酵素液の製造方法及び糖の製造方法
【課題】多糖類の分解性が高い酵素液を、容易に製造することができる酵素液の製造方法、並びに、それにより得られる酵素液を用いた糖の製造方法を提供すること。
【解決手段】本発明は、リグノセルロース系バイオマスを最大径が２ｍｍ以下となるように裁断してバイオマス粒子とする裁断工程Ｓ１と、該バイオマス粒子及び水を固形分率が０．１〜２０質量％となるように混合して混合液とし、温度０〜５０℃の条件下で連続的に粉砕し、混合液をスラリー状の炭素源とする粉砕工程Ｓ２と、炭素源、培養培地及び多糖分解酵素生産菌株を混合し、培養することにより、酵素液を得る酵素生産工程Ｓ３と、を備える酵素液の製造方法及びそれを用いた糖の製造方法である。
【解決手段】本発明は、リグノセルロース系バイオマスを最大径が２ｍｍ以下となるように裁断してバイオマス粒子とする裁断工程Ｓ１と、該バイオマス粒子及び水を固形分率が０．１〜２０質量％となるように混合して混合液とし、温度０〜５０℃の条件下で連続的に粉砕し、混合液をスラリー状の炭素源とする粉砕工程Ｓ２と、炭素源、培養培地及び多糖分解酵素生産菌株を混合し、培養することにより、酵素液を得る酵素生産工程Ｓ３と、を備える酵素液の製造方法及びそれを用いた糖の製造方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素液の製造方法及びそれにより得られる酵素液を用いた糖の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
木材や草木等の植物体の主要な化学成分は、セルロース、ヘミセルロース及びリグニンが含まれるリグノセルロース系バイオマスである。
かかるリグノセルロース系バイオマスは、多糖類であるセルロース及びヘミセルロースに、リグニンが絡まった構造となっている。
【０００３】
近年、リグノセルロース系バイオマス資源の有効利用の観点から、リグノセルロース系バイオマスを加水分解してグルコース等の還元糖を得る研究がなされている。
例えば、リグノセルロース系バイオマスを加圧熱水で処理し、機械的粉砕処理を経て、酵素で糖化処理する糖化方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
ところが、上記特許文献１記載の糖化方法においては、リグノセルロース系バイオマスを単糖類に分解すると同時に、酵素が失活するので、酵素が大量に必要となる欠点がある。
【０００５】
これに対し、リグノセルロース系バイオマスを分解するための酵素を製造する方法として、セルロース、ヘミセルロース、あるいは糖類を炭素源して、糖化酵素を産出する微生物を培養する方法が開発されている（例えば、特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−１３６２６３号公報
【特許文献２】特開２００８−５４６７６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、従来から知られているように、セルラーゼ生産菌のセルラーゼ生産能が不十分であるので、上述した特許文献２記載の方法のように、セルロース及びヘミセルロースを炭素源とするのみでは、十分な分解性を有する酵素液を得ることができない。
したがって、特許文献２記載の酵素では、リグノセルロース系バイオマスを完全に単糖類まで分解することは困難である。
【０００８】
また、特許文献２記載の方法においては、セルロースやヘミセルロースを準備する必要があるので、手間がかかると共に、高コストとなる。
【０００９】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、多糖類の分解性が高い酵素液を、容易に製造することができる酵素液の製造方法、並びに、それにより得られる酵素液を用いた糖の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意検討したところ、セルロース又はヘミセルロースを個別に単離するのではなく、リグノセルロース系バイオマス自体から酵素液を製造できないかと考えた。
そして、所定の固形分率で粉砕等することにより、意外にも、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、（１）リグノセルロース系バイオマスを最大径が２ｍｍ以下となるように裁断してバイオマス粒子とする裁断工程と、該バイオマス粒子及び水を固形分率が０．１〜２０質量％となるように混合して混合液とし、温度０〜５０℃の条件下で連続的に粉砕し、混合液をスラリー状の炭素源とする粉砕工程と、炭素源、培養培地及び多糖分解酵素生産菌株を混合し、培養することにより、酵素液を得る酵素生産工程と、を備える酵素液の製造方法に存する。
【００１２】
本発明は、（２）混合液が、バイオマス粒子を解繊するための解繊物質を更に含有する上記（１）記載の酵素液の製造方法に存する。
【００１３】
本発明は、（３）炭素源の繊維長が１００μｍ以下である上記（１）記載の酵素液の製造方法に存する。
【００１４】
本発明は、（４）炭素源の結晶化度が１５〜５５％である上記（１）記載の酵素液の製造方法に存する。
【００１５】
本発明は、（５）酵素生産工程において、炭素源、培養培地及び多糖分解酵素生産菌株に加え、乳糖を含む乳清が更に含まれている上記（１）記載の酵素液の製造方法に存する。
【００１６】
本発明は、（６）多糖分解酵素生産菌株が、アクレモニウム属、トリコデルマ属、アスペルギルス属又はペニシリウム属に属するものである上記（１）記載の酵素液の製造方法に存する。
【００１７】
本発明は、（７）酵素液が多糖類から単糖類への加水分解に用いられる上記（１）記載の酵素液の製造方法に存する。
【００１８】
本発明は、（８）家畜用飼料として用いられ、酵素生産工程において、培養を途中で停止することにより、炭素源と多糖分解酵素生産菌株とを残存させた酵素液を得る上記（１）記載の酵素液の製造方法に存する。
【００１９】
本発明は、（９）上記（１）〜（８）のいずれか一つに記載の酵素液の製造方法により得られる酵素液と、分解用リグノセルロース系バイオマスとを混合し、該分解用リグノセルロース系バイオマスを加水分解して糖とする糖の製造方法に存する。
【００２０】
本発明は、（１０）リグノセルロース系バイオマスと、分解用リグノセルロース系バイオマスとが同一物質である上記（９）記載の糖の製造方法に存する。
【００２１】
本発明は、（１１）分解用リグノセルロース系バイオマスが、最大径が２ｍｍ以下となるように裁断して分解用バイオマス粒子とし、該分解用バイオマス粒子及び水を固形分率が０．１〜２０質量％となるように混合して混合液とし、温度０〜５０℃の条件下で連続的に粉砕し、混合液をスラリー状としたものである上記（９）記載の糖の製造方法に存する。
【００２２】
本発明は、（１２）分解用リグノセルロース系バイオマスが、最大径が２ｍｍ以下となるように裁断して分解用バイオマス粒子とし、該分解用バイオマス粒子及び水を固形分率が０．１〜２０質量％となるように混合して混合液とし、温度１００〜１５０℃の条件下で水熱処理をし、温度０〜５０℃の条件下で連続的に粉砕し、混合液をスラリー状としたものである上記（９）記載の糖の製造方法に存する。
【００２３】
なお、本発明の目的に添ったものであれば、上記（１）〜（１２）を適宜組み合わせた構成も採用可能である。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の酵素液の製造方法においては、リグノセルロース系バイオマスを所定のサイズに裁断し、所定の条件下で粉砕することにより、炭素源とすることができる。
そして、かかる炭素源は、多糖分解酵素生産菌株に対して好適な栄養となる。このため、この炭素源に、多糖分解酵素生産菌株及び培養培地を加えて培養することにより、多糖類の分解性が高い酵素液が得られる。
したがって、上記酵素液の製造方法によれば、多糖類の分解性が高い酵素液を、容易に製造することができる。また、得られる酵素液は、多糖類から単糖類への加水分解に好適に用いられる。
【００２５】
このように、得られる酵素液が、多糖類の分解性に優れる理由は、定かではないが、上述のような工程を経ることによって、炭素源の結晶構造が維持されるためであると考えられる。なお、理由はこれに限定されない。
特に、炭素源の結晶化度は１５〜５５％であることが好ましい。
【００２６】
上記酵素液の製造方法においては、混合液が、バイオマス粒子を解繊するための解繊物質を更に含有すると、解繊物質がバイオマス粒子のセルロースのミクロフィブリルの間に進入してこれらの隙間を広げ、同時に組織を破壊し、セルロースミクロフィブリルに付着したヘミセルロース及びリグニンが剥がされる。
これにより、バイオマス粒子は、セルロース分子鎖の最小集合単位であるミクロフィブリルにまで解かれることになる。
このため、得られる炭素源は、リグノセルロース系バイオマス独自の結晶性が確実に維持される。すなわち、表面や内部のセルロース分子は分子鎖配列・配向の乱れや化学的な変性をほとんど受けていない結晶性を有する炭素源が得られる。
【００２７】
上記酵素液の製造方法においては、炭素源の繊維長が１００μｍ以下であると、多糖分解酵素生産菌株の増殖速度が向上する。
【００２８】
上記酵素液の製造方法の酵素生産工程においては、炭素源、培養培地及び多糖分解酵素生産菌株に加え、乳糖を含む乳清が更に含まれていると、多糖類の分解性が一層高い酵素液が得られる。
【００２９】
上記酵素液の製造方法においては、多糖分解酵素生産菌株が、アクレモニウム属、トリコデルマ属、アスペルギルス属又はペニシリウム属に属するものであると、確実に多糖類の分解性が高い酵素液が得られる。
【００３０】
上記酵素液の製造方法の酵素生産工程においては、培養を途中で停止することにより、炭素源と多糖分解酵素生産菌株とを残存させた酵素液が得られる。
この場合、かかる酵素液は、サイレージ様家畜飼料（家畜用飼料）として好適に用いられる。
【００３１】
本発明の糖の製造方法においては、上述した酵素液と、リグノセルロース系バイオマス（以下便宜的に「分解用リグノセルロース系バイオマス」という。）とを混合することにより、分解用リグノセルロース系バイオマスが酵素加水分解される。これにより、糖が得られる。なお、ここでいう「糖」は、単糖を意味する。
このとき、上述した酵素液を用いているので、分解用リグノセルロース系バイオマスは、高収率で糖に分解される。
【００３２】
本発明の糖の製造方法においては、リグノセルロース系バイオマスと、分解用リグノセルロース系バイオマスとが同一物質であると、酵素量が少なくて済む。すなわち、上記分解用リグノセルロース系バイオマスを酵素で糖化させる場合、市販の酵素液やＳｏｌｋａ
ｆｌｏｃで培養したときに得られる粗酵素液を用いるよりも、分解用リグノセルロース系バイオマスと同一物質のリグノセルロース系バイオマスから上述の酵素の製造方法で得られる酵素液を用いたほうが、酵素量が少なくて済む。
また、同じリグノセルロース系バイオマスから糖まで一貫した生産体系を構築できる。
【００３３】
本発明の糖の製造方法においては、分解用リグノセルロース系バイオマスが、最大径が２ｍｍ以下となるように裁断してバイオマス粒子（以下便宜的に「分解用バイオマス粒子」という。）とし、該分解用バイオマス粒子及び水を固形分率が０．１〜２０質量％となるように混合して混合液とし、温度０〜５０℃の条件下で連続的に粉砕し、混合液をスラリー状としたものであると、得られる糖の収率が向上する。なお、分解用バイオマス粒子に水熱処理を施すと、糖の収率がより向上する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、本発明に係る酵素液の製造方法の一実施形態を示すフローチャート図である。
【図２】図２は、本発明に係る糖の製造方法の一実施形態を示すフローチャート図である。
【図３】図３は、本発明に係る糖の製造方法の他の実施形態を示すフローチャート図である。
【図４】図４は、実施例１,２及び比較例２,３で得られた酵素液の量と、糖化量との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
以下、必要に応じて図面を参照しつつ、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
図１は、本発明に係る酵素液の製造方法の一実施形態を示すフローチャート図である。
図１に示すように、本実施形態に係る酵素液の製造方法は、リグノセルロース系バイオマスをバイオマス粒子とする裁断工程Ｓ１と、該バイオマス粒子及び水を混合して混合液とし、粉砕により炭素源とする粉砕工程Ｓ２と、炭素源、培養培地及び多糖分解酵素生産菌株を混合し、培養することにより、酵素液を得る酵素生産工程Ｓ３と、を備える。
【００３６】
本実施形態に係る酵素液の製造方法においては、リグノセルロース系バイオマスを所定のサイズに裁断し（裁断工程Ｓ１）、所定の条件下で湿式粉砕する（粉砕工程Ｓ２）ことにより、結晶構造が維持された炭素源となる。
ここで、湿式粉砕とは、液体の存在下、こなごなに打ち砕く処理をする方式を意味する。なお、液体を用いない乾式粉砕では顕著に粉砕物の結晶化度が低下する。
【００３７】
そして、かかる炭素源は、結晶性が維持されているので、多糖分解酵素生産菌株に対して好適な栄養となる。このため、この炭素源に、多糖分解酵素生産菌株及び培養培地を加えて培養する（酵素生産工程Ｓ３）ことにより、多糖類の分解性が高い酵素液が得られる。
したがって、上記酵素液の製造方法によれば、多糖類の分解性が高い酵素液を、容易に製造できる。また、得られる酵素液は、多糖類から単糖類への加水分解に好適に用いられる。
【００３８】
以下、裁断工程Ｓ１、粉砕工程Ｓ２及び酵素生産工程Ｓ３について、更に詳細に説明する。
（裁断工程）
裁断工程Ｓ１は、リグノセルロース系バイオマスを所定の粒子径となるように裁断してバイオマス粒子とする工程である。
【００３９】
リグノセルロース系バイオマスとしては、稲わら、麦わら、バガス、コーンストーバー等の農産廃棄物、木材、古紙等が挙げられる。なお、かかるリグノセルロース系バイオマスには、これらの発酵物も含まれる。かかる発酵物としては、サイレージ化された稲わらや多量のオガ粉を含む使用済みキノコ培地等が挙げられる。
【００４０】
これらのリグノセルロース系バイオマスは、グルコースがβ１−４結合されたセルロース、キシロース（広葉樹、草本類）、マンノース（針葉樹）等が主成分であり、これにヘミセルロースやリグニンが絡み合った構造となっている。
【００４１】
上記裁断工程においては、リグノセルロース系バイオマスを裁断することにより、バイオマス粒子が得られる。
ここで、リグノセルロース系バイオマスを裁断する方法としては、カッターミル、ハンマーミル、エクストルーダー等が挙げられる。
【００４２】
上記裁断工程により得られるバイオマス粒子の粒子径は、最大径が２ｍｍ以下になるようにする。
ここで、最大径とは、バイオマス粒子の任意の断面における最大の直径を意味する。
上記最大径が２ｍｍを超えると、後述する粉砕工程において、十分な炭素源とならず、得られる酵素液も多糖類の分解性が不十分となる。なお、得られるバイオマス粒子の形状は特に限定されない。
【００４３】
（粉砕工程）
粉砕工程Ｓ２は、得られたバイオマス粒子及び水を所定の固形分率となるように混合して混合液とし、所定の条件下で連続的に湿式粉砕し、混合液をスラリー状の炭素源とする工程である。
【００４４】
上記混合液は、固形分であるバイオマス粒子と、液体である水との混合物となっている。すなわち、水中にバイオマス粒子が分散された状態となっている。
【００４５】
また、混合液全体における固形分率は、０．１〜２０質量％である。すなわち、混合液全量に対するバイオマス粒子の含有割合は、０．１〜２０質量％である。
固形分率が０．１質量％未満であると、得られる酵素液の量が少なくなるので、多糖類の分解性が不十分となる傾向にあり、固形分率が２０質量％を超えると、湿式粉砕が十分にできなくなる場合がある。
【００４６】
上記混合液は、バイオマス粒子を解繊するための解繊物質を更に含有してもよい。すなわち、この場合の混合液は、バイオマス粒子、水及び解繊物質からなるものであってもよい。
混合液が解繊物質を含むと、解繊物質がバイオマス粒子のセルロースのミクロフィブリルの間に進入してこれらの隙間を広げ、同時に組織を破壊し、セルロースミクロフィブリルに付着したヘミセルロース及びリグニンが剥がされ、バイオマス粒子は、セルロース分子鎖の最小集合単位であるミクロフィブリルにまで解かれることになる。
このため、得られる炭素源は、リグノセルロース系バイオマス独自の結晶性が維持される。すなわち、表面や内部のセルロース分子は分子鎖配列・配向の乱れや化学的な変性をほとんど受けていない結晶性を有する炭素源が得られる。なお、解繊物質が含まれる場合であっても、固形分率は、０．１〜２０質量％であることが好ましい。
【００４７】
かかる解繊物質としては、特に限定されないが、低分子化合物、高分子化合物、脂肪酸類又は無機アルカリが好適に用いられる。これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００４８】
上記低分子化合物は、アルコール類、エーテル類、ケトン類、スルホキシド類、アミド類、アミン類、芳香族類及びモルフォリン類からなる群より選ばれる少なくとも一つであることが好ましい。
【００４９】
上記アルコール類としては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、ｔ−ブタノール、エチレングリコール等のアルキレングリコール、トリメチレンプロパノール、ブタンジオール、グリセリン等が挙げられる。なお、これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００５０】
上記エーテル類としては、１，４−ジオキサン等が挙げられる。なお、これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００５１】
上記ケトン類としては、アセトン、メチルエチルケトン、ジエチルケトン、メチルプロピルケトン、ステアリルケテンダイマー等が挙げられる。なお、これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００５２】
上記スルホキシド類としては、ジメチルスルホキシド、ビスフェニルスルホキシド類、ビス（４−ヒドロキシフェニル）スルホキシド、ビス（３，５−ジメチル−４−ヒドロキシフェニル）スルホキシド、ビス（２，３−ジヒドロキシフェニル）スルホキシド、ビス（５−クロロ−２，３−ジヒドロキシフェニル）スルホキシド、ビス（２，４−ジヒドロキシフェニル）スルホキシド、ビス（２，４−ジヒドロキシ−６−メチルフェニル）スルホキシド、ビス（５−クロロ−２，４−ジヒドロキシフェニル）スルホキシド、ビス（２，５−ジヒドロキシフェニル）スルホキシド、ビス（３，４−ジヒドロキシフェニル）スルホキシド等のビスヒドロキシフェニルスルホキシド類等が挙げられる。なお、これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００５３】
上記アミド類としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、オレイン酸アミド、ステアリン酸アミド等が挙げられる。なお、これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００５４】
上記アミン類としては、アンモニア、アニリン、ジメチルアミン、トリエチルアミン、エタノールアミン、ジエチルエタノールアミン等が挙げられる。なお、これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００５５】
上記芳香族類としては、ベンゼン、トルエン、キシレン、フェノール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、カテキン類、テルペン類等が挙げられる。なお、これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００５６】
上記モルフォリン類としては、Ｎ−メチルモルフォリン、Ｎ−メチルモルフォリン−Ｎ−オキシド等が挙げられる。なお、これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００５７】
また、上記低分子化合物にはイオン性液体が含まれる。ここで、イオン性液体とは、室温でも液体で存在する塩を意味する。
かかる上記イオン性液体としては、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムクロライド、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム、１−エチル−３（ヒドロキシメチル）ピリジニウムエチルスルファート、１−エチル−３−メチルピリジニウムエチルスルファート、１，３−ジメチルイミダゾリウムジメチルホスファート等が挙げられる。なお、これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００５８】
上記解繊物質が低分子化合物であると、低分子化合物がバイオマス粒子の組織や細胞壁の間に進入するとともに、低分子化合物がクサビのように作用して、バイオマス粒子の解繊が進行しやすくなるという利点がある。
【００５９】
上記高分子化合物は、アルコール系高分子類、エーテル系高分子類、アミド系高分子類、アミン系高分子類及び芳香族系高分子類からなる群より選ばれる少なくとも一つであることが好ましい。
【００６０】
上記アルコール系高分子類としては、ポリエチレングリコール、ポリエーテルポリオール、ポリエステルポリオール、ポリビニルアルコール、アミロース、アミロペクチン、ソルビトル、ポリカプロラクトン、ポリバレロラクトン、ポリブチロラクトン、ポリグリコール、ポリ乳酸等が挙げられる。なお、これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００６１】
上記エーテル系高分子類としては、クラウンエーテル、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等が挙げられる。なお、これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００６２】
上記アミド系高分子類としては、ポリアクリルアミド、キチン、キトサン、ポリビニルピロリドン、ポリカプロラクタム等が挙げられる。なお、これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００６３】
上記アミン系高分子類としては、ポリアリルアミン、ポリリジン、各種のアミン変性アクリルコポリマー等が挙げられる。なお、これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００６４】
上記芳香族系高分子類としては、ポリフェニレンオキサイド、カテキン、タンニン、テルペン等が挙げられる。なお、これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００６５】
上記解繊物質が高分子化合物であると、粉砕の際のせん断力又は熱により、バイオマス粒子の一部の組織が溶融したり、混合液の流動性が向上する。
そうすると、バイオマス粒子の組織や細胞壁表面に高分子化合物が付着して引きはがす作用がより働き、更に、高分子化合物がバイオマス粒子の組織の隙間に進入して、解繊が進行しやすくなるという利点がある。
【００６６】
上記脂肪酸類は、飽和脂肪酸類、不飽和脂肪酸類及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも一つであることが好ましい。
【００６７】
上記飽和脂肪酸類としては、蟻酸、酢酸、蓚酸、クエン酸、マロン酸、コハク酸、プロピオン酸、酪酸、パルミチン酸、ステアリン酸等が挙げられる。なお、これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００６８】
上記不飽和脂肪酸類としては、安息香酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸等が挙げられる。なお、これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００６９】
上記解繊物質が脂肪酸類であると、脂肪酸類が、側鎖にアセチル基を有するヘミセルロースと、親和性を示すので、バイオマス粒子の組織や細胞壁の間に進入しやすい。
また、粉砕の際のせん断力又は熱によりセルロース、ヘミセルロース又はリグニンの水酸基の一部が脂肪酸類とエステル化し、それにより組織間が広がるので、解繊が進行しやすくなるという利点がある。
【００７０】
上記無機アルカリとしては、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等が挙げられる。なお、これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００７１】
上記解繊物質が無機アルカリであると、水がアルカリ性になるためバイオマス粒子中のセルロースやヘミセルロースが部分的に加水分解を起こして、強固な細胞壁などが脆弱になり、粉砕エネルギーにより容易に組織が壊されて解繊が進行しやすくなるという利点がある。
また、アルカリイオンは水和構造を取っているため組織や細胞壁の間に進入してセルロースやヘミセルロースのネットワークを広げて相乗効果で解繊が進行しやすくなるという利点がある。
【００７２】
バイオマス粒子と解繊物質との混合割合は、バイオマス粒子１質量部に対して、解繊物質が０．０１〜２００質量部であることが好ましく、０．０１〜１００質量部であることがより好ましく、０．１ 〜２０質量部であることがより一層好ましい。
解繊物質の混合割合が０．０１質量部未満であると、混合割合が上記範囲内にある場合と比較して、バイオマス粒子を十分に解繊されない傾向にあり、混合割合が２００質量部を超えると、混合割合が上記範囲内にある場合と比較して、粉砕エネルギーの多くが解繊物質に吸収され、バイオマス粒子の解繊に使われる粉砕エネルギーの割合が少なくなり、解繊が効率良く進みにくくなる傾向がある。
【００７３】
上記粉砕工程Ｓ２においては、上述した混合液を機械的に粉砕する。
ここで、粉砕の方法は、特に限定されず、せん断力をバイオマス粒子に印可できる方法であればよい。
例えば、ボールミル、ロッドミル、ハンマーミル、インペラーミル、高速ミキサ、ディスクミル（バッチ式又は連続式）、ミキサ、高圧ホモジナイザー、機械式ホモジナイザー又は超音波ホモジナイザー等が挙げられる。
【００７４】
これらの中でも、粉砕の方法は、ボールミル、ロッドミル、ビーズミル、ディスクミル又はミキサであることが好ましく、ボールミル、ディスクミル又はミキサで行われることがより好ましい。
この場合、比較的容易にバイオマス粒子を後述するスラリー状にすることができる。また、得られる炭素源のサイズのバラツキが小さくなる。
【００７５】
特に好ましくは、粉砕の方法が、ディスクミルの場合である。
この場合、圧力やせん断力を印可することにより、セルロースミクロフィブリルが集合した太いリグノセルロース系バイオマスの束を、より細いリグノセルロース系バイオマスに解くことができ、且つ、連続的にこの処理ができるという利点がある。
【００７６】
粉砕は、バッチ式又は連続式エクストルーダーで行われることが好ましい。
この場合、より短時間で効率よくバイオマス粒子を粉砕できる。
【００７７】
これらの中でも、２軸エクストルーダーで行われることが好ましい。
２軸エクストルーダーは、スクリュー間の物質にせん断力や圧力を印可しながら押し出し、連続的に処理することができる。このため、解繊物質がリグノセルロース系バイオマス全体に均一に分散・浸透しやすくなり、結果として、少量の解繊物質でもバイオマス粒子を十分に解繊できる。
【００７８】
上記粉砕は、０〜５０℃の温度条件下で行われる。
温度が０℃未満であると、温度が上記範囲内にある場合と比較して、水が凍り始めるので、混合液の流動性が低下し、粉砕が不十分となる恐れがあり、温度が５０℃を超えると、温度が上記範囲内にある場合と比較して、多糖類分解酵素生産菌株が失活する虞がある。
【００７９】
こうして、スラリー状の炭素源が得られる。
炭素源をスラリー状とすることにより、多糖分解酵素生産菌株に対する好適なバイオ燃料となる。
【００８０】
上記炭素源は、結晶化度が１５〜５５％であることが好ましい。
この場合、多糖類の分解性が高い酵素液を製造することができる。
【００８１】
炭素源は、繊維長が１００μｍ以下であることが好ましく、５０μｍ以下であることがより好ましい。
また、幅が１μｍ以下であることが好ましく、０．１μｍ以下であることがより好ましく、３〜５ｎｍであることが更に好ましい。
炭素源は、サイズを上記範囲内とすることにより、多糖分解酵素生産菌株の培養される速度が向上する。
【００８２】
（酵素生産工程）
酵素生産工程Ｓ３は、炭素源、培養培地及び多糖分解酵素生産菌株を混合し、培養することにより、酵素液を得る工程である。
【００８３】
多糖分解酵素生産菌株としては、特に限定されないが、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ等を生産するアクレモニウム属、トリコデルマ属、アスペルギルス属又はペニシリウム属に属するものが挙げられる。なお、これらの多糖分解酵素生産菌株の遺伝子を組み換えることによって、多糖分解酵素生産力そのものを新規に加えた菌株、異化可能な糖類の種類が新たに加えられた菌株、生産性が増強された菌株等も上記多糖分解酵素生産菌株に含まれる。
【００８４】
培養培地としては、市販のものや乳清が用いられる。
例えば、ＫＨ２ＰＯ４、Ｔｗｅｅｎ８０、(ＮＨ４)２ＳＯ４、コーンスティープリター、酒石酸カリウム半水和物、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、尿素、乳糖等が挙げられる。これらは単独で用いても、複数を混合して用いてもよい。
培養方法は、特に限定されないが、例えば、振とう培養、旋回培養、静止培養、旋回振とう培養等が好適に用いられる。
【００８５】
こうして、炭素源、培養培地及び多糖分解酵素生産菌株を混合して約１週間培養し、その後、多糖分解酵素生産菌株を取り除くことにより、酵素液（セルラーゼ）が得られる。
得られる酵素液は、ＦＰＵ活性が８ＦＰＵ／ｍＬ以上であることが好ましく、１０ＦＰＵ／ｍＬ以上であることがより好ましい。
ここで、ＦＰＵ活性とは、Ｗｈａｔｍａｎ Ｎｏ．１ろ紙を基質とし、１分間に１μｍｏｌのグルコースを生成する酵素量を意味する。
ＦＰＵ活性が８ＦＰＵ／ｍＬ未満であると、ＦＰＵ活性が上記範囲内になる場合と比較して、酵素コストの増加や、糖化性減少となる傾向にある。
【００８６】
上記酵素生産工程Ｓ３においては、炭素源、培養培地及び多糖分解酵素生産菌株に加え、乳糖が更に含まれていることが好ましい。
この場合、多糖類の分解性が一層高い酵素液が得られる。なお、かかる乳糖は、セルラーゼ生産の誘導炭素源として知られている乳糖を含む乳清等の乳製品加工工場から排出される産業廃棄物であってもよい。
【００８７】
次に、本実施形態に係る糖の製造方法について説明する。
図２は、本発明に係る糖の製造方法の一実施形態を示すフローチャート図である。
図２に示すように、本実施形態に係る糖の製造方法においては、上述した酵素液の製造方法により得られた酵素液を用いた糖製造工程Ｓ４を備える。
【００８８】
すなわち、本実施形態に係る糖の製造方法においては、リグノセルロース系バイオマスを用い、裁断工程Ｓ１、湿式粉砕工程Ｓ２及び酵素生産工程Ｓ３を経て、酵素液としたものが用いられる。
そして、かかる酸素液に、上述した酵素の製造方法において原料として用いたリグノセルロース系バイオマスを加えることにより、リグノセルロース系バイオマスが酵素加水分解される。なお、上記酵素液は、多糖分解酵素生産菌株を除去したものである。
【００８９】
なお、上記酵素生産工程Ｓ３は、培養を途中で停止してもよい。
そうすると、炭素源と多糖分解酵素生産菌株とが残存した酵素液が得られる。すなわち、炭素源が多糖分解酵素生産菌株により部分分解し、多糖分解酵素生産菌株を含んだ酵素液が得られる。
かかる酵素液は、軟らかい炭素源を含むため、サイレージ様家畜飼料（家畜用飼料）として用いると、消化性が向上する。
【００９０】
（糖製造工程）
糖製造工程Ｓ４は、得られた酵素液を用いて、分解用リグノセルロース系バイオマスを糖に加水分解する工程である。
【００９１】
分解用リグノセルロース系バイオマスとしては、稲わら、麦わら、バガス、コーンストーバー等の農産廃棄物、木材、古紙等が挙げられる。なお、かかる分解用リグノセルロース系バイオマスには、これらの発酵物も含まれる。かかる発酵物としては、サイレージ化された稲わらや多量のオガ粉を含む使用済みキノコ培地等が挙げられる。
【００９２】
ここで、酵素液の製造に用いられるリグノセルロース系バイオマスと、糖の製造に用いられる分解用リグノセルロース系バイオマスとが同一物質であることが好ましい。この場合、理由は定かではないが、得られる酵素液が、分解用リグノセルロース系バイオマスの組成を分解するために必要な酵素組成になっていると考えられる。例えば、セルラーゼだけでなく、キシラナーゼやアラビノフラノシダーゼの比活性が高いことが挙げられる。
したがって、この場合、リグノセルロース系バイオマスから上述の酵素の製造方法で得られた酵素液が、分解用リグノセルロース系バイオマスの糖化を促進させるため、酵素量が少なくて済むという利点がある。
【００９３】
上記糖製造工程においては、分解用リグノセルロース系バイオマスに酵素液を浸漬させ、３０〜５５℃の温度条件下で、１〜３日間、放置することにより、分解用リグノセルロース系バイオマスに含まれる多糖が加水分解され糖が得られる。なお、分解用リグノセルロース系バイオマス中のセルロースからはグルコースが得られ、ヘミセルロースからは、キシロース、マンノース、アラビノース、ガラクトース等が得られる。
【００９４】
こうして得られる糖は、発酵させてもよい。
このとき、発酵させる菌としては、例えば、サッカロマイセス、ピシア、ザイモモナス、ラクトバチルス等が挙げられる。なお、これらの菌の遺伝子を組み換えることによって、発酵能力そのものを新規に加えた菌、発酵可能な糖類の種類が新たに加えられた菌、発酵性が増強された菌等も上記発酵させる菌に含まれる。具体的には、エタノール発酵組換え大腸菌やキシロース発酵組換え酵母等が挙げられる。
【００９５】
例えば、糖を発酵によりエタノールに変換することができる。
このエタノールは、化成品原料、溶媒又は自動車用燃料等に用いられる。また、エタノールを含む水溶液は、アルコール系飲料とすることもできる。
また、糖は化学的に変換して、化成品、高分子原料、生理活性物質等の有用物質に用いることも可能である。
【００９６】
図３は、本発明に係る糖の製造方法の他の実施形態を示すフローチャート図である。
図３に示すように、本実施形態に係る糖の製造方法においては、酵素加水分解をする原料として、分解用リグノセルロース系バイオマスを用いる代わりに、所定の処理を施した分解用リグノセルロース系バイオマス（炭素源）を用いる点で、図２に示す糖の製造方法と相違する。
【００９７】
すなわち、本実施形態に係る糖の製造方法において、原料となる分解用リグノセルロース系バイオマスは、最大径が２ｍｍ以下となるように裁断して分解用バイオマス粒子とし、該分解用バイオマス粒子及び水を固形分率が０．１〜２０質量％となるように混合して混合液とし、温度０〜５０℃の条件下で連続的に湿式粉砕し、混合液をスラリー状としたものである。換言すると、このスラリー状としたものは、上述した炭素源と同様な工程を経たものである。
【００９８】
したがって、上記糖の製造方法においては、分解用リグノセルロース系バイオマスを用い、裁断工程Ｓ１、粉砕工程Ｓ２を経て炭素源とし、かかる炭素源の一部を用い、酵素生産工程Ｓ３を経て酵素液とし、多糖分解酵素生産菌株を除去した後、上記炭素源の一部を加えて、糖を製造してもよい。すなわち、炭素源の一部を酵素生産工程に用い、一部を糖の製造に用いてもよい。
この場合、得られる糖の収率が向上すると共に、同じ分解用リグノセルロース系バイオマスから糖まで一貫した生産体系を構築できる。
【００９９】
以上、本発明の好適な実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。
【０１００】
例えば、本実施形態に係る酵素液の製造方法において、粉砕工程を施す前に、バイオマス粒子を、オートクレーブ等を用いて水熱処理してもよい。
この場合、バイオマス粒子が膨潤等により解れやすくなる、すなわち、バイオマス粒子が脆弱になる。
これにより、セルロースミクロフィブリルが部分的に切れたり、外力によって切れ易くなる。
そうすると、バイオマス粒子の解繊が速やかに進行し、解繊が速やかに進行し、分解性が増加することで得られる糖の収率が向上する。
【０１０１】
上記酵素液の製造方法において、粉砕工程により得られる炭素源は、減圧凍結等により乾燥させてから、酵素生産工程に用いてもよい。
この場合、炭素源の運搬等の作業性が向上する。
【０１０２】
上記糖の製造方法においては、分解用リグノセルロース系バイオマスに対して、湿式粉砕する前に、オートクレーブ等の水熱反応を施すことが好ましい。すなわち、分解用リグノセルロース系バイオマスが、最大径が２ｍｍ以下となるように裁断して分解用バイオマス粒子とし、該分解用バイオマス粒子及び水を固形分率が０．１〜２０質量％となるように混合して混合液とした後、温度１００〜１５０℃の条件下で水熱処理をし、その後、温度０〜５０℃の条件下で連続的に湿式粉砕し、混合液をスラリー状としたものであることが好ましい。
この場合、糖の収率がより向上する。
【実施例】
【０１０３】
以下、本発明の微細繊維状リグノセルロース系バイオマスの実施例を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１０４】
（実施例１）
［裁断工程］
原料として稲わらを準備した。そして、これをカッターミルにより２ｍｍパスの稲わら粉（バイオマス粒子）に粗粉砕した。
【０１０５】
［粉砕工程］
稲わら粉１ｋｇに対し、水道水２０Ｌを加え（固形分率４．８質量％）、スーパーマスコロイダー（連続湿式粉砕処理機、ディスクミル、ディスク材質：シリコンカーバイド、ディスク径：１０インチ、ディスク回転数１８００ｒｐｍ、ディスク間隔３０μｍ、増幸産業社製）に投入し、２分間、湿式粉砕処理を施した。
この処理を１０回繰り返し、スラリー状の炭素源を得た。なお、湿式粉砕処理の温度は室温〜４５℃の範囲で行った。そして、スラリー状の炭素源を減圧凍結し、乾燥させた。
得られた炭素源は、繊維長が１００μｍ未満、幅が０．１〜１μｍ、結晶化度が約５０％であった。
【０１０６】
［酵素生産工程］
乾燥させた炭素源４０ｇ／ｌを含む前培養培地（ＫＨ２ＰＯ４：２４ｇ／ｌ、Ｔｗｅｅｎ８０：１ｇ／ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４：５ｇ／ｌ、ＣＳＬ：１０ｇ／ｌ、酒石酸カリウム半水和物：４．７ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：１．２ｇ／ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０１ｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０１ｇ／ｌ、ＣｕＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０１ｇ／ｌ、尿素：２ｇ／ｌ）と、炭素源１００ｇ／ｌ含む本培養培地（ＫＨ２ＰＯ４：２４ｇ／ｌ、Ｔｗｅｅｎ８０：１ｇ／ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４：５ｇ／ｌ、酒石酸カリウム半水和物：４．７ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：１．２ｇ／ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０１ｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０１ｇ／ｌ、ＣｕＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０１ｇ／ｌ、尿素：４ｇ／ｌ）を準備した。
【０１０７】
次に、多糖分解酵素生産菌株（糸状菌）としてAcremonium cellulolyticus ＴＮ株（アクレモニウム属）を準備した。
ＰＤＡスラント培地（ポテトデキストロース寒天培地３９ｇ／ｌ）にて継代培養（３０℃）を行ったA.cellulolyticusＴＮ株を上述した前培養培地にて３０℃、２２０ｒｐｍで１週間、回転振とう培養を行い、引き続いて、本培養培地にて、同様に、回転振とう培養を行なった。そして、培養液の上清を取り出すことにより、酵素液を得た。
【０１０８】
（実施例２）
粉砕工程において、スーパーマスコロイダー（ディスクミル）の代わりに、Ｖｉｂｒａｔｉｎｇ ｓａｍｐｌｅ ｍｉｌｌ（ボールミル）を用い、６０分間、乾式粉砕処理を施したこと以外は実施例１と同様にして、酵素液を得た。
【０１０９】
（比較例１）
粉砕工程は経ないこと、すなわち、裁断工程を経たバイオマス粒子１００ｇ／ｌをそのまま炭素源として用いたこと以外は、実施例１と同様にして、酵素液を得た。
なお、かかる炭素源は、繊維長が２ｍｍ未満、幅が２００〜５００μｍ、結晶化度が約５０％であった。
【０１１０】
（比較例２）
炭素源として、粉末セルロース（Ｓｏｌｋａ ｆｌｏｃ ＢＷ２００）５０ｇ／ｌを用いたこと以外は、実施例１と同様にして、酵素液を得た。
なお、かかる炭素源は、繊維長が５０μｍ未満、幅が０．１〜１μｍ、結晶化度が約７０％であった。
【０１１１】
（比較例３）
酵素液として、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ（製品名）を１０
ＦＰＵ／ｇ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅと、Ｏｐｔｉｍａｓｈ ＢＧ（製品名）を０．２％とを混合して酵素液を得た。
【０１１２】
［評価１］ＦＰＵ活性
１×６ｃｍにカットしたＷｈａｔｍａｎ Ｎｏ．１フィルターろ紙（約５０ｍｇ）を入れたキャップ付き試験管に、０．０５Ｍクエン酸ナトリウムバッファー(ｐＨ４．８)５００μｌ及び実施例１、比較例１又は比較例２で得られた酵素液５００μｌを添加し、５０℃、６０分間で反応させた。
反応終了後、ＤＮＳ試薬３ｍＬを添加し、５分間沸騰水に入れ、呈色反応を行った。氷水で約５分間冷やした後、反応液２００μｌを２．５ｍＬの蒸留水で希釈し、波長５４０ｎｍで吸光度を測定した。あらかじめ作成した検量線より２ｍｇのグルコースを得る酵素の希釈率を求め、０．３７／酵素濃度の値をＦＰＵ／ｍＬと定義した。
得られた結果を表１に示す。
【０１１３】
【表１】
表１の結果より、本発明の酵素液の製造方法で得られた酵素液は、ＦＰＵ活性が極めて優れることがわかった。
このことから、リグノセルロース系バイオマスを用い、裁断工程、粉砕工程を経た炭素源は、多糖分解酵素生産菌株のバイオ燃料として、有効であることがわかった。
【０１１４】
［評価２］糖化量
実施例１及び比較例１で得られた酵素液を用い、糖を製造した。
すなわち、原料として、稲わら基質（分解用リグノセルロース系バイオマス）５％を含む０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液に、４ＦＰＵ／ｇとなるように実施例１又は比較例１の酵素液を加え、４５℃、７２時間で糖化反応を行い、糖化液を得た。なお、実施例１の酵素液については、力価を１０ＦＰＵ／ｇに高めた場合についても測定した。
得られた糖化液に含まれる単糖類の量を表２に示す。
【０１１５】
【表２】
表２の結果より、本発明の糖の製造方法によれば、高収率で糖が得られることが確認された。
【０１１６】
[評価３]酵素液の量と糖化量との関係
実施例１,２及び比較例２,３で得られた酵素液を用い、糖を製造した。
すなわち、原料として、稲わら基質（分解用リグノセルロース系バイオマス）５％を含む０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液に、実施例１又は比較例１の酵素液の量を変えて加え、４５℃、７２時間で糖化反応を行い、糖化液を得た。
各酵素液の量と、糖化量との関係を図４に示す。
【０１１７】
図４に示すように、糖を３００ｍｇ／ｇ-rice strawを得るためには、比較例２のＳｏｌｋａ ｆｌｏｃで培養した酵素液では約２３ｍｇ必要であり、比較例３の市販の酵素の混合物では約３２ｍｇ必要であったのに対し、実施例１及び２の酵素液では、約１０ｍｇの酵素液の量であればよいことが分かった。すなわち、本発明の酵素液において、リグノセルロース系バイオマスと、分解用リグノセルロース系バイオマスとが同一物質であると、酵素量が極端に少なくて済むことが確認された。
【０１１８】
［参考評価］発酵
評価２において、実施例１の酵素液を用いて得られた糖化液を用い発酵を行った。
酵母は、市販パン酵母を用いた。酵母をＹＰＤ液体培地（２％グルコース、２％ポリペプトン、１％酵母エキス、ｐＨ５．０）で３０℃の温度条件下、好気的に前培養を行った。
次いで、上記糖化液を１５０ｒｐｍの速度で撹拌しながら３０℃、ｐＨ５．０に調整し、上記前培養液４００ｍＬを装置に添加し、エタノール発酵を開始した。３０℃、ｐＨ５．０、１５０ｒｐｍを維持しながら４８時間発酵させたものをエタノール発酵液とした。
【０１１９】
発酵液中のエタノール濃度は、４．６１％(ｖ／ｖ)であった。これは、本発酵液中に１１０．６ｍＬ相当の純粋なエタノールが発酵液中に含まれる計算になる。すなわち、発酵阻害を受けることなく、エタノール生産を行うことができた。
【符号の説明】
【０１２０】
Ｓ１・・・裁断工程
Ｓ２・・・粉砕工程
Ｓ３・・・酵素生産工程
Ｓ４・・・糖製造工程
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素液の製造方法及びそれにより得られる酵素液を用いた糖の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
木材や草木等の植物体の主要な化学成分は、セルロース、ヘミセルロース及びリグニンが含まれるリグノセルロース系バイオマスである。
かかるリグノセルロース系バイオマスは、多糖類であるセルロース及びヘミセルロースに、リグニンが絡まった構造となっている。
【０００３】
近年、リグノセルロース系バイオマス資源の有効利用の観点から、リグノセルロース系バイオマスを加水分解してグルコース等の還元糖を得る研究がなされている。
例えば、リグノセルロース系バイオマスを加圧熱水で処理し、機械的粉砕処理を経て、酵素で糖化処理する糖化方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
ところが、上記特許文献１記載の糖化方法においては、リグノセルロース系バイオマスを単糖類に分解すると同時に、酵素が失活するので、酵素が大量に必要となる欠点がある。
【０００５】
これに対し、リグノセルロース系バイオマスを分解するための酵素を製造する方法として、セルロース、ヘミセルロース、あるいは糖類を炭素源して、糖化酵素を産出する微生物を培養する方法が開発されている（例えば、特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−１３６２６３号公報
【特許文献２】特開２００８−５４６７６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、従来から知られているように、セルラーゼ生産菌のセルラーゼ生産能が不十分であるので、上述した特許文献２記載の方法のように、セルロース及びヘミセルロースを炭素源とするのみでは、十分な分解性を有する酵素液を得ることができない。
したがって、特許文献２記載の酵素では、リグノセルロース系バイオマスを完全に単糖類まで分解することは困難である。
【０００８】
また、特許文献２記載の方法においては、セルロースやヘミセルロースを準備する必要があるので、手間がかかると共に、高コストとなる。
【０００９】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、多糖類の分解性が高い酵素液を、容易に製造することができる酵素液の製造方法、並びに、それにより得られる酵素液を用いた糖の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意検討したところ、セルロース又はヘミセルロースを個別に単離するのではなく、リグノセルロース系バイオマス自体から酵素液を製造できないかと考えた。
そして、所定の固形分率で粉砕等することにより、意外にも、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、（１）リグノセルロース系バイオマスを最大径が２ｍｍ以下となるように裁断してバイオマス粒子とする裁断工程と、該バイオマス粒子及び水を固形分率が０．１〜２０質量％となるように混合して混合液とし、温度０〜５０℃の条件下で連続的に粉砕し、混合液をスラリー状の炭素源とする粉砕工程と、炭素源、培養培地及び多糖分解酵素生産菌株を混合し、培養することにより、酵素液を得る酵素生産工程と、を備える酵素液の製造方法に存する。
【００１２】
本発明は、（２）混合液が、バイオマス粒子を解繊するための解繊物質を更に含有する上記（１）記載の酵素液の製造方法に存する。
【００１３】
本発明は、（３）炭素源の繊維長が１００μｍ以下である上記（１）記載の酵素液の製造方法に存する。
【００１４】
本発明は、（４）炭素源の結晶化度が１５〜５５％である上記（１）記載の酵素液の製造方法に存する。
【００１５】
本発明は、（５）酵素生産工程において、炭素源、培養培地及び多糖分解酵素生産菌株に加え、乳糖を含む乳清が更に含まれている上記（１）記載の酵素液の製造方法に存する。
【００１６】
本発明は、（６）多糖分解酵素生産菌株が、アクレモニウム属、トリコデルマ属、アスペルギルス属又はペニシリウム属に属するものである上記（１）記載の酵素液の製造方法に存する。
【００１７】
本発明は、（７）酵素液が多糖類から単糖類への加水分解に用いられる上記（１）記載の酵素液の製造方法に存する。
【００１８】
本発明は、（８）家畜用飼料として用いられ、酵素生産工程において、培養を途中で停止することにより、炭素源と多糖分解酵素生産菌株とを残存させた酵素液を得る上記（１）記載の酵素液の製造方法に存する。
【００１９】
本発明は、（９）上記（１）〜（８）のいずれか一つに記載の酵素液の製造方法により得られる酵素液と、分解用リグノセルロース系バイオマスとを混合し、該分解用リグノセルロース系バイオマスを加水分解して糖とする糖の製造方法に存する。
【００２０】
本発明は、（１０）リグノセルロース系バイオマスと、分解用リグノセルロース系バイオマスとが同一物質である上記（９）記載の糖の製造方法に存する。
【００２１】
本発明は、（１１）分解用リグノセルロース系バイオマスが、最大径が２ｍｍ以下となるように裁断して分解用バイオマス粒子とし、該分解用バイオマス粒子及び水を固形分率が０．１〜２０質量％となるように混合して混合液とし、温度０〜５０℃の条件下で連続的に粉砕し、混合液をスラリー状としたものである上記（９）記載の糖の製造方法に存する。
【００２２】
本発明は、（１２）分解用リグノセルロース系バイオマスが、最大径が２ｍｍ以下となるように裁断して分解用バイオマス粒子とし、該分解用バイオマス粒子及び水を固形分率が０．１〜２０質量％となるように混合して混合液とし、温度１００〜１５０℃の条件下で水熱処理をし、温度０〜５０℃の条件下で連続的に粉砕し、混合液をスラリー状としたものである上記（９）記載の糖の製造方法に存する。
【００２３】
なお、本発明の目的に添ったものであれば、上記（１）〜（１２）を適宜組み合わせた構成も採用可能である。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の酵素液の製造方法においては、リグノセルロース系バイオマスを所定のサイズに裁断し、所定の条件下で粉砕することにより、炭素源とすることができる。
そして、かかる炭素源は、多糖分解酵素生産菌株に対して好適な栄養となる。このため、この炭素源に、多糖分解酵素生産菌株及び培養培地を加えて培養することにより、多糖類の分解性が高い酵素液が得られる。
したがって、上記酵素液の製造方法によれば、多糖類の分解性が高い酵素液を、容易に製造することができる。また、得られる酵素液は、多糖類から単糖類への加水分解に好適に用いられる。
【００２５】
このように、得られる酵素液が、多糖類の分解性に優れる理由は、定かではないが、上述のような工程を経ることによって、炭素源の結晶構造が維持されるためであると考えられる。なお、理由はこれに限定されない。
特に、炭素源の結晶化度は１５〜５５％であることが好ましい。
【００２６】
上記酵素液の製造方法においては、混合液が、バイオマス粒子を解繊するための解繊物質を更に含有すると、解繊物質がバイオマス粒子のセルロースのミクロフィブリルの間に進入してこれらの隙間を広げ、同時に組織を破壊し、セルロースミクロフィブリルに付着したヘミセルロース及びリグニンが剥がされる。
これにより、バイオマス粒子は、セルロース分子鎖の最小集合単位であるミクロフィブリルにまで解かれることになる。
このため、得られる炭素源は、リグノセルロース系バイオマス独自の結晶性が確実に維持される。すなわち、表面や内部のセルロース分子は分子鎖配列・配向の乱れや化学的な変性をほとんど受けていない結晶性を有する炭素源が得られる。
【００２７】
上記酵素液の製造方法においては、炭素源の繊維長が１００μｍ以下であると、多糖分解酵素生産菌株の増殖速度が向上する。
【００２８】
上記酵素液の製造方法の酵素生産工程においては、炭素源、培養培地及び多糖分解酵素生産菌株に加え、乳糖を含む乳清が更に含まれていると、多糖類の分解性が一層高い酵素液が得られる。
【００２９】
上記酵素液の製造方法においては、多糖分解酵素生産菌株が、アクレモニウム属、トリコデルマ属、アスペルギルス属又はペニシリウム属に属するものであると、確実に多糖類の分解性が高い酵素液が得られる。
【００３０】
上記酵素液の製造方法の酵素生産工程においては、培養を途中で停止することにより、炭素源と多糖分解酵素生産菌株とを残存させた酵素液が得られる。
この場合、かかる酵素液は、サイレージ様家畜飼料（家畜用飼料）として好適に用いられる。
【００３１】
本発明の糖の製造方法においては、上述した酵素液と、リグノセルロース系バイオマス（以下便宜的に「分解用リグノセルロース系バイオマス」という。）とを混合することにより、分解用リグノセルロース系バイオマスが酵素加水分解される。これにより、糖が得られる。なお、ここでいう「糖」は、単糖を意味する。
このとき、上述した酵素液を用いているので、分解用リグノセルロース系バイオマスは、高収率で糖に分解される。
【００３２】
本発明の糖の製造方法においては、リグノセルロース系バイオマスと、分解用リグノセルロース系バイオマスとが同一物質であると、酵素量が少なくて済む。すなわち、上記分解用リグノセルロース系バイオマスを酵素で糖化させる場合、市販の酵素液やＳｏｌｋａ
ｆｌｏｃで培養したときに得られる粗酵素液を用いるよりも、分解用リグノセルロース系バイオマスと同一物質のリグノセルロース系バイオマスから上述の酵素の製造方法で得られる酵素液を用いたほうが、酵素量が少なくて済む。
また、同じリグノセルロース系バイオマスから糖まで一貫した生産体系を構築できる。
【００３３】
本発明の糖の製造方法においては、分解用リグノセルロース系バイオマスが、最大径が２ｍｍ以下となるように裁断してバイオマス粒子（以下便宜的に「分解用バイオマス粒子」という。）とし、該分解用バイオマス粒子及び水を固形分率が０．１〜２０質量％となるように混合して混合液とし、温度０〜５０℃の条件下で連続的に粉砕し、混合液をスラリー状としたものであると、得られる糖の収率が向上する。なお、分解用バイオマス粒子に水熱処理を施すと、糖の収率がより向上する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、本発明に係る酵素液の製造方法の一実施形態を示すフローチャート図である。
【図２】図２は、本発明に係る糖の製造方法の一実施形態を示すフローチャート図である。
【図３】図３は、本発明に係る糖の製造方法の他の実施形態を示すフローチャート図である。
【図４】図４は、実施例１,２及び比較例２,３で得られた酵素液の量と、糖化量との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
以下、必要に応じて図面を参照しつつ、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
図１は、本発明に係る酵素液の製造方法の一実施形態を示すフローチャート図である。
図１に示すように、本実施形態に係る酵素液の製造方法は、リグノセルロース系バイオマスをバイオマス粒子とする裁断工程Ｓ１と、該バイオマス粒子及び水を混合して混合液とし、粉砕により炭素源とする粉砕工程Ｓ２と、炭素源、培養培地及び多糖分解酵素生産菌株を混合し、培養することにより、酵素液を得る酵素生産工程Ｓ３と、を備える。
【００３６】
本実施形態に係る酵素液の製造方法においては、リグノセルロース系バイオマスを所定のサイズに裁断し（裁断工程Ｓ１）、所定の条件下で湿式粉砕する（粉砕工程Ｓ２）ことにより、結晶構造が維持された炭素源となる。
ここで、湿式粉砕とは、液体の存在下、こなごなに打ち砕く処理をする方式を意味する。なお、液体を用いない乾式粉砕では顕著に粉砕物の結晶化度が低下する。
【００３７】
そして、かかる炭素源は、結晶性が維持されているので、多糖分解酵素生産菌株に対して好適な栄養となる。このため、この炭素源に、多糖分解酵素生産菌株及び培養培地を加えて培養する（酵素生産工程Ｓ３）ことにより、多糖類の分解性が高い酵素液が得られる。
したがって、上記酵素液の製造方法によれば、多糖類の分解性が高い酵素液を、容易に製造できる。また、得られる酵素液は、多糖類から単糖類への加水分解に好適に用いられる。
【００３８】
以下、裁断工程Ｓ１、粉砕工程Ｓ２及び酵素生産工程Ｓ３について、更に詳細に説明する。
（裁断工程）
裁断工程Ｓ１は、リグノセルロース系バイオマスを所定の粒子径となるように裁断してバイオマス粒子とする工程である。
【００３９】
リグノセルロース系バイオマスとしては、稲わら、麦わら、バガス、コーンストーバー等の農産廃棄物、木材、古紙等が挙げられる。なお、かかるリグノセルロース系バイオマスには、これらの発酵物も含まれる。かかる発酵物としては、サイレージ化された稲わらや多量のオガ粉を含む使用済みキノコ培地等が挙げられる。
【００４０】
これらのリグノセルロース系バイオマスは、グルコースがβ１−４結合されたセルロース、キシロース（広葉樹、草本類）、マンノース（針葉樹）等が主成分であり、これにヘミセルロースやリグニンが絡み合った構造となっている。
【００４１】
上記裁断工程においては、リグノセルロース系バイオマスを裁断することにより、バイオマス粒子が得られる。
ここで、リグノセルロース系バイオマスを裁断する方法としては、カッターミル、ハンマーミル、エクストルーダー等が挙げられる。
【００４２】
上記裁断工程により得られるバイオマス粒子の粒子径は、最大径が２ｍｍ以下になるようにする。
ここで、最大径とは、バイオマス粒子の任意の断面における最大の直径を意味する。
上記最大径が２ｍｍを超えると、後述する粉砕工程において、十分な炭素源とならず、得られる酵素液も多糖類の分解性が不十分となる。なお、得られるバイオマス粒子の形状は特に限定されない。
【００４３】
（粉砕工程）
粉砕工程Ｓ２は、得られたバイオマス粒子及び水を所定の固形分率となるように混合して混合液とし、所定の条件下で連続的に湿式粉砕し、混合液をスラリー状の炭素源とする工程である。
【００４４】
上記混合液は、固形分であるバイオマス粒子と、液体である水との混合物となっている。すなわち、水中にバイオマス粒子が分散された状態となっている。
【００４５】
また、混合液全体における固形分率は、０．１〜２０質量％である。すなわち、混合液全量に対するバイオマス粒子の含有割合は、０．１〜２０質量％である。
固形分率が０．１質量％未満であると、得られる酵素液の量が少なくなるので、多糖類の分解性が不十分となる傾向にあり、固形分率が２０質量％を超えると、湿式粉砕が十分にできなくなる場合がある。
【００４６】
上記混合液は、バイオマス粒子を解繊するための解繊物質を更に含有してもよい。すなわち、この場合の混合液は、バイオマス粒子、水及び解繊物質からなるものであってもよい。
混合液が解繊物質を含むと、解繊物質がバイオマス粒子のセルロースのミクロフィブリルの間に進入してこれらの隙間を広げ、同時に組織を破壊し、セルロースミクロフィブリルに付着したヘミセルロース及びリグニンが剥がされ、バイオマス粒子は、セルロース分子鎖の最小集合単位であるミクロフィブリルにまで解かれることになる。
このため、得られる炭素源は、リグノセルロース系バイオマス独自の結晶性が維持される。すなわち、表面や内部のセルロース分子は分子鎖配列・配向の乱れや化学的な変性をほとんど受けていない結晶性を有する炭素源が得られる。なお、解繊物質が含まれる場合であっても、固形分率は、０．１〜２０質量％であることが好ましい。
【００４７】
かかる解繊物質としては、特に限定されないが、低分子化合物、高分子化合物、脂肪酸類又は無機アルカリが好適に用いられる。これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００４８】
上記低分子化合物は、アルコール類、エーテル類、ケトン類、スルホキシド類、アミド類、アミン類、芳香族類及びモルフォリン類からなる群より選ばれる少なくとも一つであることが好ましい。
【００４９】
上記アルコール類としては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、ｔ−ブタノール、エチレングリコール等のアルキレングリコール、トリメチレンプロパノール、ブタンジオール、グリセリン等が挙げられる。なお、これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００５０】
上記エーテル類としては、１，４−ジオキサン等が挙げられる。なお、これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００５１】
上記ケトン類としては、アセトン、メチルエチルケトン、ジエチルケトン、メチルプロピルケトン、ステアリルケテンダイマー等が挙げられる。なお、これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００５２】
上記スルホキシド類としては、ジメチルスルホキシド、ビスフェニルスルホキシド類、ビス（４−ヒドロキシフェニル）スルホキシド、ビス（３，５−ジメチル−４−ヒドロキシフェニル）スルホキシド、ビス（２，３−ジヒドロキシフェニル）スルホキシド、ビス（５−クロロ−２，３−ジヒドロキシフェニル）スルホキシド、ビス（２，４−ジヒドロキシフェニル）スルホキシド、ビス（２，４−ジヒドロキシ−６−メチルフェニル）スルホキシド、ビス（５−クロロ−２，４−ジヒドロキシフェニル）スルホキシド、ビス（２，５−ジヒドロキシフェニル）スルホキシド、ビス（３，４−ジヒドロキシフェニル）スルホキシド等のビスヒドロキシフェニルスルホキシド類等が挙げられる。なお、これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００５３】
上記アミド類としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、オレイン酸アミド、ステアリン酸アミド等が挙げられる。なお、これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００５４】
上記アミン類としては、アンモニア、アニリン、ジメチルアミン、トリエチルアミン、エタノールアミン、ジエチルエタノールアミン等が挙げられる。なお、これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００５５】
上記芳香族類としては、ベンゼン、トルエン、キシレン、フェノール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、カテキン類、テルペン類等が挙げられる。なお、これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００５６】
上記モルフォリン類としては、Ｎ−メチルモルフォリン、Ｎ−メチルモルフォリン−Ｎ−オキシド等が挙げられる。なお、これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００５７】
また、上記低分子化合物にはイオン性液体が含まれる。ここで、イオン性液体とは、室温でも液体で存在する塩を意味する。
かかる上記イオン性液体としては、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムクロライド、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム、１−エチル−３（ヒドロキシメチル）ピリジニウムエチルスルファート、１−エチル−３−メチルピリジニウムエチルスルファート、１，３−ジメチルイミダゾリウムジメチルホスファート等が挙げられる。なお、これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００５８】
上記解繊物質が低分子化合物であると、低分子化合物がバイオマス粒子の組織や細胞壁の間に進入するとともに、低分子化合物がクサビのように作用して、バイオマス粒子の解繊が進行しやすくなるという利点がある。
【００５９】
上記高分子化合物は、アルコール系高分子類、エーテル系高分子類、アミド系高分子類、アミン系高分子類及び芳香族系高分子類からなる群より選ばれる少なくとも一つであることが好ましい。
【００６０】
上記アルコール系高分子類としては、ポリエチレングリコール、ポリエーテルポリオール、ポリエステルポリオール、ポリビニルアルコール、アミロース、アミロペクチン、ソルビトル、ポリカプロラクトン、ポリバレロラクトン、ポリブチロラクトン、ポリグリコール、ポリ乳酸等が挙げられる。なお、これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００６１】
上記エーテル系高分子類としては、クラウンエーテル、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等が挙げられる。なお、これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００６２】
上記アミド系高分子類としては、ポリアクリルアミド、キチン、キトサン、ポリビニルピロリドン、ポリカプロラクタム等が挙げられる。なお、これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００６３】
上記アミン系高分子類としては、ポリアリルアミン、ポリリジン、各種のアミン変性アクリルコポリマー等が挙げられる。なお、これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００６４】
上記芳香族系高分子類としては、ポリフェニレンオキサイド、カテキン、タンニン、テルペン等が挙げられる。なお、これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００６５】
上記解繊物質が高分子化合物であると、粉砕の際のせん断力又は熱により、バイオマス粒子の一部の組織が溶融したり、混合液の流動性が向上する。
そうすると、バイオマス粒子の組織や細胞壁表面に高分子化合物が付着して引きはがす作用がより働き、更に、高分子化合物がバイオマス粒子の組織の隙間に進入して、解繊が進行しやすくなるという利点がある。
【００６６】
上記脂肪酸類は、飽和脂肪酸類、不飽和脂肪酸類及びこれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも一つであることが好ましい。
【００６７】
上記飽和脂肪酸類としては、蟻酸、酢酸、蓚酸、クエン酸、マロン酸、コハク酸、プロピオン酸、酪酸、パルミチン酸、ステアリン酸等が挙げられる。なお、これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００６８】
上記不飽和脂肪酸類としては、安息香酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸等が挙げられる。なお、これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００６９】
上記解繊物質が脂肪酸類であると、脂肪酸類が、側鎖にアセチル基を有するヘミセルロースと、親和性を示すので、バイオマス粒子の組織や細胞壁の間に進入しやすい。
また、粉砕の際のせん断力又は熱によりセルロース、ヘミセルロース又はリグニンの水酸基の一部が脂肪酸類とエステル化し、それにより組織間が広がるので、解繊が進行しやすくなるという利点がある。
【００７０】
上記無機アルカリとしては、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等が挙げられる。なお、これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００７１】
上記解繊物質が無機アルカリであると、水がアルカリ性になるためバイオマス粒子中のセルロースやヘミセルロースが部分的に加水分解を起こして、強固な細胞壁などが脆弱になり、粉砕エネルギーにより容易に組織が壊されて解繊が進行しやすくなるという利点がある。
また、アルカリイオンは水和構造を取っているため組織や細胞壁の間に進入してセルロースやヘミセルロースのネットワークを広げて相乗効果で解繊が進行しやすくなるという利点がある。
【００７２】
バイオマス粒子と解繊物質との混合割合は、バイオマス粒子１質量部に対して、解繊物質が０．０１〜２００質量部であることが好ましく、０．０１〜１００質量部であることがより好ましく、０．１ 〜２０質量部であることがより一層好ましい。
解繊物質の混合割合が０．０１質量部未満であると、混合割合が上記範囲内にある場合と比較して、バイオマス粒子を十分に解繊されない傾向にあり、混合割合が２００質量部を超えると、混合割合が上記範囲内にある場合と比較して、粉砕エネルギーの多くが解繊物質に吸収され、バイオマス粒子の解繊に使われる粉砕エネルギーの割合が少なくなり、解繊が効率良く進みにくくなる傾向がある。
【００７３】
上記粉砕工程Ｓ２においては、上述した混合液を機械的に粉砕する。
ここで、粉砕の方法は、特に限定されず、せん断力をバイオマス粒子に印可できる方法であればよい。
例えば、ボールミル、ロッドミル、ハンマーミル、インペラーミル、高速ミキサ、ディスクミル（バッチ式又は連続式）、ミキサ、高圧ホモジナイザー、機械式ホモジナイザー又は超音波ホモジナイザー等が挙げられる。
【００７４】
これらの中でも、粉砕の方法は、ボールミル、ロッドミル、ビーズミル、ディスクミル又はミキサであることが好ましく、ボールミル、ディスクミル又はミキサで行われることがより好ましい。
この場合、比較的容易にバイオマス粒子を後述するスラリー状にすることができる。また、得られる炭素源のサイズのバラツキが小さくなる。
【００７５】
特に好ましくは、粉砕の方法が、ディスクミルの場合である。
この場合、圧力やせん断力を印可することにより、セルロースミクロフィブリルが集合した太いリグノセルロース系バイオマスの束を、より細いリグノセルロース系バイオマスに解くことができ、且つ、連続的にこの処理ができるという利点がある。
【００７６】
粉砕は、バッチ式又は連続式エクストルーダーで行われることが好ましい。
この場合、より短時間で効率よくバイオマス粒子を粉砕できる。
【００７７】
これらの中でも、２軸エクストルーダーで行われることが好ましい。
２軸エクストルーダーは、スクリュー間の物質にせん断力や圧力を印可しながら押し出し、連続的に処理することができる。このため、解繊物質がリグノセルロース系バイオマス全体に均一に分散・浸透しやすくなり、結果として、少量の解繊物質でもバイオマス粒子を十分に解繊できる。
【００７８】
上記粉砕は、０〜５０℃の温度条件下で行われる。
温度が０℃未満であると、温度が上記範囲内にある場合と比較して、水が凍り始めるので、混合液の流動性が低下し、粉砕が不十分となる恐れがあり、温度が５０℃を超えると、温度が上記範囲内にある場合と比較して、多糖類分解酵素生産菌株が失活する虞がある。
【００７９】
こうして、スラリー状の炭素源が得られる。
炭素源をスラリー状とすることにより、多糖分解酵素生産菌株に対する好適なバイオ燃料となる。
【００８０】
上記炭素源は、結晶化度が１５〜５５％であることが好ましい。
この場合、多糖類の分解性が高い酵素液を製造することができる。
【００８１】
炭素源は、繊維長が１００μｍ以下であることが好ましく、５０μｍ以下であることがより好ましい。
また、幅が１μｍ以下であることが好ましく、０．１μｍ以下であることがより好ましく、３〜５ｎｍであることが更に好ましい。
炭素源は、サイズを上記範囲内とすることにより、多糖分解酵素生産菌株の培養される速度が向上する。
【００８２】
（酵素生産工程）
酵素生産工程Ｓ３は、炭素源、培養培地及び多糖分解酵素生産菌株を混合し、培養することにより、酵素液を得る工程である。
【００８３】
多糖分解酵素生産菌株としては、特に限定されないが、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ等を生産するアクレモニウム属、トリコデルマ属、アスペルギルス属又はペニシリウム属に属するものが挙げられる。なお、これらの多糖分解酵素生産菌株の遺伝子を組み換えることによって、多糖分解酵素生産力そのものを新規に加えた菌株、異化可能な糖類の種類が新たに加えられた菌株、生産性が増強された菌株等も上記多糖分解酵素生産菌株に含まれる。
【００８４】
培養培地としては、市販のものや乳清が用いられる。
例えば、ＫＨ２ＰＯ４、Ｔｗｅｅｎ８０、(ＮＨ４)２ＳＯ４、コーンスティープリター、酒石酸カリウム半水和物、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、尿素、乳糖等が挙げられる。これらは単独で用いても、複数を混合して用いてもよい。
培養方法は、特に限定されないが、例えば、振とう培養、旋回培養、静止培養、旋回振とう培養等が好適に用いられる。
【００８５】
こうして、炭素源、培養培地及び多糖分解酵素生産菌株を混合して約１週間培養し、その後、多糖分解酵素生産菌株を取り除くことにより、酵素液（セルラーゼ）が得られる。
得られる酵素液は、ＦＰＵ活性が８ＦＰＵ／ｍＬ以上であることが好ましく、１０ＦＰＵ／ｍＬ以上であることがより好ましい。
ここで、ＦＰＵ活性とは、Ｗｈａｔｍａｎ Ｎｏ．１ろ紙を基質とし、１分間に１μｍｏｌのグルコースを生成する酵素量を意味する。
ＦＰＵ活性が８ＦＰＵ／ｍＬ未満であると、ＦＰＵ活性が上記範囲内になる場合と比較して、酵素コストの増加や、糖化性減少となる傾向にある。
【００８６】
上記酵素生産工程Ｓ３においては、炭素源、培養培地及び多糖分解酵素生産菌株に加え、乳糖が更に含まれていることが好ましい。
この場合、多糖類の分解性が一層高い酵素液が得られる。なお、かかる乳糖は、セルラーゼ生産の誘導炭素源として知られている乳糖を含む乳清等の乳製品加工工場から排出される産業廃棄物であってもよい。
【００８７】
次に、本実施形態に係る糖の製造方法について説明する。
図２は、本発明に係る糖の製造方法の一実施形態を示すフローチャート図である。
図２に示すように、本実施形態に係る糖の製造方法においては、上述した酵素液の製造方法により得られた酵素液を用いた糖製造工程Ｓ４を備える。
【００８８】
すなわち、本実施形態に係る糖の製造方法においては、リグノセルロース系バイオマスを用い、裁断工程Ｓ１、湿式粉砕工程Ｓ２及び酵素生産工程Ｓ３を経て、酵素液としたものが用いられる。
そして、かかる酸素液に、上述した酵素の製造方法において原料として用いたリグノセルロース系バイオマスを加えることにより、リグノセルロース系バイオマスが酵素加水分解される。なお、上記酵素液は、多糖分解酵素生産菌株を除去したものである。
【００８９】
なお、上記酵素生産工程Ｓ３は、培養を途中で停止してもよい。
そうすると、炭素源と多糖分解酵素生産菌株とが残存した酵素液が得られる。すなわち、炭素源が多糖分解酵素生産菌株により部分分解し、多糖分解酵素生産菌株を含んだ酵素液が得られる。
かかる酵素液は、軟らかい炭素源を含むため、サイレージ様家畜飼料（家畜用飼料）として用いると、消化性が向上する。
【００９０】
（糖製造工程）
糖製造工程Ｓ４は、得られた酵素液を用いて、分解用リグノセルロース系バイオマスを糖に加水分解する工程である。
【００９１】
分解用リグノセルロース系バイオマスとしては、稲わら、麦わら、バガス、コーンストーバー等の農産廃棄物、木材、古紙等が挙げられる。なお、かかる分解用リグノセルロース系バイオマスには、これらの発酵物も含まれる。かかる発酵物としては、サイレージ化された稲わらや多量のオガ粉を含む使用済みキノコ培地等が挙げられる。
【００９２】
ここで、酵素液の製造に用いられるリグノセルロース系バイオマスと、糖の製造に用いられる分解用リグノセルロース系バイオマスとが同一物質であることが好ましい。この場合、理由は定かではないが、得られる酵素液が、分解用リグノセルロース系バイオマスの組成を分解するために必要な酵素組成になっていると考えられる。例えば、セルラーゼだけでなく、キシラナーゼやアラビノフラノシダーゼの比活性が高いことが挙げられる。
したがって、この場合、リグノセルロース系バイオマスから上述の酵素の製造方法で得られた酵素液が、分解用リグノセルロース系バイオマスの糖化を促進させるため、酵素量が少なくて済むという利点がある。
【００９３】
上記糖製造工程においては、分解用リグノセルロース系バイオマスに酵素液を浸漬させ、３０〜５５℃の温度条件下で、１〜３日間、放置することにより、分解用リグノセルロース系バイオマスに含まれる多糖が加水分解され糖が得られる。なお、分解用リグノセルロース系バイオマス中のセルロースからはグルコースが得られ、ヘミセルロースからは、キシロース、マンノース、アラビノース、ガラクトース等が得られる。
【００９４】
こうして得られる糖は、発酵させてもよい。
このとき、発酵させる菌としては、例えば、サッカロマイセス、ピシア、ザイモモナス、ラクトバチルス等が挙げられる。なお、これらの菌の遺伝子を組み換えることによって、発酵能力そのものを新規に加えた菌、発酵可能な糖類の種類が新たに加えられた菌、発酵性が増強された菌等も上記発酵させる菌に含まれる。具体的には、エタノール発酵組換え大腸菌やキシロース発酵組換え酵母等が挙げられる。
【００９５】
例えば、糖を発酵によりエタノールに変換することができる。
このエタノールは、化成品原料、溶媒又は自動車用燃料等に用いられる。また、エタノールを含む水溶液は、アルコール系飲料とすることもできる。
また、糖は化学的に変換して、化成品、高分子原料、生理活性物質等の有用物質に用いることも可能である。
【００９６】
図３は、本発明に係る糖の製造方法の他の実施形態を示すフローチャート図である。
図３に示すように、本実施形態に係る糖の製造方法においては、酵素加水分解をする原料として、分解用リグノセルロース系バイオマスを用いる代わりに、所定の処理を施した分解用リグノセルロース系バイオマス（炭素源）を用いる点で、図２に示す糖の製造方法と相違する。
【００９７】
すなわち、本実施形態に係る糖の製造方法において、原料となる分解用リグノセルロース系バイオマスは、最大径が２ｍｍ以下となるように裁断して分解用バイオマス粒子とし、該分解用バイオマス粒子及び水を固形分率が０．１〜２０質量％となるように混合して混合液とし、温度０〜５０℃の条件下で連続的に湿式粉砕し、混合液をスラリー状としたものである。換言すると、このスラリー状としたものは、上述した炭素源と同様な工程を経たものである。
【００９８】
したがって、上記糖の製造方法においては、分解用リグノセルロース系バイオマスを用い、裁断工程Ｓ１、粉砕工程Ｓ２を経て炭素源とし、かかる炭素源の一部を用い、酵素生産工程Ｓ３を経て酵素液とし、多糖分解酵素生産菌株を除去した後、上記炭素源の一部を加えて、糖を製造してもよい。すなわち、炭素源の一部を酵素生産工程に用い、一部を糖の製造に用いてもよい。
この場合、得られる糖の収率が向上すると共に、同じ分解用リグノセルロース系バイオマスから糖まで一貫した生産体系を構築できる。
【００９９】
以上、本発明の好適な実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。
【０１００】
例えば、本実施形態に係る酵素液の製造方法において、粉砕工程を施す前に、バイオマス粒子を、オートクレーブ等を用いて水熱処理してもよい。
この場合、バイオマス粒子が膨潤等により解れやすくなる、すなわち、バイオマス粒子が脆弱になる。
これにより、セルロースミクロフィブリルが部分的に切れたり、外力によって切れ易くなる。
そうすると、バイオマス粒子の解繊が速やかに進行し、解繊が速やかに進行し、分解性が増加することで得られる糖の収率が向上する。
【０１０１】
上記酵素液の製造方法において、粉砕工程により得られる炭素源は、減圧凍結等により乾燥させてから、酵素生産工程に用いてもよい。
この場合、炭素源の運搬等の作業性が向上する。
【０１０２】
上記糖の製造方法においては、分解用リグノセルロース系バイオマスに対して、湿式粉砕する前に、オートクレーブ等の水熱反応を施すことが好ましい。すなわち、分解用リグノセルロース系バイオマスが、最大径が２ｍｍ以下となるように裁断して分解用バイオマス粒子とし、該分解用バイオマス粒子及び水を固形分率が０．１〜２０質量％となるように混合して混合液とした後、温度１００〜１５０℃の条件下で水熱処理をし、その後、温度０〜５０℃の条件下で連続的に湿式粉砕し、混合液をスラリー状としたものであることが好ましい。
この場合、糖の収率がより向上する。
【実施例】
【０１０３】
以下、本発明の微細繊維状リグノセルロース系バイオマスの実施例を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１０４】
（実施例１）
［裁断工程］
原料として稲わらを準備した。そして、これをカッターミルにより２ｍｍパスの稲わら粉（バイオマス粒子）に粗粉砕した。
【０１０５】
［粉砕工程］
稲わら粉１ｋｇに対し、水道水２０Ｌを加え（固形分率４．８質量％）、スーパーマスコロイダー（連続湿式粉砕処理機、ディスクミル、ディスク材質：シリコンカーバイド、ディスク径：１０インチ、ディスク回転数１８００ｒｐｍ、ディスク間隔３０μｍ、増幸産業社製）に投入し、２分間、湿式粉砕処理を施した。
この処理を１０回繰り返し、スラリー状の炭素源を得た。なお、湿式粉砕処理の温度は室温〜４５℃の範囲で行った。そして、スラリー状の炭素源を減圧凍結し、乾燥させた。
得られた炭素源は、繊維長が１００μｍ未満、幅が０．１〜１μｍ、結晶化度が約５０％であった。
【０１０６】
［酵素生産工程］
乾燥させた炭素源４０ｇ／ｌを含む前培養培地（ＫＨ２ＰＯ４：２４ｇ／ｌ、Ｔｗｅｅｎ８０：１ｇ／ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４：５ｇ／ｌ、ＣＳＬ：１０ｇ／ｌ、酒石酸カリウム半水和物：４．７ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：１．２ｇ／ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０１ｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０１ｇ／ｌ、ＣｕＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０１ｇ／ｌ、尿素：２ｇ／ｌ）と、炭素源１００ｇ／ｌ含む本培養培地（ＫＨ２ＰＯ４：２４ｇ／ｌ、Ｔｗｅｅｎ８０：１ｇ／ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４：５ｇ／ｌ、酒石酸カリウム半水和物：４．７ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：１．２ｇ／ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０１ｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０１ｇ／ｌ、ＣｕＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０１ｇ／ｌ、尿素：４ｇ／ｌ）を準備した。
【０１０７】
次に、多糖分解酵素生産菌株（糸状菌）としてAcremonium cellulolyticus ＴＮ株（アクレモニウム属）を準備した。
ＰＤＡスラント培地（ポテトデキストロース寒天培地３９ｇ／ｌ）にて継代培養（３０℃）を行ったA.cellulolyticusＴＮ株を上述した前培養培地にて３０℃、２２０ｒｐｍで１週間、回転振とう培養を行い、引き続いて、本培養培地にて、同様に、回転振とう培養を行なった。そして、培養液の上清を取り出すことにより、酵素液を得た。
【０１０８】
（実施例２）
粉砕工程において、スーパーマスコロイダー（ディスクミル）の代わりに、Ｖｉｂｒａｔｉｎｇ ｓａｍｐｌｅ ｍｉｌｌ（ボールミル）を用い、６０分間、乾式粉砕処理を施したこと以外は実施例１と同様にして、酵素液を得た。
【０１０９】
（比較例１）
粉砕工程は経ないこと、すなわち、裁断工程を経たバイオマス粒子１００ｇ／ｌをそのまま炭素源として用いたこと以外は、実施例１と同様にして、酵素液を得た。
なお、かかる炭素源は、繊維長が２ｍｍ未満、幅が２００〜５００μｍ、結晶化度が約５０％であった。
【０１１０】
（比較例２）
炭素源として、粉末セルロース（Ｓｏｌｋａ ｆｌｏｃ ＢＷ２００）５０ｇ／ｌを用いたこと以外は、実施例１と同様にして、酵素液を得た。
なお、かかる炭素源は、繊維長が５０μｍ未満、幅が０．１〜１μｍ、結晶化度が約７０％であった。
【０１１１】
（比較例３）
酵素液として、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ（製品名）を１０
ＦＰＵ／ｇ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅと、Ｏｐｔｉｍａｓｈ ＢＧ（製品名）を０．２％とを混合して酵素液を得た。
【０１１２】
［評価１］ＦＰＵ活性
１×６ｃｍにカットしたＷｈａｔｍａｎ Ｎｏ．１フィルターろ紙（約５０ｍｇ）を入れたキャップ付き試験管に、０．０５Ｍクエン酸ナトリウムバッファー(ｐＨ４．８)５００μｌ及び実施例１、比較例１又は比較例２で得られた酵素液５００μｌを添加し、５０℃、６０分間で反応させた。
反応終了後、ＤＮＳ試薬３ｍＬを添加し、５分間沸騰水に入れ、呈色反応を行った。氷水で約５分間冷やした後、反応液２００μｌを２．５ｍＬの蒸留水で希釈し、波長５４０ｎｍで吸光度を測定した。あらかじめ作成した検量線より２ｍｇのグルコースを得る酵素の希釈率を求め、０．３７／酵素濃度の値をＦＰＵ／ｍＬと定義した。
得られた結果を表１に示す。
【０１１３】
【表１】
表１の結果より、本発明の酵素液の製造方法で得られた酵素液は、ＦＰＵ活性が極めて優れることがわかった。
このことから、リグノセルロース系バイオマスを用い、裁断工程、粉砕工程を経た炭素源は、多糖分解酵素生産菌株のバイオ燃料として、有効であることがわかった。
【０１１４】
［評価２］糖化量
実施例１及び比較例１で得られた酵素液を用い、糖を製造した。
すなわち、原料として、稲わら基質（分解用リグノセルロース系バイオマス）５％を含む０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液に、４ＦＰＵ／ｇとなるように実施例１又は比較例１の酵素液を加え、４５℃、７２時間で糖化反応を行い、糖化液を得た。なお、実施例１の酵素液については、力価を１０ＦＰＵ／ｇに高めた場合についても測定した。
得られた糖化液に含まれる単糖類の量を表２に示す。
【０１１５】
【表２】
表２の結果より、本発明の糖の製造方法によれば、高収率で糖が得られることが確認された。
【０１１６】
[評価３]酵素液の量と糖化量との関係
実施例１,２及び比較例２,３で得られた酵素液を用い、糖を製造した。
すなわち、原料として、稲わら基質（分解用リグノセルロース系バイオマス）５％を含む０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液に、実施例１又は比較例１の酵素液の量を変えて加え、４５℃、７２時間で糖化反応を行い、糖化液を得た。
各酵素液の量と、糖化量との関係を図４に示す。
【０１１７】
図４に示すように、糖を３００ｍｇ／ｇ-rice strawを得るためには、比較例２のＳｏｌｋａ ｆｌｏｃで培養した酵素液では約２３ｍｇ必要であり、比較例３の市販の酵素の混合物では約３２ｍｇ必要であったのに対し、実施例１及び２の酵素液では、約１０ｍｇの酵素液の量であればよいことが分かった。すなわち、本発明の酵素液において、リグノセルロース系バイオマスと、分解用リグノセルロース系バイオマスとが同一物質であると、酵素量が極端に少なくて済むことが確認された。
【０１１８】
［参考評価］発酵
評価２において、実施例１の酵素液を用いて得られた糖化液を用い発酵を行った。
酵母は、市販パン酵母を用いた。酵母をＹＰＤ液体培地（２％グルコース、２％ポリペプトン、１％酵母エキス、ｐＨ５．０）で３０℃の温度条件下、好気的に前培養を行った。
次いで、上記糖化液を１５０ｒｐｍの速度で撹拌しながら３０℃、ｐＨ５．０に調整し、上記前培養液４００ｍＬを装置に添加し、エタノール発酵を開始した。３０℃、ｐＨ５．０、１５０ｒｐｍを維持しながら４８時間発酵させたものをエタノール発酵液とした。
【０１１９】
発酵液中のエタノール濃度は、４．６１％(ｖ／ｖ)であった。これは、本発酵液中に１１０．６ｍＬ相当の純粋なエタノールが発酵液中に含まれる計算になる。すなわち、発酵阻害を受けることなく、エタノール生産を行うことができた。
【符号の説明】
【０１２０】
Ｓ１・・・裁断工程
Ｓ２・・・粉砕工程
Ｓ３・・・酵素生産工程
Ｓ４・・・糖製造工程
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグノセルロース系バイオマスを最大径が２ｍｍ以下となるように裁断してバイオマス粒子とする裁断工程と、
該バイオマス粒子及び水を固形分率が０．１〜２０質量％となるように混合して混合液とし、温度０〜５０℃の条件下で連続的に粉砕し、前記混合液をスラリー状の炭素源とする粉砕工程と、
前記炭素源、培養培地及び多糖分解酵素生産菌株を混合し、培養することにより、酵素液を得る酵素生産工程と、
を備えることを特徴とする酵素液の製造方法。
【請求項２】
前記混合液が、前記バイオマス粒子を解繊するための解繊物質を更に含有することを特徴とする請求項１記載の酵素液の製造方法。
【請求項３】
前記炭素源の繊維長が１００μｍ以下であることを特徴とする請求項１記載の酵素液の製造方法。
【請求項４】
前記炭素源の結晶化度が１５〜５５％であることを特徴とする請求項１記載の酵素液の製造方法。
【請求項５】
前記酵素生産工程において、前記炭素源、前記培養培地及び前記多糖分解酵素生産菌株に加え、乳糖を含む乳清が更に含まれていることを特徴とする請求項１記載の酵素液の製造方法。
【請求項６】
前記多糖分解酵素生産菌株が、アクレモニウム属、トリコデルマ属、アスペルギルス属又はペニシリウム属に属するものであることを特徴とする請求項１記載の酵素液の製造方法。
【請求項７】
前記酵素液が多糖類から単糖類への加水分解に用いられることを特徴とする請求項１記載の酵素液の製造方法。
【請求項８】
家畜用飼料として用いられ、
前記酵素生産工程において、前記培養を途中で停止することにより、前記炭素源と前記多糖分解酵素生産菌株とを残存させた酵素液を得ることを特徴とする酵素液の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の酵素液の製造方法により得られる酵素液と、分解用リグノセルロース系バイオマスとを混合し、該分解用リグノセルロース系バイオマスを加水分解して糖とすることを特徴とする糖の製造方法。
【請求項１０】
前記リグノセルロース系バイオマスと、前記分解用リグノセルロース系バイオマスとが同一物質であることを特徴とする請求項９記載の糖の製造方法。
【請求項１１】
前記分解用リグノセルロース系バイオマスが、
最大径が２ｍｍ以下となるように裁断して分解用バイオマス粒子とし、該分解用バイオマス粒子及び水を固形分率が０．１〜２０質量％となるように混合して混合液とし、温度０〜５０℃の条件下で連続的に粉砕し、前記混合液をスラリー状としたものであることを特徴とする請求項９記載の糖の製造方法。
【請求項１２】
前記分解用リグノセルロース系バイオマスが、
最大径が２ｍｍ以下となるように裁断して分解用バイオマス粒子とし、該分解用バイオマス粒子及び水を固形分率が０．１〜２０質量％となるように混合して混合液とし、温度１００〜１５０℃の条件下で水熱処理をし、温度０〜５０℃の条件下で連続的に粉砕し、前記混合液をスラリー状としたものであることを特徴とする請求項９記載の糖の製造方法。
【請求項１】
リグノセルロース系バイオマスを最大径が２ｍｍ以下となるように裁断してバイオマス粒子とする裁断工程と、
該バイオマス粒子及び水を固形分率が０．１〜２０質量％となるように混合して混合液とし、温度０〜５０℃の条件下で連続的に粉砕し、前記混合液をスラリー状の炭素源とする粉砕工程と、
前記炭素源、培養培地及び多糖分解酵素生産菌株を混合し、培養することにより、酵素液を得る酵素生産工程と、
を備えることを特徴とする酵素液の製造方法。
【請求項２】
前記混合液が、前記バイオマス粒子を解繊するための解繊物質を更に含有することを特徴とする請求項１記載の酵素液の製造方法。
【請求項３】
前記炭素源の繊維長が１００μｍ以下であることを特徴とする請求項１記載の酵素液の製造方法。
【請求項４】
前記炭素源の結晶化度が１５〜５５％であることを特徴とする請求項１記載の酵素液の製造方法。
【請求項５】
前記酵素生産工程において、前記炭素源、前記培養培地及び前記多糖分解酵素生産菌株に加え、乳糖を含む乳清が更に含まれていることを特徴とする請求項１記載の酵素液の製造方法。
【請求項６】
前記多糖分解酵素生産菌株が、アクレモニウム属、トリコデルマ属、アスペルギルス属又はペニシリウム属に属するものであることを特徴とする請求項１記載の酵素液の製造方法。
【請求項７】
前記酵素液が多糖類から単糖類への加水分解に用いられることを特徴とする請求項１記載の酵素液の製造方法。
【請求項８】
家畜用飼料として用いられ、
前記酵素生産工程において、前記培養を途中で停止することにより、前記炭素源と前記多糖分解酵素生産菌株とを残存させた酵素液を得ることを特徴とする酵素液の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の酵素液の製造方法により得られる酵素液と、分解用リグノセルロース系バイオマスとを混合し、該分解用リグノセルロース系バイオマスを加水分解して糖とすることを特徴とする糖の製造方法。
【請求項１０】
前記リグノセルロース系バイオマスと、前記分解用リグノセルロース系バイオマスとが同一物質であることを特徴とする請求項９記載の糖の製造方法。
【請求項１１】
前記分解用リグノセルロース系バイオマスが、
最大径が２ｍｍ以下となるように裁断して分解用バイオマス粒子とし、該分解用バイオマス粒子及び水を固形分率が０．１〜２０質量％となるように混合して混合液とし、温度０〜５０℃の条件下で連続的に粉砕し、前記混合液をスラリー状としたものであることを特徴とする請求項９記載の糖の製造方法。
【請求項１２】
前記分解用リグノセルロース系バイオマスが、
最大径が２ｍｍ以下となるように裁断して分解用バイオマス粒子とし、該分解用バイオマス粒子及び水を固形分率が０．１〜２０質量％となるように混合して混合液とし、温度１００〜１５０℃の条件下で水熱処理をし、温度０〜５０℃の条件下で連続的に粉砕し、前記混合液をスラリー状としたものであることを特徴とする請求項９記載の糖の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−５１３０８（Ｐ２０１０−５１３０８Ａ）
【公開日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１５５３２６（Ｐ２００９−１５５３２６）
【出願日】平成２１年６月３０日（２００９．６．３０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 第６０回 日本生物工学会大会 社団法人日本生物工学会 平成２０年８月２７、２８、２９日
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月３０日（２００９．６．３０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 第６０回 日本生物工学会大会 社団法人日本生物工学会 平成２０年８月２７、２８、２９日
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
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