｌ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，０．１Ｍトレハロース，２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），１．２５Ｍ ＫＣｌ，１３２．５ｍＭ ＭｇＣｌ，５μＭ各ｄＮＴＰとなるように調整した。
《ＤＮＡのスポッティング》
６０ＭＤＰ紙（三島製紙製）に上記により調整した溶液を９６ ｐｉｎ−ｔｏｏｌ（Ｍｕｌｔｉ ９６−ｍｕｌｔｉｂｌｏｔ ｒｅｐｌｉｃａｔｏｒ ＶＰ４０９，Ｂｉｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，ＵＳ）を用いて，図１５に示すように，スポットの位置および種類が判別できるようにスポットした。スポッティング用溶液は１μｌ／スポットとなるようにした。
《ＤＮＡの増幅》
スポッティングした用紙を３０分以上室温にて乾燥させた後，スポット部分を含むように４ｍｍ ｘ ４ｍｍの大きさに６０ＭＤＰ紙を切り取りＰＣＲ用マイクロチューブに入れ，そこに水２５μｌを加え，次の条件でＰＣＲを行った。
２ｍｉｎ ａｔ ９４℃
（１ｍｉｎ ａｔ ９４℃，１ｍｉｎ ａｔ ５５℃，７５ｓｅｃ ａｔ ６８℃）２９サイクル
１５ｍｉｎ ａｔ ７４℃
反応後のチューブより適量を取り，１％アガロースゲルで電気泳動した結果を図１６に示す。Ｌａｎｅ１はリンゴ酸脱水素酵素のｃＤＮＡ、Ｌａｎｅ２はイソクエンサン脱水素酵素（ＮＡＤＰ）のｃＤＮＡ、Ｌａｎｅ３はイソクエンサン脱水素酵素（ＮＡＤ）のｃＤＮＡ、Ｌａｎｅ４はオキソグルタル酸脱水素酵素のｃＤＮＡ、左端はサイズマーカーを示す。４種類のｃＤＮＡについてそれぞれ目的とする長さの断片が得られ，６０ＭＤＰ紙に固定したｃＤＮＡ，プライマー，アプタマー，ポリメラーゼ，およびＰＣＲ用バッファー組成物に水のみを加えることによりＰＣＲ増幅が可能であることが判った。
反応後のチューブより適量を取り，１％アガロースゲルで電気泳動した結果を１０８に示す。１８４ｂｐおよび３４３ｂｐ付近に見られるバンドがそれぞれエクソン１および２の目的とするＤＮＡ断片と考えられ，６０ＭＤＰ紙に固定されたプライマーを用いてテンプレートＤＮＡからＰＣＲにより目的とする断片を増幅可能であることが判った。また，Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに対するアプタマーの有無を比較すると，アプタマーを含む反応の方が非特異的な増幅を抑えることが出来ることが判った。
［実施例４］
《ｃＤＮＡ溶液の調整》
実施例３で使用したのと同じマウスリンゴ酸脱水素酵素のｃＤＮＡクローン（クローンＩＤ：１５０００１２Ｍ１５，１７５８ｂｐ）をクローニングしたｐＦＬＣベクター（図１０）を１μｇ／μｌとなるようにＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した。
《ｃＤＮＡ＋プライマー＋反応促進剤（スペルミジン）＋ポリメラーゼ＋ＰＣＲ用バッファー組成溶液の調整》
上記ｃＤＮＡ，プライマーセット１，スペルミジンおよびＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅａｒｓｅを最終濃度，ｃＤＮＡ ０．００５μｇ／μｌ，５μＭプライマーセット，５０Ｕ／μｌ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，スペルミジン１００ｍＭ，０．１Ｍトレハロース，２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），１．２５Ｍ ＫＣｌ，１３２．５ｍＭ ＭｇＣｌ，５μＭ各ｄＮＴＰとなるように調整した。
《ＤＮＡのスポッティング》
６０ＭＤＰ紙（三島製紙製）に上記により調整した溶液を９６ ｐｉｎ−ｔｏｏｌ（Ｍｕｌｔｉ ９６−ｍｕｌｔｉｂｌｏｔ ｒｅｐｌｉｃａｔｏｒ ＶＰ４０９，Ｂｉｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，ＵＳ）を用いて，図１５に示すように，スポットの位置および種類が判別できるようにスポットした。スポッティング用溶液は１μｌ／スポットとなるようにした。
《ＤＮＡの増幅》
スポッティングした用紙を３０分以上室温にて乾燥させた後，スポット部分を含むように４ｍｍ ｘ ４ｍｍの大きさに６０ＭＤＰ紙を切り取りＰＣＲ用マイクロチューブに入れ，そこに水２５μｌを加え，次の条件でＰＣＲを行った。
２ｍｉｎ ａｔ ９４℃
（１ｍｉｎ ａｔ ９４℃，１ｍｉｎ ａｔ ５５℃，７５ｓｅｃ ａｔ ６８℃）２９サイクル
１５ｍｉｎ ａｔ ７４℃
反応後のチューブより適量を取り，１％アガロースゲルで電気泳動した結果を図１７に示す。Ｌａｎｅ１および２はｃＤＮＡ，プライマー，ポリメラーゼ，反応促進剤としてポリアミンの一種であるスペルミジン，およびＰＣＲ用バッファー組成物を６０ＭＤＰ紙固定したサンプルで，Ｌａｎｅ３はスペルミジンのみ除いた組成を固定したサンプルである。どちらも，水を加えることにより，固定されたＤＮＡを増幅することが可能であり，また，反応促進剤を固定したサンプルでは，増幅反応が促進されていることが判った。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明の支持体は、酵素の保存や流通に利用することができる。また、印刷物及び試薬キットへの応用も可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００６８】
配列番号１は、プライマー−２１Ｍ１３の塩基配列を示す。
配列番号２は、プライマー１２３３−Ｒｖの塩基配列を示す。
配列番号３は、マウスリンゴ酸脱水素酵素のｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号４は、プライマーＨｓＬＨ１Ｆの塩基配列を示す。
配列番号５は、プライマーＨｓＬＨ１Ｒの塩基配列を示す。
配列番号６は、プライマーＨｓＬＨ２Ｆの塩基配列を示す。
配列番号７は、プライマーＨｓＬＨ２Ｒの塩基配列を示す。
配列番号８は、Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに対するアプタマーの塩基配列を示す。
配列番号９は、マウスイソクエン酸脱水素酵素（ＮＡＤＰ）のｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号１０は、マウスイソクエン酸脱水素酵素（ＮＡＤ）のｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号１１は、マウスオキソグルタル酸脱水素酵素のｃＤＮＡの塩基配列を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素と当該酵素の保護剤とが固定されている支持体。
【請求項２】
上記保護剤がトレハロース及びその誘導体からなる化合物群より選択される少なくとも一種類の化合物である請求項１記載の支持体。
【請求項３】
酵素反応の促進剤をさらに含む請求項１又は２に記載の支持体。
【請求項４】
上記酵素に対するアプタマーをさらに含む請求項１ないし３の何れか一項に記載の支持体。
【請求項５】
酵素と当該酵素に対するアプタマーとが固定されている支持体。
【請求項６】
上記酵素がＤＮＡポリメラーゼである請求項１ないし５の何れか一項に記載の支持体。
【請求項７】
さらに、上記ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸増幅反応で目的とする核酸を増幅するためのプライマーを含んでなる請求項６記載の支持体。
【請求項８】
さらに、上記ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸増幅反応の鋳型となる核酸、当該核酸を増幅するためのプライマー、及び核酸増幅反応のためのバッファーから選択される少なくとも一つを含んでなる請求項６に記載の支持体。
【請求項９】
請求項１ないし８の何れか一項に記載の支持体を含む印刷物。
【請求項１０】
請求項１ないし８の何れか一項に記載の支持体を含む試薬キット。
【請求項１１】
請求項１記載の支持体を製造する方法であって、酵素及び保護剤の混合溶液を調製し、該溶液を支持体に適用し、該支持体を乾燥することにより、前記酵素及び保護剤の混合物を支持体に固定することを含む前記の方法。
【請求項１２】
請求項１ないし８の何れか一項に記載の支持体を液体に浸漬させることにより、該液体中に酵素を溶出させることを含む、支持体に固定された酵素を再生する方法。
【請求項１３】
請求項６ないし８の何れか一項に記載の支持体を液体中に配置して当該支持体よりＤＮＡポリメラ−ゼを溶出させる工程と、当該ＤＮＡポリメラ−ゼを用いて核酸増幅反応を行うことを特徴とする、核酸の増幅方法。
【請求項１】
酵素と当該酵素の保護剤とが固定されている支持体。
【請求項２】
上記保護剤がトレハロース及びその誘導体からなる化合物群より選択される少なくとも一種類の化合物である請求項１記載の支持体。
【請求項３】
酵素反応の促進剤をさらに含む請求項１又は２に記載の支持体。
【請求項４】
上記酵素に対するアプタマーをさらに含む請求項１ないし３の何れか一項に記載の支持体。
【請求項５】
酵素と当該酵素に対するアプタマーとが固定されている支持体。
【請求項６】
上記酵素がＤＮＡポリメラーゼである請求項１ないし５の何れか一項に記載の支持体。
【請求項７】
さらに、上記ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸増幅反応で目的とする核酸を増幅するためのプライマーを含んでなる請求項６記載の支持体。
【請求項８】
さらに、上記ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸増幅反応の鋳型となる核酸、当該核酸を増幅するためのプライマー、及び核酸増幅反応のためのバッファーから選択される少なくとも一つを含んでなる請求項６に記載の支持体。
【請求項９】
請求項１ないし８の何れか一項に記載の支持体を含む印刷物。
【請求項１０】
請求項１ないし８の何れか一項に記載の支持体を含む試薬キット。
【請求項１１】
請求項１記載の支持体を製造する方法であって、酵素及び保護剤の混合溶液を調製し、該溶液を支持体に適用し、該支持体を乾燥することにより、前記酵素及び保護剤の混合物を支持体に固定することを含む前記の方法。
【請求項１２】
請求項１ないし８の何れか一項に記載の支持体を液体に浸漬させることにより、該液体中に酵素を溶出させることを含む、支持体に固定された酵素を再生する方法。
【請求項１３】
請求項６ないし８の何れか一項に記載の支持体を液体中に配置して当該支持体よりＤＮＡポリメラ−ゼを溶出させる工程と、当該ＤＮＡポリメラ−ゼを用いて核酸増幅反応を行うことを特徴とする、核酸の増幅方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３０９５８
【国際公開日】平成１７年４月７日（２００５．４．７）
【発行日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１４２５０（Ｐ２００５−５１４２５０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１４２４５
【国際出願日】平成１６年９月２９日（２００４．９．２９）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【出願人】（５０１２９３６６６）株式会社ダナフォーム (25)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年４月７日（２００５．４．７）
【発行日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１４２４５
【国際出願日】平成１６年９月２９日（２００４．９．２９）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【出願人】（５０１２９３６６６）株式会社ダナフォーム (25)
【Ｆターム（参考）】
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