金属イオン介在性蛍光スーパークエンチングアッセイ、キット及び試薬
金属イオンリン酸リガンドの特異的結合及び蛍光性ポリマースーパークエンチングを用いた、キナーゼ、ホスファターゼ及びプロテアーゼ酵素活性のための試薬及びアッセイについて説明する。本アッセイは、ペプチド及びタンパク質基質を用いて、キナーゼ、ホスファターゼ及びプロテアーゼ酵素活性を測定するための一般的なプラットホームを提供する。ＤＮＡハイブリダイゼーションをベースとした試薬及びアッセイ、並びにアプタマー、抗体及び他のリガンドを用いたタンパク質用の試薬及びアッセイについても説明する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００３年１２月１２日付けで出願された米国特許仮出願第６０／５２８,７９２号；２００４年３月８日付けで出願された米国特許仮出願第６０／５５０,７３３号；及び、２００４年８月２７日付けで出願された米国特許仮出願第６０／６０４,８１３号の利益を主張するものである。前述の各出願は、その全部が本明細書中で参考文献として組み込まれている。
【０００２】
本出願は、一般的に生体分子の検出のための試薬、キット及びアッセイに関し、特に、金属イオン結合及び蛍光性ポリマースーパークエンチングを組み合わせた生体分子の検出のための試薬、キット及びアッセイに関する。
【背景技術】
【０００３】
酵素免疫測定法（すなわち、ＥＬＩＳＡ）は、広範囲のタンパク質、抗体、細胞、ウイルスなどの存在及び生体活性を同定するための、最も広く用いられ且つ許容された技術である。ＥＬＩＳＡは、最初に分析対象である生体分子が表面に付着（ａｔｔａｃｈ）された抗体に結合する、多段階の「サンドイッチ（ｓａｎｄｗｉｃｈ）アッセイ」である。次に、二次抗体が生体分子に結合する。いくつかの場合においては、この二次抗体はその後増大反応を「展開する」触媒酵素に付着される。他の場合においては、この二次抗体は、３番目のタンパク質（例えば、アビジン又はストレプトアビジン）に結合するためにビオチン化される。このタンパク質は、比色変化を増大するための化学的カスケードを引き起こす酵素、又は蛍光タギングのための蛍光団のいずれかに付着される。
【０００４】
広範に使用されているにもかかわらず、ＥＬＩＳＡには多くの不都合な点がある。例えば、多段階の手順は試薬と展開時間の双方に渡って厳密な制御を要するため、時間がかかり、「偽陽性」になりやすい。更に、非特異的吸着試薬を除去するために慎重な洗浄が必要である。
【０００５】
蛍光共鳴エネルギー移動（即ち、ＦＲＥＴ）法は、ポリメラーゼ連鎖反応をベースとした（ＰＣＲ）遺伝子配列決定及び免疫測定法の双方に適用されている。ＦＲＥＴは分析対象である生体分子の同種（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）結合を用いて、オフ状態ではクエンチングされる色素の蛍光を活性化する。ＦＲＥＴ技術の典型的な例においては、蛍光色素は抗体に連結（ｌｉｎｋ）され（Ｆ−Ａｂ）、そしてこの２分子がクエンチャー（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）に連結している抗原（Ａｇ−Ｑ）に結合する。結合複合体（Ｆ−Ａｂ：Ａｇ−Ｑ）はエネルギー移動によりクエンチングされる（即ち、非蛍光）。Ｑにテザリングしていない同一の分析対象抗原（Ａｇ）の存在下では、Ａｇ−Ｑの２分子は相対濃度（［Ａｇ−Ｑ］／［Ａｇ］）により決定される平衡結合確率により定量的に置換される。これによりＦＲＥＴ法は、抗原が既に十分特定されている定量的アッセイに制限されており、抗原をＱに連結させる化学をそれぞれの新しい場合について解決しなければならない。
【０００６】
他のＦＲＥＴの基質及びアッセイは、米国特許第６,２９１,２０１号及び以下の文献に開示されている：Ａｎｎｅ，他，「Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｔｙｐｅ Ｂ Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ」（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９１，２５３−２６１（２００１））；Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，他，「Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｓｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ａｎｔｈｒａｃｉｓ Ｌｅｔｈａｌ Ｆａｃｔｏｒ Ｐｒｏｔｅａｓｅ」（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅ．９９，６６０３−６６０６（２００２））；Ｍｏｃｋ，他，「Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｒａｐｉｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ａｎｔｈｒａｃｉｓ Ｌｅｔｈａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｆａｃｔｏｒ」（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９，６５２７−６５２９（２００２））；Ｓｐｏｒｔｓｍａｎ他，（Ａｓｓａｙ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ., ２００４，２，２０５）；及びＲｏｄｅｍｓ他，（Ａｓｓａｙ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ., ２００２，１，９）。
【０００７】
分子内でクエンチングされる蛍光基質を用いた他のアッセイは、以下の文献に開示されている：Ｚｈｏｎｇ，他，「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｌｌｙ Ｑｕｅｎｃｈｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｏｒ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ Ｌｅａｄｅｒ Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ」（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５５，６６−７３（１９９８））；Ｒｏｓｓｅ，他，「Ｒａｐｉｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｆｏｒ Ｎｏｖｅｌ Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｙ」（Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ.，２，４６１−４６６（２０００）；及びＴｈｏｍｐｓｏｎ，他，「Ａ ＢＯＤＩＰＹ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｐａｉｎｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ」（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７９，１７０−１７８（２０００））。
【０００８】
蛍光分極の変化を測定し、分析物の量を定量するために使用するアッセイも開発されている。例えば、Ｌｅｖｉｎｅ，他，「Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ」（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４７，８３−８８（１９９７））を参照されたい。また、Ｓｃｈａｄｅ，他，「ＢＯＤＩＰＹ−α−Ｃａｓｅｉｎ，ａ ｐＨ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ａｓｓａｙｓ Ｕｓｉｎｇ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ」（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４３，１−７（１９９６））を参照されたい。
【０００９】
しかしながら、高い感度で、酵素及び核酸などの生物学的に関連のある分子を迅速且つ正確に検出して定量することが、なお必要とされている。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
１番目の実施態様によると：
ビオチン化ポリペプチド（ここで、ポリペプチドは１又は複数のリン酸基を含む）；及び
ポリペプチドのリン酸基と会合（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）する金属カチオン、
を含んで成る複合体が提供される。
【００１１】
２番目の実施態様によると、サンプル中のキナーゼ又はホスファターゼ酵素分析物の存在及び／又は量を検出する方法が提供される。
この実施態様に従った方法は：
ａ）サンプルを、ビオチン化ポリペプチドとインキュベートすること（ここで、キナーゼ酵素分析物の場合には、ポリペプチドは分析物によりリン酸化可能な１又は複数の基を含んで成り、又はホスファターゼ酵素分析物の場合には、ポリペプチドは分析物により脱リン酸化可能な１又は複数の基を含んで成る）；
ｂ）サンプルに金属カチオンを添加すること（ここで、金属カチオンはクエンチャーであるか、又はこの方法は金属カチオンと会合することができるクエンチャーをサンプルに添加することを更に含んで成る）
ｃ）クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、クエンチャーが蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように、互いに会合した複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、サンプルに添加すること（ここで、蛍光剤はビオチン結合性タンパク質と会合している）；及び
ｄ）蛍光を検出すること、
を含んで成り、
ここで、検出される蛍光は、サンプル中の分析物の存在及び／又は量を示す。
【００１２】
３番目の実施態様によると、キナーゼ又はホスファターゼ酵素活性の阻害剤としての化合物をスクリーニングする方法が提供される。この実施態様に従った方法は：
ａ）サンプル中で、ビオチン化ポリペプチドをこの化合物の存在下でキナーゼ又はホスファターゼ酵素とインキュベートすること（ここで、キナーゼ酵素アッセイの場合には、このポリペプチドは分析物によりリン酸化可能な１又は複数の基を含んで成り、且つ、ホスファターゼ酵素アッセイの場合には、このポリペプチド分析物により脱リン酸化可能な１又は複数の基を含んで成る）；
ｂ）サンプルに金属カチオンを添加すること（ここで、金属カチオンはクエンチャーであるか、又は該方法は金属カチオンと会合することができるクエンチャーをサンプルに添加することを更に含んで成る）
ｃ）クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、クエンチャーが蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように、互いに会合した複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、サンプルに添加すること（ここで、蛍光剤はビオチン結合性タンパク質と会合している）；及び
ｄ）化合物の存在下でサンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成り、
ここで、化合物の存在下で検出される蛍光の量は、キナーゼ又はホスファターゼ酵素活性における化合物の阻害効果を示す。
【００１３】
４番目の実施態様によると：
１又は複数のリン酸化可能な又は脱リン酸化可能な基を含んで成るポリペプチド；及び
ポリペプチドに接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）するクエンチング部分、
を含んで成るバイオコンジュゲート（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）が提供される。クエンチング部分は、ローダミン又は類似のスペクトル特性を有する別の色素であることができる。
【００１４】
５番目の実施態様によると、上記のバイオコンジュゲートは、１又は複数のリン酸基及び切断部位を更に含んで成ることができる（ここで、クエンチング部分及びリン酸基は切断部位の反対側に存在する）。好ましくは、クエンチング部分が接合する切断部位の側には、リン酸基は存在しない。
【００１５】
６番目の実施態様によると：
ａ）サンプルを、上記の切断部位及び１又は複数のリン酸基を含んで成るバイオコンジュゲートとインキュベートすること（ここで、プロテアーゼ酵素は切断部位でポリペプチドを切断する）；
ｂ）クエンチング部分が蛍光剤と会合する際に、クエンチング部分が蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合する複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、サンプルに添加すること（ここで、蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンが蛍光剤のアニオン基と会合している）；及び
ｃ）サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成る、サンプル中のプロテアーゼ酵素の存在及び／又は量を検出する方法が提供され、
ここで、検出される蛍光は、サンプル中のプロテアーゼ酵素の存在及び／又は量を示す。
【００１６】
７番目の実施態様によると：
上記のバイオコンジュゲートを含んで成る第一の成分；及び
蛍光剤を含んで成る第二の成分（該蛍光剤は、クエンチング部分が蛍光剤と会合する際に、バイオコンジュゲートのクエンチング部分が蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合する複数の蛍光種を含んで成る（ここで、蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは蛍光剤のアニオン基と会合している））
を含んで成る、サンプル中のキナーゼ又はプロテアーゼ酵素分析物の存在及び／又は量を検出するためのキットが提供される。
【００１７】
８番目の実施態様によると：
ａ）サンプルを、上記のバイオコンジュゲートとインキュベートすること（ここで、バイオコンジュゲートのポリペプチドは、酵素分析物によりリン酸化可能な又は脱リン酸化可能な基を含んで成る）；
ｂ）クエンチング部分が蛍光剤と会合する際に、クエンチング部分が蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合する複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、サンプルに添加すること（ここで、蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは蛍光剤のアニオン基と会合している）；及び
ｃ）サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成る、サンプル中の酵素分析物の存在及び／又は量を検出する方法が提供され、
ここで、検出される蛍光は、サンプル中の分析物の存在及び／又は量を示す。
【００１８】
９番目の実施態様によると：
クエンチャーを含んで成る第一の成分；及び
ビオチン化ポリペプチドを含んで成る第二の成分（ここで、ポリペプチドは分析物により修飾されることができ、且つ分析物により修飾されたポリペプチドはクエンチャーと会合している）
を含んで成る、サンプル中の分析物の存在を検出するためのキットが提供される。
【００１９】
１０番目の実施態様によると：
ａ）サンプルを、サイクリックＡＭＰ又はサイクリックＧＭＰと接合したクエンチャーを含んで成るバイオコンジュゲートとインキュベートすること；
ｂ）クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、クエンチャーが蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合する複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、サンプルに添加すること（ここで、蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは蛍光剤のアニオン基と会合している）；及び
ｃ）サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成る、サンプル中のホスホジエステラーゼ酵素の存在及び／又は量を検出する方法が提供され、
ここで、検出される蛍光の量は、サンプル中のホスホジエステラーゼ酵素の存在及び／又は量を示す。
【００２０】
１１番目の実施態様によると：
ａ）１又は複数のリン酸化可能な基を含んで成るポリペプチド基質及びクエンチャー標識ポリペプチドを、キナーゼ酵素を含んで成るサンプルとインキュベートすること；
ｂ）クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、クエンチャーが蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合する複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、サンプルに添加すること（ここで、蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは蛍光剤のアニオン基と会合している）；及び
ｃ）サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成る、ポリペプチド基質のキナーゼ酵素活性を検出する方法が提供され、
ここで、ポリペプチド基質のリン酸化は、蛍光の増加をもたらし；且つ
ここで、検出される蛍光の量は、ポリペプチド基質のキナーゼ酵素活性の存在及び／又は量を示す。
【００２１】
１２番目の実施態様によると：
ａ）ポリヌクレオチドの第一末端領域にポリペプチドに接合したクエンチャーを、且つポリヌクレオチドの第二末端領域にリン酸基を含んで成るポリヌクレオチドとともに、サンプルをインキュベートすること（ここで、ポリヌクレオチドの第一及び第二末端領域の少なくとも１つの部分が互いにハイブリダイズしてヘアピン構造を形成することができ、且つ末端領域の間のポリヌクレオチドの中心領域が、核酸分析物にハイブリダイズすることのできる核酸配列を含んで成り、それによりヘアピン構造を崩壊させて、ポリヌクレオチドのクエンチャーとリン酸基の分離をもたらす）；
ｂ）クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、クエンチャーが蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合する複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、サンプルに添加すること（ここで、蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは蛍光剤のアニオン基と会合している）；及び
ｃ）サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成る、サンプル中の核酸分析物の存在及び／又は量を検出する方法が提供され、
ここで、検出される蛍光は、サンプル中の核酸分析物の存在及び／又は量を示す。
【００２２】
１３番目の実施態様によると：
ａ）サンプル中の核酸をクエンチャーで標識すること；
ｂ）サンプルを、ポリヌクレオチドの第一末端領域にリン酸基を含んで成るポリヌクレオチドとインキュベートすること（ここで、ポリヌクレオチドは、核酸分析物にハイブリダイズすることのできる核酸配列を含んで成る）；
ｃ）クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、クエンチャーが蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合する複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、サンプルに添加すること（ここで、蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは蛍光剤のアニオン基と会合している）；及び
ｄ）サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成る、サンプル中の核酸分析物の存在及び／又は量を検出する方法が提供され、
ここで、核酸分析物のポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションが、蛍光の減少をもたらし；且つ
ここで、蛍光の減少は、サンプル中の核酸分析物の存在及び／又は量を示す。
【００２３】
１４番目の実施態様によると：
ａ）末端領域にリン酸基を含んで成る第一のポリヌクレオチド、及び末端領域において第二のポリヌクレオチドに接合したクエンチャーを含んで成る第二のポリヌクレオチドとともに、サンプルをインキュベートすること（ここで、第二のポリヌクレオチド及び核酸分析物は、第一のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる）；
ｂ）クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、クエンチャーが蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合する複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、サンプルに添加すること（ここで、蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは蛍光剤のアニオン基と会合している）；及び
ｃ）サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成る、サンプル中の核酸分析物の存在及び／又は量を検出する方法が提供され、
ここで、核酸分析物の第一のポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションは、蛍光の増大をもたらし；且つ
ここで、検出される蛍光の量は、サンプル中の核酸分析物の存在及び／又は量を示す。
【００２４】
１５番目の実施態様によると：
ａ）末端領域にリン酸基を含んで成る核酸アプタマー（ここで、核酸アプタマーはポリペプチド分析物に結合することができる）、及びクエンチャーを含んで成るポリヌクレオチド（ここで、ポリヌクレオチドは核酸アプタマーにハイブリダイズすることができる）とともに、サンプルをインキュベートすること；
ｂ）クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、クエンチャーが蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合する複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、サンプルに添加すること（ここで、蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは蛍光剤のアニオン基と会合している）；及び
ｃ）サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成る、サンプル中のポリペプチド分析物の存在及び／又は量を検出する方法が提供され、
ここで、ポリペプチド分析物の核酸アプタマーへの結合は、蛍光の増大をもたらし；且つ
ここで、検出される蛍光の量は、サンプル中のポリペプチド分析物の存在及び／又は量を示す。
【００２５】
１６番目の実施態様によると：
ビオチン部分を含んで成るポリペプチド（ここで、ポリペプチドの１又は複数のアミノ酸残基は、リン酸化又は脱リン酸化が可能である）；及び
クエンチング部分に接合したビオチン結合性タンパク質、
を含んで成る複合体が提供され、
ここで、ポリペプチドのビオチン部分は、タンパク質−タンパク質相互作用によってビオチン結合性タンパク質と会合し；且つ
ここで、クエンチング部分は、蛍光剤と会合する際に蛍光剤のスーパークエンチングを増大することが可能である。
【００２６】
１７番目の実施態様によると：
ａ）上記の複合体（ここで、キナーゼ酵素分析物の場合には、ポリペプチドは分析物によりリン酸化可能な１又は複数の基を含んで成り、ホスファターゼ酵素分析物の場合には、ポリペプチドは分析物により脱リン酸化可能な１又は複数の基を含んで成る）とともに、サンプルをインキュベートすること；
ｂ）クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、クエンチャーが蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合する複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、サンプルに添加すること（ここで、蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは蛍光剤のアニオン基と会合している）；及び
ｃ）サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成る、サンプル中のキナーゼ又はホスファターゼ酵素分析物の存在及び／又は量を検出する方法が提供され、
ここで、検出される蛍光の量は、サンプル中の分析物の存在及び／又は量を示す。
【００２７】
１８番目の実施態様によると：
ａ）キナーゼ酵素分析物のアッセイの場合には、分析物によりリン酸化可能な１又は複数の基を含んで成るビオチン化ポリペプチド、或いは、ホスファターゼ酵素分析物のアッセイの場合には、分析物により脱リン酸化可能な１又は複数の基を含んで成るビオチン化ポリペプチドのいずれかとともに、サンプルをインキュベートすること；
ｂ）クエンチング部分に接合したビオチン結合性タンパク質を、インキュベートしたサンプルに添加すること；
ｃ）クエンチング部分が蛍光剤と会合する際に、クエンチング部分が蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合する複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、サンプルに添加すること（ここで、蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは蛍光剤のアニオン基と会合している）；及び
ｄ）サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成る、サンプル中のキナーゼ又はホスファターゼ酵素分析物の存在及び／又は量を検出する方法が提供され、
ここで、検出される蛍光は、サンプル中の分析物の存在及び／又は量を示す。
【００２８】
発明の詳細な説明
バイオセンシング（ｂｉｏｓｅｎｓｉｎｇ）に対するクエンチャー−テザリング−リガンド（ＱＴＬ）アプローチは、電子及びエネルギー移動クエンチャーによる蛍光性高分子電解質のスーパークエンチングを利用する。ＱＴＬアッセイのプラットホームは、接合したポリマーの集光能力とそれらの高く非局在化された励起状態を利用して、非常に少量の電子及びエネルギー移動種の存在に反応した増大された蛍光シグナルの変調を提供する。この新規の技術は、シグナル変調現象と抗原−レセプター、基質−酵素及びオリゴヌクレオチド−オリゴヌクレオチド結合の相互作用とを会合させることにより、タンパク質、小分子、ペプチド、プロテアーゼ及びオリゴヌクレオチドの感度の高い検出に適用されてきた。［１−９］
【００２９】
１つのアプローチにおいて、蛍光性ポリマー（Ｐ）は、溶液中又は固形支持体上のいずれかにおいてビオチン結合性タンパク質とともに配置され、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質相互作用により、クエンチャー−テザリング−ビオチン（ＱＴＢ）バイオコンジュゲートと会合複合体を形成する。ＱＴＢコンジュゲートは、ビオチンへの反応性テザリングにより連結したクエンチャーＱを含む。ビオチンは、ポリマー（Ｐ）とともに配置されたビオチン結合性タンパク質と強く結合する。ＱＴＢバイオコンジュゲートの標的分析物との反応は、容易に検出可能な方法においてポリマー蛍光を変える。
【００３０】
本明細書中で説明するように、ＱＴＬバイオコンジュゲートと蛍光性ポリマーとを会合させる代替方法が開発されてきた。代替方法は、溶液中における個々の分子又は支持体上の集合体（ａｓｓｅｍｂｌｙ）のいずれかとしての、蛍光性高分子電解質の金属イオンと複合する自己組織化能力を利用する。このようにして複合した金属イオンは、ＱＴＬバイオコンジュゲート中に組み込まれた配位基（例えば、リン酸基）に選択的に会合することができ、それにより、例えばタンパク質、小分子、ペプチド、プロテアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ及びオリゴヌクレオチドの選択的検出のための基礎を提供する。［１０−１１］
【００３１】
アクセプタ分子（すなわち、クエンチャー）がドナー分子の効力をクエンチングすることのできる効力は、２つの実在物を隔てる距離に依存する。構成的（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ）アッセイにおいては、分子のテザリング（アクセプタとドナーを一緒にする）は、共有結合及びビオチン−アビジン相互作用などの一般的なストラテジーにより達成されることができる。共有結合はクエンチャーを直接アクセプタ上に配置し、それらを１つの分子にするので、共有結合は共鳴エネルギー移動に対して優れたアプローチである。従って、その２つの間の距離は、単結合と同じくらいの短さであることができる。一方、ほとんどどの分子もビオチンに共有結合することができるため、ビオチンとアビジンなどのビオチン結合性タンパク質（ＢＢＰ）の間の相互作用は、広範な汎用性を提供する。しかし、ビオチン結合性タンパク質は一般的に６０キロダルトンより大きく、その結果として、ビオチン−ＢＢＰ相互作用によりアクセプタとドナーが一緒にされる場合に、アクセプタとドナーの間の距離が大きくなり得る。
【００３２】
ビオチン−ＢＢＰ相互作用に対する一般的な置き換えとして、スーパークエンチングアッセイにおけるアクセプタ及びドナーの同じ場所への配置に対しては、金属イオンリン酸相互作用を提案する。多くの分子はリン酸化されることができるので、ビオチン−ＢＢＰ相互作用と同様に、このストラテジーは一般的に適用可能である。さらに、そのテザリングの両端距離（すなわち、金属イオンとリン酸との間の配位距離）は著しく短いので、このストラテジーはビオチン−アビジン相互作用に対する一般的な改良である。リン酸基などのリガンドに対する金属イオンの親和性は、ビオチン−ＢＢＰ相互作用の親和性より著しく低い（Ｋａ＝１０5-7に対して対Ｋａ＝１０13-15）。
【００３３】
１つの実施態様によると、溶液中で個々の分子又は金属イオンに複合した支持体上の集合体のいずれかとして、蛍光性高分子電解質を含んで成る新規のセンサーが提供される。センサーの金属イオンは更に、ＱＴＬバイオコンジュゲート中に組み込まれたリガンド（例えば、リン酸基）に選択的に会合することができ、そしてエンドポイント様式及び動態（ｋｉｎｅｔｉｃ）様式を含む（これらに限定されない）、上記と同様の分子（例えば、タンパク質、小分子、ペプチド、プロテアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ及びオリゴヌクレオチド）の選択的な検出に対する基礎を提供することができる。下記で説明するように、いくつかのアッセイに対して、配位基−金属イオン結合はビオチン−ビオチン結合性タンパク質会合に対する代替手段を提供する。他の実施例において、配位基をＱＴＬのクエンチャー部分に会合するか又はＱＴＬのクエンチャー部分から取り除いて、センサー蛍光をクエンチングし、又はセンサー蛍光を回復させる（又はその双方）。
【００３４】
本明細書中に記載の様々な実施態様は、蛍光性ポリマー−ＱＴＬスーパークエンチング及び金属イオン−リン酸リガンド特異的結合を用いて、キナーゼ、ホスファターゼ及びプロテアーゼ活性に対する改良されたアッセイを提供する。蛍光性ポリマーの金属イオン介在性スーパークエンチングは、ペプチド及びタンパク質基質を用いるキナーゼ、ホスファターゼ及びプロテアーゼ酵素活性の測定に対する一般的なプラットホームを提供し、そしてＤＮＡハイブリダイゼーションをベースとしたアッセイ並びにアプタマー、抗体及び他のリガンドを用いるタンパク質のアッセイを実施するためのより一般的なアプローチを提供する。
【００３５】
ポリ（フェニレンエチニレン）（ＰＰＥ）ファミリー中の共役ポリマーは、芳香環に付加される様々な官能基を用いて調製することができる。ペンダントアニオン基を用いて合成されたポリマーの中には、図１Ａ及び図１Ｂに示すものがある。図１Ａは、スルホポリｐ−フェニレンエチニレン（ＰＰＥ−Ｄｉ−ＣＯＯＨ）共役ポリマーの分子構造を示す。図１Ｂは、スフホポリｐ−フェニレンエチニレン（ＰＰＥ）共役ポリマーの分子構造を示す。これらのポリマーの双方は、水中でカチオン性マイクロスフィアと会合して、安定なポリマー被覆を形成することができる。ポリマー被覆マイクロスフィアは、強い蛍光を示す。ポリマー被覆マイクロスフィア上の全体の電荷は、ポリマー負荷の程度を変化させること及びポリマーの構造を変化させることにより調整することができる。
【００３６】
蛍光性ポリマー被覆マイクロスフィアは金属カチオンと会合することができ、そして金属カチオンの負荷はマイクロスフィア上のポリマーの負荷レベルに依存し得ることが見出された。Ｆｅ3+及びＣｕ2+などのいくつかの金属イオンは、ポリマー蛍光をクエンチングすることができ、一方Ｇａ3+などの他のものはポリマー蛍光をクエンチングしない。いくつかの実施態様において、金属イオンの不在下ではほとんど又は全くクエンチングが生じない条件下で、マイクロスフィア結合ポリマーの蛍光のスーパークエンチングを介在するためにＧａ3+が用いられる。
【００３７】
例えば、色素を含有するリン酸化ペプチド：
ローダミン−ＬＲＲＡ（ｐＳ）ＬＧ 配列番号：１
［式中、ｐＳはリン酸化セリン（ポリマーに対して優れたエネルギー移動クエンチャーとして働くはずである）を指す］は、ポリマー被覆マイクロスフィアの蛍光をほとんど又は全くクエンチングしないことが見出された。しかし、ポリマー被覆マイクロスフィアをＧａ3+の添加により「荷電」させた後では、懸濁物への同一のペプチドの添加はポリマー蛍光の顕著なクエンチングをもたらす。対照的に：
ローダミン−ＬＲＲＡＳＬＧ 配列番号：２
で表されるペプチドなどの、リン酸化残基のみ又はクエンチャー色素のみを含有するペプチドは、同一の条件下でポリマー蛍光にほとんど影響を与えない。リン酸化生体分子の金属で荷電したポリマーとの特異的な会合は、下記で説明するように多くのアッセイの基礎となり得る。
【００３８】
図２は、キナーゼ又はホスファターゼ活性のアッセイにおいて用いることのできる、金属イオン介在性スーパークエンチングをベースとしたセンサーを図示する。図２は、標的酵素によるローダミンペプチド基質のリン酸化又は脱リン酸化を、ＱＴＬセンサーの添加により検出する方法を示す。ペプチド産物をローダミンクエンチャーで標識し、Ｇａ3+金属イオンへの特異的なリン酸結合によりポリマー表面に移動させる。その結果生じるポリマー蛍光のクエンチングは、ポリペプチド基質のリン酸化又は脱リン酸化と同時に起こる。このタイプのアッセイは、ペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物及びヌクレオチド又は小分子（これらに限定されない）を含む生体基質に対するリン酸化又は脱リン酸化を和らげる（ｍｏｄｅｒａｔｅ）酵素に対して用いることができる。
【００３９】
キナーゼ／ホスファターゼアッセイ
タンパク質のリン酸化及び脱リン酸化は、細胞の代謝、成長、分化及び細胞増殖の調節を介在する。酵素機能における異常は、癌及び炎症などの疾患を引き起こし得る。５００超のキナーゼ及びホスファターゼは、細胞活性の調節に関与していると考えられており、それらの多くは薬物治療の標的である。
【００４０】
タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）は、ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼであり、ホルモン及び神経伝達などの、多くのｃＡＭＰ上昇性の最初のメッセンジャーのエフェクターとして機能する。ＰＫＡの遍在的な分布及びその柔軟な基質認識特性は、リンパ球細胞増殖及び免疫応答の阻害、海馬における長期抑制の介在並びに感覚神経伝達などにおける生きた細胞の多くのプロセスにおいて、ＰＫＡを中心的な要素とする。タンパク質チロシンホスファターゼ−１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ）は、インスリンシグナル伝達経路の負の調節因子であることが最近示され、これはＰＴＰ−１Ｂに対する阻害剤が２型糖尿病の処置において有益であるかもしれないことを示唆している。
【００４１】
キナーゼのうち、９０％はセリン残基をリン酸化し、１０％はスレオニン残基をリン酸化し、そして０.１％はチロシン残基をリン酸化する。抗ホスホチロシン抗体の開発は可能となったが、ホスホ−セリン及びスレオニン残基に対する抗体は低親和性であり、しばしば１つだけのキナーゼに特異的である。現在、非抗体ベースのハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイは、時間分解蛍光（ＴＲＦ）、蛍光偏光アッセイ（ＦＰ）又は蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）などの方法をベースとしている。これらのアッセイは、特殊装置を必要とし、そして／或いは酵素活性に応じた低い蛍光強度変化に苦しんでいる。
【００４２】
上記のスーパークエンチングを用いた蛍光シグナルの増大により、酵素活性測定における感度の強化に努めてきた。センサーのプラットホームは、図１Ａに示すポリ（フェニレンエチレン）（ＰＰＥ）誘導体などの修飾アニオン性高分子電解質蛍光剤を含むことができる。ＰＰＥ蛍光剤は、正に荷電したマイクロスフィア上で吸着により固定化することができる。このポリマーは、高い量子効率で光ルミネッセンスを示し、プロテアーゼ活性の検出に使用されてきた。［９］このプラットホームにおいて、Ｎ−末端のクエンチャー及びＣ−末端のビオチンを側面に配置する反応性ペプチド配列が用いられた。このペプチドは、ビオチン結合性タンパク質とともに配置されたＰＰＥ被覆マイクロスフィアに結合し、ＰＰＥ蛍光のほぼ完全なクエンチングをもたらす。ペプチドの酵素介在性切断は、酵素活性に対して直線性を有した蛍光クエンチングの反転をもたらす。１つのエネルギーアクセプタ色素はクエンチャーあたり約４９繰り返し単位からの光ルミネッセンスをクエンチングすることができることが、実証された。［９］
【００４３】
蛍光性ポリマーのスーパークエンチングは、図２に示すように、キナーゼ／ホスファターゼ酵素活性のバイオディテクション（ｂｉｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）に適応することができる。図２に示すように、多価金属イオンは、溶液中でアニオン性共役ポリマーと強く会合することができ、ポリマー蛍光の変化及び／又はクエンチングをもたらす。ポリマー−マイクロスフィアアンサンブル上の全体の電荷は調整することができるので、これらのアンサンブルは、特異的リガンドと複合する能力を保持したままポリマー蛍光を強くクエンチングせずに金属イオンがポリマーと会合するプラットホームを与えることができる。このアプローチは、低いｐＨでのリン酸酸素との配位によって金属イオンがリン酸化化合物を特異的にトラップすることのできる固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）で使用されるものと類似している。例えば、Ｍｏｒｇａｎ他,（Ａｓｓａｙ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ., ２００４，２，１７１）を参照されたい。
【００４４】
本明細書中で説明するように、ガリウムはポリマー放射をクエンチングすることなく蛍光剤（図１Ａ及び図１Ｂに示すものなどのアニオン性共役ポリマー、並びに複数の蛍光種を含んで成る他の蛍光剤が挙げられるが、これらに限定されない）と会合することができる。ガリウムは、単量体のＧａ3+として又はポリオキソ種などの多量体アンサンブルとして存在することができる。蛍光剤会合ガリウムはまた、ペプチドがローダミンなどの色素を含む場合、金属イオン介在性ポリマースーパークエンチングが起こるように、リン酸化ペプチドと会合することもできる。蛍光剤は、マイクロスフィアなどの固形支持体の表面と会合することができる。このアプローチは、図２に示すように、感度の良い選択的なキナーゼ／ホスファターゼアッセイに対する基礎を提供する。
【００４５】
蛍光クエンチング（ターンオフ（ｔｕｒｎ ｏｆｆ））キナーゼアッセイの場合において、ポリマー蛍光のクエンチングは酵素活性に対して直線性を有する。下記の実施例で説明するように、このアッセイは、ほぼ生理学的ｐＨで実施することができ、そして構成的リアルタイム又はエンドポイントアッセイにおいて柔軟性を許容する。このアッセイは、瞬時の「混ぜて読む（ｍｉｘ ａｎｄ ｒｅａｄ）」であり、洗浄段階又は複雑なサンプル調製を必要としない。
【実施例】
【００４６】
下記の実施例１は、タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）及びタンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＢ−１Ｂ）の酵素活性に対する確固たる（ｒｏｂｕｓｔ）アッセイを示す。このアッセイは、通常１０〜２０％の基質転換で０.９超のＺ'値を与える。下記に示す実施例において、キナーゼアッセイは酵素活性に応じた蛍光シグナルの減衰を与え、一方ホスファターゼアッセイは酵素活性の増加にともなったシグナルの増大を与える。配列番号：１などのペプチドに対しては、クエンチャーはポリマー蛍光のクエンチングの結果として感作された蛍光を示すことができるので、このアッセイは同一のサンプルにおいて、観察する波長に依存したシグナルの増大又は減少を示すことができる。これにより、レシオメトリック（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ）測定が可能となる。さらに、ペプチドのクエンチャーにおける蛍光偏光の観察により検出を実施することができる。金属イオン介在性スーパークエンチングをベースとしたタンパク質キナーゼ、ホスファターゼ及びプロテアーゼアッセイに対しては、エンドポイント及び動態アッセイの双方を実施することができる。
【００４７】
実施例１−タンパク質キナーゼａ（ＰＫＡ）及びチロシンホスファターゼ活性１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ）に対するアッセイ
下記のペプチドを酵素基質及びホスホペプチドキャリブレータ（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）として使用した。
【００４８】
ＰＫＡ活性の検出用に：
ローダミン−ＬＲＲＡＳＬＧ 配列番号：２
及びそのキャリブレータペプチド：
ローダミン−ＬＲＲＡ（ｐＳ）ＬＧ 配列番号：１
が、Ａｎａｓｐｅｃにより合成された。
【００４９】
ホスファターゼ活性の検出用に：
ローダミン−ＫＶＥＫＩＧＥＧＴ（ｐＹ）ＧＶＶＹＫ 配列番号：３
及びそのキャリブレータペプチド：
ローダミン−ＫＶＥＫＩＧＥＧＴＹＧＶＶＹＫ 配列番号：４
が、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙにより合成された。
【００５０】
組み換えＰＫＡを、Ｐｒｏｍｅｇａから購入した。酵素であるＰＴＰ−１Ｂ及び阻害剤であるＲＫ６８２を、Ｂｉｏｍｏｌから購入した。ＰＫＡに対するＳｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ阻害剤を、Ｓｉｇｍａから購入した。ポリスチレンアミンで官能基化されたビーズを、Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓから得た。
【００５１】
アッセイバッファー中の１５μＬの１μＭペプチド溶液（ローダミン−ホスホ−ペプチド又はローダミン−非ホスホ−ペプチドのいずれか）を、検出器（ｄｅｔｅｃｔｏｒ）バッファー中の１５μＬのセンサーに添加することにより、センサービーズの性能を決定した。４５０ｎｍでの励起、４７５ｎｍでのカットオフフィルター及び４９０ｎｍでの放射にて、ウエルスキャンモードで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＸＳプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ）を用いて、混合物の蛍光を測定した。
【００５２】
２価又は３価の金属イオンが、溶液中で図１Ａ及び図１Ｂに示すようなアニオン性ポリマーと強く会合することができるという発見に基づいて、図１Ａに示す構造のポリマーをキナーゼ／ホスファターゼアッセイのためのセンサーとして選んだ。ＰＰＥ−Ｄｉ−ＣＯＯＨで被覆したマイクロスフィアを含んで成る溶液に、３４０μＭの濃度のＧａＣｌ3を添加した際に、放射のクエンチングは観察されなかった。より高い濃度のＧａＣｌ3では、蛍光放射のクエンチングが観察された。しかし、最適濃度のＧａ3+を用いた場合、ローダミン標識ホスホ−ペプチドはポリマー蛍光を強くクエンチングし、一方、非リン酸化のローダミン標識ペプチドを用いた場合には蛍光の変調はほとんど観察されないことが見出された。
【００５３】
図３は、ローダミン標識ＰＴＰ−１Ｂホスホペプチド基質に対して得られたＳｔｅｒｎ Ｖｏｌｍｅｒプロットを示す。Ｓｔｅｒｎ Ｖｏｌｍｅｒ定数（ＫSV）は、クエンチングの定量的尺度を提供する（Ｆ0はクエンチャーの不在下での蛍光強度であり、Ｆはクエンチャーの存在下での蛍光強度である。）本明細書で決定したＫSVは比較的大きい（すなわち、２×１０7Ｍ-1）。５０％のクエンチングは（ＰＲＵ／Ｑ）５０＝５０を与え、スーパークエンチングの発生を実証する。
【００５４】
上記に示すように、クエンチャー標識基質を用いてアッセイを開発した。基質のリン酸化で、ペプチドはリン酸基によりセンサーに会合し、蛍光をクエンチングする。金属イオン配位基はリン酸と特異的に結合するので、リン酸化セリン、スレオイニン又はチロシン残基を検出することができる。
【００５５】
セリン及びチロシン酵素（すなわちタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ））及びタンパク質チロシンホスファターゼ１−Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ）に対する蛍光のスーパークエンチングをベースとしたアッセイを、下記で説明する。
【００５６】
図４Ａは、ポリマークエンチングの増加が酵素濃度と相互に関連がある、ＰＫＡ酵素活性のエンドポイント測定を示す。Ｆｅ3+配位アッセイ（非常に低いｐＨを必要とする）とは違って、このプラットホームはほぼ生理学的ｐＨで有効であり、これによりリアルタイムアッセイ又はエンドポイントアッセイの実施において研究者による柔軟な選択を許容する。リアルタイムアッセイは（酵素反応ミックスの一部分として検出（ｄｅｔｅｃｔｏｒ）ミックスを含む）は、図４Ｂに示すように、５０％の基質リン酸化に対してエンドポイントアッセイよりも約１０倍高い濃度の酵素を必要とする。
【００５７】
アッセイの感度を、ＰＫＡ活性の既知の阻害剤であるＳｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅを用いて試験した。結果を図５に示す。図５に示すように、６.５μＭのＡＴＰ及び２００ｍＵのＰＫＡを用いた反応において１μＭの基質を使用して得たＩＣ50は５９ｍＵであり、公開された値（１８.４ｍＵ）と一致する。
【００５８】
この形態（ｆｏｒｍａｔ）を、ＰＫＡに対して使用したものとは異なる長さ及び配列組成のペプチド基質上でタンパク質チロシンホスファターゼ活性１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ）の検出に対して試験した。図６は、１２５ｎＭの基質上でのＰＴＰ−１Ｂを用いたエンドポイントアッセイとして又はリアルタイムにおいて測定した酵素濃度曲線のＥＣ50及びＬＯＤの結果を示す。既知の阻害剤であるＲＫ−６８２を用いた阻害剤曲線は、２６.４ｎＭの優れたＩＣ50をもたらした。
【００５９】
このアッセイで与えることのできる統計パラメーターは、ホスホペプチドキャリブレータペプチドの既知の量を８回繰り返して評価することにより決定した（図６）。このデータは優れており、このアッセイがそれぞれ０.８及び０.９のＺ'因子でわずか５〜１０％の基質転換を決定するのに適していることを示している。
【００６０】
このＰＫＡアッセイの性能は、商業的に入手可能なＦＲＥＴアッセイ（ＡＴＰ消費アッセイ及びＩＭＡＣベースのアッセイ）と比較されてきた。酵素濃度曲線において最適の性能を生み出すように、そして可能であれば同一のペプチドを用いて、全てのアッセイを実施した。ＩＭＡＣベースのアッセイは、酵素濃度曲線において最も低い感度を与えた（２０ｐｇに比較して１ｎｇ）。このアッセイにおいては（原理上は、ＱＴＬ Ｌｉｇｈｔｓｐｅｅｄ（登録商標）アッセイに最も近い）、現在の形態における１：５０の比率とは対照的に、センサー対検出器は１：１の比率となる。これらの結果は、スーパークエンチングで得ることのできる感度の増大を明確に実証している。
【００６１】
Ａｋｔ−１及びＰＫＣαに対する基質を用いて、追加のアッセイが開発された。これらの異なった基質を用いた場合、蛍光クエンチングの基質の長さ又はペプチド配列の内容への顕著な依存は観察されなかった。この点で、金属イオン介在性スーパークエンチングアッセイは一般的であると考えることができ、クエンチングがドナーとアクセプタの間の距離に高く依存するＦＲＥＴペプチドに対して大きな利点を与える。
【００６２】
プロテアーゼアッセイ
プロテアーゼ酵素は、それらの基質上のアミド結合を切断する。金属イオン−蛍光性ポリマーアンサンブルとともに、切断部位の両側にクエンチャー及びリン酸基を含むペプチド又はタンパク質基質の使用することにより、プロテアーゼ酵素活性の検出のための感度の高いアッセイの開発が可能となる。
【００６３】
プロテアーゼアッセイの１つの実施態様を図８に示す。図８に示すように、切断されていない（ｉｎｔａｃｔ）基質がセンサーに結合する場合、センサー蛍光はクエンチャー色素の接近（ｐｒｏｍｉｘｉｔｙ）によりクエンチングされる。酵素により基質を切断してフラグメントにすることで、リン酸基からクエンチャーを分離し、クエンチャー及びポリマーを分離させる。この分離は、酵素活性の存在下において、ポリマー蛍光のクエンチングを減少させる（すなわち、センサーからのシグナルを増大させる）。
【００６４】
プロテアーゼ活性は、同種（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）又は異種（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）の形態において、リアルタイム又はエンドポイントのいずれかで測定することができる。同種のリアルタイムアッセイにおいては、基質はポリマー−マイクロスフィアアンサンブルの表面上に存在することができる。同種のエンドポイントアッセイにおいては、基質及び酵素は溶液中で反応することができ、そして特定のインキュベーション期間の最後に、反応を止めるためにサンプルにセンサーを添加することができる。クエンチャーとして蛍光色素を用いる場合、プロテアーゼ活性はレシオメトリックに測定することができる。異種のエンドポイント形態においては、切断部位の同じ側にリン酸基とクエンチャーを含むビオチン化基質を用いることができる。切断後に、ビオチン種の結合によりペプチド種は分離し、一方、クエンチャー標識部分は移動して蛍光剤をクエンチングすることができる。
【００６５】
実施例２−金属イオン介在性蛍光スーパークエンチングをベースとしたプロテアーゼアッセイ
このアッセイにおいてトリプシンに対するペプチド基質は、
ローダミン−ＬＲＲＡｐＳＬＧ （配列番号：１）
である。
【００６６】
トリプシンは２つのアルギニンの箇所でペプチドを切断する。この実施例において実施されるアッセイは、下記のパラメーターを用いた：
マイクロスフィア−蛍光剤−ガリウムアンサンブル（ＱＴＬセンサー）；
３μＭ（終濃度） Ｒｈ−ＬＲＲＡｐＳＬＧ（配列番号：１）；
１Ｕ／μＬ トリプシン；
４０×１０6 マイクロスフィア（ＭＳ）／１５μＬ；
λex４３０；
λem４９０；及び
λco４７５ｎｍ。
【００６７】
このアッセイを、３８４−ウエルの白色プレートにおいて約２２℃で１時間実施した。このアッセイの結果を下記の表１に示した。
【表１】
【００６８】
図１２は、「リアルタイム」（すなわち、動態）アッセイ形態においてトリプシン活性を測定した結果を示すグラフである。図１２から分かるように、トリプシン活性の増大は時間−依存的である。これに対応して、蛍光シグナルの増大は時間とともに起こる。
【００６９】
非標識ペプチド及びタンパク質を用いたブロッキングアッセイ
上記及び図２に示すアッセイの基礎は、ブロッキングアッセイに適応することができる。ブロッキングアッセイにおいては、「一般的な」リン酸化色素標識ペプチド又は色素及び金属イオン結合性リン酸（例えば、ガリウム）の双方を含む他の基質は、付加的なリン酸化基質の不在下で、蛍光性ポリマー及び金属イオンを含むポリマービーズをクエンチングするが、ペプチド又はタンパク質基質がリン酸化される場合は「ブロック」される。
【００７０】
金属イオン介在性スーパークエンチングをベースとしたブロッキングキナーゼアッセイを図示する図９において、このアッセイの原理を示す。このアッセイは、酵素及び分析物の混合物にセンサーを添加し、その後インキュベートして反応させることにより、最も慣用的に実施される。任意のリン酸化分析物は、ポリマー蛍光をクエンチングせずに、図９で説明するようにセンサーと会合するだろう。「一般的な」リン酸化色素標識ペプチドの添加は、ポリマー蛍光のクエンチングをもたらすだろう（「ブロック」されたマイクロスフィア上における「遊離の」リン酸結合部位の程度により制限される）。このアッセイは蛍光「ターン−オン（ｔｕｒｎ−ｏｎ）」アッセイとして機能し、アッセイを展開する際に事前に基質を誘導体化する必要がないという付加的な利点を与える。図１０は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を用いたＰＫＣαに対するブロッキングアッセイ（「蛍光ターン−オン」）についての実験データを示す。
【００７１】
天然のタンパク質基質上でのキナーゼ活性の検出は、下記のペプチド基質を用いるよりもいくつかの利点を有する。
・５１８の既知のヒトキナーゼ（又は２５００のアイソフォーム）の中で、ほんの約５０のキナーゼに対するペプチド基質が立証されており、ほとんどの場合においては標的タンパク質が同定されている。いくつかの酵素は、効果的な基質認識、結合及びリン酸化に対して標的の非連続的な（ｎｏｎ−ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ）アミノ酸を必要とするかもしれない。この場合、たとえ関与するアミノ酸が同定されていても、人工のペプチド配列を構築することはできない。
・天然の標的タンパク質のリン酸化は、ペプチド基質のリン酸化よりも効率的であると予想される。これは、（ペプチド基質の）コストの意味において重要であり、またＨＴＳにおける阻害剤の同定をより正確なものともする。
・天然の標的タンパク質のリン酸化は、人工の基質のリン酸化よりもより特異的である。ペプチド基質の交差認識（ｃｒｏｓｓ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）により、細胞内キナーゼ活性を分析する将来的な試みが妨げられるだろうが、タンパク質基質については取り組むべきである。
・タンパク質のリン酸化の検出を可能にする現在の非放射性及び非抗体ベースのアッセイは、二次酵素であるルシフェラーゼによるＡＴＰ消費をベースとしている。このようなアッセイは、二次酵素であるルシフェラーゼの阻害の結果として、阻害剤スクリーンにおいて偽陰性を生じやすい。ＦＰアッセイは、シグナルを得るために分子運動における大きな変化を必要とするため、低分子量のタンパク質のみを検出することができる。
【００７２】
実施例３
標準的な反応において、キナーゼＰＫＣαによるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）のリン酸化を実施し、上記の実施例２に記載のＱＴＬセンサーを添加した。リン酸化ＭＢＰは、金属配位イオンへの特異的なリン酸結合によりＱＴＬセンサーに結合し、色素標識ホスホペプチド（トレーサー）の会合を濃度依存的な様式で阻害する。その結果生じる蛍光は、ｍｂｐのリン酸化の程度と相互に関連している。
【００７３】
この原理を下記の実施例において実証する。１μｇの濃度のｍｂｐを、連続的に希釈したキナーゼＰＫＣα酵素を用いて、白色の３８４ウエルＯｐｔｉｐｌａｔｅにおいて室温で１時間リン酸化した。インキュベーション後に、５０×１０6のＱＴＬセンサービーズを、約２２℃で１０分間添加し、その後１μＭの色素標識ペプチドトレーサーを添加した。プレートを約２２℃で３０分間インキュベートし、そして、Ｇｅｍｉｎｉ ＸＳプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ）において、４７５ｎｍカットオフフィルターを用いて、４５０ｎｍでの励起、４９０ｎｍでの放射にて、蛍光シグナルを測定した。蛍光「ターンオン」を、図９において図示する。
【００７４】
金属イオン介在性蛍光スーパークエンチングにより測定した、ホスホジエステラーゼ酵素活性
３'，５'−サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）は、メタロホスホヒドラーゼ（ｍｅｔａｌｌｏｐｈｏｓｐｈｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）のファミリーを含んで成る。メタロホスホヒドラーゼは、サイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）及び／又はサイクリックグアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）の３'結合を特異的に切断して、対応する５'−ヌクレオチドを生成する。ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰに対する様々な選択性を有するＰＤＥの１１のファミリーが、哺乳動物の組織において同定された。
【００７５】
ＰＤＥは、細胞内のｃＡＭＰ及び／又はｃＧＭＰレベルの必須のモジュレータ（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）である。サイクリック−ＡＭＰ又はｃＧＭＰは、重要な細胞プロセスに関与する細胞内シグナル伝達において重要な役割を果たす細胞内二次メッセンジャーである。ＰＤＥは、様々な疾患を処置するための創薬の標的であった。例えば、シデナフィル（ＰＤＥ５の選択的阻害剤）は、薬剤として商品化された（すなわち、Ｖｉａｇｒａ（登録商標）（Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃの登録商標））。いくつかのＰＤＥ４阻害剤は、喘息などの疾患を処置する抗炎症剤として臨床試験中である。
【００７６】
上記に説明するように、キナーゼ及びホスファターゼアッセイで実証されているようにＱＴＬセンサーはリン酸基に対して高い結合親和性を示す。ＰＤＥアッセイは、ホスホジエステラーゼの活性を試験するために、色素標識ｃＡＭＰ又はｃＧＭＰを基質として用いる。ローダミン、アゾ又はフルオロセイン（これらに限定されない）を含む色素は、ＰＤＥに対する反応性を阻害することなくｃＡＭＰ又はｃＧＭＰに結合することができる。ｃＡＭＰ又はｃＧＭＰはホスホジエステル（ガリウム−ポリマー表面に強く結合しない）として存在するので、ポリマー蛍光の初期のクエンチングはほとんど起こらない。ＰＤＥにより触媒される加水分解の間、これらの基質上のホスホジエステルはリン酸基に変換される。次に、ガリウム−リン酸の特異的相互作用により、色素はマイクロスフィア表面の周辺にもたらされ、ポリマー蛍光のクエンチングが生じる。図１１は、ホスホジエステラーゼアッセイを図示する。
【００７７】
核酸アッセイ
金属−リン酸介在性結合は、ＤＮＡ及びＲＮＡ検出用のスーパークエンチングアッセイを作り出すために用いることができる。溶液中に存在することのできる又は固形支持体上に固定化することのできる標的核酸種への核酸種のハイブリダイゼーションをベースとした、多くの異なったアプローチを用いることができる。第一のアプローチは、その末端がリン酸化されているオリゴヌクレオチドを用いる。リン酸は、ＤＮＡ鎖の接合蛍光性ポリマーとの、金属−リン酸により介在される同一場所への配置を可能にする。リン酸基がオリゴヌクレオチドの５'−末端に付着している場合、３'−末端にクエンチャーを有する相補的な標的はリン酸化鎖にハイブリダイズすることができる。これらの末端は、機能的システムを保持したまま逆にすることもできる。このハイブリダイズした構造においては、クエンチャーは接合ポリマーに配向して、スーパークエンチングを促進する。従って、クエンチャー標識標的の存在下では、ポリマー蛍光はクエンチングされる。このような系は、非標識及び標識ＤＮＡ鎖をそれらのリン酸化相補鎖への結合に対して競合させることにより、非標識ＤＮＡに対するアッセイとして容易に描写することができる。
【００７８】
第二のアプローチが、分子指標により用いられるアプローチに類似したストラテジーに続く。オリゴヌクレオチドの末端領域が互いに相補的であって、ハイブリダイズしたステムを形成し、同時に、オリゴヌクレオチドの中心領域が標的オリゴヌクレオチドに対して相補的であって、標的が存在しない場合に一本鎖のループを形成するように、その末端の一方にリン酸を有し、もう一方にクエンチャーを有するヘアピンオリゴヌクレオチドを設計することができる。このようなオリゴヌクレオチドは、リン酸とクエンチャーをステムハイブリダイゼーションにより接近させる「ヘアピン」構造を形成するだろう。リン酸化ヘアピンオリゴヌクレオチドが、リン酸と金属との相互作用により金属−ポリマー複合体に結合している場合、クエンチャーのポリマーへの配向によりクエンチングが誘導されるだろう。リン酸／クエンチャー官能基化オリゴヌクレオチドがヘアピンのループ領域に結合する標的にハイブリダイズする場合、ループ領域はステム領域の二次構造を分裂させるリジッドロッド（ｒｉｇｉｄ ｒｏｄ）になる。これは、アクセプタとドナーのペアを強制的に分離させ、それによりポリマーのクエンチングを減少させる。
【００７９】
タンパク質及び他の標的に対する直接的なアッセイは、ＤＮＡアプタマーの結合特性を用いて多くの経路により実施することもできる。リン酸化ＤＮＡアプタマーは、金属被覆共役ポリマー表面に結合することができる。標的分子（サイズの小さな分子、サイズではタンパク質まで）の存在下では、オリゴヌクレオチドのアプタマー構造は安定化されるはずである（より低いΔＧ）。選択された標的の不在下においては、アプタマー鎖は弱い自己構造（ｓｅｌｆ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を有することができる。アプタマーの自己構造がクエンチャーで標識された相補的オリゴヌクレオチドにより侵入され得る場合には、アッセイは生み出されることができる。このようなアッセイ（アプタマーの標的が不在である場合）においては、相補的オリゴヌクレオチド−クエンチャーはアプタマーにハイブリダイズすることができる。このハイブリッドは、上記にリストした形態のもの（すなわち、５'−末端にリン酸、３'−末端にクエンチャー；又はその逆）であることができ、これにより、クエンチャーは配向して接合ポリマーをクエンチングするだろう。アプタマーの標的の存在下では、アプタマーの自己構造は安定化し、オリゴヌクレオチドクエンチャーはアプタマーにハイブリダイズすることはできないだろう。従って、アプタマーの標的の存在下では、ポリマーは蛍光を発し、そしてアプタマーの標的の不在下では、蛍光はクエンチングされるだろう。
【００８０】
一般的なリン酸の修飾又は消費
任意の方法でクエンチャーにテザリングされたリン酸を含む任意の系においては、化学的手段によるリン酸の修飾はリン酸を別の官能基に変換することができ、これにより金属−ポリマー複合体へのリン酸−金属介在性結合を妨げる。同様に、リン酸の他の要素への結合は、その同一のリン酸の金属ポリマー複合体への結合を妨げることができる。これらの場合においては、クエンチャーは共役ポリマーと同じ場所に配置され、蛍光発光が起こるだろう。一般的な例として、複合体Ａ（任意の手段によりクエンチャーにテザリングされたリン酸を含む）は、金属ポリマー複合体をクエンチングすることができる。複合体Ａに対する親和性を有し且つ複合体Ａ中に含まれるリン酸を化学的に修飾するか又は結合する要素も含む分子Ｂとともに存在する場合には、複合体Ａは金属ポリマー複合体に結合することができず、それにより金属ポリマー複合体をクエンチングすることができない。
【００８１】
ビオチン−テザー（ｔｅｔｈｅｒ）（ＢＴ）コンジュゲートを用いたアッセイ、試薬及びキット
１つの実施態様によると、標的分析物に対するアッセイを実施するためのキットが提供される。キットは２つの別個の成分を含んで成る：クエンチャー（Ｑ）及びビオチン−テザーコンジュゲート（ＢＴ）。ＢＴコンジュゲートのテザー（Ｔ）は、例えばタンパク質又はポリペプチド基質を含んで成ることができる。この実施態様によると、テザーは標的分子との相互作用及び標的分子による修飾でクエンチャーと会合する能力を獲得し、修飾テザー（Ｔ'）を形成する。テザーの修飾後に、ＢＴコンジュゲートの標的分析物との相互作用、そしてその後の修飾ＢＴコンジュゲート（ＢＴ'）のクエンチャー（Ｑ）との会合の結果として、ＱＴ'Ｂバイオコンジュゲートが形成される。キットは蛍光剤成分（Ｐ）も含んで成ることができる。蛍光剤成分は、クエンチャーと蛍光剤が会合した場合にクエンチャーによる蛍光剤のスーパークエンチングの増幅が可能である様式において、会合した複数の蛍光種を含んで成る。蛍光剤は蛍光性ポリマーであることができる。蛍光剤は、マイクロスフィア、ビーズ又はナノ粒子などの固形支持体と会合することができる。ＱＴ'Ｂ複合体上のビオチン部分と固形支持体上のビオチン結合性タンパク質との相互作用が蛍光のクエンチングをもたらすように、固形支持体はビオチン結合性タンパク質も含んで成ることができる。
【００８２】
上記に説明するように、ＢＴコンジュゲートのテザーは認識されそして標的分析物への会合又は反応により修飾されて、ＢＴ'コンジュゲートを形成することができる。テザーの修飾は、修飾ＢＴコンジュゲート（ＢＴ'）がクエンチャー（Ｑ）に結合しＱＴ'Ｂ複合体を形成するのを可能にする。この一連の出来事は、ポリマー蛍光の変調へと続くことができる。特に、蛍光の変化は、サンプル中の標的分析物の存在及び／又は量を示すために用いることができる。更に、ＢＴコンジュゲートの酵素又は他の標的分析物との特定の会合又は反応がない場合は、蛍光ＰはＢＴコンジュゲートへの会合により影響を受けない。従って、サンプル中の標的分析物の存在及び／又は量を決定するための、上記のクエンチャー（Ｑ）及びビオチン−テザーコンジュゲート（ＢＴ）を使用する方法も提供する。
【００８３】
１つの実施態様によると、ＢＴコンジュゲートのテザー（Ｔ）の標的分析物との相互作用は、テザー上のクエンチャー結合成分の除去をもたらすことができる。この実施態様において、ＢＴコンジュゲートのクエンチャー（Ｑ）に結合する能力は、分析物との相互作用の結果として取り除かれ、修飾コンジュゲート（ＢＴ'）を形成する。さらに、この一連の出来事は、定量的にポリマー蛍光の変調へと続くことができる。いくつかの実施態様においては、ＢＴと標的分析物の反応は触媒的であることができ、ポリマー蛍光の変調の増大をもたらす。
【００８４】
更なる実施態様によると、ポリマースーパークエンチングは、金属イオンにより介在されることができる。この実施態様によると、ＱＴコンジュゲート（ここで、Ｑは電子又はエネルギー移動クエンチャーであり、Ｔは反応性テザーである）は、標的分析物と反応して、テザー上の官能基を導入し、修飾し又は除去することができる。官能基は、蛍光性ポリマーに会合した又は蛍光性ポリマーと同じ場所（例えば、固形支持体の表面上）に配置された金属イオンとの会合が可能な官能基であることができる。従って、修飾ＱＴコンジュゲート（ＱＴ'）は、蛍光性ポリマー及び金属イオンを含んで成るアンサンブルとの会合が可能である。その結果、テザーの修飾はポリマー蛍光における変化をもたらす。この方法は、標的分析物としてのキナーゼ、ホスファターゼ及び他の酵素に対する感度の高いアッセイにおいて用いることができる。
【００８５】
翻訳後修飾イベントのバイオディテクション（ｂｉｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）のための修飾可能なテザーをベースとしたＱＴＢアプローチ
このアプローチは、標的分析物との相互作用で修飾されてＢＴ'コンジュゲートを形成する、合成ビオチン化ペプチド基質又はテザー（以下、「ＢＴコンジュゲート」と呼ぶ）を用いる。１つの実施態様において、ＢＴコンジュゲートは非蛍光性クエンチャー（Ｑ）に複合することが不可能であり、一方、修飾コンジュゲート（ＢＴ'）は容易にクエンチャーに結合する。このタイプの相互作用は、基質転換の増加とともにポリマー蛍光が減少する蛍光「ターン−オフ」アッセイを導く。
【００８６】
別の実施態様においては、ＢＴコンジュゲートはダーク（ｄａｒｋ）クエンチャーと容易に会合することができる。しかし、ＢＴコンジュゲートは、標的分析物と相互作用をして修飾コンジュゲート（ＢＴ'）を形成した後は会合する能力を失う。このタイプの相互作用は、蛍光「ターン−オン」アッセイをもたらす。
【００８７】
更なる実施態様において、上記の実施態様におけるクエンチャーは、蛍光部分であることもできる。蛍光部分のクエンチャーとしての使用は、蛍光の感作された放射を提供することができる。全てのこれらの実施態様においては、ＱＴＢバイオコンジュゲートはポリマー−レセプターアンサンブルと複合体を形成して、スーパークエンチングプロセスにより効率的にポリマー蛍光を変調することができる。
【００８８】
翻訳後修飾相互作用のためのアッセイで使用されるクエンチャー部分は、基質上に修飾される官能基に会合する特性及び近傍に存在する場合に共役ポリマーの蛍光のスーパークエンチングを増大させる特性を兼ね備える。１つの実施態様において、クエンチャーは遷移金属又は鉄（ＩＩＩ）イミノ二酢酸（ＩＤＡ）型のキレートなどの有機金属種であることができる。第二鉄はホスホペプチドに強く会合することができ、そして電子移動により蛍光性ポリマーをスーパークエンチングすることができる。別の実施態様において、クエンチャーは２つの異なる部分から成ることができる（１つはクエンチャーの修飾官能基への会合を促進し、もう１つはエネルギー移動によりポリマークエンチングを引き起こす）。
【００８９】
センサーは、固形支持体上又は溶液中のいずれかのビオチン結合性タンパク質と同じ場所に配置された共役蛍光性ポリマーを含んで成ることができる。ポリマーは、非共役骨格上又はビーズ若しくはナノ粒子などの固形支持体の反対に荷電した表面上に集合した蛍光色素から構成される荷電ポリマー、中性のポリマー、又は「実質上の（ｖｉｒｔｕａｌ）」ポリマーであることができる。
【００９０】
キナーゼ及びホスファターゼ酵素のバイオディテクション及びバイオアッセイ（ｂｉｏａｓｓａｙ）のための修飾テザーをベースとした（ＱＴ'Ｂ）アプローチ
ＱＴ'Ｂ形態は、サンプル中のキナーゼ又はホスファターゼ酵素活性の検出及び定量のために使用することができる。例えば、このアッセイは、ＰＫＡなどの標的キナーゼ及びＰＴＰ−１Ｂなどのホスファターゼによるビオチン化ペプチド基質のリン酸化又は脱リン酸化のそれぞれを測定するために使用することができる。キナーゼ又はホスファターゼ活性の検出のためのＱＴ'Ｂ形態の使用を、図１３に示す。
【００９１】
ＱＴＬセンサーは、ビオチン結合性タンパク質と同じ場所に配置された（図１３に示すように固形支持体（例えば、マイクロスフィア）の表面上に被覆されるか、又は溶液中で複合体として存在するかのいずれか）、高い蛍光性の接合高分子電解質を含んで成ることができる。標的キナーゼ（例えば、ＰＫＡ）により特異的にリン酸化されること又は標的ホスファターゼ（例えば、ＰＴＰ−１Ｂ）により特異的に脱リン酸化されることが知られているビオチン化ペプチド又はタンパク質基質を、所望の時間の間適切な酵素とインキュベートすることができる。
【００９２】
図１３に示すように、非リン酸化ＢＴコンジュゲートをサンプル中に添加し、サンプルとともにインキュベートして、キナーゼ酵素活性を測定することができる。このコンジュゲートをサンプルとインキュベートした後の、ポリマーセンサー及びクエンチャーのサンプルへの添加は、ポリマー蛍光のクエンチングをもたらすことができる。蛍光の減少は、酵素活性の一次関数である。
【００９３】
図１４は、ＱＴ'Ｂアッセイを用いたタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）活性の測定を示すグラフである。図１４においては、蛍光（ＲＦＵ）をＰＫＡ濃度（ｍＵ／ウエル）の関数としてプロットする。図１４から分かるように、ＰＫＡ濃度の増加は蛍光の減少をもたらす。
【００９４】
図１５は、ホール（ｗｈｏｌｅ）のタンパク質基質（ヒストン１）を用いたタンパク質キナーゼＣ活性の検出を示すグラフである。図１５から分かるように、リン酸化ヒストン基質（１）と比較して非リン酸化ヒストン基質（２）は、低いレベルのポリマー蛍光が観察される。
【００９５】
図１３にも示すように、サンプル中のホスファターゼ酵素活性は、サンプルのリン酸化ＢＴコンジュゲートとのインキュベーションにより測定することができる。インキュベートしたサンプルへのポリマーセンサー及びクエンチャーの添加は、ＰＴＰ−１Ｂ活性に応じてポリマー蛍光の増加をもたらすことができる。
【００９６】
図１６は、ＱＴ'Ｂアッセイを用いたタンパク質チロシンホスファターゼ−１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ）活性の検出を示すグラフである。図１６においては、蛍光（ＲＦＵ）をＰＴＰ−１Ｂ濃度（ｍＵ／ウエル）の関数としてプロットする。図１６から分かるように、ＰＴＰ−１Ｂ濃度の増加は蛍光の増大をもたらす。
【００９７】
ＰＫＡキナーゼ活性の検出の場合には、Ｋｅｍｐｔｉｄｅペプチド基質を用いることができる。この基質は、Ｎ末端にビオチンを含み、そしてＰＫＡによりリン酸化されることのできるセリンを含む。
【００９８】
ＰＴＰ−１Ｂホスファターゼ活性の検出のために、Ｎ末端にビオチンを有するリン酸化基質を用いることができる。この基質は、ＰＴＰ−１Ｂとの相互作用で脱リン酸化を受けることができる。
【００９９】
クエンチングがドナーとアクセプターの間の等モル量のイベントであるＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）アッセイとは違って、上記のＱＴＬキナーゼ及びホスファターゼアッセイは、機能的に優れたプラットホームを用いる。このプラットホームは、良く確立されたリン酸−金属複合体相互作用と電子及びエネルギー移動クエンチャーによる共役ポリマースーパークエンチング現象とを組み合わせることで、蛍光シグナルの増大及び酵素活性の測定における感度の増強をもたらす。
【０１００】
金属イオン介在性ポリマースーパークエンチングをベースとしたバイオアッセイ
アニオン性共役ポリマーが金属カチオン及び有機カチオンと強く会合する（時おり、同時発生的にポリマー蛍光のクエンチングが起こる）ことが以前示された。［１、４］会合は、クーロン力及び疎水性相互作用の結果として起こる。以前の研究では、ポリマー及び対イオンの間の会合は、荷電した支持体（ポリスチレンマイクロスフィア、シリカ又は粘土など）又は別の荷電したポリマーとの事前の会合により制御又は調整できることも示された。［４−６］
【０１０１】
アニオン性ポリマー（図１Ａに示した例）は、ポリマー蛍光の変化をほとんど引き起こさないプロセスにおいて金属イオンと会合することができる。このアプローチの例として、最初に図１Ａに示す構造を有するポリマーをカチオン性ポリスチレンマイクロスフィア上に被覆し、次にＧａ3+で処理した。このプロセスを図１７に示す。図１７から分かるように、Ｇａ3+はそのポリマーと会合するが、その蛍光をクエンチングしない。固形支持体（例えば、ビーズ）、ポリマー及び金属イオン（例えば、Ｇａ3+）から成るアンサンブルは、以前実証された金属イオンの有機リン酸と会合する能力を利用する新たなセンサープラットホームを提供する。
【０１０２】
金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）は、リン酸化種の精製における一般的な技術である。Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｇａ（ＩＩＩ）、Ａｌ（ＩＩＩ）、Ｚｒ（ＩＶ）、Ｓｃ（ＩＩＩ）及びＬｕ（ＩＩＩ）（硬いルイス酸）などの金属イオンは、共有結合したイミノ二酢酸（ＩＤＡ）又はニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）又は他のリガンドとの会合により、アガロース、セファロースなどの樹脂ビーズの表面上に固体化することができる。次に、結合した金属イオンは、タンパク質又はペプチドなどのリン酸化種に結合することができる。タンパク質の単離におけるＩＭＡＣの適用に加えて、ＩＭＡＣ関連技術は、リン酸化後にリン酸金属複合体を形成する際の、蛍光標識基質の蛍光偏光における変化を測定することにより、タンパク質キナーゼ酵素用の検出形態として使用することができる。
【０１０３】
図１７に示すように、固形支持体会合Ｇａ3+は、キナーゼ酵素（又はホスファターゼ酵素による脱リン酸化）により生み出されるリン酸化基質と複合する能力を保持している。従って、固形支持体テザリングＧａ3+を、ＱＴＬアッセイ用の基礎を提供するのに用いることができる。示した例においては、金属イオン（例えば、Ｇａ3+）との会合によりポリマーの近傍にもたらされた際に、エネルギー又は電子移動クエンチングのいずれかにより蛍光性ポリマーの蛍光を減少させることのできるクエンチャーを用いて基質を機能化した。
【０１０４】
典型的な検出形態は、図１Ａに示す構造を有するアニオン性高分子電解質（以下、「ＰＰＥ」と呼ぶ）、０.５５μｍのカチオン性ポリスチレンマイクロスフィア、塩化ガリウム、及びローダミン標識リン酸化ペプチドを用いる。この検出形態を図１７で図示する。
【０１０５】
最初に、アニオン性ＰＰＥポリマーを、水中における沈着（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）により固形支持体（すなわち、０.５５μｍのカチオン性ポリスチレンマイクロスフィア）上に固定化した。次に、ポリマー被覆マイクロスフィアを、ｐＨ５.５の水溶液中において塩化ガリウムで処理した。次に、過剰のＧａ3+を洗い流した。
【０１０６】
酵素リン酸化反応（例えば、キナーゼ）、プロテアーゼ切断反応、又は１つのＤＮＡ／ＲＮＡ配列のいずれから作り出される、又は競合反応により作り出される色素標識リン酸化物質は、ガリウムポリマーセンサーと会合することができ、そしてポリマーからの蛍光を変調することができる。
【０１０７】
図１８は、ペプチド基質におけるリン酸化の程度の関数としてのガリウムポリマーセンサーの蛍光を示す。図１８においては、相対的な蛍光をリン酸化の程度（ホスホペプチド（％））の関数としてプロットする。
【０１０８】
図１９は、サンプル中のタンパク質キナーゼＡ酵素のレベルに対する、実際の動態アッセイを実証する。このアッセイでは、基質の酵素介在性リン酸化はガリウムポリマーセンサーの存在下で起こる。図１９では、相対的な蛍光をタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）濃度（ｍＵ／Ｒｘ）の関数としてプロットする。
【０１０９】
蛍光変化は、様々な形態で測定することができる。一般的なアッセイは、動態及びエンドポイントアッセイの双方として、様々な基質に対する酵素介在性反応を測定するのに用いることができる。
【０１１０】
創薬のための阻害剤スクリーニングへのＱＴ'Ｂ検出アプローチの適用
キナーゼ及びホスファターゼ酵素活性に対するアッセイにおける、電子又はエネルギー移動クエンチャーの存在下でスーパークエンチングを示す共役ポリマーの使用は、薬理学的に適切な酵素及び他の生体分子の効果を緩和する薬剤に対する、大きな化合物ライブラリーのスクリーンに適用することができる。酵素活性の既知の阻害剤の添加は、酵素の基質との反応を妨害し、それにより、阻害剤不在下で見られるシグナル応答を違った風に変調するだろう。阻害剤の所望の濃度に対して見られるシグナル変調の程度は、阻害剤の強さの尺度である。
【０１１１】
ＱＴ'Ｂをベースとしたアッセイは、様々なウエル濃度のマイクロタイタープレートにおいて実施し、創薬プロセスを加速することができる。１つの実施態様において、化合物のライブラリーをキナーゼ又はホスファターゼアッセイにおいてスクリーンし、リン酸化又は脱リン酸化反応の阻害をそれぞれ捜すことができる。
【０１１２】
ビオチン化テザー（ＢＴ）並びにクエンチャー及びビオチン結合性タンパク質のコンジュゲートを用いた、アッセイ、試薬及びキット
上記に説明したように、蛍光性ポリマーと会合したＱＴＬバイオコンジュゲートを開発した。このＱＴＬバイオコンジュゲートは、溶液中における個々の分子又は支持体上の集合体のいずれかとしての、蛍光性高分子電解質の金属イオンと複合する自己組織化能力を利用する。このように複合した金属イオンは、クエンチャーを含んで成るバイオコンジュゲート上の配位基（例えば、リン酸基）と選択的に会合することができ、これによりタンパク質、小分子、ペプチド、プロテアーゼ及びオリゴヌクレオチドの選択的検出のための基礎を提供する。［１０−１１］
【０１１３】
上記のアプローチは、クエンチャーで標識したバイオコンジュゲートを用いる。しかし、バイオコンジュゲートは２段階のプロセスで集合させることもできる。２段階のプロセスでは、最初の段階でビオチン化基質を酵素学的に反応させ、２番目の段階でクエンチャーと結合（ｃｏｕｐｌｅ）したビオチン結合性タンパク質分子（例えば、ストレプトアビジン）を含む検出分子を添加する。センサーを添加すると、金属イオンへのリン酸の会合が起こり、クエンチングは結合したビオチン結合性タンパク質／クエンチャーコンジュゲートにより介在される。
【０１１４】
この「スナップ式」のアプローチは、ビオチン化基質をストレプトアビジンクエンチャーと事前に会合させること及び集合したバイオコンジュゲートを用いて直接的に酵素と反応させることによる１段階のアッセイにおいて使用することもできる。しかし、この１段階のスナップ式アッセイアプローチの使用は、アッセイスピード及び／又は感度を落としてしまうかもしれない。
【０１１５】
金属イオン介在性スーパークエンチング
ポリ（フェニレンエチニレン）（ＰＰＥ）ファミリーにおける共役ポリマーは、芳香環に付加される様々な官能基を用いて調製することができる。使用されてきたペンダントアニオン基の中に、スルホポリｐ−フェニレンエチニレン（ＰＰＥ−Ｄｉ−ＣＯＯＨ）共役ポリマーの分子構造を示す図１Ａにおいて図示されるものもある。このポリマーは、水中でカチオン性マイクロスフィアと会合して、安定なポリマー被覆を形成することができる。被覆マイクロスフィアは、強い蛍光を示す。ポリマー被覆マイクロスフィア上の全体の電荷は、ポリマー負荷の程度により、そしてポリマーの構造を変化させることにより調整することができる。
【０１１６】
ポリマー被覆マイクロスフィアは金属カチオンと会合することができ、そして金属カチオンの負荷はマイクロスフィア上のポリマーの負荷レベルに依存し得ることが見出されてきた。Ｆｅ3+及びＣｕ2+などのいくつかの金属イオンは、ポリマー蛍光をクエンチングすることができ、一方Ｇａ3+などの他のものはポリマー蛍光をクエンチングしない。金属イオンの不在下においてほとんど又は全くクエンチングが生じない条件下において、非クエンチング金属イオンはマイクロスフィア結合ポリマーの蛍光のスーパークエンチングを介在しない。Ｇａ3+の添加によりポリマー被覆マイクロスフィアが「荷電」された後において、懸濁物へのリン酸化ペプチドの添加はポリマー蛍光の顕著なクエンチングをもたらす。Ｇａ3+によるペプチド上のリン酸の会合がクエンチャーをポリマーの近傍にもたらし、蛍光クエンチングを介在することが示された。
【０１１７】
金属イオン荷電ポリマーによるリン酸化生体分子のポリマークエンチングは、下記の２段階のプロセスにおいて達成することができる。図２０は、酵素学的に反応させたビオチン化基質へのクエンチャーのその後の添加により達成される金属イオン介在性スーパークエンチング、及びキナーゼアッセイの実施例を図示する。図２０は、ストレプトアビジン−クエンチャーの後にＱＴＬセンサーを添加により検出される、標的酵素によるビオチンペプチド基質のリン酸化又は脱リン酸化を示す概略図である。ペプチド産物は、Ｇａ3+金属イオンへの特異的なリン酸結合によりポリマーの表面にもたらされる。その結果生じるポリマー蛍光のクエンチングは、リン酸化又は脱リン酸化と同時に起こる。
【０１１８】
金属イオン介在性スーパークエンチング−キナーゼ／ホスファターゼアッセイをベースとしたバイオアッセイ
タンパク質のリン酸化及び脱リン酸化は、細胞の代謝、成長、分化及び細胞増殖の調節を介在する。酵素機能の異常は、癌及び炎症などの疾患を引き起こし得る。５００超のキナーゼ及びホスファターゼは、細胞活性の調節に関与していると考えられており、薬物治療の有力な標的である。
【０１１９】
スーパークエンチングを用いて蛍光シグナルを増大することにより酵素活性の測定において強化された感度を示すアッセイが説明されている。［１０−１１］これらのアッセイで使用されるセンサープラットホームは、正に荷電したマイクロスフィア上での吸着により固定化された、修飾アニオン性高分子電解質誘導体を含んで成る。典型的な修飾アニオン性高分子電解質は、図１Ａに示すポリ（フェニレンエチニレン）（ＰＰＥ）の誘導体である。蛍光性ポリマースーパークエンチングは、図２０に示すようにキナーゼ／ホスファターゼ活性の検出に適用されてきた。２価又は３価金属イオンは溶液中でアニオン性共役ポリマーと強く会合することができ、修飾及び／又はポリマー蛍光のクエンチングをもたらす。ポリマー−マイクロスフィアアンサンブル上の全体の電荷は調整できるので、金属イオンが特定のリガンドと複合する能力を保持しながらポリマー蛍光を強くクエンチングせずにポリマーと会合することができるプラットホームを与えるように、アンサンブルを構築した。例えば、ＰＰＥ会合Ｇａ3+は、ペプチドがローダミンなどの色素を含む場合に金属イオン介在性ポリマースーパークエンチングが生じるように、リン酸化ペプチドと会合することもできることが見出された。ここで、ビオチン化ペプチド基質を検出するためのプラットホームの適用について説明する。
【０１２０】
例えば、シンチレーション近接（ＳＰＡ）又はストレプトアビジン膜支持体（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｕｐｐｏｒｔ）（ＳＡＭ）を用いる適用においては、洗浄段階は非結合性放射性ＡＴＰ又は非結合性抗ホスホ（ｐｈｏｓｐｈｏ）抗体を反応混合物から分離することを必要とされる。変換基質を保持するために、ビオチン化ペプチドが用いられ、様々なマトリクス上でストレプトアビジン又は他のビオチン結合性タンパク質により固定化されてきた。下記で説明するように、金属イオン介在性スーパークエンチングは、個々の基質又はビオチン−ペプチドライブラリーにおいてキナーゼの活性をスクリーンするのに使用することができる。このアプローチは、研究者が：
１）酵素突然変異体の基質特異性を試験すること；
２）リン酸化パターンを比較することにより、独自の（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）酵素の酵素純度を評価すること；
３）キナーゼに対する蛍光ターン−オンアッセイを提供する、強化された放射を測定すること；及び
４）それにより、ライブラリー中の可視の自己蛍光化合物のスクリーニングを改良するために、検出を赤色に移す適切な色素クエンチャーによる強化された放射を使用すること、
を可能にする。
【０１２１】
例として、ストレプトアビジン結合フルオレセインクエンチャーを、酵素学的に反応させたビオチン化ペプチド基質に添加することができる。このアプローチは、図２０において示す、感度が良くそして選択的なキナーゼ／ホスファターゼアッセイのための基礎を提供する。このアッセイは、洗浄段階又は複雑なサンプル調製を必要としない瞬時の「混ぜて読む」である。
【０１２２】
サンプル中におけるビオチン化ペプチド基質の酵素とのインキュベーション後に、クエンチャー及びビオチン結合性タンパク質（例えば、ストレプトアビジン）のコンジュゲートを添加し、インキュベートしたサンプルと会合させる（例えば、室温で１５分間）。
【０１２３】
下記の実施例４は、タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）に対する確固たるアッセイ、並びに１段階及び２段階アプローチの比較性能を示す。実施例４においては、キナーゼアッセイは蛍光「ターンオフ」アッセイとして機能する。クエンチャーがポリマー蛍光のクエンチングの結果として感作された蛍光を示すことできるので、このアッセイは測定される波長に依存してターンオン又はターンオフのいずれかとして使用することができる。更に、ポリマー及びクエンチャーの蛍光を同時に測定することは、感度の良いレシオメトリックアッセイを提供する。
【０１２４】
実施例４−タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）活性のためのアッセイ
酵素基質として及びホスホ−ペプチドキャリブレータとして使用されるペプチドを下記で説明する。１段階様式におけるＰＫＡ活性の検出用に、
ローダミン−ＬＲＲＡＳＬＧ 配列番号：２
及びキャリブレータペプチド
ローダミン−ＬＲＲＡ（ｐＳ）ＬＧ配列番号：１
が、Ａｎａｓｐｅｃにより合成された。
【０１２５】
２段階様式にけるＰＫＡ活性の検出用に、
ビオチン−ＬＲＲＡＳＬＧ 配列番号：５
及び
ビオチン−ＬＲＲＡ（ｐＳ）ＬＧ 配列番号：６
を、Ａｎａｓｐｅｃから購入した。組み換え体ＰＫＡをＰｒｏｍｅｇａから購入した。ストレプトアビジン結合蛍光剤をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅから得た。ポリスチレン官能基化ビーズをＩｎｔｅｒｆａｃｉａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓから得た。
【０１２６】
ＣＲＴで６０分間アッセイバッファー中において１μＭのペプチド（ローダミン−ペプチド又はビオチン−ペプチドのいずれか）を反応させることにより、１段階アプローチ対２段階アプローチの性能を決定した。２段階プロセスに対しては、５μＬのストレプトアビジン−フルオレセインを添加し、ＣＲＴで１５分間インキュベートした。最後に、検出器バッファー中の１５μＬのセンサーを添加した。４５０ｎｍでの励起、４７５ｎｍでのカットオフフィルター及び４９０ｎｍでの放射にて、ウエルスキャンモードで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＸＳプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ）を用いて、混合物の蛍光を測定した。
【０１２７】
図２１Ａ及び図２１Ｂに示すように、Ｎ末端にクエンチャーを有する合成基質、又はストレプトアビジン−フルオレセインコンジュゲートを添加したビオチン化基質のいずれかを用いて、アッセイを実施した。基質のリン酸化において、ペプチドはリン酸基によりセンサーに会合して蛍光をクエンチングする。
【０１２８】
図２１Ａ及び図２１Ｂは、２段階アプローチにおけるローダミン標識基質又はビオチン化基質を用いたＰＫＡに対する酵素濃度曲線を示すグラフである。このアッセイにおいて得られたＲＦＵを図２１Ａに示し、標準曲線からのバックカリキュレーション（ｂａｃｋｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ）後のリン酸化（％）を図２１Ｂに示す。図２１Ａ及び図２１Ｂにおいては、３８４ウエルの白色Ｏｐｔｉｐｌａｔｅにおいて室温で１時間、連続希釈したキナーゼＰＫＡ酵素を用いて、１μＭの濃度の基質をリン酸化した。インキュベーション後に、５ｐｍｏｌのストレプトアビジン−ローダミンコンジュゲートを添加し、約２２℃で１５分間インキュベートし、その後約１００×１０6のＱＴＬセンサービーズを添加し、そして約２２℃で１０分間インキュベートした。プレートを約２２℃で３０分間インキュベートし、Ｇｅｍｉｎｉ ＸＳプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ）で、４７５ｎｍでのカットオフフィルターを用いて、４５０ｎｍでの励起及び４９０ｎｍでの放射にて、蛍光シグナルを測定した。
【０１２９】
実施例５−ＰＫＡ、ＰＫＣα又はＰＴＰ−１Ｂに対する基質をスクリーニングするためのアッセイ
基質スクリーニングに対しては、１μＭのビオチン−ペプチドを、約２２℃で６０分間アッセイバッファー中において反応させた。コントロール反応は、酵素を含まなかった。その後、５μＬのストレプトアビジン−フルオロセインコンジュゲートを添加し、約２２℃で１５分間インキュベートした。最後に、検出器バッファー中の１５μＬのセンサーを添加した。４５０ｎｍでの励起、４７５ｎｍでのカットオフフィルター及び４９０ｎｍでの放射にて、ウエルスキャンモードで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＸＳプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ）を用いて、混合物の蛍光を測定した。
【０１３０】
図２２は、酵素ＰＴＰ−１Ｂ、ＰＫＣα及びＰＫＡを用いて、キナーゼ又はホスファターゼに対する７つの異なるビオチン化基質のスクリーニングを示す棒グラフである。酵素を用いて又は用いないで反応を行い、ＲＦＵにおける差異を計算しプロットした。図２２から分かるように、リン酸化依存性蛍光クエンチングは適切な基質を含む反応においてのみ検出され、非特異的基質を含む反応では検出されなかった。
【０１３１】
１つの実施態様によると、Ｓｔｅｒｎ−Ｖｏｌｍｅｒクエンチング定数により測定した増幅されたスーパークエンチングのクエンチング感度は、少なくとも５００である。更なる実施態様によると、Ｓｔｅｒｎ−Ｖｏｌｍｅｒクエンチング定数により測定した増幅されたスーパークエンチングのクエンチング感度は、少なくとも１０００、２０００、５０００、１００００、１０００００又は１×１０6である。
【０１３２】
典型的な蛍光剤としては、蛍光性ポリマーが挙げられる。典型的な蛍光性ポリマーとしては、例えばポリ（フェニレンビニレン）などの発光性共役物質が挙げられる。ポリ（フェニレンビニレン）としては、例えばポリ（ｐ−フェニレンビニレン）（ＰＰＶ）、ポリチオフェン、ポリフェニレン、ポリジアセチレン、ポリアセチレン、ポリ（ｐ−ナフタレンビニレン）、ポリ（２，５−ピリジルビニレン）及びそれらの誘導体である。それらの誘導体としては、例えばポリ（２，５−メトキシプロピルオキシスルホネートフェニレンビニレン）（ＭＰＳ−ＰＰＶ）、ポリ（２，５−メトキシブチルオキシスルホネートフェニレンビニレン）（ＭＢＳ−ＰＰＶ）などである。水溶解性に対しては、誘導体としてスルホン酸塩及びメチルアンモニウムなどの、１又は複数のペンダントイオン基を挙げることができる。典型的なペンダント基としては：
−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＯＳＯ3-（Ｍ+）
式中、ｎは整数（例えば、ｎ＝３又は４）、Ｍ+はカチオン（例えば、Ｎａ+又はＬｉ+）；
−（ＣＨ2）n−ＯＳＯ3-（Ｍ+）
式中、ｎは整数（例えば、ｎ＝３又は４）、Ｍ+はカチオン（例えば、Ｎａ+又はＬｉ+）；
−Ｏ−（ＣＨ2）n−Ｎ+（ＣＨ3）3（Ｘ-）
式中、ｎは整数（例えば、ｎ＝３又は４）、Ｘ-はアニオン（例えば、Ｃｌ-）；及び
−（ＣＨ2）n−Ｎ+（ＣＨ3）3（Ｘ-）
式中、ｎは整数（例えば、ｎ＝３又は４）、Ｘ-はアニオン（例えば、Ｃｌ-）、
が挙げられる。
【０１３３】
前述の明細書は本適用の原理を教示するが（説明を目的として提供される例とともに）、一方で、本開示を読むことで、開示の真の範囲から逸脱することなく形態及び細部において様々な変更が可能であるあることが、当業者により十分に理解されるだろう。
【０１３４】
【表２】
【０１３５】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１Ａ】図１Ａ及び図１Ｂは、金属イオン介在性蛍光スーパークエンチングアッセイにおいて使用することのできるポリマーの化学的構造を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ及び図１Ｂは、金属イオン介在性蛍光スーパークエンチングアッセイにおいて使用することのできるポリマーの化学的構造を示す。
【図２】図２は、金属イオン介在性蛍光スーパークエンチングをベースとした、酵素介在性リン酸化又は脱リン酸化活性のためのアッセイの概略図である。
【図３】図３は、ローダミン標識リン酸化ペプチドによるガリウムセンサーのクエンチングに対するＳｔｅｒｎ−Ｖｏｌｍｅｒプロットである。
【図４Ａ】図４Ａ及び図４Ｂは、タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）に対する、エンドポイント及び動態アッセイを示すグラフである。
【図４Ｂ】図４Ａ及び図４Ｂは、タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）に対する、エンドポイント及び動態アッセイを示すグラフである。
【図５】図５は、阻害剤の存在下でのタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）アッセイの応答を示すグラフである。
【図６】図６は、タンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＢ−１Ｂ）のホスファターゼアッセイに対するＥＣ50及び検出の限界を実証するグラフである。
【図７】図７は、タンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＢ−１Ｂ）活性の阻害を示すグラフである。
【図８】図８は、金属イオン介在性蛍光スーパークエンチングをベースとしたプロテアーゼアッセイの概略図である。
【図９】図９は、金属イオン介在性スーパークエンチングをベースとしたタンパク質及びペプチド基質を用いたブロッキングキナーゼアッセイの概略図である。
【図１０】図１０は、例としてＰＫＣαを用いた蛍光ターンオンブロッキングキナーゼアッセイを示すグラフである。
【図１１】図１１は、金属イオン介在性スーパークエンチングを用いたホスホジエステラーゼアッセイの概略図である。
【図１２】図１２は、リアルタイム又は動態アッセイ形態における、トリプシン活性の測定結果を示すグラフである。
【図１３】図１３は、１つの実施態様に従った、リン酸化ポリペプチドの検出を示す。
【図１４】図１４は、１つの実施態様に従った、ビオチン化ペプチド基質（ＢＴ）を用いたアッセイにおける、タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）濃度の関数とした相対的な蛍光を示すグラフである。
【図１５】図１５は、リン酸化及び非リン酸化ヒストンに応答した相対的な蛍光を示す図である。
【図１６】図１６は、更なる実施態様に従った、ビオチン化ペプチド基質（ＢＴ）を用いたアッセイにおける、タンパク質チロシンホスファターゼ−１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ）濃度の関数とした相対的な蛍光を示すグラフである。
【図１７】図１７は、クエンチャー−テザーコンジュゲート（ＱＴ）が金属イオン及び蛍光性ポリマーアンサンブルと会合し、蛍光性ポリマーのスーパークエンチングの増大をもたらすアッセイを示す。
【図１８】図１８は、金属イオン介在性スーパークエンチングアッセイに対するリン酸化ペプチドの較正曲線を示すグラフである。
【図１９】図１９は、金属イオン介在性スーパークエンチングアッセイから得られるタンパク質キナーゼＡの濃度曲線を示す。
【図２０】図２０は、キナーゼ反応への第二段階において添加されるストレプトアビジンクエンチング分子の会合による、金属イオン介在性蛍光スーパークエンチングをベースとしたキナーゼ酵素活性センサーに対する概略図である。
【図２１Ａ】図２１Ａ及び図２１Ｂは、ビオチン化基質及びクエンチャー（例えば、ローダミン）標識基質を用いた２段階アプローチを用いたＰＫＡに対するエンドポイントアッセイを比較したグラフである。ここで、図２１Ａは、ＰＫＡ濃度の関数としてのＲＦＵを示す。
【図２１Ｂ】図２１Ａ及び図２１Ｂは、ビオチン化基質及びクエンチャー（例えば、ローダミン）標識基質を用いた２段階アプローチを用いたＰＫＡに対するエンドポイントアッセイを比較したグラフである。ここで、図２１Ｂは、ＰＫＡ濃度の関数としてのリン酸化（％）を示す。
【図２２】図２２は、３つの異なる酵素（すなわち、ＰＴＰ−１Ｂ、ＰＫＣα及びＰＫＡ）を用いてそれぞれ反応させた、７つの異なるビオチン化ペプチド基質を用いたスクリーンの結果を示す棒グラフである。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００３年１２月１２日付けで出願された米国特許仮出願第６０／５２８,７９２号；２００４年３月８日付けで出願された米国特許仮出願第６０／５５０,７３３号；及び、２００４年８月２７日付けで出願された米国特許仮出願第６０／６０４,８１３号の利益を主張するものである。前述の各出願は、その全部が本明細書中で参考文献として組み込まれている。
【０００２】
本出願は、一般的に生体分子の検出のための試薬、キット及びアッセイに関し、特に、金属イオン結合及び蛍光性ポリマースーパークエンチングを組み合わせた生体分子の検出のための試薬、キット及びアッセイに関する。
【背景技術】
【０００３】
酵素免疫測定法（すなわち、ＥＬＩＳＡ）は、広範囲のタンパク質、抗体、細胞、ウイルスなどの存在及び生体活性を同定するための、最も広く用いられ且つ許容された技術である。ＥＬＩＳＡは、最初に分析対象である生体分子が表面に付着（ａｔｔａｃｈ）された抗体に結合する、多段階の「サンドイッチ（ｓａｎｄｗｉｃｈ）アッセイ」である。次に、二次抗体が生体分子に結合する。いくつかの場合においては、この二次抗体はその後増大反応を「展開する」触媒酵素に付着される。他の場合においては、この二次抗体は、３番目のタンパク質（例えば、アビジン又はストレプトアビジン）に結合するためにビオチン化される。このタンパク質は、比色変化を増大するための化学的カスケードを引き起こす酵素、又は蛍光タギングのための蛍光団のいずれかに付着される。
【０００４】
広範に使用されているにもかかわらず、ＥＬＩＳＡには多くの不都合な点がある。例えば、多段階の手順は試薬と展開時間の双方に渡って厳密な制御を要するため、時間がかかり、「偽陽性」になりやすい。更に、非特異的吸着試薬を除去するために慎重な洗浄が必要である。
【０００５】
蛍光共鳴エネルギー移動（即ち、ＦＲＥＴ）法は、ポリメラーゼ連鎖反応をベースとした（ＰＣＲ）遺伝子配列決定及び免疫測定法の双方に適用されている。ＦＲＥＴは分析対象である生体分子の同種（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）結合を用いて、オフ状態ではクエンチングされる色素の蛍光を活性化する。ＦＲＥＴ技術の典型的な例においては、蛍光色素は抗体に連結（ｌｉｎｋ）され（Ｆ−Ａｂ）、そしてこの２分子がクエンチャー（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）に連結している抗原（Ａｇ−Ｑ）に結合する。結合複合体（Ｆ−Ａｂ：Ａｇ−Ｑ）はエネルギー移動によりクエンチングされる（即ち、非蛍光）。Ｑにテザリングしていない同一の分析対象抗原（Ａｇ）の存在下では、Ａｇ−Ｑの２分子は相対濃度（［Ａｇ−Ｑ］／［Ａｇ］）により決定される平衡結合確率により定量的に置換される。これによりＦＲＥＴ法は、抗原が既に十分特定されている定量的アッセイに制限されており、抗原をＱに連結させる化学をそれぞれの新しい場合について解決しなければならない。
【０００６】
他のＦＲＥＴの基質及びアッセイは、米国特許第６,２９１,２０１号及び以下の文献に開示されている：Ａｎｎｅ，他，「Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｔｙｐｅ Ｂ Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ」（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９１，２５３−２６１（２００１））；Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，他，「Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｓｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ａｎｔｈｒａｃｉｓ Ｌｅｔｈａｌ Ｆａｃｔｏｒ Ｐｒｏｔｅａｓｅ」（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅ．９９，６６０３−６６０６（２００２））；Ｍｏｃｋ，他，「Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｒａｐｉｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ａｎｔｈｒａｃｉｓ Ｌｅｔｈａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｆａｃｔｏｒ」（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９，６５２７−６５２９（２００２））；Ｓｐｏｒｔｓｍａｎ他，（Ａｓｓａｙ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ., ２００４，２，２０５）；及びＲｏｄｅｍｓ他，（Ａｓｓａｙ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ., ２００２，１，９）。
【０００７】
分子内でクエンチングされる蛍光基質を用いた他のアッセイは、以下の文献に開示されている：Ｚｈｏｎｇ，他，「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｌｌｙ Ｑｕｅｎｃｈｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｏｒ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ Ｌｅａｄｅｒ Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ」（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５５，６６−７３（１９９８））；Ｒｏｓｓｅ，他，「Ｒａｐｉｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｆｏｒ Ｎｏｖｅｌ Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｙ」（Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ.，２，４６１−４６６（２０００）；及びＴｈｏｍｐｓｏｎ，他，「Ａ ＢＯＤＩＰＹ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｐａｉｎｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ」（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７９，１７０−１７８（２０００））。
【０００８】
蛍光分極の変化を測定し、分析物の量を定量するために使用するアッセイも開発されている。例えば、Ｌｅｖｉｎｅ，他，「Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ」（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４７，８３−８８（１９９７））を参照されたい。また、Ｓｃｈａｄｅ，他，「ＢＯＤＩＰＹ−α−Ｃａｓｅｉｎ，ａ ｐＨ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ａｓｓａｙｓ Ｕｓｉｎｇ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ」（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４３，１−７（１９９６））を参照されたい。
【０００９】
しかしながら、高い感度で、酵素及び核酸などの生物学的に関連のある分子を迅速且つ正確に検出して定量することが、なお必要とされている。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
１番目の実施態様によると：
ビオチン化ポリペプチド（ここで、ポリペプチドは１又は複数のリン酸基を含む）；及び
ポリペプチドのリン酸基と会合（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）する金属カチオン、
を含んで成る複合体が提供される。
【００１１】
２番目の実施態様によると、サンプル中のキナーゼ又はホスファターゼ酵素分析物の存在及び／又は量を検出する方法が提供される。
この実施態様に従った方法は：
ａ）サンプルを、ビオチン化ポリペプチドとインキュベートすること（ここで、キナーゼ酵素分析物の場合には、ポリペプチドは分析物によりリン酸化可能な１又は複数の基を含んで成り、又はホスファターゼ酵素分析物の場合には、ポリペプチドは分析物により脱リン酸化可能な１又は複数の基を含んで成る）；
ｂ）サンプルに金属カチオンを添加すること（ここで、金属カチオンはクエンチャーであるか、又はこの方法は金属カチオンと会合することができるクエンチャーをサンプルに添加することを更に含んで成る）
ｃ）クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、クエンチャーが蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように、互いに会合した複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、サンプルに添加すること（ここで、蛍光剤はビオチン結合性タンパク質と会合している）；及び
ｄ）蛍光を検出すること、
を含んで成り、
ここで、検出される蛍光は、サンプル中の分析物の存在及び／又は量を示す。
【００１２】
３番目の実施態様によると、キナーゼ又はホスファターゼ酵素活性の阻害剤としての化合物をスクリーニングする方法が提供される。この実施態様に従った方法は：
ａ）サンプル中で、ビオチン化ポリペプチドをこの化合物の存在下でキナーゼ又はホスファターゼ酵素とインキュベートすること（ここで、キナーゼ酵素アッセイの場合には、このポリペプチドは分析物によりリン酸化可能な１又は複数の基を含んで成り、且つ、ホスファターゼ酵素アッセイの場合には、このポリペプチド分析物により脱リン酸化可能な１又は複数の基を含んで成る）；
ｂ）サンプルに金属カチオンを添加すること（ここで、金属カチオンはクエンチャーであるか、又は該方法は金属カチオンと会合することができるクエンチャーをサンプルに添加することを更に含んで成る）
ｃ）クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、クエンチャーが蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように、互いに会合した複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、サンプルに添加すること（ここで、蛍光剤はビオチン結合性タンパク質と会合している）；及び
ｄ）化合物の存在下でサンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成り、
ここで、化合物の存在下で検出される蛍光の量は、キナーゼ又はホスファターゼ酵素活性における化合物の阻害効果を示す。
【００１３】
４番目の実施態様によると：
１又は複数のリン酸化可能な又は脱リン酸化可能な基を含んで成るポリペプチド；及び
ポリペプチドに接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）するクエンチング部分、
を含んで成るバイオコンジュゲート（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）が提供される。クエンチング部分は、ローダミン又は類似のスペクトル特性を有する別の色素であることができる。
【００１４】
５番目の実施態様によると、上記のバイオコンジュゲートは、１又は複数のリン酸基及び切断部位を更に含んで成ることができる（ここで、クエンチング部分及びリン酸基は切断部位の反対側に存在する）。好ましくは、クエンチング部分が接合する切断部位の側には、リン酸基は存在しない。
【００１５】
６番目の実施態様によると：
ａ）サンプルを、上記の切断部位及び１又は複数のリン酸基を含んで成るバイオコンジュゲートとインキュベートすること（ここで、プロテアーゼ酵素は切断部位でポリペプチドを切断する）；
ｂ）クエンチング部分が蛍光剤と会合する際に、クエンチング部分が蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合する複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、サンプルに添加すること（ここで、蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンが蛍光剤のアニオン基と会合している）；及び
ｃ）サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成る、サンプル中のプロテアーゼ酵素の存在及び／又は量を検出する方法が提供され、
ここで、検出される蛍光は、サンプル中のプロテアーゼ酵素の存在及び／又は量を示す。
【００１６】
７番目の実施態様によると：
上記のバイオコンジュゲートを含んで成る第一の成分；及び
蛍光剤を含んで成る第二の成分（該蛍光剤は、クエンチング部分が蛍光剤と会合する際に、バイオコンジュゲートのクエンチング部分が蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合する複数の蛍光種を含んで成る（ここで、蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは蛍光剤のアニオン基と会合している））
を含んで成る、サンプル中のキナーゼ又はプロテアーゼ酵素分析物の存在及び／又は量を検出するためのキットが提供される。
【００１７】
８番目の実施態様によると：
ａ）サンプルを、上記のバイオコンジュゲートとインキュベートすること（ここで、バイオコンジュゲートのポリペプチドは、酵素分析物によりリン酸化可能な又は脱リン酸化可能な基を含んで成る）；
ｂ）クエンチング部分が蛍光剤と会合する際に、クエンチング部分が蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合する複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、サンプルに添加すること（ここで、蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは蛍光剤のアニオン基と会合している）；及び
ｃ）サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成る、サンプル中の酵素分析物の存在及び／又は量を検出する方法が提供され、
ここで、検出される蛍光は、サンプル中の分析物の存在及び／又は量を示す。
【００１８】
９番目の実施態様によると：
クエンチャーを含んで成る第一の成分；及び
ビオチン化ポリペプチドを含んで成る第二の成分（ここで、ポリペプチドは分析物により修飾されることができ、且つ分析物により修飾されたポリペプチドはクエンチャーと会合している）
を含んで成る、サンプル中の分析物の存在を検出するためのキットが提供される。
【００１９】
１０番目の実施態様によると：
ａ）サンプルを、サイクリックＡＭＰ又はサイクリックＧＭＰと接合したクエンチャーを含んで成るバイオコンジュゲートとインキュベートすること；
ｂ）クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、クエンチャーが蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合する複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、サンプルに添加すること（ここで、蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは蛍光剤のアニオン基と会合している）；及び
ｃ）サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成る、サンプル中のホスホジエステラーゼ酵素の存在及び／又は量を検出する方法が提供され、
ここで、検出される蛍光の量は、サンプル中のホスホジエステラーゼ酵素の存在及び／又は量を示す。
【００２０】
１１番目の実施態様によると：
ａ）１又は複数のリン酸化可能な基を含んで成るポリペプチド基質及びクエンチャー標識ポリペプチドを、キナーゼ酵素を含んで成るサンプルとインキュベートすること；
ｂ）クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、クエンチャーが蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合する複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、サンプルに添加すること（ここで、蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは蛍光剤のアニオン基と会合している）；及び
ｃ）サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成る、ポリペプチド基質のキナーゼ酵素活性を検出する方法が提供され、
ここで、ポリペプチド基質のリン酸化は、蛍光の増加をもたらし；且つ
ここで、検出される蛍光の量は、ポリペプチド基質のキナーゼ酵素活性の存在及び／又は量を示す。
【００２１】
１２番目の実施態様によると：
ａ）ポリヌクレオチドの第一末端領域にポリペプチドに接合したクエンチャーを、且つポリヌクレオチドの第二末端領域にリン酸基を含んで成るポリヌクレオチドとともに、サンプルをインキュベートすること（ここで、ポリヌクレオチドの第一及び第二末端領域の少なくとも１つの部分が互いにハイブリダイズしてヘアピン構造を形成することができ、且つ末端領域の間のポリヌクレオチドの中心領域が、核酸分析物にハイブリダイズすることのできる核酸配列を含んで成り、それによりヘアピン構造を崩壊させて、ポリヌクレオチドのクエンチャーとリン酸基の分離をもたらす）；
ｂ）クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、クエンチャーが蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合する複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、サンプルに添加すること（ここで、蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは蛍光剤のアニオン基と会合している）；及び
ｃ）サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成る、サンプル中の核酸分析物の存在及び／又は量を検出する方法が提供され、
ここで、検出される蛍光は、サンプル中の核酸分析物の存在及び／又は量を示す。
【００２２】
１３番目の実施態様によると：
ａ）サンプル中の核酸をクエンチャーで標識すること；
ｂ）サンプルを、ポリヌクレオチドの第一末端領域にリン酸基を含んで成るポリヌクレオチドとインキュベートすること（ここで、ポリヌクレオチドは、核酸分析物にハイブリダイズすることのできる核酸配列を含んで成る）；
ｃ）クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、クエンチャーが蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合する複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、サンプルに添加すること（ここで、蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは蛍光剤のアニオン基と会合している）；及び
ｄ）サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成る、サンプル中の核酸分析物の存在及び／又は量を検出する方法が提供され、
ここで、核酸分析物のポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションが、蛍光の減少をもたらし；且つ
ここで、蛍光の減少は、サンプル中の核酸分析物の存在及び／又は量を示す。
【００２３】
１４番目の実施態様によると：
ａ）末端領域にリン酸基を含んで成る第一のポリヌクレオチド、及び末端領域において第二のポリヌクレオチドに接合したクエンチャーを含んで成る第二のポリヌクレオチドとともに、サンプルをインキュベートすること（ここで、第二のポリヌクレオチド及び核酸分析物は、第一のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる）；
ｂ）クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、クエンチャーが蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合する複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、サンプルに添加すること（ここで、蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは蛍光剤のアニオン基と会合している）；及び
ｃ）サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成る、サンプル中の核酸分析物の存在及び／又は量を検出する方法が提供され、
ここで、核酸分析物の第一のポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションは、蛍光の増大をもたらし；且つ
ここで、検出される蛍光の量は、サンプル中の核酸分析物の存在及び／又は量を示す。
【００２４】
１５番目の実施態様によると：
ａ）末端領域にリン酸基を含んで成る核酸アプタマー（ここで、核酸アプタマーはポリペプチド分析物に結合することができる）、及びクエンチャーを含んで成るポリヌクレオチド（ここで、ポリヌクレオチドは核酸アプタマーにハイブリダイズすることができる）とともに、サンプルをインキュベートすること；
ｂ）クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、クエンチャーが蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合する複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、サンプルに添加すること（ここで、蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは蛍光剤のアニオン基と会合している）；及び
ｃ）サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成る、サンプル中のポリペプチド分析物の存在及び／又は量を検出する方法が提供され、
ここで、ポリペプチド分析物の核酸アプタマーへの結合は、蛍光の増大をもたらし；且つ
ここで、検出される蛍光の量は、サンプル中のポリペプチド分析物の存在及び／又は量を示す。
【００２５】
１６番目の実施態様によると：
ビオチン部分を含んで成るポリペプチド（ここで、ポリペプチドの１又は複数のアミノ酸残基は、リン酸化又は脱リン酸化が可能である）；及び
クエンチング部分に接合したビオチン結合性タンパク質、
を含んで成る複合体が提供され、
ここで、ポリペプチドのビオチン部分は、タンパク質−タンパク質相互作用によってビオチン結合性タンパク質と会合し；且つ
ここで、クエンチング部分は、蛍光剤と会合する際に蛍光剤のスーパークエンチングを増大することが可能である。
【００２６】
１７番目の実施態様によると：
ａ）上記の複合体（ここで、キナーゼ酵素分析物の場合には、ポリペプチドは分析物によりリン酸化可能な１又は複数の基を含んで成り、ホスファターゼ酵素分析物の場合には、ポリペプチドは分析物により脱リン酸化可能な１又は複数の基を含んで成る）とともに、サンプルをインキュベートすること；
ｂ）クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、クエンチャーが蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合する複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、サンプルに添加すること（ここで、蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは蛍光剤のアニオン基と会合している）；及び
ｃ）サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成る、サンプル中のキナーゼ又はホスファターゼ酵素分析物の存在及び／又は量を検出する方法が提供され、
ここで、検出される蛍光の量は、サンプル中の分析物の存在及び／又は量を示す。
【００２７】
１８番目の実施態様によると：
ａ）キナーゼ酵素分析物のアッセイの場合には、分析物によりリン酸化可能な１又は複数の基を含んで成るビオチン化ポリペプチド、或いは、ホスファターゼ酵素分析物のアッセイの場合には、分析物により脱リン酸化可能な１又は複数の基を含んで成るビオチン化ポリペプチドのいずれかとともに、サンプルをインキュベートすること；
ｂ）クエンチング部分に接合したビオチン結合性タンパク質を、インキュベートしたサンプルに添加すること；
ｃ）クエンチング部分が蛍光剤と会合する際に、クエンチング部分が蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合する複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、サンプルに添加すること（ここで、蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは蛍光剤のアニオン基と会合している）；及び
ｄ）サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成る、サンプル中のキナーゼ又はホスファターゼ酵素分析物の存在及び／又は量を検出する方法が提供され、
ここで、検出される蛍光は、サンプル中の分析物の存在及び／又は量を示す。
【００２８】
発明の詳細な説明
バイオセンシング（ｂｉｏｓｅｎｓｉｎｇ）に対するクエンチャー−テザリング−リガンド（ＱＴＬ）アプローチは、電子及びエネルギー移動クエンチャーによる蛍光性高分子電解質のスーパークエンチングを利用する。ＱＴＬアッセイのプラットホームは、接合したポリマーの集光能力とそれらの高く非局在化された励起状態を利用して、非常に少量の電子及びエネルギー移動種の存在に反応した増大された蛍光シグナルの変調を提供する。この新規の技術は、シグナル変調現象と抗原−レセプター、基質−酵素及びオリゴヌクレオチド−オリゴヌクレオチド結合の相互作用とを会合させることにより、タンパク質、小分子、ペプチド、プロテアーゼ及びオリゴヌクレオチドの感度の高い検出に適用されてきた。［１−９］
【００２９】
１つのアプローチにおいて、蛍光性ポリマー（Ｐ）は、溶液中又は固形支持体上のいずれかにおいてビオチン結合性タンパク質とともに配置され、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質相互作用により、クエンチャー−テザリング−ビオチン（ＱＴＢ）バイオコンジュゲートと会合複合体を形成する。ＱＴＢコンジュゲートは、ビオチンへの反応性テザリングにより連結したクエンチャーＱを含む。ビオチンは、ポリマー（Ｐ）とともに配置されたビオチン結合性タンパク質と強く結合する。ＱＴＢバイオコンジュゲートの標的分析物との反応は、容易に検出可能な方法においてポリマー蛍光を変える。
【００３０】
本明細書中で説明するように、ＱＴＬバイオコンジュゲートと蛍光性ポリマーとを会合させる代替方法が開発されてきた。代替方法は、溶液中における個々の分子又は支持体上の集合体（ａｓｓｅｍｂｌｙ）のいずれかとしての、蛍光性高分子電解質の金属イオンと複合する自己組織化能力を利用する。このようにして複合した金属イオンは、ＱＴＬバイオコンジュゲート中に組み込まれた配位基（例えば、リン酸基）に選択的に会合することができ、それにより、例えばタンパク質、小分子、ペプチド、プロテアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ及びオリゴヌクレオチドの選択的検出のための基礎を提供する。［１０−１１］
【００３１】
アクセプタ分子（すなわち、クエンチャー）がドナー分子の効力をクエンチングすることのできる効力は、２つの実在物を隔てる距離に依存する。構成的（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ）アッセイにおいては、分子のテザリング（アクセプタとドナーを一緒にする）は、共有結合及びビオチン−アビジン相互作用などの一般的なストラテジーにより達成されることができる。共有結合はクエンチャーを直接アクセプタ上に配置し、それらを１つの分子にするので、共有結合は共鳴エネルギー移動に対して優れたアプローチである。従って、その２つの間の距離は、単結合と同じくらいの短さであることができる。一方、ほとんどどの分子もビオチンに共有結合することができるため、ビオチンとアビジンなどのビオチン結合性タンパク質（ＢＢＰ）の間の相互作用は、広範な汎用性を提供する。しかし、ビオチン結合性タンパク質は一般的に６０キロダルトンより大きく、その結果として、ビオチン−ＢＢＰ相互作用によりアクセプタとドナーが一緒にされる場合に、アクセプタとドナーの間の距離が大きくなり得る。
【００３２】
ビオチン−ＢＢＰ相互作用に対する一般的な置き換えとして、スーパークエンチングアッセイにおけるアクセプタ及びドナーの同じ場所への配置に対しては、金属イオンリン酸相互作用を提案する。多くの分子はリン酸化されることができるので、ビオチン−ＢＢＰ相互作用と同様に、このストラテジーは一般的に適用可能である。さらに、そのテザリングの両端距離（すなわち、金属イオンとリン酸との間の配位距離）は著しく短いので、このストラテジーはビオチン−アビジン相互作用に対する一般的な改良である。リン酸基などのリガンドに対する金属イオンの親和性は、ビオチン−ＢＢＰ相互作用の親和性より著しく低い（Ｋａ＝１０5-7に対して対Ｋａ＝１０13-15）。
【００３３】
１つの実施態様によると、溶液中で個々の分子又は金属イオンに複合した支持体上の集合体のいずれかとして、蛍光性高分子電解質を含んで成る新規のセンサーが提供される。センサーの金属イオンは更に、ＱＴＬバイオコンジュゲート中に組み込まれたリガンド（例えば、リン酸基）に選択的に会合することができ、そしてエンドポイント様式及び動態（ｋｉｎｅｔｉｃ）様式を含む（これらに限定されない）、上記と同様の分子（例えば、タンパク質、小分子、ペプチド、プロテアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ及びオリゴヌクレオチド）の選択的な検出に対する基礎を提供することができる。下記で説明するように、いくつかのアッセイに対して、配位基−金属イオン結合はビオチン−ビオチン結合性タンパク質会合に対する代替手段を提供する。他の実施例において、配位基をＱＴＬのクエンチャー部分に会合するか又はＱＴＬのクエンチャー部分から取り除いて、センサー蛍光をクエンチングし、又はセンサー蛍光を回復させる（又はその双方）。
【００３４】
本明細書中に記載の様々な実施態様は、蛍光性ポリマー−ＱＴＬスーパークエンチング及び金属イオン−リン酸リガンド特異的結合を用いて、キナーゼ、ホスファターゼ及びプロテアーゼ活性に対する改良されたアッセイを提供する。蛍光性ポリマーの金属イオン介在性スーパークエンチングは、ペプチド及びタンパク質基質を用いるキナーゼ、ホスファターゼ及びプロテアーゼ酵素活性の測定に対する一般的なプラットホームを提供し、そしてＤＮＡハイブリダイゼーションをベースとしたアッセイ並びにアプタマー、抗体及び他のリガンドを用いるタンパク質のアッセイを実施するためのより一般的なアプローチを提供する。
【００３５】
ポリ（フェニレンエチニレン）（ＰＰＥ）ファミリー中の共役ポリマーは、芳香環に付加される様々な官能基を用いて調製することができる。ペンダントアニオン基を用いて合成されたポリマーの中には、図１Ａ及び図１Ｂに示すものがある。図１Ａは、スルホポリｐ−フェニレンエチニレン（ＰＰＥ−Ｄｉ−ＣＯＯＨ）共役ポリマーの分子構造を示す。図１Ｂは、スフホポリｐ−フェニレンエチニレン（ＰＰＥ）共役ポリマーの分子構造を示す。これらのポリマーの双方は、水中でカチオン性マイクロスフィアと会合して、安定なポリマー被覆を形成することができる。ポリマー被覆マイクロスフィアは、強い蛍光を示す。ポリマー被覆マイクロスフィア上の全体の電荷は、ポリマー負荷の程度を変化させること及びポリマーの構造を変化させることにより調整することができる。
【００３６】
蛍光性ポリマー被覆マイクロスフィアは金属カチオンと会合することができ、そして金属カチオンの負荷はマイクロスフィア上のポリマーの負荷レベルに依存し得ることが見出された。Ｆｅ3+及びＣｕ2+などのいくつかの金属イオンは、ポリマー蛍光をクエンチングすることができ、一方Ｇａ3+などの他のものはポリマー蛍光をクエンチングしない。いくつかの実施態様において、金属イオンの不在下ではほとんど又は全くクエンチングが生じない条件下で、マイクロスフィア結合ポリマーの蛍光のスーパークエンチングを介在するためにＧａ3+が用いられる。
【００３７】
例えば、色素を含有するリン酸化ペプチド：
ローダミン−ＬＲＲＡ（ｐＳ）ＬＧ 配列番号：１
［式中、ｐＳはリン酸化セリン（ポリマーに対して優れたエネルギー移動クエンチャーとして働くはずである）を指す］は、ポリマー被覆マイクロスフィアの蛍光をほとんど又は全くクエンチングしないことが見出された。しかし、ポリマー被覆マイクロスフィアをＧａ3+の添加により「荷電」させた後では、懸濁物への同一のペプチドの添加はポリマー蛍光の顕著なクエンチングをもたらす。対照的に：
ローダミン−ＬＲＲＡＳＬＧ 配列番号：２
で表されるペプチドなどの、リン酸化残基のみ又はクエンチャー色素のみを含有するペプチドは、同一の条件下でポリマー蛍光にほとんど影響を与えない。リン酸化生体分子の金属で荷電したポリマーとの特異的な会合は、下記で説明するように多くのアッセイの基礎となり得る。
【００３８】
図２は、キナーゼ又はホスファターゼ活性のアッセイにおいて用いることのできる、金属イオン介在性スーパークエンチングをベースとしたセンサーを図示する。図２は、標的酵素によるローダミンペプチド基質のリン酸化又は脱リン酸化を、ＱＴＬセンサーの添加により検出する方法を示す。ペプチド産物をローダミンクエンチャーで標識し、Ｇａ3+金属イオンへの特異的なリン酸結合によりポリマー表面に移動させる。その結果生じるポリマー蛍光のクエンチングは、ポリペプチド基質のリン酸化又は脱リン酸化と同時に起こる。このタイプのアッセイは、ペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物及びヌクレオチド又は小分子（これらに限定されない）を含む生体基質に対するリン酸化又は脱リン酸化を和らげる（ｍｏｄｅｒａｔｅ）酵素に対して用いることができる。
【００３９】
キナーゼ／ホスファターゼアッセイ
タンパク質のリン酸化及び脱リン酸化は、細胞の代謝、成長、分化及び細胞増殖の調節を介在する。酵素機能における異常は、癌及び炎症などの疾患を引き起こし得る。５００超のキナーゼ及びホスファターゼは、細胞活性の調節に関与していると考えられており、それらの多くは薬物治療の標的である。
【００４０】
タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）は、ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼであり、ホルモン及び神経伝達などの、多くのｃＡＭＰ上昇性の最初のメッセンジャーのエフェクターとして機能する。ＰＫＡの遍在的な分布及びその柔軟な基質認識特性は、リンパ球細胞増殖及び免疫応答の阻害、海馬における長期抑制の介在並びに感覚神経伝達などにおける生きた細胞の多くのプロセスにおいて、ＰＫＡを中心的な要素とする。タンパク質チロシンホスファターゼ−１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ）は、インスリンシグナル伝達経路の負の調節因子であることが最近示され、これはＰＴＰ−１Ｂに対する阻害剤が２型糖尿病の処置において有益であるかもしれないことを示唆している。
【００４１】
キナーゼのうち、９０％はセリン残基をリン酸化し、１０％はスレオニン残基をリン酸化し、そして０.１％はチロシン残基をリン酸化する。抗ホスホチロシン抗体の開発は可能となったが、ホスホ−セリン及びスレオニン残基に対する抗体は低親和性であり、しばしば１つだけのキナーゼに特異的である。現在、非抗体ベースのハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイは、時間分解蛍光（ＴＲＦ）、蛍光偏光アッセイ（ＦＰ）又は蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）などの方法をベースとしている。これらのアッセイは、特殊装置を必要とし、そして／或いは酵素活性に応じた低い蛍光強度変化に苦しんでいる。
【００４２】
上記のスーパークエンチングを用いた蛍光シグナルの増大により、酵素活性測定における感度の強化に努めてきた。センサーのプラットホームは、図１Ａに示すポリ（フェニレンエチレン）（ＰＰＥ）誘導体などの修飾アニオン性高分子電解質蛍光剤を含むことができる。ＰＰＥ蛍光剤は、正に荷電したマイクロスフィア上で吸着により固定化することができる。このポリマーは、高い量子効率で光ルミネッセンスを示し、プロテアーゼ活性の検出に使用されてきた。［９］このプラットホームにおいて、Ｎ−末端のクエンチャー及びＣ−末端のビオチンを側面に配置する反応性ペプチド配列が用いられた。このペプチドは、ビオチン結合性タンパク質とともに配置されたＰＰＥ被覆マイクロスフィアに結合し、ＰＰＥ蛍光のほぼ完全なクエンチングをもたらす。ペプチドの酵素介在性切断は、酵素活性に対して直線性を有した蛍光クエンチングの反転をもたらす。１つのエネルギーアクセプタ色素はクエンチャーあたり約４９繰り返し単位からの光ルミネッセンスをクエンチングすることができることが、実証された。［９］
【００４３】
蛍光性ポリマーのスーパークエンチングは、図２に示すように、キナーゼ／ホスファターゼ酵素活性のバイオディテクション（ｂｉｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）に適応することができる。図２に示すように、多価金属イオンは、溶液中でアニオン性共役ポリマーと強く会合することができ、ポリマー蛍光の変化及び／又はクエンチングをもたらす。ポリマー−マイクロスフィアアンサンブル上の全体の電荷は調整することができるので、これらのアンサンブルは、特異的リガンドと複合する能力を保持したままポリマー蛍光を強くクエンチングせずに金属イオンがポリマーと会合するプラットホームを与えることができる。このアプローチは、低いｐＨでのリン酸酸素との配位によって金属イオンがリン酸化化合物を特異的にトラップすることのできる固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）で使用されるものと類似している。例えば、Ｍｏｒｇａｎ他,（Ａｓｓａｙ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ., ２００４，２，１７１）を参照されたい。
【００４４】
本明細書中で説明するように、ガリウムはポリマー放射をクエンチングすることなく蛍光剤（図１Ａ及び図１Ｂに示すものなどのアニオン性共役ポリマー、並びに複数の蛍光種を含んで成る他の蛍光剤が挙げられるが、これらに限定されない）と会合することができる。ガリウムは、単量体のＧａ3+として又はポリオキソ種などの多量体アンサンブルとして存在することができる。蛍光剤会合ガリウムはまた、ペプチドがローダミンなどの色素を含む場合、金属イオン介在性ポリマースーパークエンチングが起こるように、リン酸化ペプチドと会合することもできる。蛍光剤は、マイクロスフィアなどの固形支持体の表面と会合することができる。このアプローチは、図２に示すように、感度の良い選択的なキナーゼ／ホスファターゼアッセイに対する基礎を提供する。
【００４５】
蛍光クエンチング（ターンオフ（ｔｕｒｎ ｏｆｆ））キナーゼアッセイの場合において、ポリマー蛍光のクエンチングは酵素活性に対して直線性を有する。下記の実施例で説明するように、このアッセイは、ほぼ生理学的ｐＨで実施することができ、そして構成的リアルタイム又はエンドポイントアッセイにおいて柔軟性を許容する。このアッセイは、瞬時の「混ぜて読む（ｍｉｘ ａｎｄ ｒｅａｄ）」であり、洗浄段階又は複雑なサンプル調製を必要としない。
【実施例】
【００４６】
下記の実施例１は、タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）及びタンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＢ−１Ｂ）の酵素活性に対する確固たる（ｒｏｂｕｓｔ）アッセイを示す。このアッセイは、通常１０〜２０％の基質転換で０.９超のＺ'値を与える。下記に示す実施例において、キナーゼアッセイは酵素活性に応じた蛍光シグナルの減衰を与え、一方ホスファターゼアッセイは酵素活性の増加にともなったシグナルの増大を与える。配列番号：１などのペプチドに対しては、クエンチャーはポリマー蛍光のクエンチングの結果として感作された蛍光を示すことができるので、このアッセイは同一のサンプルにおいて、観察する波長に依存したシグナルの増大又は減少を示すことができる。これにより、レシオメトリック（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ）測定が可能となる。さらに、ペプチドのクエンチャーにおける蛍光偏光の観察により検出を実施することができる。金属イオン介在性スーパークエンチングをベースとしたタンパク質キナーゼ、ホスファターゼ及びプロテアーゼアッセイに対しては、エンドポイント及び動態アッセイの双方を実施することができる。
【００４７】
実施例１−タンパク質キナーゼａ（ＰＫＡ）及びチロシンホスファターゼ活性１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ）に対するアッセイ
下記のペプチドを酵素基質及びホスホペプチドキャリブレータ（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）として使用した。
【００４８】
ＰＫＡ活性の検出用に：
ローダミン−ＬＲＲＡＳＬＧ 配列番号：２
及びそのキャリブレータペプチド：
ローダミン−ＬＲＲＡ（ｐＳ）ＬＧ 配列番号：１
が、Ａｎａｓｐｅｃにより合成された。
【００４９】
ホスファターゼ活性の検出用に：
ローダミン−ＫＶＥＫＩＧＥＧＴ（ｐＹ）ＧＶＶＹＫ 配列番号：３
及びそのキャリブレータペプチド：
ローダミン−ＫＶＥＫＩＧＥＧＴＹＧＶＶＹＫ 配列番号：４
が、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙにより合成された。
【００５０】
組み換えＰＫＡを、Ｐｒｏｍｅｇａから購入した。酵素であるＰＴＰ−１Ｂ及び阻害剤であるＲＫ６８２を、Ｂｉｏｍｏｌから購入した。ＰＫＡに対するＳｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ阻害剤を、Ｓｉｇｍａから購入した。ポリスチレンアミンで官能基化されたビーズを、Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓから得た。
【００５１】
アッセイバッファー中の１５μＬの１μＭペプチド溶液（ローダミン−ホスホ−ペプチド又はローダミン−非ホスホ−ペプチドのいずれか）を、検出器（ｄｅｔｅｃｔｏｒ）バッファー中の１５μＬのセンサーに添加することにより、センサービーズの性能を決定した。４５０ｎｍでの励起、４７５ｎｍでのカットオフフィルター及び４９０ｎｍでの放射にて、ウエルスキャンモードで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＸＳプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ）を用いて、混合物の蛍光を測定した。
【００５２】
２価又は３価の金属イオンが、溶液中で図１Ａ及び図１Ｂに示すようなアニオン性ポリマーと強く会合することができるという発見に基づいて、図１Ａに示す構造のポリマーをキナーゼ／ホスファターゼアッセイのためのセンサーとして選んだ。ＰＰＥ−Ｄｉ−ＣＯＯＨで被覆したマイクロスフィアを含んで成る溶液に、３４０μＭの濃度のＧａＣｌ3を添加した際に、放射のクエンチングは観察されなかった。より高い濃度のＧａＣｌ3では、蛍光放射のクエンチングが観察された。しかし、最適濃度のＧａ3+を用いた場合、ローダミン標識ホスホ−ペプチドはポリマー蛍光を強くクエンチングし、一方、非リン酸化のローダミン標識ペプチドを用いた場合には蛍光の変調はほとんど観察されないことが見出された。
【００５３】
図３は、ローダミン標識ＰＴＰ−１Ｂホスホペプチド基質に対して得られたＳｔｅｒｎ Ｖｏｌｍｅｒプロットを示す。Ｓｔｅｒｎ Ｖｏｌｍｅｒ定数（ＫSV）は、クエンチングの定量的尺度を提供する（Ｆ0はクエンチャーの不在下での蛍光強度であり、Ｆはクエンチャーの存在下での蛍光強度である。）本明細書で決定したＫSVは比較的大きい（すなわち、２×１０7Ｍ-1）。５０％のクエンチングは（ＰＲＵ／Ｑ）５０＝５０を与え、スーパークエンチングの発生を実証する。
【００５４】
上記に示すように、クエンチャー標識基質を用いてアッセイを開発した。基質のリン酸化で、ペプチドはリン酸基によりセンサーに会合し、蛍光をクエンチングする。金属イオン配位基はリン酸と特異的に結合するので、リン酸化セリン、スレオイニン又はチロシン残基を検出することができる。
【００５５】
セリン及びチロシン酵素（すなわちタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ））及びタンパク質チロシンホスファターゼ１−Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ）に対する蛍光のスーパークエンチングをベースとしたアッセイを、下記で説明する。
【００５６】
図４Ａは、ポリマークエンチングの増加が酵素濃度と相互に関連がある、ＰＫＡ酵素活性のエンドポイント測定を示す。Ｆｅ3+配位アッセイ（非常に低いｐＨを必要とする）とは違って、このプラットホームはほぼ生理学的ｐＨで有効であり、これによりリアルタイムアッセイ又はエンドポイントアッセイの実施において研究者による柔軟な選択を許容する。リアルタイムアッセイは（酵素反応ミックスの一部分として検出（ｄｅｔｅｃｔｏｒ）ミックスを含む）は、図４Ｂに示すように、５０％の基質リン酸化に対してエンドポイントアッセイよりも約１０倍高い濃度の酵素を必要とする。
【００５７】
アッセイの感度を、ＰＫＡ活性の既知の阻害剤であるＳｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅを用いて試験した。結果を図５に示す。図５に示すように、６.５μＭのＡＴＰ及び２００ｍＵのＰＫＡを用いた反応において１μＭの基質を使用して得たＩＣ50は５９ｍＵであり、公開された値（１８.４ｍＵ）と一致する。
【００５８】
この形態（ｆｏｒｍａｔ）を、ＰＫＡに対して使用したものとは異なる長さ及び配列組成のペプチド基質上でタンパク質チロシンホスファターゼ活性１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ）の検出に対して試験した。図６は、１２５ｎＭの基質上でのＰＴＰ−１Ｂを用いたエンドポイントアッセイとして又はリアルタイムにおいて測定した酵素濃度曲線のＥＣ50及びＬＯＤの結果を示す。既知の阻害剤であるＲＫ−６８２を用いた阻害剤曲線は、２６.４ｎＭの優れたＩＣ50をもたらした。
【００５９】
このアッセイで与えることのできる統計パラメーターは、ホスホペプチドキャリブレータペプチドの既知の量を８回繰り返して評価することにより決定した（図６）。このデータは優れており、このアッセイがそれぞれ０.８及び０.９のＺ'因子でわずか５〜１０％の基質転換を決定するのに適していることを示している。
【００６０】
このＰＫＡアッセイの性能は、商業的に入手可能なＦＲＥＴアッセイ（ＡＴＰ消費アッセイ及びＩＭＡＣベースのアッセイ）と比較されてきた。酵素濃度曲線において最適の性能を生み出すように、そして可能であれば同一のペプチドを用いて、全てのアッセイを実施した。ＩＭＡＣベースのアッセイは、酵素濃度曲線において最も低い感度を与えた（２０ｐｇに比較して１ｎｇ）。このアッセイにおいては（原理上は、ＱＴＬ Ｌｉｇｈｔｓｐｅｅｄ（登録商標）アッセイに最も近い）、現在の形態における１：５０の比率とは対照的に、センサー対検出器は１：１の比率となる。これらの結果は、スーパークエンチングで得ることのできる感度の増大を明確に実証している。
【００６１】
Ａｋｔ−１及びＰＫＣαに対する基質を用いて、追加のアッセイが開発された。これらの異なった基質を用いた場合、蛍光クエンチングの基質の長さ又はペプチド配列の内容への顕著な依存は観察されなかった。この点で、金属イオン介在性スーパークエンチングアッセイは一般的であると考えることができ、クエンチングがドナーとアクセプタの間の距離に高く依存するＦＲＥＴペプチドに対して大きな利点を与える。
【００６２】
プロテアーゼアッセイ
プロテアーゼ酵素は、それらの基質上のアミド結合を切断する。金属イオン−蛍光性ポリマーアンサンブルとともに、切断部位の両側にクエンチャー及びリン酸基を含むペプチド又はタンパク質基質の使用することにより、プロテアーゼ酵素活性の検出のための感度の高いアッセイの開発が可能となる。
【００６３】
プロテアーゼアッセイの１つの実施態様を図８に示す。図８に示すように、切断されていない（ｉｎｔａｃｔ）基質がセンサーに結合する場合、センサー蛍光はクエンチャー色素の接近（ｐｒｏｍｉｘｉｔｙ）によりクエンチングされる。酵素により基質を切断してフラグメントにすることで、リン酸基からクエンチャーを分離し、クエンチャー及びポリマーを分離させる。この分離は、酵素活性の存在下において、ポリマー蛍光のクエンチングを減少させる（すなわち、センサーからのシグナルを増大させる）。
【００６４】
プロテアーゼ活性は、同種（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）又は異種（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）の形態において、リアルタイム又はエンドポイントのいずれかで測定することができる。同種のリアルタイムアッセイにおいては、基質はポリマー−マイクロスフィアアンサンブルの表面上に存在することができる。同種のエンドポイントアッセイにおいては、基質及び酵素は溶液中で反応することができ、そして特定のインキュベーション期間の最後に、反応を止めるためにサンプルにセンサーを添加することができる。クエンチャーとして蛍光色素を用いる場合、プロテアーゼ活性はレシオメトリックに測定することができる。異種のエンドポイント形態においては、切断部位の同じ側にリン酸基とクエンチャーを含むビオチン化基質を用いることができる。切断後に、ビオチン種の結合によりペプチド種は分離し、一方、クエンチャー標識部分は移動して蛍光剤をクエンチングすることができる。
【００６５】
実施例２−金属イオン介在性蛍光スーパークエンチングをベースとしたプロテアーゼアッセイ
このアッセイにおいてトリプシンに対するペプチド基質は、
ローダミン−ＬＲＲＡｐＳＬＧ （配列番号：１）
である。
【００６６】
トリプシンは２つのアルギニンの箇所でペプチドを切断する。この実施例において実施されるアッセイは、下記のパラメーターを用いた：
マイクロスフィア−蛍光剤−ガリウムアンサンブル（ＱＴＬセンサー）；
３μＭ（終濃度） Ｒｈ−ＬＲＲＡｐＳＬＧ（配列番号：１）；
１Ｕ／μＬ トリプシン；
４０×１０6 マイクロスフィア（ＭＳ）／１５μＬ；
λex４３０；
λem４９０；及び
λco４７５ｎｍ。
【００６７】
このアッセイを、３８４−ウエルの白色プレートにおいて約２２℃で１時間実施した。このアッセイの結果を下記の表１に示した。
【表１】
【００６８】
図１２は、「リアルタイム」（すなわち、動態）アッセイ形態においてトリプシン活性を測定した結果を示すグラフである。図１２から分かるように、トリプシン活性の増大は時間−依存的である。これに対応して、蛍光シグナルの増大は時間とともに起こる。
【００６９】
非標識ペプチド及びタンパク質を用いたブロッキングアッセイ
上記及び図２に示すアッセイの基礎は、ブロッキングアッセイに適応することができる。ブロッキングアッセイにおいては、「一般的な」リン酸化色素標識ペプチド又は色素及び金属イオン結合性リン酸（例えば、ガリウム）の双方を含む他の基質は、付加的なリン酸化基質の不在下で、蛍光性ポリマー及び金属イオンを含むポリマービーズをクエンチングするが、ペプチド又はタンパク質基質がリン酸化される場合は「ブロック」される。
【００７０】
金属イオン介在性スーパークエンチングをベースとしたブロッキングキナーゼアッセイを図示する図９において、このアッセイの原理を示す。このアッセイは、酵素及び分析物の混合物にセンサーを添加し、その後インキュベートして反応させることにより、最も慣用的に実施される。任意のリン酸化分析物は、ポリマー蛍光をクエンチングせずに、図９で説明するようにセンサーと会合するだろう。「一般的な」リン酸化色素標識ペプチドの添加は、ポリマー蛍光のクエンチングをもたらすだろう（「ブロック」されたマイクロスフィア上における「遊離の」リン酸結合部位の程度により制限される）。このアッセイは蛍光「ターン−オン（ｔｕｒｎ−ｏｎ）」アッセイとして機能し、アッセイを展開する際に事前に基質を誘導体化する必要がないという付加的な利点を与える。図１０は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を用いたＰＫＣαに対するブロッキングアッセイ（「蛍光ターン−オン」）についての実験データを示す。
【００７１】
天然のタンパク質基質上でのキナーゼ活性の検出は、下記のペプチド基質を用いるよりもいくつかの利点を有する。
・５１８の既知のヒトキナーゼ（又は２５００のアイソフォーム）の中で、ほんの約５０のキナーゼに対するペプチド基質が立証されており、ほとんどの場合においては標的タンパク質が同定されている。いくつかの酵素は、効果的な基質認識、結合及びリン酸化に対して標的の非連続的な（ｎｏｎ−ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ）アミノ酸を必要とするかもしれない。この場合、たとえ関与するアミノ酸が同定されていても、人工のペプチド配列を構築することはできない。
・天然の標的タンパク質のリン酸化は、ペプチド基質のリン酸化よりも効率的であると予想される。これは、（ペプチド基質の）コストの意味において重要であり、またＨＴＳにおける阻害剤の同定をより正確なものともする。
・天然の標的タンパク質のリン酸化は、人工の基質のリン酸化よりもより特異的である。ペプチド基質の交差認識（ｃｒｏｓｓ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）により、細胞内キナーゼ活性を分析する将来的な試みが妨げられるだろうが、タンパク質基質については取り組むべきである。
・タンパク質のリン酸化の検出を可能にする現在の非放射性及び非抗体ベースのアッセイは、二次酵素であるルシフェラーゼによるＡＴＰ消費をベースとしている。このようなアッセイは、二次酵素であるルシフェラーゼの阻害の結果として、阻害剤スクリーンにおいて偽陰性を生じやすい。ＦＰアッセイは、シグナルを得るために分子運動における大きな変化を必要とするため、低分子量のタンパク質のみを検出することができる。
【００７２】
実施例３
標準的な反応において、キナーゼＰＫＣαによるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）のリン酸化を実施し、上記の実施例２に記載のＱＴＬセンサーを添加した。リン酸化ＭＢＰは、金属配位イオンへの特異的なリン酸結合によりＱＴＬセンサーに結合し、色素標識ホスホペプチド（トレーサー）の会合を濃度依存的な様式で阻害する。その結果生じる蛍光は、ｍｂｐのリン酸化の程度と相互に関連している。
【００７３】
この原理を下記の実施例において実証する。１μｇの濃度のｍｂｐを、連続的に希釈したキナーゼＰＫＣα酵素を用いて、白色の３８４ウエルＯｐｔｉｐｌａｔｅにおいて室温で１時間リン酸化した。インキュベーション後に、５０×１０6のＱＴＬセンサービーズを、約２２℃で１０分間添加し、その後１μＭの色素標識ペプチドトレーサーを添加した。プレートを約２２℃で３０分間インキュベートし、そして、Ｇｅｍｉｎｉ ＸＳプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ）において、４７５ｎｍカットオフフィルターを用いて、４５０ｎｍでの励起、４９０ｎｍでの放射にて、蛍光シグナルを測定した。蛍光「ターンオン」を、図９において図示する。
【００７４】
金属イオン介在性蛍光スーパークエンチングにより測定した、ホスホジエステラーゼ酵素活性
３'，５'−サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）は、メタロホスホヒドラーゼ（ｍｅｔａｌｌｏｐｈｏｓｐｈｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）のファミリーを含んで成る。メタロホスホヒドラーゼは、サイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）及び／又はサイクリックグアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）の３'結合を特異的に切断して、対応する５'−ヌクレオチドを生成する。ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰに対する様々な選択性を有するＰＤＥの１１のファミリーが、哺乳動物の組織において同定された。
【００７５】
ＰＤＥは、細胞内のｃＡＭＰ及び／又はｃＧＭＰレベルの必須のモジュレータ（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）である。サイクリック−ＡＭＰ又はｃＧＭＰは、重要な細胞プロセスに関与する細胞内シグナル伝達において重要な役割を果たす細胞内二次メッセンジャーである。ＰＤＥは、様々な疾患を処置するための創薬の標的であった。例えば、シデナフィル（ＰＤＥ５の選択的阻害剤）は、薬剤として商品化された（すなわち、Ｖｉａｇｒａ（登録商標）（Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃの登録商標））。いくつかのＰＤＥ４阻害剤は、喘息などの疾患を処置する抗炎症剤として臨床試験中である。
【００７６】
上記に説明するように、キナーゼ及びホスファターゼアッセイで実証されているようにＱＴＬセンサーはリン酸基に対して高い結合親和性を示す。ＰＤＥアッセイは、ホスホジエステラーゼの活性を試験するために、色素標識ｃＡＭＰ又はｃＧＭＰを基質として用いる。ローダミン、アゾ又はフルオロセイン（これらに限定されない）を含む色素は、ＰＤＥに対する反応性を阻害することなくｃＡＭＰ又はｃＧＭＰに結合することができる。ｃＡＭＰ又はｃＧＭＰはホスホジエステル（ガリウム−ポリマー表面に強く結合しない）として存在するので、ポリマー蛍光の初期のクエンチングはほとんど起こらない。ＰＤＥにより触媒される加水分解の間、これらの基質上のホスホジエステルはリン酸基に変換される。次に、ガリウム−リン酸の特異的相互作用により、色素はマイクロスフィア表面の周辺にもたらされ、ポリマー蛍光のクエンチングが生じる。図１１は、ホスホジエステラーゼアッセイを図示する。
【００７７】
核酸アッセイ
金属−リン酸介在性結合は、ＤＮＡ及びＲＮＡ検出用のスーパークエンチングアッセイを作り出すために用いることができる。溶液中に存在することのできる又は固形支持体上に固定化することのできる標的核酸種への核酸種のハイブリダイゼーションをベースとした、多くの異なったアプローチを用いることができる。第一のアプローチは、その末端がリン酸化されているオリゴヌクレオチドを用いる。リン酸は、ＤＮＡ鎖の接合蛍光性ポリマーとの、金属−リン酸により介在される同一場所への配置を可能にする。リン酸基がオリゴヌクレオチドの５'−末端に付着している場合、３'−末端にクエンチャーを有する相補的な標的はリン酸化鎖にハイブリダイズすることができる。これらの末端は、機能的システムを保持したまま逆にすることもできる。このハイブリダイズした構造においては、クエンチャーは接合ポリマーに配向して、スーパークエンチングを促進する。従って、クエンチャー標識標的の存在下では、ポリマー蛍光はクエンチングされる。このような系は、非標識及び標識ＤＮＡ鎖をそれらのリン酸化相補鎖への結合に対して競合させることにより、非標識ＤＮＡに対するアッセイとして容易に描写することができる。
【００７８】
第二のアプローチが、分子指標により用いられるアプローチに類似したストラテジーに続く。オリゴヌクレオチドの末端領域が互いに相補的であって、ハイブリダイズしたステムを形成し、同時に、オリゴヌクレオチドの中心領域が標的オリゴヌクレオチドに対して相補的であって、標的が存在しない場合に一本鎖のループを形成するように、その末端の一方にリン酸を有し、もう一方にクエンチャーを有するヘアピンオリゴヌクレオチドを設計することができる。このようなオリゴヌクレオチドは、リン酸とクエンチャーをステムハイブリダイゼーションにより接近させる「ヘアピン」構造を形成するだろう。リン酸化ヘアピンオリゴヌクレオチドが、リン酸と金属との相互作用により金属−ポリマー複合体に結合している場合、クエンチャーのポリマーへの配向によりクエンチングが誘導されるだろう。リン酸／クエンチャー官能基化オリゴヌクレオチドがヘアピンのループ領域に結合する標的にハイブリダイズする場合、ループ領域はステム領域の二次構造を分裂させるリジッドロッド（ｒｉｇｉｄ ｒｏｄ）になる。これは、アクセプタとドナーのペアを強制的に分離させ、それによりポリマーのクエンチングを減少させる。
【００７９】
タンパク質及び他の標的に対する直接的なアッセイは、ＤＮＡアプタマーの結合特性を用いて多くの経路により実施することもできる。リン酸化ＤＮＡアプタマーは、金属被覆共役ポリマー表面に結合することができる。標的分子（サイズの小さな分子、サイズではタンパク質まで）の存在下では、オリゴヌクレオチドのアプタマー構造は安定化されるはずである（より低いΔＧ）。選択された標的の不在下においては、アプタマー鎖は弱い自己構造（ｓｅｌｆ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を有することができる。アプタマーの自己構造がクエンチャーで標識された相補的オリゴヌクレオチドにより侵入され得る場合には、アッセイは生み出されることができる。このようなアッセイ（アプタマーの標的が不在である場合）においては、相補的オリゴヌクレオチド−クエンチャーはアプタマーにハイブリダイズすることができる。このハイブリッドは、上記にリストした形態のもの（すなわち、５'−末端にリン酸、３'−末端にクエンチャー；又はその逆）であることができ、これにより、クエンチャーは配向して接合ポリマーをクエンチングするだろう。アプタマーの標的の存在下では、アプタマーの自己構造は安定化し、オリゴヌクレオチドクエンチャーはアプタマーにハイブリダイズすることはできないだろう。従って、アプタマーの標的の存在下では、ポリマーは蛍光を発し、そしてアプタマーの標的の不在下では、蛍光はクエンチングされるだろう。
【００８０】
一般的なリン酸の修飾又は消費
任意の方法でクエンチャーにテザリングされたリン酸を含む任意の系においては、化学的手段によるリン酸の修飾はリン酸を別の官能基に変換することができ、これにより金属−ポリマー複合体へのリン酸−金属介在性結合を妨げる。同様に、リン酸の他の要素への結合は、その同一のリン酸の金属ポリマー複合体への結合を妨げることができる。これらの場合においては、クエンチャーは共役ポリマーと同じ場所に配置され、蛍光発光が起こるだろう。一般的な例として、複合体Ａ（任意の手段によりクエンチャーにテザリングされたリン酸を含む）は、金属ポリマー複合体をクエンチングすることができる。複合体Ａに対する親和性を有し且つ複合体Ａ中に含まれるリン酸を化学的に修飾するか又は結合する要素も含む分子Ｂとともに存在する場合には、複合体Ａは金属ポリマー複合体に結合することができず、それにより金属ポリマー複合体をクエンチングすることができない。
【００８１】
ビオチン−テザー（ｔｅｔｈｅｒ）（ＢＴ）コンジュゲートを用いたアッセイ、試薬及びキット
１つの実施態様によると、標的分析物に対するアッセイを実施するためのキットが提供される。キットは２つの別個の成分を含んで成る：クエンチャー（Ｑ）及びビオチン−テザーコンジュゲート（ＢＴ）。ＢＴコンジュゲートのテザー（Ｔ）は、例えばタンパク質又はポリペプチド基質を含んで成ることができる。この実施態様によると、テザーは標的分子との相互作用及び標的分子による修飾でクエンチャーと会合する能力を獲得し、修飾テザー（Ｔ'）を形成する。テザーの修飾後に、ＢＴコンジュゲートの標的分析物との相互作用、そしてその後の修飾ＢＴコンジュゲート（ＢＴ'）のクエンチャー（Ｑ）との会合の結果として、ＱＴ'Ｂバイオコンジュゲートが形成される。キットは蛍光剤成分（Ｐ）も含んで成ることができる。蛍光剤成分は、クエンチャーと蛍光剤が会合した場合にクエンチャーによる蛍光剤のスーパークエンチングの増幅が可能である様式において、会合した複数の蛍光種を含んで成る。蛍光剤は蛍光性ポリマーであることができる。蛍光剤は、マイクロスフィア、ビーズ又はナノ粒子などの固形支持体と会合することができる。ＱＴ'Ｂ複合体上のビオチン部分と固形支持体上のビオチン結合性タンパク質との相互作用が蛍光のクエンチングをもたらすように、固形支持体はビオチン結合性タンパク質も含んで成ることができる。
【００８２】
上記に説明するように、ＢＴコンジュゲートのテザーは認識されそして標的分析物への会合又は反応により修飾されて、ＢＴ'コンジュゲートを形成することができる。テザーの修飾は、修飾ＢＴコンジュゲート（ＢＴ'）がクエンチャー（Ｑ）に結合しＱＴ'Ｂ複合体を形成するのを可能にする。この一連の出来事は、ポリマー蛍光の変調へと続くことができる。特に、蛍光の変化は、サンプル中の標的分析物の存在及び／又は量を示すために用いることができる。更に、ＢＴコンジュゲートの酵素又は他の標的分析物との特定の会合又は反応がない場合は、蛍光ＰはＢＴコンジュゲートへの会合により影響を受けない。従って、サンプル中の標的分析物の存在及び／又は量を決定するための、上記のクエンチャー（Ｑ）及びビオチン−テザーコンジュゲート（ＢＴ）を使用する方法も提供する。
【００８３】
１つの実施態様によると、ＢＴコンジュゲートのテザー（Ｔ）の標的分析物との相互作用は、テザー上のクエンチャー結合成分の除去をもたらすことができる。この実施態様において、ＢＴコンジュゲートのクエンチャー（Ｑ）に結合する能力は、分析物との相互作用の結果として取り除かれ、修飾コンジュゲート（ＢＴ'）を形成する。さらに、この一連の出来事は、定量的にポリマー蛍光の変調へと続くことができる。いくつかの実施態様においては、ＢＴと標的分析物の反応は触媒的であることができ、ポリマー蛍光の変調の増大をもたらす。
【００８４】
更なる実施態様によると、ポリマースーパークエンチングは、金属イオンにより介在されることができる。この実施態様によると、ＱＴコンジュゲート（ここで、Ｑは電子又はエネルギー移動クエンチャーであり、Ｔは反応性テザーである）は、標的分析物と反応して、テザー上の官能基を導入し、修飾し又は除去することができる。官能基は、蛍光性ポリマーに会合した又は蛍光性ポリマーと同じ場所（例えば、固形支持体の表面上）に配置された金属イオンとの会合が可能な官能基であることができる。従って、修飾ＱＴコンジュゲート（ＱＴ'）は、蛍光性ポリマー及び金属イオンを含んで成るアンサンブルとの会合が可能である。その結果、テザーの修飾はポリマー蛍光における変化をもたらす。この方法は、標的分析物としてのキナーゼ、ホスファターゼ及び他の酵素に対する感度の高いアッセイにおいて用いることができる。
【００８５】
翻訳後修飾イベントのバイオディテクション（ｂｉｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）のための修飾可能なテザーをベースとしたＱＴＢアプローチ
このアプローチは、標的分析物との相互作用で修飾されてＢＴ'コンジュゲートを形成する、合成ビオチン化ペプチド基質又はテザー（以下、「ＢＴコンジュゲート」と呼ぶ）を用いる。１つの実施態様において、ＢＴコンジュゲートは非蛍光性クエンチャー（Ｑ）に複合することが不可能であり、一方、修飾コンジュゲート（ＢＴ'）は容易にクエンチャーに結合する。このタイプの相互作用は、基質転換の増加とともにポリマー蛍光が減少する蛍光「ターン−オフ」アッセイを導く。
【００８６】
別の実施態様においては、ＢＴコンジュゲートはダーク（ｄａｒｋ）クエンチャーと容易に会合することができる。しかし、ＢＴコンジュゲートは、標的分析物と相互作用をして修飾コンジュゲート（ＢＴ'）を形成した後は会合する能力を失う。このタイプの相互作用は、蛍光「ターン−オン」アッセイをもたらす。
【００８７】
更なる実施態様において、上記の実施態様におけるクエンチャーは、蛍光部分であることもできる。蛍光部分のクエンチャーとしての使用は、蛍光の感作された放射を提供することができる。全てのこれらの実施態様においては、ＱＴＢバイオコンジュゲートはポリマー−レセプターアンサンブルと複合体を形成して、スーパークエンチングプロセスにより効率的にポリマー蛍光を変調することができる。
【００８８】
翻訳後修飾相互作用のためのアッセイで使用されるクエンチャー部分は、基質上に修飾される官能基に会合する特性及び近傍に存在する場合に共役ポリマーの蛍光のスーパークエンチングを増大させる特性を兼ね備える。１つの実施態様において、クエンチャーは遷移金属又は鉄（ＩＩＩ）イミノ二酢酸（ＩＤＡ）型のキレートなどの有機金属種であることができる。第二鉄はホスホペプチドに強く会合することができ、そして電子移動により蛍光性ポリマーをスーパークエンチングすることができる。別の実施態様において、クエンチャーは２つの異なる部分から成ることができる（１つはクエンチャーの修飾官能基への会合を促進し、もう１つはエネルギー移動によりポリマークエンチングを引き起こす）。
【００８９】
センサーは、固形支持体上又は溶液中のいずれかのビオチン結合性タンパク質と同じ場所に配置された共役蛍光性ポリマーを含んで成ることができる。ポリマーは、非共役骨格上又はビーズ若しくはナノ粒子などの固形支持体の反対に荷電した表面上に集合した蛍光色素から構成される荷電ポリマー、中性のポリマー、又は「実質上の（ｖｉｒｔｕａｌ）」ポリマーであることができる。
【００９０】
キナーゼ及びホスファターゼ酵素のバイオディテクション及びバイオアッセイ（ｂｉｏａｓｓａｙ）のための修飾テザーをベースとした（ＱＴ'Ｂ）アプローチ
ＱＴ'Ｂ形態は、サンプル中のキナーゼ又はホスファターゼ酵素活性の検出及び定量のために使用することができる。例えば、このアッセイは、ＰＫＡなどの標的キナーゼ及びＰＴＰ−１Ｂなどのホスファターゼによるビオチン化ペプチド基質のリン酸化又は脱リン酸化のそれぞれを測定するために使用することができる。キナーゼ又はホスファターゼ活性の検出のためのＱＴ'Ｂ形態の使用を、図１３に示す。
【００９１】
ＱＴＬセンサーは、ビオチン結合性タンパク質と同じ場所に配置された（図１３に示すように固形支持体（例えば、マイクロスフィア）の表面上に被覆されるか、又は溶液中で複合体として存在するかのいずれか）、高い蛍光性の接合高分子電解質を含んで成ることができる。標的キナーゼ（例えば、ＰＫＡ）により特異的にリン酸化されること又は標的ホスファターゼ（例えば、ＰＴＰ−１Ｂ）により特異的に脱リン酸化されることが知られているビオチン化ペプチド又はタンパク質基質を、所望の時間の間適切な酵素とインキュベートすることができる。
【００９２】
図１３に示すように、非リン酸化ＢＴコンジュゲートをサンプル中に添加し、サンプルとともにインキュベートして、キナーゼ酵素活性を測定することができる。このコンジュゲートをサンプルとインキュベートした後の、ポリマーセンサー及びクエンチャーのサンプルへの添加は、ポリマー蛍光のクエンチングをもたらすことができる。蛍光の減少は、酵素活性の一次関数である。
【００９３】
図１４は、ＱＴ'Ｂアッセイを用いたタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）活性の測定を示すグラフである。図１４においては、蛍光（ＲＦＵ）をＰＫＡ濃度（ｍＵ／ウエル）の関数としてプロットする。図１４から分かるように、ＰＫＡ濃度の増加は蛍光の減少をもたらす。
【００９４】
図１５は、ホール（ｗｈｏｌｅ）のタンパク質基質（ヒストン１）を用いたタンパク質キナーゼＣ活性の検出を示すグラフである。図１５から分かるように、リン酸化ヒストン基質（１）と比較して非リン酸化ヒストン基質（２）は、低いレベルのポリマー蛍光が観察される。
【００９５】
図１３にも示すように、サンプル中のホスファターゼ酵素活性は、サンプルのリン酸化ＢＴコンジュゲートとのインキュベーションにより測定することができる。インキュベートしたサンプルへのポリマーセンサー及びクエンチャーの添加は、ＰＴＰ−１Ｂ活性に応じてポリマー蛍光の増加をもたらすことができる。
【００９６】
図１６は、ＱＴ'Ｂアッセイを用いたタンパク質チロシンホスファターゼ−１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ）活性の検出を示すグラフである。図１６においては、蛍光（ＲＦＵ）をＰＴＰ−１Ｂ濃度（ｍＵ／ウエル）の関数としてプロットする。図１６から分かるように、ＰＴＰ−１Ｂ濃度の増加は蛍光の増大をもたらす。
【００９７】
ＰＫＡキナーゼ活性の検出の場合には、Ｋｅｍｐｔｉｄｅペプチド基質を用いることができる。この基質は、Ｎ末端にビオチンを含み、そしてＰＫＡによりリン酸化されることのできるセリンを含む。
【００９８】
ＰＴＰ−１Ｂホスファターゼ活性の検出のために、Ｎ末端にビオチンを有するリン酸化基質を用いることができる。この基質は、ＰＴＰ−１Ｂとの相互作用で脱リン酸化を受けることができる。
【００９９】
クエンチングがドナーとアクセプターの間の等モル量のイベントであるＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）アッセイとは違って、上記のＱＴＬキナーゼ及びホスファターゼアッセイは、機能的に優れたプラットホームを用いる。このプラットホームは、良く確立されたリン酸−金属複合体相互作用と電子及びエネルギー移動クエンチャーによる共役ポリマースーパークエンチング現象とを組み合わせることで、蛍光シグナルの増大及び酵素活性の測定における感度の増強をもたらす。
【０１００】
金属イオン介在性ポリマースーパークエンチングをベースとしたバイオアッセイ
アニオン性共役ポリマーが金属カチオン及び有機カチオンと強く会合する（時おり、同時発生的にポリマー蛍光のクエンチングが起こる）ことが以前示された。［１、４］会合は、クーロン力及び疎水性相互作用の結果として起こる。以前の研究では、ポリマー及び対イオンの間の会合は、荷電した支持体（ポリスチレンマイクロスフィア、シリカ又は粘土など）又は別の荷電したポリマーとの事前の会合により制御又は調整できることも示された。［４−６］
【０１０１】
アニオン性ポリマー（図１Ａに示した例）は、ポリマー蛍光の変化をほとんど引き起こさないプロセスにおいて金属イオンと会合することができる。このアプローチの例として、最初に図１Ａに示す構造を有するポリマーをカチオン性ポリスチレンマイクロスフィア上に被覆し、次にＧａ3+で処理した。このプロセスを図１７に示す。図１７から分かるように、Ｇａ3+はそのポリマーと会合するが、その蛍光をクエンチングしない。固形支持体（例えば、ビーズ）、ポリマー及び金属イオン（例えば、Ｇａ3+）から成るアンサンブルは、以前実証された金属イオンの有機リン酸と会合する能力を利用する新たなセンサープラットホームを提供する。
【０１０２】
金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）は、リン酸化種の精製における一般的な技術である。Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｇａ（ＩＩＩ）、Ａｌ（ＩＩＩ）、Ｚｒ（ＩＶ）、Ｓｃ（ＩＩＩ）及びＬｕ（ＩＩＩ）（硬いルイス酸）などの金属イオンは、共有結合したイミノ二酢酸（ＩＤＡ）又はニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）又は他のリガンドとの会合により、アガロース、セファロースなどの樹脂ビーズの表面上に固体化することができる。次に、結合した金属イオンは、タンパク質又はペプチドなどのリン酸化種に結合することができる。タンパク質の単離におけるＩＭＡＣの適用に加えて、ＩＭＡＣ関連技術は、リン酸化後にリン酸金属複合体を形成する際の、蛍光標識基質の蛍光偏光における変化を測定することにより、タンパク質キナーゼ酵素用の検出形態として使用することができる。
【０１０３】
図１７に示すように、固形支持体会合Ｇａ3+は、キナーゼ酵素（又はホスファターゼ酵素による脱リン酸化）により生み出されるリン酸化基質と複合する能力を保持している。従って、固形支持体テザリングＧａ3+を、ＱＴＬアッセイ用の基礎を提供するのに用いることができる。示した例においては、金属イオン（例えば、Ｇａ3+）との会合によりポリマーの近傍にもたらされた際に、エネルギー又は電子移動クエンチングのいずれかにより蛍光性ポリマーの蛍光を減少させることのできるクエンチャーを用いて基質を機能化した。
【０１０４】
典型的な検出形態は、図１Ａに示す構造を有するアニオン性高分子電解質（以下、「ＰＰＥ」と呼ぶ）、０.５５μｍのカチオン性ポリスチレンマイクロスフィア、塩化ガリウム、及びローダミン標識リン酸化ペプチドを用いる。この検出形態を図１７で図示する。
【０１０５】
最初に、アニオン性ＰＰＥポリマーを、水中における沈着（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）により固形支持体（すなわち、０.５５μｍのカチオン性ポリスチレンマイクロスフィア）上に固定化した。次に、ポリマー被覆マイクロスフィアを、ｐＨ５.５の水溶液中において塩化ガリウムで処理した。次に、過剰のＧａ3+を洗い流した。
【０１０６】
酵素リン酸化反応（例えば、キナーゼ）、プロテアーゼ切断反応、又は１つのＤＮＡ／ＲＮＡ配列のいずれから作り出される、又は競合反応により作り出される色素標識リン酸化物質は、ガリウムポリマーセンサーと会合することができ、そしてポリマーからの蛍光を変調することができる。
【０１０７】
図１８は、ペプチド基質におけるリン酸化の程度の関数としてのガリウムポリマーセンサーの蛍光を示す。図１８においては、相対的な蛍光をリン酸化の程度（ホスホペプチド（％））の関数としてプロットする。
【０１０８】
図１９は、サンプル中のタンパク質キナーゼＡ酵素のレベルに対する、実際の動態アッセイを実証する。このアッセイでは、基質の酵素介在性リン酸化はガリウムポリマーセンサーの存在下で起こる。図１９では、相対的な蛍光をタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）濃度（ｍＵ／Ｒｘ）の関数としてプロットする。
【０１０９】
蛍光変化は、様々な形態で測定することができる。一般的なアッセイは、動態及びエンドポイントアッセイの双方として、様々な基質に対する酵素介在性反応を測定するのに用いることができる。
【０１１０】
創薬のための阻害剤スクリーニングへのＱＴ'Ｂ検出アプローチの適用
キナーゼ及びホスファターゼ酵素活性に対するアッセイにおける、電子又はエネルギー移動クエンチャーの存在下でスーパークエンチングを示す共役ポリマーの使用は、薬理学的に適切な酵素及び他の生体分子の効果を緩和する薬剤に対する、大きな化合物ライブラリーのスクリーンに適用することができる。酵素活性の既知の阻害剤の添加は、酵素の基質との反応を妨害し、それにより、阻害剤不在下で見られるシグナル応答を違った風に変調するだろう。阻害剤の所望の濃度に対して見られるシグナル変調の程度は、阻害剤の強さの尺度である。
【０１１１】
ＱＴ'Ｂをベースとしたアッセイは、様々なウエル濃度のマイクロタイタープレートにおいて実施し、創薬プロセスを加速することができる。１つの実施態様において、化合物のライブラリーをキナーゼ又はホスファターゼアッセイにおいてスクリーンし、リン酸化又は脱リン酸化反応の阻害をそれぞれ捜すことができる。
【０１１２】
ビオチン化テザー（ＢＴ）並びにクエンチャー及びビオチン結合性タンパク質のコンジュゲートを用いた、アッセイ、試薬及びキット
上記に説明したように、蛍光性ポリマーと会合したＱＴＬバイオコンジュゲートを開発した。このＱＴＬバイオコンジュゲートは、溶液中における個々の分子又は支持体上の集合体のいずれかとしての、蛍光性高分子電解質の金属イオンと複合する自己組織化能力を利用する。このように複合した金属イオンは、クエンチャーを含んで成るバイオコンジュゲート上の配位基（例えば、リン酸基）と選択的に会合することができ、これによりタンパク質、小分子、ペプチド、プロテアーゼ及びオリゴヌクレオチドの選択的検出のための基礎を提供する。［１０−１１］
【０１１３】
上記のアプローチは、クエンチャーで標識したバイオコンジュゲートを用いる。しかし、バイオコンジュゲートは２段階のプロセスで集合させることもできる。２段階のプロセスでは、最初の段階でビオチン化基質を酵素学的に反応させ、２番目の段階でクエンチャーと結合（ｃｏｕｐｌｅ）したビオチン結合性タンパク質分子（例えば、ストレプトアビジン）を含む検出分子を添加する。センサーを添加すると、金属イオンへのリン酸の会合が起こり、クエンチングは結合したビオチン結合性タンパク質／クエンチャーコンジュゲートにより介在される。
【０１１４】
この「スナップ式」のアプローチは、ビオチン化基質をストレプトアビジンクエンチャーと事前に会合させること及び集合したバイオコンジュゲートを用いて直接的に酵素と反応させることによる１段階のアッセイにおいて使用することもできる。しかし、この１段階のスナップ式アッセイアプローチの使用は、アッセイスピード及び／又は感度を落としてしまうかもしれない。
【０１１５】
金属イオン介在性スーパークエンチング
ポリ（フェニレンエチニレン）（ＰＰＥ）ファミリーにおける共役ポリマーは、芳香環に付加される様々な官能基を用いて調製することができる。使用されてきたペンダントアニオン基の中に、スルホポリｐ−フェニレンエチニレン（ＰＰＥ−Ｄｉ−ＣＯＯＨ）共役ポリマーの分子構造を示す図１Ａにおいて図示されるものもある。このポリマーは、水中でカチオン性マイクロスフィアと会合して、安定なポリマー被覆を形成することができる。被覆マイクロスフィアは、強い蛍光を示す。ポリマー被覆マイクロスフィア上の全体の電荷は、ポリマー負荷の程度により、そしてポリマーの構造を変化させることにより調整することができる。
【０１１６】
ポリマー被覆マイクロスフィアは金属カチオンと会合することができ、そして金属カチオンの負荷はマイクロスフィア上のポリマーの負荷レベルに依存し得ることが見出されてきた。Ｆｅ3+及びＣｕ2+などのいくつかの金属イオンは、ポリマー蛍光をクエンチングすることができ、一方Ｇａ3+などの他のものはポリマー蛍光をクエンチングしない。金属イオンの不在下においてほとんど又は全くクエンチングが生じない条件下において、非クエンチング金属イオンはマイクロスフィア結合ポリマーの蛍光のスーパークエンチングを介在しない。Ｇａ3+の添加によりポリマー被覆マイクロスフィアが「荷電」された後において、懸濁物へのリン酸化ペプチドの添加はポリマー蛍光の顕著なクエンチングをもたらす。Ｇａ3+によるペプチド上のリン酸の会合がクエンチャーをポリマーの近傍にもたらし、蛍光クエンチングを介在することが示された。
【０１１７】
金属イオン荷電ポリマーによるリン酸化生体分子のポリマークエンチングは、下記の２段階のプロセスにおいて達成することができる。図２０は、酵素学的に反応させたビオチン化基質へのクエンチャーのその後の添加により達成される金属イオン介在性スーパークエンチング、及びキナーゼアッセイの実施例を図示する。図２０は、ストレプトアビジン−クエンチャーの後にＱＴＬセンサーを添加により検出される、標的酵素によるビオチンペプチド基質のリン酸化又は脱リン酸化を示す概略図である。ペプチド産物は、Ｇａ3+金属イオンへの特異的なリン酸結合によりポリマーの表面にもたらされる。その結果生じるポリマー蛍光のクエンチングは、リン酸化又は脱リン酸化と同時に起こる。
【０１１８】
金属イオン介在性スーパークエンチング−キナーゼ／ホスファターゼアッセイをベースとしたバイオアッセイ
タンパク質のリン酸化及び脱リン酸化は、細胞の代謝、成長、分化及び細胞増殖の調節を介在する。酵素機能の異常は、癌及び炎症などの疾患を引き起こし得る。５００超のキナーゼ及びホスファターゼは、細胞活性の調節に関与していると考えられており、薬物治療の有力な標的である。
【０１１９】
スーパークエンチングを用いて蛍光シグナルを増大することにより酵素活性の測定において強化された感度を示すアッセイが説明されている。［１０−１１］これらのアッセイで使用されるセンサープラットホームは、正に荷電したマイクロスフィア上での吸着により固定化された、修飾アニオン性高分子電解質誘導体を含んで成る。典型的な修飾アニオン性高分子電解質は、図１Ａに示すポリ（フェニレンエチニレン）（ＰＰＥ）の誘導体である。蛍光性ポリマースーパークエンチングは、図２０に示すようにキナーゼ／ホスファターゼ活性の検出に適用されてきた。２価又は３価金属イオンは溶液中でアニオン性共役ポリマーと強く会合することができ、修飾及び／又はポリマー蛍光のクエンチングをもたらす。ポリマー−マイクロスフィアアンサンブル上の全体の電荷は調整できるので、金属イオンが特定のリガンドと複合する能力を保持しながらポリマー蛍光を強くクエンチングせずにポリマーと会合することができるプラットホームを与えるように、アンサンブルを構築した。例えば、ＰＰＥ会合Ｇａ3+は、ペプチドがローダミンなどの色素を含む場合に金属イオン介在性ポリマースーパークエンチングが生じるように、リン酸化ペプチドと会合することもできることが見出された。ここで、ビオチン化ペプチド基質を検出するためのプラットホームの適用について説明する。
【０１２０】
例えば、シンチレーション近接（ＳＰＡ）又はストレプトアビジン膜支持体（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｕｐｐｏｒｔ）（ＳＡＭ）を用いる適用においては、洗浄段階は非結合性放射性ＡＴＰ又は非結合性抗ホスホ（ｐｈｏｓｐｈｏ）抗体を反応混合物から分離することを必要とされる。変換基質を保持するために、ビオチン化ペプチドが用いられ、様々なマトリクス上でストレプトアビジン又は他のビオチン結合性タンパク質により固定化されてきた。下記で説明するように、金属イオン介在性スーパークエンチングは、個々の基質又はビオチン−ペプチドライブラリーにおいてキナーゼの活性をスクリーンするのに使用することができる。このアプローチは、研究者が：
１）酵素突然変異体の基質特異性を試験すること；
２）リン酸化パターンを比較することにより、独自の（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）酵素の酵素純度を評価すること；
３）キナーゼに対する蛍光ターン−オンアッセイを提供する、強化された放射を測定すること；及び
４）それにより、ライブラリー中の可視の自己蛍光化合物のスクリーニングを改良するために、検出を赤色に移す適切な色素クエンチャーによる強化された放射を使用すること、
を可能にする。
【０１２１】
例として、ストレプトアビジン結合フルオレセインクエンチャーを、酵素学的に反応させたビオチン化ペプチド基質に添加することができる。このアプローチは、図２０において示す、感度が良くそして選択的なキナーゼ／ホスファターゼアッセイのための基礎を提供する。このアッセイは、洗浄段階又は複雑なサンプル調製を必要としない瞬時の「混ぜて読む」である。
【０１２２】
サンプル中におけるビオチン化ペプチド基質の酵素とのインキュベーション後に、クエンチャー及びビオチン結合性タンパク質（例えば、ストレプトアビジン）のコンジュゲートを添加し、インキュベートしたサンプルと会合させる（例えば、室温で１５分間）。
【０１２３】
下記の実施例４は、タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）に対する確固たるアッセイ、並びに１段階及び２段階アプローチの比較性能を示す。実施例４においては、キナーゼアッセイは蛍光「ターンオフ」アッセイとして機能する。クエンチャーがポリマー蛍光のクエンチングの結果として感作された蛍光を示すことできるので、このアッセイは測定される波長に依存してターンオン又はターンオフのいずれかとして使用することができる。更に、ポリマー及びクエンチャーの蛍光を同時に測定することは、感度の良いレシオメトリックアッセイを提供する。
【０１２４】
実施例４−タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）活性のためのアッセイ
酵素基質として及びホスホ−ペプチドキャリブレータとして使用されるペプチドを下記で説明する。１段階様式におけるＰＫＡ活性の検出用に、
ローダミン−ＬＲＲＡＳＬＧ 配列番号：２
及びキャリブレータペプチド
ローダミン−ＬＲＲＡ（ｐＳ）ＬＧ配列番号：１
が、Ａｎａｓｐｅｃにより合成された。
【０１２５】
２段階様式にけるＰＫＡ活性の検出用に、
ビオチン−ＬＲＲＡＳＬＧ 配列番号：５
及び
ビオチン−ＬＲＲＡ（ｐＳ）ＬＧ 配列番号：６
を、Ａｎａｓｐｅｃから購入した。組み換え体ＰＫＡをＰｒｏｍｅｇａから購入した。ストレプトアビジン結合蛍光剤をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅから得た。ポリスチレン官能基化ビーズをＩｎｔｅｒｆａｃｉａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓから得た。
【０１２６】
ＣＲＴで６０分間アッセイバッファー中において１μＭのペプチド（ローダミン−ペプチド又はビオチン−ペプチドのいずれか）を反応させることにより、１段階アプローチ対２段階アプローチの性能を決定した。２段階プロセスに対しては、５μＬのストレプトアビジン−フルオレセインを添加し、ＣＲＴで１５分間インキュベートした。最後に、検出器バッファー中の１５μＬのセンサーを添加した。４５０ｎｍでの励起、４７５ｎｍでのカットオフフィルター及び４９０ｎｍでの放射にて、ウエルスキャンモードで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＸＳプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ）を用いて、混合物の蛍光を測定した。
【０１２７】
図２１Ａ及び図２１Ｂに示すように、Ｎ末端にクエンチャーを有する合成基質、又はストレプトアビジン−フルオレセインコンジュゲートを添加したビオチン化基質のいずれかを用いて、アッセイを実施した。基質のリン酸化において、ペプチドはリン酸基によりセンサーに会合して蛍光をクエンチングする。
【０１２８】
図２１Ａ及び図２１Ｂは、２段階アプローチにおけるローダミン標識基質又はビオチン化基質を用いたＰＫＡに対する酵素濃度曲線を示すグラフである。このアッセイにおいて得られたＲＦＵを図２１Ａに示し、標準曲線からのバックカリキュレーション（ｂａｃｋｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ）後のリン酸化（％）を図２１Ｂに示す。図２１Ａ及び図２１Ｂにおいては、３８４ウエルの白色Ｏｐｔｉｐｌａｔｅにおいて室温で１時間、連続希釈したキナーゼＰＫＡ酵素を用いて、１μＭの濃度の基質をリン酸化した。インキュベーション後に、５ｐｍｏｌのストレプトアビジン−ローダミンコンジュゲートを添加し、約２２℃で１５分間インキュベートし、その後約１００×１０6のＱＴＬセンサービーズを添加し、そして約２２℃で１０分間インキュベートした。プレートを約２２℃で３０分間インキュベートし、Ｇｅｍｉｎｉ ＸＳプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ）で、４７５ｎｍでのカットオフフィルターを用いて、４５０ｎｍでの励起及び４９０ｎｍでの放射にて、蛍光シグナルを測定した。
【０１２９】
実施例５−ＰＫＡ、ＰＫＣα又はＰＴＰ−１Ｂに対する基質をスクリーニングするためのアッセイ
基質スクリーニングに対しては、１μＭのビオチン−ペプチドを、約２２℃で６０分間アッセイバッファー中において反応させた。コントロール反応は、酵素を含まなかった。その後、５μＬのストレプトアビジン−フルオロセインコンジュゲートを添加し、約２２℃で１５分間インキュベートした。最後に、検出器バッファー中の１５μＬのセンサーを添加した。４５０ｎｍでの励起、４７５ｎｍでのカットオフフィルター及び４９０ｎｍでの放射にて、ウエルスキャンモードで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＸＳプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ）を用いて、混合物の蛍光を測定した。
【０１３０】
図２２は、酵素ＰＴＰ−１Ｂ、ＰＫＣα及びＰＫＡを用いて、キナーゼ又はホスファターゼに対する７つの異なるビオチン化基質のスクリーニングを示す棒グラフである。酵素を用いて又は用いないで反応を行い、ＲＦＵにおける差異を計算しプロットした。図２２から分かるように、リン酸化依存性蛍光クエンチングは適切な基質を含む反応においてのみ検出され、非特異的基質を含む反応では検出されなかった。
【０１３１】
１つの実施態様によると、Ｓｔｅｒｎ−Ｖｏｌｍｅｒクエンチング定数により測定した増幅されたスーパークエンチングのクエンチング感度は、少なくとも５００である。更なる実施態様によると、Ｓｔｅｒｎ−Ｖｏｌｍｅｒクエンチング定数により測定した増幅されたスーパークエンチングのクエンチング感度は、少なくとも１０００、２０００、５０００、１００００、１０００００又は１×１０6である。
【０１３２】
典型的な蛍光剤としては、蛍光性ポリマーが挙げられる。典型的な蛍光性ポリマーとしては、例えばポリ（フェニレンビニレン）などの発光性共役物質が挙げられる。ポリ（フェニレンビニレン）としては、例えばポリ（ｐ−フェニレンビニレン）（ＰＰＶ）、ポリチオフェン、ポリフェニレン、ポリジアセチレン、ポリアセチレン、ポリ（ｐ−ナフタレンビニレン）、ポリ（２，５−ピリジルビニレン）及びそれらの誘導体である。それらの誘導体としては、例えばポリ（２，５−メトキシプロピルオキシスルホネートフェニレンビニレン）（ＭＰＳ−ＰＰＶ）、ポリ（２，５−メトキシブチルオキシスルホネートフェニレンビニレン）（ＭＢＳ−ＰＰＶ）などである。水溶解性に対しては、誘導体としてスルホン酸塩及びメチルアンモニウムなどの、１又は複数のペンダントイオン基を挙げることができる。典型的なペンダント基としては：
−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＯＳＯ3-（Ｍ+）
式中、ｎは整数（例えば、ｎ＝３又は４）、Ｍ+はカチオン（例えば、Ｎａ+又はＬｉ+）；
−（ＣＨ2）n−ＯＳＯ3-（Ｍ+）
式中、ｎは整数（例えば、ｎ＝３又は４）、Ｍ+はカチオン（例えば、Ｎａ+又はＬｉ+）；
−Ｏ−（ＣＨ2）n−Ｎ+（ＣＨ3）3（Ｘ-）
式中、ｎは整数（例えば、ｎ＝３又は４）、Ｘ-はアニオン（例えば、Ｃｌ-）；及び
−（ＣＨ2）n−Ｎ+（ＣＨ3）3（Ｘ-）
式中、ｎは整数（例えば、ｎ＝３又は４）、Ｘ-はアニオン（例えば、Ｃｌ-）、
が挙げられる。
【０１３３】
前述の明細書は本適用の原理を教示するが（説明を目的として提供される例とともに）、一方で、本開示を読むことで、開示の真の範囲から逸脱することなく形態及び細部において様々な変更が可能であるあることが、当業者により十分に理解されるだろう。
【０１３４】
【表２】
【０１３５】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１Ａ】図１Ａ及び図１Ｂは、金属イオン介在性蛍光スーパークエンチングアッセイにおいて使用することのできるポリマーの化学的構造を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ及び図１Ｂは、金属イオン介在性蛍光スーパークエンチングアッセイにおいて使用することのできるポリマーの化学的構造を示す。
【図２】図２は、金属イオン介在性蛍光スーパークエンチングをベースとした、酵素介在性リン酸化又は脱リン酸化活性のためのアッセイの概略図である。
【図３】図３は、ローダミン標識リン酸化ペプチドによるガリウムセンサーのクエンチングに対するＳｔｅｒｎ−Ｖｏｌｍｅｒプロットである。
【図４Ａ】図４Ａ及び図４Ｂは、タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）に対する、エンドポイント及び動態アッセイを示すグラフである。
【図４Ｂ】図４Ａ及び図４Ｂは、タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）に対する、エンドポイント及び動態アッセイを示すグラフである。
【図５】図５は、阻害剤の存在下でのタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）アッセイの応答を示すグラフである。
【図６】図６は、タンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＢ−１Ｂ）のホスファターゼアッセイに対するＥＣ50及び検出の限界を実証するグラフである。
【図７】図７は、タンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＢ−１Ｂ）活性の阻害を示すグラフである。
【図８】図８は、金属イオン介在性蛍光スーパークエンチングをベースとしたプロテアーゼアッセイの概略図である。
【図９】図９は、金属イオン介在性スーパークエンチングをベースとしたタンパク質及びペプチド基質を用いたブロッキングキナーゼアッセイの概略図である。
【図１０】図１０は、例としてＰＫＣαを用いた蛍光ターンオンブロッキングキナーゼアッセイを示すグラフである。
【図１１】図１１は、金属イオン介在性スーパークエンチングを用いたホスホジエステラーゼアッセイの概略図である。
【図１２】図１２は、リアルタイム又は動態アッセイ形態における、トリプシン活性の測定結果を示すグラフである。
【図１３】図１３は、１つの実施態様に従った、リン酸化ポリペプチドの検出を示す。
【図１４】図１４は、１つの実施態様に従った、ビオチン化ペプチド基質（ＢＴ）を用いたアッセイにおける、タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）濃度の関数とした相対的な蛍光を示すグラフである。
【図１５】図１５は、リン酸化及び非リン酸化ヒストンに応答した相対的な蛍光を示す図である。
【図１６】図１６は、更なる実施態様に従った、ビオチン化ペプチド基質（ＢＴ）を用いたアッセイにおける、タンパク質チロシンホスファターゼ−１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ）濃度の関数とした相対的な蛍光を示すグラフである。
【図１７】図１７は、クエンチャー−テザーコンジュゲート（ＱＴ）が金属イオン及び蛍光性ポリマーアンサンブルと会合し、蛍光性ポリマーのスーパークエンチングの増大をもたらすアッセイを示す。
【図１８】図１８は、金属イオン介在性スーパークエンチングアッセイに対するリン酸化ペプチドの較正曲線を示すグラフである。
【図１９】図１９は、金属イオン介在性スーパークエンチングアッセイから得られるタンパク質キナーゼＡの濃度曲線を示す。
【図２０】図２０は、キナーゼ反応への第二段階において添加されるストレプトアビジンクエンチング分子の会合による、金属イオン介在性蛍光スーパークエンチングをベースとしたキナーゼ酵素活性センサーに対する概略図である。
【図２１Ａ】図２１Ａ及び図２１Ｂは、ビオチン化基質及びクエンチャー（例えば、ローダミン）標識基質を用いた２段階アプローチを用いたＰＫＡに対するエンドポイントアッセイを比較したグラフである。ここで、図２１Ａは、ＰＫＡ濃度の関数としてのＲＦＵを示す。
【図２１Ｂ】図２１Ａ及び図２１Ｂは、ビオチン化基質及びクエンチャー（例えば、ローダミン）標識基質を用いた２段階アプローチを用いたＰＫＡに対するエンドポイントアッセイを比較したグラフである。ここで、図２１Ｂは、ＰＫＡ濃度の関数としてのリン酸化（％）を示す。
【図２２】図２２は、３つの異なる酵素（すなわち、ＰＴＰ−１Ｂ、ＰＫＣα及びＰＫＡ）を用いてそれぞれ反応させた、７つの異なるビオチン化ペプチド基質を用いたスクリーンの結果を示す棒グラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１又は複数のリン酸基を含んで成るビオチン化ポリペプチド；及び
該ポリペプチドのリン酸基と会合した金属カチオン、
を含んで成る複合体。
【請求項２】
前記金属カチオンがＧａ3+である、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
蛍光剤を更に含んで成り、当該蛍光剤が１又は複数のアニオン基及び複数の蛍光種であってクエンチャーが当該蛍光剤と会合する際に当該クエンチャーが当該蛍光剤の増幅されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合した複数の蛍光種を含んで成り、当該蛍光剤がビオチン結合性タンパク質と会合し；且つ
当該蛍光剤のアニオン基が前記金属カチオンと会合している、請求項１に記載の複合体。
【請求項４】
前記蛍光剤が蛍光性ポリマーである、請求項３に記載の複合体。
【請求項５】
前記蛍光剤がポリ（ｐ−フェニレンエチニレン）ポリマーである、請求項３に記載の複合体。
【請求項６】
前記蛍光剤が固形支持体の表面と会合している、請求項３に記載の複合体。
【請求項７】
前記固形支持体がマイクロスフィアである、請求項６に記載の複合体。
【請求項８】
前記固形支持体が正に荷電した表面を含んで成り、且つ前記蛍光剤のアニオン基が正に荷電した表面と会合している、請求項６に記載の複合体。
【請求項９】
前記蛍光剤とクエンチャーとが会合する際に当該蛍光剤の増幅されたスーパークエンチングが可能である当該クエンチャーを更に含んで成り、当該クエンチャーが前記ポリペプチドのリン酸基と会合している、請求項３に記載の複合体。
【請求項１０】
前記クエンチャーが有機金属化合物である、請求項９に記載の複合体。
【請求項１１】
前記クエンチャーが鉄（ＩＩＩ）イミノ二酢酸キレートである、請求項１０に記載の複合体。
【請求項１２】
前記蛍光剤と前記ビオチン結合性タンパク質が固形支持体の表面と会合している、請求項３に記載の複合体。
【請求項１３】
サンプル中のキナーゼ又はホスファターゼ酵素分析物の存在及び／又は量を検出する方法であって：
ａ）当該サンプルをビオチン化ポリペプチドとインキュベートすること、ここで、キナーゼ酵素分析物の場合には、当該ポリペプチドは当該分析物によるリン酸化が可能な１又は複数の基を含んで成り、又はホスファターゼ酵素分析物の場合には、当該ポリペプチドは当該分析物による脱リン酸化が可能な１又は複数の基を含んで成る；
ｂ）当該サンプルに金属カチオンを添加すること、ここで、当該金属カチオンはクエンチャーであるか、又は当該方法は当該金属カチオンと会合することのできるクエンチャーを当該サンプルに添加することを更に含んで成る；
ｃ）当該クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、当該クエンチャーが当該蛍光剤の増幅されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合した複数の蛍光種を含んで成る当該蛍光剤を当該サンプルに添加すること、ここで、当該蛍光剤はビオチン結合性タンパク質と会合している；
ｄ）蛍光を検出すること；
を含んで成り、
検出される蛍光が当該サンプル中の分析物の存在及び／又は量を示す前記方法。
【請求項１４】
前記クエンチャーがリン酸化ポリペプチドと会合している、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが前記分析物によるリン酸化可能な基を含んで成り；且つ
当該リン酸化可能な基のリン酸化が蛍光の減少をもたらす、
請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが前記分析物による脱リン酸化可能な基を含んで成り、且つ
当該基の脱リン酸化が蛍光の増加をもたらす、
請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記金属カチオンがＧａ3+である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記蛍光剤が蛍光性ポリマーである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記蛍光剤がポリ（ｐ−フェニレンエチニレン）ポリマーである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記蛍光剤が固形支持体の表面と会合している、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記蛍光剤と前記ビオチン結合性タンパク質が固形支持体の表面と会合している、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
前記固形支持体がマイクロスフィアである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記固形支持体が正に荷電した表面を含んで成り；
前記蛍光剤が１又は複数のアニオン基を含んで成り；且つ
当該蛍光剤のアニオン基が正に荷電した表面と会合している、
請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記クエンチャーが有機金属化合物である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
前記クエンチャーが鉄（ＩＩＩ）イミノ二酢酸キレートである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
インキュベーション後で且つ蛍光を検出する前に、前記蛍光剤、前記クエンチャー、及び前記金属カチオンを前記サンプルに添加する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２７】
インキュベーション前又はインキュベーション中に、前記蛍光剤、前記クエンチャー、及び前記金属カチオンを前記サンプルに添加し、且つ蛍光の検出がインキュベーション中に蛍光を検出することを含んで成る、請求項１３に記載の方法。
【請求項２８】
ａ）キナーゼ又はホスファターゼ酵素活性の阻害剤としての化合物の存在下で、ビオチン化ポリペプチドをキナーゼ又はホスファターゼ酵素とともにサンプル中でインキュベートすること、ここで、キナーゼ酵素アッセイの場合には、当該ポリペプチドは当該分析物によるリン酸化が可能な１又は複数の基を含んで成り、ホスファターゼ酵素アッセイの場合には、当該ポリペプチドは当該分析物による脱リン酸化が可能な１又は複数の基を含んで成る；
ｂ）金属カチオンを当該サンプルに添加すること、ここで、当該金属カチオンはクエンチャーであるか、又は当該方法は当該金属カチオンと会合することのできるクエンチャーを当該サンプルに添加することを更に含んで成る；及び
ｃ）当該クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、当該クエンチャーが当該蛍光剤の増幅されたスーパークエンチングが可能であるように、互いに会合した複数の蛍光種を含んで成る当該蛍光剤を当該サンプルに添加すること、ここで、当該蛍光剤はビオチン結合性タンパク質と会合している；
ｄ）当該化合物の存在下で、当該サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成り、
当該化合物の存在下で検出される蛍光の量が当該化合物のキナーゼ又はホスファターゼ酵素活性における阻害効果を示す、当該化合物をスクリーニングする方法。
【請求項２９】
ａ）第二の化合物の存在下において、前記ビオチン化ポリペプチドをキナーゼ又はホスファターゼ酵素とともに、第二のサンプル中でインキュベートすること；
ｂ）前記蛍光剤、前記クエンチャー、及び前記金属カチオンを、当該第二のサンプルに添加すること；
ｃ）当該第二の化合物の存在下において、当該第二のサンプルからの蛍光を検出すること、
を更に含んで成り、
前記第二のサンプルから検出される蛍光の量がキナーゼ又はホスファターゼ酵素活性における前記第二の化合物の阻害効果を示す、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ビオチン化ポリペプチドを前記キナーゼ又はホスファターゼ酵素とともに、第二のサンプル中においてインキュベートすること、ここで、当該第二のサンプルは前記化合物を欠いている；
ｂ）前記蛍光剤、前記クエンチャー、及び前記金属カチオンを当該第二のサンプルに添加すること；及び
ｃ）当該化合物の不在下において当該第二のサンプルからの蛍光を検出すること、
を更に含んで成り、
前記化合物の不在下において前記第二のサンプルから検出される蛍光の量が、ベースライン（ｂａｓｅｌｉｎｅ）の蛍光である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記化合物の存在下において検出される蛍光を前記化合物の不在下において検出されるベースラインの蛍光と比較すること、
を更に含んで成り、
化合物の存在下において検出される蛍光とベースラインの蛍光との相違は、キナーゼ又はホスファターゼ酵素活性における当該化合物の阻害効果を示す、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
１又は複数のリン酸化可能な又は脱リン酸化可能な基を含んで成るポリペプチド；及び
当該ポリペプチドに接合したクエンチング部分であって、当該クエンチング部分が蛍光性ポリマーと会合する際に当該蛍光性ポリマーの増幅されたスーパークエンチングが可能であるクエンチング部分、
を含んで成る、バイオコンジュゲート。
【請求項３３】
前記クエンチング部分がローダミンである、請求項３２に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項３４】
前記ポリペプチドが１又は複数のリン酸基を含んで成る、請求項３２に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項３５】
前記ポリペプチドが切断部位を更に含んで成り、前記クエンチング部分及び前記リン酸基が当該切断部位の反対側に存在し、且つ当該クエンチング部分が接合する当該切断部位の側にリン酸基が存在しない、請求項３４に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項３６】
前記ポリペプチドが切断部位を更に含んで成り、前記クエンチング部分及び前記リン酸基が当該切断部位の反対側に存在し、且つ当該クエンチング部分が接合する側とは反対の当該切断部位の側にリン酸基が存在しない、請求項３４に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項３７】
サンプル中のプロテアーゼ酵素の存在及び／又は量を検出する方法であって：
ａ）当該プロテアーゼ酵素が当該切断部位で当該ポリペプチドを切断する、請求項３５に記載のバイオコンジュゲートともに、当該サンプルをインキュベートすること；
ｂ）当該クエンチング部分が蛍光剤と会合する際に、当該クエンチング部分が当該蛍光剤の増幅されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合した複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、当該サンプルに添加すること、ここで、当該蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは当該蛍光剤のアニオン基と会合している；及び
ｃ）当該サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成り、
検出される蛍光が当該サンプル中のプロテアーゼ酵素の存在及び／又は量を示す、前記方法。
【請求項３８】
請求項３２に記載のバイオコンジュゲートを含んで成る第一の成分；及び
クエンチング部分が蛍光剤と会合する際に、当該バイオコンジュゲートのクエンチング部分が当該蛍光剤の増幅されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合した複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を含んで成る第二の成分であって、当該蛍光剤が１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンが前記蛍光剤のアニオン基と会合している第二の成分、
を含んで成る、サンプル中のキナーゼ又はホスファターゼ酵素分析物の存在及び／又は量を検出するためのキット。
【請求項３９】
前記蛍光剤が蛍光性ポリマーである、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
前記蛍光剤がポリ（ｐ−フェニレンエチニレン）ポリマーである、請求項３８に記載のキット。
【請求項４１】
前記蛍光剤が固形支持体の表面と会合している、請求項３８に記載のキット。
【請求項４２】
前記固形支持体がマイクロスフィアである、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
前記固形支持体が正に荷電した表面を含んで成り、且つ前記蛍光剤の１又は複数のアニオン基が正に荷電した表面と会合している、請求項４１に記載のキット。
【請求項４４】
前記クエンチング部分がローダミンである、請求項３８に記載のキット。
【請求項４５】
サンプル中の酵素分析物の存在及び／又は量を検出する方法であって：
ａ）サンプルを、請求項３２に記載のバイオコンジュゲートとインキュベートすること、当該バイオコンジュゲートのポリペプチドが当該酵素分析物によりリン酸化可能又は脱リン酸化可能である基を含んで成る；
ｂ）当該クエンチング部分が蛍光剤と会合する際に、当該クエンチング部分が当該蛍光剤の増幅されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合した複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を当該サンプルに添加すること、ここで、当該蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは当該蛍光剤のアニオン基と会合している；及び
ｃ）当該サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成り、
検出される蛍光が当該サンプル中の分析物の存在及び／又は量を示す、前記方法。
【請求項４６】
前記ポリペプチドが前記分析物によりリン酸化可能である基を含んで成り、且つ前記ポリペプチドのリン酸化可能な基のリン酸化が蛍光の減少をもたらす、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ポリペプチドが前記分析物により脱リン酸化可能である基を含んで成り、且つ前記ポリペプチドの脱リン酸化可能な基の脱リン酸化が蛍光の増加をもたらす、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記金属カチオンがＧａ3+である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記蛍光剤が蛍光性ポリマーである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記蛍光剤がアニオン基を含むポリ（ｐ−フェニレンエチニレン）である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記蛍光剤が固形支持体の表面と会合している、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
前記固形支持体がマイクロスフィアである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記固形支持体が正に荷電した表面を含んで成り、且つ前記蛍光性ポリマーのアニオン基が正に荷電した表面と会合している、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記蛍光剤を、インキュベーション後で且つ蛍光を検出する前に前記サンプルに添加する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５５】
前記蛍光剤をインキュベーション前又はインキュベーション中に前記サンプルに添加し、且つ蛍光の検出がインキュベーション中の蛍光の検出を含んで成る、請求項４５に記載の方法。
【請求項５６】
クエンチャーを含んで成る第一の成分；及び
ビオチン化ポリペプチドであって、分析物により修飾されることができ且つ当該クエンチャーと会合した当該分析物により修飾されることができるビオチン化ポリペプチドを含んで成る第二の成分、
を含んで成る、サンプル中の分析物の存在を検出するためのキット。
【請求項５７】
蛍光剤が前記クエンチャーと会合する際に、当該クエンチャーが当該蛍光剤の増幅されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合した複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を更に含んで成る、請求項５６に記載のキット。
【請求項５８】
前記蛍光剤が蛍光性ポリマーである、請求項５７に記載のキット。
【請求項５９】
前記蛍光性ポリマーがポリ（ｐ−フェニレンエチニレン）ポリマーである、請求項５７に記載のキット。
【請求項６０】
前記蛍光剤が固形支持体の表面と会合している、請求項５７に記載のキット。
【請求項６１】
前記固形支持体がマイクロスフィアである、請求項６０に記載のキット。
【請求項６２】
前記分析物が酵素である、請求項５６に記載のキット。
【請求項６３】
前記酵素がキナーゼ又はホスファターゼ酵素である、請求項６２に記載のキット。
【請求項６４】
前記酵素が前記ポリペプチド基質をリン酸化することができ、前記リン酸化ペプチド基質が前記クエンチャーと会合している、請求項６２に記載のキット。
【請求項６５】
前記クエンチャーが有機金属化合物である、請求項５６に記載のキット。
【請求項６６】
前記クエンチャーが鉄（ＩＩＩ）イミノ二酢酸キレートである、請求項５６に記載のキット。
【請求項６７】
サンプル中のホスホジエステラーゼ酵素の存在及び／又は量を検出する方法であって：
ａ）サイクリックＡＭＰ又はサイクリックＧＭＰに接合したクエンチャーを含んで成るバイオコンジュゲートとともに、当該サンプルをインキュベートすること；
ｂ）当該クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、当該クエンチャーが当該蛍光剤の増幅されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合した複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、当該サンプルに添加すること、ここで、当該蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは当該蛍光剤のアニオン基と会合している；及び
ｃ）当該サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成り、
検出される蛍光の量が当該サンプル中のホスホジエステラーゼ酵素の存在及び／又は量を示す、前記方法。
【請求項６８】
前記蛍光剤及び前記金属カチオンを、インキュベーション後で且つ蛍光を検出する前に前記サンプルに添加している、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記蛍光剤及び前記金属カチオンを、インキュベーション前又はインキュベーション中に前記サンプルに添加し、蛍光の検出がインキュベーション中の蛍光の検出を含んで成る、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
ポリペプチド基質のキナーゼ酵素活性を検出する方法であって：
ａ）当該ポリペプチド基質及び１又は複数のリン酸化可能な基を含んで成るクエンチャー標識ポリペプチドを、キナーゼ酵素を含んで成るサンプルとインキュベートすること；
ｂ）当該クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、当該クエンチャーが当該蛍光剤の増幅されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合した複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、当該サンプルに添加すること、ここで、当該蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは当該蛍光剤のアニオン基と会合している；及び
ｃ）当該サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成り、
当該ポリペプチド基質のリン酸化が蛍光の増大をもたらし：且つ
検出される蛍光の量が当該ポリペプチド基質のキナーゼ酵素活性の存在及び／又は量を示す、前記方法。
【請求項７１】
前記ポリペプチド基質が天然のタンパク質である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記蛍光剤及び前記金属カチオンを、インキュベーション後で且つ蛍光を検出する前に前記サンプルに添加する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記蛍光剤及び前記金属カチオンを、インキュベーション前又はインキュベーション中に前記サンプルに添加し、蛍光の検出がインキュベーション中の蛍光の検出を含んで成る、請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
サンプル中の核酸分析物の存在及び／又は量を検出する方法であって：
ａ）ポリヌクレオチドの第一末端領域に当該ポリペプチドに接合したクエンチャーを、及び当該ポリヌクレオチドの第二末端領域にリン酸基を含んで成るポリヌクレオチドとともに、当該サンプルをインキュベートすること、ここで、当該ポリヌクレオチドの第一及び第二末端領域の少なくとも１つの部分が互いにハイブリダイズしてヘアピン構造を形成することができ、且つ当該末端領域の間の当該ポリヌクレオチドの中心領域が、当該核酸分析物にハイブリダイズすることのできる核酸配列を含んで成り、それにより当該ヘアピン構造を崩壊させて、当該ポリヌクレオチドの当該クエンチャーと当該リン酸基の分離をもたらす；
ｂ）当該クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、当該クエンチャーが当該蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合する複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、当該サンプルに添加すること、ここで、当該蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは当該蛍光剤のアニオン基と会合している；及び
ｃ）当該サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成り、
検出される蛍光がサンプル中の核酸分析物の存在及び／又は量を示す、前記方法。
【請求項７５】
サンプル中の核酸分析物の存在及び／又は量を検出する方法であって：
ａ）当該サンプル中の核酸をクエンチャーで標識すること；
ｂ）当該サンプルを、当該ポリヌクレオチドの第一末端領域にリン酸基を含んで成るポリヌクレオチドとインキュベートすること、ここで、当該ポリヌクレオチドは、当該核酸分析物にハイブリダイズすることのできる核酸配列を含んで成る；
ｃ）当該クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、当該クエンチャーが当該蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合する複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、当該サンプルに添加すること、ここで、当該蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは当該蛍光剤のアニオン基と会合している；及び
ｄ）当該サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成り、
当該核酸分析物の当該ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションが蛍光の減少をもたらし；且つ
蛍光の減少が当該サンプル中の核酸分析物の存在及び／又は量を示す、前記方法。
【請求項７６】
サンプル中の核酸分析物の存在及び／又は量を検出する方法であって：
ａ）末端領域にリン酸基を含んで成る第一のポリヌクレオチド、及び末端領域に当該第二のポリヌクレオチドに接合したクエンチャーを含んで成る第二のポリヌクレオチドとともに、当該サンプルをインキュベートすること、ここで、当該第二のポリヌクレオチド及び当該核酸分析物は、当該第一のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる；
ｂ）当該クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、当該クエンチャーが当該蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合する複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、当該サンプルに添加すること、ここで、当該蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは当該蛍光剤のアニオン基と会合し；及び
ｃ）当該サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成り、
当該核酸分析物の当該第一のポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションが蛍光の増大をもたらし；且つ
検出される蛍光の量が当該サンプル中の核酸分析物の存在及び／又は量を示す、前記方法。
【請求項７７】
前記リン酸基が前記第一のポリヌクレオチドの３'末端領域に存在し且つ前記クエンチャーが前記第二のポリヌクレオチドの５'末端領域に存在するか、又は前記リン酸基が前記第一のポリヌクレオチドの５'末端領域に存在し且つ前記クエンチャーが前記第二のポリヌクレオチドの３'末端領域に存在する、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
サンプル中のポリペプチド分析物の存在及び／又は量を検出する方法であって：
ａ）末端領域にリン酸基を含んで成る核酸アプタマーであって、当該ポリペプチド分析物に結合することができる当該核酸アプタマー；及びクエンチャーを含んで成るポリヌクレオチドであって、当該核酸アプタマーにハイブリダイズすることができる当該ポリヌクレオチド、とともに当該サンプルをインキュベートすること；
ｂ）当該クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、当該クエンチャーが当該蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合する複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、当該サンプルに添加すること、当該蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは当該蛍光剤のアニオン基と会合している；及び
ｃ）当該サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成り、
当該ポリペプチド分析物の当該核酸アプタマーへの結合が蛍光の増大をもたらし；且つ
検出される蛍光の量が当該サンプル中のポリペプチド分析物の存在及び／又は量を示す、前記方法。
【請求項７９】
前記リン酸基が前記核酸アプタマーの３'末端領域に存在し且つ前記クエンチャーが前記ポリヌクレオチドの５'末端領域に存在するか、又は前記リン酸基が前記核酸アプタマーの５'末端領域に存在し且つ前記クエンチャーが前記ポリヌクレオチドの３'末端領域に存在する、請求項７６に記載の方法。
【請求項８０】
前記ポリヌクレオチド分析物が天然のタンパク質である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
ビオチン部分を含んで成るポリペプチドであって、当該ポリペプチドの１又は複数のアミノ酸残基がリン酸化又は脱リン酸化が可能であるポリペプチド；及び
クエンチング部分に接合したビオチン結合性タンパク質、
を含んで成り、
ポリペプチドの当該ビオチン部分がタンパク質−タンパク質相互作用によって当該ビオチン結合性タンパク質と会合し；且つ
当該クエンチング部分が当該蛍光剤と会合する際に蛍光剤の増幅されたスーパークエンチングが可能である、複合体。
【請求項８２】
前記ポリペプチドが１又は複数のリン酸基を含んで成る、請求項８１に記載の複合体。
【請求項８３】
前記ポリペプチドのリン酸基と会合する金属カチオンを更に含んで成る、請求項８２に記載の複合体。
【請求項８４】
前記金属カチオンがＧａ3+である、請求項８３に記載の複合体。
【請求項８５】
蛍光剤を更に含んで成り；
当該蛍光剤が、１又は複数のアニオン基、及び当該クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、当該クエンチャーが当該蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合する複数の蛍光種を含んで成り；且つ
当該蛍光剤のアニオン基が当該金属カチオンと会合している、請求項８３に記載の複合体。
【請求項８６】
前記蛍光剤が蛍光性ポリマーである、請求項８５に記載の複合体。
【請求項８７】
前記蛍光剤がポリ（ｐ−フェニレンエチニレン）ポリマーである、請求項８５に記載の複合体。
【請求項８８】
前記蛍光剤が固形支持体の表面と会合している、請求項８５に記載の複合体。
【請求項８９】
前記固形支持体がマイクロスフィアである、請求項８８に記載の複合体。
【請求項９０】
前記固形支持体が正に荷電した表面を含んで成り、且つ前記蛍光剤のアニオン基が正に荷電した表面と会合している、請求項８８に記載の複合体。
【請求項９１】
前記ビオチン結合性タンパク質がストレプトアビジンである、請求項８１に記載の複合体。
【請求項９２】
前記クエンチング部分がフルオロセインである、請求項８１に記載の複合体。
【請求項９３】
サンプル中のキナーゼ又はホスファターゼ酵素分析物の存在及び／又は量を検出する方法であって：
ａ）請求項８１に記載の複合体とともに当該サンプルをインキュベートすること、ここで、キナーゼ酵素分析物の場合には、当該ポリペプチドは分析物によりリン酸化可能な１又は複数の基を含んで成り、ホスファターゼ酵素分析物の場合には、当該ポリペプチドは分析物により脱リン酸化可能な１又は複数の基を含んで成る；
ｂ）当該クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、当該クエンチャーが当該蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合する複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、当該サンプルに添加すること、ここで、当該蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは当該蛍光剤のアニオン基と会合している；及び
ｃ）当該サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成り、
検出される蛍光の量が当該サンプル中の分析物の存在及び／又は量を示す、前記方法。
【請求項９４】
前記蛍光剤及び前記金属カチオンを、インキュベーション後で且つ蛍光を検出する前に前記サンプルに添加する、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記蛍光剤及び前記金属カチオンを、インキュベーション前又はインキュベーション中に前記サンプルに添加し、蛍光の検出がインキュベーション中の蛍光の検出を含んで成る、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
サンプル中のキナーゼ又はホスファターゼ酵素分析物の存在及び／又は量を検出する方法であって：
ａ）キナーゼ酵素分析物のアッセイの場合には、当該分析物によりリン酸化可能な１又は複数の基を含んで成るビオチン化ポリペプチド、或いはホスファターゼ酵素分析物のアッセイの場合には、当該分析物により脱リン酸化可能な１又は複数の基を含んで成るビオチン化ポリペプチドのいずれかとともに、当該サンプルをインキュベートすること；
ｂ）クエンチング部分に接合したビオチン結合性タンパク質を、インキュベートしたサンプルに添加すること；
ｃ）当該クエンチング部分が蛍光剤と会合する際に、当該クエンチング部分が当該蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合する複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、当該サンプルに添加すること、ここで、当該蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは当該蛍光剤のアニオン基と会合している；及び
ｄ）当該サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成り、
検出される蛍光が当該サンプル中の分析物の存在及び／又は量を示す、前記方法。
【請求項９７】
前記蛍光剤及び前記金属カチオンを、インキュベーション後で且つ蛍光を検出する前に前記サンプルに添加する、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記蛍光剤及び前記金属カチオンを、インキュベーション前又はインキュベーション中に前記サンプルに添加し、蛍光の検出がインキュベーション中の蛍光の検出を含んで成る、請求項９６に記載の方法。
【請求項１】
１又は複数のリン酸基を含んで成るビオチン化ポリペプチド；及び
該ポリペプチドのリン酸基と会合した金属カチオン、
を含んで成る複合体。
【請求項２】
前記金属カチオンがＧａ3+である、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
蛍光剤を更に含んで成り、当該蛍光剤が１又は複数のアニオン基及び複数の蛍光種であってクエンチャーが当該蛍光剤と会合する際に当該クエンチャーが当該蛍光剤の増幅されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合した複数の蛍光種を含んで成り、当該蛍光剤がビオチン結合性タンパク質と会合し；且つ
当該蛍光剤のアニオン基が前記金属カチオンと会合している、請求項１に記載の複合体。
【請求項４】
前記蛍光剤が蛍光性ポリマーである、請求項３に記載の複合体。
【請求項５】
前記蛍光剤がポリ（ｐ−フェニレンエチニレン）ポリマーである、請求項３に記載の複合体。
【請求項６】
前記蛍光剤が固形支持体の表面と会合している、請求項３に記載の複合体。
【請求項７】
前記固形支持体がマイクロスフィアである、請求項６に記載の複合体。
【請求項８】
前記固形支持体が正に荷電した表面を含んで成り、且つ前記蛍光剤のアニオン基が正に荷電した表面と会合している、請求項６に記載の複合体。
【請求項９】
前記蛍光剤とクエンチャーとが会合する際に当該蛍光剤の増幅されたスーパークエンチングが可能である当該クエンチャーを更に含んで成り、当該クエンチャーが前記ポリペプチドのリン酸基と会合している、請求項３に記載の複合体。
【請求項１０】
前記クエンチャーが有機金属化合物である、請求項９に記載の複合体。
【請求項１１】
前記クエンチャーが鉄（ＩＩＩ）イミノ二酢酸キレートである、請求項１０に記載の複合体。
【請求項１２】
前記蛍光剤と前記ビオチン結合性タンパク質が固形支持体の表面と会合している、請求項３に記載の複合体。
【請求項１３】
サンプル中のキナーゼ又はホスファターゼ酵素分析物の存在及び／又は量を検出する方法であって：
ａ）当該サンプルをビオチン化ポリペプチドとインキュベートすること、ここで、キナーゼ酵素分析物の場合には、当該ポリペプチドは当該分析物によるリン酸化が可能な１又は複数の基を含んで成り、又はホスファターゼ酵素分析物の場合には、当該ポリペプチドは当該分析物による脱リン酸化が可能な１又は複数の基を含んで成る；
ｂ）当該サンプルに金属カチオンを添加すること、ここで、当該金属カチオンはクエンチャーであるか、又は当該方法は当該金属カチオンと会合することのできるクエンチャーを当該サンプルに添加することを更に含んで成る；
ｃ）当該クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、当該クエンチャーが当該蛍光剤の増幅されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合した複数の蛍光種を含んで成る当該蛍光剤を当該サンプルに添加すること、ここで、当該蛍光剤はビオチン結合性タンパク質と会合している；
ｄ）蛍光を検出すること；
を含んで成り、
検出される蛍光が当該サンプル中の分析物の存在及び／又は量を示す前記方法。
【請求項１４】
前記クエンチャーがリン酸化ポリペプチドと会合している、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが前記分析物によるリン酸化可能な基を含んで成り；且つ
当該リン酸化可能な基のリン酸化が蛍光の減少をもたらす、
請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが前記分析物による脱リン酸化可能な基を含んで成り、且つ
当該基の脱リン酸化が蛍光の増加をもたらす、
請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記金属カチオンがＧａ3+である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記蛍光剤が蛍光性ポリマーである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記蛍光剤がポリ（ｐ−フェニレンエチニレン）ポリマーである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記蛍光剤が固形支持体の表面と会合している、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記蛍光剤と前記ビオチン結合性タンパク質が固形支持体の表面と会合している、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
前記固形支持体がマイクロスフィアである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記固形支持体が正に荷電した表面を含んで成り；
前記蛍光剤が１又は複数のアニオン基を含んで成り；且つ
当該蛍光剤のアニオン基が正に荷電した表面と会合している、
請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記クエンチャーが有機金属化合物である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
前記クエンチャーが鉄（ＩＩＩ）イミノ二酢酸キレートである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
インキュベーション後で且つ蛍光を検出する前に、前記蛍光剤、前記クエンチャー、及び前記金属カチオンを前記サンプルに添加する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２７】
インキュベーション前又はインキュベーション中に、前記蛍光剤、前記クエンチャー、及び前記金属カチオンを前記サンプルに添加し、且つ蛍光の検出がインキュベーション中に蛍光を検出することを含んで成る、請求項１３に記載の方法。
【請求項２８】
ａ）キナーゼ又はホスファターゼ酵素活性の阻害剤としての化合物の存在下で、ビオチン化ポリペプチドをキナーゼ又はホスファターゼ酵素とともにサンプル中でインキュベートすること、ここで、キナーゼ酵素アッセイの場合には、当該ポリペプチドは当該分析物によるリン酸化が可能な１又は複数の基を含んで成り、ホスファターゼ酵素アッセイの場合には、当該ポリペプチドは当該分析物による脱リン酸化が可能な１又は複数の基を含んで成る；
ｂ）金属カチオンを当該サンプルに添加すること、ここで、当該金属カチオンはクエンチャーであるか、又は当該方法は当該金属カチオンと会合することのできるクエンチャーを当該サンプルに添加することを更に含んで成る；及び
ｃ）当該クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、当該クエンチャーが当該蛍光剤の増幅されたスーパークエンチングが可能であるように、互いに会合した複数の蛍光種を含んで成る当該蛍光剤を当該サンプルに添加すること、ここで、当該蛍光剤はビオチン結合性タンパク質と会合している；
ｄ）当該化合物の存在下で、当該サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成り、
当該化合物の存在下で検出される蛍光の量が当該化合物のキナーゼ又はホスファターゼ酵素活性における阻害効果を示す、当該化合物をスクリーニングする方法。
【請求項２９】
ａ）第二の化合物の存在下において、前記ビオチン化ポリペプチドをキナーゼ又はホスファターゼ酵素とともに、第二のサンプル中でインキュベートすること；
ｂ）前記蛍光剤、前記クエンチャー、及び前記金属カチオンを、当該第二のサンプルに添加すること；
ｃ）当該第二の化合物の存在下において、当該第二のサンプルからの蛍光を検出すること、
を更に含んで成り、
前記第二のサンプルから検出される蛍光の量がキナーゼ又はホスファターゼ酵素活性における前記第二の化合物の阻害効果を示す、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ビオチン化ポリペプチドを前記キナーゼ又はホスファターゼ酵素とともに、第二のサンプル中においてインキュベートすること、ここで、当該第二のサンプルは前記化合物を欠いている；
ｂ）前記蛍光剤、前記クエンチャー、及び前記金属カチオンを当該第二のサンプルに添加すること；及び
ｃ）当該化合物の不在下において当該第二のサンプルからの蛍光を検出すること、
を更に含んで成り、
前記化合物の不在下において前記第二のサンプルから検出される蛍光の量が、ベースライン（ｂａｓｅｌｉｎｅ）の蛍光である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記化合物の存在下において検出される蛍光を前記化合物の不在下において検出されるベースラインの蛍光と比較すること、
を更に含んで成り、
化合物の存在下において検出される蛍光とベースラインの蛍光との相違は、キナーゼ又はホスファターゼ酵素活性における当該化合物の阻害効果を示す、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
１又は複数のリン酸化可能な又は脱リン酸化可能な基を含んで成るポリペプチド；及び
当該ポリペプチドに接合したクエンチング部分であって、当該クエンチング部分が蛍光性ポリマーと会合する際に当該蛍光性ポリマーの増幅されたスーパークエンチングが可能であるクエンチング部分、
を含んで成る、バイオコンジュゲート。
【請求項３３】
前記クエンチング部分がローダミンである、請求項３２に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項３４】
前記ポリペプチドが１又は複数のリン酸基を含んで成る、請求項３２に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項３５】
前記ポリペプチドが切断部位を更に含んで成り、前記クエンチング部分及び前記リン酸基が当該切断部位の反対側に存在し、且つ当該クエンチング部分が接合する当該切断部位の側にリン酸基が存在しない、請求項３４に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項３６】
前記ポリペプチドが切断部位を更に含んで成り、前記クエンチング部分及び前記リン酸基が当該切断部位の反対側に存在し、且つ当該クエンチング部分が接合する側とは反対の当該切断部位の側にリン酸基が存在しない、請求項３４に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項３７】
サンプル中のプロテアーゼ酵素の存在及び／又は量を検出する方法であって：
ａ）当該プロテアーゼ酵素が当該切断部位で当該ポリペプチドを切断する、請求項３５に記載のバイオコンジュゲートともに、当該サンプルをインキュベートすること；
ｂ）当該クエンチング部分が蛍光剤と会合する際に、当該クエンチング部分が当該蛍光剤の増幅されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合した複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、当該サンプルに添加すること、ここで、当該蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは当該蛍光剤のアニオン基と会合している；及び
ｃ）当該サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成り、
検出される蛍光が当該サンプル中のプロテアーゼ酵素の存在及び／又は量を示す、前記方法。
【請求項３８】
請求項３２に記載のバイオコンジュゲートを含んで成る第一の成分；及び
クエンチング部分が蛍光剤と会合する際に、当該バイオコンジュゲートのクエンチング部分が当該蛍光剤の増幅されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合した複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を含んで成る第二の成分であって、当該蛍光剤が１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンが前記蛍光剤のアニオン基と会合している第二の成分、
を含んで成る、サンプル中のキナーゼ又はホスファターゼ酵素分析物の存在及び／又は量を検出するためのキット。
【請求項３９】
前記蛍光剤が蛍光性ポリマーである、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
前記蛍光剤がポリ（ｐ−フェニレンエチニレン）ポリマーである、請求項３８に記載のキット。
【請求項４１】
前記蛍光剤が固形支持体の表面と会合している、請求項３８に記載のキット。
【請求項４２】
前記固形支持体がマイクロスフィアである、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
前記固形支持体が正に荷電した表面を含んで成り、且つ前記蛍光剤の１又は複数のアニオン基が正に荷電した表面と会合している、請求項４１に記載のキット。
【請求項４４】
前記クエンチング部分がローダミンである、請求項３８に記載のキット。
【請求項４５】
サンプル中の酵素分析物の存在及び／又は量を検出する方法であって：
ａ）サンプルを、請求項３２に記載のバイオコンジュゲートとインキュベートすること、当該バイオコンジュゲートのポリペプチドが当該酵素分析物によりリン酸化可能又は脱リン酸化可能である基を含んで成る；
ｂ）当該クエンチング部分が蛍光剤と会合する際に、当該クエンチング部分が当該蛍光剤の増幅されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合した複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を当該サンプルに添加すること、ここで、当該蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは当該蛍光剤のアニオン基と会合している；及び
ｃ）当該サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成り、
検出される蛍光が当該サンプル中の分析物の存在及び／又は量を示す、前記方法。
【請求項４６】
前記ポリペプチドが前記分析物によりリン酸化可能である基を含んで成り、且つ前記ポリペプチドのリン酸化可能な基のリン酸化が蛍光の減少をもたらす、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ポリペプチドが前記分析物により脱リン酸化可能である基を含んで成り、且つ前記ポリペプチドの脱リン酸化可能な基の脱リン酸化が蛍光の増加をもたらす、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記金属カチオンがＧａ3+である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記蛍光剤が蛍光性ポリマーである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記蛍光剤がアニオン基を含むポリ（ｐ−フェニレンエチニレン）である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記蛍光剤が固形支持体の表面と会合している、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
前記固形支持体がマイクロスフィアである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記固形支持体が正に荷電した表面を含んで成り、且つ前記蛍光性ポリマーのアニオン基が正に荷電した表面と会合している、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記蛍光剤を、インキュベーション後で且つ蛍光を検出する前に前記サンプルに添加する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５５】
前記蛍光剤をインキュベーション前又はインキュベーション中に前記サンプルに添加し、且つ蛍光の検出がインキュベーション中の蛍光の検出を含んで成る、請求項４５に記載の方法。
【請求項５６】
クエンチャーを含んで成る第一の成分；及び
ビオチン化ポリペプチドであって、分析物により修飾されることができ且つ当該クエンチャーと会合した当該分析物により修飾されることができるビオチン化ポリペプチドを含んで成る第二の成分、
を含んで成る、サンプル中の分析物の存在を検出するためのキット。
【請求項５７】
蛍光剤が前記クエンチャーと会合する際に、当該クエンチャーが当該蛍光剤の増幅されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合した複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を更に含んで成る、請求項５６に記載のキット。
【請求項５８】
前記蛍光剤が蛍光性ポリマーである、請求項５７に記載のキット。
【請求項５９】
前記蛍光性ポリマーがポリ（ｐ−フェニレンエチニレン）ポリマーである、請求項５７に記載のキット。
【請求項６０】
前記蛍光剤が固形支持体の表面と会合している、請求項５７に記載のキット。
【請求項６１】
前記固形支持体がマイクロスフィアである、請求項６０に記載のキット。
【請求項６２】
前記分析物が酵素である、請求項５６に記載のキット。
【請求項６３】
前記酵素がキナーゼ又はホスファターゼ酵素である、請求項６２に記載のキット。
【請求項６４】
前記酵素が前記ポリペプチド基質をリン酸化することができ、前記リン酸化ペプチド基質が前記クエンチャーと会合している、請求項６２に記載のキット。
【請求項６５】
前記クエンチャーが有機金属化合物である、請求項５６に記載のキット。
【請求項６６】
前記クエンチャーが鉄（ＩＩＩ）イミノ二酢酸キレートである、請求項５６に記載のキット。
【請求項６７】
サンプル中のホスホジエステラーゼ酵素の存在及び／又は量を検出する方法であって：
ａ）サイクリックＡＭＰ又はサイクリックＧＭＰに接合したクエンチャーを含んで成るバイオコンジュゲートとともに、当該サンプルをインキュベートすること；
ｂ）当該クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、当該クエンチャーが当該蛍光剤の増幅されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合した複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、当該サンプルに添加すること、ここで、当該蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは当該蛍光剤のアニオン基と会合している；及び
ｃ）当該サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成り、
検出される蛍光の量が当該サンプル中のホスホジエステラーゼ酵素の存在及び／又は量を示す、前記方法。
【請求項６８】
前記蛍光剤及び前記金属カチオンを、インキュベーション後で且つ蛍光を検出する前に前記サンプルに添加している、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記蛍光剤及び前記金属カチオンを、インキュベーション前又はインキュベーション中に前記サンプルに添加し、蛍光の検出がインキュベーション中の蛍光の検出を含んで成る、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
ポリペプチド基質のキナーゼ酵素活性を検出する方法であって：
ａ）当該ポリペプチド基質及び１又は複数のリン酸化可能な基を含んで成るクエンチャー標識ポリペプチドを、キナーゼ酵素を含んで成るサンプルとインキュベートすること；
ｂ）当該クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、当該クエンチャーが当該蛍光剤の増幅されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合した複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、当該サンプルに添加すること、ここで、当該蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは当該蛍光剤のアニオン基と会合している；及び
ｃ）当該サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成り、
当該ポリペプチド基質のリン酸化が蛍光の増大をもたらし：且つ
検出される蛍光の量が当該ポリペプチド基質のキナーゼ酵素活性の存在及び／又は量を示す、前記方法。
【請求項７１】
前記ポリペプチド基質が天然のタンパク質である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記蛍光剤及び前記金属カチオンを、インキュベーション後で且つ蛍光を検出する前に前記サンプルに添加する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記蛍光剤及び前記金属カチオンを、インキュベーション前又はインキュベーション中に前記サンプルに添加し、蛍光の検出がインキュベーション中の蛍光の検出を含んで成る、請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
サンプル中の核酸分析物の存在及び／又は量を検出する方法であって：
ａ）ポリヌクレオチドの第一末端領域に当該ポリペプチドに接合したクエンチャーを、及び当該ポリヌクレオチドの第二末端領域にリン酸基を含んで成るポリヌクレオチドとともに、当該サンプルをインキュベートすること、ここで、当該ポリヌクレオチドの第一及び第二末端領域の少なくとも１つの部分が互いにハイブリダイズしてヘアピン構造を形成することができ、且つ当該末端領域の間の当該ポリヌクレオチドの中心領域が、当該核酸分析物にハイブリダイズすることのできる核酸配列を含んで成り、それにより当該ヘアピン構造を崩壊させて、当該ポリヌクレオチドの当該クエンチャーと当該リン酸基の分離をもたらす；
ｂ）当該クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、当該クエンチャーが当該蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合する複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、当該サンプルに添加すること、ここで、当該蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは当該蛍光剤のアニオン基と会合している；及び
ｃ）当該サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成り、
検出される蛍光がサンプル中の核酸分析物の存在及び／又は量を示す、前記方法。
【請求項７５】
サンプル中の核酸分析物の存在及び／又は量を検出する方法であって：
ａ）当該サンプル中の核酸をクエンチャーで標識すること；
ｂ）当該サンプルを、当該ポリヌクレオチドの第一末端領域にリン酸基を含んで成るポリヌクレオチドとインキュベートすること、ここで、当該ポリヌクレオチドは、当該核酸分析物にハイブリダイズすることのできる核酸配列を含んで成る；
ｃ）当該クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、当該クエンチャーが当該蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合する複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、当該サンプルに添加すること、ここで、当該蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは当該蛍光剤のアニオン基と会合している；及び
ｄ）当該サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成り、
当該核酸分析物の当該ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションが蛍光の減少をもたらし；且つ
蛍光の減少が当該サンプル中の核酸分析物の存在及び／又は量を示す、前記方法。
【請求項７６】
サンプル中の核酸分析物の存在及び／又は量を検出する方法であって：
ａ）末端領域にリン酸基を含んで成る第一のポリヌクレオチド、及び末端領域に当該第二のポリヌクレオチドに接合したクエンチャーを含んで成る第二のポリヌクレオチドとともに、当該サンプルをインキュベートすること、ここで、当該第二のポリヌクレオチド及び当該核酸分析物は、当該第一のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる；
ｂ）当該クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、当該クエンチャーが当該蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合する複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、当該サンプルに添加すること、ここで、当該蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは当該蛍光剤のアニオン基と会合し；及び
ｃ）当該サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成り、
当該核酸分析物の当該第一のポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションが蛍光の増大をもたらし；且つ
検出される蛍光の量が当該サンプル中の核酸分析物の存在及び／又は量を示す、前記方法。
【請求項７７】
前記リン酸基が前記第一のポリヌクレオチドの３'末端領域に存在し且つ前記クエンチャーが前記第二のポリヌクレオチドの５'末端領域に存在するか、又は前記リン酸基が前記第一のポリヌクレオチドの５'末端領域に存在し且つ前記クエンチャーが前記第二のポリヌクレオチドの３'末端領域に存在する、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
サンプル中のポリペプチド分析物の存在及び／又は量を検出する方法であって：
ａ）末端領域にリン酸基を含んで成る核酸アプタマーであって、当該ポリペプチド分析物に結合することができる当該核酸アプタマー；及びクエンチャーを含んで成るポリヌクレオチドであって、当該核酸アプタマーにハイブリダイズすることができる当該ポリヌクレオチド、とともに当該サンプルをインキュベートすること；
ｂ）当該クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、当該クエンチャーが当該蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合する複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、当該サンプルに添加すること、当該蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは当該蛍光剤のアニオン基と会合している；及び
ｃ）当該サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成り、
当該ポリペプチド分析物の当該核酸アプタマーへの結合が蛍光の増大をもたらし；且つ
検出される蛍光の量が当該サンプル中のポリペプチド分析物の存在及び／又は量を示す、前記方法。
【請求項７９】
前記リン酸基が前記核酸アプタマーの３'末端領域に存在し且つ前記クエンチャーが前記ポリヌクレオチドの５'末端領域に存在するか、又は前記リン酸基が前記核酸アプタマーの５'末端領域に存在し且つ前記クエンチャーが前記ポリヌクレオチドの３'末端領域に存在する、請求項７６に記載の方法。
【請求項８０】
前記ポリヌクレオチド分析物が天然のタンパク質である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
ビオチン部分を含んで成るポリペプチドであって、当該ポリペプチドの１又は複数のアミノ酸残基がリン酸化又は脱リン酸化が可能であるポリペプチド；及び
クエンチング部分に接合したビオチン結合性タンパク質、
を含んで成り、
ポリペプチドの当該ビオチン部分がタンパク質−タンパク質相互作用によって当該ビオチン結合性タンパク質と会合し；且つ
当該クエンチング部分が当該蛍光剤と会合する際に蛍光剤の増幅されたスーパークエンチングが可能である、複合体。
【請求項８２】
前記ポリペプチドが１又は複数のリン酸基を含んで成る、請求項８１に記載の複合体。
【請求項８３】
前記ポリペプチドのリン酸基と会合する金属カチオンを更に含んで成る、請求項８２に記載の複合体。
【請求項８４】
前記金属カチオンがＧａ3+である、請求項８３に記載の複合体。
【請求項８５】
蛍光剤を更に含んで成り；
当該蛍光剤が、１又は複数のアニオン基、及び当該クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、当該クエンチャーが当該蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合する複数の蛍光種を含んで成り；且つ
当該蛍光剤のアニオン基が当該金属カチオンと会合している、請求項８３に記載の複合体。
【請求項８６】
前記蛍光剤が蛍光性ポリマーである、請求項８５に記載の複合体。
【請求項８７】
前記蛍光剤がポリ（ｐ−フェニレンエチニレン）ポリマーである、請求項８５に記載の複合体。
【請求項８８】
前記蛍光剤が固形支持体の表面と会合している、請求項８５に記載の複合体。
【請求項８９】
前記固形支持体がマイクロスフィアである、請求項８８に記載の複合体。
【請求項９０】
前記固形支持体が正に荷電した表面を含んで成り、且つ前記蛍光剤のアニオン基が正に荷電した表面と会合している、請求項８８に記載の複合体。
【請求項９１】
前記ビオチン結合性タンパク質がストレプトアビジンである、請求項８１に記載の複合体。
【請求項９２】
前記クエンチング部分がフルオロセインである、請求項８１に記載の複合体。
【請求項９３】
サンプル中のキナーゼ又はホスファターゼ酵素分析物の存在及び／又は量を検出する方法であって：
ａ）請求項８１に記載の複合体とともに当該サンプルをインキュベートすること、ここで、キナーゼ酵素分析物の場合には、当該ポリペプチドは分析物によりリン酸化可能な１又は複数の基を含んで成り、ホスファターゼ酵素分析物の場合には、当該ポリペプチドは分析物により脱リン酸化可能な１又は複数の基を含んで成る；
ｂ）当該クエンチャーが蛍光剤と会合する際に、当該クエンチャーが当該蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合する複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、当該サンプルに添加すること、ここで、当該蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは当該蛍光剤のアニオン基と会合している；及び
ｃ）当該サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成り、
検出される蛍光の量が当該サンプル中の分析物の存在及び／又は量を示す、前記方法。
【請求項９４】
前記蛍光剤及び前記金属カチオンを、インキュベーション後で且つ蛍光を検出する前に前記サンプルに添加する、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記蛍光剤及び前記金属カチオンを、インキュベーション前又はインキュベーション中に前記サンプルに添加し、蛍光の検出がインキュベーション中の蛍光の検出を含んで成る、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
サンプル中のキナーゼ又はホスファターゼ酵素分析物の存在及び／又は量を検出する方法であって：
ａ）キナーゼ酵素分析物のアッセイの場合には、当該分析物によりリン酸化可能な１又は複数の基を含んで成るビオチン化ポリペプチド、或いはホスファターゼ酵素分析物のアッセイの場合には、当該分析物により脱リン酸化可能な１又は複数の基を含んで成るビオチン化ポリペプチドのいずれかとともに、当該サンプルをインキュベートすること；
ｂ）クエンチング部分に接合したビオチン結合性タンパク質を、インキュベートしたサンプルに添加すること；
ｃ）当該クエンチング部分が蛍光剤と会合する際に、当該クエンチング部分が当該蛍光剤の増大されたスーパークエンチングが可能であるように互いに会合する複数の蛍光種を含んで成る蛍光剤を、当該サンプルに添加すること、ここで、当該蛍光剤は１又は複数のアニオン基を更に含んで成り、且つ少なくとも１つの金属カチオンは当該蛍光剤のアニオン基と会合している；及び
ｄ）当該サンプルからの蛍光を検出すること、
を含んで成り、
検出される蛍光が当該サンプル中の分析物の存在及び／又は量を示す、前記方法。
【請求項９７】
前記蛍光剤及び前記金属カチオンを、インキュベーション後で且つ蛍光を検出する前に前記サンプルに添加する、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記蛍光剤及び前記金属カチオンを、インキュベーション前又はインキュベーション中に前記サンプルに添加し、蛍光の検出がインキュベーション中の蛍光の検出を含んで成る、請求項９６に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２２】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２２】
【公表番号】特表２００７−５１６９７３（Ｐ２００７−５１６９７３Ａ）
【公表日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４４０１７（Ｐ２００６−５４４０１７）
【出願日】平成１６年１２月１３日（２００４．１２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０４１４００
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０６０６２６
【国際公開日】平成１７年７月７日（２００５．７．７）
【出願人】（５０６１９７８９７）キューティーエル バイオシステムズ リミティド ライアビリティ カンパニー (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月１３日（２００４．１２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０４１４００
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０６０６２６
【国際公開日】平成１７年７月７日（２００５．７．７）
【出願人】（５０６１９７８９７）キューティーエル バイオシステムズ リミティド ライアビリティ カンパニー (2)
【Ｆターム（参考）】
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