酵素の再利用方法
【課題】セルロースの糖化分解において、酵素活性を低下させることなく、また、酵素を再利用することにより酵素の使用量を減少させる方法を提供する。
【解決手段】セルロースの糖化分解において、好熱性細菌由来のβ−グルコシダーゼ活性を示す領域とセルロースに結合可能なモジュールとを含むキメラβ−グルコシダーゼ及びセルロソームを併用し、セルロースの糖化分解反応終了時にセルロース系基質を添加し、キメラβ−グルコシダーゼ及びセルロソームをセルロース系基質に吸着させて分離する。
【解決手段】セルロースの糖化分解において、好熱性細菌由来のβ−グルコシダーゼ活性を示す領域とセルロースに結合可能なモジュールとを含むキメラβ−グルコシダーゼ及びセルロソームを併用し、セルロースの糖化分解反応終了時にセルロース系基質を添加し、キメラβ−グルコシダーゼ及びセルロソームをセルロース系基質に吸着させて分離する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素を利用した基質の変換反応において、反応終了後の反応溶液から酵素を回収して再利用するリサイクル技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
バガス、稲わら、籾殻、キノコ廃床、堆肥、木材チップ等のセルロース系バイオマスが食糧生産を圧迫しないエネルギーや化学工業の原料資源として注目されている。特に、セルロース系バイオマスの燃料エタノールへの変換においては、発酵原料を効率良く糖化する技術が切望されている。
【０００３】
しかし、セルロース系バイオマスはでん粉に比べて糖化技術の難易度が高い。これは、セルロース系バイオマスの構成主体であるセルロースが堅固な結晶構造を持つ難分解性の高分子多糖であることによる。
【０００４】
セルロース系バイオマスの糖化方法には、物理的糖化、化学的糖化及び酵素糖化の３つの方法がある。
【０００５】
物理的糖化処理はボールミルや振動ミル又は蒸煮爆砕や加圧熱水処理など物理的に糖化を施す処理があるが、物理的な処理は多大なエネルギーを必要とするため、化学的糖化や酵素糖化の前処理として併用されることが多い。
化学的糖化処理は、アルカリ、酸を利用するものがあるが、古くより酸糖化がよく用いられている。酸糖化には濃硫酸糖化法と希硫酸二段糖化法とがあるが、何れも硫酸を用いるため、廃棄物処理や環境負荷の低減を必要とし、低コスト化及びエネルギー変換効率に限界があるといわれている。
【０００６】
酵素糖化は、酸糖化に比べ、廃液回収や処理の負担が軽く、耐薬設備等の設備コストを低減できること、過分解が起こらずに糖の収率が高い等の利点があるため、澱粉質を多く含むバイオマスの酵素糖化で実用化されている。ところが、セルロース系バイオマスは、前述したように、セルロースが結晶構造を有していること及び結晶性セルロースをヘミセルロースやリグニンが取り囲んだ複雑な構造を有しているため、でん粉系に比べ、酵素糖化がきわめて困難である。したがって、酵素による糖化処理前に、物理的あるいは化学的前処理による結晶構造の破壊等の前処理や大量のヘミセルラーゼやセルラーゼを併用しているのが現状である。
【０００７】
ヘミセルラーゼやセルラーゼに関しては好気性糸状菌トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来の糖化酵素が工業的に使用されているため、セルロース系バイオマスの糖化においても、トリコデルマ属菌の研究が活発に行われてきた（特許文献１参照）。
【０００８】
近年、ある種の嫌気性微生物が、セルロースを効率よく分解できる酵素複合体セルロソーム（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｏｍｅ）を生産することが明らかとなった。
【０００９】
セルロソームは、骨格となるタンパク質をベースに多数の高分子多糖分解酵素が結合した構造を有し、これらの複数の酵素が共同してセルロースに作用することで、非常に高い高分子多糖の分解活性を示すことが解明されている（非特許文献１及び２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００７−３１９０４０号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ． ２００５ Ｍａｒ；６９（１）：１２４−５４
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． ２００４ Ｓｅｐ １５；３８２（Ｐｔ ３）：７６９−８１．
【非特許文献３】Ｊｏｈｎｓｏｎ ＥＡ， Ｓａｋａｊｏｈ Ｍ， Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ Ｇ， Ｍｅｄｉａ Ａ， Ｄｅｍａｉｎ ＡＬ （１９８２） Ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｂｙ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ ｆｒｏｍ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４３：１１２５−１１３２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
トリコデルマ・リーセイ由来の酵素は、基質の分解速度が遅いため、実用化に際し、大量の酵素を必要とすることが指摘されている。
【００１３】
セルロソームは、高分子多糖の最終産物であるセロビオースの蓄積により酵素活性が阻害されるため、反応後期に糖化効率が低下するという問題がある。
【００１４】
本発明は、セルロースの糖化分解において、酵素活性を低下させることなく、また、酵素を再利用することにより酵素の使用量を減少させることを目的とする。
本発明は、また、セルロースの糖化分解において繰り返し利用することが可能な酵素を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らはセルロソームがセルロース結合モジュールを有することに着目し、鋭意研究を行ったところ、セルロース結合モジュールを融合させたセルロソームを有する酵素をセルロースに結合させることで、酵素を反応系から容易に分離でき、かつ酵素活性を低下させることなく分離した酵素を再利用できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
本発明の酵素の再利用方法は、セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素をセルロース系の基質に結合させ、セルロース系の基質に結合した酵素を再利用することを特徴とする。
本発明の酵素は、β−グルコシダーゼ活性を示す領域とセルロースに結合可能なモジュールとを含むβ−グルコシダーゼ及びキメラβ−グルコシダーゼである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の方法により、酵素反応系に存在する酵素が反応系外に排除されることが少なくなるため、効率的に酵素を分離回収することが可能となる。したがって、再利用するたびに新たに酵素を添加する必要がなく、酵素の使用量を減少させることが可能となる。特に、酵素反応系に複数種類の酵素が存在する場合、セルロース系基質に酵素が結合するため、複数種類の酵素を一括して分離することができるので、再利用にあたり、特定の酵素活性だけが失われることもなくなる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明に従う実施形態１の酵素の再利用方法のフロー図である。
【図２】実施形態２の酵素の再利用方法のフロー図である。
【図３】クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４からのセルロソームとサーモアナエロバクター・ブロッキＡＴＣＣ３３０７５からのβ−グルコシダーゼ（ＣｇｌＴ）併用によるアビセル分解能への影響を示す図である。
【図４】アビセルに対するセルロソームとＣｇｌＴ併用によるリサイクル糖化法の工程を示す図である。
【図５】セルロソームとＣｇｌＴ併用リサイクル糖化反応によるラウンドごとのアビセル分解率を示す図である。
【図６】セルロース結合モジュール融合キメラβ−グルコシダーゼ（ＣＢＭ−ＣｇｌＴ及びＣｇｌＴ−ＣＢＭ）とセルロソーム併用によるアビセル分解能への影響を示す図である。
【図７】セルロソームとＣＢＭ−ＣｇｌＴ併用によるリサイクル糖化反応によるラウンドごとのアビセル分解効率を示す図である。
【図８】リグノセルロース系バイオマスを用いる際のセルロソームとＣＢＭ−ＣｇｌＴ併用によるリサイクル糖化法の工程を示す図である。
【図９】アンモニア浸漬処理稲わら及び、各ブロッキング処理を行ったアンモニア浸漬処理稲わらに対するリサイクル糖化によるセルロース分解率の比較を示す図である。
【図１０】ブロッキング処理リグノセルロース系バイオマスを用いる際のセルロソームとＣＢＭ−ＣｇｌＴ併用によるリサイクル糖化法の工程を示す図である。
【図１１Ａ】ブロッキング処理を行った稲わらを用いたリサイクル糖化によるセルロース分解率の比較を示す図である。
【図１１Ｂ】ブロッキング処理を行った杉パルプを用いたリサイクル糖化によるセルロース分解率の比較を示す図である。
【図１１Ｃ】ブロッキング処理を行った使用済みオフィス紙を用いたリサイクル糖化によるセルロース分解率の比較を示す図である。
【図１２】残渣を残したままでのカゼインでブロッキングしたアンモニア浸漬した稲わらを用いた際のセルロース分解率を示す図である。
【図１３】市販カビセルラーゼとカビβ−グルコシダーゼを併用した稲わらのリサイクル糖化の効果を示す図である。
【図１４】セルロソーム及びβ−グルコシダーゼ（ＣＢＭ−ＣｇｌＴ）にブロッキング剤を添加したリサイクル糖化の結果を示す図である。
【図１５】セルロソーム酵素反応系にＤＴＴを含むリサイクル糖化の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を幾つかの実施の形態並びに実施例に基づいて詳細に説明する。
【００２０】
［実施形態１］
本実施形態１は、セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素をセルロース系の基質に結合させ、セルロース系の基質に結合した酵素を再利用する方法である。
【００２１】
詳細には、本実施形態は、図１に示すように、セルロースに結合可能なモジュール（Ｃａｒｂｏｈｙｄｏｒａｔｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｏｄｕｌｅ、以下、ＣＢＭと略記する。）を有する酵素（以下、ＣＢＭを有する酵素という。）と酵素特異的な基質との酵素反応液にセルロース系の基質を添加し、ＣＢＭをセルロース系の基質に結合させた後、酵素反応液からＣＢＭを分離し、分離されたＣＢＭに酵素特異的な基質を加える操作を繰り返し行う、酵素の再利用方法である。
【００２２】
言い換えるならば、本実施形態のＣＢＭを有する酵素を再利用する方法は、ＣＢＭを有する酵素と酵素特異的な基質との酵素反応液にセルロース系の基質を加え、セルロース系の基質にＣＢＭを有する酵素を結合させる第一ステップと、ＣＢＭを有する酵素を酵素反応液から分離する第二ステップと、分離したＣＢＭを有する酵素に酵素特異的な基質を加えて反応させる第三ステップとからなり、第一ステップから第三ステップを繰り返すことにより、ＣＢＭを有する酵素を再利用するものである。
【００２３】
ＣＢＭとは、セルロース結合モジュール（Ｃａｒｂｏｈｙｄｏｒａｔｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｏｄｕｌｅ）を意味し、非特許文献２に記載されるように、疎水的結合、静電的結合、水素結合、又はカルシウムやマグネシウムなど無機のカチオンを介して生化学的に多糖質、セルロース又はヘミセルロースへ結合できるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指している。したがって、ＣＢＭを有する酵素とは、ＣＢＭを酵素のアミノ酸配列中に含む酵素である。
【００２４】
セルロソームはセルラーゼ複合体であって、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、クロストリジウム・セルロボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）、クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ジョースイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｊｏｓｕｉ）、クロストリジウム・アセトブティリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム・セロビオパルム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｏｂｉｏｐａｒｕｍ）、クロストリジウム・パピロソルベンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｐｙｒｏｓｏｌｖｅｎｓ）、ルミノコッカス・アルブス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ）、ルミノコッカス・フラベファシエンス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ）、アセトビブリオ・セルロリティクス（Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、バクテロイディス・セルロソルベンス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃｅｌｌｕｌｏｓｏｌｖｅｎｓ）、ブチリビブリオ・フィブリソルベンス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ）に属する菌等が産生することが知られている。上記セルロソーム生産菌の天然由来のグルコシダーゼにおいて、セルロースに結合するＣＢＭのような領域が存在することは知られていない。
【００２５】
つまり、ＣＢＭを有する酵素とは、ＣＢＭのアミノ酸配列を含む様々な酵素活性を有する酵素であって、遺伝子組み換えによりＣＢＭが結合されたキメラ酵素を含むものである。酵素の酵素活性は、特に限定されるものでなく、セルラーゼ活性、ヘミセルラーゼ活性、アミラーゼ活性、グルコシダーゼ活性等、様々な機能を有するものであってよい。
【００２６】
ＣＭＢのアミノ酸配列の例として、配列表番号１にクロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４（ＮＩＴＥ ＢＰ−６２７）株ＣＢＭのアミノ酸配列を示すが、これに限定されるものではない。例えば、カルボハイドレイト・アクティブエンザイムデータベース（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ ｅｎＺＹｍｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ／）から糖質結合モジュールファミリー分類（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｏｄｕｌｅ ｆａｍｉｌｙ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に属するＣＢＭを用いることができる。好ましくは、そのモジュールファミリー分類表の中でもファミリー３に属するＣＢＭが良い。
【００２７】
ＣＢＭを有するキメラ酵素は、セルラーゼ活性、ヘミセルラーゼ活性、アミラーゼ活性、グルコシダーゼ活性等、様々な機能の少なくとも１つを備える酵素であって、天然由来の酵素の遺伝配列のＣ末端又はＮ末端又は中央部分等、いかなる部分にもＣＢＭをコードする遺伝子を融合した遺伝子を含む形質転換体を培養して得ることができる。
【００２８】
ＣＢＭをコードした遺伝子は、例えば、セルロソームを生産するクロストリジウム属微生物として、先に述べたクロストリジウム・サーモセラムやクロストリジウム・セルロボランスから得ることができる。配列番号２にクロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４（ＮＩＴＥ ＢＰ−６２７）株ＣＢＭのアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を示す。ＣＢＭのアミノ酸配列同様、ＣＢＭのアミノ酸配列をコードする遺伝子配列は、配列表番号２の遺伝子酸配列に限定されるものではない。
【００２９】
ＣＢＭを有する酵素は、酵素反応系に供給されたセルロース系基質に結合する。セルロース系基質は、水不溶性であるため、ＣＢＭを有する酵素は、水不溶性物質に固定されることになる。次いで、反応生成物とセルロース系基質に結合した酵素とを分離する。ＣＢＭを有する酵素は、水不溶性物質に固定化されるので、固液分離等の簡易な手段で容易に酵素反応系から効率よく回収することができる。そして、分離して得られたセルロース系基質に結合したＣＢＭを有する酵素に新たな酵素特異的な基質を加えることで、ＣＢＭを有する酵素を繰り返し再利用することが可能となる。
【００３０】
酵素特異的な基質がセルロース系基質と同じである反応系においては、セルロース系基質が糖類に分解されるため、反応が終了する都度、セルロース系基質を酵素反応系に酵素供給して、ＣＢＭを有する酵素をセルロース系基質に結合させる。なお、反応系に残渣がある場合には、セルロース系基質を供給する前に残渣を除去しておくことが望ましい。
【００３１】
酵素特異的な基質とセルロース系基質とが異なる物質である場合には、酵素反応を効率よく行うために、セルロソーム又はセルラーゼ等のセルロース分解酵素を酵素反応系に存在させてもよい。セルロース分解酵素とＣＢＭを有する酵素とを併用する場合には、反応が終了する都度、セルロース系基質を酵素反応系に供給する必要がある。
【００３２】
このようにして、酵素反応系からＣＢＭを有する酵素を分離して再使用することで、新たな酵素を酵素反応系に追加する必要が無くなる。
【００３３】
なお、セルロースに結合可能なモジュールを有する様々な活性をもった酵素を複数酵素反応系に存在させてもよい。すなわち、酵素反応系に存在する複数の酵素をセルロース系基質に結合させて、酵素反応液から分離することで、複数の酵素を再利用することが可能となる。
【００３４】
［実施形態２］
本実施形態２は、セルロソームとＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼとを用いた、両酵素の再利用方法である。実施形態１とは、ＣＢＭを有する酵素をセルロソームとＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼとを含む２種類の酵素に特定した点で相違する。
【００３５】
セルロース系のバイオマスをセルロソームにより糖化する場合、セルロソームは、その最終産物であるセロビオースにより酵素活性が阻害され、セルロース系バイオマスを効率よくセロビオース又はオリゴ糖へ分解することができないことが知られている。
【００３６】
本発明者らがセルロース系バイオマスのセルロソームを用いた糖化反応において、セロビオースを酵素反応系から除去するために、β−グルコシダーゼを併存させたところ、最初はセルロース分解効率が改善されていても、繰り返し利用するとセルロース分解効率が低下してしまうことを見出した。この原因は、再利用を繰り返すことにより、好熱嫌気性細菌由来のβ−グルコシダーゼが失われるためと考えられた。
【００３７】
そこで、セルロソームとβ−グルコシダーゼとを併用する場合の酵素反応効率の低下を抑制するために、ＣＢＭをβ−グルコシダーゼのＣ末端又はＮ末端に融合したキメラβ−グルコシダーゼを用いたところ、繰り返し利用によってもセルロース分解効率は低下しないことを見出した。
【００３８】
すなわち、本実施形態の方法は、セルロース系の基質とＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼとセルロソームとを含有する酵素反応液にセルロース系の基質を加えて、ＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼ及びセルロソームをセルロース系の基質に結合させ、セルロース系の基質に結合したＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼ及びセルロソームを反応系から分離して、基質に結合したＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼ及びセルロソームを再利用することを特徴とする。
【００３９】
図２に本実施形態の酵素の再利用方法のフローを示す。
すなわち、本実施形態の酵素の再利用方法においては、セルロース系の基質と、ＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼと、セルロソームとを含有する酵素反応液にセルロース系の基質を加え、セルロース系の基質にセルロソーム及びＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼを結合させる第一ステップと、セルロース系の基質に結合したＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼ及びセルロソームを分離する第二ステップと、分離したＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼ及びセルロソームにセルロース系の基質を加えて反応させる第三ステップとを含み、第一ステップから第三ステップを繰り返すことで、β−グルコシダーゼ及びセルロソームを再利用するものである。
【００４０】
セルロソームは、クロストリジウム属菌が産生するものであり、例えば、クロストリジウム・サーモセラムやクロストリジウム・セルロボランスに属する菌が産生するものを用いることができる。
【００４１】
本発明で使用するβ−グルコシダーゼは、一般的に酵素番号３．２．１．２１（ＥＣ３．２．１．２１）に定義されるセロビオースをグルコース２分子へ変換可能な酵素の触媒を有する酵素を意味する。
【００４２】
ＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼとは、ＣＢＭを融合したキメラβ−グルコシダーゼである。β−グルコシダーゼはカビ由来の酵素でもよいが、好ましくは好熱性細菌由来の酵素が望ましい。カビ由来のβ−グルコシダーゼを用いた場合、再利用の回数が好熱性細菌由来のβ−グルコシダーゼに比べ減少するからである。
【００４３】
β−グルコシダーゼとしては、使用するセルロソームの反応条件に近似し、グルコシダーゼ活性も持っているものであればいかなる生物由来のものを使用してもよい。例えば、クロストリジウム・サーモセラム由来のセルロソームを使用する場合、至適温度が５０℃〜８０℃、至適ｐＨが、５〜９の範囲で活性を有しているβ−グルコシダーゼと共に反応させることが考えられる。
【００４４】
利用可能なβ−グルコシダーゼは、微生物由来のアミノ酸配列を有するものが好ましい。使用するセルロソームの反応条件にも依存するが、クロストリジウム・サーモセラムからのセルロソームを使用する場合は、特に好熱性細菌由来のβ‐グルコシダーゼを用いることが好ましい。具体的な例を上げれば、好熱性細菌由来のβ−グルコシダーゼとしては、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｓｐｏｒａ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ、Ｔｈｅｒｍｕｓ、Ｔｏｌｕｍｏｎａｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ａｃｉｄｕｌｉｐｒｏｆｕｎｄｕｍ、Ｃａｌｄｉｖｉｒｇａ、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｅｒａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｅｒａ属由来のものを用いることができる。この他にもファミリー１、３、９、３０、１１６に属する酵素を生産する菌であれば用いることが可能である。
【００４５】
なお、β−グルコシダーゼとしては、上記以外の酵素として、カルボハイドレイト・アクティブエンザイム・データベース（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ ｅｎＺＹｍｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ／）に記載の糖質分解酵素ファミリー分類（Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆａｍｉｌｙ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に記載のある分類ファミリー１、３、９、３０、１１６に属するタンパク質を用いることが可能である。
【００４６】
なお、β−グルコシダーゼは、上述した微生物由来のアミノ酸配列に限定されるものではなく、微生物由来のアミノ酸配列と６０％程度のホモロジーがあるものを用いることができる。遺伝子組み換えの分野において、同一の機能を有するタンパク質となることが一般的に知られており、配列番号１と６０％程度のホモロジーを有するアミノ酸配列は本発明の範囲に含まれるものである。
【００４７】
好熱性細菌由来のβ−グルコシダーゼと融合するＣＢＭは、併用するセルロソームのＣＢＭと同じアミノ酸配列のものを用いるのが好ましい。これは、同じアミノ酸配列のＣＢＭとすることで、セルロースとβ−グルコシダーゼのセルロースへの結合挙動が同じになり、両酵素の反応系からの分離が容易になるからである。
【００４８】
なお、セルロソーム及びセルロースに結合可能なモジュールを有するβ−グルコシダーゼ以外にも、セルロースに結合可能なモジュールを有し、様々な活性を有する酵素を複数酵素反応系に存在させてもよい。
酵素反応系に存在する複数の酵素をセルロース系基質に結合させて、酵素反応液からセルロース系基質に結合した酵素を分離する。セルロース系基質に結合した酵素の糖化効率は低下することなく繰り返し利用することができるので、複数の酵素を再利用することが可能となる。
【００４９】
嫌気性菌由来の酵素であるセルロソームに関し、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）や２−メルカプトエタノールなどの還元剤を反応系に存在させることが知られている（非特許文献３）。本実施形態の方法において、セルロース系の基質にセルロソーム及びＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼを反応するうえにおいて、還元剤を存在させてもよいが、酵素を繰り返し使うと糖化効率が低下することがある。したがって、還元剤は反応系に存在させないほうが好ましい。
【００５０】
［実施形態３］
本実施形態３は、セルロース系の基質がリグニンを含むセルロース系バイオマスである点で、実施形態２と異なる。
【００５１】
すなわち、本実施形態の方法は、リグニンを含むセルロース系バイオマスと、ＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼと、セルロソームとの酵素反応液にリグニンを含むセルロース系バイオマスを加えてＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼ及びセルロソームを、リグニンを含むセルロース系バイオマスに結合させて反応させ、反応系からセルロース系バイオマスに結合したＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼ及びセルロソームを分離して、セルロース系バイオマスに結合したＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼ及びセルロソームを繰り返し利用することを特徴とする。
【００５２】
言い換えれば、本実施形態の酵素の再利用方法においては、リグニンを含むセルロース系バイオマスと、ＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼと、セルロソームとの酵素反応液にリグニンを含むセルロース系バイオマスを加え、リグニンを含むセルロース系バイオマスにセルロソーム及びＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼを結合及び反応させる第一ステップと、リグニンを含むセルロース系バイオマスに結合したＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼ及びセルロソームを反応系から分離する第二ステップと、分離したＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼ及びセルロソームにリグニンを含むセルロース系バイオマスを加えて反応させる第三ステップと、を含み、第一ステップから第三ステップを繰り返すことで、β−グルコシダーゼ及びセルロソームを再利用するものである。
【００５３】
ここで、リグニンを含むセルロース系バイオマスは、事前に前処理としてアンモニア浸漬処理を行っておくことが好ましく、さらに、アンモニア浸漬処理後にタンパク質、高分子ポリエチレングリコール及び界面活性剤から選択される１種以上のブロッキング剤でブロッキング処理を行っておくことが望ましい。ブロッキング処理とは、リグノセルロース系バイオマスの酸不溶な部位をコーティングする処理であり、アンモニア浸漬処理後のセルロース系のバイオマスをブロッキング剤に浸漬すればよい。具体的なブロッキング剤は、タンパク質としてスキムミルク又はカゼイン、界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ２０又はＴｗｅｅｎ８０に代表される非イオン性界面活性剤が好ましい。ブロッキング処理により植物細胞壁が有するリグニン及びリグニン−ヘミセルロース複合体、リグニン−無機物複合体等、セルロース及びヘミセルロース以外の疎水性基等の反応基とタンパク質との非特異的吸着が抑制されると考えられる。
【００５４】
本実施形態の方法において、セルロース系の基質にセルロソーム及びＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼを結合させる反応、すなわち第一ステップ及び第三ステップにおいて、還元剤を存在させてもよいが、酵素を繰り返し使うと糖化効率が低下することがある。したがって、還元剤は反応系に存在させないほうが好ましい。
【００５５】
また、リグニンを含むセルロース系バイオマスと、ＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼと、セルロソームとの酵素反応液にリグニンを含むセルロース系バイオマスを加える前に、酵素反応の残渣を除去しておくことが好ましい。残渣の除去により、再利用回数を増やすことができる。
【００５６】
［実施形態４］
本実施形態４は、セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素をタンパク質、高分子ポリエチレングリコール及び界面活性剤から選択される１種以上のブロッキング剤の存在下で、セルロース系の基質と結合及び／又は反応させる、酵素の再利用方法である。
ブロッキング剤は、セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素とセルロース系の基質との反応系に存在していればよいが、セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素をセルロース系の基質と反応させる前にブロッキング剤と接触させておくことが好ましい。接触は、例えば、セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素を含む溶液にブロッキング剤を添加すればよい。
【００５７】
具体的には、セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素を含む溶液にブロッキング剤を添加した後、セルロース系の基質を加え、セルロース系の基質にＣＢＭを有する酵素を結合させる第一ステップと、ＣＢＭを有する酵素を酵素反応液から分離する第二ステップと、分離したＣＢＭを有する酵素に酵素特異的な基質を加えて反応させる第三ステップと、からなり、第一ステップから第三ステップを繰り返すことにより、ＣＢＭを有する酵素を再利用するものである。
【００５８】
セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素を、セルロソーム及びＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼとし、セルロース系の基質及びＣＢＭを有する酵素に酵素特異的な基質を、リグニンを含むセルロース系バイオマスとする場合、反応系に還元剤を存在させてもよいが、酵素を繰り返し使うと糖化効率が低下することがあるので、還元剤を反応系に存在させないほうが好ましい。
【００５９】
また、この場合、セルロソーム及びＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼを含む溶液にブロッキング剤を添加してから、リグニンを含むセルロース系の基質を添加し、酵素と基質とを結合及び／又は反応させることが好ましい。
【００６０】
さらに、実施例を挙げて本発明を詳しく説明する。なお、本発明は、以下に示す実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００６１】
前述したように、セルロソームは、酵素反応の最終産物であるセロビオースによって、酵素反応が阻害されてしまう。セルロソームの糖化能力を発揮させるためには、セロビオースを反応系から除去する必要がある。そこで、セロビオースをグルコースへ分解可能な酵素β−グルコシダーゼをセルロソームと併存させて、微結晶セルロース（シグマセルタイプ２０）の分解能を比較した。
【００６２】
β−グルコシダーゼとして、以下の２つの酵素を準備した。
（１）市販のアスペルギルス・ニガー由来酵素（シグマ−アルドリッチ社製）。
（２）好熱嫌気性細菌であるサーモアナエロバクター・ブロッキＡＴＣＣ３３０７５（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｂｒｏｃｋｉｉ）（アメリカンタイプカルチャーコレクション）のβ−グルコシダーゼをもとにした組換えβ−グルコシダーゼ（以下、ＣｇｌＴという）。
【００６３】
［ＣｇｌＴの作成］
サーモアナエロバクター・ブロッキからのゲノムＤＮＡは、以下の手順により抽出した。０．５％セロビオースを含むＢＭ７ＣＯ−ＣＢ液体培地を用いてサーモアナエロバクター・ブロッキを培養後、４℃にて１０，０００回転で５分間、遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体を溶菌させるために、１０％ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）を最終濃度が０．５％になるように添加するとともに、プロテナーゼＫ（１ｍｇ／ｍｌ）溶液が５μｇ／ｍｌになるように加え、３７℃で１時間反応させた。さらに１０％臭化セチルトリメチルアンモニウム−０．７Ｍ塩化ナトリウム溶液を１％濃度になるように加え、６５℃で１０分間反応させた後、等量のクロロフォルム・イソアミルアルコール溶液を加えよく攪拌し、１５，０００回転、５分間遠心分離にて水層を得た。
【００６４】
この水層にフェノール・クロロフォルム・イソアミルアルコール混液を等量加え、攪拌して再度１５，０００回転、５分間遠心分離にて水層を得た。この水層に対し０．６倍容量のイソプロパノールを加えてゲノムＤＮＡを析出させ、再度遠心分離によりゲノムＤＮＡを調製した。このゲノムＤＮＡを７０％エタノールで洗浄、乾燥した。
【００６５】
なおＢＭ７ＣＯ−ＣＢ培地の組成は、リン酸二水素カリウム１．５ｇ／Ｌ、 リン酸水素二カリウム２．９ｇ／Ｌ、 尿素２．１ｇ／Ｌ、 酵母エキス ６．０ｇ／Ｌ、 炭酸ナトリウム４ｇ／Ｌ、システイン塩酸塩０．０５ｇ／Ｌ、０．２ ｍｌミネラル溶液（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、 ５ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、 ０．７５ｇ、 ＦｅＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、 ０．００６３ｇを水４ｍｌに溶解）として調製した。また、培地に炭素源としてセロビオースを５ｇ／Ｌになるように加えた。最終的な培地のｐＨは７．０前後に調製した。
【００６６】
ＣｇｌＴは、上記調製したゲノムＤＮＡを用い、オリゴヌクレオチドプライマーＣｇｌＴＦ（配列番号３：５´−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＡＡＴＴＴＣＣＡＡＧＡＧＡＴ−３´）及び、ＣｇｌＴＲ（配列番号４に示す：５´−ＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＡＴＣＴＴＣＧＡＴＡＣＣＡＴＣＡＴＣ−３´）をデザイン、合成し、ＰＣＲにより約１．４キロベース長の二本鎖増幅ＤＮＡ配列を得た。増幅したＣｇｌＴ遺伝子配列を配列番号５に示す。
【００６７】
デザインしたオリゴヌクレオチドプライマーＣｇｌＴＦ及びＣｇｌＴＲは、大腸菌発現ベクターに挿入するため、制限酵素サイトＢａｍＨＩ及びＢｐｕ１１０２サイトを付加してある。なお、サーモアナエロバクター・ブロッキＡＴＣＣ３３０７５のβ−グルコシダーゼＣｇｌＴ遺伝子配列は、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＢＩＣ）のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じ、遺伝子配列を取得することができる（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号；ＣＡＡ９１２２０．１）。
【００６８】
ＰＣＲは、ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）により１６ｓｒＲＮＡ遺伝子の増幅を行った。ＰＣＲの条件は９８℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間、を３０サイクルの条件において増幅を行なった。
【００６９】
ＰＣＲ産物は０．８％アガロースゲル電気泳動で増幅されたバンドを確認後、キアゲンＰＣＲ精製キット（キアゲン社製）を用い精製した。精製したＰＣＲ産物はＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）及びＢｐｕ１１０２（タカラバイオ社製）を用い、３７℃で一晩、制限酵素処理を行った。
【００７０】
制限酵素処理済みＰＣＲ産物は再度０．８％アガロースゲル電気泳動により制限酵素分解産物と分離し、ゲルから目的のバンドを切り出し、ゲル抽出キット（キアゲン社製）により精製した。
【００７１】
ＣｇｌＴ遺伝子を大腸菌において発現させるため、ｐＥＴ１９ｂ発現ベクター（メルク社製）も使用した。本ベクターは発現させたい目的のタンパク質のＮ末端側に６残基のヒスチジンタグが融合されるような設計になっている。ｐＥＴ１９ｂ発現ベクターは、同じくＢａｍＨＩ及びＢｐｕ１１０２を用い、３７℃で一晩、制限酵素処理を行った。制限酵素処理後、制限酵素切断サイトの脱リン酸を行うため、アルカリフォスファターゼ（タカラバイオ社製）を５０℃で１時間処理を行った。フェノール・クロロフォルム抽出を繰り返し、アルカリフォスファターゼを失活させた後、エタノール沈殿処理を行い、制限酵素処理済みｐＥＴ１９ｂ発現ベクターを回収した。
【００７２】
ＣｇｌＴ発現ベクターを構築するため、上記制限酵素処理済みＣｇｌＴ遺伝子とｐＥＴ１９ｂ発現ベクターはＴ４ライゲース（タカラバイオ社製）により１６℃で一晩、インキュベートを行い、連結させた。その発現ベクターＣｇｌＴ−ｐＥＴ１９は大腸菌ＪＭ１０９へ一度形質転換を行い、５０μｇ／ｍｌアンピシリンナトリウムと１．５％寒天を含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地（ＬＢ培地）により３７℃で一晩培養を行った。
【００７３】
ＬＢ培地の組成を以下に示す。バクトペプトン１ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１ｇ／Ｌ、イーストエキストラクト１ｇ／Ｌ、最終的な培地のｐＨは７．０前後に調製された。
【００７４】
生育してきたコロニーから目的の発現ベクターＣｇｌＴ−ｐＥＴ１９を有するクローンを選択した。選択には大腸菌クローンからプラスミド抽出キット（キアゲン社製）を用いて発現ベクターＣｇｌＴ−ｐＥＴ１９を抽出したのち上記プライマーによりＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１（アプライドバイオシステムズ社）、ＰＲＩＳＭ（登録商標） ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）または、ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）によりＤＮＡ配列を読み取った。
【００７５】
読み取った遺伝子配列が正確かどうかを確認するため、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＢＩＣ）のホームページを通じ、得られたＤＮＡ配列データを用いて、ホモロジー検索を行なって正確性を確かめた。正確な遺伝子配列を有する発現ベクターＣｇｌＴ−ｐＥＴ１９はＣｇｌＴタンパク質を多量発現させるため、再度大腸菌ＢＬ２１（メルク社製）へ形質転換しタンパク質多量発現大腸菌クローンを得た。
【００７６】
ＣｇｌＴを得るため、発現ベクターＣｇｌＴ−ｐＥＴ１９を持つ大腸菌ＢＬ２１をアンピシリンナトリウム含有ＬＢ培地で３７℃、４時間培養を行った後、イソプロピル−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を１ｍＭの濃度を加えさらに１２時間培養を行った。
【００７７】
ＣｇｌＴ−ｐＥＴ１９を持つ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）は遠心分離（８，０００回転、４℃、１０分）により菌体を回収した。回収した菌体は一度−８０℃で一晩凍結し、溶菌緩衝液（５０ ｍＭ リン酸緩衝液、 ３００ ｍＭ 塩化ナトリウム、 １０ ｍＭ イミダゾール、 ｐＨ ８．０）に懸濁したのち、氷中において超音波破砕機により破砕した。得られた溶菌混濁液を遠心分離し、透明な溶菌液と沈殿している未破砕菌体とを分離後、溶菌液のみを回収し０．４５μｍフィルター濾過を行った。
【００７８】
その溶菌液はニッケルアガロースゲルカラム（Ｎｉ−ＮＴＡアガロースゲル；キアゲン社製）を通して、ヒスタグ融合ＣｇｌＴを得た。さらに溶出を行ったＣｇｌＴは脱塩カラム（バイオラッド社製）に通して精製した。ヒスタグ融合ＣｇｌＴのタンパク量測定は、必要に応じて蒸留水で希釈後、ＢＣＡ・タンパク測定キット（サーモサイエンティフィック社製）により測定を行った。タンパク質の検量線はウシ血清アルブミンを使用し作成した。
【００７９】
ＣｇｌＴのアミノ酸配列を配列番号６に示す。
【００８０】
［セルロソームの製造］
クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４株（ＮＩＴＥ ＢＰ−６２７）を上記したＢＭ７ＣＯ−ＣＢ培地の炭素源をセロビオースから微結晶セルロース１０ｇ／Ｌへ変更したＢＭ７ＣＯ−ＣＬ培地を用いて６日間、６０℃にて培養を行った。
【００８１】
培養後、遠心分離により菌体を除き、その培養液にアモロファスセルロース（リン酸膨潤セルロース）を加え、４℃、一晩にて攪拌しセルロソームをアモロファスセルロースに吸着させた。攪拌後、アモロファスセルロースを回収し５ｍＭ塩化カルシウムを含む１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で懸濁し、透析チューブ（１０ｋＤａカット；スペクトラ社製）に注ぎ、６０℃で蒸留水による透析を約６時間行った。なお、透析は１時間おきに新しい蒸留水に交換して行った。
【００８２】
この反応により、セルロソームにより分解されたアモロファスセルロースからの反応産物であるセロビオースやセロオリゴ糖は、透析により蒸留水へ拡散し、反応阻害を受けることなく完全に分解することができる。その結果、透析チューブ内にはセルロソームのみを簡易に回収できる。
【００８３】
得られた透析液をセルロソーム酵素画分として以降の実験に使用した。セルロソームのタンパク質量は適当な濃度へ蒸留水で希釈後、上記同様にＢＣＡ・タンパク測定キットにより測定を行った。
【００８４】
β−グルコシダーゼの活性測定は、Ｗｏｏｄ， ＷＡ．， Ｋｅｌｌｏｇ， Ｓ．Ｔ．， １９８８． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．１６０， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．に記載された、ｐ−ニトロフェノールガラクトピラノシドを基質として酵素反応により遊離してくるｐ−ニトロフェノール量を測定することにより活性（ユニット）を算出した。一分間にμモルｐ−ニトロフェノールを生成する量を１ユニット（Ｕ）の酵素活性と定義した。
【００８５】
１％シグマセルタイプ２０、５ｍＭ塩化カルシウムを含む１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）にセルロソーム０．５ｍｇ及びβ−グルコシダーゼを添加した。セルロース分解率は、一定時間おきに、サンプリングを行い、生成してくるセロビオースやグルコースをアミネックスＨＰＸ−８７Ｐカラム（バイオラッド社製）による示差屈折検出器を用いた高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製、Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ）により測定した。
【００８６】
初発糖濃度は、シグマセルタイプ２０を０．３ｇとし、７２％硫酸（重量％）を３ｍｌ加え、よく攪拌し１時間加水分解を行なった。その後、蒸留水を８０ｍｌ加え１２１℃で１時間オートクレーブをかけた後、ガラスフィルターにより濾過し、濾液を得た。この濾液を強アニオンカラムに通したのち、その一部を上記アミネックスＨＰＸ−８７Ｐカラム（バイオラッド社製）による示差屈折検出器を用いた高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製、Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ）により測定した。測定されたグルコース量は、使用したセルロース重量を参考にグルコース換算での全糖量を算出し１００％量とした。
【００８７】
セルロソームのみと、セルロソームとβ−グルコシダーゼ共存下における、微結晶セルロース分解率（％：ｗ／ｗ）の結果を図３に示す。図中の黒丸印はセルロソームのみの分解反応、黒三角印はセルロソームと市販アスペルギルス・ニガーのβ−グルコシダーゼ（０．５ｍｇ；０．９３ユニット）、黒四角印はセルロソームとＣｇｌＴ（０．０１ｍｇ；０．２４Ｕ）である。
【００８８】
セルロソームのみ、及び市販アスペルギルス・ニガーのβ−グルコシダーゼを併用した場合のセルロース分解能は約４０％とほとんど効果が見られず、セロビオースによるセルロソームの阻害が認められた。また、セルロソームと市販アスペルギルス・ニガーのβ−グルコシダーゼの併用はほとんど効果がないことが分かる。一方、セルロソームとＣｇｌＴの併用はほぼ完全分解できることから、セルロソームにより生成されたセロビオースが効果的にグルコースに分解され、生成物阻害から解除された状態になっていた。
【００８９】
したがって、セルロソームとサーモアナエロバクター・ブロッキＡＴＣＣ３３０７５のβ−グルコシダーゼＣｇｌＴの併用は、市販アスペルギルス・ニガー酵素のβ−グルコシダーゼとの併用よりも極めて高いセルロース分解率を奏することが明らかとなった。
【実施例２】
【００９０】
セルロソームの骨格蛋白質（以下ＣｉｐＡという）はセルロース結合モジュールを保有しているために、セルロソームごとセルロースへ吸着することができる。一方、β−グルコシダーゼは糖質に結合可能なモジュールを有していない。したがって、セルロソームをリサイクルする場合には、β−グルコシダーゼを添加し続ける必要があることが想定される。
【００９１】
そこでβ−グルコシダーゼの再利用が可能かどうか確認するため、微結晶セルロース（アビセル）を用い、セルロソームとＣｇｌＴを用いリサイクル反応を行った。リサイクル反応の手順を図４に示す。
【００９２】
すなわち、アビセル（微結晶性セルロース）にセルロソームとβ−グルコシダーゼを作用させ、アビセルを加水分解した後、反応液に再度アビセルを加え、アビセルに吸着した酵素を分離して再利用するものである。
【００９３】
基質となる１％アビセル、２ｍｇセルロソームと０．５ｍｇのＣｇｌＴ（５ユニット）を用い、５ｍＭ塩化カルシウムを含む１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）、６０℃にてリサイクル糖化反応をスタートした。
【００９４】
２４時間の酵素加水分解反応後、残渣を除き、反応液に再度アビセルのセルロース基質を初発濃度と同量添加し、４℃、６時間、酵素を基質に吸着させる。その後緩衝液を加え、再度、酵素加水分解反応をスタートする。２ラウンド目以降の反応にはセルロソーム及びＣｇｌＴの酵素類を加えることはせず、初発に添加した酵素で再利用可能かどうか反応を行った。
【００９５】
結果を図５に示す。ラウンド１回目においては９４％、ラウンド２回目では７５％と高いセルロース分解率を保っていたが、ラウンド３回目以降、急激に低下し、最終的にラウンド５回目では６％のセルロース分解率であった。
【００９６】
この結果はＣｇｌＴがリサイクル糖化の糖化サイクルを繰り返すことで反応系外へ流出していることを示しており、高いセルロース分解率を保つのに必要な酵素量が不足していることが理解できる。従って、高いセルロース分解率の維持を目指したリサイクル糖化を行うためには、セルロソームとＣｇｌＴとの反応中の挙動を一致させる必要があることが分かった。
【実施例３】
【００９７】
セルロソームと挙動を一致させるために、セルロソーム構造の有する特徴の一部分をＣｇｌＴに持たせることにより可能となると考えられた。特に、ＣｉｐＡが有するＣＢＭをＣｇｌＴに持たせることで、挙動を共にすることが可能であると推測できた。しかし、多くのβ−グルコシダーゼでは触媒ドメインのみのタンパク質構造を持ち、ＣｇｌＴにはセルロース結合領域はない。そこで骨格タンパク質ＣｉｐＡが有するＣＢＭを融合させたＣｇｌＴを作成した。
【００９８】
前述したように、クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４（ＮＩＴＥ ＢＰ−６２７）株ＣＢＭのアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を配列番号２に示す。
【００９９】
ＣＢＭ融合ＣｇｌＴをデザインするに当たり、Ｎ末端側にＣＢＭを融合させたタイプ（以下、ＣＢＭ−ＣｇｌＴとして示す。）とＣ末端側にＣＢＭを融合させたタイプ（以下、ＣｇｌＴ−ＣＢＭとして示す。）とをそれぞれ作成した。
【０１００】
ＣＢＭ−ＣｇｌＴの作成にあたり、ＣＢＭの増幅にはオリゴヌクレオチドプライマーＣＢＭＦ１（配列番号７に示す：５´−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＴＧＧＣＡＡＴＧＣＡＡＣＡＣＣＧ−３´）およびＣＢＭＦｕｓｉｏｎＮ（配列番号８に示す：５´−ＡＣＧＡＡＡＴＣＴＣＴＴＧＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＡＴＴＣＧＧＡＴＣＡＴＣＴＧＡＣＧＧＣＧＧ−３´）を用いた。
【０１０１】
オリゴヌクレオチドプライマーＣＢＭＦ１にはＢａｍＨＩの制限酵素サイトを付与するようにデザインし、またＣＢＭＦｕｓｉｏｎＮにはＣｇｌＴのＮ末端アミノ酸配列が一部含まれるようにデザインした。
【０１０２】
ＰＣＲは実施例１と同じ条件下、クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４株（ＮＩＴＥ ＢＰ−６２７）のゲノムＤＮＡを鋳型としＣＢＭ遺伝子断片を増幅した。
【０１０３】
ＣｇｌＴの作成にあたっては、プライマーＣｇｌＴＦｕｓｉｏｎ（Ｎ）（配列番号９に示す：５´−ＣＣＧＣＣＧＴＣＡＧＡＴＧＡＴＣＣＧＡＡＴＧＣＡＡＡＡＴＴＴＣＣＡＡＧＡＧＡＴＴＴＣＧＴＴ−３´）、および実施例１記載のＣｇｌＴＲ（配列番号４に示す）を用いた。
【０１０４】
プライマーＣｇｌＴＦｕｓｉｏｎ（Ｎ）は、ＣＢＭのＣ末端側を一部重複した形でプライマーをデザインした。それぞれ増幅したＣＢＭ遺伝子（３´側にＣｇｌＴのＮ末端アミノ酸配列をコードする遺伝子を含む。）及びＣｇｌＴ遺伝子（５´側にＣＢＭのＣ末端アミノ酸配列をコードする遺伝子を含む。）を鋳型として用い、オリゴヌクレオチドプライマーＣＢＭＦ１及びＣｇｌＴＲを用い実施例１と同じ条件においてＰＣＲ反応を行った。
【０１０５】
ＰＣＲ反応により、ＣＢＭとＣｇｌＴとが融合した約１．９ｋｂのＤＮＡ断片を得ることができた。
【０１０６】
Ｃ末端側にＣＢＭを融合させたタイプのＣｇｌＴ−ＣＢＭの作成において、ＣｇｌＴ遺伝子の増幅には実施例１記載のオリゴヌクレオチドプライマーＣｇｌＴＦ（配列番号３に示す）及びＣｇｌＴＲ−Ｆｕｓｉｏｎ（Ｃ）（配列番号１０に示す：５´−ＣＧＧＴＧＴＴＧＣＡＴＴＧＣＣＡＡＣＡＴＣＴＴＣＧＡＴＡＣＣＡＴＣＡＴＣ−３´）を用いた。
【０１０７】
オリゴヌクレオチドプライマーＣｇｌＴＲ−Ｆｕｓｉｏｎ（Ｃ）には、ＣＢＭのＮ末端側を一部重複した形でオリゴヌクレオチドプライマーをデザインした。
【０１０８】
Ｃ末端側へのＣＢＭ遺伝子の増幅においては、オリゴヌクレオチドプライマーＣＢＭ３Ｆ−Ｆｕｓｉｏｎ（Ｃ）（配列番号１１に示す：５´−ＧＡＴＧＡＴＧＧＴＡＴＣＧＡＡＧＡＴＧＴＴＧＧＣＡＡＴＧＣＡＡＣＡＣＣＧ−３´）及びオリゴヌクレオチドプライマーＣＢＭ３Ｒ、（配列番号１２に示す：５´−ＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＡＴＴＣＧＧＡＴＣＡＴＣＴＧＡＣＧＧＣＧＧＴＡＴ−３´）を用いた。
【０１０９】
オリゴヌクレオチドプライマーＣＢＭ３Ｆ−Ｆｕｓｉｏｎ（Ｃ）には、ＣｇｌＴのＣ末端側のアミノ酸配列をコードする遺伝子が一部重複した形でデザインした。
【０１１０】
オリゴヌクレオチドプライマーＣＢＭ３Ｒは、制限酵素Ｂｐｕ１１０２の切断サイトを付与するようにデザインした。
【０１１１】
それぞれ増幅したＣｇｌＴ遺伝子（３´側にＣＢＭのＣ末端アミノ酸配列をコードする遺伝子を含む。）及びＣＢＭ遺伝子（５´側にＣｇｌＴのＮ末端アミノ酸配列をコードする遺伝子を含む。）を鋳型として用い、オリゴヌクレオチドプライマーＣｇｌＴＦ及びＣＢＭ３Ｆ−Ｆｕｓｉｏｎ（Ｃ）を用い、実施例１と同じ条件でＰＣＲ反応を行った。
【０１１２】
ＰＣＲの結果、ＣｇｌＴとＣＢＭが融合した場合において得られる約２ｋｂのＤＮＡ断片を得ることができた。
【０１１３】
ＰＣＲで得られた２つの融合遺伝子をそれぞれＢａｍＨＩとＢｐｕ１１０２の制限酵素により切断後、精製を行い、ｐＥＴ１９ｂのＢａｍＨＩとＢｐｕ１１０２制限酵素サイト間へ挿入し、ＣＢＭ融合ＣｇｌＴ発現プラスミドを作成した。２つの発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１へ導入して形質転換を行い、それぞれ発現株を取得した。
【０１１４】
Ｎ末端側にＣＢＭを融合させたＣＢＭ−ＣｇｌＴの遺伝子配列を配列番号１３に、Ｃ末端側にＣＢＭを融合させたタイプのＣｇｌＴ−ＣＢＭの遺伝子配列を配列番号１４に示した。
【０１１５】
ＣＢＭを融合したβ−グルコシダーゼの一般的な特徴を確認するため、それぞれの組換えタンパク質を発現し精製した。精製したタンパク質は両者ともＮ末端側にヒスチジンタグが付与される構造となることから、上記記載の組換えＣｇｌＴと同様にニッケルアガロースカラムにおいてＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドになるまで精製を行った。
【０１１６】
精製したＣＢＭ融合型β−グルコシダーゼのセルロース結合能を測定するため、セルロースを使った結合能を試験した。セルロース結合能は精製タンパク質０．２ｍｇを用い、１０ｍｇアビセルを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）と混合し、４℃で一晩放置した。その後、遠心分離により上清と沈殿（すなわち、セルロース）を分離したのち、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で３回洗浄を行った。再度遠心分離により沈殿を回収したのち、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で懸濁し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。
【０１１７】
ＣｇｌＴと比較した場合、ＣＢＭ−ＣｇｌＴ及びＣｇｌＴ−ＣＢＭともに沈殿画分に精製タンパク質と同一のバンドが認められたが、ＣｇｌＴは上清及び緩衝液洗浄画分に認められたことから、この融合したＣＢＭ遺伝子はセルロース結合能を有しＣｇｌＴ内で機能していることが明らかとなった。
【０１１８】
また、β−グルコシダーゼ活性が変化しているかを確認するために、実施例１に記載した方法でＣｇｌＴ、ＣＢＭ−ＣｇｌＴ及びＣｇｌＴ−ＣＢＭのβ−グルコシダーゼ活性を測定した。結果を表１に示す。
【０１１９】
【表１】
【０１２０】
ＣｇｌＴは２５Ｕ／ｍｇタンパク質と非常に高い活性を示したのに対し、ＣＢＭ融合型のＣｇｌＴに関し、ＣＢＭ‐ＣｇｌＴにおいては４Ｕ／ｍｇタンパク質、ＣｇｌＴ‐ＣｇｌＴでは２ユニット／ｍｇタンパク質と劇的なβ−グルコシダーゼ活性の低下を招いた。これはＣＢＭを融合したことによる立体構造変化により、酵素触媒部分へ影響したものと考えられた。
【０１２１】
ＣＢＭ−ＣｇｌＴ又はＣｇｌＴ−ＣＢＭをセルロソームと併用した際に、β−グルコシダーゼの活性が低下の影響を確認するため、セルロース分解率を測定した。
【０１２２】
反応条件は１％アビセルを用い、上記記載の緩衝液と条件を用いて測定を行った。結果を図６に示す。
【０１２３】
図中、黒三角印がセルロソームのみでの反応、白丸印がセルロソームとＣｇｌＴを併用した反応、白四角印がセルロソームとＣＢＭ−ＣｇｌＴを併用した反応、黒四角印がセルロソームとＣｇｌＴ−ＣＢＭを併用した反応である。
【０１２４】
セルロソームのみでは７２時間後に約６０％のセルロース分解率しか得られず、セロビオース蓄積による反応阻害が生じていることが分かる。
【０１２５】
セルロソームとＣｇｌＴの併用では阻害が解除され、ほぼ１００％のセルロース分解率を得ることができる。一方、ＣＢＭ融合ＣｇｌＴでは、上記に示したβ−グルコシダーゼ活性の低下から考察して、セルロソームのみのセルロース分解率、もしくは若干の効果しか得られないだろうと考えられたが、驚くことにＣｇｌＴと同様にほぼ１００％のセルロース分解率を得ることができた。
このことは、一般的なβ−グルコシダーゼ基質として使用されるｐ−ニトロフェノールグルコピラノシドではうまく活性を示せないが、セルロース存在下においてはＣＢＭの機能により活性が復帰することが明らかとなった。したがって、ＣＢＭをＣｇｌＴと融合させるデメリットは人工基質を使用した際の活性低下に限定されることになる。
【０１２６】
なお、Ｎ末端側及びＣ末端側のどちらにＣＢＭを融合したＣｇｌＴを用いても、セルロソームとの併用においてセルロース分解率に差異は無いことから、以降の実施例においてはＣＢＭ−ＣｇｌＴを使用することにした。
【実施例４】
【０１２７】
実際にＣＢＭ−ＣｇｌＴを用いセルロソームと共に挙動を一致させることができるかどうかを確認するために、シグマセルを用いて図４に準じてリサイクル糖化反応を行った。反応条件は実施例２と同じ条件、すなわち、１％シグマセルと２ｍｇセルロソームと０．５ｍｇ ＣＢＭ−ＣｇｌＴ（０．８ユニット）を用い、５ｍＭ塩化カルシウムを含む１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）、６０℃にてリサイクル糖化反応をスタートした。結果を図７に示す。
【０１２８】
セルロソーム及びＣＢＭ−ＣｇｌＴを併用することにより、初回から９０％以上のセルロース分解率を維持しながら、少なくとも５回繰り返し利用することが可能であることが明らかとなった。この結果はセルロソームのＣＢＭをβ−グルコシダーゼのような補助酵素に融合させることで、反応中の挙動を同じくさせ、補助酵素自身もセルロソームと同じく回収が可能になることを示しており画期的である。
【０１２９】
リグノセルロース系バイオマスにおいてもセルロソーム及びセルロース結合モジュール融合β−グルコシダーゼを併用するリサイクル糖化法が有効か確認するため、前処理を行った稲わらを用いてリサイクル糖化反応を行った。
【０１３０】
前処理としてアンモニア浸漬を行った。アンモニア浸漬は乾燥稲わらを１０ｇに１０倍量の２８％アンモニア水溶液を加え、密閉容器に入れて６０℃で７日間放置した。その後、蒸留水により中性になるまでよく洗浄を繰り返し、水を絞ったものをアンモニア浸漬処理稲わらサンプルとした。
【０１３１】
アンモニア浸漬処理稲わらの全糖成分や量を測定するため、実施例１記載の硫酸加水分解により加水分解液を調製後、高速液体クロマトグラフィーにて測定した。
アンモニア浸漬処理稲わらを使用したリサイクル糖化法の工程を図８に示す。基本的に図４と同様のサイクルであるが、基質が１％セルロース量を含むアンモニア浸漬処理稲わらである点で異なる。また加水分解後残存する残渣を系外から除く工程を厳密に行った。残渣を系外から除くことにより、再利用回数を増やすことができる。
【０１３２】
酵素量や反応量は実施例３の条件である２ｍｇセルロソームと０．５ｍｇＣＢＭ−ＣｇｌＴ（０．８ユニット）を用い、５ｍＭ塩化カルシウムを含む１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）、６０℃にてリサイクル糖化反応をスタートした。結果を図９中の「前処理のみ」と記載したレーンに示した。初回ラウンドでは９０％以上のセルロース分解率を示したものの、２ラウンド目以降、急激にセルロース分解率の低下が認められ、３ラウンド目では約１２％のセルロース分解率まで低下した。反応溶液中のタンパク質量の測定によれば、反応開始後から急激に反応溶液中のタンパク量が低下していることから、アンモニア浸漬処理稲わらによる酵素の非特異的吸着が生じていることが分かった。
【０１３３】
非特異的吸着を抑制させるために、非特異的吸着を起こすと考えられるリグノセルロース系バイオマスのリグニンを含む酸不溶な成分部位を何らかの方法でコーティングさせることでリサイクル糖化を持続させることができるか検討を行った。
【０１３４】
セルロソームとＣＢＭ−ＣｇｌＴの併用により反応スタートする前に、一度ブロッキング処理として、各種タンパク質や界面活性剤により浸漬を行ったアンモニア浸漬処理稲わらを用いた。このリサイクル工程図を図１０に示す。
【０１３５】
ブロッキング処理方法は、前処理したバイオマス１ｇあたり０．２重量％溶液で４℃又は、室温にて６時間〜１５時間浸漬処理を行った。また蒸留水に不溶なブロッキング試薬は薄い酸やアルカリ溶液により溶解したものを用いた。この工程を繰り返す際に添加するブロッキング済みアンモニア浸漬処理稲わらのセルロース含量は先のブロッキング処理無の工程と同じである。
【０１３６】
コーティング剤として、タンパク質ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（シグマ・アルドリッチ社製）、ゼラチン（和光純薬社製）、スキムミルク（和光純薬社製）、大豆タンパク質（和光純薬社製）や培地成分であるペプトン（ディフコ社製）、ポリペプトン（ディフコ社製）、アミノ酸であるアルギニン（シグマ・アルドリッチ社製）、各種界面活性剤［Ｔｗｅｅｎ ２０，８０（和光純薬社製）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ（和光純薬社製）、ＳＤＳ（和光純薬）及び高分子ポリマー［ＰＥＧ４００−ＰＥＧ２００００（和光純薬社製）］を用いた。
【０１３７】
タンパク質においては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やスキムミルク、カゼイン、界面活性剤では非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０やＴｗｅｅｎ８０、及び高分子ポリエチレングリコール（ＰＥＧ２００００）に高いセルロース分解率を維持したままでのリサイクル回数継続の効果が認められた。特にスキムミルク、カゼイン、Ｔｗｅｅｎ８０により前処理稲わらをコーティング処理することで９０％以上の高いセルロース分解率を３ラウンドまでリサイクル工程を繰り返せることが分かった。
【実施例５】
【０１３８】
セルロソームとＣＢＭ−ＣｇｌＴの併用によるリサイクル糖化法とブロッキング処理を用いた組み合わせによる糖化方法は、稲わら以外のリグノセルロース系バイオマスにおいても効果があるかを試験するため、上記記載のアンモニア浸漬処理稲わらの他に、アルカリ蒸解処理した杉パルプ、使用済みオフィス紙（水洗のみ）を用いてリサイクル糖化試験を行った。
【０１３９】
アルカリ蒸解処理杉パルプの調製は、杉チップあたり酸化ナトリウム換算で２３％となるように水酸化ナトリウムを加え、耐圧容器中で１７０℃、３時間反応を行った。その後、十分に水洗し、亜塩素酸（対パルプ当たり３．５％）により６０℃、３０分間で漂白処理を行った。さらに対杉パルプ当たり４％水酸化ナトリウムで６０℃、３０分間処理を行い中性になるまで水洗を繰り返したものを使用した。
【０１４０】
オフィス紙は、使用済みオフィス紙（再生紙）をシュレッダーにより裁断後、蒸留水により１時間洗浄したものを使用した。
【０１４１】
カゼイン及びツイーン８０によるブロッキング処理の場合、実施例４記載の方法と同様に各セルロース系バイオマスに対して処理を行いリサイクル糖化反応に使用した。
【０１４２】
糖化反応における酵素濃度は実施例４と同じく、２ｍｇセルロソームと０．５ｍｇ ＣＢＭ−ＣｇｌＴ（０．８ユニット）を用い、５ｍＭ塩化カルシウムを含む１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）、６０℃にてリサイクル糖化反応をスタートした。結果を図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｃに示す。
【０１４３】
図１１Ａ〜図１１Ｃの結果から、セルロソームとＣＢＭ−ＣｇｌＴとの併用によるリサイクル糖化反応において、前処理のみでは、アンモニア浸漬処理稲わらでは２ラウンド目から、アルカリ蒸解杉パルプ、オフィス紙では３回目から急激なセルロース分解率の低下が見られ、その後のサイクルも低下していることが分かる。一方、カゼインやツイーン８０によるブロッキング処理によりアンモニア浸漬処理稲わらでは４回、アルカリ蒸解杉パルプでは５回のサイクルでも７０％以上の高いセルロース分解率を保ったままリサイクル糖化できることが明らかとなり、稲わら以外の他のバイオマスにおいても本リサイクル糖化方法は適応可能であることが示された。
【０１４４】
セルロース系の基質がブロッキング処理を施されたリグニンを含むセルロース系バイオマスである場合、酵素のリサイクル回数を増加させるためには、加水分解後残存する残渣を系外から除くことも大切である。残渣を系外から除かない場合と、除いた場合の再利用回数を比較するため、残渣を残したままでのカゼインでブロッキングしたアンモニア浸漬した稲わらを用いた際のセルロース分解率を図１２に示す。
【０１４５】
残渣を反応系内に残すことにより、リサイクル回数に伴う糖化効率の低下が認められる。この現象は、系内に残ったブロッキング処理したセルロース系バイオマスと酵素複合体の反応が進むことで、ブロックした場所以外の酵素非特異的吸着部分が露出し始め、系内で働いている酵素を奪うために、再利用を継続すると糖化効率が低下してくるものと考えられる。
【実施例６】
【０１４６】
セルロソームのように酵素複合体になっておらず、個々のフリーの酵素によりリグノセルロースを分解する作用メカニズムを持つカビ酵素においても、本方法で示したリサイクル糖化工程により酵素リサイクル反応が可能であるかどうかを確認するための試験を行った。試験においては、市販カビ酵素を用い前処理稲わらでの前処理のみ稲わらや、ブロッキング処理後のリサイクル糖化能に関して同様に検討を行った。
【０１４７】
市販酵素としてトリコデルマ・リーゼイ由来セルラーゼ（シグマ・アルドリッチ）、またカビβ−グルコシダーゼとして実施例１記載のアスペルギルス・ニガー由来を使用した。リサイクル糖化の反応として、市販セルラーゼ酵素２ｍｇ、β−グルコシダーゼ０．５ｍｇ、１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、５０℃の条件で、図８及び図１０に示したようにリサイクル糖化反応をスタートした。結果を図１３に示す。
【０１４８】
アンモニア浸漬処理稲わらでは、セルロソームとＣＢＭ−ＣｇｌＴの併用でのリサイクル糖化による傾向と同様に１ラウンド目のセルロース分解率は９０％以上であるが、２ラウンド目以降急激にセルロース分解率の低下が認められ、その基質であるアンモニア浸漬処理稲わらによる酵素の非特異的吸着が起こっていることが示唆された。
【０１４９】
一方、セルロソームリサイクル糖化において効果のあった、カゼインやツイーン８０でブロッキング処理を行った前処理稲わらでは、２ラウンド目からブロッキング処理なしの時と同様にセルロース分解率が急激に低下する現象が認められた。このことはカビ酵素では単に基質への非特異的吸着で酵素回収不能になっているだけでなく、糖化に重要な酵素が、回収されず系外へ消失していることが示唆された。これらの結果は、カビ酵素のような個々の酵素が遊離した状態でそれぞれ働く糖化酵素の場合、本発明で示しているリサイクル糖化法は不適であり、セルロソームのような必要な酵素がセットとなっている酵素複合体を用いることが重要であることが明らかとなった。
【実施例７】
【０１５０】
ブロッキング処理したセルロース系バイオマスではなく、セルロソームに各種タンパク質、高分子ポリエチレングリコール又は界面活性剤を少量添加しても効果があるかを確認した。
【０１５１】
セルロソーム酵素画分及びβ−グルコシダーゼ（ＣＢＭ−ＣｇｌＴ）に対し０．２％（容量％）の濃度でカゼイン又はスキムミルクをそれぞれ添加した。このブロッキング剤を含む酵素溶液を用い、ブロッキング処理なしのアンモニア浸漬稲わら及びアルカリ蒸解処理杉パルプを用い、実施例３と同じ条件で酵素リサイクル試験を行った。
【０１５２】
結果を図１４に示す。カゼイン又はスキムミルクを添加した酵素溶液は、添加のない酵素溶液に比べ、再利用回数の増加が認められ、少なくとも３回目まで９０％以上の糖化効率を維持することができた。セルロース系バイオマスにブロッキング処理した場合と同じ効果を示すことが明らかとなった。
【実施例８】
【０１５３】
嫌気性細菌由来の酵素利用の場合、酵素が働く環境も嫌気性であることから、通常のジチオトレイトール（ＤＴＴ）や２−メルカプトエタノールなどの還元剤を少量添加し酵素反応させることがある。セルロソームも古くから反応溶液に５〜１０ｍＭ程度のジチオトレイトールを添加して酵素反応を行わせてきた（非特許文献３）。そこで、上記記載のブロッキング剤を含んだ酵素溶液にＤＴＴを１０ｍＭ加えて上昇効果があるかどうかを確認した。
【０１５４】
結果を図１５に示す。再利用の都度、糖化効率が減少しており、３回目の再利用で糖化効率は最初に比べ５０％以上低下している。
【０１５５】
この現象は、還元作用のある他の２−メルカプトエタノール、システインやアスコルビン酸の添加でも２回目から３回目において糖化効率の低下という現象を示した。したがって、上記酵素再利用においては、ＤＴＴなど還元作用の持つ化合物剤を除くことが重要であることが明らかとなった。
【受託番号】
【０１５６】
ＮＩＴＥ ＢＰ−６２７（クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４株）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素を利用した基質の変換反応において、反応終了後の反応溶液から酵素を回収して再利用するリサイクル技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
バガス、稲わら、籾殻、キノコ廃床、堆肥、木材チップ等のセルロース系バイオマスが食糧生産を圧迫しないエネルギーや化学工業の原料資源として注目されている。特に、セルロース系バイオマスの燃料エタノールへの変換においては、発酵原料を効率良く糖化する技術が切望されている。
【０００３】
しかし、セルロース系バイオマスはでん粉に比べて糖化技術の難易度が高い。これは、セルロース系バイオマスの構成主体であるセルロースが堅固な結晶構造を持つ難分解性の高分子多糖であることによる。
【０００４】
セルロース系バイオマスの糖化方法には、物理的糖化、化学的糖化及び酵素糖化の３つの方法がある。
【０００５】
物理的糖化処理はボールミルや振動ミル又は蒸煮爆砕や加圧熱水処理など物理的に糖化を施す処理があるが、物理的な処理は多大なエネルギーを必要とするため、化学的糖化や酵素糖化の前処理として併用されることが多い。
化学的糖化処理は、アルカリ、酸を利用するものがあるが、古くより酸糖化がよく用いられている。酸糖化には濃硫酸糖化法と希硫酸二段糖化法とがあるが、何れも硫酸を用いるため、廃棄物処理や環境負荷の低減を必要とし、低コスト化及びエネルギー変換効率に限界があるといわれている。
【０００６】
酵素糖化は、酸糖化に比べ、廃液回収や処理の負担が軽く、耐薬設備等の設備コストを低減できること、過分解が起こらずに糖の収率が高い等の利点があるため、澱粉質を多く含むバイオマスの酵素糖化で実用化されている。ところが、セルロース系バイオマスは、前述したように、セルロースが結晶構造を有していること及び結晶性セルロースをヘミセルロースやリグニンが取り囲んだ複雑な構造を有しているため、でん粉系に比べ、酵素糖化がきわめて困難である。したがって、酵素による糖化処理前に、物理的あるいは化学的前処理による結晶構造の破壊等の前処理や大量のヘミセルラーゼやセルラーゼを併用しているのが現状である。
【０００７】
ヘミセルラーゼやセルラーゼに関しては好気性糸状菌トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来の糖化酵素が工業的に使用されているため、セルロース系バイオマスの糖化においても、トリコデルマ属菌の研究が活発に行われてきた（特許文献１参照）。
【０００８】
近年、ある種の嫌気性微生物が、セルロースを効率よく分解できる酵素複合体セルロソーム（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｏｍｅ）を生産することが明らかとなった。
【０００９】
セルロソームは、骨格となるタンパク質をベースに多数の高分子多糖分解酵素が結合した構造を有し、これらの複数の酵素が共同してセルロースに作用することで、非常に高い高分子多糖の分解活性を示すことが解明されている（非特許文献１及び２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００７−３１９０４０号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ． ２００５ Ｍａｒ；６９（１）：１２４−５４
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． ２００４ Ｓｅｐ １５；３８２（Ｐｔ ３）：７６９−８１．
【非特許文献３】Ｊｏｈｎｓｏｎ ＥＡ， Ｓａｋａｊｏｈ Ｍ， Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ Ｇ， Ｍｅｄｉａ Ａ， Ｄｅｍａｉｎ ＡＬ （１９８２） Ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｂｙ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ ｆｒｏｍ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４３：１１２５−１１３２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
トリコデルマ・リーセイ由来の酵素は、基質の分解速度が遅いため、実用化に際し、大量の酵素を必要とすることが指摘されている。
【００１３】
セルロソームは、高分子多糖の最終産物であるセロビオースの蓄積により酵素活性が阻害されるため、反応後期に糖化効率が低下するという問題がある。
【００１４】
本発明は、セルロースの糖化分解において、酵素活性を低下させることなく、また、酵素を再利用することにより酵素の使用量を減少させることを目的とする。
本発明は、また、セルロースの糖化分解において繰り返し利用することが可能な酵素を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らはセルロソームがセルロース結合モジュールを有することに着目し、鋭意研究を行ったところ、セルロース結合モジュールを融合させたセルロソームを有する酵素をセルロースに結合させることで、酵素を反応系から容易に分離でき、かつ酵素活性を低下させることなく分離した酵素を再利用できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
本発明の酵素の再利用方法は、セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素をセルロース系の基質に結合させ、セルロース系の基質に結合した酵素を再利用することを特徴とする。
本発明の酵素は、β−グルコシダーゼ活性を示す領域とセルロースに結合可能なモジュールとを含むβ−グルコシダーゼ及びキメラβ−グルコシダーゼである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の方法により、酵素反応系に存在する酵素が反応系外に排除されることが少なくなるため、効率的に酵素を分離回収することが可能となる。したがって、再利用するたびに新たに酵素を添加する必要がなく、酵素の使用量を減少させることが可能となる。特に、酵素反応系に複数種類の酵素が存在する場合、セルロース系基質に酵素が結合するため、複数種類の酵素を一括して分離することができるので、再利用にあたり、特定の酵素活性だけが失われることもなくなる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明に従う実施形態１の酵素の再利用方法のフロー図である。
【図２】実施形態２の酵素の再利用方法のフロー図である。
【図３】クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４からのセルロソームとサーモアナエロバクター・ブロッキＡＴＣＣ３３０７５からのβ−グルコシダーゼ（ＣｇｌＴ）併用によるアビセル分解能への影響を示す図である。
【図４】アビセルに対するセルロソームとＣｇｌＴ併用によるリサイクル糖化法の工程を示す図である。
【図５】セルロソームとＣｇｌＴ併用リサイクル糖化反応によるラウンドごとのアビセル分解率を示す図である。
【図６】セルロース結合モジュール融合キメラβ−グルコシダーゼ（ＣＢＭ−ＣｇｌＴ及びＣｇｌＴ−ＣＢＭ）とセルロソーム併用によるアビセル分解能への影響を示す図である。
【図７】セルロソームとＣＢＭ−ＣｇｌＴ併用によるリサイクル糖化反応によるラウンドごとのアビセル分解効率を示す図である。
【図８】リグノセルロース系バイオマスを用いる際のセルロソームとＣＢＭ−ＣｇｌＴ併用によるリサイクル糖化法の工程を示す図である。
【図９】アンモニア浸漬処理稲わら及び、各ブロッキング処理を行ったアンモニア浸漬処理稲わらに対するリサイクル糖化によるセルロース分解率の比較を示す図である。
【図１０】ブロッキング処理リグノセルロース系バイオマスを用いる際のセルロソームとＣＢＭ−ＣｇｌＴ併用によるリサイクル糖化法の工程を示す図である。
【図１１Ａ】ブロッキング処理を行った稲わらを用いたリサイクル糖化によるセルロース分解率の比較を示す図である。
【図１１Ｂ】ブロッキング処理を行った杉パルプを用いたリサイクル糖化によるセルロース分解率の比較を示す図である。
【図１１Ｃ】ブロッキング処理を行った使用済みオフィス紙を用いたリサイクル糖化によるセルロース分解率の比較を示す図である。
【図１２】残渣を残したままでのカゼインでブロッキングしたアンモニア浸漬した稲わらを用いた際のセルロース分解率を示す図である。
【図１３】市販カビセルラーゼとカビβ−グルコシダーゼを併用した稲わらのリサイクル糖化の効果を示す図である。
【図１４】セルロソーム及びβ−グルコシダーゼ（ＣＢＭ−ＣｇｌＴ）にブロッキング剤を添加したリサイクル糖化の結果を示す図である。
【図１５】セルロソーム酵素反応系にＤＴＴを含むリサイクル糖化の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を幾つかの実施の形態並びに実施例に基づいて詳細に説明する。
【００２０】
［実施形態１］
本実施形態１は、セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素をセルロース系の基質に結合させ、セルロース系の基質に結合した酵素を再利用する方法である。
【００２１】
詳細には、本実施形態は、図１に示すように、セルロースに結合可能なモジュール（Ｃａｒｂｏｈｙｄｏｒａｔｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｏｄｕｌｅ、以下、ＣＢＭと略記する。）を有する酵素（以下、ＣＢＭを有する酵素という。）と酵素特異的な基質との酵素反応液にセルロース系の基質を添加し、ＣＢＭをセルロース系の基質に結合させた後、酵素反応液からＣＢＭを分離し、分離されたＣＢＭに酵素特異的な基質を加える操作を繰り返し行う、酵素の再利用方法である。
【００２２】
言い換えるならば、本実施形態のＣＢＭを有する酵素を再利用する方法は、ＣＢＭを有する酵素と酵素特異的な基質との酵素反応液にセルロース系の基質を加え、セルロース系の基質にＣＢＭを有する酵素を結合させる第一ステップと、ＣＢＭを有する酵素を酵素反応液から分離する第二ステップと、分離したＣＢＭを有する酵素に酵素特異的な基質を加えて反応させる第三ステップとからなり、第一ステップから第三ステップを繰り返すことにより、ＣＢＭを有する酵素を再利用するものである。
【００２３】
ＣＢＭとは、セルロース結合モジュール（Ｃａｒｂｏｈｙｄｏｒａｔｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｏｄｕｌｅ）を意味し、非特許文献２に記載されるように、疎水的結合、静電的結合、水素結合、又はカルシウムやマグネシウムなど無機のカチオンを介して生化学的に多糖質、セルロース又はヘミセルロースへ結合できるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指している。したがって、ＣＢＭを有する酵素とは、ＣＢＭを酵素のアミノ酸配列中に含む酵素である。
【００２４】
セルロソームはセルラーゼ複合体であって、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、クロストリジウム・セルロボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）、クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ジョースイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｊｏｓｕｉ）、クロストリジウム・アセトブティリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム・セロビオパルム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｏｂｉｏｐａｒｕｍ）、クロストリジウム・パピロソルベンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｐｙｒｏｓｏｌｖｅｎｓ）、ルミノコッカス・アルブス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ）、ルミノコッカス・フラベファシエンス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ）、アセトビブリオ・セルロリティクス（Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、バクテロイディス・セルロソルベンス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃｅｌｌｕｌｏｓｏｌｖｅｎｓ）、ブチリビブリオ・フィブリソルベンス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ）に属する菌等が産生することが知られている。上記セルロソーム生産菌の天然由来のグルコシダーゼにおいて、セルロースに結合するＣＢＭのような領域が存在することは知られていない。
【００２５】
つまり、ＣＢＭを有する酵素とは、ＣＢＭのアミノ酸配列を含む様々な酵素活性を有する酵素であって、遺伝子組み換えによりＣＢＭが結合されたキメラ酵素を含むものである。酵素の酵素活性は、特に限定されるものでなく、セルラーゼ活性、ヘミセルラーゼ活性、アミラーゼ活性、グルコシダーゼ活性等、様々な機能を有するものであってよい。
【００２６】
ＣＭＢのアミノ酸配列の例として、配列表番号１にクロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４（ＮＩＴＥ ＢＰ−６２７）株ＣＢＭのアミノ酸配列を示すが、これに限定されるものではない。例えば、カルボハイドレイト・アクティブエンザイムデータベース（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ ｅｎＺＹｍｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ／）から糖質結合モジュールファミリー分類（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｏｄｕｌｅ ｆａｍｉｌｙ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に属するＣＢＭを用いることができる。好ましくは、そのモジュールファミリー分類表の中でもファミリー３に属するＣＢＭが良い。
【００２７】
ＣＢＭを有するキメラ酵素は、セルラーゼ活性、ヘミセルラーゼ活性、アミラーゼ活性、グルコシダーゼ活性等、様々な機能の少なくとも１つを備える酵素であって、天然由来の酵素の遺伝配列のＣ末端又はＮ末端又は中央部分等、いかなる部分にもＣＢＭをコードする遺伝子を融合した遺伝子を含む形質転換体を培養して得ることができる。
【００２８】
ＣＢＭをコードした遺伝子は、例えば、セルロソームを生産するクロストリジウム属微生物として、先に述べたクロストリジウム・サーモセラムやクロストリジウム・セルロボランスから得ることができる。配列番号２にクロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４（ＮＩＴＥ ＢＰ−６２７）株ＣＢＭのアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を示す。ＣＢＭのアミノ酸配列同様、ＣＢＭのアミノ酸配列をコードする遺伝子配列は、配列表番号２の遺伝子酸配列に限定されるものではない。
【００２９】
ＣＢＭを有する酵素は、酵素反応系に供給されたセルロース系基質に結合する。セルロース系基質は、水不溶性であるため、ＣＢＭを有する酵素は、水不溶性物質に固定されることになる。次いで、反応生成物とセルロース系基質に結合した酵素とを分離する。ＣＢＭを有する酵素は、水不溶性物質に固定化されるので、固液分離等の簡易な手段で容易に酵素反応系から効率よく回収することができる。そして、分離して得られたセルロース系基質に結合したＣＢＭを有する酵素に新たな酵素特異的な基質を加えることで、ＣＢＭを有する酵素を繰り返し再利用することが可能となる。
【００３０】
酵素特異的な基質がセルロース系基質と同じである反応系においては、セルロース系基質が糖類に分解されるため、反応が終了する都度、セルロース系基質を酵素反応系に酵素供給して、ＣＢＭを有する酵素をセルロース系基質に結合させる。なお、反応系に残渣がある場合には、セルロース系基質を供給する前に残渣を除去しておくことが望ましい。
【００３１】
酵素特異的な基質とセルロース系基質とが異なる物質である場合には、酵素反応を効率よく行うために、セルロソーム又はセルラーゼ等のセルロース分解酵素を酵素反応系に存在させてもよい。セルロース分解酵素とＣＢＭを有する酵素とを併用する場合には、反応が終了する都度、セルロース系基質を酵素反応系に供給する必要がある。
【００３２】
このようにして、酵素反応系からＣＢＭを有する酵素を分離して再使用することで、新たな酵素を酵素反応系に追加する必要が無くなる。
【００３３】
なお、セルロースに結合可能なモジュールを有する様々な活性をもった酵素を複数酵素反応系に存在させてもよい。すなわち、酵素反応系に存在する複数の酵素をセルロース系基質に結合させて、酵素反応液から分離することで、複数の酵素を再利用することが可能となる。
【００３４】
［実施形態２］
本実施形態２は、セルロソームとＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼとを用いた、両酵素の再利用方法である。実施形態１とは、ＣＢＭを有する酵素をセルロソームとＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼとを含む２種類の酵素に特定した点で相違する。
【００３５】
セルロース系のバイオマスをセルロソームにより糖化する場合、セルロソームは、その最終産物であるセロビオースにより酵素活性が阻害され、セルロース系バイオマスを効率よくセロビオース又はオリゴ糖へ分解することができないことが知られている。
【００３６】
本発明者らがセルロース系バイオマスのセルロソームを用いた糖化反応において、セロビオースを酵素反応系から除去するために、β−グルコシダーゼを併存させたところ、最初はセルロース分解効率が改善されていても、繰り返し利用するとセルロース分解効率が低下してしまうことを見出した。この原因は、再利用を繰り返すことにより、好熱嫌気性細菌由来のβ−グルコシダーゼが失われるためと考えられた。
【００３７】
そこで、セルロソームとβ−グルコシダーゼとを併用する場合の酵素反応効率の低下を抑制するために、ＣＢＭをβ−グルコシダーゼのＣ末端又はＮ末端に融合したキメラβ−グルコシダーゼを用いたところ、繰り返し利用によってもセルロース分解効率は低下しないことを見出した。
【００３８】
すなわち、本実施形態の方法は、セルロース系の基質とＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼとセルロソームとを含有する酵素反応液にセルロース系の基質を加えて、ＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼ及びセルロソームをセルロース系の基質に結合させ、セルロース系の基質に結合したＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼ及びセルロソームを反応系から分離して、基質に結合したＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼ及びセルロソームを再利用することを特徴とする。
【００３９】
図２に本実施形態の酵素の再利用方法のフローを示す。
すなわち、本実施形態の酵素の再利用方法においては、セルロース系の基質と、ＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼと、セルロソームとを含有する酵素反応液にセルロース系の基質を加え、セルロース系の基質にセルロソーム及びＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼを結合させる第一ステップと、セルロース系の基質に結合したＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼ及びセルロソームを分離する第二ステップと、分離したＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼ及びセルロソームにセルロース系の基質を加えて反応させる第三ステップとを含み、第一ステップから第三ステップを繰り返すことで、β−グルコシダーゼ及びセルロソームを再利用するものである。
【００４０】
セルロソームは、クロストリジウム属菌が産生するものであり、例えば、クロストリジウム・サーモセラムやクロストリジウム・セルロボランスに属する菌が産生するものを用いることができる。
【００４１】
本発明で使用するβ−グルコシダーゼは、一般的に酵素番号３．２．１．２１（ＥＣ３．２．１．２１）に定義されるセロビオースをグルコース２分子へ変換可能な酵素の触媒を有する酵素を意味する。
【００４２】
ＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼとは、ＣＢＭを融合したキメラβ−グルコシダーゼである。β−グルコシダーゼはカビ由来の酵素でもよいが、好ましくは好熱性細菌由来の酵素が望ましい。カビ由来のβ−グルコシダーゼを用いた場合、再利用の回数が好熱性細菌由来のβ−グルコシダーゼに比べ減少するからである。
【００４３】
β−グルコシダーゼとしては、使用するセルロソームの反応条件に近似し、グルコシダーゼ活性も持っているものであればいかなる生物由来のものを使用してもよい。例えば、クロストリジウム・サーモセラム由来のセルロソームを使用する場合、至適温度が５０℃〜８０℃、至適ｐＨが、５〜９の範囲で活性を有しているβ−グルコシダーゼと共に反応させることが考えられる。
【００４４】
利用可能なβ−グルコシダーゼは、微生物由来のアミノ酸配列を有するものが好ましい。使用するセルロソームの反応条件にも依存するが、クロストリジウム・サーモセラムからのセルロソームを使用する場合は、特に好熱性細菌由来のβ‐グルコシダーゼを用いることが好ましい。具体的な例を上げれば、好熱性細菌由来のβ−グルコシダーゼとしては、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｓｐｏｒａ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ、Ｔｈｅｒｍｕｓ、Ｔｏｌｕｍｏｎａｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ａｃｉｄｕｌｉｐｒｏｆｕｎｄｕｍ、Ｃａｌｄｉｖｉｒｇａ、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｅｒａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｅｒａ属由来のものを用いることができる。この他にもファミリー１、３、９、３０、１１６に属する酵素を生産する菌であれば用いることが可能である。
【００４５】
なお、β−グルコシダーゼとしては、上記以外の酵素として、カルボハイドレイト・アクティブエンザイム・データベース（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ ｅｎＺＹｍｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ／）に記載の糖質分解酵素ファミリー分類（Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆａｍｉｌｙ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に記載のある分類ファミリー１、３、９、３０、１１６に属するタンパク質を用いることが可能である。
【００４６】
なお、β−グルコシダーゼは、上述した微生物由来のアミノ酸配列に限定されるものではなく、微生物由来のアミノ酸配列と６０％程度のホモロジーがあるものを用いることができる。遺伝子組み換えの分野において、同一の機能を有するタンパク質となることが一般的に知られており、配列番号１と６０％程度のホモロジーを有するアミノ酸配列は本発明の範囲に含まれるものである。
【００４７】
好熱性細菌由来のβ−グルコシダーゼと融合するＣＢＭは、併用するセルロソームのＣＢＭと同じアミノ酸配列のものを用いるのが好ましい。これは、同じアミノ酸配列のＣＢＭとすることで、セルロースとβ−グルコシダーゼのセルロースへの結合挙動が同じになり、両酵素の反応系からの分離が容易になるからである。
【００４８】
なお、セルロソーム及びセルロースに結合可能なモジュールを有するβ−グルコシダーゼ以外にも、セルロースに結合可能なモジュールを有し、様々な活性を有する酵素を複数酵素反応系に存在させてもよい。
酵素反応系に存在する複数の酵素をセルロース系基質に結合させて、酵素反応液からセルロース系基質に結合した酵素を分離する。セルロース系基質に結合した酵素の糖化効率は低下することなく繰り返し利用することができるので、複数の酵素を再利用することが可能となる。
【００４９】
嫌気性菌由来の酵素であるセルロソームに関し、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）や２−メルカプトエタノールなどの還元剤を反応系に存在させることが知られている（非特許文献３）。本実施形態の方法において、セルロース系の基質にセルロソーム及びＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼを反応するうえにおいて、還元剤を存在させてもよいが、酵素を繰り返し使うと糖化効率が低下することがある。したがって、還元剤は反応系に存在させないほうが好ましい。
【００５０】
［実施形態３］
本実施形態３は、セルロース系の基質がリグニンを含むセルロース系バイオマスである点で、実施形態２と異なる。
【００５１】
すなわち、本実施形態の方法は、リグニンを含むセルロース系バイオマスと、ＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼと、セルロソームとの酵素反応液にリグニンを含むセルロース系バイオマスを加えてＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼ及びセルロソームを、リグニンを含むセルロース系バイオマスに結合させて反応させ、反応系からセルロース系バイオマスに結合したＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼ及びセルロソームを分離して、セルロース系バイオマスに結合したＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼ及びセルロソームを繰り返し利用することを特徴とする。
【００５２】
言い換えれば、本実施形態の酵素の再利用方法においては、リグニンを含むセルロース系バイオマスと、ＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼと、セルロソームとの酵素反応液にリグニンを含むセルロース系バイオマスを加え、リグニンを含むセルロース系バイオマスにセルロソーム及びＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼを結合及び反応させる第一ステップと、リグニンを含むセルロース系バイオマスに結合したＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼ及びセルロソームを反応系から分離する第二ステップと、分離したＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼ及びセルロソームにリグニンを含むセルロース系バイオマスを加えて反応させる第三ステップと、を含み、第一ステップから第三ステップを繰り返すことで、β−グルコシダーゼ及びセルロソームを再利用するものである。
【００５３】
ここで、リグニンを含むセルロース系バイオマスは、事前に前処理としてアンモニア浸漬処理を行っておくことが好ましく、さらに、アンモニア浸漬処理後にタンパク質、高分子ポリエチレングリコール及び界面活性剤から選択される１種以上のブロッキング剤でブロッキング処理を行っておくことが望ましい。ブロッキング処理とは、リグノセルロース系バイオマスの酸不溶な部位をコーティングする処理であり、アンモニア浸漬処理後のセルロース系のバイオマスをブロッキング剤に浸漬すればよい。具体的なブロッキング剤は、タンパク質としてスキムミルク又はカゼイン、界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ２０又はＴｗｅｅｎ８０に代表される非イオン性界面活性剤が好ましい。ブロッキング処理により植物細胞壁が有するリグニン及びリグニン−ヘミセルロース複合体、リグニン−無機物複合体等、セルロース及びヘミセルロース以外の疎水性基等の反応基とタンパク質との非特異的吸着が抑制されると考えられる。
【００５４】
本実施形態の方法において、セルロース系の基質にセルロソーム及びＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼを結合させる反応、すなわち第一ステップ及び第三ステップにおいて、還元剤を存在させてもよいが、酵素を繰り返し使うと糖化効率が低下することがある。したがって、還元剤は反応系に存在させないほうが好ましい。
【００５５】
また、リグニンを含むセルロース系バイオマスと、ＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼと、セルロソームとの酵素反応液にリグニンを含むセルロース系バイオマスを加える前に、酵素反応の残渣を除去しておくことが好ましい。残渣の除去により、再利用回数を増やすことができる。
【００５６】
［実施形態４］
本実施形態４は、セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素をタンパク質、高分子ポリエチレングリコール及び界面活性剤から選択される１種以上のブロッキング剤の存在下で、セルロース系の基質と結合及び／又は反応させる、酵素の再利用方法である。
ブロッキング剤は、セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素とセルロース系の基質との反応系に存在していればよいが、セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素をセルロース系の基質と反応させる前にブロッキング剤と接触させておくことが好ましい。接触は、例えば、セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素を含む溶液にブロッキング剤を添加すればよい。
【００５７】
具体的には、セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素を含む溶液にブロッキング剤を添加した後、セルロース系の基質を加え、セルロース系の基質にＣＢＭを有する酵素を結合させる第一ステップと、ＣＢＭを有する酵素を酵素反応液から分離する第二ステップと、分離したＣＢＭを有する酵素に酵素特異的な基質を加えて反応させる第三ステップと、からなり、第一ステップから第三ステップを繰り返すことにより、ＣＢＭを有する酵素を再利用するものである。
【００５８】
セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素を、セルロソーム及びＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼとし、セルロース系の基質及びＣＢＭを有する酵素に酵素特異的な基質を、リグニンを含むセルロース系バイオマスとする場合、反応系に還元剤を存在させてもよいが、酵素を繰り返し使うと糖化効率が低下することがあるので、還元剤を反応系に存在させないほうが好ましい。
【００５９】
また、この場合、セルロソーム及びＣＢＭを有するβ−グルコシダーゼを含む溶液にブロッキング剤を添加してから、リグニンを含むセルロース系の基質を添加し、酵素と基質とを結合及び／又は反応させることが好ましい。
【００６０】
さらに、実施例を挙げて本発明を詳しく説明する。なお、本発明は、以下に示す実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００６１】
前述したように、セルロソームは、酵素反応の最終産物であるセロビオースによって、酵素反応が阻害されてしまう。セルロソームの糖化能力を発揮させるためには、セロビオースを反応系から除去する必要がある。そこで、セロビオースをグルコースへ分解可能な酵素β−グルコシダーゼをセルロソームと併存させて、微結晶セルロース（シグマセルタイプ２０）の分解能を比較した。
【００６２】
β−グルコシダーゼとして、以下の２つの酵素を準備した。
（１）市販のアスペルギルス・ニガー由来酵素（シグマ−アルドリッチ社製）。
（２）好熱嫌気性細菌であるサーモアナエロバクター・ブロッキＡＴＣＣ３３０７５（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｂｒｏｃｋｉｉ）（アメリカンタイプカルチャーコレクション）のβ−グルコシダーゼをもとにした組換えβ−グルコシダーゼ（以下、ＣｇｌＴという）。
【００６３】
［ＣｇｌＴの作成］
サーモアナエロバクター・ブロッキからのゲノムＤＮＡは、以下の手順により抽出した。０．５％セロビオースを含むＢＭ７ＣＯ−ＣＢ液体培地を用いてサーモアナエロバクター・ブロッキを培養後、４℃にて１０，０００回転で５分間、遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体を溶菌させるために、１０％ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）を最終濃度が０．５％になるように添加するとともに、プロテナーゼＫ（１ｍｇ／ｍｌ）溶液が５μｇ／ｍｌになるように加え、３７℃で１時間反応させた。さらに１０％臭化セチルトリメチルアンモニウム−０．７Ｍ塩化ナトリウム溶液を１％濃度になるように加え、６５℃で１０分間反応させた後、等量のクロロフォルム・イソアミルアルコール溶液を加えよく攪拌し、１５，０００回転、５分間遠心分離にて水層を得た。
【００６４】
この水層にフェノール・クロロフォルム・イソアミルアルコール混液を等量加え、攪拌して再度１５，０００回転、５分間遠心分離にて水層を得た。この水層に対し０．６倍容量のイソプロパノールを加えてゲノムＤＮＡを析出させ、再度遠心分離によりゲノムＤＮＡを調製した。このゲノムＤＮＡを７０％エタノールで洗浄、乾燥した。
【００６５】
なおＢＭ７ＣＯ−ＣＢ培地の組成は、リン酸二水素カリウム１．５ｇ／Ｌ、 リン酸水素二カリウム２．９ｇ／Ｌ、 尿素２．１ｇ／Ｌ、 酵母エキス ６．０ｇ／Ｌ、 炭酸ナトリウム４ｇ／Ｌ、システイン塩酸塩０．０５ｇ／Ｌ、０．２ ｍｌミネラル溶液（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、 ５ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、 ０．７５ｇ、 ＦｅＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、 ０．００６３ｇを水４ｍｌに溶解）として調製した。また、培地に炭素源としてセロビオースを５ｇ／Ｌになるように加えた。最終的な培地のｐＨは７．０前後に調製した。
【００６６】
ＣｇｌＴは、上記調製したゲノムＤＮＡを用い、オリゴヌクレオチドプライマーＣｇｌＴＦ（配列番号３：５´−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＡＡＴＴＴＣＣＡＡＧＡＧＡＴ−３´）及び、ＣｇｌＴＲ（配列番号４に示す：５´−ＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＡＴＣＴＴＣＧＡＴＡＣＣＡＴＣＡＴＣ−３´）をデザイン、合成し、ＰＣＲにより約１．４キロベース長の二本鎖増幅ＤＮＡ配列を得た。増幅したＣｇｌＴ遺伝子配列を配列番号５に示す。
【００６７】
デザインしたオリゴヌクレオチドプライマーＣｇｌＴＦ及びＣｇｌＴＲは、大腸菌発現ベクターに挿入するため、制限酵素サイトＢａｍＨＩ及びＢｐｕ１１０２サイトを付加してある。なお、サーモアナエロバクター・ブロッキＡＴＣＣ３３０７５のβ−グルコシダーゼＣｇｌＴ遺伝子配列は、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＢＩＣ）のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じ、遺伝子配列を取得することができる（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号；ＣＡＡ９１２２０．１）。
【００６８】
ＰＣＲは、ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）により１６ｓｒＲＮＡ遺伝子の増幅を行った。ＰＣＲの条件は９８℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間、を３０サイクルの条件において増幅を行なった。
【００６９】
ＰＣＲ産物は０．８％アガロースゲル電気泳動で増幅されたバンドを確認後、キアゲンＰＣＲ精製キット（キアゲン社製）を用い精製した。精製したＰＣＲ産物はＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）及びＢｐｕ１１０２（タカラバイオ社製）を用い、３７℃で一晩、制限酵素処理を行った。
【００７０】
制限酵素処理済みＰＣＲ産物は再度０．８％アガロースゲル電気泳動により制限酵素分解産物と分離し、ゲルから目的のバンドを切り出し、ゲル抽出キット（キアゲン社製）により精製した。
【００７１】
ＣｇｌＴ遺伝子を大腸菌において発現させるため、ｐＥＴ１９ｂ発現ベクター（メルク社製）も使用した。本ベクターは発現させたい目的のタンパク質のＮ末端側に６残基のヒスチジンタグが融合されるような設計になっている。ｐＥＴ１９ｂ発現ベクターは、同じくＢａｍＨＩ及びＢｐｕ１１０２を用い、３７℃で一晩、制限酵素処理を行った。制限酵素処理後、制限酵素切断サイトの脱リン酸を行うため、アルカリフォスファターゼ（タカラバイオ社製）を５０℃で１時間処理を行った。フェノール・クロロフォルム抽出を繰り返し、アルカリフォスファターゼを失活させた後、エタノール沈殿処理を行い、制限酵素処理済みｐＥＴ１９ｂ発現ベクターを回収した。
【００７２】
ＣｇｌＴ発現ベクターを構築するため、上記制限酵素処理済みＣｇｌＴ遺伝子とｐＥＴ１９ｂ発現ベクターはＴ４ライゲース（タカラバイオ社製）により１６℃で一晩、インキュベートを行い、連結させた。その発現ベクターＣｇｌＴ−ｐＥＴ１９は大腸菌ＪＭ１０９へ一度形質転換を行い、５０μｇ／ｍｌアンピシリンナトリウムと１．５％寒天を含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地（ＬＢ培地）により３７℃で一晩培養を行った。
【００７３】
ＬＢ培地の組成を以下に示す。バクトペプトン１ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１ｇ／Ｌ、イーストエキストラクト１ｇ／Ｌ、最終的な培地のｐＨは７．０前後に調製された。
【００７４】
生育してきたコロニーから目的の発現ベクターＣｇｌＴ−ｐＥＴ１９を有するクローンを選択した。選択には大腸菌クローンからプラスミド抽出キット（キアゲン社製）を用いて発現ベクターＣｇｌＴ−ｐＥＴ１９を抽出したのち上記プライマーによりＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１（アプライドバイオシステムズ社）、ＰＲＩＳＭ（登録商標） ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）または、ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）によりＤＮＡ配列を読み取った。
【００７５】
読み取った遺伝子配列が正確かどうかを確認するため、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＢＩＣ）のホームページを通じ、得られたＤＮＡ配列データを用いて、ホモロジー検索を行なって正確性を確かめた。正確な遺伝子配列を有する発現ベクターＣｇｌＴ−ｐＥＴ１９はＣｇｌＴタンパク質を多量発現させるため、再度大腸菌ＢＬ２１（メルク社製）へ形質転換しタンパク質多量発現大腸菌クローンを得た。
【００７６】
ＣｇｌＴを得るため、発現ベクターＣｇｌＴ−ｐＥＴ１９を持つ大腸菌ＢＬ２１をアンピシリンナトリウム含有ＬＢ培地で３７℃、４時間培養を行った後、イソプロピル−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を１ｍＭの濃度を加えさらに１２時間培養を行った。
【００７７】
ＣｇｌＴ−ｐＥＴ１９を持つ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）は遠心分離（８，０００回転、４℃、１０分）により菌体を回収した。回収した菌体は一度−８０℃で一晩凍結し、溶菌緩衝液（５０ ｍＭ リン酸緩衝液、 ３００ ｍＭ 塩化ナトリウム、 １０ ｍＭ イミダゾール、 ｐＨ ８．０）に懸濁したのち、氷中において超音波破砕機により破砕した。得られた溶菌混濁液を遠心分離し、透明な溶菌液と沈殿している未破砕菌体とを分離後、溶菌液のみを回収し０．４５μｍフィルター濾過を行った。
【００７８】
その溶菌液はニッケルアガロースゲルカラム（Ｎｉ−ＮＴＡアガロースゲル；キアゲン社製）を通して、ヒスタグ融合ＣｇｌＴを得た。さらに溶出を行ったＣｇｌＴは脱塩カラム（バイオラッド社製）に通して精製した。ヒスタグ融合ＣｇｌＴのタンパク量測定は、必要に応じて蒸留水で希釈後、ＢＣＡ・タンパク測定キット（サーモサイエンティフィック社製）により測定を行った。タンパク質の検量線はウシ血清アルブミンを使用し作成した。
【００７９】
ＣｇｌＴのアミノ酸配列を配列番号６に示す。
【００８０】
［セルロソームの製造］
クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４株（ＮＩＴＥ ＢＰ−６２７）を上記したＢＭ７ＣＯ−ＣＢ培地の炭素源をセロビオースから微結晶セルロース１０ｇ／Ｌへ変更したＢＭ７ＣＯ−ＣＬ培地を用いて６日間、６０℃にて培養を行った。
【００８１】
培養後、遠心分離により菌体を除き、その培養液にアモロファスセルロース（リン酸膨潤セルロース）を加え、４℃、一晩にて攪拌しセルロソームをアモロファスセルロースに吸着させた。攪拌後、アモロファスセルロースを回収し５ｍＭ塩化カルシウムを含む１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で懸濁し、透析チューブ（１０ｋＤａカット；スペクトラ社製）に注ぎ、６０℃で蒸留水による透析を約６時間行った。なお、透析は１時間おきに新しい蒸留水に交換して行った。
【００８２】
この反応により、セルロソームにより分解されたアモロファスセルロースからの反応産物であるセロビオースやセロオリゴ糖は、透析により蒸留水へ拡散し、反応阻害を受けることなく完全に分解することができる。その結果、透析チューブ内にはセルロソームのみを簡易に回収できる。
【００８３】
得られた透析液をセルロソーム酵素画分として以降の実験に使用した。セルロソームのタンパク質量は適当な濃度へ蒸留水で希釈後、上記同様にＢＣＡ・タンパク測定キットにより測定を行った。
【００８４】
β−グルコシダーゼの活性測定は、Ｗｏｏｄ， ＷＡ．， Ｋｅｌｌｏｇ， Ｓ．Ｔ．， １９８８． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．１６０， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．に記載された、ｐ−ニトロフェノールガラクトピラノシドを基質として酵素反応により遊離してくるｐ−ニトロフェノール量を測定することにより活性（ユニット）を算出した。一分間にμモルｐ−ニトロフェノールを生成する量を１ユニット（Ｕ）の酵素活性と定義した。
【００８５】
１％シグマセルタイプ２０、５ｍＭ塩化カルシウムを含む１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）にセルロソーム０．５ｍｇ及びβ−グルコシダーゼを添加した。セルロース分解率は、一定時間おきに、サンプリングを行い、生成してくるセロビオースやグルコースをアミネックスＨＰＸ−８７Ｐカラム（バイオラッド社製）による示差屈折検出器を用いた高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製、Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ）により測定した。
【００８６】
初発糖濃度は、シグマセルタイプ２０を０．３ｇとし、７２％硫酸（重量％）を３ｍｌ加え、よく攪拌し１時間加水分解を行なった。その後、蒸留水を８０ｍｌ加え１２１℃で１時間オートクレーブをかけた後、ガラスフィルターにより濾過し、濾液を得た。この濾液を強アニオンカラムに通したのち、その一部を上記アミネックスＨＰＸ−８７Ｐカラム（バイオラッド社製）による示差屈折検出器を用いた高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製、Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ）により測定した。測定されたグルコース量は、使用したセルロース重量を参考にグルコース換算での全糖量を算出し１００％量とした。
【００８７】
セルロソームのみと、セルロソームとβ−グルコシダーゼ共存下における、微結晶セルロース分解率（％：ｗ／ｗ）の結果を図３に示す。図中の黒丸印はセルロソームのみの分解反応、黒三角印はセルロソームと市販アスペルギルス・ニガーのβ−グルコシダーゼ（０．５ｍｇ；０．９３ユニット）、黒四角印はセルロソームとＣｇｌＴ（０．０１ｍｇ；０．２４Ｕ）である。
【００８８】
セルロソームのみ、及び市販アスペルギルス・ニガーのβ−グルコシダーゼを併用した場合のセルロース分解能は約４０％とほとんど効果が見られず、セロビオースによるセルロソームの阻害が認められた。また、セルロソームと市販アスペルギルス・ニガーのβ−グルコシダーゼの併用はほとんど効果がないことが分かる。一方、セルロソームとＣｇｌＴの併用はほぼ完全分解できることから、セルロソームにより生成されたセロビオースが効果的にグルコースに分解され、生成物阻害から解除された状態になっていた。
【００８９】
したがって、セルロソームとサーモアナエロバクター・ブロッキＡＴＣＣ３３０７５のβ−グルコシダーゼＣｇｌＴの併用は、市販アスペルギルス・ニガー酵素のβ−グルコシダーゼとの併用よりも極めて高いセルロース分解率を奏することが明らかとなった。
【実施例２】
【００９０】
セルロソームの骨格蛋白質（以下ＣｉｐＡという）はセルロース結合モジュールを保有しているために、セルロソームごとセルロースへ吸着することができる。一方、β−グルコシダーゼは糖質に結合可能なモジュールを有していない。したがって、セルロソームをリサイクルする場合には、β−グルコシダーゼを添加し続ける必要があることが想定される。
【００９１】
そこでβ−グルコシダーゼの再利用が可能かどうか確認するため、微結晶セルロース（アビセル）を用い、セルロソームとＣｇｌＴを用いリサイクル反応を行った。リサイクル反応の手順を図４に示す。
【００９２】
すなわち、アビセル（微結晶性セルロース）にセルロソームとβ−グルコシダーゼを作用させ、アビセルを加水分解した後、反応液に再度アビセルを加え、アビセルに吸着した酵素を分離して再利用するものである。
【００９３】
基質となる１％アビセル、２ｍｇセルロソームと０．５ｍｇのＣｇｌＴ（５ユニット）を用い、５ｍＭ塩化カルシウムを含む１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）、６０℃にてリサイクル糖化反応をスタートした。
【００９４】
２４時間の酵素加水分解反応後、残渣を除き、反応液に再度アビセルのセルロース基質を初発濃度と同量添加し、４℃、６時間、酵素を基質に吸着させる。その後緩衝液を加え、再度、酵素加水分解反応をスタートする。２ラウンド目以降の反応にはセルロソーム及びＣｇｌＴの酵素類を加えることはせず、初発に添加した酵素で再利用可能かどうか反応を行った。
【００９５】
結果を図５に示す。ラウンド１回目においては９４％、ラウンド２回目では７５％と高いセルロース分解率を保っていたが、ラウンド３回目以降、急激に低下し、最終的にラウンド５回目では６％のセルロース分解率であった。
【００９６】
この結果はＣｇｌＴがリサイクル糖化の糖化サイクルを繰り返すことで反応系外へ流出していることを示しており、高いセルロース分解率を保つのに必要な酵素量が不足していることが理解できる。従って、高いセルロース分解率の維持を目指したリサイクル糖化を行うためには、セルロソームとＣｇｌＴとの反応中の挙動を一致させる必要があることが分かった。
【実施例３】
【００９７】
セルロソームと挙動を一致させるために、セルロソーム構造の有する特徴の一部分をＣｇｌＴに持たせることにより可能となると考えられた。特に、ＣｉｐＡが有するＣＢＭをＣｇｌＴに持たせることで、挙動を共にすることが可能であると推測できた。しかし、多くのβ−グルコシダーゼでは触媒ドメインのみのタンパク質構造を持ち、ＣｇｌＴにはセルロース結合領域はない。そこで骨格タンパク質ＣｉｐＡが有するＣＢＭを融合させたＣｇｌＴを作成した。
【００９８】
前述したように、クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４（ＮＩＴＥ ＢＰ−６２７）株ＣＢＭのアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を配列番号２に示す。
【００９９】
ＣＢＭ融合ＣｇｌＴをデザインするに当たり、Ｎ末端側にＣＢＭを融合させたタイプ（以下、ＣＢＭ−ＣｇｌＴとして示す。）とＣ末端側にＣＢＭを融合させたタイプ（以下、ＣｇｌＴ−ＣＢＭとして示す。）とをそれぞれ作成した。
【０１００】
ＣＢＭ−ＣｇｌＴの作成にあたり、ＣＢＭの増幅にはオリゴヌクレオチドプライマーＣＢＭＦ１（配列番号７に示す：５´−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＴＧＧＣＡＡＴＧＣＡＡＣＡＣＣＧ−３´）およびＣＢＭＦｕｓｉｏｎＮ（配列番号８に示す：５´−ＡＣＧＡＡＡＴＣＴＣＴＴＧＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＡＴＴＣＧＧＡＴＣＡＴＣＴＧＡＣＧＧＣＧＧ−３´）を用いた。
【０１０１】
オリゴヌクレオチドプライマーＣＢＭＦ１にはＢａｍＨＩの制限酵素サイトを付与するようにデザインし、またＣＢＭＦｕｓｉｏｎＮにはＣｇｌＴのＮ末端アミノ酸配列が一部含まれるようにデザインした。
【０１０２】
ＰＣＲは実施例１と同じ条件下、クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４株（ＮＩＴＥ ＢＰ−６２７）のゲノムＤＮＡを鋳型としＣＢＭ遺伝子断片を増幅した。
【０１０３】
ＣｇｌＴの作成にあたっては、プライマーＣｇｌＴＦｕｓｉｏｎ（Ｎ）（配列番号９に示す：５´−ＣＣＧＣＣＧＴＣＡＧＡＴＧＡＴＣＣＧＡＡＴＧＣＡＡＡＡＴＴＴＣＣＡＡＧＡＧＡＴＴＴＣＧＴＴ−３´）、および実施例１記載のＣｇｌＴＲ（配列番号４に示す）を用いた。
【０１０４】
プライマーＣｇｌＴＦｕｓｉｏｎ（Ｎ）は、ＣＢＭのＣ末端側を一部重複した形でプライマーをデザインした。それぞれ増幅したＣＢＭ遺伝子（３´側にＣｇｌＴのＮ末端アミノ酸配列をコードする遺伝子を含む。）及びＣｇｌＴ遺伝子（５´側にＣＢＭのＣ末端アミノ酸配列をコードする遺伝子を含む。）を鋳型として用い、オリゴヌクレオチドプライマーＣＢＭＦ１及びＣｇｌＴＲを用い実施例１と同じ条件においてＰＣＲ反応を行った。
【０１０５】
ＰＣＲ反応により、ＣＢＭとＣｇｌＴとが融合した約１．９ｋｂのＤＮＡ断片を得ることができた。
【０１０６】
Ｃ末端側にＣＢＭを融合させたタイプのＣｇｌＴ−ＣＢＭの作成において、ＣｇｌＴ遺伝子の増幅には実施例１記載のオリゴヌクレオチドプライマーＣｇｌＴＦ（配列番号３に示す）及びＣｇｌＴＲ−Ｆｕｓｉｏｎ（Ｃ）（配列番号１０に示す：５´−ＣＧＧＴＧＴＴＧＣＡＴＴＧＣＣＡＡＣＡＴＣＴＴＣＧＡＴＡＣＣＡＴＣＡＴＣ−３´）を用いた。
【０１０７】
オリゴヌクレオチドプライマーＣｇｌＴＲ−Ｆｕｓｉｏｎ（Ｃ）には、ＣＢＭのＮ末端側を一部重複した形でオリゴヌクレオチドプライマーをデザインした。
【０１０８】
Ｃ末端側へのＣＢＭ遺伝子の増幅においては、オリゴヌクレオチドプライマーＣＢＭ３Ｆ−Ｆｕｓｉｏｎ（Ｃ）（配列番号１１に示す：５´−ＧＡＴＧＡＴＧＧＴＡＴＣＧＡＡＧＡＴＧＴＴＧＧＣＡＡＴＧＣＡＡＣＡＣＣＧ−３´）及びオリゴヌクレオチドプライマーＣＢＭ３Ｒ、（配列番号１２に示す：５´−ＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＡＴＴＣＧＧＡＴＣＡＴＣＴＧＡＣＧＧＣＧＧＴＡＴ−３´）を用いた。
【０１０９】
オリゴヌクレオチドプライマーＣＢＭ３Ｆ−Ｆｕｓｉｏｎ（Ｃ）には、ＣｇｌＴのＣ末端側のアミノ酸配列をコードする遺伝子が一部重複した形でデザインした。
【０１１０】
オリゴヌクレオチドプライマーＣＢＭ３Ｒは、制限酵素Ｂｐｕ１１０２の切断サイトを付与するようにデザインした。
【０１１１】
それぞれ増幅したＣｇｌＴ遺伝子（３´側にＣＢＭのＣ末端アミノ酸配列をコードする遺伝子を含む。）及びＣＢＭ遺伝子（５´側にＣｇｌＴのＮ末端アミノ酸配列をコードする遺伝子を含む。）を鋳型として用い、オリゴヌクレオチドプライマーＣｇｌＴＦ及びＣＢＭ３Ｆ−Ｆｕｓｉｏｎ（Ｃ）を用い、実施例１と同じ条件でＰＣＲ反応を行った。
【０１１２】
ＰＣＲの結果、ＣｇｌＴとＣＢＭが融合した場合において得られる約２ｋｂのＤＮＡ断片を得ることができた。
【０１１３】
ＰＣＲで得られた２つの融合遺伝子をそれぞれＢａｍＨＩとＢｐｕ１１０２の制限酵素により切断後、精製を行い、ｐＥＴ１９ｂのＢａｍＨＩとＢｐｕ１１０２制限酵素サイト間へ挿入し、ＣＢＭ融合ＣｇｌＴ発現プラスミドを作成した。２つの発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１へ導入して形質転換を行い、それぞれ発現株を取得した。
【０１１４】
Ｎ末端側にＣＢＭを融合させたＣＢＭ−ＣｇｌＴの遺伝子配列を配列番号１３に、Ｃ末端側にＣＢＭを融合させたタイプのＣｇｌＴ−ＣＢＭの遺伝子配列を配列番号１４に示した。
【０１１５】
ＣＢＭを融合したβ−グルコシダーゼの一般的な特徴を確認するため、それぞれの組換えタンパク質を発現し精製した。精製したタンパク質は両者ともＮ末端側にヒスチジンタグが付与される構造となることから、上記記載の組換えＣｇｌＴと同様にニッケルアガロースカラムにおいてＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドになるまで精製を行った。
【０１１６】
精製したＣＢＭ融合型β−グルコシダーゼのセルロース結合能を測定するため、セルロースを使った結合能を試験した。セルロース結合能は精製タンパク質０．２ｍｇを用い、１０ｍｇアビセルを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）と混合し、４℃で一晩放置した。その後、遠心分離により上清と沈殿（すなわち、セルロース）を分離したのち、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で３回洗浄を行った。再度遠心分離により沈殿を回収したのち、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で懸濁し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。
【０１１７】
ＣｇｌＴと比較した場合、ＣＢＭ−ＣｇｌＴ及びＣｇｌＴ−ＣＢＭともに沈殿画分に精製タンパク質と同一のバンドが認められたが、ＣｇｌＴは上清及び緩衝液洗浄画分に認められたことから、この融合したＣＢＭ遺伝子はセルロース結合能を有しＣｇｌＴ内で機能していることが明らかとなった。
【０１１８】
また、β−グルコシダーゼ活性が変化しているかを確認するために、実施例１に記載した方法でＣｇｌＴ、ＣＢＭ−ＣｇｌＴ及びＣｇｌＴ−ＣＢＭのβ−グルコシダーゼ活性を測定した。結果を表１に示す。
【０１１９】
【表１】
【０１２０】
ＣｇｌＴは２５Ｕ／ｍｇタンパク質と非常に高い活性を示したのに対し、ＣＢＭ融合型のＣｇｌＴに関し、ＣＢＭ‐ＣｇｌＴにおいては４Ｕ／ｍｇタンパク質、ＣｇｌＴ‐ＣｇｌＴでは２ユニット／ｍｇタンパク質と劇的なβ−グルコシダーゼ活性の低下を招いた。これはＣＢＭを融合したことによる立体構造変化により、酵素触媒部分へ影響したものと考えられた。
【０１２１】
ＣＢＭ−ＣｇｌＴ又はＣｇｌＴ−ＣＢＭをセルロソームと併用した際に、β−グルコシダーゼの活性が低下の影響を確認するため、セルロース分解率を測定した。
【０１２２】
反応条件は１％アビセルを用い、上記記載の緩衝液と条件を用いて測定を行った。結果を図６に示す。
【０１２３】
図中、黒三角印がセルロソームのみでの反応、白丸印がセルロソームとＣｇｌＴを併用した反応、白四角印がセルロソームとＣＢＭ−ＣｇｌＴを併用した反応、黒四角印がセルロソームとＣｇｌＴ−ＣＢＭを併用した反応である。
【０１２４】
セルロソームのみでは７２時間後に約６０％のセルロース分解率しか得られず、セロビオース蓄積による反応阻害が生じていることが分かる。
【０１２５】
セルロソームとＣｇｌＴの併用では阻害が解除され、ほぼ１００％のセルロース分解率を得ることができる。一方、ＣＢＭ融合ＣｇｌＴでは、上記に示したβ−グルコシダーゼ活性の低下から考察して、セルロソームのみのセルロース分解率、もしくは若干の効果しか得られないだろうと考えられたが、驚くことにＣｇｌＴと同様にほぼ１００％のセルロース分解率を得ることができた。
このことは、一般的なβ−グルコシダーゼ基質として使用されるｐ−ニトロフェノールグルコピラノシドではうまく活性を示せないが、セルロース存在下においてはＣＢＭの機能により活性が復帰することが明らかとなった。したがって、ＣＢＭをＣｇｌＴと融合させるデメリットは人工基質を使用した際の活性低下に限定されることになる。
【０１２６】
なお、Ｎ末端側及びＣ末端側のどちらにＣＢＭを融合したＣｇｌＴを用いても、セルロソームとの併用においてセルロース分解率に差異は無いことから、以降の実施例においてはＣＢＭ−ＣｇｌＴを使用することにした。
【実施例４】
【０１２７】
実際にＣＢＭ−ＣｇｌＴを用いセルロソームと共に挙動を一致させることができるかどうかを確認するために、シグマセルを用いて図４に準じてリサイクル糖化反応を行った。反応条件は実施例２と同じ条件、すなわち、１％シグマセルと２ｍｇセルロソームと０．５ｍｇ ＣＢＭ−ＣｇｌＴ（０．８ユニット）を用い、５ｍＭ塩化カルシウムを含む１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）、６０℃にてリサイクル糖化反応をスタートした。結果を図７に示す。
【０１２８】
セルロソーム及びＣＢＭ−ＣｇｌＴを併用することにより、初回から９０％以上のセルロース分解率を維持しながら、少なくとも５回繰り返し利用することが可能であることが明らかとなった。この結果はセルロソームのＣＢＭをβ−グルコシダーゼのような補助酵素に融合させることで、反応中の挙動を同じくさせ、補助酵素自身もセルロソームと同じく回収が可能になることを示しており画期的である。
【０１２９】
リグノセルロース系バイオマスにおいてもセルロソーム及びセルロース結合モジュール融合β−グルコシダーゼを併用するリサイクル糖化法が有効か確認するため、前処理を行った稲わらを用いてリサイクル糖化反応を行った。
【０１３０】
前処理としてアンモニア浸漬を行った。アンモニア浸漬は乾燥稲わらを１０ｇに１０倍量の２８％アンモニア水溶液を加え、密閉容器に入れて６０℃で７日間放置した。その後、蒸留水により中性になるまでよく洗浄を繰り返し、水を絞ったものをアンモニア浸漬処理稲わらサンプルとした。
【０１３１】
アンモニア浸漬処理稲わらの全糖成分や量を測定するため、実施例１記載の硫酸加水分解により加水分解液を調製後、高速液体クロマトグラフィーにて測定した。
アンモニア浸漬処理稲わらを使用したリサイクル糖化法の工程を図８に示す。基本的に図４と同様のサイクルであるが、基質が１％セルロース量を含むアンモニア浸漬処理稲わらである点で異なる。また加水分解後残存する残渣を系外から除く工程を厳密に行った。残渣を系外から除くことにより、再利用回数を増やすことができる。
【０１３２】
酵素量や反応量は実施例３の条件である２ｍｇセルロソームと０．５ｍｇＣＢＭ−ＣｇｌＴ（０．８ユニット）を用い、５ｍＭ塩化カルシウムを含む１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）、６０℃にてリサイクル糖化反応をスタートした。結果を図９中の「前処理のみ」と記載したレーンに示した。初回ラウンドでは９０％以上のセルロース分解率を示したものの、２ラウンド目以降、急激にセルロース分解率の低下が認められ、３ラウンド目では約１２％のセルロース分解率まで低下した。反応溶液中のタンパク質量の測定によれば、反応開始後から急激に反応溶液中のタンパク量が低下していることから、アンモニア浸漬処理稲わらによる酵素の非特異的吸着が生じていることが分かった。
【０１３３】
非特異的吸着を抑制させるために、非特異的吸着を起こすと考えられるリグノセルロース系バイオマスのリグニンを含む酸不溶な成分部位を何らかの方法でコーティングさせることでリサイクル糖化を持続させることができるか検討を行った。
【０１３４】
セルロソームとＣＢＭ−ＣｇｌＴの併用により反応スタートする前に、一度ブロッキング処理として、各種タンパク質や界面活性剤により浸漬を行ったアンモニア浸漬処理稲わらを用いた。このリサイクル工程図を図１０に示す。
【０１３５】
ブロッキング処理方法は、前処理したバイオマス１ｇあたり０．２重量％溶液で４℃又は、室温にて６時間〜１５時間浸漬処理を行った。また蒸留水に不溶なブロッキング試薬は薄い酸やアルカリ溶液により溶解したものを用いた。この工程を繰り返す際に添加するブロッキング済みアンモニア浸漬処理稲わらのセルロース含量は先のブロッキング処理無の工程と同じである。
【０１３６】
コーティング剤として、タンパク質ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（シグマ・アルドリッチ社製）、ゼラチン（和光純薬社製）、スキムミルク（和光純薬社製）、大豆タンパク質（和光純薬社製）や培地成分であるペプトン（ディフコ社製）、ポリペプトン（ディフコ社製）、アミノ酸であるアルギニン（シグマ・アルドリッチ社製）、各種界面活性剤［Ｔｗｅｅｎ ２０，８０（和光純薬社製）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ（和光純薬社製）、ＳＤＳ（和光純薬）及び高分子ポリマー［ＰＥＧ４００−ＰＥＧ２００００（和光純薬社製）］を用いた。
【０１３７】
タンパク質においては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やスキムミルク、カゼイン、界面活性剤では非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０やＴｗｅｅｎ８０、及び高分子ポリエチレングリコール（ＰＥＧ２００００）に高いセルロース分解率を維持したままでのリサイクル回数継続の効果が認められた。特にスキムミルク、カゼイン、Ｔｗｅｅｎ８０により前処理稲わらをコーティング処理することで９０％以上の高いセルロース分解率を３ラウンドまでリサイクル工程を繰り返せることが分かった。
【実施例５】
【０１３８】
セルロソームとＣＢＭ−ＣｇｌＴの併用によるリサイクル糖化法とブロッキング処理を用いた組み合わせによる糖化方法は、稲わら以外のリグノセルロース系バイオマスにおいても効果があるかを試験するため、上記記載のアンモニア浸漬処理稲わらの他に、アルカリ蒸解処理した杉パルプ、使用済みオフィス紙（水洗のみ）を用いてリサイクル糖化試験を行った。
【０１３９】
アルカリ蒸解処理杉パルプの調製は、杉チップあたり酸化ナトリウム換算で２３％となるように水酸化ナトリウムを加え、耐圧容器中で１７０℃、３時間反応を行った。その後、十分に水洗し、亜塩素酸（対パルプ当たり３．５％）により６０℃、３０分間で漂白処理を行った。さらに対杉パルプ当たり４％水酸化ナトリウムで６０℃、３０分間処理を行い中性になるまで水洗を繰り返したものを使用した。
【０１４０】
オフィス紙は、使用済みオフィス紙（再生紙）をシュレッダーにより裁断後、蒸留水により１時間洗浄したものを使用した。
【０１４１】
カゼイン及びツイーン８０によるブロッキング処理の場合、実施例４記載の方法と同様に各セルロース系バイオマスに対して処理を行いリサイクル糖化反応に使用した。
【０１４２】
糖化反応における酵素濃度は実施例４と同じく、２ｍｇセルロソームと０．５ｍｇ ＣＢＭ−ＣｇｌＴ（０．８ユニット）を用い、５ｍＭ塩化カルシウムを含む１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）、６０℃にてリサイクル糖化反応をスタートした。結果を図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｃに示す。
【０１４３】
図１１Ａ〜図１１Ｃの結果から、セルロソームとＣＢＭ−ＣｇｌＴとの併用によるリサイクル糖化反応において、前処理のみでは、アンモニア浸漬処理稲わらでは２ラウンド目から、アルカリ蒸解杉パルプ、オフィス紙では３回目から急激なセルロース分解率の低下が見られ、その後のサイクルも低下していることが分かる。一方、カゼインやツイーン８０によるブロッキング処理によりアンモニア浸漬処理稲わらでは４回、アルカリ蒸解杉パルプでは５回のサイクルでも７０％以上の高いセルロース分解率を保ったままリサイクル糖化できることが明らかとなり、稲わら以外の他のバイオマスにおいても本リサイクル糖化方法は適応可能であることが示された。
【０１４４】
セルロース系の基質がブロッキング処理を施されたリグニンを含むセルロース系バイオマスである場合、酵素のリサイクル回数を増加させるためには、加水分解後残存する残渣を系外から除くことも大切である。残渣を系外から除かない場合と、除いた場合の再利用回数を比較するため、残渣を残したままでのカゼインでブロッキングしたアンモニア浸漬した稲わらを用いた際のセルロース分解率を図１２に示す。
【０１４５】
残渣を反応系内に残すことにより、リサイクル回数に伴う糖化効率の低下が認められる。この現象は、系内に残ったブロッキング処理したセルロース系バイオマスと酵素複合体の反応が進むことで、ブロックした場所以外の酵素非特異的吸着部分が露出し始め、系内で働いている酵素を奪うために、再利用を継続すると糖化効率が低下してくるものと考えられる。
【実施例６】
【０１４６】
セルロソームのように酵素複合体になっておらず、個々のフリーの酵素によりリグノセルロースを分解する作用メカニズムを持つカビ酵素においても、本方法で示したリサイクル糖化工程により酵素リサイクル反応が可能であるかどうかを確認するための試験を行った。試験においては、市販カビ酵素を用い前処理稲わらでの前処理のみ稲わらや、ブロッキング処理後のリサイクル糖化能に関して同様に検討を行った。
【０１４７】
市販酵素としてトリコデルマ・リーゼイ由来セルラーゼ（シグマ・アルドリッチ）、またカビβ−グルコシダーゼとして実施例１記載のアスペルギルス・ニガー由来を使用した。リサイクル糖化の反応として、市販セルラーゼ酵素２ｍｇ、β−グルコシダーゼ０．５ｍｇ、１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、５０℃の条件で、図８及び図１０に示したようにリサイクル糖化反応をスタートした。結果を図１３に示す。
【０１４８】
アンモニア浸漬処理稲わらでは、セルロソームとＣＢＭ−ＣｇｌＴの併用でのリサイクル糖化による傾向と同様に１ラウンド目のセルロース分解率は９０％以上であるが、２ラウンド目以降急激にセルロース分解率の低下が認められ、その基質であるアンモニア浸漬処理稲わらによる酵素の非特異的吸着が起こっていることが示唆された。
【０１４９】
一方、セルロソームリサイクル糖化において効果のあった、カゼインやツイーン８０でブロッキング処理を行った前処理稲わらでは、２ラウンド目からブロッキング処理なしの時と同様にセルロース分解率が急激に低下する現象が認められた。このことはカビ酵素では単に基質への非特異的吸着で酵素回収不能になっているだけでなく、糖化に重要な酵素が、回収されず系外へ消失していることが示唆された。これらの結果は、カビ酵素のような個々の酵素が遊離した状態でそれぞれ働く糖化酵素の場合、本発明で示しているリサイクル糖化法は不適であり、セルロソームのような必要な酵素がセットとなっている酵素複合体を用いることが重要であることが明らかとなった。
【実施例７】
【０１５０】
ブロッキング処理したセルロース系バイオマスではなく、セルロソームに各種タンパク質、高分子ポリエチレングリコール又は界面活性剤を少量添加しても効果があるかを確認した。
【０１５１】
セルロソーム酵素画分及びβ−グルコシダーゼ（ＣＢＭ−ＣｇｌＴ）に対し０．２％（容量％）の濃度でカゼイン又はスキムミルクをそれぞれ添加した。このブロッキング剤を含む酵素溶液を用い、ブロッキング処理なしのアンモニア浸漬稲わら及びアルカリ蒸解処理杉パルプを用い、実施例３と同じ条件で酵素リサイクル試験を行った。
【０１５２】
結果を図１４に示す。カゼイン又はスキムミルクを添加した酵素溶液は、添加のない酵素溶液に比べ、再利用回数の増加が認められ、少なくとも３回目まで９０％以上の糖化効率を維持することができた。セルロース系バイオマスにブロッキング処理した場合と同じ効果を示すことが明らかとなった。
【実施例８】
【０１５３】
嫌気性細菌由来の酵素利用の場合、酵素が働く環境も嫌気性であることから、通常のジチオトレイトール（ＤＴＴ）や２−メルカプトエタノールなどの還元剤を少量添加し酵素反応させることがある。セルロソームも古くから反応溶液に５〜１０ｍＭ程度のジチオトレイトールを添加して酵素反応を行わせてきた（非特許文献３）。そこで、上記記載のブロッキング剤を含んだ酵素溶液にＤＴＴを１０ｍＭ加えて上昇効果があるかどうかを確認した。
【０１５４】
結果を図１５に示す。再利用の都度、糖化効率が減少しており、３回目の再利用で糖化効率は最初に比べ５０％以上低下している。
【０１５５】
この現象は、還元作用のある他の２−メルカプトエタノール、システインやアスコルビン酸の添加でも２回目から３回目において糖化効率の低下という現象を示した。したがって、上記酵素再利用においては、ＤＴＴなど還元作用の持つ化合物剤を除くことが重要であることが明らかとなった。
【受託番号】
【０１５６】
ＮＩＴＥ ＢＰ−６２７（クロストリジウム・サーモセラムＪＫ−Ｓ１４株）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素をセルロース系の基質に結合させ、セルロース系の基質に結合した酵素を再利用する、酵素の再利用方法。
【請求項２】
前記セルロースに結合可能なモジュールがセルロソーム由来である、請求項１記載の酵素の再利用方法。
【請求項３】
前記セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素が、β−グルコシダーゼ活性を有する酵素である、請求項１記載の酵素の再利用方法。
【請求項４】
前記酵素が、セルロソーム及びセルロースに結合可能なモジュールを有するβ−グルコシダーゼである、請求項１記載の酵素の再利用方法。
【請求項５】
前記セルロースに結合可能なモジュールを有するβ−グルコシダーゼが、セルロース結合モジュールを含むキメラ酵素である、請求項４記載の酵素の再利用方法。
【請求項６】
前記セルロースに結合可能なモジュールを有するβ−グルコシダーゼが、好熱性細菌由来のβ−グルコシダーゼとクロストリジウム属の生産するセルロソーム由来のセルロース結合モジュールとのキメラ酵素である、請求項４記載の酵素の再利用方法。
【請求項７】
前記セルロース系の基質は、タンパク質、高分子ポリエチレングリコール及び界面活性剤から選択される１種以上のブロッキング剤で処理されたリグニンを含むセルロース系バイオマスである、請求項１〜６のいずれかに記載の酵素の再利用方法。
【請求項８】
前記セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素が、タンパク質、高分子ポリエチレングリコール及び界面活性剤から選択される１種以上のブロッキング剤を含む酵素溶液である、請求項１〜６のいずれかに記載の酵素の再利用方法。
【請求項９】
セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素をセルロース系の基質に結合させる前に、酵素反応後の残渣を除去することを含む、請求項１〜８のいずれかに記載の酵素の再利用方法。
【請求項１０】
タンパク質、高分子ポリエチレングリコール及び界面活性剤から選択される１種以上のブロッキング剤の存在下で、セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素をセルロース系の基質と反応させる、請求項１〜９のいずれかに記載の酵素の再利用方法。
【請求項１１】
還元剤の非存在下、セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素をセルロース系の基質に反応させる、請求項１〜１０のいずれかに記載の酵素の再利用方法。
【請求項１２】
好熱性細菌由来のβ−グルコシダーゼ活性を示す領域とクロストリジウム属の生産するセルロソーム由来のセルロースに結合可能なモジュールとを含む、β−グルコシダーゼ。
【請求項１】
セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素をセルロース系の基質に結合させ、セルロース系の基質に結合した酵素を再利用する、酵素の再利用方法。
【請求項２】
前記セルロースに結合可能なモジュールがセルロソーム由来である、請求項１記載の酵素の再利用方法。
【請求項３】
前記セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素が、β−グルコシダーゼ活性を有する酵素である、請求項１記載の酵素の再利用方法。
【請求項４】
前記酵素が、セルロソーム及びセルロースに結合可能なモジュールを有するβ−グルコシダーゼである、請求項１記載の酵素の再利用方法。
【請求項５】
前記セルロースに結合可能なモジュールを有するβ−グルコシダーゼが、セルロース結合モジュールを含むキメラ酵素である、請求項４記載の酵素の再利用方法。
【請求項６】
前記セルロースに結合可能なモジュールを有するβ−グルコシダーゼが、好熱性細菌由来のβ−グルコシダーゼとクロストリジウム属の生産するセルロソーム由来のセルロース結合モジュールとのキメラ酵素である、請求項４記載の酵素の再利用方法。
【請求項７】
前記セルロース系の基質は、タンパク質、高分子ポリエチレングリコール及び界面活性剤から選択される１種以上のブロッキング剤で処理されたリグニンを含むセルロース系バイオマスである、請求項１〜６のいずれかに記載の酵素の再利用方法。
【請求項８】
前記セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素が、タンパク質、高分子ポリエチレングリコール及び界面活性剤から選択される１種以上のブロッキング剤を含む酵素溶液である、請求項１〜６のいずれかに記載の酵素の再利用方法。
【請求項９】
セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素をセルロース系の基質に結合させる前に、酵素反応後の残渣を除去することを含む、請求項１〜８のいずれかに記載の酵素の再利用方法。
【請求項１０】
タンパク質、高分子ポリエチレングリコール及び界面活性剤から選択される１種以上のブロッキング剤の存在下で、セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素をセルロース系の基質と反応させる、請求項１〜９のいずれかに記載の酵素の再利用方法。
【請求項１１】
還元剤の非存在下、セルロースに結合可能なモジュールを有する酵素をセルロース系の基質に反応させる、請求項１〜１０のいずれかに記載の酵素の再利用方法。
【請求項１２】
好熱性細菌由来のβ−グルコシダーゼ活性を示す領域とクロストリジウム属の生産するセルロソーム由来のセルロースに結合可能なモジュールとを含む、β−グルコシダーゼ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２】
【図１３】
【図９】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２】
【図１３】
【図９】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２０１２−３９９９９（Ｐ２０１２−３９９９９Ａ）
【公開日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−４４５４１（Ｐ２０１１−４４５４１）
【出願日】平成２３年３月１日（２０１１．３．１）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２２年度、独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構、「酵素複合体を活用したリグノセルロース系バイオマスの効率的糖化技術の研究開発」委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０１１７４５５０）独立行政法人国際農林水産業研究センター (22)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月１日（２０１１．３．１）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２２年度、独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構、「酵素複合体を活用したリグノセルロース系バイオマスの効率的糖化技術の研究開発」委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０１１７４５５０）独立行政法人国際農林水産業研究センター (22)
【Ｆターム（参考）】
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