金属ナノ粒子を製造するための方法
本発明は、銀、金、亜鉛、水銀、銅、パラジウム、白金、もしくはビスマスを含む金属のコロイドナノ粒子を含む組成物を製造するための方法であって、金属もしくは金属化合物を細菌と接触させる工程による方法を提供する。本方法の１つの実施形態は、プロバイオティクス細菌を少なくとも４ｍＭの銀塩もしくは金塩を含む水溶液とともにインキュベートする工程を含む。結果として生じるナノ銀含有組成物は、例えば担体に含浸させた場合に高度に有効な抗菌剤、または殺藻剤もしくは除草剤として有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌膜上でのコロイド金属化合物の製造に関する。本発明は、銀もしくは金ナノサイズ粒子を生物学的プロセスによって製造する方法にさらに関する。詳細には、本発明は、金属ナノ析出物、詳細には銀もしくは金ナノ粒子の製造におけるそれらの抗菌効率を改善するための特定条件下での、例えば乳酸桿菌などであるがそれには限定されないプロバイオティクス細菌の使用に関する。本発明は、前記方法によって製造されるコロイドナノ銀もしくはナノ金を含む組成物が含浸された担体を含む殺菌製品にさらに関する。
【背景技術】
【０００２】
効果的な殺菌プロセスは、例えば水、詳細には家庭用および工業用循環水、および廃水（例えば食品加工産業において存在する廃水）などの衛生上、操業上もしくは環境上の理由から未処理のままで排出もしくは再使用することのできない、微生物を含有する極めて大量の汚染物質を処理するために必要である。効果的な殺菌プロセスは、施設、装置、容器、空調システムなどの表面を処理するためにもまた必要である。環境に適合する殺菌プロセスは、主として、過酸化水素などの活性酸素化合物、または単量体の第４級アンモニウム化合物の使用に基づいている。
【０００３】
過酸化水素は、殺菌特性を備える、中等度に活性かつマイルドな殺菌剤である。過酸化水素は２５ｍｇ／Ｌの濃度で一部の細菌の増殖を阻害することが公知であるが、過酸化水素の濃度がはるかに高い場合でさえ、細菌数を効果的に減少させるには多くの時間がかかる、またはさらに紫外線照射を必要とする。しかし、後者を発生させるには、高額の装置および相当の電気料金の両方を必要とする。このため、例えば下水処理場における水およびそれらの生産物を処理するために、水などの大量の汚染物質を殺菌する場合には、そのような手段は事実上不適切および／または不経済である。このため、当分野ではこれらの欠点を克服するための様々な方法が既に試みられてきた。
【０００４】
当分野においては、銀イオンおよび銀をベースとする化合物は微生物にとって高度に毒性であり、このため大腸菌を含む多数の一般種の細菌において強力な殺菌作用を示することは周知である。さらに、銀ナノ粒子と両親媒性超分岐高分子との混成物は、有効な抗菌表面コーティングを提示することも証明されている。非毒性元素である銀のヒドロゾルの形状にある銀ナノ粒子の安定な水性分散液は、５０μｇ／ｃｍ３の濃度で細菌増殖の１００％阻害を引き起こすため、大腸菌に対して強度に殺菌性であることが見いだされている。銀ナノ粒子は、細菌膜中に蓄積し、何らかの形で細菌膜の所定の構築要素と相互作用して、それによって構造変化、分解、そして最後には細胞死を引き起こすことが見いだされている。細菌の表面は、概して、膜内の過剰数のカルボン酸基およびその他の基の解離に起因して、生物学的ｐＨ値では、負に荷電していると報告されている。膜炭素−マトリックス内に包埋された銀ナノ粒子は、マトリックス内部でのそれらの運動および摩擦に起因して表面電荷を生成するので、このように静電力がナノ粒子と細菌との相互作用の原因となっているのではないかと提唱されている。さらに、銀は、細菌膜だけではなくＤＮＡにも含有されているリンおよび硫黄化合物と反応する、さらに高度の親和性を有する傾向がある。可能性がある第３の作用様式は、銀イオンの放出であり、これは銀ナノ粒子の殺菌作用にさらに寄与する可能性がある。
【０００５】
数種の微生物、例えば乳酸桿菌種、および真菌のフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）は、Ａｇ（Ｉ）をそれらの細胞表面に生体吸着させ（ｂｉｏｓｏｒｂ）、還元酵素作用もしくは電子シャトルキノンのいずれかまたは両方によってこのイオンをＡｇ（０）へ還元させることによって解毒すると報告されている。
【０００６】
１〜１００ｎｍのサイズ範囲内にある生物学的に安定化した銀ナノ粒子および前記生物学的に安定化した銀ナノ粒子の濃度が１〜６ｐｐｍの範囲内にある担体を含む非細胞毒性抗菌調製物は、当分野において既に公知である。
【０００７】
さらに、コロイド銀−生体分子錯体を調製するための方法であって：
−単一溶液中の生体分子、銀塩、およびハロゲン化物イオンの起源の混合物を用意する工程と；
−前記混合物を可視領域内の波長を有する光線で照射する工程とを含み、銀塩およびハロゲン化物イオンの起源は水溶性であり、生体分子、銀塩およびハロゲン化物イオンの起源の量は、照射する工程がコロイド銀−生体分子錯体の生成を生じさせるような量である方法もまた公知である。
【０００８】
さらに、ナノサイズのコロイド金属粒子を調製するためのプロセスであって、前記プロセスは、１５〜４０℃の範囲内の温度で、２〜１２０時間に及ぶ期間に渡って湿性真菌もしくは真菌抽出物を金属イオン溶液で処理する工程と、ナノサイズのコロイド金属粒子を得るためにバイオマスを分離する工程とを含むプロセスも開示されている。
【０００９】
銀ナノ粒子を製造するための従来の製造方法は、例えば高額の製造コスト、有意な比率の副産物の産生、または得られるナノ粒子の濃度に対する上限の存在などの多数の欠点を有する。例えば、後者の製造方法は、非常に長い製造時間を必要とし、病原性である可能性がある真菌の使用に基づいている。このため、当分野においては、信頼性が高く、安価で、副産物の生成を減少させる、もしくは回避する銀ナノ粒子を製造するための方法に対するニーズがある。
【００１０】
乳酸桿菌によるＡｇ（Ｉ）生体吸着プロセス、２〜６のｐＨ範囲内にあるそのｐＨ依存性および１０〜６０℃の範囲内の温度依存性、ならびに乳酸桿菌によるＡｇ＋からＡｇ０への還元の機序についてもまた研究されている。
【００１１】
さらにまた当分野においては、銀イオン、アンモニアおよび水酸化ナトリウムとの混合物中のアエロモナス種を用いた、２時間にわたる６０℃での生体内還元によって銀ナノ粒子を調製するためのプロセスもまた公知である。
【００１２】
上記のプロセスは、必要とされる高い温度、酸性ｐＨおよび／または長いインキュベーション時間、またはその結果として生じる銀ナノ粒子の不十分な殺菌活性のような欠点を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
このため当分野においては、これらの欠点を有していない方法によって銀もしくは金ナノ粒子を製造することに対するニーズがある。
【００１４】
さらにまた当分野においては、高い抗菌特性を備える銀もしくは金ナノ粒子を製造するための単純で環境に優しく、そして再現可能な方法に対するニーズがある。
【００１５】
さらに当分野においては、所定の医学的用途において有用であることが公知である金もしくは銀ナノ粒子を製造するための対応する方法に対するニーズがある。
【００１６】
金もしくは銀以外の金属のコロイド形、および前記金属の化合物もまた、貴重な特性および用途を有することが当分野において公知である。例えば、コロイドビスマスサブシト
レートは、詳細には約３〜８のｐＨ範囲内では水溶性であり、胃潰瘍および十二指腸潰瘍、ならびにヘリコバクターピロリ菌感染症の治療のために抗生物質と一緒に数十年間にわたり使用されてきた。水銀、無機水銀化合物および金属水銀軟膏のコロイド形は、感染性湿疹もしくはインペチゴの治療（水銀塩）、梅毒の治療（カロメル）、乾癬の治療（酸化水銀もしくは白降汞）を含む様々な治療使用のために局所的に使用されてきた。パラジウムおよび白金のコロイド形は、有機還元、水素化分解などを含む様々な化学反応のための触媒として使用されてきた。コロイド形にある白金ナノ粒子は、抗癌剤としても公知である。任意にサリチル酸を用いてキレート化されたコロイド銅は、強力な抗炎症薬であり、コロイド銅もしくはコロイド亜鉛の舌下剤形は、風邪および流感と戦うために活性であることが公知である。さらに、コロイド亜鉛は、ウイルスに対して特に有効であり得る。これらすべての様々な分野において、それらの関連適用分野における有効性を向上させるために、また別の物理的形状のコロイド金属もしくはコロイド金属化合物を提供することに対する永続的ニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
極めて広い表現では、本発明は、細菌膜上でコロイド金属化合物を製造するための細菌の使用および被覆された細菌のその後の抗菌剤としての使用に関する。詳細には、本発明は：
・その細菌にその膜上でコロイド金属化合物を作製させる制御されたｐＨ下で、前記細菌と金属塩および他の塩の混合物とを接触させる工程による、コロイド金属化合物を製造するための細菌の使用、および
・膜上の金属化合物で被覆された上記の細菌の、抗菌剤としての使用
とに関する。
【００１８】
１つの実施形態では、本発明は、飲用水、表面コーティングおよびその他の物質において抗菌剤として使用できるプロバイオティクス細菌およびその他の細菌による金属ナノ析出物の製造に関する。
【００１９】
より詳細には、一部の細菌は、Ａｇ（Ｉ）塩を、細胞表面上のナノＡｇ粒子として析出させるコロイドＡｇ（０）へ還元させることができる。コロイド銀もしくは他の金属ナノ析出物で被覆されたバイオマスは、濾過もしくは遠心分離によって水相から容易に採取することができ、洗浄およびすすぎ洗いし、さらに加工処理することができるので、（希釈）懸濁液中およびコーティングに加工された場合の両方において、強力な抗菌特性を備えるコロイド製品を提供する。
【００２０】
興味深いことに、一連のプロバイオティクス細菌、即ちそれらがヒトの消化管系内に存在するとヒトの健康に有益な作用を及ぼすために工業生産されている細菌は、それらの細胞表面上でＡｇナノ析出物を生成する能力を示している。これらの細菌には、プロバイオティクス発酵乳酸桿菌の菌株が含まれるが、それらに限定されない。
【００２１】
塩（ＡｇＮＯ３、ＮＨ４Ｃｌ、ＮａＯＨその他）の特定の組み合わせを細菌の濃縮細胞培養物に添加し、ｐＨを制御することによって、強力な抗菌特性を備えるコロイド銀製品が形成される。所定の細菌菌株と結合した他の金属塩も類似の特性を備えるナノ析出物を生じさせるため、これも同様に本発明の一部である。
【００２２】
「銀の質量」対「生物学的細胞の質量」の比率（Ａｇ：ＣＤＷ、このときＣＤＷ＝細胞乾燥重量である）を調整することによって、最終コロイド銀製品の反応性および特性は、コロイド粒径、コロイド粒子分布およびその他の特性に関して、変化させることができる。
【００２３】
細菌の表面上で生成されたコロイド銀化合物は、水殺菌、洗浄製品中の殺菌剤としての使用、洗浄剤として、抗菌コーティング剤中の調製物、医学的用途、人間の消費、繊維製品中の使用、軟膏剤および潤滑剤における適用、触媒としてなどからなるがそれらに限定されない、極めて広範囲の用途を有する。
【００２４】
製造プロセスは、単純でコスト効率が高く、高い収量を示し、容易に大規模生産することができ、粒子のサイズおよび分布を制御することができ、製造されるナノ銀の抗菌反応性は極めて低濃度（ｐｐｂ）で他のコロイド銀製品より優れている。さらに、製品は様々な形態の下で加工処理することができる：乾燥させて、懸濁化形で、もしくは「湿性」ペレットとして、様々な用途に調製することができる。浄水を用いると活性を損失させずに洗い流すことができるため、最終製品中に化学試薬の残留物は全く存在しない。
【００２５】
プロバイオティクス細菌の使用は、ヘルスケア産業および食品産業における数多くの用途に広がっている。Ａｇ被覆細菌製品は、特に以下の用途に適合するであろう：
・殺菌洗浄製品中の調製物（病院、実験室、動物生産用地その他）、
・飲用水および水泳プール水の両方、動物生産用水、水産養殖用水、任意のその他の多数における水殺菌のためのセラミックフィルタもしくは他のフィルタにおける用途、
・殺菌コーティングにおける用途：ポリマー、織物繊維、金属、
・皮膚殺菌用軟膏、潤滑剤などにおける調製物のために適合する、
・飲用水を殺菌するための用途：新興国、バックパッカー、航空機、およびその他多数（ｅａｓｙ−ｄｒｏｐ法）、および
・効果のある病原体：レジオネラ菌、クリプトスポリジウム菌、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、シュードモナス菌、ブドウ球菌などの様々なタイプの細菌、真菌およびウイルス。
【００２６】
本発明の１つの目的は、優れた品質の金もしくは銀ナノ粒子を提供することである。本発明の第１態様は、コロイド銀もしくは金ナノ粒子を含む組成物を製造するための改良された生物学的方法であって、プロバイオティクス細菌、詳細には発酵乳酸桿菌などの乳酸桿菌種の使用、および前記バイオマスを銀（Ｉ）塩もしくは金（ＩＩＩ）塩の水溶液と接触させる工程を含む方法を提供することである。本発明は、生体内還元により銀もしくは金ナノ粒子を製造するための所定の特異的プロセスパラメータが、結果として生じるナノ粒子の生産効率および特性に大きな影響を及ぼすという予想外の発見に基づいている。詳細には、本発明の特異的方法は、結果として生じる銀ナノ粒子を含む組成物の抗菌活性に大きな影響を及ぼす。
【００２７】
本発明のまた別の態様は、これらの特定条件下で生体内還元によって得られた銀もしくは金ナノ粒子組成物が、それらの活性もしくは保管期間を通しての安定性などの他の関連特性を維持またはさらに改善しながら、さらに加工処理できる、例えばバイオマスから分離できることである。または、例えばこれらの特定条件下で生体内還元により得られた金もしくは銀ナノ粒子組成物の、例えば過酸化物もしくは過酸基塩などの酸化種による化学的後処理は、結果として生じるナノ粒子組成物の特性を一層増強し得る。
【発明の効果】
【００２８】
さらに本発明のプロセスの利点は、結果として生じる銀もしくは金ナノ粒子のサイズおよび分布を再現可能な方法で制御することができることである。
【００２９】
本発明のさらなる利点は、潜在的に毒性および／または高価な化学薬品の必要を減少させることによって、前記方法が有意に短期間内に高度に信頼できる結果を低コストおよび環境に優しい方法で達成することでもある。本発明の方法の結果として生じる組成物中には化学試薬の有害な残留物は大方の場合に残っていないが、それは使用されるバイオマス
が無害の、例えばプロバイオティクス微生物に由来するためである。このために本発明の利点は、本方法が真核生物へ適用された場合に、そのような生物へ実質的に影響を及ぼさない組成物を提供することである。特定の実施形態では、本発明は、実質的に真核生物に影響を及ぼさずに、海洋病原体に対しても作用する高度の抗菌活性を備える組成物を提供する。本発明のさらなる利点は、本発明が、それ自体が高濃度のナノ銀もしくはナノ金を含む、および実質的にそれらの金属状態にある実質的に銀もしくは金によって構成されるナノ銀もしくはナノ金を含む、例えば各々全銀含量の約９５％を超えるＡｇ０または全金含量の約９５％を超えるＡｕ０を含む組成物の製造を可能にすることである。
【００３０】
本発明のまた別の利点は、結果として生じる生成物もしくは組成物は、その活性を維持または改善さえしながら容易かつ安全に加工処理できることである。本組成物は、乾燥させる、または懸濁化形もしくは湿性ペレットとして維持することができ、さらにナノ銀粒子の安定性に起因する抗菌活性に影響を及ぼさずに、例えばエアロゾル調製物もしくは担体への含浸などの様々な形態で調製することができる。
【００３１】
さらにまた別の実施形態では、本発明は、上記の方法によって製造されたコロイド銀組成物の殺藻剤もしくは除草剤としての使用に関する。
【００３２】
用語の定義
本明細書で本発明のために使用する用語「ナノ銀」もしくは「ナノＡｇ」は、金属銀（Ａｇ０）のナノ粒子を意味する。本発明の範囲内では、前記ナノ粒子は、バイオマス上に沈着させられてもさせられなくてもよい。これらのナノ粒子は、サイズが約０．１ｎｍ〜約１００ｎｍ、例えば約０．５ｎｍ〜約５ｎｍの範囲内で変動してよい。これらのナノ粒子は、サイズ分布においてもそれらの平均サイズ前後で変動してよい。
【００３３】
本明細書で本発明のために使用する用語「ナノ金」もしくは「ナノＡｕ」は、金属金（Ａｕ０）のナノ粒子を意味する。本発明の範囲内では、前記ナノ粒子は、バイオマス上に沈着させられてもさせられなくてもよい。これらのナノ粒子は、サイズが約０．１ｎｍ〜約１００ｎｍ、例えば約０．５〜約５ｎｍの範囲内で変動してよい。
【００３４】
本明細書で本発明のために使用する用語「バイオマス」は、「ナノ銀」もしくは「ナノ金」を製造するために使用される細菌種からなる、またはそれらに由来する有機物質を意味する。
【００３５】
本明細書で本発明のために使用する用語「プロバイオティクス細菌」は、適切な量で例えば哺乳動物、海産種（例えば、魚）もしくは人間などの宿主へ投与された場合に、前記宿主の健康に有益な作用を与える細菌を意味する。
【００３６】
本明細書で本発明のために使用する用語「銀（Ｉ）」もしくは「Ａｇ（Ｉ）」は、１価の正に荷電した銀イオンもしくはＡｇ＋を意味する。
【００３７】
本明細書で本発明のために使用する用語「金（Ｉ）」および「金（ＩＩＩ）」は、１価および３価の正に荷電した金イオン各々を意味する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明の１つの実施形態によるナノ銀粒子を様々な濃度で用いた処理が大腸菌の全細胞数および生存率へ及ぼす抗菌作用を示す図である。
【図２】本発明の１つの実施形態によるナノ銀粒子のＸ線回折分析スペクトルを示す図である。
【図３】本発明の１つの実施形態によるナノ銀粒子の製造中の銀対細胞乾燥重量比がネズミチフス菌に対する前記粒子の抗菌活性に及ぼす作用を示す図である。
【図４】本発明のまた別の実施形態によるナノ銀粒子のＸ線回折分析スペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明の第１態様は、コロイドナノ銀もしくはナノ金を含む組成物を製造するための単純な方法であって、プロバイオティクス細菌を少なくとも４ｍＭの銀塩もしくは金塩を含む水溶液とともにインキュベートする工程を含む方法を提供することである。
【００４０】
本発明によると、適切なプロバイオティクス細菌には、例えば乳酸桿菌属、ビフィズス菌属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）などが含まれるが、それらに限定されない。制限なく、プロバイオティクス細菌は、以下の種：ラクトバシラス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ）、ラクトバシラス・アシドフィルス（ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバシラス・カゼイ（ｃａｓｅｉ）、ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバシラス・デルブリュキイの亜種ブルガリア菌（ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、発酵乳酸桿菌、ラクトバシラス・ガッセリ（ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバシラス・ジョンソニイ（ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバシラス・パラカゼイ（ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバシラス・プランタルム（ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバシラス・ロイテリ（ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバシラス・ラムノーサス（ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、大腸菌小体（Ｎｉｓｓｌｅ）、サッカロミセス・ブーラルディ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、バシラス・リシェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシラス・セレウス（ｃｅｒｅｕｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシラス・メガテリウム（ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バシラス・アシドフィルス（ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、バシラス・プミルス（ｐｕｍｉｌｕｓ）、バシラス・ポリフェルメンティクス（ｐｏｌｙｆｅｒｍｅｎｔｉｃｕｓ）、バシラス・クラウジイ（ｃｌａｕｓｉｉ）、バシラス・ラテロスポールス（ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、バシラス・スポロゲネス（ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）、バシラス・コアグラス（ｃｏａｇｕｌａｓ）、およびバシラス・ポリミクサ（ｐｏｌｙｍｙｘａ）の１つまたは複数に属していてよい。
【００４１】
本発明の方法の様々な実施形態のためには、任意の水溶性銀塩を使用できる。本明細書で使用する用語「銀塩」は、そのような銀塩の水和物およびその他の溶媒和物も含んでいる。典型的には、水溶性銀塩は、本明細書では例えば室温のような本発明の方法の実施温度で少なくとも０．１ｇ／Ｌの水溶性を備える銀塩であると定義できる。制限なく、銀塩は、酢酸銀、塩化銀、過塩素酸銀、塩素酸銀、臭化銀、フッ化銀、乳酸銀、硝酸銀、硫酸銀もしくは酒石酸銀などであるがそれらに限定されない無機銀塩もしくは有機銀塩であってよい。
【００４２】
本発明の方法の様々な実施形態のためには、任意の水溶性金塩を使用できる。本明細書で使用する用語「金塩」は、そのような金塩の水和物およびその他の溶媒和物も含んでいる。典型的には、水溶性金塩は、本明細書では例えば室温のような本発明の方法の実施温
度で少なくとも０．１ｇ／Ｌの水溶性を備える金塩である。制限なく、金塩は、１価もしくは３価であってよい。制限なく、金塩は例えば塩化金（ＩＩＩ）、金チオリンゴ酸ナトリウム１水和物、臭化金（ＩＩＩ）、ヨウ化金（ＩＩＩ）および硝酸金（ＩＩＩ）などを含むがそれらに限定されない無機金塩もしくは有機金塩もしくは混合金塩であってよい。
【００４３】
本発明の１つの実施形態によると、インキュベートすべき水溶液中の銀塩もしくは金塩の初期濃度は少なくとも４ｍＭ、例えば少なくとも１０ｍＭ、または特別の例では少なくとも５０ｍＭでなければならない。
【００４４】
本発明のまた別の実施形態によると、前記水溶液は挙動に影響を及ぼしやすい、詳細には結果として生じる組成物の特性を改善するさらなる成分をさらに含んでいてよい。これに関連して、ナノ銀が望ましい本発明の１つの実施形態では、本方法は、プロバイオティクス細菌（例えば先に定義した細菌）を、少なくとも４ｍＭの銀塩を含み、さらにアンモニアおよび／またはアンモニウム塩を含む水溶液とともにインキュベートする工程を含んでいてよい。この実施形態のために適合するアンモニウム塩は、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、ギ酸アンモニウムおよび臭化アンモニウムなどであるが、それらに限定されない。本発明のこの実施形態において使用されるアンモニアおよび／またはアンモニウム塩の量は、好ましくは相当量の銀−アンモニア、または例えばＡｇ（ＮＨ２）＋および／または｛Ａｇ（ＮＨ３）２｝＋の形態の下にある銀（Ｉ）−アンモニア錯体などであるがそれには限定されない銀−アンモニア錯体の形成を可能にするために十分な量でなければならない。本発明のこの実施形態のまた別の変形によると、インキュベートすべき水溶液は、適切な量の例えば水酸化ナトリウムもしくは水酸化カリウムなどであるがそれらに限定されないアルカリ金属水酸化物をさらに含んでいてよい。そのような適切な量は、本明細書中以下に説明するように、達成すべき適切なｐＨ範囲を参照することによって規定できる。
【００４５】
本発明のまた別の実施形態によると、本方法は、プロバイオティクス細菌（例えば、本明細書で先に定義した細菌）を、少なくとも４ｍＭの金塩を含み、適切な量の例えば水酸化ナトリウムもしくは水酸化カリウムなどであるがそれらに限定されないアルカリ金属水酸化物をさらに含む水溶液と、アンモニアおよび／またはアンモニウム塩の不存在下でインキュベートする工程を含んでいる。
【００４６】
例えば水酸化ナトリウムもしくは水酸化カリウムなどであるがそれらに限定されない適切なアルカリ金属水酸化物は、インキュベーション中の水溶液へ約１Ｍまでの濃度で加えることができる。好ましくは、インキュベーションは、ｐＨが少なくとも８である、例えば約８〜約１２の範囲内にある、またはより特定の実施形態では約８．５〜約１１の範囲内にあるような条件下で実施される。
【００４７】
本発明の１つの実施形態によると、銀重量もしくは金重量対プロバイオティクス細菌の細胞乾燥重量（以下、ＣＤＷと略記する）の比率は、少なくとも約０．０１、例えば少なくとも約０．０５もしくは少なくとも約０．１である。本発明のまた別の実施形態によると、Ａｇ：ＣＤＷもしくはＡｕ／ＣＤＷ重量比は約２０を超えない、好ましくは約１０未満、例えば５未満である。
【００４８】
本発明の１つの実施形態によると、本方法のインキュベーション工程は、約５℃〜約４５℃の温度で、好ましくは約１５℃〜約３５℃の温度で、例えば室温で実施される。
【００４９】
本発明のまた別の実施形態として、本方法のインキュベーション工程は、約１秒間〜約３０分間、例えば約５秒間〜約２０分間の期間にわたり実施されてよい。当業者であれば、限定された実験を用いてインキュベーションのために最も適切な期間を、例えば銀塩も
しくは金塩の濃度、インキュベーション温度、Ａｇ：ＣＤＷもしくはＡｕ／ＣＤＷ重量比、アンモニアおよび／またはアンモニウム塩の存在もしくは不存在などを含むがそれらに限定されない他のプロセスパラメータによって決定することができる。当分野において通常のことであるが、インキュベーションは、インキュベーション期間の少なくとも一部の間には攪拌しながら実施することができる。
【００５０】
本発明の方法は、結果として生じるコロイド銀もしくは金ナノ粒子を含む組成物をさらに加工処理する工程をも含むことができる。前記のさらに加工処理する工程は、例えば、バイオマスの少なくとも一部を銀もしくは金ナノ粒子から除去する工程または例えば超音波処理による機械的、酵素的および／または物理化学的処理によってバイオマスを分別する工程などであるがそれらに限定されない１つまたは複数の工程を含むことができる。そのようなバイオマス除去もしくは分別方法の各々は、当業者には周知である。代替的に、もしくは前記に加えて、前記加工処理する工程は、結果として生じるコロイド銀もしくは金ナノ粒子を含む組成物の所定の所望の特性を安定化もしくは改善さえするための化学処理工程を含むことができる。そのような化学的加工処理の特定の実施形態として、本発明による金もしくは銀ナノ粒子組成物は、インキュベーション後、および任意にバイオマスの除去後に、改良された安定性および／または（ナノ銀に関して）より高度の抗菌活性を備える銀もしくは金ナノ粒子析出物を生成するために、例えば過酸化物もしくは過酸基塩などの酸化剤を用いて処理することができる。本発明のこの実施形態の範囲内では、適切な有機および無機過酸化物には、過酸化水素、過酢酸などが含まれるが、それらに限定されない。本発明のこの実施形態において使用するために適切な過酸基塩には、解離すると過酸化水素を形成することのできるアルカリ性水溶性塩、例えばそのような塩が水に溶解させられると過酸化物イオンが遊離するアルカリ性水溶性塩が含まれるが、それには限定されない。それらの適切な例には、例えばアルカリ金属などのカチオンと結合している過炭酸塩、過ホウ酸塩、過ケイ酸塩および過リン酸塩が含まれる。特に好ましいのは、実験式２Ｎａ２ＣＯ３，３Ｈ２Ｏ２を有する過炭酸ナトリウムである。本発明のこの実施形態を支持して、当業者には：
−そのような過酸基塩は殺菌能力に関して過酸化水素より優れている可能性があり、
−過酸化水素は弱い殺菌剤で細菌内への透過性が乏しく、
−過酸基塩が水に溶解させられ過酸化水素を遊離すると、アルカリ塩は遊離した過酸化水素からプロトンを引き出してヒドロペルオキシドイオンを形成するが、これは過酸化水素とは対照的に強力な殺菌剤であり、細菌内へ容易に透過可能である
ことが公知である。
【００５１】
本発明のプロセスの任意の時点に、コロイドナノ銀もしくはナノ金を含む固体部分は、当業者には周知である任意の方法で液体部分から分離することができる。例えば、固体部分は遠心分離およびその後の液体画分のデカンテーション、または濾過によって分離することができる。
【００５２】
本発明の方法では、銀塩もしくは金塩は、例えばｐＨ、インキュベーション温度、塩のタイプおよび塩濃度などであるがそれらに限定されない反応作業条件の１つまたは複数を注意深く調整しながら、少なくとも部分的に銅塩と置換することができる。本発明の方法では、プロバイオティクス細菌種は、例えばｐＨ、インキュベーション温度、塩のタイプ、および（金もしくは銀）塩濃度などであるがそれらに限定されない反応作業条件の１つまたは複数を注意深く調整しながら、少なくとも部分的に別の微生物もしくは細菌と置換することができる。そのような別の細菌は、環境にとって安全であると一般に見なされる細菌、より詳細には生体内還元能力を有することが公知である細菌からなる群から選択することができる。
【００５３】
本発明の方法を主として本明細書では銀および金に関して記載してきたが、それらには
限定されず、その極めて広範な表現において言及されるように、本方法は、例えばｐＨ、インキュベーション温度、塩のタイプ、および塩濃度などであるがそれらに限定されない１つまたは複数の反応作業条件が適切に適応させられることを前提に、他の金属もしくは金属化合物にも適用できる。そのような適応は、本明細書に組み込まれた一般的教示を前提に、当業者の日常的実験の範囲内に含まれる。本発明の範囲内にある特に重要な金属には、亜鉛、水銀、銅、パラジウム、白金、およびビスマスが含まれる。
【００５４】
本発明の第２態様は、上述した方法によって製造されたナノ銀組成物の抗菌使用であるが、これはそのようなナノ銀組成物の抗菌処理における有効濃度は、標的細菌によって、約０．５ｐｐｍ以下、例えば約０．０５ｐｐｍ以下と格別に低い可能性があるという予想外の観察所見、および望ましくない細菌の量の実質的減少が限定された期間内、例えば約５時間以下の間に観察できるという観察所見に基づいている。本発明のこの態様のために適切な細菌標的には、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（例えば、ＣＭＣＭ−２−２２菌株）、シュードモナス・セパシア（ｃｅｐａｃｉａ）、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター・アグロメランス（ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（例えば、ＡＴＣＣ−１００３１菌株）、大腸菌、糞便連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）（例えば、ＡＴＣＣ−１０５４１菌株）、スタフィロコッカス・コーニィ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｈｎｉｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（例えば、ＩＰ５２１５４もしくはＡＴＣＣ−６５３８菌株）、枯草菌（ＡＴＣＣ−１９６５９菌株）（全部が院内細菌株として一般的である）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｃｉｕｍ）、腸内連鎖球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｉｒａｅ）、鉄酸化球菌（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）（例えば、ＡＴＣＣ１３６６１菌株）、乳酸桿菌、高温性バシラス（Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ｂａｃｉｌｌｉ）、トリコフィトン・インタージギターレ（Ｔｒｙｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ）（例えば、ＡＴＣＣ−６４０菌株）、クロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）（ＡＴＣＣ−３５８４菌株）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）（ＡＴＣＣ−１３１２４菌株）、ネズミチフス菌、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）などの広範囲のグラム陽性およびグラム陰性菌が含まれるが、それらに限定されない。本発明のナノ銀組成物は、さらにまた例えばカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）（例えば、ＡＰＣＣ−２０９１菌株）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）（例えば、ＩＰ７３２６菌株）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）（例えば、２１８ＩＰ菌株）、ペニシリウム・ベルコサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ）などを含む真菌に対しても活性である可能性があり、さらに例えばビルハルツ住血吸虫、マンソン住血吸虫などに対する抗寄生虫活性も有する可能性がある。
【００５５】
抗菌（または抗真菌もしくは抗寄生虫もしくは抗ウイルス）使用は、本発明の特定の実施形態によると、液体殺菌組成物の形状にあってよいが、このとき上述した方法によって製造されるナノ銀組成物は、第２抗菌剤もしくはそのような物質の混合物と組み合わせることができる。第２抗菌剤の適切な例には、過酸化水素、第４級アンモニウム塩、過酢酸、過酸基塩（後者は本明細書において本発明の第１態様に関連して記載されている）、および任意の公知の比率でのそれらの混合物が含まれるが、それらに限定されない。詳細には、前記組み合わせは、抗菌活性における相乗作用を提供することができる。特定の実施形態では、前記第２抗菌剤は、例えば二酸化塩素、モノクロラミン、次亜塩素酸塩、過マンガン酸カリウム、ヨウ素もしくは塩素などであるがそれらに限定されない酸化抗菌剤であってよい。本発明のこの実施形態による液体殺菌組成物は、例えば、リン酸、硝酸、硫
酸、臭化水素酸もしくはホウ酸またはそれらの混合物などの１つまたは複数の安定剤を、つまり組成物のｐＨを取り扱いおよび使用のために適切な範囲内に調整する目的でさらに含むことができる。無機酸安定剤の中では、リン酸が特に好ましい。実際に、前記酸安定剤は、一般に既に市販されている等級の過酸化水素には適切な量で組み込まれている可能性がある。本発明において任意に使用される安定剤は、さらに酒石酸、クエン酸（もしくはその水和物）、安息香酸、ピコリン酸、ニコチン酸およびイソニコチン酸などの有機カルボン酸であってよい。無機酸および有機酸の混合物も、この目的に適合すると見なすことができる。前記安定剤は、存在する場合は、好ましくは液体殺菌組成物のｐＨ調整および／または長期間の保存安定性のために有効な量である。本発明のこれらの液体殺菌組成物は、界面活性剤、腐食阻害剤およびフラグランス（香料）からなる群から選択される少なくとも１つの成分をさらに含むことができる。
【００５６】
本発明の殺菌組成物において使用するために適切な界面活性剤には、好ましくは適切な用量で食料品もしくは飲用水と接触するために適合する、例えばカチオン性、非イオン性、両親媒性および両性イオン性界面活性化合物、ならびにそのような化合物の混合物が含まれるが、それらに限定されない。極めて様々な非イオン性界面活性剤が、本明細書で有用な可能性がある。アニオン性界面活性剤の非限定的な例には、例えば、ポリエトキシル化および／またはポリプロポキシル化グリコール、Ｃ８−Ｃ２０脂肪酸モノエステル、ソルビタンモノパルミテートなどからなる群から選択される活性剤が含まれる。適切な両親媒性界面活性剤の特定の例には、３−ドデシルアミノプロピオン酸ナトリウム、３−ドデシルアミノプロパンスルホン酸ナトリウム、Ｎ−アルキルタウリンおよびベタインが含まれる。
【００５７】
本発明の方法によって得られるナノ銀を含む殺菌組成物は、バイオマトリックス中で安定化させることができ、処理、洗浄もしくは汚染除去すべき環境において直接的に、または上記に開示したようにまた別の加工処理後に適用することができる。例えば、ナノ銀粒子は、任意の好適な手段もしくは適用方法によって細菌が除去されるべき場所またはその場所の周囲に分散させることができる。本組成物のナノ銀成分は、細菌の細胞成分と相互作用することができ、それによってそれらを効果的に破壊し、総細菌数を許容レベルへ減少させることができる。
【００５８】
上述したようなナノ銀含有液体組成物の使用は、固体表面または大量の気体もしくは液体を洗浄する、汚染物質を除去する、殺菌もしくは滅菌するためであってよい。本発明による前記液体組成物が（例えば、液体もしくは気体内への分散によって）殺菌もしくは滅菌組成物として使用される場合は、典型的には、当業者であれば殺菌および滅菌の分野における標準知識から容易に決定できる濃度および適用時間を含む適切な条件において適用される。
【００５９】
本発明の液体殺菌ナノ銀含有組成物が固体表面に適用される場合は、安全規制のために、適切な量の濃縮組成物を水と混合する工程によって得られる直ちに使用できる希釈調製物を使用し、次に前記固体表面をそのような時間中に得られる希釈調製物で固体表面の完全湿潤が達成されるまで湿潤させる（これは、当業者には公知であるように、表面多孔性に左右される可能性がある）ことが好ましい。
【００６０】
当業者には理解されるように、ナノ銀含有殺菌液体組成物の好ましい使用量は、処理すべき固体表面上、または液体もしくは気体内に存在する微生物のタイプおよび量に伴って広範囲に変動するであろう。
【００６１】
本発明によるナノ銀含有液体組成物の上記の殺菌剤としての使用に関しては、より特別には下記の適用方法が推奨されている：
−前記ナノ銀含有組成物中への処理すべき製品の浸漬、
−処理すべき固体表面上への殺菌組成物の噴霧、および
−処理すべき水（特別には水泳プール水、工業用プロセス水、廃水など）の中への（希釈もしくは濃縮した）殺菌組成物の組み込み。
【００６２】
このために、本発明によるナノ銀含有殺菌液体組成物は、特別には：
（ａ）病院および研究室施設、工業施設（牛乳製造所、チーズ製造所、麦芽製造所、醸造所、ミネラルウォータ、ワイン、蒸留酒、フルーツジュースおよび野菜ジュースを製造するための施設；温室；牛舎、鶏小屋および馬小屋；食料品、飲料もしくは医薬品の包装ライン；航空機および汽船の内部）および前記施設の内容物、詳細には前記施設内の装置もしくは機器の殺菌および衛生；
（ｂ）早産動物もしくは成長中の無菌動物のための培養器などの無菌囲いの滅菌；
（ｃ）空調システム内のレジオネラ菌の処理；
（ｄ）保存容器（詳細にはサイロ）および例えば食料品（砂糖、茶、コーヒー、シリアル、飲料）および動物用飼料などの液体もしくは固体製品を輸送するためのパイプラインの殺菌および衛生；
（ｅ）水泳プールおよびその他の鉱泉療法設備の殺菌および衛生（この場合には、組成物は好ましくは界面活性剤非含有であろう）；
（ｆ）飲用水（例えば、井戸もしくは貯蔵容器内）を製造、輸送および貯蔵するためのシステムの殺菌（この場合には組成物は、好ましくは界面活性剤非含有であろう）；および
（ｇ）その殺菌、殺真菌、抗ウイルスおよび抗寄生虫特性による、屋外作物（例えば、シリアル、トマト、バナナ園、例えばチコリー、種子、塊根を含む水耕栽培など）の保護のために有用である。
【００６３】
本発明の方法によって得られるナノ銀組成物の高度の選択的な抗菌活性は、例えば医学的用途またはヒトもしくは動物が消費するための栄養もしくはその他の物質の加工処理において使用するため（特に真核細胞もしくは微生物への作用の不存在もしくは最小限の作用に起因して）、繊維製品の抗菌保護において使用するため、例えばクリーム剤、軟膏剤もしくはローション剤などであるがそれらに限定されない曝露させた組織の感染性もしくは微生物汚染を防止するための局所用医学的製剤において使用するため、または化学的もしくはその他の変換プロセスにおける触媒として使用するための、水の殺菌、水中の藻の繁殖の処理、洗浄製品、および抗菌コーティングの調製物などであるがそれらに限定されない広範囲の家庭用途ならびに工業用途を有する。上述した使用各々は、懸濁液中のナノ銀によって、ならびにポリマーおよび／または他のタイプのコーティング内にナノ銀を組み込むことによって達成できる。
【００６４】
本発明の第３態様は、驚くべきことに飲用水中、水族館もしくは池もしくは水泳プールの水中、または淡水もしくは海水を含む他の貯水容器中、ポリマーおよび塗料中、軟質ファウリング（審美的外観）もしくは硬質ファウリング（物質の劣化）に対して保護するための表面コーティング中および他の材料中において殺藻剤として使用できる、プロバイオティクス細菌およびその他の細菌による金属ナノ析出物の製造に関する。本発明の第４態様は、水中の希釈形において、または機械的、酵素的および／または生化学的手段によってさらに加工処理された場合の両方において、驚くべきことに所定の双子葉植物もしくは単子葉植物に対する除草作用、または苔のような様々なタイプの下等植物に対する作用を有する可能性があるプロバイオティクス細菌およびその他の細菌による金属ナノ析出物の製造に関する。このための関連植物の選択は、本発明の臨界的パラメータではない。このために適切な植物には、特に、例えばタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ウキクサ（Ｌａｍｎａ種）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、リンゴ、テンサイ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、アルファルファ、ペチュ
ニア、ワタ、ニンジン、セロリ、キャベツ、キュウリ、コショウ、カノーラ、トマト、ジャガイモ、レンズマメ、アマ、ブロッコリ、マメ、レタス、アブラナ、カリフラワー、ホウレンソウ、芽キャベツ、アーティチョーク、エンドウ、オクラ、カボチャ、ケール、カラードグリーン、茶、コーヒーおよびセラギネラ・レピドフィラ（Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａ ｌｅｐｉｄｏｐｈｙｌｌａ）などの双子葉植物が含まれる。それらはさらに、コメであるオリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、コーン、オオムギ、トウモロコシ、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、コムギ、オート麦、キビ、ソルガム、アマランス、タマネギ、アスパラガスおよびサトウキビなどの単子葉植物も含んでいる。
【００６５】
本発明の上記の態様は、特に以下の分野において有用である：
−水族館の水、動物およびヒトのための飲用水配水システム、園芸用の配水システム、池、水泳プール、池もしくは水泳プールからの水を処理するための濾過システム、および様々なタイプの散水システムにおける藻類増殖の阻止；
−船殻などの水と接触する表面を含む、表面上の藻類増殖の阻止；
−藻類、および植物のような高等生物の表面上での藻類増殖を含む藻類に対する表面処理のための塗料、ポリマーもしくはコーティングにおける使用；
−葉、幹、花もしくは根茎のコロイド銀への、例えば上述した製造方法によってプロバイオティクス細菌によって生成されてその上に析出したコロイド銀への曝露による、苔または他の望ましくない植物（双子葉植物もしくは単子葉植物両方）の増殖の阻害；および
−これらの表面をコロイド銀へ、例えば上述した製造方法によって細菌により生成されてその上に析出したコロイド銀へ曝露させることによる、表面上の所定の植物もしくは雑草の増殖の阻害。
【００６６】
以下の実施例は、何ら限定的意図なく、本発明による方法および殺菌組成物の所定の実施形態の例示として提供されている。
【００６７】
実施例１−ナノ銀の調製
発酵乳酸桿菌の培養物Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋ １９０１ ＡＬ（ＡＴＣＣ１１９７６、ＬＭＧ８９００、生後８日の母乳栄養児の腸由来）を１５時間にわたり３７℃の微好気性条件下で、ＭＲＳブロス（Ｏｘｏｉｄ社（英国ベイジングストーク）から市販されている）中で増殖させた。細胞は、ＭＲＳから１５℃で１０分間にわたる３，０００ｇでの遠心分離によって採取し、次にｍｉｌｌｉＱ水を用いて２回洗浄し、６００ｎｍで１．５の最終光学密度（ＯＤ６００）までｍｉｌｌｉＱ水中に再懸濁させた。ＮａＯＨの最終濃度が各々０．０５Ｎおよび０．１０Ｎに達するように、細胞懸濁液に１ＮのＮａＯＨストック溶液からの水酸化ナトリウムを加えた。
【００６８】
５０ｍＬのｍｉｌｌｉＱ水中に４２５ｍｇのＡｇＮＯ３および２２５ｍｇのＮＨ４Ｃｌを含むＡｇ（Ｉ）ストック溶液を調製した。１容積のこのＡｇ（Ｉ）ストック溶液を、各々０．０５および０．１０ＮのＮａＯＨを含む１０容積の細胞懸濁液に加えた。これらの混合液は、３０分間にわたり軽度の攪拌条件（シェーカ上で１００回転／分）下で、２５℃の可視光線下でインキュベートさせた。発酵乳酸桿菌バイオマス上に沈着させた、本明細書では「ナノ銀」もしくは「ナノＡｇ」と呼ぶ５．０ｍＭのＡｇ（０）（５３５ｍｇ／ＬのＡｇ（０））の最終溶液を得た。被覆された発酵乳酸桿菌細胞は、繰り返し遠心分離し、デカンテーションし、本組成物を新しいｍｉｌｌｉＱ水中に再懸濁させることによって、増殖培地残留物および他の添加物を除去するために、遠心分離し、ｍｉｌｌｉＱ水で３回洗浄した。その結果として最終ナノＡｇ濃度が調整された。本組成物を次にｍｉｌｌｉＱ水で希釈し、または３，０００ｇでの遠心分離によって濃縮し、そしてエンドユーザーのニーズに応じてｍｉｌｌｉＱ水中に再懸濁させた。
【００６９】
実施例２−ナノ銀のＸＲＤ分析
実施例１において得て、さらに３０℃で乾燥させた銀粒子を備えるバイオマスについてのＸ線回折（ＸＲＤ）分析は、Ｂｒａｇｇ−Ｂｒｅｎｔａｎｏ光学素子を備えるＳｉｅｍｅｎｓ回折計Ｄ５０００（Ｓｉｅｍｅｎｓ社（ドイツ国ミュンヘン）から市販されている）を用いて実施した。Ｘ線は、出力１．６ｋＷ（４０ｋＶ、４０ｍＡ）を備える銅Ｘ線管によって発生させた。測定は、１．６秒のステップ時間および０．０２度のステップサイズを用いて２５〜９０度の２θの間で実施した。結果として生じるスペクトル（図示していない）は、銀金属と酸化ナトリウムのＸ線回折パターンの存在を示している。後者は、ナノ銀の調製において使用された水酸化ナトリウムの残留物である。
【００７０】
実施例３−ナノ銀のＥＤＸ分析
実施例１において得て、さらに３０℃で乾燥させたナノ銀を備える乾燥バイオマスのエネルギー分散Ｘ線（ＥＤＸ）分析は、２０．０ｋｅＶの入射エネルギーに対応する分解能を備えるＥＤＸ検出器（ＪＥＯＬ ＵＳＡ社から入手可能）とともにＪＳＭ６１００走査型電子顕微鏡を用いて実施した。分析結果は表１に列挙されており（重量％および原子％の両方）、主として有機物質（高含量の炭素および酸素に起因する）および銀の存在を明らかに証明しており、それらの組み合わせは総計で乾燥物質の約９１重量％である。乾燥した生成物の残りは、ほとんどは乾燥した生物学的マトリックス由来の鉱物残留物に起因する微量元素Ｃａ、Ｍｇ、Ｓｉ、Ｐ、ＳおよびＣｌから構成された。
【００７１】
【表１】
【００７２】
実施例４−大腸菌についての固体増殖培地上のナノ銀の抗菌活性
実施例１において得た発酵乳酸桿菌バイオマス上に沈着させたナノ銀の形状にある、５ｍＭのＡｇ濃度を備える１００ｍＬの銀懸濁液を、大腸菌を培養するための固化増殖培地（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ寒天）上にプレーティングした。コントロールとして０．１ＮのＮａＯＨを含む無菌ｍｉｌｌｉＱ水中の５ｍＭのＡｇＮＯ３の溶液１００ｍＬを同一増殖培地上にプレーティングした。この設定は、１枚の寒天プレート当たり０．０５ｍｇのＡｇ、または総表面積１ｍ２当たり１１ｍｇのＡｇの総量と一致していた。この実験は、後者の濃度の２倍、即ち寒天プレート１枚当たり０．１１ｍｇのＡｇまたは総表面積１ｍ２当たり２２ｍｇのＡｇを用いて繰り返した。
【００７３】
これらの銀懸濁液をプレーティングすることによって、Ａｇ（Ｉ）ＮＯ３、またはナノ
Ａｇ各々の均質層を固化増殖培地上に塗布した。
【００７４】
この方法で固化した増殖培地を前処理した後、生理溶液（８．５ｇ／ＬのＮａＣｌ／無菌水）中の１００μＬの２×１０６ＣＦＵ／ｍＬの大腸菌懸濁液を前処理した寒天プレート上にプレーティングした。プレートを次に３０℃で２４時間にわたりインキュベートし、コロニーを計数した。計数の結果は、図１に示されている。１１ｍｇ／ｍ２のＡｇおよび２２ｍｇ／ｍ２のＡｇのナノＡｇ濃度では、処理された固体増殖培地上で大腸菌の生存細胞を検出することはできなかった（＜検出限界（Ｄ．Ｌ．）＝１×１０１ＣＦＵ／ｍＬ）。このように、これらの濃度でのナノＡｇ処理は、２×１０６ＣＦＵ／ｍＬから１×１０１ＣＦＵ／ｍＬ（Ｄ．Ｌ．）未満への大腸菌細胞の減少を生じさせた。１１ｍｇ／ｍ２のＡｇおよび２２ｍｇ／ｍ２のＡｇを含むＡｇ（Ｉ）ＮＯ３濃度では、２×１０６ＣＦＵ／ｍＬから各々４×１０２ＣＦＵ／ｍＬおよび１×１０２ＣＦＵ／ｍＬへの有意な大腸菌細胞減少が見られた。
【００７５】
コントロールとして、濃度が２×１０６ＣＦＵ／ｍＬの大腸菌懸濁液を未処理、即ちＡｇを含まない増殖培地上、およびナノＡｇを含まないがナノＡｇ処理と同一濃度で発酵乳酸桿菌ＡＴＣＣ１１９７６だけを含む１００μＬの無菌ｍＱ水を用いて処理した同一増殖培地上へプレーティングした。これらの細菌の総数では阻害作用は観察されなかった。この結果として、ナノＡｇおよびＡｇ（Ｉ）について観察された阻害作用はＡｇ処理に帰することができ、この実験で使用した処理方法もしくは乳酸桿菌菌株のいずれにも帰することはできない。
【００７６】
実施例５−様々な病原細菌についての懸濁液中の抗菌活性
実施例１で得た様々な濃度（０ｍｇ／Ｌ、０．１０ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌおよび５０ｍｇ／Ｌ）のナノＡｇ組成物を含有する生理溶液中に希釈した病原性大腸菌、ネズミチフス菌、黄色ブドウ球菌およびリステリア・モノサイトゲネス培養菌の生存率を試験した。ナノＡｇは、上述した病原細菌の１つの生きた培養菌を含有する生理溶液中に適用した。生理溶液は、水１Ｌ当たり８．５ｇのＮａＣｌを含んでおり、細菌細胞に向かって中性の浸透ポテンシャルを有するように調製されており、したがって浸透ストレスに起因してそれらを殺滅しない。コントロール処理は、ナノＡｇの不存在下での生理溶液中の細菌培養から構成した。
【００７７】
１００ｍｇ／ＬのナノＡｇ／ｍＱ水のストック溶液を調製し、表２に示した最終ナノＡｇ濃度を達成するために適合する量で生理溶液中に希釈した細菌培養物に加えた。
【００７８】
処理は、上述した各病原細菌種について独立して繰り返したが、「細菌培養物」は生理溶液中で１０４〜１０５ＣＦＵ／ｍＬの最終細胞濃度へ希釈した、指数的増殖期にある細菌種を含む希釈した液体ブロスを表している。各処理は、２回ずつ実施した。全インキュベーションは、３７℃で７２時間にわたって振とうしながらインキュベートした無菌のキャップ付き試験管内で実施した。インキュベーション後、１００μＬの各試験管はトリプチカーゼソイ寒天（ＴＳＡ）固体増殖培地上にプレーティングし、コロニーを計数した。これらの計数の結果は、試験した様々な病原体について表２に示されている。
【００７９】
【表２】
【００８０】
表２は、実施例１で得たナノＡｇの１ｍｇ／Ｌの濃度が、７２時間以内に大腸菌、黄色ブドウ球菌およびネズミチフス菌の生存細胞数を＜１０ＣＦＵ／ｍＬ（即ち、検出限界未満）の細胞濃度へ減少させるために十分であったことを示す。有意な細胞死は、０．１０ｍｇ／Ｌの濃度で既に観察された。リステリア菌に関しては、生存細胞の濃度の検出限界未満への減少は、１０ｍｇ／ＬのナノＡｇで得られた。そこで本発明者らは、実施例１で得たナノＡｇが、液体細胞懸濁液中での１．０ｍｇ／Ｌ以下の濃度で、液体から生存病原性細菌を有意かつ効果的に排除する強力な抗菌剤として作用すると結論づける。
【００８１】
実施例６−アルテミア・フランシスカーナ（Ａｒｔｅｍｉａ ｆｒａｎｃｉｓｃａｎａ）と組み合わせた懸濁液中のナノＡｇの抗菌活性
無菌人工海水（Ａｑｕａｒｉｕｍ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＵＳＡ社から入手可能なＩｎｓｔａｎｔ Ｏｃｅａｎ（登録商標））は、オートクレーブ滅菌処理によりｍｉｌｌｉＱ水中で調製した。全処理は、５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブ中の無菌人工海水の２０ｍＬアリコート中で構成した。各処理（３回ずつ実施した）は、１０５ＣＦＵ／ｍＬ（コロニー形成単位）のビブリオ・カンベリイ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃａｍｐｂｅｌｌｉｉ）ＬＭＧ２１３６３および／または表３に示した最終濃度で実施例１において得たナノＡｇの組み合わせが補給された、２０ｍＬの人工海水中の２０例の無菌アルテミア・ナウプリウス（Ａｒｔｅｍｉａ ｎａｕｐｌｉｕｓ）から構成した。そこで病原性細菌であるＶ．カンベリイをその宿主生物であるアルテミア・フランシスカーナと一緒にインキュベートした。
【００８２】
以下の試験を構成した：
−アルテミア・フランシスカーナ＋１０５ＣＦＵ／ｍＬのビブリオ・カンベリイ
−アルテミア・フランシスカーナ＋１０５ＣＦＵ／ｍＬのビブリオ・カンベリイ＋１００ｍｇ／ＬのナノＡｇ
−アルテミア・フランシスカーナ＋１０５ＣＦＵ／ｍＬのビブリオ・カンベリイ＋１０ｍｇ／ＬのナノＡｇ
−アルテミア・フランシスカーナ＋１０５ＣＦＵ／ｍＬのビブリオ・カンベリイ＋１．０ｍｇ／ＬのナノＡｇ
−アルテミア・フランシスカーナ＋１０５ＣＦＵ／ｍＬのビブリオ・カンベリイ＋０．１ｍｇ／ＬのナノＡｇ
−アルテミア・フランシスカーナ＋０．１０ｍｇ／ＬのナノＡｇ
−アルテミア・フランシスカーナ＋１００ｍｇ／ＬのナノＡｇ
−アルテミア・フランシスカーナ＋１０ｍｇ／ＬのナノＡｇ
−アルテミア・フランシスカーナ＋１．０ｍｇ／ＬのナノＡｇ、および
−アルテミア・フランシスカーナ＋０．１０ｍｇ／ＬのナノＡｇ
４８時間のインキュベーション後、アルテミア・フランシスカーナを含む無菌人工海水中のＶ．カンベリイの濃度を、特異的ビブリオ菌増殖培地上でのプレート計数によって決定した。平均的処理結果は、以下の表３に示されている（このとき、Ｄ．Ｌ．は検出限界を意味する）。
【００８３】
【表３】
【００８４】
さらにその上、０．１０および１．０ｍｇ／ＬのナノＡｇの濃度では、未処理コントロールに比較してアルテミア・フランシスカーナの生存率（８０％）に対する有意な作用は生じなかった。これは、実施例１によって生成されたナノＡｇが、高等生物にはこれらの濃度では毒性もしくは阻害作用を有していないことを示している。
【００８５】
実施例７−抗菌活性のための有効な接触時間の決定
本試験の目的は、各々０．１および１ｍｇ／Ｌの濃度のＡｇで有効な抗菌活性を得るために、実施例１のナノＡｇ組成物と生理溶液中に希釈した病原性細菌培養物である大腸菌、ネズミチフス菌、黄色ブドウ球菌もしくはリステリア・モノサイトゲネスとの適切な接触時間を決定することであった。
【００８６】
これらのナノＡｇ濃度を、細菌細胞に対して中性であり、したがって浸透ストレスに起因してそれらを殺滅しない浸透ポテンシャルを有するように調製された生理溶液（８．５ｇ／ＬのＮａＣｌ／水）中の細菌培養物に適用した。コントロール処理は、ナノＡｇ組成物を含まない生理溶液中の細菌培養から構成した。
【００８７】
１００ｍｇ／ＬのナノＡｇ／ｍＱ水のストック溶液を調製し、所望の最終ナノＡｇ濃度を提供するために適切な量で生理溶液中の細菌培養物（実施例５と同一の意味）へ加えた。
【００８８】
インキュベーション（２回ずつ実施した）は、３７℃で振とうすることによって無菌のキャップ付き試験管内で実施し、その後に様々な接触時間での細胞数を決定した（サンプリング事象）。各サンプリング事象時に、各処理物の１００μＬをトリプチカーゼソイ寒天（ＴＳＡ）固体増殖培地上にプレーティングし、コロニーを計数した。１５時間後、１６時間後、１７時間後、１８時間後および４０時間後各々に得られた結果は、以下の表４に示されている（このとき、ＮＤは検出不可能、即ち検出限界未満であることを意味している）。
【００８９】
【表４】
【００９０】
実施例８−様々な銀重量対バイオマス細胞乾燥重量比でのナノ銀組成物の調製
銀（Ｉ）のストック溶液は、ＡｇＮＯ３の最終濃度が４２５ｇ／Ｌ（＝５０ｍＭのＡｇＮＯ３）である液体アンモニア（水中で２８容量％のＮＨ３）中で調製した。発酵乳酸桿菌の培養物は、次に実施例１と同様に調製した。
【００９１】
遠心分離した２．８ｇ（湿重量）の細胞ペレットを、各々Ａ、ＢおよびＣと呼ばれる反応混合液を得るために３つの異なる量（５０ｍＬ、１００ｍＬおよび１Ｌ）のｍｉｌｌｉＱ水中に再懸濁させた。
【００９２】
上述した懸濁液中の０．１０ＮのＮａＯＨの規定度を得るために、ＮａＯＨはｍｉｌｌ
ｉＱ水中の１ＮのＮａＯＨストック溶液から各試験管に加えた。
【００９３】
結果として、銀（Ｉ）ストック溶液を以下のように加えた：
−反応混合液Ａ：Ａｇの１．３０ｇ／Ｌ（もしくは１２ｍＭ）の最終濃度を得るために、０．２４ｍＬの銀（Ｉ）ストック溶液を加えた。５６ｇ／Ｌのバイオマス（湿重量）上でほぼ即時の析出反応（赤みがかった褐色の析出物）が発生した。遠心分離したバイオマスの平均乾燥重量比が１０〜３０％であると仮定すると、１：４〜１：１２の銀対細胞乾燥重量比が得られた。
【００９４】
−反応混合液Ｂ：Ａｇの５．７８ｇ／Ｌ（５５ｍＭ）の最終濃度を得るために、２．４ｍＬの銀（Ｉ）ストック溶液を加えた。２８ｇ／Ｌのバイオマス（湿重量）上でほぼ即時の析出反応（赤みがかった褐色の析出物）が発生した。遠心分離したバイオマスの乾燥重量は平均して１０〜３０％であるので、２：１〜０．７：１の銀対細胞乾燥重量比が得られた。この反応中のｐＨは１１．６であった。
【００９５】
−反応混合液Ｃ：Ａｇの５．７８ｇ／Ｌ（５５ｍＭ）の最終濃度を得るために、２４ｍＬの銀（Ｉ）ストック溶液を加えた。２．８ｇ／Ｌのバイオマス（湿重量）上でほぼ即時の析出反応が発生した。遠心分離したバイオマスの乾燥重量は平均して１０〜３０％であるので、２０：１〜７：１の銀対細胞乾燥重量比が得られた。
【００９６】
反応混合液を３０分間にわたり放置し、その後に形成されたナノＡｇ組成物を採取した。
【００９７】
結果として生じるナノＡｇ析出物は１５℃で１０分間にわたり３，０００ｇでバイオマスと一緒に遠沈させ、次に製造プロセスからすべての残留アンモニアおよびその他の水溶性成分を除去するためにｍｉｌｌｉＱ水を用いて２回洗浄した。ナノＡｇ精製ペレット生成物を次に分析した（実施例９）、またはさらにその後の試験のためにｍｉｌｌｉＱ水中で適切な濃度のナノＡｇへ希釈した。
【００９８】
実施例９−０．７：１の銀対バイオマス細胞乾燥重量比で生成されたナノＡｇのＸＲＤ分析
実施例８による０．７：１の銀対バイオマス細胞乾燥重量比を備えて生成され、次に２４時間にわたり１００℃のオーブンで乾燥させたナノ銀粒子を含むバイオマスのＸＲＤ分析は、実施例２で説明したように実施した。このＸＲＤスペクトルでは、銀金属のＸ線回折パターンしか検出できなかった。乾燥生成物中の５重量％未満の結晶状微量元素はＸＲＤによって検出することはできないと確実に推定できるので、大まかにはこのＸＲＤ分析によって検出された銀の少なくとも９５％はＡｇ（０）状態にあると推定できる。
【００９９】
実施例１０−Ｈ２Ｏ２を用いたナノ銀の後処理
実施例１もしくは実施例８によって得て洗浄したナノＡｇペレットは、３０容量％のＨ２Ｏ２水溶液を用いて後処理した。この作用のために、ペレットをＨ２Ｏ２中にＡｇ／Ｈ２Ｏ２が６ｇ／Ｌ（３０％）までの濃度で懸濁させた。より安定な析出物が得られた。得られた析出物の懸濁液を次にｍｉｌｌｉＱ水中に希釈させると、その後の試験のために適切な濃度のナノＡｇが得られた。
【０１００】
実施例１１−Ｈ２Ｏ２後処理を行わない、またはＨ２Ｏ２後処理後のナノＡｇの抗菌特性
ナノＡｇ調製物は、実施例８に記載したように、７：１、１：１０および０．７：１の各々の様々な銀対バイオマス細胞乾燥重量比で調製した（本明細書でサンプルを各々Ａ、ＢおよびＣと呼ぶ）。さらに、０．７：１の銀対バイオマス細胞乾燥重量比で得たナノＡ
ｇ調製物は、さらに実施例１０に記載したようにＨ２Ｏ２で処理すると、それによりＤと呼ぶ第４サンプルが産生した。
【０１０１】
銀対バイオマス細胞乾燥重量比がナノＡｇ製品の抗菌活性に及ぼす作用を評価するために、１×１０４ＣＦＵ／ｍＬのネズミチフス菌の細胞懸濁液を無菌生理溶液中で作製し、様々な試験管に分配した。これらの試験管に、各試験管中で０．０５ｍｇ／Ｌ（もしくは５０ｐｐｂ）のナノＡｇの最終濃度が得られるまでサンプルＡ、Ｂ、ＣおよびＤを加えた。コントロールとして、細菌培養物を０．０５ｐｐｍのＡｇＮＯ３と、銀を使用せずにインキュベートした。試験管にキャップを嵌め、２回ずつ３７℃で振とうしながらインキュベートした。４時間半のインキュベーション後、サンプルを取り出し、生理溶液中で一連の希釈液を作製し、ＴＳＡ培地上でプレーティングし、その後に全ネズミチフス菌数を決定できるように３７℃で一晩プレートをインキュベートした。これらの計数の結果は、２回の独立した計数についての平均細胞数と標準偏差の形で図３に示されている。細菌数の実質的減少は、実施例８の方法によって得られた０．０５ｐｐｍのナノＡｇの存在下での４時間半のインキュベーション後に観察されている。図３は、銀対細胞乾燥重量比が高いほど、結果として生じる抗菌活性に対するナノＡｇの反応性が低くなることを証明している。さらに、Ｈ２Ｏ２を用いたナノＡｇ製品の処理はその抗菌活性を大きく増加させた。
【０１０２】
実施例１２−透過型電子顕微鏡法によるナノ銀の粒径の決定
ＴＥＭによる分析のための薄片を作製するために、細菌のペレットは２．５％グルタールアルデヒドおよび２％ホルムアルデヒドを含有する０．１Ｍのカコジル酸バッファ（ｐＨ７．４）中で固定し、３％低融点アガロース（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製、米国ミシガン州デトロイト）中に包埋した。これらのサンプルは、１％四酸化オスミウム中で後固定した。固定工程の間および後には、サンプルを蒸留水で洗浄した。その後、サンプルはエタノール中で濃度を増加させながら、そして最後には無水酸化プロピレン中で脱水した。Ｅｐｏｎ−Ｓｐｕｒｒ培地中に包埋した後、標本ブロックをＴＭ６０トリミング装置（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ社、オーストリア国ウィーン）を用いてトリミングして０．５×１ｍｍ２−１×２ｍｍ２のすくい面を得て、さらに銀干渉色範囲をつや消しにするために金内の超薄切片はＵｌｔｒａｃｕｔマイクロトーム（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ社、オーストリア国ウィーン）を用いて切削した。切片をピオロフォーム（ｐｉｏｌｏｆｏｒｍ）および炭素被覆銅グリッド（２００メッシュ）上に載せた。これを実施したら、薄片を２％酢酸ウラニル、次にクエン酸鉛で染色して細胞の超微細構造を決定した。化学薬品およびグリッドは、Ａｇａｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（英国スタンステッド）から得た。イメージングは、８０ｋＶで作動させたＥＭ２０８Ｓ透過型電子顕微鏡（ＦＥＩ社、オランダ国アイントホーフェン）を用いて実施した。
【０１０３】
ＴＥＭ画像（図示していない）は、実施例８に記載した反応混合液Ａ、ＢおよびＣから結果として生じたナノ銀粒子について得られた。これらの画像は、細菌細胞表面上の析出物の形状にある組成物およびバイオマス間の懸濁液中において球状ナノ銀粒子が得られたことを確証している。
【０１０４】
−反応混合液Ａ（比率１：１０）から結果として生じたナノＡｇについての粒径：測定された３５個のナノ粒子については、直径の範囲は３．３ｎｍ〜７２ｎｍに及んで平均は１４ｎｍであり、粒子表面積の範囲は６．４〜２，９９６ｎｍ２に及び、このため空電性の範囲は０．１４〜０．９７に及んだ；
−反応混合液Ｂ（比率１：１）から結果として生じたナノＡｇについての粒径：測定された２０２個のナノ粒子については、直径の範囲は３ｎｍ〜１１６ｎｍに及んで平均は１５ｎｍであり、粒子表面積の範囲は６〜４，８０５ｎｍ２に及び、このため空電性の範囲は０．１２〜０．９６に及んだ；
−反応混合液Ｃ（比率１０：１）から結果として生じたナノＡｇについての粒径：測定
された５６個のナノ粒子については、直径の範囲は３．３ｎｍ〜５６ｎｍに及んで平均は１６ｎｍであり、粒子表面積の範囲は６．４〜１，８４１ｎｍ２に及び、このため空電性の範囲は０．１５〜０．９５に及んだ。
【０１０５】
実施例１３−コロイドナノ金の調製
金（ＩＩＩ）のストック溶液は、ＡｕＣｌ３の最終濃度が７．５ｇ／ＬとなるようにｍｉｌｌｉＱ水中で調製した。発酵乳酸桿菌の培養物は、実施例１にしたがって得た。
【０１０６】
湿重量２．５ｇを備える遠心分離した細胞ペレットを１００ｍＬのｍｉｌｌｉＱ水中へ加えた。
【０１０７】
上述した懸濁液中の０．１０ＮのＮａＯＨの規定度を得るために、ＮａＯＨはｍｉｌｌｉＱ水中の１ＮのＮａＯＨストック溶液から加えた。
【０１０８】
結果としてこの懸濁液に、ＡｕＣｌ３−Ａｕ（３．８ｍＭのＡｕ）の形状にあるＡｕ（ＩＩＩ）の７５ｍｇ／１００ｍＬの最終濃度を得るために１０ｍＬの金（ＩＩＩ）ストック溶液を加えた。２．５ｇ／１００ｍＬのバイオマス（湿重量）上へのＡｕ（０）の析出は、４時間以内に完了した。遠心分離したバイオマスの乾燥重量は平均して１０〜３０％であるので、１：３〜１：１０の金対細胞乾燥重量比が得られた。
【０１０９】
反応を４時間にわたり持続させ、その後ナノ金粒子を採取した。この紫色析出物は１５℃で１０分間にわたり３，０００ｇで遠沈させ、ｍｉｌｌｉＱ水を用いて２回洗浄し、製造プロセスから水溶性成分を除去した。
【０１１０】
実施例１４−ナノ金のＸＲＤ分析
実施例１３からの、２４時間にわたり１００℃のオーブン中で乾燥させた金粒子を備えるバイオマスのＸＲＤ分析は、実施例２において説明したようにＢｒａｇｇ−Ｂｒｅｎｔａｎｏ光学素子を備えたＳｉｅｍｅｎｓ回折計Ｄ５０００を用いて実施した。結果として生じるスペクトルは図４に示されており、Ａｕ０のＸ線回折ピークの存在だけを示している。
【０１１１】
実施例１５−様々な銀対バイオマス細胞乾燥重量比でのバイオマスについての生体内析出効率および回収率
Ａｇ（Ｉ）からＡｇ（０）ナノ粒子への生体内還元にバイオマスが及ぼす影響を評価するために、様々なＡｇ：ＣＤＷ比での生体内還元後のバイオマス上および溶液中の回収率を決定した。
【０１１２】
様々なＡｇ：ＣＤＷ比でのナノ銀調製物は、実施例８に記載したように調製した。銀回収率は、バイオマスとＡｇ（Ｉ）とのインキュベーションの４時間後ならびに１０分間にわたる７，０００ｇでの遠心分離による可溶相（溶液中）および析出物相（バイオマス上）間の分別後に決定した。調査の結果は、下記の表５に示されている。
【０１１３】
【表５】
【０１１４】
これらの結果から、バイオマス結合粒子としての銀の回収率は、Ａｇ：ＣＤＷ比が低い場合に高いことは明白である。例えば、１：１０のＡｇ：ＣＤＷ比は、生体内還元によって溶液中のＡｇ（Ｉ）からの許容できるＡｇ０の回収率（約９５％）を提供する。
【０１１５】
実施例１６−過酸化水素後処理を行っていないナノ銀調製物の殺藻特性
ナノ銀調製物は、１：４の銀対バイオマス細胞乾燥重量比で実施例８に記載したように調製した。
【０１１６】
この調製物の殺藻特性を評価するために、１０ｍＬのＢＧ１１培地（ＳｔａｎｉｅｒらによってＢａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｒｅｖ．（１９７１）３５：１７１−２０５に記載されている）を含有する試験管にクロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）が活発に増殖している０．５ｍＬの液体ＢＧ１１培養物を接種し、２０℃で６５％相対湿度および１，０００ルクス（１６時間／日）でインキュベートした。増殖は、分光光度測定によって２週間後に評価した。Ａｇが２０ｍｇ／Ｌ〜０．０１ｍｇ／Ｌの範囲に及ぶ様々な濃度のナノ銀調製物を試験管へ投与することによって試験した。ＭＩＣ値は、微生物増殖の完全阻害が観察された最低試験濃度である。クロレラ・ブルガリスに対するこのナノ銀調製物のＭＩＣ値は、０．１２５ｍｇ／ＬのＡｇであると決定された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌膜上でのコロイド金属化合物の製造に関する。本発明は、銀もしくは金ナノサイズ粒子を生物学的プロセスによって製造する方法にさらに関する。詳細には、本発明は、金属ナノ析出物、詳細には銀もしくは金ナノ粒子の製造におけるそれらの抗菌効率を改善するための特定条件下での、例えば乳酸桿菌などであるがそれには限定されないプロバイオティクス細菌の使用に関する。本発明は、前記方法によって製造されるコロイドナノ銀もしくはナノ金を含む組成物が含浸された担体を含む殺菌製品にさらに関する。
【背景技術】
【０００２】
効果的な殺菌プロセスは、例えば水、詳細には家庭用および工業用循環水、および廃水（例えば食品加工産業において存在する廃水）などの衛生上、操業上もしくは環境上の理由から未処理のままで排出もしくは再使用することのできない、微生物を含有する極めて大量の汚染物質を処理するために必要である。効果的な殺菌プロセスは、施設、装置、容器、空調システムなどの表面を処理するためにもまた必要である。環境に適合する殺菌プロセスは、主として、過酸化水素などの活性酸素化合物、または単量体の第４級アンモニウム化合物の使用に基づいている。
【０００３】
過酸化水素は、殺菌特性を備える、中等度に活性かつマイルドな殺菌剤である。過酸化水素は２５ｍｇ／Ｌの濃度で一部の細菌の増殖を阻害することが公知であるが、過酸化水素の濃度がはるかに高い場合でさえ、細菌数を効果的に減少させるには多くの時間がかかる、またはさらに紫外線照射を必要とする。しかし、後者を発生させるには、高額の装置および相当の電気料金の両方を必要とする。このため、例えば下水処理場における水およびそれらの生産物を処理するために、水などの大量の汚染物質を殺菌する場合には、そのような手段は事実上不適切および／または不経済である。このため、当分野ではこれらの欠点を克服するための様々な方法が既に試みられてきた。
【０００４】
当分野においては、銀イオンおよび銀をベースとする化合物は微生物にとって高度に毒性であり、このため大腸菌を含む多数の一般種の細菌において強力な殺菌作用を示することは周知である。さらに、銀ナノ粒子と両親媒性超分岐高分子との混成物は、有効な抗菌表面コーティングを提示することも証明されている。非毒性元素である銀のヒドロゾルの形状にある銀ナノ粒子の安定な水性分散液は、５０μｇ／ｃｍ３の濃度で細菌増殖の１００％阻害を引き起こすため、大腸菌に対して強度に殺菌性であることが見いだされている。銀ナノ粒子は、細菌膜中に蓄積し、何らかの形で細菌膜の所定の構築要素と相互作用して、それによって構造変化、分解、そして最後には細胞死を引き起こすことが見いだされている。細菌の表面は、概して、膜内の過剰数のカルボン酸基およびその他の基の解離に起因して、生物学的ｐＨ値では、負に荷電していると報告されている。膜炭素−マトリックス内に包埋された銀ナノ粒子は、マトリックス内部でのそれらの運動および摩擦に起因して表面電荷を生成するので、このように静電力がナノ粒子と細菌との相互作用の原因となっているのではないかと提唱されている。さらに、銀は、細菌膜だけではなくＤＮＡにも含有されているリンおよび硫黄化合物と反応する、さらに高度の親和性を有する傾向がある。可能性がある第３の作用様式は、銀イオンの放出であり、これは銀ナノ粒子の殺菌作用にさらに寄与する可能性がある。
【０００５】
数種の微生物、例えば乳酸桿菌種、および真菌のフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）は、Ａｇ（Ｉ）をそれらの細胞表面に生体吸着させ（ｂｉｏｓｏｒｂ）、還元酵素作用もしくは電子シャトルキノンのいずれかまたは両方によってこのイオンをＡｇ（０）へ還元させることによって解毒すると報告されている。
【０００６】
１〜１００ｎｍのサイズ範囲内にある生物学的に安定化した銀ナノ粒子および前記生物学的に安定化した銀ナノ粒子の濃度が１〜６ｐｐｍの範囲内にある担体を含む非細胞毒性抗菌調製物は、当分野において既に公知である。
【０００７】
さらに、コロイド銀−生体分子錯体を調製するための方法であって：
−単一溶液中の生体分子、銀塩、およびハロゲン化物イオンの起源の混合物を用意する工程と；
−前記混合物を可視領域内の波長を有する光線で照射する工程とを含み、銀塩およびハロゲン化物イオンの起源は水溶性であり、生体分子、銀塩およびハロゲン化物イオンの起源の量は、照射する工程がコロイド銀−生体分子錯体の生成を生じさせるような量である方法もまた公知である。
【０００８】
さらに、ナノサイズのコロイド金属粒子を調製するためのプロセスであって、前記プロセスは、１５〜４０℃の範囲内の温度で、２〜１２０時間に及ぶ期間に渡って湿性真菌もしくは真菌抽出物を金属イオン溶液で処理する工程と、ナノサイズのコロイド金属粒子を得るためにバイオマスを分離する工程とを含むプロセスも開示されている。
【０００９】
銀ナノ粒子を製造するための従来の製造方法は、例えば高額の製造コスト、有意な比率の副産物の産生、または得られるナノ粒子の濃度に対する上限の存在などの多数の欠点を有する。例えば、後者の製造方法は、非常に長い製造時間を必要とし、病原性である可能性がある真菌の使用に基づいている。このため、当分野においては、信頼性が高く、安価で、副産物の生成を減少させる、もしくは回避する銀ナノ粒子を製造するための方法に対するニーズがある。
【００１０】
乳酸桿菌によるＡｇ（Ｉ）生体吸着プロセス、２〜６のｐＨ範囲内にあるそのｐＨ依存性および１０〜６０℃の範囲内の温度依存性、ならびに乳酸桿菌によるＡｇ＋からＡｇ０への還元の機序についてもまた研究されている。
【００１１】
さらにまた当分野においては、銀イオン、アンモニアおよび水酸化ナトリウムとの混合物中のアエロモナス種を用いた、２時間にわたる６０℃での生体内還元によって銀ナノ粒子を調製するためのプロセスもまた公知である。
【００１２】
上記のプロセスは、必要とされる高い温度、酸性ｐＨおよび／または長いインキュベーション時間、またはその結果として生じる銀ナノ粒子の不十分な殺菌活性のような欠点を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
このため当分野においては、これらの欠点を有していない方法によって銀もしくは金ナノ粒子を製造することに対するニーズがある。
【００１４】
さらにまた当分野においては、高い抗菌特性を備える銀もしくは金ナノ粒子を製造するための単純で環境に優しく、そして再現可能な方法に対するニーズがある。
【００１５】
さらに当分野においては、所定の医学的用途において有用であることが公知である金もしくは銀ナノ粒子を製造するための対応する方法に対するニーズがある。
【００１６】
金もしくは銀以外の金属のコロイド形、および前記金属の化合物もまた、貴重な特性および用途を有することが当分野において公知である。例えば、コロイドビスマスサブシト
レートは、詳細には約３〜８のｐＨ範囲内では水溶性であり、胃潰瘍および十二指腸潰瘍、ならびにヘリコバクターピロリ菌感染症の治療のために抗生物質と一緒に数十年間にわたり使用されてきた。水銀、無機水銀化合物および金属水銀軟膏のコロイド形は、感染性湿疹もしくはインペチゴの治療（水銀塩）、梅毒の治療（カロメル）、乾癬の治療（酸化水銀もしくは白降汞）を含む様々な治療使用のために局所的に使用されてきた。パラジウムおよび白金のコロイド形は、有機還元、水素化分解などを含む様々な化学反応のための触媒として使用されてきた。コロイド形にある白金ナノ粒子は、抗癌剤としても公知である。任意にサリチル酸を用いてキレート化されたコロイド銅は、強力な抗炎症薬であり、コロイド銅もしくはコロイド亜鉛の舌下剤形は、風邪および流感と戦うために活性であることが公知である。さらに、コロイド亜鉛は、ウイルスに対して特に有効であり得る。これらすべての様々な分野において、それらの関連適用分野における有効性を向上させるために、また別の物理的形状のコロイド金属もしくはコロイド金属化合物を提供することに対する永続的ニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
極めて広い表現では、本発明は、細菌膜上でコロイド金属化合物を製造するための細菌の使用および被覆された細菌のその後の抗菌剤としての使用に関する。詳細には、本発明は：
・その細菌にその膜上でコロイド金属化合物を作製させる制御されたｐＨ下で、前記細菌と金属塩および他の塩の混合物とを接触させる工程による、コロイド金属化合物を製造するための細菌の使用、および
・膜上の金属化合物で被覆された上記の細菌の、抗菌剤としての使用
とに関する。
【００１８】
１つの実施形態では、本発明は、飲用水、表面コーティングおよびその他の物質において抗菌剤として使用できるプロバイオティクス細菌およびその他の細菌による金属ナノ析出物の製造に関する。
【００１９】
より詳細には、一部の細菌は、Ａｇ（Ｉ）塩を、細胞表面上のナノＡｇ粒子として析出させるコロイドＡｇ（０）へ還元させることができる。コロイド銀もしくは他の金属ナノ析出物で被覆されたバイオマスは、濾過もしくは遠心分離によって水相から容易に採取することができ、洗浄およびすすぎ洗いし、さらに加工処理することができるので、（希釈）懸濁液中およびコーティングに加工された場合の両方において、強力な抗菌特性を備えるコロイド製品を提供する。
【００２０】
興味深いことに、一連のプロバイオティクス細菌、即ちそれらがヒトの消化管系内に存在するとヒトの健康に有益な作用を及ぼすために工業生産されている細菌は、それらの細胞表面上でＡｇナノ析出物を生成する能力を示している。これらの細菌には、プロバイオティクス発酵乳酸桿菌の菌株が含まれるが、それらに限定されない。
【００２１】
塩（ＡｇＮＯ３、ＮＨ４Ｃｌ、ＮａＯＨその他）の特定の組み合わせを細菌の濃縮細胞培養物に添加し、ｐＨを制御することによって、強力な抗菌特性を備えるコロイド銀製品が形成される。所定の細菌菌株と結合した他の金属塩も類似の特性を備えるナノ析出物を生じさせるため、これも同様に本発明の一部である。
【００２２】
「銀の質量」対「生物学的細胞の質量」の比率（Ａｇ：ＣＤＷ、このときＣＤＷ＝細胞乾燥重量である）を調整することによって、最終コロイド銀製品の反応性および特性は、コロイド粒径、コロイド粒子分布およびその他の特性に関して、変化させることができる。
【００２３】
細菌の表面上で生成されたコロイド銀化合物は、水殺菌、洗浄製品中の殺菌剤としての使用、洗浄剤として、抗菌コーティング剤中の調製物、医学的用途、人間の消費、繊維製品中の使用、軟膏剤および潤滑剤における適用、触媒としてなどからなるがそれらに限定されない、極めて広範囲の用途を有する。
【００２４】
製造プロセスは、単純でコスト効率が高く、高い収量を示し、容易に大規模生産することができ、粒子のサイズおよび分布を制御することができ、製造されるナノ銀の抗菌反応性は極めて低濃度（ｐｐｂ）で他のコロイド銀製品より優れている。さらに、製品は様々な形態の下で加工処理することができる：乾燥させて、懸濁化形で、もしくは「湿性」ペレットとして、様々な用途に調製することができる。浄水を用いると活性を損失させずに洗い流すことができるため、最終製品中に化学試薬の残留物は全く存在しない。
【００２５】
プロバイオティクス細菌の使用は、ヘルスケア産業および食品産業における数多くの用途に広がっている。Ａｇ被覆細菌製品は、特に以下の用途に適合するであろう：
・殺菌洗浄製品中の調製物（病院、実験室、動物生産用地その他）、
・飲用水および水泳プール水の両方、動物生産用水、水産養殖用水、任意のその他の多数における水殺菌のためのセラミックフィルタもしくは他のフィルタにおける用途、
・殺菌コーティングにおける用途：ポリマー、織物繊維、金属、
・皮膚殺菌用軟膏、潤滑剤などにおける調製物のために適合する、
・飲用水を殺菌するための用途：新興国、バックパッカー、航空機、およびその他多数（ｅａｓｙ−ｄｒｏｐ法）、および
・効果のある病原体：レジオネラ菌、クリプトスポリジウム菌、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、シュードモナス菌、ブドウ球菌などの様々なタイプの細菌、真菌およびウイルス。
【００２６】
本発明の１つの目的は、優れた品質の金もしくは銀ナノ粒子を提供することである。本発明の第１態様は、コロイド銀もしくは金ナノ粒子を含む組成物を製造するための改良された生物学的方法であって、プロバイオティクス細菌、詳細には発酵乳酸桿菌などの乳酸桿菌種の使用、および前記バイオマスを銀（Ｉ）塩もしくは金（ＩＩＩ）塩の水溶液と接触させる工程を含む方法を提供することである。本発明は、生体内還元により銀もしくは金ナノ粒子を製造するための所定の特異的プロセスパラメータが、結果として生じるナノ粒子の生産効率および特性に大きな影響を及ぼすという予想外の発見に基づいている。詳細には、本発明の特異的方法は、結果として生じる銀ナノ粒子を含む組成物の抗菌活性に大きな影響を及ぼす。
【００２７】
本発明のまた別の態様は、これらの特定条件下で生体内還元によって得られた銀もしくは金ナノ粒子組成物が、それらの活性もしくは保管期間を通しての安定性などの他の関連特性を維持またはさらに改善しながら、さらに加工処理できる、例えばバイオマスから分離できることである。または、例えばこれらの特定条件下で生体内還元により得られた金もしくは銀ナノ粒子組成物の、例えば過酸化物もしくは過酸基塩などの酸化種による化学的後処理は、結果として生じるナノ粒子組成物の特性を一層増強し得る。
【発明の効果】
【００２８】
さらに本発明のプロセスの利点は、結果として生じる銀もしくは金ナノ粒子のサイズおよび分布を再現可能な方法で制御することができることである。
【００２９】
本発明のさらなる利点は、潜在的に毒性および／または高価な化学薬品の必要を減少させることによって、前記方法が有意に短期間内に高度に信頼できる結果を低コストおよび環境に優しい方法で達成することでもある。本発明の方法の結果として生じる組成物中には化学試薬の有害な残留物は大方の場合に残っていないが、それは使用されるバイオマス
が無害の、例えばプロバイオティクス微生物に由来するためである。このために本発明の利点は、本方法が真核生物へ適用された場合に、そのような生物へ実質的に影響を及ぼさない組成物を提供することである。特定の実施形態では、本発明は、実質的に真核生物に影響を及ぼさずに、海洋病原体に対しても作用する高度の抗菌活性を備える組成物を提供する。本発明のさらなる利点は、本発明が、それ自体が高濃度のナノ銀もしくはナノ金を含む、および実質的にそれらの金属状態にある実質的に銀もしくは金によって構成されるナノ銀もしくはナノ金を含む、例えば各々全銀含量の約９５％を超えるＡｇ０または全金含量の約９５％を超えるＡｕ０を含む組成物の製造を可能にすることである。
【００３０】
本発明のまた別の利点は、結果として生じる生成物もしくは組成物は、その活性を維持または改善さえしながら容易かつ安全に加工処理できることである。本組成物は、乾燥させる、または懸濁化形もしくは湿性ペレットとして維持することができ、さらにナノ銀粒子の安定性に起因する抗菌活性に影響を及ぼさずに、例えばエアロゾル調製物もしくは担体への含浸などの様々な形態で調製することができる。
【００３１】
さらにまた別の実施形態では、本発明は、上記の方法によって製造されたコロイド銀組成物の殺藻剤もしくは除草剤としての使用に関する。
【００３２】
用語の定義
本明細書で本発明のために使用する用語「ナノ銀」もしくは「ナノＡｇ」は、金属銀（Ａｇ０）のナノ粒子を意味する。本発明の範囲内では、前記ナノ粒子は、バイオマス上に沈着させられてもさせられなくてもよい。これらのナノ粒子は、サイズが約０．１ｎｍ〜約１００ｎｍ、例えば約０．５ｎｍ〜約５ｎｍの範囲内で変動してよい。これらのナノ粒子は、サイズ分布においてもそれらの平均サイズ前後で変動してよい。
【００３３】
本明細書で本発明のために使用する用語「ナノ金」もしくは「ナノＡｕ」は、金属金（Ａｕ０）のナノ粒子を意味する。本発明の範囲内では、前記ナノ粒子は、バイオマス上に沈着させられてもさせられなくてもよい。これらのナノ粒子は、サイズが約０．１ｎｍ〜約１００ｎｍ、例えば約０．５〜約５ｎｍの範囲内で変動してよい。
【００３４】
本明細書で本発明のために使用する用語「バイオマス」は、「ナノ銀」もしくは「ナノ金」を製造するために使用される細菌種からなる、またはそれらに由来する有機物質を意味する。
【００３５】
本明細書で本発明のために使用する用語「プロバイオティクス細菌」は、適切な量で例えば哺乳動物、海産種（例えば、魚）もしくは人間などの宿主へ投与された場合に、前記宿主の健康に有益な作用を与える細菌を意味する。
【００３６】
本明細書で本発明のために使用する用語「銀（Ｉ）」もしくは「Ａｇ（Ｉ）」は、１価の正に荷電した銀イオンもしくはＡｇ＋を意味する。
【００３７】
本明細書で本発明のために使用する用語「金（Ｉ）」および「金（ＩＩＩ）」は、１価および３価の正に荷電した金イオン各々を意味する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明の１つの実施形態によるナノ銀粒子を様々な濃度で用いた処理が大腸菌の全細胞数および生存率へ及ぼす抗菌作用を示す図である。
【図２】本発明の１つの実施形態によるナノ銀粒子のＸ線回折分析スペクトルを示す図である。
【図３】本発明の１つの実施形態によるナノ銀粒子の製造中の銀対細胞乾燥重量比がネズミチフス菌に対する前記粒子の抗菌活性に及ぼす作用を示す図である。
【図４】本発明のまた別の実施形態によるナノ銀粒子のＸ線回折分析スペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明の第１態様は、コロイドナノ銀もしくはナノ金を含む組成物を製造するための単純な方法であって、プロバイオティクス細菌を少なくとも４ｍＭの銀塩もしくは金塩を含む水溶液とともにインキュベートする工程を含む方法を提供することである。
【００４０】
本発明によると、適切なプロバイオティクス細菌には、例えば乳酸桿菌属、ビフィズス菌属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）などが含まれるが、それらに限定されない。制限なく、プロバイオティクス細菌は、以下の種：ラクトバシラス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ）、ラクトバシラス・アシドフィルス（ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバシラス・カゼイ（ｃａｓｅｉ）、ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバシラス・デルブリュキイの亜種ブルガリア菌（ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、発酵乳酸桿菌、ラクトバシラス・ガッセリ（ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバシラス・ジョンソニイ（ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバシラス・パラカゼイ（ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバシラス・プランタルム（ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバシラス・ロイテリ（ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバシラス・ラムノーサス（ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、大腸菌小体（Ｎｉｓｓｌｅ）、サッカロミセス・ブーラルディ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、バシラス・リシェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシラス・セレウス（ｃｅｒｅｕｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシラス・メガテリウム（ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バシラス・アシドフィルス（ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、バシラス・プミルス（ｐｕｍｉｌｕｓ）、バシラス・ポリフェルメンティクス（ｐｏｌｙｆｅｒｍｅｎｔｉｃｕｓ）、バシラス・クラウジイ（ｃｌａｕｓｉｉ）、バシラス・ラテロスポールス（ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、バシラス・スポロゲネス（ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）、バシラス・コアグラス（ｃｏａｇｕｌａｓ）、およびバシラス・ポリミクサ（ｐｏｌｙｍｙｘａ）の１つまたは複数に属していてよい。
【００４１】
本発明の方法の様々な実施形態のためには、任意の水溶性銀塩を使用できる。本明細書で使用する用語「銀塩」は、そのような銀塩の水和物およびその他の溶媒和物も含んでいる。典型的には、水溶性銀塩は、本明細書では例えば室温のような本発明の方法の実施温度で少なくとも０．１ｇ／Ｌの水溶性を備える銀塩であると定義できる。制限なく、銀塩は、酢酸銀、塩化銀、過塩素酸銀、塩素酸銀、臭化銀、フッ化銀、乳酸銀、硝酸銀、硫酸銀もしくは酒石酸銀などであるがそれらに限定されない無機銀塩もしくは有機銀塩であってよい。
【００４２】
本発明の方法の様々な実施形態のためには、任意の水溶性金塩を使用できる。本明細書で使用する用語「金塩」は、そのような金塩の水和物およびその他の溶媒和物も含んでいる。典型的には、水溶性金塩は、本明細書では例えば室温のような本発明の方法の実施温
度で少なくとも０．１ｇ／Ｌの水溶性を備える金塩である。制限なく、金塩は、１価もしくは３価であってよい。制限なく、金塩は例えば塩化金（ＩＩＩ）、金チオリンゴ酸ナトリウム１水和物、臭化金（ＩＩＩ）、ヨウ化金（ＩＩＩ）および硝酸金（ＩＩＩ）などを含むがそれらに限定されない無機金塩もしくは有機金塩もしくは混合金塩であってよい。
【００４３】
本発明の１つの実施形態によると、インキュベートすべき水溶液中の銀塩もしくは金塩の初期濃度は少なくとも４ｍＭ、例えば少なくとも１０ｍＭ、または特別の例では少なくとも５０ｍＭでなければならない。
【００４４】
本発明のまた別の実施形態によると、前記水溶液は挙動に影響を及ぼしやすい、詳細には結果として生じる組成物の特性を改善するさらなる成分をさらに含んでいてよい。これに関連して、ナノ銀が望ましい本発明の１つの実施形態では、本方法は、プロバイオティクス細菌（例えば先に定義した細菌）を、少なくとも４ｍＭの銀塩を含み、さらにアンモニアおよび／またはアンモニウム塩を含む水溶液とともにインキュベートする工程を含んでいてよい。この実施形態のために適合するアンモニウム塩は、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、ギ酸アンモニウムおよび臭化アンモニウムなどであるが、それらに限定されない。本発明のこの実施形態において使用されるアンモニアおよび／またはアンモニウム塩の量は、好ましくは相当量の銀−アンモニア、または例えばＡｇ（ＮＨ２）＋および／または｛Ａｇ（ＮＨ３）２｝＋の形態の下にある銀（Ｉ）−アンモニア錯体などであるがそれには限定されない銀−アンモニア錯体の形成を可能にするために十分な量でなければならない。本発明のこの実施形態のまた別の変形によると、インキュベートすべき水溶液は、適切な量の例えば水酸化ナトリウムもしくは水酸化カリウムなどであるがそれらに限定されないアルカリ金属水酸化物をさらに含んでいてよい。そのような適切な量は、本明細書中以下に説明するように、達成すべき適切なｐＨ範囲を参照することによって規定できる。
【００４５】
本発明のまた別の実施形態によると、本方法は、プロバイオティクス細菌（例えば、本明細書で先に定義した細菌）を、少なくとも４ｍＭの金塩を含み、適切な量の例えば水酸化ナトリウムもしくは水酸化カリウムなどであるがそれらに限定されないアルカリ金属水酸化物をさらに含む水溶液と、アンモニアおよび／またはアンモニウム塩の不存在下でインキュベートする工程を含んでいる。
【００４６】
例えば水酸化ナトリウムもしくは水酸化カリウムなどであるがそれらに限定されない適切なアルカリ金属水酸化物は、インキュベーション中の水溶液へ約１Ｍまでの濃度で加えることができる。好ましくは、インキュベーションは、ｐＨが少なくとも８である、例えば約８〜約１２の範囲内にある、またはより特定の実施形態では約８．５〜約１１の範囲内にあるような条件下で実施される。
【００４７】
本発明の１つの実施形態によると、銀重量もしくは金重量対プロバイオティクス細菌の細胞乾燥重量（以下、ＣＤＷと略記する）の比率は、少なくとも約０．０１、例えば少なくとも約０．０５もしくは少なくとも約０．１である。本発明のまた別の実施形態によると、Ａｇ：ＣＤＷもしくはＡｕ／ＣＤＷ重量比は約２０を超えない、好ましくは約１０未満、例えば５未満である。
【００４８】
本発明の１つの実施形態によると、本方法のインキュベーション工程は、約５℃〜約４５℃の温度で、好ましくは約１５℃〜約３５℃の温度で、例えば室温で実施される。
【００４９】
本発明のまた別の実施形態として、本方法のインキュベーション工程は、約１秒間〜約３０分間、例えば約５秒間〜約２０分間の期間にわたり実施されてよい。当業者であれば、限定された実験を用いてインキュベーションのために最も適切な期間を、例えば銀塩も
しくは金塩の濃度、インキュベーション温度、Ａｇ：ＣＤＷもしくはＡｕ／ＣＤＷ重量比、アンモニアおよび／またはアンモニウム塩の存在もしくは不存在などを含むがそれらに限定されない他のプロセスパラメータによって決定することができる。当分野において通常のことであるが、インキュベーションは、インキュベーション期間の少なくとも一部の間には攪拌しながら実施することができる。
【００５０】
本発明の方法は、結果として生じるコロイド銀もしくは金ナノ粒子を含む組成物をさらに加工処理する工程をも含むことができる。前記のさらに加工処理する工程は、例えば、バイオマスの少なくとも一部を銀もしくは金ナノ粒子から除去する工程または例えば超音波処理による機械的、酵素的および／または物理化学的処理によってバイオマスを分別する工程などであるがそれらに限定されない１つまたは複数の工程を含むことができる。そのようなバイオマス除去もしくは分別方法の各々は、当業者には周知である。代替的に、もしくは前記に加えて、前記加工処理する工程は、結果として生じるコロイド銀もしくは金ナノ粒子を含む組成物の所定の所望の特性を安定化もしくは改善さえするための化学処理工程を含むことができる。そのような化学的加工処理の特定の実施形態として、本発明による金もしくは銀ナノ粒子組成物は、インキュベーション後、および任意にバイオマスの除去後に、改良された安定性および／または（ナノ銀に関して）より高度の抗菌活性を備える銀もしくは金ナノ粒子析出物を生成するために、例えば過酸化物もしくは過酸基塩などの酸化剤を用いて処理することができる。本発明のこの実施形態の範囲内では、適切な有機および無機過酸化物には、過酸化水素、過酢酸などが含まれるが、それらに限定されない。本発明のこの実施形態において使用するために適切な過酸基塩には、解離すると過酸化水素を形成することのできるアルカリ性水溶性塩、例えばそのような塩が水に溶解させられると過酸化物イオンが遊離するアルカリ性水溶性塩が含まれるが、それには限定されない。それらの適切な例には、例えばアルカリ金属などのカチオンと結合している過炭酸塩、過ホウ酸塩、過ケイ酸塩および過リン酸塩が含まれる。特に好ましいのは、実験式２Ｎａ２ＣＯ３，３Ｈ２Ｏ２を有する過炭酸ナトリウムである。本発明のこの実施形態を支持して、当業者には：
−そのような過酸基塩は殺菌能力に関して過酸化水素より優れている可能性があり、
−過酸化水素は弱い殺菌剤で細菌内への透過性が乏しく、
−過酸基塩が水に溶解させられ過酸化水素を遊離すると、アルカリ塩は遊離した過酸化水素からプロトンを引き出してヒドロペルオキシドイオンを形成するが、これは過酸化水素とは対照的に強力な殺菌剤であり、細菌内へ容易に透過可能である
ことが公知である。
【００５１】
本発明のプロセスの任意の時点に、コロイドナノ銀もしくはナノ金を含む固体部分は、当業者には周知である任意の方法で液体部分から分離することができる。例えば、固体部分は遠心分離およびその後の液体画分のデカンテーション、または濾過によって分離することができる。
【００５２】
本発明の方法では、銀塩もしくは金塩は、例えばｐＨ、インキュベーション温度、塩のタイプおよび塩濃度などであるがそれらに限定されない反応作業条件の１つまたは複数を注意深く調整しながら、少なくとも部分的に銅塩と置換することができる。本発明の方法では、プロバイオティクス細菌種は、例えばｐＨ、インキュベーション温度、塩のタイプ、および（金もしくは銀）塩濃度などであるがそれらに限定されない反応作業条件の１つまたは複数を注意深く調整しながら、少なくとも部分的に別の微生物もしくは細菌と置換することができる。そのような別の細菌は、環境にとって安全であると一般に見なされる細菌、より詳細には生体内還元能力を有することが公知である細菌からなる群から選択することができる。
【００５３】
本発明の方法を主として本明細書では銀および金に関して記載してきたが、それらには
限定されず、その極めて広範な表現において言及されるように、本方法は、例えばｐＨ、インキュベーション温度、塩のタイプ、および塩濃度などであるがそれらに限定されない１つまたは複数の反応作業条件が適切に適応させられることを前提に、他の金属もしくは金属化合物にも適用できる。そのような適応は、本明細書に組み込まれた一般的教示を前提に、当業者の日常的実験の範囲内に含まれる。本発明の範囲内にある特に重要な金属には、亜鉛、水銀、銅、パラジウム、白金、およびビスマスが含まれる。
【００５４】
本発明の第２態様は、上述した方法によって製造されたナノ銀組成物の抗菌使用であるが、これはそのようなナノ銀組成物の抗菌処理における有効濃度は、標的細菌によって、約０．５ｐｐｍ以下、例えば約０．０５ｐｐｍ以下と格別に低い可能性があるという予想外の観察所見、および望ましくない細菌の量の実質的減少が限定された期間内、例えば約５時間以下の間に観察できるという観察所見に基づいている。本発明のこの態様のために適切な細菌標的には、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（例えば、ＣＭＣＭ−２−２２菌株）、シュードモナス・セパシア（ｃｅｐａｃｉａ）、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター・アグロメランス（ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（例えば、ＡＴＣＣ−１００３１菌株）、大腸菌、糞便連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）（例えば、ＡＴＣＣ−１０５４１菌株）、スタフィロコッカス・コーニィ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｈｎｉｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（例えば、ＩＰ５２１５４もしくはＡＴＣＣ−６５３８菌株）、枯草菌（ＡＴＣＣ−１９６５９菌株）（全部が院内細菌株として一般的である）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｃｉｕｍ）、腸内連鎖球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｉｒａｅ）、鉄酸化球菌（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）（例えば、ＡＴＣＣ１３６６１菌株）、乳酸桿菌、高温性バシラス（Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ｂａｃｉｌｌｉ）、トリコフィトン・インタージギターレ（Ｔｒｙｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ）（例えば、ＡＴＣＣ−６４０菌株）、クロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）（ＡＴＣＣ−３５８４菌株）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）（ＡＴＣＣ−１３１２４菌株）、ネズミチフス菌、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）などの広範囲のグラム陽性およびグラム陰性菌が含まれるが、それらに限定されない。本発明のナノ銀組成物は、さらにまた例えばカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）（例えば、ＡＰＣＣ−２０９１菌株）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）（例えば、ＩＰ７３２６菌株）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）（例えば、２１８ＩＰ菌株）、ペニシリウム・ベルコサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ）などを含む真菌に対しても活性である可能性があり、さらに例えばビルハルツ住血吸虫、マンソン住血吸虫などに対する抗寄生虫活性も有する可能性がある。
【００５５】
抗菌（または抗真菌もしくは抗寄生虫もしくは抗ウイルス）使用は、本発明の特定の実施形態によると、液体殺菌組成物の形状にあってよいが、このとき上述した方法によって製造されるナノ銀組成物は、第２抗菌剤もしくはそのような物質の混合物と組み合わせることができる。第２抗菌剤の適切な例には、過酸化水素、第４級アンモニウム塩、過酢酸、過酸基塩（後者は本明細書において本発明の第１態様に関連して記載されている）、および任意の公知の比率でのそれらの混合物が含まれるが、それらに限定されない。詳細には、前記組み合わせは、抗菌活性における相乗作用を提供することができる。特定の実施形態では、前記第２抗菌剤は、例えば二酸化塩素、モノクロラミン、次亜塩素酸塩、過マンガン酸カリウム、ヨウ素もしくは塩素などであるがそれらに限定されない酸化抗菌剤であってよい。本発明のこの実施形態による液体殺菌組成物は、例えば、リン酸、硝酸、硫
酸、臭化水素酸もしくはホウ酸またはそれらの混合物などの１つまたは複数の安定剤を、つまり組成物のｐＨを取り扱いおよび使用のために適切な範囲内に調整する目的でさらに含むことができる。無機酸安定剤の中では、リン酸が特に好ましい。実際に、前記酸安定剤は、一般に既に市販されている等級の過酸化水素には適切な量で組み込まれている可能性がある。本発明において任意に使用される安定剤は、さらに酒石酸、クエン酸（もしくはその水和物）、安息香酸、ピコリン酸、ニコチン酸およびイソニコチン酸などの有機カルボン酸であってよい。無機酸および有機酸の混合物も、この目的に適合すると見なすことができる。前記安定剤は、存在する場合は、好ましくは液体殺菌組成物のｐＨ調整および／または長期間の保存安定性のために有効な量である。本発明のこれらの液体殺菌組成物は、界面活性剤、腐食阻害剤およびフラグランス（香料）からなる群から選択される少なくとも１つの成分をさらに含むことができる。
【００５６】
本発明の殺菌組成物において使用するために適切な界面活性剤には、好ましくは適切な用量で食料品もしくは飲用水と接触するために適合する、例えばカチオン性、非イオン性、両親媒性および両性イオン性界面活性化合物、ならびにそのような化合物の混合物が含まれるが、それらに限定されない。極めて様々な非イオン性界面活性剤が、本明細書で有用な可能性がある。アニオン性界面活性剤の非限定的な例には、例えば、ポリエトキシル化および／またはポリプロポキシル化グリコール、Ｃ８−Ｃ２０脂肪酸モノエステル、ソルビタンモノパルミテートなどからなる群から選択される活性剤が含まれる。適切な両親媒性界面活性剤の特定の例には、３−ドデシルアミノプロピオン酸ナトリウム、３−ドデシルアミノプロパンスルホン酸ナトリウム、Ｎ−アルキルタウリンおよびベタインが含まれる。
【００５７】
本発明の方法によって得られるナノ銀を含む殺菌組成物は、バイオマトリックス中で安定化させることができ、処理、洗浄もしくは汚染除去すべき環境において直接的に、または上記に開示したようにまた別の加工処理後に適用することができる。例えば、ナノ銀粒子は、任意の好適な手段もしくは適用方法によって細菌が除去されるべき場所またはその場所の周囲に分散させることができる。本組成物のナノ銀成分は、細菌の細胞成分と相互作用することができ、それによってそれらを効果的に破壊し、総細菌数を許容レベルへ減少させることができる。
【００５８】
上述したようなナノ銀含有液体組成物の使用は、固体表面または大量の気体もしくは液体を洗浄する、汚染物質を除去する、殺菌もしくは滅菌するためであってよい。本発明による前記液体組成物が（例えば、液体もしくは気体内への分散によって）殺菌もしくは滅菌組成物として使用される場合は、典型的には、当業者であれば殺菌および滅菌の分野における標準知識から容易に決定できる濃度および適用時間を含む適切な条件において適用される。
【００５９】
本発明の液体殺菌ナノ銀含有組成物が固体表面に適用される場合は、安全規制のために、適切な量の濃縮組成物を水と混合する工程によって得られる直ちに使用できる希釈調製物を使用し、次に前記固体表面をそのような時間中に得られる希釈調製物で固体表面の完全湿潤が達成されるまで湿潤させる（これは、当業者には公知であるように、表面多孔性に左右される可能性がある）ことが好ましい。
【００６０】
当業者には理解されるように、ナノ銀含有殺菌液体組成物の好ましい使用量は、処理すべき固体表面上、または液体もしくは気体内に存在する微生物のタイプおよび量に伴って広範囲に変動するであろう。
【００６１】
本発明によるナノ銀含有液体組成物の上記の殺菌剤としての使用に関しては、より特別には下記の適用方法が推奨されている：
−前記ナノ銀含有組成物中への処理すべき製品の浸漬、
−処理すべき固体表面上への殺菌組成物の噴霧、および
−処理すべき水（特別には水泳プール水、工業用プロセス水、廃水など）の中への（希釈もしくは濃縮した）殺菌組成物の組み込み。
【００６２】
このために、本発明によるナノ銀含有殺菌液体組成物は、特別には：
（ａ）病院および研究室施設、工業施設（牛乳製造所、チーズ製造所、麦芽製造所、醸造所、ミネラルウォータ、ワイン、蒸留酒、フルーツジュースおよび野菜ジュースを製造するための施設；温室；牛舎、鶏小屋および馬小屋；食料品、飲料もしくは医薬品の包装ライン；航空機および汽船の内部）および前記施設の内容物、詳細には前記施設内の装置もしくは機器の殺菌および衛生；
（ｂ）早産動物もしくは成長中の無菌動物のための培養器などの無菌囲いの滅菌；
（ｃ）空調システム内のレジオネラ菌の処理；
（ｄ）保存容器（詳細にはサイロ）および例えば食料品（砂糖、茶、コーヒー、シリアル、飲料）および動物用飼料などの液体もしくは固体製品を輸送するためのパイプラインの殺菌および衛生；
（ｅ）水泳プールおよびその他の鉱泉療法設備の殺菌および衛生（この場合には、組成物は好ましくは界面活性剤非含有であろう）；
（ｆ）飲用水（例えば、井戸もしくは貯蔵容器内）を製造、輸送および貯蔵するためのシステムの殺菌（この場合には組成物は、好ましくは界面活性剤非含有であろう）；および
（ｇ）その殺菌、殺真菌、抗ウイルスおよび抗寄生虫特性による、屋外作物（例えば、シリアル、トマト、バナナ園、例えばチコリー、種子、塊根を含む水耕栽培など）の保護のために有用である。
【００６３】
本発明の方法によって得られるナノ銀組成物の高度の選択的な抗菌活性は、例えば医学的用途またはヒトもしくは動物が消費するための栄養もしくはその他の物質の加工処理において使用するため（特に真核細胞もしくは微生物への作用の不存在もしくは最小限の作用に起因して）、繊維製品の抗菌保護において使用するため、例えばクリーム剤、軟膏剤もしくはローション剤などであるがそれらに限定されない曝露させた組織の感染性もしくは微生物汚染を防止するための局所用医学的製剤において使用するため、または化学的もしくはその他の変換プロセスにおける触媒として使用するための、水の殺菌、水中の藻の繁殖の処理、洗浄製品、および抗菌コーティングの調製物などであるがそれらに限定されない広範囲の家庭用途ならびに工業用途を有する。上述した使用各々は、懸濁液中のナノ銀によって、ならびにポリマーおよび／または他のタイプのコーティング内にナノ銀を組み込むことによって達成できる。
【００６４】
本発明の第３態様は、驚くべきことに飲用水中、水族館もしくは池もしくは水泳プールの水中、または淡水もしくは海水を含む他の貯水容器中、ポリマーおよび塗料中、軟質ファウリング（審美的外観）もしくは硬質ファウリング（物質の劣化）に対して保護するための表面コーティング中および他の材料中において殺藻剤として使用できる、プロバイオティクス細菌およびその他の細菌による金属ナノ析出物の製造に関する。本発明の第４態様は、水中の希釈形において、または機械的、酵素的および／または生化学的手段によってさらに加工処理された場合の両方において、驚くべきことに所定の双子葉植物もしくは単子葉植物に対する除草作用、または苔のような様々なタイプの下等植物に対する作用を有する可能性があるプロバイオティクス細菌およびその他の細菌による金属ナノ析出物の製造に関する。このための関連植物の選択は、本発明の臨界的パラメータではない。このために適切な植物には、特に、例えばタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ウキクサ（Ｌａｍｎａ種）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、リンゴ、テンサイ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、アルファルファ、ペチュ
ニア、ワタ、ニンジン、セロリ、キャベツ、キュウリ、コショウ、カノーラ、トマト、ジャガイモ、レンズマメ、アマ、ブロッコリ、マメ、レタス、アブラナ、カリフラワー、ホウレンソウ、芽キャベツ、アーティチョーク、エンドウ、オクラ、カボチャ、ケール、カラードグリーン、茶、コーヒーおよびセラギネラ・レピドフィラ（Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａ ｌｅｐｉｄｏｐｈｙｌｌａ）などの双子葉植物が含まれる。それらはさらに、コメであるオリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、コーン、オオムギ、トウモロコシ、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、コムギ、オート麦、キビ、ソルガム、アマランス、タマネギ、アスパラガスおよびサトウキビなどの単子葉植物も含んでいる。
【００６５】
本発明の上記の態様は、特に以下の分野において有用である：
−水族館の水、動物およびヒトのための飲用水配水システム、園芸用の配水システム、池、水泳プール、池もしくは水泳プールからの水を処理するための濾過システム、および様々なタイプの散水システムにおける藻類増殖の阻止；
−船殻などの水と接触する表面を含む、表面上の藻類増殖の阻止；
−藻類、および植物のような高等生物の表面上での藻類増殖を含む藻類に対する表面処理のための塗料、ポリマーもしくはコーティングにおける使用；
−葉、幹、花もしくは根茎のコロイド銀への、例えば上述した製造方法によってプロバイオティクス細菌によって生成されてその上に析出したコロイド銀への曝露による、苔または他の望ましくない植物（双子葉植物もしくは単子葉植物両方）の増殖の阻害；および
−これらの表面をコロイド銀へ、例えば上述した製造方法によって細菌により生成されてその上に析出したコロイド銀へ曝露させることによる、表面上の所定の植物もしくは雑草の増殖の阻害。
【００６６】
以下の実施例は、何ら限定的意図なく、本発明による方法および殺菌組成物の所定の実施形態の例示として提供されている。
【００６７】
実施例１−ナノ銀の調製
発酵乳酸桿菌の培養物Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋ １９０１ ＡＬ（ＡＴＣＣ１１９７６、ＬＭＧ８９００、生後８日の母乳栄養児の腸由来）を１５時間にわたり３７℃の微好気性条件下で、ＭＲＳブロス（Ｏｘｏｉｄ社（英国ベイジングストーク）から市販されている）中で増殖させた。細胞は、ＭＲＳから１５℃で１０分間にわたる３，０００ｇでの遠心分離によって採取し、次にｍｉｌｌｉＱ水を用いて２回洗浄し、６００ｎｍで１．５の最終光学密度（ＯＤ６００）までｍｉｌｌｉＱ水中に再懸濁させた。ＮａＯＨの最終濃度が各々０．０５Ｎおよび０．１０Ｎに達するように、細胞懸濁液に１ＮのＮａＯＨストック溶液からの水酸化ナトリウムを加えた。
【００６８】
５０ｍＬのｍｉｌｌｉＱ水中に４２５ｍｇのＡｇＮＯ３および２２５ｍｇのＮＨ４Ｃｌを含むＡｇ（Ｉ）ストック溶液を調製した。１容積のこのＡｇ（Ｉ）ストック溶液を、各々０．０５および０．１０ＮのＮａＯＨを含む１０容積の細胞懸濁液に加えた。これらの混合液は、３０分間にわたり軽度の攪拌条件（シェーカ上で１００回転／分）下で、２５℃の可視光線下でインキュベートさせた。発酵乳酸桿菌バイオマス上に沈着させた、本明細書では「ナノ銀」もしくは「ナノＡｇ」と呼ぶ５．０ｍＭのＡｇ（０）（５３５ｍｇ／ＬのＡｇ（０））の最終溶液を得た。被覆された発酵乳酸桿菌細胞は、繰り返し遠心分離し、デカンテーションし、本組成物を新しいｍｉｌｌｉＱ水中に再懸濁させることによって、増殖培地残留物および他の添加物を除去するために、遠心分離し、ｍｉｌｌｉＱ水で３回洗浄した。その結果として最終ナノＡｇ濃度が調整された。本組成物を次にｍｉｌｌｉＱ水で希釈し、または３，０００ｇでの遠心分離によって濃縮し、そしてエンドユーザーのニーズに応じてｍｉｌｌｉＱ水中に再懸濁させた。
【００６９】
実施例２−ナノ銀のＸＲＤ分析
実施例１において得て、さらに３０℃で乾燥させた銀粒子を備えるバイオマスについてのＸ線回折（ＸＲＤ）分析は、Ｂｒａｇｇ−Ｂｒｅｎｔａｎｏ光学素子を備えるＳｉｅｍｅｎｓ回折計Ｄ５０００（Ｓｉｅｍｅｎｓ社（ドイツ国ミュンヘン）から市販されている）を用いて実施した。Ｘ線は、出力１．６ｋＷ（４０ｋＶ、４０ｍＡ）を備える銅Ｘ線管によって発生させた。測定は、１．６秒のステップ時間および０．０２度のステップサイズを用いて２５〜９０度の２θの間で実施した。結果として生じるスペクトル（図示していない）は、銀金属と酸化ナトリウムのＸ線回折パターンの存在を示している。後者は、ナノ銀の調製において使用された水酸化ナトリウムの残留物である。
【００７０】
実施例３−ナノ銀のＥＤＸ分析
実施例１において得て、さらに３０℃で乾燥させたナノ銀を備える乾燥バイオマスのエネルギー分散Ｘ線（ＥＤＸ）分析は、２０．０ｋｅＶの入射エネルギーに対応する分解能を備えるＥＤＸ検出器（ＪＥＯＬ ＵＳＡ社から入手可能）とともにＪＳＭ６１００走査型電子顕微鏡を用いて実施した。分析結果は表１に列挙されており（重量％および原子％の両方）、主として有機物質（高含量の炭素および酸素に起因する）および銀の存在を明らかに証明しており、それらの組み合わせは総計で乾燥物質の約９１重量％である。乾燥した生成物の残りは、ほとんどは乾燥した生物学的マトリックス由来の鉱物残留物に起因する微量元素Ｃａ、Ｍｇ、Ｓｉ、Ｐ、ＳおよびＣｌから構成された。
【００７１】
【表１】
【００７２】
実施例４−大腸菌についての固体増殖培地上のナノ銀の抗菌活性
実施例１において得た発酵乳酸桿菌バイオマス上に沈着させたナノ銀の形状にある、５ｍＭのＡｇ濃度を備える１００ｍＬの銀懸濁液を、大腸菌を培養するための固化増殖培地（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ寒天）上にプレーティングした。コントロールとして０．１ＮのＮａＯＨを含む無菌ｍｉｌｌｉＱ水中の５ｍＭのＡｇＮＯ３の溶液１００ｍＬを同一増殖培地上にプレーティングした。この設定は、１枚の寒天プレート当たり０．０５ｍｇのＡｇ、または総表面積１ｍ２当たり１１ｍｇのＡｇの総量と一致していた。この実験は、後者の濃度の２倍、即ち寒天プレート１枚当たり０．１１ｍｇのＡｇまたは総表面積１ｍ２当たり２２ｍｇのＡｇを用いて繰り返した。
【００７３】
これらの銀懸濁液をプレーティングすることによって、Ａｇ（Ｉ）ＮＯ３、またはナノ
Ａｇ各々の均質層を固化増殖培地上に塗布した。
【００７４】
この方法で固化した増殖培地を前処理した後、生理溶液（８．５ｇ／ＬのＮａＣｌ／無菌水）中の１００μＬの２×１０６ＣＦＵ／ｍＬの大腸菌懸濁液を前処理した寒天プレート上にプレーティングした。プレートを次に３０℃で２４時間にわたりインキュベートし、コロニーを計数した。計数の結果は、図１に示されている。１１ｍｇ／ｍ２のＡｇおよび２２ｍｇ／ｍ２のＡｇのナノＡｇ濃度では、処理された固体増殖培地上で大腸菌の生存細胞を検出することはできなかった（＜検出限界（Ｄ．Ｌ．）＝１×１０１ＣＦＵ／ｍＬ）。このように、これらの濃度でのナノＡｇ処理は、２×１０６ＣＦＵ／ｍＬから１×１０１ＣＦＵ／ｍＬ（Ｄ．Ｌ．）未満への大腸菌細胞の減少を生じさせた。１１ｍｇ／ｍ２のＡｇおよび２２ｍｇ／ｍ２のＡｇを含むＡｇ（Ｉ）ＮＯ３濃度では、２×１０６ＣＦＵ／ｍＬから各々４×１０２ＣＦＵ／ｍＬおよび１×１０２ＣＦＵ／ｍＬへの有意な大腸菌細胞減少が見られた。
【００７５】
コントロールとして、濃度が２×１０６ＣＦＵ／ｍＬの大腸菌懸濁液を未処理、即ちＡｇを含まない増殖培地上、およびナノＡｇを含まないがナノＡｇ処理と同一濃度で発酵乳酸桿菌ＡＴＣＣ１１９７６だけを含む１００μＬの無菌ｍＱ水を用いて処理した同一増殖培地上へプレーティングした。これらの細菌の総数では阻害作用は観察されなかった。この結果として、ナノＡｇおよびＡｇ（Ｉ）について観察された阻害作用はＡｇ処理に帰することができ、この実験で使用した処理方法もしくは乳酸桿菌菌株のいずれにも帰することはできない。
【００７６】
実施例５−様々な病原細菌についての懸濁液中の抗菌活性
実施例１で得た様々な濃度（０ｍｇ／Ｌ、０．１０ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌおよび５０ｍｇ／Ｌ）のナノＡｇ組成物を含有する生理溶液中に希釈した病原性大腸菌、ネズミチフス菌、黄色ブドウ球菌およびリステリア・モノサイトゲネス培養菌の生存率を試験した。ナノＡｇは、上述した病原細菌の１つの生きた培養菌を含有する生理溶液中に適用した。生理溶液は、水１Ｌ当たり８．５ｇのＮａＣｌを含んでおり、細菌細胞に向かって中性の浸透ポテンシャルを有するように調製されており、したがって浸透ストレスに起因してそれらを殺滅しない。コントロール処理は、ナノＡｇの不存在下での生理溶液中の細菌培養から構成した。
【００７７】
１００ｍｇ／ＬのナノＡｇ／ｍＱ水のストック溶液を調製し、表２に示した最終ナノＡｇ濃度を達成するために適合する量で生理溶液中に希釈した細菌培養物に加えた。
【００７８】
処理は、上述した各病原細菌種について独立して繰り返したが、「細菌培養物」は生理溶液中で１０４〜１０５ＣＦＵ／ｍＬの最終細胞濃度へ希釈した、指数的増殖期にある細菌種を含む希釈した液体ブロスを表している。各処理は、２回ずつ実施した。全インキュベーションは、３７℃で７２時間にわたって振とうしながらインキュベートした無菌のキャップ付き試験管内で実施した。インキュベーション後、１００μＬの各試験管はトリプチカーゼソイ寒天（ＴＳＡ）固体増殖培地上にプレーティングし、コロニーを計数した。これらの計数の結果は、試験した様々な病原体について表２に示されている。
【００７９】
【表２】
【００８０】
表２は、実施例１で得たナノＡｇの１ｍｇ／Ｌの濃度が、７２時間以内に大腸菌、黄色ブドウ球菌およびネズミチフス菌の生存細胞数を＜１０ＣＦＵ／ｍＬ（即ち、検出限界未満）の細胞濃度へ減少させるために十分であったことを示す。有意な細胞死は、０．１０ｍｇ／Ｌの濃度で既に観察された。リステリア菌に関しては、生存細胞の濃度の検出限界未満への減少は、１０ｍｇ／ＬのナノＡｇで得られた。そこで本発明者らは、実施例１で得たナノＡｇが、液体細胞懸濁液中での１．０ｍｇ／Ｌ以下の濃度で、液体から生存病原性細菌を有意かつ効果的に排除する強力な抗菌剤として作用すると結論づける。
【００８１】
実施例６−アルテミア・フランシスカーナ（Ａｒｔｅｍｉａ ｆｒａｎｃｉｓｃａｎａ）と組み合わせた懸濁液中のナノＡｇの抗菌活性
無菌人工海水（Ａｑｕａｒｉｕｍ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＵＳＡ社から入手可能なＩｎｓｔａｎｔ Ｏｃｅａｎ（登録商標））は、オートクレーブ滅菌処理によりｍｉｌｌｉＱ水中で調製した。全処理は、５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブ中の無菌人工海水の２０ｍＬアリコート中で構成した。各処理（３回ずつ実施した）は、１０５ＣＦＵ／ｍＬ（コロニー形成単位）のビブリオ・カンベリイ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃａｍｐｂｅｌｌｉｉ）ＬＭＧ２１３６３および／または表３に示した最終濃度で実施例１において得たナノＡｇの組み合わせが補給された、２０ｍＬの人工海水中の２０例の無菌アルテミア・ナウプリウス（Ａｒｔｅｍｉａ ｎａｕｐｌｉｕｓ）から構成した。そこで病原性細菌であるＶ．カンベリイをその宿主生物であるアルテミア・フランシスカーナと一緒にインキュベートした。
【００８２】
以下の試験を構成した：
−アルテミア・フランシスカーナ＋１０５ＣＦＵ／ｍＬのビブリオ・カンベリイ
−アルテミア・フランシスカーナ＋１０５ＣＦＵ／ｍＬのビブリオ・カンベリイ＋１００ｍｇ／ＬのナノＡｇ
−アルテミア・フランシスカーナ＋１０５ＣＦＵ／ｍＬのビブリオ・カンベリイ＋１０ｍｇ／ＬのナノＡｇ
−アルテミア・フランシスカーナ＋１０５ＣＦＵ／ｍＬのビブリオ・カンベリイ＋１．０ｍｇ／ＬのナノＡｇ
−アルテミア・フランシスカーナ＋１０５ＣＦＵ／ｍＬのビブリオ・カンベリイ＋０．１ｍｇ／ＬのナノＡｇ
−アルテミア・フランシスカーナ＋０．１０ｍｇ／ＬのナノＡｇ
−アルテミア・フランシスカーナ＋１００ｍｇ／ＬのナノＡｇ
−アルテミア・フランシスカーナ＋１０ｍｇ／ＬのナノＡｇ
−アルテミア・フランシスカーナ＋１．０ｍｇ／ＬのナノＡｇ、および
−アルテミア・フランシスカーナ＋０．１０ｍｇ／ＬのナノＡｇ
４８時間のインキュベーション後、アルテミア・フランシスカーナを含む無菌人工海水中のＶ．カンベリイの濃度を、特異的ビブリオ菌増殖培地上でのプレート計数によって決定した。平均的処理結果は、以下の表３に示されている（このとき、Ｄ．Ｌ．は検出限界を意味する）。
【００８３】
【表３】
【００８４】
さらにその上、０．１０および１．０ｍｇ／ＬのナノＡｇの濃度では、未処理コントロールに比較してアルテミア・フランシスカーナの生存率（８０％）に対する有意な作用は生じなかった。これは、実施例１によって生成されたナノＡｇが、高等生物にはこれらの濃度では毒性もしくは阻害作用を有していないことを示している。
【００８５】
実施例７−抗菌活性のための有効な接触時間の決定
本試験の目的は、各々０．１および１ｍｇ／Ｌの濃度のＡｇで有効な抗菌活性を得るために、実施例１のナノＡｇ組成物と生理溶液中に希釈した病原性細菌培養物である大腸菌、ネズミチフス菌、黄色ブドウ球菌もしくはリステリア・モノサイトゲネスとの適切な接触時間を決定することであった。
【００８６】
これらのナノＡｇ濃度を、細菌細胞に対して中性であり、したがって浸透ストレスに起因してそれらを殺滅しない浸透ポテンシャルを有するように調製された生理溶液（８．５ｇ／ＬのＮａＣｌ／水）中の細菌培養物に適用した。コントロール処理は、ナノＡｇ組成物を含まない生理溶液中の細菌培養から構成した。
【００８７】
１００ｍｇ／ＬのナノＡｇ／ｍＱ水のストック溶液を調製し、所望の最終ナノＡｇ濃度を提供するために適切な量で生理溶液中の細菌培養物（実施例５と同一の意味）へ加えた。
【００８８】
インキュベーション（２回ずつ実施した）は、３７℃で振とうすることによって無菌のキャップ付き試験管内で実施し、その後に様々な接触時間での細胞数を決定した（サンプリング事象）。各サンプリング事象時に、各処理物の１００μＬをトリプチカーゼソイ寒天（ＴＳＡ）固体増殖培地上にプレーティングし、コロニーを計数した。１５時間後、１６時間後、１７時間後、１８時間後および４０時間後各々に得られた結果は、以下の表４に示されている（このとき、ＮＤは検出不可能、即ち検出限界未満であることを意味している）。
【００８９】
【表４】
【００９０】
実施例８−様々な銀重量対バイオマス細胞乾燥重量比でのナノ銀組成物の調製
銀（Ｉ）のストック溶液は、ＡｇＮＯ３の最終濃度が４２５ｇ／Ｌ（＝５０ｍＭのＡｇＮＯ３）である液体アンモニア（水中で２８容量％のＮＨ３）中で調製した。発酵乳酸桿菌の培養物は、次に実施例１と同様に調製した。
【００９１】
遠心分離した２．８ｇ（湿重量）の細胞ペレットを、各々Ａ、ＢおよびＣと呼ばれる反応混合液を得るために３つの異なる量（５０ｍＬ、１００ｍＬおよび１Ｌ）のｍｉｌｌｉＱ水中に再懸濁させた。
【００９２】
上述した懸濁液中の０．１０ＮのＮａＯＨの規定度を得るために、ＮａＯＨはｍｉｌｌ
ｉＱ水中の１ＮのＮａＯＨストック溶液から各試験管に加えた。
【００９３】
結果として、銀（Ｉ）ストック溶液を以下のように加えた：
−反応混合液Ａ：Ａｇの１．３０ｇ／Ｌ（もしくは１２ｍＭ）の最終濃度を得るために、０．２４ｍＬの銀（Ｉ）ストック溶液を加えた。５６ｇ／Ｌのバイオマス（湿重量）上でほぼ即時の析出反応（赤みがかった褐色の析出物）が発生した。遠心分離したバイオマスの平均乾燥重量比が１０〜３０％であると仮定すると、１：４〜１：１２の銀対細胞乾燥重量比が得られた。
【００９４】
−反応混合液Ｂ：Ａｇの５．７８ｇ／Ｌ（５５ｍＭ）の最終濃度を得るために、２．４ｍＬの銀（Ｉ）ストック溶液を加えた。２８ｇ／Ｌのバイオマス（湿重量）上でほぼ即時の析出反応（赤みがかった褐色の析出物）が発生した。遠心分離したバイオマスの乾燥重量は平均して１０〜３０％であるので、２：１〜０．７：１の銀対細胞乾燥重量比が得られた。この反応中のｐＨは１１．６であった。
【００９５】
−反応混合液Ｃ：Ａｇの５．７８ｇ／Ｌ（５５ｍＭ）の最終濃度を得るために、２４ｍＬの銀（Ｉ）ストック溶液を加えた。２．８ｇ／Ｌのバイオマス（湿重量）上でほぼ即時の析出反応が発生した。遠心分離したバイオマスの乾燥重量は平均して１０〜３０％であるので、２０：１〜７：１の銀対細胞乾燥重量比が得られた。
【００９６】
反応混合液を３０分間にわたり放置し、その後に形成されたナノＡｇ組成物を採取した。
【００９７】
結果として生じるナノＡｇ析出物は１５℃で１０分間にわたり３，０００ｇでバイオマスと一緒に遠沈させ、次に製造プロセスからすべての残留アンモニアおよびその他の水溶性成分を除去するためにｍｉｌｌｉＱ水を用いて２回洗浄した。ナノＡｇ精製ペレット生成物を次に分析した（実施例９）、またはさらにその後の試験のためにｍｉｌｌｉＱ水中で適切な濃度のナノＡｇへ希釈した。
【００９８】
実施例９−０．７：１の銀対バイオマス細胞乾燥重量比で生成されたナノＡｇのＸＲＤ分析
実施例８による０．７：１の銀対バイオマス細胞乾燥重量比を備えて生成され、次に２４時間にわたり１００℃のオーブンで乾燥させたナノ銀粒子を含むバイオマスのＸＲＤ分析は、実施例２で説明したように実施した。このＸＲＤスペクトルでは、銀金属のＸ線回折パターンしか検出できなかった。乾燥生成物中の５重量％未満の結晶状微量元素はＸＲＤによって検出することはできないと確実に推定できるので、大まかにはこのＸＲＤ分析によって検出された銀の少なくとも９５％はＡｇ（０）状態にあると推定できる。
【００９９】
実施例１０−Ｈ２Ｏ２を用いたナノ銀の後処理
実施例１もしくは実施例８によって得て洗浄したナノＡｇペレットは、３０容量％のＨ２Ｏ２水溶液を用いて後処理した。この作用のために、ペレットをＨ２Ｏ２中にＡｇ／Ｈ２Ｏ２が６ｇ／Ｌ（３０％）までの濃度で懸濁させた。より安定な析出物が得られた。得られた析出物の懸濁液を次にｍｉｌｌｉＱ水中に希釈させると、その後の試験のために適切な濃度のナノＡｇが得られた。
【０１００】
実施例１１−Ｈ２Ｏ２後処理を行わない、またはＨ２Ｏ２後処理後のナノＡｇの抗菌特性
ナノＡｇ調製物は、実施例８に記載したように、７：１、１：１０および０．７：１の各々の様々な銀対バイオマス細胞乾燥重量比で調製した（本明細書でサンプルを各々Ａ、ＢおよびＣと呼ぶ）。さらに、０．７：１の銀対バイオマス細胞乾燥重量比で得たナノＡ
ｇ調製物は、さらに実施例１０に記載したようにＨ２Ｏ２で処理すると、それによりＤと呼ぶ第４サンプルが産生した。
【０１０１】
銀対バイオマス細胞乾燥重量比がナノＡｇ製品の抗菌活性に及ぼす作用を評価するために、１×１０４ＣＦＵ／ｍＬのネズミチフス菌の細胞懸濁液を無菌生理溶液中で作製し、様々な試験管に分配した。これらの試験管に、各試験管中で０．０５ｍｇ／Ｌ（もしくは５０ｐｐｂ）のナノＡｇの最終濃度が得られるまでサンプルＡ、Ｂ、ＣおよびＤを加えた。コントロールとして、細菌培養物を０．０５ｐｐｍのＡｇＮＯ３と、銀を使用せずにインキュベートした。試験管にキャップを嵌め、２回ずつ３７℃で振とうしながらインキュベートした。４時間半のインキュベーション後、サンプルを取り出し、生理溶液中で一連の希釈液を作製し、ＴＳＡ培地上でプレーティングし、その後に全ネズミチフス菌数を決定できるように３７℃で一晩プレートをインキュベートした。これらの計数の結果は、２回の独立した計数についての平均細胞数と標準偏差の形で図３に示されている。細菌数の実質的減少は、実施例８の方法によって得られた０．０５ｐｐｍのナノＡｇの存在下での４時間半のインキュベーション後に観察されている。図３は、銀対細胞乾燥重量比が高いほど、結果として生じる抗菌活性に対するナノＡｇの反応性が低くなることを証明している。さらに、Ｈ２Ｏ２を用いたナノＡｇ製品の処理はその抗菌活性を大きく増加させた。
【０１０２】
実施例１２−透過型電子顕微鏡法によるナノ銀の粒径の決定
ＴＥＭによる分析のための薄片を作製するために、細菌のペレットは２．５％グルタールアルデヒドおよび２％ホルムアルデヒドを含有する０．１Ｍのカコジル酸バッファ（ｐＨ７．４）中で固定し、３％低融点アガロース（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製、米国ミシガン州デトロイト）中に包埋した。これらのサンプルは、１％四酸化オスミウム中で後固定した。固定工程の間および後には、サンプルを蒸留水で洗浄した。その後、サンプルはエタノール中で濃度を増加させながら、そして最後には無水酸化プロピレン中で脱水した。Ｅｐｏｎ−Ｓｐｕｒｒ培地中に包埋した後、標本ブロックをＴＭ６０トリミング装置（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ社、オーストリア国ウィーン）を用いてトリミングして０．５×１ｍｍ２−１×２ｍｍ２のすくい面を得て、さらに銀干渉色範囲をつや消しにするために金内の超薄切片はＵｌｔｒａｃｕｔマイクロトーム（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ社、オーストリア国ウィーン）を用いて切削した。切片をピオロフォーム（ｐｉｏｌｏｆｏｒｍ）および炭素被覆銅グリッド（２００メッシュ）上に載せた。これを実施したら、薄片を２％酢酸ウラニル、次にクエン酸鉛で染色して細胞の超微細構造を決定した。化学薬品およびグリッドは、Ａｇａｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（英国スタンステッド）から得た。イメージングは、８０ｋＶで作動させたＥＭ２０８Ｓ透過型電子顕微鏡（ＦＥＩ社、オランダ国アイントホーフェン）を用いて実施した。
【０１０３】
ＴＥＭ画像（図示していない）は、実施例８に記載した反応混合液Ａ、ＢおよびＣから結果として生じたナノ銀粒子について得られた。これらの画像は、細菌細胞表面上の析出物の形状にある組成物およびバイオマス間の懸濁液中において球状ナノ銀粒子が得られたことを確証している。
【０１０４】
−反応混合液Ａ（比率１：１０）から結果として生じたナノＡｇについての粒径：測定された３５個のナノ粒子については、直径の範囲は３．３ｎｍ〜７２ｎｍに及んで平均は１４ｎｍであり、粒子表面積の範囲は６．４〜２，９９６ｎｍ２に及び、このため空電性の範囲は０．１４〜０．９７に及んだ；
−反応混合液Ｂ（比率１：１）から結果として生じたナノＡｇについての粒径：測定された２０２個のナノ粒子については、直径の範囲は３ｎｍ〜１１６ｎｍに及んで平均は１５ｎｍであり、粒子表面積の範囲は６〜４，８０５ｎｍ２に及び、このため空電性の範囲は０．１２〜０．９６に及んだ；
−反応混合液Ｃ（比率１０：１）から結果として生じたナノＡｇについての粒径：測定
された５６個のナノ粒子については、直径の範囲は３．３ｎｍ〜５６ｎｍに及んで平均は１６ｎｍであり、粒子表面積の範囲は６．４〜１，８４１ｎｍ２に及び、このため空電性の範囲は０．１５〜０．９５に及んだ。
【０１０５】
実施例１３−コロイドナノ金の調製
金（ＩＩＩ）のストック溶液は、ＡｕＣｌ３の最終濃度が７．５ｇ／ＬとなるようにｍｉｌｌｉＱ水中で調製した。発酵乳酸桿菌の培養物は、実施例１にしたがって得た。
【０１０６】
湿重量２．５ｇを備える遠心分離した細胞ペレットを１００ｍＬのｍｉｌｌｉＱ水中へ加えた。
【０１０７】
上述した懸濁液中の０．１０ＮのＮａＯＨの規定度を得るために、ＮａＯＨはｍｉｌｌｉＱ水中の１ＮのＮａＯＨストック溶液から加えた。
【０１０８】
結果としてこの懸濁液に、ＡｕＣｌ３−Ａｕ（３．８ｍＭのＡｕ）の形状にあるＡｕ（ＩＩＩ）の７５ｍｇ／１００ｍＬの最終濃度を得るために１０ｍＬの金（ＩＩＩ）ストック溶液を加えた。２．５ｇ／１００ｍＬのバイオマス（湿重量）上へのＡｕ（０）の析出は、４時間以内に完了した。遠心分離したバイオマスの乾燥重量は平均して１０〜３０％であるので、１：３〜１：１０の金対細胞乾燥重量比が得られた。
【０１０９】
反応を４時間にわたり持続させ、その後ナノ金粒子を採取した。この紫色析出物は１５℃で１０分間にわたり３，０００ｇで遠沈させ、ｍｉｌｌｉＱ水を用いて２回洗浄し、製造プロセスから水溶性成分を除去した。
【０１１０】
実施例１４−ナノ金のＸＲＤ分析
実施例１３からの、２４時間にわたり１００℃のオーブン中で乾燥させた金粒子を備えるバイオマスのＸＲＤ分析は、実施例２において説明したようにＢｒａｇｇ−Ｂｒｅｎｔａｎｏ光学素子を備えたＳｉｅｍｅｎｓ回折計Ｄ５０００を用いて実施した。結果として生じるスペクトルは図４に示されており、Ａｕ０のＸ線回折ピークの存在だけを示している。
【０１１１】
実施例１５−様々な銀対バイオマス細胞乾燥重量比でのバイオマスについての生体内析出効率および回収率
Ａｇ（Ｉ）からＡｇ（０）ナノ粒子への生体内還元にバイオマスが及ぼす影響を評価するために、様々なＡｇ：ＣＤＷ比での生体内還元後のバイオマス上および溶液中の回収率を決定した。
【０１１２】
様々なＡｇ：ＣＤＷ比でのナノ銀調製物は、実施例８に記載したように調製した。銀回収率は、バイオマスとＡｇ（Ｉ）とのインキュベーションの４時間後ならびに１０分間にわたる７，０００ｇでの遠心分離による可溶相（溶液中）および析出物相（バイオマス上）間の分別後に決定した。調査の結果は、下記の表５に示されている。
【０１１３】
【表５】
【０１１４】
これらの結果から、バイオマス結合粒子としての銀の回収率は、Ａｇ：ＣＤＷ比が低い場合に高いことは明白である。例えば、１：１０のＡｇ：ＣＤＷ比は、生体内還元によって溶液中のＡｇ（Ｉ）からの許容できるＡｇ０の回収率（約９５％）を提供する。
【０１１５】
実施例１６−過酸化水素後処理を行っていないナノ銀調製物の殺藻特性
ナノ銀調製物は、１：４の銀対バイオマス細胞乾燥重量比で実施例８に記載したように調製した。
【０１１６】
この調製物の殺藻特性を評価するために、１０ｍＬのＢＧ１１培地（ＳｔａｎｉｅｒらによってＢａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｒｅｖ．（１９７１）３５：１７１−２０５に記載されている）を含有する試験管にクロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）が活発に増殖している０．５ｍＬの液体ＢＧ１１培養物を接種し、２０℃で６５％相対湿度および１，０００ルクス（１６時間／日）でインキュベートした。増殖は、分光光度測定によって２週間後に評価した。Ａｇが２０ｍｇ／Ｌ〜０．０１ｍｇ／Ｌの範囲に及ぶ様々な濃度のナノ銀調製物を試験管へ投与することによって試験した。ＭＩＣ値は、微生物増殖の完全阻害が観察された最低試験濃度である。クロレラ・ブルガリスに対するこのナノ銀調製物のＭＩＣ値は、０．１２５ｍｇ／ＬのＡｇであると決定された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コロイドナノ銀もしくはナノ金を含む組成物を製造するための方法であって、プロバイオティクス細菌を少なくとも４ｍＭの銀塩もしくは金塩を含む水溶液とともにインキュベートする工程を含む、方法。
【請求項２】
前記水溶液は、少なくとも４ｍＭの銀塩を含み、さらにアンモニアおよび／またはアンモニウム塩、およびアルカリ金属水酸化物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
コロイドナノ銀を含む組成物を製造するための方法であって、５℃〜４５℃の温度でプロバイオティクス細菌を銀塩、アンモニアおよび／またはアンモニウム塩、およびアルカリ金属水酸化物の混合物を含む水溶液と接触させる工程を含む、方法。
【請求項４】
アンモニアおよび／またはアンモニウム塩の量は、相当量のＡｇ（ＮＨ３）＋もしくは｛Ａｇ（ＮＨ３）２｝＋錯体を形成するために十分である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
コロイドナノ金を含む組成物を製造するための方法であって、５℃〜４５℃の温度でプロバイオティクス細菌を金塩およびアルカリ水酸化物の混合物を含む水溶液とアンモニアおよび／またはアンモニウム塩の不存在下で接触させる工程を含む、方法。
【請求項６】
前記アルカリ金属水酸化物は、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムから選択される、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
銀もしくは金の重量対細菌の細胞乾燥重量の比は、０．０５〜２０の範囲内にある、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
インキュベーション時間もしくは接触時間は、１秒間〜３０分間である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記塩は、硝酸銀、塩化銀もしくは塩化金である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
インキュベーションは、８〜１２の範囲内のｐＨで実施される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記プロバイオティクス細菌は、乳酸桿菌種である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記プロバイオティクス細菌の少なくとも一部をインキュベーション混合物から機械的、酵素的もしくは物理化学的処理によって除去する工程をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
−インキュベーション混合物を、コロイドナノ銀もしくはナノ金を有する組成物を含む固体部分および液体部分に遠心分離する工程と、
−前記固体部分を液体部分から分離する工程と、
をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
コロイドナノ銀もしくはナノ金を含む前記組成物を過酸化物もしくは過酸基塩で処理する工程をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記過酸化物は、過酸化水素である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記コロイドナノ銀は、抗菌剤の成分として添加される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記コロイドナノ銀は、殺藻剤の成分として添加される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記コロイドナノ銀は、除草剤の成分として添加される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
細菌を金属もしくは金属化合物と制御されたｐＨ下で接触させる工程によって前記細菌膜上でコロイド金属もしくは金属化合物を製造するための細菌の使用。
【請求項２０】
前記金属もしくは金属化合物の金属は、銀である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記金属もしくは金属化合物の金属は、金、亜鉛、水銀、銅、パラジウム、白金、およびビスマスからなる群から選択される、請求項１９に記載の使用。
【請求項１】
コロイドナノ銀もしくはナノ金を含む組成物を製造するための方法であって、プロバイオティクス細菌を少なくとも４ｍＭの銀塩もしくは金塩を含む水溶液とともにインキュベートする工程を含む、方法。
【請求項２】
前記水溶液は、少なくとも４ｍＭの銀塩を含み、さらにアンモニアおよび／またはアンモニウム塩、およびアルカリ金属水酸化物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
コロイドナノ銀を含む組成物を製造するための方法であって、５℃〜４５℃の温度でプロバイオティクス細菌を銀塩、アンモニアおよび／またはアンモニウム塩、およびアルカリ金属水酸化物の混合物を含む水溶液と接触させる工程を含む、方法。
【請求項４】
アンモニアおよび／またはアンモニウム塩の量は、相当量のＡｇ（ＮＨ３）＋もしくは｛Ａｇ（ＮＨ３）２｝＋錯体を形成するために十分である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
コロイドナノ金を含む組成物を製造するための方法であって、５℃〜４５℃の温度でプロバイオティクス細菌を金塩およびアルカリ水酸化物の混合物を含む水溶液とアンモニアおよび／またはアンモニウム塩の不存在下で接触させる工程を含む、方法。
【請求項６】
前記アルカリ金属水酸化物は、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムから選択される、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
銀もしくは金の重量対細菌の細胞乾燥重量の比は、０．０５〜２０の範囲内にある、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
インキュベーション時間もしくは接触時間は、１秒間〜３０分間である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記塩は、硝酸銀、塩化銀もしくは塩化金である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
インキュベーションは、８〜１２の範囲内のｐＨで実施される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記プロバイオティクス細菌は、乳酸桿菌種である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記プロバイオティクス細菌の少なくとも一部をインキュベーション混合物から機械的、酵素的もしくは物理化学的処理によって除去する工程をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
−インキュベーション混合物を、コロイドナノ銀もしくはナノ金を有する組成物を含む固体部分および液体部分に遠心分離する工程と、
−前記固体部分を液体部分から分離する工程と、
をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
コロイドナノ銀もしくはナノ金を含む前記組成物を過酸化物もしくは過酸基塩で処理する工程をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記過酸化物は、過酸化水素である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記コロイドナノ銀は、抗菌剤の成分として添加される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記コロイドナノ銀は、殺藻剤の成分として添加される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記コロイドナノ銀は、除草剤の成分として添加される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
細菌を金属もしくは金属化合物と制御されたｐＨ下で接触させる工程によって前記細菌膜上でコロイド金属もしくは金属化合物を製造するための細菌の使用。
【請求項２０】
前記金属もしくは金属化合物の金属は、銀である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記金属もしくは金属化合物の金属は、金、亜鉛、水銀、銅、パラジウム、白金、およびビスマスからなる群から選択される、請求項１９に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００９−５４１５９３（Ｐ２００９−５４１５９３Ａ）
【公表日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１７０４５（Ｐ２００９−５１７０４５）
【出願日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００６１４５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／００３５２２
【国際公開日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【出願人】（５０３４５９９７０）ジャンセン ファーマシューティカ エヌ．ヴェー． (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００６１４５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／００３５２２
【国際公開日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【出願人】（５０３４５９９７０）ジャンセン ファーマシューティカ エヌ．ヴェー． (3)
【Ｆターム（参考）】
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