重金属の測定方法
【課題】本発明は迅速かつ簡便に重金属を検出、定量する測定法を提供するものである。
【解決手段】試料中の重金属を測定する方法であって、以下の工程：
（１）重金属を含有する可能性のある試料とグルタチオンとの混合物にファイトケラチン合成酵素を作用させて酵素反応を行う工程；
（２）酵素反応液に蛍光標識化試薬を添加して前記酵素反応により生成したファイトケラチンを標識する工程；
（３）標識化されたファイトケラチンの蛍光強度を測定もしくは観察する工程；
を包含することを特徴とする重金属の測定方法。
【解決手段】試料中の重金属を測定する方法であって、以下の工程：
（１）重金属を含有する可能性のある試料とグルタチオンとの混合物にファイトケラチン合成酵素を作用させて酵素反応を行う工程；
（２）酵素反応液に蛍光標識化試薬を添加して前記酵素反応により生成したファイトケラチンを標識する工程；
（３）標識化されたファイトケラチンの蛍光強度を測定もしくは観察する工程；
を包含することを特徴とする重金属の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は重金属の測定方法、該測定方法に用いる測定キット、該測定方法に用いる新規酵素、および該酵素のアミノ酸配列をコードするＤＮＡに関する。
【背景技術】
【０００２】
カドミウム、コバルト、水銀、銅、亜鉛などの重金属は飲食品に含まれていると、それを飲食することにより、人体に悪影響を及ぼすことになる。また、土壌に重金属が過剰に存在していると作物（米など）や水道水や井戸水に重金属が混入し、それを長期に摂取することにより人体に影響を及ぼすことが懸念される。さらには、排ガス中に重金属が含まれると、環境衛生上、公害の問題を引き起こすことになる。したがって、飲食品、土壌、空気中にこれらの重金属が存在していないかどうかを検出したり、定量することは、食品衛生上あるいは環境衛生上非常に重要である。
【０００３】
従来、重金属を測定（検出、定量を含む）する方法として、例えば、ファイトケラチンと被測定溶液とを混合して、該被測定溶液中の重金属とファイトケラチン中のＳＨ基と反応させてファイトケラチン−重金属結合体を形成させ、得られた反応液中の残存ＳＨ基を定量する方法が知られている（特許文献１）。しかし、この方法は、重金属と反応したファイトケラチンを、ジメチルスベリミデートを介してウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合させる；結合したものをプレートに吸着させる、ＢＳＡによりブロッキングする；一次抗体として抗ファイトケラチン抗体を添加して反応を行う；二次抗体としてアルカリホスファターゼ等で標識した抗マウスＩｇＧを添加して反応を行う；基質分解による発色反応を行うという煩雑な工程が必要であり、経済性、簡便性、迅速性などの点で問題がある。
また、排ガス中のカドミウムや鉛の分析方法として、ＪＩＳ Ｋ ００８３には、フレーム原子吸光法、ジチゾン吸光光度法、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）発光分析法が採用されているが、これらの方法も初期コストがかかり、また機器自体が大型であるため、現場へ持ち込んでの測定が困難である。
【０００４】
【特許文献１】特開平１１−１７４０５４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、重金属（例えば、カドミウム、水銀、銅、亜鉛など）を簡便にかつ迅速に測定する方法を提供する点にある。また、本発明の他の目的は、重金属測定用キットを提供する点にある。さらに、本発明の他の目的は、前記測定方法に用いる新規な酵素ならびにそれをコードする新規ＤＮＡを提供する点にある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記目的を達成すべく種々研究を重ねた結果、重金属を簡便にかつ迅速に測定する方法を見出し、さらに研究を重ねて本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、
［１］ 試料中の重金属を測定する方法であって、以下の工程：
（１）重金属を含有する可能性のある試料とグルタチオンとの混合物にファイトケラチン合成酵素を作用させて酵素反応を行う工程；
（２）酵素反応液に蛍光標識化試薬を添加して前記酵素反応により生成したファイトケラチンを標識する工程；
（３）標識化されたファイトケラチンの蛍光強度を測定もしくは観察する工程；
を包含することを特徴とする重金属の測定方法、
［２］ 試料中の重金属を測定する方法であって、以下の工程：
（１）重金属を含有する可能性のある試料と蛍光標識化されたグルタチオンとの混合物にファイトケラチン合成酵素を作用させて酵素反応を行う工程；
（２）酵素反応液中に生成した蛍光標識されたファイトケラチンの蛍光強度を測定する工程；
を包含することを特徴とする重金属の測定方法、
［３］ ファイトケラチン合成酵素が、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来のファイトケラチン合成酵素である前記［１］または［２］記載の測定方法、
［４］ ファイトケラチン合成酵素が
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグルタチオンからファイトケラチンを合成する能力を有するタンパク質；
である前記［１］または［２］記載の測定方法、
［５］ ファイトケラチン合成酵素が配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質である前記［１］または［２］記載の測定方法、
［６］ 重金属がカドミウムである前記［１］〜［５］のいずれかに記載の測定方法、
［７］ 蛍光標識化試薬がＮ−（１−ピレニル）マレインアミドである前記［１］記載の測定方法、
［８］ 蛍光標識化されたグルタチオンが、Ｎ−（１−ピレニル）マレインアミドで標識化されたグルタチオンである前記［２］記載の測定方法、
［９］ 基質としてグルタチオン、酵素としてファイトケラチン合成酵素、および蛍光標識試薬を含む重金属測定用キット、
［１０］ 基質として蛍光標識試薬で標識化されたグルタチオン、および酵素としてファイトケラチン合成酵素を含む重金属検定用キット、
［１１］ 蛍光標識試薬がＮ−（１−ピレニル）マレインアミドである前記［８］または［９］記載の重金属測定用キット、
［１２］ ファイトケラチン合成酵素が、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質である前記［９］〜［１１］のいずれかに記載の重金属測定用キット、
［１３］ 配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するファイトケラチン合成酵素、
［１４］ 配列番号４で示されるファイトケラチン合成酵素のアミノ酸配列をコードする、精製および単離されたポリヌクレオチド、および
［１５］ 配列番号３で示されるポリヌクレオチド、
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明方法によれば、重金属、特にカドミウムを簡便にかつ迅速に測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（第一態様の測定方法）
本発明の一態様は、試料中の重金属を測定する方法であって、以下の工程：
（１）重金属を含有する可能性のある試料とグルタチオンとの混合物にファイトケラチン合成酵素を作用させて酵素反応を行う工程；
（２）酵素反応液に蛍光標識化試薬を添加して前記酵素反応により生成したファイトケラチンを標識する工程；
（３）標識化されたファイトケラチンの蛍光強度を測定もしくは観察する工程；
を包含することを特徴とする測定方法である。
以下、上記工程を順次説明する。
【００１０】
第（１）工程について
本工程は、重金属を含有する可能性のある試料とグルタチオンとの混合物にファイトケラチン合成酵素を作用させて酵素反応を行う工程である。
（試料）
本発明方法の第（１）工程で使用する試料は、重金属を含有する可能性のある試料であって、例えば、土壌、工場排水、飲料水、地下水、農作物、食品、食品材料、排ガスなどから調製した水溶液が好適に挙げられる。本発明方法は、カドミウム、水銀、銅、亜鉛などの重金属、とりわけカドミウムを含有する可能性のある試料に対して好適に適用される。
【００１１】
（基質）
本発明方法に使用されるグルタチオン（ＧＳＨとも表記する。）は下記式で示される。
【化１】
第（１）工程で使用するグルタチオンの使用量は、特に限定されないが、酵素反応系での終濃度が１〜１００ｍＭ程度、好ましくは１０ｍＭ程度になる量が好ましい。
【００１２】
（酵素）
本発明方法で使用されるファイトケラチン合成酵素は、グルタチオンが重金属（カドミウム）の存在下にグルタチオンの重合体、すなわち下記式
【化２】
で示されるファイトケラチン（ｐｈｙｔｏｃｈｅｌａｔｉｎ；ＰＣと略記する。）、とくに前記式でｎが２であるグルタチオンの二量体、すなわち式
【化３】
で示される化合物（ＰＣ２と略称する。）を合成する能力を有するものであれば、天然に存在する酵素であっても、遺伝子組み換え技術を利用して製造された酵素であってもよい。
【００１３】
天然に存在する酵素としては、例えば、シロイヌナズナ（学名：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来のファイトケラチン合成酵素（ＡｔＰＣＳ１と略称する。）や分裂酵母（学名：Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）由来のファイトケラチン合成酵素（ＳｐＰＣＳと略称する。）などが挙げられる。
【００１４】
また、遺伝子組み換え技術を利用して製造された酵素としては、例えば、シロイヌナズナ由来のファイトケラチン合成酵素（ＡｔＰＣＳ１；配列番号２）をコードする遺伝子（配列番号１）を遺伝子発現用ベクターに組み込み、得られた組換えベクター（例えば、ｐＥＴ８ｃ−ＡｔＰＣＳ１）を宿主細胞（例えば、大腸菌）に導入して形質転換体とし、該形質転換体を培養し、培養液から抽出・精製することにより取得することができる。
遺伝子発現用ベクターとしては、例えば宿主細胞を大腸菌とするｐＥＴ８ｃ、ｐＥＴ２５ｂ、ｐＧＥＸ等が例示することができる。遺伝子発現用ベクターの宿主細胞への導入は、それ自体公知の方法、例えば塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法などを採用することができる。
【００１５】
本発明に使用される酵素は、さらに天然に存在するかあるいは遺伝子工学法により調製されたファイトケラチン合成酵素（例えば、ＡｔＰＣＳ１）をコードするアミノ酸配列（配列番号２）において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグルタチオンからファイトケラチンを合成する能力を有するタンパク質であってもよい。このようなタンパク質としては、例えばＡｔＰＣＳ１の７５番目のアミノ酸ＫをＴに代えた変異体（ＡｔＰＣＳ１ Ｋ７５Ｔと略称する。；配列番号４）が挙げられる。この変異体ＡｔＰＣＳ１ Ｋ７５Ｔは、天然に存在するＡｔＰＣＳ１もしくは遺伝子工学で製造されたＡｔＰＣＳ１に比べて、顕著に酵素能力が優れており、この酵素を用いることにより、検出感度を著しく向上させることができるという利点がある。変異体ＡｔＰＣＳ１ Ｋ７５Ｔは、例えば前記のｐＥＴ８ｃ−ＡｔＰＣＳ１を原料とし遺伝子工学の常法にしたがって製造することができる。すなわち、Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ−ｍｕｔａｇｅｓｅｓｉｓ Ｋｉｔと後記実施例で使用した特定のプライマーを用いることにより、ｐＥＴ８ｃ−ＡｔＰＣＳ１からＡｔＰＣＳ１ Ｋ７５Ｔ発現プラスミドを構築し、該プラスミドで宿主細胞（例えば、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ））を形質転換し、該形質転換体を培養し、培養液から抽出・精製することにより取得することができる。なお、ＡｔＰＣＳ１ Ｋ７５ＴをコードするＤＮＡの配列は配列番号３に示す通りである。
【００１６】
（酵素反応）
第（１）工程の酵素反応は、２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃で行うのが好ましい。また、本酵素反応はｐＨ６〜８.５、好ましくは８付近の範囲で実施するのが好ましい。反応時間は特に制限されないが、通常５〜１２０分、好ましくは２０〜６０分である。
本酵素反応により、試料中に存在する重金属によりファイトケラチン合成酵素が活性化され、基質であるグルタチオンからファイトケラチンが生成する。
なお、生成するファイトケラチンは二量体（ＰＣ２）が主な生成物であるが、反応時間が長くなるについて三量体以上のものも生成されることがある。本発明においては、酵素反応は生成物が二量体（ＰＣ２）にとどまる範囲で実施するのが好ましい。
【００１７】
第（２）工程について
本工程は第（１）工程の酵素反応により生成したファイトケラチンを蛍光標識化試薬で標識する工程である。
（蛍光標識化試薬）
本工程に使用される蛍光標識化試薬は、スルフヒドリル基（−ＳＨ）と結合するものであれば特に制限されないが、蛍光標識用ピレン化合物が好適に挙げられる。蛍光標識用ピレン化合物としては、例えば下記式で示されるＮ−（１−ピレニル）マレインイミド（ＮＰＭ）や４−（１−ピレン）酪酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＰＳＥ）などが挙げられ、さらに特開平８−１９８８７３に記載の試薬なども利用することができる。
【化４】
【００１８】
（標識化反応）
蛍光標識用試薬の添加量は、使用したグルタチオン（ＧＳＨ）１モルに対して０．２〜２．５モル、とりわけ０．３〜０．６モル程度が好ましい。また、本工程の標識化反応は、室温で好適に実施できる。反応時間は通常５〜３０分程度が好ましい。
本標識化反応により、蛍光標識用試薬がファイトケラチンのスルフヒドリル基（−ＳＨ）と反応して標識化される。
【００１９】
第（３）工程について
【００２０】
第（３）工程は、蛍光標識化されたファイトケラチン（ＰＣ２）に蛍光を発生させ、その蛍光強度を測定もしくは観察する工程である。
蛍光標識化されたファイトケラチン（ＰＣ２）は、該分子上に複数の蛍光標識化試薬（たとえばピレン化合物）が結合しているので、一方（ピレン化合物）が光を吸収して励起状態となると、他方の基底状態の試薬（ピレン化合物）と会合して励起会合体（エキシマー）を形成する。したがって、このエキシマーからの発光（エキシマー発光）を測定もしくは観察することにより、試料中に存在していた重金属を検出あるいは定量することができる。
すなわち、試料中にカドミウムなどの重金属が存在すると、ファイトケラチン合成酵素が活性化されてファイトケラチンの生成が促進され、蛍光標識化されたファイトケラチン（ＰＣ２）の蛍光強度（エキシマー発光の強度）も強くなる。したがって、この蛍光強度を測定もしくは観察することにより試料中の重金属（カドミウムなど）の存在が確認でき、また検量線を用いて定量することも可能となるのである。
蛍光強度を測定するための装置は、特に制限されず、標識部位を励起させるための励起光源、励起偏光および蛍光偏光を得るための偏光素子、光電管や光電子倍増管などの蛍光量を電気量に変換する検出器および検出器で変換された電気量を読み取るメーターまたは記録計などを備えたものであればよい。なお、発生した蛍光を目視で判定し、重金属の有無を判定することもでき、このような場合は、上記の装置は必ずしも必要でなく、励起光源を備えた簡略な装置でよい。
【００２１】
（第二態様の測定方法）
【００２２】
本発明の第２の態様は、試料中の重金属を測定する方法であって、以下の工程：
（１）重金属を含有する可能性のある試料と蛍光標識化されたグルタチオンとの混合物にファイトケラチン合成酵素を作用させて酵素反応を行う工程；
（２）酵素反応液中に生成した蛍光標識されたファイトケラチンの蛍光強度を測定する工程；
を包含することを特徴とする重金属の測定方法である。
【００２３】
（蛍光標識化したグルタチオン）
本態様は、基質として、あらかじめ蛍光標識化されたグルタチオンを使用する方法である。この方法で使用される“蛍光標識化されたグルタチオン”は、グルタチオンを前記した蛍光標識化試薬で標識したものが挙げられる。
具体的には、Ｎ−（１−ピレニル）マレインアミド（ＮＰＭ）で標識化されたグルタチオン；すなわち式：
【化５】
で示される化合物が挙げられる。この標識化グルタチオンはグルタチオンとＮＰＭとを適当な溶媒（例えば、アセトニトリル）中、室温で反応させることにより容易に製造することができる。
第（１）工程の酵素反応は、基質として、第１態様のグルタチオンに代えて、“蛍光標識化されたグルタチオン”を用いる以外は、第１態様の酵素反応と同様に実施できる。
第（２）工程は、第１態様の第（３）工程と実質的に同様にして実施できる。
【００２４】
（測定用キット）
本発明の第３の態様は、基質としてグルタチオン、酵素としてファイトケラチン合成酵素、および蛍光標識化試薬を含む重金属測定用キットであり、第４の態様は基質として蛍光標識化試薬で標識化されたグルタチオン、および酵素としてファイトケラチン合成酵素を含む重金属検定用キットである。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例および実験例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２６】
（実施例１）
１）ＡｔＰＣＳ１発現プラスミドの構築
ＰＣ合成酵素遺伝子（ＡｔＰＣＳ１）をコードするＤＮＡ断片を含むシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来ｃＤＮＡファージライブラリー(Arabidopsis Biological Resource Center, Columbus, OH, USA)を鋳型とし、ＰＣＲ法を用いてＡｔＰＣＳ１を含むｃＤＮＡを取得した。ポリメラーゼにはＫＯＤ Ｄａｓｈ（TOYOBO）を用い、添付文書に従い反応液を作製した。ＰＣＲに用いたプライマーは、表１に示したものを用いた。
【表１】
上記表中、ＡｔＦ１のＤＮＡ配列は配列番号５、ＡｔＲ１のＤＮＡ配列は配列番号６である。
【００２７】
反応はｉ−Ｃｙｃｌｅｒ（BIO-RAD）を使用し、９４℃で５分間加熱した後、９４℃で１分間、４９℃で３０秒間、７２℃で２分間のサイクルを３０回行い、最後に７２℃で５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ産物は１．２％アガロースゲル電気泳動に供した。泳動はMupid(ADVANCE Co.,Ltd.)を用いて行い、５０Ｖで５分間流した後、１００Ｖに切り替えた。電気泳動した後、１５分間臭化エチジウムに曝してＤＮＡの染色を行い、ゲル解析装置(TOYOBO FAS−III)を用いてＤＮＡの検出を行った。ゲルから目的のｃＤＮＡ断片の回収には、DNA and Gel Band Purification kit(amarsham biosciences)を用いて行い、操作は添付文書に従った。精製したＡｔＰＣＳ１を含むｃＤＮＡは、Ｔ−ＡクローニングによりpGEM-T Easy(Promega)に挿入した。Ｔ−ＡクローニングはpGEM-T Easy Vector System(Promega)の添付文書に従って操作した。これを大腸菌JM109(TOYOBO)にトランスフォーメーションした後、得られたコロニーをＬＢ寒天培地で培養し、インサートチェックを行った。その後、ＡｔＰＣＳ１を含むｃＤＮＡを組み込んでいると確認された大腸菌をＬＢ培地で培養し、QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN)を用いてプラスミド抽出を行った。操作については添付文書に従った。プラスミド抽出を行った後、シーケンサー(ABI 310 Genetic Analyzer)により配列を確認した。シーケンスサンプルはＰＣＲチューブに１０μＭプライマーを０．５μｌ 、プラスミドＤＮＡを２５０−５００ｎｇ、Big Dye v.3.1を４μｌ加え、滅菌水で１０μｌにした。反応はi-Cycler(BIO-RAD)を使用し、９６℃で５分間加熱した後、９６℃で３０秒間、４９℃で１５秒間、６０℃で４分間のサイクルを２５回行った。ＰＣＲ産物は、３Ｍ酢酸ナトリウムを２μｌ加えて撹拌しスピンダウン後、１００％エタノールを３０μｌ加えて撹拌した。氷上に３０分間放置し、１５，０００ｒｐｍ、２０分間、室温で遠心、上清を捨てた。その後７０％エタノールを１００μｌ加えて、１５，０００ｒｐｍ、１０分間、室温で遠心し、ドライアップした。Template Suppression Reagent(ABI)を１４μｌ加え、煮沸を２分間した後、すばやく急冷した。これをスピンダウンして、シークエンス用のチューブに移した。シーケンスによって確認されたプラスミドは、制限酵素ＮｃｏＩ (TOYOBO)およびＢａｍＨＩ (TOYOBO)を用い添付文書に従った反応系で、３７℃、３時間処理した後、添付文書に従い、ベクターｐＥＴ８ｃ(Novagen)に組み込んだ。
【００２８】
２）ＡｔＰＣＳ１ Ｋ７５Ｔ発現プラスミド構築
ＡｔＰＣＳ１ Ｋ７５Ｔ発現プラスミド（ｐＥＴ８ｃ−ＡｔＰＣＳ１ Ｋ７５Ｔ）は、上記したｐＥＴ８ｃ−ＡｔＰＣＳ１からSite-directed-mutagenesis Kit(Novagen)を用いて構築した。プライマーは下記表２のものを用いた（太字が置換部位）。Ｆ側プライマーは配列番号７、Ｒ側プライマーは配列番号８である。
【表２】
【００２９】
３）ＡｔＰＣＳ１およびＡｔＰＣＳ１ Ｋ７５Ｔの精製
ｐＥＴ８ｃ(Novagen)に組み込んだＡｔＰＣＳ１発現プラスミド（ｐＥＴ８ｃ−ＡｔＰＣＳ１）またはＡｔＰＣＳ１ Ｋ７５Ｔ発現プラスミド（ｐＥＴ８ｃ−ＡｔＰＣＳ１ Ｋ７５Ｔ）を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Novagen）にトランスフォーメーションし、得られたコロニーを５ｍｌの３０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢ培地に植え込み、一晩前培養した。翌日１２５ｍＬの３０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢ培地に１ｍＬ植菌し、WATER BATH SHAKER PERSONAL-11(TAITEC)を用い２９℃で振盪を行い、ＯＤ６００で１．０付近になるまで（約３時間）培養した。その後、１Ｍ ＩＰＴＧを１２５μＬ加え（終濃度１ｍＭ）、再びWATER BATH SHAKER PERSONAL-11(TAITEC)を用い２９℃で振盪を行い３時間培養した。細胞を遠心により集菌（３，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）し、上清を除いた後、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ β−ＭＥ（β−メルカプトエタノール）、１ｍＭ ＥＤＴＡを１７．５ｍｌ加えてよく懸濁させ、ソニケーターで細胞破砕した（output：４．０、duty cycle：５０で１分間ソニケーション、１分間冷却の繰り返し)。氷にエタノールを少し混ぜ、水をたし、ファルコンチューブを浸した状態で、液が透明になってくるまで行った。破砕した細胞を遠心により可溶性画分と不溶性画分に分離させ（１５，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）、可溶性画分を回収した。それを０．４５μｍフィルター(KURABO)で濾過した後、透析膜(Viskase)に封入し、１Ｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ β−ＭＥ、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で一晩透析した。透析後、サンプルをDEAE-Toyopearl column(５ｃｍ×１５ｃｍ; Tosh)にアプライし、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ β−ＭＥ、１ｍＭ ＥＤＴＡで平衡化した後、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ β−ＭＥで溶出した。そのサンプルを０．４５μｍフィルター(KURABO)で濾過した後、透析膜(Viskase)に封入し、１Ｌの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ６．０）、１０ｍＭ β−ＭＥ中で一晩透析した。サンプルを、４℃下においてAKTAPrime system（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス）に装着したHiTrap SP column(Pharmacia Biotech)にアプライし、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１０ｍＭ β−ＭＥで平衡化した。その後サンプルを０−１Ｍ ＮａＣｌ in ２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１０ｍＭ β−ＭＥで溶出させた。得られたサンプルを０．４５μｍフィルター(KURABO)で濾過した後、透析膜(Viskase)に封入し、１Ｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ β−ＭＥ中で一晩透析した。その後、ブラッドフォード（Bradford）の方法に従い濃度を測定した。
上記のようにして、ファイトケラチン合成酵素であるＡｔＰＣＳ１およびＡｔＰＣＳ１ Ｋ７５Ｔを得た。
【００３０】
４）ファイトケラチン合成酵素を用いた重金属センサー
（Ａ）ＡｔＰＣＳ１を用いた重金属センサー
２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ β−ＭＥ、１０ｍＭグルタチオン（ＧＳＨ）、０．５μｇ／１２５μｌ ＡｔＰＣＳ１および様々な濃度（０、０．１、０．５、１．０、５．０、１０、１００μＭ）のカドミウム（塩化カドミウムとして）を添加した後、３５℃で６０分間、酵素反応を行った。その後、７５μＭのＮＰＭ（アセトニトリルに溶解)、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と混合し、３０℃、５分間の反応を行った。その後、反応液を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）により１０倍希釈した後、蛍光分光光度計(Hitachi F-2500)を用いて蛍光スペクトルの観察(Exitation＝３４５ｎｍ， Emission＝４７０ｎｍ）およびゲル解析装置の３０２ｎｍ照射下で撮影を行った。撮影にはＵＶブロックカバーをゲル解析装置に設置し、暗条件下でデジタルカメラを用い行った。コントロールとして、ＰＣ２の代わりに蒸留水を用いたもので同様の実験を行った。
【００３１】
結果は、図１の通りである。図１からカドミウム（Ｃｄ）の添加濃度が上昇するにつれて蛍光濃度が上昇することが分かる。また、図１には目視による結果（写真）は示していないが、カドミウムの添加濃度が増えるにつれて強い蛍光が観測された。これらのことから、本発明方法により、カドミウムを検出、定量できることが確認できた。
【００３２】
（Ｂ）ＡｔＰＣＳ１ Ｋ７５Ｔを用いた重金属センサー
ファイトケラチン合成酵素としてＡｔＰＣＳ１に代えてＡｔＰＣＳ１ Ｋ７５Ｔを用いる以外は、前記（Ａ）と同様にして酵素反応および標識化反応後、蛍光強度を測定することにより、カドミウムを検出、定量することができる。
【００３３】
（実施例２）
ＰＣ合成酵素としてシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＡｔＰＣＳ１および分裂酵母由来のＰＣ合成酵素ＳｐＰＣＳを用いた。酵素反応は、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ β−ＭＥ、１０ｍＭ グルタチオン（ＧＳＨ）および酵素（酵素量：５．０μｇ／３７５μｌ）の混合液に、重金属を所定の濃度となるように塩化物の形で添加し、３５℃、２０分間の酵素反応を行った。その後、７５μＭのＮＰＭ（アセトニトリルに溶解）、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と混合し、３０℃、５分間の反応を行った。反応終了後、反応液を実施例１−４）と同様に処理して蛍光強度を測定し、カドミウム（Ｃｄ）の濃度が５０μＭのときの活性を１００％とし、相対的な活性で示した。
結果は図２（ＰＣ合成酵素としてＡｔＰＣＳ１を用いた時）および図３（ＳｐＰＣＳを用いた時）の通りである。これらの結果から、ＡｔＰＣＳ１においてはカドミウム（Ｃｄ）特異的、ＳｐＰＣＳにおいては銅（Ｃｕ）特異的に反応が進行したことが分かった。
【００３４】
（実施例３）
ＰＣ合成酵素としてシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＡｔＰＣＳ１を用いた。ＰＣ合成反応は、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ ｍＭ β−ＭＥ、１０ｍＭ ＧＳＨ、酵素量は５．０μｇ／３７５μｌ、反応温度は３５℃、反応時間は０、１０、２０、３０、６０、１５０、２４０分間のそれぞれで行った。その後、７５μＭのＮＰＭ（アセトニトリルに溶解）、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と混合し、３０℃、５分間の反応を行った。反応終了後、反応液を実施例１と同様に処理して蛍光強度を測定した。
結果は図４の通りであり、６０分で蛍光強度はほぼ最大値に達することが確認された。
【００３５】
（実験例１）
２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ β−ＭＥ、１０ｍＭ グルタチオン（ＧＳＨ）、５００μＭのカドミウム（塩化カドミウムとして）に０．５μｇ／１２５μｌのＡｔＰＣＳ１ Ｋ７５ＴまたはＡｔＰＣＳ１を添加した後、３５℃で２０分間反応を行った。その後、３．６Ｍ ＨＣｌを１２５μｌ加え１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清をＨＰＬＣ分析に供し、ＰＣ２の生成量を測定した。
その結果、ＰＣ合成酵素としてＡｔＰＣＳ１を用いた時のＰＣ２生成量は、８．８８ｎｍｏｌであり、ＡｔＰＣＳ１ Ｋ７５Ｔを用いた時のＰＣ２生成量は、３７．８５ｎｍｏｌであった。すなわち、上記条件下におけるＡｔＰＣＳ１ Ｋ７５Ｔの酵素活性（ＰＣ２生成能）は、ＡｔＰＣＳ１のそれに比べて４．２６倍高いことが確認できた。
【００３６】
（実験例２）
ファイトケラチン（ＰＣ２）を終濃度０．１、１．０、１０、１００μＭに設定し、７５μＭのＮ−（１−ピレニル）マレインイミド（ＮＰＭ）（アセトニトリルに溶解）、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）と混合し、３０℃、５分間の反応を行った。反応終了後、反応液を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）により１０倍希釈した後、蛍光分光光度計(Hitachi F-2500)を用いて蛍光強度(Exitation＝３４５ｎｍ， Emission＝４７０ｎｍ）を測定した。
結果は図５に示す通りであり、ＰＣ２濃度依存的に蛍光強度の増大が確認され、０−１００μＭの間で定量的にＰＣ２を測定することが可能であることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明方法によれば、飲食品や環境中の重金属の測定（検出および定量）を簡便にかつ迅速に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ファイトケラチン合成酵素としてＡｔＰＣＳ１を用いたときの、試料中のカドミウム濃度と蛍光強度の関係を示す図である。
【図２】ファイトケラチン合成酵素としてＡｔＰＣＳ１を用いたときの、試料中の各種重金属の濃度と蛍光強度の関係を示す図である。
【図３】ファイトケラチン合成酵素としてＳｐＰＣＳを用いたときの、試料中の各種重金属の濃度と蛍光強度の関係を示す図である。
【図４】ファイトケラチン合成酵素としてＡｔＰＣＳ１を用いたときの、酵素反応時間と蛍光強度の関係を示す図である。
【図５】ファイトケラチンの濃度と蛍光強度の関係を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は重金属の測定方法、該測定方法に用いる測定キット、該測定方法に用いる新規酵素、および該酵素のアミノ酸配列をコードするＤＮＡに関する。
【背景技術】
【０００２】
カドミウム、コバルト、水銀、銅、亜鉛などの重金属は飲食品に含まれていると、それを飲食することにより、人体に悪影響を及ぼすことになる。また、土壌に重金属が過剰に存在していると作物（米など）や水道水や井戸水に重金属が混入し、それを長期に摂取することにより人体に影響を及ぼすことが懸念される。さらには、排ガス中に重金属が含まれると、環境衛生上、公害の問題を引き起こすことになる。したがって、飲食品、土壌、空気中にこれらの重金属が存在していないかどうかを検出したり、定量することは、食品衛生上あるいは環境衛生上非常に重要である。
【０００３】
従来、重金属を測定（検出、定量を含む）する方法として、例えば、ファイトケラチンと被測定溶液とを混合して、該被測定溶液中の重金属とファイトケラチン中のＳＨ基と反応させてファイトケラチン−重金属結合体を形成させ、得られた反応液中の残存ＳＨ基を定量する方法が知られている（特許文献１）。しかし、この方法は、重金属と反応したファイトケラチンを、ジメチルスベリミデートを介してウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合させる；結合したものをプレートに吸着させる、ＢＳＡによりブロッキングする；一次抗体として抗ファイトケラチン抗体を添加して反応を行う；二次抗体としてアルカリホスファターゼ等で標識した抗マウスＩｇＧを添加して反応を行う；基質分解による発色反応を行うという煩雑な工程が必要であり、経済性、簡便性、迅速性などの点で問題がある。
また、排ガス中のカドミウムや鉛の分析方法として、ＪＩＳ Ｋ ００８３には、フレーム原子吸光法、ジチゾン吸光光度法、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）発光分析法が採用されているが、これらの方法も初期コストがかかり、また機器自体が大型であるため、現場へ持ち込んでの測定が困難である。
【０００４】
【特許文献１】特開平１１−１７４０５４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、重金属（例えば、カドミウム、水銀、銅、亜鉛など）を簡便にかつ迅速に測定する方法を提供する点にある。また、本発明の他の目的は、重金属測定用キットを提供する点にある。さらに、本発明の他の目的は、前記測定方法に用いる新規な酵素ならびにそれをコードする新規ＤＮＡを提供する点にある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記目的を達成すべく種々研究を重ねた結果、重金属を簡便にかつ迅速に測定する方法を見出し、さらに研究を重ねて本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、
［１］ 試料中の重金属を測定する方法であって、以下の工程：
（１）重金属を含有する可能性のある試料とグルタチオンとの混合物にファイトケラチン合成酵素を作用させて酵素反応を行う工程；
（２）酵素反応液に蛍光標識化試薬を添加して前記酵素反応により生成したファイトケラチンを標識する工程；
（３）標識化されたファイトケラチンの蛍光強度を測定もしくは観察する工程；
を包含することを特徴とする重金属の測定方法、
［２］ 試料中の重金属を測定する方法であって、以下の工程：
（１）重金属を含有する可能性のある試料と蛍光標識化されたグルタチオンとの混合物にファイトケラチン合成酵素を作用させて酵素反応を行う工程；
（２）酵素反応液中に生成した蛍光標識されたファイトケラチンの蛍光強度を測定する工程；
を包含することを特徴とする重金属の測定方法、
［３］ ファイトケラチン合成酵素が、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来のファイトケラチン合成酵素である前記［１］または［２］記載の測定方法、
［４］ ファイトケラチン合成酵素が
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグルタチオンからファイトケラチンを合成する能力を有するタンパク質；
である前記［１］または［２］記載の測定方法、
［５］ ファイトケラチン合成酵素が配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質である前記［１］または［２］記載の測定方法、
［６］ 重金属がカドミウムである前記［１］〜［５］のいずれかに記載の測定方法、
［７］ 蛍光標識化試薬がＮ−（１−ピレニル）マレインアミドである前記［１］記載の測定方法、
［８］ 蛍光標識化されたグルタチオンが、Ｎ−（１−ピレニル）マレインアミドで標識化されたグルタチオンである前記［２］記載の測定方法、
［９］ 基質としてグルタチオン、酵素としてファイトケラチン合成酵素、および蛍光標識試薬を含む重金属測定用キット、
［１０］ 基質として蛍光標識試薬で標識化されたグルタチオン、および酵素としてファイトケラチン合成酵素を含む重金属検定用キット、
［１１］ 蛍光標識試薬がＮ−（１−ピレニル）マレインアミドである前記［８］または［９］記載の重金属測定用キット、
［１２］ ファイトケラチン合成酵素が、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質である前記［９］〜［１１］のいずれかに記載の重金属測定用キット、
［１３］ 配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するファイトケラチン合成酵素、
［１４］ 配列番号４で示されるファイトケラチン合成酵素のアミノ酸配列をコードする、精製および単離されたポリヌクレオチド、および
［１５］ 配列番号３で示されるポリヌクレオチド、
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明方法によれば、重金属、特にカドミウムを簡便にかつ迅速に測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（第一態様の測定方法）
本発明の一態様は、試料中の重金属を測定する方法であって、以下の工程：
（１）重金属を含有する可能性のある試料とグルタチオンとの混合物にファイトケラチン合成酵素を作用させて酵素反応を行う工程；
（２）酵素反応液に蛍光標識化試薬を添加して前記酵素反応により生成したファイトケラチンを標識する工程；
（３）標識化されたファイトケラチンの蛍光強度を測定もしくは観察する工程；
を包含することを特徴とする測定方法である。
以下、上記工程を順次説明する。
【００１０】
第（１）工程について
本工程は、重金属を含有する可能性のある試料とグルタチオンとの混合物にファイトケラチン合成酵素を作用させて酵素反応を行う工程である。
（試料）
本発明方法の第（１）工程で使用する試料は、重金属を含有する可能性のある試料であって、例えば、土壌、工場排水、飲料水、地下水、農作物、食品、食品材料、排ガスなどから調製した水溶液が好適に挙げられる。本発明方法は、カドミウム、水銀、銅、亜鉛などの重金属、とりわけカドミウムを含有する可能性のある試料に対して好適に適用される。
【００１１】
（基質）
本発明方法に使用されるグルタチオン（ＧＳＨとも表記する。）は下記式で示される。
【化１】
第（１）工程で使用するグルタチオンの使用量は、特に限定されないが、酵素反応系での終濃度が１〜１００ｍＭ程度、好ましくは１０ｍＭ程度になる量が好ましい。
【００１２】
（酵素）
本発明方法で使用されるファイトケラチン合成酵素は、グルタチオンが重金属（カドミウム）の存在下にグルタチオンの重合体、すなわち下記式
【化２】
で示されるファイトケラチン（ｐｈｙｔｏｃｈｅｌａｔｉｎ；ＰＣと略記する。）、とくに前記式でｎが２であるグルタチオンの二量体、すなわち式
【化３】
で示される化合物（ＰＣ２と略称する。）を合成する能力を有するものであれば、天然に存在する酵素であっても、遺伝子組み換え技術を利用して製造された酵素であってもよい。
【００１３】
天然に存在する酵素としては、例えば、シロイヌナズナ（学名：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来のファイトケラチン合成酵素（ＡｔＰＣＳ１と略称する。）や分裂酵母（学名：Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）由来のファイトケラチン合成酵素（ＳｐＰＣＳと略称する。）などが挙げられる。
【００１４】
また、遺伝子組み換え技術を利用して製造された酵素としては、例えば、シロイヌナズナ由来のファイトケラチン合成酵素（ＡｔＰＣＳ１；配列番号２）をコードする遺伝子（配列番号１）を遺伝子発現用ベクターに組み込み、得られた組換えベクター（例えば、ｐＥＴ８ｃ−ＡｔＰＣＳ１）を宿主細胞（例えば、大腸菌）に導入して形質転換体とし、該形質転換体を培養し、培養液から抽出・精製することにより取得することができる。
遺伝子発現用ベクターとしては、例えば宿主細胞を大腸菌とするｐＥＴ８ｃ、ｐＥＴ２５ｂ、ｐＧＥＸ等が例示することができる。遺伝子発現用ベクターの宿主細胞への導入は、それ自体公知の方法、例えば塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法などを採用することができる。
【００１５】
本発明に使用される酵素は、さらに天然に存在するかあるいは遺伝子工学法により調製されたファイトケラチン合成酵素（例えば、ＡｔＰＣＳ１）をコードするアミノ酸配列（配列番号２）において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグルタチオンからファイトケラチンを合成する能力を有するタンパク質であってもよい。このようなタンパク質としては、例えばＡｔＰＣＳ１の７５番目のアミノ酸ＫをＴに代えた変異体（ＡｔＰＣＳ１ Ｋ７５Ｔと略称する。；配列番号４）が挙げられる。この変異体ＡｔＰＣＳ１ Ｋ７５Ｔは、天然に存在するＡｔＰＣＳ１もしくは遺伝子工学で製造されたＡｔＰＣＳ１に比べて、顕著に酵素能力が優れており、この酵素を用いることにより、検出感度を著しく向上させることができるという利点がある。変異体ＡｔＰＣＳ１ Ｋ７５Ｔは、例えば前記のｐＥＴ８ｃ−ＡｔＰＣＳ１を原料とし遺伝子工学の常法にしたがって製造することができる。すなわち、Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ−ｍｕｔａｇｅｓｅｓｉｓ Ｋｉｔと後記実施例で使用した特定のプライマーを用いることにより、ｐＥＴ８ｃ−ＡｔＰＣＳ１からＡｔＰＣＳ１ Ｋ７５Ｔ発現プラスミドを構築し、該プラスミドで宿主細胞（例えば、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ））を形質転換し、該形質転換体を培養し、培養液から抽出・精製することにより取得することができる。なお、ＡｔＰＣＳ１ Ｋ７５ＴをコードするＤＮＡの配列は配列番号３に示す通りである。
【００１６】
（酵素反応）
第（１）工程の酵素反応は、２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃で行うのが好ましい。また、本酵素反応はｐＨ６〜８.５、好ましくは８付近の範囲で実施するのが好ましい。反応時間は特に制限されないが、通常５〜１２０分、好ましくは２０〜６０分である。
本酵素反応により、試料中に存在する重金属によりファイトケラチン合成酵素が活性化され、基質であるグルタチオンからファイトケラチンが生成する。
なお、生成するファイトケラチンは二量体（ＰＣ２）が主な生成物であるが、反応時間が長くなるについて三量体以上のものも生成されることがある。本発明においては、酵素反応は生成物が二量体（ＰＣ２）にとどまる範囲で実施するのが好ましい。
【００１７】
第（２）工程について
本工程は第（１）工程の酵素反応により生成したファイトケラチンを蛍光標識化試薬で標識する工程である。
（蛍光標識化試薬）
本工程に使用される蛍光標識化試薬は、スルフヒドリル基（−ＳＨ）と結合するものであれば特に制限されないが、蛍光標識用ピレン化合物が好適に挙げられる。蛍光標識用ピレン化合物としては、例えば下記式で示されるＮ−（１−ピレニル）マレインイミド（ＮＰＭ）や４−（１−ピレン）酪酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＰＳＥ）などが挙げられ、さらに特開平８−１９８８７３に記載の試薬なども利用することができる。
【化４】
【００１８】
（標識化反応）
蛍光標識用試薬の添加量は、使用したグルタチオン（ＧＳＨ）１モルに対して０．２〜２．５モル、とりわけ０．３〜０．６モル程度が好ましい。また、本工程の標識化反応は、室温で好適に実施できる。反応時間は通常５〜３０分程度が好ましい。
本標識化反応により、蛍光標識用試薬がファイトケラチンのスルフヒドリル基（−ＳＨ）と反応して標識化される。
【００１９】
第（３）工程について
【００２０】
第（３）工程は、蛍光標識化されたファイトケラチン（ＰＣ２）に蛍光を発生させ、その蛍光強度を測定もしくは観察する工程である。
蛍光標識化されたファイトケラチン（ＰＣ２）は、該分子上に複数の蛍光標識化試薬（たとえばピレン化合物）が結合しているので、一方（ピレン化合物）が光を吸収して励起状態となると、他方の基底状態の試薬（ピレン化合物）と会合して励起会合体（エキシマー）を形成する。したがって、このエキシマーからの発光（エキシマー発光）を測定もしくは観察することにより、試料中に存在していた重金属を検出あるいは定量することができる。
すなわち、試料中にカドミウムなどの重金属が存在すると、ファイトケラチン合成酵素が活性化されてファイトケラチンの生成が促進され、蛍光標識化されたファイトケラチン（ＰＣ２）の蛍光強度（エキシマー発光の強度）も強くなる。したがって、この蛍光強度を測定もしくは観察することにより試料中の重金属（カドミウムなど）の存在が確認でき、また検量線を用いて定量することも可能となるのである。
蛍光強度を測定するための装置は、特に制限されず、標識部位を励起させるための励起光源、励起偏光および蛍光偏光を得るための偏光素子、光電管や光電子倍増管などの蛍光量を電気量に変換する検出器および検出器で変換された電気量を読み取るメーターまたは記録計などを備えたものであればよい。なお、発生した蛍光を目視で判定し、重金属の有無を判定することもでき、このような場合は、上記の装置は必ずしも必要でなく、励起光源を備えた簡略な装置でよい。
【００２１】
（第二態様の測定方法）
【００２２】
本発明の第２の態様は、試料中の重金属を測定する方法であって、以下の工程：
（１）重金属を含有する可能性のある試料と蛍光標識化されたグルタチオンとの混合物にファイトケラチン合成酵素を作用させて酵素反応を行う工程；
（２）酵素反応液中に生成した蛍光標識されたファイトケラチンの蛍光強度を測定する工程；
を包含することを特徴とする重金属の測定方法である。
【００２３】
（蛍光標識化したグルタチオン）
本態様は、基質として、あらかじめ蛍光標識化されたグルタチオンを使用する方法である。この方法で使用される“蛍光標識化されたグルタチオン”は、グルタチオンを前記した蛍光標識化試薬で標識したものが挙げられる。
具体的には、Ｎ−（１−ピレニル）マレインアミド（ＮＰＭ）で標識化されたグルタチオン；すなわち式：
【化５】
で示される化合物が挙げられる。この標識化グルタチオンはグルタチオンとＮＰＭとを適当な溶媒（例えば、アセトニトリル）中、室温で反応させることにより容易に製造することができる。
第（１）工程の酵素反応は、基質として、第１態様のグルタチオンに代えて、“蛍光標識化されたグルタチオン”を用いる以外は、第１態様の酵素反応と同様に実施できる。
第（２）工程は、第１態様の第（３）工程と実質的に同様にして実施できる。
【００２４】
（測定用キット）
本発明の第３の態様は、基質としてグルタチオン、酵素としてファイトケラチン合成酵素、および蛍光標識化試薬を含む重金属測定用キットであり、第４の態様は基質として蛍光標識化試薬で標識化されたグルタチオン、および酵素としてファイトケラチン合成酵素を含む重金属検定用キットである。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例および実験例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２６】
（実施例１）
１）ＡｔＰＣＳ１発現プラスミドの構築
ＰＣ合成酵素遺伝子（ＡｔＰＣＳ１）をコードするＤＮＡ断片を含むシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来ｃＤＮＡファージライブラリー(Arabidopsis Biological Resource Center, Columbus, OH, USA)を鋳型とし、ＰＣＲ法を用いてＡｔＰＣＳ１を含むｃＤＮＡを取得した。ポリメラーゼにはＫＯＤ Ｄａｓｈ（TOYOBO）を用い、添付文書に従い反応液を作製した。ＰＣＲに用いたプライマーは、表１に示したものを用いた。
【表１】
上記表中、ＡｔＦ１のＤＮＡ配列は配列番号５、ＡｔＲ１のＤＮＡ配列は配列番号６である。
【００２７】
反応はｉ−Ｃｙｃｌｅｒ（BIO-RAD）を使用し、９４℃で５分間加熱した後、９４℃で１分間、４９℃で３０秒間、７２℃で２分間のサイクルを３０回行い、最後に７２℃で５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ産物は１．２％アガロースゲル電気泳動に供した。泳動はMupid(ADVANCE Co.,Ltd.)を用いて行い、５０Ｖで５分間流した後、１００Ｖに切り替えた。電気泳動した後、１５分間臭化エチジウムに曝してＤＮＡの染色を行い、ゲル解析装置(TOYOBO FAS−III)を用いてＤＮＡの検出を行った。ゲルから目的のｃＤＮＡ断片の回収には、DNA and Gel Band Purification kit(amarsham biosciences)を用いて行い、操作は添付文書に従った。精製したＡｔＰＣＳ１を含むｃＤＮＡは、Ｔ−ＡクローニングによりpGEM-T Easy(Promega)に挿入した。Ｔ−ＡクローニングはpGEM-T Easy Vector System(Promega)の添付文書に従って操作した。これを大腸菌JM109(TOYOBO)にトランスフォーメーションした後、得られたコロニーをＬＢ寒天培地で培養し、インサートチェックを行った。その後、ＡｔＰＣＳ１を含むｃＤＮＡを組み込んでいると確認された大腸菌をＬＢ培地で培養し、QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN)を用いてプラスミド抽出を行った。操作については添付文書に従った。プラスミド抽出を行った後、シーケンサー(ABI 310 Genetic Analyzer)により配列を確認した。シーケンスサンプルはＰＣＲチューブに１０μＭプライマーを０．５μｌ 、プラスミドＤＮＡを２５０−５００ｎｇ、Big Dye v.3.1を４μｌ加え、滅菌水で１０μｌにした。反応はi-Cycler(BIO-RAD)を使用し、９６℃で５分間加熱した後、９６℃で３０秒間、４９℃で１５秒間、６０℃で４分間のサイクルを２５回行った。ＰＣＲ産物は、３Ｍ酢酸ナトリウムを２μｌ加えて撹拌しスピンダウン後、１００％エタノールを３０μｌ加えて撹拌した。氷上に３０分間放置し、１５，０００ｒｐｍ、２０分間、室温で遠心、上清を捨てた。その後７０％エタノールを１００μｌ加えて、１５，０００ｒｐｍ、１０分間、室温で遠心し、ドライアップした。Template Suppression Reagent(ABI)を１４μｌ加え、煮沸を２分間した後、すばやく急冷した。これをスピンダウンして、シークエンス用のチューブに移した。シーケンスによって確認されたプラスミドは、制限酵素ＮｃｏＩ (TOYOBO)およびＢａｍＨＩ (TOYOBO)を用い添付文書に従った反応系で、３７℃、３時間処理した後、添付文書に従い、ベクターｐＥＴ８ｃ(Novagen)に組み込んだ。
【００２８】
２）ＡｔＰＣＳ１ Ｋ７５Ｔ発現プラスミド構築
ＡｔＰＣＳ１ Ｋ７５Ｔ発現プラスミド（ｐＥＴ８ｃ−ＡｔＰＣＳ１ Ｋ７５Ｔ）は、上記したｐＥＴ８ｃ−ＡｔＰＣＳ１からSite-directed-mutagenesis Kit(Novagen)を用いて構築した。プライマーは下記表２のものを用いた（太字が置換部位）。Ｆ側プライマーは配列番号７、Ｒ側プライマーは配列番号８である。
【表２】
【００２９】
３）ＡｔＰＣＳ１およびＡｔＰＣＳ１ Ｋ７５Ｔの精製
ｐＥＴ８ｃ(Novagen)に組み込んだＡｔＰＣＳ１発現プラスミド（ｐＥＴ８ｃ−ＡｔＰＣＳ１）またはＡｔＰＣＳ１ Ｋ７５Ｔ発現プラスミド（ｐＥＴ８ｃ−ＡｔＰＣＳ１ Ｋ７５Ｔ）を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Novagen）にトランスフォーメーションし、得られたコロニーを５ｍｌの３０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢ培地に植え込み、一晩前培養した。翌日１２５ｍＬの３０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢ培地に１ｍＬ植菌し、WATER BATH SHAKER PERSONAL-11(TAITEC)を用い２９℃で振盪を行い、ＯＤ６００で１．０付近になるまで（約３時間）培養した。その後、１Ｍ ＩＰＴＧを１２５μＬ加え（終濃度１ｍＭ）、再びWATER BATH SHAKER PERSONAL-11(TAITEC)を用い２９℃で振盪を行い３時間培養した。細胞を遠心により集菌（３，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）し、上清を除いた後、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ β−ＭＥ（β−メルカプトエタノール）、１ｍＭ ＥＤＴＡを１７．５ｍｌ加えてよく懸濁させ、ソニケーターで細胞破砕した（output：４．０、duty cycle：５０で１分間ソニケーション、１分間冷却の繰り返し)。氷にエタノールを少し混ぜ、水をたし、ファルコンチューブを浸した状態で、液が透明になってくるまで行った。破砕した細胞を遠心により可溶性画分と不溶性画分に分離させ（１５，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）、可溶性画分を回収した。それを０．４５μｍフィルター(KURABO)で濾過した後、透析膜(Viskase)に封入し、１Ｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ β−ＭＥ、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で一晩透析した。透析後、サンプルをDEAE-Toyopearl column(５ｃｍ×１５ｃｍ; Tosh)にアプライし、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ β−ＭＥ、１ｍＭ ＥＤＴＡで平衡化した後、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ β−ＭＥで溶出した。そのサンプルを０．４５μｍフィルター(KURABO)で濾過した後、透析膜(Viskase)に封入し、１Ｌの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ６．０）、１０ｍＭ β−ＭＥ中で一晩透析した。サンプルを、４℃下においてAKTAPrime system（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス）に装着したHiTrap SP column(Pharmacia Biotech)にアプライし、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１０ｍＭ β−ＭＥで平衡化した。その後サンプルを０−１Ｍ ＮａＣｌ in ２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１０ｍＭ β−ＭＥで溶出させた。得られたサンプルを０．４５μｍフィルター(KURABO)で濾過した後、透析膜(Viskase)に封入し、１Ｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ β−ＭＥ中で一晩透析した。その後、ブラッドフォード（Bradford）の方法に従い濃度を測定した。
上記のようにして、ファイトケラチン合成酵素であるＡｔＰＣＳ１およびＡｔＰＣＳ１ Ｋ７５Ｔを得た。
【００３０】
４）ファイトケラチン合成酵素を用いた重金属センサー
（Ａ）ＡｔＰＣＳ１を用いた重金属センサー
２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ β−ＭＥ、１０ｍＭグルタチオン（ＧＳＨ）、０．５μｇ／１２５μｌ ＡｔＰＣＳ１および様々な濃度（０、０．１、０．５、１．０、５．０、１０、１００μＭ）のカドミウム（塩化カドミウムとして）を添加した後、３５℃で６０分間、酵素反応を行った。その後、７５μＭのＮＰＭ（アセトニトリルに溶解)、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と混合し、３０℃、５分間の反応を行った。その後、反応液を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）により１０倍希釈した後、蛍光分光光度計(Hitachi F-2500)を用いて蛍光スペクトルの観察(Exitation＝３４５ｎｍ， Emission＝４７０ｎｍ）およびゲル解析装置の３０２ｎｍ照射下で撮影を行った。撮影にはＵＶブロックカバーをゲル解析装置に設置し、暗条件下でデジタルカメラを用い行った。コントロールとして、ＰＣ２の代わりに蒸留水を用いたもので同様の実験を行った。
【００３１】
結果は、図１の通りである。図１からカドミウム（Ｃｄ）の添加濃度が上昇するにつれて蛍光濃度が上昇することが分かる。また、図１には目視による結果（写真）は示していないが、カドミウムの添加濃度が増えるにつれて強い蛍光が観測された。これらのことから、本発明方法により、カドミウムを検出、定量できることが確認できた。
【００３２】
（Ｂ）ＡｔＰＣＳ１ Ｋ７５Ｔを用いた重金属センサー
ファイトケラチン合成酵素としてＡｔＰＣＳ１に代えてＡｔＰＣＳ１ Ｋ７５Ｔを用いる以外は、前記（Ａ）と同様にして酵素反応および標識化反応後、蛍光強度を測定することにより、カドミウムを検出、定量することができる。
【００３３】
（実施例２）
ＰＣ合成酵素としてシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＡｔＰＣＳ１および分裂酵母由来のＰＣ合成酵素ＳｐＰＣＳを用いた。酵素反応は、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ β−ＭＥ、１０ｍＭ グルタチオン（ＧＳＨ）および酵素（酵素量：５．０μｇ／３７５μｌ）の混合液に、重金属を所定の濃度となるように塩化物の形で添加し、３５℃、２０分間の酵素反応を行った。その後、７５μＭのＮＰＭ（アセトニトリルに溶解）、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と混合し、３０℃、５分間の反応を行った。反応終了後、反応液を実施例１−４）と同様に処理して蛍光強度を測定し、カドミウム（Ｃｄ）の濃度が５０μＭのときの活性を１００％とし、相対的な活性で示した。
結果は図２（ＰＣ合成酵素としてＡｔＰＣＳ１を用いた時）および図３（ＳｐＰＣＳを用いた時）の通りである。これらの結果から、ＡｔＰＣＳ１においてはカドミウム（Ｃｄ）特異的、ＳｐＰＣＳにおいては銅（Ｃｕ）特異的に反応が進行したことが分かった。
【００３４】
（実施例３）
ＰＣ合成酵素としてシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＡｔＰＣＳ１を用いた。ＰＣ合成反応は、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ ｍＭ β−ＭＥ、１０ｍＭ ＧＳＨ、酵素量は５．０μｇ／３７５μｌ、反応温度は３５℃、反応時間は０、１０、２０、３０、６０、１５０、２４０分間のそれぞれで行った。その後、７５μＭのＮＰＭ（アセトニトリルに溶解）、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と混合し、３０℃、５分間の反応を行った。反応終了後、反応液を実施例１と同様に処理して蛍光強度を測定した。
結果は図４の通りであり、６０分で蛍光強度はほぼ最大値に達することが確認された。
【００３５】
（実験例１）
２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ β−ＭＥ、１０ｍＭ グルタチオン（ＧＳＨ）、５００μＭのカドミウム（塩化カドミウムとして）に０．５μｇ／１２５μｌのＡｔＰＣＳ１ Ｋ７５ＴまたはＡｔＰＣＳ１を添加した後、３５℃で２０分間反応を行った。その後、３．６Ｍ ＨＣｌを１２５μｌ加え１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清をＨＰＬＣ分析に供し、ＰＣ２の生成量を測定した。
その結果、ＰＣ合成酵素としてＡｔＰＣＳ１を用いた時のＰＣ２生成量は、８．８８ｎｍｏｌであり、ＡｔＰＣＳ１ Ｋ７５Ｔを用いた時のＰＣ２生成量は、３７．８５ｎｍｏｌであった。すなわち、上記条件下におけるＡｔＰＣＳ１ Ｋ７５Ｔの酵素活性（ＰＣ２生成能）は、ＡｔＰＣＳ１のそれに比べて４．２６倍高いことが確認できた。
【００３６】
（実験例２）
ファイトケラチン（ＰＣ２）を終濃度０．１、１．０、１０、１００μＭに設定し、７５μＭのＮ−（１−ピレニル）マレインイミド（ＮＰＭ）（アセトニトリルに溶解）、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）と混合し、３０℃、５分間の反応を行った。反応終了後、反応液を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）により１０倍希釈した後、蛍光分光光度計(Hitachi F-2500)を用いて蛍光強度(Exitation＝３４５ｎｍ， Emission＝４７０ｎｍ）を測定した。
結果は図５に示す通りであり、ＰＣ２濃度依存的に蛍光強度の増大が確認され、０−１００μＭの間で定量的にＰＣ２を測定することが可能であることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明方法によれば、飲食品や環境中の重金属の測定（検出および定量）を簡便にかつ迅速に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ファイトケラチン合成酵素としてＡｔＰＣＳ１を用いたときの、試料中のカドミウム濃度と蛍光強度の関係を示す図である。
【図２】ファイトケラチン合成酵素としてＡｔＰＣＳ１を用いたときの、試料中の各種重金属の濃度と蛍光強度の関係を示す図である。
【図３】ファイトケラチン合成酵素としてＳｐＰＣＳを用いたときの、試料中の各種重金属の濃度と蛍光強度の関係を示す図である。
【図４】ファイトケラチン合成酵素としてＡｔＰＣＳ１を用いたときの、酵素反応時間と蛍光強度の関係を示す図である。
【図５】ファイトケラチンの濃度と蛍光強度の関係を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の重金属を測定する方法であって、以下の工程：
（１）重金属を含有する可能性のある試料とグルタチオンとの混合物にファイトケラチン合成酵素を作用させて酵素反応を行う工程；
（２）酵素反応液に蛍光標識化試薬を添加して前記酵素反応により生成したファイトケラチンを標識する工程；
（３）標識化されたファイトケラチンの蛍光強度を測定もしくは観察する工程；
を包含することを特徴とする重金属の測定方法。
【請求項２】
試料中の重金属を測定する方法であって、以下の工程：
（１）重金属を含有する可能性のある試料と蛍光標識化されたグルタチオンとの混合物にファイトケラチン合成酵素を作用させて酵素反応を行う工程；
（２）酵素反応液中に生成した蛍光標識されたファイトケラチンの蛍光強度を測定もしくは観察する工程；
を包含することを特徴とする重金属の測定方法。
【請求項３】
ファイトケラチン合成酵素が、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来のファイトケラチン合成酵素である請求項１または２記載の測定方法。
【請求項４】
ファイトケラチン合成酵素が
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグルタチオンからファイトケラチンを合成する能力を有するタンパク質；
である請求項１または２記載の測定方法。
【請求項５】
ファイトケラチン合成酵素が配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質である請求項１または２記載の測定方法。
【請求項６】
重金属がカドミウムである請求項１〜５のいずれかに記載の測定方法。
【請求項７】
蛍光標識化試薬がＮ−（１−ピレニル）マレインアミドである請求項１記載の測定方法。
【請求項８】
蛍光標識化されたグルタチオンが、Ｎ−（１−ピレニル）マレインアミドで標識化されたグルタチオンである請求項２記載の測定方法。
【請求項９】
基質としてグルタチオン、酵素としてファイトケラチン合成酵素、および蛍光標識試薬を含む重金属測定用キット。
【請求項１０】
基質として蛍光標識試薬で標識化されたグルタチオン、および酵素としてファイトケラチン合成酵素を含む重金属検定用キット。
【請求項１１】
蛍光標識試薬がＮ−（１−ピレニル）マレインアミドである請求項８または９記載の重金属測定用キット。
【請求項１２】
ファイトケラチン合成酵素が、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質である請求項９〜１１のいずれかに記載の重金属測定用キット。
【請求項１３】
配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するファイトケラチン合成酵素。
【請求項１４】
配列番号４で示されるファイトケラチン合成酵素のアミノ酸配列をコードする、精製および単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１５】
配列番号３で示されるポリヌクレオチド。
【請求項１】
試料中の重金属を測定する方法であって、以下の工程：
（１）重金属を含有する可能性のある試料とグルタチオンとの混合物にファイトケラチン合成酵素を作用させて酵素反応を行う工程；
（２）酵素反応液に蛍光標識化試薬を添加して前記酵素反応により生成したファイトケラチンを標識する工程；
（３）標識化されたファイトケラチンの蛍光強度を測定もしくは観察する工程；
を包含することを特徴とする重金属の測定方法。
【請求項２】
試料中の重金属を測定する方法であって、以下の工程：
（１）重金属を含有する可能性のある試料と蛍光標識化されたグルタチオンとの混合物にファイトケラチン合成酵素を作用させて酵素反応を行う工程；
（２）酵素反応液中に生成した蛍光標識されたファイトケラチンの蛍光強度を測定もしくは観察する工程；
を包含することを特徴とする重金属の測定方法。
【請求項３】
ファイトケラチン合成酵素が、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来のファイトケラチン合成酵素である請求項１または２記載の測定方法。
【請求項４】
ファイトケラチン合成酵素が
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグルタチオンからファイトケラチンを合成する能力を有するタンパク質；
である請求項１または２記載の測定方法。
【請求項５】
ファイトケラチン合成酵素が配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質である請求項１または２記載の測定方法。
【請求項６】
重金属がカドミウムである請求項１〜５のいずれかに記載の測定方法。
【請求項７】
蛍光標識化試薬がＮ−（１−ピレニル）マレインアミドである請求項１記載の測定方法。
【請求項８】
蛍光標識化されたグルタチオンが、Ｎ−（１−ピレニル）マレインアミドで標識化されたグルタチオンである請求項２記載の測定方法。
【請求項９】
基質としてグルタチオン、酵素としてファイトケラチン合成酵素、および蛍光標識試薬を含む重金属測定用キット。
【請求項１０】
基質として蛍光標識試薬で標識化されたグルタチオン、および酵素としてファイトケラチン合成酵素を含む重金属検定用キット。
【請求項１１】
蛍光標識試薬がＮ−（１−ピレニル）マレインアミドである請求項８または９記載の重金属測定用キット。
【請求項１２】
ファイトケラチン合成酵素が、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質である請求項９〜１１のいずれかに記載の重金属測定用キット。
【請求項１３】
配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するファイトケラチン合成酵素。
【請求項１４】
配列番号４で示されるファイトケラチン合成酵素のアミノ酸配列をコードする、精製および単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１５】
配列番号３で示されるポリヌクレオチド。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００９−３４０４１（Ｐ２００９−３４０４１Ａ）
【公開日】平成２１年２月１９日（２００９．２．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２０１０９２（Ｐ２００７−２０１０９２）
【出願日】平成１９年８月１日（２００７．８．１）
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【出願人】（０００１５６９３８）関西電力株式会社 (1,442)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年２月１９日（２００９．２．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月１日（２００７．８．１）
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【出願人】（０００１５６９３８）関西電力株式会社 (1,442)
【Ｆターム（参考）】
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