高免疫抑制活性の水溶性トリプトリド誘導体及びその応用
本発明は免疫抑制活性を有する水溶性トリプトリド（triptolide）誘導体（それらの構造式はそれぞれ下記化２８式、化２９式、化３０式、化３１式で示され、式中、Ｒ１及びＲ２の定義は明細書を参考する）、下記化２８式、化２９式、化３０式、化３１式の製造方法及びそれらの化合物を含む免疫抑制剤又は抗炎剤を提供する。
【化２８】
【化２９】
【化３０】
【化３１】
【化２８】
【化２９】
【化３０】
【化３１】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物化学分野に関する。更に具体的に、本発明は、高免疫抑制活性を有する水溶性トリプトリド（Triptolide）誘導体、その製造方法、及びそれらの誘導体が免疫抑制に関する病気の治療に用いられる用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫抑制因子は、慢性関節リウマチ、喘息、系統性紅斑狼瘡（ＳＬＥ）、鱗屑癬、多重硬皮症、動脈粥状硬化、腎炎、Ｉ−型糖尿病などの能動免疫欠乏病、及び免疫に関する炎症に、広く使われている。今、免疫抑制因子も、臓器移植後の同種拒絶を解決するための最も有効な手段である。最もよく使われる免疫抑制因子はアザチオブリン（azathyopurine）、コルチコステロイド（corticosterroids）、メトトレクセエイト（methotrexate）、サイクロホスファミド（cyclophospamide）、６−メルカプトプリン（6-mercaptopurine）、ビンクリスチン（vincristine）、セレブロックス（celebrox）、シクロスポリンＡ（cyclosporine A）、ＦＫ５０６などがある。しかし、これらの薬物はすべて完全に有効ではないし、大多数がわりに高い毒性が伴う。
【０００３】
免疫抑制の活性は免疫系統のＴ、Ｂ細胞によく関連していることが分かる。Ｔ、Ｂ細胞は多種細胞因子を分泌・産生する。細胞因子ごとにその特定の生理機能を有し、そこで、その反映した医療領域は全く同じではない。ある種類の化合物のＴ、Ｂ細胞に対する抑制活性のみから、その化合物の免疫抑制活性の高低を判断することが十分ではない。反って、現在では、Ｔ、Ｂ細胞に対する抑制活性の測定は、当該化合物の細胞に対する毒性を検出するための指標としてよく用いられている。例えば、サイクロホスファミドとシクロスポリンＡに対して、いずれも免疫抑制因子であるが、それぞれ抑制された免疫因子は違う。シクロスポリンＡは、主にインターロイキンＩＩ（ＩＬ−２）を抑制するが、インターロイキンＩ（ＩＬ−Ｉ）に対する抑制作用が極めて弱く、その主要な臨床応用が臓器移植後の同種拒絶を防止することである。そして、サイクロホスファミドは、ＩＬ−ＩＩに対する抑制作用が比較的に弱いが、ＩＬ−Ｉに対してより強い抑制作用があって、主にリューマチ性関節炎のような免疫抑制に関係がある炎症に用いられる。現在、発見した細胞因子は数十種類に達するが、大多数の細胞因子の生理機能は依然としてよく知らない。しかしＩＬ―１、ＩＬ―２、ＩＬ−６、ＴＮＦ、ｉＮＯＳなどの細胞因子について、それらの免疫調節に関する生理機能及び治療分野との関連性は、既に比較的に明瞭である。そのため、動物試験をする前に、化合物についてこれらの細胞因子の作用に対して研究を行うことができ、以後の動物試験の目標と実験方案の制定に指導的な意義がある。
【０００４】
中国の薬用植物であるクロヅルはすでにとても強い免疫抑制活性を持つことが証明された。その粗抽出物（例えば、市販のトリプテリジウムグリコシド（tripterygium glycosides）錠剤）は、すでに臨床に慢性関節リューマチ、喘息、系統性紅斑狼瘡（ＳＬＥ）、鱗屑癬などの能動免疫欠乏病を治療することに用いられている。クロヅルから抽出された化合物であるトリプトリド（triptolide）を用いて臓器移植後の同種拒絶を防止することを研究したところ、トリプトリドの活性がシクロスポリンＡに近いことが認められた。クロヅル植物の著しい免疫抑制活性は国内外の関連実験室の注意を引き起こし、そして多方面の研究を行った。その研究領域が以下の方面に関連する：
【０００５】
１．クロヅル植物から有効な免疫調節化合物を分離・精製している。今まですでにクロヅル植物から１００種類以上の化合物を分離された。例えば、トリプトリド（triptolide）、１６−ヒドロキシトリプトリド、トリプトヘノリド（triptophenolide）、トリプトジオリド（tripdiolide）、トリプクロロリド（tripchlorolide）などの化合物。その中でも、トリプトリドの免疫調節と抗腫瘍活性に対する研究がわりに多い。トリプトリドの免疫抑制活性が最高で、植物の中の含有量は比較的に高くて、構造に修飾を行うことができる位置はわりに多いため、比較的に広範な研究が行なわれた。
【０００６】
２．高免疫抑制活性のトリプトリドに対して、化学構造の修飾を行って、リードコンパウンド（lead compound）であるトリプトリドの毒性を下げる。この方面の研究仕事をめぐって次の通りの特許と文献をすでに発表した：特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、及び特許文献８。
【０００７】
３．天然産物であるトリプトリドの化学デノボシンテシース（Chemical total synthesis）：非特許文献１。
【０００８】
４．細胞培養法で、天然産物のトリプトリドを生産する：特許文献９。
【０００９】
トリプトリドの免疫抑制活性がかなり高いが、次の通りの欠点がその臨床応用を制限した：１．毒性は高くて、そのＬＤ５０は０．８５ｍｇ／ｋｇ体重であり、そして生殖毒性がある。２．水溶性は低くて、静脈（ｉＶ）注射を行うことができない。３．細胞膜の透過性（permeability）が低くて（出願人はまだ実験結果を発表していない）、経口効果がよくない。
【００１０】
これらの問題をめぐって、いくつかの実験室はトリプトリドの化学構造の修飾に対して一連の仕事をした。その中で、特許文献４の１４―無水琥珀酸トリプトリドは水に対する溶解性が高い。特許文献１の８−ヒドロキシトリプトリドと、特許文献１０の１２―チオシアノトリプトリド（thiocyano-triptolide）は元の化合物活性を保つと共に、リードコンパウンドであるトリプトリドの毒性を下げるのに、成功を取る。その中で、１２―チオシアノトリプトリドＬＤ５０は７４ｍｇ／ｋｇ体重で、その毒性はリードコンパウンドであるトリプトリドＬＤ５０（０．８５ｍｇ／ｋｇ体重）に比べて約８７倍下がった。しかしこれらの、トリプトリドから誘導された類似体の水溶性が依然として低くて、細胞膜の透過性も低い。
【００１１】
特許文献１１はいくつかの水溶性トリプトリド誘導体の情報を提供した。特許文献１は水溶性トリプトリド誘導体をいくつか提供したが、これらの水溶性のトリプトリド誘導体の免疫抑制活性の実験データを提供していない。現在、発表された資料の中で優れた水溶性、かつ高免疫抑制活性を有する水溶性のトリプトリド誘導体の中で特許文献４に開示されている１４―無水琥珀酸トリプトリドは好ましい。それの抗腫瘍と臓器移植に対する応用は特許文献１２と非特許文献２に開示されている。
【００１２】
【特許文献１】米国特許第６１５０５３９号明細書
【特許文献２】米国特許第６００４９９９号明細書
【特許文献３】米国特許第５９７２９９８号明細書
【特許文献４】米国特許第５９６２５１６号明細書
【特許文献５】米国特許第５６６３３３５号明細書
【特許文献６】国際特許出願第ＷＯ００／１２４８３号
【特許文献７】中国特許第１０２７３７１Ｃ号明細書
【特許文献８】ＺＬ特許第８９１０６９４１．０号明細書
【特許文献９】米国特許第４３２８３０９号明細書
【特許文献１０】国際特許出願第ＷＯ ００／６３２１２１号
【特許文献１１】国際特許出願ＷＯ０２／２８８６２号
【特許文献１２】米国特許第６３２９１４８号明細書
【非特許文献１】Ｙａｎｇ Ｄなど：有機化学（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）２０００ Ａｐｒ．７；６５（７）：２２０８−１７。
【非特許文献２】移植（Transplantation）、２０００ Ｎｏｖ．２７；７０（１０）：１４４２―７
【非特許文献３】Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ａ ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｓｓａｙ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ． Ｐｒｏｃ Ｓｏｃ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．１９７１，１３７：５０６−５１２．
【非特許文献４】Ａｍ Ｊ Ａｎａｔ．１９６３：２７３−２７８
【発明の開示】
【００１３】
本発明の第―発明は、３種類の水溶性と免疫抑制活性を有する新規なトリプトリド誘導体を提供した。それらの構造は以下の通りである。
【００１４】
第Ｉ種類のトリプトリド誘導体は、下記化９式によって示される。
【００１５】
【化９】
【００１６】
（式中、Ｒ１はＨ、下記化１０式で示されるホスファート、或いは下記化１１式で示されるホスフィットである。本発明の第Ｉ種類の化合物の中に、Ｒ１は下記化１２式で示されるホスファートで、Ｘ１とＸ２はＮａであるものが好ましい。）
【００１７】
【化１０】
【化１１】
【化１２】
【００１８】
第ＩＩ種類のトリプトリド誘導体は、下記化１３式で示される。
【００１９】
【化１３】
【００２０】
（式中、Ｒ１はＨ、炭素数１〜４のアルキル基、−ＡＣ又は−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎＣＯ２（ただし、ｎは１〜４の整数）、或いは下記化１４式で示されるホスファート、或いは下記化１５式で示されるホスフィットである。Ｘ１とＸ２はＮａ、Ｋ、又はＮＨ４である。Ｒ２はＨ、−ＳＣＮ又は−Ｃｌ（−Ｂｒ）である。）
【００２１】
【化１４】
【化１５】
【００２２】
本発明の第ＩＩ種類の化合物の中に、Ｒ１は下記化１６式で示されるホスファートと無水琥珀酸［−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）４ＣＯ２］で、Ｘ１とＸ２はＮａで、Ｒ２は―ＳＣＮであるものが好ましい。
【００２３】
【化１６】
【００２４】
第ＩＩＩ種類のトリプトリド誘導体は、下記化１７式或いは下記化１８式で示される。
【００２５】
【化１７】
【化１８】
（式中、Ｒ２はＨ、−ＳＣＮ、−Ｃｌ又は−Ｂｒである。）
【００２６】
本発明の又の１つの目的は、これらの高水溶性のあるトリプトリドの新規な誘導体の合成方法を提供することにある。具体的に、以下のリードコンパウンドから、前記の３種類の水溶性トリプトリド誘導体を製造する方法（具体的に、実施例１〜７を参照）である。
【００２７】
第１種類のリードコンパウンドは次の化１９式で示されるトリプトリドであり、
特許文献４に、トリプトリドから１４−無水琥珀酸トリプトリド及びそのナトリウム塩の製造方法が開示されているが、本発明のホスホリル化によって製造するトリプトリド−１４−β↓リン酸ジナトリウムは、より高水溶性を有する。
【００２８】
【化１９】
【００２９】
第２種類のリードコンパウンドは、下記化２０式で示される１２−β−チオシアノ−１３−α−ヒドロキシトリプトリド（12-β-thiocynao-α-hydroxy triptolide）である。
【００３０】
【化２０】
【００３１】
本発明の又の１つの目的は、これらの高水溶性のあるトリプトリドの新規な誘導体の免疫抑制活性に関する分子生物学証拠（実施例８，９）を提供することにある。これらのトリプトリドの新規な誘導体は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ｉＮＯＳなどの細胞因子の産生を著しく抑制すると共に、Ｃｏｘ−２の産生を著しく抑制している。
【００３２】
本発明のもう１つの目的は、これらの高水溶性のあるトリプトリドの新規な誘導体の低毒性の動物実験証拠（実施例１０）を提供することにある。本発明のＴ−ＳＣＮから製造された水溶性トリプトリド誘導体の毒性は、著しく低下し、例えば、１２−β−チオシアノトリプトリド−１３−β−１４−α−リン酸ナトリウムのＬＤ５０が１２６ｍｇ／ｋｇ体重、その毒性はトリプトリドのＬＤ５０（０．８５ｍｇ／ｋｇ体重）に比べて、非常に低くて、またその免疫抑制活性もかなり高い。
【００３３】
本発明のもう１つの目的は、これらの高水溶性のあるトリプトリドの新規な誘導体が能動免疫欠乏病の治療に用いられる動物実験証拠（実施例１１）を提供することにある。例えば、ＤＮＣによるマウス遅延過敏症の影響実験（実施例１１）とラット綿球肉芽腫法抗炎試験（実施例１２）で、ＷＤＹ系のトリプトリドの新規な誘導体が全て著しい免疫抑制活性と抗炎活性を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下に、実施例を挙げて本発明を詳しく説明する。
【００３５】
（実施例１）
次の化２１式で示される１２−β−チオシアノトリプトリド−１３−α−１４−β−リン酸ナトリウム（以下、ＷＤＹ１と略称する）の製造。
【００３６】
【化２１】
【００３７】
窒素雰囲気で三口フラスコ（three-necked bottle）の中にＴ−ＳＣＮ（０．６００ｍｍｏｌ）２５１ｍｇを入れて、更にピリジン２０ｍｌ、ＰＯＣｌ３（３．０００ｍｍｏｌ）０．２８ｍｌを添加し、最後に４０ｍｇのＤＭＡＰを入れて、密封して、室温で２４時間反応した後、氷浴で冷却・加水分解して、ｐＨが８になるように調節した。乾くまで減圧・濃縮して、アセトニトリルでそれを溶解して、無機塩を除去した。ＴＬＣにより検出した（展開剤はｎ−ブチルアルコール：水：氷酢酸＝１０：１：１であり、主なスポットは産物であるＷＤＹ １のスポットであり、さらに極めて少量のＴ−ＳＣＮと他の副産物が認められた）。アセトニトリルで溶解して、７５〜３００メッシュのシリカゲル２ｇを入れて、アセトニトリルを全部除去した後、溶出剤としてのｎ−ブチルアルコール：水（２０：１）で７５〜３００メッシュのシリカゲルカラムクロマトグラフィにより分離を行って、ＴＬＣにより追従検出して、産物スポットを収集し、併合して、溶媒を減圧で蒸発・除去し、少量溶媒を入れてエーテルで沈殿し、１時間静置した後、ろ過することにより、粉状の固形成分がえられた。えられたものを乾燥ガン（drying pistol）で乾燥することにより、イールド（yield）が７５％であり、水溶解度は１００ｍｇ／ｍｌより大きくて、Ｒｆ値が０．２４（展開剤はｎ−ブチルアルコール：水：氷酢酸＝１０：１：１である）であり、赤紫色を表示した（呈色試薬はＫｅｄｄ’ｓ試薬である）。
【００３８】
ＭＳ ＥＳＩ＋ ｍ／ｚ：Ｃ２１Ｈ２３ＮＳＯ８ＰＮａ計算値：５０４．０８５８，測定値：５０４．０８５７。
【００３９】
ＭＳ ＥＳＩ− ｍ／ｚ：Ｃ２１Ｈ２３ＮＳＯ８Ｐ計算値：４８０．０８７７，測定値：４８０．０８８８。
【００４０】
ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：３４１７，２９３８，２１５６，１７４９，１６７４，１２４７，１１０９，１０００。
【００４１】
１ＨＮＭＲ，δｐｐｍ：０．８４（３Ｈ，ｓ，１８−ＣＨ３），１．０１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ，１６−ＣＨ３），１．０４（３Ｈ，ｓ，１７−ＣＨ３），１．３４（１Ｈ，ｍ，１−αＨ），１．４６（１Ｈ，ｍ，１−βＨ），１．８０（１ｍ，ｔ，Ｊ＝１４．４Ｈｚ，６−βＨ），１．９４（１Ｈ，ｍ，２−Ｈ），２．１３（１Ｈ，ｍ，２−Ｈ），２．２０（１Ｈ，ｍ，６−αＨ），２．３５（１Ｈ，ｍ，１５−Ｈ），３．０９（１Ｈ，ｍ，５−Ｈ），３．５１（１Ｈ，ｂｒ，７−Ｈ），３．７１（１Ｈ，ｓ，１２−Ｈ），４．２５（１Ｈ，ｂｒ，１１−Ｈ），４．６１（１Ｈ，ｂｒ，１４−Ｈ），４．８５（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ１＝３６Ｈｚ，Ｊ２＝１７．２Ｈｚ，１９−Ｈ）；
１３ＣＮＭＲ，δｐｐｍ：１５．４（１８−Ｃ），１７（２−Ｃ），１９．２（１６−Ｃ），２０（１７−Ｃ），２１．８（６−Ｃ），２９．５（１−Ｃ），３２．７（１５−Ｃ），３５．０（１０−Ｃ），３９（５−Ｃ），５５．７（１１−Ｃ），５６．０，５６．２（８−Ｃ），５６．７（７−Ｃ），６２．５（１２−Ｃ），６６．０（９−Ｃ），７０．８（１９−Ｃ），７７．５（１４−Ｃ），８３．７（１３−Ｃ），１１２（ＳＣＮ），１２３（３−Ｃ），１６３（４−Ｃ），１７３．６（２０−Ｃ）。
【００４２】
３１ＰＮＭＲ，δｐｐｍ：４．５７．
【００４３】
（実施例２）
下記化２２式で示される１２−β−チオシアノ−１３−α−ヒドロキシトリプトリド−１４−β−ブタンジオイン酸モノエステル（Preparation of 12-β-thiocyano-13-α-hydroxy triptolide-14-β-mono-succinate）（以下、ＷＤＹ６と略称する）の製造。
【００４４】
【化２２】
【００４５】
室温で、５０ｍｌの三口フラスコの中に１２−β−チオシアノ−１３−α−１４−β−ヒドロキシトリプトリド（Ｔ−ＳＣＮ）（０．１９１ｍｍｏｌ）８０ｍｇ、ピリジン８ｍｌを入れて、ＤＭＦ４ｍｌとＤＭＡＰ２４ｍｇを添加し、最後に無水ブタンジオイン酸３．２ｇ（３．８２０ｍｍｏｌ）を添加し、密封・攪拌し１週間反応した後、反応液を氷水に注いで、ジクロロメタンで数回抽出し、ジクロロメタンを併合し、ＴＬＣにより検出した（展開剤はクロロホルム：メタノール＝１０：１であり、主なスポットはＷＤＹ６であり、極めて少量の反応していない１２−β−チオシアノ−１３−α−１４−β−ヒドロキシトリプトリドが認められた）。減圧・濃縮し、溶媒を全部蒸発して、Ｈシリカゲルを使って、クロロホルム：メタノール（１４：１）を溶出剤とするカラムクロマトグラフィにより純標題物が得られた。イールドが９０％であり、Ｒｆが０．３０である。融点が１２７〜１２９℃である。水溶解度は３０ｍｇ／ｍｌより大きい。
【００４６】
元素分析：Ｃ２５Ｈ２９ＳＮＯ９、計算値％：Ｃ、５７．７９。Ｈ、５．６３。Ｎ、２．７０。実測値％：Ｃ、５７．６６。Ｈ、５．９１。Ｎ、３．０５。
【００４７】
ＩＲ：３４３５，２９７０，２１５２，１７４５，１６７３，１１５７，１０２２，９９３。
【００４８】
１ＨＮＭＲ，δｐｐｍ：０．７９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１６−ＣＨ３），０．８９（３Ｈ，ｓ，１８−ＣＨ３），０．９７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１７−ＣＨ３），１．２９（１Ｈ，ｍ，１−αＨ），１．４４（１Ｈ，ｍ，１−βＨ），１．８３（１ｍ，ｔ，Ｊ＝１４．４Ｈｚ，６−βＨ），１．９５（１Ｈ，ｍ，１５−Ｈ），１．９９（１Ｈ，ｍ，２−Ｈ），２．１５（１Ｈ，ｍ，２−Ｈ），２．２３（１Ｈ，ｍ，６−αＨ），２．４６〜２．５１（４Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２−），２．６９（１Ｈ，ｍ，５−Ｈ），３．５２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，７−Ｈ），３．９６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１２−Ｈ），４．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０３Ｈｚ，１１−Ｈ），４．５３（１Ｈ，ｓ，１４−Ｈ），４．８４（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ１＝４２Ｈｚ，Ｊ２＝１８．４Ｈｚ，１９−Ｈ）；５．５３（１Ｈ，ｓ，１３−ＯＨ），１２（１Ｈ，ｂｒ，−ＣＯＯＨ）。
【００４９】
１３ＣＮＭＲ，δｐｐｍ：１４．３（１８−Ｃ），１５．７（１７−Ｃ），１６．３（１６−Ｃ），１６．８（２−Ｃ），２２．２（６−Ｃ），２８．８〜２８．９（−ＣＨ２ＣＨ２−），２９．４（１５−Ｃ），３０．１（１−Ｃ），３５．２（１０−Ｃ），３９．５（５−Ｃ），５０．９（１２−Ｃ），５７．７（１１−Ｃ），５９．０（８−Ｃ），６２．１（７−Ｃ），６７．１（９−Ｃ），７０．６（１９−Ｃ），７４．２（１４−Ｃ），７５．６（１３−Ｃ），１１４．０（ＳＣＮ），１２３．５（３−Ｃ），１６２．２（４−Ｃ），１７０．８（−ＣＯ−），１７３．３８〜１７３．４３（−ＣＯＯＨ，２０−Ｃ）。
【００５０】
（実施例３）
下記化２３式で示されるトリプトリド−１４−β−リン酸ジナトリウム（triptolide-14-β-phosphate disodium）（以下、ＷＤＹ７と略称する）の製造
【００５１】
【化２３】
【００５２】
窒素雰囲気で三口フラスコの中にＴ（０．５００ｍｍｏｌ）１８０ｍｇ、ピリジン１０ｍｌを入れて、ＰＯＣｌ３（１．５０ｍｍｏｌ）０．１４ｍｌをゆっくり滴下し、それから、密封し２〜３時間反応し、氷浴で冷却・加水分解して、炭酸水素ナトリウムでｐＨ＝９に調節して、乾くまで減圧・濃縮して、メタノールでそれを溶解して、無機塩を除去した。ＴＬＣにより検出した（展開剤はｎ−ブチルアルコール：水：氷酢酸＝４：１：１であり、主なスポットがＷＤＹ７であり、極めて少量のＴと他の副産物が認められた）。ｎ−ブチルアルコール：水（１５：２）を溶出剤とするシリカゲルカラムクロマトグラフィにより分離を行った。ＴＬＣにより検出しながらＷＤＹ ７を併合し、乾くまで減圧・濃縮して、テトラヒドロフランで溶解し、エーテルで沈殿することにより、純標題物１６７ｍｇが得られ、イールドが７５％であり、Ｒｆ値が０．３２であり、水溶解度は１００ｍｇ／ｍｌより大きい。
【００５３】
ＭＳ：ＥＳＩ＋ ｍ／ｚ：Ｃ２０Ｈ２４Ｏ９ＰＮａ２計算値：４８５．０９５６，測定値：４８５．０９５３。
【００５４】
ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：３４２４，２９７１，２９３５，２８７８，１７４８，１６７１，１４４５，１２２６，１１１８，１０３５，９７５．
１ＨＮＭＲ；δｐｐｍ：０．７０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１６−ＣＨ３），０．８８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１７−ＣＨ３），０．９６（３Ｈ，ｓ，１８−ＣＨ３），１．２５（１Ｈ，ｍ，１−αＨ），１．３０（１Ｈ，ｍ，１−βＨ），１．８２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１３．８Ｈｚ，６−βＨ），１．９６（１Ｈ，ｍ，２−Ｈ），２．０８（１Ｈ，ｍ，２−Ｈ），２．１３（１Ｈ，ｍ，６−αＨ），２．２１（１Ｈ，ｍ，１５−Ｈ），２．５５（１Ｈ，ｍ，５−Ｈ），３．３６（１Ｈ，ｍ，７−Ｈ），３．８３（１Ｈ，ｍ，１１−Ｈ），４．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ，１４−Ｈ），０．８３（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ１＝３５．０Ｈｚ，Ｊ２＝１７．４Ｈｚ，１９−Ｈ）。
【００５５】
１３ＣＮＭＲ，δｐｐｍ：１４．４（１８−Ｃ），１７．１（２−Ｃ），１７．５（１６−Ｃ），１８．０（１７−Ｃ），２３．１（６−Ｃ），２６．０（１５−Ｃ），２９．７（１−Ｃ），３５．７（１０−Ｃ），４０．３（５−Ｃ），５４．７（１２−Ｃ），５５．５（１１−Ｃ），６０．８（７−Ｃ），７１．０（１９−Ｃ），７５（１４−Ｃ），１２３．８（３−Ｃ），１６３．２（４−Ｃ），１７４．１（２０−Ｃ），６１．１，６４．２，６５．２，６５．３（８−Ｃ，９−Ｃ，１３−Ｃ）。
【００５６】
（実施例４）
化２４式で示されるトリプトリド−１４−β−亜リン酸ナトリウム（triptolide-14-β-phosphite sodium）（以下、ＷＤＹ４と略称する）の製造。
【００５７】
【化２４】
【００５８】
窒素雰囲気で２５ｍｌの三口フラスコの中にＴ（０．５５６ｍｍｏｌ）２００ｍｇとピリジン２０ｍｌを入れてから、ＰＣｌ３（１．１４９ｍｍｏｌ）０．１０ｍｌをゆっくり滴下し、それから、窒素の通気を停止し、密封し１時間反応し、反応フラスコを氷浴で冷却して、反応液に飽和炭酸水素ナトリウムをゆっくり添加し、加水分解してｐＨ＝８に調節した。溶媒を減圧で全部蒸発した後、クロロホルム／メタノール（５／２）を入れて溶解し、無機塩を除去した。ＴＬＣにより検出した（展開剤はｎ−ブチルアルコール：水：氷酢酸＝４：１：１であり、主なスポットはＷＤＹ４であり、極めて少量の他の副産物が認められた）。Ｈシリカゲル２２ｇでクロロホルム：メタノール（５：２）を溶出剤とするカラムクロマトグラフィにより分離を行った。ＴＬＣにより検出しながら、目的物を併合し、溶媒を減圧で蒸発・除去して、そして、少量の溶出液で溶解してから、エーテルで沈殿し、純標題物７０ｍｇがえられた。イールドが５０％であり、Ｒｆ値が０．４６で、呈色試薬であるＫｅｄｄ’ｓ試薬により、赤紫色を表示した。水溶解度は１００ｍｇ／ｍｌより大きい。
【００５９】
ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：３４２４，２９６５，２３６５，１７５０，１６２７，１２２６，１０２８，９７２。
【００６０】
１ＨＮＭＲ，δｐｐｍ：０．７４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１６−ＣＨ３），０．９０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１７−ＣＨ３），０．９４（３Ｈ，ｓ，１８−ＣＨ３），１．２５（１Ｈ，ｍ，１−αＨ），１．３２（１Ｈ，ｍ，１−βＨ），１．８０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１４．２Ｈｚ，６−βＨ），１．９４（１Ｈ，ｍ，２−Ｈ），２．１０（１Ｈ，ｍ，２−Ｈ），２．２０（１Ｈ，ｍ，６−αＨ），２．３３（１Ｈ，ｍ，１５−Ｈ），２．５９（１Ｈ，ｍ，５−Ｈ），３．２９（１Ｈ，ｍ，７−Ｈ），３．５２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１１−Ｈ），３．８２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１２−Ｈ），４．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，１４−Ｈ），４．８３（２Ｈ，ｍ，１９−Ｈ），６．７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５９５．６Ｈｚ，Ｐ−Ｈ）。
【００６１】
１３ＣＮＭＲ，δｐｐｍ：１３．９（１８−Ｃ），１６．７（２−Ｃ），１７．０（１６−Ｃ），１７．５（１７−Ｃ），２２．８（６−Ｃ），２６．３（１５−Ｃ），２９．２（１−Ｃ），３５．３（１０−Ｃ），４０．１（５−Ｃ），５４．３（１２−Ｃ），５４．９（１１−Ｃ），６０．４（７−Ｃ），７０．３（１９−Ｃ），７３．（Ｃ−１４，ｄ，Ｊ＝２２．８Ｈｚ），１２３．２（３−Ｃ），１６２．５（４−Ｃ），１７３．２（２０−Ｃ），６３．５，６４．５，６４．６（８−Ｃ，９−Ｃ，１３−Ｃ）。
【００６２】
３１ＰＮＭＲ，δｐｐｍ：１．３４（ｄ，ＪＰ−Ｈ＝５９９Ｈｚ）。
【００６３】
（実施例５）
化２５式で示される１２−β−クロロトリプトリド−１３−α−１４−β−リン酸ナトリウム（12-β-chlorotriptolide-13-α-14-β-phosphate sodium）（以下、ＷＤＹ２と略称する）の製造。
【００６４】
【化２５】
【００６５】
窒素雰囲気で三口フラスコの中にＴ（０．３ｍｍｏｌ）１０８ｍｇと、ピリジン３０ｍｌと、ＤＭＡＰ３９ｍｇとを入れてから、ＰＯＣｌ３（１６．３７ｍｍｏｌ）１．５ｍｌを滴下し、それから、窒素の通気を停止し、密封し室温で２４時間反応して、氷浴で冷却・加水分解して、飽和炭酸水素ナトリウムでｐＨ＝８に調節して、乾くまで減圧・濃縮して、テトラヒドロフランでそれを溶解して、無機塩を除去した。ＴＬＣにより検出した（展開剤はｎ−ブチルアルコール：水：氷酢酸＝１０：１：１であり、主なスポットがＷＤＹ２であり、極めて少量のＴと他の副産物が認められた）。得られたものを、ｎ−ブチルアルコール：水（１５：２）を溶出剤とするシリカゲルカラムクロマトグラフィにより分離した。ＴＬＣにより検出しながら、ＷＤＹ２を併合し、濃縮・蒸発乾涸して、少量テトラヒドロフランで溶解しエーテルで沈殿することによって、純標題物１１５．２ｍｇが得られた。イールドが８０％であり、Ｒｆ値が０．３３であり、呈色試薬であるＫｅｄｄ’ｓ試薬により、赤紫色を表示した。水溶解度は１００ｍｇ／ｍｌより大きい。
【００６６】
元素分析：Ｃ２０Ｈ２３Ｏ７ＣｌＰＮａ、計算値％：Ｃ４９．９６、Ｈ４．８２、実測値％：Ｃ４９．７５、Ｈ４．４３。
【００６７】
ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：３４２８，２９３０，１７４１，１６３４，１２４４，１０２３，５８２
１ＨＮＭＲ，δｐｐｍ：０．７８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１６−ＣＨ３），０．９６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１７−ＣＨ３），１．０（３Ｈ，ｓ，１８−ＣＨ３），１．３６（１Ｈ，ｍ，１−αＨ），１．３８（１Ｈ，ｍ，１−βＨ），１．８９（１Ｈ，ｍ，６−βＨ），２．０６（１Ｈ，ｍ，２−Ｈ），２．１６（１Ｈ，ｍ，１５−Ｈ），２．２１（１Ｈ，ｍ，２−Ｈ），２．３９（１Ｈ，ｍ，６−αＨ），３．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ，５−Ｈ），３．５４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１２−Ｈ），３．８６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１１−Ｈ），４．４４（１Ｈ，ｓ，１４−Ｈ），４．６３（１Ｈ，ｓ，７−Ｈ），４．８３（２Ｈ，ｍ，１９−Ｈ）。
【００６８】
１３ＣＮＭＲ，δｐｐｍ：１５．０（１８−Ｃ），１６．８（１６−Ｃ），１７．６（２−Ｃ），１８．０（１７−Ｃ），２８．５（６−Ｃ），２８．９（１５−Ｃ），２９．９（１−Ｃ），３７．０（１０−Ｃ），３７．５（５−Ｃ），５３．４（１２−Ｃ），５７．８（１１−Ｃ），６３．７（７−Ｃ），７０．７（１９−Ｃ），７４．６（１４−Ｃ），１２４．０（３−Ｃ），１６３．３（４−Ｃ），１７３．５（２０−Ｃ），６１．８，６１．９，６２．９，８１．４（８−Ｃ，９−Ｃ，１３−Ｃ）。
【００６９】
３１ＰＮＭＲ，δｐｐｍ：２．９６。
【００７０】
（実施例６）
下記化２６式で示される１２−β−チオシアノ−１３−α−ヒドロキシトリプトリド−１４−β−リン酸ジナトリウム（12-β-thiocyano-13-α-hydroxy triptolide-14-β-phosphate disodium）（以下、ＷＤＹ３と略称する）の製造。
【００７１】
【化２６】
【００７２】
窒素雰囲気で三口フラスコの中にＴ−ＳＣＮ（０．１００ｍｍｏｌ）４１．９ｍｇを入れて、次にピリジン５ｍｌ、ＤＭＡＰ８ｍｇを添加し、最後にＰＣｌ３（０．２００ｍｍｏｌ）０．０１８ｍｌを入れて、密封し室温で反応して、ｐ−メトキシベンザルコール（０．５２０ｍｍｏｌ）０．０６５ｍｌを入れて、室温で１０分間反応した後、３０％のＨ２Ｏ２０．２００ｍｌを入れ、室温で半時間反応した後、氷浴で冷却し飽和炭酸水素ナトリウムを入れ、加水分解する。乾くまで減圧・濃縮して、酢酸エチルでそれを溶解して、無機塩を除去して、飽和塩化ナトリウム水溶液で数回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、乾くまで減圧・濃縮して、アセトニトリルで溶解しプラスチック試験管の中に転移して、そしてＨＦ（４８％）０．３００ｍｌを入れて７２時間反応させ、ＴＬＣにより検出した（展開剤はｎ−ブチルアルコール：水：氷酢酸＝４：１：１であり、主なスポットは産物スポットであり、極めて少量のＴ−ＳＣＮと他の副産物が認められた）。アセトニトリルで溶解し７５〜３００メッシュのシリカゲル２ｇと撹拌してからアセトニトリルを全部除去した後、ｎ−ブチルアルコール：水（１５：２）を溶出剤とするシリカゲルカラムクロマトグラフィ（７５〜３００メッシュ）により分離を行って、ＴＬＣにより追従検出しながら、産物スポットを収集し、併合し、溶媒を減圧で蒸発・除去し、少量溶媒を入れてエーテルで沈殿し、１時間静置した後、ろ過して粉状の固形成分が得られ、得られたものを乾燥ガンで乾燥した。Ｒｆ値が０．２４であり（ｎ−ブチルアルコール／水／氷酢酸＝４：１：１）、呈色試薬であるＫｅｄｄ’ｓ試薬により、赤紫色を表示した。水溶解度は１００ｍｇ／ｍｌより大きい。
【００７３】
（実施例７）
下記化２７式で示される１２−β−チオシアノトリプトリド−１３−α−ヒドロキシ−１４−β−亜リン酸ナトリウムと１２−β−チオシアノトリプトリド−１４−β−ヒドロキシ−１３−α−亜リン酸ナトリウム（12-β-thiocyano-13-α-hydroxy triptolide-14-β-phosphite sodium and 12-β-thiocyano-14-β-hydroxy triptolide-13-α-phosphite sodium）（以下、ＷＤＹ５と略称する）の製造。
【００７４】
【化２７】
【００７５】
三口フラスコの中にＴ−ＳＣＮ（０．１９１ｍｍｏｌ）８０ｍｇを入れて、次にピリジン８ｍｌを入れて攪拌しながら溶解した後、無水酢酸を入れて、密封し室温で１週間反応して、そして４０℃で１０時間反応した後、反応液を氷水に注いで、ジクロロメタンで三回抽出し、ジクロロメタンを併合し、飽和ＮａＨＣＯ３で三回洗浄し、そして飽和ＮａＣｌ水溶液で中性まで洗浄し、最後に無水Ｎａ２ＳＯ４で２４時間乾燥して、減圧で蒸留・濃縮し溶媒を除去することにより粗品が得られた。ＴＬＣにより検出した（展開剤はクロロホルム：メタノール＝１０：１であり、主なスポットはアセチル化されたＴ−ＳＣＮであり、また少量のＴ−ＳＣＮが認められた）。産物スポットを併合してアセトンで溶解し、シリカゲル０．５ｇと攪拌してからアセトニトリルを全部除去した後、クロロホルム：メタノール（１５：１）を溶出剤とするシリカゲルカラムクロマトグラフィにより分離を行った。ＴＬＣにより検出しながら、アセチルＴ−ＳＣＮ画分を収集し、７０ｍｇが得られた。窒素雰囲気の三口フラスコの中に、アセチル化されたＴ−ＳＣＮ ７０ｍｇをピリジン２ｍｌに溶解して、そしてＰＣｌ３０．１ｍｌを入れて、密封し室温で３０分間反応した後、氷水で冷却し加水分解し、ジクロロメタンを４０ｍｌ入れ、水で二回洗浄し、水相のもの６０ｍｌを併合し、ＴＬＣ（展開剤はｎ−ブチルアルコール：水：氷酢酸＝４：１：１である）により検出した結果は、基本的に不純物はないことである。前記６０ｍｌの水溶液に飽和Ｎａ２ＣＯ３水溶液４０ｍｌを入れて、室温で１８時間加水分解して、希Ｈ２ＳＯ４でＰＨ＝７になるように中和して、水を減圧蒸留で除去し、アルコールで脱塩して、ＴＬＣ（展開剤はｎ−ブチルアルコール：水：氷酢酸＝１０：１：１である）により検出した結果は、産物スポットが著しいがわりに多い不純物点もあることである。クロロホルム：メタノール（４：１）を溶出剤とするシリカゲルカラムクロマトグラフィにより分離を行ってＷＤＹ５が得られた。Ｒｆ値が０．５４である。産物の水溶解度は１００ｍｇ／ｍｌより大きい。
【００７６】
（実施例８）
ＩＬ―１、ＩＬ―２、ＩＬ−６及びｉＮＯＳの細胞因子に対するＷＤＹ系化合物の作用についての説明。
【００７７】
細胞因子、プロスタグランジン類、及び亜酸化窒素のいずれも、免疫系の重要な媒質であり、かつ多くの能動免疫欠乏病と炎症病気に関連する組織と細胞の中に発現されている。薬物がそれらの炎症媒質の産生を抑制することを研究するために、リアルタイム逆転写ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）により定量的にＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６及びｉＮＯＳのｍＲＮＡ発現レベルを検出したが、それらの炎症因子は、ＬＰＳ或いはＰＨＡがラットの脾臓リンパ球を刺激することにより、誘導産生された。シクロスポリンＡとＷＤＹ４が完全的にＬＰＳ或いはＰＨＡにより誘導されたＩＬ−２ｍＲＮＡの発現を抑制した（図１）が、ＷＤＹ４も完全的にＩＬ−６とｉＮＯＳのｍＲＮＡの発現を抑制した（図２）。しかし、シクロスポリンＡはこれらの二種類の因子に対する作用がわりに弱い。ＷＤＹ１とＷＤＹ６の免疫抑制活性はとても良い。また、動物試験結果から、この二種類の化合物は、毒性がとても低いことが分かる。本発明及びその誘導体が能動免疫欠乏病と炎症病気の治療に有効であることは証明された。
【００７８】
（実験方法）
常法に従って、Ｌｅｗｉｚラットから脾臓細胞を取得して、これを６穴の培養板に接種して、細胞密度が１×１０６／ｍｌである。培養細胞内に適宜な濃度の化合物を入れて、３７℃で１５分間予培養しＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ産品）１μｇ／ｍｌ或いはＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ産品）１μｇ／ｍｌを入れて、３７℃で５％のＣＯ２条件下で２時間培養して、Ｑｉａｇｅｎ社制のＲＮＡ製造キットで脾臓細胞の総ＲＮＡを抽出した。
【００７９】
メーカー（Perkin Elmer applied Biosystems）の提供したＡＢＩ ＴａｑＭａｎ検出キット解説に基づき、ＲＴ−ＰＣＲ実験を行った。デオキシヌクレオチド混合物２ｍＭ、ＤＴＴ１００ｍＭ、ＲＮａｓｅ抑制剤４０単位、ランダムプライマー５０ｎｇ、Thermoscriptリバーストランスクリプターゼ１５単位を含んでいる反応系の中に、脾臓細胞ｍＲＮＡ（１μｇ）を相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写し、反応条件は２５℃、１０分間、４８℃、４５分間、は９０℃、５分間で、その後に、４℃に冷却した。ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ技術によりＡＢＩ７７００シーケンス検出器にＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ｉＮＯＳ及びサイクロフィリン（cyclophilin）の発現レベルを測定した。その反応系は、１× TaqMan Universal Master Mix、９００ｎＭの順方向（上流側）と逆方向（下流側）プライマー、２００ｎＭ、ＴａｑＭａｎプローブ、５０ｎＭのプライマー及びプローブを含み、熱サイクル条件は、９５℃、１５分間、６０℃、１分間で、全部で４０サイクルを行った。相関正規曲線で目標ｍＲＮＡとサイクロフィリンのｍＲＮＡの発現収量を算出した。結果を図１と図２に示す。
【００８０】
（実施例９）
ＰＧＥ２酵素活性法で本発明のＣＯＸ−２に対する抑制作用について説明する。
【００８１】
Ｃａｙｍａｎ社制のＰＧＥ２ＥＩＡキットを用いて、本発明のＷＤＹｓがＣＯＸ−２の触媒作用によりアラキドン酸からＰＧＥ２を産生するということに対する影響を検討した。仔牛血清（fetal calf serum）１０％と適量のペニシリン、ストレプトマイシンを含んでいるＲＰＭＩ １６４０培養液に適宜密度のＨＴ−２９人結腸癌細胞を接種して、翌日に細胞が壁に貼ってから、新たな培養液に変えて本発明（ＷＤＹ４とＷＤＹ７、１０μｇ／ｍｌ）を入れて、インドメタシン（１００μｇ／ｍｌ）を陽性対照として、薬物を含んでいないものを陰性対照とした。薬物が２４時間作用した後、古い培養液を捨てて、ＰＢＳで二回洗濯して、アラキドン酸（ＡＡ）４０μＭを含んでいる無血清培地１ｍｌを入れて、３７℃で３０分間作用し、上清液を収集して、キットの取り扱い解説に従って誘導化を行って夜を越して、且つＰＧＥ２の産生量を検出・計算し、結果を図３に示す。
【００８２】
（実施例１０）
ＷＤＹ１静脈注射のＬＤ５０の結果について説明する。
【００８３】
水でＷＤＹ１を調製して、五つの用量群（１５０、１３５、１２２、１０９、９８ｍｇ／ｋｇ体重）を設けて、群ごとに１０匹の昆明種マウス（動物合格証明番号：川実動管第９９−３０号）、雌と雄が別々半分であり、尾静脈注射（ｉｖ）した。下記表１に示す結果は、ＷＤＹ１の短期毒性のＬＤ５０が１２６ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００８４】
【表１】
【００８５】
（実施例１１）
ＷＤＹのＤＮＣによるマウス遅延型過敏反応に対する影響について説明する。
【００８６】
原理：ジニトロフルオロベンゼン（dinitrofluorobenzene、ＤＮＣＢ）をハプテンとして、その溶液を腹壁皮膚に塗布した後、皮膚蛋白質と結合し全抗原になって、これによって、ＴＬＣを刺激し感作リンパ球に増殖した。４〜７日後に、これを再び皮膚に塗布し、局部に遅延型アレルギー（水腫）を起こさせ、一般的に、抗原が侵襲した後の２４〜４８時間にピークに達するために、この時に局部腫脹を測定した。
【００８７】
評価：薬物が細胞免疫に対する作用を検出することを除いて、また常に細胞免疫機能増加と減少のモデルを製造することに用いられている。遅延型過敏反応は、感作生体が抗原により攻撃された２４〜４８時間後に発生した組織損傷であり、ピーク時期で測定された組織腫脹度は遅延型過敏反応の強度とすることができる。
【００８８】
（１．試験材料）
試薬：ＷＤＹ１、ＷＤＹ６、ＷＤＹ７のいずれも白色粉末であり、使用直前に生理食塩水で所望の濃度に調製される。
【００８９】
動物：昆明種マウス１１０匹、動物合格証明番号：川実動管第９９−３０号。
【００９０】
試薬：２，４−ジニトロクロルベンゼン（ＤＮＣＢ）、ロット番号：２００００１０１、上海試剤一廠から生産される。使用直前にアセトンで５０％、２％、０．５％、０．１５％の濃度に調製される。
【００９１】
（２．試験方法）
中国衛生部が発布した新薬（西洋薬剤）の臨床前研究指導原則中の抗炎免疫薬物薬力学指導原則に従ってデザインする。用量配置：以下の表２の通りにグループ分けと薬剤投与を行う。
【００９２】
【表２】
【００９３】
感作：マウスについては一匹ずつ背部に小さい部分が脱毛され、微量注射器で５０％のＤＮＣＢアセトン溶液２μｌを裸出の皮膚に滴下して、動物を感作させる。
【００９４】
薬剤投与：感作当日で表１の通り投与開始、一日一回、十日続き（ただし、ＷＤＹ７は一日おき投与）
誘発：投与１０日目後に、一匹ずつ腹部に三箇所の脱毛が認められ、その大きさはｄ＝１ｃｍ程度であり、２％、０．５％、０．１５％のＤＮＣＢアセトン溶液をそれぞれ２０μｌ三箇所の裸出皮膚に滴下して、動物を誘発する。
【００９５】
評価指数：誘発の２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ後に、動物の三箇所の皮膚の反応を観察して、以下の表３の通りに点数を記録して、三箇所の皮膚の点数合計を評価指数として、対照群と比較する。
【００９６】
【表３】
【００９７】
（３．試験結果）
下記表４の通りである。
【００９８】
【表４】
【００９９】
（実施例１２）
ＷＤＹ１、ＷＤＹ６、ＷＤＹ７の抗炎試験（綿球肉芽腫法）
原理：綿球をラット体内に植え込み結合組織の過形成を引き起こし、このような肉芽過形成は、臨床で幾つかの炎症後期の病理変化と類似し、薬物の抗結合組織増殖作用に対する評価に用いられる。薬剤投与群と陰性対照群の肉芽腫の重量の差異を比較して、各薬剤投与群の抑制率は有意的な差異が認められ、それで、当該薬物が該炎症モデルに抗炎作用を有すると考えられる。陽性薬物はヒドロコルチゾンである。
【０１００】
（１．実験材料）
動物：Ｗｉｓｔｅｒラット１１０匹、雄性、体重２００〜２５０ｇ。試薬：ＷＤＹ１、ＷＤＹ６、ＷＤＹ７。陽性試料：ヒドロコルチゾン。
【０１０１】
（２．実験方法）
中国衛生部が発布した新薬（西洋薬剤）の臨床前研究指導原則中の抗炎免疫薬物薬力学指導原則に従ってデザインする。
【０１０２】
１１０匹の動物をペントバルビダールナトリウムｉｐ３０ｍｇ／ｋｇで麻酔し、消毒幹綿球２０ｍｇを右腹部の下部に植え込み、翌日表１の通りにグループ分けに投与して、最終投与２４時間後に、ラットを殺して、綿球を剥離して脂肪組織を取り除き、６０℃のオーブンで１時間焙焼して、綿球を取り出し秤量して、秤量し得た重量から元の綿球重量２０ｍｇを引き、腫脹度としてｍｇ／１００ｇで表示し、同時に薬剤投与群と対照群を比較した。
【０１０３】
（３．実験結果）
【表５】
【０１０４】
表５に示すように、ヒドロコルチゾン群が対照群と比較すると、その綿球肉芽腫の重量が対照群より有意的に小さいことが分かる。ＷＤＹ１、ＷＤＹ６、ＷＤＹ７のいずれも著しい抗綿球肉芽腫作用を示した。３薬剤の高、中用量及びＷＤＹ１の低用量は、それらの綿球肉芽腫が対照群より、全部有意的に減少して、且つ一定のプラスの量効関係（positive dose-effect relationship）を示す。
【０１０５】
（実施例１３）
短期毒性試験について説明する。
【０１０６】
マウスのＷＤＹ６静脈注射（ｉｖ）による短期毒性ＬＤ５０、
昆明種マウス（雄：５匹、雌：５匹、動物合格証明番号：川実動管第９９−３０号）を短期毒性ＬＤ５０試験に使用した。５群のＷＤＹ６の用量組（２１５、１８７、１６３、１４２、１２３ｍｇ／ｋｇ体重）を設け、生理食塩水でＷＤＹ６を調製し、尾静脈注射した。測定したＬＤ５０は１７２ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０１０７】
【表６】
【０１０８】
同様な方法によりＷＤＹ１とＷＤＹ７を尾静脈注射した場合のＬＤ５０はそれぞれ１２６と０．８ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０１０９】
（実施例１４）
ＷＤＹ６とＷＤＹ７静脈注射のラット佐剤誘導関節炎モデルにおける治療作用について説明する。
【０１１０】
（実験方法）
Ｐｅｒｐｅｒ ＲＪ ｅｔ ａｌ．の方法（非特許文献３）に従って、ラットの佐剤により誘導された関節炎モデルを作成し、且つＷＤＹ６とＷＤＹ７のラット佐剤誘導関節炎に対する治療作用を評価した。またラット後足の腫脹用足の厚さを測定した。
【０１１１】
６４匹の雄ＳＤラット（動物合格証明番号：川実動管質９９−３２号）を無作為的に８群れに分けて、ＷＤＹ６とＷＤＹ７の用量によってそれぞれ５群を設けて、尾静脈注射（ｉｖ）した。空白対照は生理食塩水である。陽性対照薬物はヒドロコルチゾン３０ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０１１２】
【表７】
【０１１３】
Ｆｒｅｕｎｄ佐剤処理後１８日に、関節炎モデルを成功的に作った。注射足（右後足）の腫脹は原発性病変であり、注射足の対側足（左後足）の腫脹は続発性病変である。続発性病変は免疫と関係があると考えられる。
【０１１４】
（実験結果）：
ＷＤＹ６の対側（左後）足に対する影響の結果は図４に示す：ＷＤＹ６は対側足の厚さを著しく減少させ、厚さ減少とＷＤＹ６の用量とは量効関係を示す。その厚さ減少の効果はヒドロコルチゾンによる効果と相当する。低用量ＷＤＹ６（５ｍｇ／ｋｇ体重）は対側足の厚さを著しく減少させる。ＷＤＹ６の短期毒性ＬＤ５０は１７２ｍｇ／ｋｇ、その安全係数“ＬＤ５０／有効用量”は３４（１７２／５）〜６８（１７２／２．５）である。したがってＷＤＹ６は有効且つ安全であるという効果が証明される。
【０１１５】
ＷＤＹ７は同じ結果が認められた（図５を参照）。その安全係数“ＬＤ５０／有効用量”は３２（０．８／０．０２５）である。
【０１１６】
（実施例１５）
ＷＤＹ６ とＷＤＹ７経口投与のラット佐剤誘導関節炎モデルにおける治療作用について説明する。
【０１１７】
（実験方法）
実施例１４と同じ、静脈注射を経口投与に変える。
【０１１８】
【表８】
【０１１９】
実験結果（図６と図７を参照）は、ＷＤＹ６とＷＤＹ７経口投与は顕著にラット佐剤誘導関節炎を治療できるということである。
【０１２０】
（実施例１６）
マウス異種心耳接枝実験でＷＤＹ６とＷＤＹ７の移植心臓の生存時間延長に対する作用について説明する。
【０１２１】
（実験方法）
Ｆｕｌｍｅｒ ＲＩ ｅｔ ａｌ．の方法（非特許文献４）Ａｍ Ｊ Ａｎａｔ． １９６３：２７３−２７８）に従って、６日齢のＣ５７ＢＬマウス（雄又は雌）の全心臓を雄ｂａｌｂ／ｃマウス（動物合格証明番号：川実動管質９９−３１号）（体重２０−２５ｇ）の耳介に接枝する。心電図（ＥＣＧ）で或いは直接的に解剖顕微鏡で接枝された心臓の拍動を記録する。心拍停止は拒絶発生を示す。
【０１２２】
用量：ＷＤＹ６：２０，１０と５ｍｇ／ｋｇ；日ごとに投与、静脈注射。
【０１２３】
ＷＤＹ７：０．２５，０．１２と０．０５ｍｇ／ｋｇ；一日おきに投与、静脈注射。
【０１２４】
シクロスポリンＡ（Cyclosporine Ａ）：２５ｍｇ／ｋｇ；日ごとに投与、経口投与。
【０１２５】
（結果）
次の表９の通りである。
【０１２６】
【表９】
【０１２７】
ＷＤＹ６、ＷＤＹ７とシクロスポリンＡによって、マウス異種心耳接枝実験で、心臓平均生存時間はそれぞれ１２．７、１３．８、１６．１日である。そして、対照の平均生存時間は９．７日だけである。その結果から、ＷＤＹ６とＷＤＹ７は全部著しい抗拒絶作用を有することが分かる。ＷＤＹ６とＷＤＹ７によって処理されたマウスの体重は全然減少しなくて、食欲も正常に維持した。しかし、シクロスポリンＡ処理群のマウスの体重と食欲は皆減少した。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】ＩＬ−２に対する本発明の水溶性トリプトリド誘導体の作用（ｍｅｄｉｕｍ：空白対照、ＰＨＡ：リポ多糖、ＣｓＡ：シクロスポリンＡ）の図である。
【図２】ＩＬ−１、ＩＬ−６、ｉＮＯＳに対する本発明の水溶性トリプトリド誘導体の作用（ｍｅｄｉｕｍ：空白対照、ＰＨＡ：リポ多糖、ＣｓＡ：シクロスポリンＡ）の図である。
【図３】ＨＴ−２９細胞のＰＧＥ２含有量（ｐｇ／ｍｌ）に対する本発明の水溶性トリプトリド誘導体の影響（対照＝２２．９３ｐｇ／ｍｌ、インドメタシン（ｉｎｄｏ）＝１．３ｐｇ／ｍｌ、ＷＤＹ４＝４．２２ｐｇ／ｍｌ、ＷＤＹ７＝４．９７ｐｇ／ｍｌ）の図である。
【図４】対側足（lateral feet）に対するＷＤＹ６の影響の結果を示す図である。
【図５】対側足（lateral feet）の厚さに対するＷＤＹ７の影響の結果を示す図である。
【図６】ＷＤＹ７経口投与場合の左足の厚さに対する影響の結果を示す図である。
【図７】ＷＤＹ６経口投与場合の左足の厚さに対する影響の結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物化学分野に関する。更に具体的に、本発明は、高免疫抑制活性を有する水溶性トリプトリド（Triptolide）誘導体、その製造方法、及びそれらの誘導体が免疫抑制に関する病気の治療に用いられる用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫抑制因子は、慢性関節リウマチ、喘息、系統性紅斑狼瘡（ＳＬＥ）、鱗屑癬、多重硬皮症、動脈粥状硬化、腎炎、Ｉ−型糖尿病などの能動免疫欠乏病、及び免疫に関する炎症に、広く使われている。今、免疫抑制因子も、臓器移植後の同種拒絶を解決するための最も有効な手段である。最もよく使われる免疫抑制因子はアザチオブリン（azathyopurine）、コルチコステロイド（corticosterroids）、メトトレクセエイト（methotrexate）、サイクロホスファミド（cyclophospamide）、６−メルカプトプリン（6-mercaptopurine）、ビンクリスチン（vincristine）、セレブロックス（celebrox）、シクロスポリンＡ（cyclosporine A）、ＦＫ５０６などがある。しかし、これらの薬物はすべて完全に有効ではないし、大多数がわりに高い毒性が伴う。
【０００３】
免疫抑制の活性は免疫系統のＴ、Ｂ細胞によく関連していることが分かる。Ｔ、Ｂ細胞は多種細胞因子を分泌・産生する。細胞因子ごとにその特定の生理機能を有し、そこで、その反映した医療領域は全く同じではない。ある種類の化合物のＴ、Ｂ細胞に対する抑制活性のみから、その化合物の免疫抑制活性の高低を判断することが十分ではない。反って、現在では、Ｔ、Ｂ細胞に対する抑制活性の測定は、当該化合物の細胞に対する毒性を検出するための指標としてよく用いられている。例えば、サイクロホスファミドとシクロスポリンＡに対して、いずれも免疫抑制因子であるが、それぞれ抑制された免疫因子は違う。シクロスポリンＡは、主にインターロイキンＩＩ（ＩＬ−２）を抑制するが、インターロイキンＩ（ＩＬ−Ｉ）に対する抑制作用が極めて弱く、その主要な臨床応用が臓器移植後の同種拒絶を防止することである。そして、サイクロホスファミドは、ＩＬ−ＩＩに対する抑制作用が比較的に弱いが、ＩＬ−Ｉに対してより強い抑制作用があって、主にリューマチ性関節炎のような免疫抑制に関係がある炎症に用いられる。現在、発見した細胞因子は数十種類に達するが、大多数の細胞因子の生理機能は依然としてよく知らない。しかしＩＬ―１、ＩＬ―２、ＩＬ−６、ＴＮＦ、ｉＮＯＳなどの細胞因子について、それらの免疫調節に関する生理機能及び治療分野との関連性は、既に比較的に明瞭である。そのため、動物試験をする前に、化合物についてこれらの細胞因子の作用に対して研究を行うことができ、以後の動物試験の目標と実験方案の制定に指導的な意義がある。
【０００４】
中国の薬用植物であるクロヅルはすでにとても強い免疫抑制活性を持つことが証明された。その粗抽出物（例えば、市販のトリプテリジウムグリコシド（tripterygium glycosides）錠剤）は、すでに臨床に慢性関節リューマチ、喘息、系統性紅斑狼瘡（ＳＬＥ）、鱗屑癬などの能動免疫欠乏病を治療することに用いられている。クロヅルから抽出された化合物であるトリプトリド（triptolide）を用いて臓器移植後の同種拒絶を防止することを研究したところ、トリプトリドの活性がシクロスポリンＡに近いことが認められた。クロヅル植物の著しい免疫抑制活性は国内外の関連実験室の注意を引き起こし、そして多方面の研究を行った。その研究領域が以下の方面に関連する：
【０００５】
１．クロヅル植物から有効な免疫調節化合物を分離・精製している。今まですでにクロヅル植物から１００種類以上の化合物を分離された。例えば、トリプトリド（triptolide）、１６−ヒドロキシトリプトリド、トリプトヘノリド（triptophenolide）、トリプトジオリド（tripdiolide）、トリプクロロリド（tripchlorolide）などの化合物。その中でも、トリプトリドの免疫調節と抗腫瘍活性に対する研究がわりに多い。トリプトリドの免疫抑制活性が最高で、植物の中の含有量は比較的に高くて、構造に修飾を行うことができる位置はわりに多いため、比較的に広範な研究が行なわれた。
【０００６】
２．高免疫抑制活性のトリプトリドに対して、化学構造の修飾を行って、リードコンパウンド（lead compound）であるトリプトリドの毒性を下げる。この方面の研究仕事をめぐって次の通りの特許と文献をすでに発表した：特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、及び特許文献８。
【０００７】
３．天然産物であるトリプトリドの化学デノボシンテシース（Chemical total synthesis）：非特許文献１。
【０００８】
４．細胞培養法で、天然産物のトリプトリドを生産する：特許文献９。
【０００９】
トリプトリドの免疫抑制活性がかなり高いが、次の通りの欠点がその臨床応用を制限した：１．毒性は高くて、そのＬＤ５０は０．８５ｍｇ／ｋｇ体重であり、そして生殖毒性がある。２．水溶性は低くて、静脈（ｉＶ）注射を行うことができない。３．細胞膜の透過性（permeability）が低くて（出願人はまだ実験結果を発表していない）、経口効果がよくない。
【００１０】
これらの問題をめぐって、いくつかの実験室はトリプトリドの化学構造の修飾に対して一連の仕事をした。その中で、特許文献４の１４―無水琥珀酸トリプトリドは水に対する溶解性が高い。特許文献１の８−ヒドロキシトリプトリドと、特許文献１０の１２―チオシアノトリプトリド（thiocyano-triptolide）は元の化合物活性を保つと共に、リードコンパウンドであるトリプトリドの毒性を下げるのに、成功を取る。その中で、１２―チオシアノトリプトリドＬＤ５０は７４ｍｇ／ｋｇ体重で、その毒性はリードコンパウンドであるトリプトリドＬＤ５０（０．８５ｍｇ／ｋｇ体重）に比べて約８７倍下がった。しかしこれらの、トリプトリドから誘導された類似体の水溶性が依然として低くて、細胞膜の透過性も低い。
【００１１】
特許文献１１はいくつかの水溶性トリプトリド誘導体の情報を提供した。特許文献１は水溶性トリプトリド誘導体をいくつか提供したが、これらの水溶性のトリプトリド誘導体の免疫抑制活性の実験データを提供していない。現在、発表された資料の中で優れた水溶性、かつ高免疫抑制活性を有する水溶性のトリプトリド誘導体の中で特許文献４に開示されている１４―無水琥珀酸トリプトリドは好ましい。それの抗腫瘍と臓器移植に対する応用は特許文献１２と非特許文献２に開示されている。
【００１２】
【特許文献１】米国特許第６１５０５３９号明細書
【特許文献２】米国特許第６００４９９９号明細書
【特許文献３】米国特許第５９７２９９８号明細書
【特許文献４】米国特許第５９６２５１６号明細書
【特許文献５】米国特許第５６６３３３５号明細書
【特許文献６】国際特許出願第ＷＯ００／１２４８３号
【特許文献７】中国特許第１０２７３７１Ｃ号明細書
【特許文献８】ＺＬ特許第８９１０６９４１．０号明細書
【特許文献９】米国特許第４３２８３０９号明細書
【特許文献１０】国際特許出願第ＷＯ ００／６３２１２１号
【特許文献１１】国際特許出願ＷＯ０２／２８８６２号
【特許文献１２】米国特許第６３２９１４８号明細書
【非特許文献１】Ｙａｎｇ Ｄなど：有機化学（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）２０００ Ａｐｒ．７；６５（７）：２２０８−１７。
【非特許文献２】移植（Transplantation）、２０００ Ｎｏｖ．２７；７０（１０）：１４４２―７
【非特許文献３】Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ａ ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｓｓａｙ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ． Ｐｒｏｃ Ｓｏｃ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．１９７１，１３７：５０６−５１２．
【非特許文献４】Ａｍ Ｊ Ａｎａｔ．１９６３：２７３−２７８
【発明の開示】
【００１３】
本発明の第―発明は、３種類の水溶性と免疫抑制活性を有する新規なトリプトリド誘導体を提供した。それらの構造は以下の通りである。
【００１４】
第Ｉ種類のトリプトリド誘導体は、下記化９式によって示される。
【００１５】
【化９】
【００１６】
（式中、Ｒ１はＨ、下記化１０式で示されるホスファート、或いは下記化１１式で示されるホスフィットである。本発明の第Ｉ種類の化合物の中に、Ｒ１は下記化１２式で示されるホスファートで、Ｘ１とＸ２はＮａであるものが好ましい。）
【００１７】
【化１０】
【化１１】
【化１２】
【００１８】
第ＩＩ種類のトリプトリド誘導体は、下記化１３式で示される。
【００１９】
【化１３】
【００２０】
（式中、Ｒ１はＨ、炭素数１〜４のアルキル基、−ＡＣ又は−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎＣＯ２（ただし、ｎは１〜４の整数）、或いは下記化１４式で示されるホスファート、或いは下記化１５式で示されるホスフィットである。Ｘ１とＸ２はＮａ、Ｋ、又はＮＨ４である。Ｒ２はＨ、−ＳＣＮ又は−Ｃｌ（−Ｂｒ）である。）
【００２１】
【化１４】
【化１５】
【００２２】
本発明の第ＩＩ種類の化合物の中に、Ｒ１は下記化１６式で示されるホスファートと無水琥珀酸［−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）４ＣＯ２］で、Ｘ１とＸ２はＮａで、Ｒ２は―ＳＣＮであるものが好ましい。
【００２３】
【化１６】
【００２４】
第ＩＩＩ種類のトリプトリド誘導体は、下記化１７式或いは下記化１８式で示される。
【００２５】
【化１７】
【化１８】
（式中、Ｒ２はＨ、−ＳＣＮ、−Ｃｌ又は−Ｂｒである。）
【００２６】
本発明の又の１つの目的は、これらの高水溶性のあるトリプトリドの新規な誘導体の合成方法を提供することにある。具体的に、以下のリードコンパウンドから、前記の３種類の水溶性トリプトリド誘導体を製造する方法（具体的に、実施例１〜７を参照）である。
【００２７】
第１種類のリードコンパウンドは次の化１９式で示されるトリプトリドであり、
特許文献４に、トリプトリドから１４−無水琥珀酸トリプトリド及びそのナトリウム塩の製造方法が開示されているが、本発明のホスホリル化によって製造するトリプトリド−１４−β↓リン酸ジナトリウムは、より高水溶性を有する。
【００２８】
【化１９】
【００２９】
第２種類のリードコンパウンドは、下記化２０式で示される１２−β−チオシアノ−１３−α−ヒドロキシトリプトリド（12-β-thiocynao-α-hydroxy triptolide）である。
【００３０】
【化２０】
【００３１】
本発明の又の１つの目的は、これらの高水溶性のあるトリプトリドの新規な誘導体の免疫抑制活性に関する分子生物学証拠（実施例８，９）を提供することにある。これらのトリプトリドの新規な誘導体は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ｉＮＯＳなどの細胞因子の産生を著しく抑制すると共に、Ｃｏｘ−２の産生を著しく抑制している。
【００３２】
本発明のもう１つの目的は、これらの高水溶性のあるトリプトリドの新規な誘導体の低毒性の動物実験証拠（実施例１０）を提供することにある。本発明のＴ−ＳＣＮから製造された水溶性トリプトリド誘導体の毒性は、著しく低下し、例えば、１２−β−チオシアノトリプトリド−１３−β−１４−α−リン酸ナトリウムのＬＤ５０が１２６ｍｇ／ｋｇ体重、その毒性はトリプトリドのＬＤ５０（０．８５ｍｇ／ｋｇ体重）に比べて、非常に低くて、またその免疫抑制活性もかなり高い。
【００３３】
本発明のもう１つの目的は、これらの高水溶性のあるトリプトリドの新規な誘導体が能動免疫欠乏病の治療に用いられる動物実験証拠（実施例１１）を提供することにある。例えば、ＤＮＣによるマウス遅延過敏症の影響実験（実施例１１）とラット綿球肉芽腫法抗炎試験（実施例１２）で、ＷＤＹ系のトリプトリドの新規な誘導体が全て著しい免疫抑制活性と抗炎活性を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下に、実施例を挙げて本発明を詳しく説明する。
【００３５】
（実施例１）
次の化２１式で示される１２−β−チオシアノトリプトリド−１３−α−１４−β−リン酸ナトリウム（以下、ＷＤＹ１と略称する）の製造。
【００３６】
【化２１】
【００３７】
窒素雰囲気で三口フラスコ（three-necked bottle）の中にＴ−ＳＣＮ（０．６００ｍｍｏｌ）２５１ｍｇを入れて、更にピリジン２０ｍｌ、ＰＯＣｌ３（３．０００ｍｍｏｌ）０．２８ｍｌを添加し、最後に４０ｍｇのＤＭＡＰを入れて、密封して、室温で２４時間反応した後、氷浴で冷却・加水分解して、ｐＨが８になるように調節した。乾くまで減圧・濃縮して、アセトニトリルでそれを溶解して、無機塩を除去した。ＴＬＣにより検出した（展開剤はｎ−ブチルアルコール：水：氷酢酸＝１０：１：１であり、主なスポットは産物であるＷＤＹ １のスポットであり、さらに極めて少量のＴ−ＳＣＮと他の副産物が認められた）。アセトニトリルで溶解して、７５〜３００メッシュのシリカゲル２ｇを入れて、アセトニトリルを全部除去した後、溶出剤としてのｎ−ブチルアルコール：水（２０：１）で７５〜３００メッシュのシリカゲルカラムクロマトグラフィにより分離を行って、ＴＬＣにより追従検出して、産物スポットを収集し、併合して、溶媒を減圧で蒸発・除去し、少量溶媒を入れてエーテルで沈殿し、１時間静置した後、ろ過することにより、粉状の固形成分がえられた。えられたものを乾燥ガン（drying pistol）で乾燥することにより、イールド（yield）が７５％であり、水溶解度は１００ｍｇ／ｍｌより大きくて、Ｒｆ値が０．２４（展開剤はｎ−ブチルアルコール：水：氷酢酸＝１０：１：１である）であり、赤紫色を表示した（呈色試薬はＫｅｄｄ’ｓ試薬である）。
【００３８】
ＭＳ ＥＳＩ＋ ｍ／ｚ：Ｃ２１Ｈ２３ＮＳＯ８ＰＮａ計算値：５０４．０８５８，測定値：５０４．０８５７。
【００３９】
ＭＳ ＥＳＩ− ｍ／ｚ：Ｃ２１Ｈ２３ＮＳＯ８Ｐ計算値：４８０．０８７７，測定値：４８０．０８８８。
【００４０】
ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：３４１７，２９３８，２１５６，１７４９，１６７４，１２４７，１１０９，１０００。
【００４１】
１ＨＮＭＲ，δｐｐｍ：０．８４（３Ｈ，ｓ，１８−ＣＨ３），１．０１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ，１６−ＣＨ３），１．０４（３Ｈ，ｓ，１７−ＣＨ３），１．３４（１Ｈ，ｍ，１−αＨ），１．４６（１Ｈ，ｍ，１−βＨ），１．８０（１ｍ，ｔ，Ｊ＝１４．４Ｈｚ，６−βＨ），１．９４（１Ｈ，ｍ，２−Ｈ），２．１３（１Ｈ，ｍ，２−Ｈ），２．２０（１Ｈ，ｍ，６−αＨ），２．３５（１Ｈ，ｍ，１５−Ｈ），３．０９（１Ｈ，ｍ，５−Ｈ），３．５１（１Ｈ，ｂｒ，７−Ｈ），３．７１（１Ｈ，ｓ，１２−Ｈ），４．２５（１Ｈ，ｂｒ，１１−Ｈ），４．６１（１Ｈ，ｂｒ，１４−Ｈ），４．８５（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ１＝３６Ｈｚ，Ｊ２＝１７．２Ｈｚ，１９−Ｈ）；
１３ＣＮＭＲ，δｐｐｍ：１５．４（１８−Ｃ），１７（２−Ｃ），１９．２（１６−Ｃ），２０（１７−Ｃ），２１．８（６−Ｃ），２９．５（１−Ｃ），３２．７（１５−Ｃ），３５．０（１０−Ｃ），３９（５−Ｃ），５５．７（１１−Ｃ），５６．０，５６．２（８−Ｃ），５６．７（７−Ｃ），６２．５（１２−Ｃ），６６．０（９−Ｃ），７０．８（１９−Ｃ），７７．５（１４−Ｃ），８３．７（１３−Ｃ），１１２（ＳＣＮ），１２３（３−Ｃ），１６３（４−Ｃ），１７３．６（２０−Ｃ）。
【００４２】
３１ＰＮＭＲ，δｐｐｍ：４．５７．
【００４３】
（実施例２）
下記化２２式で示される１２−β−チオシアノ−１３−α−ヒドロキシトリプトリド−１４−β−ブタンジオイン酸モノエステル（Preparation of 12-β-thiocyano-13-α-hydroxy triptolide-14-β-mono-succinate）（以下、ＷＤＹ６と略称する）の製造。
【００４４】
【化２２】
【００４５】
室温で、５０ｍｌの三口フラスコの中に１２−β−チオシアノ−１３−α−１４−β−ヒドロキシトリプトリド（Ｔ−ＳＣＮ）（０．１９１ｍｍｏｌ）８０ｍｇ、ピリジン８ｍｌを入れて、ＤＭＦ４ｍｌとＤＭＡＰ２４ｍｇを添加し、最後に無水ブタンジオイン酸３．２ｇ（３．８２０ｍｍｏｌ）を添加し、密封・攪拌し１週間反応した後、反応液を氷水に注いで、ジクロロメタンで数回抽出し、ジクロロメタンを併合し、ＴＬＣにより検出した（展開剤はクロロホルム：メタノール＝１０：１であり、主なスポットはＷＤＹ６であり、極めて少量の反応していない１２−β−チオシアノ−１３−α−１４−β−ヒドロキシトリプトリドが認められた）。減圧・濃縮し、溶媒を全部蒸発して、Ｈシリカゲルを使って、クロロホルム：メタノール（１４：１）を溶出剤とするカラムクロマトグラフィにより純標題物が得られた。イールドが９０％であり、Ｒｆが０．３０である。融点が１２７〜１２９℃である。水溶解度は３０ｍｇ／ｍｌより大きい。
【００４６】
元素分析：Ｃ２５Ｈ２９ＳＮＯ９、計算値％：Ｃ、５７．７９。Ｈ、５．６３。Ｎ、２．７０。実測値％：Ｃ、５７．６６。Ｈ、５．９１。Ｎ、３．０５。
【００４７】
ＩＲ：３４３５，２９７０，２１５２，１７４５，１６７３，１１５７，１０２２，９９３。
【００４８】
１ＨＮＭＲ，δｐｐｍ：０．７９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１６−ＣＨ３），０．８９（３Ｈ，ｓ，１８−ＣＨ３），０．９７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１７−ＣＨ３），１．２９（１Ｈ，ｍ，１−αＨ），１．４４（１Ｈ，ｍ，１−βＨ），１．８３（１ｍ，ｔ，Ｊ＝１４．４Ｈｚ，６−βＨ），１．９５（１Ｈ，ｍ，１５−Ｈ），１．９９（１Ｈ，ｍ，２−Ｈ），２．１５（１Ｈ，ｍ，２−Ｈ），２．２３（１Ｈ，ｍ，６−αＨ），２．４６〜２．５１（４Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２−），２．６９（１Ｈ，ｍ，５−Ｈ），３．５２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，７−Ｈ），３．９６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１２−Ｈ），４．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０３Ｈｚ，１１−Ｈ），４．５３（１Ｈ，ｓ，１４−Ｈ），４．８４（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ１＝４２Ｈｚ，Ｊ２＝１８．４Ｈｚ，１９−Ｈ）；５．５３（１Ｈ，ｓ，１３−ＯＨ），１２（１Ｈ，ｂｒ，−ＣＯＯＨ）。
【００４９】
１３ＣＮＭＲ，δｐｐｍ：１４．３（１８−Ｃ），１５．７（１７−Ｃ），１６．３（１６−Ｃ），１６．８（２−Ｃ），２２．２（６−Ｃ），２８．８〜２８．９（−ＣＨ２ＣＨ２−），２９．４（１５−Ｃ），３０．１（１−Ｃ），３５．２（１０−Ｃ），３９．５（５−Ｃ），５０．９（１２−Ｃ），５７．７（１１−Ｃ），５９．０（８−Ｃ），６２．１（７−Ｃ），６７．１（９−Ｃ），７０．６（１９−Ｃ），７４．２（１４−Ｃ），７５．６（１３−Ｃ），１１４．０（ＳＣＮ），１２３．５（３−Ｃ），１６２．２（４−Ｃ），１７０．８（−ＣＯ−），１７３．３８〜１７３．４３（−ＣＯＯＨ，２０−Ｃ）。
【００５０】
（実施例３）
下記化２３式で示されるトリプトリド−１４−β−リン酸ジナトリウム（triptolide-14-β-phosphate disodium）（以下、ＷＤＹ７と略称する）の製造
【００５１】
【化２３】
【００５２】
窒素雰囲気で三口フラスコの中にＴ（０．５００ｍｍｏｌ）１８０ｍｇ、ピリジン１０ｍｌを入れて、ＰＯＣｌ３（１．５０ｍｍｏｌ）０．１４ｍｌをゆっくり滴下し、それから、密封し２〜３時間反応し、氷浴で冷却・加水分解して、炭酸水素ナトリウムでｐＨ＝９に調節して、乾くまで減圧・濃縮して、メタノールでそれを溶解して、無機塩を除去した。ＴＬＣにより検出した（展開剤はｎ−ブチルアルコール：水：氷酢酸＝４：１：１であり、主なスポットがＷＤＹ７であり、極めて少量のＴと他の副産物が認められた）。ｎ−ブチルアルコール：水（１５：２）を溶出剤とするシリカゲルカラムクロマトグラフィにより分離を行った。ＴＬＣにより検出しながらＷＤＹ ７を併合し、乾くまで減圧・濃縮して、テトラヒドロフランで溶解し、エーテルで沈殿することにより、純標題物１６７ｍｇが得られ、イールドが７５％であり、Ｒｆ値が０．３２であり、水溶解度は１００ｍｇ／ｍｌより大きい。
【００５３】
ＭＳ：ＥＳＩ＋ ｍ／ｚ：Ｃ２０Ｈ２４Ｏ９ＰＮａ２計算値：４８５．０９５６，測定値：４８５．０９５３。
【００５４】
ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：３４２４，２９７１，２９３５，２８７８，１７４８，１６７１，１４４５，１２２６，１１１８，１０３５，９７５．
１ＨＮＭＲ；δｐｐｍ：０．７０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１６−ＣＨ３），０．８８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１７−ＣＨ３），０．９６（３Ｈ，ｓ，１８−ＣＨ３），１．２５（１Ｈ，ｍ，１−αＨ），１．３０（１Ｈ，ｍ，１−βＨ），１．８２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１３．８Ｈｚ，６−βＨ），１．９６（１Ｈ，ｍ，２−Ｈ），２．０８（１Ｈ，ｍ，２−Ｈ），２．１３（１Ｈ，ｍ，６−αＨ），２．２１（１Ｈ，ｍ，１５−Ｈ），２．５５（１Ｈ，ｍ，５−Ｈ），３．３６（１Ｈ，ｍ，７−Ｈ），３．８３（１Ｈ，ｍ，１１−Ｈ），４．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ，１４−Ｈ），０．８３（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ１＝３５．０Ｈｚ，Ｊ２＝１７．４Ｈｚ，１９−Ｈ）。
【００５５】
１３ＣＮＭＲ，δｐｐｍ：１４．４（１８−Ｃ），１７．１（２−Ｃ），１７．５（１６−Ｃ），１８．０（１７−Ｃ），２３．１（６−Ｃ），２６．０（１５−Ｃ），２９．７（１−Ｃ），３５．７（１０−Ｃ），４０．３（５−Ｃ），５４．７（１２−Ｃ），５５．５（１１−Ｃ），６０．８（７−Ｃ），７１．０（１９−Ｃ），７５（１４−Ｃ），１２３．８（３−Ｃ），１６３．２（４−Ｃ），１７４．１（２０−Ｃ），６１．１，６４．２，６５．２，６５．３（８−Ｃ，９−Ｃ，１３−Ｃ）。
【００５６】
（実施例４）
化２４式で示されるトリプトリド−１４−β−亜リン酸ナトリウム（triptolide-14-β-phosphite sodium）（以下、ＷＤＹ４と略称する）の製造。
【００５７】
【化２４】
【００５８】
窒素雰囲気で２５ｍｌの三口フラスコの中にＴ（０．５５６ｍｍｏｌ）２００ｍｇとピリジン２０ｍｌを入れてから、ＰＣｌ３（１．１４９ｍｍｏｌ）０．１０ｍｌをゆっくり滴下し、それから、窒素の通気を停止し、密封し１時間反応し、反応フラスコを氷浴で冷却して、反応液に飽和炭酸水素ナトリウムをゆっくり添加し、加水分解してｐＨ＝８に調節した。溶媒を減圧で全部蒸発した後、クロロホルム／メタノール（５／２）を入れて溶解し、無機塩を除去した。ＴＬＣにより検出した（展開剤はｎ−ブチルアルコール：水：氷酢酸＝４：１：１であり、主なスポットはＷＤＹ４であり、極めて少量の他の副産物が認められた）。Ｈシリカゲル２２ｇでクロロホルム：メタノール（５：２）を溶出剤とするカラムクロマトグラフィにより分離を行った。ＴＬＣにより検出しながら、目的物を併合し、溶媒を減圧で蒸発・除去して、そして、少量の溶出液で溶解してから、エーテルで沈殿し、純標題物７０ｍｇがえられた。イールドが５０％であり、Ｒｆ値が０．４６で、呈色試薬であるＫｅｄｄ’ｓ試薬により、赤紫色を表示した。水溶解度は１００ｍｇ／ｍｌより大きい。
【００５９】
ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：３４２４，２９６５，２３６５，１７５０，１６２７，１２２６，１０２８，９７２。
【００６０】
１ＨＮＭＲ，δｐｐｍ：０．７４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１６−ＣＨ３），０．９０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１７−ＣＨ３），０．９４（３Ｈ，ｓ，１８−ＣＨ３），１．２５（１Ｈ，ｍ，１−αＨ），１．３２（１Ｈ，ｍ，１−βＨ），１．８０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１４．２Ｈｚ，６−βＨ），１．９４（１Ｈ，ｍ，２−Ｈ），２．１０（１Ｈ，ｍ，２−Ｈ），２．２０（１Ｈ，ｍ，６−αＨ），２．３３（１Ｈ，ｍ，１５−Ｈ），２．５９（１Ｈ，ｍ，５−Ｈ），３．２９（１Ｈ，ｍ，７−Ｈ），３．５２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１１−Ｈ），３．８２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１２−Ｈ），４．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，１４−Ｈ），４．８３（２Ｈ，ｍ，１９−Ｈ），６．７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５９５．６Ｈｚ，Ｐ−Ｈ）。
【００６１】
１３ＣＮＭＲ，δｐｐｍ：１３．９（１８−Ｃ），１６．７（２−Ｃ），１７．０（１６−Ｃ），１７．５（１７−Ｃ），２２．８（６−Ｃ），２６．３（１５−Ｃ），２９．２（１−Ｃ），３５．３（１０−Ｃ），４０．１（５−Ｃ），５４．３（１２−Ｃ），５４．９（１１−Ｃ），６０．４（７−Ｃ），７０．３（１９−Ｃ），７３．（Ｃ−１４，ｄ，Ｊ＝２２．８Ｈｚ），１２３．２（３−Ｃ），１６２．５（４−Ｃ），１７３．２（２０−Ｃ），６３．５，６４．５，６４．６（８−Ｃ，９−Ｃ，１３−Ｃ）。
【００６２】
３１ＰＮＭＲ，δｐｐｍ：１．３４（ｄ，ＪＰ−Ｈ＝５９９Ｈｚ）。
【００６３】
（実施例５）
化２５式で示される１２−β−クロロトリプトリド−１３−α−１４−β−リン酸ナトリウム（12-β-chlorotriptolide-13-α-14-β-phosphate sodium）（以下、ＷＤＹ２と略称する）の製造。
【００６４】
【化２５】
【００６５】
窒素雰囲気で三口フラスコの中にＴ（０．３ｍｍｏｌ）１０８ｍｇと、ピリジン３０ｍｌと、ＤＭＡＰ３９ｍｇとを入れてから、ＰＯＣｌ３（１６．３７ｍｍｏｌ）１．５ｍｌを滴下し、それから、窒素の通気を停止し、密封し室温で２４時間反応して、氷浴で冷却・加水分解して、飽和炭酸水素ナトリウムでｐＨ＝８に調節して、乾くまで減圧・濃縮して、テトラヒドロフランでそれを溶解して、無機塩を除去した。ＴＬＣにより検出した（展開剤はｎ−ブチルアルコール：水：氷酢酸＝１０：１：１であり、主なスポットがＷＤＹ２であり、極めて少量のＴと他の副産物が認められた）。得られたものを、ｎ−ブチルアルコール：水（１５：２）を溶出剤とするシリカゲルカラムクロマトグラフィにより分離した。ＴＬＣにより検出しながら、ＷＤＹ２を併合し、濃縮・蒸発乾涸して、少量テトラヒドロフランで溶解しエーテルで沈殿することによって、純標題物１１５．２ｍｇが得られた。イールドが８０％であり、Ｒｆ値が０．３３であり、呈色試薬であるＫｅｄｄ’ｓ試薬により、赤紫色を表示した。水溶解度は１００ｍｇ／ｍｌより大きい。
【００６６】
元素分析：Ｃ２０Ｈ２３Ｏ７ＣｌＰＮａ、計算値％：Ｃ４９．９６、Ｈ４．８２、実測値％：Ｃ４９．７５、Ｈ４．４３。
【００６７】
ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：３４２８，２９３０，１７４１，１６３４，１２４４，１０２３，５８２
１ＨＮＭＲ，δｐｐｍ：０．７８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１６−ＣＨ３），０．９６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１７−ＣＨ３），１．０（３Ｈ，ｓ，１８−ＣＨ３），１．３６（１Ｈ，ｍ，１−αＨ），１．３８（１Ｈ，ｍ，１−βＨ），１．８９（１Ｈ，ｍ，６−βＨ），２．０６（１Ｈ，ｍ，２−Ｈ），２．１６（１Ｈ，ｍ，１５−Ｈ），２．２１（１Ｈ，ｍ，２−Ｈ），２．３９（１Ｈ，ｍ，６−αＨ），３．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ，５−Ｈ），３．５４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１２−Ｈ），３．８６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１１−Ｈ），４．４４（１Ｈ，ｓ，１４−Ｈ），４．６３（１Ｈ，ｓ，７−Ｈ），４．８３（２Ｈ，ｍ，１９−Ｈ）。
【００６８】
１３ＣＮＭＲ，δｐｐｍ：１５．０（１８−Ｃ），１６．８（１６−Ｃ），１７．６（２−Ｃ），１８．０（１７−Ｃ），２８．５（６−Ｃ），２８．９（１５−Ｃ），２９．９（１−Ｃ），３７．０（１０−Ｃ），３７．５（５−Ｃ），５３．４（１２−Ｃ），５７．８（１１−Ｃ），６３．７（７−Ｃ），７０．７（１９−Ｃ），７４．６（１４−Ｃ），１２４．０（３−Ｃ），１６３．３（４−Ｃ），１７３．５（２０−Ｃ），６１．８，６１．９，６２．９，８１．４（８−Ｃ，９−Ｃ，１３−Ｃ）。
【００６９】
３１ＰＮＭＲ，δｐｐｍ：２．９６。
【００７０】
（実施例６）
下記化２６式で示される１２−β−チオシアノ−１３−α−ヒドロキシトリプトリド−１４−β−リン酸ジナトリウム（12-β-thiocyano-13-α-hydroxy triptolide-14-β-phosphate disodium）（以下、ＷＤＹ３と略称する）の製造。
【００７１】
【化２６】
【００７２】
窒素雰囲気で三口フラスコの中にＴ−ＳＣＮ（０．１００ｍｍｏｌ）４１．９ｍｇを入れて、次にピリジン５ｍｌ、ＤＭＡＰ８ｍｇを添加し、最後にＰＣｌ３（０．２００ｍｍｏｌ）０．０１８ｍｌを入れて、密封し室温で反応して、ｐ−メトキシベンザルコール（０．５２０ｍｍｏｌ）０．０６５ｍｌを入れて、室温で１０分間反応した後、３０％のＨ２Ｏ２０．２００ｍｌを入れ、室温で半時間反応した後、氷浴で冷却し飽和炭酸水素ナトリウムを入れ、加水分解する。乾くまで減圧・濃縮して、酢酸エチルでそれを溶解して、無機塩を除去して、飽和塩化ナトリウム水溶液で数回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、乾くまで減圧・濃縮して、アセトニトリルで溶解しプラスチック試験管の中に転移して、そしてＨＦ（４８％）０．３００ｍｌを入れて７２時間反応させ、ＴＬＣにより検出した（展開剤はｎ−ブチルアルコール：水：氷酢酸＝４：１：１であり、主なスポットは産物スポットであり、極めて少量のＴ−ＳＣＮと他の副産物が認められた）。アセトニトリルで溶解し７５〜３００メッシュのシリカゲル２ｇと撹拌してからアセトニトリルを全部除去した後、ｎ−ブチルアルコール：水（１５：２）を溶出剤とするシリカゲルカラムクロマトグラフィ（７５〜３００メッシュ）により分離を行って、ＴＬＣにより追従検出しながら、産物スポットを収集し、併合し、溶媒を減圧で蒸発・除去し、少量溶媒を入れてエーテルで沈殿し、１時間静置した後、ろ過して粉状の固形成分が得られ、得られたものを乾燥ガンで乾燥した。Ｒｆ値が０．２４であり（ｎ−ブチルアルコール／水／氷酢酸＝４：１：１）、呈色試薬であるＫｅｄｄ’ｓ試薬により、赤紫色を表示した。水溶解度は１００ｍｇ／ｍｌより大きい。
【００７３】
（実施例７）
下記化２７式で示される１２−β−チオシアノトリプトリド−１３−α−ヒドロキシ−１４−β−亜リン酸ナトリウムと１２−β−チオシアノトリプトリド−１４−β−ヒドロキシ−１３−α−亜リン酸ナトリウム（12-β-thiocyano-13-α-hydroxy triptolide-14-β-phosphite sodium and 12-β-thiocyano-14-β-hydroxy triptolide-13-α-phosphite sodium）（以下、ＷＤＹ５と略称する）の製造。
【００７４】
【化２７】
【００７５】
三口フラスコの中にＴ−ＳＣＮ（０．１９１ｍｍｏｌ）８０ｍｇを入れて、次にピリジン８ｍｌを入れて攪拌しながら溶解した後、無水酢酸を入れて、密封し室温で１週間反応して、そして４０℃で１０時間反応した後、反応液を氷水に注いで、ジクロロメタンで三回抽出し、ジクロロメタンを併合し、飽和ＮａＨＣＯ３で三回洗浄し、そして飽和ＮａＣｌ水溶液で中性まで洗浄し、最後に無水Ｎａ２ＳＯ４で２４時間乾燥して、減圧で蒸留・濃縮し溶媒を除去することにより粗品が得られた。ＴＬＣにより検出した（展開剤はクロロホルム：メタノール＝１０：１であり、主なスポットはアセチル化されたＴ−ＳＣＮであり、また少量のＴ−ＳＣＮが認められた）。産物スポットを併合してアセトンで溶解し、シリカゲル０．５ｇと攪拌してからアセトニトリルを全部除去した後、クロロホルム：メタノール（１５：１）を溶出剤とするシリカゲルカラムクロマトグラフィにより分離を行った。ＴＬＣにより検出しながら、アセチルＴ−ＳＣＮ画分を収集し、７０ｍｇが得られた。窒素雰囲気の三口フラスコの中に、アセチル化されたＴ−ＳＣＮ ７０ｍｇをピリジン２ｍｌに溶解して、そしてＰＣｌ３０．１ｍｌを入れて、密封し室温で３０分間反応した後、氷水で冷却し加水分解し、ジクロロメタンを４０ｍｌ入れ、水で二回洗浄し、水相のもの６０ｍｌを併合し、ＴＬＣ（展開剤はｎ−ブチルアルコール：水：氷酢酸＝４：１：１である）により検出した結果は、基本的に不純物はないことである。前記６０ｍｌの水溶液に飽和Ｎａ２ＣＯ３水溶液４０ｍｌを入れて、室温で１８時間加水分解して、希Ｈ２ＳＯ４でＰＨ＝７になるように中和して、水を減圧蒸留で除去し、アルコールで脱塩して、ＴＬＣ（展開剤はｎ−ブチルアルコール：水：氷酢酸＝１０：１：１である）により検出した結果は、産物スポットが著しいがわりに多い不純物点もあることである。クロロホルム：メタノール（４：１）を溶出剤とするシリカゲルカラムクロマトグラフィにより分離を行ってＷＤＹ５が得られた。Ｒｆ値が０．５４である。産物の水溶解度は１００ｍｇ／ｍｌより大きい。
【００７６】
（実施例８）
ＩＬ―１、ＩＬ―２、ＩＬ−６及びｉＮＯＳの細胞因子に対するＷＤＹ系化合物の作用についての説明。
【００７７】
細胞因子、プロスタグランジン類、及び亜酸化窒素のいずれも、免疫系の重要な媒質であり、かつ多くの能動免疫欠乏病と炎症病気に関連する組織と細胞の中に発現されている。薬物がそれらの炎症媒質の産生を抑制することを研究するために、リアルタイム逆転写ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）により定量的にＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６及びｉＮＯＳのｍＲＮＡ発現レベルを検出したが、それらの炎症因子は、ＬＰＳ或いはＰＨＡがラットの脾臓リンパ球を刺激することにより、誘導産生された。シクロスポリンＡとＷＤＹ４が完全的にＬＰＳ或いはＰＨＡにより誘導されたＩＬ−２ｍＲＮＡの発現を抑制した（図１）が、ＷＤＹ４も完全的にＩＬ−６とｉＮＯＳのｍＲＮＡの発現を抑制した（図２）。しかし、シクロスポリンＡはこれらの二種類の因子に対する作用がわりに弱い。ＷＤＹ１とＷＤＹ６の免疫抑制活性はとても良い。また、動物試験結果から、この二種類の化合物は、毒性がとても低いことが分かる。本発明及びその誘導体が能動免疫欠乏病と炎症病気の治療に有効であることは証明された。
【００７８】
（実験方法）
常法に従って、Ｌｅｗｉｚラットから脾臓細胞を取得して、これを６穴の培養板に接種して、細胞密度が１×１０６／ｍｌである。培養細胞内に適宜な濃度の化合物を入れて、３７℃で１５分間予培養しＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ産品）１μｇ／ｍｌ或いはＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ産品）１μｇ／ｍｌを入れて、３７℃で５％のＣＯ２条件下で２時間培養して、Ｑｉａｇｅｎ社制のＲＮＡ製造キットで脾臓細胞の総ＲＮＡを抽出した。
【００７９】
メーカー（Perkin Elmer applied Biosystems）の提供したＡＢＩ ＴａｑＭａｎ検出キット解説に基づき、ＲＴ−ＰＣＲ実験を行った。デオキシヌクレオチド混合物２ｍＭ、ＤＴＴ１００ｍＭ、ＲＮａｓｅ抑制剤４０単位、ランダムプライマー５０ｎｇ、Thermoscriptリバーストランスクリプターゼ１５単位を含んでいる反応系の中に、脾臓細胞ｍＲＮＡ（１μｇ）を相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写し、反応条件は２５℃、１０分間、４８℃、４５分間、は９０℃、５分間で、その後に、４℃に冷却した。ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ技術によりＡＢＩ７７００シーケンス検出器にＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ｉＮＯＳ及びサイクロフィリン（cyclophilin）の発現レベルを測定した。その反応系は、１× TaqMan Universal Master Mix、９００ｎＭの順方向（上流側）と逆方向（下流側）プライマー、２００ｎＭ、ＴａｑＭａｎプローブ、５０ｎＭのプライマー及びプローブを含み、熱サイクル条件は、９５℃、１５分間、６０℃、１分間で、全部で４０サイクルを行った。相関正規曲線で目標ｍＲＮＡとサイクロフィリンのｍＲＮＡの発現収量を算出した。結果を図１と図２に示す。
【００８０】
（実施例９）
ＰＧＥ２酵素活性法で本発明のＣＯＸ−２に対する抑制作用について説明する。
【００８１】
Ｃａｙｍａｎ社制のＰＧＥ２ＥＩＡキットを用いて、本発明のＷＤＹｓがＣＯＸ−２の触媒作用によりアラキドン酸からＰＧＥ２を産生するということに対する影響を検討した。仔牛血清（fetal calf serum）１０％と適量のペニシリン、ストレプトマイシンを含んでいるＲＰＭＩ １６４０培養液に適宜密度のＨＴ−２９人結腸癌細胞を接種して、翌日に細胞が壁に貼ってから、新たな培養液に変えて本発明（ＷＤＹ４とＷＤＹ７、１０μｇ／ｍｌ）を入れて、インドメタシン（１００μｇ／ｍｌ）を陽性対照として、薬物を含んでいないものを陰性対照とした。薬物が２４時間作用した後、古い培養液を捨てて、ＰＢＳで二回洗濯して、アラキドン酸（ＡＡ）４０μＭを含んでいる無血清培地１ｍｌを入れて、３７℃で３０分間作用し、上清液を収集して、キットの取り扱い解説に従って誘導化を行って夜を越して、且つＰＧＥ２の産生量を検出・計算し、結果を図３に示す。
【００８２】
（実施例１０）
ＷＤＹ１静脈注射のＬＤ５０の結果について説明する。
【００８３】
水でＷＤＹ１を調製して、五つの用量群（１５０、１３５、１２２、１０９、９８ｍｇ／ｋｇ体重）を設けて、群ごとに１０匹の昆明種マウス（動物合格証明番号：川実動管第９９−３０号）、雌と雄が別々半分であり、尾静脈注射（ｉｖ）した。下記表１に示す結果は、ＷＤＹ１の短期毒性のＬＤ５０が１２６ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００８４】
【表１】
【００８５】
（実施例１１）
ＷＤＹのＤＮＣによるマウス遅延型過敏反応に対する影響について説明する。
【００８６】
原理：ジニトロフルオロベンゼン（dinitrofluorobenzene、ＤＮＣＢ）をハプテンとして、その溶液を腹壁皮膚に塗布した後、皮膚蛋白質と結合し全抗原になって、これによって、ＴＬＣを刺激し感作リンパ球に増殖した。４〜７日後に、これを再び皮膚に塗布し、局部に遅延型アレルギー（水腫）を起こさせ、一般的に、抗原が侵襲した後の２４〜４８時間にピークに達するために、この時に局部腫脹を測定した。
【００８７】
評価：薬物が細胞免疫に対する作用を検出することを除いて、また常に細胞免疫機能増加と減少のモデルを製造することに用いられている。遅延型過敏反応は、感作生体が抗原により攻撃された２４〜４８時間後に発生した組織損傷であり、ピーク時期で測定された組織腫脹度は遅延型過敏反応の強度とすることができる。
【００８８】
（１．試験材料）
試薬：ＷＤＹ１、ＷＤＹ６、ＷＤＹ７のいずれも白色粉末であり、使用直前に生理食塩水で所望の濃度に調製される。
【００８９】
動物：昆明種マウス１１０匹、動物合格証明番号：川実動管第９９−３０号。
【００９０】
試薬：２，４−ジニトロクロルベンゼン（ＤＮＣＢ）、ロット番号：２００００１０１、上海試剤一廠から生産される。使用直前にアセトンで５０％、２％、０．５％、０．１５％の濃度に調製される。
【００９１】
（２．試験方法）
中国衛生部が発布した新薬（西洋薬剤）の臨床前研究指導原則中の抗炎免疫薬物薬力学指導原則に従ってデザインする。用量配置：以下の表２の通りにグループ分けと薬剤投与を行う。
【００９２】
【表２】
【００９３】
感作：マウスについては一匹ずつ背部に小さい部分が脱毛され、微量注射器で５０％のＤＮＣＢアセトン溶液２μｌを裸出の皮膚に滴下して、動物を感作させる。
【００９４】
薬剤投与：感作当日で表１の通り投与開始、一日一回、十日続き（ただし、ＷＤＹ７は一日おき投与）
誘発：投与１０日目後に、一匹ずつ腹部に三箇所の脱毛が認められ、その大きさはｄ＝１ｃｍ程度であり、２％、０．５％、０．１５％のＤＮＣＢアセトン溶液をそれぞれ２０μｌ三箇所の裸出皮膚に滴下して、動物を誘発する。
【００９５】
評価指数：誘発の２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ後に、動物の三箇所の皮膚の反応を観察して、以下の表３の通りに点数を記録して、三箇所の皮膚の点数合計を評価指数として、対照群と比較する。
【００９６】
【表３】
【００９７】
（３．試験結果）
下記表４の通りである。
【００９８】
【表４】
【００９９】
（実施例１２）
ＷＤＹ１、ＷＤＹ６、ＷＤＹ７の抗炎試験（綿球肉芽腫法）
原理：綿球をラット体内に植え込み結合組織の過形成を引き起こし、このような肉芽過形成は、臨床で幾つかの炎症後期の病理変化と類似し、薬物の抗結合組織増殖作用に対する評価に用いられる。薬剤投与群と陰性対照群の肉芽腫の重量の差異を比較して、各薬剤投与群の抑制率は有意的な差異が認められ、それで、当該薬物が該炎症モデルに抗炎作用を有すると考えられる。陽性薬物はヒドロコルチゾンである。
【０１００】
（１．実験材料）
動物：Ｗｉｓｔｅｒラット１１０匹、雄性、体重２００〜２５０ｇ。試薬：ＷＤＹ１、ＷＤＹ６、ＷＤＹ７。陽性試料：ヒドロコルチゾン。
【０１０１】
（２．実験方法）
中国衛生部が発布した新薬（西洋薬剤）の臨床前研究指導原則中の抗炎免疫薬物薬力学指導原則に従ってデザインする。
【０１０２】
１１０匹の動物をペントバルビダールナトリウムｉｐ３０ｍｇ／ｋｇで麻酔し、消毒幹綿球２０ｍｇを右腹部の下部に植え込み、翌日表１の通りにグループ分けに投与して、最終投与２４時間後に、ラットを殺して、綿球を剥離して脂肪組織を取り除き、６０℃のオーブンで１時間焙焼して、綿球を取り出し秤量して、秤量し得た重量から元の綿球重量２０ｍｇを引き、腫脹度としてｍｇ／１００ｇで表示し、同時に薬剤投与群と対照群を比較した。
【０１０３】
（３．実験結果）
【表５】
【０１０４】
表５に示すように、ヒドロコルチゾン群が対照群と比較すると、その綿球肉芽腫の重量が対照群より有意的に小さいことが分かる。ＷＤＹ１、ＷＤＹ６、ＷＤＹ７のいずれも著しい抗綿球肉芽腫作用を示した。３薬剤の高、中用量及びＷＤＹ１の低用量は、それらの綿球肉芽腫が対照群より、全部有意的に減少して、且つ一定のプラスの量効関係（positive dose-effect relationship）を示す。
【０１０５】
（実施例１３）
短期毒性試験について説明する。
【０１０６】
マウスのＷＤＹ６静脈注射（ｉｖ）による短期毒性ＬＤ５０、
昆明種マウス（雄：５匹、雌：５匹、動物合格証明番号：川実動管第９９−３０号）を短期毒性ＬＤ５０試験に使用した。５群のＷＤＹ６の用量組（２１５、１８７、１６３、１４２、１２３ｍｇ／ｋｇ体重）を設け、生理食塩水でＷＤＹ６を調製し、尾静脈注射した。測定したＬＤ５０は１７２ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０１０７】
【表６】
【０１０８】
同様な方法によりＷＤＹ１とＷＤＹ７を尾静脈注射した場合のＬＤ５０はそれぞれ１２６と０．８ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０１０９】
（実施例１４）
ＷＤＹ６とＷＤＹ７静脈注射のラット佐剤誘導関節炎モデルにおける治療作用について説明する。
【０１１０】
（実験方法）
Ｐｅｒｐｅｒ ＲＪ ｅｔ ａｌ．の方法（非特許文献３）に従って、ラットの佐剤により誘導された関節炎モデルを作成し、且つＷＤＹ６とＷＤＹ７のラット佐剤誘導関節炎に対する治療作用を評価した。またラット後足の腫脹用足の厚さを測定した。
【０１１１】
６４匹の雄ＳＤラット（動物合格証明番号：川実動管質９９−３２号）を無作為的に８群れに分けて、ＷＤＹ６とＷＤＹ７の用量によってそれぞれ５群を設けて、尾静脈注射（ｉｖ）した。空白対照は生理食塩水である。陽性対照薬物はヒドロコルチゾン３０ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０１１２】
【表７】
【０１１３】
Ｆｒｅｕｎｄ佐剤処理後１８日に、関節炎モデルを成功的に作った。注射足（右後足）の腫脹は原発性病変であり、注射足の対側足（左後足）の腫脹は続発性病変である。続発性病変は免疫と関係があると考えられる。
【０１１４】
（実験結果）：
ＷＤＹ６の対側（左後）足に対する影響の結果は図４に示す：ＷＤＹ６は対側足の厚さを著しく減少させ、厚さ減少とＷＤＹ６の用量とは量効関係を示す。その厚さ減少の効果はヒドロコルチゾンによる効果と相当する。低用量ＷＤＹ６（５ｍｇ／ｋｇ体重）は対側足の厚さを著しく減少させる。ＷＤＹ６の短期毒性ＬＤ５０は１７２ｍｇ／ｋｇ、その安全係数“ＬＤ５０／有効用量”は３４（１７２／５）〜６８（１７２／２．５）である。したがってＷＤＹ６は有効且つ安全であるという効果が証明される。
【０１１５】
ＷＤＹ７は同じ結果が認められた（図５を参照）。その安全係数“ＬＤ５０／有効用量”は３２（０．８／０．０２５）である。
【０１１６】
（実施例１５）
ＷＤＹ６ とＷＤＹ７経口投与のラット佐剤誘導関節炎モデルにおける治療作用について説明する。
【０１１７】
（実験方法）
実施例１４と同じ、静脈注射を経口投与に変える。
【０１１８】
【表８】
【０１１９】
実験結果（図６と図７を参照）は、ＷＤＹ６とＷＤＹ７経口投与は顕著にラット佐剤誘導関節炎を治療できるということである。
【０１２０】
（実施例１６）
マウス異種心耳接枝実験でＷＤＹ６とＷＤＹ７の移植心臓の生存時間延長に対する作用について説明する。
【０１２１】
（実験方法）
Ｆｕｌｍｅｒ ＲＩ ｅｔ ａｌ．の方法（非特許文献４）Ａｍ Ｊ Ａｎａｔ． １９６３：２７３−２７８）に従って、６日齢のＣ５７ＢＬマウス（雄又は雌）の全心臓を雄ｂａｌｂ／ｃマウス（動物合格証明番号：川実動管質９９−３１号）（体重２０−２５ｇ）の耳介に接枝する。心電図（ＥＣＧ）で或いは直接的に解剖顕微鏡で接枝された心臓の拍動を記録する。心拍停止は拒絶発生を示す。
【０１２２】
用量：ＷＤＹ６：２０，１０と５ｍｇ／ｋｇ；日ごとに投与、静脈注射。
【０１２３】
ＷＤＹ７：０．２５，０．１２と０．０５ｍｇ／ｋｇ；一日おきに投与、静脈注射。
【０１２４】
シクロスポリンＡ（Cyclosporine Ａ）：２５ｍｇ／ｋｇ；日ごとに投与、経口投与。
【０１２５】
（結果）
次の表９の通りである。
【０１２６】
【表９】
【０１２７】
ＷＤＹ６、ＷＤＹ７とシクロスポリンＡによって、マウス異種心耳接枝実験で、心臓平均生存時間はそれぞれ１２．７、１３．８、１６．１日である。そして、対照の平均生存時間は９．７日だけである。その結果から、ＷＤＹ６とＷＤＹ７は全部著しい抗拒絶作用を有することが分かる。ＷＤＹ６とＷＤＹ７によって処理されたマウスの体重は全然減少しなくて、食欲も正常に維持した。しかし、シクロスポリンＡ処理群のマウスの体重と食欲は皆減少した。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】ＩＬ−２に対する本発明の水溶性トリプトリド誘導体の作用（ｍｅｄｉｕｍ：空白対照、ＰＨＡ：リポ多糖、ＣｓＡ：シクロスポリンＡ）の図である。
【図２】ＩＬ−１、ＩＬ−６、ｉＮＯＳに対する本発明の水溶性トリプトリド誘導体の作用（ｍｅｄｉｕｍ：空白対照、ＰＨＡ：リポ多糖、ＣｓＡ：シクロスポリンＡ）の図である。
【図３】ＨＴ−２９細胞のＰＧＥ２含有量（ｐｇ／ｍｌ）に対する本発明の水溶性トリプトリド誘導体の影響（対照＝２２．９３ｐｇ／ｍｌ、インドメタシン（ｉｎｄｏ）＝１．３ｐｇ／ｍｌ、ＷＤＹ４＝４．２２ｐｇ／ｍｌ、ＷＤＹ７＝４．９７ｐｇ／ｍｌ）の図である。
【図４】対側足（lateral feet）に対するＷＤＹ６の影響の結果を示す図である。
【図５】対側足（lateral feet）の厚さに対するＷＤＹ７の影響の結果を示す図である。
【図６】ＷＤＹ７経口投与場合の左足の厚さに対する影響の結果を示す図である。
【図７】ＷＤＹ６経口投与場合の左足の厚さに対する影響の結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造式が下記化１式で示されることを特徴とするトリプトリド誘導体。
【化１】
（式中、Ｒ１はＨ、又は下記化２式で示されるホスファート又は下記化３式のホスフィットであり、Ｘ１、Ｘ２はＮａ、Ｋ又はＮＨ４である。）
【化２】
【化３】
【請求項２】
請求項１に記載のトリプド誘導体を製造する方法であって、リードコンパウンドトリプトリドを塩化ホスホリル、三塩化リン又はその他のホスファジルハロゲン、リン酸エステル、亜ホスファジルハロゲン、亜リン酸エステルなどの化合物と反応させるステップを含むことを特徴とするトリプド誘導体の製造方法。
【請求項３】
構造式が下記化４式で示されることを特徴とするトリプトリド誘導体。
【化４】
（式中、Ｒ１はＨ、炭素数１〜４のアルキル基、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎＣＯ２（ただし、ｎは１〜４の整数）、下記化５式で示されるホスファート、又は下記化６式で示されるホスフィットであり、Ｘ１とＸ２はＮａ、Ｋ又はＮＨ４であり、Ｒ２はＨ、−ＳＣＮ、−Ｃｌ、又は−Ｂｒである。）
【化５】
【化６】
【請求項４】
請求項３に記載のトリプトリド誘導体を製造する方法において、第２種類のリードコンパウンドである１２−β−チオシアノ−１３−α−ヒドロキシトリプトリドをエステル化とホスホリル化させるステップを含むことを特徴とするトリプトリド誘導体の製造方法。
【請求項５】
構造式が下記化７式又は下記化８式で示されることを特徴とするトリプトリド誘導体。
【化７】
【化８】
（式中、Ｒ２はＨ、−ＳＣＮ、−Ｃｌ又は−Ｂｒである。）
【請求項６】
請求項５に記載のトリプトリド誘導体を製造する方法であって、第２種類のリードコンパウンドである１２−β−チオシアノ−１３−α−ヒドロキシトリプトリドを塩化ホスホリル、又はその他のホスファジルハロゲン、リン酸エステル、亜リン酸エステルなどの化合物と反応させるステップ、或いは第１種類のリードコンパウンドトリプトリドを塩化ホスホリル、又はその他のホスファジルハロゲン、亜ホスファジルハロゲンなどの化合物と反応させるステップを含むことを特徴とするトリプトリド誘導体の製造方法。
【請求項７】
請求項１、３、及び５の内のいずれか一つに記載のトリプトリド誘導体を含有することを特徴とする免疫抑制剤又は抗炎剤。
【請求項８】
請求項７に記載の免疫抑制剤又は抗炎剤において、リンパ球Ｔ、Ｂの成長、細胞因子ＩＬ―１、ＩＬ―２、ＩＬ−６、ｉＮＯＳの生成及びＣｏｘ−２の生成に関する疾病を治療することを特徴とする免疫抑制剤又は抗炎剤。
【請求項９】
請求項８に記載の免疫抑制剤又は抗炎剤において、疾病が能動免疫欠乏病及び炎症であることを特徴とする免疫抑制剤又は抗炎剤。
【請求項１０】
請求項９に記載の免疫抑制剤又は抗炎剤において、前記疾病が慢性関節リウマチ、喘息、系統性紅斑狼瘡、鱗屑癬、多重硬皮症、動脈粥状硬化、Ｉ−型糖尿病、腎炎であることを特徴とする免疫抑制剤又は抗炎剤。
【請求項１１】
請求項７に記載の免疫抑制剤又は抗炎剤において、臓器移植時の臓器拒絶を防止し、移植された臓器の生存時間を延長するために用いられることを特徴とする免疫抑制剤又は抗炎剤。
【請求項１】
構造式が下記化１式で示されることを特徴とするトリプトリド誘導体。
【化１】
（式中、Ｒ１はＨ、又は下記化２式で示されるホスファート又は下記化３式のホスフィットであり、Ｘ１、Ｘ２はＮａ、Ｋ又はＮＨ４である。）
【化２】
【化３】
【請求項２】
請求項１に記載のトリプド誘導体を製造する方法であって、リードコンパウンドトリプトリドを塩化ホスホリル、三塩化リン又はその他のホスファジルハロゲン、リン酸エステル、亜ホスファジルハロゲン、亜リン酸エステルなどの化合物と反応させるステップを含むことを特徴とするトリプド誘導体の製造方法。
【請求項３】
構造式が下記化４式で示されることを特徴とするトリプトリド誘導体。
【化４】
（式中、Ｒ１はＨ、炭素数１〜４のアルキル基、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎＣＯ２（ただし、ｎは１〜４の整数）、下記化５式で示されるホスファート、又は下記化６式で示されるホスフィットであり、Ｘ１とＸ２はＮａ、Ｋ又はＮＨ４であり、Ｒ２はＨ、−ＳＣＮ、−Ｃｌ、又は−Ｂｒである。）
【化５】
【化６】
【請求項４】
請求項３に記載のトリプトリド誘導体を製造する方法において、第２種類のリードコンパウンドである１２−β−チオシアノ−１３−α−ヒドロキシトリプトリドをエステル化とホスホリル化させるステップを含むことを特徴とするトリプトリド誘導体の製造方法。
【請求項５】
構造式が下記化７式又は下記化８式で示されることを特徴とするトリプトリド誘導体。
【化７】
【化８】
（式中、Ｒ２はＨ、−ＳＣＮ、−Ｃｌ又は−Ｂｒである。）
【請求項６】
請求項５に記載のトリプトリド誘導体を製造する方法であって、第２種類のリードコンパウンドである１２−β−チオシアノ−１３−α−ヒドロキシトリプトリドを塩化ホスホリル、又はその他のホスファジルハロゲン、リン酸エステル、亜リン酸エステルなどの化合物と反応させるステップ、或いは第１種類のリードコンパウンドトリプトリドを塩化ホスホリル、又はその他のホスファジルハロゲン、亜ホスファジルハロゲンなどの化合物と反応させるステップを含むことを特徴とするトリプトリド誘導体の製造方法。
【請求項７】
請求項１、３、及び５の内のいずれか一つに記載のトリプトリド誘導体を含有することを特徴とする免疫抑制剤又は抗炎剤。
【請求項８】
請求項７に記載の免疫抑制剤又は抗炎剤において、リンパ球Ｔ、Ｂの成長、細胞因子ＩＬ―１、ＩＬ―２、ＩＬ−６、ｉＮＯＳの生成及びＣｏｘ−２の生成に関する疾病を治療することを特徴とする免疫抑制剤又は抗炎剤。
【請求項９】
請求項８に記載の免疫抑制剤又は抗炎剤において、疾病が能動免疫欠乏病及び炎症であることを特徴とする免疫抑制剤又は抗炎剤。
【請求項１０】
請求項９に記載の免疫抑制剤又は抗炎剤において、前記疾病が慢性関節リウマチ、喘息、系統性紅斑狼瘡、鱗屑癬、多重硬皮症、動脈粥状硬化、Ｉ−型糖尿病、腎炎であることを特徴とする免疫抑制剤又は抗炎剤。
【請求項１１】
請求項７に記載の免疫抑制剤又は抗炎剤において、臓器移植時の臓器拒絶を防止し、移植された臓器の生存時間を延長するために用いられることを特徴とする免疫抑制剤又は抗炎剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００６−５０３８３１（Ｐ２００６−５０３８３１Ａ）
【公表日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５３６７７７（Ｐ２００４−５３６７７７）
【出願日】平成１５年９月４日（２００３．９．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００３／０００７４８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２６２９８
【国際公開日】平成１６年４月１日（２００４．４．１）
【出願人】（５０５０９８９８２）成都▲達▼▲遠▼▲薬▼物有限公司 (1)
【出願人】（５０５０９９７２７）ダブリュ アンド ケイ インターナショナル，インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年９月４日（２００３．９．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００３／０００７４８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２６２９８
【国際公開日】平成１６年４月１日（２００４．４．１）
【出願人】（５０５０９８９８２）成都▲達▼▲遠▼▲薬▼物有限公司 (1)
【出願人】（５０５０９９７２７）ダブリュ アンド ケイ インターナショナル，インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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