３’，６−置換インディルビンおよびその生物学的適用
本発明は式(I)で表されるインディルビン誘導体およびその生物学的適用に関する。式中、Ｒは、−（Ａ）ｎ−Ｒ１または−ＣＯ−Ｎ（Ｒ２，Ｒ３）を表し、Ａは、１個または数個のＡ１基によって置換されていてもよいＣ１−Ｃ５アルキレン基であり、Ａ１は、ハロゲンＢｒ、ＯＨ、ＯＲ４またはＮＨ２であり、Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ５アルキルであり；・Ｒ１は、ハロゲン、ＯＨ、Ｎ（Ｒ２、Ｒ３）であり；同一または異なっているＲ２およびＲ３は、上記で定義されるものなどのＡ１によって置換されていてもよいＣ１〜Ｃ５アルキルであり、またはＲ２およびＲ３は、ＯもしくはＮなどの別のヘテロ原子を含んでいてもよい、５もしくは６個の要素を有する環の一部であり；・ｎ＝１〜５］
【化１】
【化１】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３（ＧＳＫ−３）に対する選択性が増強された３’，６−置換インディルビンに関する。また、その生物学的適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトキノームを構成する５１８種のプロテインキナーゼの中でも、ＧＳＫ−３は、特に興味深く、十分に研究されたセリン／トレオニンキナーゼのファミリーとして際立っている。広範囲の類似性（８４％の全体の同一性、９８％の触媒ドメイン内）を共有する２種のＧＳＫ−３形態（ＧＳＫ−３αおよびＧＳＫ−３β）があるだけであり、主な相違は、ＧＳＫ−３αのＮ末端ドメインにおける余分なＧｌｙリッチストレッチに起因する。ＧＳＫ−３は、単細胞寄生虫から酵母、哺乳類にまで存在する高度に保存されたプロテインキナーゼである。これらのキナーゼは、ＷｎｔおよびＨｅｄｇｅｈｏｇシグナル伝達、胚発生（パターン指定および軸配向）、転写、インスリン作用、細胞分裂周期、細胞死、細胞生存、分化、複数の神経機能、日内周期調節、幹細胞分化などといった多数の重大な生理学的事象に関与している。さらに、ＧＳＫ−３は、アルツハイマー病、統合失調症、双極性障害などの神経系障害、糖尿病、心臓肥大、腎疾患、ショックおよび炎症、癌などを含む多様なヒト疾患に関与している。したがって、基礎研究における薬理学的ツールとして、特定の疾患の治療ための、およびフィーダー細胞の不在下での多能性幹細胞の維持のための可能性ある薬物として使用するための、強力な、選択的ＧＳＫ−３阻害剤の探索を支持する強力な論理的根拠がある。多数の阻害性ＧＳＫ−３骨格(scaffold)が記載されている。興味深いことに、これらの阻害剤の多くはまた、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）、十分に研究された重要な調節酵素の別のファミリーとも相互作用する。
【０００３】
ＧＳＫ−３阻害剤の中でも、ビス−インドールインディルビンの誘導体（まとめて、インディルビンと呼ばれる）が、独創的な、見込みのあるツールおよび薬剤の１クラスと思われる。その中程度の選択性は、研究試薬として使用される場合には不都合であり得るが、いくつかの疾患関連標的（特に、ＣＤＫおよびＧＳＫ−３）に対するその組み合わされた効果は、治療的適用の可能性にとって利点となり得る。多数のインディルビンの中でも、６−ブロモ−インディルビン−３’−オキシム（６ＢＩＯ）（１〜３）は、種々の細胞設定におけるＧＳＫ−３の生理学的役割を調べるために、また胚幹細胞の運命を変えるために（１）広く使用されてきた（非特許文献１〜３）。
【０００４】
極めて強力な、比較的選択性のキナーゼ阻害性インディルビンが開発されているが、それらは、通常、低い水溶性を示す。これらの見込みのある化合物の溶解度の問題に対処するために、本発明者らは、親水性の増大した６ＢＩＯの新規類似体をデザインした。分子の親水特性の改善は、いくつかの方法によって取り組まれ得る。芳香族炭素原子と、ｓｐ３のハイブリダイゼーション状態を変更することによるインディルビン骨格の芳香族特性の低減が、溶解度を増強するための一方法として提案されている。代替法は、分子への親水基の導入である。親水性の最適化が、標的キナーゼに対する分子の効力または選択性のいずれかに悪影響を与えないことが絶対必要であるということは明らかである。したがって、キナーゼに対する有効性の激減を伴わずには変更できない分子の２つの重要な領域があるので、置換位置の選択は極めて重要である。第１のものは、キナーゼ標的の活性部位と水素結合性相互作用パターンを形成する、ビス−インドールコアのラクタム窒素およびカルボニルおよび複素環式窒素からなるファルマコフォアである。第２のものは、ＧＳＫ−３βに対する６ＢＩＯの選択性決定基である６位での臭素置換である。本発明者らによって、６ＢＩＯとの複合体中のＧＳＫ−３βの結晶構造の詳細な分析が実施された。このように得られた情報に基づいて、本発明者らは、インディルビン骨格に化学修飾を実施するには３’位が重大であると考えた。したがって、本発明者らは、３’位に種々の置換を有する一連の６−ブロモ−インディルビンをデザインし、合成した。予想外なことに、これらの分子は、ＧＳＫ−３に対する高い効力、増強された選択性およびかなり増大した水溶性を示した。これらの分子を、いくつかの細胞系においてそのＧＳＫ−３阻害作用について評価した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Meijer, L; Skaltsounis, AL; Magiatis, P; Polychonopoulos, P; Knockaert, M; Leost, M; Ryan, XP; Vonica, CD; Brivanlou, A; Dajani, R; Tarricone, A; Musacchio, A; Roe, SM; Pearl, L, Greengard, P. GSK-3 selective inhibitors derived from Tyrian purple indirubins. Chem. & Biol. 2003, 10, 1255-1266.
【非特許文献２】Jope, R.S.; Johnson, G.V.W. The glamour and gloom of glycogen synthase kinase-3. Trends Biochem. Sci. 2004, 29, 95-102.
【非特許文献３】Ribas, J.; Bettayeb, K.; Ferandin, Y.; Garrofe-Ochoa, X.; Knockaert, M.; Totzke, F.; Schachtele, C.; Mester, J.; Polychronopoulos, P.; Magiatis, P.; Skaltsounis, A.L.; Boix, J.; Meijer, L.,. 7-bromoindirubin-3’-oxime induces caspase-independent cell death. Oncogene 2006, 25, 6304-6318.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明の目的は、ＧＳＫ−３に対して増強された選択性を有する新規３’，６−置換インディルビンを提供することである。
【０００７】
本発明の別の目的は、前記インディルビンを得る方法を提供することである。
【０００８】
さらに別の目的によれば、本発明は、有効成分として前記インディルビンを含有する医薬組成物および生物学的試薬ならびにこのような有効成分の使用を含むＧＳＫ−３調節解除と関連している病態を治療する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によるインディルビン誘導体は、次式(I)
【化１】
【００１０】
［式中、Ｒは、−（Ａ）ｎ−Ｒ１または−ＣＯ−Ｎ（Ｒ２，Ｒ３）を表し、
・Ａは、１個または数個のＡ１基によって置換されていてもよいＣ１〜Ｃ５アルキレン基であり、Ａ１は、ハロゲンＢｒ、ＯＨ、ＯＲ４またはＮＨ２であり、Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ５アルキルであり；
・Ｒ１は、ハロゲン、ＯＨ、Ｎ（Ｒ２，Ｒ３）であり；Ｒ２およびＲ３は、同一または異なり、上記で定義されるものなどのＡ１によって置換されていてもよいＣ１〜Ｃ５アルキルであるか、またはＲ２およびＲ３は、ＯもしくはＮなどの別のヘテロ原子を含んでいてもよい、５もしくは６個の環員を有する環の一部であり（すなわち、Ｒ２およびＲ３は、互いに一緒になって、ＯもしくはＮなどの別のヘテロ原子を含んでいてもよい、５もしくは６個の環員を有する環を形成し）、
・ｎ＝１〜５］
で表される。
【００１１】
本発明はまた、上記で定義される誘導体の薬学的に許容される塩に関する。これらの塩は、とりわけ、上記で開示されるインディルビンの塩化物、酢酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩を含む。
【００１２】
第１のファミリーでは、
・Ｒは、−（Ａ）ｎ−Ｒ１を表し、Ｒ１は、ハロゲン、ＯＨ、Ｎ（Ｒ２，Ｒ３）であり、Ｒ２およびＲ３は、同一または異なり、上記で定義されるものなどのＡ１によって置換されていてもよいＣ１〜Ｃ５アルキルである。
【００１３】
前記ファミリーの好ましい基では、Ｒ１は、ハロゲンまたはＯＨである。前記基の有利な誘導体では、Ａは、−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＨ（Ｒ１）−（ＣＨ２）ｍ２基を表し、ここで、ｍ１＝１〜３およびｍ２＝０、１〜３である。
【００１４】
前記ファミリーの別の好ましい基では、Ｒ１は、Ｎ（Ｒ２，Ｒ３）である。
【００１５】
第１の実施形態によれば、同一または異なっているＲ２およびＲ３は、上記で定義されるものなどのＡ１によって置換されていてもよいＣ１〜Ｃ５アルキルである。
【００１６】
第２の実施形態によれば、Ｒ２およびＲ３は、ピロール、モルホリニルまたはピペラジニル基の一部であり、前記基は、１個または数個のＡ１によって置換されていてもよく、ピペラジニル基は、Ｃ１〜Ｃ５アルキルによって位置の窒素で置換されていてもよく、Ｃ１〜Ｃ５アルキルは同様に、上記で定義されるものなどのＡ１によって置換されていてもよい。
【００１７】
前記基の有利な誘導体では、Ａは、Ｃ１〜Ｃ５アルキレン基である。
【００１８】
第２のファミリーでは、
・Ｒは、−ＣＯ−Ｎ（Ｒ２，Ｒ３）を表し、同一または異なっているＲ２およびＲ３は、Ｃ１〜Ｃ５アルキル基である。
【００１９】
本発明によれば、Ｒ１が−Ｎ（Ｒ２，Ｒ３）である、上記で定義されるインディルビン誘導体は、式(II)
【化２】
【００２０】
で表されるオキシム誘導体を、式(III)で表される適当なアミン
（Ａ２）ｎ−Ｎ（Ｒ２，Ｒ３）
(III)
［式中、Ａ２は、Ｃ１〜Ｃ５アルキルであり、Ｒ２およびＲ３は、上記で定義されるとおりである］
と反応させることによって有利に合成される。
【００２１】
適当なアミンは、ピロリジン、モルホリン、ピペラジン、Ｎ−メチルピペラジン、ヒドロキシエチルピペラジン、メトキシエチルピペラジン、ジメチルアミンおよびジエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ビス−２−ヒドロキシエチルアミン、Ｎ−２，３−ジヒドロキシプロピル−Ｎ−メチルアミンおよびＮ−２−ヒドロキシエトキシエチルピペラジンを含む。
【００２２】
式(II)のオキシム誘導体は、室温で、６ＢＩＯを、ＤＭＦ中、１，２−ジブロモエタンおよびトリエチルアミンＥｔ３Ｎと反応させることによって調製することが有利である。
【００２３】
さらに、ＲがＣＯ−Ｎ（Ｒ２，Ｒ３）基を表すカルバメート誘導体は、６ＢＩＯを、Ｎ，Ｎ−ジアルキルカルバモイルクロリドと反応させることによって調製する。Ａ１がＯＨである式Ｉのアルコール誘導体は、６ＢＩＯを、適当な１，２−ジブロモアルカンまたはブロモアルコールと反応させることによって調製する。インディルビンおよび６ＢＩＯは、これまでに報告されたように合成した（文献２）。
【００２４】
有利なことに、前記誘導体は、親６ＢＩＯ化合物よりも細胞傷害性が少なく、細胞モデルにおいて強力なＧＳＫ−３阻害活性を示した。したがって、本発明は、アルツハイマー病、糖尿病、心臓肥大などのＧＳＫ３調節解除と関連している病態を治療するための、胚幹細胞多能性維持または哺乳類における概日期間の変更の分野における、非常に注目される手段を提供する。
【００２５】
これらの結果は、薬理学的に好都合なインディルビンのデザインに向けた新規方向を開き、このような病態に対する開発を伴う。
【００２６】
したがって、本発明は、薬物として使用するための式(I)の新規誘導体に関する。
【００２７】
次いで、本発明はまた、治療上有効な量の、上記で定義されるものなどの式(I)の少なくとも１種の誘導体またはその薬学的に許容される塩を、薬学的に許容されるビヒクルと組合せて含む医薬組成物に関する。
【００２８】
薬物の製造の際に、治療上有効な量で使用される有効成分を、選択される投与様式のための薬学的に許容されるビヒクルと混合する。これらのビヒクルは固体または液体またはゲルであり得る。
【００２９】
薬物は、固体または液体またはゲルであり得る。
【００３０】
薬物は、好ましくは、静脈内経路によるが、経口または注射用経路筋肉内および皮下経路または鼻腔経路による投与に適した形態であり得る。
【００３１】
したがって、経口経路による投与のために、ゼラチンカプセル剤、錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤などの形態で医薬を調製できる。このような医薬は、単位あたり１０マイクログラム〜１ｇの有効成分を含み得る。
【００３２】
注射（ボーラスまたは灌流；静脈内の、皮下、腹腔内、くも膜下腔内、真皮内）による投与のためには、医薬は、滅菌または滅菌可能な溶液の形態で提供される。
【００３３】
それらは、エマルジョンまたは懸濁液の形態であり得る。
【００３４】
投与量単位あたりの用量は、例えば、１マイクログラム〜１ｇの有効成分で変動し得る。
【００３５】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の実施例に、図１〜３を参照して示される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】類似体１１（Ａ）および類似体１３（Ｂ）と、ＧＳＫ−３βの結合ポケットとの結合様式を示す図である。両類似体のピペラジン置換は、インディルビン骨格および受容体基幹(backbone)間に形成される水素結合（黄色破線）に加えて、ａｓｐ２００および結合ポケットのリン酸サブサイトに位置する残基と相互作用する。
【図２】インディルビン誘導体による、ＧＳＫ−３リン酸化部位でのβ−カテニンリン酸化の阻害を示す。Ａ．ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞を、一定の２μＭレベルのプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２の存在下で各インディルビン１０μＭに対して６時間曝露した。ＧＳＫ−３−リン酸化β−カテニンのレベルを、ＧＳＫ−３リン酸化β−カテニンと特異的に交差反応する抗体を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のウエスタンブロッティングによって推定した。シグナルがないことまたはシグナルの減少は、インディルビンが神経芽腫細胞内でＧＳＫ−３を阻害できていることを示す。Ｃ、コントロール（ＤＭＳＯ）；６Ｂ、６ＢＩＯ；Ｍ６Ｂ、メチル−６ＢＩＯ（６ＢＩＯのコントロール不活性類似体）；Ｋ、ケンパウロン、構造的に関連のないＧＳＫ−３阻害剤。Ｂ．インディルビンの選択のための用量反応曲線を、ＧＳＫ−３リン酸化β−カテニンに対する同一抗体を使用するＥＬＩＳＡアッセイにおいて実行した。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、ＭＧ１３２の存在下で、さまざまな濃度の各インディルビンに対して６時間曝露し、抽出物をＥＬＩＳＡアッセイにおいて評価した。活性は、未処理コントロール細胞におけるリン酸化β−カテニンのパーセンテージとして表した。
【図３】インディルビン誘導体による哺乳類線維芽細胞における概日期間の変化を示す。ＰＰｅｒ２：：Ｆｌｕｃリポーター構築物を用いて安定にトランスフェクトされたＲａｔ−１線維芽細胞は、時計制御Ｐｅｒ２プロモーター（ＰＰｅｒ２）活性の尺度として発光の頑強な日内周期を示す。細胞を１００％コンフルエンスにまで培養し、０．１μＭデキサメタゾンを用いて２時間処理し、オシレーターを同期化した。次いで、培地を、０．１ｍＭルシフェリンを補給したアッセイ培地と交換し、発光リズムを４日以上モニタリングした。培養ディッシュに、１０μＭで化合物を加え、引き続き残した。溶媒コントロールとしてＤＭＳＯを使用した。回帰分析を使用して、発光リズムの期間および相を調べた。Ａ．コントロール細胞（○）またはインディルビン１５で処理した細胞（●）において記録された通常の発光リズムの経時変化。白色矢印は、コントロール細胞における発光のピークを示し、黒色矢印は、インディルビン１５処理細胞における発光のピークを示す。Ｂ．種々の化合物に対して曝露された細胞において算出された周期長。Ｃ、コントロール；Ｋ、ケンパウロン。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
【実施例】
【００３８】
化学
一般的な化学試験手順
すべての化学薬品は、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から購入した。ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ＤＲＸ４００およびＢｒｕｋｅｒ ＡＣ２００分光計［１Ｈ（４００および２００ＭＨｚ）および１３Ｃ（５０ＭＨｚ）］で記録し；化学シフトは、ＴＭＳからのｐｐｍ低磁場で表されている。１Ｈ−１Ｈおよび１Ｈ−１３Ｃ ＮＭＲ実験は、標準Ｂｒｕｋｅｒマイクロプログラムを使用して実施した。融点は、Ｓａｎｙｏ Ｇａｌｌｅｎｃａｍｐ装置を用いて調べた。ＭＳスペクトルは、ＭＳＱ Ｔｈｅｒｍｏｆｉｎｎｉｇａｎ分光計で測定した。すべてのＵＶ／ｖｉｓスペクトルは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ−１６０Ａ分光光度計で記録した。
【００３９】
溶解度測定。媒液（水、再蒸留された）に過剰量の固体を加え、続いて、５分間超音波処理し、周囲温度（２５±０．１℃）で撹拌することによって１晩平衡化することにより、平衡溶解度を調べた。サンプルを遠心分離し、アリコートを回収した。各化合物の標準溶液を調製して、前記飽和溶液を定量し、各化合物の参照曲線をプロットした。５１５および５１８ｎｍの間で変わる波長でＵＶ／ｖｉｓ分光光度計を用いて、各飽和および標準溶液の吸光度を測定した。
【００４０】
結果を表１に示す。これは、インディルビン塩の水溶性および対応する塩基のｐＨ７．４での算出された物理化学的特性ｐＫａおよびｌｏｇＤを示す。
【表１】
【００４１】
エーテル１〜３の調製のための一般手順
Ａｒ下、ＤＭＦ（９０ｍｌ）中の６−ブロモインディルビン−３’−オキシム（１．０ｇ、２．８３ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（０．５ｍｌ）および適当な臭化物（２当量）を加え、混合物を室温で１７時間撹拌した。次いで、水（３００ｍｌ）を加え、形成された沈殿を濾過によって回収し、水で洗浄した。
【００４２】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（２−ブロモエチル）−オキシム］（１）のデータ。
【００４３】
収率：９５％。融点２５２℃。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ ｄ−６，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１１．６７（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１’），１０．９３（１ｈ，ｓ，Ｈ−１），８．４９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，Ｈ−４），８．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４５（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−６’，Ｈ−７’），７．１６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．３／２．０Ｈｚ，Ｈ−５），７．０７（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，Ｈ−７），４．９３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，Ｈ−１’’），３．９７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，Ｈ−２’’）。ＡＰＣＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ４６２，４６４，４６６（Ｍ＋Ｈ）＋。元素分析値（Ｃ１８Ｈ１３Ｎ３Ｏ２Ｂｒ２）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００４４】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−オキシム］（２）のデータ。収率：９６％。融点＞３００℃。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ、ＤＭＳＯ ｄ−６，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１１．７０（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−１’），１０．９０（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−１），８．５４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ｈ−４），８．１８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４４（２Ｈ，ｍ，Ｈ−７’，Ｈ−６’），７．１６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．４／１．９Ｈｚ，Ｈ−５），７．０５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，Ｈ−７），５．０２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，−ＯＨ），４．６２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，Ｈ−１’’），３．８９（２Ｈ，ｍ，Ｈ−２’’）。ＣＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ４００，４０２（Ｍ＋Ｈ）＋。元素分析値（Ｃ１８Ｈ１４Ｎ３Ｏ３Ｂｒ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００４５】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−オキシム］（３）のデータ。収率：９５％。融点＞３００℃。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ ｄ−６，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１１．７０（１Η，ｓ，Ｈ−１’），１０．９０（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１），８．５６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−４），８．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４４（２Ｈ，ｍ，Ｈ−６’，Ｈ−７’），７．１５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５，１．９Ｈｚ，Ｈ−５），７．０６（１Ｈ，ｍ，Ｈ−５’），７．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，Ｈ−７），５．１４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，−ＣＨＯＨ），４．８４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，−ＣＨ２ＯＨ），４．６５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．９，３．７Ｈｚ，Ｈ−１’’ａ），４．５０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．９，６．６Ｈｚ，Ｈ−１’’ｂ），３．９９（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２’’），３．５０（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３’’）。ＡＰＣＩ−ＭＳ（＋）ｍ／ｚ ４３０，４３２（Ｍ＋Ｈ）＋。元素分析値（Ｃ１９Ｈ１６Ｎ３Ｏ４Ｂｒ２）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００４６】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジエチルカルバモイル）−オキシム］（４）のデータ。
【００４７】
Ａｒ下、ＤＭＦ（１０ｍｌ）中の６−ブロモインディルビン−３’−オキシム（３６ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）溶液に、トリエチルアミン（０．５ｍｌ）および０．３ｍｌ（３．６６ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジエチルカルバモイルクロリドを加え、混合物を室温で１２時間撹拌した。次いで、水（４０ｍｌ）を加え、形成された沈殿を濾過によって回収し、水で洗浄すると、化合物（４）が定量的に得られた。収率：９０％。融点２３７℃。１Η−ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ピリシン ｄ−５，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１２．３６（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１’），１２．１５（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１），９．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ｈ−４），８．１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｈ−４’），７．６１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．６／１．９Ｈｚ，Ｈ−５），７．４３（１Ｈ，ｍ，Ｈ−６’），７．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，Ｈ−７’），７．１４ − ７．０６（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，Ｈ−７），３．４４（４Ｈ，ｂｒｓ，−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），１．１８（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２）。ＡＰＣＩ−ＭＳ（＋）ｍ／ｚ ４５５，４５７（Ｍ＋Ｈ）＋。元素分析値（Ｃ２１Ｈ１９Ｎ４Ｏ３Ｂｒ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【化３】
【００４８】
試薬など：(i)ジブロモエタン、トリエチルアミン、無水ＤＭＦ、２５℃、(ii)２−ブロモエタノール、トリエチルアミン、無水ＤＭＦ、２５℃、(iii)３−ブロモ−１，２−プロパンジオール、トリエチルアミン、無水ＤＭＦ、２５℃、(iv) Ｎ，Ｎ−ジエチルカルバモイルクロリド、トリエチルアミン、無水ＤＭＦ、２５℃、(v)無水ＤＭＦ、２５℃、アミンａ〜ｋ。
【００４９】
アミン５〜１５の調製のための一般手順。
【００５０】
１００ｍｇの６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（２’’−ブロモエチル）−オキシム］（１）を、５ｍｌの無水ＤＭＦに溶解した。磁気撹拌下、過剰の適当なアミンを加え、次いで、混合物を５０℃に加熱した。反応が完了した後、混合物を水（３０ｍｌ）中に注ぎ入れ、沈殿を濾過し、水およびシクロヘキサンで洗浄した。ジメチルアミン、ジエチルアミン、ピロリジン、モルホリン、ジエタノールアミン、３−メチルアミン−１，２−プロパンジオール、ピペラジン、１−メチルピペラジン、１−（２−メトキシエチル）ピペラジン、１−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジンおよび１−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）−エチル］ピペラジンによって、それに応じた生成物（５）〜（１５）が、定性的な収率で得られた。
【００５１】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（２−ジメチルアミノエチル）−オキシム］（５）のデータ。融点２３０℃。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ ｄ−６，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１１．７１（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−１’），１０．９２（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−１），８．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−４），８．１４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，Ｈ−６’，Ｈ−７’），７．１５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５／２．０Ｈｚ，Ｈ−５），７．０５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，Ｈ−７），４．６９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，Ｈ−１’’），２．８０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，Ｈ−２’’），２．２７（６Ｈ，ｓ，−Ｎ（ＣＨ３）２）。ＡＰＣＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ４２７，４２９（Ｍ＋Ｈ）＋。元素分析値（Ｃ２０Ｈ１９Ｎ４Ｏ２Ｂｒ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００５２】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）−オキシム］（６）のデータ。融点２３２℃。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ ｄ−６，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１１．７１（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１’），１０．９２（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１），８．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，Ｈ−４），８．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，Ｈ−６’，Ｈ−７’），７．１３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２／２．１Ｈｚ，Ｈ−５），７．０９ − ７．０２（２Ｈ，ｍ，Ｈ−７，Ｈ−５’），４．６５（２Ｈ，ｔ，Ｊ ＝６．０Ｈｚ，Ｈ−１’’），２．９４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ｈ−２’’），２．５８（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），０．９８（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２）。ＡＰＣＩ−ＭＳ（＋）ｍ／ｚ ４５５，４５７（Ｍ＋Ｈ）＋。元素分析値（Ｃ２２Ｈ２３Ｎ４Ｏ２Ｂｒ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００５３】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（２−ピロリジン−１−イルエチル）オキシム］（７）のデータ。融点２０８℃。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ ｄ−６，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１１．７０（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１’），１０．９３（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１），８．５４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−４），８．１４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−６’，Ｈ−７’），７．１４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５／１．９Ｈｚ，Ｈ−５），７．０５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，Ｈ−７），４．７０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，Ｈ−１’’），２．９８（２Ｈ，ｂｒｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，Ｈ−２’’），２．５７（４Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−３’’，Ｈ−６’’），１．６９（４Ｈ，ｍ，Ｈ−４’’，Ｈ−５’’）。ＡＰＣＩ−ＭＳ（＋）ｍ／ｚ ４５３，４５５（Ｍ＋Ｈ）＋。元素分析値（Ｃ２２Ｈ２１Ｎ４Ｏ２Ｂｒ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００５４】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（２−モルホリン−１−イルエチル）オキシム］（８）のデータ。融点２３５℃。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ ｄ−６，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１１．７０（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１’），１０．９０（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１），８．５２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−４），８．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４３（２Ｈ，ｍ，Ｈ−６’，Ｈ−７’），７．１４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５／１．９Ｈｚ，Ｈ−５），７．０５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−５’），７．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，Ｈ−７），４．７０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，Ｈ−１’’），３．５７（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，Ｈ−４’’，Ｈ−５’’），２．８６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，Ｈ−２’’），２．５０（４Ｈ，ｍ，Ｈ−３’’，Ｈ−６’’，ＤＭＳＯと重複）。ＡＰＣＩ−ＭＳ（＋）ｍ／ｚ ４６９，４７１（Ｍ＋Ｈ）＋。元素分析値（Ｃ２２Ｈ２１Ｎ４Ｏ３Ｂｒ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００５５】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（２−（Ｎ，Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アミノエチル）オキシム）（９）のデータ。融点２０１℃。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ピリシン ｄ−５，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１２．３１（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−１’），１２．２５（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−１），８．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，Ｈ−４），８．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．８Ｈｚ，Ｈ−５），７．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ｈ−７），７．３４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｈ−６’），７．０４（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，Ｈ−７’），５．８９（１Ｈ，ｂｒｓ，−ＯＨ），４．８６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，Ｈ−１’’），４．００（４Ｈ，ｍ，−−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）２），３．３８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，Ｈ−２’’），３．０８（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，−−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）２）。ＡＰＣＩ−ＭＳ（＋） ｍ／ｚ ４８７，４８９（Ｍ＋Ｈ）＋。元素分析値（Ｃ２２Ｈ２３Ｎ４Ｏ４Ｂｒ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００５６】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−（Ｏ−｛２−［Ｎ−メチル、Ｎ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）アミノ］エチル｝オキシム］（１０）のデータ。融点１９５℃。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ピリジン ｄ−５，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１２．２７（２Ｈ，ｍ，Ｈ−１，Ｈ−１’），８．９０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，Ｈ−４），８．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８，１．８Ｈｚ，Ｈ−５），７．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ｈ−７’），７．３６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｈ−６’），７．０５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，Ｈ−７），４．８０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，Ｈ−１’’），４．２９（１Ｈ，ｍ，Ｈ−４’’），４．１１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．０，４．６Ｈｚ，Ｈ−５’’ａ），４．０４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．０，５．５Ｈｚ，Ｈ−５’’ｂ），３．１４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，Ｈ−２’’），２．９３（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３’’），２．４９（３Ｈ，ｓ，−ＮＣＨ３）。ＣＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ４８７，４８９（Ｍ＋Ｈ）＋。元素分析値（Ｃ２２Ｈ２３Ｎ４Ｏ４Ｂｒ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００５７】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（２−ピペラジン−１−イルエチル）オキシム］（１１）のデータ。融点２５５℃（ｄｅｃ．）１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ、ＤＭＳＯ ｄ−６，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１１．６９（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１’），１０．９２（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１），８．５３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−４），８．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４３（２Ｈ，ｍ，Ｈ−６’，Ｈ−７’），７．１４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−５），７．０３（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，Ｈ−７），４．６９（２Ｈ，ｂｒ ｔ，Ｈ−１’’），２．８３（２Ｈ，ｂｒ ｔ，Ｈ−２’’），２．７１（４Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−４’’，Ｈ−５’’），２．４６（４Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−３’’，Ｈ−６’’，ＤＭＳＯと部分的に重複）。ＡＰＣＩ−ＭＳ（＋）ｍ／ｚ ４６８，４７０（Ｍ＋Ｈ）＋。元素分析値（Ｃ２２Ｈ２２Ｎ５Ｏ２Ｂｒ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００５８】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−｛Ｏ−［２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エチル］オキシム｝（１２）のデータ。融点２２２℃。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ ｄ−６，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１１．６８（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１’），１０．９０（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１），８．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−４），８．１４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４２（２Ｈ，ｍ，Ｈ−６’，Ｈ−７’），７．１３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５／１．９Ｈｚ，Ｈ−５），７．０４（１Ｈ，ｍ，Ｈ−５’），７．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，Ｈ−７），４．６８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，Ｈ−１’’），２．８５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，Ｈ−２’’），２．５０（４Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−３’’，Ｈ−６’’，ＤＭＳＯと重複），２．３１（４Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−４’’，Ｈ−５’’），２．１３（３Ｈ，ｓ，−ＮＣＨ３）。ＡＰＣＩ−ＭＳ（＋）ｍ／ｚ ４８２，４８４（Ｍ＋Ｈ）＋。元素分析値（Ｃ２３Ｈ２４Ｎ５Ｏ２Ｂｒ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００５９】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−（Ｏ−｛２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エチル｝オキシム）（１３）のデータ。融点１８７℃。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ ｄ−６，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）８．５２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−４），８．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４３（２Ｈ，ｍ，Ｈ−６’，Ｈ−７’），７．１３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５／１．８Ｈｚ，Ｈ−５），７．０５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−５’），７．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ｈ−７），４．６９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，Ｈ−１’’），３．４５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，Ｈ−８’’），２．８５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，Ｈ−２’’），２．５０（４Ｈ，Ｈ−３’’，Ｈ−６’’，ＤＭＳＯと重複），２．４２（４Ｈ，Ｈ−４’’，Ｈ−５’’），２．３４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，Ｈ−７’’）。ＡＰＣＩ−ＭＳ（＋）ｍ／ｚ ５１２，５１４（Ｍ＋Ｈ）＋。元素分析値（Ｃ２４Ｈ２６Ｎ５Ｏ３Ｂｒ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００６０】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−（Ｏ−｛２−［４−（２−メトキシエチル）ピペラジン−１−イル］エチル｝オキシム）（１４）のデータ。融点１８４℃。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ ｄ−６，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１１．７０（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１’），１０．９０（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１），８．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−４），８．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４４（２Ｈ，ｍ，Ｈ−６’，Ｈ−７’），７．１５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５，１．７Ｈｚ，Ｈ−５），７．０７（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，Ｈ−７），４．７０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，Ｈ−１’’），３．４０（２Ｈ，Ｈ−８’’，水と重複），３．２１（３Ｈ，ｓ，−ＯＣＨ３），２．８７（２Ｈ，ｂｒｔ，Ｈ−２’’），２．６６−２．４０（Ｈ−４’’，Ｈ−５’’，Ｈ−３’’，Ｈ−６’’，Η−７’’，ＤＭＳＯと重複）。ＡＰＣＩ−ＭＳ（＋）ｍ／ｚ ５２６，５２８（Ｍ＋Ｈ）＋。元素分析値（Ｃ２５Ｈ２８Ｎ５Ｏ３Ｂｒ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００６１】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（２−｛４−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）−エチル］ピペラジン−１−イル｝エチル）オキシム］（１５）のデータ。融点１８３℃。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ピリジン ｄ−５，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１２．３１（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１’），１２．２５（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１），８．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，Ｈ−４），８．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４５ − ７．３３（３Ｈ，ｍ，Ｈ−５，Ｈ−７’，Ｈ−６’），７．０９（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，Ｈ−７），４．７８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，Ｈ−１’’），３．９６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，Ｈ−１０’’），３．７０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，Ｈ−９’’），３．６６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，Ｈ−８’’），２．９４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，Ｈ−２’’），２．６８（２Ｈ，ｂｒｓ，Η−３’’，Ｈ−６’’），２．５７（８Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，Ｈ−４’’，Ｈ−５’’，Η−７’’）。ＡＰＣＩ−ＭＳ（＋）ｍ／ｚ ５５６，５５８（Ｍ＋Ｈ）＋。元素分析値（Ｃ２６Ｈ３０Ｎ５Ｏ４Ｂｒ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００６２】
アミン塩１６〜２６の調製のための一般手順。
【００６３】
適当なインディルビン誘導体５〜１５（０．１０ｍｍｏｌ）を、無水ＴＨＦ（５０ｍｌ）に溶解し、エーテル中塩酸の飽和溶液０．２ｍｌを滴加した。反応混合物を氷浴中で冷却させ、形成された沈殿を濾過によって回収した。
【００６４】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（２−ジメチルアミノエチル）オキシム］ヒドロクロリド（１６）のデータ。Ｓｗ（ｇ／ｌ）０．１４１．１Η−ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ ｄ−６，δ ｐｐｍ Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１１．７０（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１’），１０．９７（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１），８．４９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，Ｈ−４），８．２２（１Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４６（２Ｈ，ｍ，Ｈ−７，Ｈ−６’），７．２０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．３／１．７Ｈｚ，Ｈ−５），７．０５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，Ｈ−７’），４．９５（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−１’’），３．５８（２Ｈ，ｍ，Ｈ−２’’），２．８１（６Ｈ，ｂｒｓ，−Ｎ（ＣＨ３）２）。分析値（Ｃ２０Ｈ２０Ｎ４Ｏ２ＢｒＣｌ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００６５】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）オキシム］ヒドロクロリド（１７）のデータ。Ｓｗ（ｇ／ｌ）０．１９２。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ ｄ−６，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１１．７０（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１’），１０．９８（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１），８．４９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ｈ−４），８．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４７（２Ｈ，ｍ，Ｈ−７，Ｈ−６’），７．２１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．６／１．９Ｈｚ，Ｈ−５），７．０９ − ７．０４（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，Ｈ−７’），５．００（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−１’’），３．５８（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−２’’），３．２４（４Ｈ，ｂｒｓ，−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），１．２１（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２）。分析値（Ｃ２２Ｈ２４Ｎ４Ｏ２ＢｒＣｌ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００６６】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（２−ピロリジン−１−イルエチル）オキシム］ヒドロクロリド（１８）のデータ。Ｓｗ（ｇ／ｌ）０．１９５。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ ｄ−６，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１１．７１（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１’），１０．９７（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１），８．４８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ｈ−４），８．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４４ − ７．５２（２Ｈ，ｍ，Ｈ−７，Ｈ−６’），７．２０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．６／１．９Ｈｚ，Ｈ−５），７．０７（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，Ｈ−７’），４．９４（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−１’’），３．６４（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−２’’），３．１３（４Ｈ，ｍ，Η−３’’，Η−６’’），２．０２（４Ｈ，ｍ，Ｈ−４’’，Ｈ−５’’）。元素分析値（Ｃ２２Ｈ２２Ｎ４Ｏ２ＢｒＣｌ）Ｃ，Ｈ，Ｎ．
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（２−モルホリン−１−イルエチル）オキシム］ヒドロクロリド（１９）のデータ。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ ｄ−６，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１１．６９（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１’），１０．９８（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１），８．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−４），８．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−７，Ｈ−６’），７．２１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．３，１．８Ｈｚ，Ｈ−５），７．０６（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，Ｈ−７’），５．０５（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−１’’），３．９５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−２’’），３．７５（４Ｈ，ｍ，Ｈ−４’’，Ｈ−５’’），３．２７（４Ｈ，Ｈ−３’’，Ｈ−６’’，水と重複）。元素分析値（Ｃ２２Ｈ２２Ｎ４Ｏ３ＢｒＣｌ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００６７】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（２−（Ｎ，Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アミノエチル）オキシム）ヒドロクロリド（２０）のデータ。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ ｄ−６，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１１．７１（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１’），１０．９８（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１），８．４８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，Ｈ−４），８．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４６（２Ｈ，ｍ，Ｈ−７，Ｈ−６’），７．２１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．３／１．８Ｈｚ，Ｈ−５），７．０６（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，Ｈ−７’），５．３５（２Ｈ，ｂｒｓ，ＯＨ），５．０３（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−１’’），３．８４（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−２’’），３．７８（４Ｈ，ｂｒｓ，−−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）２），３．３８（４Ｈ，ｍ，−−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）２，水と重複）。分析値（Ｃ２２Ｈ２４Ｎ４Ｏ４ＢｒＣｌ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００６８】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−（Ｏ−｛２−［Ｎ−メチル、Ｎ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）アミノ］エチル｝オキシム）ヒドロクロリド（２１）のデータ。Ｓｗ（ｇ／ｌ）１．４５。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ ｄ−６，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１１．６９（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１’），１０．９６（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１），８．４８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−４），８．２０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４（２Ｈ，ｍ，Ｈ−７，Ｈ−６’），７．１９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５／１．８Ｈｚ，Ｈ−５），７．０５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，Ｈ−７’），４．９５（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−１’’），３．８９（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−４’’），３．３８（４Ｈ，Ｈ−３’’，Ｈ−５’’，水と重複），２．８３（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−３’’），２．５０（３Ｈ，−Ｎ（ＣＨ３），ＤＭＳＯと重複）。元素分析値（Ｃ２２Ｈ２４Ｎ４Ｏ４ＢｒＣｌ）Ｃ，Ｈ，Ｎ．
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（２−ピペラジン−１−イルエチル）オキシム］ジヒドロクロリド（２２）のデータ． Ｓｗ（ｇ／ｌ）１．６１。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）７．６５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−４），７．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５，Ｈ−４’），７．２６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｈ−６’），６．８５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｈ−５’），６．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−５），６．７２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｈ−７’），６．５４（１Ｈ，ｓ，Ｈ−７），４．４２（２Ｈ，ｂｒｔ，Ｈ−１’’），３．３８（４Ｈ，ｂｒｔ，Ｈ−４’’，Ｈ−５’’），３．１１（６Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−３’’，Ｈ−６’’，Ｈ−２’’）。元素分析値（Ｃ２２Ｈ２４Ｎ５Ｏ２ＢｒＣｌ２）Ｃ，Ｈ，Ｎ．
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−｛Ｏ−［２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エチル］オキシム｝ジヒドロクロリド（２３）のデータ。Ｓｗ（ｇ／ｌ）１．５０。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）７．６３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，Ｈ−４），７．５３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５，Ｈ−４’），７．２５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｈ−６’），６．８４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｈ−５’），６．７５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，Ｈ−５），６．７０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｈ−７’），６．５３（１Ｈ，ｓ，Ｈ−７），４．３９（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−１’’），３．３９（４Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−３’’，Ｈ−６’’），３．１１（６Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−２’’，Ｈ−４’’，Ｈ−５’’），２．９０（３Ｈ，ｓ，−ＮＣＨ３）。元素分析値（Ｃ２３Ｈ２６Ｎ５Ｏ２ＢｒＣｌ２）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００６９】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−（Ｏ−｛２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エチル｝オキシム）ジヒドロクロリド（２４）のデータ。Ｓｗ（ｇ／ｌ）１．１４。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）７．６８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−４），７．５６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４，Ｈ−４’），７．２７（１Ｈ，ｂｒｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｈ−６’），６．８５（１Ｈ，ｂｒｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｈ−５’），６．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−５），６．７３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，Ｈ−７’），６．５７（１Ｈ，ｓ，Ｈ−７），４．４２（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−１’’），３．８９（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−８’’），３．３９（４Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−３’’，Ｈ−６’’），３．２６（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−７’’），３．１２（６Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−２’’，Ｈ−４’’，Ｈ−５’’）。元素分析値（Ｃ２４Ｈ２８Ｎ５Ｏ３ＢｒＣｌ２）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００７０】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−（Ｏ−｛２−［４−（２−メトキシエチル）ピペラジン−１−イル］エチル｝オキシム）ジヒドロクロリド（２５）のデータ。Ｓｗ（ｇ／ｌ）０．５７。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）７．７０（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−４），７．６１（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−４’），７．２８（１Ｈ，ｂｒｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｈ−６’），６．８８（１Ｈ，ｂｒｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｈ−５’），６．７７（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−５，Ｈ−７’），６．５８（１Ｈ，ｓ，Ｈ−７），４．５２（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−１’’），３．７４（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−８’’），３．５５−３．２２（１２Ｈ，Ｈ−２’’，Ｈ−３’’，Ｈ−４’’，Ｈ−５’’，Ｈ−６’’，Ｈ−７’’），３．３５（３Ｈ，ｓ，−ＯＣＨ３）。Ａｎａｌ．（Ｃ２５Ｈ３０Ｎ５Ｏ３ＢｒＣｌ２）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００７１】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（２−｛４−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）−エチル］ピペラジン−１−イル｝エチル）オキシム］ジヒドロクロリド（２６）のデータ． Ｓｗ（ｇ／ｌ）４．２５３。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）７．５４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，Ｈ−４），７．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｈ−４’），７．２１（１Ｈ，ｂｒｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｈ−６’），６．７８（１Ｈ，ｂｒｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｈ−５’），６．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｈ−７’），６．６１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，Ｈ−５），６．３４（１Ｈ，ｓ，Ｈ−７），４．２８（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−１’’），３．８２，３．７２，３．６３，（６Ｈ，Ｈ−８’’，Ｈ−９’’，Ｈ−１０’’），３．４６−２．７２（１２Ｈ，Ｈ−２’’，Ｈ−３’’，Ｈ−４’’，Ｈ−５’’，Ｈ−６’’，Ｈ−７’’）。元素分析値（Ｃ２６Ｈ３２Ｎ５Ｏ４ＢｒＣｌ２）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００７２】
アミンａは化合物(5)(16)に、ｂは(6)(17)に、ｃは(7)(18)に、ｄは(8)(19)に、ｅは(11)(22)に、ｆは(12)(23)に、ｇは(15)(26)に、ｈは(10)(21)に、ｉは(9)(20)に、ｊは(13)(24)に、ｋは(14)(25)にそれぞれ対応する。
【００７３】
生物学
キナーゼ調製およびアッセイ
キナーゼ活性を、バッファーＡ（１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、５０μｇヘパリン／ｍｌ）またはＣ（ホモジネーションバッファーであるが、５ｍＭ ＥＧＴＡを含み、ＮａＦを含まず、プロテアーゼ阻害剤を含まない）中、３０℃、最終ＡＴＰ濃度１５μＭでアッセイした。ブランク値を差し引き、活性を、３０分のインキュベーションの間に組み込まれたリン酸のｐｍｏｌｅとして算出した。活性は、最大活性の（すなわち、阻害剤の不在下での）％で表した。コントロールは、ジメチルスルホキシドの適当な希釈を用いて実施した。基質のリン酸化は、Ｐ８１ホスホセルロースアッセイによって評価した。
【００７４】
ＣＤＫ１／サイクリンＢは、先に記載されるように（文献４）、Ｍ期ヒトデ（Ｍａｒｔｈａｓｔｅｒｉａｓ ｇｌａｃｉａｌｉｓ）卵母細胞から、ホモジネーション バッファー（６０ｍＭ β−グリセロホスフェート、１５ｍＭ ｐ−ニトロフェニルホスフェート、２５ｍＭ Ｍｏｐｓ（ｐＨ７．２）、１５ｍＭ ＥＧＴＡ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ バナジウム酸ナトリウム、１ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ フェニルホスフェート、１０μｇロイペプチン／ｍｌ、１０μｇアプロチニン／ｍｌ、１０μｇ 大豆トリプシンインヒビター／ｍｌおよび１００μＭ ベンズアミジン）で抽出し、ｐ９ＣＫＳｈｓ１−セファロースビーズでのアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、それから、遊離ｐ９ＣＫＳｈｓ１によって溶出した。キナーゼ活性は、最終容量３０μｌで、１５μＭ［γ−３３Ｐ］ＡＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；１０ｍＣｉ／ｍｌ）の存在下、１ｍｇヒストンＨ１／ｍｌを含むバッファーＣにおいてアッセイした。３０℃で３０分インキュベートした後、上清の２５μｌのアリコートを、Ｗｈａｔｍａｎ Ｐ８１ホスホセルロースペーパーの２．５×３ｃｍ片にスポッティングし、２０秒後、フィルターを、１０ｍｌリン酸／水１リットルの溶液中で５回洗浄した（各回少なくとも５分間）。湿ったフィルターを、１ｍｌのＡＣＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）シンチレーション液の存在下でカウントした。
【００７５】
ＣＤＫ５／ｐ２５を、等量の組換えヒトＣＤＫ５およびＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）融合タンパク質として大腸菌で発現されたｐ２５を混合することによって再構成し、グルタチオン−アガロースでのアフィニティークロマトグラフィーによって精製した（ｐ２５は、ｐ３５、３５ｋＤａのＣＤＫ５アクチベーターの末端切断型である）。その活性は、ＣＤＫ１／サイクリンＢについて記載されるようにバッファーＣにおいてヒストンＨ１を用いてアッセイした。
【００７６】
ＧＳＫ−３α／βは、固定化アキシンでのアフィニティークロマトグラフィーによってブタ脳から精製した（文献５）。最終容量３０μｌで、１５μＭ［γ−３３Ｐ］ＡＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；１０ｍＣｉ／ｍｌ）の存在下、バッファーＡ中、４μＭのＧＳ−１（ＹＲＲＡＡＶＰＰＳＰＳＬＳＲＨＳＳＰＨＱＳｐＥＤＥＥＥ）、Ｍｉｌｌｅｇｅｎ（Ｌａｂｅｇｅ、Ｆｒａｎｃｅ）から入手したＧＳＫ−３特異的基質を含む、１ｍｇ ＢＳＡ／ｍｌの１０ｍＭ ＤＴＴで１／１００希釈した後アッセイした。３０℃で３０分間インキュベートした後、２５μｌの上清のアリコートを上記のように処理した。
【００７７】
細胞アッセイ
細胞培養条件および細胞生存評価
ＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞株を、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｅｒｇｙ Ｐｏｎｔｏｉｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）およびＬｏｎｚａから得た抗生物質（ペニシリン−ストレプトマイシン）および１０％容量のウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補給したＤＭＥＭで、５％ ＣＯ２を用いて３７℃で増殖させた。薬物処理は、指数増殖期培養物で、示された時間および濃度で実施した。コントロール実験はまた、ＤＭＳＯの適当な希釈物を使用して実施した。細胞生存力は、これまでに記載されるように（文献６）、処理の４８時間後にＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム）法によって決定した。
【００７８】
ＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞におけるβ−カテニンリン酸化
ほぼコンフルエントのＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞を、ＤＭＥＭ（１０％ ＦＣＳおよび抗生物質を補給した）中、９６プレートで増殖させた。細胞を、試験される化合物および２μＭ ＭＧ１３２を用いて６時間同時処理した（リン酸化β−カテニンを蓄積させた）。最終ＤＭＳＯ濃度は、１％を越えなかった。次いで、細胞を、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手したＳｅｒ３３／Ｓｅｒ３７／Ｔｈｒ４１−リン酸化（１：１０００）β−カテニンに対する抗体を使用するＥＬＩＳＡアッセイに付した。結果は、最大β−カテニンリン酸化の、すなわち、陽性コントロール（１００％リン酸化）としてＭＧ１３２のみに曝露された未処理細胞におけるパーセンテージで表されている。
【００７９】
細胞培養および日内周期性の発光アッセイ
これらの実験では、時計制御Ｐｅｒ２プロモーター（ＰＰｅｒ２）活性の尺度として、発光の頑強な日内周期を示す、ＰＰｅｒ２：：Ｆｌｕｃリポーター構築物を用いて安定にトランスフェクトされたＲａｔ−１線維芽細胞を使用した（文献７）。細胞を、５％ ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で、５％ ＦＢＳ、５０ユニット／ｍｌペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補給したＤＭＥＭ（１１９６５−０９２、ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。約５×１０５個細胞を、実験の少なくとも５日前に３５ｍｍディッシュに播種した。３日後、細胞は１００％コンフルエンスに達し、細胞を０．１μＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）で１時間処理し、集団中の細胞間でオシレーターを同期化した。処理の最後に、培地を、アッセイ培地［フェノールレッドを含まない、重炭酸（３５０ｍｇ／Ｌ）、５％ ＦＢＳ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、抗生物質（２５ユニット／ｍｌペニシリン、２５μｇ／ｍｌストレプトマイシン）および０．１ｍＭ ルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を補給したＤＭＥＭ］と交換した。培養ディッシュを、４０ｍｍ顕微鏡ガラスカバースリップおよび高真空グリースで密閉して、培養培地の蒸発を防いだ。ＬｕｍｉＣｙｃｌｅ（Ａｃｔｉｍｅｔｒｉｃｓ Ｉｎｃ．、Ｅｖａｎｓｔｏｎ、ＩＬ、ＵＳＡ）において発光リズムをモニタリングした。密閉される前に、培養ディッシュに薬物を種々の終濃度に加え、その後、細胞とともに引き続き残し、その間に、発光パターンを５日間以上記録した。溶媒コントロールとしてＤＭＳＯを使用した。発光リズムの期間および相を調べるために、Ｃｈｒｏｎｏ ＩＩプログラムを用いて回帰分析を実施した。
【００８０】
電気泳動およびウエスタンブロッティング
細胞を４℃でホモジネーションバッファーに３０分間再懸濁し、溶解し、超音波処理した。遠心分離（４℃で、１４０００ｒ．ｐ．ｍ．１５分間）した後、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって上清中のタンパク質濃度を調べた。５分間熱変性させた後、タンパク質を、ＭＯＰＳ ＳＤＳランニングバッファーを用い、１０％ ＮｕＰＡＧＥ ｐｒｅ−ｃａｓｔ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ａｃｅｔａｔｅ ポリアクリルアミドミニゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって分離した。タンパク質を０．４５μｍのニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）にトランスファーした。これらをＴｒｉｓ緩衝生理食塩水−Ｔｗｅｅｎ−２０中、５％低脂肪乳を用いてブロッキングし、Ｓｅｒ３３／Ｓｅｒ３７／Ｔｈｒ４１−リン酸化β−カテニン（１：１０００）に対する抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともに４℃で１晩インキュベートし、Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって分析した。
【００８１】
結果
６ＢＩＯ誘導体の細胞毒性
３種のプロテインキナーゼに対する、およびヒト神経芽腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の生存に対するインディルビン１〜２６の効果が、表２〜表４に示されている。インディルビンは、実験の節に記載されるように、ＧＳＫ−３α／β、ＣＤＫ１／サイクリンＢ、ＣＤＫ５／ｐ２５に対して種々の濃度で試験した。用量反応曲線から算出されたＩＣ５０値は、μＭで報告されている。化合物は、ＭＴＳ還元アッセイを使用して推定される４８時間インキュベーションした後のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞生存に対するその効果について種々の濃度で試験した。用量反応曲線から算出されるＩＣ５０値は、μＭで報告されている。
【化４】
【表２】
【表３】
【表４】
【００８２】
本発明のインディルビン誘導体を、ＭＴＳ還元アッセイを使用してＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞の生存に対するその効果について調べた。これらのアッセイは、ＧＳＫ−３に対する効力の増大は、細胞死の増強と関連しないということを示した（表１）。類似体１３、１４および１５（およびその対応する塩２４、２５、２６）は、細胞死誘導活性をほとんど有さなかった。６ＢＩＯのＩＣ５０、９μＭと比較するためのＩＣ５０値は、それぞれ、２８μＭ、＞１００μＭ、９４μＭ（塩：１７μＭ、＞１００μＭ、９８μＭ）であった。したがって、置換ピペラジン環拡張は、ＧＳＫ−３に対する選択性および有効性に有利に働き、良好な溶解度を可能にするだけでなく、その細胞毒性も低減する。これらの特徴は、細胞系におけるＧＳＫ−３の研究におけるこれらの化合物の使用にとって、また、神経変性性疾患および糖尿病との関連で、可能性ある治療リード化合物として特に好都合である。
【００８３】
インディルビンによるＧＳＫ−３の細胞内阻害の確認
新規インディルビンが、細胞状況におけるＧＳＫ−３の阻害で有効であるかどうかを調べるために、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞においてＧＳＫ−３特異的部位でのβ−カテニンのリン酸化に対するその効果を測定した。細胞を、一定レベルのＭＧ１３２（ＧＳＫ−３によってリン酸化されるとすぐのβ−カテニンの迅速な分解を防いだ、プロテアソームの阻害剤）の存在下で、１０μＭの各インディルビンの種々の濃度に曝露した。ＧＳＫ−３によってリン酸化されたもののレベルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のウエスタンブロッティング（ＧＳＫ−３部位でリン酸化された場合にβ−カテニンと特異的に交差反応する抗体を用いる）によって（図２ａ）、またはＥＬＩＳＡアッセイによって（図２ｂ）推定した。結果は、β−カテニン上のＧＳＫ−３選択的リン酸化部位の用量依存性阻害を示し、これは、これらの化合物は、細胞においてＧＳＫ−３を実際に阻害できることを実証した。最も効果的な化合物は、６ＢＩＯ、３、５、９、１１、１２および１３（および利用可能である場合にはその塩、すなわち、１６、２０、２２、２３、２４）であった。用量反応曲線は、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて得られた（図２ｂ）。キナーゼ不活性誘導体１−メチル−６ＢＩＯは、細胞アッセイでは効果がなかった。
【００８４】
哺乳類細胞培養における日内周期に対する効果
ＧＳＫ−３は、日内周期（日周体内時計としても知られる）の重要なレギュレーターである。日内周期は、非神経系、末梢組織における概日時計の優れたモデル系である細胞系において部分的に再現できる。この系を使用して、ＧＳＫ−３阻害が日内周期に影響を及ぼし得る可能性を探った。ＰＰｅｒ２：：Ｆｌｕｃリポーター構築物を用いて安定にトランスフェクトされたＲａｔ−１線維芽細胞は、時計制御Ｐｅｒ２プロモーター（ＰＰｅｒ２）の尺度として発光の頑強な日内周期を示す。実験の節に記載されるように、細胞を培養し、まず、１０μＭインディルビン１５を用いて処理し、そのＰｅｒ発現依存性発光の日内周期を４日間モニタリングした。周期長の段階的な短縮が明確に観察された（図３ａ）。次いで、図３ａにおけるように、同様の実験を、小規模に選んだインディルビンを用いて実施し、周期長を算出した。周期長の短縮において最も有効な化合物（図３ｂ）はまた、細胞アッセイにおけるβ−カテニンリン酸化の阻害においても最も有効であり（図２）、このことは、概日期間の短縮におけるインディルビンの作用は、ＧＳＫ−３に対するものであるという仮説を支持する。これまでの研究は、薬理学的ツールとしてリチウムを使用する、哺乳類細胞の日内周期の調節におけるＧＳＫ−３の重要な作用を支持した。リチウムは、日内周期の期間を延長するのに対し、インディルビンは、期間を短縮する（図５）。しかし、日内周期のこれまでの研究において使用されたリチウムおよびＧＳＫ−３の濃度は、１０〜２０ｍＭであったのに対し、インディルビンを用いた結果は、１０００倍低い濃度（１０μＭ）を用いて得られた。これらの比較は、リチウムの概日期間延長効果は、リチウムの副作用によるものであり得るということを示唆する。したがって、インディルビンは、日内周期の調節におけるＧＳＫ−３の役割を調べるための有用な薬理学的ツールとなると思われる。
【００８５】
本発明者らは、疾患関連グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３のＡＴＰ結合部位でのインディルビンの重要な相互作用の論理的根拠分析ならびに３’部位の種々の修飾を調べる類似体の合成および生物学的評価によって、阻害剤／ＧＳＫ−３複合体にさらなる安定化を与える新規相互作用部位を明らかにすることができた。結果として、この部位での拡張は、ＧＳＫ−３に対する活性および選択性の増強を提供し、また、水溶性の増強に好都合な置換を導入する機会も提供した。
【００８６】
参考文献
1.Meijer, L; Skaltsounis, AL; Magiatis, P; Polychonopoulos, P; Knockaert, M; Leost, M; Ryan, XP; Vonica, CD; Brivanlou, A; Dajani, R; Tarricone, A; Musacchio, A; Roe, SM; Pearl, L, Greengard, P. GSK-3 selective inhibitors derived from Tyrian purple indirubins. Chem. & Biol. 2003, 10, 1255-1266.
2. Jope, R.S.; Johnson, G.V.W. The glamour and gloom of glycogen synthase kinase-3. Trends Biochem. Sci. 2004, 29, 95-102.
3 Ribas, J.; Bettayeb, K.; Ferandin, Y.; Garrofe-Ochoa, X.; Knockaert, M.; Totzke, F.; Schachtele, C.; Mester, J.; Polychronopoulos, P.; Magiatis, P.; Skaltsounis, A.L.; Boix, J.; Meijer, L.,. 7-bromoindirubin-3’-oxime induces caspase-independent cell death. Oncogene 2006, 25, 6304-6318.
4 Leclerc, S.; Garnier, M.; Hoessel, R.; Marko, D.; Bibb, J.A.; Snyder, G.L.; Greengard, P.; Biernat, J.; Mandelkow, E.-M.; Eisenbrand, G.; Meijer, L. Indirubins inhibit glycogen synthase kinase - 3β and CDK5/p25, two kinases involved in abnormal tau phosphorylation in Alzheimer’s disease - A property common to most CDK inhibitors ? J. Biol. Chem. 2001, 276, 251-260.
5 Primot, A.; Baratte, B.; Gompel, M.; Borgne, A.; Liabeuf, S.; Romette, J.L.; Costantini, F.; Meijer, L. Purification of GSK-3 by affinity chromatography on immobilised axin. Protein Expr. & Purif. 2000, 20, 394-404.
6 Ribas, J.; Boix, J. Cell differentiation, caspase inhibition, and macromolecular synthesis blockage, but not BCL-2 or BCL-XL proteins, protect SH-SY5Y cells from apoptosis triggered by two CDK inhibitory drugs. Exp. Cell Res. 2004, 295, 9-24.
7 Izumo, M.; Sato, T.R.; Straume M.; Johnson C.H.. Quantitative analyses of circadian gene expression in mammalian cell cultures. PLoS Computational Biology 2006, 2, e136.
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３（ＧＳＫ−３）に対する選択性が増強された３’，６−置換インディルビンに関する。また、その生物学的適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトキノームを構成する５１８種のプロテインキナーゼの中でも、ＧＳＫ−３は、特に興味深く、十分に研究されたセリン／トレオニンキナーゼのファミリーとして際立っている。広範囲の類似性（８４％の全体の同一性、９８％の触媒ドメイン内）を共有する２種のＧＳＫ−３形態（ＧＳＫ−３αおよびＧＳＫ−３β）があるだけであり、主な相違は、ＧＳＫ−３αのＮ末端ドメインにおける余分なＧｌｙリッチストレッチに起因する。ＧＳＫ−３は、単細胞寄生虫から酵母、哺乳類にまで存在する高度に保存されたプロテインキナーゼである。これらのキナーゼは、ＷｎｔおよびＨｅｄｇｅｈｏｇシグナル伝達、胚発生（パターン指定および軸配向）、転写、インスリン作用、細胞分裂周期、細胞死、細胞生存、分化、複数の神経機能、日内周期調節、幹細胞分化などといった多数の重大な生理学的事象に関与している。さらに、ＧＳＫ−３は、アルツハイマー病、統合失調症、双極性障害などの神経系障害、糖尿病、心臓肥大、腎疾患、ショックおよび炎症、癌などを含む多様なヒト疾患に関与している。したがって、基礎研究における薬理学的ツールとして、特定の疾患の治療ための、およびフィーダー細胞の不在下での多能性幹細胞の維持のための可能性ある薬物として使用するための、強力な、選択的ＧＳＫ−３阻害剤の探索を支持する強力な論理的根拠がある。多数の阻害性ＧＳＫ−３骨格(scaffold)が記載されている。興味深いことに、これらの阻害剤の多くはまた、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）、十分に研究された重要な調節酵素の別のファミリーとも相互作用する。
【０００３】
ＧＳＫ−３阻害剤の中でも、ビス−インドールインディルビンの誘導体（まとめて、インディルビンと呼ばれる）が、独創的な、見込みのあるツールおよび薬剤の１クラスと思われる。その中程度の選択性は、研究試薬として使用される場合には不都合であり得るが、いくつかの疾患関連標的（特に、ＣＤＫおよびＧＳＫ−３）に対するその組み合わされた効果は、治療的適用の可能性にとって利点となり得る。多数のインディルビンの中でも、６−ブロモ−インディルビン−３’−オキシム（６ＢＩＯ）（１〜３）は、種々の細胞設定におけるＧＳＫ−３の生理学的役割を調べるために、また胚幹細胞の運命を変えるために（１）広く使用されてきた（非特許文献１〜３）。
【０００４】
極めて強力な、比較的選択性のキナーゼ阻害性インディルビンが開発されているが、それらは、通常、低い水溶性を示す。これらの見込みのある化合物の溶解度の問題に対処するために、本発明者らは、親水性の増大した６ＢＩＯの新規類似体をデザインした。分子の親水特性の改善は、いくつかの方法によって取り組まれ得る。芳香族炭素原子と、ｓｐ３のハイブリダイゼーション状態を変更することによるインディルビン骨格の芳香族特性の低減が、溶解度を増強するための一方法として提案されている。代替法は、分子への親水基の導入である。親水性の最適化が、標的キナーゼに対する分子の効力または選択性のいずれかに悪影響を与えないことが絶対必要であるということは明らかである。したがって、キナーゼに対する有効性の激減を伴わずには変更できない分子の２つの重要な領域があるので、置換位置の選択は極めて重要である。第１のものは、キナーゼ標的の活性部位と水素結合性相互作用パターンを形成する、ビス−インドールコアのラクタム窒素およびカルボニルおよび複素環式窒素からなるファルマコフォアである。第２のものは、ＧＳＫ−３βに対する６ＢＩＯの選択性決定基である６位での臭素置換である。本発明者らによって、６ＢＩＯとの複合体中のＧＳＫ−３βの結晶構造の詳細な分析が実施された。このように得られた情報に基づいて、本発明者らは、インディルビン骨格に化学修飾を実施するには３’位が重大であると考えた。したがって、本発明者らは、３’位に種々の置換を有する一連の６−ブロモ−インディルビンをデザインし、合成した。予想外なことに、これらの分子は、ＧＳＫ−３に対する高い効力、増強された選択性およびかなり増大した水溶性を示した。これらの分子を、いくつかの細胞系においてそのＧＳＫ−３阻害作用について評価した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Meijer, L; Skaltsounis, AL; Magiatis, P; Polychonopoulos, P; Knockaert, M; Leost, M; Ryan, XP; Vonica, CD; Brivanlou, A; Dajani, R; Tarricone, A; Musacchio, A; Roe, SM; Pearl, L, Greengard, P. GSK-3 selective inhibitors derived from Tyrian purple indirubins. Chem. & Biol. 2003, 10, 1255-1266.
【非特許文献２】Jope, R.S.; Johnson, G.V.W. The glamour and gloom of glycogen synthase kinase-3. Trends Biochem. Sci. 2004, 29, 95-102.
【非特許文献３】Ribas, J.; Bettayeb, K.; Ferandin, Y.; Garrofe-Ochoa, X.; Knockaert, M.; Totzke, F.; Schachtele, C.; Mester, J.; Polychronopoulos, P.; Magiatis, P.; Skaltsounis, A.L.; Boix, J.; Meijer, L.,. 7-bromoindirubin-3’-oxime induces caspase-independent cell death. Oncogene 2006, 25, 6304-6318.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明の目的は、ＧＳＫ−３に対して増強された選択性を有する新規３’，６−置換インディルビンを提供することである。
【０００７】
本発明の別の目的は、前記インディルビンを得る方法を提供することである。
【０００８】
さらに別の目的によれば、本発明は、有効成分として前記インディルビンを含有する医薬組成物および生物学的試薬ならびにこのような有効成分の使用を含むＧＳＫ−３調節解除と関連している病態を治療する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によるインディルビン誘導体は、次式(I)
【化１】
【００１０】
［式中、Ｒは、−（Ａ）ｎ−Ｒ１または−ＣＯ−Ｎ（Ｒ２，Ｒ３）を表し、
・Ａは、１個または数個のＡ１基によって置換されていてもよいＣ１〜Ｃ５アルキレン基であり、Ａ１は、ハロゲンＢｒ、ＯＨ、ＯＲ４またはＮＨ２であり、Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ５アルキルであり；
・Ｒ１は、ハロゲン、ＯＨ、Ｎ（Ｒ２，Ｒ３）であり；Ｒ２およびＲ３は、同一または異なり、上記で定義されるものなどのＡ１によって置換されていてもよいＣ１〜Ｃ５アルキルであるか、またはＲ２およびＲ３は、ＯもしくはＮなどの別のヘテロ原子を含んでいてもよい、５もしくは６個の環員を有する環の一部であり（すなわち、Ｒ２およびＲ３は、互いに一緒になって、ＯもしくはＮなどの別のヘテロ原子を含んでいてもよい、５もしくは６個の環員を有する環を形成し）、
・ｎ＝１〜５］
で表される。
【００１１】
本発明はまた、上記で定義される誘導体の薬学的に許容される塩に関する。これらの塩は、とりわけ、上記で開示されるインディルビンの塩化物、酢酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩を含む。
【００１２】
第１のファミリーでは、
・Ｒは、−（Ａ）ｎ−Ｒ１を表し、Ｒ１は、ハロゲン、ＯＨ、Ｎ（Ｒ２，Ｒ３）であり、Ｒ２およびＲ３は、同一または異なり、上記で定義されるものなどのＡ１によって置換されていてもよいＣ１〜Ｃ５アルキルである。
【００１３】
前記ファミリーの好ましい基では、Ｒ１は、ハロゲンまたはＯＨである。前記基の有利な誘導体では、Ａは、−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＨ（Ｒ１）−（ＣＨ２）ｍ２基を表し、ここで、ｍ１＝１〜３およびｍ２＝０、１〜３である。
【００１４】
前記ファミリーの別の好ましい基では、Ｒ１は、Ｎ（Ｒ２，Ｒ３）である。
【００１５】
第１の実施形態によれば、同一または異なっているＲ２およびＲ３は、上記で定義されるものなどのＡ１によって置換されていてもよいＣ１〜Ｃ５アルキルである。
【００１６】
第２の実施形態によれば、Ｒ２およびＲ３は、ピロール、モルホリニルまたはピペラジニル基の一部であり、前記基は、１個または数個のＡ１によって置換されていてもよく、ピペラジニル基は、Ｃ１〜Ｃ５アルキルによって位置の窒素で置換されていてもよく、Ｃ１〜Ｃ５アルキルは同様に、上記で定義されるものなどのＡ１によって置換されていてもよい。
【００１７】
前記基の有利な誘導体では、Ａは、Ｃ１〜Ｃ５アルキレン基である。
【００１８】
第２のファミリーでは、
・Ｒは、−ＣＯ−Ｎ（Ｒ２，Ｒ３）を表し、同一または異なっているＲ２およびＲ３は、Ｃ１〜Ｃ５アルキル基である。
【００１９】
本発明によれば、Ｒ１が−Ｎ（Ｒ２，Ｒ３）である、上記で定義されるインディルビン誘導体は、式(II)
【化２】
【００２０】
で表されるオキシム誘導体を、式(III)で表される適当なアミン
（Ａ２）ｎ−Ｎ（Ｒ２，Ｒ３）
(III)
［式中、Ａ２は、Ｃ１〜Ｃ５アルキルであり、Ｒ２およびＲ３は、上記で定義されるとおりである］
と反応させることによって有利に合成される。
【００２１】
適当なアミンは、ピロリジン、モルホリン、ピペラジン、Ｎ−メチルピペラジン、ヒドロキシエチルピペラジン、メトキシエチルピペラジン、ジメチルアミンおよびジエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ビス−２−ヒドロキシエチルアミン、Ｎ−２，３−ジヒドロキシプロピル−Ｎ−メチルアミンおよびＮ−２−ヒドロキシエトキシエチルピペラジンを含む。
【００２２】
式(II)のオキシム誘導体は、室温で、６ＢＩＯを、ＤＭＦ中、１，２−ジブロモエタンおよびトリエチルアミンＥｔ３Ｎと反応させることによって調製することが有利である。
【００２３】
さらに、ＲがＣＯ−Ｎ（Ｒ２，Ｒ３）基を表すカルバメート誘導体は、６ＢＩＯを、Ｎ，Ｎ−ジアルキルカルバモイルクロリドと反応させることによって調製する。Ａ１がＯＨである式Ｉのアルコール誘導体は、６ＢＩＯを、適当な１，２−ジブロモアルカンまたはブロモアルコールと反応させることによって調製する。インディルビンおよび６ＢＩＯは、これまでに報告されたように合成した（文献２）。
【００２４】
有利なことに、前記誘導体は、親６ＢＩＯ化合物よりも細胞傷害性が少なく、細胞モデルにおいて強力なＧＳＫ−３阻害活性を示した。したがって、本発明は、アルツハイマー病、糖尿病、心臓肥大などのＧＳＫ３調節解除と関連している病態を治療するための、胚幹細胞多能性維持または哺乳類における概日期間の変更の分野における、非常に注目される手段を提供する。
【００２５】
これらの結果は、薬理学的に好都合なインディルビンのデザインに向けた新規方向を開き、このような病態に対する開発を伴う。
【００２６】
したがって、本発明は、薬物として使用するための式(I)の新規誘導体に関する。
【００２７】
次いで、本発明はまた、治療上有効な量の、上記で定義されるものなどの式(I)の少なくとも１種の誘導体またはその薬学的に許容される塩を、薬学的に許容されるビヒクルと組合せて含む医薬組成物に関する。
【００２８】
薬物の製造の際に、治療上有効な量で使用される有効成分を、選択される投与様式のための薬学的に許容されるビヒクルと混合する。これらのビヒクルは固体または液体またはゲルであり得る。
【００２９】
薬物は、固体または液体またはゲルであり得る。
【００３０】
薬物は、好ましくは、静脈内経路によるが、経口または注射用経路筋肉内および皮下経路または鼻腔経路による投与に適した形態であり得る。
【００３１】
したがって、経口経路による投与のために、ゼラチンカプセル剤、錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤などの形態で医薬を調製できる。このような医薬は、単位あたり１０マイクログラム〜１ｇの有効成分を含み得る。
【００３２】
注射（ボーラスまたは灌流；静脈内の、皮下、腹腔内、くも膜下腔内、真皮内）による投与のためには、医薬は、滅菌または滅菌可能な溶液の形態で提供される。
【００３３】
それらは、エマルジョンまたは懸濁液の形態であり得る。
【００３４】
投与量単位あたりの用量は、例えば、１マイクログラム〜１ｇの有効成分で変動し得る。
【００３５】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の実施例に、図１〜３を参照して示される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】類似体１１（Ａ）および類似体１３（Ｂ）と、ＧＳＫ−３βの結合ポケットとの結合様式を示す図である。両類似体のピペラジン置換は、インディルビン骨格および受容体基幹(backbone)間に形成される水素結合（黄色破線）に加えて、ａｓｐ２００および結合ポケットのリン酸サブサイトに位置する残基と相互作用する。
【図２】インディルビン誘導体による、ＧＳＫ−３リン酸化部位でのβ−カテニンリン酸化の阻害を示す。Ａ．ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞を、一定の２μＭレベルのプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２の存在下で各インディルビン１０μＭに対して６時間曝露した。ＧＳＫ−３−リン酸化β−カテニンのレベルを、ＧＳＫ−３リン酸化β−カテニンと特異的に交差反応する抗体を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のウエスタンブロッティングによって推定した。シグナルがないことまたはシグナルの減少は、インディルビンが神経芽腫細胞内でＧＳＫ−３を阻害できていることを示す。Ｃ、コントロール（ＤＭＳＯ）；６Ｂ、６ＢＩＯ；Ｍ６Ｂ、メチル−６ＢＩＯ（６ＢＩＯのコントロール不活性類似体）；Ｋ、ケンパウロン、構造的に関連のないＧＳＫ−３阻害剤。Ｂ．インディルビンの選択のための用量反応曲線を、ＧＳＫ−３リン酸化β−カテニンに対する同一抗体を使用するＥＬＩＳＡアッセイにおいて実行した。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、ＭＧ１３２の存在下で、さまざまな濃度の各インディルビンに対して６時間曝露し、抽出物をＥＬＩＳＡアッセイにおいて評価した。活性は、未処理コントロール細胞におけるリン酸化β−カテニンのパーセンテージとして表した。
【図３】インディルビン誘導体による哺乳類線維芽細胞における概日期間の変化を示す。ＰＰｅｒ２：：Ｆｌｕｃリポーター構築物を用いて安定にトランスフェクトされたＲａｔ−１線維芽細胞は、時計制御Ｐｅｒ２プロモーター（ＰＰｅｒ２）活性の尺度として発光の頑強な日内周期を示す。細胞を１００％コンフルエンスにまで培養し、０．１μＭデキサメタゾンを用いて２時間処理し、オシレーターを同期化した。次いで、培地を、０．１ｍＭルシフェリンを補給したアッセイ培地と交換し、発光リズムを４日以上モニタリングした。培養ディッシュに、１０μＭで化合物を加え、引き続き残した。溶媒コントロールとしてＤＭＳＯを使用した。回帰分析を使用して、発光リズムの期間および相を調べた。Ａ．コントロール細胞（○）またはインディルビン１５で処理した細胞（●）において記録された通常の発光リズムの経時変化。白色矢印は、コントロール細胞における発光のピークを示し、黒色矢印は、インディルビン１５処理細胞における発光のピークを示す。Ｂ．種々の化合物に対して曝露された細胞において算出された周期長。Ｃ、コントロール；Ｋ、ケンパウロン。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
【実施例】
【００３８】
化学
一般的な化学試験手順
すべての化学薬品は、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から購入した。ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ＤＲＸ４００およびＢｒｕｋｅｒ ＡＣ２００分光計［１Ｈ（４００および２００ＭＨｚ）および１３Ｃ（５０ＭＨｚ）］で記録し；化学シフトは、ＴＭＳからのｐｐｍ低磁場で表されている。１Ｈ−１Ｈおよび１Ｈ−１３Ｃ ＮＭＲ実験は、標準Ｂｒｕｋｅｒマイクロプログラムを使用して実施した。融点は、Ｓａｎｙｏ Ｇａｌｌｅｎｃａｍｐ装置を用いて調べた。ＭＳスペクトルは、ＭＳＱ Ｔｈｅｒｍｏｆｉｎｎｉｇａｎ分光計で測定した。すべてのＵＶ／ｖｉｓスペクトルは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ−１６０Ａ分光光度計で記録した。
【００３９】
溶解度測定。媒液（水、再蒸留された）に過剰量の固体を加え、続いて、５分間超音波処理し、周囲温度（２５±０．１℃）で撹拌することによって１晩平衡化することにより、平衡溶解度を調べた。サンプルを遠心分離し、アリコートを回収した。各化合物の標準溶液を調製して、前記飽和溶液を定量し、各化合物の参照曲線をプロットした。５１５および５１８ｎｍの間で変わる波長でＵＶ／ｖｉｓ分光光度計を用いて、各飽和および標準溶液の吸光度を測定した。
【００４０】
結果を表１に示す。これは、インディルビン塩の水溶性および対応する塩基のｐＨ７．４での算出された物理化学的特性ｐＫａおよびｌｏｇＤを示す。
【表１】
【００４１】
エーテル１〜３の調製のための一般手順
Ａｒ下、ＤＭＦ（９０ｍｌ）中の６−ブロモインディルビン−３’−オキシム（１．０ｇ、２．８３ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（０．５ｍｌ）および適当な臭化物（２当量）を加え、混合物を室温で１７時間撹拌した。次いで、水（３００ｍｌ）を加え、形成された沈殿を濾過によって回収し、水で洗浄した。
【００４２】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（２−ブロモエチル）−オキシム］（１）のデータ。
【００４３】
収率：９５％。融点２５２℃。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ ｄ−６，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１１．６７（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１’），１０．９３（１ｈ，ｓ，Ｈ−１），８．４９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，Ｈ−４），８．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４５（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−６’，Ｈ−７’），７．１６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．３／２．０Ｈｚ，Ｈ−５），７．０７（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，Ｈ−７），４．９３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，Ｈ−１’’），３．９７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，Ｈ−２’’）。ＡＰＣＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ４６２，４６４，４６６（Ｍ＋Ｈ）＋。元素分析値（Ｃ１８Ｈ１３Ｎ３Ｏ２Ｂｒ２）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００４４】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−オキシム］（２）のデータ。収率：９６％。融点＞３００℃。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ、ＤＭＳＯ ｄ−６，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１１．７０（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−１’），１０．９０（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−１），８．５４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ｈ−４），８．１８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４４（２Ｈ，ｍ，Ｈ−７’，Ｈ−６’），７．１６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．４／１．９Ｈｚ，Ｈ−５），７．０５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，Ｈ−７），５．０２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，−ＯＨ），４．６２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，Ｈ−１’’），３．８９（２Ｈ，ｍ，Ｈ−２’’）。ＣＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ４００，４０２（Ｍ＋Ｈ）＋。元素分析値（Ｃ１８Ｈ１４Ｎ３Ｏ３Ｂｒ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００４５】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−オキシム］（３）のデータ。収率：９５％。融点＞３００℃。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ ｄ−６，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１１．７０（１Η，ｓ，Ｈ−１’），１０．９０（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１），８．５６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−４），８．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４４（２Ｈ，ｍ，Ｈ−６’，Ｈ−７’），７．１５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５，１．９Ｈｚ，Ｈ−５），７．０６（１Ｈ，ｍ，Ｈ−５’），７．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，Ｈ−７），５．１４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，−ＣＨＯＨ），４．８４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，−ＣＨ２ＯＨ），４．６５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．９，３．７Ｈｚ，Ｈ−１’’ａ），４．５０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．９，６．６Ｈｚ，Ｈ−１’’ｂ），３．９９（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２’’），３．５０（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３’’）。ＡＰＣＩ−ＭＳ（＋）ｍ／ｚ ４３０，４３２（Ｍ＋Ｈ）＋。元素分析値（Ｃ１９Ｈ１６Ｎ３Ｏ４Ｂｒ２）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００４６】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジエチルカルバモイル）−オキシム］（４）のデータ。
【００４７】
Ａｒ下、ＤＭＦ（１０ｍｌ）中の６−ブロモインディルビン−３’−オキシム（３６ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）溶液に、トリエチルアミン（０．５ｍｌ）および０．３ｍｌ（３．６６ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジエチルカルバモイルクロリドを加え、混合物を室温で１２時間撹拌した。次いで、水（４０ｍｌ）を加え、形成された沈殿を濾過によって回収し、水で洗浄すると、化合物（４）が定量的に得られた。収率：９０％。融点２３７℃。１Η−ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ピリシン ｄ−５，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１２．３６（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１’），１２．１５（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１），９．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ｈ−４），８．１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｈ−４’），７．６１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．６／１．９Ｈｚ，Ｈ−５），７．４３（１Ｈ，ｍ，Ｈ−６’），７．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，Ｈ−７’），７．１４ − ７．０６（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，Ｈ−７），３．４４（４Ｈ，ｂｒｓ，−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），１．１８（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２）。ＡＰＣＩ−ＭＳ（＋）ｍ／ｚ ４５５，４５７（Ｍ＋Ｈ）＋。元素分析値（Ｃ２１Ｈ１９Ｎ４Ｏ３Ｂｒ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【化３】
【００４８】
試薬など：(i)ジブロモエタン、トリエチルアミン、無水ＤＭＦ、２５℃、(ii)２−ブロモエタノール、トリエチルアミン、無水ＤＭＦ、２５℃、(iii)３−ブロモ−１，２−プロパンジオール、トリエチルアミン、無水ＤＭＦ、２５℃、(iv) Ｎ，Ｎ−ジエチルカルバモイルクロリド、トリエチルアミン、無水ＤＭＦ、２５℃、(v)無水ＤＭＦ、２５℃、アミンａ〜ｋ。
【００４９】
アミン５〜１５の調製のための一般手順。
【００５０】
１００ｍｇの６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（２’’−ブロモエチル）−オキシム］（１）を、５ｍｌの無水ＤＭＦに溶解した。磁気撹拌下、過剰の適当なアミンを加え、次いで、混合物を５０℃に加熱した。反応が完了した後、混合物を水（３０ｍｌ）中に注ぎ入れ、沈殿を濾過し、水およびシクロヘキサンで洗浄した。ジメチルアミン、ジエチルアミン、ピロリジン、モルホリン、ジエタノールアミン、３−メチルアミン−１，２−プロパンジオール、ピペラジン、１−メチルピペラジン、１−（２−メトキシエチル）ピペラジン、１−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジンおよび１−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）−エチル］ピペラジンによって、それに応じた生成物（５）〜（１５）が、定性的な収率で得られた。
【００５１】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（２−ジメチルアミノエチル）−オキシム］（５）のデータ。融点２３０℃。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ ｄ−６，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１１．７１（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−１’），１０．９２（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−１），８．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−４），８．１４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，Ｈ−６’，Ｈ−７’），７．１５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５／２．０Ｈｚ，Ｈ−５），７．０５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，Ｈ−７），４．６９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，Ｈ−１’’），２．８０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，Ｈ−２’’），２．２７（６Ｈ，ｓ，−Ｎ（ＣＨ３）２）。ＡＰＣＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ４２７，４２９（Ｍ＋Ｈ）＋。元素分析値（Ｃ２０Ｈ１９Ｎ４Ｏ２Ｂｒ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００５２】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）−オキシム］（６）のデータ。融点２３２℃。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ ｄ−６，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１１．７１（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１’），１０．９２（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１），８．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，Ｈ−４），８．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，Ｈ−６’，Ｈ−７’），７．１３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２／２．１Ｈｚ，Ｈ−５），７．０９ − ７．０２（２Ｈ，ｍ，Ｈ−７，Ｈ−５’），４．６５（２Ｈ，ｔ，Ｊ ＝６．０Ｈｚ，Ｈ−１’’），２．９４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ｈ−２’’），２．５８（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），０．９８（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２）。ＡＰＣＩ−ＭＳ（＋）ｍ／ｚ ４５５，４５７（Ｍ＋Ｈ）＋。元素分析値（Ｃ２２Ｈ２３Ｎ４Ｏ２Ｂｒ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００５３】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（２−ピロリジン−１−イルエチル）オキシム］（７）のデータ。融点２０８℃。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ ｄ−６，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１１．７０（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１’），１０．９３（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１），８．５４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−４），８．１４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−６’，Ｈ−７’），７．１４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５／１．９Ｈｚ，Ｈ−５），７．０５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，Ｈ−７），４．７０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，Ｈ−１’’），２．９８（２Ｈ，ｂｒｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，Ｈ−２’’），２．５７（４Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−３’’，Ｈ−６’’），１．６９（４Ｈ，ｍ，Ｈ−４’’，Ｈ−５’’）。ＡＰＣＩ−ＭＳ（＋）ｍ／ｚ ４５３，４５５（Ｍ＋Ｈ）＋。元素分析値（Ｃ２２Ｈ２１Ｎ４Ｏ２Ｂｒ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００５４】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（２−モルホリン−１−イルエチル）オキシム］（８）のデータ。融点２３５℃。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ ｄ−６，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１１．７０（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１’），１０．９０（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１），８．５２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−４），８．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４３（２Ｈ，ｍ，Ｈ−６’，Ｈ−７’），７．１４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５／１．９Ｈｚ，Ｈ−５），７．０５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−５’），７．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，Ｈ−７），４．７０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，Ｈ−１’’），３．５７（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，Ｈ−４’’，Ｈ−５’’），２．８６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，Ｈ−２’’），２．５０（４Ｈ，ｍ，Ｈ−３’’，Ｈ−６’’，ＤＭＳＯと重複）。ＡＰＣＩ−ＭＳ（＋）ｍ／ｚ ４６９，４７１（Ｍ＋Ｈ）＋。元素分析値（Ｃ２２Ｈ２１Ｎ４Ｏ３Ｂｒ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００５５】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（２−（Ｎ，Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アミノエチル）オキシム）（９）のデータ。融点２０１℃。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ピリシン ｄ−５，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１２．３１（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−１’），１２．２５（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−１），８．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，Ｈ−４），８．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．８Ｈｚ，Ｈ−５），７．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ｈ−７），７．３４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｈ−６’），７．０４（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，Ｈ−７’），５．８９（１Ｈ，ｂｒｓ，−ＯＨ），４．８６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，Ｈ−１’’），４．００（４Ｈ，ｍ，−−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）２），３．３８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，Ｈ−２’’），３．０８（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，−−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）２）。ＡＰＣＩ−ＭＳ（＋） ｍ／ｚ ４８７，４８９（Ｍ＋Ｈ）＋。元素分析値（Ｃ２２Ｈ２３Ｎ４Ｏ４Ｂｒ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００５６】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−（Ｏ−｛２−［Ｎ−メチル、Ｎ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）アミノ］エチル｝オキシム］（１０）のデータ。融点１９５℃。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ピリジン ｄ−５，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１２．２７（２Ｈ，ｍ，Ｈ−１，Ｈ−１’），８．９０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，Ｈ−４），８．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８，１．８Ｈｚ，Ｈ−５），７．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ｈ−７’），７．３６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｈ−６’），７．０５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，Ｈ−７），４．８０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，Ｈ−１’’），４．２９（１Ｈ，ｍ，Ｈ−４’’），４．１１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．０，４．６Ｈｚ，Ｈ−５’’ａ），４．０４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．０，５．５Ｈｚ，Ｈ−５’’ｂ），３．１４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，Ｈ−２’’），２．９３（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３’’），２．４９（３Ｈ，ｓ，−ＮＣＨ３）。ＣＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ４８７，４８９（Ｍ＋Ｈ）＋。元素分析値（Ｃ２２Ｈ２３Ｎ４Ｏ４Ｂｒ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００５７】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（２−ピペラジン−１−イルエチル）オキシム］（１１）のデータ。融点２５５℃（ｄｅｃ．）１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ、ＤＭＳＯ ｄ−６，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１１．６９（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１’），１０．９２（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１），８．５３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−４），８．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４３（２Ｈ，ｍ，Ｈ−６’，Ｈ−７’），７．１４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−５），７．０３（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，Ｈ−７），４．６９（２Ｈ，ｂｒ ｔ，Ｈ−１’’），２．８３（２Ｈ，ｂｒ ｔ，Ｈ−２’’），２．７１（４Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−４’’，Ｈ−５’’），２．４６（４Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−３’’，Ｈ−６’’，ＤＭＳＯと部分的に重複）。ＡＰＣＩ−ＭＳ（＋）ｍ／ｚ ４６８，４７０（Ｍ＋Ｈ）＋。元素分析値（Ｃ２２Ｈ２２Ｎ５Ｏ２Ｂｒ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００５８】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−｛Ｏ−［２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エチル］オキシム｝（１２）のデータ。融点２２２℃。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ ｄ−６，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１１．６８（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１’），１０．９０（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１），８．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−４），８．１４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４２（２Ｈ，ｍ，Ｈ−６’，Ｈ−７’），７．１３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５／１．９Ｈｚ，Ｈ−５），７．０４（１Ｈ，ｍ，Ｈ−５’），７．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，Ｈ−７），４．６８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，Ｈ−１’’），２．８５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，Ｈ−２’’），２．５０（４Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−３’’，Ｈ−６’’，ＤＭＳＯと重複），２．３１（４Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−４’’，Ｈ−５’’），２．１３（３Ｈ，ｓ，−ＮＣＨ３）。ＡＰＣＩ−ＭＳ（＋）ｍ／ｚ ４８２，４８４（Ｍ＋Ｈ）＋。元素分析値（Ｃ２３Ｈ２４Ｎ５Ｏ２Ｂｒ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００５９】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−（Ｏ−｛２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エチル｝オキシム）（１３）のデータ。融点１８７℃。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ ｄ−６，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）８．５２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−４），８．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４３（２Ｈ，ｍ，Ｈ−６’，Ｈ−７’），７．１３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５／１．８Ｈｚ，Ｈ−５），７．０５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−５’），７．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ｈ−７），４．６９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，Ｈ−１’’），３．４５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，Ｈ−８’’），２．８５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，Ｈ−２’’），２．５０（４Ｈ，Ｈ−３’’，Ｈ−６’’，ＤＭＳＯと重複），２．４２（４Ｈ，Ｈ−４’’，Ｈ−５’’），２．３４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，Ｈ−７’’）。ＡＰＣＩ−ＭＳ（＋）ｍ／ｚ ５１２，５１４（Ｍ＋Ｈ）＋。元素分析値（Ｃ２４Ｈ２６Ｎ５Ｏ３Ｂｒ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００６０】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−（Ｏ−｛２−［４−（２−メトキシエチル）ピペラジン−１−イル］エチル｝オキシム）（１４）のデータ。融点１８４℃。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ ｄ−６，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１１．７０（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１’），１０．９０（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１），８．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−４），８．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４４（２Ｈ，ｍ，Ｈ−６’，Ｈ−７’），７．１５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５，１．７Ｈｚ，Ｈ−５），７．０７（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，Ｈ−７），４．７０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，Ｈ−１’’），３．４０（２Ｈ，Ｈ−８’’，水と重複），３．２１（３Ｈ，ｓ，−ＯＣＨ３），２．８７（２Ｈ，ｂｒｔ，Ｈ−２’’），２．６６−２．４０（Ｈ−４’’，Ｈ−５’’，Ｈ−３’’，Ｈ−６’’，Η−７’’，ＤＭＳＯと重複）。ＡＰＣＩ−ＭＳ（＋）ｍ／ｚ ５２６，５２８（Ｍ＋Ｈ）＋。元素分析値（Ｃ２５Ｈ２８Ｎ５Ｏ３Ｂｒ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００６１】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（２−｛４−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）−エチル］ピペラジン−１−イル｝エチル）オキシム］（１５）のデータ。融点１８３℃。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ピリジン ｄ−５，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１２．３１（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１’），１２．２５（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１），８．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，Ｈ−４），８．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４５ − ７．３３（３Ｈ，ｍ，Ｈ−５，Ｈ−７’，Ｈ−６’），７．０９（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，Ｈ−７），４．７８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，Ｈ−１’’），３．９６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，Ｈ−１０’’），３．７０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，Ｈ−９’’），３．６６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，Ｈ−８’’），２．９４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，Ｈ−２’’），２．６８（２Ｈ，ｂｒｓ，Η−３’’，Ｈ−６’’），２．５７（８Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，Ｈ−４’’，Ｈ−５’’，Η−７’’）。ＡＰＣＩ−ＭＳ（＋）ｍ／ｚ ５５６，５５８（Ｍ＋Ｈ）＋。元素分析値（Ｃ２６Ｈ３０Ｎ５Ｏ４Ｂｒ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００６２】
アミン塩１６〜２６の調製のための一般手順。
【００６３】
適当なインディルビン誘導体５〜１５（０．１０ｍｍｏｌ）を、無水ＴＨＦ（５０ｍｌ）に溶解し、エーテル中塩酸の飽和溶液０．２ｍｌを滴加した。反応混合物を氷浴中で冷却させ、形成された沈殿を濾過によって回収した。
【００６４】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（２−ジメチルアミノエチル）オキシム］ヒドロクロリド（１６）のデータ。Ｓｗ（ｇ／ｌ）０．１４１．１Η−ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ ｄ−６，δ ｐｐｍ Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１１．７０（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１’），１０．９７（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１），８．４９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，Ｈ−４），８．２２（１Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４６（２Ｈ，ｍ，Ｈ−７，Ｈ−６’），７．２０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．３／１．７Ｈｚ，Ｈ−５），７．０５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，Ｈ−７’），４．９５（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−１’’），３．５８（２Ｈ，ｍ，Ｈ−２’’），２．８１（６Ｈ，ｂｒｓ，−Ｎ（ＣＨ３）２）。分析値（Ｃ２０Ｈ２０Ｎ４Ｏ２ＢｒＣｌ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００６５】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）オキシム］ヒドロクロリド（１７）のデータ。Ｓｗ（ｇ／ｌ）０．１９２。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ ｄ−６，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１１．７０（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１’），１０．９８（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１），８．４９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ｈ−４），８．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４７（２Ｈ，ｍ，Ｈ−７，Ｈ−６’），７．２１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．６／１．９Ｈｚ，Ｈ−５），７．０９ − ７．０４（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，Ｈ−７’），５．００（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−１’’），３．５８（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−２’’），３．２４（４Ｈ，ｂｒｓ，−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），１．２１（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２）。分析値（Ｃ２２Ｈ２４Ｎ４Ｏ２ＢｒＣｌ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００６６】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（２−ピロリジン−１−イルエチル）オキシム］ヒドロクロリド（１８）のデータ。Ｓｗ（ｇ／ｌ）０．１９５。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ ｄ−６，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１１．７１（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１’），１０．９７（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１），８．４８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ｈ−４），８．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４４ − ７．５２（２Ｈ，ｍ，Ｈ−７，Ｈ−６’），７．２０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．６／１．９Ｈｚ，Ｈ−５），７．０７（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，Ｈ−７’），４．９４（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−１’’），３．６４（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−２’’），３．１３（４Ｈ，ｍ，Η−３’’，Η−６’’），２．０２（４Ｈ，ｍ，Ｈ−４’’，Ｈ−５’’）。元素分析値（Ｃ２２Ｈ２２Ｎ４Ｏ２ＢｒＣｌ）Ｃ，Ｈ，Ｎ．
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（２−モルホリン−１−イルエチル）オキシム］ヒドロクロリド（１９）のデータ。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ ｄ−６，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１１．６９（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１’），１０．９８（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１），８．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−４），８．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−７，Ｈ−６’），７．２１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．３，１．８Ｈｚ，Ｈ−５），７．０６（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，Ｈ−７’），５．０５（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−１’’），３．９５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−２’’），３．７５（４Ｈ，ｍ，Ｈ−４’’，Ｈ−５’’），３．２７（４Ｈ，Ｈ−３’’，Ｈ−６’’，水と重複）。元素分析値（Ｃ２２Ｈ２２Ｎ４Ｏ３ＢｒＣｌ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００６７】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（２−（Ｎ，Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アミノエチル）オキシム）ヒドロクロリド（２０）のデータ。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ ｄ−６，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１１．７１（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１’），１０．９８（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１），８．４８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，Ｈ−４），８．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４６（２Ｈ，ｍ，Ｈ−７，Ｈ−６’），７．２１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．３／１．８Ｈｚ，Ｈ−５），７．０６（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，Ｈ−７’），５．３５（２Ｈ，ｂｒｓ，ＯＨ），５．０３（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−１’’），３．８４（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−２’’），３．７８（４Ｈ，ｂｒｓ，−−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）２），３．３８（４Ｈ，ｍ，−−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）２，水と重複）。分析値（Ｃ２２Ｈ２４Ｎ４Ｏ４ＢｒＣｌ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００６８】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−（Ｏ−｛２−［Ｎ−メチル、Ｎ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）アミノ］エチル｝オキシム）ヒドロクロリド（２１）のデータ。Ｓｗ（ｇ／ｌ）１．４５。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ ｄ−６，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）１１．６９（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１’），１０．９６（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１），８．４８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−４），８．２０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，Ｈ−４’），７．４（２Ｈ，ｍ，Ｈ−７，Ｈ−６’），７．１９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５／１．８Ｈｚ，Ｈ−５），７．０５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，Ｈ−７’），４．９５（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−１’’），３．８９（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−４’’），３．３８（４Ｈ，Ｈ−３’’，Ｈ−５’’，水と重複），２．８３（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−３’’），２．５０（３Ｈ，−Ｎ（ＣＨ３），ＤＭＳＯと重複）。元素分析値（Ｃ２２Ｈ２４Ｎ４Ｏ４ＢｒＣｌ）Ｃ，Ｈ，Ｎ．
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（２−ピペラジン−１−イルエチル）オキシム］ジヒドロクロリド（２２）のデータ． Ｓｗ（ｇ／ｌ）１．６１。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）７．６５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−４），７．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５，Ｈ−４’），７．２６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｈ−６’），６．８５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｈ−５’），６．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−５），６．７２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｈ−７’），６．５４（１Ｈ，ｓ，Ｈ−７），４．４２（２Ｈ，ｂｒｔ，Ｈ−１’’），３．３８（４Ｈ，ｂｒｔ，Ｈ−４’’，Ｈ−５’’），３．１１（６Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−３’’，Ｈ−６’’，Ｈ−２’’）。元素分析値（Ｃ２２Ｈ２４Ｎ５Ｏ２ＢｒＣｌ２）Ｃ，Ｈ，Ｎ．
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−｛Ｏ−［２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エチル］オキシム｝ジヒドロクロリド（２３）のデータ。Ｓｗ（ｇ／ｌ）１．５０。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）７．６３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，Ｈ−４），７．５３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５，Ｈ−４’），７．２５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｈ−６’），６．８４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｈ−５’），６．７５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，Ｈ−５），６．７０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｈ−７’），６．５３（１Ｈ，ｓ，Ｈ−７），４．３９（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−１’’），３．３９（４Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−３’’，Ｈ−６’’），３．１１（６Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−２’’，Ｈ−４’’，Ｈ−５’’），２．９０（３Ｈ，ｓ，−ＮＣＨ３）。元素分析値（Ｃ２３Ｈ２６Ｎ５Ｏ２ＢｒＣｌ２）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００６９】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−（Ｏ−｛２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エチル｝オキシム）ジヒドロクロリド（２４）のデータ。Ｓｗ（ｇ／ｌ）１．１４。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）７．６８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−４），７．５６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４，Ｈ−４’），７．２７（１Ｈ，ｂｒｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｈ−６’），６．８５（１Ｈ，ｂｒｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｈ−５’），６．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−５），６．７３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，Ｈ−７’），６．５７（１Ｈ，ｓ，Ｈ−７），４．４２（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−１’’），３．８９（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−８’’），３．３９（４Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−３’’，Ｈ−６’’），３．２６（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−７’’），３．１２（６Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−２’’，Ｈ−４’’，Ｈ−５’’）。元素分析値（Ｃ２４Ｈ２８Ｎ５Ｏ３ＢｒＣｌ２）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００７０】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−（Ｏ−｛２−［４−（２−メトキシエチル）ピペラジン−１−イル］エチル｝オキシム）ジヒドロクロリド（２５）のデータ。Ｓｗ（ｇ／ｌ）０．５７。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）７．７０（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−４），７．６１（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−４’），７．２８（１Ｈ，ｂｒｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｈ−６’），６．８８（１Ｈ，ｂｒｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｈ−５’），６．７７（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−５，Ｈ−７’），６．５８（１Ｈ，ｓ，Ｈ−７），４．５２（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−１’’），３．７４（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−８’’），３．５５−３．２２（１２Ｈ，Ｈ−２’’，Ｈ−３’’，Ｈ−４’’，Ｈ−５’’，Ｈ−６’’，Ｈ−７’’），３．３５（３Ｈ，ｓ，−ＯＣＨ３）。Ａｎａｌ．（Ｃ２５Ｈ３０Ｎ５Ｏ３ＢｒＣｌ２）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００７１】
（２’Ｚ−３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−［Ｏ−（２−｛４−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）−エチル］ピペラジン−１−イル｝エチル）オキシム］ジヒドロクロリド（２６）のデータ． Ｓｗ（ｇ／ｌ）４．２５３。１Η ΝΜＲ（４００ ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，δ ｐｐｍ，Ｊ ｉｎ Ｈｚ）７．５４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，Ｈ−４），７．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｈ−４’），７．２１（１Ｈ，ｂｒｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｈ−６’），６．７８（１Ｈ，ｂｒｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｈ−５’），６．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｈ−７’），６．６１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，Ｈ−５），６．３４（１Ｈ，ｓ，Ｈ−７），４．２８（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−１’’），３．８２，３．７２，３．６３，（６Ｈ，Ｈ−８’’，Ｈ−９’’，Ｈ−１０’’），３．４６−２．７２（１２Ｈ，Ｈ−２’’，Ｈ−３’’，Ｈ−４’’，Ｈ−５’’，Ｈ−６’’，Ｈ−７’’）。元素分析値（Ｃ２６Ｈ３２Ｎ５Ｏ４ＢｒＣｌ２）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【００７２】
アミンａは化合物(5)(16)に、ｂは(6)(17)に、ｃは(7)(18)に、ｄは(8)(19)に、ｅは(11)(22)に、ｆは(12)(23)に、ｇは(15)(26)に、ｈは(10)(21)に、ｉは(9)(20)に、ｊは(13)(24)に、ｋは(14)(25)にそれぞれ対応する。
【００７３】
生物学
キナーゼ調製およびアッセイ
キナーゼ活性を、バッファーＡ（１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、５０μｇヘパリン／ｍｌ）またはＣ（ホモジネーションバッファーであるが、５ｍＭ ＥＧＴＡを含み、ＮａＦを含まず、プロテアーゼ阻害剤を含まない）中、３０℃、最終ＡＴＰ濃度１５μＭでアッセイした。ブランク値を差し引き、活性を、３０分のインキュベーションの間に組み込まれたリン酸のｐｍｏｌｅとして算出した。活性は、最大活性の（すなわち、阻害剤の不在下での）％で表した。コントロールは、ジメチルスルホキシドの適当な希釈を用いて実施した。基質のリン酸化は、Ｐ８１ホスホセルロースアッセイによって評価した。
【００７４】
ＣＤＫ１／サイクリンＢは、先に記載されるように（文献４）、Ｍ期ヒトデ（Ｍａｒｔｈａｓｔｅｒｉａｓ ｇｌａｃｉａｌｉｓ）卵母細胞から、ホモジネーション バッファー（６０ｍＭ β−グリセロホスフェート、１５ｍＭ ｐ−ニトロフェニルホスフェート、２５ｍＭ Ｍｏｐｓ（ｐＨ７．２）、１５ｍＭ ＥＧＴＡ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ バナジウム酸ナトリウム、１ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ フェニルホスフェート、１０μｇロイペプチン／ｍｌ、１０μｇアプロチニン／ｍｌ、１０μｇ 大豆トリプシンインヒビター／ｍｌおよび１００μＭ ベンズアミジン）で抽出し、ｐ９ＣＫＳｈｓ１−セファロースビーズでのアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、それから、遊離ｐ９ＣＫＳｈｓ１によって溶出した。キナーゼ活性は、最終容量３０μｌで、１５μＭ［γ−３３Ｐ］ＡＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；１０ｍＣｉ／ｍｌ）の存在下、１ｍｇヒストンＨ１／ｍｌを含むバッファーＣにおいてアッセイした。３０℃で３０分インキュベートした後、上清の２５μｌのアリコートを、Ｗｈａｔｍａｎ Ｐ８１ホスホセルロースペーパーの２．５×３ｃｍ片にスポッティングし、２０秒後、フィルターを、１０ｍｌリン酸／水１リットルの溶液中で５回洗浄した（各回少なくとも５分間）。湿ったフィルターを、１ｍｌのＡＣＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）シンチレーション液の存在下でカウントした。
【００７５】
ＣＤＫ５／ｐ２５を、等量の組換えヒトＣＤＫ５およびＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）融合タンパク質として大腸菌で発現されたｐ２５を混合することによって再構成し、グルタチオン−アガロースでのアフィニティークロマトグラフィーによって精製した（ｐ２５は、ｐ３５、３５ｋＤａのＣＤＫ５アクチベーターの末端切断型である）。その活性は、ＣＤＫ１／サイクリンＢについて記載されるようにバッファーＣにおいてヒストンＨ１を用いてアッセイした。
【００７６】
ＧＳＫ−３α／βは、固定化アキシンでのアフィニティークロマトグラフィーによってブタ脳から精製した（文献５）。最終容量３０μｌで、１５μＭ［γ−３３Ｐ］ＡＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；１０ｍＣｉ／ｍｌ）の存在下、バッファーＡ中、４μＭのＧＳ−１（ＹＲＲＡＡＶＰＰＳＰＳＬＳＲＨＳＳＰＨＱＳｐＥＤＥＥＥ）、Ｍｉｌｌｅｇｅｎ（Ｌａｂｅｇｅ、Ｆｒａｎｃｅ）から入手したＧＳＫ−３特異的基質を含む、１ｍｇ ＢＳＡ／ｍｌの１０ｍＭ ＤＴＴで１／１００希釈した後アッセイした。３０℃で３０分間インキュベートした後、２５μｌの上清のアリコートを上記のように処理した。
【００７７】
細胞アッセイ
細胞培養条件および細胞生存評価
ＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞株を、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｅｒｇｙ Ｐｏｎｔｏｉｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）およびＬｏｎｚａから得た抗生物質（ペニシリン−ストレプトマイシン）および１０％容量のウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補給したＤＭＥＭで、５％ ＣＯ２を用いて３７℃で増殖させた。薬物処理は、指数増殖期培養物で、示された時間および濃度で実施した。コントロール実験はまた、ＤＭＳＯの適当な希釈物を使用して実施した。細胞生存力は、これまでに記載されるように（文献６）、処理の４８時間後にＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム）法によって決定した。
【００７８】
ＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞におけるβ−カテニンリン酸化
ほぼコンフルエントのＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞を、ＤＭＥＭ（１０％ ＦＣＳおよび抗生物質を補給した）中、９６プレートで増殖させた。細胞を、試験される化合物および２μＭ ＭＧ１３２を用いて６時間同時処理した（リン酸化β−カテニンを蓄積させた）。最終ＤＭＳＯ濃度は、１％を越えなかった。次いで、細胞を、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手したＳｅｒ３３／Ｓｅｒ３７／Ｔｈｒ４１−リン酸化（１：１０００）β−カテニンに対する抗体を使用するＥＬＩＳＡアッセイに付した。結果は、最大β−カテニンリン酸化の、すなわち、陽性コントロール（１００％リン酸化）としてＭＧ１３２のみに曝露された未処理細胞におけるパーセンテージで表されている。
【００７９】
細胞培養および日内周期性の発光アッセイ
これらの実験では、時計制御Ｐｅｒ２プロモーター（ＰＰｅｒ２）活性の尺度として、発光の頑強な日内周期を示す、ＰＰｅｒ２：：Ｆｌｕｃリポーター構築物を用いて安定にトランスフェクトされたＲａｔ−１線維芽細胞を使用した（文献７）。細胞を、５％ ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で、５％ ＦＢＳ、５０ユニット／ｍｌペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補給したＤＭＥＭ（１１９６５−０９２、ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。約５×１０５個細胞を、実験の少なくとも５日前に３５ｍｍディッシュに播種した。３日後、細胞は１００％コンフルエンスに達し、細胞を０．１μＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）で１時間処理し、集団中の細胞間でオシレーターを同期化した。処理の最後に、培地を、アッセイ培地［フェノールレッドを含まない、重炭酸（３５０ｍｇ／Ｌ）、５％ ＦＢＳ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、抗生物質（２５ユニット／ｍｌペニシリン、２５μｇ／ｍｌストレプトマイシン）および０．１ｍＭ ルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を補給したＤＭＥＭ］と交換した。培養ディッシュを、４０ｍｍ顕微鏡ガラスカバースリップおよび高真空グリースで密閉して、培養培地の蒸発を防いだ。ＬｕｍｉＣｙｃｌｅ（Ａｃｔｉｍｅｔｒｉｃｓ Ｉｎｃ．、Ｅｖａｎｓｔｏｎ、ＩＬ、ＵＳＡ）において発光リズムをモニタリングした。密閉される前に、培養ディッシュに薬物を種々の終濃度に加え、その後、細胞とともに引き続き残し、その間に、発光パターンを５日間以上記録した。溶媒コントロールとしてＤＭＳＯを使用した。発光リズムの期間および相を調べるために、Ｃｈｒｏｎｏ ＩＩプログラムを用いて回帰分析を実施した。
【００８０】
電気泳動およびウエスタンブロッティング
細胞を４℃でホモジネーションバッファーに３０分間再懸濁し、溶解し、超音波処理した。遠心分離（４℃で、１４０００ｒ．ｐ．ｍ．１５分間）した後、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって上清中のタンパク質濃度を調べた。５分間熱変性させた後、タンパク質を、ＭＯＰＳ ＳＤＳランニングバッファーを用い、１０％ ＮｕＰＡＧＥ ｐｒｅ−ｃａｓｔ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ａｃｅｔａｔｅ ポリアクリルアミドミニゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって分離した。タンパク質を０．４５μｍのニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）にトランスファーした。これらをＴｒｉｓ緩衝生理食塩水−Ｔｗｅｅｎ−２０中、５％低脂肪乳を用いてブロッキングし、Ｓｅｒ３３／Ｓｅｒ３７／Ｔｈｒ４１−リン酸化β−カテニン（１：１０００）に対する抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともに４℃で１晩インキュベートし、Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって分析した。
【００８１】
結果
６ＢＩＯ誘導体の細胞毒性
３種のプロテインキナーゼに対する、およびヒト神経芽腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の生存に対するインディルビン１〜２６の効果が、表２〜表４に示されている。インディルビンは、実験の節に記載されるように、ＧＳＫ−３α／β、ＣＤＫ１／サイクリンＢ、ＣＤＫ５／ｐ２５に対して種々の濃度で試験した。用量反応曲線から算出されたＩＣ５０値は、μＭで報告されている。化合物は、ＭＴＳ還元アッセイを使用して推定される４８時間インキュベーションした後のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞生存に対するその効果について種々の濃度で試験した。用量反応曲線から算出されるＩＣ５０値は、μＭで報告されている。
【化４】
【表２】
【表３】
【表４】
【００８２】
本発明のインディルビン誘導体を、ＭＴＳ還元アッセイを使用してＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞の生存に対するその効果について調べた。これらのアッセイは、ＧＳＫ−３に対する効力の増大は、細胞死の増強と関連しないということを示した（表１）。類似体１３、１４および１５（およびその対応する塩２４、２５、２６）は、細胞死誘導活性をほとんど有さなかった。６ＢＩＯのＩＣ５０、９μＭと比較するためのＩＣ５０値は、それぞれ、２８μＭ、＞１００μＭ、９４μＭ（塩：１７μＭ、＞１００μＭ、９８μＭ）であった。したがって、置換ピペラジン環拡張は、ＧＳＫ−３に対する選択性および有効性に有利に働き、良好な溶解度を可能にするだけでなく、その細胞毒性も低減する。これらの特徴は、細胞系におけるＧＳＫ−３の研究におけるこれらの化合物の使用にとって、また、神経変性性疾患および糖尿病との関連で、可能性ある治療リード化合物として特に好都合である。
【００８３】
インディルビンによるＧＳＫ−３の細胞内阻害の確認
新規インディルビンが、細胞状況におけるＧＳＫ−３の阻害で有効であるかどうかを調べるために、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞においてＧＳＫ−３特異的部位でのβ−カテニンのリン酸化に対するその効果を測定した。細胞を、一定レベルのＭＧ１３２（ＧＳＫ−３によってリン酸化されるとすぐのβ−カテニンの迅速な分解を防いだ、プロテアソームの阻害剤）の存在下で、１０μＭの各インディルビンの種々の濃度に曝露した。ＧＳＫ−３によってリン酸化されたもののレベルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のウエスタンブロッティング（ＧＳＫ−３部位でリン酸化された場合にβ−カテニンと特異的に交差反応する抗体を用いる）によって（図２ａ）、またはＥＬＩＳＡアッセイによって（図２ｂ）推定した。結果は、β−カテニン上のＧＳＫ−３選択的リン酸化部位の用量依存性阻害を示し、これは、これらの化合物は、細胞においてＧＳＫ−３を実際に阻害できることを実証した。最も効果的な化合物は、６ＢＩＯ、３、５、９、１１、１２および１３（および利用可能である場合にはその塩、すなわち、１６、２０、２２、２３、２４）であった。用量反応曲線は、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて得られた（図２ｂ）。キナーゼ不活性誘導体１−メチル−６ＢＩＯは、細胞アッセイでは効果がなかった。
【００８４】
哺乳類細胞培養における日内周期に対する効果
ＧＳＫ−３は、日内周期（日周体内時計としても知られる）の重要なレギュレーターである。日内周期は、非神経系、末梢組織における概日時計の優れたモデル系である細胞系において部分的に再現できる。この系を使用して、ＧＳＫ−３阻害が日内周期に影響を及ぼし得る可能性を探った。ＰＰｅｒ２：：Ｆｌｕｃリポーター構築物を用いて安定にトランスフェクトされたＲａｔ−１線維芽細胞は、時計制御Ｐｅｒ２プロモーター（ＰＰｅｒ２）の尺度として発光の頑強な日内周期を示す。実験の節に記載されるように、細胞を培養し、まず、１０μＭインディルビン１５を用いて処理し、そのＰｅｒ発現依存性発光の日内周期を４日間モニタリングした。周期長の段階的な短縮が明確に観察された（図３ａ）。次いで、図３ａにおけるように、同様の実験を、小規模に選んだインディルビンを用いて実施し、周期長を算出した。周期長の短縮において最も有効な化合物（図３ｂ）はまた、細胞アッセイにおけるβ−カテニンリン酸化の阻害においても最も有効であり（図２）、このことは、概日期間の短縮におけるインディルビンの作用は、ＧＳＫ−３に対するものであるという仮説を支持する。これまでの研究は、薬理学的ツールとしてリチウムを使用する、哺乳類細胞の日内周期の調節におけるＧＳＫ−３の重要な作用を支持した。リチウムは、日内周期の期間を延長するのに対し、インディルビンは、期間を短縮する（図５）。しかし、日内周期のこれまでの研究において使用されたリチウムおよびＧＳＫ−３の濃度は、１０〜２０ｍＭであったのに対し、インディルビンを用いた結果は、１０００倍低い濃度（１０μＭ）を用いて得られた。これらの比較は、リチウムの概日期間延長効果は、リチウムの副作用によるものであり得るということを示唆する。したがって、インディルビンは、日内周期の調節におけるＧＳＫ−３の役割を調べるための有用な薬理学的ツールとなると思われる。
【００８５】
本発明者らは、疾患関連グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３のＡＴＰ結合部位でのインディルビンの重要な相互作用の論理的根拠分析ならびに３’部位の種々の修飾を調べる類似体の合成および生物学的評価によって、阻害剤／ＧＳＫ−３複合体にさらなる安定化を与える新規相互作用部位を明らかにすることができた。結果として、この部位での拡張は、ＧＳＫ−３に対する活性および選択性の増強を提供し、また、水溶性の増強に好都合な置換を導入する機会も提供した。
【００８６】
参考文献
1.Meijer, L; Skaltsounis, AL; Magiatis, P; Polychonopoulos, P; Knockaert, M; Leost, M; Ryan, XP; Vonica, CD; Brivanlou, A; Dajani, R; Tarricone, A; Musacchio, A; Roe, SM; Pearl, L, Greengard, P. GSK-3 selective inhibitors derived from Tyrian purple indirubins. Chem. & Biol. 2003, 10, 1255-1266.
2. Jope, R.S.; Johnson, G.V.W. The glamour and gloom of glycogen synthase kinase-3. Trends Biochem. Sci. 2004, 29, 95-102.
3 Ribas, J.; Bettayeb, K.; Ferandin, Y.; Garrofe-Ochoa, X.; Knockaert, M.; Totzke, F.; Schachtele, C.; Mester, J.; Polychronopoulos, P.; Magiatis, P.; Skaltsounis, A.L.; Boix, J.; Meijer, L.,. 7-bromoindirubin-3’-oxime induces caspase-independent cell death. Oncogene 2006, 25, 6304-6318.
4 Leclerc, S.; Garnier, M.; Hoessel, R.; Marko, D.; Bibb, J.A.; Snyder, G.L.; Greengard, P.; Biernat, J.; Mandelkow, E.-M.; Eisenbrand, G.; Meijer, L. Indirubins inhibit glycogen synthase kinase - 3β and CDK5/p25, two kinases involved in abnormal tau phosphorylation in Alzheimer’s disease - A property common to most CDK inhibitors ? J. Biol. Chem. 2001, 276, 251-260.
5 Primot, A.; Baratte, B.; Gompel, M.; Borgne, A.; Liabeuf, S.; Romette, J.L.; Costantini, F.; Meijer, L. Purification of GSK-3 by affinity chromatography on immobilised axin. Protein Expr. & Purif. 2000, 20, 394-404.
6 Ribas, J.; Boix, J. Cell differentiation, caspase inhibition, and macromolecular synthesis blockage, but not BCL-2 or BCL-XL proteins, protect SH-SY5Y cells from apoptosis triggered by two CDK inhibitory drugs. Exp. Cell Res. 2004, 295, 9-24.
7 Izumo, M.; Sato, T.R.; Straume M.; Johnson C.H.. Quantitative analyses of circadian gene expression in mammalian cell cultures. PLoS Computational Biology 2006, 2, e136.
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(I)
【化１】
［式中、
Ｒ、は−（Ａ）ｎ−Ｒ１または−ＣＯ−Ｎ（Ｒ２，Ｒ３）を表し、
・Ａは、１個または数個のＡ１基によって置換されていてもよいＣ１〜Ｃ５アルキレン基であり、Ａ１は、ハロゲンＢｒ、ＯＨ、ＯＲ４またはＮＨ２であり、Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ５アルキルであり；
・Ｒ１は、ハロゲン、ＯＨ、Ｎ（Ｒ２、Ｒ３）であり；Ｒ２およびＲ３は、同一または異なり、上記で定義されたＡ１によって置換されていてもよいＣ１〜Ｃ５アルキルであるか、またはＲ２およびＲ３は、ＯもしくはＮなどの他のヘテロ原子を含んでいてもよい、５もしくは６個の環員を有する環の一部であり；
・ｎ＝１〜５］
で示されるインディルビン誘導体。
【請求項２】
請求項１に記載のインディルビン誘導体の薬学的に許容される塩。
【請求項３】
Ｒが−（Ａ）ｎ−Ｒ１を表し、Ｒ１がハロゲン、ＯＨまたはＮ（Ｒ２、Ｒ３）であり、同一または異なっているＲ２およびＲ３が、上記で定義されたＡ１によって置換されていてもよいＣ１〜Ｃ５アルキルである、請求項１または２に記載のインディルビン誘導体。
【請求項４】
Ｒ１がＢｒまたはＯＨであり、Ａが、−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＨ（Ｒ１）−（ＣＨ２）ｍ２基を表し、ここで、ｍ１＝１〜３およびｍ２＝０、１〜３である、請求項３に記載のインディルビン誘導体。
【請求項５】
Ｒ１が、Ｎ（Ｒ２、Ｒ３）である、請求項３に記載のインディルビン誘導体。
【請求項６】
Ａが、Ｃ１〜Ｃ５アルキレン基である、請求項１から５のいずれか１項に記載のインディルビン誘導体。
【請求項７】
Ｒが、−ＣＯ−Ｎ（Ｒ２，Ｒ３）を表し、同一または異なっているＲ２およびＲ３が、Ｃ１〜Ｃ５アルキル基である、請求項１または２に記載のインディルビン誘導体。
【請求項８】
薬物として使用するための、請求項１から７のいずれか１項に記載のインディルビン誘導体。
【請求項９】
請求項１から７のいずれか１項に記載されたインディルビン誘導体の少なくとも１種の治療上有効な量を、薬学的に許容されるビヒクルと組合せて含む医薬組成物。
【請求項１０】
静脈内経路または筋肉内または皮下による投与に適した形態である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ＧＳＫ調節解除と関連している病態の治療のための、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
アルツハイマー病、糖尿病、心臓肥大などのＧＳＫ調節解除と関連している病態の治療のための、胚幹細胞多能性維持または哺乳類における日内周期の変更の分野における、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１】
式(I)
【化１】
［式中、
Ｒ、は−（Ａ）ｎ−Ｒ１または−ＣＯ−Ｎ（Ｒ２，Ｒ３）を表し、
・Ａは、１個または数個のＡ１基によって置換されていてもよいＣ１〜Ｃ５アルキレン基であり、Ａ１は、ハロゲンＢｒ、ＯＨ、ＯＲ４またはＮＨ２であり、Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ５アルキルであり；
・Ｒ１は、ハロゲン、ＯＨ、Ｎ（Ｒ２、Ｒ３）であり；Ｒ２およびＲ３は、同一または異なり、上記で定義されたＡ１によって置換されていてもよいＣ１〜Ｃ５アルキルであるか、またはＲ２およびＲ３は、ＯもしくはＮなどの他のヘテロ原子を含んでいてもよい、５もしくは６個の環員を有する環の一部であり；
・ｎ＝１〜５］
で示されるインディルビン誘導体。
【請求項２】
請求項１に記載のインディルビン誘導体の薬学的に許容される塩。
【請求項３】
Ｒが−（Ａ）ｎ−Ｒ１を表し、Ｒ１がハロゲン、ＯＨまたはＮ（Ｒ２、Ｒ３）であり、同一または異なっているＲ２およびＲ３が、上記で定義されたＡ１によって置換されていてもよいＣ１〜Ｃ５アルキルである、請求項１または２に記載のインディルビン誘導体。
【請求項４】
Ｒ１がＢｒまたはＯＨであり、Ａが、−（ＣＨ２）ｍ１−ＣＨ（Ｒ１）−（ＣＨ２）ｍ２基を表し、ここで、ｍ１＝１〜３およびｍ２＝０、１〜３である、請求項３に記載のインディルビン誘導体。
【請求項５】
Ｒ１が、Ｎ（Ｒ２、Ｒ３）である、請求項３に記載のインディルビン誘導体。
【請求項６】
Ａが、Ｃ１〜Ｃ５アルキレン基である、請求項１から５のいずれか１項に記載のインディルビン誘導体。
【請求項７】
Ｒが、−ＣＯ−Ｎ（Ｒ２，Ｒ３）を表し、同一または異なっているＲ２およびＲ３が、Ｃ１〜Ｃ５アルキル基である、請求項１または２に記載のインディルビン誘導体。
【請求項８】
薬物として使用するための、請求項１から７のいずれか１項に記載のインディルビン誘導体。
【請求項９】
請求項１から７のいずれか１項に記載されたインディルビン誘導体の少なくとも１種の治療上有効な量を、薬学的に許容されるビヒクルと組合せて含む医薬組成物。
【請求項１０】
静脈内経路または筋肉内または皮下による投与に適した形態である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ＧＳＫ調節解除と関連している病態の治療のための、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
アルツハイマー病、糖尿病、心臓肥大などのＧＳＫ調節解除と関連している病態の治療のための、胚幹細胞多能性維持または哺乳類における日内周期の変更の分野における、請求項１１に記載の医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１１−５２９８７３（Ｐ２０１１−５２９８７３Ａ）
【公表日】平成２３年１２月１５日（２０１１．１２．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２０６２７（Ｐ２０１１−５２０６２７）
【出願日】平成２１年７月２１日（２００９．７．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００９／０５３１５３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１３１６８
【国際公開日】平成２２年２月４日（２０１０．２．４）
【出願人】（５０７１９９９７５）サーントゥル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシュ シャーンティフィク セエンエールエス (13)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１２月１５日（２０１１．１２．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月２１日（２００９．７．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００９／０５３１５３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１３１６８
【国際公開日】平成２２年２月４日（２０１０．２．４）
【出願人】（５０７１９９９７５）サーントゥル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシュ シャーンティフィク セエンエールエス (13)
【Ｆターム（参考）】
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