顕微鏡
【課題】複数種の蛍光を検出する場合において、検出する蛍光のスペクトル形状を維持するとともに、各チャネルの感度調整を容易に行うことができる顕微鏡を提供する。
【解決手段】標本１１５において発生した光を集光する対物レンズ１１４と、集光された光をスペクトル成分に分光するグレーティング１１７と、分光されたスペクトル成分をそれぞれ検出する複数のチャネルを有するＰＭＴ１１８と、ＰＭＴ１１８の各チャネルの感度を調節する制御部３０１とを備え、制御部３０１が、検出する光の波長範囲に関する情報に基づいてチャネルを複数のグループに分け、グループ内の全てのチャネルが同一の感度となるように、チャネルの感度をグループ毎に一括して調節する顕微鏡１を採用する。
【解決手段】標本１１５において発生した光を集光する対物レンズ１１４と、集光された光をスペクトル成分に分光するグレーティング１１７と、分光されたスペクトル成分をそれぞれ検出する複数のチャネルを有するＰＭＴ１１８と、ＰＭＴ１１８の各チャネルの感度を調節する制御部３０１とを備え、制御部３０１が、検出する光の波長範囲に関する情報に基づいてチャネルを複数のグループに分け、グループ内の全てのチャネルが同一の感度となるように、チャネルの感度をグループ毎に一括して調節する顕微鏡１を採用する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、試料から発せられた蛍光を分光素子によってスペクトル成分に分割し、分割したスペクトル成分を、複数のチャネルを有する多チャネル光検出器によってそれぞれ検出する顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１および２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００６−０９８４１９号公報
【特許文献２】特開２００６−１３８８７５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところで、特許文献１および２に開示されている顕微鏡では、多チャネル光検出器への印加電圧を調整することで、全てのチャネルの感度が一括して調整されるようになっていた。したがって、多重染色観察のように複数種の蛍光を観測する場合には、いずれかの蛍光の強度を高くすると、他の蛍光においてスペクトル成分が飽和してしまうことがある。その結果、他の蛍光におけるスペクトル形状が変化してしまい、精度良く観察を行うことができないという不都合があった。
【０００５】
一方、各蛍光におけるスペクトル形状を維持したままゲインを調整するためには、各チャネルの感度を１つずつ調整しなければならず、その作業が非常に煩雑となってしまうという不都合があった。
【０００６】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたもので、複数種の蛍光を検出する場合において、検出する蛍光のスペクトル形状を維持するとともに、各チャネルの感度調整を容易に行うことができる顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、標本において発生した光を集光する対物レンズと、該対物レンズにより集光された光をスペクトル成分に分光する分光素子と、該分光素子により分光されたスペクトル成分をそれぞれ検出する複数のチャネルを有する光検出器と、該光検出器の各チャネルの感度を調節する感度調節部とを備え、該感度調節部が、検出する光の波長範囲に関する情報に基づいて前記チャネルを複数のグループに分け、グループ内の全ての前記チャネルが同一の感度となるように、前記チャネルの感度をグループ毎に一括して調節する顕微鏡を採用する。
【０００８】
本発明によれば、標本において発生して対物レンズにより集光された光が、分光素子によりスペクトル成分に分光され、分光されたスペクトル成分は、複数のチャネルを有する光検出器によりそれぞれ検出される。この場合において、光検出器のチャネルは、感度調節部により、検出する光の波長範囲に関する情報に基づいて複数のグループに分けられ、グループ内の全てのチャネルが同一の感度となるように、その感度がグループ毎に一括して調節される。
【０００９】
これにより、グループ化されたチャネル群毎、すなわち、検出する光の波長範囲毎に、スペクトル形状を維持しつつ、その強度を調整することができる。例えば、複数種の蛍光を同時に観察する場合においても、各蛍光のスペクトル成分を飽和させることなく、各蛍光の強度をそれぞれ別個に調整することができ、精度良く観察することができる。また、各チャネルの感度を個別に調節する必要性を排除することができ、その調節作業を容易にすることができる。
【００１０】
上記発明において、前記感度調節部が、前記光検出器に印加される電圧を前記チャネルのグループ毎に調節することとしてもよい。
感度調節部によって、光検出器に印加される電圧をグループ毎に調節することで、チャネルの感度をグループ毎に調節することができ、検出する光の波長範囲毎に、スペクトル形状を維持しつつ、その強度を調整することができる。
【００１１】
上記発明において、前記光検出器により検出する光の輝度情報を積算する積算部を備え、前記感度調節部が、前記積算部の積算時間を前記チャネルのグループ毎に調節することとしてもよい。
感度調節部によって積算部の積算時間をグループ毎に調節することで、各チャネルにより検出した輝度情報をグループ毎に調節することができ、検出する光の波長範囲毎に、スペクトル形状を維持しつつ、その強度を調整することができる。
【００１２】
上記発明において、前記光検出器により検出する光の輝度情報を増幅する増幅部を備え、前記感度調節部が、前記増幅部の増幅率を前記チャネルのグループ毎に調節することとしてもよい。
感度調節部によって増幅部の増幅率をグループ毎に調節することで、各チャネルにより検出した輝度情報をグループ毎に調節することができ、検出する光の波長範囲毎に、スペクトル形状を維持しつつ、その強度を調整することができる。
【００１３】
上記発明において、複数の前記チャネルのグループに対して、グループ毎に前記感度調節部の感度調整値を設定可能な入力部を備えることとしてもよい。
このようにすることで、ＧＵＩ（Graphical User Interface）等の入力部によって、複数のチャネルのグループに対して、グループ毎に感度調節部の感度調整値を設定し、各チャネルの感度をグループ毎に調節することができる。
【００１４】
上記発明において、前記チャネル全体の感度を調節する全体感度調節部と、前記光検出器により検出する光の輝度情報を積算する積算部と、前記積算部により積算された輝度情報が所定値以上となる最大積算時間において、いずれかのスペクトル成分が飽和するような前記チャネル全体の最大感度を記憶する記憶部とを備え、前記感度調節部は、前記チャネル全体の感度が、前記記憶部に記憶されている最大感度よりも下がった場合には、前記チャネルのグループ毎に前記積算部の積算時間を最大化させることとしてもよい。
【００１５】
感度調節部によって積算部の積算時間をグループ毎に調節することで、各チャネルにより検出した輝度情報をグループ毎に調節することができ、検出する光の波長範囲毎に、スペクトル形状を維持しつつ、その強度を調整することができる。この場合において、チャネル全体の感度が、いずれかのスペクトル成分が飽和する最大感度よりも下がった場合に、チャネルのグループ毎に積算部の積算時間を最大化させることで、積算された輝度情報のＳ／Ｎ比を向上させることができる。
【００１６】
上記発明において、前記チャネルにより検出されたスペクトル成分のいずれかが所定の閾値を超えたときに、前記感度調節部が前記チャネルの感度をグループ毎に調節することとしてもよい。
このようにすることで、スペクトル成分のいずれかが所定の閾値を超えたとき、例えばスペクトル成分のいずれかが飽和したときに、チャネルの感度が調節されるので、いずれのスペクトル成分を飽和させることなく、検出される光の強度を調整することができる。
【００１７】
上記発明において、グループ毎の前記チャネルの感度と輝度情報とを対応付けて記憶する記憶部を備えることとしてもよい。
各グループのチャネルの感度と輝度情報とを対応付けて記憶部に記憶させておくことで、検出する光の波長範囲毎にチャネルの感度を再現することができる。また、波長範囲毎の輝度情報とその感度から、全てのチャネルを同一の感度にした場合の標本の画像を生成することができる。
【００１８】
上記発明において、前記光検出器により検出された光に基づいて画像を生成する画像生成部と、該画像生成部により生成された画像を表示する表示部と、該表示部に表示された画面において所定の範囲を設定する設定部とを備え、前記感度調節部が、前記設定部により設定された所定の範囲において前記チャネルの感度を調節することとしてもよい。
【００１９】
このようにすることで、表示部に表示された画面において設定部により注目する領域（所定の範囲）を設定し、この注目する領域（所定の範囲）において、検出する光の波長範囲毎に、スペクトル形状を維持しつつ、その強度を調整することができる。一方、表示部に表示された画面中の非注目領域については、強度を調整する必要性を排除することができる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、複数種の蛍光を検出する場合において、検出する蛍光のスペクトル形状を維持するとともに、各チャネルの感度調整を容易に行うことができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の一実施形態に係る顕微鏡の概略構成図である。
【図２】図１の信号調節部の機能ブロック図である。
【図３】図１の顕微鏡により実行される処理を示すフローチャートである。
【図４】図３のステップ５の詳細な処理を示すフローチャートである。
【図５】図１のＣＰＵに設定値未満のディジタル信号値が入力されている状態を説明する図である。
【図６】図１のＣＰＵに設定値以上のディジタル信号値が入力されている状態を説明する図である。
【図７】第１の変形例に係る顕微鏡により実行される処理を示すフローチャートである。
【図８】第２の変形例に係る顕微鏡により実行される処理を示すフローチャートである。
【図９】第３の変形例に係る顕微鏡により実行される処理を示すフローチャートである。
【図１０】第４の変形例に係る顕微鏡により実行される処理を示すフローチャートである。
【図１１】図１０の顕微鏡の動作を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の一実施形態に係る顕微鏡について、図面を参照して説明する。
図１は、本実施形態の顕微鏡１の概略構成図である。図１に示すように、本実施形態の顕微鏡１は、レーザ光を標本１１５に照射して標本１１５において発生した蛍光を検出する顕微鏡本体１０１と、顕微鏡本体１０１からの信号の強度等を調整する信号調整部２０１と、各部を制御するとともに顕微鏡本体１０１からの信号に基づいて画像を生成する制御部（感度調節部、画像生成部）３０１と、制御部３０１により生成された標本１１５の画像を表示する表示部４０１と、ユーザによる設定条件等が入力される入力部（入力部、設定部）５０１とを主な構成要素として備えている。
【００２３】
顕微鏡本体１０１は、光源１１１と、ビームスプリッタ１１２と、走査系１１３と、対物レンズ１１４と、ステージ１１６と、グレーティング（分光素子）１１７と、ＰＭＴ（光検出器）１１８とを備えている。
【００２４】
光源１１１は、レーザ光を射出するようになっている。このレーザ光は、標本１１５内の蛍光指示薬を励起させ、蛍光を発生させるようになっている。
【００２５】
ビームスプリッタ１１２は、光源１１１からのレーザ光を透過する一方、標本１１５において発生して対物レンズ１１４により集光された蛍光を反射するようになっている。このような構成を有することで、ビームスプリッタ１１２は、レーザ光の光路と標本１１５からの蛍光の光路とを分岐するようになっている。
【００２６】
走査系１１３は、例えばアルミコートされた一対のガルバノミラー（図示略）を有しており、これら一対のガルバノミラーの角度を変化させ、ラスタスキャン方式で駆動されるようになっている。これにより、光源１１１からのレーザ光を標本１１５上において２次元的に走査させるようになっている。
【００２７】
対物レンズ１１４は、走査系１１３により走査されたレーザ光を標本１１５上に照射する一方、標本１１５から発生した蛍光を集光するようになっている。
【００２８】
グレーティング１１７は、標本１１５において発生し、ビームスプリッタ１１２により分岐された蛍光を波長毎のスペクトル成分に分光し、分光したスペクトル成分をＰＭＴ１１８に入射させるようになっている。
【００２９】
ＰＭＴ１１８は、例えば３２チャネルの光電子増倍管(Photo Multiplier Tube)であり、スペクトル成分を検出するチャネルが、グレーティング１１７により分光される方向に複数配列されている。このような構成を有することで、ＰＭＴ１１８は、各チャネルによりグレーティング１１７により分光されたスペクトル成分をそれぞれ検出し、検出したスペクトル成分の輝度情報を電気信号へ変換して、信号調整部２０１に出力するようになっている。
【００３０】
信号調整部２０１は、ＰＭＴ１１８により検出する蛍光の輝度情報を積算する積算器（積算部）２０１と、ＰＭＴ１１８により検出する蛍光の輝度情報にオフセットを与えて増幅するオフセット増幅器（増幅部）２１２と、ＰＭＴ１１８により検出する蛍光の輝度情報をディジタル信号に変換するＡ／Ｄ変換器２１３とを備えている。
【００３１】
信号調整部２０１は、図２に示すように、ＰＭＴ１１８のチャネル毎に、積算器２１１、オフセット増幅器２１２、およびＡ／Ｄ変換器２１３が設置されており、Ａ／Ｄ変換器２１３により変換されたディジタル信号を制御部３０１のＣＰＵ３１１に出力するようになっている。
【００３２】
制御部３０１は、各種の情報を記憶するメモリ（記憶部）３１２と、Ａ／Ｄ変換器２１３からのディジタル信号を合算するマルチプレクサ３１３と、これらを制御するＣＰＵ３１１とを備えており、レーザ光源１１１、走査系１１３、積算器２１１、オフセット増幅器２１２、Ａ／Ｄ変換器２１３のそれぞれを制御する信号を生成するようになっている。
【００３３】
また、制御部３０１は、ＰＭＴ１１８が検出する蛍光の波長範囲に関する情報に基づいて、ＰＭＴ１１８のチャネルを複数のグループ（チャネル群）に分け、チャネル群内の全てのチャネルが同一の感度となるように、チャネルの感度をチャネル群毎に一括して調節するようになっている。ここでは、その具体的な調節方法として、制御部３０１が、積算器２１１の積算時間をチャネル群毎に調節することとして説明する。
【００３４】
また、制御部３０１は、Ａ／Ｄ変換器２１３から出力されるディジタル信号値が、予め設定された設定値を超えたことをＣＰＵ３１１が認識したとき、積算器２１１における積算時間と、そのときのＰＭＴ１１８への印加電圧（以下「ＨＶ」と表記する。）をＣＰＵ３１１がメモリ３１２に記憶するようになっている。
【００３５】
また、制御部３０１は、ＣＰＵ３１１により算出された蛍光強度に基づいてスキャン画像を生成するようになっている。
表示部４０１は、例えば液晶ディプレイであり、制御部３０１により生成された標本１１５の画像を表示するようになっている。
【００３６】
入力部５０１は、例えばキーボードやマウスからなり、ユーザが入力した値や動作を取得してＣＰＵ３１１に出力するようになっている。入力部５０１は、ユーザによって、例えば感度調整、色素選択、閾値設定についての入力が行われるようになっており、その入力情報を制御部３０１に出力するようになっている。
【００３７】
このような構成とすることで、入力部５０１によりユーザがＰＭＴ１１８の感度調整を行うと、制御部３０１を介してＰＭＴ１１８の感度が調整されるようになっている。また、入力部５０１によりユーザが色素選択についての入力を行うと、その設定が制御部３０１内のＣＰＵ３１１に送られ、ＣＰＵ３１１では選択した色素に対応する合算チャネル（チャネル群）を決定し、決定したチャネルにより検出されたスペクトル成分の合算処理が行われるようになっている。
【００３８】
また、入力部５０１によりユーザが閾値設定についての入力を行うと、その設定が制御部３０１内のＣＰＵ３１１に送られ、ＣＰＵ３１１では設定した閾値と、ＰＭＴ１１８の各チャネルにより検出されたスペクトル成分の強度との比較が行われるようになっている。
【００３９】
上記構成を有する顕微鏡１において、蛍光画像を取得する際の動作について以下に説明する。
顕微鏡本体１０１において、レーザ光源１１１から出射された光は、ビームスプリッタ１１２を通過してレーザ走査系１１３に入射する。レーザ走査系１１３は、対物レンズ１１４を通してレーザ光を、ステージ１１６上に載置された標本１１５の平面上においてＸ方向およびＹ方向に走査する。
【００４０】
標本１１５の焦点面においては、レーザ光により標本１１５内の蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。標本１１５からの蛍光は、対物レンズ１１４により集光され、レーザ走査系１１３を経て、ビームスプリッタ１１２によりレーザ光の光路から分岐される。
【００４１】
分岐された蛍光は、グレーティング１１７により分光され、分光されたスペクトル成分は波長ごとにＰＭＴ１１８の各チャネルに入射する。このとき、ＰＭＴ１１８には少なくとも二つの蛍光色素からの蛍光が入射する。
【００４２】
ＰＭＴ１１８の各チャネルでは、検出したスペクトル成分の強度に応じて、その輝度情報が電気信号へ変換され、信号調整部２０１にそれぞれ出力される。信号調整部２０１では、ＰＭＴ１１８のチャネル毎に、積算器２１１によりスペクトル成分の輝度情報が積算されるとともに、オフセット増幅器２１２によりスペクトル成分の輝度情報が増幅される。そして、このような処理が行われた輝度情報は、Ａ／Ｄ変換器２１３によりディジタル信号に変換され、ＣＰＵ３１１に出力される。
【００４３】
ＣＰＵ３１１が受け取ったディジタル信号は、ＣＰＵ３１１内部のマルチプレクサ３１３により、蛍光色素に対応したチャネル群分が合算される。合算された信号は、蛍光色素ごとに生じるため複数存在し、それぞれ表示部４０１に表示される１ピクセル分の輝度信号となる。
以上を繰返し、レーザ走査系１１３により走査することで、表示部４０１において蛍光画像が生成される。
【００４４】
上記の蛍光画像の取得動作において、信号調整部２０１および制御部３０１により実行される詳細な制御について以下に説明する。
ＰＭＴ１１８の各チャネルから出力される全ての信号は、標本１１５上にレーザ光を照射して１ピクセルの信号を取得する時間中、それぞれ積算器２１１により積算され続ける。その積算時間は、ＣＰＵ３１１により生成されているクロック信号（以下、「ＰＣＬＫ信号」と表記する。）により決定する。例えば、ＰＣＬＫ信号がＬｏｗである間は積算され、ＰＣＬＫ信号がＨｉｇｈとなったときには積算器２１１の値を０とする。
【００４５】
積算器２１１の後にはオフセット増幅器２１２が接続されており、積算後の信号にオフセットが与えられる。オフセットを与えられた信号は、Ａ／Ｄ変換器２１３によりディジタル信号に変換される。
【００４６】
また、積算されている間も、積算器２１１からの信号は、オフセット増幅器２１２およびＡ／Ｄ変換器２１３を通過して、ＣＰＵ３１１へと出力され続ける。ここで、Ａ／Ｄ変換器２１３では、ＣＰＵ３１１にて生成されるＰＣＬＫ信号よりも短い周期をもつ変換クロックで、オフセット増幅器２１２からのアナログ信号がディジタル信号に変換されており、変換クロックごとにＣＰＵ３１１へとディジタル信号を出力する。
【００４７】
このときのＣＰＵ３１１の処理について図３に示すフローチャートを用いて説明する。
まず、ステップＳ１において、ＰＣＬＫ信号がＬｏｗであるか否かが判断される。
ＰＣＬＫ信号がＬｏｗであれば、ステップＳ２において、ＣＰＵ３１１によりディジタル信号値が取得される。
【００４８】
次に、ステップＳ３において、各チャネルのそれぞれについてディジタル信号値が設定値以下であるか否かが判断される。この際、図５に示すように、ディジタル信号値が設定値以下である場合には、ＰＣＬＫ信号がＨｉｇｈになったとき、つまり積算時間がｔｍａｘになったときのディジタル信号値がＣＰＵ３１１へ出力される（ステップＳ４）。
【００４９】
ここで、この設定値は、ディジタル信号がＡ／Ｄ変換器２１３の変換範囲外となっているとＣＰＵ３１１が判断する値であり、走査開始前にユーザが入力部５０１を介して、変換範囲の何％とするかを入力して設定した値である。
【００５０】
このディジタル信号は、ステップＳ５において、ＣＰＵ３１１内部のマルチプレクサ３１３により合算される。その際の詳細な手順について図４に示すフローチャートを用いて説明する。
まず、蛍光色素に対応したチャネル群が決定されるように、その対応表（以下、「ＬＵＴ」と表記する。）をメモリ３１２に保存しておく。
【００５１】
表示部４０１に表示されている蛍光色素をユーザが入力部５０１を介して選択すると、ＣＰＵ３１１が使用する蛍光色素が認識され（ステップＳ５−１）、ＬＵＴを参照することで合算するチャネル群が決定される（ステップＳ５−２）。
【００５２】
次に、ステップＳ５−３において、このチャネル群からの各信号が加算され、表示部４０１に表示される１ピクセル分の輝度信号となる。このとき、蛍光色素ごとに輝度信号が生じるため、これら輝度信号が表示部４０１へ同時に伝送されるが、重ねて表示しても蛍光色素ごとに分けて表示してもよい。
【００５３】
また、図３のステップＳ３において、図６に示すように、ＰＣＬＫ信号がＬｏｗのうちに設定値以上のディジタル信号値がＣＰＵ３１１に出力されてきた場合には、Ａ／Ｄ変換器２１３の変換範囲外になったとＣＰＵ３１１が判断し、そのときの積算時間ｔｓとＨＶの値がメモリ３１２に記憶される（ステップＳ６）。
【００５４】
そして、設定値以上のディジタル信号値が、表示部４０１に表示される１ライン中、つまり標本１１５上を走査するＹ軸の値が一定の間に、３ピクセル続いた場合には（ステップＳ７）、ＣＰＵ２１１により取得された３ピクセル分の積算時間の平均が算出される（ステップＳ８）。
【００５５】
そして、次のピクセルから合算するチャネル群に対応する各積算器２１１に対して、ＰＣＬＫ信号を分周して適用することで、ステップＳ８において算出された平均積算時間が、次のピクセル以降の１ピクセル積算時間に設定される（ステップＳ９）。このとき、チャネル群からの各信号のうち、輝度信号が最大となるチャネルの積算器２１１に適用した積算時間を、チャネル群の各積算器２１１に適用する。
【００５６】
ステップＳ１０では、ＰＣＬＫ信号がＨｉｇｈになるまで待機することで、積算器２１１において積算されている値を０とする。
これにより、チャネル群の各チャネルからの信号強度により形成されるスペクトルの形状を保ったまま、輝度信号の強度を調整することができる。
【００５７】
以上の処理を、ユーザが入力部５０１を介して制御条件（ＨＶ値、オフセット値、蛍光色素の選択）の入力を終了した後、少なくとも１フレーム分走査する。
なお、表示部４０１には、図３のステップＳ６からステップＳ１０を行うための制御機能をＯＮ／ＯＦＦするボタンを表示し、入力部５０１を介してユーザが切り替えることができることとしてもよい。
【００５８】
以上のように、本実施形態に係る顕微鏡１によれば、標本１１５において発生して対物レンズ１１４により集光された蛍光が、グレーティング１１７によりスペクトル成分に分光され、分光されたスペクトル成分は、複数のチャネルを有するＰＭＴ１１８によりそれぞれ検出される。この場合において、ＰＭＴ１１８のチャネルは、制御部３０１により、検出する光の波長範囲に関する情報に基づいて複数のグループ（チャネル群）に分けられ、チャネル群内の全てのチャネルが同一の感度となるように、その感度がチャネル群毎に一括して調節される。
【００５９】
これにより、グループ化されたチャネル群毎、すなわち、検出する光の波長範囲毎に、スペクトル形状を維持しつつ、その強度を調整することができる。例えば、複数種の蛍光を同時に観察する場合においても、各蛍光のスペクトル成分を飽和させることなく、各蛍光の強度をそれぞれ別個に調整することができ、精度良く観察することができる。また、各チャネルの感度を個別に調節する必要性を排除することができ、その調節作業を容易にすることができる。
【００６０】
また、制御部３０１によって積算器２１１の積算時間をグループ毎に調節することで、ＰＭＴ１１８の各チャネルにより検出した輝度情報をグループ毎に調節することができ、検出する光の波長範囲毎に、スペクトル形状を維持しつつ、その強度を調整することができる。
【００６１】
また、スペクトル成分のいずれかが設定値を超えたとき、例えばスペクトル成分のいずれかが飽和したときに、ＰＭＴ１１８のチャネルの感度を調節することで、いずれのスペクトル成分を飽和させることなく、検出される蛍光の強度を調整することができる。
【００６２】
なお、制御部３０１によって、ＰＭＴ１１８に印加される電圧をチャネル群毎に調節することとしてもよい。このようにすることで、ＰＭＴ１１８のチャネルの感度をチャネル群毎に調節することができ、検出する光の波長範囲毎に、スペクトル形状を維持しつつ、その強度を調整することができる。
【００６３】
また、制御部３０１によって、オフセット増幅器２１２の増幅率をチャネル群毎に調節することとしてもよい。このようにすることで、ＰＭＴ１１８の各チャネルにより検出した輝度情報をチャネル群毎に調節することができ、検出する光の波長範囲毎に、スペクトル形状を維持しつつ、その強度を調整することができる。
【００６４】
また、各グループのチャネルの感度と輝度情報とを対応付けてメモリ３１２に記憶させておくこととしてもよい。このようにすることで、検出する光の波長範囲毎にチャネルの感度を再現することができる。また、波長範囲毎の輝度情報とその感度から、全てのチャネルを同一の感度にした場合の標本１１５の画像を生成することができる。
【００６５】
［第１の変形例］
以下に、本実施形態の第１の変形例について図７を用いて説明する。
本変形例の顕微鏡１は、積算器２１１の積算時間が変更されている場合には、そのことをユーザに認識させる手段を有している。
本変形例におけるＣＰＵ３１１の処理手順について、図７に示すフローチャートを用いて以下に説明する。
【００６６】
まず、ステップＳ８において、ＣＰＵ３１１により３ピクセル分の積算時間の平均を算出する。
そして、その平均積算時間が次のピクセルに適用されると同時に（ステップＳ９）、表示部４０１に表示される積算時間を適応して得られた輝度情報に基づいて生成された１フレーム分の画像の周辺部について色を変えて表示する（ステップＳ１１）。
このようにすることで、積算時間が調整されている輝度信号によって画像を生成していることを、ユーザが認識することができる。
【００６７】
［第２の変形例］
以下に、本実施形態の第２の変形例について図８を用いて説明する。
本変形例の顕微鏡１は、積算器２１１の積算時間をユーザが任意に変更することを可能とし、入力した積算時間を、蛍光色素に対応した範囲のチャネルに接続される各積算器に適用するように制御している。
【００６８】
具体的には、例えば、積算時間に対応したスライドを蛍光色素ごとに表示部４０１に表示し、そのスライドを入力部５０１を介してユーザが変更することで、スライドの位置に対応して積算時間が決定されることとする。
【００６９】
本変形例におけるＣＰＵ３１１の処理について図８に示すフローチャートを用いて説明する。
表示部４０１に表示されている蛍光色素をユーザが入力部５０１を介して選択すると、ＣＰＵ３１１が使用する蛍光色素を認識し（ステップＳ５−１）、ＬＵＴを参照することで合算するチャネル群が決定される（ステップＳ５−２）。
そして、スライドの位置から積算時間を取得し（ステップＳ１２）、この積算時間を決定されたチャネル群に対応する各積算器２１１に対して適用する（ステップＳ１３）。
このようにすることで、ユーザが任意に調整した信号強度から画像を生成することが可能となる。
【００７０】
［第３の変形例］
以下に、本実施形態の第３の変形例について図９を用いて説明する。
本変形例の顕微鏡１は、ＰＣＬＫ信号に基づいた最大の積算時間、つまり積算時間がｔｍａｘとなっているときにＣＰＵ３１１が受け取るディジタル信号が、初めて設定値以上となったときのＨＶを保存し、レーザ走査途中でＨＶを変更した場合には、記憶したＨＶよりも下げられたときに積算時間をｔｍａｘに戻すようになっている。
【００７１】
本変形例の顕微鏡１は、制御部３０１により、チャネル全体の感度を調節することができるようになっている（全体感度調節部）。
メモリ３１２には、積算器２１１により積算された輝度情報が所定値以上となる最大積算時間において、いずれかのスペクトル成分が飽和するようなチャネル全体の最大感度が記憶されるようになっている。
【００７２】
制御部３０１は、チャネル全体の感度が、メモリ３１２に記憶されている最大感度よりも下がった場合には、チャネルのグループ毎に積算器２１１の積算時間を最大化させるようになっている。
【００７３】
ＨＶの値は、表示部４０１に表示されているＨＶの値をユーザが入力部５０１を介して変更することで調整することができる。
ＰＣＬＫ信号に基づいた最大の積算時間、つまり積算時間がｔｍａｘとなっているときに、ＣＰＵ３１１が受け取るディジタル信号が、初めて設定値以上となったときのＨＶをメモリ３１２に記憶しておく。
【００７４】
その後のＣＰＵ３１１による処理手順について、図９に示すフローチャートに従って説明する。
ＨＶが変化したときにはその値を取得し（ステップＳ１４）、記憶したＨＶの値と比較する（ステップＳ１５）。記憶したＨＶの値よりも大きくなる場合には、図３のステップＳ６からステップＳ１０により積算時間の調整が行われる。記憶したＨＶの値よりも小さい場合には、積算時間をｔｍａｘにすることで元の積算時間に戻される（ステップＳ１６）。
【００７５】
このようにすることで、ＨＶを微動させたときには積算時間の変動が無いため、微小量の感度調整の場合に有効となる。
また、制御部３０１によって積算器２１１の積算時間をグループ毎に調節することで、各チャネルにより検出した輝度情報をグループ毎に調節することができ、検出する光の波長範囲毎に、スペクトル形状を維持しつつ、その強度を調整することができる。この場合において、チャネル全体の感度が、いずれかのスペクトル成分が飽和する最大感度よりも下がった場合に、チャネルのグループ毎に積算器２１１の積算時間を最大化させることで、積算された輝度情報のＳ／Ｎ比を向上させることができる。
【００７６】
［第４の変形例］
以下に、本実施形態の第４変形例について図１０および図１１を用いて説明する。
本変形例の顕微鏡１は、ユーザが選択した範囲においてのみ、図３のステップＳ６からステップＳ１０の処理により、積算時間の調整を行うようになっている。
本変形例におけるＣＰＵ３１１による処理手順について、図１０のフローチャートを用いて説明する。
【００７７】
図１１に示すように、表示部４０１に表示された標本画像においてユーザが任意に選択した選択範囲をＣＰＵ３１１が認識し（ステップＳ１７）、選択範囲内のピクセルに相当するスキャンポイントであるかを判別する（ステップＳ１８）。
【００７８】
選択範囲内である場合には、図３のステップＳ６からステップＳ１０と同様の処理によって積算時間が決定されるように、イネーブル信号をＣＰＵ３１１に対して出力する（ステップＳ１９）。一方、選択範囲外である場合は、イネーブル信号は出力されず、前ピクセルと同じ積算時間が適用され、ＣＰＵ３１１によりディジタル信号値が取得される（ステップＳ２）。これにより積算時間の決定は選択範囲内でのみ行われるが、決定された積算時間はレーザ走査範囲全体に適用されることとなる。
【００７９】
このようにすることで、ユーザが着目したい範囲だけ信号調整手段のダイナミックレンジ内で輝度信号を取得することができる。
また、表示部４０１に表示された画面において入力部５０１により注目する領域（選択範囲）を設定し、この選択範囲において、検出する光の波長範囲毎に、スペクトル形状を維持しつつ、その強度を調整することができる。一方、表示部４０１に表示された画面中の非注目領域については、強度を調整する必要性を排除することができる。
【００８０】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
例えば、本実施形態において、積算器２１１の積算時間、あるいはオフセット増幅器２１２の増幅率、あるいはＨＶをチャネル群毎に調節することとして説明したが、これらを任意に組み合わせてＰＭＴ１１８のチャネルの感度を調節することとしてもよい。
【００８１】
また、図３に示すフローチャートのステップＳ７において、積算器２１１の積算時間を、設定値以上のディジタル信号値が３ピクセル続いた場合に変更することとして説明したが、１〜２ピクセルまたは４ピクセル以上続いた場合に変更することとしてもよい。
【符号の説明】
【００８２】
１ 顕微鏡
１０１ 顕微鏡本体
１１１ 光源
１１２ ビームスプリッタ
１１３ 走査系
１１４ 対物レンズ
１１５ 標本
１１６ ステージ
１１７ グレーティング（分光素子）
１１８ ＰＭＴ（光検出器）
２０１ 信号調整部
２１１ 積算器（積算部）
２１２ オフセット増幅器（増幅部）
２１３ Ａ／Ｄ変換器
３０１ 制御部（感度調節部、画像生成部）
３１１ ＣＰＵ
３１２ メモリ（記憶部）
３１３ マルチプレクサ
４０１ 表示部
５０１ 入力部（入力部、設定部）
【技術分野】
【０００１】
本発明は顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、試料から発せられた蛍光を分光素子によってスペクトル成分に分割し、分割したスペクトル成分を、複数のチャネルを有する多チャネル光検出器によってそれぞれ検出する顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１および２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００６−０９８４１９号公報
【特許文献２】特開２００６−１３８８７５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところで、特許文献１および２に開示されている顕微鏡では、多チャネル光検出器への印加電圧を調整することで、全てのチャネルの感度が一括して調整されるようになっていた。したがって、多重染色観察のように複数種の蛍光を観測する場合には、いずれかの蛍光の強度を高くすると、他の蛍光においてスペクトル成分が飽和してしまうことがある。その結果、他の蛍光におけるスペクトル形状が変化してしまい、精度良く観察を行うことができないという不都合があった。
【０００５】
一方、各蛍光におけるスペクトル形状を維持したままゲインを調整するためには、各チャネルの感度を１つずつ調整しなければならず、その作業が非常に煩雑となってしまうという不都合があった。
【０００６】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたもので、複数種の蛍光を検出する場合において、検出する蛍光のスペクトル形状を維持するとともに、各チャネルの感度調整を容易に行うことができる顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、標本において発生した光を集光する対物レンズと、該対物レンズにより集光された光をスペクトル成分に分光する分光素子と、該分光素子により分光されたスペクトル成分をそれぞれ検出する複数のチャネルを有する光検出器と、該光検出器の各チャネルの感度を調節する感度調節部とを備え、該感度調節部が、検出する光の波長範囲に関する情報に基づいて前記チャネルを複数のグループに分け、グループ内の全ての前記チャネルが同一の感度となるように、前記チャネルの感度をグループ毎に一括して調節する顕微鏡を採用する。
【０００８】
本発明によれば、標本において発生して対物レンズにより集光された光が、分光素子によりスペクトル成分に分光され、分光されたスペクトル成分は、複数のチャネルを有する光検出器によりそれぞれ検出される。この場合において、光検出器のチャネルは、感度調節部により、検出する光の波長範囲に関する情報に基づいて複数のグループに分けられ、グループ内の全てのチャネルが同一の感度となるように、その感度がグループ毎に一括して調節される。
【０００９】
これにより、グループ化されたチャネル群毎、すなわち、検出する光の波長範囲毎に、スペクトル形状を維持しつつ、その強度を調整することができる。例えば、複数種の蛍光を同時に観察する場合においても、各蛍光のスペクトル成分を飽和させることなく、各蛍光の強度をそれぞれ別個に調整することができ、精度良く観察することができる。また、各チャネルの感度を個別に調節する必要性を排除することができ、その調節作業を容易にすることができる。
【００１０】
上記発明において、前記感度調節部が、前記光検出器に印加される電圧を前記チャネルのグループ毎に調節することとしてもよい。
感度調節部によって、光検出器に印加される電圧をグループ毎に調節することで、チャネルの感度をグループ毎に調節することができ、検出する光の波長範囲毎に、スペクトル形状を維持しつつ、その強度を調整することができる。
【００１１】
上記発明において、前記光検出器により検出する光の輝度情報を積算する積算部を備え、前記感度調節部が、前記積算部の積算時間を前記チャネルのグループ毎に調節することとしてもよい。
感度調節部によって積算部の積算時間をグループ毎に調節することで、各チャネルにより検出した輝度情報をグループ毎に調節することができ、検出する光の波長範囲毎に、スペクトル形状を維持しつつ、その強度を調整することができる。
【００１２】
上記発明において、前記光検出器により検出する光の輝度情報を増幅する増幅部を備え、前記感度調節部が、前記増幅部の増幅率を前記チャネルのグループ毎に調節することとしてもよい。
感度調節部によって増幅部の増幅率をグループ毎に調節することで、各チャネルにより検出した輝度情報をグループ毎に調節することができ、検出する光の波長範囲毎に、スペクトル形状を維持しつつ、その強度を調整することができる。
【００１３】
上記発明において、複数の前記チャネルのグループに対して、グループ毎に前記感度調節部の感度調整値を設定可能な入力部を備えることとしてもよい。
このようにすることで、ＧＵＩ（Graphical User Interface）等の入力部によって、複数のチャネルのグループに対して、グループ毎に感度調節部の感度調整値を設定し、各チャネルの感度をグループ毎に調節することができる。
【００１４】
上記発明において、前記チャネル全体の感度を調節する全体感度調節部と、前記光検出器により検出する光の輝度情報を積算する積算部と、前記積算部により積算された輝度情報が所定値以上となる最大積算時間において、いずれかのスペクトル成分が飽和するような前記チャネル全体の最大感度を記憶する記憶部とを備え、前記感度調節部は、前記チャネル全体の感度が、前記記憶部に記憶されている最大感度よりも下がった場合には、前記チャネルのグループ毎に前記積算部の積算時間を最大化させることとしてもよい。
【００１５】
感度調節部によって積算部の積算時間をグループ毎に調節することで、各チャネルにより検出した輝度情報をグループ毎に調節することができ、検出する光の波長範囲毎に、スペクトル形状を維持しつつ、その強度を調整することができる。この場合において、チャネル全体の感度が、いずれかのスペクトル成分が飽和する最大感度よりも下がった場合に、チャネルのグループ毎に積算部の積算時間を最大化させることで、積算された輝度情報のＳ／Ｎ比を向上させることができる。
【００１６】
上記発明において、前記チャネルにより検出されたスペクトル成分のいずれかが所定の閾値を超えたときに、前記感度調節部が前記チャネルの感度をグループ毎に調節することとしてもよい。
このようにすることで、スペクトル成分のいずれかが所定の閾値を超えたとき、例えばスペクトル成分のいずれかが飽和したときに、チャネルの感度が調節されるので、いずれのスペクトル成分を飽和させることなく、検出される光の強度を調整することができる。
【００１７】
上記発明において、グループ毎の前記チャネルの感度と輝度情報とを対応付けて記憶する記憶部を備えることとしてもよい。
各グループのチャネルの感度と輝度情報とを対応付けて記憶部に記憶させておくことで、検出する光の波長範囲毎にチャネルの感度を再現することができる。また、波長範囲毎の輝度情報とその感度から、全てのチャネルを同一の感度にした場合の標本の画像を生成することができる。
【００１８】
上記発明において、前記光検出器により検出された光に基づいて画像を生成する画像生成部と、該画像生成部により生成された画像を表示する表示部と、該表示部に表示された画面において所定の範囲を設定する設定部とを備え、前記感度調節部が、前記設定部により設定された所定の範囲において前記チャネルの感度を調節することとしてもよい。
【００１９】
このようにすることで、表示部に表示された画面において設定部により注目する領域（所定の範囲）を設定し、この注目する領域（所定の範囲）において、検出する光の波長範囲毎に、スペクトル形状を維持しつつ、その強度を調整することができる。一方、表示部に表示された画面中の非注目領域については、強度を調整する必要性を排除することができる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、複数種の蛍光を検出する場合において、検出する蛍光のスペクトル形状を維持するとともに、各チャネルの感度調整を容易に行うことができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の一実施形態に係る顕微鏡の概略構成図である。
【図２】図１の信号調節部の機能ブロック図である。
【図３】図１の顕微鏡により実行される処理を示すフローチャートである。
【図４】図３のステップ５の詳細な処理を示すフローチャートである。
【図５】図１のＣＰＵに設定値未満のディジタル信号値が入力されている状態を説明する図である。
【図６】図１のＣＰＵに設定値以上のディジタル信号値が入力されている状態を説明する図である。
【図７】第１の変形例に係る顕微鏡により実行される処理を示すフローチャートである。
【図８】第２の変形例に係る顕微鏡により実行される処理を示すフローチャートである。
【図９】第３の変形例に係る顕微鏡により実行される処理を示すフローチャートである。
【図１０】第４の変形例に係る顕微鏡により実行される処理を示すフローチャートである。
【図１１】図１０の顕微鏡の動作を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の一実施形態に係る顕微鏡について、図面を参照して説明する。
図１は、本実施形態の顕微鏡１の概略構成図である。図１に示すように、本実施形態の顕微鏡１は、レーザ光を標本１１５に照射して標本１１５において発生した蛍光を検出する顕微鏡本体１０１と、顕微鏡本体１０１からの信号の強度等を調整する信号調整部２０１と、各部を制御するとともに顕微鏡本体１０１からの信号に基づいて画像を生成する制御部（感度調節部、画像生成部）３０１と、制御部３０１により生成された標本１１５の画像を表示する表示部４０１と、ユーザによる設定条件等が入力される入力部（入力部、設定部）５０１とを主な構成要素として備えている。
【００２３】
顕微鏡本体１０１は、光源１１１と、ビームスプリッタ１１２と、走査系１１３と、対物レンズ１１４と、ステージ１１６と、グレーティング（分光素子）１１７と、ＰＭＴ（光検出器）１１８とを備えている。
【００２４】
光源１１１は、レーザ光を射出するようになっている。このレーザ光は、標本１１５内の蛍光指示薬を励起させ、蛍光を発生させるようになっている。
【００２５】
ビームスプリッタ１１２は、光源１１１からのレーザ光を透過する一方、標本１１５において発生して対物レンズ１１４により集光された蛍光を反射するようになっている。このような構成を有することで、ビームスプリッタ１１２は、レーザ光の光路と標本１１５からの蛍光の光路とを分岐するようになっている。
【００２６】
走査系１１３は、例えばアルミコートされた一対のガルバノミラー（図示略）を有しており、これら一対のガルバノミラーの角度を変化させ、ラスタスキャン方式で駆動されるようになっている。これにより、光源１１１からのレーザ光を標本１１５上において２次元的に走査させるようになっている。
【００２７】
対物レンズ１１４は、走査系１１３により走査されたレーザ光を標本１１５上に照射する一方、標本１１５から発生した蛍光を集光するようになっている。
【００２８】
グレーティング１１７は、標本１１５において発生し、ビームスプリッタ１１２により分岐された蛍光を波長毎のスペクトル成分に分光し、分光したスペクトル成分をＰＭＴ１１８に入射させるようになっている。
【００２９】
ＰＭＴ１１８は、例えば３２チャネルの光電子増倍管(Photo Multiplier Tube)であり、スペクトル成分を検出するチャネルが、グレーティング１１７により分光される方向に複数配列されている。このような構成を有することで、ＰＭＴ１１８は、各チャネルによりグレーティング１１７により分光されたスペクトル成分をそれぞれ検出し、検出したスペクトル成分の輝度情報を電気信号へ変換して、信号調整部２０１に出力するようになっている。
【００３０】
信号調整部２０１は、ＰＭＴ１１８により検出する蛍光の輝度情報を積算する積算器（積算部）２０１と、ＰＭＴ１１８により検出する蛍光の輝度情報にオフセットを与えて増幅するオフセット増幅器（増幅部）２１２と、ＰＭＴ１１８により検出する蛍光の輝度情報をディジタル信号に変換するＡ／Ｄ変換器２１３とを備えている。
【００３１】
信号調整部２０１は、図２に示すように、ＰＭＴ１１８のチャネル毎に、積算器２１１、オフセット増幅器２１２、およびＡ／Ｄ変換器２１３が設置されており、Ａ／Ｄ変換器２１３により変換されたディジタル信号を制御部３０１のＣＰＵ３１１に出力するようになっている。
【００３２】
制御部３０１は、各種の情報を記憶するメモリ（記憶部）３１２と、Ａ／Ｄ変換器２１３からのディジタル信号を合算するマルチプレクサ３１３と、これらを制御するＣＰＵ３１１とを備えており、レーザ光源１１１、走査系１１３、積算器２１１、オフセット増幅器２１２、Ａ／Ｄ変換器２１３のそれぞれを制御する信号を生成するようになっている。
【００３３】
また、制御部３０１は、ＰＭＴ１１８が検出する蛍光の波長範囲に関する情報に基づいて、ＰＭＴ１１８のチャネルを複数のグループ（チャネル群）に分け、チャネル群内の全てのチャネルが同一の感度となるように、チャネルの感度をチャネル群毎に一括して調節するようになっている。ここでは、その具体的な調節方法として、制御部３０１が、積算器２１１の積算時間をチャネル群毎に調節することとして説明する。
【００３４】
また、制御部３０１は、Ａ／Ｄ変換器２１３から出力されるディジタル信号値が、予め設定された設定値を超えたことをＣＰＵ３１１が認識したとき、積算器２１１における積算時間と、そのときのＰＭＴ１１８への印加電圧（以下「ＨＶ」と表記する。）をＣＰＵ３１１がメモリ３１２に記憶するようになっている。
【００３５】
また、制御部３０１は、ＣＰＵ３１１により算出された蛍光強度に基づいてスキャン画像を生成するようになっている。
表示部４０１は、例えば液晶ディプレイであり、制御部３０１により生成された標本１１５の画像を表示するようになっている。
【００３６】
入力部５０１は、例えばキーボードやマウスからなり、ユーザが入力した値や動作を取得してＣＰＵ３１１に出力するようになっている。入力部５０１は、ユーザによって、例えば感度調整、色素選択、閾値設定についての入力が行われるようになっており、その入力情報を制御部３０１に出力するようになっている。
【００３７】
このような構成とすることで、入力部５０１によりユーザがＰＭＴ１１８の感度調整を行うと、制御部３０１を介してＰＭＴ１１８の感度が調整されるようになっている。また、入力部５０１によりユーザが色素選択についての入力を行うと、その設定が制御部３０１内のＣＰＵ３１１に送られ、ＣＰＵ３１１では選択した色素に対応する合算チャネル（チャネル群）を決定し、決定したチャネルにより検出されたスペクトル成分の合算処理が行われるようになっている。
【００３８】
また、入力部５０１によりユーザが閾値設定についての入力を行うと、その設定が制御部３０１内のＣＰＵ３１１に送られ、ＣＰＵ３１１では設定した閾値と、ＰＭＴ１１８の各チャネルにより検出されたスペクトル成分の強度との比較が行われるようになっている。
【００３９】
上記構成を有する顕微鏡１において、蛍光画像を取得する際の動作について以下に説明する。
顕微鏡本体１０１において、レーザ光源１１１から出射された光は、ビームスプリッタ１１２を通過してレーザ走査系１１３に入射する。レーザ走査系１１３は、対物レンズ１１４を通してレーザ光を、ステージ１１６上に載置された標本１１５の平面上においてＸ方向およびＹ方向に走査する。
【００４０】
標本１１５の焦点面においては、レーザ光により標本１１５内の蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。標本１１５からの蛍光は、対物レンズ１１４により集光され、レーザ走査系１１３を経て、ビームスプリッタ１１２によりレーザ光の光路から分岐される。
【００４１】
分岐された蛍光は、グレーティング１１７により分光され、分光されたスペクトル成分は波長ごとにＰＭＴ１１８の各チャネルに入射する。このとき、ＰＭＴ１１８には少なくとも二つの蛍光色素からの蛍光が入射する。
【００４２】
ＰＭＴ１１８の各チャネルでは、検出したスペクトル成分の強度に応じて、その輝度情報が電気信号へ変換され、信号調整部２０１にそれぞれ出力される。信号調整部２０１では、ＰＭＴ１１８のチャネル毎に、積算器２１１によりスペクトル成分の輝度情報が積算されるとともに、オフセット増幅器２１２によりスペクトル成分の輝度情報が増幅される。そして、このような処理が行われた輝度情報は、Ａ／Ｄ変換器２１３によりディジタル信号に変換され、ＣＰＵ３１１に出力される。
【００４３】
ＣＰＵ３１１が受け取ったディジタル信号は、ＣＰＵ３１１内部のマルチプレクサ３１３により、蛍光色素に対応したチャネル群分が合算される。合算された信号は、蛍光色素ごとに生じるため複数存在し、それぞれ表示部４０１に表示される１ピクセル分の輝度信号となる。
以上を繰返し、レーザ走査系１１３により走査することで、表示部４０１において蛍光画像が生成される。
【００４４】
上記の蛍光画像の取得動作において、信号調整部２０１および制御部３０１により実行される詳細な制御について以下に説明する。
ＰＭＴ１１８の各チャネルから出力される全ての信号は、標本１１５上にレーザ光を照射して１ピクセルの信号を取得する時間中、それぞれ積算器２１１により積算され続ける。その積算時間は、ＣＰＵ３１１により生成されているクロック信号（以下、「ＰＣＬＫ信号」と表記する。）により決定する。例えば、ＰＣＬＫ信号がＬｏｗである間は積算され、ＰＣＬＫ信号がＨｉｇｈとなったときには積算器２１１の値を０とする。
【００４５】
積算器２１１の後にはオフセット増幅器２１２が接続されており、積算後の信号にオフセットが与えられる。オフセットを与えられた信号は、Ａ／Ｄ変換器２１３によりディジタル信号に変換される。
【００４６】
また、積算されている間も、積算器２１１からの信号は、オフセット増幅器２１２およびＡ／Ｄ変換器２１３を通過して、ＣＰＵ３１１へと出力され続ける。ここで、Ａ／Ｄ変換器２１３では、ＣＰＵ３１１にて生成されるＰＣＬＫ信号よりも短い周期をもつ変換クロックで、オフセット増幅器２１２からのアナログ信号がディジタル信号に変換されており、変換クロックごとにＣＰＵ３１１へとディジタル信号を出力する。
【００４７】
このときのＣＰＵ３１１の処理について図３に示すフローチャートを用いて説明する。
まず、ステップＳ１において、ＰＣＬＫ信号がＬｏｗであるか否かが判断される。
ＰＣＬＫ信号がＬｏｗであれば、ステップＳ２において、ＣＰＵ３１１によりディジタル信号値が取得される。
【００４８】
次に、ステップＳ３において、各チャネルのそれぞれについてディジタル信号値が設定値以下であるか否かが判断される。この際、図５に示すように、ディジタル信号値が設定値以下である場合には、ＰＣＬＫ信号がＨｉｇｈになったとき、つまり積算時間がｔｍａｘになったときのディジタル信号値がＣＰＵ３１１へ出力される（ステップＳ４）。
【００４９】
ここで、この設定値は、ディジタル信号がＡ／Ｄ変換器２１３の変換範囲外となっているとＣＰＵ３１１が判断する値であり、走査開始前にユーザが入力部５０１を介して、変換範囲の何％とするかを入力して設定した値である。
【００５０】
このディジタル信号は、ステップＳ５において、ＣＰＵ３１１内部のマルチプレクサ３１３により合算される。その際の詳細な手順について図４に示すフローチャートを用いて説明する。
まず、蛍光色素に対応したチャネル群が決定されるように、その対応表（以下、「ＬＵＴ」と表記する。）をメモリ３１２に保存しておく。
【００５１】
表示部４０１に表示されている蛍光色素をユーザが入力部５０１を介して選択すると、ＣＰＵ３１１が使用する蛍光色素が認識され（ステップＳ５−１）、ＬＵＴを参照することで合算するチャネル群が決定される（ステップＳ５−２）。
【００５２】
次に、ステップＳ５−３において、このチャネル群からの各信号が加算され、表示部４０１に表示される１ピクセル分の輝度信号となる。このとき、蛍光色素ごとに輝度信号が生じるため、これら輝度信号が表示部４０１へ同時に伝送されるが、重ねて表示しても蛍光色素ごとに分けて表示してもよい。
【００５３】
また、図３のステップＳ３において、図６に示すように、ＰＣＬＫ信号がＬｏｗのうちに設定値以上のディジタル信号値がＣＰＵ３１１に出力されてきた場合には、Ａ／Ｄ変換器２１３の変換範囲外になったとＣＰＵ３１１が判断し、そのときの積算時間ｔｓとＨＶの値がメモリ３１２に記憶される（ステップＳ６）。
【００５４】
そして、設定値以上のディジタル信号値が、表示部４０１に表示される１ライン中、つまり標本１１５上を走査するＹ軸の値が一定の間に、３ピクセル続いた場合には（ステップＳ７）、ＣＰＵ２１１により取得された３ピクセル分の積算時間の平均が算出される（ステップＳ８）。
【００５５】
そして、次のピクセルから合算するチャネル群に対応する各積算器２１１に対して、ＰＣＬＫ信号を分周して適用することで、ステップＳ８において算出された平均積算時間が、次のピクセル以降の１ピクセル積算時間に設定される（ステップＳ９）。このとき、チャネル群からの各信号のうち、輝度信号が最大となるチャネルの積算器２１１に適用した積算時間を、チャネル群の各積算器２１１に適用する。
【００５６】
ステップＳ１０では、ＰＣＬＫ信号がＨｉｇｈになるまで待機することで、積算器２１１において積算されている値を０とする。
これにより、チャネル群の各チャネルからの信号強度により形成されるスペクトルの形状を保ったまま、輝度信号の強度を調整することができる。
【００５７】
以上の処理を、ユーザが入力部５０１を介して制御条件（ＨＶ値、オフセット値、蛍光色素の選択）の入力を終了した後、少なくとも１フレーム分走査する。
なお、表示部４０１には、図３のステップＳ６からステップＳ１０を行うための制御機能をＯＮ／ＯＦＦするボタンを表示し、入力部５０１を介してユーザが切り替えることができることとしてもよい。
【００５８】
以上のように、本実施形態に係る顕微鏡１によれば、標本１１５において発生して対物レンズ１１４により集光された蛍光が、グレーティング１１７によりスペクトル成分に分光され、分光されたスペクトル成分は、複数のチャネルを有するＰＭＴ１１８によりそれぞれ検出される。この場合において、ＰＭＴ１１８のチャネルは、制御部３０１により、検出する光の波長範囲に関する情報に基づいて複数のグループ（チャネル群）に分けられ、チャネル群内の全てのチャネルが同一の感度となるように、その感度がチャネル群毎に一括して調節される。
【００５９】
これにより、グループ化されたチャネル群毎、すなわち、検出する光の波長範囲毎に、スペクトル形状を維持しつつ、その強度を調整することができる。例えば、複数種の蛍光を同時に観察する場合においても、各蛍光のスペクトル成分を飽和させることなく、各蛍光の強度をそれぞれ別個に調整することができ、精度良く観察することができる。また、各チャネルの感度を個別に調節する必要性を排除することができ、その調節作業を容易にすることができる。
【００６０】
また、制御部３０１によって積算器２１１の積算時間をグループ毎に調節することで、ＰＭＴ１１８の各チャネルにより検出した輝度情報をグループ毎に調節することができ、検出する光の波長範囲毎に、スペクトル形状を維持しつつ、その強度を調整することができる。
【００６１】
また、スペクトル成分のいずれかが設定値を超えたとき、例えばスペクトル成分のいずれかが飽和したときに、ＰＭＴ１１８のチャネルの感度を調節することで、いずれのスペクトル成分を飽和させることなく、検出される蛍光の強度を調整することができる。
【００６２】
なお、制御部３０１によって、ＰＭＴ１１８に印加される電圧をチャネル群毎に調節することとしてもよい。このようにすることで、ＰＭＴ１１８のチャネルの感度をチャネル群毎に調節することができ、検出する光の波長範囲毎に、スペクトル形状を維持しつつ、その強度を調整することができる。
【００６３】
また、制御部３０１によって、オフセット増幅器２１２の増幅率をチャネル群毎に調節することとしてもよい。このようにすることで、ＰＭＴ１１８の各チャネルにより検出した輝度情報をチャネル群毎に調節することができ、検出する光の波長範囲毎に、スペクトル形状を維持しつつ、その強度を調整することができる。
【００６４】
また、各グループのチャネルの感度と輝度情報とを対応付けてメモリ３１２に記憶させておくこととしてもよい。このようにすることで、検出する光の波長範囲毎にチャネルの感度を再現することができる。また、波長範囲毎の輝度情報とその感度から、全てのチャネルを同一の感度にした場合の標本１１５の画像を生成することができる。
【００６５】
［第１の変形例］
以下に、本実施形態の第１の変形例について図７を用いて説明する。
本変形例の顕微鏡１は、積算器２１１の積算時間が変更されている場合には、そのことをユーザに認識させる手段を有している。
本変形例におけるＣＰＵ３１１の処理手順について、図７に示すフローチャートを用いて以下に説明する。
【００６６】
まず、ステップＳ８において、ＣＰＵ３１１により３ピクセル分の積算時間の平均を算出する。
そして、その平均積算時間が次のピクセルに適用されると同時に（ステップＳ９）、表示部４０１に表示される積算時間を適応して得られた輝度情報に基づいて生成された１フレーム分の画像の周辺部について色を変えて表示する（ステップＳ１１）。
このようにすることで、積算時間が調整されている輝度信号によって画像を生成していることを、ユーザが認識することができる。
【００６７】
［第２の変形例］
以下に、本実施形態の第２の変形例について図８を用いて説明する。
本変形例の顕微鏡１は、積算器２１１の積算時間をユーザが任意に変更することを可能とし、入力した積算時間を、蛍光色素に対応した範囲のチャネルに接続される各積算器に適用するように制御している。
【００６８】
具体的には、例えば、積算時間に対応したスライドを蛍光色素ごとに表示部４０１に表示し、そのスライドを入力部５０１を介してユーザが変更することで、スライドの位置に対応して積算時間が決定されることとする。
【００６９】
本変形例におけるＣＰＵ３１１の処理について図８に示すフローチャートを用いて説明する。
表示部４０１に表示されている蛍光色素をユーザが入力部５０１を介して選択すると、ＣＰＵ３１１が使用する蛍光色素を認識し（ステップＳ５−１）、ＬＵＴを参照することで合算するチャネル群が決定される（ステップＳ５−２）。
そして、スライドの位置から積算時間を取得し（ステップＳ１２）、この積算時間を決定されたチャネル群に対応する各積算器２１１に対して適用する（ステップＳ１３）。
このようにすることで、ユーザが任意に調整した信号強度から画像を生成することが可能となる。
【００７０】
［第３の変形例］
以下に、本実施形態の第３の変形例について図９を用いて説明する。
本変形例の顕微鏡１は、ＰＣＬＫ信号に基づいた最大の積算時間、つまり積算時間がｔｍａｘとなっているときにＣＰＵ３１１が受け取るディジタル信号が、初めて設定値以上となったときのＨＶを保存し、レーザ走査途中でＨＶを変更した場合には、記憶したＨＶよりも下げられたときに積算時間をｔｍａｘに戻すようになっている。
【００７１】
本変形例の顕微鏡１は、制御部３０１により、チャネル全体の感度を調節することができるようになっている（全体感度調節部）。
メモリ３１２には、積算器２１１により積算された輝度情報が所定値以上となる最大積算時間において、いずれかのスペクトル成分が飽和するようなチャネル全体の最大感度が記憶されるようになっている。
【００７２】
制御部３０１は、チャネル全体の感度が、メモリ３１２に記憶されている最大感度よりも下がった場合には、チャネルのグループ毎に積算器２１１の積算時間を最大化させるようになっている。
【００７３】
ＨＶの値は、表示部４０１に表示されているＨＶの値をユーザが入力部５０１を介して変更することで調整することができる。
ＰＣＬＫ信号に基づいた最大の積算時間、つまり積算時間がｔｍａｘとなっているときに、ＣＰＵ３１１が受け取るディジタル信号が、初めて設定値以上となったときのＨＶをメモリ３１２に記憶しておく。
【００７４】
その後のＣＰＵ３１１による処理手順について、図９に示すフローチャートに従って説明する。
ＨＶが変化したときにはその値を取得し（ステップＳ１４）、記憶したＨＶの値と比較する（ステップＳ１５）。記憶したＨＶの値よりも大きくなる場合には、図３のステップＳ６からステップＳ１０により積算時間の調整が行われる。記憶したＨＶの値よりも小さい場合には、積算時間をｔｍａｘにすることで元の積算時間に戻される（ステップＳ１６）。
【００７５】
このようにすることで、ＨＶを微動させたときには積算時間の変動が無いため、微小量の感度調整の場合に有効となる。
また、制御部３０１によって積算器２１１の積算時間をグループ毎に調節することで、各チャネルにより検出した輝度情報をグループ毎に調節することができ、検出する光の波長範囲毎に、スペクトル形状を維持しつつ、その強度を調整することができる。この場合において、チャネル全体の感度が、いずれかのスペクトル成分が飽和する最大感度よりも下がった場合に、チャネルのグループ毎に積算器２１１の積算時間を最大化させることで、積算された輝度情報のＳ／Ｎ比を向上させることができる。
【００７６】
［第４の変形例］
以下に、本実施形態の第４変形例について図１０および図１１を用いて説明する。
本変形例の顕微鏡１は、ユーザが選択した範囲においてのみ、図３のステップＳ６からステップＳ１０の処理により、積算時間の調整を行うようになっている。
本変形例におけるＣＰＵ３１１による処理手順について、図１０のフローチャートを用いて説明する。
【００７７】
図１１に示すように、表示部４０１に表示された標本画像においてユーザが任意に選択した選択範囲をＣＰＵ３１１が認識し（ステップＳ１７）、選択範囲内のピクセルに相当するスキャンポイントであるかを判別する（ステップＳ１８）。
【００７８】
選択範囲内である場合には、図３のステップＳ６からステップＳ１０と同様の処理によって積算時間が決定されるように、イネーブル信号をＣＰＵ３１１に対して出力する（ステップＳ１９）。一方、選択範囲外である場合は、イネーブル信号は出力されず、前ピクセルと同じ積算時間が適用され、ＣＰＵ３１１によりディジタル信号値が取得される（ステップＳ２）。これにより積算時間の決定は選択範囲内でのみ行われるが、決定された積算時間はレーザ走査範囲全体に適用されることとなる。
【００７９】
このようにすることで、ユーザが着目したい範囲だけ信号調整手段のダイナミックレンジ内で輝度信号を取得することができる。
また、表示部４０１に表示された画面において入力部５０１により注目する領域（選択範囲）を設定し、この選択範囲において、検出する光の波長範囲毎に、スペクトル形状を維持しつつ、その強度を調整することができる。一方、表示部４０１に表示された画面中の非注目領域については、強度を調整する必要性を排除することができる。
【００８０】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
例えば、本実施形態において、積算器２１１の積算時間、あるいはオフセット増幅器２１２の増幅率、あるいはＨＶをチャネル群毎に調節することとして説明したが、これらを任意に組み合わせてＰＭＴ１１８のチャネルの感度を調節することとしてもよい。
【００８１】
また、図３に示すフローチャートのステップＳ７において、積算器２１１の積算時間を、設定値以上のディジタル信号値が３ピクセル続いた場合に変更することとして説明したが、１〜２ピクセルまたは４ピクセル以上続いた場合に変更することとしてもよい。
【符号の説明】
【００８２】
１ 顕微鏡
１０１ 顕微鏡本体
１１１ 光源
１１２ ビームスプリッタ
１１３ 走査系
１１４ 対物レンズ
１１５ 標本
１１６ ステージ
１１７ グレーティング（分光素子）
１１８ ＰＭＴ（光検出器）
２０１ 信号調整部
２１１ 積算器（積算部）
２１２ オフセット増幅器（増幅部）
２１３ Ａ／Ｄ変換器
３０１ 制御部（感度調節部、画像生成部）
３１１ ＣＰＵ
３１２ メモリ（記憶部）
３１３ マルチプレクサ
４０１ 表示部
５０１ 入力部（入力部、設定部）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標本において発生した光を集光する対物レンズと、
該対物レンズにより集光された光をスペクトル成分に分光する分光素子と、
該分光素子により分光されたスペクトル成分をそれぞれ検出する複数のチャネルを有する光検出器と、
該光検出器の各チャネルの感度を調節する感度調節部とを備え、
該感度調節部が、検出する光の波長範囲に関する情報に基づいて前記チャネルを複数のグループに分け、グループ内の全ての前記チャネルが同一の感度となるように、前記チャネルの感度をグループ毎に一括して調節する顕微鏡。
【請求項２】
前記感度調節部が、前記光検出器に印加される電圧を前記チャネルのグループ毎に調節する請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項３】
前記光検出器により検出する光の輝度情報を積算する積算部を備え、
前記感度調節部が、前記積算部の積算時間を前記チャネルのグループ毎に調節する請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項４】
前記光検出器により検出する光の輝度情報を増幅する増幅部を備え、
前記感度調節部が、前記増幅部の増幅率を前記チャネルのグループ毎に調節する請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項５】
複数の前記チャネルのグループに対して、グループ毎に前記感度調節部の感度調整値を設定可能な入力部を備える請求項１から請求項４のいずれかに記載の顕微鏡。
【請求項６】
前記チャネル全体の感度を調節する全体感度調節部と、
前記光検出器により検出する光の輝度情報を積算する積算部と、
前記積算部により積算された輝度情報が所定値以上となる最大積算時間において、いずれかのスペクトル成分が飽和するような前記チャネル全体の最大感度を記憶する記憶部とを備え、
前記感度調節部は、前記チャネル全体の感度が、前記記憶部に記憶されている最大感度よりも下がった場合には、前記チャネルのグループ毎に前記積算部の積算時間を最大化させる請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項７】
前記チャネルにより検出されたスペクトル成分のいずれかが所定の閾値を超えたときに、前記感度調節部が前記チャネルの感度をグループ毎に調節する請求項１から請求項６のいずれかに記載の顕微鏡。
【請求項８】
グループ毎の前記チャネルの感度と輝度情報とを対応付けて記憶する記憶部を備える請求項１から請求項７のいずれかに記載の顕微鏡。
【請求項９】
前記光検出器により検出された光に基づいて画像を生成する画像生成部と、
該画像生成部により生成された画像を表示する表示部と、
該表示部に表示された画面において所定の範囲を設定する設定部とを備え、
前記感度調節部が、前記設定部により設定された所定の範囲において前記チャネルの感度を調節する請求項１から請求項８のいずれかに記載の顕微鏡。
【請求項１】
標本において発生した光を集光する対物レンズと、
該対物レンズにより集光された光をスペクトル成分に分光する分光素子と、
該分光素子により分光されたスペクトル成分をそれぞれ検出する複数のチャネルを有する光検出器と、
該光検出器の各チャネルの感度を調節する感度調節部とを備え、
該感度調節部が、検出する光の波長範囲に関する情報に基づいて前記チャネルを複数のグループに分け、グループ内の全ての前記チャネルが同一の感度となるように、前記チャネルの感度をグループ毎に一括して調節する顕微鏡。
【請求項２】
前記感度調節部が、前記光検出器に印加される電圧を前記チャネルのグループ毎に調節する請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項３】
前記光検出器により検出する光の輝度情報を積算する積算部を備え、
前記感度調節部が、前記積算部の積算時間を前記チャネルのグループ毎に調節する請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項４】
前記光検出器により検出する光の輝度情報を増幅する増幅部を備え、
前記感度調節部が、前記増幅部の増幅率を前記チャネルのグループ毎に調節する請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項５】
複数の前記チャネルのグループに対して、グループ毎に前記感度調節部の感度調整値を設定可能な入力部を備える請求項１から請求項４のいずれかに記載の顕微鏡。
【請求項６】
前記チャネル全体の感度を調節する全体感度調節部と、
前記光検出器により検出する光の輝度情報を積算する積算部と、
前記積算部により積算された輝度情報が所定値以上となる最大積算時間において、いずれかのスペクトル成分が飽和するような前記チャネル全体の最大感度を記憶する記憶部とを備え、
前記感度調節部は、前記チャネル全体の感度が、前記記憶部に記憶されている最大感度よりも下がった場合には、前記チャネルのグループ毎に前記積算部の積算時間を最大化させる請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項７】
前記チャネルにより検出されたスペクトル成分のいずれかが所定の閾値を超えたときに、前記感度調節部が前記チャネルの感度をグループ毎に調節する請求項１から請求項６のいずれかに記載の顕微鏡。
【請求項８】
グループ毎の前記チャネルの感度と輝度情報とを対応付けて記憶する記憶部を備える請求項１から請求項７のいずれかに記載の顕微鏡。
【請求項９】
前記光検出器により検出された光に基づいて画像を生成する画像生成部と、
該画像生成部により生成された画像を表示する表示部と、
該表示部に表示された画面において所定の範囲を設定する設定部とを備え、
前記感度調節部が、前記設定部により設定された所定の範囲において前記チャネルの感度を調節する請求項１から請求項８のいずれかに記載の顕微鏡。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１０−２６６２７８（Ｐ２０１０−２６６２７８Ａ）
【公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１１６５９８（Ｐ２００９−１１６５９８）
【出願日】平成２１年５月１３日（２００９．５．１３）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月１３日（２００９．５．１３）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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