Ａｋｔ２に結合する蛋白質
インスリン抵抗性改善薬及び糖代謝改善薬のスクリーニングに有用な新規なポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記発現ベクターでトランスフェクトされた細胞を開示する。前記ポリペプチドは脂肪に発現する蛋白質であり、同蛋白質を高発現させた脂肪細胞ではＡｋｔ２の活性が低下する。前記ポリペプチドを用いたインスリン抵抗性改善薬及び糖代謝改善薬のスクリーニング方法並びに該スクリーニング方法により得られる物質を有効成分とするインスリン抵抗性改善用及び糖代謝改善用医薬組成物の製造方法を開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、Ａｋｔ２に結合する新規なポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードする新規なポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、該ベクターを含有する形質転換細胞及び前記ポリペプチドとＡｋｔ２との結合阻害物質をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
インスリンは膵臓ランゲルハンス島のβ細胞より分泌され、主に筋肉、肝臓、脂肪に作用して血中の糖を細胞に取り込ませて貯蔵、消費させることにより血糖値を降下させる。糖尿病は、このインスリンの作用不足から引き起こされるが、患者にはインスリンの生産又は分泌に障害をもつ１型と、インスリンによる糖代謝促進が起こりにくくなる２型の２つのタイプが存在する。いずれの患者でも血糖値が健常人より高くなるが、１型では血中インスリンが絶対的に不足するのに対して、２型ではインスリンの存在にもかかわらず血糖の細胞における取り込み又は消費が促進されないインスリン抵抗性が生じている。２型糖尿病は遺伝的素因に加えて過食や運動不足、ストレスなどが原因となり惹起されるいわゆる生活習慣病である。今日先進諸国では摂取カロリーの増大に伴いこの２型糖尿病患者が急激に増加しており、日本では糖尿病患者の９５％を占めている。そのため糖尿病の治療薬には単純な血糖降下剤のみでなく、インスリン抵抗性の改善により糖代謝を促進する２型糖尿病の治療を対象とした研究の必要性が高まっている。
現在１型糖尿病患者の治療にはインスリン注射製剤が処方されている。一方、２型患者に処方される血糖降下剤としては、インスリン注射製剤に加えて膵臓のβ細胞に作用してインスリンの分泌を促すスルホニル尿素系血糖降下剤（ＳＵ剤）や、嫌気的解糖作用による糖利用の増大や糖新生の抑制、及び糖の腸管吸収を抑制する作用を持つビグアナイド系血糖降下剤の他、糖質の消化吸収を遅らせるα−グルコシダーゼ阻害剤が知られている。これらは間接的にインスリン抵抗性を改善するが、近年より直接的にインスリン抵抗性を改善する薬剤としてチアゾリジン誘導体が使われるようになった。その作用は細胞内へのブドウ糖の取り込みと細胞内におけるブドウ糖利用の促進である。このチアゾリジン誘導体はペルオキシソーム増殖剤応答性受容体ガンマ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＰＰＡＲγ）のアゴニストとして作用することが示されている（非特許文献１参照）。しかしチアゾリジン誘導体はインスリン抵抗性を改善するのみでなく、浮腫を惹起する副作用が知られている（非特許文献２、非特許文献３参照）。この浮腫の惹起は心肥大をもたらす重篤な副作用なので、インスリン抵抗性改善のために、ＰＰＡＲγにかわるより有用な創薬標的分子が求められている。
インスリン作用のシグナルは細胞膜上にあるインスリン受容体を介して細胞内へ伝達される。このインスリンの作用経路には第一と第二の２経路が存在する。（非特許文献４参照）。第一経路においては、活性化されたインスリン受容体からＩＲＳ−１、ＩＲＳ−２、ＰＩ３キナーゼ、及びＰＤＫ１を介してＡｋｔ１（ＰＫＢα）若しくはＡｋｔ２（ＰＫＢβ）、またはＰＫＣλ若しくはＰＫＣζへ順次シグナルが伝達され、その結果として細胞内に存在するグルコーストランスポーターＧＬＵＴ４を細胞膜上へ移行させることにより、細胞外からの糖の取り込みを促進する（非特許文献５参照）。一方、第二経路ではインスリン受容体からｃ−ＣｂＩ及びＣＡＰを介してＣｒＫＩＩ、Ｃ３Ｇ、並びにＴＣ１０へ順次シグナルが伝達され、結果ＧＬＵＴ４による糖の取り込みを促進する（非特許文献６参照）。しかし、これらインスリンシグナル伝達経路の詳細についてはいまだ不明な部分が多く、特にこれらのシグナルが最終的にどのような機構を経てグルコーストランスポーターを介した細胞の糖取り込みを促進するのか明らかではない。
Ａｋｔ２は前述のインスリンシグナル第一経路に存在し、インスリンの刺激によりＰＤＫ１を介してリン酸化され活性化する。活性化したＡｋｔ２はキナーゼとして基質となる蛋白質をリン酸化することによりシグナルを伝達する。Ａｋｔ２蛋白質をコードする遺伝子を人為的に欠失させたホモノックアウトマウスは主に筋肉、肝臓においてインスリンの感受性が低下し２型糖尿病様の表現型を示すことが報告されている。これらの事実から、Ａｋｔ２はインスリンシグナルに応答した細胞内への糖取り込みに働くシグナル仲介因子であり、その機能阻害はインスリンシグナル伝達の部分的な遮断によりインスリン抵抗性を惹起すると考えられている（非特許文献７参照）。
【非特許文献１】「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、（米国）、１９９５年、第２７０巻、ｐ．１２９５３−１２９５６
【非特許文献２】「ダイアビーティーズ フロンティア（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｆｒｏｎｔｉｅｒ）」、（米国）、１９９９年、第１０巻、ｐ．８１１−８１８
【非特許文献３】「ダイアビーティーズ フロンティア（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｆｒｏｎｔｉｅｒ）」、（米国）、１９９９年、第１０巻、ｐ．８１９−８２４
【非特許文献４】「ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）」（米国）、２０００年、第１０６巻、第２号、ｐ．１６５−１６９
【非特許文献５】「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、（米国）、１９９９年、第２７４巻、第４号、ｐ．１８６５−１８６８
【非特許文献６】「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、（英国）、２００１年、第４１０巻、第６８３１号、ｐ．９４４−９４８
【非特許文献７】「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」（米国）、２００２年、第２９２巻、第２号、ｐ．１７２８−１７３１
【発明の開示】
本発明者らは、上述の知見からＡｋｔ２の働きを増強させることができれば、インスリン抵抗性を改善できると考えた。そしてこの目的は、Ａｋｔ２自身の活性を増大させるか、Ａｋｔ２に結合してその作用を制御している細胞内因子を同定し、その作用を調節することにより達成できると考えた。しかしＡｋｔ２はキナーゼであり、その酵素活性を薬剤によって増強する方向に調節することは困難である。そこでＡｋｔ２に結合する蛋白質を、酵母ツーハイブリッドシステムにより同定した。その結果、Ａｋｔ２に結合する蛋白質ＡＫＢＰ２（Ａｋｔ２ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２）をコードする新規な塩基配列のマウス由来ｃＤＮＡのクローニングに成功した。さらに同蛋白質は糖尿病モデルマウスの筋肉および脂肪において正常個体より発現量が顕著に増加していることから同蛋白質が糖尿病態の原因因子であることを見出した。加えて、ヒトオルソログであるヒトＡＫＢＰ２遺伝子のクローニングに成功し、該遺伝子がインスリン応答組織である脂肪細胞に発現していること、マウスＡＫＢＰ２と同様ヒトＡＫＢＰ２もＡｋｔ２に結合することを見出した。加えて、マウスＡＫＢＰ２過剰発現によりＡｋｔ２のキナーゼ活性が低下することを検出し、ＡＫＢＰ２によりインスリンシグナルが遮断されインスリン抵抗性が惹起されること、従って、ＡＫＢＰ２とＡｋｔ２との結合を阻害することによりインスリン抵抗性が改善されることがわかった。そこで、ＡＫＢＰ２とＡｋｔ２との相互作用を利用したインスリン抵抗性改善薬及び／又は糖代謝改善薬のスクリーニング系を構築した。
これらの結果、インスリン抵抗性改善薬及び／又は糖代謝改善薬の探索に有用な新規なポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記発現ベクターで形質転換された細胞、インスリン抵抗性改善薬及び／又は糖代謝改善薬をスクリーニングする方法、並びに、インスリン抵抗性改善用及び／又は糖代謝改善用医薬組成物の製造方法を提供し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
［１］配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列、あるいは、配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列
を含み、しかもＡｋｔ２と結合するポリペプチド、
［２］配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
［３］［１］又は［２］に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
［４］［３］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
［５］［４］に記載の発現ベクターで形質転換された細胞、
［６］（１）［１］若しくは［２］に記載のポリペプチド、または配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかもＡｋｔ２と結合するポリペプチド、あるいは前記ポリペプチドを発現している細胞と（２）試験物質とを接触させる工程、
該ポリペプチドとＡｋｔ２との結合を測定する工程、及び
前記結合を阻害する物質を選択する工程
を含むことを特徴とする前記ポリペプチドとＡｋｔ２との結合阻害物質をスクリーニングする方法、
［７］結合阻害物質がインスリン抵抗性改善薬及び／又は糖代謝改善薬である［６］に記載のスクリーニングする方法。
［８］（１）［１］又は［２］に記載のポリペプチド、あるいは配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、Ａｋｔ２と結合するポリペプチドと（２）Ａｋｔ２との結合を測定する工程が、前記結合の変化によるＡｋｔ２の変化を測定する工程である［６］又は［７］に記載のスクリーニングする方法。
［９］［６］乃至［８］に記載のスクリーニングする方法を用いてスクリーニングする工程、及び
製剤化する工程
を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善用及び／又は糖代謝改善用医薬組成物の製造方法
に関する。
配列番号１〜４に記載の本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドと同一の配列は知られていない。本願優先日後に、配列データベースＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号ＡＸ７１４０４３、ＢＣ０４２１５５、及びＢＣ０４９１１０として本発明のポリヌクレオチドと相同性を有する配列が収載されたが、配列が開示されたにすぎず、その具体的用途については記載されていない。また、配列データベースＧｅｎＰｅｐｔには、アクセッション番号ＡＫ０５６０９０として、本発明のポリペプチドの一つである配列番号４で表されるアミノ酸配列において、６８個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるポリペプチド、及びアクセッション番号ＡＫ０１９１０５として、本発明のポリペプチドの一つである配列番号２で表されるアミノ酸配列において、２２８個のアミノ酸が欠失し、１３個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが収載されている。しかしながら、実際にこれらポリペプチドを取得したとの情報はおろか、どのように取得できるかの具体的情報もない。また、当該ポリペプチドの具体的用途についても記載されていない。本発明者らは本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドを初めて見出し、その蛋白質の発現亢進及びＡｋｔ２との結合の増加が糖尿病病態の原因であることを初めて明らかにした。また、本発明のポリペプチドとＡｋｔ２との結合を利用した本発明のスクリーニング方法は本発明者らによって初めて提供された方法である。
【図面の簡単な説明】
図１は、培養細胞におけるＡＫＢＰ２の発現を示す図である。レーン１及びレーン３は分子量マーカーを、レーン２は空ベクターを、レーン３はｐｃＤＮＡ−ＡＫＢＰ２を導入した場合を示している。
図２の（１）は、通常食又は高脂肪食負荷した正常マウスＣ５７ＢＬ／６Ｊにおける脂肪でのＡＫＢＰ２発現量の比較を示す図である。図の縦軸はマウス脂肪における相対発現量を示す。白塗りのバーは通常食、黒塗りのバーは高脂肪食負荷した場合を示している。
（２）は、通常食又は高脂肪食負荷した正常マウスＣ５７ＢＬ／６Ｊにおける筋肉でのＡＫＢＰ２発現量の比較を示す図である。図の縦軸はマウス筋肉における相対発現量を示す。白塗りのバーは通常食、黒塗りのバーは高脂肪食負荷した場合を示している。
（３）は、正常マウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ及び糖尿病モデルマウスＫＫＡｙ／Ｔａにおける脂肪でのＡＫＢＰ２発現量の比較を示す図である。図の縦軸はマウス脂肪における相対発現量を示す。白塗りのバーは正常マウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ、線入りのバーは糖尿病モデルマウスＫＫＡｙ／Ｔａの結果を示している。
（４）は、正常マウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ及び糖尿病モデルマウスＫＫＡｙ／Ｔａにおける筋肉でのＡＫＢＰ２発現量の比較を示す図である。図の縦軸はマウス筋肉における相対発現量を示す。白塗りのバーは正常マウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ、線入りのバーは糖尿病モデルマウスＫＫＡｙ／Ｔａの結果を示している。
（１）、（２）の比較においては通常食のＣ５７ＢＬ／６Ｊの発現量を、（３）、（４）の比較においてはＣ５７ＢＬ／６Ｊの発現量を、それぞれ１として表示している。
図３は、ＮＩＨ３Ｔ３ Ｌ１脂肪細胞におけるマウスＡＫＢＰ２過剰発現によるＡｋｔ２酵素活性への影響を示す図である。図の縦軸は相対活性を示しており、インスリン無刺激状態におけるコントロールウイルス感染細胞における酵素活性の値を１として表示している。図の横軸の数値は、インスリンの刺激時間（分）を示している。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜本発明のポリペプチド＞
本発明のポリペプチドには、
（１）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；及び
（２）ｉ）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかもＡｋｔ２に結合するポリペプチド、あるいは、ｉｉ）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個（好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜３個）のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもＡｋｔ２に結合するポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）
が含まれる。
本発明のポリペプチドは、Ａｋｔ２と結合し、Ａｋｔ２のキナーゼ活性を低下させるものが特に好ましい。
また、本発明のポリペプチドは、前述の（１）〜（２）のいずれかに該当する限りヒト及びマウス由来のポリペプチドに限定されず、他の脊椎動物（例えばラット、ウサギ、ウマ、ヒツジ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ブタ、ニワトリなど）由来のものも包含する。また、前述の（１）〜（２）のいずれかに該当する限り、天然のポリペプチドに限定されず人工的に製造した変異体も含まれる。
「Ａｋｔ２に結合する」とは、Ａｋｔ２（好ましくはヒトＡｋｔ２、更に好ましくはＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号Ｍ９５９３６によりコードされるポリペプチド）にポリペプチドが結合することを意味しており、「結合する」か否かは以下の方法により確認することができる。
結合するか否かの検討対象ポリペプチドの一部若しくは全長域、またはＧＳＴやＦｌａｇ、Ｈｉｓなどのタグを融合させた検討対象ポリペプチドの一部若しくは全長域を細胞に発現させる。前記細胞としてはインスリンに応答する細胞が好ましく、より具体的には脂肪細胞、肝細胞、あるいは骨格筋由来細胞が好ましい。前記細胞から抗Ａｋｔ２抗体を用いた免疫沈降によりＡｋｔ２蛋白質とそこに結合する蛋白質を濃縮することができる。得られたＡｋｔ２およびその結合蛋白質の濃縮液を公知の方法によりポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離し、抗体を用いたウエスタンブロティングにより検討対象のポリペプチドがＡｋｔ２に結合するか否かを確認することができる。ここで用いる抗体は、検討対象のポリペプチド若しくはその部分配列をもとに作製した検討対象のポリペプチドに対する抗体、または上記タグを認識する抗体を利用することができる。
また検討対象のポリペプチドを発現させた細胞の抽出液、または、インビトロで転写及び翻訳して作製した蛋白質混合液と、ＧＳＴなどのタグをつけて精製したＡｋｔ２蛋白質とを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏのプルダウン法（実験工学、Ｖｏｌ１３、Ｎｏ．６、１９９４年５２８頁 松七五三ら）と上述と同様のウエスタンブロッティングを組み合わせるによってもＡｋｔ２と検討対象のポリペプチドの結合を検出することができる。好ましくは、実施例６に示すように検討対象蛋白質発現用プラスミド（例えば実施例１（５）で作製したＡＫＢＰ２蛋白質発現用プラスミド）から直接検討対象蛋白質をインビトロトランスレーションキット（例えばＴＮＴキット（プロメガ社））を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで転写及び翻訳して作製した蛋白質混合液を用いて結合を検出できる。より好ましくは、実施例６に記載の方法により検討対象のポリペプチドとＡｋｔ２との結合を検出することができる。「Ａｋｔ２のキナーゼ活性を低下させる」とは、検討対象のポリペプチドがＡｋｔ２に結合することによりＡｋｔ２の有するキナーゼ活性を低下させることを意味する。「キナーゼ活性を低下」させるか否かは、以下の方法により確認することができる。
Ａｋｔ２は分子内のセリン４７３番（Ｓｅｒ４７３）あるいはスレオニン３０８番（Ｔｈｒ３０８）がリン酸化されてキナーゼ活性が亢進することが知られている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９９８ ３３５（１−１３））。これを利用し、Ａｋｔ２のＳｅｒ４７３又はＴｈｒ３０８のリン酸化状態をこれらリン酸化残基に特異的に反応する抗体（例えば抗ｐｈｏｓｐｈｏＳｅｒ抗体等）を用いたウエスタンブロットにより検出することでＡｋｔ２の活性の有無が検出できる。より具体的には、検討対象のポリペプチドの一部若しくは全長域を発現させた細胞（インスリンに応答する細胞が好ましく、より具体的には脂肪細胞、肝細胞、または骨格筋由来細胞が好ましい）を溶解し、これを試料として抗ｐｈｏｓｐｈｏＳｅｒ抗体を用いるウエスタンブロット法、スポットウエスタンブロット法などを利用することによりＡｋｔ２のリン酸化、すなわちＡｋｔ２の活性の有無を検出することができる。好ましくは実施例７の方法で検出することができる。この検出系において、検討対象のポリペプチドを発現させない細胞から得た試料に比較して検討対象のポリペプチドを発現させた細胞から得た試料を用いたときのＡｋｔ２のリン酸化（すなわちＡｋｔ２の活性化）の低下が観察された場合、検討対象のポリペプチドは「Ａｋｔ２のキナーゼ活性を低下させる」と判断することができる。
また、ヒストンＨ２ＢやＧＳＫ−３融合タンパク質などをＡｋｔ２の基質としてＡｋｔ２の免疫沈降物と反応させたときの、基質に対する放射性リン酸の取り込み量を測定するインビトロキナーゼアッセイ法によっても「Ａｋｔ２のキナーゼ活性を低下」させるか否か確認することができる。具体的には、検討対象のポリペプチドの一部または全長域を発現させた細胞（インスリンに応答する細胞が好ましく、より具体的には脂肪細胞、肝細胞、あるいは骨格筋由来細胞が好ましい）の抽出液から抗Ａｋｔ２抗体を用いた免疫沈降によりＡｋｔ２蛋白質を濃縮することができる。Ａｋｔ２の基質、例えば、ＧＳＴ−ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ（Ａｋｔの生理的基質であるＧＳＫ３−ｂｅｔａ配列のＧＳＴ融合蛋白質）と濃縮Ａｋｔ２蛋白質とを混合することにより、基質のリン酸化を指標としてＡｋｔ２のキナーゼ活性を測定及び定量化できる。好ましくは実施例７に記載の方法で測定することができる。この測定系において、検討対象のポリペプチドを発現させない細胞から得た試料に比較して検討対象のポリペプチドを発現させた細胞から得た試料を用いたときの基質のリン酸化の低下が観察された場合、検討対象のポリペプチドは「Ａｋｔ２のキナーゼ活性を低下させる」と判断することができる。
＜本発明のポリヌクレオチド＞
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド、すなわち、配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド、またはその機能的等価改変体をコードする塩基配列ならいずれの種由来のものであってもよい。好ましくは、配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、さらに好ましくは、配列番号１又は配列番号３に記載の塩基配列である。なお、本明細書における「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれる。
本発明のポリヌクレオチドには、本発明のポリペプチドをコードする限り、あらゆる変異体を含むことが出来る。より具体的には天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、欠失、置換、付加及び挿入を有する変異体を含むことが出来る。前記の変異は、例えば天然において突然変異によって生じることもあるが、人為的に改変し作製することも出来る。本発明は、上記ポリヌクレオチドの変異の原因及び手段を問わず、上記本発明のポリペプチドをコードする全ての変異遺伝子を包含する。上記の変異体作製にいたる人為的手段としては、例えば塩基特異的置換法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、（１９８７）１５４、３５０，３６７−３８２）等の遺伝子工学的手法の他、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイド法などの化学合成手段（Ｓｃｉｅｎｃｅ １５０、１７８、１９６８）を挙げることができる。それらの組み合わせによって所望の塩基置換を伴うＤＮＡを得ることが可能である。あるいはＰＣＲ法の繰り返し作業や、その反応液中にマンガンイオンなどを存在させることによりＤＮＡ分子中の非特定塩基に置換を生じさせることが可能である。
本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、本発明により開示された配列情報に基づいて一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することが出来る。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば次のように得ることができるが、この方法に限らず公知の操作「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年」等でも得ることができる。
例えば、（１）ＰＣＲを用いた方法、（２）常法の遺伝子工学的手法（すなわちｃＤＮＡライブラリーで形質転換した形質転換株から所望のアミノ酸を含む形質転換株を選択する方法）を用いる方法、又は（３）化学合成法などを挙げることができる。各製造方法については、ＷＯ０１／３４７８５に記載されているのと同様に実施できる。
ＰＣＲを用いた方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ａ）第１製造法に記載された手順により、本明細書記載のポリヌクレオチドを製造することができる。該記載において、「本発明の蛋白質を産生する能力を有するヒト細胞あるいは組織」とは、例えば、脂肪細胞を挙げることができる。ヒト又はマウス脂肪細胞からｍＲＮＡを抽出する。次いで、このｍＲＮＡをランダムプライマーまたはオリゴｄＴプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行い、第一鎖ｃＤＮＡを合成することが出来る。得られた第一鎖ｃＤＮＡを用い、目的遺伝子の一部の領域をはさんだ２種類のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供し、本発明のポリヌクレオチドまたはその一部を得ることができる。より具体的には、例えば実施例１及び実施例４に記載の方法により本発明のポリヌクレオチドを製造することが出来る。
常法の遺伝子工学的手法を用いる方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ｂ）第２製造法に記載された手順により、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを製造することができる。
化学合成法を用いた方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ｃ）第３製造法、ｄ）第４製造法に記載された方法によって、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを製造することができる。
このようにして得られる本発明のポリヌクレオチドの一部または全部の塩基配列を利用することにより、個体もしくは各種組織における本発明のポリヌクレオチドの発現レベルを特異的に検出することが出来る。
かかる検出方法としては、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ノーザンブロッティング解析、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどの方法を挙げることが出来る。
＜本発明の発現ベクター、細胞、及びポリペプチドの製造法＞
本発明には、本発明の形質転換された細胞を培養することを特徴とする本発明のポリペプチドの製造方法も包含される。
上述のように得られた本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年」等に記載の公知の方法により、適当なプロモーターの下流に連結することで本発明のポリペプチドを試験管内、あるいは試験細胞内で発現させることに利用できる。
具体的には上述のように得られた本発明のポリペプチドの開始コドン上流に特定のプロモーター配列を含むポリヌクレオチドを付加することにより、これを鋳型として用いた無細胞系での遺伝子の転写、翻訳による本発明のポリペプチドの発現が可能である。
あるいは上述の本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを適当なベクタープラスミドに組み込み、プラスミドの形で宿主細胞に導入すれば細胞内で本発明のポリペプチドの発現が可能になる。あるいは、このような構成が染色体ＤＮＡに組み込まれた細胞を取得してこれを用いてもよい。より具体的には、単離されたポリヌクレオチドを含む断片は、適当なベクタープラスミドに再び組込むことにより、真核生物及び原核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。さらに、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞において本発明のポリペプチドを発現させることが可能である。宿主細胞は、特に限定されるわけではなく、本発明のポリペプチドの発現量をメッセンジャーＲＮＡレベルで、あるいは蛋白質レベルで検出できるものであればよい。内在性のＡｋｔ２が豊富に存在する脂肪由来細胞、あるいは筋肉由来細胞を宿主細胞として用いることがより好ましい。
宿主細胞を形質転換し遺伝子を発現させる方法は、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」２）本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明の組換え蛋白の製造方法に記載された方法により実施できる。発現ベクターは、所望のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではない。例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、所望のポリヌクレオチドを挿入することにより得られる発現ベクターを挙げることができる。本発明の細胞は、例えば、前記発現ベクターにより所望の宿主細胞をトランスフェクションすることにより得ることができる。より具体的には、例えば、実施例２に記載のように所望のポリヌクレオチドを哺乳類動物細胞用の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１に組み込むことにより、所望の蛋白質の発現ベクターを得ることができ、該発現ベクターをリン酸カルシウム法を用いて２９３細胞に取り込ませて本発明の形質転換細胞を製造することができる。
上記で得られる所望の形質転換細胞は、常法に従い培養することができ、該培養により所望の蛋白質が生産される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択できる。例えば上記２９３細胞であれば牛胎児血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したダルベッコ修飾イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地にＧ４１８を加えたものを使用できる。本発明の形質転換された細胞としては、本発明のポリペプチドを発現している細胞が好ましい。
本発明の細胞を培養することにより、細胞中で産生した本発明のポリペプチドを検出、定量、さらには精製することが出来る。例えば、本発明のポリペプチドと結合する抗体を用いたウエスタンブロット法、あるいは免疫沈降法により本発明のポリペプチドを検出、精製することが可能である。あるいは、本発明のポリペプチドを、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、プロテインＡ、β−ガラクトシダーゼ、マルトースバインディングプロテイン（ＭＢＰ）など適当なタグ蛋白質との融合蛋白質として発現させることにより、これらタグ蛋白質に特異的な抗体を用いてウエスタンブロット法、あるいは免疫沈降法により本発明のポリペプチドを検出、タグ蛋白質を利用して精製することが出来る。より具体的には以下のようにしてタグ蛋白質を利用して精製することができる。
本発明のポリペプチド（例えば、配列番号２又は配列番号４で表されるポリペプチド）は、本発明のポリヌクレオチド（例えば、配列番号１及び３で示されるポリヌクレオチド）を例えばＨｉｓタグが融合されるベクター、より具体的には例えば実施例１に記載のｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社）等に組み込むことで培養細胞に発現させ、Ｈｉｓタグを用いて精製した後でタグ部分を除去することにより得ることができる。例えば実施例１あるいは実施例５においてｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯを用いて作製したマウスあるいはヒトのＡＫＢＰ２発現プラスミドは、いずれもＡＫＢＰ２のＣ−末端にＶ５およびＨｉｓタグが付加されるように設計されている。これにより、それらのＨｉｓタグを利用して、実施例２あるいは実施例５に示したＡＫＢＰ２を発現させた培養細胞からＡＫＢＰ２蛋白質を精製することができる。具体的には公知の方法（実験医学別冊タンパク質の分子間相互作用実験法、１９９６年３２頁 中原ら）に従って、破砕した細胞の抽出液よりＨｉｓタグと融合したＡＫＢＰ２蛋白質をＮｉ２＋−ＮＴＡ−Ａｇａｒｏｓｅ（フナコシ）に結合させて遠心分離により単離することができる。より具体的には培養フラスコ（例えば１０ｃｍ径のシャーレ）に培養させた本発明のポリペプチド発現細胞を適当な量の緩衝液（例えば、１ｍｌ）を加えて掻き取った後、毎分１５０００回転で５分間の遠心分離によって上清を分離し、適当な緩衝液で置換した適量（例えば５０μＭ）のＮｉ２＋−ＮＴＡ−Ａｇａｒｏｓｅを加えて十分に混合する（例えば、ローテーターで１０分以上撹拌する）ことができる。続いて遠心分離（例えば毎分２０００回転で２分間）により上清を分離して除去し、ｐＨを６．８にした緩衝液を適量（例えば０．５ｍｌ）加えて再度遠心分離することにより洗浄する。これを３回繰り返した。後適量（例えば５０μｌ）の１００ｍＭ ＥＤＴＡを加えて１０分置き、上清を回収することにより遊離した本発明のポリペプチドを精製することができる。上記緩衝液としては、例えば緩衝液Ｂ（８Ｍ Ｕｒｅａ，０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４，０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４，０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０）を用いることができる。精製した蛋白質分子中のＨｉｓタグは、例えばＮ末端がわにＨｉｓタグを融合させる様設計することによりＴＡＧＺｙｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（キアゲン社）を用いることで分子中から除去することができる。
あるいは所望により、タグ蛋白質を利用しない方法、例えば、本発明のポリペプチドからなる蛋白質の物理的性質、化学的性質を利用した各種の分離操作によっても精製できる。具体的には限外濾過、遠心分離、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーの利用を例示することが出来る。
本発明のポリペプチドは、配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列情報に従って、一般的な化学合成法により製造することが出来る。具体的には液相、及び固相法によるペプチド合成法が包含される。合成はアミノ酸を１個ずつ逐次結合させても、数アミノ酸からなるペプチド断片を合成した後に結合させてもよい。これらの手段により得られる本発明ポリペプチドは前記した各種の方法に従って精製を行うことが出来る。
＜糖尿病の検査方法＞
本発明のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするプローブを用いることにより、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現量を調べることができ、その発現量（好ましくは脂肪組織における発現量）の増加を指標として糖尿病の診断をすることができる。糖尿病の検査方法において、「ストリンジェントな条件」とは、非特異的な結合が起こらない条件を意味し、具体的には、０．１％ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有する０．１×ＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）溶液を使用し、温度が６５℃である条件を意味する。プローブとしては、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも一部若しくは全部の配列（またはその相補配列）を有し、少なくとも１５ｂｐの鎖長のＤＮＡが用いられる。
糖尿病の検出方法では、上述のプローブと試験試料とを接触させ、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ又はそれ由来のｃＤＮＡ）と前記プローブとの結合体を、公知の分析方法（例えば、ノザンブロッティング）で分析することにより、糖尿病であるか否かを検出することができる。また、上述のプローブをＤＮＡチップに適用し、発現量を分析することもできる。前記結合体の量、すなわち、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの量が、健常人に比べて増加している場合には、糖尿病であると判定することができる。
本発明のポリヌクレオチドの発現レベルを測定する方法として、発現レベルを本発明のポリペプチドの検出によって測定する方法が可能である。このような検査方法としては、例えば、試験試料を本発明のポリペプチドに結合する抗体、好ましくは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体を利用したウエスタンブロッティング、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ法などを利用することが出来る。試験試料中に含まれる本発明のポリペプチドの量を定量する際、本発明のポリペプチドを標準量として利用することができる。また、本発明のポリペプチドは本発明のポリペプチドに結合する抗体を作製するために有用である。本発明のポリペプチドの量が健常人に比べて増加している場合には、糖尿病であると判定することができる。
＜本発明のスクリーニングする方法＞
（１）本発明のポリペプチド、（２）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、Ａｋｔ２と結合するポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）、あるいは（３）配列番号１又は配列番号３で表される塩基配列であるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、しかも、Ａｋｔ２に結合する蛋白質であるポリペプチド（以下、ハイブリダイズポリペプチドと称する）を使用し、前記ポリペプチド（即ち本発明のポリペプチド、相同ポリペプチド又はハイブリダイズポリペプチド）とＡｋｔ２キナーゼとの相互作用を利用してインスリン抵抗性改善作用を有する物質及び／又は糖代謝改善作用を有する物質（即ち糖尿病改善薬）のスクリーニング方法を構築できる。本発明のポリペプチド、前記相同ポリペプチド及び前記ハイブリダイズポリペプチドを総称して本発明のスクリーニング用ポリペプチドと称する。
本明細書における相同ポリペプチドは、配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、Ａｋｔ２に結合するポリペプチドである限り、特に限定されるものではないが、配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列に関して、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが好ましい。
なお、本明細書における前記「相同性」とは、Ｃｌｕｓｔａｌ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ ７３，２３７−２４４，１９９８；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，４６７３−４６８０，１９９４）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値（Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）を意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓとして、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ １５．００、Ｇａｐ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｅｎａｌｔｙ ６．６６、Ｄｅｌａｙ Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ Ｓｅｑｓ（％）３０、ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｗｅｉｇｈｔ ０．５０、Ｐａｉｒｗｉｓｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓとして、Ｓｌｏｗ−Ａｃｃｕｒａｔｅで、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ １５．００、Ｇａｐ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｅｎａｌｔｙ ６．６６。
本明細書のハイブリダイズポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号１又は配列番号３で表される塩基配列であるポリヌクレオチドとハイブリダイズする、本明細書のハイブリダイズポリペプチド用の「ストリンジェントな条件」としては、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５ｘＳＳＰＥ、５ｘＤｅｎｈａｒｄ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、４０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍｌ鮭精子ＤＮＡ、３７℃オーバーナイト」の条件であり、より厳しい条件としては「５ｘＳＳＰＥ、５ｘＤｅｎｈａｒｄ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍｌ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」の条件である。また洗浄のための条件として、緩い条件としては「５ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ、４２℃」、通常「０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」の条件であり、より厳しい条件としては「０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」の条件である。
本発明のスクリーニングする方法には、本発明のスクリーニング用ポリペプチドまたは本発明のスクリーニング用ポリペプチドを発現している細胞と試験物質とを接触させる工程、該ポリペプチドとＡｋｔ２との結合を測定する工程、及び前記結合を阻害する物質を選択する工程を含むことを特徴とする前記ポリペプチドとＡｋｔ２との結合阻害物質をスクリーニングする方法が含まれる。本発明のスクリーニング用ポリペプチドを発現している細胞は、本発明のスクリーニング用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換した細胞、天然に存在する本発明のポリペプチドを発現している細胞何れでも良いが、形質転換した細胞が好ましい。
本発明のスクリーニング用ポリペプチドの一つであるＡＫＢＰ２はＡｋｔ２と結合すること、糖尿病モデルマウスで発現が低下していること、及びマウスＡＫＢＰ２を過剰発現させた脂肪細胞でＡｋｔ２活性が低下していることから、本発明のポリペプチドはＡｋｔ２との結合を介してインスリンシグナルを負に制御していることがわかった。従って、上述のスクリーニングする方法によりインスリン抵抗性改善薬及び／又は糖代謝改善薬をスクリーニングすることができる。
上述のスクリーニングする方法における本発明のスクリーニング用ポリペプチドまたは本発明のスクリーニング用ポリペプチドを発現している細胞とＡｋｔ２との結合を測定する工程は、本発明のスクリーニング用ポリペプチドとＡｋｔ２との結合を直接検出することによって実施でき、また、前記結合の変化によるＡｋｔ２の変化を測定することによっても実施できる。
本発明のスクリーニングする方法で使用する試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、市販の化合物（ペプチドを含む）、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｎ．Ｋ．Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｍ．Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｄ．Ｗ．Ｇｏｒｄｏｎ，Ｒ．Ｊ．Ｋｏｂｙｌｅｃｋｉ，Ｊ．Ｓｔｅｅｌｅ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，８１３５−７３（１９９５））によって得られた化合物群、微生物の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、あるいは、本発明のスクリーニング法により選択された化合物（ペプチドを含む）を化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を挙げることができる。
上記スクリーニングする方法として限定はされないが具体的には以下のスクリーニング方法が挙げられる。
１）Ａｋｔ２のリン酸化を利用したスクリーニング方法
Ａｋｔ２は分子内のセリン４７３番（Ｓｅｒ４７３）あるいはスレオニン３０８番（Ｔｈｒ３０８）がリン酸化されてキナーゼ活性が亢進することが知られている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９９８ ３３５（１−１３））。これを利用し、Ａｋｔ２のＳｅｒ４７３又はＴｈｒ３０８のリン酸化状態をこれらリン酸化残基に特異的に反応する抗体（例えば抗ｐｈｏｓｐｈｏＳｅｒ抗体等）を用いたウエスタンブロットにより検出することでＡｋｔ２の活性の有無が検出できる。
本発明のスクリーニング用ポリペプチドの一部あるいは全長域を発現している試験用細胞に試験物質を未処理又は処理する。試験用細胞としてはインスリンに応答する細胞が好ましく、より具体的には脂肪細胞、肝細胞、あるいは骨格筋由来細胞が好ましい。試験物質を未処理又は処理した細胞を溶解し、これを試料として抗ｐｈｏｓｐｈｏＳｅｒ抗体を用いるウエスタンブロット法、スポットウエスタンブロット法などを利用することによりＡｋｔ２のリン酸化、すなわちＡｋｔ２の活性の有無を検出することができる。好ましくは実施例７の方法で検出することができる。この検出系において、試験物質を未処理の試料に比較してＡｋｔ２のリン酸化（すなわちＡｋｔ２の活性化）の亢進が観察された試料に処理した物質を本発明のスクリーニング用ポリペプチドとＡｋｔ２との結合を阻害する物質として選択することができ、これによりインスリン抵抗性改善薬及び／又は糖代謝改善薬、即ち糖尿病治療効果を有する物質をスクリーニングすることができる。このような物質としては、該スクリーニング法におけるＡｋｔ２のリン酸化亢進作用のＥＤ５０が、１０μＭ以下、、好ましくは１μＭ以下、更に好ましくは０．１μＭ以下のものを選択することが好ましい。
２）インビトロキナーゼ法を利用したスクリーニング法
ヒストンＨ２ＢやＧＳＫ−３融合タンパク質などをＡｋｔ２の基質としてＡｋｔ２の免疫沈降物と反応させたときの、基質に対する放射性リン酸の取り込み量を測定するインビトロキナーゼアッセイ法によってもＡｋｔ２活性を検出することができる。具体的には、本発明のスクリーニング用ポリペプチドの一部あるいは全長域を発現している試験用細胞に試験物質を未処理又は処理する。試験用細胞としてはインスリンに応答する細胞が好ましく、より具体的には脂肪細胞、肝細胞、あるいは骨格筋由来細胞が好ましい。前記細胞から抗Ａｋｔ２抗体を用いた免疫沈降により活性化したＡｋｔ２蛋白質を濃縮することができる。Ａｋｔ２の基質、例えば、ＧＳＴ−ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ（Ａｋｔが生理的基質としているＧＳＫ３−ｂｅｔａ配列のＧＳＴ融合タンパク）と濃縮Ａｋｔ２蛋白質とを混合することにより、基質のリン酸化を指標としてＡｋｔ２のキナーゼ活性を測定及び定量化できる。好ましくは実施例７に記載の方法で測定することができる。キナーゼ測定は、トータルキナーゼアッセイ法（Ｗａｇａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９０，ｐｐ７１−７７，１９９６）を利用することにより大規模な数の化合物のスクリーニング方法として使用が可能である。この測定系において、試験物質を未処理の試料に比較してＡｋｔ２のキナーゼ活性の亢進が観察された試料に処理した物質を本発明のスクリーニング用ポリペプチドとＡｋｔ２との結合を阻害する物質として選択することができ、これによりインスリン抵抗性改善薬及び／又は糖代謝改善薬、即ち糖尿病治療効果を有する物質をスクリーニングすることができる。このような物質としては、該スクリーニング法におけるＡｋｔ２のキナーゼ活性亢進作用のＥＤ５０が、１０μＭ以下、、好ましくは１μＭ以下、更に好ましくは０．１μＭ以下のものを選択することが好ましい。
３）本発明のスクリーニング用ポリペプチドとＡｋｔ２との結合を利用したスクリーニング方法
本発明のスクリーニング用ポリペプチドはＡｋｔ２との結合を介してインスリンシグナルを負に制御していることから、本発明のスクリーニング用ポリペプチドとＡｋｔ２との結合を指標とした以下のスクリーニング方法が挙げられる。具体的には、本発明のスクリーニング用ポリペプチドの一部あるいは全長域、あるいはＧＳＴやＦｌａｇ、Ｈｉｓなどのタグを融合させた本発明のスクリーニング用ポリペプチドの一部あるいは全長域を発現している試験用細胞を試験物質で未処理又は処理する。試験用細胞としてはインスリンに応答する細胞が好ましく、より具体的には脂肪細胞、肝細胞、あるいは骨格筋由来細胞が好ましい。前記細胞から抗Ａｋｔ２抗体を用いた免疫沈降によりＡｋｔ２蛋白質とそこに結合する蛋白質を濃縮することができる。この濃縮過程では反応液中に上記で細胞を処理した同じ試験物質を含有させておくことが望ましい。得られたＡｋｔ２およびその結合蛋白質の濃縮液を公知の方法によりポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離し、抗体を用いたウエスタンブロティングにより本発明のスクリーニング用ポリペプチドの量を測定することにより、本発明のスクリーニング用ポリペプチドとＡｋｔ２の結合を阻害する試験物質を選択することができる。このような物質としては、上記のスクリーニング方法において、本発明のポリペプチドとＡｋｔ２との結合を阻害する作用のＩＣ５０が、好ましくは１０μＭ以下、好ましくは１μＭ以下、更に好ましくは０．１μＭ以下のものを選択することが好ましい。ここで用いる抗体は、本発明のスクリーニング用ポリペプチド或いはその部分配列をもとに作製した本発明のスクリーニング用ポリペプチドに対する抗体（例えば抗ＡＫＢＰ２抗体）、あるいは上記タグを認識する抗体を利用することができる。
以上１）〜３）のスクリーニング方法においては、試験用細胞にインスリンを未刺激又は刺激して用いることができるが、好ましくは試験用細胞にインスリン刺激して用いることができる。
また上述と同様に本発明のスクリーニング用ポリペプチドを発現している細胞の抽出液またはインビトロで転写及び翻訳して作製した蛋白質混合液に試験物質を添加あるいは未添加したものから、ＧＳＴなどのタグをつけて精製したＡｋｔ２蛋白質を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏのプルダウン法（実験工学、Ｖｏｌ１３、Ｎｏ．６、１９９４年５２８頁 松七五三ら）と上述と同様のウエスタンブロッティングを組み合わせるによってもＡｋｔ２と本発明のスクリーニング用ポリペプチドの結合を阻害する試験物質を選択することができる。好ましくは、実施例６に示すように本発明のスクリーニング用ポリペプチドを発現するプラスミド（例えば、実施例１（５）で作製したＡＫＢＰ２発現プラスミド）から直接本発明のポリペプチドからなる蛋白質（例えば、ＡＫＢＰ２蛋白質）をインビトロトランスレーションキット（例えばＴＮＴキット（プロメガ社））を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで転写及び翻訳して作製した蛋白質混合液に試験物質を添加あるいは未添加したものを用いても同様にＡｋｔ２と本発明のスクリーニング用ポリペプチドの結合を阻害する試験物質を選択することができる。これらの方法ではいずれもポリアクリルアミド電気泳動法を行わずに公知のスポットウエスタンブロッティングを行うことにより多数の試験物質をスクリーニングすることが可能である。また上述と同様のタグを融合させて発現させた本発明のスクリーニング用ポリペプチドおよびＡｋｔ２を同時に発現させた細胞の溶解液に試験物質を添加することからなる公知のＥＬＩＳＡ法に従ってもＡｋｔ２と本発明のスクリーニング用ポリペプチドの結合を阻害する試験物質を選択するスクリーニングが可能である。また公知の哺乳類細胞におけるツーハイブリッドシステム（クロンテック社）を利用して、ベイトにＧＡＬ４のＤＮＡ結合領域と融合させたＡｋｔ２を、プレイ側にＶＰ１６の転写促進領域を融合させた本発明のスクリーニング用ポリペプチドを配置することにより、既存のＣＡＴあるいはルシフェラーゼ活性の検出によりＡｋｔ２と本発明のスクリーニング用ポリペプチドとの結合を阻害する試験物質を大多数の母集団からスクリーニングし選択することが可能である。
＜インスリン抵抗性改善用及び／又は糖代謝改善用医薬組成物の製造方法＞
本発明には、本発明のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、及び製剤化する工程を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善用医薬組成物の製造方法が包含される。
本発明のスクリーニング方法により得られる物質を有効成分とする製剤は、前記有効成分のタイプに応じて、それらの製剤化に通常用いられる担体、賦形剤、及び／又はその他の添加剤を用いて調製することができる。
投与としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは、静注、筋注、若しくは関節注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げることができる。特に胃で消化されるペプチドにあっては、静注等の非経口投与が好ましい。
経口投与のための固体組成物においては、１又はそれ以上の活性物質と、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。前記組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。錠剤又は丸剤は、必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆することができる。
経口のための液体組成物は、例えば、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、又はエリキシル剤を含むことができ、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば、精製水又はエタノールを含むことができる。前記組成物は、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤を含有することができる。
非経口のための注射剤としては、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含むことができる。水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、希釈剤として、例えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、アルコール類（例えば、エタノール）、又はポリソルベート８０等を含むことができる。前記組成物は、更に湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解若しくは溶解補助剤、又は防腐剤などを含むことができる。前記組成物は、例えば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、又は照射によって無菌化することができる。また、無菌の固体組成物を製造し、使用の際に、無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもできる。
投与量は、有効成分、すなわち本発明のスクリーニング方法により得られる物質の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、又は性別等を考慮して、適宜決定することができる。
例えば、経口投与の場合、その投与量は、通常、成人（体重６０ｋｇとして）において、１日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇである。非経口投与の場合、注射剤の形では、１日につき０．０１〜５０ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇである。
【実施例】
以下、実施例によって本発明を詳述するが、本発明は該実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年」、等）に従って実施可能である。また、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って実施可能である。
＜実施例１＞マウスＡＫＢＰ２遺伝子のクローニングと発現ベクターの構築
（１）Ａｋｔ２遺伝子のクローニング
遺伝子データベースＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号Ｍ９５９３６に記載されたヒトＡｋｔ２の全長領域をコードするｃＤＮＡ配列を参照して設計した配列番号５及び配列番号６で示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとし、ヒト骨格筋ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ ｃＤＮＡ；クロンテック社）を鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社））を用いて、９５℃３分間の熱変性反応の後、９８℃１０秒間、６０℃３０秒間、７４℃１分３０秒からなるサイクルを４０回、さらに７４℃７分間の条件で、ＰＣＲを行なった。これにより生成した約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を、プラスミドｐＺＥｒＯＴＭ−２．１（インビトロジェン社）のＥｃｏＲＶ認識部位に挿入することにより、ヒトＡｋｔ２ ｃＤＮＡをクローニングした。ベクター上にクローニングしたＡｋｔ２ ｃＤＮＡの配列は前述の配列番号５及び配列番号６に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして、シーケンシングキット（アプライドバイオシステム社）及びシーケンサー（ＡＢＩ ３７００ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒアプライドバイオシステムズ社）を用いて塩基配列を決定し、報告された配列と一致することを確認した。
（２）酵母ツーハイブリッド用発現プラスミドの作製
ヒトＡｋｔ２のｃＤＮＡを酵母ツーハイブリッド用発現ベクターｐＤＢｔｒｐ（インビトロジェン社）に挿入するため、ヒトＡｋｔ２遺伝子配列のそれぞれ５’側及び３’側にｐＤＢｔｒｐベクターのマルチクローニングサイトの前後４０ヌクレオチドと相同な領域を付加した配列番号７及び配列番号８に示すプライマーを設計した。ＰＣＲは上述でクローニングしたヒトＡｋｔ２プラスミドを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、９８℃（１分）の後、９８℃（５秒）、５５℃（３０秒）、７２℃（５分）のサイクルを３５回、繰り返した。その結果得られたＤＮＡ断片はヒトＡｋｔ２遺伝子の全コード領域を有している。
制限酵素ＳａｌＩ及びＮｃｏＩで切断して直鎖状にしたベクターｐＤＢｔｒｐ及び上記で得られたヒトＡｋｔ２のｃＤＮＡを含むＰＣＲ断片を同時にツーハイブリッド用酵母株ＭａＶ２０３（インビトロジェン社）へ添加し、リチウム酢酸法により形質転換した（Ｇｕｔｈｒｉｅ Ｃ．ａｎｄ Ｆｉｎｋ Ｒ．，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９１年）。その結果同酵母細胞内で相同組換えが生じ、ｐＤＢｔｒｐのマルチクローニングサイトにＡｋｔ２ ｃＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下ｐＤＢ−Ａｋｔ２と略称する）が形成された。同プラスミドを有する酵母細胞を、プラスミドの選択マーカーであるトリプトファンを欠乏させた固形合成最小培地（ＤＩＦＣＯ社）（２０％アガロース）上にて培養することにより選択し、同酵母細胞をザイモリエース（生化学工業社）で３７℃にて３０分処理した後、アルカリ法でプラスミドを単離精製し、シーケンシングキット（アプライドバイオシステム社）及びシーケンサー（ＡＢＩ ３７００ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒアプライドバイオシステムズ社）を用いて塩基配列の決定を行い、Ａｋｔ２のｃＤＮＡが、ｐＤＢｔｒｐのＧＡＬ４ ＤＮＡ結合領域のコード領域と翻訳フレームが一致して挿入されているものを選択した。
（３）マウス脂肪組織由来ｃＤＮＡライブラリーの作製
１２週令オスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス、及び１３週令オスのＣ５７ＢＬ／ＫｓＪ−＋ｍ／＋ｍマウスを日本クレアより購入し、副睾丸脂肪から実験医学別冊バイオマニュアルシリーズ２ 遺伝子ライブラリー作製法（羊土社 野島博 編集；１９９４年２月２０日発行）に記載のｍＲＮＡ調製法に従い、Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを調製した。ストラタジーン社のＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いて、添付のプロトコールに従い、５μｇのＲＮＡを用いて第１ストランド合成、第２ストランド合成を行い、２本鎖ｃＤＮＡを平滑末端化し、キットに添付のＥｃｏＲＩアダプターを連結し、制限酵素ＥｃｏＲＩ、及びＸｈｏＩで切断した。スピンカラム（ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−４００；クロンテック社）によりサイズ分画を行い、短い断片を除いた。ベクターｐＡＣＴ２（クロンテック社）１００μｇを制限酵素ＸｈｏＩで切断し、アルカリフォスファターゼ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；宝酒造社）で処理した後、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、スピンカラム（ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−１０００；クロンテック社）にかけた。実験医学別冊バイオマニュアルシリーズ２ 遺伝子ライブラリー作製法（羊土社 野島博 編集；１９９４年２月２０日発行）のｃＤＮＡライブラリー作製法に従い、ベクターとｃＤＮＡを連結し、連結後のサンプルをミリポア社のフィルターカップ（ＵＦＣＰ３ＴＫ５０）で処理した。ギブコＢＲＬ社のエレクトロポレーション用大腸菌（ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸＴＭ ＤＨ１０Ｂ０ＴＭ Ｃｅｌｌｓ）を用いて、エレクトロポレーション法による形質転換を行い、１０００ｍｌの培養液で一晩振盪培養した。培養液中に独立コロニーが１０６個以上であることを確認し、プラスミド精製キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ；キアゲン社）を用いて、キットに添付のプロトコールに従い、プラスミドを精製した。
（４）酵母ツーハイブリッドスクリーニング
上述のｐＤＢ−Ａｋｔ２により形質転換したツーハイブリッド用酵母株ＭａＶ２０３を４００ｍｌのＹＰＤ液体培地（ＤＩＦＣＯ社）に懸濁し、波長５９０ナノメートルの吸光度が０．１から０．４になるまで３０℃で約６時間振とう培養した後、リチウム酢酸法でコンピテントセルとし、最終量を１．０ｍｌの０．１Ｍリチウム−トリス緩衝液に懸濁した。同細胞を前述（３）で作製したマウス脂肪組織由来ｃＤＮＡライブラリー各２０μｇで形質転換し、同細胞をｐＤＢ−Ａｋｔ２及びライブラリーそれぞれのプラスミドの選択マーカーであるトリプトファン、ロイシンを欠乏させた固形合成最小培地（ＤＩＦＣＯ社）（２０％アガロース）上にて培養することにより選別し、両プラスミドが導入された形質転換株を得た。同時に同じ形質転換細胞をトリプトファン、ロイシンのほかに、ツーハイブリッドシステムにおいて人工的に発現させたＧＡＬ４ ＤＮＡ結合領域の融合蛋白質に、ＧＡＬ４転写促進領域の融合蛋白質が結合した場合に発現するレポーター遺伝子ＨＩＳ３が作動した細胞を選択するため、ヒスチジンを培地から除き、さらにＨＩＳ３がコードする酵素の阻害剤である３ＡＴ（３−ＡＭＩＮＯ−１，２，４−ＴＲＩＡＺＯＬＥ；シグマ社）２０ｍＭを添加した固形最小培地（２０％アガロース）上で３０℃にて５日間培養した。同条件下でＡｋｔ２に結合する蛋白質を発現していることを示す３ＡＴ耐性の酵母のコロニーを取得した。これらの酵母細胞を２４時間ＹＰＤ固形培地上で成長させた後、ＨＩＳ３とは別のツーハイブリッドシステムの結合指示レポーターであるｌａｃＺ遺伝子の発現をβ−ガラクトシダーゼ活性を指標として調べた。β−ガラクトシダーゼ活性は培地上の酵母細胞をニトロセルロースフィルターに移し取り、液体窒素中で凍結させた後、室温で解凍し、フィルターを０．４％のＸ−ＧＡＬ（シグマ社）溶液を浸した濾紙上にのせて３７℃で２４時間静置し、β−ガラクトシダーゼによる青色変化を測定した。フィルター上に写し取った細胞内容物が白色から青色に変化したコロニーを選択することにより、Ａｋｔ２に結合する蛋白質を発現している酵母細胞を特定し、同細胞からクロンテック社Ｙｅａｓｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋの方法に従ってライブラリー由来のプラスミドを抽出した。そこに含まれる遺伝子断片の塩基配列を、配列番号９で表される塩基配列（ＧＡＬ４ ＡＤ領域に結合する配列；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 Ｕ２９８９９ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ ｐＡＣＴ２由来）をプライマーとし、シーケンシングキット（アプライドバイオシステム社）及びシーケンサー（ＡＢＩ ３７００ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒアプライドバイオシステムズ社）を用いて決定した結果、配列番号１に示す塩基配列が含まれていることを確認した。
（５）マウスＡＫＢＰ２遺伝子の開始コドンの決定
前述（４）の結果、配列番号１で表される塩基配列を含む遺伝子断片を持ったライブラリー由来のプラスミドが得られた。そこで該断片に含まれる遺伝子の開始コドンを決定するために、配列番号１で示された塩基配列の第１０３４番から第１０１１番の塩基配列の相補鎖に相当する配列番号１０で表される塩基配列のプライマーを合成（プロリゴ社）し、該プライマーと前述配列番号９で表される塩基配列のプライマーを用いて前述の脂肪組織由来ｃＤＮＡライブラリー中からＰＣＲ法により該遺伝子の発現産物由来の全長ｃＤＮＡの増幅を試みた。ＰＣＲ反応はＤＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ Ｔａｑ；宝酒造社）を用い、９４℃（３分）の後、９４℃（３０秒）・５８℃（１．５分）・７２℃（４分）のサイクルを３５回繰り返した。反応液中の同ＤＮＡ断片を発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ；インビトロジェン社）にＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇシステム（インビトロジェン社）を用いてクローニングした。得られたプラスミド中の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を、ベクター上のＴ７プロモーター領域に結合するプライマー（ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ；インビトロジェン社；配列番号１１）とシーケンシングキット（アプライドバイオシステム社）及びシーケンサー（ＡＢＩ ３７００ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ；アプライドバイオシステムズ社）を用いて決定した。その結果、該遺伝子の配列を有する様々な長さのｃＤＮＡを含むプラスミドが得られたが、最長のｃＤＮＡはいずれも前述（４）で得られた転写産物由来のｃＤＮＡとほぼ同等の鎖長であった。数度の試行でも同じ結果であったことから、該遺伝子の転写産物の鎖長および配列は（４）で得られたｃＤＮＡとほぼ一致することがわかった。これにより配列番号１に示す塩基配列の初めにあるＡＴＧが該遺伝子の開始コドンであるとわかり、配列番号１に示す該遺伝子のオープンリーディングフレームを確定した。この遺伝子をマウスＡＫＢＰ２遺伝子と名付けた。
（６）マウスＡＫＢＰ２発現ベクターの作製
前述（４）の結果、配列番号１で表される塩基配列の全長を含む遺伝子断片を持ったライブラリー由来のプラスミドが得られ、Ａｋｔ２に結合する因子の存在が示された。また前述（５）においてそのオープンリーディングフレームが確定した。そこで配列番号１に示す塩基配列情報に従い、配列番号１２及び配列番号１３に示すプライマーを合成（プロリゴ社）し、該プライマーを用いて、正味ＡＫＢＰ２蛋白質をコードするＡＫＢＰ２ ｃＤＮＡを前述の（４）で得られたプラスミドを鋳型としてＰＣＲ法により増幅した。これら２種類のＤＮＡプライマーはそれぞれ配列番号１が示すマウスＡＫＢＰ２遺伝子の５’側、３’側の部分配列と相同な塩基配列を有する。ＰＣＲ反応はＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、９８℃（１分）の後、９８℃（５秒）、５５℃（３０秒）、７２℃（５分）のサイクルを３５回繰り返した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分離した結果、約１．７ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅されたことを確認した。そこで反応液中の同ＤＮＡ断片を発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ；インビトロジェン社）にＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇシステム（インビトロジェン社）を用いてサブクローニングした。このとき用いた配列番号１３に示すプライマーはクローニング後３’側にベクター由来のＶ５エピトープ（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ ＳＶ５のＶ ｐｒｏｔｅｉｎ由来、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｊ Ａ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２，１５５１−１５５７，１９９１）及びＨｉｓ６タグ（Ｌｉｎｄｎｅｒ Ｐ ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２２，１４０−１４９，１９９７）がマウスＡＫＢＰ２遺伝子のトリプレットと同じフレームで続くように、ＡＫＢＰ２のストップコドン配列が除かれるよう設計した。得られたプラスミド中の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を、ベクター上のＴ７プロモーター領域に結合するプライマー（ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ；インビトロジェン社；配列番号１１）とシーケンシングキット（アプライドバイオシステム社）及びシーケンサー（ＡＢＩ ３７００ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ；アプライドバイオシステムズ社）を用いて決定した。その結果、配列番号１に示す正味ＡＫＢＰ２蛋白質をコードする１７１９塩基対のＡＫＢＰ２ ｃＤＮＡがＤＮＡ配列の３’側のストップコドンを除いたＤＮＡとして前述の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯに挿入されていることを確認した。以下この発現プラスミドをｐｃＤＮＡ−ＡＫＢＰ２と略記する。
＜実施例２＞ＡＫＢＰ２蛋白質を発現する培養細胞の作製
（１）ＡＫＢＰ２発現細胞の作製
上述の実施例１（５）で作製した発現プラスミドｐｃＤＮＡ−ＡＫＢＰ２又は空ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ）を２９３細胞（セルバンク社）に導入した。２９３細胞は６ウェル培養プレート（ウェル直径３５ｍｍ）の培養皿に各ウェル２ｍｌの１０％牛胎児血清（シグマ社）を含む最少必須培地ＤＭＥＭ（ギブコ社）を加えて７０％コンフルエントの状態になるまで培養した。この細胞にリン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６，１９７３、新井直子、遺伝子導入と発現／解析法１３−１５頁１９９４年）によりｐｃＤＮＡ−ＡＫＢＰ２（３．０μｇ／ウェル）を一過性に導入した。３０時間培養した後、培地を除去し、細胞をリン酸緩衝液（以下ＰＢＳと略称する）で洗浄した後にウェルあたり０．１ｍｌの細胞溶解液（１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．８）、０．２％トリトンＸ−１００）を添加して細胞を溶解した。
（２）ＡＫＢＰ２蛋白質の検出
上述実施例２（１）のＡＫＢＰ２発現細胞の溶解液１０μｌに１０μｌの２倍濃度ＳＤＳサンプルバッファー（１２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ６．８）、３％ラウリル硫酸ナトリウム、２０％グリセリン、０．１４Ｍ β−メルカプトエタノール、０．０２％ブロムフェノールブルー）を添加し、１００℃で２分間処理した後、１０％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、試料中に含まれている蛋白質を分離した。セミドライ式ブロッティング装置（バイオラッド社）を用いてポリアクリルアミドゲル中の蛋白質をニトロセルロース膜に転写した後、常法に従いウエスタンブロッティング法により該ニトロセルロース上のＡＫＢＰ２蛋白質の検出を行った。一次抗体にはＡＫＢＰ２のＣ末端に融合させたＶ５エピトープを認識するモノクローナル抗体（インビトロジェン社）を用い、二次抗体にはマウスＩｇＧ−ＨＲＰ融合抗体（バイオラッド社）を用いた。その結果、図１に示す通り、４５アミノ酸からなるＣ末端側のタグを含む６１８アミノ酸からなるＡＫＢＰ２−Ｖ５−Ｈｉｓ６融合蛋白質を示す約７０ｋＤａの蛋白質が発現ベクターｐｃＤＮＡ−ＡＫＢＰ２の遺伝子導入に依存して検出されることを確認した。これにより、培養細胞中でクローニングした前述のマウスＡＫＢＰ２遺伝子は全長領域が確かに発現し、蛋白質として安定な構造をとりうることが明らかになった。
＜実施例３＞正常マウス、高脂肪食負荷正常マウス、および糖尿病モデルマウスにおけるＡＫＢＰ２発現量の測定
上述の知見により本発明のマウスＡＫＢＰ２蛋白質はＡｋｔ２と結合し、脂肪、筋肉などのインスリン応答組織で発現していることが判明した。Ａｋｔ２蛋白質はインスリンシグナル第一経路に作用する因子であることから、本発明のＡＫＢＰ２の作用がインスリン抵抗性に関わることが予想された。そこで２型糖尿病モデルマウスＫＫＡｙ／Ｔａ（Ｉｗａｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｊａｐｏｎ．：１７，２３−３５，１９７０、Ｔａｋｅｔｏｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．，７，２４２−２４６，１９７５）および通常食もしくは高脂肪食を与えた健常マウスＣ５７ＢＬ／６Ｊの筋肉および脂肪におけるＡＫＢＰ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）発現量を測定した。
遺伝子発現量は、本発明のマウスＡＫＢＰ２遺伝子の発現量を測定し、同時に測定したグリセルアルデヒド ３−リン酸脱水素酵素（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｇ３ＰＤＨ））遺伝子の発現量により補正した。測定系としてはＰＲＩＳＭＴＭ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＳｙｓｔｅｍとＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を用いた。本測定系においてはＰＣＲで増幅された２本鎖ＤＮＡがとりこむＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ色素の蛍光量をリアルタイムに検出・定量することにより、目的とする遺伝子の発現量が決定される。
具体的には、以下の手順により測定した。
（１）全ＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）の調製
通常食又は高脂肪食負荷した１４週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス、並びに１５週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス及びＫＫＡｙ／Ｔａマウス（いずれも日本クレア社）を使用した。高脂肪食負荷は５週齢から１４週齢までの９週間行った。高脂肪食の組成は次の通りである；カゼイン２９．８％、スクロース１５．８％、ビタミンミックス１．３％、ミネラルミックス８．８％、セルロースパウダー５．０％、メチオニン０．５％、サフラワーオイル２８．９％、水１０％。一方、正常食はＣＥ−２（日本クレア社）を用いた。前記各マウスの筋肉および脂肪を摘出し、ＲＮＡ抽出用試薬（Ｉｓｏｇｅｎ；ニッポンジーン社）を用いて、説明書に従い全ＲＮＡを調製した。調製した各々の全ＲＮＡはその後デオキシリボヌクレアーゼ（ニッポンジーン社）を用いて処理し、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿して滅菌水に溶解し−２０℃で保存した。
（２）１本鎖ｃＤＮＡの合成
全ＲＮＡから１本鎖ｃＤＮＡへの逆転写は、（１）で調製した１μｇのＲＮＡ（脂肪）、１μｇのＲＮＡ（１４週齢のマウスの筋肉）、０．２５μｇのＲＮＡ（１５週齢のマウスの筋肉）をそれぞれ用い、逆転写反応用キット（ＡｄｖａｎｔａｇｅＴＭ ＲＴ−ｆｏｒ−ＰＣＲ Ｋｉｔ；クロンテック社）を用いて２０μｌの系で行った。逆転写後、滅菌水１８０μｌを加えて−２０℃で保存した。
（３）ＰＣＲプライマーの作製
４つのオリゴヌクレオチド（配列番号１４一配列番号１７）を（４）の項で述べるＰＣＲのプライマーとして設計した。マウスＡＫＢＰ２遺伝子に対しては配列番号１４と配列番号１５の組合せ、Ｇ３ＰＤＨ遺伝子に対しては配列番号１６と配列番号１７の組み合わせで使用した。
（４）遺伝子発現量の測定
ＰＲＩＳＭＴＭ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＳｙｓｔｅｍによるＰＣＲ増幅のリアルタイム測定は２５μｌの系で説明書に従って行った。各系において１本鎖ｃＤＮＡは５μｌ、２ｘＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ試薬を１２．５μｌ、各プライマーは７．５ｐｍｏｌ使用した。ここで１本鎖ｃＤＮＡは（２）で保存したものをＧ３ＰＤＨに関しては３０倍希釈、マウスＡＫＢＰ２に関しては１０倍希釈して使用した。なお検量線作成には、１本鎖ｃＤＮＡに代えて０．１μｇ／μｌのマウスゲノムＤＮＡ（クロンテック社）を適当に希釈したものを５μｌ用いた。ＰＣＲは、５０℃で１０分に続いて９５℃で１０分の後、９５℃で１５秒、６０℃で６０秒の２ステップからなる工程を４５サイクル繰り返すことにより行った。
各試料におけるマウスＡＫＢＰ２遺伝子の発現量は、下記式に基づいてＧ３ＰＤＨ遺伝子の発現量で補正した。
［ＡＫＢＰ２補正発現量］＝［ＡＫＢＰ２遺伝子の発現量（生データ）］／［Ｇ３ＰＤＨ遺伝子の発現量（生データ）］
脂肪における発現量の比較においては通常食のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの発現量を、筋肉組織における発現量の比較においてはＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの発現量を、それぞれ１とした相対量を図２に示した。
図２に示す通り、高脂肪食負荷時の脂肪および筋肉、または糖尿病モデルマウスの脂肪および筋肉において、本発明のマウスＡＫＢＰ２遺伝子の発現は顕著に増加していることが判明した。従って本発明のマウスＡＫＢＰ２は脂肪および筋肉における発現量亢進によりインスリン抵抗性を惹起すると考えられる。以上のことからインスリン抵抗性に本発明のマウスＡＫＢＰ２の関与が大きいと結論づけられる。
また本実施例の結果より、マウスＡＫＢＰ２発現量の測定により糖尿病病態の診断が出来ることが明らかとなった。
＜実施例４＞ヒトＡＫＢＰ２遺伝子のクローニング、および組織別発現分布解析
ヒト脂肪由来ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社）を鋳型とし、配列番号１８及び配列番号１９に示す一対のプライマーを用いて、前述の実施例１（５）に示したものと同様のＰＣＲ法により、ＡＫＢＰ２ヒトオルソログ遺伝子全長ｃＤＮＡの増幅を試みた。その結果得られた約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を、実施例１に示したものと同様の方法に従い塩基配列を決定したところ、配列番号３に示す遺伝子の全長ｃＤＮＡが含まれることを確認した。該遺伝子ｃＤＮＡは配列番号４に示すポリペプチドをコードする新規の遺伝子である。該遺伝子は配列番号１に示すマウスＡＫＢＰ２遺伝子と７６．８％、コードするポリペプチドは配列番号２に示すマウスＡＫＢＰ２蛋白質と７１．３％の相同性をそれぞれ有しているＡＫＢＰ２のヒトオルソログ遺伝子である。
そこで次に該ヒトＡＫＢＰ２遺伝子の配列をもとに、配列番号２０に示すプライマーを設計し、これと前述配列番号１９に示すプライマーを用いて、ヒトＡＫＢＰ２遺伝子の３’末端側約８００塩基のｃＤＮＡ断片を、ヒト各種組織由来ｃＤＮＡからＰＣＲ反応を用いて増幅を試み、各種組織におけるＡＫＢＰ２の発現の有無を調べた。ヒトの各種組織ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社）各２μｇを鋳型としてＰＣＲ反応はＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、９８℃（１分）の後、９８℃（５秒）、５５℃（３０秒）、７２℃（５分）のサイクルを３５回繰り返した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分離した結果、骨格筋、肝臓、脂肪由来の各ｃＤＮＡライブラリーから所望するヒトＡＫＢＰ２遺伝子の３’末端側部分配列を含むと思われる約８００塩基対のＤＮＡ断片が増幅された。これらのＤＮＡ断片を各々アガロースゲル中から分離した後、上述の実施例１（４）に記した方法に従い配列番号２０に示すプライマーを用いて該ＤＮＡ断片の塩基配列をそれぞれ決定した結果、配列番号３に示すヒトＡＫＢＰ２遺伝子の３’末端側の部分配列であることを確認した。このことから、ヒトＡＫＢＰ２遺伝子の発現は、インスリンシグナルに応答する脂肪、筋肉、肝臓などの限定された臓器で特異的に制御されていることが判明した。
本実施例の結果、ヒトＡＫＢＰ２はマウスＡＫＢＰ２と相同性が高く、さらにインスリン応答性組織で発現が観察されることから、マウスと同様の機能を有しており、糖尿病診断、糖尿病改善薬のスクリーニングに有用であることが明らかになった。
＜実施例５＞ヒトＡＫＢＰ２蛋白質を発現する培養細胞の作製
前述の実施例４で得られたヒトＡＫＢＰ２遺伝子の全長ｃＤＮＡを前述の実施例１（６）に示したものと同様の方法でサブクローニングした。そして配列番号３に示す正味ヒトＡＫＢＰ２蛋白質をコードする１７８２塩基対のヒトＡＫＢＰ２ ｃＤＮＡがＤＮＡ配列の３’側のストップコドンを除いたＤＮＡとして前述の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯに挿入されていることを確認した。以下この発現プラスミドをｐｃＤＮＡ−ｈｕｍａｎ ＡＫＢＰ２と略記する。この発現プラスミドｐｃＤＮＡ−ｈｕｍａｎ ＡＫＢＰ２を実施例２（１）と同様の方法でウェルあたり５．１μｇ導入し、ヒトＡＫＢＰ２タンパク質の発現を実施例２（２）の方法に従って検出した。その結果、４５アミノ酸からなるＣ末端側のタグを含む６３８アミノ酸からなるヒトＡＫＢＰ２−Ｖ５−Ｈｉｓ６融合蛋白質を示す約７０ｋＤａの白質が発現ベクターｐｃＤＮＡ−ｈｕｍａｎ ＡＫＢＰ２の遺伝子導入に依存して検出されることを確認し、クローニングした前述のヒトＡＫＢＰ２遺伝子は培養細胞中で全長領域が確かに発現し、蛋白質として安定な構造をとりうることが明らかになった。
＜実施例６＞ヒトＡＫＢＰ２とＡｋｔ２の相互作用の検証
（１）ＧＳＴ融合Ａｋｔ２発現プラスミドの作製
ヒトＡｋｔ２のｃＤＮＡをＧＳＴ融合発現ベクターｐＧＥＸ−３Ｘ（アマシャムバイオサイエンス社）に挿入するため、実施例１（１）で得られたヒトＡｋｔ２のｃＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで、ベクターｐＧＥＸ−３Ｘを制限酵素ＢａｍＨＩ及，びＥｃｏＲＩでそれぞれ切断し、直鎖状にした。また配列番号２１及び配列番号２２に示す断片をこれらの連結用断片として用いるために、前処理として各々６０℃で３０分間処理した後混合し、室温で２時間放置した。これら処理済みのヒトＡｋｔ２ ｃＤＮＡ断片、ベクターｐＧＥＸ−３Ｘ及び連結用断片を混合したものをＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ液（ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ＩＩ；宝酒造社）と混合して１６℃で３時間処理し、ｐＧＥＸ−３ＸのマルチクローニングサイトにＡｋｔ２ｃＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下ｐＧＥＸ−Ａｋｔ２と略称する）を作製した。配列番号２３に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして、シーケンシングキット（アプライドバイオシステム社）及びシーケンサー（ＡＢＩ ３７００ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒアプライドバイオシステムズ社）を用いて塩基配列の決定を行い、Ａｋｔ２のｃＤＮＡのコード領域とｐＧＥＸベクターのＧＳＴタグ翻訳フレームが一致して挿入されているものを選択した。
（２）ＧＳＴ融合Ａｋｔ２タンパク質の精製
上述の（１）で得られたプラスミドｐＧＥＸ−Ａｋｔ２を大腸菌ＢＬ２１を用いて、ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ法による形質転換を行い、２．４ｍＬの培養液で一晩振盪培養した後、その全量を４００ｍＬ培養液に移し変え、３７℃で３時間振盪培養した後、最終濃度が２．５ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（ＳＩＧＭＡ）を添加し、更に３時間振盪培養してＧＳＴ融合Ａｋｔ２蛋白質（以下ＧＳＴ−Ａｋｔ２と略記する）の発現を誘導した。菌体を回収し、公知の方法（実験工学、Ｖｏｌ１３、Ｎｏ．６、１９９４年５２８頁 松七五三ら）に従ってＧＳＴ−Ａｋｔ２をグルタチオンセファロースビーズ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ；アマシャム・ファルマシア社）上に精製した。コントロールとしてｐＧＥＸ−３Ｘで形質転換した大腸菌ＢＬ２１からＧＳＴ部分のみの蛋白質（以下ＧＳＴ蛋白質と略記する）を上述と同様に発現誘導して精製した。公知の方法に従ってＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分離及びクーマジーブリリアントブルー染色を行い、期待される分子量の蛋白質（ＧＳＴ−Ａｋｔ２；７９ｋＤａ、ＧＳＴ蛋白質；２６ｋＤａ）が精製されていることを確認した。
（３）Ａｋｔ２蛋白質とヒトＡＫＢＰ２蛋白質との生化学的結合の確認
上述（２）で作製したＧＳＴ融合Ａｋｔ２蛋白質（以下ＧＳＴ−Ａｋｔ２と略記する）を用いて、ヒトＡＫＢＰ２蛋白質とＡｋｔ２蛋白質の直接の相互作用の有無をＧＳＴ−ｐｕｌｌ ｄｏｗｎ法（実験工学、Ｖｏｌ４３、Ｎｏ．６、１９９４年５２８頁 松七五三ら）によって確認した。まず上述実施例５で作製したｐｃＤＮＡ−ｈｕｍａｎ ＡＫＢＰ２の０．５μｇを鋳型としてＴＮＴ ｋｉｔ（ＴＮＴＲＱｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ；プロメガ社）４０μｌおよびラジオアイソトープ（ｒｅｄｉｖｕｅ Ｐｒｏ−ｍｉｘ Ｌ−［３５Ｓ］；アマシャム）１．３ＭＢｑを用いて添付のプロトコールに従いｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写・翻訳によりラジオアイソトープラベルされたヒトＡＫＢＰ２蛋白質を調製した。このヒトＡＫＢＰ２蛋白質調製液各１５μｌと上述（２）でグルタチオンビーズ上に精製したＧＳＴ蛋白質あるいはＧＳＴ−Ａｋｔ２各１μｇを混合し、０．３ｍｌのＢｕｆｆｅｒ Ａ（５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１０％グリセロール、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、０．５％ＮＰ−４０）を添加して４℃で１時間振盪した。その後遠心分離によりビーズ上のＧＳＴ蛋白質あるいはＧＳＴ−Ａｋｔ２に結合する蛋白質を共沈殿させた。これを上述のＢｕｆｆｅｒ ＡのＮａＣｌ濃度を１００ｍＭに置換した緩衝液０．５ｍｌでけん濁し、再度遠心分離により共沈殿させた。この操作を４回繰り返したのち、沈殿物中の蛋白質を公知の方法に従ってＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離し、オートラジオグラフィによりヒトＡＫＢＰ２蛋白質を検出した。その結果、ＧＳＴ蛋白質を混合した場合には検出されないバンドがＧＳＴ−Ａｋｔ２を混合した場合に検出された。これにより、本発明のポリペプチドの一つであるヒトＡＫＢＰ２は、本発明のマウスＡＫＢＰ２と同様にＡｋｔ２蛋白質と相互作用することが明らかになり、これらヒト、マウスのＡＫＢＰ２は両動物種で互いに同一の機能を担うカウンターパートであることが裏付けられた。従って本発明のヒトＡＫＢＰ２は、本発明のマウスＡＫＢＰ２と同様にＡｋｔ２蛋白質との相互作用を介してインスリン抵抗性の惹起に関与することがわかった。
＜実施例７＞ＮＩＨ３Ｔ３ Ｌ１脂肪細胞におけるマウスＡＫＢＰ２過剰発現によるＡｋｔ２キナーゼ活性への影響
上述の酵母ツーハイブリッド及び生化学的結合の解析の結果から、Ａｋｔ２とＡＫＢＰ２が相互作用することが示された。そこで、ＡＫＢＰ２がＡｋｔ２の酵素（キナーゼ）活性にどのような影響を及ぼすか、培養細胞ＮＩＨ３Ｔ３ Ｌ１を用いたインビトロキナーゼアッセイで調査した。
（１）インビトロキナーゼアッセイ用基質ＧＳＴ−ｃｒｏｓｓｔｉｄｅの調製
Ａｋｔ２の生理的基質であるＧＳＫ３βのリン酸化部位をコードする配列番号２４および配列番号２５に示した合成オリゴＤＮＡを混合し、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１ベクターのＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩサイトに組み換えた。これをｐＧＳＴ−ｃｒｏｓｓｔｉｄｅとした。プラスミドｐＧＳＴ−ｃｒｏｓｓｔｉｄｅを大腸菌ＢＬ２１を用いて、ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ法による形質転換を行い、２．４ｍＬの培養液で一晩振盪培養した後、その全量を４００ｍＬ培養液に移し変え、３７℃で３時間振盪培養した後、最終濃度が２．５ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（ＳＩＧＭＡ社）を添加し、更に３時間振盪培養してＧＳＴ融合蛋白質（以下ＧＳＴ−ｃｒｏｓｓｔｉｄｅと略記する）の発現を誘導した。菌体を回収し、公知の方法（実験工学、Ｖｏｌ１３、Ｎｏ．６、１９９４年５２８頁 松七五三ら）に従ってＧＳＴ−ｃｒｏｓｓｔｉｄｅをグルタチオンセファロースビーズ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ；アマシャム・ファルマシア社）上に精製した。精製したこれらの蛋白質は、公知の方法に従ってＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分離と、クーマジーブリリアントブルー染色によりＧＳＴ−ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ蛋白質が精製されていることを確認した。
（２）アデノウイルスベクターを利用したＡＫＢＰ２高発現ウイルスの作製
マウスＡＫＢＰ２をコードする遺伝子断片を、ｐｃＤＮＡ−ＡＫＢＰ２ベクターより制限酵素ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩＩを用いて切り出し、さらにＳａｃＩＩおよびＮｏｔＩ切断断片をつくるリンカーオリゴ配列番号２６および配列番号２７を用いてアデノウイルスベクターｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶ（ジョンズホプキンス癌センターより入手）のマルチクローニングサイト（ＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩ）に挿入し、ＡＫＢＰ２／ｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶベクターを得た。
以下、公知のプロトコール［“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＡｄＥａｓｙ Ｓｙｓｔｅｍ”］（ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ“ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ／ａｄｅａｓｙ．ｈｔｍ”“ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ／ａｄｅａｓｙ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ２．ｈｔｍ”）］に従い、ＡＫＢＰ２を発現する高力価アデノウイルス液の調製を行った。コントロール用アデノウイルスは、ｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶより調製した。
なおウイルス量は２６０ｎｍにおける吸光度（Ａ２６０）を測定し、下記の計算式で換算した。
［式］ １ Ａ２６０＝１．１ｘ１０１２ウイルス粒子＝３．３ｘ１０１１ｐｆｕ／ｍｌ
（３）ＮＩＨ３Ｔ３ Ｌ１脂肪細胞におけるマウスＡＫＢＰ２過剰発現およびＡｋｔ２の免疫沈降
ＮＩＨ３Ｔ３ Ｌ１細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に懸濁し、８ｘ１０５個／穴になるようにコラーゲンコートした６穴プレート（旭テクノグラス社）にまいた。翌日、１０μｇ／ｍｌインスリン、２５０ｎＭデキサメサゾン、０．５ｍＭ ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を加えたＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）に培地を交換して３Ｔ３−Ｌ１細胞の分化を誘導した。その２日後、培地を０．４ｍｌのＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）に戻した。その４日後、ＡＫＢＰ２を発現させるアデノウイルスを１穴あたり８ｘ１０１０ｐｆｕの濃度で培地に添加した。コントロールとしてはＧＦＰのみを発現させるアデノウイルスを用いた。
アデノウイルス感染３６時間後より１６時間、無血清ＤＭＥＭ培地で培養し、１００ｎＭインスリンにより所定の時間（０、３０、６０分間）刺激し、ただちに細胞溶解液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、０．５ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、０．１％２−メルカプトエタノール、５０ｍＭ ＮａＦ、５ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１０ｍＭ β−Ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ）５００μｌ中に溶解した。１５０００ｒｐｍ、２０分間の遠心後、上清に抗Ａｋｔ２抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ社）およびＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）により免疫沈降した。免疫沈降物は細胞溶解液で２回、洗浄液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．０３％Ｂｒｉｊ３５、０．１％２−メルカプトエタノール）で２回、反応液（２０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．２、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ β−Ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ）で２回洗浄し、キナーゼ反応に供与した。
（４）インビトロキナーゼアッセイ
上記免疫沈降物を２０μｌの反応液にけん濁した。さらに、１５μＭ ＡＴＰ、１０μＣｉ［γ３２Ｐ］−ＡＴＰ、３μｇ ＧＳＴ−ｃｒｏｓｓｔｉｄｅを含む反応液を加え、３０℃で２０分間加温した。反応は、１０μｌの４ｘＳＤＳサンプルバッファーを加えて停止した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離後、ＧＳＴ−ｃｒｏｓｓｔｉｄｅに取り込まれた放射活性をＢＡＳ２０００バイオイメージングアナライザー（富士フィルム社）により解析し、定量した。図３に示すように、インスリン無刺激状態におけるコントロールウイルス（ＧＦＰ）およびＡＫＢＰ２を感染させたＮＩＨ３Ｔ３ Ｌ１細胞を比較した場合、Ａｋｔ２のキナーゼ活性はＡＫＢＰ２過剰発現によりコントロールより０．８２倍に低下した。同様に１００ｎＭインスリン刺激によるＡｋｔ２の活性上昇を観察したところ、ＧＦＰ感染細胞では、無刺激状態に比べ１．３９倍（３０分）、１．５倍（６０分）の酵素活性の上昇を示したのに対し、ＡＫＢＰ２ウイルスを感染させた細胞では、刺激依存的な活性上昇は１．３０倍（３０分）および１．２２倍（６０分）しか示さなかった。また、Ａｋｔ２の活性化にセリン４７３番のリン酸化が重要であることから、上述のインスリン刺激後に免疫沈降したＡｋｔ２を抗リン酸化セリン４７３抗体（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社）を用いてウエスタンブロット解析したところ、無刺激時のリン酸化状態は、ＡＫＢＰ２ウイルスを感染させた細胞においてコントロールウイルス感染細胞より低下していた。また、３０分間のインスリン刺激により、ＡＫＢＰ２ウイルスを感染させた細胞とコントロールウイルス感染細胞において共に刺激依存的なリン酸化の亢進が認められたが、そのリン酸化亢進の程度は、ＡＫＢＰ２ウイルスを感染させた細胞においてはコントロールウイルス感染細胞より弱められており、インビトロキナーゼアッセイの結果を支持した。以上の結果より、本発明のマウスＡＫＢＰ２は、Ａｋｔ２と相互作用し、そのインスリン非依存的な酵素活性に加え、インスリン依存的な酵素活性上昇を低下させることによりインスリン抵抗性を惹起していると考えられる。
【産業上の利用可能性】
Ａｋｔ２に結合する性質を有し、Ａｋｔ２のキナーゼ活性を低下させ、糖尿病態において発現量が増加する本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドは、糖尿病の診断に有用である。また、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクター及び細胞は本発明のポリペプチドとＡｋｔ２との結合を阻害する物質（すなわちＡｋｔ２の働きを増強させる物質）のスクリーニングに有用である。該スクリーニングにより選択される物質はインスリン抵抗性改善薬並びに糖尿病改善薬の候補物質として有用である。
【配列表フリーテキスト】
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号５〜８、１０〜２７の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。配列番号９の配列で表される塩基配列は、クローニングベクターｐＡＣＴ２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ２９８９９）の第５１８３番（５’）〜第５１６２番（３’）の塩基からなる配列である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【技術分野】
本発明は、Ａｋｔ２に結合する新規なポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードする新規なポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、該ベクターを含有する形質転換細胞及び前記ポリペプチドとＡｋｔ２との結合阻害物質をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
インスリンは膵臓ランゲルハンス島のβ細胞より分泌され、主に筋肉、肝臓、脂肪に作用して血中の糖を細胞に取り込ませて貯蔵、消費させることにより血糖値を降下させる。糖尿病は、このインスリンの作用不足から引き起こされるが、患者にはインスリンの生産又は分泌に障害をもつ１型と、インスリンによる糖代謝促進が起こりにくくなる２型の２つのタイプが存在する。いずれの患者でも血糖値が健常人より高くなるが、１型では血中インスリンが絶対的に不足するのに対して、２型ではインスリンの存在にもかかわらず血糖の細胞における取り込み又は消費が促進されないインスリン抵抗性が生じている。２型糖尿病は遺伝的素因に加えて過食や運動不足、ストレスなどが原因となり惹起されるいわゆる生活習慣病である。今日先進諸国では摂取カロリーの増大に伴いこの２型糖尿病患者が急激に増加しており、日本では糖尿病患者の９５％を占めている。そのため糖尿病の治療薬には単純な血糖降下剤のみでなく、インスリン抵抗性の改善により糖代謝を促進する２型糖尿病の治療を対象とした研究の必要性が高まっている。
現在１型糖尿病患者の治療にはインスリン注射製剤が処方されている。一方、２型患者に処方される血糖降下剤としては、インスリン注射製剤に加えて膵臓のβ細胞に作用してインスリンの分泌を促すスルホニル尿素系血糖降下剤（ＳＵ剤）や、嫌気的解糖作用による糖利用の増大や糖新生の抑制、及び糖の腸管吸収を抑制する作用を持つビグアナイド系血糖降下剤の他、糖質の消化吸収を遅らせるα−グルコシダーゼ阻害剤が知られている。これらは間接的にインスリン抵抗性を改善するが、近年より直接的にインスリン抵抗性を改善する薬剤としてチアゾリジン誘導体が使われるようになった。その作用は細胞内へのブドウ糖の取り込みと細胞内におけるブドウ糖利用の促進である。このチアゾリジン誘導体はペルオキシソーム増殖剤応答性受容体ガンマ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＰＰＡＲγ）のアゴニストとして作用することが示されている（非特許文献１参照）。しかしチアゾリジン誘導体はインスリン抵抗性を改善するのみでなく、浮腫を惹起する副作用が知られている（非特許文献２、非特許文献３参照）。この浮腫の惹起は心肥大をもたらす重篤な副作用なので、インスリン抵抗性改善のために、ＰＰＡＲγにかわるより有用な創薬標的分子が求められている。
インスリン作用のシグナルは細胞膜上にあるインスリン受容体を介して細胞内へ伝達される。このインスリンの作用経路には第一と第二の２経路が存在する。（非特許文献４参照）。第一経路においては、活性化されたインスリン受容体からＩＲＳ−１、ＩＲＳ−２、ＰＩ３キナーゼ、及びＰＤＫ１を介してＡｋｔ１（ＰＫＢα）若しくはＡｋｔ２（ＰＫＢβ）、またはＰＫＣλ若しくはＰＫＣζへ順次シグナルが伝達され、その結果として細胞内に存在するグルコーストランスポーターＧＬＵＴ４を細胞膜上へ移行させることにより、細胞外からの糖の取り込みを促進する（非特許文献５参照）。一方、第二経路ではインスリン受容体からｃ−ＣｂＩ及びＣＡＰを介してＣｒＫＩＩ、Ｃ３Ｇ、並びにＴＣ１０へ順次シグナルが伝達され、結果ＧＬＵＴ４による糖の取り込みを促進する（非特許文献６参照）。しかし、これらインスリンシグナル伝達経路の詳細についてはいまだ不明な部分が多く、特にこれらのシグナルが最終的にどのような機構を経てグルコーストランスポーターを介した細胞の糖取り込みを促進するのか明らかではない。
Ａｋｔ２は前述のインスリンシグナル第一経路に存在し、インスリンの刺激によりＰＤＫ１を介してリン酸化され活性化する。活性化したＡｋｔ２はキナーゼとして基質となる蛋白質をリン酸化することによりシグナルを伝達する。Ａｋｔ２蛋白質をコードする遺伝子を人為的に欠失させたホモノックアウトマウスは主に筋肉、肝臓においてインスリンの感受性が低下し２型糖尿病様の表現型を示すことが報告されている。これらの事実から、Ａｋｔ２はインスリンシグナルに応答した細胞内への糖取り込みに働くシグナル仲介因子であり、その機能阻害はインスリンシグナル伝達の部分的な遮断によりインスリン抵抗性を惹起すると考えられている（非特許文献７参照）。
【非特許文献１】「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、（米国）、１９９５年、第２７０巻、ｐ．１２９５３−１２９５６
【非特許文献２】「ダイアビーティーズ フロンティア（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｆｒｏｎｔｉｅｒ）」、（米国）、１９９９年、第１０巻、ｐ．８１１−８１８
【非特許文献３】「ダイアビーティーズ フロンティア（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｆｒｏｎｔｉｅｒ）」、（米国）、１９９９年、第１０巻、ｐ．８１９−８２４
【非特許文献４】「ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）」（米国）、２０００年、第１０６巻、第２号、ｐ．１６５−１６９
【非特許文献５】「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、（米国）、１９９９年、第２７４巻、第４号、ｐ．１８６５−１８６８
【非特許文献６】「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、（英国）、２００１年、第４１０巻、第６８３１号、ｐ．９４４−９４８
【非特許文献７】「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」（米国）、２００２年、第２９２巻、第２号、ｐ．１７２８−１７３１
【発明の開示】
本発明者らは、上述の知見からＡｋｔ２の働きを増強させることができれば、インスリン抵抗性を改善できると考えた。そしてこの目的は、Ａｋｔ２自身の活性を増大させるか、Ａｋｔ２に結合してその作用を制御している細胞内因子を同定し、その作用を調節することにより達成できると考えた。しかしＡｋｔ２はキナーゼであり、その酵素活性を薬剤によって増強する方向に調節することは困難である。そこでＡｋｔ２に結合する蛋白質を、酵母ツーハイブリッドシステムにより同定した。その結果、Ａｋｔ２に結合する蛋白質ＡＫＢＰ２（Ａｋｔ２ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２）をコードする新規な塩基配列のマウス由来ｃＤＮＡのクローニングに成功した。さらに同蛋白質は糖尿病モデルマウスの筋肉および脂肪において正常個体より発現量が顕著に増加していることから同蛋白質が糖尿病態の原因因子であることを見出した。加えて、ヒトオルソログであるヒトＡＫＢＰ２遺伝子のクローニングに成功し、該遺伝子がインスリン応答組織である脂肪細胞に発現していること、マウスＡＫＢＰ２と同様ヒトＡＫＢＰ２もＡｋｔ２に結合することを見出した。加えて、マウスＡＫＢＰ２過剰発現によりＡｋｔ２のキナーゼ活性が低下することを検出し、ＡＫＢＰ２によりインスリンシグナルが遮断されインスリン抵抗性が惹起されること、従って、ＡＫＢＰ２とＡｋｔ２との結合を阻害することによりインスリン抵抗性が改善されることがわかった。そこで、ＡＫＢＰ２とＡｋｔ２との相互作用を利用したインスリン抵抗性改善薬及び／又は糖代謝改善薬のスクリーニング系を構築した。
これらの結果、インスリン抵抗性改善薬及び／又は糖代謝改善薬の探索に有用な新規なポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記発現ベクターで形質転換された細胞、インスリン抵抗性改善薬及び／又は糖代謝改善薬をスクリーニングする方法、並びに、インスリン抵抗性改善用及び／又は糖代謝改善用医薬組成物の製造方法を提供し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
［１］配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列、あるいは、配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列
を含み、しかもＡｋｔ２と結合するポリペプチド、
［２］配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
［３］［１］又は［２］に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
［４］［３］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
［５］［４］に記載の発現ベクターで形質転換された細胞、
［６］（１）［１］若しくは［２］に記載のポリペプチド、または配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかもＡｋｔ２と結合するポリペプチド、あるいは前記ポリペプチドを発現している細胞と（２）試験物質とを接触させる工程、
該ポリペプチドとＡｋｔ２との結合を測定する工程、及び
前記結合を阻害する物質を選択する工程
を含むことを特徴とする前記ポリペプチドとＡｋｔ２との結合阻害物質をスクリーニングする方法、
［７］結合阻害物質がインスリン抵抗性改善薬及び／又は糖代謝改善薬である［６］に記載のスクリーニングする方法。
［８］（１）［１］又は［２］に記載のポリペプチド、あるいは配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、Ａｋｔ２と結合するポリペプチドと（２）Ａｋｔ２との結合を測定する工程が、前記結合の変化によるＡｋｔ２の変化を測定する工程である［６］又は［７］に記載のスクリーニングする方法。
［９］［６］乃至［８］に記載のスクリーニングする方法を用いてスクリーニングする工程、及び
製剤化する工程
を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善用及び／又は糖代謝改善用医薬組成物の製造方法
に関する。
配列番号１〜４に記載の本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドと同一の配列は知られていない。本願優先日後に、配列データベースＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号ＡＸ７１４０４３、ＢＣ０４２１５５、及びＢＣ０４９１１０として本発明のポリヌクレオチドと相同性を有する配列が収載されたが、配列が開示されたにすぎず、その具体的用途については記載されていない。また、配列データベースＧｅｎＰｅｐｔには、アクセッション番号ＡＫ０５６０９０として、本発明のポリペプチドの一つである配列番号４で表されるアミノ酸配列において、６８個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるポリペプチド、及びアクセッション番号ＡＫ０１９１０５として、本発明のポリペプチドの一つである配列番号２で表されるアミノ酸配列において、２２８個のアミノ酸が欠失し、１３個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが収載されている。しかしながら、実際にこれらポリペプチドを取得したとの情報はおろか、どのように取得できるかの具体的情報もない。また、当該ポリペプチドの具体的用途についても記載されていない。本発明者らは本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドを初めて見出し、その蛋白質の発現亢進及びＡｋｔ２との結合の増加が糖尿病病態の原因であることを初めて明らかにした。また、本発明のポリペプチドとＡｋｔ２との結合を利用した本発明のスクリーニング方法は本発明者らによって初めて提供された方法である。
【図面の簡単な説明】
図１は、培養細胞におけるＡＫＢＰ２の発現を示す図である。レーン１及びレーン３は分子量マーカーを、レーン２は空ベクターを、レーン３はｐｃＤＮＡ−ＡＫＢＰ２を導入した場合を示している。
図２の（１）は、通常食又は高脂肪食負荷した正常マウスＣ５７ＢＬ／６Ｊにおける脂肪でのＡＫＢＰ２発現量の比較を示す図である。図の縦軸はマウス脂肪における相対発現量を示す。白塗りのバーは通常食、黒塗りのバーは高脂肪食負荷した場合を示している。
（２）は、通常食又は高脂肪食負荷した正常マウスＣ５７ＢＬ／６Ｊにおける筋肉でのＡＫＢＰ２発現量の比較を示す図である。図の縦軸はマウス筋肉における相対発現量を示す。白塗りのバーは通常食、黒塗りのバーは高脂肪食負荷した場合を示している。
（３）は、正常マウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ及び糖尿病モデルマウスＫＫＡｙ／Ｔａにおける脂肪でのＡＫＢＰ２発現量の比較を示す図である。図の縦軸はマウス脂肪における相対発現量を示す。白塗りのバーは正常マウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ、線入りのバーは糖尿病モデルマウスＫＫＡｙ／Ｔａの結果を示している。
（４）は、正常マウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ及び糖尿病モデルマウスＫＫＡｙ／Ｔａにおける筋肉でのＡＫＢＰ２発現量の比較を示す図である。図の縦軸はマウス筋肉における相対発現量を示す。白塗りのバーは正常マウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ、線入りのバーは糖尿病モデルマウスＫＫＡｙ／Ｔａの結果を示している。
（１）、（２）の比較においては通常食のＣ５７ＢＬ／６Ｊの発現量を、（３）、（４）の比較においてはＣ５７ＢＬ／６Ｊの発現量を、それぞれ１として表示している。
図３は、ＮＩＨ３Ｔ３ Ｌ１脂肪細胞におけるマウスＡＫＢＰ２過剰発現によるＡｋｔ２酵素活性への影響を示す図である。図の縦軸は相対活性を示しており、インスリン無刺激状態におけるコントロールウイルス感染細胞における酵素活性の値を１として表示している。図の横軸の数値は、インスリンの刺激時間（分）を示している。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜本発明のポリペプチド＞
本発明のポリペプチドには、
（１）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；及び
（２）ｉ）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかもＡｋｔ２に結合するポリペプチド、あるいは、ｉｉ）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個（好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜３個）のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもＡｋｔ２に結合するポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）
が含まれる。
本発明のポリペプチドは、Ａｋｔ２と結合し、Ａｋｔ２のキナーゼ活性を低下させるものが特に好ましい。
また、本発明のポリペプチドは、前述の（１）〜（２）のいずれかに該当する限りヒト及びマウス由来のポリペプチドに限定されず、他の脊椎動物（例えばラット、ウサギ、ウマ、ヒツジ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ブタ、ニワトリなど）由来のものも包含する。また、前述の（１）〜（２）のいずれかに該当する限り、天然のポリペプチドに限定されず人工的に製造した変異体も含まれる。
「Ａｋｔ２に結合する」とは、Ａｋｔ２（好ましくはヒトＡｋｔ２、更に好ましくはＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号Ｍ９５９３６によりコードされるポリペプチド）にポリペプチドが結合することを意味しており、「結合する」か否かは以下の方法により確認することができる。
結合するか否かの検討対象ポリペプチドの一部若しくは全長域、またはＧＳＴやＦｌａｇ、Ｈｉｓなどのタグを融合させた検討対象ポリペプチドの一部若しくは全長域を細胞に発現させる。前記細胞としてはインスリンに応答する細胞が好ましく、より具体的には脂肪細胞、肝細胞、あるいは骨格筋由来細胞が好ましい。前記細胞から抗Ａｋｔ２抗体を用いた免疫沈降によりＡｋｔ２蛋白質とそこに結合する蛋白質を濃縮することができる。得られたＡｋｔ２およびその結合蛋白質の濃縮液を公知の方法によりポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離し、抗体を用いたウエスタンブロティングにより検討対象のポリペプチドがＡｋｔ２に結合するか否かを確認することができる。ここで用いる抗体は、検討対象のポリペプチド若しくはその部分配列をもとに作製した検討対象のポリペプチドに対する抗体、または上記タグを認識する抗体を利用することができる。
また検討対象のポリペプチドを発現させた細胞の抽出液、または、インビトロで転写及び翻訳して作製した蛋白質混合液と、ＧＳＴなどのタグをつけて精製したＡｋｔ２蛋白質とを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏのプルダウン法（実験工学、Ｖｏｌ１３、Ｎｏ．６、１９９４年５２８頁 松七五三ら）と上述と同様のウエスタンブロッティングを組み合わせるによってもＡｋｔ２と検討対象のポリペプチドの結合を検出することができる。好ましくは、実施例６に示すように検討対象蛋白質発現用プラスミド（例えば実施例１（５）で作製したＡＫＢＰ２蛋白質発現用プラスミド）から直接検討対象蛋白質をインビトロトランスレーションキット（例えばＴＮＴキット（プロメガ社））を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで転写及び翻訳して作製した蛋白質混合液を用いて結合を検出できる。より好ましくは、実施例６に記載の方法により検討対象のポリペプチドとＡｋｔ２との結合を検出することができる。「Ａｋｔ２のキナーゼ活性を低下させる」とは、検討対象のポリペプチドがＡｋｔ２に結合することによりＡｋｔ２の有するキナーゼ活性を低下させることを意味する。「キナーゼ活性を低下」させるか否かは、以下の方法により確認することができる。
Ａｋｔ２は分子内のセリン４７３番（Ｓｅｒ４７３）あるいはスレオニン３０８番（Ｔｈｒ３０８）がリン酸化されてキナーゼ活性が亢進することが知られている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９９８ ３３５（１−１３））。これを利用し、Ａｋｔ２のＳｅｒ４７３又はＴｈｒ３０８のリン酸化状態をこれらリン酸化残基に特異的に反応する抗体（例えば抗ｐｈｏｓｐｈｏＳｅｒ抗体等）を用いたウエスタンブロットにより検出することでＡｋｔ２の活性の有無が検出できる。より具体的には、検討対象のポリペプチドの一部若しくは全長域を発現させた細胞（インスリンに応答する細胞が好ましく、より具体的には脂肪細胞、肝細胞、または骨格筋由来細胞が好ましい）を溶解し、これを試料として抗ｐｈｏｓｐｈｏＳｅｒ抗体を用いるウエスタンブロット法、スポットウエスタンブロット法などを利用することによりＡｋｔ２のリン酸化、すなわちＡｋｔ２の活性の有無を検出することができる。好ましくは実施例７の方法で検出することができる。この検出系において、検討対象のポリペプチドを発現させない細胞から得た試料に比較して検討対象のポリペプチドを発現させた細胞から得た試料を用いたときのＡｋｔ２のリン酸化（すなわちＡｋｔ２の活性化）の低下が観察された場合、検討対象のポリペプチドは「Ａｋｔ２のキナーゼ活性を低下させる」と判断することができる。
また、ヒストンＨ２ＢやＧＳＫ−３融合タンパク質などをＡｋｔ２の基質としてＡｋｔ２の免疫沈降物と反応させたときの、基質に対する放射性リン酸の取り込み量を測定するインビトロキナーゼアッセイ法によっても「Ａｋｔ２のキナーゼ活性を低下」させるか否か確認することができる。具体的には、検討対象のポリペプチドの一部または全長域を発現させた細胞（インスリンに応答する細胞が好ましく、より具体的には脂肪細胞、肝細胞、あるいは骨格筋由来細胞が好ましい）の抽出液から抗Ａｋｔ２抗体を用いた免疫沈降によりＡｋｔ２蛋白質を濃縮することができる。Ａｋｔ２の基質、例えば、ＧＳＴ−ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ（Ａｋｔの生理的基質であるＧＳＫ３−ｂｅｔａ配列のＧＳＴ融合蛋白質）と濃縮Ａｋｔ２蛋白質とを混合することにより、基質のリン酸化を指標としてＡｋｔ２のキナーゼ活性を測定及び定量化できる。好ましくは実施例７に記載の方法で測定することができる。この測定系において、検討対象のポリペプチドを発現させない細胞から得た試料に比較して検討対象のポリペプチドを発現させた細胞から得た試料を用いたときの基質のリン酸化の低下が観察された場合、検討対象のポリペプチドは「Ａｋｔ２のキナーゼ活性を低下させる」と判断することができる。
＜本発明のポリヌクレオチド＞
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド、すなわち、配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド、またはその機能的等価改変体をコードする塩基配列ならいずれの種由来のものであってもよい。好ましくは、配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、さらに好ましくは、配列番号１又は配列番号３に記載の塩基配列である。なお、本明細書における「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれる。
本発明のポリヌクレオチドには、本発明のポリペプチドをコードする限り、あらゆる変異体を含むことが出来る。より具体的には天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、欠失、置換、付加及び挿入を有する変異体を含むことが出来る。前記の変異は、例えば天然において突然変異によって生じることもあるが、人為的に改変し作製することも出来る。本発明は、上記ポリヌクレオチドの変異の原因及び手段を問わず、上記本発明のポリペプチドをコードする全ての変異遺伝子を包含する。上記の変異体作製にいたる人為的手段としては、例えば塩基特異的置換法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、（１９８７）１５４、３５０，３６７−３８２）等の遺伝子工学的手法の他、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイド法などの化学合成手段（Ｓｃｉｅｎｃｅ １５０、１７８、１９６８）を挙げることができる。それらの組み合わせによって所望の塩基置換を伴うＤＮＡを得ることが可能である。あるいはＰＣＲ法の繰り返し作業や、その反応液中にマンガンイオンなどを存在させることによりＤＮＡ分子中の非特定塩基に置換を生じさせることが可能である。
本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、本発明により開示された配列情報に基づいて一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することが出来る。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば次のように得ることができるが、この方法に限らず公知の操作「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年」等でも得ることができる。
例えば、（１）ＰＣＲを用いた方法、（２）常法の遺伝子工学的手法（すなわちｃＤＮＡライブラリーで形質転換した形質転換株から所望のアミノ酸を含む形質転換株を選択する方法）を用いる方法、又は（３）化学合成法などを挙げることができる。各製造方法については、ＷＯ０１／３４７８５に記載されているのと同様に実施できる。
ＰＣＲを用いた方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ａ）第１製造法に記載された手順により、本明細書記載のポリヌクレオチドを製造することができる。該記載において、「本発明の蛋白質を産生する能力を有するヒト細胞あるいは組織」とは、例えば、脂肪細胞を挙げることができる。ヒト又はマウス脂肪細胞からｍＲＮＡを抽出する。次いで、このｍＲＮＡをランダムプライマーまたはオリゴｄＴプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行い、第一鎖ｃＤＮＡを合成することが出来る。得られた第一鎖ｃＤＮＡを用い、目的遺伝子の一部の領域をはさんだ２種類のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供し、本発明のポリヌクレオチドまたはその一部を得ることができる。より具体的には、例えば実施例１及び実施例４に記載の方法により本発明のポリヌクレオチドを製造することが出来る。
常法の遺伝子工学的手法を用いる方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ｂ）第２製造法に記載された手順により、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを製造することができる。
化学合成法を用いた方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ｃ）第３製造法、ｄ）第４製造法に記載された方法によって、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを製造することができる。
このようにして得られる本発明のポリヌクレオチドの一部または全部の塩基配列を利用することにより、個体もしくは各種組織における本発明のポリヌクレオチドの発現レベルを特異的に検出することが出来る。
かかる検出方法としては、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ノーザンブロッティング解析、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどの方法を挙げることが出来る。
＜本発明の発現ベクター、細胞、及びポリペプチドの製造法＞
本発明には、本発明の形質転換された細胞を培養することを特徴とする本発明のポリペプチドの製造方法も包含される。
上述のように得られた本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年」等に記載の公知の方法により、適当なプロモーターの下流に連結することで本発明のポリペプチドを試験管内、あるいは試験細胞内で発現させることに利用できる。
具体的には上述のように得られた本発明のポリペプチドの開始コドン上流に特定のプロモーター配列を含むポリヌクレオチドを付加することにより、これを鋳型として用いた無細胞系での遺伝子の転写、翻訳による本発明のポリペプチドの発現が可能である。
あるいは上述の本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを適当なベクタープラスミドに組み込み、プラスミドの形で宿主細胞に導入すれば細胞内で本発明のポリペプチドの発現が可能になる。あるいは、このような構成が染色体ＤＮＡに組み込まれた細胞を取得してこれを用いてもよい。より具体的には、単離されたポリヌクレオチドを含む断片は、適当なベクタープラスミドに再び組込むことにより、真核生物及び原核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。さらに、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞において本発明のポリペプチドを発現させることが可能である。宿主細胞は、特に限定されるわけではなく、本発明のポリペプチドの発現量をメッセンジャーＲＮＡレベルで、あるいは蛋白質レベルで検出できるものであればよい。内在性のＡｋｔ２が豊富に存在する脂肪由来細胞、あるいは筋肉由来細胞を宿主細胞として用いることがより好ましい。
宿主細胞を形質転換し遺伝子を発現させる方法は、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」２）本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明の組換え蛋白の製造方法に記載された方法により実施できる。発現ベクターは、所望のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではない。例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、所望のポリヌクレオチドを挿入することにより得られる発現ベクターを挙げることができる。本発明の細胞は、例えば、前記発現ベクターにより所望の宿主細胞をトランスフェクションすることにより得ることができる。より具体的には、例えば、実施例２に記載のように所望のポリヌクレオチドを哺乳類動物細胞用の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１に組み込むことにより、所望の蛋白質の発現ベクターを得ることができ、該発現ベクターをリン酸カルシウム法を用いて２９３細胞に取り込ませて本発明の形質転換細胞を製造することができる。
上記で得られる所望の形質転換細胞は、常法に従い培養することができ、該培養により所望の蛋白質が生産される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択できる。例えば上記２９３細胞であれば牛胎児血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したダルベッコ修飾イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地にＧ４１８を加えたものを使用できる。本発明の形質転換された細胞としては、本発明のポリペプチドを発現している細胞が好ましい。
本発明の細胞を培養することにより、細胞中で産生した本発明のポリペプチドを検出、定量、さらには精製することが出来る。例えば、本発明のポリペプチドと結合する抗体を用いたウエスタンブロット法、あるいは免疫沈降法により本発明のポリペプチドを検出、精製することが可能である。あるいは、本発明のポリペプチドを、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、プロテインＡ、β−ガラクトシダーゼ、マルトースバインディングプロテイン（ＭＢＰ）など適当なタグ蛋白質との融合蛋白質として発現させることにより、これらタグ蛋白質に特異的な抗体を用いてウエスタンブロット法、あるいは免疫沈降法により本発明のポリペプチドを検出、タグ蛋白質を利用して精製することが出来る。より具体的には以下のようにしてタグ蛋白質を利用して精製することができる。
本発明のポリペプチド（例えば、配列番号２又は配列番号４で表されるポリペプチド）は、本発明のポリヌクレオチド（例えば、配列番号１及び３で示されるポリヌクレオチド）を例えばＨｉｓタグが融合されるベクター、より具体的には例えば実施例１に記載のｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社）等に組み込むことで培養細胞に発現させ、Ｈｉｓタグを用いて精製した後でタグ部分を除去することにより得ることができる。例えば実施例１あるいは実施例５においてｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯを用いて作製したマウスあるいはヒトのＡＫＢＰ２発現プラスミドは、いずれもＡＫＢＰ２のＣ−末端にＶ５およびＨｉｓタグが付加されるように設計されている。これにより、それらのＨｉｓタグを利用して、実施例２あるいは実施例５に示したＡＫＢＰ２を発現させた培養細胞からＡＫＢＰ２蛋白質を精製することができる。具体的には公知の方法（実験医学別冊タンパク質の分子間相互作用実験法、１９９６年３２頁 中原ら）に従って、破砕した細胞の抽出液よりＨｉｓタグと融合したＡＫＢＰ２蛋白質をＮｉ２＋−ＮＴＡ−Ａｇａｒｏｓｅ（フナコシ）に結合させて遠心分離により単離することができる。より具体的には培養フラスコ（例えば１０ｃｍ径のシャーレ）に培養させた本発明のポリペプチド発現細胞を適当な量の緩衝液（例えば、１ｍｌ）を加えて掻き取った後、毎分１５０００回転で５分間の遠心分離によって上清を分離し、適当な緩衝液で置換した適量（例えば５０μＭ）のＮｉ２＋−ＮＴＡ−Ａｇａｒｏｓｅを加えて十分に混合する（例えば、ローテーターで１０分以上撹拌する）ことができる。続いて遠心分離（例えば毎分２０００回転で２分間）により上清を分離して除去し、ｐＨを６．８にした緩衝液を適量（例えば０．５ｍｌ）加えて再度遠心分離することにより洗浄する。これを３回繰り返した。後適量（例えば５０μｌ）の１００ｍＭ ＥＤＴＡを加えて１０分置き、上清を回収することにより遊離した本発明のポリペプチドを精製することができる。上記緩衝液としては、例えば緩衝液Ｂ（８Ｍ Ｕｒｅａ，０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４，０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４，０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０）を用いることができる。精製した蛋白質分子中のＨｉｓタグは、例えばＮ末端がわにＨｉｓタグを融合させる様設計することによりＴＡＧＺｙｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（キアゲン社）を用いることで分子中から除去することができる。
あるいは所望により、タグ蛋白質を利用しない方法、例えば、本発明のポリペプチドからなる蛋白質の物理的性質、化学的性質を利用した各種の分離操作によっても精製できる。具体的には限外濾過、遠心分離、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーの利用を例示することが出来る。
本発明のポリペプチドは、配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列情報に従って、一般的な化学合成法により製造することが出来る。具体的には液相、及び固相法によるペプチド合成法が包含される。合成はアミノ酸を１個ずつ逐次結合させても、数アミノ酸からなるペプチド断片を合成した後に結合させてもよい。これらの手段により得られる本発明ポリペプチドは前記した各種の方法に従って精製を行うことが出来る。
＜糖尿病の検査方法＞
本発明のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするプローブを用いることにより、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現量を調べることができ、その発現量（好ましくは脂肪組織における発現量）の増加を指標として糖尿病の診断をすることができる。糖尿病の検査方法において、「ストリンジェントな条件」とは、非特異的な結合が起こらない条件を意味し、具体的には、０．１％ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有する０．１×ＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）溶液を使用し、温度が６５℃である条件を意味する。プローブとしては、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも一部若しくは全部の配列（またはその相補配列）を有し、少なくとも１５ｂｐの鎖長のＤＮＡが用いられる。
糖尿病の検出方法では、上述のプローブと試験試料とを接触させ、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ又はそれ由来のｃＤＮＡ）と前記プローブとの結合体を、公知の分析方法（例えば、ノザンブロッティング）で分析することにより、糖尿病であるか否かを検出することができる。また、上述のプローブをＤＮＡチップに適用し、発現量を分析することもできる。前記結合体の量、すなわち、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの量が、健常人に比べて増加している場合には、糖尿病であると判定することができる。
本発明のポリヌクレオチドの発現レベルを測定する方法として、発現レベルを本発明のポリペプチドの検出によって測定する方法が可能である。このような検査方法としては、例えば、試験試料を本発明のポリペプチドに結合する抗体、好ましくは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体を利用したウエスタンブロッティング、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ法などを利用することが出来る。試験試料中に含まれる本発明のポリペプチドの量を定量する際、本発明のポリペプチドを標準量として利用することができる。また、本発明のポリペプチドは本発明のポリペプチドに結合する抗体を作製するために有用である。本発明のポリペプチドの量が健常人に比べて増加している場合には、糖尿病であると判定することができる。
＜本発明のスクリーニングする方法＞
（１）本発明のポリペプチド、（２）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、Ａｋｔ２と結合するポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）、あるいは（３）配列番号１又は配列番号３で表される塩基配列であるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、しかも、Ａｋｔ２に結合する蛋白質であるポリペプチド（以下、ハイブリダイズポリペプチドと称する）を使用し、前記ポリペプチド（即ち本発明のポリペプチド、相同ポリペプチド又はハイブリダイズポリペプチド）とＡｋｔ２キナーゼとの相互作用を利用してインスリン抵抗性改善作用を有する物質及び／又は糖代謝改善作用を有する物質（即ち糖尿病改善薬）のスクリーニング方法を構築できる。本発明のポリペプチド、前記相同ポリペプチド及び前記ハイブリダイズポリペプチドを総称して本発明のスクリーニング用ポリペプチドと称する。
本明細書における相同ポリペプチドは、配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、Ａｋｔ２に結合するポリペプチドである限り、特に限定されるものではないが、配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列に関して、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが好ましい。
なお、本明細書における前記「相同性」とは、Ｃｌｕｓｔａｌ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ ７３，２３７−２４４，１９９８；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，４６７３−４６８０，１９９４）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値（Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）を意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓとして、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ １５．００、Ｇａｐ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｅｎａｌｔｙ ６．６６、Ｄｅｌａｙ Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ Ｓｅｑｓ（％）３０、ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｗｅｉｇｈｔ ０．５０、Ｐａｉｒｗｉｓｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓとして、Ｓｌｏｗ−Ａｃｃｕｒａｔｅで、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ １５．００、Ｇａｐ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｅｎａｌｔｙ ６．６６。
本明細書のハイブリダイズポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号１又は配列番号３で表される塩基配列であるポリヌクレオチドとハイブリダイズする、本明細書のハイブリダイズポリペプチド用の「ストリンジェントな条件」としては、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５ｘＳＳＰＥ、５ｘＤｅｎｈａｒｄ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、４０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍｌ鮭精子ＤＮＡ、３７℃オーバーナイト」の条件であり、より厳しい条件としては「５ｘＳＳＰＥ、５ｘＤｅｎｈａｒｄ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍｌ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」の条件である。また洗浄のための条件として、緩い条件としては「５ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ、４２℃」、通常「０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」の条件であり、より厳しい条件としては「０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」の条件である。
本発明のスクリーニングする方法には、本発明のスクリーニング用ポリペプチドまたは本発明のスクリーニング用ポリペプチドを発現している細胞と試験物質とを接触させる工程、該ポリペプチドとＡｋｔ２との結合を測定する工程、及び前記結合を阻害する物質を選択する工程を含むことを特徴とする前記ポリペプチドとＡｋｔ２との結合阻害物質をスクリーニングする方法が含まれる。本発明のスクリーニング用ポリペプチドを発現している細胞は、本発明のスクリーニング用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換した細胞、天然に存在する本発明のポリペプチドを発現している細胞何れでも良いが、形質転換した細胞が好ましい。
本発明のスクリーニング用ポリペプチドの一つであるＡＫＢＰ２はＡｋｔ２と結合すること、糖尿病モデルマウスで発現が低下していること、及びマウスＡＫＢＰ２を過剰発現させた脂肪細胞でＡｋｔ２活性が低下していることから、本発明のポリペプチドはＡｋｔ２との結合を介してインスリンシグナルを負に制御していることがわかった。従って、上述のスクリーニングする方法によりインスリン抵抗性改善薬及び／又は糖代謝改善薬をスクリーニングすることができる。
上述のスクリーニングする方法における本発明のスクリーニング用ポリペプチドまたは本発明のスクリーニング用ポリペプチドを発現している細胞とＡｋｔ２との結合を測定する工程は、本発明のスクリーニング用ポリペプチドとＡｋｔ２との結合を直接検出することによって実施でき、また、前記結合の変化によるＡｋｔ２の変化を測定することによっても実施できる。
本発明のスクリーニングする方法で使用する試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、市販の化合物（ペプチドを含む）、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｎ．Ｋ．Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｍ．Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｄ．Ｗ．Ｇｏｒｄｏｎ，Ｒ．Ｊ．Ｋｏｂｙｌｅｃｋｉ，Ｊ．Ｓｔｅｅｌｅ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，８１３５−７３（１９９５））によって得られた化合物群、微生物の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、あるいは、本発明のスクリーニング法により選択された化合物（ペプチドを含む）を化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を挙げることができる。
上記スクリーニングする方法として限定はされないが具体的には以下のスクリーニング方法が挙げられる。
１）Ａｋｔ２のリン酸化を利用したスクリーニング方法
Ａｋｔ２は分子内のセリン４７３番（Ｓｅｒ４７３）あるいはスレオニン３０８番（Ｔｈｒ３０８）がリン酸化されてキナーゼ活性が亢進することが知られている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９９８ ３３５（１−１３））。これを利用し、Ａｋｔ２のＳｅｒ４７３又はＴｈｒ３０８のリン酸化状態をこれらリン酸化残基に特異的に反応する抗体（例えば抗ｐｈｏｓｐｈｏＳｅｒ抗体等）を用いたウエスタンブロットにより検出することでＡｋｔ２の活性の有無が検出できる。
本発明のスクリーニング用ポリペプチドの一部あるいは全長域を発現している試験用細胞に試験物質を未処理又は処理する。試験用細胞としてはインスリンに応答する細胞が好ましく、より具体的には脂肪細胞、肝細胞、あるいは骨格筋由来細胞が好ましい。試験物質を未処理又は処理した細胞を溶解し、これを試料として抗ｐｈｏｓｐｈｏＳｅｒ抗体を用いるウエスタンブロット法、スポットウエスタンブロット法などを利用することによりＡｋｔ２のリン酸化、すなわちＡｋｔ２の活性の有無を検出することができる。好ましくは実施例７の方法で検出することができる。この検出系において、試験物質を未処理の試料に比較してＡｋｔ２のリン酸化（すなわちＡｋｔ２の活性化）の亢進が観察された試料に処理した物質を本発明のスクリーニング用ポリペプチドとＡｋｔ２との結合を阻害する物質として選択することができ、これによりインスリン抵抗性改善薬及び／又は糖代謝改善薬、即ち糖尿病治療効果を有する物質をスクリーニングすることができる。このような物質としては、該スクリーニング法におけるＡｋｔ２のリン酸化亢進作用のＥＤ５０が、１０μＭ以下、、好ましくは１μＭ以下、更に好ましくは０．１μＭ以下のものを選択することが好ましい。
２）インビトロキナーゼ法を利用したスクリーニング法
ヒストンＨ２ＢやＧＳＫ−３融合タンパク質などをＡｋｔ２の基質としてＡｋｔ２の免疫沈降物と反応させたときの、基質に対する放射性リン酸の取り込み量を測定するインビトロキナーゼアッセイ法によってもＡｋｔ２活性を検出することができる。具体的には、本発明のスクリーニング用ポリペプチドの一部あるいは全長域を発現している試験用細胞に試験物質を未処理又は処理する。試験用細胞としてはインスリンに応答する細胞が好ましく、より具体的には脂肪細胞、肝細胞、あるいは骨格筋由来細胞が好ましい。前記細胞から抗Ａｋｔ２抗体を用いた免疫沈降により活性化したＡｋｔ２蛋白質を濃縮することができる。Ａｋｔ２の基質、例えば、ＧＳＴ−ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ（Ａｋｔが生理的基質としているＧＳＫ３−ｂｅｔａ配列のＧＳＴ融合タンパク）と濃縮Ａｋｔ２蛋白質とを混合することにより、基質のリン酸化を指標としてＡｋｔ２のキナーゼ活性を測定及び定量化できる。好ましくは実施例７に記載の方法で測定することができる。キナーゼ測定は、トータルキナーゼアッセイ法（Ｗａｇａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９０，ｐｐ７１−７７，１９９６）を利用することにより大規模な数の化合物のスクリーニング方法として使用が可能である。この測定系において、試験物質を未処理の試料に比較してＡｋｔ２のキナーゼ活性の亢進が観察された試料に処理した物質を本発明のスクリーニング用ポリペプチドとＡｋｔ２との結合を阻害する物質として選択することができ、これによりインスリン抵抗性改善薬及び／又は糖代謝改善薬、即ち糖尿病治療効果を有する物質をスクリーニングすることができる。このような物質としては、該スクリーニング法におけるＡｋｔ２のキナーゼ活性亢進作用のＥＤ５０が、１０μＭ以下、、好ましくは１μＭ以下、更に好ましくは０．１μＭ以下のものを選択することが好ましい。
３）本発明のスクリーニング用ポリペプチドとＡｋｔ２との結合を利用したスクリーニング方法
本発明のスクリーニング用ポリペプチドはＡｋｔ２との結合を介してインスリンシグナルを負に制御していることから、本発明のスクリーニング用ポリペプチドとＡｋｔ２との結合を指標とした以下のスクリーニング方法が挙げられる。具体的には、本発明のスクリーニング用ポリペプチドの一部あるいは全長域、あるいはＧＳＴやＦｌａｇ、Ｈｉｓなどのタグを融合させた本発明のスクリーニング用ポリペプチドの一部あるいは全長域を発現している試験用細胞を試験物質で未処理又は処理する。試験用細胞としてはインスリンに応答する細胞が好ましく、より具体的には脂肪細胞、肝細胞、あるいは骨格筋由来細胞が好ましい。前記細胞から抗Ａｋｔ２抗体を用いた免疫沈降によりＡｋｔ２蛋白質とそこに結合する蛋白質を濃縮することができる。この濃縮過程では反応液中に上記で細胞を処理した同じ試験物質を含有させておくことが望ましい。得られたＡｋｔ２およびその結合蛋白質の濃縮液を公知の方法によりポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離し、抗体を用いたウエスタンブロティングにより本発明のスクリーニング用ポリペプチドの量を測定することにより、本発明のスクリーニング用ポリペプチドとＡｋｔ２の結合を阻害する試験物質を選択することができる。このような物質としては、上記のスクリーニング方法において、本発明のポリペプチドとＡｋｔ２との結合を阻害する作用のＩＣ５０が、好ましくは１０μＭ以下、好ましくは１μＭ以下、更に好ましくは０．１μＭ以下のものを選択することが好ましい。ここで用いる抗体は、本発明のスクリーニング用ポリペプチド或いはその部分配列をもとに作製した本発明のスクリーニング用ポリペプチドに対する抗体（例えば抗ＡＫＢＰ２抗体）、あるいは上記タグを認識する抗体を利用することができる。
以上１）〜３）のスクリーニング方法においては、試験用細胞にインスリンを未刺激又は刺激して用いることができるが、好ましくは試験用細胞にインスリン刺激して用いることができる。
また上述と同様に本発明のスクリーニング用ポリペプチドを発現している細胞の抽出液またはインビトロで転写及び翻訳して作製した蛋白質混合液に試験物質を添加あるいは未添加したものから、ＧＳＴなどのタグをつけて精製したＡｋｔ２蛋白質を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏのプルダウン法（実験工学、Ｖｏｌ１３、Ｎｏ．６、１９９４年５２８頁 松七五三ら）と上述と同様のウエスタンブロッティングを組み合わせるによってもＡｋｔ２と本発明のスクリーニング用ポリペプチドの結合を阻害する試験物質を選択することができる。好ましくは、実施例６に示すように本発明のスクリーニング用ポリペプチドを発現するプラスミド（例えば、実施例１（５）で作製したＡＫＢＰ２発現プラスミド）から直接本発明のポリペプチドからなる蛋白質（例えば、ＡＫＢＰ２蛋白質）をインビトロトランスレーションキット（例えばＴＮＴキット（プロメガ社））を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで転写及び翻訳して作製した蛋白質混合液に試験物質を添加あるいは未添加したものを用いても同様にＡｋｔ２と本発明のスクリーニング用ポリペプチドの結合を阻害する試験物質を選択することができる。これらの方法ではいずれもポリアクリルアミド電気泳動法を行わずに公知のスポットウエスタンブロッティングを行うことにより多数の試験物質をスクリーニングすることが可能である。また上述と同様のタグを融合させて発現させた本発明のスクリーニング用ポリペプチドおよびＡｋｔ２を同時に発現させた細胞の溶解液に試験物質を添加することからなる公知のＥＬＩＳＡ法に従ってもＡｋｔ２と本発明のスクリーニング用ポリペプチドの結合を阻害する試験物質を選択するスクリーニングが可能である。また公知の哺乳類細胞におけるツーハイブリッドシステム（クロンテック社）を利用して、ベイトにＧＡＬ４のＤＮＡ結合領域と融合させたＡｋｔ２を、プレイ側にＶＰ１６の転写促進領域を融合させた本発明のスクリーニング用ポリペプチドを配置することにより、既存のＣＡＴあるいはルシフェラーゼ活性の検出によりＡｋｔ２と本発明のスクリーニング用ポリペプチドとの結合を阻害する試験物質を大多数の母集団からスクリーニングし選択することが可能である。
＜インスリン抵抗性改善用及び／又は糖代謝改善用医薬組成物の製造方法＞
本発明には、本発明のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、及び製剤化する工程を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善用医薬組成物の製造方法が包含される。
本発明のスクリーニング方法により得られる物質を有効成分とする製剤は、前記有効成分のタイプに応じて、それらの製剤化に通常用いられる担体、賦形剤、及び／又はその他の添加剤を用いて調製することができる。
投与としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは、静注、筋注、若しくは関節注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げることができる。特に胃で消化されるペプチドにあっては、静注等の非経口投与が好ましい。
経口投与のための固体組成物においては、１又はそれ以上の活性物質と、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。前記組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。錠剤又は丸剤は、必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆することができる。
経口のための液体組成物は、例えば、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、又はエリキシル剤を含むことができ、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば、精製水又はエタノールを含むことができる。前記組成物は、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤を含有することができる。
非経口のための注射剤としては、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含むことができる。水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、希釈剤として、例えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、アルコール類（例えば、エタノール）、又はポリソルベート８０等を含むことができる。前記組成物は、更に湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解若しくは溶解補助剤、又は防腐剤などを含むことができる。前記組成物は、例えば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、又は照射によって無菌化することができる。また、無菌の固体組成物を製造し、使用の際に、無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもできる。
投与量は、有効成分、すなわち本発明のスクリーニング方法により得られる物質の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、又は性別等を考慮して、適宜決定することができる。
例えば、経口投与の場合、その投与量は、通常、成人（体重６０ｋｇとして）において、１日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇである。非経口投与の場合、注射剤の形では、１日につき０．０１〜５０ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇである。
【実施例】
以下、実施例によって本発明を詳述するが、本発明は該実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年」、等）に従って実施可能である。また、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って実施可能である。
＜実施例１＞マウスＡＫＢＰ２遺伝子のクローニングと発現ベクターの構築
（１）Ａｋｔ２遺伝子のクローニング
遺伝子データベースＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号Ｍ９５９３６に記載されたヒトＡｋｔ２の全長領域をコードするｃＤＮＡ配列を参照して設計した配列番号５及び配列番号６で示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとし、ヒト骨格筋ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ ｃＤＮＡ；クロンテック社）を鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社））を用いて、９５℃３分間の熱変性反応の後、９８℃１０秒間、６０℃３０秒間、７４℃１分３０秒からなるサイクルを４０回、さらに７４℃７分間の条件で、ＰＣＲを行なった。これにより生成した約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を、プラスミドｐＺＥｒＯＴＭ−２．１（インビトロジェン社）のＥｃｏＲＶ認識部位に挿入することにより、ヒトＡｋｔ２ ｃＤＮＡをクローニングした。ベクター上にクローニングしたＡｋｔ２ ｃＤＮＡの配列は前述の配列番号５及び配列番号６に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして、シーケンシングキット（アプライドバイオシステム社）及びシーケンサー（ＡＢＩ ３７００ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒアプライドバイオシステムズ社）を用いて塩基配列を決定し、報告された配列と一致することを確認した。
（２）酵母ツーハイブリッド用発現プラスミドの作製
ヒトＡｋｔ２のｃＤＮＡを酵母ツーハイブリッド用発現ベクターｐＤＢｔｒｐ（インビトロジェン社）に挿入するため、ヒトＡｋｔ２遺伝子配列のそれぞれ５’側及び３’側にｐＤＢｔｒｐベクターのマルチクローニングサイトの前後４０ヌクレオチドと相同な領域を付加した配列番号７及び配列番号８に示すプライマーを設計した。ＰＣＲは上述でクローニングしたヒトＡｋｔ２プラスミドを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、９８℃（１分）の後、９８℃（５秒）、５５℃（３０秒）、７２℃（５分）のサイクルを３５回、繰り返した。その結果得られたＤＮＡ断片はヒトＡｋｔ２遺伝子の全コード領域を有している。
制限酵素ＳａｌＩ及びＮｃｏＩで切断して直鎖状にしたベクターｐＤＢｔｒｐ及び上記で得られたヒトＡｋｔ２のｃＤＮＡを含むＰＣＲ断片を同時にツーハイブリッド用酵母株ＭａＶ２０３（インビトロジェン社）へ添加し、リチウム酢酸法により形質転換した（Ｇｕｔｈｒｉｅ Ｃ．ａｎｄ Ｆｉｎｋ Ｒ．，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９１年）。その結果同酵母細胞内で相同組換えが生じ、ｐＤＢｔｒｐのマルチクローニングサイトにＡｋｔ２ ｃＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下ｐＤＢ−Ａｋｔ２と略称する）が形成された。同プラスミドを有する酵母細胞を、プラスミドの選択マーカーであるトリプトファンを欠乏させた固形合成最小培地（ＤＩＦＣＯ社）（２０％アガロース）上にて培養することにより選択し、同酵母細胞をザイモリエース（生化学工業社）で３７℃にて３０分処理した後、アルカリ法でプラスミドを単離精製し、シーケンシングキット（アプライドバイオシステム社）及びシーケンサー（ＡＢＩ ３７００ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒアプライドバイオシステムズ社）を用いて塩基配列の決定を行い、Ａｋｔ２のｃＤＮＡが、ｐＤＢｔｒｐのＧＡＬ４ ＤＮＡ結合領域のコード領域と翻訳フレームが一致して挿入されているものを選択した。
（３）マウス脂肪組織由来ｃＤＮＡライブラリーの作製
１２週令オスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス、及び１３週令オスのＣ５７ＢＬ／ＫｓＪ−＋ｍ／＋ｍマウスを日本クレアより購入し、副睾丸脂肪から実験医学別冊バイオマニュアルシリーズ２ 遺伝子ライブラリー作製法（羊土社 野島博 編集；１９９４年２月２０日発行）に記載のｍＲＮＡ調製法に従い、Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを調製した。ストラタジーン社のＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いて、添付のプロトコールに従い、５μｇのＲＮＡを用いて第１ストランド合成、第２ストランド合成を行い、２本鎖ｃＤＮＡを平滑末端化し、キットに添付のＥｃｏＲＩアダプターを連結し、制限酵素ＥｃｏＲＩ、及びＸｈｏＩで切断した。スピンカラム（ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−４００；クロンテック社）によりサイズ分画を行い、短い断片を除いた。ベクターｐＡＣＴ２（クロンテック社）１００μｇを制限酵素ＸｈｏＩで切断し、アルカリフォスファターゼ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；宝酒造社）で処理した後、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、スピンカラム（ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−１０００；クロンテック社）にかけた。実験医学別冊バイオマニュアルシリーズ２ 遺伝子ライブラリー作製法（羊土社 野島博 編集；１９９４年２月２０日発行）のｃＤＮＡライブラリー作製法に従い、ベクターとｃＤＮＡを連結し、連結後のサンプルをミリポア社のフィルターカップ（ＵＦＣＰ３ＴＫ５０）で処理した。ギブコＢＲＬ社のエレクトロポレーション用大腸菌（ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸＴＭ ＤＨ１０Ｂ０ＴＭ Ｃｅｌｌｓ）を用いて、エレクトロポレーション法による形質転換を行い、１０００ｍｌの培養液で一晩振盪培養した。培養液中に独立コロニーが１０６個以上であることを確認し、プラスミド精製キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ；キアゲン社）を用いて、キットに添付のプロトコールに従い、プラスミドを精製した。
（４）酵母ツーハイブリッドスクリーニング
上述のｐＤＢ−Ａｋｔ２により形質転換したツーハイブリッド用酵母株ＭａＶ２０３を４００ｍｌのＹＰＤ液体培地（ＤＩＦＣＯ社）に懸濁し、波長５９０ナノメートルの吸光度が０．１から０．４になるまで３０℃で約６時間振とう培養した後、リチウム酢酸法でコンピテントセルとし、最終量を１．０ｍｌの０．１Ｍリチウム−トリス緩衝液に懸濁した。同細胞を前述（３）で作製したマウス脂肪組織由来ｃＤＮＡライブラリー各２０μｇで形質転換し、同細胞をｐＤＢ−Ａｋｔ２及びライブラリーそれぞれのプラスミドの選択マーカーであるトリプトファン、ロイシンを欠乏させた固形合成最小培地（ＤＩＦＣＯ社）（２０％アガロース）上にて培養することにより選別し、両プラスミドが導入された形質転換株を得た。同時に同じ形質転換細胞をトリプトファン、ロイシンのほかに、ツーハイブリッドシステムにおいて人工的に発現させたＧＡＬ４ ＤＮＡ結合領域の融合蛋白質に、ＧＡＬ４転写促進領域の融合蛋白質が結合した場合に発現するレポーター遺伝子ＨＩＳ３が作動した細胞を選択するため、ヒスチジンを培地から除き、さらにＨＩＳ３がコードする酵素の阻害剤である３ＡＴ（３−ＡＭＩＮＯ−１，２，４−ＴＲＩＡＺＯＬＥ；シグマ社）２０ｍＭを添加した固形最小培地（２０％アガロース）上で３０℃にて５日間培養した。同条件下でＡｋｔ２に結合する蛋白質を発現していることを示す３ＡＴ耐性の酵母のコロニーを取得した。これらの酵母細胞を２４時間ＹＰＤ固形培地上で成長させた後、ＨＩＳ３とは別のツーハイブリッドシステムの結合指示レポーターであるｌａｃＺ遺伝子の発現をβ−ガラクトシダーゼ活性を指標として調べた。β−ガラクトシダーゼ活性は培地上の酵母細胞をニトロセルロースフィルターに移し取り、液体窒素中で凍結させた後、室温で解凍し、フィルターを０．４％のＸ−ＧＡＬ（シグマ社）溶液を浸した濾紙上にのせて３７℃で２４時間静置し、β−ガラクトシダーゼによる青色変化を測定した。フィルター上に写し取った細胞内容物が白色から青色に変化したコロニーを選択することにより、Ａｋｔ２に結合する蛋白質を発現している酵母細胞を特定し、同細胞からクロンテック社Ｙｅａｓｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋの方法に従ってライブラリー由来のプラスミドを抽出した。そこに含まれる遺伝子断片の塩基配列を、配列番号９で表される塩基配列（ＧＡＬ４ ＡＤ領域に結合する配列；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 Ｕ２９８９９ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ ｐＡＣＴ２由来）をプライマーとし、シーケンシングキット（アプライドバイオシステム社）及びシーケンサー（ＡＢＩ ３７００ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒアプライドバイオシステムズ社）を用いて決定した結果、配列番号１に示す塩基配列が含まれていることを確認した。
（５）マウスＡＫＢＰ２遺伝子の開始コドンの決定
前述（４）の結果、配列番号１で表される塩基配列を含む遺伝子断片を持ったライブラリー由来のプラスミドが得られた。そこで該断片に含まれる遺伝子の開始コドンを決定するために、配列番号１で示された塩基配列の第１０３４番から第１０１１番の塩基配列の相補鎖に相当する配列番号１０で表される塩基配列のプライマーを合成（プロリゴ社）し、該プライマーと前述配列番号９で表される塩基配列のプライマーを用いて前述の脂肪組織由来ｃＤＮＡライブラリー中からＰＣＲ法により該遺伝子の発現産物由来の全長ｃＤＮＡの増幅を試みた。ＰＣＲ反応はＤＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ Ｔａｑ；宝酒造社）を用い、９４℃（３分）の後、９４℃（３０秒）・５８℃（１．５分）・７２℃（４分）のサイクルを３５回繰り返した。反応液中の同ＤＮＡ断片を発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ；インビトロジェン社）にＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇシステム（インビトロジェン社）を用いてクローニングした。得られたプラスミド中の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を、ベクター上のＴ７プロモーター領域に結合するプライマー（ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ；インビトロジェン社；配列番号１１）とシーケンシングキット（アプライドバイオシステム社）及びシーケンサー（ＡＢＩ ３７００ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ；アプライドバイオシステムズ社）を用いて決定した。その結果、該遺伝子の配列を有する様々な長さのｃＤＮＡを含むプラスミドが得られたが、最長のｃＤＮＡはいずれも前述（４）で得られた転写産物由来のｃＤＮＡとほぼ同等の鎖長であった。数度の試行でも同じ結果であったことから、該遺伝子の転写産物の鎖長および配列は（４）で得られたｃＤＮＡとほぼ一致することがわかった。これにより配列番号１に示す塩基配列の初めにあるＡＴＧが該遺伝子の開始コドンであるとわかり、配列番号１に示す該遺伝子のオープンリーディングフレームを確定した。この遺伝子をマウスＡＫＢＰ２遺伝子と名付けた。
（６）マウスＡＫＢＰ２発現ベクターの作製
前述（４）の結果、配列番号１で表される塩基配列の全長を含む遺伝子断片を持ったライブラリー由来のプラスミドが得られ、Ａｋｔ２に結合する因子の存在が示された。また前述（５）においてそのオープンリーディングフレームが確定した。そこで配列番号１に示す塩基配列情報に従い、配列番号１２及び配列番号１３に示すプライマーを合成（プロリゴ社）し、該プライマーを用いて、正味ＡＫＢＰ２蛋白質をコードするＡＫＢＰ２ ｃＤＮＡを前述の（４）で得られたプラスミドを鋳型としてＰＣＲ法により増幅した。これら２種類のＤＮＡプライマーはそれぞれ配列番号１が示すマウスＡＫＢＰ２遺伝子の５’側、３’側の部分配列と相同な塩基配列を有する。ＰＣＲ反応はＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、９８℃（１分）の後、９８℃（５秒）、５５℃（３０秒）、７２℃（５分）のサイクルを３５回繰り返した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分離した結果、約１．７ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅されたことを確認した。そこで反応液中の同ＤＮＡ断片を発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ；インビトロジェン社）にＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇシステム（インビトロジェン社）を用いてサブクローニングした。このとき用いた配列番号１３に示すプライマーはクローニング後３’側にベクター由来のＶ５エピトープ（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ ＳＶ５のＶ ｐｒｏｔｅｉｎ由来、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｊ Ａ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２，１５５１−１５５７，１９９１）及びＨｉｓ６タグ（Ｌｉｎｄｎｅｒ Ｐ ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２２，１４０−１４９，１９９７）がマウスＡＫＢＰ２遺伝子のトリプレットと同じフレームで続くように、ＡＫＢＰ２のストップコドン配列が除かれるよう設計した。得られたプラスミド中の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を、ベクター上のＴ７プロモーター領域に結合するプライマー（ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ；インビトロジェン社；配列番号１１）とシーケンシングキット（アプライドバイオシステム社）及びシーケンサー（ＡＢＩ ３７００ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ；アプライドバイオシステムズ社）を用いて決定した。その結果、配列番号１に示す正味ＡＫＢＰ２蛋白質をコードする１７１９塩基対のＡＫＢＰ２ ｃＤＮＡがＤＮＡ配列の３’側のストップコドンを除いたＤＮＡとして前述の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯに挿入されていることを確認した。以下この発現プラスミドをｐｃＤＮＡ−ＡＫＢＰ２と略記する。
＜実施例２＞ＡＫＢＰ２蛋白質を発現する培養細胞の作製
（１）ＡＫＢＰ２発現細胞の作製
上述の実施例１（５）で作製した発現プラスミドｐｃＤＮＡ−ＡＫＢＰ２又は空ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ）を２９３細胞（セルバンク社）に導入した。２９３細胞は６ウェル培養プレート（ウェル直径３５ｍｍ）の培養皿に各ウェル２ｍｌの１０％牛胎児血清（シグマ社）を含む最少必須培地ＤＭＥＭ（ギブコ社）を加えて７０％コンフルエントの状態になるまで培養した。この細胞にリン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６，１９７３、新井直子、遺伝子導入と発現／解析法１３−１５頁１９９４年）によりｐｃＤＮＡ−ＡＫＢＰ２（３．０μｇ／ウェル）を一過性に導入した。３０時間培養した後、培地を除去し、細胞をリン酸緩衝液（以下ＰＢＳと略称する）で洗浄した後にウェルあたり０．１ｍｌの細胞溶解液（１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．８）、０．２％トリトンＸ−１００）を添加して細胞を溶解した。
（２）ＡＫＢＰ２蛋白質の検出
上述実施例２（１）のＡＫＢＰ２発現細胞の溶解液１０μｌに１０μｌの２倍濃度ＳＤＳサンプルバッファー（１２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ６．８）、３％ラウリル硫酸ナトリウム、２０％グリセリン、０．１４Ｍ β−メルカプトエタノール、０．０２％ブロムフェノールブルー）を添加し、１００℃で２分間処理した後、１０％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、試料中に含まれている蛋白質を分離した。セミドライ式ブロッティング装置（バイオラッド社）を用いてポリアクリルアミドゲル中の蛋白質をニトロセルロース膜に転写した後、常法に従いウエスタンブロッティング法により該ニトロセルロース上のＡＫＢＰ２蛋白質の検出を行った。一次抗体にはＡＫＢＰ２のＣ末端に融合させたＶ５エピトープを認識するモノクローナル抗体（インビトロジェン社）を用い、二次抗体にはマウスＩｇＧ−ＨＲＰ融合抗体（バイオラッド社）を用いた。その結果、図１に示す通り、４５アミノ酸からなるＣ末端側のタグを含む６１８アミノ酸からなるＡＫＢＰ２−Ｖ５−Ｈｉｓ６融合蛋白質を示す約７０ｋＤａの蛋白質が発現ベクターｐｃＤＮＡ−ＡＫＢＰ２の遺伝子導入に依存して検出されることを確認した。これにより、培養細胞中でクローニングした前述のマウスＡＫＢＰ２遺伝子は全長領域が確かに発現し、蛋白質として安定な構造をとりうることが明らかになった。
＜実施例３＞正常マウス、高脂肪食負荷正常マウス、および糖尿病モデルマウスにおけるＡＫＢＰ２発現量の測定
上述の知見により本発明のマウスＡＫＢＰ２蛋白質はＡｋｔ２と結合し、脂肪、筋肉などのインスリン応答組織で発現していることが判明した。Ａｋｔ２蛋白質はインスリンシグナル第一経路に作用する因子であることから、本発明のＡＫＢＰ２の作用がインスリン抵抗性に関わることが予想された。そこで２型糖尿病モデルマウスＫＫＡｙ／Ｔａ（Ｉｗａｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｊａｐｏｎ．：１７，２３−３５，１９７０、Ｔａｋｅｔｏｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．，７，２４２−２４６，１９７５）および通常食もしくは高脂肪食を与えた健常マウスＣ５７ＢＬ／６Ｊの筋肉および脂肪におけるＡＫＢＰ２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）発現量を測定した。
遺伝子発現量は、本発明のマウスＡＫＢＰ２遺伝子の発現量を測定し、同時に測定したグリセルアルデヒド ３−リン酸脱水素酵素（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｇ３ＰＤＨ））遺伝子の発現量により補正した。測定系としてはＰＲＩＳＭＴＭ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＳｙｓｔｅｍとＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を用いた。本測定系においてはＰＣＲで増幅された２本鎖ＤＮＡがとりこむＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ色素の蛍光量をリアルタイムに検出・定量することにより、目的とする遺伝子の発現量が決定される。
具体的には、以下の手順により測定した。
（１）全ＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）の調製
通常食又は高脂肪食負荷した１４週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス、並びに１５週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス及びＫＫＡｙ／Ｔａマウス（いずれも日本クレア社）を使用した。高脂肪食負荷は５週齢から１４週齢までの９週間行った。高脂肪食の組成は次の通りである；カゼイン２９．８％、スクロース１５．８％、ビタミンミックス１．３％、ミネラルミックス８．８％、セルロースパウダー５．０％、メチオニン０．５％、サフラワーオイル２８．９％、水１０％。一方、正常食はＣＥ−２（日本クレア社）を用いた。前記各マウスの筋肉および脂肪を摘出し、ＲＮＡ抽出用試薬（Ｉｓｏｇｅｎ；ニッポンジーン社）を用いて、説明書に従い全ＲＮＡを調製した。調製した各々の全ＲＮＡはその後デオキシリボヌクレアーゼ（ニッポンジーン社）を用いて処理し、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿して滅菌水に溶解し−２０℃で保存した。
（２）１本鎖ｃＤＮＡの合成
全ＲＮＡから１本鎖ｃＤＮＡへの逆転写は、（１）で調製した１μｇのＲＮＡ（脂肪）、１μｇのＲＮＡ（１４週齢のマウスの筋肉）、０．２５μｇのＲＮＡ（１５週齢のマウスの筋肉）をそれぞれ用い、逆転写反応用キット（ＡｄｖａｎｔａｇｅＴＭ ＲＴ−ｆｏｒ−ＰＣＲ Ｋｉｔ；クロンテック社）を用いて２０μｌの系で行った。逆転写後、滅菌水１８０μｌを加えて−２０℃で保存した。
（３）ＰＣＲプライマーの作製
４つのオリゴヌクレオチド（配列番号１４一配列番号１７）を（４）の項で述べるＰＣＲのプライマーとして設計した。マウスＡＫＢＰ２遺伝子に対しては配列番号１４と配列番号１５の組合せ、Ｇ３ＰＤＨ遺伝子に対しては配列番号１６と配列番号１７の組み合わせで使用した。
（４）遺伝子発現量の測定
ＰＲＩＳＭＴＭ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＳｙｓｔｅｍによるＰＣＲ増幅のリアルタイム測定は２５μｌの系で説明書に従って行った。各系において１本鎖ｃＤＮＡは５μｌ、２ｘＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ試薬を１２．５μｌ、各プライマーは７．５ｐｍｏｌ使用した。ここで１本鎖ｃＤＮＡは（２）で保存したものをＧ３ＰＤＨに関しては３０倍希釈、マウスＡＫＢＰ２に関しては１０倍希釈して使用した。なお検量線作成には、１本鎖ｃＤＮＡに代えて０．１μｇ／μｌのマウスゲノムＤＮＡ（クロンテック社）を適当に希釈したものを５μｌ用いた。ＰＣＲは、５０℃で１０分に続いて９５℃で１０分の後、９５℃で１５秒、６０℃で６０秒の２ステップからなる工程を４５サイクル繰り返すことにより行った。
各試料におけるマウスＡＫＢＰ２遺伝子の発現量は、下記式に基づいてＧ３ＰＤＨ遺伝子の発現量で補正した。
［ＡＫＢＰ２補正発現量］＝［ＡＫＢＰ２遺伝子の発現量（生データ）］／［Ｇ３ＰＤＨ遺伝子の発現量（生データ）］
脂肪における発現量の比較においては通常食のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの発現量を、筋肉組織における発現量の比較においてはＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの発現量を、それぞれ１とした相対量を図２に示した。
図２に示す通り、高脂肪食負荷時の脂肪および筋肉、または糖尿病モデルマウスの脂肪および筋肉において、本発明のマウスＡＫＢＰ２遺伝子の発現は顕著に増加していることが判明した。従って本発明のマウスＡＫＢＰ２は脂肪および筋肉における発現量亢進によりインスリン抵抗性を惹起すると考えられる。以上のことからインスリン抵抗性に本発明のマウスＡＫＢＰ２の関与が大きいと結論づけられる。
また本実施例の結果より、マウスＡＫＢＰ２発現量の測定により糖尿病病態の診断が出来ることが明らかとなった。
＜実施例４＞ヒトＡＫＢＰ２遺伝子のクローニング、および組織別発現分布解析
ヒト脂肪由来ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社）を鋳型とし、配列番号１８及び配列番号１９に示す一対のプライマーを用いて、前述の実施例１（５）に示したものと同様のＰＣＲ法により、ＡＫＢＰ２ヒトオルソログ遺伝子全長ｃＤＮＡの増幅を試みた。その結果得られた約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を、実施例１に示したものと同様の方法に従い塩基配列を決定したところ、配列番号３に示す遺伝子の全長ｃＤＮＡが含まれることを確認した。該遺伝子ｃＤＮＡは配列番号４に示すポリペプチドをコードする新規の遺伝子である。該遺伝子は配列番号１に示すマウスＡＫＢＰ２遺伝子と７６．８％、コードするポリペプチドは配列番号２に示すマウスＡＫＢＰ２蛋白質と７１．３％の相同性をそれぞれ有しているＡＫＢＰ２のヒトオルソログ遺伝子である。
そこで次に該ヒトＡＫＢＰ２遺伝子の配列をもとに、配列番号２０に示すプライマーを設計し、これと前述配列番号１９に示すプライマーを用いて、ヒトＡＫＢＰ２遺伝子の３’末端側約８００塩基のｃＤＮＡ断片を、ヒト各種組織由来ｃＤＮＡからＰＣＲ反応を用いて増幅を試み、各種組織におけるＡＫＢＰ２の発現の有無を調べた。ヒトの各種組織ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社）各２μｇを鋳型としてＰＣＲ反応はＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、９８℃（１分）の後、９８℃（５秒）、５５℃（３０秒）、７２℃（５分）のサイクルを３５回繰り返した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分離した結果、骨格筋、肝臓、脂肪由来の各ｃＤＮＡライブラリーから所望するヒトＡＫＢＰ２遺伝子の３’末端側部分配列を含むと思われる約８００塩基対のＤＮＡ断片が増幅された。これらのＤＮＡ断片を各々アガロースゲル中から分離した後、上述の実施例１（４）に記した方法に従い配列番号２０に示すプライマーを用いて該ＤＮＡ断片の塩基配列をそれぞれ決定した結果、配列番号３に示すヒトＡＫＢＰ２遺伝子の３’末端側の部分配列であることを確認した。このことから、ヒトＡＫＢＰ２遺伝子の発現は、インスリンシグナルに応答する脂肪、筋肉、肝臓などの限定された臓器で特異的に制御されていることが判明した。
本実施例の結果、ヒトＡＫＢＰ２はマウスＡＫＢＰ２と相同性が高く、さらにインスリン応答性組織で発現が観察されることから、マウスと同様の機能を有しており、糖尿病診断、糖尿病改善薬のスクリーニングに有用であることが明らかになった。
＜実施例５＞ヒトＡＫＢＰ２蛋白質を発現する培養細胞の作製
前述の実施例４で得られたヒトＡＫＢＰ２遺伝子の全長ｃＤＮＡを前述の実施例１（６）に示したものと同様の方法でサブクローニングした。そして配列番号３に示す正味ヒトＡＫＢＰ２蛋白質をコードする１７８２塩基対のヒトＡＫＢＰ２ ｃＤＮＡがＤＮＡ配列の３’側のストップコドンを除いたＤＮＡとして前述の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯに挿入されていることを確認した。以下この発現プラスミドをｐｃＤＮＡ−ｈｕｍａｎ ＡＫＢＰ２と略記する。この発現プラスミドｐｃＤＮＡ−ｈｕｍａｎ ＡＫＢＰ２を実施例２（１）と同様の方法でウェルあたり５．１μｇ導入し、ヒトＡＫＢＰ２タンパク質の発現を実施例２（２）の方法に従って検出した。その結果、４５アミノ酸からなるＣ末端側のタグを含む６３８アミノ酸からなるヒトＡＫＢＰ２−Ｖ５−Ｈｉｓ６融合蛋白質を示す約７０ｋＤａの白質が発現ベクターｐｃＤＮＡ−ｈｕｍａｎ ＡＫＢＰ２の遺伝子導入に依存して検出されることを確認し、クローニングした前述のヒトＡＫＢＰ２遺伝子は培養細胞中で全長領域が確かに発現し、蛋白質として安定な構造をとりうることが明らかになった。
＜実施例６＞ヒトＡＫＢＰ２とＡｋｔ２の相互作用の検証
（１）ＧＳＴ融合Ａｋｔ２発現プラスミドの作製
ヒトＡｋｔ２のｃＤＮＡをＧＳＴ融合発現ベクターｐＧＥＸ−３Ｘ（アマシャムバイオサイエンス社）に挿入するため、実施例１（１）で得られたヒトＡｋｔ２のｃＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで、ベクターｐＧＥＸ−３Ｘを制限酵素ＢａｍＨＩ及，びＥｃｏＲＩでそれぞれ切断し、直鎖状にした。また配列番号２１及び配列番号２２に示す断片をこれらの連結用断片として用いるために、前処理として各々６０℃で３０分間処理した後混合し、室温で２時間放置した。これら処理済みのヒトＡｋｔ２ ｃＤＮＡ断片、ベクターｐＧＥＸ−３Ｘ及び連結用断片を混合したものをＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ液（ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ＩＩ；宝酒造社）と混合して１６℃で３時間処理し、ｐＧＥＸ−３ＸのマルチクローニングサイトにＡｋｔ２ｃＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下ｐＧＥＸ−Ａｋｔ２と略称する）を作製した。配列番号２３に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして、シーケンシングキット（アプライドバイオシステム社）及びシーケンサー（ＡＢＩ ３７００ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒアプライドバイオシステムズ社）を用いて塩基配列の決定を行い、Ａｋｔ２のｃＤＮＡのコード領域とｐＧＥＸベクターのＧＳＴタグ翻訳フレームが一致して挿入されているものを選択した。
（２）ＧＳＴ融合Ａｋｔ２タンパク質の精製
上述の（１）で得られたプラスミドｐＧＥＸ−Ａｋｔ２を大腸菌ＢＬ２１を用いて、ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ法による形質転換を行い、２．４ｍＬの培養液で一晩振盪培養した後、その全量を４００ｍＬ培養液に移し変え、３７℃で３時間振盪培養した後、最終濃度が２．５ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（ＳＩＧＭＡ）を添加し、更に３時間振盪培養してＧＳＴ融合Ａｋｔ２蛋白質（以下ＧＳＴ−Ａｋｔ２と略記する）の発現を誘導した。菌体を回収し、公知の方法（実験工学、Ｖｏｌ１３、Ｎｏ．６、１９９４年５２８頁 松七五三ら）に従ってＧＳＴ−Ａｋｔ２をグルタチオンセファロースビーズ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ；アマシャム・ファルマシア社）上に精製した。コントロールとしてｐＧＥＸ−３Ｘで形質転換した大腸菌ＢＬ２１からＧＳＴ部分のみの蛋白質（以下ＧＳＴ蛋白質と略記する）を上述と同様に発現誘導して精製した。公知の方法に従ってＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分離及びクーマジーブリリアントブルー染色を行い、期待される分子量の蛋白質（ＧＳＴ−Ａｋｔ２；７９ｋＤａ、ＧＳＴ蛋白質；２６ｋＤａ）が精製されていることを確認した。
（３）Ａｋｔ２蛋白質とヒトＡＫＢＰ２蛋白質との生化学的結合の確認
上述（２）で作製したＧＳＴ融合Ａｋｔ２蛋白質（以下ＧＳＴ−Ａｋｔ２と略記する）を用いて、ヒトＡＫＢＰ２蛋白質とＡｋｔ２蛋白質の直接の相互作用の有無をＧＳＴ−ｐｕｌｌ ｄｏｗｎ法（実験工学、Ｖｏｌ４３、Ｎｏ．６、１９９４年５２８頁 松七五三ら）によって確認した。まず上述実施例５で作製したｐｃＤＮＡ−ｈｕｍａｎ ＡＫＢＰ２の０．５μｇを鋳型としてＴＮＴ ｋｉｔ（ＴＮＴＲＱｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ；プロメガ社）４０μｌおよびラジオアイソトープ（ｒｅｄｉｖｕｅ Ｐｒｏ−ｍｉｘ Ｌ−［３５Ｓ］；アマシャム）１．３ＭＢｑを用いて添付のプロトコールに従いｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写・翻訳によりラジオアイソトープラベルされたヒトＡＫＢＰ２蛋白質を調製した。このヒトＡＫＢＰ２蛋白質調製液各１５μｌと上述（２）でグルタチオンビーズ上に精製したＧＳＴ蛋白質あるいはＧＳＴ−Ａｋｔ２各１μｇを混合し、０．３ｍｌのＢｕｆｆｅｒ Ａ（５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１０％グリセロール、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、０．５％ＮＰ−４０）を添加して４℃で１時間振盪した。その後遠心分離によりビーズ上のＧＳＴ蛋白質あるいはＧＳＴ−Ａｋｔ２に結合する蛋白質を共沈殿させた。これを上述のＢｕｆｆｅｒ ＡのＮａＣｌ濃度を１００ｍＭに置換した緩衝液０．５ｍｌでけん濁し、再度遠心分離により共沈殿させた。この操作を４回繰り返したのち、沈殿物中の蛋白質を公知の方法に従ってＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離し、オートラジオグラフィによりヒトＡＫＢＰ２蛋白質を検出した。その結果、ＧＳＴ蛋白質を混合した場合には検出されないバンドがＧＳＴ−Ａｋｔ２を混合した場合に検出された。これにより、本発明のポリペプチドの一つであるヒトＡＫＢＰ２は、本発明のマウスＡＫＢＰ２と同様にＡｋｔ２蛋白質と相互作用することが明らかになり、これらヒト、マウスのＡＫＢＰ２は両動物種で互いに同一の機能を担うカウンターパートであることが裏付けられた。従って本発明のヒトＡＫＢＰ２は、本発明のマウスＡＫＢＰ２と同様にＡｋｔ２蛋白質との相互作用を介してインスリン抵抗性の惹起に関与することがわかった。
＜実施例７＞ＮＩＨ３Ｔ３ Ｌ１脂肪細胞におけるマウスＡＫＢＰ２過剰発現によるＡｋｔ２キナーゼ活性への影響
上述の酵母ツーハイブリッド及び生化学的結合の解析の結果から、Ａｋｔ２とＡＫＢＰ２が相互作用することが示された。そこで、ＡＫＢＰ２がＡｋｔ２の酵素（キナーゼ）活性にどのような影響を及ぼすか、培養細胞ＮＩＨ３Ｔ３ Ｌ１を用いたインビトロキナーゼアッセイで調査した。
（１）インビトロキナーゼアッセイ用基質ＧＳＴ−ｃｒｏｓｓｔｉｄｅの調製
Ａｋｔ２の生理的基質であるＧＳＫ３βのリン酸化部位をコードする配列番号２４および配列番号２５に示した合成オリゴＤＮＡを混合し、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１ベクターのＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩサイトに組み換えた。これをｐＧＳＴ−ｃｒｏｓｓｔｉｄｅとした。プラスミドｐＧＳＴ−ｃｒｏｓｓｔｉｄｅを大腸菌ＢＬ２１を用いて、ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ法による形質転換を行い、２．４ｍＬの培養液で一晩振盪培養した後、その全量を４００ｍＬ培養液に移し変え、３７℃で３時間振盪培養した後、最終濃度が２．５ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（ＳＩＧＭＡ社）を添加し、更に３時間振盪培養してＧＳＴ融合蛋白質（以下ＧＳＴ−ｃｒｏｓｓｔｉｄｅと略記する）の発現を誘導した。菌体を回収し、公知の方法（実験工学、Ｖｏｌ１３、Ｎｏ．６、１９９４年５２８頁 松七五三ら）に従ってＧＳＴ−ｃｒｏｓｓｔｉｄｅをグルタチオンセファロースビーズ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ；アマシャム・ファルマシア社）上に精製した。精製したこれらの蛋白質は、公知の方法に従ってＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分離と、クーマジーブリリアントブルー染色によりＧＳＴ−ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ蛋白質が精製されていることを確認した。
（２）アデノウイルスベクターを利用したＡＫＢＰ２高発現ウイルスの作製
マウスＡＫＢＰ２をコードする遺伝子断片を、ｐｃＤＮＡ−ＡＫＢＰ２ベクターより制限酵素ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩＩを用いて切り出し、さらにＳａｃＩＩおよびＮｏｔＩ切断断片をつくるリンカーオリゴ配列番号２６および配列番号２７を用いてアデノウイルスベクターｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶ（ジョンズホプキンス癌センターより入手）のマルチクローニングサイト（ＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩ）に挿入し、ＡＫＢＰ２／ｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶベクターを得た。
以下、公知のプロトコール［“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＡｄＥａｓｙ Ｓｙｓｔｅｍ”］（ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ“ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ／ａｄｅａｓｙ．ｈｔｍ”“ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ／ａｄｅａｓｙ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ２．ｈｔｍ”）］に従い、ＡＫＢＰ２を発現する高力価アデノウイルス液の調製を行った。コントロール用アデノウイルスは、ｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶより調製した。
なおウイルス量は２６０ｎｍにおける吸光度（Ａ２６０）を測定し、下記の計算式で換算した。
［式］ １ Ａ２６０＝１．１ｘ１０１２ウイルス粒子＝３．３ｘ１０１１ｐｆｕ／ｍｌ
（３）ＮＩＨ３Ｔ３ Ｌ１脂肪細胞におけるマウスＡＫＢＰ２過剰発現およびＡｋｔ２の免疫沈降
ＮＩＨ３Ｔ３ Ｌ１細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に懸濁し、８ｘ１０５個／穴になるようにコラーゲンコートした６穴プレート（旭テクノグラス社）にまいた。翌日、１０μｇ／ｍｌインスリン、２５０ｎＭデキサメサゾン、０．５ｍＭ ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を加えたＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）に培地を交換して３Ｔ３−Ｌ１細胞の分化を誘導した。その２日後、培地を０．４ｍｌのＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）に戻した。その４日後、ＡＫＢＰ２を発現させるアデノウイルスを１穴あたり８ｘ１０１０ｐｆｕの濃度で培地に添加した。コントロールとしてはＧＦＰのみを発現させるアデノウイルスを用いた。
アデノウイルス感染３６時間後より１６時間、無血清ＤＭＥＭ培地で培養し、１００ｎＭインスリンにより所定の時間（０、３０、６０分間）刺激し、ただちに細胞溶解液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、０．５ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、０．１％２−メルカプトエタノール、５０ｍＭ ＮａＦ、５ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１０ｍＭ β−Ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ）５００μｌ中に溶解した。１５０００ｒｐｍ、２０分間の遠心後、上清に抗Ａｋｔ２抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ社）およびＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）により免疫沈降した。免疫沈降物は細胞溶解液で２回、洗浄液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．０３％Ｂｒｉｊ３５、０．１％２−メルカプトエタノール）で２回、反応液（２０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．２、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ β−Ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ）で２回洗浄し、キナーゼ反応に供与した。
（４）インビトロキナーゼアッセイ
上記免疫沈降物を２０μｌの反応液にけん濁した。さらに、１５μＭ ＡＴＰ、１０μＣｉ［γ３２Ｐ］−ＡＴＰ、３μｇ ＧＳＴ−ｃｒｏｓｓｔｉｄｅを含む反応液を加え、３０℃で２０分間加温した。反応は、１０μｌの４ｘＳＤＳサンプルバッファーを加えて停止した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離後、ＧＳＴ−ｃｒｏｓｓｔｉｄｅに取り込まれた放射活性をＢＡＳ２０００バイオイメージングアナライザー（富士フィルム社）により解析し、定量した。図３に示すように、インスリン無刺激状態におけるコントロールウイルス（ＧＦＰ）およびＡＫＢＰ２を感染させたＮＩＨ３Ｔ３ Ｌ１細胞を比較した場合、Ａｋｔ２のキナーゼ活性はＡＫＢＰ２過剰発現によりコントロールより０．８２倍に低下した。同様に１００ｎＭインスリン刺激によるＡｋｔ２の活性上昇を観察したところ、ＧＦＰ感染細胞では、無刺激状態に比べ１．３９倍（３０分）、１．５倍（６０分）の酵素活性の上昇を示したのに対し、ＡＫＢＰ２ウイルスを感染させた細胞では、刺激依存的な活性上昇は１．３０倍（３０分）および１．２２倍（６０分）しか示さなかった。また、Ａｋｔ２の活性化にセリン４７３番のリン酸化が重要であることから、上述のインスリン刺激後に免疫沈降したＡｋｔ２を抗リン酸化セリン４７３抗体（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社）を用いてウエスタンブロット解析したところ、無刺激時のリン酸化状態は、ＡＫＢＰ２ウイルスを感染させた細胞においてコントロールウイルス感染細胞より低下していた。また、３０分間のインスリン刺激により、ＡＫＢＰ２ウイルスを感染させた細胞とコントロールウイルス感染細胞において共に刺激依存的なリン酸化の亢進が認められたが、そのリン酸化亢進の程度は、ＡＫＢＰ２ウイルスを感染させた細胞においてはコントロールウイルス感染細胞より弱められており、インビトロキナーゼアッセイの結果を支持した。以上の結果より、本発明のマウスＡＫＢＰ２は、Ａｋｔ２と相互作用し、そのインスリン非依存的な酵素活性に加え、インスリン依存的な酵素活性上昇を低下させることによりインスリン抵抗性を惹起していると考えられる。
【産業上の利用可能性】
Ａｋｔ２に結合する性質を有し、Ａｋｔ２のキナーゼ活性を低下させ、糖尿病態において発現量が増加する本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドは、糖尿病の診断に有用である。また、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクター及び細胞は本発明のポリペプチドとＡｋｔ２との結合を阻害する物質（すなわちＡｋｔ２の働きを増強させる物質）のスクリーニングに有用である。該スクリーニングにより選択される物質はインスリン抵抗性改善薬並びに糖尿病改善薬の候補物質として有用である。
【配列表フリーテキスト】
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号５〜８、１０〜２７の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。配列番号９の配列で表される塩基配列は、クローニングベクターｐＡＣＴ２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ２９８９９）の第５１８３番（５’）〜第５１６２番（３’）の塩基からなる配列である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列、あるいは、配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列
を含み、しかも、Ａｋｔ２と結合するポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項３】
請求の範囲１又は請求の範囲２に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求の範囲３に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項５】
請求の範囲４に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
【請求項６】
（１）請求の範囲１若しくは請求の範囲２に記載のポリペプチド、または配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかもＡｋｔ２と結合するポリペプチド、あるいは前記ポリペプチドを発現している細胞と（２）試験物質とを接触させる工程、
該ポリペプチドとＡｋｔ２との結合を測定する工程、及び
前記結合を阻害する物質を選択する工程
を含むことを特徴とする前記ポリペプチドとＡｋｔ２との結合阻害物質をスクリーニングする方法。
【請求項７】
結合阻害物質がインスリン抵抗性改善薬及び／又は糖代謝改善薬である請求の範囲６に記載のスクリーニングする方法。
【請求項８】
（１）請求の範囲１又は請求の範囲２に記載のポリペプチド、あるいは配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかもＡｋｔ２と結合するポリペプチドと（２）Ａｋｔ２との結合を測定する工程が、前記結合の変化によるＡｋｔ２の変化を測定する工程である請求の範囲６又は請求の範囲７に記載のスクリーニングする方法。
【請求項９】
請求の範囲６乃至請求の範囲８に記載のスクリーニングする方法を用いてスクリーニングする工程、及び
製剤化する工程
を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善用及び／又は糖代謝改善用医薬組成物の製造方法。
【請求項１】
配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列、あるいは、配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列
を含み、しかも、Ａｋｔ２と結合するポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項３】
請求の範囲１又は請求の範囲２に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求の範囲３に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項５】
請求の範囲４に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
【請求項６】
（１）請求の範囲１若しくは請求の範囲２に記載のポリペプチド、または配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかもＡｋｔ２と結合するポリペプチド、あるいは前記ポリペプチドを発現している細胞と（２）試験物質とを接触させる工程、
該ポリペプチドとＡｋｔ２との結合を測定する工程、及び
前記結合を阻害する物質を選択する工程
を含むことを特徴とする前記ポリペプチドとＡｋｔ２との結合阻害物質をスクリーニングする方法。
【請求項７】
結合阻害物質がインスリン抵抗性改善薬及び／又は糖代謝改善薬である請求の範囲６に記載のスクリーニングする方法。
【請求項８】
（１）請求の範囲１又は請求の範囲２に記載のポリペプチド、あるいは配列番号２若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかもＡｋｔ２と結合するポリペプチドと（２）Ａｋｔ２との結合を測定する工程が、前記結合の変化によるＡｋｔ２の変化を測定する工程である請求の範囲６又は請求の範囲７に記載のスクリーニングする方法。
【請求項９】
請求の範囲６乃至請求の範囲８に記載のスクリーニングする方法を用いてスクリーニングする工程、及び
製剤化する工程
を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善用及び／又は糖代謝改善用医薬組成物の製造方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５０８６９
【国際公開日】平成１６年６月１７日（２００４．６．１７）
【発行日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５７０７３２（Ｐ２００４−５７０７３２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１５５４６
【国際出願日】平成１５年１２月４日（２００３．１２．４）
【出願人】（０００００６６７７）アステラス製薬株式会社 (274)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年６月１７日（２００４．６．１７）
【発行日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１５５４６
【国際出願日】平成１５年１２月４日（２００３．１２．４）
【出願人】（０００００６６７７）アステラス製薬株式会社 (274)
【Ｆターム（参考）】
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