顎嚢胞の予防または治療用の組成物
【課題】顎嚢胞の予防または治療用の組成物と、当該組成物を用いた顎嚢胞の予防または治療方法の提供。
【解決手段】ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を有効成分として含むことで、顎嚢胞の治療に有効な組成物を得た。また当該組成物を用いることで、顎嚢胞の予防または治療を可能とした。
【解決手段】ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を有効成分として含むことで、顎嚢胞の治療に有効な組成物を得た。また当該組成物を用いることで、顎嚢胞の予防または治療を可能とした。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は顎嚢胞の予防または治療用の組成物に関する。さらに詳しくはｐ３８ＭＡＰＫ（Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）阻害剤を有効成分として含む顎嚢胞の予防または治療用の組成物と、当該組成物を用いた顎嚢胞の新しい予防または治療方法の提供に関する。
【背景技術】
【０００２】
顎嚢胞の治療として、例えば、歯根嚢胞においては、歯の中から根管外へと漏出する感染源を除去した後、防腐的材料を根尖孔まで充填する感染根管治療を試み、治癒しない場合には外科的に切除することが一般的であった。また、歯原性角化嚢胞等の他の顎嚢胞の治療では、外科的に切除する以外に方法がなかった。このように、従来の顎嚢胞の治療には、効果的な薬剤が得られていなかった。
【０００３】
歯根嚢胞は歯性感染症の原因歯の根尖部病巣内に嚢胞が形成される炎症性嚢胞で、根管からの持続的な細菌性の刺激により形成されると考えられている（非特許文献１、２参照）。
歯根嚢胞の嚢胞壁は、病理組織学的に３層からなり、内層の裏層上皮層は不規則な上皮突起をそなえた重層扁平上皮で構成され、これに接して炎症性細胞が浸潤している肉芽組織層、その外層に厚い線維性結合組織層が存在することが知られている。
歯根嚢胞は感染根管治療を行ったにもかかわらず治癒しない場合があることから（非特許文献３参照）、初発の原因は感染であるものの、その後の嚢胞の拡大機構については感染以外の要因、リーマー等による器械刺激、刺激性の強い根管消毒薬による組織障害および抜髄や根幹拡大時の歯髄片等の押し出しによる上皮の増殖等の要因が存在すると考えられている（非特許文献４、５参照）。
【０００４】
その他にも歯根嚢胞の拡大機構に関する要因として、歯根嚢胞壁で産生されるＰＧＥ２（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２）が、嚢胞拡大における主要な骨吸収因子である可能性が報告され（非特許文献６参照）、嚢胞の結合組織性被膜部由来の線維芽細胞にＩＬ−１（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１）を作用させるとＰＧＥ２産生が１０倍以上亢進したことから（非特許文献７参照）、歯根嚢胞におけるＰＧＥ２産生の主体は嚢胞結合組織性被膜由来の線維芽細胞であると示唆されている。
【０００５】
歯根嚢胞由来の線維芽細胞様細胞（Ｒａｄｉｃｕｌａｒ ｃｙｓｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ、以下、ＲＣ ｃｅｌｌｓとする）は、ＰＧＥ２の作用によって、上皮の増殖因子でもあるＫＧＦ（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＨＧＦ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）や、骨吸収因子でありｇｐ１３０をレセプターに共有するＩＬ−６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６）、ＩＬ−１１（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１１）、ＬＩＦ（ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）等の炎症性メディエーターの産生が促進されることから、間接的にも嚢胞拡大に関与している可能性が示唆されている（非特許文献８、９参照）。
【０００６】
また、野崎（非特許文献１０参照）および本発明者ら（非特許文献１１）はｉｎ ｖｉｔｒｏの実験系で、ＰＧＥ２による刺激によって、ＲＣ ｃｅｌｌｓおよび歯原性角化嚢胞由来の線維芽細胞様細胞（Ｏｄｏｎｔｏｇｅｎｉｃ ｋｅｒａｔｏｃｙｓｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ、以下、ＫＣ ｃｅｌｌｓとする）において、ＨＧＦ、ＩＬ−６およびＰＧＥ２の産生が促進されることを確認している。そして、これらの細胞がＰＧＥ２による刺激によってＰＧＥ２産生を促進させたことから、ＰＧＥ２のオートクリン機構を有することを示唆し、同様の機構がｉｎ ｖｉｖｏにおいても存在すれば、根管からの持続的な抗原の供給がなくとも、嚢胞の拡大が継続する可能性があることを報告している。
【０００７】
近年、培養滑膜線維芽細胞にＩＬ−１β（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β）存在下で、ＰＧＥ２刺激を行うと、ｐ３８ＭＡＰＫの活性化を介してＣＯＸ２（Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ２）の発現が促進かつ安定化されること（非特許文献１２参照）や、ＩＬ−１刺激による滑膜線維芽細胞様細胞のＩＬ−６産生促進にｐ３８が関与することが報告されている（非特許文献１３参照）。
ＭＡＰＫファミリーは、細胞外からの情報を細胞内へ伝える細胞内シグナル伝達経路を構成する分子群であり（非特許文献１４参照）、ｐ３８は特に高浸透圧、熱および炎症性サイトカインなどの刺激によって活性化されることから（非特許文献１５参照）、ＰＧＥ２刺激によるＲＣ ｃｅｌｌｓのＰＧＥ２およびＩＬ−６産生促進におけるシグナル伝達機構には、ｐ３８が関与している可能性が考えられる。
そこで本発明者は、顎嚢胞の治療に有用な薬剤を見出すために、ＰＧＥ２刺激による、ＲＣ ｃｅｌｌｓのＣＯＸ、ＩＬ−６の遺伝子発現ならびにＰＧＥ２、ＩＬ−６産生への影響を調べ、これらの炎症性メディエーターの発現および産生を抑制し得る物質を検討した。
【非特許文献１】Ｍｅｇｈｊｉ Ｓ、 Ｑｕｒｅｓｈｉ Ｗ、 Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ Ｂ、 Ｈａｒｒｉｓ Ｍ （１９９６） Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｏｄｏｎｔｏｇｅｎｉｃ ｃｙｓｔｓ． Ａｒｃｈ． Ｏｒａｌ． Ｂｉｏｌ． ４１、 ５２３−５３１
【非特許文献２】石川梧朗、秋吉正豊（１９７８）口腔病理学．第１版、永末書店、京都、３７８−３９１
【非特許文献３】枝 重夫（１９９７）嚢胞および嚢胞性病変．ハンディ病理学・口腔病理学．第１版、下野正基編、学建書院、東京、２２２−２３２
【非特許文献４】Ｈａｒｒｉｓ Ｍ、 Ｔｏｌｌｅｒ Ｐ （１９７５） Ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｄｅｎｔａｌ ｃｙｓｔｓ． Ｂｒ． Ｍｅｄ． Ｂｕｌｌ． ３１、 １５９−１６３
【非特許文献５】川崎孝一、大森明、松田なおみ（２００７）サルの抜髄歯を用いた歯根嚢胞の発生に関する実験的研究、日本歯科保存学雑誌５０、８０−９０
【非特許文献６】Ｈａｒｒｉｓ Ｍ、 Ｊｅｎｋｉｎｓ ＭＶ、 Ｂｅｎｎｅｔｔ Ａ、 Ｗｉｌｌｓ ＭＲ （１９７３） Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｂｙ ｄｅｎｔａｌ ｃｙｓｔｓ． Ｎａｔｕｒｅ ２４５、 ２１３−２１５
【非特許文献７】Ｈａｒｖｅｙ Ｗ、 Ｇｕａｔ−Ｃｈｅｎ Ｆ、 Ｇｏｒｄｏｎ Ｄ、 Ｍｅｇｈｊｉ Ｓ、 Ｅｖａｎｓ Ａ、 Ｈａｒｒｉｓ Ｍ （１９８４） Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ａｓ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｃｙｃｌｉｎ ａｎｄ ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｄｅｎｔａｌ ｃｙｓｔ ｉｎ ｍａｎ． Ａｒｃｈ． Ｏｒａｌ． Ｂｉｏｌ． ２９、 ２２３−２２９
【非特許文献８】野崎弘晃、大島光宏、山口洋子、小木曽文内、明石俊和、大塚吉兵衛（２００１）ＰＧＥ２が歯根嚢胞由来細胞のケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）産生に及ぼす影響、日本歯科保存学雑誌４４、９１７−９２３
【非特許文献９】野崎弘晃、大島光宏、山口洋子、小木曽文内、明石俊和、大塚吉兵衛（２００１）ＰＧＥ２が歯根嚢胞由来細胞の骨吸収性サイトカイン産生に及ぼす影響．日本歯科保存学雑誌４４、８３６−８４３
【非特許文献１０】野崎弘晃（２００２）ＰＧＥ２が歯根嚢胞由来細胞のＰＧＥ２産生に及ぼす影響．日本歯科保存学雑誌４５、２７３−２８１
【非特許文献１１】大島崇史、宮田博史、大島光宏、山口洋子、古豊育太朗、小木曽文内、大塚吉兵衛、伊藤公一（２００６）ＰＧＥ２が歯根嚢胞および歯原性角化嚢胞由来細胞のＨＧＦ、ＩＬ−６ および ＰＧＥ２産生に及ぼす影響．日本歯科保存学雑誌、７９７−８０９
【非特許文献１２】Ｆａｏｕｒ ＷＨ、 Ｈｅ Ｙ、 Ｈｅ ＱＷ、 ｄｅ Ｌａｄｕｒａｎｔａｙｅ Ｍ、 Ｑｕｉｎｔｅｒｏ Ｍ、 Ｍａｎｃｉｎｉ Ａ、 Ｄｉ Ｂａｔｔｉｓｔａ ＪＡ （２００１） Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２ ｍＲＮＡ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｉｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β−ｔｒｅａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６、 ３１７２０−３１７３１
【非特許文献１３】Ｍｉｙａｚａｗａ Ｋ、 Ｍｏｒｉ Ａ、 Ｍｉｙａｔａ Ｈ、 Ａｋａｈａｎｅ Ｍ、 Ａｊｉｓａｗａ Ｙ、 Ｏｋｕｄａｉｒａ Ｈ （１９９８） Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１ｂｅｔａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅ ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅｓ ｂｙ ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３、 ２４８３２−２４８３８
【非特許文献１４】緒方正人（２００４）炎症制御におけるｐ３８ ＭＡＰキナーゼの役割．臨床免疫４１、４０４−４１０
【非特許文献１５】山本拓也、西田栄介 （２００５） ＭＡＰキナーゼカスケードの多様な役割．生命現象や疾患を支配する分子メカニズムと新しい研究法 現在と未来 シグナル伝達研究２００５−’０６実験医学２３、１６４９−１６５６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、外科的手術を必要としない顎嚢胞を予防または治療するための新しい組成物および当該組成物を用いた顎嚢胞の予防または治療方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤が顎嚢胞由来細胞において炎症性メディエーターの発現および産生の抑制に効果があることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を有効成分として含む組成物は、嚢胞内に直接局所投与等することにより、骨吸収に関連した炎症性メディエーターの発現および産生を抑制し、嚢胞の拡大を抑制することができる。さらに嚢胞の拡大に伴う、骨吸収を抑制することができる。本発明の予防または治療用の組成物は歯原性角化嚢胞等の歯根嚢胞以外の顎嚢胞にも用いることができる。
【００１０】
すなわち、本発明は次の（１）〜（１１）の顎嚢胞を予防または治療するための新しい組成物等に関する。
（１） ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を有効成分として含む顎嚢胞の予防または治療用の組成物。
（２） ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤が４−（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅまたは４−（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｉｎｙｌｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅである上記（１）に記載の組成物。
（３） 当該組成物が顎嚢胞の拡大を抑制する上記（１）または（２）に記載の組成物。
（４） 当該組成物が顎嚢胞の細胞壁を構成する細胞の増殖を抑制することで、顎嚢胞の拡大を抑制する上記（３）に記載の組成物。
（５） 当該組成物が顎嚢胞の細胞壁を構成する細胞のｐ３８活性化を抑制することで、顎嚢胞の拡大を抑制する上記（３）に記載の組成物。
（６） 当該組成物が顎嚢胞の細胞壁を構成する細胞のＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現を抑制することで、顎嚢胞の拡大を抑制する上記（３）に記載の組成物。
（７） 当該組成物が顎嚢胞の細胞壁を構成する細胞のＰＧＥ２およびＩＬ−６の産生を抑制することで、顎嚢胞の拡大を抑制する上記（３）に記載の組成物。
（８） 顎嚢胞の細胞壁を構成する細胞が歯根嚢胞由来の線維芽細胞様細胞または歯原性角化嚢胞由来の線維芽細胞様細胞である上記（４）〜（７）のいずれかに記載の組成物。
（９） 嚢胞内局所投与用の組成物である上記（１）〜（８）のいずれかに記載の組成物。
（１０）顎嚢胞が歯根嚢胞または歯原性角化嚢胞である上記（１）〜（９）のいずれかに記載の組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により確立された顎嚢胞を予防または治療するための新しい組成物は、外科的な切除等以外に有効な方法がなかった顎嚢胞の治療において、薬剤による予防または治療を可能とする。本発明の組成物は、嚢胞内への直接局所投与が可能であるため人体に与える副作用が少なく有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の「組成物」とは、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を有効成分とする顎嚢胞の予防または治療用の組成物のことをいう。
本発明の組成物は、顎嚢胞の予防、治療または外科的切除後の再発防止に利用できる。対象となる顎嚢胞としては、歯根嚢胞、歯原性角化嚢胞等が挙げられる。
【００１３】
本発明の組成物に含まれるｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、顎嚢胞の予防または治療に効果があればいずれのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤であっても良い。
例えば、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤としては、４−（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、４−（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｉｎｙｌｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、２−（４−Ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−ｐｙｒｉｄｉｎ−４−ｙｌ−１，２−ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒａｚｏｌ−３−ｏｎｅ、（ＲＳ）−｛４−［５−（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｎｙｌ−３Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−４−ｙｌ］ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ｝−（１−ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｅ］、５−（２−Ａｍｉｎｏ−４−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ）−４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−１−（４−ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｌｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｔｒａｎｓ−１−（４−Ｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ）−４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（２−ｍｅｔｈｏｘｙｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−４−ｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、２−Ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｈｅｎｙｌ−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｏｘａｚｏｌｅまたは６−（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏ［２，１−ｂ］ｔｈｉａｚｏｌｅ等が挙げられ、特に４−（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅまたは４−（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｉｎｙｌｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅを用いることが好ましい。また、これらの化合物の生理学的に許容される塩、例えば塩酸塩も本発明のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤に含まれるものとする。
【００１４】
これらのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、市販のものを用いることもできる。例えば、４−（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅであれば、メルク社の製品番号ＳＢ２０２１９０を用いることができ、４−（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｉｎｙｌｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅであればメルク社の製品番号ＳＢ２０３５８０（ＳＢ２０３５８０ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いることができる。
また、２−（４−Ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−ｐｙｒｉｄｉｎ−４−ｙｌ−１，２−ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒａｚｏｌ−３−ｏｎｅであれば、メルク社の製品番号ｐ３８ ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを、（ＲＳ）−｛４−［５−（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｎｙｌ−３Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−４−ｙｌ］ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ｝−（１−ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｅ］であれば、メルク社の製品番号ｐ３８ ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＩＩを、５−（２−Ａｍｉｎｏ−４−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ）−４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−１−（４−ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｌｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅであれば、メルク社の製品番号ＳＢ ２２００２５を、ｔｒａｎｓ−１−（４−Ｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ）−４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（２−ｍｅｔｈｏｘｙｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−４−ｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅであれば、メルク社の製品番号ＳＢ ２３９０６３を、２−Ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｈｅｎｙｌ−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｏｘａｚｏｌｅであれば、メルク社の製品番号ＳＣ ６８３７６を、または６−（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏ［２，１−ｂ］ｔｈｉａｚｏｌｅであれば、メルク社の製品番号ＳＫＦ−８６００２を用いることができる。
【００１５】
さらに、本発明の「組成物」は、有効成分のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤と併用して、他の阻害剤を用いることができる。他の阻害剤としては、血小板由来成長因子受容体のリン酸化（活性化）を阻害する効果を有するメシル酸イマニチブや、ＣＯＸの阻害剤で、細胞のＰＧＥ２産生を抑制する効果があるアスピリン、インドメタシンまたはデキサメタゾン等が挙げられる。また、血管新生阻害薬であるｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（ロシュ社、登録商標アバスチン）や臨床試験中であるＫＲＮ９５１（麒麟麦酒社、参考文献１）等が挙げられる。また抗生物質類も挙げられ、これらを一種類以上組み合わせて併用することにより、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の含有量を減らすことができ、副作用の危険性を下げることができる。
［参考文献１］ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６６， ９１３４−９１４２， Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １５， ２００６
【００１６】
その他、本発明の「組成物」には、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を有効成分とし、そのｐ３８の活性化を阻害する作用を損なわないものであればいずれの成分も含むことができる。
すなわち、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤のみでもよく、また、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤以外に薬剤を製造する上で必要とされる一般的な成分をも含むことができる。
本発明の「組成物」は投与方法に合わせて好ましい形態であれば、顆粒、粉末、固形、ゲル状、ゾル状、または溶液状等のいずれの形態であっても良く、その形態を保つための安定剤等も含むことができる。
【００１７】
本発明の顎嚢胞の予防または治療方法とは、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を有効成分として含む組成物を顎嚢胞または顎嚢胞の発生の可能性が高い部位に投与することをいう。
「組成物」の投与方法としては、顎嚢胞の発生の可能性が高い部位に本発明の組成物を塗布すること等で投与することができる。さらに顎嚢胞の発生の予防を目的とする場合には、根管貼薬として、綿栓やペーパーポイント等に滲み込ませて根管内に投与することができ、外科的切除後の再発防止を目的とする場合には、徐放性となるように、コラーゲンスポンジ等の吸収性の担体を併用して投与することができる。本発明の組成物を予防のために投与する、顎嚢胞の発生の高い部位としては、感染根管治療によって、器械刺激や組織障害を受けやすい、根管治療中の歯等の部位が挙げられる。
また、顎嚢胞が発生した後であれば、嚢胞内に局所投与することで、人体に与える副作用の可能性を下げることができる。
【００１８】
本発明の顎嚢胞の予防または治療方法による、顎嚢胞の予防または治療の効果は、顎嚢胞の発生や、発生後の顎嚢胞の拡大が抑制されたことから判断できる。
顎嚢胞の拡大の抑制とは、本発明の組成物を投与したことにより、顎嚢胞の細胞壁を構成する細胞の増殖が抑制されること、当該細胞のｐ３８活性化が抑制されること、ＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現が抑制されることや当該細胞のＰＧＥ２およびＩＬ−６の産生が抑制されることで判断することができる。
【００１９】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２０】
組成物の調製
ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤である４−（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅとして、メルク社の製品番号ＳＢ２０２１９０を用いた。また４−（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｉｎｙｌｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅとして、メルク社の製品番号ＳＢ２０３５８０（ＳＢ２０３５８０ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いた。これらを有効成分とする組成物（以下、有効成分によって、組成物（ＳＢ２０２１９０）または組成物（ＳＢ２０３５８０）とする）を次のように調製し、顎嚢胞の予防または治療に用いた。
【００２１】
１）組成物（ＳＢ２０３５８０）
メルク社より購入した粉末のＳＢ２０３５８０（塩酸塩）を、終末濃度の１０００倍濃いものとなるように水で調製し、小分けして、フリーザーに凍結保存した。使用時に終末濃度（２μＭ）となるように希釈して用いた。
２）組成物（ＳＢ２０２１９０）
メルク社より購入した粉末のＳＢ２０２１９０を、ＤＭＳＯで溶かして終末濃度の１０００倍濃いものとなるように調製し、小分けして、フリーザーに凍結保存した。使用時に終末濃度（２μＭ）となるように希釈して用いた。
【００２２】
［試験例］
材料の調製
１．組成物
実施例１で調製した組成物を用い、顎嚢胞由来細胞への効果を調べた。
２．顎嚢胞由来細胞
顎嚢胞由来細胞の一つとして、日本大学歯学部付属歯科病院口腔外科、歯内療法科で治療の目的で外科的に摘出され、同病院検査室病理部で歯根嚢胞または歯原性角化嚢胞と診断された嚢胞組織の一部から、歯根嚢胞由来のＲＣ ｃｅｌｌｓと歯原性角化嚢胞由来のＫＣ ｃｅｌｌｓを得た。なお、試料の採取は日本大学歯学部倫理委員会の規定に基いて行った。また、患者には組織の一部が本研究に用いられることをあらかじめ説明し、文書による同意を得た。
ＲＣ ｃｅｌｌｓは、野崎ら（非特許文献８参照）の方法に準じて得た。すなわち、組織片を３％の抗生物質溶液（ペニシリン／ストレプトマイシン／ネオマイシン、ＰＳＮ、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、Ｗａｋｏ）で数回洗浄し、歯科用メス（Ｎｏ．１５、Ｆｅａｔｈｅｒ）で細片化した。６例の歯根嚢胞から組織片を得て、それぞれ個体別に用いた。
６穴プレート（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ Ｂａｋｅｌｉｔｅ）の底に当該組織片をカバースリップで固定後、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）および１％ＰＳＮを含むＤＭＥＭで、３７℃および５％ＣＯ２／９５％ａｉｒの条件下で初代培養を行った。約２週間後、外生した細胞がコンフルエントになった時点で、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞を剥離し、同様の条件下で継代培養を行い、４から７代継代したものをＲＣ ｃｅｌｌｓとして用いた。
【００２３】
［試験例１］
ＲＣ ｃｅｌｌｓのｐ３８活性化に及ぼす組成物の効果
１．ＲＣ ｃｅｌｌｓのｐ３８活性化
１）上記試験例で調製した６例のＲＣ ｃｅｌｌｓを６穴プレートに入れ、初代培養と同様の条件下でコンフルエントになるまで培養した。
２）無血清のＤＭＥＭで２４時間の血清飢餓を行った後、組成物（ＳＢ２０３５８０）を終末濃度２μＭとなるように加え、１時間処理をした（ＳＢ処理群）。比較として組成物を添加しないＲＣ ｃｅｌｌｓを用いた（ＳＢ未処理群）。
３）２）にＰＧＥ２として、小野薬品から供与されたＰＧＥ２の安定な誘導体であるＰＧＥ２ β−ＣＤ（以下、ＰＧＥ２ β−ＣＤをＰＧＥ２とする）を終末濃度０．１μＭとなるように加え、０、５、１５、３０、６０および１２０分間細胞を刺激した。
４）各々の時間刺激した後、ＰＧＥ２を含む培地を取り除き、ＰＢＳで洗浄した後、それぞれのウェルに２５０μｌのｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、０．５％ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、３０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、０．５ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ、７４ＫＩＵ／ｍｌ ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）を用いて細胞層の回収を行った。
【００２４】
２．ｐ３８活性化の確認
活性化（リン酸化）ｐ３８の有無は、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇを用いて調べた。
１）細胞溶解液中のタンパクを１０％ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｓｌａｂ ｇｅｌ（ｃ−ＰＡＧＥＬ、ＡＴＴＯ）で電気泳動を行って分離した後、ｇｅｌ上のタンパクをＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写し、ブロックエース（雪印乳業）でブロッキングを行った。
２）一次抗体としてａｎｔｉ−ａｃｔｉｖｅ ｐ３８（ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ、ポリクローナル、Ｐｒｏｍｅｇａ）を、１０倍希釈したブロックエースで２０００倍希釈して用いた。二次抗体としてビオチン標識ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ）を、１０倍希釈したブロックエースで５０００倍希釈して用い、さらにｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識ストレプトアビジン（ＫＰＬ）とインキュベートした後、ＥＣＬ法（ＩｍｍｕｎｏＳｔａｒ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｗａｋｏ）でエックス線フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）上にバンドを検出した。
３）リン酸化ｐ３８を確認するためのポジティブコントロールとしてａｎｉｓｏｍｙｃｉｎ 処理したＣ−６ ｇｌｉｏｍａ 細胞の溶解液、ネガティブコントロールとして未処理のＣ−６ ｇｌｉｏｍａ 細胞の溶解液（ｐ３８ ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃｅｌｌ Ｅｘｔｒａｃｔｓ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いた。
【００２５】
３．ｔｏｔａｌ ｐ３８量の確認
ｔｏｔａｌ ｐ３８量は、ｒｅｐｒｏｂｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（Ｒｅ−ｂｌｏｔ ｐｌｕｓ ｓｔｒｏｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）で活性化ｐ３８を調べた転写膜を１５分間ストリッピングし、ブロッキング後にａｎｔｉ−ｐ３８ ＭＡＰＫ（ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ、ポリクローナル抗体、Ｓｉｇｍａ）を、１０倍希釈したブロックエースで５０００倍希釈して用い、以後は上述と同様の方法で調べた。
【００２６】
４．結果
ｐ３８の活性化におよぼすＰＧＥ２刺激の影響をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇで調べた結果を図１に示した。
活性化ｐ３８は、すべての症例（ＳＢ未処理群）において分子量３８−ｋＤａにＰＧＥ２刺激５分から３０分後に強く認められ、その後はしだいに減少した。また、ｔｏｔａｌ ｐ３８量として、すべての症例においてＰＧＥ２刺激０分から１２０分後までの刺激時間で、分子量３８−ｋＤａにほぼ同じ強さのバンドとして認められたことから、すべてのレーンでほぼ同じ量のタンパクが泳動されていることが確認された。
一方、組成物（ＳＢ２０３５８０）を加えたＳＢ処理群においては、図２に示すとおり、ＳＢ未処理群と比較して、刺激後５分から３０分で活性化ｐ３８のバンドの減少がみられた。図２では、代表として２例を示した。従って、本発明の組成物（ＳＢ２０３５８０）は、ＲＣ ｃｅｌｌｓのＰＧＥ２刺激によるｐ３８活性化を抑制することが確認された。
【００２７】
［試験例２］
ＲＣ ｃｅｌｌｓのＣＯＸ１、ＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現に及ぼす組成物の効果
１．ＲＣ ｃｅｌｌｓのＣＯＸ１、ＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現
１）上記試験例で調製した６例のＲＣ ｃｅｌｌｓを６穴プレートに入れ、初代培養と同様の条件下でコンフルエントになるまで培養した。
２）無血清のＤＭＥＭで２４時間の血清飢餓を行った後、組成物（ＳＢ２０３５８０）を終末濃度２μＭとなるように加え、１時間処理をした（ＳＢ処理群）。比較として組成物を添加しないＲＣ ｃｅｌｌｓを用いた（ＳＢ未処理群）。
３）２）にＰＧＥ２を終末濃度０．１μＭとなるように加え、０、１、３、６、１２および２４時間細胞を刺激した。
４）各々の刺激時間後、ＰＧＥ２を含む培地を取り除き、ＰＢＳで洗浄した後、Ｔｒｉｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞層を回収し、全ＲＮＡを抽出した。
【００２８】
２．ＣＯＸ１、ＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現の確認
ＣＯＸ１、ＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現は、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を用いて調べた。
１）上記で抽出した全ＲＮＡより、ＧｅｎｅＡｍｐ ＲＮＡ ＰＣＲ ｃｏｒｅ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてｍＲＮＡからｃＤＮＡへ変換した。
２）得られたｃＤＮＡを用いてＣＯＸ１、ＣＯＸ２、ＩＬ−６および内部標準としてグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）に特異的なプライマーと、蛍光色素としてＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によりｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法（５０℃２分、９５℃１０分の後、９５℃１５秒、６０℃１分で４０サイクル）を行った。プライマーの塩基配列は表１および配列表配列番号１〜８に示した。
３）ＧＡＰＤＨの定量結果で補正する相対定量で目的遺伝子を定量し、ＳＢ未処理群とＳＢ処理群との比較には、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ ｓｉｇｎｅｄ−ｒａｎｋｓ ｔｅｓｔを用いて統計学的処理を行った。
【００２９】
【表１】
【００３０】
３．結果
ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法によってＰＧＥ２刺激がＲＣ ｃｅｌｌｓのＣＯＸ１、ＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現に及ぼした影響を図３−１、３−２、３−３に示した。
１）ＣＯＸ１の遺伝子発現は、ＳＢ未処理群（図ではＰＧＥ２又はＰＧＥ２刺激群とする。以下同じ）、ＳＢ処理群（図ではＳＢ２０３５８０、ＳＢ２０２１９０又はＳＢ処理群とする。以下同じ）ともに、症例５および６で時間依存的にＰＧＥ２刺激によってわずかに上昇する傾向を示したが、他の症例において変化はほとんどみられなかった。また、ＳＢ２０３５８０の添加がＣＯＸ１の遺伝子発現に及ぼす影響はほとんど認められなかった。
２）ＣＯＸ２の遺伝子発現は、５症例でＰＧＥ２刺激後１時間をピークに、また１症例で３時間をピークに顕著に上昇した。その後、刺激後６時間まで減少し、１２および２４時間後に再び上昇する傾向を示した。ＳＢ処理群の症例１を除いた５症例において、ＣＯＸ２の遺伝子発現の上昇は、ＳＢ未処理群と比較して顕著に抑制されていた。
３）ＩＬ−６の遺伝子発現は、ほぼすべての症例でＰＧＥ２刺激後１時間をピークに上昇し、その後は減少した。またＳＢ処理群では、症例１および３を除いた４症例で、その遺伝子発現はＰＧＥ２刺激群と比較して顕著に抑制されていた。
【００３１】
４．統計学的処理の結果
６症例を平均して、統計学的処理を行った結果を図４に示した。
１）ＣＯＸ１の遺伝子発現は、２４時間でＳＢ未処理群およびＳＢ処理群いずれも２倍程度に上昇していた。ＳＢ未処理群においては３、１２および２４時間で、ＳＢ処理群においては６、１２および２４時間でコントロール（０時間）と比較して有意な上昇が認められたが、ＳＢ未処理群とＳＢ処理群との比較では有意な差は認められなかった。これは、ＰＧＥ２刺激によるＣＯＸ１の遺伝子発現の変化にｐ３８の活性化が関与している可能性が低いためであると考えられる。
２）ＣＯＸ２の遺伝子発現は、ＳＢ未処理群においてコントロール（０時間）と比較して１、３、１２および２４時間後で有意な上昇が確認された。また、ＳＢ処理群ではＰＧＥ２刺激群と比較して０、１、３、６および２４時間後で有意に減少した。
３）ＩＬ−６の遺伝子発現は、ＳＢ未処理群においてコントロールと比較して１および３時間後で有意な上昇が確認された。また、ＳＢ処理群ではＳＢ未処理群と比較して０、１、３および６時間後で有意に減少した。
４）従って、本発明の組成物（ＳＢ２０３５８０）は、ＲＣ ｃｅｌｌｓのＰＧＥ２刺激によるＣＯＸ２の遺伝子発現およびをＩＬ−６の遺伝子発現を抑制することが確認された。
【００３２】
［試験例３］
ＲＣ ｃｅｌｌｓのＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現に及ぼす組成物の効果
１．ＲＣ ｃｅｌｌｓのＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現
上記試験例で調製した２例のＲＣ ｃｅｌｌｓに、組成物（ＳＢ２０２１９０）または組成物（ＳＢ２０３５８０）を用いて、試験例２、１．と同様の方法でＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現を行った。以下、組成物（ＳＢ２０２１９０）で処理したものをＳＢ処理群（ＳＢ２０２１９０）と、組成物（ＳＢ２０３５８０）で処理したものをＳＢ処理群（ＳＢ２０３５８０）と表わす。
２．ＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現の確認
試験例２、２．と同様の方法で、ＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現を確認し、ＧＡＰＤＨの定量結果で補正する相対定量で目的遺伝子を定量した。
【００３３】
３．結果
２症例の遺伝子発現の結果を図５に示した。
１）ＣＯＸ２の遺伝子発現は、ＳＢ未処理群においてコントロール（０時間）と比較して１、および３時間後で有意な上昇が確認された。また、ＳＢ処理群（ＳＢ２０２１９０）およびＳＢ処理群（ＳＢ２０３５８０）ではＳＢ未処理群と比較して１、３時間後で有意に減少した。ＳＢ処理群（ＳＢ２０３５８０）と比べて、ＳＢ処理群（ＳＢ２０２１９０）の方が有意に減少していることから、組成物（ＳＢ２０２１９０）の方が、より効果が強いと考えられた。
２）ＩＬ−６の遺伝子発現は、ＳＢ未処理群においてコントロールと比較して１および３時間後で有意な上昇が確認された。また、ＳＢ処理群（ＳＢ２０２１９０）およびＳＢ処理群（ＳＢ２０３５８０）ではＳＢ未処理群と比較して１および３時間後で有意に減少した。ＳＢ処理群（ＳＢ２０３５８０）とＳＢ処理群（ＳＢ２０２１９０）では、有位な差は見られなかった。
３）以上より、本発明の組成物（ＳＢ２０２１９０）または組成物（ＳＢ２０３５８０）は、ＲＣ ｃｅｌｌｓのＰＧＥ２刺激によるＣＯＸ２の遺伝子発現およびをＩＬ−６の遺伝子発現を抑制することが確認された。
【００３４】
［試験例４］
ＲＣ ｃｅｌｌｓのＰＧＥ２およびＩＬ−６産生に及ぼす組成物の効果
１．ＲＣ ｃｅｌｌｓのＰＧＥ２およびＩＬ−６産生および定量
１）上記試験例で調製した６例のＲＣ ｃｅｌｌｓを２４穴プレートに入れ、初代培養と同様の条件下でコンフルエントになるまで培養した。
２）無血清のＤＭＥＭで２４時間の血清飢餓を行った後、組成物（ＳＢ２０３５８０）を終末濃度２μＭとなるように加え、１時間処理をした（ＳＢ処理群）。比較として組成物を添加しないＲＣ ｃｅｌｌｓを用いた（ＳＢ未処理群）。
３）２）にＰＧＥ２を終末濃度０．１μＭとなるように加え、３時間細胞を刺激した。
４）３）の細胞を無血清のＤＭＥＭで２回洗浄し、５００μｌ／ｗｅｌｌの無血清のＤＭＥＭと交換した後、培養上清を３時間後に回収した。
５）さらに、ＳＢ未処理群およびＳＢ処理群それぞれのコントロールは、ＰＧＥ２による刺激を行わずに、上記４）までの工程を行った後、３時間後に回収した培養上清を用いた。
６）回収した培養上清をＰｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＥＩＡ ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）および ｈｕｍａｎ ＩＬ−６ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）を用い、製造者指示に従ってＰＧＥ２量とＩＬ−６量を各２連で測定した。
７）得られた６症例の成績は、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ ｓｉｇｎｅｄ−ｒａｎｋｓ ｔｅｓｔにより統計学的処理を行った。
【００３５】
２．結果
１）ＰＧＥ２の産生に及ぼす組成物（ＳＢ２０３５８０）の効果を図６および図７に示した。
図６に示すように、ＳＢ未処理群の培養上清中のＰＧＥ２量は、コントロールと比較して顕著に増加した。また、すべての症例においてＳＢ処理群の培養上清中のＰＧＥ２量は、ＳＢ未処理群と比較して減少した。統計学的処理を行った結果、図７に示すように、ＳＢ未処理群ではコントロール（無刺激）と比較して有意に増加し、またＳＢ処理群では、ＳＢ未処理群と比較して有意に減少していることが確認された。
２）ＩＬ−６の産生に及ぼす組成物（ＳＢ２０３５８０）の効果を図８および図９に示した。
図８に示すように、ＳＢ未処理群の培養上清中のＩＬ−６量は、すべての症例においてコントロールと比較して顕著に増加した。また、すべての症例においてＳＢ処理群の培養上清中のＩＬ−６量は、ＳＢ未処理群と比較して減少していたが、症例３においては産生量の減少は、他の症例に比べて少ない傾向を示した。統計学的処理を行った結果、図９に示すように、ＰＧＥ２刺激群ではコントロールと比較して有意に増加し、またＳＢ処理群では、ＰＧＥ２刺激群と比較して有意に減少していることが確認された。
３）従って、本発明の組成物（ＳＢ２０３５８０）は、ＰＧＥ２およびＩＬ−６産生を抑制することが確認された。
【００３６】
［試験例５］
ＫＣ ｃｅｌｌｓのＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現に及ぼす組成物の効果
１．ＫＣ ｃｅｌｌｓのＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現
上記試験例で調製した２例のＫＣ ｃｅｌｌｓに、組成物（ＳＢ２０２１９０）または組成物（ＳＢ２０３５８０）を用いて、試験例３と同様の方法でＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現を行い、ＧＡＰＤＨの定量結果で補正する相対定量で目的遺伝子を定量した。また、試験例４と同様の方法で培養上清中に含まれるＩＬ−６の発現量をＥＬＩＳＡで定量した。
【００３７】
２．結果
２症例の遺伝子発現の結果を図１０に示した。また、ＩＬ−６の発現量を図１１に示した。
１）図１０に示すように、ＣＯＸ２の遺伝子発現は、ＳＢ未処理群においてコントロール（０時間）と比較して１、および３時間後で有意な上昇が確認された。また、ＳＢ処理群（ＳＢ２０２１９０）およびＳＢ処理群（ＳＢ２０３５８０）ではＳＢ未処理群と比較して１、３時間後で有意に減少した。
２）図１０に示すように、ＩＬ−６の遺伝子発現は、ＳＢ未処理群においてコントロールと比較して１および３時間後で有意な上昇が確認された。また、ＳＢ処理群（ＳＢ２０２１９０）およびＳＢ処理群（ＳＢ２０３５８０）ではＳＢ未処理群と比較して１時間後で有意に減少した。
症例１においては３時間後でＳＢ処理群（ＳＢ２０２１９０）がＳＢ未処理群と同様に上昇したが、ＳＢ処理群（ＳＢ２０３５８０）では減少した。また、症例２においては、ＳＢ処理群（ＳＢ２０３５８０）と比べて、組成物（ＳＢ２０２１９０）の方が減少した。
３）図１１に示すように、ＳＢ未処理群の培養上清中のＩＬ−６量は、症例１および２においてコントロールと比較して顕著に増加した。また、症例１（２４時間）および２（６時間）においてＳＢ処理群の培養上清中のＩＬ−６量は、ＳＢ未処理群と比較して減少した。
４）以上より、本発明の組成物（ＳＢ２０２１９０）または組成物（ＳＢ２０３５８０）は、ＫＣ ｃｅｌｌｓのＰＧＥ２刺激によるＣＯＸ２の遺伝子発現およびＩＬ−６の遺伝子発現を抑制することが確認された。なお、症例によって効果が高い組成物や効果の持続性が異なる場合があることが示唆された
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の顎嚢胞の予防または治療用の組成物は、顎嚢胞の予防または治療を可能とする。本発明の組成物は、嚢胞内への直接局所投与が可能であるため人体に与える副作用が少なく有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ＲＣ ｃｅｌｌｓのｐ３８活性化に及ぼすＰＧＥ２刺激の影響を示した図である（試験例１）。
【図２】ＲＣ ｃｅｌｌｓのｐ３８活性化に及ぼす組成物の効果を示した図である（試験例１）。
【図３−１】症例１、２におけるＲＣ ｃｅｌｌｓのＣＯＸ１、ＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現に及ぼす組成物の効果を示した図である（試験例２）。
【図３−２】症例３、４におけるＲＣ ｃｅｌｌｓのＣＯＸ１、ＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現に及ぼす組成物の効果を示した図である（試験例２）。
【図３−３】症例５、６におけるＲＣ ｃｅｌｌｓのＣＯＸ１、ＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現に及ぼす組成物の効果を示した図である（試験例２）。
【図４】ＲＣ ｃｅｌｌｓのＣＯＸ１、ＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現に及ぼす組成物の効果を示した図である（試験例２）。
【図５】ＲＣ ｃｅｌｌｓのＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現に及ぼす組成物の効果を示した図である（試験例３）。
【図６】ＲＣ ｃｅｌｌｓのＰＧＥ２産生に及ぼす組成物の効果を示した図である（試験例４）。
【図７】ＲＣ ｃｅｌｌｓのＰＧＥ２産生に及ぼす組成物の効果を示した図である（試験例４）。
【図８】ＲＣ ｃｅｌｌｓのＩＬ−６産生に及ぼす組成物の効果を示した図である（試験例４）。
【図９】ＲＣ ｃｅｌｌｓのＩＬ−６産生に及ぼす組成物の効果を示した図である（試験例４）
【図１０】ＫＣ ｃｅｌｌｓのＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現に及ぼす組成物の効果を示した図である（試験例５）。
【図１１】ＫＣ ｃｅｌｌｓのＩＬ−６産生に及ぼす組成物の効果を示した図である（試験例５）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は顎嚢胞の予防または治療用の組成物に関する。さらに詳しくはｐ３８ＭＡＰＫ（Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）阻害剤を有効成分として含む顎嚢胞の予防または治療用の組成物と、当該組成物を用いた顎嚢胞の新しい予防または治療方法の提供に関する。
【背景技術】
【０００２】
顎嚢胞の治療として、例えば、歯根嚢胞においては、歯の中から根管外へと漏出する感染源を除去した後、防腐的材料を根尖孔まで充填する感染根管治療を試み、治癒しない場合には外科的に切除することが一般的であった。また、歯原性角化嚢胞等の他の顎嚢胞の治療では、外科的に切除する以外に方法がなかった。このように、従来の顎嚢胞の治療には、効果的な薬剤が得られていなかった。
【０００３】
歯根嚢胞は歯性感染症の原因歯の根尖部病巣内に嚢胞が形成される炎症性嚢胞で、根管からの持続的な細菌性の刺激により形成されると考えられている（非特許文献１、２参照）。
歯根嚢胞の嚢胞壁は、病理組織学的に３層からなり、内層の裏層上皮層は不規則な上皮突起をそなえた重層扁平上皮で構成され、これに接して炎症性細胞が浸潤している肉芽組織層、その外層に厚い線維性結合組織層が存在することが知られている。
歯根嚢胞は感染根管治療を行ったにもかかわらず治癒しない場合があることから（非特許文献３参照）、初発の原因は感染であるものの、その後の嚢胞の拡大機構については感染以外の要因、リーマー等による器械刺激、刺激性の強い根管消毒薬による組織障害および抜髄や根幹拡大時の歯髄片等の押し出しによる上皮の増殖等の要因が存在すると考えられている（非特許文献４、５参照）。
【０００４】
その他にも歯根嚢胞の拡大機構に関する要因として、歯根嚢胞壁で産生されるＰＧＥ２（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２）が、嚢胞拡大における主要な骨吸収因子である可能性が報告され（非特許文献６参照）、嚢胞の結合組織性被膜部由来の線維芽細胞にＩＬ−１（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１）を作用させるとＰＧＥ２産生が１０倍以上亢進したことから（非特許文献７参照）、歯根嚢胞におけるＰＧＥ２産生の主体は嚢胞結合組織性被膜由来の線維芽細胞であると示唆されている。
【０００５】
歯根嚢胞由来の線維芽細胞様細胞（Ｒａｄｉｃｕｌａｒ ｃｙｓｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ、以下、ＲＣ ｃｅｌｌｓとする）は、ＰＧＥ２の作用によって、上皮の増殖因子でもあるＫＧＦ（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＨＧＦ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）や、骨吸収因子でありｇｐ１３０をレセプターに共有するＩＬ−６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６）、ＩＬ−１１（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１１）、ＬＩＦ（ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）等の炎症性メディエーターの産生が促進されることから、間接的にも嚢胞拡大に関与している可能性が示唆されている（非特許文献８、９参照）。
【０００６】
また、野崎（非特許文献１０参照）および本発明者ら（非特許文献１１）はｉｎ ｖｉｔｒｏの実験系で、ＰＧＥ２による刺激によって、ＲＣ ｃｅｌｌｓおよび歯原性角化嚢胞由来の線維芽細胞様細胞（Ｏｄｏｎｔｏｇｅｎｉｃ ｋｅｒａｔｏｃｙｓｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ、以下、ＫＣ ｃｅｌｌｓとする）において、ＨＧＦ、ＩＬ−６およびＰＧＥ２の産生が促進されることを確認している。そして、これらの細胞がＰＧＥ２による刺激によってＰＧＥ２産生を促進させたことから、ＰＧＥ２のオートクリン機構を有することを示唆し、同様の機構がｉｎ ｖｉｖｏにおいても存在すれば、根管からの持続的な抗原の供給がなくとも、嚢胞の拡大が継続する可能性があることを報告している。
【０００７】
近年、培養滑膜線維芽細胞にＩＬ−１β（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β）存在下で、ＰＧＥ２刺激を行うと、ｐ３８ＭＡＰＫの活性化を介してＣＯＸ２（Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ２）の発現が促進かつ安定化されること（非特許文献１２参照）や、ＩＬ−１刺激による滑膜線維芽細胞様細胞のＩＬ−６産生促進にｐ３８が関与することが報告されている（非特許文献１３参照）。
ＭＡＰＫファミリーは、細胞外からの情報を細胞内へ伝える細胞内シグナル伝達経路を構成する分子群であり（非特許文献１４参照）、ｐ３８は特に高浸透圧、熱および炎症性サイトカインなどの刺激によって活性化されることから（非特許文献１５参照）、ＰＧＥ２刺激によるＲＣ ｃｅｌｌｓのＰＧＥ２およびＩＬ−６産生促進におけるシグナル伝達機構には、ｐ３８が関与している可能性が考えられる。
そこで本発明者は、顎嚢胞の治療に有用な薬剤を見出すために、ＰＧＥ２刺激による、ＲＣ ｃｅｌｌｓのＣＯＸ、ＩＬ−６の遺伝子発現ならびにＰＧＥ２、ＩＬ−６産生への影響を調べ、これらの炎症性メディエーターの発現および産生を抑制し得る物質を検討した。
【非特許文献１】Ｍｅｇｈｊｉ Ｓ、 Ｑｕｒｅｓｈｉ Ｗ、 Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ Ｂ、 Ｈａｒｒｉｓ Ｍ （１９９６） Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｏｄｏｎｔｏｇｅｎｉｃ ｃｙｓｔｓ． Ａｒｃｈ． Ｏｒａｌ． Ｂｉｏｌ． ４１、 ５２３−５３１
【非特許文献２】石川梧朗、秋吉正豊（１９７８）口腔病理学．第１版、永末書店、京都、３７８−３９１
【非特許文献３】枝 重夫（１９９７）嚢胞および嚢胞性病変．ハンディ病理学・口腔病理学．第１版、下野正基編、学建書院、東京、２２２−２３２
【非特許文献４】Ｈａｒｒｉｓ Ｍ、 Ｔｏｌｌｅｒ Ｐ （１９７５） Ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｄｅｎｔａｌ ｃｙｓｔｓ． Ｂｒ． Ｍｅｄ． Ｂｕｌｌ． ３１、 １５９−１６３
【非特許文献５】川崎孝一、大森明、松田なおみ（２００７）サルの抜髄歯を用いた歯根嚢胞の発生に関する実験的研究、日本歯科保存学雑誌５０、８０−９０
【非特許文献６】Ｈａｒｒｉｓ Ｍ、 Ｊｅｎｋｉｎｓ ＭＶ、 Ｂｅｎｎｅｔｔ Ａ、 Ｗｉｌｌｓ ＭＲ （１９７３） Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｂｙ ｄｅｎｔａｌ ｃｙｓｔｓ． Ｎａｔｕｒｅ ２４５、 ２１３−２１５
【非特許文献７】Ｈａｒｖｅｙ Ｗ、 Ｇｕａｔ−Ｃｈｅｎ Ｆ、 Ｇｏｒｄｏｎ Ｄ、 Ｍｅｇｈｊｉ Ｓ、 Ｅｖａｎｓ Ａ、 Ｈａｒｒｉｓ Ｍ （１９８４） Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ａｓ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｃｙｃｌｉｎ ａｎｄ ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｄｅｎｔａｌ ｃｙｓｔ ｉｎ ｍａｎ． Ａｒｃｈ． Ｏｒａｌ． Ｂｉｏｌ． ２９、 ２２３−２２９
【非特許文献８】野崎弘晃、大島光宏、山口洋子、小木曽文内、明石俊和、大塚吉兵衛（２００１）ＰＧＥ２が歯根嚢胞由来細胞のケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）産生に及ぼす影響、日本歯科保存学雑誌４４、９１７−９２３
【非特許文献９】野崎弘晃、大島光宏、山口洋子、小木曽文内、明石俊和、大塚吉兵衛（２００１）ＰＧＥ２が歯根嚢胞由来細胞の骨吸収性サイトカイン産生に及ぼす影響．日本歯科保存学雑誌４４、８３６−８４３
【非特許文献１０】野崎弘晃（２００２）ＰＧＥ２が歯根嚢胞由来細胞のＰＧＥ２産生に及ぼす影響．日本歯科保存学雑誌４５、２７３−２８１
【非特許文献１１】大島崇史、宮田博史、大島光宏、山口洋子、古豊育太朗、小木曽文内、大塚吉兵衛、伊藤公一（２００６）ＰＧＥ２が歯根嚢胞および歯原性角化嚢胞由来細胞のＨＧＦ、ＩＬ−６ および ＰＧＥ２産生に及ぼす影響．日本歯科保存学雑誌、７９７−８０９
【非特許文献１２】Ｆａｏｕｒ ＷＨ、 Ｈｅ Ｙ、 Ｈｅ ＱＷ、 ｄｅ Ｌａｄｕｒａｎｔａｙｅ Ｍ、 Ｑｕｉｎｔｅｒｏ Ｍ、 Ｍａｎｃｉｎｉ Ａ、 Ｄｉ Ｂａｔｔｉｓｔａ ＪＡ （２００１） Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２ ｍＲＮＡ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｉｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β−ｔｒｅａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６、 ３１７２０−３１７３１
【非特許文献１３】Ｍｉｙａｚａｗａ Ｋ、 Ｍｏｒｉ Ａ、 Ｍｉｙａｔａ Ｈ、 Ａｋａｈａｎｅ Ｍ、 Ａｊｉｓａｗａ Ｙ、 Ｏｋｕｄａｉｒａ Ｈ （１９９８） Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１ｂｅｔａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅ ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅｓ ｂｙ ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３、 ２４８３２−２４８３８
【非特許文献１４】緒方正人（２００４）炎症制御におけるｐ３８ ＭＡＰキナーゼの役割．臨床免疫４１、４０４−４１０
【非特許文献１５】山本拓也、西田栄介 （２００５） ＭＡＰキナーゼカスケードの多様な役割．生命現象や疾患を支配する分子メカニズムと新しい研究法 現在と未来 シグナル伝達研究２００５−’０６実験医学２３、１６４９−１６５６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、外科的手術を必要としない顎嚢胞を予防または治療するための新しい組成物および当該組成物を用いた顎嚢胞の予防または治療方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤が顎嚢胞由来細胞において炎症性メディエーターの発現および産生の抑制に効果があることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を有効成分として含む組成物は、嚢胞内に直接局所投与等することにより、骨吸収に関連した炎症性メディエーターの発現および産生を抑制し、嚢胞の拡大を抑制することができる。さらに嚢胞の拡大に伴う、骨吸収を抑制することができる。本発明の予防または治療用の組成物は歯原性角化嚢胞等の歯根嚢胞以外の顎嚢胞にも用いることができる。
【００１０】
すなわち、本発明は次の（１）〜（１１）の顎嚢胞を予防または治療するための新しい組成物等に関する。
（１） ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を有効成分として含む顎嚢胞の予防または治療用の組成物。
（２） ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤が４−（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅまたは４−（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｉｎｙｌｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅである上記（１）に記載の組成物。
（３） 当該組成物が顎嚢胞の拡大を抑制する上記（１）または（２）に記載の組成物。
（４） 当該組成物が顎嚢胞の細胞壁を構成する細胞の増殖を抑制することで、顎嚢胞の拡大を抑制する上記（３）に記載の組成物。
（５） 当該組成物が顎嚢胞の細胞壁を構成する細胞のｐ３８活性化を抑制することで、顎嚢胞の拡大を抑制する上記（３）に記載の組成物。
（６） 当該組成物が顎嚢胞の細胞壁を構成する細胞のＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現を抑制することで、顎嚢胞の拡大を抑制する上記（３）に記載の組成物。
（７） 当該組成物が顎嚢胞の細胞壁を構成する細胞のＰＧＥ２およびＩＬ−６の産生を抑制することで、顎嚢胞の拡大を抑制する上記（３）に記載の組成物。
（８） 顎嚢胞の細胞壁を構成する細胞が歯根嚢胞由来の線維芽細胞様細胞または歯原性角化嚢胞由来の線維芽細胞様細胞である上記（４）〜（７）のいずれかに記載の組成物。
（９） 嚢胞内局所投与用の組成物である上記（１）〜（８）のいずれかに記載の組成物。
（１０）顎嚢胞が歯根嚢胞または歯原性角化嚢胞である上記（１）〜（９）のいずれかに記載の組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により確立された顎嚢胞を予防または治療するための新しい組成物は、外科的な切除等以外に有効な方法がなかった顎嚢胞の治療において、薬剤による予防または治療を可能とする。本発明の組成物は、嚢胞内への直接局所投与が可能であるため人体に与える副作用が少なく有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の「組成物」とは、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を有効成分とする顎嚢胞の予防または治療用の組成物のことをいう。
本発明の組成物は、顎嚢胞の予防、治療または外科的切除後の再発防止に利用できる。対象となる顎嚢胞としては、歯根嚢胞、歯原性角化嚢胞等が挙げられる。
【００１３】
本発明の組成物に含まれるｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、顎嚢胞の予防または治療に効果があればいずれのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤であっても良い。
例えば、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤としては、４−（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、４−（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｉｎｙｌｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、２−（４−Ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−ｐｙｒｉｄｉｎ−４−ｙｌ−１，２−ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒａｚｏｌ−３−ｏｎｅ、（ＲＳ）−｛４−［５−（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｎｙｌ−３Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−４−ｙｌ］ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ｝−（１−ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｅ］、５−（２−Ａｍｉｎｏ−４−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ）−４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−１−（４−ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｌｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｔｒａｎｓ−１−（４−Ｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ）−４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（２−ｍｅｔｈｏｘｙｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−４−ｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、２−Ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｈｅｎｙｌ−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｏｘａｚｏｌｅまたは６−（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏ［２，１−ｂ］ｔｈｉａｚｏｌｅ等が挙げられ、特に４−（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅまたは４−（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｉｎｙｌｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅを用いることが好ましい。また、これらの化合物の生理学的に許容される塩、例えば塩酸塩も本発明のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤に含まれるものとする。
【００１４】
これらのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、市販のものを用いることもできる。例えば、４−（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅであれば、メルク社の製品番号ＳＢ２０２１９０を用いることができ、４−（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｉｎｙｌｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅであればメルク社の製品番号ＳＢ２０３５８０（ＳＢ２０３５８０ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いることができる。
また、２−（４−Ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−ｐｙｒｉｄｉｎ−４−ｙｌ−１，２−ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒａｚｏｌ−３−ｏｎｅであれば、メルク社の製品番号ｐ３８ ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを、（ＲＳ）−｛４−［５−（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｎｙｌ−３Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−４−ｙｌ］ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ｝−（１−ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｅ］であれば、メルク社の製品番号ｐ３８ ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＩＩを、５−（２−Ａｍｉｎｏ−４−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ）−４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−１−（４−ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｌｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅであれば、メルク社の製品番号ＳＢ ２２００２５を、ｔｒａｎｓ−１−（４−Ｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ）−４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（２−ｍｅｔｈｏｘｙｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−４−ｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅであれば、メルク社の製品番号ＳＢ ２３９０６３を、２−Ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｈｅｎｙｌ−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｏｘａｚｏｌｅであれば、メルク社の製品番号ＳＣ ６８３７６を、または６−（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏ［２，１−ｂ］ｔｈｉａｚｏｌｅであれば、メルク社の製品番号ＳＫＦ−８６００２を用いることができる。
【００１５】
さらに、本発明の「組成物」は、有効成分のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤と併用して、他の阻害剤を用いることができる。他の阻害剤としては、血小板由来成長因子受容体のリン酸化（活性化）を阻害する効果を有するメシル酸イマニチブや、ＣＯＸの阻害剤で、細胞のＰＧＥ２産生を抑制する効果があるアスピリン、インドメタシンまたはデキサメタゾン等が挙げられる。また、血管新生阻害薬であるｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（ロシュ社、登録商標アバスチン）や臨床試験中であるＫＲＮ９５１（麒麟麦酒社、参考文献１）等が挙げられる。また抗生物質類も挙げられ、これらを一種類以上組み合わせて併用することにより、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の含有量を減らすことができ、副作用の危険性を下げることができる。
［参考文献１］ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６６， ９１３４−９１４２， Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １５， ２００６
【００１６】
その他、本発明の「組成物」には、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を有効成分とし、そのｐ３８の活性化を阻害する作用を損なわないものであればいずれの成分も含むことができる。
すなわち、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤のみでもよく、また、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤以外に薬剤を製造する上で必要とされる一般的な成分をも含むことができる。
本発明の「組成物」は投与方法に合わせて好ましい形態であれば、顆粒、粉末、固形、ゲル状、ゾル状、または溶液状等のいずれの形態であっても良く、その形態を保つための安定剤等も含むことができる。
【００１７】
本発明の顎嚢胞の予防または治療方法とは、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を有効成分として含む組成物を顎嚢胞または顎嚢胞の発生の可能性が高い部位に投与することをいう。
「組成物」の投与方法としては、顎嚢胞の発生の可能性が高い部位に本発明の組成物を塗布すること等で投与することができる。さらに顎嚢胞の発生の予防を目的とする場合には、根管貼薬として、綿栓やペーパーポイント等に滲み込ませて根管内に投与することができ、外科的切除後の再発防止を目的とする場合には、徐放性となるように、コラーゲンスポンジ等の吸収性の担体を併用して投与することができる。本発明の組成物を予防のために投与する、顎嚢胞の発生の高い部位としては、感染根管治療によって、器械刺激や組織障害を受けやすい、根管治療中の歯等の部位が挙げられる。
また、顎嚢胞が発生した後であれば、嚢胞内に局所投与することで、人体に与える副作用の可能性を下げることができる。
【００１８】
本発明の顎嚢胞の予防または治療方法による、顎嚢胞の予防または治療の効果は、顎嚢胞の発生や、発生後の顎嚢胞の拡大が抑制されたことから判断できる。
顎嚢胞の拡大の抑制とは、本発明の組成物を投与したことにより、顎嚢胞の細胞壁を構成する細胞の増殖が抑制されること、当該細胞のｐ３８活性化が抑制されること、ＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現が抑制されることや当該細胞のＰＧＥ２およびＩＬ−６の産生が抑制されることで判断することができる。
【００１９】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２０】
組成物の調製
ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤である４−（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅとして、メルク社の製品番号ＳＢ２０２１９０を用いた。また４−（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｉｎｙｌｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅとして、メルク社の製品番号ＳＢ２０３５８０（ＳＢ２０３５８０ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いた。これらを有効成分とする組成物（以下、有効成分によって、組成物（ＳＢ２０２１９０）または組成物（ＳＢ２０３５８０）とする）を次のように調製し、顎嚢胞の予防または治療に用いた。
【００２１】
１）組成物（ＳＢ２０３５８０）
メルク社より購入した粉末のＳＢ２０３５８０（塩酸塩）を、終末濃度の１０００倍濃いものとなるように水で調製し、小分けして、フリーザーに凍結保存した。使用時に終末濃度（２μＭ）となるように希釈して用いた。
２）組成物（ＳＢ２０２１９０）
メルク社より購入した粉末のＳＢ２０２１９０を、ＤＭＳＯで溶かして終末濃度の１０００倍濃いものとなるように調製し、小分けして、フリーザーに凍結保存した。使用時に終末濃度（２μＭ）となるように希釈して用いた。
【００２２】
［試験例］
材料の調製
１．組成物
実施例１で調製した組成物を用い、顎嚢胞由来細胞への効果を調べた。
２．顎嚢胞由来細胞
顎嚢胞由来細胞の一つとして、日本大学歯学部付属歯科病院口腔外科、歯内療法科で治療の目的で外科的に摘出され、同病院検査室病理部で歯根嚢胞または歯原性角化嚢胞と診断された嚢胞組織の一部から、歯根嚢胞由来のＲＣ ｃｅｌｌｓと歯原性角化嚢胞由来のＫＣ ｃｅｌｌｓを得た。なお、試料の採取は日本大学歯学部倫理委員会の規定に基いて行った。また、患者には組織の一部が本研究に用いられることをあらかじめ説明し、文書による同意を得た。
ＲＣ ｃｅｌｌｓは、野崎ら（非特許文献８参照）の方法に準じて得た。すなわち、組織片を３％の抗生物質溶液（ペニシリン／ストレプトマイシン／ネオマイシン、ＰＳＮ、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、Ｗａｋｏ）で数回洗浄し、歯科用メス（Ｎｏ．１５、Ｆｅａｔｈｅｒ）で細片化した。６例の歯根嚢胞から組織片を得て、それぞれ個体別に用いた。
６穴プレート（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ Ｂａｋｅｌｉｔｅ）の底に当該組織片をカバースリップで固定後、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）および１％ＰＳＮを含むＤＭＥＭで、３７℃および５％ＣＯ２／９５％ａｉｒの条件下で初代培養を行った。約２週間後、外生した細胞がコンフルエントになった時点で、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞を剥離し、同様の条件下で継代培養を行い、４から７代継代したものをＲＣ ｃｅｌｌｓとして用いた。
【００２３】
［試験例１］
ＲＣ ｃｅｌｌｓのｐ３８活性化に及ぼす組成物の効果
１．ＲＣ ｃｅｌｌｓのｐ３８活性化
１）上記試験例で調製した６例のＲＣ ｃｅｌｌｓを６穴プレートに入れ、初代培養と同様の条件下でコンフルエントになるまで培養した。
２）無血清のＤＭＥＭで２４時間の血清飢餓を行った後、組成物（ＳＢ２０３５８０）を終末濃度２μＭとなるように加え、１時間処理をした（ＳＢ処理群）。比較として組成物を添加しないＲＣ ｃｅｌｌｓを用いた（ＳＢ未処理群）。
３）２）にＰＧＥ２として、小野薬品から供与されたＰＧＥ２の安定な誘導体であるＰＧＥ２ β−ＣＤ（以下、ＰＧＥ２ β−ＣＤをＰＧＥ２とする）を終末濃度０．１μＭとなるように加え、０、５、１５、３０、６０および１２０分間細胞を刺激した。
４）各々の時間刺激した後、ＰＧＥ２を含む培地を取り除き、ＰＢＳで洗浄した後、それぞれのウェルに２５０μｌのｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、０．５％ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、３０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、０．５ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ、７４ＫＩＵ／ｍｌ ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）を用いて細胞層の回収を行った。
【００２４】
２．ｐ３８活性化の確認
活性化（リン酸化）ｐ３８の有無は、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇを用いて調べた。
１）細胞溶解液中のタンパクを１０％ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｓｌａｂ ｇｅｌ（ｃ−ＰＡＧＥＬ、ＡＴＴＯ）で電気泳動を行って分離した後、ｇｅｌ上のタンパクをＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写し、ブロックエース（雪印乳業）でブロッキングを行った。
２）一次抗体としてａｎｔｉ−ａｃｔｉｖｅ ｐ３８（ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ、ポリクローナル、Ｐｒｏｍｅｇａ）を、１０倍希釈したブロックエースで２０００倍希釈して用いた。二次抗体としてビオチン標識ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ）を、１０倍希釈したブロックエースで５０００倍希釈して用い、さらにｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識ストレプトアビジン（ＫＰＬ）とインキュベートした後、ＥＣＬ法（ＩｍｍｕｎｏＳｔａｒ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｗａｋｏ）でエックス線フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）上にバンドを検出した。
３）リン酸化ｐ３８を確認するためのポジティブコントロールとしてａｎｉｓｏｍｙｃｉｎ 処理したＣ−６ ｇｌｉｏｍａ 細胞の溶解液、ネガティブコントロールとして未処理のＣ−６ ｇｌｉｏｍａ 細胞の溶解液（ｐ３８ ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃｅｌｌ Ｅｘｔｒａｃｔｓ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いた。
【００２５】
３．ｔｏｔａｌ ｐ３８量の確認
ｔｏｔａｌ ｐ３８量は、ｒｅｐｒｏｂｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（Ｒｅ−ｂｌｏｔ ｐｌｕｓ ｓｔｒｏｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）で活性化ｐ３８を調べた転写膜を１５分間ストリッピングし、ブロッキング後にａｎｔｉ−ｐ３８ ＭＡＰＫ（ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ、ポリクローナル抗体、Ｓｉｇｍａ）を、１０倍希釈したブロックエースで５０００倍希釈して用い、以後は上述と同様の方法で調べた。
【００２６】
４．結果
ｐ３８の活性化におよぼすＰＧＥ２刺激の影響をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇで調べた結果を図１に示した。
活性化ｐ３８は、すべての症例（ＳＢ未処理群）において分子量３８−ｋＤａにＰＧＥ２刺激５分から３０分後に強く認められ、その後はしだいに減少した。また、ｔｏｔａｌ ｐ３８量として、すべての症例においてＰＧＥ２刺激０分から１２０分後までの刺激時間で、分子量３８−ｋＤａにほぼ同じ強さのバンドとして認められたことから、すべてのレーンでほぼ同じ量のタンパクが泳動されていることが確認された。
一方、組成物（ＳＢ２０３５８０）を加えたＳＢ処理群においては、図２に示すとおり、ＳＢ未処理群と比較して、刺激後５分から３０分で活性化ｐ３８のバンドの減少がみられた。図２では、代表として２例を示した。従って、本発明の組成物（ＳＢ２０３５８０）は、ＲＣ ｃｅｌｌｓのＰＧＥ２刺激によるｐ３８活性化を抑制することが確認された。
【００２７】
［試験例２］
ＲＣ ｃｅｌｌｓのＣＯＸ１、ＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現に及ぼす組成物の効果
１．ＲＣ ｃｅｌｌｓのＣＯＸ１、ＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現
１）上記試験例で調製した６例のＲＣ ｃｅｌｌｓを６穴プレートに入れ、初代培養と同様の条件下でコンフルエントになるまで培養した。
２）無血清のＤＭＥＭで２４時間の血清飢餓を行った後、組成物（ＳＢ２０３５８０）を終末濃度２μＭとなるように加え、１時間処理をした（ＳＢ処理群）。比較として組成物を添加しないＲＣ ｃｅｌｌｓを用いた（ＳＢ未処理群）。
３）２）にＰＧＥ２を終末濃度０．１μＭとなるように加え、０、１、３、６、１２および２４時間細胞を刺激した。
４）各々の刺激時間後、ＰＧＥ２を含む培地を取り除き、ＰＢＳで洗浄した後、Ｔｒｉｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞層を回収し、全ＲＮＡを抽出した。
【００２８】
２．ＣＯＸ１、ＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現の確認
ＣＯＸ１、ＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現は、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を用いて調べた。
１）上記で抽出した全ＲＮＡより、ＧｅｎｅＡｍｐ ＲＮＡ ＰＣＲ ｃｏｒｅ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてｍＲＮＡからｃＤＮＡへ変換した。
２）得られたｃＤＮＡを用いてＣＯＸ１、ＣＯＸ２、ＩＬ−６および内部標準としてグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）に特異的なプライマーと、蛍光色素としてＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によりｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法（５０℃２分、９５℃１０分の後、９５℃１５秒、６０℃１分で４０サイクル）を行った。プライマーの塩基配列は表１および配列表配列番号１〜８に示した。
３）ＧＡＰＤＨの定量結果で補正する相対定量で目的遺伝子を定量し、ＳＢ未処理群とＳＢ処理群との比較には、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ ｓｉｇｎｅｄ−ｒａｎｋｓ ｔｅｓｔを用いて統計学的処理を行った。
【００２９】
【表１】
【００３０】
３．結果
ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法によってＰＧＥ２刺激がＲＣ ｃｅｌｌｓのＣＯＸ１、ＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現に及ぼした影響を図３−１、３−２、３−３に示した。
１）ＣＯＸ１の遺伝子発現は、ＳＢ未処理群（図ではＰＧＥ２又はＰＧＥ２刺激群とする。以下同じ）、ＳＢ処理群（図ではＳＢ２０３５８０、ＳＢ２０２１９０又はＳＢ処理群とする。以下同じ）ともに、症例５および６で時間依存的にＰＧＥ２刺激によってわずかに上昇する傾向を示したが、他の症例において変化はほとんどみられなかった。また、ＳＢ２０３５８０の添加がＣＯＸ１の遺伝子発現に及ぼす影響はほとんど認められなかった。
２）ＣＯＸ２の遺伝子発現は、５症例でＰＧＥ２刺激後１時間をピークに、また１症例で３時間をピークに顕著に上昇した。その後、刺激後６時間まで減少し、１２および２４時間後に再び上昇する傾向を示した。ＳＢ処理群の症例１を除いた５症例において、ＣＯＸ２の遺伝子発現の上昇は、ＳＢ未処理群と比較して顕著に抑制されていた。
３）ＩＬ−６の遺伝子発現は、ほぼすべての症例でＰＧＥ２刺激後１時間をピークに上昇し、その後は減少した。またＳＢ処理群では、症例１および３を除いた４症例で、その遺伝子発現はＰＧＥ２刺激群と比較して顕著に抑制されていた。
【００３１】
４．統計学的処理の結果
６症例を平均して、統計学的処理を行った結果を図４に示した。
１）ＣＯＸ１の遺伝子発現は、２４時間でＳＢ未処理群およびＳＢ処理群いずれも２倍程度に上昇していた。ＳＢ未処理群においては３、１２および２４時間で、ＳＢ処理群においては６、１２および２４時間でコントロール（０時間）と比較して有意な上昇が認められたが、ＳＢ未処理群とＳＢ処理群との比較では有意な差は認められなかった。これは、ＰＧＥ２刺激によるＣＯＸ１の遺伝子発現の変化にｐ３８の活性化が関与している可能性が低いためであると考えられる。
２）ＣＯＸ２の遺伝子発現は、ＳＢ未処理群においてコントロール（０時間）と比較して１、３、１２および２４時間後で有意な上昇が確認された。また、ＳＢ処理群ではＰＧＥ２刺激群と比較して０、１、３、６および２４時間後で有意に減少した。
３）ＩＬ−６の遺伝子発現は、ＳＢ未処理群においてコントロールと比較して１および３時間後で有意な上昇が確認された。また、ＳＢ処理群ではＳＢ未処理群と比較して０、１、３および６時間後で有意に減少した。
４）従って、本発明の組成物（ＳＢ２０３５８０）は、ＲＣ ｃｅｌｌｓのＰＧＥ２刺激によるＣＯＸ２の遺伝子発現およびをＩＬ−６の遺伝子発現を抑制することが確認された。
【００３２】
［試験例３］
ＲＣ ｃｅｌｌｓのＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現に及ぼす組成物の効果
１．ＲＣ ｃｅｌｌｓのＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現
上記試験例で調製した２例のＲＣ ｃｅｌｌｓに、組成物（ＳＢ２０２１９０）または組成物（ＳＢ２０３５８０）を用いて、試験例２、１．と同様の方法でＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現を行った。以下、組成物（ＳＢ２０２１９０）で処理したものをＳＢ処理群（ＳＢ２０２１９０）と、組成物（ＳＢ２０３５８０）で処理したものをＳＢ処理群（ＳＢ２０３５８０）と表わす。
２．ＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現の確認
試験例２、２．と同様の方法で、ＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現を確認し、ＧＡＰＤＨの定量結果で補正する相対定量で目的遺伝子を定量した。
【００３３】
３．結果
２症例の遺伝子発現の結果を図５に示した。
１）ＣＯＸ２の遺伝子発現は、ＳＢ未処理群においてコントロール（０時間）と比較して１、および３時間後で有意な上昇が確認された。また、ＳＢ処理群（ＳＢ２０２１９０）およびＳＢ処理群（ＳＢ２０３５８０）ではＳＢ未処理群と比較して１、３時間後で有意に減少した。ＳＢ処理群（ＳＢ２０３５８０）と比べて、ＳＢ処理群（ＳＢ２０２１９０）の方が有意に減少していることから、組成物（ＳＢ２０２１９０）の方が、より効果が強いと考えられた。
２）ＩＬ−６の遺伝子発現は、ＳＢ未処理群においてコントロールと比較して１および３時間後で有意な上昇が確認された。また、ＳＢ処理群（ＳＢ２０２１９０）およびＳＢ処理群（ＳＢ２０３５８０）ではＳＢ未処理群と比較して１および３時間後で有意に減少した。ＳＢ処理群（ＳＢ２０３５８０）とＳＢ処理群（ＳＢ２０２１９０）では、有位な差は見られなかった。
３）以上より、本発明の組成物（ＳＢ２０２１９０）または組成物（ＳＢ２０３５８０）は、ＲＣ ｃｅｌｌｓのＰＧＥ２刺激によるＣＯＸ２の遺伝子発現およびをＩＬ−６の遺伝子発現を抑制することが確認された。
【００３４】
［試験例４］
ＲＣ ｃｅｌｌｓのＰＧＥ２およびＩＬ−６産生に及ぼす組成物の効果
１．ＲＣ ｃｅｌｌｓのＰＧＥ２およびＩＬ−６産生および定量
１）上記試験例で調製した６例のＲＣ ｃｅｌｌｓを２４穴プレートに入れ、初代培養と同様の条件下でコンフルエントになるまで培養した。
２）無血清のＤＭＥＭで２４時間の血清飢餓を行った後、組成物（ＳＢ２０３５８０）を終末濃度２μＭとなるように加え、１時間処理をした（ＳＢ処理群）。比較として組成物を添加しないＲＣ ｃｅｌｌｓを用いた（ＳＢ未処理群）。
３）２）にＰＧＥ２を終末濃度０．１μＭとなるように加え、３時間細胞を刺激した。
４）３）の細胞を無血清のＤＭＥＭで２回洗浄し、５００μｌ／ｗｅｌｌの無血清のＤＭＥＭと交換した後、培養上清を３時間後に回収した。
５）さらに、ＳＢ未処理群およびＳＢ処理群それぞれのコントロールは、ＰＧＥ２による刺激を行わずに、上記４）までの工程を行った後、３時間後に回収した培養上清を用いた。
６）回収した培養上清をＰｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＥＩＡ ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）および ｈｕｍａｎ ＩＬ−６ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）を用い、製造者指示に従ってＰＧＥ２量とＩＬ−６量を各２連で測定した。
７）得られた６症例の成績は、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ ｓｉｇｎｅｄ−ｒａｎｋｓ ｔｅｓｔにより統計学的処理を行った。
【００３５】
２．結果
１）ＰＧＥ２の産生に及ぼす組成物（ＳＢ２０３５８０）の効果を図６および図７に示した。
図６に示すように、ＳＢ未処理群の培養上清中のＰＧＥ２量は、コントロールと比較して顕著に増加した。また、すべての症例においてＳＢ処理群の培養上清中のＰＧＥ２量は、ＳＢ未処理群と比較して減少した。統計学的処理を行った結果、図７に示すように、ＳＢ未処理群ではコントロール（無刺激）と比較して有意に増加し、またＳＢ処理群では、ＳＢ未処理群と比較して有意に減少していることが確認された。
２）ＩＬ−６の産生に及ぼす組成物（ＳＢ２０３５８０）の効果を図８および図９に示した。
図８に示すように、ＳＢ未処理群の培養上清中のＩＬ−６量は、すべての症例においてコントロールと比較して顕著に増加した。また、すべての症例においてＳＢ処理群の培養上清中のＩＬ−６量は、ＳＢ未処理群と比較して減少していたが、症例３においては産生量の減少は、他の症例に比べて少ない傾向を示した。統計学的処理を行った結果、図９に示すように、ＰＧＥ２刺激群ではコントロールと比較して有意に増加し、またＳＢ処理群では、ＰＧＥ２刺激群と比較して有意に減少していることが確認された。
３）従って、本発明の組成物（ＳＢ２０３５８０）は、ＰＧＥ２およびＩＬ−６産生を抑制することが確認された。
【００３６】
［試験例５］
ＫＣ ｃｅｌｌｓのＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現に及ぼす組成物の効果
１．ＫＣ ｃｅｌｌｓのＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現
上記試験例で調製した２例のＫＣ ｃｅｌｌｓに、組成物（ＳＢ２０２１９０）または組成物（ＳＢ２０３５８０）を用いて、試験例３と同様の方法でＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現を行い、ＧＡＰＤＨの定量結果で補正する相対定量で目的遺伝子を定量した。また、試験例４と同様の方法で培養上清中に含まれるＩＬ−６の発現量をＥＬＩＳＡで定量した。
【００３７】
２．結果
２症例の遺伝子発現の結果を図１０に示した。また、ＩＬ−６の発現量を図１１に示した。
１）図１０に示すように、ＣＯＸ２の遺伝子発現は、ＳＢ未処理群においてコントロール（０時間）と比較して１、および３時間後で有意な上昇が確認された。また、ＳＢ処理群（ＳＢ２０２１９０）およびＳＢ処理群（ＳＢ２０３５８０）ではＳＢ未処理群と比較して１、３時間後で有意に減少した。
２）図１０に示すように、ＩＬ−６の遺伝子発現は、ＳＢ未処理群においてコントロールと比較して１および３時間後で有意な上昇が確認された。また、ＳＢ処理群（ＳＢ２０２１９０）およびＳＢ処理群（ＳＢ２０３５８０）ではＳＢ未処理群と比較して１時間後で有意に減少した。
症例１においては３時間後でＳＢ処理群（ＳＢ２０２１９０）がＳＢ未処理群と同様に上昇したが、ＳＢ処理群（ＳＢ２０３５８０）では減少した。また、症例２においては、ＳＢ処理群（ＳＢ２０３５８０）と比べて、組成物（ＳＢ２０２１９０）の方が減少した。
３）図１１に示すように、ＳＢ未処理群の培養上清中のＩＬ−６量は、症例１および２においてコントロールと比較して顕著に増加した。また、症例１（２４時間）および２（６時間）においてＳＢ処理群の培養上清中のＩＬ−６量は、ＳＢ未処理群と比較して減少した。
４）以上より、本発明の組成物（ＳＢ２０２１９０）または組成物（ＳＢ２０３５８０）は、ＫＣ ｃｅｌｌｓのＰＧＥ２刺激によるＣＯＸ２の遺伝子発現およびＩＬ−６の遺伝子発現を抑制することが確認された。なお、症例によって効果が高い組成物や効果の持続性が異なる場合があることが示唆された
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の顎嚢胞の予防または治療用の組成物は、顎嚢胞の予防または治療を可能とする。本発明の組成物は、嚢胞内への直接局所投与が可能であるため人体に与える副作用が少なく有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ＲＣ ｃｅｌｌｓのｐ３８活性化に及ぼすＰＧＥ２刺激の影響を示した図である（試験例１）。
【図２】ＲＣ ｃｅｌｌｓのｐ３８活性化に及ぼす組成物の効果を示した図である（試験例１）。
【図３−１】症例１、２におけるＲＣ ｃｅｌｌｓのＣＯＸ１、ＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現に及ぼす組成物の効果を示した図である（試験例２）。
【図３−２】症例３、４におけるＲＣ ｃｅｌｌｓのＣＯＸ１、ＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現に及ぼす組成物の効果を示した図である（試験例２）。
【図３−３】症例５、６におけるＲＣ ｃｅｌｌｓのＣＯＸ１、ＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現に及ぼす組成物の効果を示した図である（試験例２）。
【図４】ＲＣ ｃｅｌｌｓのＣＯＸ１、ＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現に及ぼす組成物の効果を示した図である（試験例２）。
【図５】ＲＣ ｃｅｌｌｓのＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現に及ぼす組成物の効果を示した図である（試験例３）。
【図６】ＲＣ ｃｅｌｌｓのＰＧＥ２産生に及ぼす組成物の効果を示した図である（試験例４）。
【図７】ＲＣ ｃｅｌｌｓのＰＧＥ２産生に及ぼす組成物の効果を示した図である（試験例４）。
【図８】ＲＣ ｃｅｌｌｓのＩＬ−６産生に及ぼす組成物の効果を示した図である（試験例４）。
【図９】ＲＣ ｃｅｌｌｓのＩＬ−６産生に及ぼす組成物の効果を示した図である（試験例４）
【図１０】ＫＣ ｃｅｌｌｓのＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現に及ぼす組成物の効果を示した図である（試験例５）。
【図１１】ＫＣ ｃｅｌｌｓのＩＬ−６産生に及ぼす組成物の効果を示した図である（試験例５）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を有効成分として含む顎嚢胞の予防または治療用の組成物。
【請求項２】
ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤が４−（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅまたは４−（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｉｎｙｌｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅである請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
当該組成物が顎嚢胞の拡大を抑制する請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
当該組成物が顎嚢胞の細胞壁を構成する細胞の増殖を抑制することで、顎嚢胞の拡大を抑制する請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
当該組成物が顎嚢胞の細胞壁を構成する細胞のｐ３８活性化を抑制することで、顎嚢胞の拡大を抑制する請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
当該組成物が顎嚢胞の細胞壁を構成する細胞のＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現を抑制することで、顎嚢胞の拡大を抑制する請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
当該組成物が顎嚢胞の細胞壁を構成する細胞のＰＧＥ２およびＩＬ−６の産生を抑制することで、顎嚢胞の拡大を抑制する請求項３に記載の組成物。
【請求項８】
顎嚢胞の細胞壁を構成する細胞が歯根嚢胞由来の線維芽細胞様細胞または歯原性角化嚢胞由来の線維芽細胞様細胞である請求項４〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
嚢胞内局所投与用の組成物である請求項１〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
顎嚢胞が歯根嚢胞または歯原性角化嚢胞である請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１】
ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を有効成分として含む顎嚢胞の予防または治療用の組成物。
【請求項２】
ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤が４−（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅまたは４−（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｉｎｙｌｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅである請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
当該組成物が顎嚢胞の拡大を抑制する請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
当該組成物が顎嚢胞の細胞壁を構成する細胞の増殖を抑制することで、顎嚢胞の拡大を抑制する請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
当該組成物が顎嚢胞の細胞壁を構成する細胞のｐ３８活性化を抑制することで、顎嚢胞の拡大を抑制する請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
当該組成物が顎嚢胞の細胞壁を構成する細胞のＣＯＸ２およびＩＬ−６の遺伝子発現を抑制することで、顎嚢胞の拡大を抑制する請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
当該組成物が顎嚢胞の細胞壁を構成する細胞のＰＧＥ２およびＩＬ−６の産生を抑制することで、顎嚢胞の拡大を抑制する請求項３に記載の組成物。
【請求項８】
顎嚢胞の細胞壁を構成する細胞が歯根嚢胞由来の線維芽細胞様細胞または歯原性角化嚢胞由来の線維芽細胞様細胞である請求項４〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
嚢胞内局所投与用の組成物である請求項１〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
顎嚢胞が歯根嚢胞または歯原性角化嚢胞である請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００８−２６０７０３（Ｐ２００８−２６０７０３Ａ）
【公開日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１０３３６３（Ｐ２００７−１０３３６３）
【出願日】平成１９年４月１１日（２００７．４．１１）
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月１１日（２００７．４．１１）
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【Ｆターム（参考）】
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