ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を発生するワクチン接種のための方法
【課題】マラリア、ＨＩＶ等に対して免疫原性が高く、副作用が少ない、遺伝子ワクチンを提供する。
【解決手段】少なくとも一つの標的抗原に対して保護的ＣＤ８＋ Ｔ細胞免疫応答を発生するためのキットであり、下記ｉ及びｉｉを含むキット：（ｉ）標的抗原の一つまたはそれ以上のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源、ならびに医薬品として受容可能な担体から成る初回刺激組成物；および（ｉｉ）初回刺激組成物のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープと同一である少なくとも一つのＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源を含む標的抗原の一つまたはそれ以上のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源、ここでＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源は非複製または複製欠陥組換えポックスウイルスベクターである、ならびに医薬品として受容可能な担体から成る追加刺激組成物；ただし、（ｉ）のエピトープ源がウイルスベクターであるならば、（ｉｉ）のウイルスベクターは異なるウイルスから誘導される。
【解決手段】少なくとも一つの標的抗原に対して保護的ＣＤ８＋ Ｔ細胞免疫応答を発生するためのキットであり、下記ｉ及びｉｉを含むキット：（ｉ）標的抗原の一つまたはそれ以上のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源、ならびに医薬品として受容可能な担体から成る初回刺激組成物；および（ｉｉ）初回刺激組成物のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープと同一である少なくとも一つのＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源を含む標的抗原の一つまたはそれ以上のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源、ここでＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源は非複製または複製欠陥組換えポックスウイルスベクターである、ならびに医薬品として受容可能な担体から成る追加刺激組成物；ただし、（ｉ）のエピトープ源がウイルスベクターであるならば、（ｉｉ）のウイルスベクターは異なるウイルスから誘導される。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
技術分野
発明の詳細な説明
ＣＤ８ Ｔ細胞免疫応答を発生するワクチン接種のための方法および試薬
本発明はＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源として異なった初回刺激および追加刺激組成物を使用した標的抗原に対する保護的ＣＤ８＋ Ｔ細胞免疫応答の発生に関している。
【０００２】
背景技術
ワクチン学における一般的問題は、免疫化により高レベルのＣＤ８ Ｔ細胞を発生できないことである。このことはマラリアを含むいくつかの疾患に対するワクチンの開発を妨げてきた。
【０００３】
熱帯熱マラリア原虫マラリアは毎年数億のマラリア感染を起こし、毎年１００−２００万人の死者を出している。従って、マラリアに対する有効なワクチンの開発は世界の公衆衛生においてより重要な優先すべきものである。この２０年間おける免疫学的研究のかなり多くは原虫からのワクチン抗原候補、および感染および疾患を保護しているらしい宿主免疫学的機構の両方の同定に至っている。しかしながらこの進歩にもかかわらず、現場での試みに有効であることが示されたマラリア感染に対するワクチン接種法は未だに存在しない。
【０００４】
主要な問題は、感染および疾患を保護するために十分強力な免疫応答をワクチン接種した個体に誘導する手段が同定されないためである。このように、マラリアに対するワクチン接種に有用であろう多くのマラリア抗原が知られているが、免疫系の細胞により認識されるエピトープとして知られているそのような抗原またはそれらの断片を、特定の型の十分に強い免疫応答を誘導する様式でどうのように送達するのかが問題であった。
【０００５】
大量の照射された、感染した蚊が刺すことにより与えられるマラリアスポロゾイトで個体を免疫することにより個体を保護することが可能であることは前から知られている。この方法は大量のワクチン接種には全く実際的ではないが、スポロゾイト感染に対する保護的免疫性を仲介するであろう免疫応答を分析するためのモデルを提供した（ＮａｒｄｉｎおよびＮｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ １９９３）。
【０００６】
この１０年またはそれ以上にわたるかなりの量の研究は、熱帯熱マラリア原虫マラリアの初期前赤血球期に対する主な保護的免疫応答がＣＤ８＋ｖｅ型のＴリンパ球（ＣＤ８＋ Ｔ細胞）により仲介されることを示している。そのような細胞はマラリア感染のマウスモデルにおいて直接的に保護を仲介することが示されている（ＮａｒｄｉｎおよびＮｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ １９９３）。そのようなＴ細胞はまた、自然にマラリアに感染した個体および照射されたスポロゾイトで免疫された志願者において同定されている（Ｈｉｌｌら１９９１；Ａｉｄｏｏら１９９５；Ｗｉｚｅｌら１９９５）。そのようなＣＤ８＋ Ｔ細胞はヒトにおけるマラリア感染および疾病に対して保護的であるという間接的な証拠が多く存在する（Ｌａｌｖａｎｉら１９９４）。
【０００７】
ＣＤ８＋ Ｔ細胞は一つ以上の様式で機能しているであろう。最もよく知られている機能は、ＭＨＣクラスＩ分子関連のペプチド抗原を持つ標的細胞を殺すまたは溶解させることである。従って、これらの細胞はしばしば細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と称される。しかしながら、多分マラリア感染においてより大きな保護的関連性を持つ別の機能はインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）を分泌するＣＤ８＋ Ｔ細胞の能力である。従って、ＣＤ８＋ Ｔ細胞免疫応答の測定において溶解活性およびＩＦＮ−γ放出アッセイの両方ともが価値がある。マラリアにおいてこれらのＣＤ＋８ｖｅ細胞は、疾患の徴候がでる前のマラリア感染の初期肝臓内期で原虫を殺すことにより保護することができる（Ｓｅｇｕｉｎら１９９４）。致死的ヒトマラリアの仲介者、熱帯熱マラリア原虫は限られた数の宿主種に感染する：ヒト、チンパンジーおよび新世界ザルのいくつかの種。マラリアの最良の非ヒトモデルはチンパンジーであり、その理由は、この種はヒトに密接に関連しており、およびサル宿主と異なって肝臓期感染が一致して観察されるためである（Ｔｈｏｍａｓら１９９４）。チンパンジーは高価でありおよび利用できる数が限られているので、ほとんどの実験室での研究は齧歯動物マラリア種Ｐ．ベルゲイまたはＰ．ヨエリイを用いてマウスで実施される。これら後者の二つのモデルはよく研究されており、両方ともスポロゾイト感染に対する保護的免疫性においてＣＤ８＋ｖｅリンパ球が鍵となる働きを果たしていることが示されている。
【０００８】
従来の研究はマラリアに対するＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を含む種々の方法を評価している。これらのいくつかは齧歯動物モデルにおけるＣＤ８＋ Ｔ細胞応答のいくつかのレベルおよびマラリア感染に対する部分的保護を示している（例えば、Ｌｉら１９９３；Ｓｅｄｅｇａｈら１９９４；Ｌａｎａｒら１９９６）。しかしながら、マラリアスポロゾイト感染を有効に保護するための十分に高レベルのＣＤ８＋ Ｔリンパ球の導入によるサブユニットワクチン免疫化の有効な方法はこれまで示されていない。
【０００９】
最近、抗原を運ぶために使用されるベクターを変えることにより改良された免疫応答を発生させる可能性のあるワクチンが考えられた。初回刺激および追加刺激として連続的に投与された二つの異なったベクターを使用することにより抗体応答が改良されたいくつかの例での証拠が存在する。初回刺激および追加刺激の種々の組み合わせが異なったワクチン投与法で試験された。
【００１０】
Ｌｅｏｎｇら（Ｖａｃｃｉｎｅｓ １９９５，３２７−３３１）は、最初にインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）抗原を発現するＤＮＡで、続いてＨＡを発現する組換え鶏痘ベクターによるマウスの免疫化を記載している。追加刺激後に促進された抗体応答が得られている。
【００１１】
Ｒｉｃｈｍｏｎｄら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９７，２３０：２６５−２７４）はＤＮＡ初回刺激および組換えワクシニアウイルス追加刺激を用いてＨＩＶ−ｌｅｎｖに対する中和抗体を上昇させる試みを記載している。この初回刺激−追加刺激法では低レベルの抗体応答しか観察されず、結果は落胆するものであった。
【００１２】
Ｆｕｌｌｅｒら（Ｖａｃｃｉｎｅ １９９７，１５：９２４−９２６およびＩｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９７，７５：３８９−３９６）は複製する組換えワクシニアウイルスによる追加刺激免疫化を使用することによるマカクのＤＮＡ免疫化に対する抗体応答の促進を記載している。しかしながら、ウイルス負担の非常な減少としての促進された保護的効能には転化されず、ＤＮＡ初回および追加刺激動物においてＣＤ４Ｔ細胞損失の減弱がみられた。
【００１３】
Ｈｏｄｇｅら（Ｖａｃｃｉｎｅ １９９７，１５：７５９−７６８）は組換え鶏痘ウイルス（ＡＬＶＡＣ）で発現されたヒト胎児性癌抗原（ＣＥＡ）を用いた癌のマウスモデルにおけるリンパ球増殖性Ｔ細胞応答の誘導を記載している。著者らはＷｙｅｔｈまたはＷＲ株のＣＥＡ−組換え複製適格性ワクシニアウイルスで免疫応答を初回刺激し、ＣＥＡ−組換えＡＬＶＡＣで応答を追加刺激した。これはＴ細胞増殖を増加させたが、３回の野生型組換え免疫化（１００％保護）、３回の組換えＡＬＶＡＣ−ＣＥＡ免疫化（７０％保護）またはＷＲ初回刺激に続く２回のＡＬＶＡＣ−ＣＥＡ免疫化（６３％保護）と比較した合台、保護的効能の促進は得られなかった。
【００１４】
それ故、異種初回刺激−追加刺激の組み合わせのいくつかの研究では抗体およびリンパ球増殖性応答のいくらかの促進は観察されたが、動物モデルにおける保護的効能には有意な影響を与えなかった。これらの研究においてＣＤ８ Ｔ細胞は測定されていない。抗体応答があまり促進されなかったのは多分、初回刺激免疫原に対する抗体はしばしば同一の免疫原による第二の免疫化の免疫原性を減少させるであろうが、異なった担体による追加刺激はこの問題を部分的に克服するであろうという事実を単に反映しているのであろう。この機構は免疫化の順序には有意に影響されないことが期待されるであろう。
【００１５】
異種初回刺激−追加刺激免疫化法がＣＤ８ Ｔ細胞応答に影響するという証拠がＬｉら（１９９３）により提出された。かれらは二つの生きているウイルスベクターの投与、即ち、組換えされた複製するインフルエンザウイルス続いてのマラリアエピトープをコードしている組換えされた複製するワクシニアウイルス、によりマラリアスポロゾイト感染に対してマウスで誘導された部分的な保護的効能を記載している。免疫化の順序を逆転させると保護的効能が失われ、著者らはワクシニアによる肝臓細胞の感染に関連し、マラリア原虫の肝臓期に対する保護のために肝臓中にＣＴＬの局在化が生じることを示唆している。
【００１６】
Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４，４６３６−４６４８）はマラリアスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質の免疫優性Ｂ細胞エピトープを発現している組換えインフルエンザウイルスの反復投与、続いての組換えワクシニアウイルス追加刺激によるマウスの免疫化を記載している。追加刺激における野性型ワクシニア株および減弱されているが複製適格性であるワクシニア株の使用は非常に類似したレベルの部分的保護を与えた。しかしながら、減弱されているが複製適格性であるワクシニア株は野性型ワクシニア株よりもＣＤ８ Ｔ細胞の初回刺激に対してはわずかに免疫原性が劣っていた。
【００１７】
Ｍｕｒａｔａら（Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６，１７３：９６−１０７）は、複製する組換えインフルエンザウイルスによる初回刺激およびワクシニアウイルスの複製する株による追加刺激後の促進されたＣＤ８ Ｔ細胞応答を報告しており、二つの従来の研究で観察された部分的保護はこの促進されたＣＤ８Ｔ細胞誘導によるものであることを示唆している。
【００１８】
それ故これら三つの研究を一緒にすると、複製する組換えワクシニアウイルスによる追加刺激免疫化は、複製する組換えインフルエンザウイルスによる初回刺激に続くＣＤ８ Ｔ細胞誘導をある程度促進するという証拠を提供している。しかしながら、それらの潜在的有用性に関するこれらの発見には二つの制限が存在する。第一に、誘導された免疫原性マラリアに対して部分的保護を達成する程度でしか十分ではなく、これは非常に免疫原性である通常ではない複製する組換えインフルエンザウイルスによる初回刺激免疫化に依存していた。第二に、免疫原としてこれらの複製するウイルスを使用する潜在的および記載された副作用のため、これらの組換えベクターはワクチンとしてヒト一般への使用には適していない。
【００１９】
修飾ワクシニアウイルス アンカラ（ＭＶＡ）は、正常ヒト組織を含むほとんどの細胞型で複製しないワクシニアウイルスである。ＭＶＡはトルコのアンカラでウマの痘疹病変から誘導された材料をニワトリ胎児線維芽細胞（ＣＥＦ）で＞５００回の連続継代培養により誘導された（Ｍａｙｒら１９７５）。複製欠陥的であるが、それにもかかわらず獣医学的にポックスウイルス感染に対して保護的免疫性を誘導できることが示されている（Ｍａｙｒ １９７６）。ＭＶＡは天然痘根絶キャンペーンの最終期においてヒトワクチンとして使用されており、南ドイツにおいて＞１２０，０００の被験者に皮内、皮下および筋肉内経路で投与されている。湿疹のような高リスク群へのワクチン接種の計画的標的化にもかかわらず、有意な副作用は記録されていない（Ｍａｙｒら１９７８；Ｓｔｉｃｋｌら１９７４；Ｍａｈｎｅｌら１９９４）。ＭＶＡの安全性は照射マウスおよび続いての新生児マウスへの頭蓋内投与を含む動物モデルにおけるウイルスの無毒性を反映している。ＭＶＡが複製しないことはニワトリ漿尿膜上の増殖性白色プラークの産生、非鳥類細胞の不発感染および全部で約３０ｋｂの六つのゲノム欠損に相関していた（Ｍｅｙｅｒら１９９１）。ＭＶＡの無毒性は宿主域遺伝子Ｋ１ＬおよびＣ７Ｌに影響する欠損に部分的に帰するとされているが、ヒトＴＫ−１４３細胞およびアフリカミドリザルＣＶ−１細胞では制限されたウイルス複製が起こる（Ａｌｔｅｎｂｕｒｇｅｒら１９８９）。Ｋ１Ｌ遺伝子の回復は、ＭＶＡ宿主域をただ部分的に回復させる（Ｓｕｔｔｅｒら１９９４）。宿主域制限はウイルス粒子成熟の間に起こるようであり、電子顕微鏡法でヒトヒーラー細胞中に未成熟ビリオンのみが観察されている（Ｓｕｔｔｅｒら１９９２）。ウイルス複製における後期阻害はＭＶＡ中の組換え遺伝子の効率的発現を防止しない。インフルエンザ核タンパク質、インフルエンザヘマグルチニンおよびＳＩＶタンパク質を発現している組換えＭＶＡは免疫原性であることが証明されており、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球のみに帰せられるものではないが、動物モデルにおいていろいろな程度の保護を示している（Ｓｕｔｔｅｒら１９９４；Ｈｉｒｓｃｈら１９９５；Ｈｉｒｓｃｈら１９９６）。組換えＭＶＡは、その安全性および免疫原性特性のためヒトワクチン候補として見込みがあると考えられる（Ｍｏｓｓら１９９５）。異物抗原をコードしているＤＮＡを含む組換えＭＶＡは米国特許第５，１８５，１４６号（Ａｌｔｅｎｂｕｒｇｅｒ）に記載されている。
【００２０】
ポックスウイルスは、通常細胞性サイトカインレセプターの細胞外ドメインと類似の配列を持つ腫瘍壊死因子、ＩＬ−１β、インターフェロン（ＩＦＮ）−α／βおよびＩＦＮ−γの可溶性レセプターとして機能する分泌タンパク質の産生を含む宿主免疫応答の回避のための戦略を発展させた（Ｓｙｍｏｎｓら１９９５；Ａｌｃａｍｉら１９９５；Ａｌｃａｍｉら１９９２）。この性質を持ち、最も最近に報告されたレセプターはケモカインレセプターである（Ｇｒａｈａｍら１９９７）。これらウイルスレセプターは一般に適切な宿主免疫応答を阻害するかまたは消失させ、それらの存在は増大した病原性に関連する。ＩＬ−１βレセプターは例外である：その存在は感染に直面して宿主発熱応答を弱め、および宿主生存を高める（Ａｌｃａｍｉら１９９６）。我々はＭＶＡにはインターフェロンγ、インターフェロンαβ、腫瘍壊死因子およびＣＣケモカインの機能性サイトカインレセプターが欠けているが、潜在的に有益なＩＬ−１βレセプターを保持していることを発見した。ＭＶＡはこのサイトカインレセプタープロフィールを保持している唯一の既知ワクシニア株であり、理論的に他のポックスウイルスと比較するとより安全でおよびより免疫原性である。別の複製欠陥的および安全なワクシニア株はＮＹＶＡＣとして知られており、Ｔａｒｔａｇｌｉａらにより完全に記載されている（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９２，１８８：２１７−２３２）。
【００２１】
生きているウイルスは組換えワクチンベクターとしていくつかの魅力的な特色を持っており、異物抗原に対する高い適応力および細胞免疫応答のためのかなり良好な免疫原性が含まれる（Ｅｌｌｉｓ １９８８ワクチン作成のための新技術”ワクチン”、編者：Ｐｌｏｔｋｉｎ ＳＡおよびＭｏｒｔｉｍｅｒ ＥＡ．ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，５６８ページ；Ｗｏｏｄｒｏｗ ＧＣ １９７７”新世代ワクチン第二版”編者：Ｌｅｖｉｎｅ ＭＭ，Ｗｏｏｄｒｏｗ ＧＣ，Ｋａｐｅｒ ＪＢ，Ｃｏｂｏｎ Ｇ，３３ページ）。このことにより、複製能力を減少させることを含む種々の方法でそのような生きているベクターの毒性を減弱させる試みが行われた（Ｔａｒｔａｇｌｉａら１９９２ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８８：２１７−２３２）。しかしながら、そのような複製能力の減少はウイルスにより生み出される抗原の量を減少させ、それによりワクチン免疫原性を減少させることが予期されるであろう。実際、複製するワクシニア株の減弱は抗体応答のいくらかの実質的減少を導くことが以前に示されている（Ｌｅｅ ＭＳら１９９２ Ｊ Ｖｉｒｏ１ｏｇｙ ６６：２６１７−２６３０）。同様に、狂犬病研究において非複製鶏痘ベクターは複製する野生型ワクシニア株よりも抗体産生のための免疫原性が弱く、より保護的でないことが観察されている（Ｔａｙｌｏｒ Ｊら１９９１ Ｖａｃｃｉｎｅ ９：１９０−１９３）。
【００２２】
ポックスウイルスの非複製および複製欠陥株が初回刺激ＣＴＬ応答に対し特別に良好な追加刺激効果を与えるベクターを提供することがここに発見された。驚くべきことに、この効果は野生型ポックスウイルスによる追加刺激効果よりも著しく強かった。この効果はマラリアおよびウイルスおよび腫瘍抗原のような他の抗原で観察され、マウスおよび非ヒト霊長類感染実験で示されたように保護的である。スポロゾイトの攻撃誘発（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）からの部分的というよりも完全な保護が新規免疫化投与法で観察された。
【００２３】
マラリアに対して免疫する有効な手段を同定するのもこの発明の目的である。ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答が保護的働きを果たしている手段を同定するのもこの発明のさらなる目的である。そのような疾患にはＨＩＶ、単純ヘルペス、帯状ヘルペス、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、エプスタイン−バール、麻疹、デング熱およびＨＴＬＶ−１ウイルスにより；細菌結核菌およびリステリア種により；および原虫寄生体トキソプラズマおよびトリパノソーマにより；およびある形の癌（例えば、メラノーマ、乳癌および結腸癌）で起こされる感染および疾患が含まれるがそれらに制限されるわけではない。
【００２４】
本明細書において非常に高レベルのＣＤ８＋ Ｔ細胞を発生したおよびＰ．ベルゲイスポロゾイト攻撃誘発に対して先例のない完全保護を誘導できることが観察された新規免疫化法が説明される。同一の方法がより高等な霊長類で試験され、この種においても高度に免疫原性であることが観察され、および熱帯熱マラリア原虫の攻撃誘発に対して部分的保護を誘導することが観察された。保護的免疫応答の誘導は二つの追加のウイルス感染および癌のマウスモデルにおいても示された。
【００２５】
本明細書に記載されている新規免疫化法ではまたＨＩＶエピトープに対する強力なＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を発生するのに有効である新規免疫化法がさらに示される。かなりの証拠がそのようなＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の発生はこのウイルス感染および疾患に対する予防的および治療的免疫化に有効であると期待できることを示している（Ｇａｌｌｉｍｏｒｅら１９９５；Ａｄａ １９９６）。強いＣＤ８＋ Ｔ細胞応答はＨＩＶおよびマラリア両方からの配列を持つエピトープ列を用いてこれらの微生物からのエピトープに対して発生されるであろうことが示される。ＨＩＶおよびマラリアエピトープおよびインフルエンザおよび腫瘍エピトープ両方に対する促進された免疫原性の発生における成功は、この新規免疫化法は強力なＣＤ８＋ Ｔ細胞応答が有用であろう多くの感染性病原体および非感染性疾患に一般的に有効であろうことを示している。
【００２６】
本発明の驚くべき特色とは初回刺激および特にＣＤ８＋ Ｔ細胞の追加刺激の両方における非複製作用物質の非常に高い効能の発見である。一般に、生きているウイルスベクターによるＣＤ８＋ Ｔ細胞誘導の免疫原性は非複製作用物質または複製欠陥ベクターよりも高いことはすでに見いだされている。このことは宿主中で複製できる作用物質により産生される抗原の量がより多いことから予期されるであろう。しかしながらここで我々は非複製ベクターを用いて最大の免疫原性および保護的効能が驚くべきことに観察されたことを見いだした。後者はヒトにおける使用のためには複製するベクターよりも一般的に安全であるということでワクチン接種における利点を追加する。
【００２７】
本発明は一つの態様において、少なくとも一つの標的抗原に対して保護的ＣＤ８＋ Ｔ細胞免疫応答を発生するためのキットを提供し、本キットは以下のものを含んでいる：
（ｉ） 標的抗原の一つまたはそれ以上のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源、ならびに医薬品として受容可能な担体から成る初回刺激組成物；および
（ｉｉ）初回刺激組成物のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープと同一である少なくとも一つのＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源を含む標的抗原の一つまたはそれ以上のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源、ここでＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源は非複製または複製欠陥組換えポックスウイルスベクターである、ならびに医薬品として受容可能な担体から成る追加刺激組成物；
ただし、（ｉ）のエピトープ源がウイルスベクターであるならば、（ｉｉ）におけるウイルスベクターは異なったウイルスから誘導される。
【００２８】
本発明の別の態様は少なくとも一つの標的抗原に対する保護的ＣＤ８＋ Ｔ細胞免疫応答を発生させるための方法を提供し、本方法は本発明に従ったキットの組成物（ｉ）の少なくとも一回量、続いて組成物（ｉｉ）の少なくとも一回量を投与することから成っている。
【００２９】
好適には、本発明に従った方法における（ｉ）のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源は非ウイルスベクターまたは非複製または複製欠陥ウイルスベクターであるが、複製するウイルスベクターを使用してもよい。
【００３０】
好適には、（ｉ）のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源は初回刺激および追加刺激間の交差反応が最小となるようにするためにポックスウイルスベクターではない。
本発明の一つの好適な態様において、初回刺激組成物中のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源は核酸（ＤＮＡでもＲＮＡでもよい）、特に組換えＤＮＡプラスミドである。ＤＮＡまたはＲＮＡは包まれていてもよいし（例えば、リソソーム中に）または遊離の形でもよい。
【００３１】
本発明の別の好適な熊様において、初回刺激組成物中のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源はＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープの組換え列中または標的抗原中に存在するペプチド、ポリペプチド、タンパク質、多タンパク質または二つまたはそれ以上のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを含む粒子である。多タンパク質は二つまたはそれ以上のタンパク質を含んでおり、それらは同じものでもよいが好適には異なっておりお互いに連結されている。この態様で特に好適であるのはＴｙウイルス様粒子（ＶＬＰ）（ＢｕｒｎｓらＭｏｌｅｃ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９４，１：１３７−１４５）のような組換えタンパク質様粒子である。
【００３２】
好適には、追加刺激組成物中のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源はＭＶＡまたはＮＹＶＡＣのようなワクシニアウイルスベクターである。最も好適であるのはワクシニア株修飾ウイルスアンカラ（ＭＶＡ）またはそれらから誘導された株である。ワクシニアベクターの代替物としては鶏痘またはカナリア痘ベクターのようなアビポックスベクターが挙げられる。アビポックスベクターとして特に適しているのはＡＬＶＡＣとして知られているカナリア痘の株（Ｋａｎａｐｏｘの名前で市販品として入手可能である）およびそれらから誘導された株である。
【００３３】
ポックスウイルスゲノムは多量の異種遺伝子情報を運ぶことができる。ワクチンでの使用におけるウイルスベクターの他の必要条件は良好な免疫原性および安全性である。ＭＶＡは良好な安全性の記録を持つ複製欠陥ワクシニア株である。
【００３４】
ほとんどの細胞型および正常ヒト組織において、ＭＶＡは複製を起こさない；ＭＶＡの制限された複製がＢＨＫ２１細胞のような少数の形質転換された細胞型で観察される。本明細書に記載された結果から、組換えＭＶＡおよび他の非複製または複製欠陥株は、ＤＮＡプラスミド、組換えＴｙ−ＶＬＰまたは組換えアデノウイルスによる初回刺激に続いての追加刺激組成物として投与した場合、保護的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を発現させることにおいて通常の組換えワクシニアベクターよりも驚くほどおよび著しく良好であることがここに示されている。
【００３５】
ＭＶＡから誘導されたワクシニアウイルス株、またはワクチンでの使用にＭＶＡを特に適したものにするＭＶＡの特色を持っている独立して開発された株は本発明での使用に適しているであろうことが明らかにされるであろう。
【００３６】
エピトープの挿入列を含んでいるＭＶＡ（ＭＶＡ−ＨＭ、実施例に説明されている）は１９９７年６月５日にＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，ＣＡＭＲ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ ＳＰ４０ＪＧ，ＵＫにＶ９７０６０５１１の受け入れ番号で寄託された。
【００３７】
本明細書で使用される用語”非複製”または”複製欠陥”とは大多数の哺乳類細胞または正常ヒト細胞中で有意な程度では複製できないことを意味している。
非複製または複製欠陥であるウイルスは自然にそうなるかまたはインビトロでの繁殖によりまたは例えば、複製に決定的である遺伝子の欠損のような遺伝子操作により人工的に作製される。ＭＶＡに対するＣＥＦ細胞のように、ウイルスが増殖できる一つまたは少数の細胞型が一般的に存在するであろう。
【００３８】
ウイルスの増殖は一般的に二つの方法で測定される：１）ＤＮＡ合成および２）ウイルス力価。より正確には、用語”非複製または複製欠陥”が本明細書で使用される場合およびそれがポックスウイルスに適用される場合、以下の基準の片方または両方を満足するウイルスを意味している：
１）ＭＲＣ−５細胞（ヒト細胞株）においてワクシニアウイルスのコペンハーゲン株と比較してＤＮＡ合成に１ｌｏｇ（１０倍）の減少を示す；
２）ヒーラー細胞（ヒト細胞株）においてワクシニアウイルスのコペンハーゲン株と比較してウイルス力価に２ｌｏｇの減少を示す。
【００３９】
この定義に含まれるポックスウイルスの例はＭＶＡ、ＮＹＶＡＣおよびアビポックスウイルスであり、定義に含まれないウイルスは減弱ワクシニア株Ｍ７である。
本発明に従った初回刺激に使用するための別の好適なウイルスベクターには、遺伝学上非複製または複製欠陥であるようになされた種々の異なったウイルスが含まれる。非複製または複製欠陥ベクターを産生するようなウイルスの遺伝子操作は文献に多く記載されている（例えば、ＭｃＬｅａｎら１９９４）。
【００４０】
初回刺激に使用するための別の適したウイルスベクターは、ヘルペスウイルスおよびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）（Ｄａｖｉｅｓら１９９６）に基づいたベクターである。初回刺激に適した細菌ベクターには組換えＢＣＧおよび組換えサルモネラおよびプラスミドＤＮＡで形質転換したサルモネラ（Ｄａｒｊｉら１９９７ Ｃｅｌｌ ９１：７６５−７７５）が含まれる。
【００４１】
初回刺激に使用するための別の適した非ウイルスベクターには、リポペプチドとして知られている脂質の尾をつけたペプチド、融合タンパク質としてまたは化学結合によりＫＬＨのような担体タンパク質に融合されたペプチド、アジュバントを含む全抗原およびその他の類似の系が含まれる。ＱＳ２１またはＳＢＡＳ２（Ｓｔｏｕｔｅら１９９７ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２２６：８６−９１）のようなアジュバントがＴ細胞応答の誘導を促進させるためにタンパク質、ペプチドまたは核酸とともに使用されるであろう。これらの系はしばしば”ベクター”というよりも”免疫原”と称されるが、それらは関連するＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを運んでいるという意味で本明細書においてはベクターである。
【００４２】
初回刺激および追加刺激組成物は両方とも前記（ｉ）で定義されたようなＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープの初回刺激源および前記（ｉｉ）で定義されたようなＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープの追加刺激源を含んでいるのでそれらの組成物は同一でなければならないという理由はない。初回刺激としておよび追加刺激として使用できる単一処方が単に投与されるであろう。重要なことは、初回刺激物は少なくとも前記（ｉ）で定義されたようなエピトープの初回刺激源を含んでおり、および追加刺激物は少なくとも前記（ｉｉ）で定義されたようなエピトープの追加刺激源を含んでいることである。
【００４３】
初回刺激および追加刺激組成物中に存在するまたはそれらによりコードされているＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープは、一つまたは二つまたはそれ以上のエピトープの組換え列のような種々の異なった形で、または天然の標的抗原の環境で、またはこれら両方の組み合わせで提供される。ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープは多くの異なった疾患に対して同定されており文献に見ることができる。そのようなエピトープを含む任意の抗原に対してＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を発生させるようにエピトープ列を設計することが可能である。都合よくは、不必要な核酸および／またはアミノ酸材料が回避されるように、配列が間に入ることなく多エピトープ列中のエピトープが連結される。ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープに加え、エピトープ列により発生される免疫応答を増大させるため、Ｔヘルパー細胞により認識される一つまたはそれ以上のエピトープを含んでいることが好適であろう。特に適したＴヘルパー細胞エピトープは異なったＨＬＡ型の個体で活性化されるものである、例えば、破傷風からのＴヘルパーエピトープ（それに対しほとんどの個体はすでに初回刺激されているであろう）。三つのヘルパーエピトープの有用な組み合わせが本明細書に記載された実施例で用いられている。Ｂ細胞応答および抗体産生を促進するためのＢ細胞エピトープを含ませるのも有用であろう。
【００４４】
記載されている初回刺激および追加刺激組成物は都合よくはアジュバントを含んでいる。特に、ＤＮＡプラスミドを含んでいる初回刺激組成物はさらにアジュバントとして作用するための顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）またはそれをコードしているプラスミドも含んでいる；ポリペプチド形のＧＭ−ＣＳＦを使用すると有益な効果が観察された。
【００４５】
本明細書に記載された組成物は治療的または予防的ワクチンとして用いられる。予防的または治療的免疫化のどちらがより適切であるかは通常疾患の特性に依存するであろう。例えば、癌ではそれが診断される前というよりはむしろ治療的に免疫化されるであろうし、一方、抗マラリアワクチンは必ずというわけではないが、好適には予防的に使用されるであろう。
【００４６】
本発明の組成物は種々の異なった経路で投与される。より効果的な応答の発生が得られるように、または副作用を引き起こすことがより少なくなるように、または投与がより簡単であるように、ある種の組成物に対してはある種の経路が好都合である。本発明は、金ビーズ上かまたは粉末としての遺伝子銃送達で有効であることが示されている。
【００４７】
さらなる態様において、本発明は以下のものを提供する： 病原体または腫瘍に対する保護的ＣＤ８＋ Ｔ細胞免疫応答を発生させるための方法であって、但し本方法は少なくとも一つのＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープまたは病原体または癌の抗原をコードしている組換えＤＮＡプラスミドの少なくとも一回量、続いて同一のエピトープまたは抗原をコードしている非複製または複製欠陥組換えポックスウイルスの少なくとも一回量を投与することから成る；
病原体または腫瘍に対する保護的ＣＤ８＋ Ｔ細胞免疫応答を発生させるための方法であって、但し本方法は少なくとも一つの病原体または癌のエピトープまたは抗原を含む組換えタンパク質または粒子の少なくとも一回量、続いて同一のエピトープまたは抗原をコードしている組換えＭＶＡベクターの少なくとも一回量を投与することから成る；
ＣＤ８＋ Ｔ細胞免疫応答を追加刺激するための医薬品の製造における組換え非複製または複製欠陥ポックスウイルスベクターの使用；
ＣＤ８＋ Ｔ細胞免疫応答を追加刺激するための医薬品の製造におけるＭＶＡベクターの使用；
標的抗原の一つまたはそれ以上のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源を含む、少なくとも一つの標的抗原またはエピトープに対する初回刺激ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を追加刺激するための医薬品ならびに医薬として受容可能な担体、ここでＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源は非複製または複製欠陥組換えポックスウイルスベクターである；および 遺伝子銃による送達に適した特別な形の本明細書に記載されている初回刺激および／または追加刺激組成物；および遺伝子銃法による組成物の送達から成る免疫化法。
【００４８】
以下のものも本発明により提供される：表１および表２に掲けられたアミノ酸配列から成るエピトープ列を含む本明細書に記載されたエピトープ列；エピトープ列をコードしている組換えＤＮＡプラスミド；エピトープ列を含む組換えＴｙ−ＶＬＰ；熱帯熱マラリア原虫抗原ＴＲＡＰをコードしている組換えＤＮＡプラスミドまたは非複製または複製欠陥組換えポックスウイルスベクター；および全または実質的に全部のＴＲＡＰのようなタンパク質抗原、およびマラリアからのＣＴＬエピトープのような配列中の二つまたはそれ以上のエピトープの列から成る組換えポリペプチド。
【００４９】
実施例処方および免疫化プロトコール
処方１
初回刺激組成物： ＤＮＡプラスミド１ｍｇ／ｍｌＰＢＳ溶液
追加刺激組成物： 組換えＭＶＡ、１０8ｆｆｕ ＰＢＳ溶液
プロトコール：初回刺激組成物の１ｍｇをｉ．ｍ．で０および３週に２回、続いて追加刺激物を６および９週に皮内に投与する。
処方２
初回刺激組成物： Ｔｙ−ＶＬＰ ＰＢＳ溶液
追加刺激組成物： ＭＶＡ、１０8ｆｆｕ ＰＢＳ溶液
プロトコール：初回刺激組成物をｉ．ｍ．で０および３週に２回、続いて追加刺激物を６および９週に投与する。腫瘍処置のためには、ＭＶＡは最も有効な経路としてｉ．ｖ．で投与される。
処方３
初回刺激組成物： タンパク質５００μｇ＋アジュバント（ＱＳ−２１）
追加刺激組成物： 組換えＭＶＡ、１０8ｆｆｕ ＰＢＳ溶液
プロトコール：初回刺激組成物を０および３週に２回、続いて追加刺激物を６および９週にｉ．ｄ．で投与する。
処方４
初回刺激組成物： アデノウイルスベクター、１０9ｐｆｕ ＰＢＳ溶液
追加刺激組成物： 組換えＭＶＡ、１０8ｆｆｕ ＰＢＳ溶液
プロトコール：初回刺激組成物を皮内に０および３週に２回、続いて追加刺激物を６および９週にｉ．ｄ．で投与する。
【００５０】
上記の投与量およびプロトコールは保護を最大にするために変更されることもある。例えば、２週離すというよりも１から８週離して投与されてもよい。
本発明は以下の実施例でさらに説明されるであろう。
【００５１】
実施例
実施例１
材料および方法
エピトープ列の発生
マラリアエピトープ列は各々が表１に示されたような三つのエピトープをコードしている一連のカセットから作製された（カセットは各々の末端に制限酵素部位を含んでいる）。各々のカセットは四つの合成オリゴヌクレオチドから構築され、それらはお互いにアニールされ、クローニングベクター内へ結合され、続いてエラーが導入されていないことを検査するために配列決定された。個々のカセットは次に必要に応じてお互いに連結された。カセットＣの３’末端のＢａｍＨＩ部位はカセットＡの５’末端のＢｇｌII部位と融合され、両方の制限酵素部位を破壊して二つのカセット間に二つのアミノ酸スペーサー（ＧＳ）がコードされる。カセットＢ，ＤおよびＨは次に同一の方法で一列に連結された。ＣＡＢＤＨＦＥを含むより長い列も同じ方法で構築された。
【００５２】
【表１】
【００５３】
表１ マラリアエピトープ列に含まれている配列。各々のカセットは上に示されたエピトープから成っており（示された順序で）、カセット内のエピトープ間には追加の配列は存在しない。エピトープ列中のカセット間にＢａｍＨＩ／ＢｂｌII連結がＧＳをコードするようにＢｇｌII部位が５’末端におよびＢａｍＨＩ部位が３’末端に加えられた。ｐｂ９（Ｐ．ベルゲイ）、ＢＣＧ（結核菌）およびＴＴ（破傷風菌）を除いてすべてのエピトープは熱帯熱マラリア原虫抗原からのものである。表に示されたアミノ酸およびＤＮＡ配列はそれらが出てくる順序に配列ＩＤ番号：１から４０を持っている。
【００５４】
図１はマラリアエピトープカセットＣＡＢＤＨＦＥを持つＴｙ−ＶＬＰを発現するために使用された構築物を示している。ＣＴＬエピトープは熱帯熱マラリア原虫抗原ＳＴＡＲＰ（スポロゾイト スレオニンおよびアスパラギンに富むタンパク質）（ｓｔ）、ＬＳＡ−１（肝臓期抗原１）（１ｓ）、ＣＳＰ（スポロゾイト周囲タンパク質（ｃｐ）、ＴＲＡＰ（トロンボスポンジン関連付着タンパク質）（ｔｒ）、ＬＳＡ−３（肝臓期抗原３）（ｌａ）およびＥｘｐ−１（エキスポートされたタンパク質１）（ｅｘ）からのものである。ヘルパーエピトープは熱帯熱マラリア原虫ＣＳタンパク質、結核菌３８Ｋｄ抗原および破傷風毒素からのものである。ＮＡＮＰはＣＳからの抗体エピトープであり、ＡＭは熱帯熱マラリア原虫ＴＲＡＰからの付着モチーフである（Ｍｕｌｌｅｒら１９９３）。完全列の長さは表１の注に示されているように２２９アミノ酸であり、以下のアミノ酸配列である：ＭＩＮＡＹＬＤＫＬＩＳＫＹＥＤＥＩＳＹＩＰＳＡＥＫＩＧＳＫＰＮＤＫＳＬＹＫＰＫＤＥＬＤＹＫＰＩＶＱＹＤＮＦＧＳＡＳＫＮＫＥＫＡＬＩＩＧＩＡＧＧＬＡＬＬＭＮＰＮＤＰＮＲＮＶＧＳＨＬＧＮＶＫＹＬＶＫＳＬＹＤＥＨＩＬＬＭＤＣＳＧＳＩＧＳＤＰＮＡＮＰＮＶＤＰＮＡＮＰＮＶＱＶＨＦＱＰＬＰＰＡＶＶＫＬＱＦＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＧＳＹＬＮＫＩＱＮＳＬＭＥＫＬＫＥＬＥＫＡＴＳＶＬＡＧＬＧＳＮＡＮＰＮＡＮＰＮＡＮＰＮＡＮＰＤＥＷＳＰＣＳＶＴＣＧＫＧＴＲＳＲＫＲＥＧＳＧＫ［配列ＩＤ番号：４１］。
【００５５】
ＨＩＶエピトープ列もまたオリゴヌクレオチドをアニールすることで合成された。最後にＨＩＶおよびマラリアエピトープはＨＩＶエピトープ３’末端のＢａｍＨＩ部位をカセットＣＡＢ５’末端のＢｇｌII部位へ結合させてＨＭ列を形成させることにより融合された（表２）。
【００５６】
【表２】
【００５７】
表２ ＨＩＶまたはＳＩＶからのエピトープの配列はＨエピトープ列に含まれており図２に示されたように組み立てられた。表中のアミノ酸はそれらが出てくる順序に配列ＩＤ番号：４２から６４を持っている。
【００５８】
図２はＨ、ＭおよびＨＭタンパク質の図的概要を示している。ポリエピトープタンパク質の図的表現でのバーパターンは配列の起点を示している（表１および２参照）。個々のエピトープおよびそれらのＭＨＣ制限はタンパク質の上および下に示されている。ｐｂはＰ．ベルゲイタンパク質から誘導されたただ一つのエピトープである。Ｍタンパク質中のすべての他のエピトープは熱帯熱マラリア原虫のタンパク質に起源するものである：ｃｓ−スポロゾイト周囲タンパク質、ｓｔ−ＳＴＡＲＰ、ｌｓ−ＬＳＡ−１およびｔｒ−ＴＲＡＰ。結核菌のＢＣＧ−３８ｋＤａタンパク質；ＴＴ−破傷風毒素。
【００５９】
抗腫瘍ワクチンのため、マラリアおよびＨＩＶエピトープ列に類似した、ＣＴＬエピトープを含んでいるエピトープ列を発生させた。この腫瘍エピトープ列においては報告されたマウスＣＴＬエピトープがお互いに融合され：ＭＬＰＹＬＧＷＬＶＦ−ＡＱＨＰＮＡＥＬＬ−ＫＨＹＬＦＲＮＬ−ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ−ＩＰＮＰＬＬＧＬＤ［配列ＩＤ番号：６５］のアミノ酸配列を持つ腫瘍エピトープ列が作製された。ここに示されたＣＴＬエピトープはお互いに融合された。翻訳を開始させるために最初のアミノ酸メチオニンが導入された。
【００６０】
Ｔｙウイルス様粒子（ＶＬＰ）
カセットＣＡＢＤＨを含んでいるエピトープ列はＣ末端をＴｙＡタンパク質読み枠内融合するように酵母発現ベクター内へ導入された。ＴｙＡまたはＴｙＡ融合タンパク質が酵母内でこのベクターから発現された場合、タンパク質は自発的にウイルス様粒子を形成し、それはショ糖濃度勾配遠心分離により酵母の細胞質から分離できる。組換えＴｙ−ＶＬＰはこの方法で調製され、注射前にショ糖を除去するためにＰＢＳに対して透析された（Ｌａｙｔｏｎら１９９６参照）。
【００６１】
アデノウイルス
Ｅ１遺伝子の欠損した複製欠陥組換えアデノウイルスが本研究で使用された（ＭｃＧｒｏｒｙら１９８８）。アデノウイルスはＣＭＶ ＩＥプロモーター調節下で大膳菌β−ガラクトシダーゼを発現した。免疫化のためには、１０7ｐｆｕのウイルスが耳垂内に皮内で投与された。
【００６２】
ペプチド
ペブチドはＲｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（ＵＳＡ）から購入され、１０ｍｇ／ｍｌでＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）に溶解され、さらにＰＢＳで１ｍｇ／ｍｌに希釈された。実験に使用されたＣＴＬエピトープを含んでいるペプチドは表３に記載されている。
【００６３】
【表３】
【００６４】
表３中のアミノ酸はそれらが出てくる順序に配列ＩＤ番号：６６から７３を持っている。
【００６５】
プラスミドＤＮＡ構築物
多数の異なったベクターがＤＮＡワクチンを構築するために使用された。プラスミドｐＴＨは抗原コード配列およびウシ成長ホルモン転写終止配列の導入を可能にするため、ポリリンカーが続いたイントロンＡを持つＣＭＶ ＩＥプロモーターを含んでいる。本プラスミドはアンピシリン耐性遺伝子を運んでおり、大腸菌内では複製できるが哺乳動物細胞では複製できない。これは以下の抗原の各々を発現するＤＮＡワクチンを製作するために使用された：Ｐ．ブルゲイＴＲＡＰ、Ｐ．ブルゲイＣＳ、熱帯熱マラリア原虫ＴＲＡＰ、熱帯熱マラリア原虫ＬＳＡ−１（Ｃ末端の２７８アミノ酸のみ）、カセットＣＡＢＤＨを含んでいるエピトープ列、およびＨＭエピトープ列（ＨＩＶエピトープにカセットＣＡＢが続いたもの）。プラスミドｐＳＧ２は抗生物質耐性遺伝子を除いてｐＴＨと同じである。
【００６６】
ｐＳＧ２においてはｐＴＨのアンピシリン耐性電子はカナマイシン耐性遺伝子に置き換えられている。ｐＳＧ２は以下の抗原を発現するＤＮＡワクチンを製作するために使用された：Ｐ．ブルゲイＰｂＣＳＰ、マウス腫瘍エピトープ列、カセットＣＡＢＤＨおよびＨＭエピトープ列を含んでいるエピトープ列。プラスミドＶＩＪ−ＮＰはＣＭＶ ＩＥプロモーター制御下でインフルエンザ核タンパク質を発現する。プラスミドＣＭＶ−ＴＲＡＰおよびＣＭＶ−ＬＳＡ−１はｐＴＨ．ＴＲＡＰおよびｐＴＨ．ＬＳＡ−１に似ているが、ＣＭＶプロモーターのイントロンＡを含んでいない。プラスミドＲＳＶ．ＴＲＡＰおよびＲＳＶ．ＬＳＡ−１はＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０転写終止配列を含んでおり、テトラサイクリン耐性である。β−ガラクトシダーゼ特異的ＣＴＬ導入のため、プラスミドｐｃＤＮＡ３／Ｈｉｓ／ＬａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が使用された。すべてのＤＮＡワクチンはＱｉａｇｅｎプラスミド精製カラムを用いて大腸菌株ＤＨ５αから製造された。
【００６７】
組換えワクシニアウイルスの発生
組換えＭＶＡは最初に抗原配列をプラスミドｐＳＣ１１のようなウイルスプロモーターを持つシャトルベクター内へクローニングすることにより作製された（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら１９８５；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら１９８９）。Ｐ．ベルゲイＣＳおよび熱帯熱マラリア原虫ＴＲＡＰ、インフルエンザ核タンパク質およびＨＭおよびマウス腫瘍エピトープポリエピトープ列はＰ７．５プロモーター（Ｍａｃｋｅｔｔら１９８４）を用いて発現され、およびＰ．ベルゲイＴＲＡＰは強力合成プロモーター（ＳＳＰ；Ｃａｒｒｏｌｌら１９９５）を用いて発現された。次に、プロモーター、抗原コード配列およびマーカー遺伝子に隣接するウイルス配列をＭＶＡと組換えして組換え体が生成するように、シャトルベクターｐＳＣ１１またはｐＭＣＯ３が野生型ＭＶＡで感染させた細胞の形質転換に使用された。組換えウイルスはマーカー遺伝子（βグルクロニダーゼまたはβガラクトシダーゼ）を発現するので組換えウイルスを含んでいるプラークの同定が可能である。組換え体は免疫化に使用する前に繰り返してプラーク精製された。組換えＮＹＶＡＣ−ＰｂＣＳＰワクシニアは以前に報告されている（Ｌａｎａｒら１９９６）。ＰｂＣＳＰをコードしている組換えワクシニアの野生型またはウェスタンリザーブ（ＷＲ）株は以前に報告されている（Ｓａｔｃｈｉｄａｎａｎｄａｍら１９９１）。
【００６８】
細胞および培養培地
マウス細胞およびエプスタイン−ーバールウイルス形質転換チンパンジーおよびマカクＢ細胞（ＢＣＬ）は１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補給したＲＰＭＩで培養した。脾細胞は１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μＭ ２−メルカプトエタノールおよび１０ｍＭヘペスｐＨ７．２（Ｇｉｂｃｏ，ＵＫ）を加えたＭＥＭ培地中、示されたペプチド（最終濃度１μｇ／ｍｌ）で再刺激された。
【００６９】
動物
示された系統のマウス、６−８週齢はＨａｒｌａｎ Ｏｌａｃ（Ｓｈａｗｓ Ｆａｒｍ，Ｂｌａｃｋｔｈｏｒｎ，ＵＫ）から購入された。チンパンジーＨ１およびＨ２はＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｒｉｊｓｗｉｃｋ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓで研究された。マカクはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｘｆｏｒｄで研究された。
【００７０】
免疫化
マウスのプラスミドＤＮＡ免疫化は麻酔下、頸骨筋内へのＤＮＡの筋肉内免疫化により実施された。マウス筋肉は時によりＤａｖｉｓら（１９９３）により記載されているように免疫化の５−９日前に５０μｌの１ｍＭカルジオトキシン（Ｌａｔｏｘａｎ，Ｆｒａｎｃｅ）で前処理されたが、そのような前処置は免疫原性または保護効能には何の有意な影響も与えなかったことが観察された。マウスのＭＶＡ免疫化は筋肉内（ｉ．ｍ．）、静脈内（外側尾静脈内）（ｉ．ｖ．）、皮内（ｉ．ｄ．）腹腔内（ｉ．ｐ．）または皮下（ｓ．ｃ．）免疫化により実施された。チンパンジーＨ１およびＨ２のプラスミドＤＮＡおよびＭＶＡ免疫化は麻酔下で脚筋肉の筋肉内免疫化により実施された。これらのチンパンジー免疫化には、アジュバントとして１５マイクログラムのヒトＧＭ−ＣＳＦがプラスミドＤＮＡと同時に投与された。チンパンジーへの組換えＭＶＡ投与は獣医監督下での筋肉内免疫化によるものであった。組換えヒトＧＭ−ＣＳＦはＳａｎｄｏｚ（Ｃａｍｂｅｒｌｅｙ，ＵＫ）から購入された。遺伝子銃を用いるプラスミドＤＮＡ免疫化のため、ＤＮＡは金粒子上に沈殿させた。皮内送達のためには、二つの異なった型の遺伝子銃が使用された、ＡｃｅｌｌおよびＯｘｆｏｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ装置（ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）。
【００７１】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
ＣＤ８＋ Ｔ細胞は示されたペプチドエピトープおよびＭｉｙａｈａｒａら（１９９３）により記載されているようなＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いてインビトロ再刺激なしで免疫化マウスの脾臓で定量された。簡単に説明すると、９６−ウェルニトロセルロースプレート（Ｍｉｌｉｓｃｒｅｅｎ ＭＡＨＡ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ ＵＫ）を１５μｇ／ｍｌの抗マウスインターフェロン−γモノクローナル抗体Ｒ４（ＥＡＣＣ）のリン酸緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）５０μｌで被覆した。４℃で一夜インキュベーションした後、ウェルを一度ＰＢＳで洗い、１０％ＦＣＳを含む１００μｌのＲＰＭＩを用いて室温で１時間ブロックした。免疫化したマウスからの脾細胞は１ｘ１０7細胞／ｍｌで再懸濁し、二重に抗体被覆ウェルへ加え、連続的に希釈した。ペプチドは１μｇ／ｍｌの最終濃度で各々のウェルへ加えられた。ペプチドを加えない追加のウェルはインターフェロン−γ分泌のペプチド依存性のための対照として使用された。５％ＣＯ2中、３７℃で１２−１８時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳおよび水で６回洗浄した。ウェルは次に１μｇ／ｍｌのビオチニル化抗マウスインターフェロン−γモノクローナル抗体ＸＭＧ１．２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）ＰＢＳ溶液と、室温で３時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、１μｇ／ｍｌのストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼポリマー（Ｓｉｇｍａ）溶液５０μｌを室温で２時間加えた。５０μｌのアルカリ性ホスファターゼ結合体基質溶液（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を加えることによりスポットが現れた。スポット出現後、水で洗うことにより反応を停止させた。スポットの数が立体顕微鏡の助けを借りて決定された。
【００７２】
チンパンジー末梢血リンパ球のＥＬＩＳＰＯＴアッセイはヒトＣＤ８ Ｔ細胞を検出するために開発されたアッセイおよび試薬（Ｍａｂｔｅｃｈ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ）を用いる非常に類似した方法を使用して実施された。
【００７３】
ＣＴＬアッセイ
ＣＴＬアッセイはＡｌｌｓｏｐｐら（１９９６）により記載されているように、クロム標識標的細胞およびエフェクター細胞として培養マウス脾臓細胞を使用して実施された。チンパンジーまたはマカク細胞を用いるＣＴＬアッセイは、標的細胞としてＥＢＶ−形質転換自己由来チンパンジーまたはマカクＢ細胞株を使用し、Ｈｉｌｌら（１９９２）によりヒトＣＴＬの検出で記載されているように実施された。
【００７４】
Ｐ．ベルゲイ攻撃誘発
マウスは記載されているように（Ｌａｎａｒら１９９６）２００μｌのＲＰＭＩに含まれる２０００（ＢＡＬＢ／ｃ）または２００（Ｃ５７ＢＬ／６）のＰ．ベルゲイＡＮＫＡ株スポロゾイトの静脈内接種により攻撃誘発させた。これらのスポロゾイトは感染マウスへ給餌後、２０−２５日間１８℃に維持されたアノフェレス ステフェンシ蚊の唾液腺から切開された。血液期マラリア感染（免疫化の失敗を示している）は、攻撃誘発の５−１２日後に採られたギームザ染色血液塗抹標本中のＰ．ベルゲイの環形出現を観察することにより検出された。
【００７５】
熱帯熱マラリア原虫攻撃誘発
チンパンジーは２０，０００のアノフェレス ガンビエ蚊の唾液腺から切開されたＮＦ５４株熱帯熱マラリア原虫スポロゾイトの麻酔下での静脈内接種により攻撃誘発させた。これらのチンパンジーからの血液試料は、末梢血中の低レベルの熱帯熱マラリア原虫寄生虫の出現を検出するために攻撃誘発の５日後から毎日、顕微鏡および寄生虫培養により試験された。
【００７６】
Ｐ８１５腫瘍攻撃誘発
マウスは２００μｌのＰＢＳに含まれる１ｘ１０5Ｐ８１５細胞の静脈内接種により攻撃誘発させた。動物は生存率がモニターされた。
【００７７】
インフルエンザウイルス攻撃誘発
マウスはインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４の１００ヘマグルチニン化単位（ＨＡ）の静脈内接種により攻撃誘発させた。攻撃誘発後、動物は毎日秤量され、生存率がモニターされた。
【００７８】
四量体を用いたペプチド特異性ＣＴＬの決定
Ｍａｍｕ−Ａ*０１−重鎖およびβ2−ミクログロブリンから成る四量体複合体はＯｇｇら（１９９８）により記載されているように作製された。リーダーを持たないＭａｍｕ−Ａ*０１ ＭＨＣクラスＩ重鎖の細胞外部分は５’プライマーＭａｍｕＮｄｅｌ：５’−ＣＣＴ ＧＡＣ ＴＣＡ ＧＡＣ ＣＡＴ ＡＴＧ ＧＧＣ ＴＣＴ ＣＡＣ ＴＣＣ ＡＴＧ［配列ＩＤ番号：７４］および３’プライマー：５’−ＧＴＧ ＡＴＡ ＡＧＣ ＴＴＡ ＡＣＧ ＡＴＧ ＡＴＴ ＣＣＡ ＣＡＣ ＣＡＴ ＴＴＴ ＣＴＧ ＴＧＣ ＡＴＣ ＣＡＧ ＡＡＴ ＡＴＧ ＡＴＧ ＣＡＧ ＧＧＡ ＴＣＣ ＣＴＣ ＣＣＡ ＴＣＴ ＣＡＧ ＧＧＴ ＧＡＧ ＧＧＧ Ｃ［配列ＩＤ番号：７５］を用いてｃＤＮＡからＰＣＲ−増幅された。前者のプライマーはＮｄｅＩ制限部位を含み、後者はＨｉｎｄIII部位を含んでおり、ビオチニル化酵素ＢｉｒＡ基質ペプチドをコードしている。ＰＣＲ生成物はＮｄｅＩおよびＨｉｎｄIIIで切断され細菌発現ベクターｐＧＭＴ７ポリリンカーの同じ部位へ結合された。リーダーを持たないβ2−ミクログロブリンをコードしているアカゲザル遺伝子はプライマーＢ２ＭＢＡＣＫ：５’−ＴＣＡ ＧＡＣ ＣＡＴ ＡＴＧ ＴＣＴ ＣＧＣ ＴＣＣ ＧＴＧ ＧＣＣ ［配列ＩＤ番号：７６］およびＢ２ＭＦＯＲ：５’−ＴＣＡ ＧＡＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＴＡ ＣＡＴ ＧＴＣ ＴＣＧ ＡＴＣ ＣＣＡ Ｃ［配列ＩＤ番号：７７］を用いてｃＤＮＡからＰＣＲ−増幅され、同様ｐＧＭＴ７のＮｄｅＩおよびＨｉｎｄIII部位にクローン化された。両方の鎖とも大月易菌株ＢＬ−２１で発現され、封入体から精製され、ペプチドＣＴＰＹＤＩＮＱＭ［配列ＩＤ番号：５４］の存在下で再び折り畳まれ、ＢｉｒＡ酵素（Ａｖｉｄｉｔｙ）を用いてビオチニル化され、およびＦＰＬＣおよびｍｏｎｏＱイオン交換カラムで精製された。ビオチニル化され、再び折り畳まれたＭＨＣ−ペプチド複合体の量は、単量体複合体がコンホメーション感受性モノクローナル抗体Ｗ６／３２により最初に捕捉され、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）−結合ストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ）、続いてのＡＰの比色基質により検出されるＥＬＩＳＡアッセイにより見積もられた。四量体複合体の形成はフィコエリスリン（ＰＥ）−結合ストレプトアビジン（ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ；Ｓｉｇｍａ）を再折り畳まれ、ビオチニル化された単量体へ４：１のＭＨＣ−ペプチド：ＰＥ−ストレプトアビジンモル比で加えることにより誘導された。複合体は暗所で４℃にて保存された。これらの四量体は免疫したマカクの末梢血リンパ球（ＰＢＬ）中のＭａｍｕ−Ａ*０１／ｇａｇ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度を分析するために使用された。
【００７９】
実施例２
マウスにおける免疫原性研究
プラスモジウム ベルゲイおよびプラスモジウム ヨエリイのスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質中のエピトープに対するＣＴＬ誘導の以前の研究は異なった送達系による種々のレベルのＣＴＬ誘導を示している。プラスミドＤＮＡ（Ｓｅｄｅｇａｈら１９９４）、複製するワクシニアウイルスで追加刺激されたインフルエンザウイルス（Ｌｉら１９９１）、アデノウイルス（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら１９９７）および粒子送達系（Ｓｃｈｏｄｅｌら１９９４）で部分保護が報告されている。５０マイクログラムのＣＳタンパク質をコードしているプラスミドによる筋肉内でのマウス免疫化は、１回注射後にこれらのマウスの脾臓中に中程度のＣＤ８＋細胞およびＣＴＬ活性を生み出した（図３、４）。
【００８０】
比較のため、ＢＡＬＢ／ｃマウスの群（ｎ＝５）に、異なった株（ＷＲ、ＮＹＶＡＣおよびＭＶＡ、すべてＰ．ベルゲイＣＳＰを発現する）の組換えワクシニアウイルスが１０6ｆｆｕ／ｐｆｕで静脈内に注射された。ペプチド特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度が１０日後にＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定された。ＭＶＡ．ＰｂＣＳＰは百万脾臓細胞当たり１８１＋／−４８、ＮＹＶＡＣ２２１＋／−２７およびＷＲ９４＋／−１９（平均＋／−標準偏差）のペプチド特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を誘導した。これらの結果は驚くべきことに複製欠陥ワクシニアウイルスはＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の初回刺激において複製する株より優れていることを示している。次に、初回刺激で誘導されたこれら中程度のＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の追加刺激が同種のまたは異種のベクターを用いてプラスミドＤＮＡまたはＭＶＡで試みられた。低レベルのＣＤ８＋ Ｔ細胞が、ＣＳ組換えＤＮＡワクチン単独、組換えＭＶＡワクチン単独または組換えＭＶＡ続いての組換えＤＮＡによる２回の免疫化で観察された（図３）。非常に高レベルのＣＤ８＋ Ｔ細胞が、ＤＮＡ初回刺激免疫応答を組換えＭＶＡで追加刺激することにより観察された。群当たり１０匹のマウスを使用した第二に実験においてＤＮＡ／ＭＶＡ連鎖における促進された免疫原性が確認された：ＤＮＡ／ＭＶＡ ８５６＋／−２０１；ＭＶＡ／ＤＮＡ １６８＋／−７２；ＭＶＡ／ＭＶＡ ３４５＋／−９０；ＤＮＡ／ＤＮＡ ９２＋／−４６。それ故、ＣＳタンパク質をコードしている組換えプラスミドによる第一の免疫化および組換えＭＶＡウイルスによる第二の免疫化の連鎖により、免疫化後に最も高いレベルのＣＤ８＋ Ｔリンパ球応答が得られた。
【００８１】
図３は異なった免疫化法後のマラリアＣＤ８ Ｔ細胞ＥＬＩＳＰＯＴデータを示している。結果は百万脾臓細胞当たりのペプチド特異的Ｔ細胞の数として示されている。マウスは２週間隔で、Ｘ軸に示されているようなＰｂＣＳＰ−ＭＶＡウイルスかまたはＰｂＣＳＰ−ＭＶＡウイルスまたはこれらの二つの組み合わせで免疫され、最後の免疫化２週間後にｐｂ９マラリアエピトープに特異的な脾臓細胞の数がアッセイされた。各々の点は個々のマウスで測定されたスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数を示している。最も高いＣＤ８＋ Ｔ細胞レベルはプラスミドＤＮＡで初回刺激し、組換えＭＶＡウイルスで追加刺激することにより誘導された。これは逆の順序での免疫化（ＭＶＡ／ＤＮＡ）、２回のＤＮＡ免疫化（ＤＮＡ／ＤＮＡ）または２回のＭＶＡ免疫化（ＭＶＡ／ＭＶＡ）よりも免疫原性であった。それはまたＤＮＡおよびＭＶＡ免疫化が同時に行われたよりも（ＤＮＡ＋ＭＶＡ ２ｗ）、１回のＤＮＡ免疫化（ＤＮＡ ４ｗ）またはより早いまたはより遅い時間点での１回のＭＶＡ免疫化（ＭＶＡ ２ｗおよびＭＶＡ ４ｗ）よりも免疫原性であった。
【００８２】
図４は同じ抗原をコードしているプラスミドＤＮＡによる初回刺激に続いての組換えＭＶＡ免疫化により、マラリアＣＤ８ Ｔ細胞ＥＬＩＳＰＯＴおよびＣＴＬレベルが大いに追加刺激されることを示している。ＡおよびＣ。Ｐ．ベルゲイＣＳＰからのＫd制限ペプチドＳＹＩＰＳＡＥＫＩ［配列ＩＤ番号：６７］および大腸菌β−ガラクトシダーゼからのＬd制限ペプチドＴＰＨＰＡＲＩＧＬ［配列ＩＤ番号：６９］と１８時間インキュベートした新しい脾臓細胞でのγ−インターフェロンＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用してＢＡＬＢ／ｃマウスでＣＤ８＋ Ｔ細胞応答が測定された。ＥＬＩＳＰＯＴ計測数は対数スケールで表されていることに注意されたい。ＢおよびＤ。同じマウスからの脾臓細胞が、同じペプチド（１μｇ／ｍｌ）でのインビトロ再刺激６日後に、１００：１のエフェクター：標的比で通常の51Ｃｒ−放出アッセイによってもアッセイされた。
【００８３】
マウスはＰ．ベルゲイＣＳＰおよびＴＲＡＰ、ＰｂＣＳＰ単独、Ｐ．ベルゲイＣＴＬエピトープを含んでいるマラリアエピトープカセット（ｐＴＨ．Ｈで標識されている）、またはβ−ガラクトシダーゼを発現しているプラスミドＤＮＡで免疫された。１回のＤＮＡ免疫化２３日後のマウスで測定されたＥＬＩＳＰＯＴおよびＣＴＬレベルが各々ＡおよびＢに示されている。同じアッセイが初回刺激２週間後に同じ抗原を発現する１ｘ１０7ｆｆｕの組換えＭＶＡをさらに受けた動物で実施された。これらの動物におけるＥＬＩＳＰＯＴおよびＣＴＬレベルは各々ＣおよびＤに示されている。各々の棒は個々の動物からのデータを示している。
【００８４】
ＨＩＶおよびマラリアエピトープの両方を縦列に含むエピトープ列ＨＭの免疫原性の研究もまた着手された。このエピトープ列を用いてもまた再び、ＤＮＡワクチンによる免疫化に続いての組換えＭＶＡワクチンでの免疫化の場合に最も高いＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＣＴＬレベルが脾臓で発生した（表４、図５）。
【００８５】
【表４】
【００８６】
表４は示されたようなプラスミドＤＮＡおよびＭＶＡの異なった免疫化法後のＨＩＶおよびマラリアエピトープに特異的なＣＤ８＋ Ｔ細胞のレベルを測定するために実施されたＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示している。数字は百万脾臓細胞当たりのスポット形成細胞である。ＨＭエピトープ列は図２に示されている。すべての場合にＢＡＬＢ／ｃマウスが使用された。マラリアエピトープは図２および３のようなｐｂ９であった。ＨＩＶエピトープはＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩ［配列ＩＤ番号：５１］であった。免疫化用量は５０μｇのプラスミドＤＮＡまたは１０7フォーカス形成単位の組換えＭＶＡであった。すべての免疫化は筋肉内であった。免疫化１および２の間隔はすべての場合、１４−２１日であった。
【００８７】
図５はプラスミドＤＮＡおよび組換えＭＶＡを用いる種々の免疫化法により、マラリアおよびＨＩＶエピトープに対してＢＡＬＢ／ｃマウスで誘導されたＣＴＬ応答を示している。マウスは表３の注および方法で説明されているように筋肉内で免疫された。高レベルのＣＴＬ（２５：１のエフェクター／標的比で＞３０％の特異的溶解）がプラスミドＤＮＡで初回刺激しおよび組換えＭＶＡで追加刺激した後にのみマラリアおよびＨＩＶエピトープに対して観察された。この実験に使用された抗原はＨＩＶ−マラリアエピトープ列である。組換えＭＶＡはＭＶＡ．ＨＡと表示されており、このエピトープ列を発現するプラスミドＤＮＡはｐＴＨ．ＨＭと表示されている。種々のエフェクター−標的比での特異的溶解レベルが示されている。これらは二つのペプチドｐｂ９およびＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩ［配列ＩＤ番号：５１］による脾臓細胞のインビトロ再刺激５日後に決定された。
【００８８】
ＣＴＬを誘導する多数の送達系の比較がＡｌｌｓｏｐｐら（１９９６）により報告されている。組換えＴｙ−ウイルス様粒子（Ｔｙ−ＶＬＰ）および脂質の尾を付けたマラリアペプチドの両方が良好なＣＴＬ誘導を示したが、Ｔｙ−ＶＬＰは良好なＣＴＬ誘導のために１回の免疫化しか必要としないことでより優れていた。しかしながら、本明細書に示されているようにＴｙ粒子の２回投与さえもスポロゾイト攻撃誘発に対して有意な保護を誘導しなかった（表７、ライン１）。
【００８９】
Ｐ．ベルゲイのスポロゾイト周囲タンパク質をコードしている組換え修飾ワクシニアアンカラウイルスによる免疫化も良好なＣＴＬレベルを発生した。しかしながら、Ｔｙ−ＶＬＰによる第一の免疫化続いてのＭＶＡ ＣＳワクチンによる第二の免疫化によりより高いレベルのＣＤ８＋ Ｔ細胞応答が達成された（表５）。
【００９０】
【表５】
【００９１】
表５ 示されたようなＴｙ−ＶＬＰおよび組換えＭＶＡウイルスの異なった免疫化法後の、マラリアエピトープｐｂ９に特異的なＣＤ８＋ Ｔ細胞レベルを測定するために実施されたＥＬＩＳＰＯＴおよびＣＴＬアッセイの結果。ＣＴＬおよびＥＬＩＳＰＯＴのデータは異なった実験からのものである。ＥＬＩＳＰＯＴレベル（百万脾臓細胞当たりのスポット）は再刺激されない細胞で測定され、ＣＴＬ活性はインビトロでｐｂ９ペプチドにより再刺激された細胞における４０：１のエフェクター：標的比での特異的溶解として示されている。両方とも３匹のマウスでの平均レベルとして表されている。ＢＡＬＢ／ｃマウスがすべての場合に使用された。免疫化量は５０μｇのＴｙ−ＶＬＰまたは１０7ｆｆｕ（フォーカス形成単位）の組換えＭＶＡであった。すべての免疫化は筋肉内で行われた。免疫化１および２の間隔は１４−２１日であった。ＭＶＡ．ＨＭはカセットＣＡＢを含んでいる。
【００９２】
遺伝子銃によるＤＮＡ送達を用いる免疫応答の初回刺激および組換えＭＶＡを用いる追加刺激
免疫原性および攻撃誘発
組換えＭＶＡで追加刺激できる、皮内にプラスミドをＤＮＡ送達するための遺伝子銃の使用およびそれによる免疫応答の初回刺激が研究された。ＢＡＬＢ／ｃマウスは以下の投与法で免疫された：
Ｉ）２週間隔での３回のｐＴＨ．ＰｂＣＳＰ（免疫化当たり４ｍｇ）による遺伝子銃免疫化
II）２回の遺伝子銃免疫化に続く２週間後のＭＶＡｉ．ｖ．
III）１回の筋肉内ＤＮＡ免疫化に続く２週間後のＭＶＡｉ．ｖ．
三つの免疫化法の免疫原性はＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して分析された。
特異的Ｔ細胞の最も高い頻度は２回の遺伝子銃免疫化に続くＭＶＡｉ．ｖ．追加刺激および１回の筋肉内ＤＮＡ免疫化に続くＭＶＡｉ．ｖ．追加刺激で観察された（図６）。
【００９３】
図６は異なった免疫化法後のマラリアエピトープｐｂ９に対する特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞レベルを測定するために実施されたＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示している。ＢＡＬＢ／ｃマウスの群（ｎ＝３）は示されているように免疫された（ｇ．ｇ＝遺伝子銃）。すべての免疫化の時間間隔は１４日であった。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは最後の免疫化の２週間後に行われた。
【００９４】
異なったマウス系統における同一抗原に対するＣＴＬ誘導
二つのＣＴＬエピトープ（Ｐ．ベルゲイから誘導されたＳＹＩＰＳＡＥＫＩ［配列ＩＤ番号：６７］およびＨＩＶから誘導されたＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩ［配列ＩＤ番号：６８］）によるＢＡＬＢ／ｃマウスでの前記の追加刺激効果が普遍的な現象であるかどうかを追求するため、２組の実験が実施された。インフルエンザ核タンパク質に対するＣＴＬ応答は５つの近交マウス系で研究された。最初の実験において、インフルエンザ核タンパク質から誘導された公表されているマウスＣＴＬエピトープで研究された（表３参照）。三つの異なったＨ−２ハプロタイプ、ＢＡＬＢ／ｃおよびＤＢＡ／２（Ｈ−２d）、Ｃ５７ＢＬ／６および１２９（Ｈ−２d）；ＣＢＡ／Ｊ（Ｈ−２d）のマウスが使用された。動物の一つの組はインフルエンザ核タンパク質をコードしているプラスミドＶ１Ｊ−ＮＰを用いて２週間隔で２回免疫された。同一動物の別の組はＶ１Ｊ−ＮＰで初回刺激され、２週間後にインフルエンザウイルスＮＰを発現している１０6ｆｆｕのＭＶＡ．ＮＰを用いて静脈内で追加刺激された。個々のマウスのＣＴＬレベルはペプチド再刺激された脾臓細胞の51Ｃｒ放出アッセイで決定された。図７に示されているように、ＤＮＡ初回刺激／ＭＶＡ追加刺激免疫化法が分析されたすべてのマウス系においてより高いレベルの溶解を誘導し、２回のＤＮＡ注入よりも優れている。
【００９５】
図７は異なったマウス系統におけるインフルエンザＮＰに対するＣＴＬ応答を示している。異なった系統のマウスは２週離して２回インフルエンザ核タンパク質をコードしているＤＮＡワクチンＶ１Ｊ−ＮＰで免疫されるか（白丸）、または同じＤＮＡワクチンで初回刺激され、インフルエンザウイルス核タンパク質を発現している組換えＭＶＡで追加刺激された（黒丸）。最後の免疫化から２週間後、各々のペプチドを用いてインビトロで脾臓細胞が再刺激された（表３）。ＣＴＬ活性はＭＨＣクラスＩ−致標的細胞を用いる標準51Ｃｒ−放出アッセイで決定された。
【００９６】
異なったマウス系統における異なった抗原に対するＣＴＬ誘導
プラスミドＤＮＡ初回刺激免疫応答に対するＭＶＡ追加刺激効果はさらに異なった抗原および異なった近交マウス系を用いて研究された。異なった系統のマウスは２回のＤＮＡ免疫化を用いる異なった抗原で免疫され、ＤＮＡ／ＭＶＡ免疫化と比較された。使用された抗原は大腸菌β−ガラクトシダーゼ、マラリア／ＨＩＶエピトープ列、マウス腫瘍エピトープ列および熱帯熱マラリア原虫ＴＲＡＰであった。二つのＤＮＡ免疫化を比較すると、ＤＮＡ初回刺激／ＭＶＡ追加刺激法がすべての異なったマウス系および試験された抗原の組み合わせでより高いレベルのＣＴＬを誘導した（図８）。
【００９７】
図８は異なった近交マウス系で誘導された異なった抗原に対するＣＴＬ応答を示している。マウスは２週間離して２回ＤＮＡワクチン免疫化で免疫されるか（白丸）、またはＤＮＡワクチンで初回刺激され、２週間後に同一の抗原を発現している組換えＭＶＡで追加刺激された（黒丸）。系統および抗原は以下の通りである：ＡではＣ５７ＢＬ／６；熱帯熱マラリア原虫ＴＲＡＰ。ＢではＤＢＡ／２；大腸菌β−ガラクトシダーゼ。ＣではＢＡＬＢ／ｃ；マラリアペプチド（ｐｂ９）に対するＨＭエピトープ列ＣＴＬ活性。ＤではＤＢＡ／２；ｐｂ９に対するＨＭエピトープ列ＣＴＬ活性。ＥではＢＡＬＢ／ｃ；ＨＩＶペプチドに対するＨＭエピトープ列ＣＴＬ活性。ＦではＤＢＡ／２；ＨＩＶペプチドに対するＨＭエピトープ列ＣＴＬ活性。ＧではＢＡＬＢ／ｃ；ＰＩＡ由来ペプチドに対する腫瘍エピトープ列ＣＴＬ活性。ＨではＤＢＡ／２；ＰＩＡ由来ペプチドに対する腫瘍エピトープ列ＣＴＬ活性。ペプチドエピトープの配列は表３に示されている。各々の曲線は個々のマウスからのデータを示している。
【００９８】
スポロゾイトは効果的に免疫応答を初回刺激でき、それはＭＶＡにより追加刺激可能である
マラリアが風土病である地域に住んでいるヒトは連続的にスポロゾイト接種に曝されている。マラリア特異的ＣＴＬはこれらの自然に曝されている個体においては低レベルであることが観察されている。低レベルのスポロゾイト誘導ＣＴＬ応答がＭＶＡにより追加刺激できるかどうかという問題を扱うため、ＢＡＬＢ／ｃマウスを照射した（マラリア感染を防ぐため）Ｐ．ベルゲイスポロゾイトで免疫し、ＭＶＡで追加刺激した。最後の免疫化から２週間後、脾臓細胞を再刺激して溶解活性を試験した。５０または３００＋５００スポロゾイトによる２回の注射では非常に低レベルまたは検出できないレベルの溶解しか誘導されなかった。
【００９９】
ＭＶＡによる追加刺激は高レベルのペプチド特異的ＣＴＬを誘導した。ＭＶＡ単独では中程度の溶解レベルのみを誘導した（図９）。
図９はスポロゾイト初回刺激ＣＴＬ応答がＭＶＡにより有意に追加刺激されることを示している。マウスはＡにおいては照射されたスポロゾイトの２回の低用量（５０＋５０）で、Ｂにおいてはスポロゾイトの２回の高用量（３００＋５００）で免疫された；マウスはＤでは低用量のスポロゾイト初回刺激、Ｅでは高用量のスポロゾイト初回刺激に続いてＭＶＡ．ＰｂＣＳＰで追加刺激された。ＭＶＡ．ＰｂＣＳＰでの免疫化後のＣＴＬ応答はＣに示されている。
【０１００】
初回刺激薬物としての組換えアデノウイルス
初回刺激−追加刺激免疫化法が初回刺激薬物としてプラスミドＤＮＡおよび組換えＴｙ−ＶＬＰを使用して例示されてきた。ここでは初回刺激薬物として非複製アデノウイルスを用いる例が提供される。大腸菌β−ガラクトシダーゼを発現する複製欠陥組換えアデノウイルス（Ａｄｅｎｏ−ＧＡＬ）が使用された。ＢＡＬＢ／ｃマウス群はプラスミドＤＮＡに続いてＭＶＡでまたはアデノウイルスに続いてＭＶＡで免疫された。使用されたすべての抗原送達系は大腸菌β−ガラクトシダーゼをコードしていた。プラスミドＤＮＡまたはアデノウイルスによるＣＴＬ応答の初回刺激およびＭＶＡによる追加刺激は類似のレベルのＣＴＬを誘導した（図１０）。
【０１０１】
図１０はプラスミドＤＮＡまたはアデノウイルスによる初回刺激およびＭＶＡによる追加刺激によるＣＴＬ応答を示している。ＢＡＬＢ／ｃマウス群（ｎ＝３）はプラスミドＤＮＡ（Ａ）またはβ−ガラクトシダーゼを発現する組換えアデノウイルス（Ｂ）で初回刺激された。プラスミドＤＮＡは筋肉内に、ＭＶＡは静脈内におよびアデノウイルスは皮内に投与された。脾臓細胞は最後の免疫化から２週間後にペプチドＴＰＨＰＡＲＩＧＬ［配列ＩＤ番号：６９］で再刺激された。ＣＴＬ活性はペプチドでパルス刺激したＰ８１５細胞で試験された。
【０１０２】
ＤＮＡ初回刺激、ワクシニア追加刺激法の免疫原性は使用されたワクシニアウイルス株の複製適性に依存している
複製適性が違う異なった株はＤＮＡ初回刺激ＣＴＬ応答を追加刺激する能力が異なっているかどうかを決定するために、組換えワクシニアウイルスの異なった株を使用して初回刺激−追加刺激法が試験された。ＭＶＡおよびＮＹＶＡＣのような複製欠陥組換えワクシニアウイルスによる追加刺激は、同量の複製適性ＷＲワクシニアウイルスによる追加刺激後のＣＴＬ応答と比較してより強いＣＴＬ応答の誘導を起こした（図１１）。
【０１０３】
図１１はプラスミドＤＮＡによる初回刺激、続いての異なった組換えワクシニアウイルスによる追加刺激によるＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＴＬ応答を示している。動物はｐＴＨ．ＰｂＣＳＰ（５０μｇ／マウス、ｉ．ｍ．）で初回刺激され、２週間後、ＰｂＣＳＰを発現する異なった株のワクシニアウイルス（マウス当たり１０6ｐｆｕ、ｉ．ｖ．）で追加刺激された。異なった組換えワクシニアウイルス株は、ＡではＭＶＡ、ＢではＮＹＶＡＣおよびＣではＷＲであった。複製株に対する複製欠陥ワクシニア株の優越性はさらなる実験でも観察された。ＢＡＬＢ／ｃマウス群（ｎ＝６）は５０μｇ／動物のｐＳＧ２．ＰｂＣＳＰ（ｉ．ｍ．）で初回刺激され、１０日後にＰｂＣＳＰを発現する１０6ｆｆｕ／ｐｆｕの組換えＭＶＡ、ＮＹＶＡＣおよびＷＲによりｉ．ｖ．で追加刺激された。ペプチド特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度はＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して決定された。頻度は：ＭＶＡ １１０３＋／−４３８、ＮＹＶＡＣ ８２６＋／−２４９およびＷＲ ４６８＋／−１３５であった。従って、ＣＤ８ Ｔ細胞免疫原性の尺度としてＣＴＬアッセイおよびＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いると、複製適性株と比較して複製欠陥ワクシニア株では驚くほど大きな免疫原性が観察された。
【０１０４】
ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を追加刺激するための組換えカナリアまたはニワトリポックスウイルスの使用
組換えカナリアポックスウイルス（ｒＣＰＶ）またはニワトリポックスウイルス（ｒＦＰＶ）は以前に記載されているシャトルベクターを使用して作製された（ＴａｙｌｏｒらＶｉｒｏｌｏｇｙ １９９２，１８７：３２１−３２８およびＴａｙ１ｏｒらＶａｃｃｉｎｅ １９８８，６：５０４−５０８）。これらのシャトルベクターのための戦略は、ＣＰＶまたはＦＰＶゲノムから誘導された配列から成る二つの隣接領域間のワクシニア特異的プロモーターの後ろに問題とするタンパク質をコードしている遺伝子を挿入することである。これらの隣接領域は必須ウイルス遺伝子内への挿入を避けるように選択される。組換えＣＰＶまたはＦＰＶは許容トリ細胞株（即ち、初代ニワトリ胎児線維芽細胞）でのインビボ組換えにより発生させた。任意の抗原またはエピトープ列のタンパク質配列がニワトリポックスまたはカナリアポックスウイルスを用いて発現できる。組換えＣＰＶまたはＦＰＶは抗原特異的抗体を用いて、または組換え遺伝子内へ抗体エピトープを含ませ、問題とするタンパク質の発現で特徴付けられる。組換えウイルスは初代ＣＥＦで増殖させる。免疫応答は、材料および方法で説明したようなプラスミドＤＮＡを用いて初回刺激される。このプラスミドＤＮＡ初回刺激免疫応答は、静脈内に、皮内に、または筋肉内に接種された１０7ｆｆｕ／ｐｆｕのｒＣＰＶまたはｒＦＰＶにより追加刺激される。ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答がモニターされ、攻撃誘発は前記のように実施された。
【０１０５】
実施例３
マウスにおけるマラリア攻撃誘発の研究
ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の誘導レベルの保護的効能を評価するため、免疫化ＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７ＢＬ／６マウスを２０００または２００のＰ．ベルゲイスポロゾイトの静脈注射により攻撃誘発した。このことはスポロゾイトによる肝臓細胞の感染を導く。しかしながら、肝臓内寄生虫に対する十分に強いＴリンパ球応答の存在下では生きている寄生虫は肝臓を離れないであろうので、血液期寄生虫は観察されないであろう。攻撃誘発の５−１２日後、攻撃誘発したマウスからの血液薄層は顕微鏡により寄生虫が評価された。
【０１０６】
Ｐ．ベルゲイのＣＳタンパク質およびＴＲＡＰ抗原をコードしている二つのプラスミドＤＮＡの混合物で２回免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスは、スポロゾイト攻撃誘発に対して保護されなかった。同じ二つの抗原をコードしている組換えＭＶＡウイルスの混合物で２回免疫されたマウスはスポロゾイト攻撃誘発に対して保護されなかった。最初に二つの組換えＭＶＡでおよび次に二つの組換えプラスミドで免疫されたマウスもスポロゾイト攻撃誘発に対して保護されなかった。しかしながら、最初に二つのプラスミドＤＮＡで、次に二つの組換えＭＶＡウイルスで免疫化された１５匹のマウスすべてがスポロゾイト攻撃誘発に対して完全に耐性であった（表６ＡおよびＢ）。
【０１０７】
観察された保護がＣＳ抗原またはＴＲＡＰまたはその両方に対する免疫応答によるものであるかどうかを評価するため、マウスの群が各々の抗原で別々に免疫された（表６Ｂ）。最初にＣＳプラスミドＤＮＡで、続いてＣＳ ＭＶＡウイルスで免疫された１０匹のマウスすべてがスポロゾイト攻撃誘発に対して完全に保護された。従って、前記の免疫化法が用いられる場合ＣＳ抗原単独で完全に保護的であり、ＴＲＡＰ抗原は同じ方法で実質上保護的である。
【０１０８】
ＣＤ８＋ Ｔ細胞リンパ球応答誘導レベルと保護の程度の間の良好な相関は、ＣＤ８＋応答が観察された保護に関係していることを強く示唆している。以前に採用された送達実験において、Ｐ．ベルゲイＣＳタンパク質中の主ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープに対するＣＤ８＋ Ｔリンパ球クローンは、スポロゾイト攻撃誘発を保護できることが示されている。誘導された保護が、このエピトープに対するＣＤ８＋ Ｔ細胞により本当に仲介されるのかどうかを決定するために、エピトープ列の一部としてＰ．ベルゲイからのこの９個のアミノ酸配列のみをコードしているプラスミドＤＮＡおよび組換えＭＶＡが用いられた（表６Ｂ）。（すべての他のエピトープはＰ．ベルゲイ以外の微生物からのものである。）最初にそのようなエピトープ列、続いて同様にＰ．ベルゲイＣＴＬエピトープを持つエピトープ列をコードしている組換えＭＶＡで１０匹のマウスを免疫化すると、スポロゾイト攻撃誘発から完全に保護された（表６Ｂ）。それ故、誘導された保護免疫応答は、このナノマーペプチド配列を標的とするＣＴＬ応答に違いないであろう。
【０１０９】
【表６】
【０１１０】
表６ 示されたようなプラスミドＤＮＡおよびＭＶＡの異なった免疫化法を用いた二つの攻撃誘発実験（ＡおよびＢ）の結果。すべての場合にＢＡＬＢ／ｃマウスが使用された。免疫化用量は５０μｇのプラスミドＤＮＡまたは１０6ｆｆｕの組換えＭＶＡであった。免疫化１および２の間隔はすべての場合１４−２１日であった。攻撃誘発は最後の免疫化から１８−２９日後に２０００のＰ．ベルゲイスポロゾイトを用いるｉ．ｖ．注射により実施され、血液薄膜は攻撃誘発後５、８および１０日目に評価された。ＣＳＰおよびＴＲＡＰは全Ｐ．ベルゲイ抗原を示しており、”エピトープ”とは単一のＰ．ベルゲイＫd制限ナノマーＣＴＬエピトープのみを含んでいる表１に示されたエピトープのカセットを示している。実験Ｂにおいてエピトープ列のみでの免疫化で１００％保護が得られたことに注目されたい。
【０１１１】
ｐｂ９をコードしている組換えＴｙ−ＶＬＰで２回免疫されたマウスは感染に対して完全に感受性であった。同様に、完全ＣＳタンパク質をコードしている組換えＭＶＡで２回免疫されたマウスは感染に対して完全に感受性であった。しかしながら、一度Ｔｙ−ＶＬＰで、続いて組換えＭＶＡで一度免疫されたマウスは、完全長ＣＳタンパク質を発現するＭＶＡで追加刺激された場合は８５％の、ｐｂ９を含むＨＭエピトープ列を発現するＭＶＡが追加刺激に使用された場合は９５％のマラリア発病率の減少を示した。
【０１１２】
【表７】
【０１１３】
表７ 示されたようなＴｙ−ＶＬＰおよびＭＶＡの異なった免疫化法を用いた攻撃誘発実験の結果。すべての場合にＢＡＬＢ／ｃマウスが使用された。免疫化では５０μｇのプラスミドＤＮＡまたは１０6ｆｆｕの組換えＭＶＡが静脈内に投与された。免疫化１および２の間隔はすべての場合１４−２１日であった。攻撃誘発は最後の免疫化から１８−２９日後に２０００のＰ．ベルゲイスポロゾイトによるｉ．ｖ．注射により実施され、血液薄膜は攻撃誘発後５、８および１０日目に評価された。ＣＳＰは全Ｐ．ベルゲイ抗原を示している。Ｔｙ−ＶＬＰは表１に示したようなエピトープカセットＣＡＢＤＨまたはＣＡＢＤＨＦＥを運んでいる。ＭＶＡ．ＨＭはカセットＣＡＢを含んでいる。
【０１１４】
組換えＭＶＡで追加刺激されることにより観察された促進された免疫原性および保護効能がこの特定のワクシニアウイルス株に独特のものかまたは他の組換えワクシニアと共有されているのかどうかを決定するため、以下の実験が実施された。マウスはＰ．ベルゲイＣＳタンパク質をコードしているＤＮＡワクチンで免疫され、（ｉ）この抗原をコードしている組換えＭＶＡ；（ｉｉ）同一の抗原をコードしている組換え野生型ワクシニアウイルス（ウェスタン リザーブ株）（Ｓａｔｃｈｉｄａｎａｎｄａｍら１９９１）、または（ｉｉｉ）同一のマラリア抗原をコードしている組換えＮＹＶＡＣ（ＣＯＰＡＫ）ウイルス（Ｌａｎａｒら１９９６）で追加刺激された。最も高程度の保護はＭＶＡ組換え体による追加刺激で観察された、８０％（表８）。非常に低レベルの保護（１０％）が野生型組換えワクシニアウイルスで、有意なレベルの保護（６０％）がＮＹＶＡＣ組換え体による追加刺激で観察された。それ故、記載した初回刺激−追加刺激法は任意の非複製ワクシニアウイルス株で保護的効能を誘導する。ＭＶＡ組換え体およびＮＹＶＡＣの両方がＷＲ株組換え体よりも有意に（各々Ｐ＜０．０５）良好であった。
【０１１５】
【表８】
【０１１６】
表８ 示されたようなプラスミドＤＮＡおよび種々のワクシニアの組み合わせの異なった免疫化法を用いた攻撃誘発実験の結果。すべての場合にＢＡＬＢ／ｃマウスが使用された。免疫化用量は５０μｇのプラスミドＤＮＡまたは１０6ｆｆｕ／ｐｆｕの組換えＭＶＡまたは１０4ｆｆｕ／ｐｆｕの組換え野生型（ＷＲ）ヮクシニアまたは１０6ｆｆｕ／ｐｆｕの組換えＮＹＶＡＣであった。ＷＲ株は宿主中で複製するであろうが他の株は複製しないであろうので、この実験においてはより低用量のＷＲが使用された。免疫化１および２の間隔は２３日であった。攻撃誘発は最後の免疫化から２８日後に２０００のＰ．ベルゲイスポロゾイトを用いるｉ．ｖ．注射により実施され、血液薄膜は攻撃誘発後７、９および１１日目に評価された。ｐｂＣＳＰは全Ｐ．ベルゲイ抗原を、およびＮＰはインフルエンザウイルスの核タンパク質抗原（対照抗原として使用された）を示している。グループＡの最初の免疫化は、非マラリア抗原であるベータガラクトシダーゼを発現するプラスミドＤＮＡベクターであった。
【０１１７】
表８に示されたさらなる実験において、マウスはＰ．ベルゲイＣＳタンパク質をコードしているＤＮＡワクチンで免疫され、（ｉ）この抗原をコードしている組換えＭＶＡ；（ｉｉ）同一の抗原をコードしている組換えＷＲワクシニアウイルス、または（ｉｉｉ）同一のマラリア抗原をコードしている組換えＮＹＶＡＣ（ＣＯＰＡＫ）ウイルスで追加刺激された（すべて１０6ｆｆｕ／ｐｆｕ）。高いおよび満足すべき程度の保護が組換えＮＹＶＡＣ（８０％）または組換えＭＶＡ（６６％）による追加刺激で観察された。低いおよび満足できないレベルの保護（２６％）がＷＲ組換えワクシニアウイルスによる追加刺激で観察された（表９）。ＭＶＡおよびＮＹＶＡＣ追加刺激は各々ＷＲ追加刺激より有意に高い保護を与えた（各々Ｐ＝０．０３およびＰ＝０．０１）。これらのデータは非複製ポックスウイルス株は高レベルの保護を誘導するためのより良好な追加刺激剤であることを再び強調している。
【０１１８】
【表９】
【０１１９】
表９ プラスミドＤＮＡおよび追加刺激免疫剤としての複製欠陥ワクシニア組換え体の異なった免疫化法を使用する攻撃誘発実験の結果。すべての場合にＢＡＬＢ／ｃマウスが使用された。免疫化用量は５０μｇのプラスミドＤＮＡまたは１０6ｆｆｕ／ｐｆｕの組換えＭＶＡまたは組換え野生型（ＷＲ）ワクシニアまたは組換えＮＹＶＡＣであった。免疫化１および２の間隔は２３日であった。攻撃誘発は最後の免疫化から２８日後に２０００のＰ．ベルゲイスポロゾイトを用いるｉ．ｖ．注射により実施され、血液薄膜は攻撃誘発後７、９および１１日目に評価された。ｐｂＣＳＰは全Ｐ．ベルゲイ抗原を、およびＮＰはインフルエンザウイルスの核タンパク質抗原（対照抗原として使用された）を示している。対照免疫化はβ−ガラクトシダーゼを発現するプラスミドＤＮＡベクター、続いてＭＶＡ．ＮＰによるものであった。
【０１２０】
組換えＭＶＡによる免疫応答追加刺激のための別の経路
組換えＭＶＡの静脈内注射はヒト免疫化には好適な経路ではなく、大量免疫化には実現不可能である。それ故、ＭＶＡ追加刺激の異なった経路での免疫原性および保護効能が試験された。マウスはプラスミドＤＮＡによりｉ．ｍ．で初回刺激された。２週間後、それらは以下の経路で投与されたＭＶＡで追加刺激された：静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）および皮内（ｉ．ｄ．）。この追加刺激２週間後、ペプチド特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞はＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより決定された。最も高いレベルを誘導した最も有効な経路はＭＶＡのｉ．ｖ．およびｉ．ｄ．接種であった。他の経路は中程度から弱い応答しか与えなかった（図１２）。
【０１２１】
図１２は異なった経路でＭＶＡを追加刺激した後のペプチド特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度を示している。結果は百万脾臓細胞当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数として示されている。マウスはプラスミドＤＮＡで初回刺激され、２週間後にＭＶＡを用いて示された経路で追加刺激された。ＳＹＩＰＳＡＥＫＩ［配列ＩＤ番号：６７］ペプチドに特異的な脾臓細胞の数が最後に免疫して２週間後にＩＮＦ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより決定された。各々の棒は個々にアッセイされた３匹のマウスからのＳＦＣの平均の数を表している。
【０１２２】
攻撃誘発実験においてｉ．ｖ．経路の追加刺激がｉ．ｄ．およびｉ．ｍ．経路と比較された。ｉ．ｄ．経路が高レベルの保護（８０％保護）を与えた。ｉ．ｍ．経路で追加刺激された動物の群では、５０％の動物が保護された。完全な保護はｉ．ｖ．で投与されたＭＶＡ追加刺激で達成された（表１０）。
【０１２３】
【表１０】
【０１２４】
表１０ 異なった経路のＭＶＡ追加刺激免疫化を用いた攻撃誘発実験の結果。
動物は筋肉内プラスミドＤＮＡ注射により初回刺激され、２週間後、示された組換えＭＶＡ（１０6ｆｆｕ／マウス）が示された経路により投与された。マウスは最後の免疫化から１６日後に２０００のＰ．ベルゲイスポロゾイトで攻撃誘発し、攻撃誘発の８および１０日後に血液期寄生虫血症がスクリーニングされた。エピトープはポリペプチド列ＨＭを示している。
【０１２５】
ＤＮＡ初回刺激の別経路：ペプチド特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を初回刺激するための遺伝子銃の使用
遺伝子銃送達は例えばＥｉｓｅｎｂｒａｕｎら ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９３，１２：７９１−７９７およびＤｅｇａｎｏら Ｖａｃｃｉｎｅ １９９８，１６：３９４−３９８に詳細に記載されている。
【０１２６】
免疫応答を初回刺激するためにプラスミドＤＮＡを使用するこれまで説明されてきたマウスマラリア攻撃誘発実験はプラスミドＤＮＡの筋肉内注射を使用した。バイオリスティック装置を使用するプラスミドＤＮＡの皮内送達は、特異的ＣＴＬ応答を初回刺激する別の経路である。プラスミドＤＮＡで金粒子を被覆し、遺伝子銃により皮内に送達された。マウス群（ｎ＝１０）は２週間間隔で３回、遺伝子銃のみで免疫化するか（４μｇ／免疫化）、遺伝子銃で２回、続いて静脈内ＭＶＡ．ＰｂＣＳＰ追加刺激により免疫するか、または５０μｇのｐＴＨ．ＰｂＣＳＰを用いて筋肉内で免疫されて２週間後にＭＶＡ．ＰｂＣＳＰが静脈内で追加刺激された。最後に免疫化して２週間後に、動物を２０００のスポロゾイトで攻撃誘発し、各々の免疫化法の保護効能を評価した。２回の遺伝子銃免疫化に続いて静脈内ＭＶＡ追加刺激を受けた群において、１０匹の動物のうち１匹が血液期寄生虫血症を発症した（９０％保護）。筋肉内ＤＮＡ追加刺激に続くＭＶＡｉ．ｖ．追加刺激により完全な保護が観察された。遺伝子銃により３回免疫された１０匹の動物のうち３匹が感染された（３０％保護）（表１１）。
【０１２７】
【表１１】
【０１２８】
表１１ ＤＮＡ初回刺激の異なった経路（遺伝子銃による皮内と筋肉内針注射）を比較している攻撃誘発実験の結果。ＢＡＬＢ／ｃマウス群（ｎ＝１０）は示されたように免疫された。各々の遺伝子銃免疫化は４μｇのプラスミドＤＮＡを表皮内へ送達した。ｉ．ｍ．免疫化では５０μｇのプラスミドＤＮＡが注射された。最後の免疫化から２０日後、マウスを前記のように攻撃誘発した。
【０１２９】
高感受性Ｃ５７ＢＬ／６マウスは保護される
Ｃ５７ＢＬ／６マウスはＰ．ベルゲイスポロゾイト攻撃誘発に対して非常に感受性である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは前赤血球抗原ＰｂＣＳＰおよびＰｂＴＲＡＰの両方によるＤＮＡ−ＭＶＡ初回刺激−追加刺激法を用いて免疫化され、マウス当たり２００または１０００の感染性スポロゾイトで攻撃誘発した（２００はこの系統での感染を誘導するために必要とされる量の２倍以上に相当する）。２００のスポロゾイトで攻撃誘発された１０匹のマウスすべてが滅菌免疫性を示した。１０００のスポロゾイトで攻撃誘発された群でさえも、６０％のマウスが保護された（表１２）。天然のままのＣ５７ＢＬ／６マウスはすべてスポロゾイト攻撃誘発で感染された。
【０１３０】
【表１２】
【０１３１】
表１２ Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用した攻撃誘発実験の結果。動物はＤＮＡに続いたＭＶＡ初回刺激−追加刺激法を用いてＰｂＣＳＰおよびＰｂＴＲＡＰで免疫化された。１４日後、マウスを示されているようにＰ．ベルゲイスポロゾイトで攻撃誘発した。
【０１３２】
実施例４
マウスのさらに二つの疾患モデルにおけるＤＮＡ−初回刺激／ＭＶＡ−追加刺激法の保護効能
免疫原性研究に続いて、ＤＮＡ−初回刺激／ＭＶＡ−追加刺激法の保護効能が二つの追加のマウス攻撃誘発モデルで試験された。二つの攻撃誘発モデルはＰ８１５腫瘍モデルおよびインフルエンザＡウイルス攻撃誘発モデルであった。両方のモデル系においてＣＴＬが保護を仲介していることが示された。
【０１３３】
Ｐ８１５腫瘍攻撃
ＤＢＡ／２マウス群（ｎ＝１０）はＤＮＡ、続いてＨＭエピトープ列の腫瘍エピトープ列を発現するＭＶＡの組み合わせで免疫された。最後の免疫化から２週間後、マウスは１０5のＰ８１５細胞の静脈内投与で攻撃された。この攻撃後、マウスは定期的に腫瘍関連徴候および生存率でモニターされた。
【０１３４】
図１３は二群のマウスの生存率を示している。攻撃６０日後、腫瘍エピトープ列で免疫された群では１０匹のマウスの内８匹が生き残っていた。ＨＭエピトープ列で免疫された群では２匹のみしか生き残っていなかった。この結果は統計的に有意である：２／１０対８／１０カイ２乗＝７．２。Ｐ＝０．００７。腫瘍エピトープ列で免疫された動物群における死の始まりはＨＭエピトープ列で免疫された群と比較すると遅くなっている。
【０１３５】
インフルエンザウイルス攻撃誘発
ＢＡＬＢ／ｃマウス群はプラスミドＤＮＡによる３回の遺伝子銃免疫化、２回の筋肉内プラスミドＤＮＡ注射、１回のｉ．ｍ．ＤＮＡ注射に続く１回のＭＶＡ．ＮＰ追加刺激ｉ．ｖ．または２回の遺伝子銃免疫化に続く１回のＭＶＡ．ＮＰ追加刺激ｉ．ｖ．で免疫された。プラスミドＤＮＡおよび組換えＭＶＡはインフルエンザウイルス核タンパク質を発現した。最後の免疫化から２週間後、マウスに鼻腔内で１００ＨＡのインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスを攻撃誘発した。動物は攻撃誘発後毎日生存でモニターした。
【０１３６】
完全保護が以下の動物群で観察された：
２回のＤＮＡ遺伝子銃免疫化に続く１回のＭＶＡ．ＮＰ追加刺激ｉ．ｖ．
１回のｉ．ｍ．ＤＮＡ注射に続く１回のＭＶＡ．ＮＰ追加刺激ｉ．ｖ．
２回のｉ．ｍ．ＤＮＡ注射。
【０１３７】
遺伝子銃で３回免疫した動物群では７１％の動物が生き残り（５／７）、対照とのこの差は統計的に有意ではなかった（Ｐ＞０．０５）。天然のままの群では２５％の動物が生き残り（図１４）、この群は二つの完全保護群と有意に異なっていた（Ｐ＜０．０５）。
【０１３８】
図１４はインフルエンザウイルス攻撃誘発実験の結果を示している。ＢＡＬＢ／ｃマウスは示されているように免疫された。ＧＧ＝遺伝子銃免疫化、ｉｍ＝筋肉内注射、ｉｖ＝静脈内注射。動物の生存を攻撃誘発後毎日モニターした。
【０１３９】
第二の実験において、１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスはＭＶＡ．ＮＰｉ．ｖ．のみ、３回の遺伝子銃、２回の遺伝子銃に続く１回のＭＶＡ．ＮＰ追加刺激ｉ．ｖ．および２回のＶＩＪ−ＮＰｉ．ｍ．注射に続く１回のＭＶＡ．ＮＰ追加刺激で免疫された。最後の免疫化から２週間後、マウスに１００ＨＡのインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスを攻撃誘発した。
【０１４０】
完全および統計的に有意な保護が以下の動物群で観察された： ２回の遺伝子銃免疫化に続く１回のＭＶＡ．ＮＰ追加刺激 ２回のＶＩＪ−ＮＰｉ．ｍ．注射に続く１回のＭＶＡ．ＮＰ追加刺激。
【０１４１】
１回のＭＶＡ．ＮＰｉ．ｖ．を受けた群は３０％（１０匹の内の３匹）の動物が生き残った。３回の遺伝子銃によるＤＮＡワクチン送達により免疫された群は７０％の動物が保護されたが天然のままの対照とは有意に異なっていなかった。この攻撃誘発実験において、４０％（１０匹の内の４匹）の天然のままの動物が攻撃誘発から生き残った。
【０１４２】
実施例５
非ヒト霊長類での免疫原性研究非ヒト霊長類での初回刺激追加刺激法の免疫原性および保護効能
マウスで観察されたＤＮＡ初回刺激／ＭＶＡ追加刺激法の強力な免疫原性が、霊長類でも強力な免疫原性を誘導することを示すために、本方法がマカクにおいて試験された。ワクチンはＨＩＶおよびＳＩＶ配列から誘導されたＣＴＬエピトープの列から成っており、プラスミドＤＮＡまたはＭＶＡにおいては各々ＤＮＡ．ＨおよびＭＶＡ．Ｈと表示されている。ポリエピトープ列中での定義されたＣＴＬエピトープの使用はマカクにおけるＳＩＶ特異的ＣＴＬを試験することを可能にする。抗原性ペプチドのＭＨＣクラスＩ制限のため、マカクはそのＭＨＣクラスＩハロタイプでスクリーニングされ、Ｍａｍｕ−Ａ*Ａ０１陽性動物が記載された実験に選択された。
三匹の動物（ＣＹＤ，ＤＩおよびＤＯＲＩＳ）が下記の本免疫化法で免疫された
０週 ＤＮＡ（８μｇ、ｉ．ｄ．、遺伝子銃）
８週 ＤＮＡ（８μｇ，ｉ．ｄ．、遺伝子銃）
１７週 ＭＶＡ（５ｘ１０8ｐｆｕ、ｉ．ｄ．）
２２週 ＭＶＡ（５ｘ１０8ｐｆｕ、ｉ．ｄ．）。
【０１４３】
各々の動物からの血液が実験の０、２、５、８、１０、１１、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４および２５週に採取された。動物は二つの異なった方法を使用してＣＴＬの誘導がモニターされた。各々の採血で単離されたＰＢＭＣはエピトープ列中にコードされているペプチドを用いてインビトロで再刺激され、クロム放出細胞毒性アッセイにより自己由来ペプチドを持つ標的細胞を認識する能力が試験された。さらに、新しく単離されたＰＢＭＣは四量体を用いて抗原特異性ＣＤ８＋ Ｔ細胞が染色された。
【０１４４】
２回の遺伝子銃免疫化後、四量体染色を使用して非常に低レベルのＣＴＬが検出された（図１５）。第一のＭＶＡ追加刺激２週間後、三匹すべての動物が四量体染色を使用して検出されるようなペプチド特異的ＣＴＬを発現した（図１５）。これはインビトロ再刺激に続く中程度のＣＴＬ応答の検出で反映された（図１６、９週）。第二のＭＶＡ．Ａによる追加刺激は非常に高レベルのＣＤ８＋抗原特異的Ｔ細胞（図１５）およびまた非常に高レベルのエピトープ特異的細胞毒性Ｔ細胞（図１６、２３週）を誘導した。
【０１４５】
図１５は四量体を用いるＳＩＶ特異的ＭＨＣクラスＩ制限ＣＤ８＋ Ｔ細胞の検出を示している。三匹のＭａｍｕ−Ａ*Ａ０１陽性マカクは、示されたようなプラスミドＤＮＡ（遺伝子銃）続いてのＭＶＡ追加刺激により免疫された。Ｍａｍｕ−Ａ*Ａ０１／ＣＤ８二重陽性Ｔ細胞はＦＡＣＳ分析後に同定された。各々の棒は示された時間でのＭａｍｕ−Ａ*０１／ｇａｇエピトープに特異的なＣＤ８＋ Ｔ細胞のパーセントを示している。１パーセントのＣＤ８ Ｔ細胞は約５０００／１０6末梢血リンパ球に相当する。従ってこれらのマカクの末梢血中のエピトープ特異性ＣＤ８ Ｔ細胞レベルは、マラリア研究で免疫化されおよび保護されたマウスの脾臓で観察されたレベルと少なくとも同じ程度には高い。
【０１４６】
図１６はＤＮＡ／ＭＶＡ免疫化後のマカクにおけるＣＴＬ誘導を示している。
３匹の異なったマカク（ＣＹＤ、ＤＩおよびＤＯＲＩＳ）からのＰＢＭＣは１８、１９および２３週に単離され、インビトロでペプチドＣＴＰＹＤＩＮＱＭ［配列ＩＤ番号：５４］で再刺激された。ペプチドＣＴＰＹＤＩＮＱＭ［配列ＩＤ番号：５４］による２回の再刺激後、培養物はペプチド−パルス自己由来標的細胞に対するそれらの溶解活性が試験された。強いＣＴＬ活性が観察された。
【０１４７】
実施例６
チンパンジーでの免疫原性および攻撃誘発の研究
プラスミドＤＮＡによる最初の免疫化および続いての組換えＭＶＡによる免疫化の同様な方法が、より高等な霊長類において熱帯熱マラリア原虫マラリアに対して有効であることを示すため、２匹のチンパンジーで免疫化および攻撃誘発の研究が実施された。チンパンジーＨ１はイントロンＡなしでＣＭＶプロモーターから熱帯熱マラリア原虫ＴＲＡＰを発現するプラスミド（ＣＭＶ−ＴＲＡＰ）の５００μｇによる最初の免疫化を受けた。チンパンジーＨ２は、熱帯熱マラリア原虫ＬＳＡ−１遺伝子のＣ末端部分を発現するＣＭＶ−ＬＳＡ−１を同量受けた。両方のチンパンジーは続いての２ヶ月かけてさらに３回の免疫化を受けたが、その各々の免疫化は三つのプラスミドで行われた。Ｈ１は前記のＣＭＶ−ＴＲＡＰに、イントロンＡを持つＣＭＶプロモーターを使用してＴＲＡＰを発現するｐＨＴ−ＴＲＡＰが加えられ、より高い発現レベルが導かれた。Ｈ１はまたＲＳＶプロモーターからＬＳＡ−１のＣ末端部分を発現するＲＳＶ−ＬＳＡ−１も受けた。Ｈ２は第二、第三および第四の免疫化時にＣＭＶ−ＬＳＡ−１、ｐＴＨ−ＬＳＡ−１およびＲＳＶ−ＴＲＡＰを受けた。用量はいつも各々のプラスミド５００μｇであった。
【０１４８】
ＲＳＶプラスミドはそれらに含まれている抗原を発現しなかったことが後で発見され、従って、Ｈ１のみがＴＲＡＰを発現するプラスミドで、Ｈ２はＬＳＡ−１を発現するプラスミドで免疫された。
【０１４９】
これらのＤＮＡ免疫化の間および後のいくつかの時間点で細胞免疫応答のアッセイが実施され、最後のアッセイは４回目のＤＮＡ免疫化の３ヶ月後に実施されたが、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイまたはＣＤ８＋ Ｔ細胞のＣＴＬアッセイのどちらもマラリア特異的Ｔ細胞は検出できなかった。
【０１５０】
両方の動物は次に６週間の期間に渡って熱帯熱マラリア原虫ＴＲＡＰ抗原をコードしている組換えＭＶＡウイルスを１０8ｆｆｕの用量で３回免疫した。３回目の組換えＭＶＡ免疫化の直前および後にＴＲＡＰ抗原へのＴ細胞応答が、ラテックスビーズへ結合された全ＴＲＡＰタンパク質に対するＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して両方のチンパンジーで検出された。このアッセイはＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の両方を検出する。特異的ＣＤ８＋ Ｔ応答が両方の免疫化チンパンジーにおいて一連の短い８−１１アミノ酸ペプチドで探された。ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答のためのそのような分析は、チンパンジーＨ１でのみＣＤ８＋ Ｔ細胞が検出可能であったことを示した。これらのＣＤ８＋ Ｔリンパ球の標的エピトープは配列ＫＴＡＳＣＧＶＷＤＥＷ［配列ＩＤ番号：７８］のＴＲＡＰからの１１アミノ酸ペプチド（ｔｒ５７）であった。Ｈ１からのこれらのＣＤ８＋ Ｔ細胞はｔｒ５７ペプチドでパルス刺激した自己由来標的細胞に対しておよび組換えＰｆＴＲＡＰ−ＭＶＡウイルスが感染した自己由来標的細胞に対して溶解活性を持っていた。５００リンパ球当たり約１のこれらの特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の高い前駆体頻度が、最後のＭＶＡ免疫化から２ケ月後にＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いてチンパンジーＨ１の末梢血中に検出された。ＴＲＡＰを発現するプラスミドＤＮＡで初回刺激されなかったチンパンジーＨ２では特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答は明らかに検出されなかった。
【０１５１】
３回目のＰｆＴＲＡＰ−ＭＶＡ免疫化から２ヶ月後、攻撃誘発７日後にチンパンジーに確かに検出可能な血液期感染を起こすことが以前に観察されている数である２０００のスポロゾイトによりＨ１およびＨ２の攻撃誘発が実施された（Ｔｈｏｍａｓら１９９４、未発表データ）。攻撃誘発は熱帯熱マラリア原虫のＮＦ５４株で実施された。このことは重要で、なぜならプラスミドＤＮＡおよび組換えＭＶＡ中のＴＲＡＰ配列は、ＮＦ５４ ＴＲＡＰ対立遺伝子とは多数のアミノ酸相違を持つ熱帯熱マラリア原虫のＴ９／９６株からのものであるためである（Ｒｏｂｓｏｎら１９９０）。それ故、このスポロゾイト攻撃誘発は異種というよりも同種の寄生虫株で実施される。チンパンジーＨ２において、インビトロ寄生虫培養検出の使用によりスポロゾイト攻撃誘発７日後に予測されるように寄生虫が末梢血で検出可能であった。しかしながら、Ｈ１においては、培養での血液期寄生虫の出現は７日目から３日遅れた血液試料からであり、肝臓期感染に対するいくらかの保護効果と一致している。以前の候補マラリアワクチンの研究で、ヒトにおける末梢血中の寄生虫出現の遅れは肝臓の寄生虫密度の実質的減少に関係していると推定されている（Ｄａｖｉｓら１９８９）。従って、最初に熱帯熱マラリア原虫ＴＲＡＰプラスミドＤＮＡ、続いて組換えウイルスにより発現された同一の抗原により免疫されたチンパンジーＨ１は、強いＣＤ８＋ Ｔリンパ球応答および異種スポロゾイト攻撃誘発からのいくらかの保護の証拠を示した。
【０１５２】
考察
これらの実施例はヒトマラリア感染の齧歯動物モデルにおける高レベルの保護的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を誘導する、マラリアに対する免疫化のための新しい方法を示している。また、サブユニットワクチンを使用するスポロゾイト攻撃誘発に対する先例のない完全保護も示されている（ＣＳエピトープ含有ワクチンによるＤＮＡ初回刺激およびＭＶＡ追加刺激を用いて表６では３６匹のマウスの内３６匹が保護された）。ＤＮＡ初回刺激／ＭＶＡ追加刺激法を用いた保護的免疫応答の誘導がウイルス感染インフルエンザＡモデルおよび癌（Ｐ８１６腫瘍モデル）の二つの追加のマウスモデルで示された。ヒトでの使用のためのワクチンにより重要であるのは、この免疫化法はまた霊長類のＣＤ８＋ Ｔ細胞に対して高度に免疫原性であることである。強いＳＩＶ−ｇａｇ特異的ＣＴＬが、エピトープ列を発現するプラスミドＤＮＡおよびＭＶＡにより３匹のマカクの内の３匹で誘導された。誘導されたレベルはＳＩＶ感染動物で観察されたレベルに匹敵する。チンパンジー研究からのデータは、同じ免疫化法がより高等な霊長類で熱帯熱マラリア原虫に対する強いＣＤ８＋ Ｔリンパ球応答を誘導でき、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト攻撃誘発に対する保護のいくつかの証拠があることを示している。
【０１５３】
Ｔｙ−ＶＬＰはＰ．ベルゲイ齧歯動物マラリアに対して良好なレベルのＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導すると以前に報告されているが（Ａｌｌｓｏｐｐら１９９５）、この構築物単独では保護的ではない。ここで組換えＭＶＡ追加刺激による続いての免疫化はＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を非常に大きくし、高レベルの保護を発生させることが発見された（表７）。
【０１５４】
従来、組換えＭＶＡウイルスはマラリアワクチンとしての効能は評価されていない。組換えＭＶＡ単独では有意に保護的ではなく、また組換えＭＶＡによる初回刺激に続いての組換えプラスミドＤＮＡによる第二の免疫化も保護的でない。
【０１５５】
しかしながら、Ｔｙ−ＶＬＰまたはプラスミドＤＮＡによる最初の免疫化後の組換えＭＶＡによる第二の免疫化では印象的なレベルの保護が得られた。非組換えＭＶＡウイルスは天然痘に対する数千のヒトのワクチン接種に安全に使用されており、優れた安全性プロフィールを持っているようである。ワクシニアウイルスのこの株の増大した安全性および免疫原性の分子的基礎は分子研究により詳細に解明されている（Ｍｅｙｅｒら１９９１；Ｓｕｔｔｅｒら１９９４）。
【０１５６】
プラスミドＤＮＡはＰ．ヨエリイ齧歯動物マラリアのためのマラリアワクチンとして以前に試験されている。高レベル（しかし完全ではない）の保護がいくつかの系統で見られているが、他の系統のマウスでは多数回の免疫化後でさえもわずかな保護かまたは保護しないことが観察されている（Ｄｏｏｌａｎら１９９６）。プラスミドＤＮＡは熱帯熱マラリア原虫に対する免疫化法として提案されているが、これまで成功は達成されていない。本明細書に提供された証拠は、ヒトマラリア寄生虫熱帯熱マラリア原虫に対する保護的免疫性を誘導するための免疫化法にプラスミドＤＮＡが使用されるであろうことを示した最初の証拠である。
【０１５７】
本明細書に示された方法と類似の免疫化法は、ヒトにおける熱帯熱マラリア原虫に対する有用な保護的免疫性を誘導するために期待できる。齧歯動物またはチンパンジーで保護的免疫性を誘導するためにこれらの研究で用いられたワクチン構築物の五つは熱帯熱マラリア原虫配列を含んでおり、それ故熱帯熱マラリア原虫に対するヒト免疫化に使用できるであろうことに注意しなければならない。これらは１．熱帯熱マラリア原虫ＴＲＡＰプラスミドＤＮＡワクチン、２．熱帯熱マラリア原虫ＴＲＡＰ組換えＭＶＡウイルス、３．多数の熱帯熱マラリア原虫エピトープのエピトープ列、ならびに単一のＰ．ベルゲイＣＴＬエピトープをコードしているＴｙ−ＶＬＰ、４．３と同一のエピトープ列をコードしているプラスミドＤＮＡ、５．３および４の多くのマラリアエピトープを含むより長いＨＭエピトープ列をコードしている組換えＭＶＡである。同様に、ヒトクラスＩ分子のＨＩＶエピトープをコードしているプラスミドＤＮＡおよびＭＶＡは、ＨＩＶ感染に対する予防的または治療的免疫化に使用できる。
【０１５８】
これらの研究は、追加刺激として非複製または複製欠陥ポックスウイルスを用いる新規連続的免疫化法はマラリア寄生虫に対する強い保護的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導することができるという明瞭な証拠を提供した。実施例はポックスウイルスの複製株と比較されたＣＤ８＋ Ｔ細胞応答および保護の驚くほどのおよび本質的な促進を明瞭に示している。マラリア寄生虫からのＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープの免疫原性は他の抗原中のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープとは本質的に異なるべきと信じる理由はないので、本明細書に記載された免疫化法は他の疾患に対して価値のあるＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を発生させるのに有効であると証明されることが期待される。本免疫化法の決定的工程は前に存在しているＣＴＬ応答を追加刺激するための非複製または複製欠陥組換えポックスウイルスの使用である。ＣＴＬ応答は、ＤＮＡワクチンｉ．ｄ．およびｉ．ｍ．、組換えＴｙ−ＶＬＰ、組換えアデノウイルスおよび照射スポロゾイトのような異なった抗原送達系を使用して初回刺激できることが示されている。このことはＨＩＶ、インフルエンザウイルスおよび腫瘍に対するＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の発生で示されたデータにより支持される。他の疾患のいくつかの既知の例の中でＣＤ８＋ Ｔ細胞免疫応答が重要であるのは以下のものである：ＨＩＶ、単純ヘルペス、帯状ヘルペス、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、エプスタイン−バール、麻疹、デング熱およびＨＴＬＶ−１ウイルスにより；細菌結核菌およびリステリア種により；および原虫寄生体トキソプラズマおよびトリパノソーマにより起こされる感染および疾患。インフルエンザＡウイルスに対する保護的ＣＴＬ応答の誘導は図１４に示されている。さらに、本明細書で記載された免疫化法は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答が保護的役割を果たしている癌の形に対する免疫化で価値があると期待される。
【０１５９】
腫瘍に対してＤＮＡ初回刺激ＭＶＡ追加刺激法を使用した保護的ＣＴＬ応答の誘導は図１３に示されている。ヒトにおける特別の例にはメラノーマ、乳癌および結腸癌が含まれる。
【０１６０】
文献
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【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】図１はマラリアエピトープカセットＣＡＢＤＨＦＥを持つＴｙ−ＶＬＰを発現するために使用された構築物を示している。
【図２】図２はＨ、ＭおよびＨＭタンパク質の図的概要を示している。
【図３】図３は異なった免疫化法後のマラリアＣＤ８ Ｔ細胞ＥＬＩＳＰＯＴデータを示している。
【図４】図４は同じ抗原をコードしているプラスミドＤＮＡによる初回刺激に続いての組換えＭＶＡ免疫化により、マラリアＣＤ８ Ｔ細胞ＥＬＩＳＰＯＴおよびＣＴＬレベルが大いに追加刺激されることを示している。ＡおよびＣ。Ｐ．ベルゲイＣＳＰからのＫd制限ペプチドＳＹＩＰＳＡＥＫＩ［配列ＩＤ番号：６７］および大腸菌β−ガラクトシダーゼからのＬd制限ペプチドＴＰＨＰＡＲＩＧＬ［配列ＩＤ番号：６９］と１８時間インキュベートした新しい脾臓細胞でのγ−インターフェロンＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用してＢＡＬＢ／ｃマウスでＣＤ８＋ Ｔ細胞応答が測定された。ＥＬＩＳＰＯＴ計測数は対数スケールで表されていることに注意されたい。ＢおよびＤ。
【図５】図５はプラスミドＤＮＡおよび組換えＭＶＡを用いる種々の免疫化法により、マラリアおよびＨＩＶエピトープに対してＢＡＬＢ／ｃマウスで誘導されたＣＴＬ応答を示している。
【図６】図６は異なった免疫化法後のマラリアエピトープｐｂ９に対する特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞レベルを測定するために実施されたＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示している。
【図７】図７は異なったマウス系統におけるインフルエンザＮＰに対するＣＴＬ応答を示している。異なった系統のマウスは２週離して２回インフルエンザ核タンパク質をコードしているＤＮＡワクチンＶ１Ｊ−ＮＰで免疫されるか（白丸）、または同じＤＮＡワクチンで初回刺激され、インフルエンザウイルス核タンパク質を発現している組換えＭＶＡで追加刺激された（黒丸）。
【図８】図８は異なった近交マウス系で誘導された異なった抗原に対するＣＴＬ応答を示している。マウスは２週間離して２回ＤＮＡワクチン免疫化で免疫されるか（白丸）、またはＤＮＡワクチンで初回刺激され、２週間後に同一の抗原を発現している組換えＭＶＡで追加刺激された（黒丸）。
【図９】図９はスポロゾイト初回刺激ＣＴＬ応答がＭＶＡにより有意に追加刺激されることを示している。マウスはＡにおいては照射されたスポロゾイトの２回の低用量（５０＋５０）で、Ｂにおいてはスポロゾイトの２回の高用量（３００＋５００）で免疫された；マウスはＤでは低用量のスポロゾイト初回刺激、Ｅでは高用量のスポロゾイト初回刺激に続いてＭＶＡ．ＰｂＣＳＰで追加刺激された。ＭＶＡ．ＰｂＣＳＰでの免疫化後のＣＴＬ応答はＣに示されている。
【図１０】図１０はプラスミドＤＮＡまたはアデノウイルスによる初回刺激およびＭＶＡによる追加刺激によるＣＴＬ応答を示している。ＢＡＬＢ／ｃマウス群（ｎ＝３）はプラスミドＤＮＡ（Ａ）またはβ−ガラクトシダーゼを発現する組換えアデノウイルス（Ｂ）で初回刺激された。プラスミドＤＮＡは筋肉内に、ＭＶＡは静脈内におよびアデノウイルスは皮内に投与された。脾臓細胞は最後の免疫化から２週間後にペプチドＴＰＨＰＡＲＩＧＬ［配列ＩＤ番号：６９］で再刺激された。ＣＴＬ活性はペプチドでパルス刺激したＰ８１５細胞で試験された。
【図１１】図１１はプラスミドＤＮＡによる初回刺激、続いての異なった組換えワクシニアウイルスによる追加刺激によるＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＴＬ応答を示している。
【図１２】図１２は異なった経路でＭＶＡを追加刺激した後のペプチド特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度を示している。
【図１３】図１３は二群のマウスの生存率を示している。攻撃６０日後、腫瘍エピトープ列で免疫された群では１０匹のマウスの内８匹が生き残っていた。
【図１４】図１４はインフルエンザウイルス攻撃誘発実験の結果を示している。ＢＡＬＢ／ｃマウスは示されているように免疫された。ＧＧ＝遺伝子銃免疫化、ｉｍ＝筋肉内注射、ｉｖ＝静脈内注射。動物の生存を攻撃誘発後毎日モニターした。
【発明の開示】
【０００１】
技術分野
発明の詳細な説明
ＣＤ８ Ｔ細胞免疫応答を発生するワクチン接種のための方法および試薬
本発明はＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源として異なった初回刺激および追加刺激組成物を使用した標的抗原に対する保護的ＣＤ８＋ Ｔ細胞免疫応答の発生に関している。
【０００２】
背景技術
ワクチン学における一般的問題は、免疫化により高レベルのＣＤ８ Ｔ細胞を発生できないことである。このことはマラリアを含むいくつかの疾患に対するワクチンの開発を妨げてきた。
【０００３】
熱帯熱マラリア原虫マラリアは毎年数億のマラリア感染を起こし、毎年１００−２００万人の死者を出している。従って、マラリアに対する有効なワクチンの開発は世界の公衆衛生においてより重要な優先すべきものである。この２０年間おける免疫学的研究のかなり多くは原虫からのワクチン抗原候補、および感染および疾患を保護しているらしい宿主免疫学的機構の両方の同定に至っている。しかしながらこの進歩にもかかわらず、現場での試みに有効であることが示されたマラリア感染に対するワクチン接種法は未だに存在しない。
【０００４】
主要な問題は、感染および疾患を保護するために十分強力な免疫応答をワクチン接種した個体に誘導する手段が同定されないためである。このように、マラリアに対するワクチン接種に有用であろう多くのマラリア抗原が知られているが、免疫系の細胞により認識されるエピトープとして知られているそのような抗原またはそれらの断片を、特定の型の十分に強い免疫応答を誘導する様式でどうのように送達するのかが問題であった。
【０００５】
大量の照射された、感染した蚊が刺すことにより与えられるマラリアスポロゾイトで個体を免疫することにより個体を保護することが可能であることは前から知られている。この方法は大量のワクチン接種には全く実際的ではないが、スポロゾイト感染に対する保護的免疫性を仲介するであろう免疫応答を分析するためのモデルを提供した（ＮａｒｄｉｎおよびＮｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ １９９３）。
【０００６】
この１０年またはそれ以上にわたるかなりの量の研究は、熱帯熱マラリア原虫マラリアの初期前赤血球期に対する主な保護的免疫応答がＣＤ８＋ｖｅ型のＴリンパ球（ＣＤ８＋ Ｔ細胞）により仲介されることを示している。そのような細胞はマラリア感染のマウスモデルにおいて直接的に保護を仲介することが示されている（ＮａｒｄｉｎおよびＮｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ １９９３）。そのようなＴ細胞はまた、自然にマラリアに感染した個体および照射されたスポロゾイトで免疫された志願者において同定されている（Ｈｉｌｌら１９９１；Ａｉｄｏｏら１９９５；Ｗｉｚｅｌら１９９５）。そのようなＣＤ８＋ Ｔ細胞はヒトにおけるマラリア感染および疾病に対して保護的であるという間接的な証拠が多く存在する（Ｌａｌｖａｎｉら１９９４）。
【０００７】
ＣＤ８＋ Ｔ細胞は一つ以上の様式で機能しているであろう。最もよく知られている機能は、ＭＨＣクラスＩ分子関連のペプチド抗原を持つ標的細胞を殺すまたは溶解させることである。従って、これらの細胞はしばしば細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と称される。しかしながら、多分マラリア感染においてより大きな保護的関連性を持つ別の機能はインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）を分泌するＣＤ８＋ Ｔ細胞の能力である。従って、ＣＤ８＋ Ｔ細胞免疫応答の測定において溶解活性およびＩＦＮ−γ放出アッセイの両方ともが価値がある。マラリアにおいてこれらのＣＤ＋８ｖｅ細胞は、疾患の徴候がでる前のマラリア感染の初期肝臓内期で原虫を殺すことにより保護することができる（Ｓｅｇｕｉｎら１９９４）。致死的ヒトマラリアの仲介者、熱帯熱マラリア原虫は限られた数の宿主種に感染する：ヒト、チンパンジーおよび新世界ザルのいくつかの種。マラリアの最良の非ヒトモデルはチンパンジーであり、その理由は、この種はヒトに密接に関連しており、およびサル宿主と異なって肝臓期感染が一致して観察されるためである（Ｔｈｏｍａｓら１９９４）。チンパンジーは高価でありおよび利用できる数が限られているので、ほとんどの実験室での研究は齧歯動物マラリア種Ｐ．ベルゲイまたはＰ．ヨエリイを用いてマウスで実施される。これら後者の二つのモデルはよく研究されており、両方ともスポロゾイト感染に対する保護的免疫性においてＣＤ８＋ｖｅリンパ球が鍵となる働きを果たしていることが示されている。
【０００８】
従来の研究はマラリアに対するＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を含む種々の方法を評価している。これらのいくつかは齧歯動物モデルにおけるＣＤ８＋ Ｔ細胞応答のいくつかのレベルおよびマラリア感染に対する部分的保護を示している（例えば、Ｌｉら１９９３；Ｓｅｄｅｇａｈら１９９４；Ｌａｎａｒら１９９６）。しかしながら、マラリアスポロゾイト感染を有効に保護するための十分に高レベルのＣＤ８＋ Ｔリンパ球の導入によるサブユニットワクチン免疫化の有効な方法はこれまで示されていない。
【０００９】
最近、抗原を運ぶために使用されるベクターを変えることにより改良された免疫応答を発生させる可能性のあるワクチンが考えられた。初回刺激および追加刺激として連続的に投与された二つの異なったベクターを使用することにより抗体応答が改良されたいくつかの例での証拠が存在する。初回刺激および追加刺激の種々の組み合わせが異なったワクチン投与法で試験された。
【００１０】
Ｌｅｏｎｇら（Ｖａｃｃｉｎｅｓ １９９５，３２７−３３１）は、最初にインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）抗原を発現するＤＮＡで、続いてＨＡを発現する組換え鶏痘ベクターによるマウスの免疫化を記載している。追加刺激後に促進された抗体応答が得られている。
【００１１】
Ｒｉｃｈｍｏｎｄら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９７，２３０：２６５−２７４）はＤＮＡ初回刺激および組換えワクシニアウイルス追加刺激を用いてＨＩＶ−ｌｅｎｖに対する中和抗体を上昇させる試みを記載している。この初回刺激−追加刺激法では低レベルの抗体応答しか観察されず、結果は落胆するものであった。
【００１２】
Ｆｕｌｌｅｒら（Ｖａｃｃｉｎｅ １９９７，１５：９２４−９２６およびＩｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９７，７５：３８９−３９６）は複製する組換えワクシニアウイルスによる追加刺激免疫化を使用することによるマカクのＤＮＡ免疫化に対する抗体応答の促進を記載している。しかしながら、ウイルス負担の非常な減少としての促進された保護的効能には転化されず、ＤＮＡ初回および追加刺激動物においてＣＤ４Ｔ細胞損失の減弱がみられた。
【００１３】
Ｈｏｄｇｅら（Ｖａｃｃｉｎｅ １９９７，１５：７５９−７６８）は組換え鶏痘ウイルス（ＡＬＶＡＣ）で発現されたヒト胎児性癌抗原（ＣＥＡ）を用いた癌のマウスモデルにおけるリンパ球増殖性Ｔ細胞応答の誘導を記載している。著者らはＷｙｅｔｈまたはＷＲ株のＣＥＡ−組換え複製適格性ワクシニアウイルスで免疫応答を初回刺激し、ＣＥＡ−組換えＡＬＶＡＣで応答を追加刺激した。これはＴ細胞増殖を増加させたが、３回の野生型組換え免疫化（１００％保護）、３回の組換えＡＬＶＡＣ−ＣＥＡ免疫化（７０％保護）またはＷＲ初回刺激に続く２回のＡＬＶＡＣ−ＣＥＡ免疫化（６３％保護）と比較した合台、保護的効能の促進は得られなかった。
【００１４】
それ故、異種初回刺激−追加刺激の組み合わせのいくつかの研究では抗体およびリンパ球増殖性応答のいくらかの促進は観察されたが、動物モデルにおける保護的効能には有意な影響を与えなかった。これらの研究においてＣＤ８ Ｔ細胞は測定されていない。抗体応答があまり促進されなかったのは多分、初回刺激免疫原に対する抗体はしばしば同一の免疫原による第二の免疫化の免疫原性を減少させるであろうが、異なった担体による追加刺激はこの問題を部分的に克服するであろうという事実を単に反映しているのであろう。この機構は免疫化の順序には有意に影響されないことが期待されるであろう。
【００１５】
異種初回刺激−追加刺激免疫化法がＣＤ８ Ｔ細胞応答に影響するという証拠がＬｉら（１９９３）により提出された。かれらは二つの生きているウイルスベクターの投与、即ち、組換えされた複製するインフルエンザウイルス続いてのマラリアエピトープをコードしている組換えされた複製するワクシニアウイルス、によりマラリアスポロゾイト感染に対してマウスで誘導された部分的な保護的効能を記載している。免疫化の順序を逆転させると保護的効能が失われ、著者らはワクシニアによる肝臓細胞の感染に関連し、マラリア原虫の肝臓期に対する保護のために肝臓中にＣＴＬの局在化が生じることを示唆している。
【００１６】
Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４，４６３６−４６４８）はマラリアスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質の免疫優性Ｂ細胞エピトープを発現している組換えインフルエンザウイルスの反復投与、続いての組換えワクシニアウイルス追加刺激によるマウスの免疫化を記載している。追加刺激における野性型ワクシニア株および減弱されているが複製適格性であるワクシニア株の使用は非常に類似したレベルの部分的保護を与えた。しかしながら、減弱されているが複製適格性であるワクシニア株は野性型ワクシニア株よりもＣＤ８ Ｔ細胞の初回刺激に対してはわずかに免疫原性が劣っていた。
【００１７】
Ｍｕｒａｔａら（Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６，１７３：９６−１０７）は、複製する組換えインフルエンザウイルスによる初回刺激およびワクシニアウイルスの複製する株による追加刺激後の促進されたＣＤ８ Ｔ細胞応答を報告しており、二つの従来の研究で観察された部分的保護はこの促進されたＣＤ８Ｔ細胞誘導によるものであることを示唆している。
【００１８】
それ故これら三つの研究を一緒にすると、複製する組換えワクシニアウイルスによる追加刺激免疫化は、複製する組換えインフルエンザウイルスによる初回刺激に続くＣＤ８ Ｔ細胞誘導をある程度促進するという証拠を提供している。しかしながら、それらの潜在的有用性に関するこれらの発見には二つの制限が存在する。第一に、誘導された免疫原性マラリアに対して部分的保護を達成する程度でしか十分ではなく、これは非常に免疫原性である通常ではない複製する組換えインフルエンザウイルスによる初回刺激免疫化に依存していた。第二に、免疫原としてこれらの複製するウイルスを使用する潜在的および記載された副作用のため、これらの組換えベクターはワクチンとしてヒト一般への使用には適していない。
【００１９】
修飾ワクシニアウイルス アンカラ（ＭＶＡ）は、正常ヒト組織を含むほとんどの細胞型で複製しないワクシニアウイルスである。ＭＶＡはトルコのアンカラでウマの痘疹病変から誘導された材料をニワトリ胎児線維芽細胞（ＣＥＦ）で＞５００回の連続継代培養により誘導された（Ｍａｙｒら１９７５）。複製欠陥的であるが、それにもかかわらず獣医学的にポックスウイルス感染に対して保護的免疫性を誘導できることが示されている（Ｍａｙｒ １９７６）。ＭＶＡは天然痘根絶キャンペーンの最終期においてヒトワクチンとして使用されており、南ドイツにおいて＞１２０，０００の被験者に皮内、皮下および筋肉内経路で投与されている。湿疹のような高リスク群へのワクチン接種の計画的標的化にもかかわらず、有意な副作用は記録されていない（Ｍａｙｒら１９７８；Ｓｔｉｃｋｌら１９７４；Ｍａｈｎｅｌら１９９４）。ＭＶＡの安全性は照射マウスおよび続いての新生児マウスへの頭蓋内投与を含む動物モデルにおけるウイルスの無毒性を反映している。ＭＶＡが複製しないことはニワトリ漿尿膜上の増殖性白色プラークの産生、非鳥類細胞の不発感染および全部で約３０ｋｂの六つのゲノム欠損に相関していた（Ｍｅｙｅｒら１９９１）。ＭＶＡの無毒性は宿主域遺伝子Ｋ１ＬおよびＣ７Ｌに影響する欠損に部分的に帰するとされているが、ヒトＴＫ−１４３細胞およびアフリカミドリザルＣＶ−１細胞では制限されたウイルス複製が起こる（Ａｌｔｅｎｂｕｒｇｅｒら１９８９）。Ｋ１Ｌ遺伝子の回復は、ＭＶＡ宿主域をただ部分的に回復させる（Ｓｕｔｔｅｒら１９９４）。宿主域制限はウイルス粒子成熟の間に起こるようであり、電子顕微鏡法でヒトヒーラー細胞中に未成熟ビリオンのみが観察されている（Ｓｕｔｔｅｒら１９９２）。ウイルス複製における後期阻害はＭＶＡ中の組換え遺伝子の効率的発現を防止しない。インフルエンザ核タンパク質、インフルエンザヘマグルチニンおよびＳＩＶタンパク質を発現している組換えＭＶＡは免疫原性であることが証明されており、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球のみに帰せられるものではないが、動物モデルにおいていろいろな程度の保護を示している（Ｓｕｔｔｅｒら１９９４；Ｈｉｒｓｃｈら１９９５；Ｈｉｒｓｃｈら１９９６）。組換えＭＶＡは、その安全性および免疫原性特性のためヒトワクチン候補として見込みがあると考えられる（Ｍｏｓｓら１９９５）。異物抗原をコードしているＤＮＡを含む組換えＭＶＡは米国特許第５，１８５，１４６号（Ａｌｔｅｎｂｕｒｇｅｒ）に記載されている。
【００２０】
ポックスウイルスは、通常細胞性サイトカインレセプターの細胞外ドメインと類似の配列を持つ腫瘍壊死因子、ＩＬ−１β、インターフェロン（ＩＦＮ）−α／βおよびＩＦＮ−γの可溶性レセプターとして機能する分泌タンパク質の産生を含む宿主免疫応答の回避のための戦略を発展させた（Ｓｙｍｏｎｓら１９９５；Ａｌｃａｍｉら１９９５；Ａｌｃａｍｉら１９９２）。この性質を持ち、最も最近に報告されたレセプターはケモカインレセプターである（Ｇｒａｈａｍら１９９７）。これらウイルスレセプターは一般に適切な宿主免疫応答を阻害するかまたは消失させ、それらの存在は増大した病原性に関連する。ＩＬ−１βレセプターは例外である：その存在は感染に直面して宿主発熱応答を弱め、および宿主生存を高める（Ａｌｃａｍｉら１９９６）。我々はＭＶＡにはインターフェロンγ、インターフェロンαβ、腫瘍壊死因子およびＣＣケモカインの機能性サイトカインレセプターが欠けているが、潜在的に有益なＩＬ−１βレセプターを保持していることを発見した。ＭＶＡはこのサイトカインレセプタープロフィールを保持している唯一の既知ワクシニア株であり、理論的に他のポックスウイルスと比較するとより安全でおよびより免疫原性である。別の複製欠陥的および安全なワクシニア株はＮＹＶＡＣとして知られており、Ｔａｒｔａｇｌｉａらにより完全に記載されている（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９２，１８８：２１７−２３２）。
【００２１】
生きているウイルスは組換えワクチンベクターとしていくつかの魅力的な特色を持っており、異物抗原に対する高い適応力および細胞免疫応答のためのかなり良好な免疫原性が含まれる（Ｅｌｌｉｓ １９８８ワクチン作成のための新技術”ワクチン”、編者：Ｐｌｏｔｋｉｎ ＳＡおよびＭｏｒｔｉｍｅｒ ＥＡ．ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，５６８ページ；Ｗｏｏｄｒｏｗ ＧＣ １９７７”新世代ワクチン第二版”編者：Ｌｅｖｉｎｅ ＭＭ，Ｗｏｏｄｒｏｗ ＧＣ，Ｋａｐｅｒ ＪＢ，Ｃｏｂｏｎ Ｇ，３３ページ）。このことにより、複製能力を減少させることを含む種々の方法でそのような生きているベクターの毒性を減弱させる試みが行われた（Ｔａｒｔａｇｌｉａら１９９２ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８８：２１７−２３２）。しかしながら、そのような複製能力の減少はウイルスにより生み出される抗原の量を減少させ、それによりワクチン免疫原性を減少させることが予期されるであろう。実際、複製するワクシニア株の減弱は抗体応答のいくらかの実質的減少を導くことが以前に示されている（Ｌｅｅ ＭＳら１９９２ Ｊ Ｖｉｒｏ１ｏｇｙ ６６：２６１７−２６３０）。同様に、狂犬病研究において非複製鶏痘ベクターは複製する野生型ワクシニア株よりも抗体産生のための免疫原性が弱く、より保護的でないことが観察されている（Ｔａｙｌｏｒ Ｊら１９９１ Ｖａｃｃｉｎｅ ９：１９０−１９３）。
【００２２】
ポックスウイルスの非複製および複製欠陥株が初回刺激ＣＴＬ応答に対し特別に良好な追加刺激効果を与えるベクターを提供することがここに発見された。驚くべきことに、この効果は野生型ポックスウイルスによる追加刺激効果よりも著しく強かった。この効果はマラリアおよびウイルスおよび腫瘍抗原のような他の抗原で観察され、マウスおよび非ヒト霊長類感染実験で示されたように保護的である。スポロゾイトの攻撃誘発（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）からの部分的というよりも完全な保護が新規免疫化投与法で観察された。
【００２３】
マラリアに対して免疫する有効な手段を同定するのもこの発明の目的である。ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答が保護的働きを果たしている手段を同定するのもこの発明のさらなる目的である。そのような疾患にはＨＩＶ、単純ヘルペス、帯状ヘルペス、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、エプスタイン−バール、麻疹、デング熱およびＨＴＬＶ−１ウイルスにより；細菌結核菌およびリステリア種により；および原虫寄生体トキソプラズマおよびトリパノソーマにより；およびある形の癌（例えば、メラノーマ、乳癌および結腸癌）で起こされる感染および疾患が含まれるがそれらに制限されるわけではない。
【００２４】
本明細書において非常に高レベルのＣＤ８＋ Ｔ細胞を発生したおよびＰ．ベルゲイスポロゾイト攻撃誘発に対して先例のない完全保護を誘導できることが観察された新規免疫化法が説明される。同一の方法がより高等な霊長類で試験され、この種においても高度に免疫原性であることが観察され、および熱帯熱マラリア原虫の攻撃誘発に対して部分的保護を誘導することが観察された。保護的免疫応答の誘導は二つの追加のウイルス感染および癌のマウスモデルにおいても示された。
【００２５】
本明細書に記載されている新規免疫化法ではまたＨＩＶエピトープに対する強力なＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を発生するのに有効である新規免疫化法がさらに示される。かなりの証拠がそのようなＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の発生はこのウイルス感染および疾患に対する予防的および治療的免疫化に有効であると期待できることを示している（Ｇａｌｌｉｍｏｒｅら１９９５；Ａｄａ １９９６）。強いＣＤ８＋ Ｔ細胞応答はＨＩＶおよびマラリア両方からの配列を持つエピトープ列を用いてこれらの微生物からのエピトープに対して発生されるであろうことが示される。ＨＩＶおよびマラリアエピトープおよびインフルエンザおよび腫瘍エピトープ両方に対する促進された免疫原性の発生における成功は、この新規免疫化法は強力なＣＤ８＋ Ｔ細胞応答が有用であろう多くの感染性病原体および非感染性疾患に一般的に有効であろうことを示している。
【００２６】
本発明の驚くべき特色とは初回刺激および特にＣＤ８＋ Ｔ細胞の追加刺激の両方における非複製作用物質の非常に高い効能の発見である。一般に、生きているウイルスベクターによるＣＤ８＋ Ｔ細胞誘導の免疫原性は非複製作用物質または複製欠陥ベクターよりも高いことはすでに見いだされている。このことは宿主中で複製できる作用物質により産生される抗原の量がより多いことから予期されるであろう。しかしながらここで我々は非複製ベクターを用いて最大の免疫原性および保護的効能が驚くべきことに観察されたことを見いだした。後者はヒトにおける使用のためには複製するベクターよりも一般的に安全であるということでワクチン接種における利点を追加する。
【００２７】
本発明は一つの態様において、少なくとも一つの標的抗原に対して保護的ＣＤ８＋ Ｔ細胞免疫応答を発生するためのキットを提供し、本キットは以下のものを含んでいる：
（ｉ） 標的抗原の一つまたはそれ以上のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源、ならびに医薬品として受容可能な担体から成る初回刺激組成物；および
（ｉｉ）初回刺激組成物のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープと同一である少なくとも一つのＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源を含む標的抗原の一つまたはそれ以上のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源、ここでＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源は非複製または複製欠陥組換えポックスウイルスベクターである、ならびに医薬品として受容可能な担体から成る追加刺激組成物；
ただし、（ｉ）のエピトープ源がウイルスベクターであるならば、（ｉｉ）におけるウイルスベクターは異なったウイルスから誘導される。
【００２８】
本発明の別の態様は少なくとも一つの標的抗原に対する保護的ＣＤ８＋ Ｔ細胞免疫応答を発生させるための方法を提供し、本方法は本発明に従ったキットの組成物（ｉ）の少なくとも一回量、続いて組成物（ｉｉ）の少なくとも一回量を投与することから成っている。
【００２９】
好適には、本発明に従った方法における（ｉ）のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源は非ウイルスベクターまたは非複製または複製欠陥ウイルスベクターであるが、複製するウイルスベクターを使用してもよい。
【００３０】
好適には、（ｉ）のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源は初回刺激および追加刺激間の交差反応が最小となるようにするためにポックスウイルスベクターではない。
本発明の一つの好適な態様において、初回刺激組成物中のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源は核酸（ＤＮＡでもＲＮＡでもよい）、特に組換えＤＮＡプラスミドである。ＤＮＡまたはＲＮＡは包まれていてもよいし（例えば、リソソーム中に）または遊離の形でもよい。
【００３１】
本発明の別の好適な熊様において、初回刺激組成物中のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源はＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープの組換え列中または標的抗原中に存在するペプチド、ポリペプチド、タンパク質、多タンパク質または二つまたはそれ以上のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを含む粒子である。多タンパク質は二つまたはそれ以上のタンパク質を含んでおり、それらは同じものでもよいが好適には異なっておりお互いに連結されている。この態様で特に好適であるのはＴｙウイルス様粒子（ＶＬＰ）（ＢｕｒｎｓらＭｏｌｅｃ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９４，１：１３７−１４５）のような組換えタンパク質様粒子である。
【００３２】
好適には、追加刺激組成物中のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源はＭＶＡまたはＮＹＶＡＣのようなワクシニアウイルスベクターである。最も好適であるのはワクシニア株修飾ウイルスアンカラ（ＭＶＡ）またはそれらから誘導された株である。ワクシニアベクターの代替物としては鶏痘またはカナリア痘ベクターのようなアビポックスベクターが挙げられる。アビポックスベクターとして特に適しているのはＡＬＶＡＣとして知られているカナリア痘の株（Ｋａｎａｐｏｘの名前で市販品として入手可能である）およびそれらから誘導された株である。
【００３３】
ポックスウイルスゲノムは多量の異種遺伝子情報を運ぶことができる。ワクチンでの使用におけるウイルスベクターの他の必要条件は良好な免疫原性および安全性である。ＭＶＡは良好な安全性の記録を持つ複製欠陥ワクシニア株である。
【００３４】
ほとんどの細胞型および正常ヒト組織において、ＭＶＡは複製を起こさない；ＭＶＡの制限された複製がＢＨＫ２１細胞のような少数の形質転換された細胞型で観察される。本明細書に記載された結果から、組換えＭＶＡおよび他の非複製または複製欠陥株は、ＤＮＡプラスミド、組換えＴｙ−ＶＬＰまたは組換えアデノウイルスによる初回刺激に続いての追加刺激組成物として投与した場合、保護的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を発現させることにおいて通常の組換えワクシニアベクターよりも驚くほどおよび著しく良好であることがここに示されている。
【００３５】
ＭＶＡから誘導されたワクシニアウイルス株、またはワクチンでの使用にＭＶＡを特に適したものにするＭＶＡの特色を持っている独立して開発された株は本発明での使用に適しているであろうことが明らかにされるであろう。
【００３６】
エピトープの挿入列を含んでいるＭＶＡ（ＭＶＡ−ＨＭ、実施例に説明されている）は１９９７年６月５日にＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，ＣＡＭＲ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ ＳＰ４０ＪＧ，ＵＫにＶ９７０６０５１１の受け入れ番号で寄託された。
【００３７】
本明細書で使用される用語”非複製”または”複製欠陥”とは大多数の哺乳類細胞または正常ヒト細胞中で有意な程度では複製できないことを意味している。
非複製または複製欠陥であるウイルスは自然にそうなるかまたはインビトロでの繁殖によりまたは例えば、複製に決定的である遺伝子の欠損のような遺伝子操作により人工的に作製される。ＭＶＡに対するＣＥＦ細胞のように、ウイルスが増殖できる一つまたは少数の細胞型が一般的に存在するであろう。
【００３８】
ウイルスの増殖は一般的に二つの方法で測定される：１）ＤＮＡ合成および２）ウイルス力価。より正確には、用語”非複製または複製欠陥”が本明細書で使用される場合およびそれがポックスウイルスに適用される場合、以下の基準の片方または両方を満足するウイルスを意味している：
１）ＭＲＣ−５細胞（ヒト細胞株）においてワクシニアウイルスのコペンハーゲン株と比較してＤＮＡ合成に１ｌｏｇ（１０倍）の減少を示す；
２）ヒーラー細胞（ヒト細胞株）においてワクシニアウイルスのコペンハーゲン株と比較してウイルス力価に２ｌｏｇの減少を示す。
【００３９】
この定義に含まれるポックスウイルスの例はＭＶＡ、ＮＹＶＡＣおよびアビポックスウイルスであり、定義に含まれないウイルスは減弱ワクシニア株Ｍ７である。
本発明に従った初回刺激に使用するための別の好適なウイルスベクターには、遺伝学上非複製または複製欠陥であるようになされた種々の異なったウイルスが含まれる。非複製または複製欠陥ベクターを産生するようなウイルスの遺伝子操作は文献に多く記載されている（例えば、ＭｃＬｅａｎら１９９４）。
【００４０】
初回刺激に使用するための別の適したウイルスベクターは、ヘルペスウイルスおよびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）（Ｄａｖｉｅｓら１９９６）に基づいたベクターである。初回刺激に適した細菌ベクターには組換えＢＣＧおよび組換えサルモネラおよびプラスミドＤＮＡで形質転換したサルモネラ（Ｄａｒｊｉら１９９７ Ｃｅｌｌ ９１：７６５−７７５）が含まれる。
【００４１】
初回刺激に使用するための別の適した非ウイルスベクターには、リポペプチドとして知られている脂質の尾をつけたペプチド、融合タンパク質としてまたは化学結合によりＫＬＨのような担体タンパク質に融合されたペプチド、アジュバントを含む全抗原およびその他の類似の系が含まれる。ＱＳ２１またはＳＢＡＳ２（Ｓｔｏｕｔｅら１９９７ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２２６：８６−９１）のようなアジュバントがＴ細胞応答の誘導を促進させるためにタンパク質、ペプチドまたは核酸とともに使用されるであろう。これらの系はしばしば”ベクター”というよりも”免疫原”と称されるが、それらは関連するＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを運んでいるという意味で本明細書においてはベクターである。
【００４２】
初回刺激および追加刺激組成物は両方とも前記（ｉ）で定義されたようなＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープの初回刺激源および前記（ｉｉ）で定義されたようなＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープの追加刺激源を含んでいるのでそれらの組成物は同一でなければならないという理由はない。初回刺激としておよび追加刺激として使用できる単一処方が単に投与されるであろう。重要なことは、初回刺激物は少なくとも前記（ｉ）で定義されたようなエピトープの初回刺激源を含んでおり、および追加刺激物は少なくとも前記（ｉｉ）で定義されたようなエピトープの追加刺激源を含んでいることである。
【００４３】
初回刺激および追加刺激組成物中に存在するまたはそれらによりコードされているＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープは、一つまたは二つまたはそれ以上のエピトープの組換え列のような種々の異なった形で、または天然の標的抗原の環境で、またはこれら両方の組み合わせで提供される。ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープは多くの異なった疾患に対して同定されており文献に見ることができる。そのようなエピトープを含む任意の抗原に対してＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を発生させるようにエピトープ列を設計することが可能である。都合よくは、不必要な核酸および／またはアミノ酸材料が回避されるように、配列が間に入ることなく多エピトープ列中のエピトープが連結される。ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープに加え、エピトープ列により発生される免疫応答を増大させるため、Ｔヘルパー細胞により認識される一つまたはそれ以上のエピトープを含んでいることが好適であろう。特に適したＴヘルパー細胞エピトープは異なったＨＬＡ型の個体で活性化されるものである、例えば、破傷風からのＴヘルパーエピトープ（それに対しほとんどの個体はすでに初回刺激されているであろう）。三つのヘルパーエピトープの有用な組み合わせが本明細書に記載された実施例で用いられている。Ｂ細胞応答および抗体産生を促進するためのＢ細胞エピトープを含ませるのも有用であろう。
【００４４】
記載されている初回刺激および追加刺激組成物は都合よくはアジュバントを含んでいる。特に、ＤＮＡプラスミドを含んでいる初回刺激組成物はさらにアジュバントとして作用するための顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）またはそれをコードしているプラスミドも含んでいる；ポリペプチド形のＧＭ−ＣＳＦを使用すると有益な効果が観察された。
【００４５】
本明細書に記載された組成物は治療的または予防的ワクチンとして用いられる。予防的または治療的免疫化のどちらがより適切であるかは通常疾患の特性に依存するであろう。例えば、癌ではそれが診断される前というよりはむしろ治療的に免疫化されるであろうし、一方、抗マラリアワクチンは必ずというわけではないが、好適には予防的に使用されるであろう。
【００４６】
本発明の組成物は種々の異なった経路で投与される。より効果的な応答の発生が得られるように、または副作用を引き起こすことがより少なくなるように、または投与がより簡単であるように、ある種の組成物に対してはある種の経路が好都合である。本発明は、金ビーズ上かまたは粉末としての遺伝子銃送達で有効であることが示されている。
【００４７】
さらなる態様において、本発明は以下のものを提供する： 病原体または腫瘍に対する保護的ＣＤ８＋ Ｔ細胞免疫応答を発生させるための方法であって、但し本方法は少なくとも一つのＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープまたは病原体または癌の抗原をコードしている組換えＤＮＡプラスミドの少なくとも一回量、続いて同一のエピトープまたは抗原をコードしている非複製または複製欠陥組換えポックスウイルスの少なくとも一回量を投与することから成る；
病原体または腫瘍に対する保護的ＣＤ８＋ Ｔ細胞免疫応答を発生させるための方法であって、但し本方法は少なくとも一つの病原体または癌のエピトープまたは抗原を含む組換えタンパク質または粒子の少なくとも一回量、続いて同一のエピトープまたは抗原をコードしている組換えＭＶＡベクターの少なくとも一回量を投与することから成る；
ＣＤ８＋ Ｔ細胞免疫応答を追加刺激するための医薬品の製造における組換え非複製または複製欠陥ポックスウイルスベクターの使用；
ＣＤ８＋ Ｔ細胞免疫応答を追加刺激するための医薬品の製造におけるＭＶＡベクターの使用；
標的抗原の一つまたはそれ以上のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源を含む、少なくとも一つの標的抗原またはエピトープに対する初回刺激ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を追加刺激するための医薬品ならびに医薬として受容可能な担体、ここでＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源は非複製または複製欠陥組換えポックスウイルスベクターである；および 遺伝子銃による送達に適した特別な形の本明細書に記載されている初回刺激および／または追加刺激組成物；および遺伝子銃法による組成物の送達から成る免疫化法。
【００４８】
以下のものも本発明により提供される：表１および表２に掲けられたアミノ酸配列から成るエピトープ列を含む本明細書に記載されたエピトープ列；エピトープ列をコードしている組換えＤＮＡプラスミド；エピトープ列を含む組換えＴｙ−ＶＬＰ；熱帯熱マラリア原虫抗原ＴＲＡＰをコードしている組換えＤＮＡプラスミドまたは非複製または複製欠陥組換えポックスウイルスベクター；および全または実質的に全部のＴＲＡＰのようなタンパク質抗原、およびマラリアからのＣＴＬエピトープのような配列中の二つまたはそれ以上のエピトープの列から成る組換えポリペプチド。
【００４９】
実施例処方および免疫化プロトコール
処方１
初回刺激組成物： ＤＮＡプラスミド１ｍｇ／ｍｌＰＢＳ溶液
追加刺激組成物： 組換えＭＶＡ、１０8ｆｆｕ ＰＢＳ溶液
プロトコール：初回刺激組成物の１ｍｇをｉ．ｍ．で０および３週に２回、続いて追加刺激物を６および９週に皮内に投与する。
処方２
初回刺激組成物： Ｔｙ−ＶＬＰ ＰＢＳ溶液
追加刺激組成物： ＭＶＡ、１０8ｆｆｕ ＰＢＳ溶液
プロトコール：初回刺激組成物をｉ．ｍ．で０および３週に２回、続いて追加刺激物を６および９週に投与する。腫瘍処置のためには、ＭＶＡは最も有効な経路としてｉ．ｖ．で投与される。
処方３
初回刺激組成物： タンパク質５００μｇ＋アジュバント（ＱＳ−２１）
追加刺激組成物： 組換えＭＶＡ、１０8ｆｆｕ ＰＢＳ溶液
プロトコール：初回刺激組成物を０および３週に２回、続いて追加刺激物を６および９週にｉ．ｄ．で投与する。
処方４
初回刺激組成物： アデノウイルスベクター、１０9ｐｆｕ ＰＢＳ溶液
追加刺激組成物： 組換えＭＶＡ、１０8ｆｆｕ ＰＢＳ溶液
プロトコール：初回刺激組成物を皮内に０および３週に２回、続いて追加刺激物を６および９週にｉ．ｄ．で投与する。
【００５０】
上記の投与量およびプロトコールは保護を最大にするために変更されることもある。例えば、２週離すというよりも１から８週離して投与されてもよい。
本発明は以下の実施例でさらに説明されるであろう。
【００５１】
実施例
実施例１
材料および方法
エピトープ列の発生
マラリアエピトープ列は各々が表１に示されたような三つのエピトープをコードしている一連のカセットから作製された（カセットは各々の末端に制限酵素部位を含んでいる）。各々のカセットは四つの合成オリゴヌクレオチドから構築され、それらはお互いにアニールされ、クローニングベクター内へ結合され、続いてエラーが導入されていないことを検査するために配列決定された。個々のカセットは次に必要に応じてお互いに連結された。カセットＣの３’末端のＢａｍＨＩ部位はカセットＡの５’末端のＢｇｌII部位と融合され、両方の制限酵素部位を破壊して二つのカセット間に二つのアミノ酸スペーサー（ＧＳ）がコードされる。カセットＢ，ＤおよびＨは次に同一の方法で一列に連結された。ＣＡＢＤＨＦＥを含むより長い列も同じ方法で構築された。
【００５２】
【表１】
【００５３】
表１ マラリアエピトープ列に含まれている配列。各々のカセットは上に示されたエピトープから成っており（示された順序で）、カセット内のエピトープ間には追加の配列は存在しない。エピトープ列中のカセット間にＢａｍＨＩ／ＢｂｌII連結がＧＳをコードするようにＢｇｌII部位が５’末端におよびＢａｍＨＩ部位が３’末端に加えられた。ｐｂ９（Ｐ．ベルゲイ）、ＢＣＧ（結核菌）およびＴＴ（破傷風菌）を除いてすべてのエピトープは熱帯熱マラリア原虫抗原からのものである。表に示されたアミノ酸およびＤＮＡ配列はそれらが出てくる順序に配列ＩＤ番号：１から４０を持っている。
【００５４】
図１はマラリアエピトープカセットＣＡＢＤＨＦＥを持つＴｙ−ＶＬＰを発現するために使用された構築物を示している。ＣＴＬエピトープは熱帯熱マラリア原虫抗原ＳＴＡＲＰ（スポロゾイト スレオニンおよびアスパラギンに富むタンパク質）（ｓｔ）、ＬＳＡ−１（肝臓期抗原１）（１ｓ）、ＣＳＰ（スポロゾイト周囲タンパク質（ｃｐ）、ＴＲＡＰ（トロンボスポンジン関連付着タンパク質）（ｔｒ）、ＬＳＡ−３（肝臓期抗原３）（ｌａ）およびＥｘｐ−１（エキスポートされたタンパク質１）（ｅｘ）からのものである。ヘルパーエピトープは熱帯熱マラリア原虫ＣＳタンパク質、結核菌３８Ｋｄ抗原および破傷風毒素からのものである。ＮＡＮＰはＣＳからの抗体エピトープであり、ＡＭは熱帯熱マラリア原虫ＴＲＡＰからの付着モチーフである（Ｍｕｌｌｅｒら１９９３）。完全列の長さは表１の注に示されているように２２９アミノ酸であり、以下のアミノ酸配列である：ＭＩＮＡＹＬＤＫＬＩＳＫＹＥＤＥＩＳＹＩＰＳＡＥＫＩＧＳＫＰＮＤＫＳＬＹＫＰＫＤＥＬＤＹＫＰＩＶＱＹＤＮＦＧＳＡＳＫＮＫＥＫＡＬＩＩＧＩＡＧＧＬＡＬＬＭＮＰＮＤＰＮＲＮＶＧＳＨＬＧＮＶＫＹＬＶＫＳＬＹＤＥＨＩＬＬＭＤＣＳＧＳＩＧＳＤＰＮＡＮＰＮＶＤＰＮＡＮＰＮＶＱＶＨＦＱＰＬＰＰＡＶＶＫＬＱＦＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＧＳＹＬＮＫＩＱＮＳＬＭＥＫＬＫＥＬＥＫＡＴＳＶＬＡＧＬＧＳＮＡＮＰＮＡＮＰＮＡＮＰＮＡＮＰＤＥＷＳＰＣＳＶＴＣＧＫＧＴＲＳＲＫＲＥＧＳＧＫ［配列ＩＤ番号：４１］。
【００５５】
ＨＩＶエピトープ列もまたオリゴヌクレオチドをアニールすることで合成された。最後にＨＩＶおよびマラリアエピトープはＨＩＶエピトープ３’末端のＢａｍＨＩ部位をカセットＣＡＢ５’末端のＢｇｌII部位へ結合させてＨＭ列を形成させることにより融合された（表２）。
【００５６】
【表２】
【００５７】
表２ ＨＩＶまたはＳＩＶからのエピトープの配列はＨエピトープ列に含まれており図２に示されたように組み立てられた。表中のアミノ酸はそれらが出てくる順序に配列ＩＤ番号：４２から６４を持っている。
【００５８】
図２はＨ、ＭおよびＨＭタンパク質の図的概要を示している。ポリエピトープタンパク質の図的表現でのバーパターンは配列の起点を示している（表１および２参照）。個々のエピトープおよびそれらのＭＨＣ制限はタンパク質の上および下に示されている。ｐｂはＰ．ベルゲイタンパク質から誘導されたただ一つのエピトープである。Ｍタンパク質中のすべての他のエピトープは熱帯熱マラリア原虫のタンパク質に起源するものである：ｃｓ−スポロゾイト周囲タンパク質、ｓｔ−ＳＴＡＲＰ、ｌｓ−ＬＳＡ−１およびｔｒ−ＴＲＡＰ。結核菌のＢＣＧ−３８ｋＤａタンパク質；ＴＴ−破傷風毒素。
【００５９】
抗腫瘍ワクチンのため、マラリアおよびＨＩＶエピトープ列に類似した、ＣＴＬエピトープを含んでいるエピトープ列を発生させた。この腫瘍エピトープ列においては報告されたマウスＣＴＬエピトープがお互いに融合され：ＭＬＰＹＬＧＷＬＶＦ−ＡＱＨＰＮＡＥＬＬ−ＫＨＹＬＦＲＮＬ−ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ−ＩＰＮＰＬＬＧＬＤ［配列ＩＤ番号：６５］のアミノ酸配列を持つ腫瘍エピトープ列が作製された。ここに示されたＣＴＬエピトープはお互いに融合された。翻訳を開始させるために最初のアミノ酸メチオニンが導入された。
【００６０】
Ｔｙウイルス様粒子（ＶＬＰ）
カセットＣＡＢＤＨを含んでいるエピトープ列はＣ末端をＴｙＡタンパク質読み枠内融合するように酵母発現ベクター内へ導入された。ＴｙＡまたはＴｙＡ融合タンパク質が酵母内でこのベクターから発現された場合、タンパク質は自発的にウイルス様粒子を形成し、それはショ糖濃度勾配遠心分離により酵母の細胞質から分離できる。組換えＴｙ−ＶＬＰはこの方法で調製され、注射前にショ糖を除去するためにＰＢＳに対して透析された（Ｌａｙｔｏｎら１９９６参照）。
【００６１】
アデノウイルス
Ｅ１遺伝子の欠損した複製欠陥組換えアデノウイルスが本研究で使用された（ＭｃＧｒｏｒｙら１９８８）。アデノウイルスはＣＭＶ ＩＥプロモーター調節下で大膳菌β−ガラクトシダーゼを発現した。免疫化のためには、１０7ｐｆｕのウイルスが耳垂内に皮内で投与された。
【００６２】
ペプチド
ペブチドはＲｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（ＵＳＡ）から購入され、１０ｍｇ／ｍｌでＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）に溶解され、さらにＰＢＳで１ｍｇ／ｍｌに希釈された。実験に使用されたＣＴＬエピトープを含んでいるペプチドは表３に記載されている。
【００６３】
【表３】
【００６４】
表３中のアミノ酸はそれらが出てくる順序に配列ＩＤ番号：６６から７３を持っている。
【００６５】
プラスミドＤＮＡ構築物
多数の異なったベクターがＤＮＡワクチンを構築するために使用された。プラスミドｐＴＨは抗原コード配列およびウシ成長ホルモン転写終止配列の導入を可能にするため、ポリリンカーが続いたイントロンＡを持つＣＭＶ ＩＥプロモーターを含んでいる。本プラスミドはアンピシリン耐性遺伝子を運んでおり、大腸菌内では複製できるが哺乳動物細胞では複製できない。これは以下の抗原の各々を発現するＤＮＡワクチンを製作するために使用された：Ｐ．ブルゲイＴＲＡＰ、Ｐ．ブルゲイＣＳ、熱帯熱マラリア原虫ＴＲＡＰ、熱帯熱マラリア原虫ＬＳＡ−１（Ｃ末端の２７８アミノ酸のみ）、カセットＣＡＢＤＨを含んでいるエピトープ列、およびＨＭエピトープ列（ＨＩＶエピトープにカセットＣＡＢが続いたもの）。プラスミドｐＳＧ２は抗生物質耐性遺伝子を除いてｐＴＨと同じである。
【００６６】
ｐＳＧ２においてはｐＴＨのアンピシリン耐性電子はカナマイシン耐性遺伝子に置き換えられている。ｐＳＧ２は以下の抗原を発現するＤＮＡワクチンを製作するために使用された：Ｐ．ブルゲイＰｂＣＳＰ、マウス腫瘍エピトープ列、カセットＣＡＢＤＨおよびＨＭエピトープ列を含んでいるエピトープ列。プラスミドＶＩＪ−ＮＰはＣＭＶ ＩＥプロモーター制御下でインフルエンザ核タンパク質を発現する。プラスミドＣＭＶ−ＴＲＡＰおよびＣＭＶ−ＬＳＡ−１はｐＴＨ．ＴＲＡＰおよびｐＴＨ．ＬＳＡ−１に似ているが、ＣＭＶプロモーターのイントロンＡを含んでいない。プラスミドＲＳＶ．ＴＲＡＰおよびＲＳＶ．ＬＳＡ−１はＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０転写終止配列を含んでおり、テトラサイクリン耐性である。β−ガラクトシダーゼ特異的ＣＴＬ導入のため、プラスミドｐｃＤＮＡ３／Ｈｉｓ／ＬａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が使用された。すべてのＤＮＡワクチンはＱｉａｇｅｎプラスミド精製カラムを用いて大腸菌株ＤＨ５αから製造された。
【００６７】
組換えワクシニアウイルスの発生
組換えＭＶＡは最初に抗原配列をプラスミドｐＳＣ１１のようなウイルスプロモーターを持つシャトルベクター内へクローニングすることにより作製された（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら１９８５；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら１９８９）。Ｐ．ベルゲイＣＳおよび熱帯熱マラリア原虫ＴＲＡＰ、インフルエンザ核タンパク質およびＨＭおよびマウス腫瘍エピトープポリエピトープ列はＰ７．５プロモーター（Ｍａｃｋｅｔｔら１９８４）を用いて発現され、およびＰ．ベルゲイＴＲＡＰは強力合成プロモーター（ＳＳＰ；Ｃａｒｒｏｌｌら１９９５）を用いて発現された。次に、プロモーター、抗原コード配列およびマーカー遺伝子に隣接するウイルス配列をＭＶＡと組換えして組換え体が生成するように、シャトルベクターｐＳＣ１１またはｐＭＣＯ３が野生型ＭＶＡで感染させた細胞の形質転換に使用された。組換えウイルスはマーカー遺伝子（βグルクロニダーゼまたはβガラクトシダーゼ）を発現するので組換えウイルスを含んでいるプラークの同定が可能である。組換え体は免疫化に使用する前に繰り返してプラーク精製された。組換えＮＹＶＡＣ−ＰｂＣＳＰワクシニアは以前に報告されている（Ｌａｎａｒら１９９６）。ＰｂＣＳＰをコードしている組換えワクシニアの野生型またはウェスタンリザーブ（ＷＲ）株は以前に報告されている（Ｓａｔｃｈｉｄａｎａｎｄａｍら１９９１）。
【００６８】
細胞および培養培地
マウス細胞およびエプスタイン−ーバールウイルス形質転換チンパンジーおよびマカクＢ細胞（ＢＣＬ）は１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補給したＲＰＭＩで培養した。脾細胞は１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μＭ ２−メルカプトエタノールおよび１０ｍＭヘペスｐＨ７．２（Ｇｉｂｃｏ，ＵＫ）を加えたＭＥＭ培地中、示されたペプチド（最終濃度１μｇ／ｍｌ）で再刺激された。
【００６９】
動物
示された系統のマウス、６−８週齢はＨａｒｌａｎ Ｏｌａｃ（Ｓｈａｗｓ Ｆａｒｍ，Ｂｌａｃｋｔｈｏｒｎ，ＵＫ）から購入された。チンパンジーＨ１およびＨ２はＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｒｉｊｓｗｉｃｋ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓで研究された。マカクはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｘｆｏｒｄで研究された。
【００７０】
免疫化
マウスのプラスミドＤＮＡ免疫化は麻酔下、頸骨筋内へのＤＮＡの筋肉内免疫化により実施された。マウス筋肉は時によりＤａｖｉｓら（１９９３）により記載されているように免疫化の５−９日前に５０μｌの１ｍＭカルジオトキシン（Ｌａｔｏｘａｎ，Ｆｒａｎｃｅ）で前処理されたが、そのような前処置は免疫原性または保護効能には何の有意な影響も与えなかったことが観察された。マウスのＭＶＡ免疫化は筋肉内（ｉ．ｍ．）、静脈内（外側尾静脈内）（ｉ．ｖ．）、皮内（ｉ．ｄ．）腹腔内（ｉ．ｐ．）または皮下（ｓ．ｃ．）免疫化により実施された。チンパンジーＨ１およびＨ２のプラスミドＤＮＡおよびＭＶＡ免疫化は麻酔下で脚筋肉の筋肉内免疫化により実施された。これらのチンパンジー免疫化には、アジュバントとして１５マイクログラムのヒトＧＭ−ＣＳＦがプラスミドＤＮＡと同時に投与された。チンパンジーへの組換えＭＶＡ投与は獣医監督下での筋肉内免疫化によるものであった。組換えヒトＧＭ−ＣＳＦはＳａｎｄｏｚ（Ｃａｍｂｅｒｌｅｙ，ＵＫ）から購入された。遺伝子銃を用いるプラスミドＤＮＡ免疫化のため、ＤＮＡは金粒子上に沈殿させた。皮内送達のためには、二つの異なった型の遺伝子銃が使用された、ＡｃｅｌｌおよびＯｘｆｏｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ装置（ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）。
【００７１】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
ＣＤ８＋ Ｔ細胞は示されたペプチドエピトープおよびＭｉｙａｈａｒａら（１９９３）により記載されているようなＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いてインビトロ再刺激なしで免疫化マウスの脾臓で定量された。簡単に説明すると、９６−ウェルニトロセルロースプレート（Ｍｉｌｉｓｃｒｅｅｎ ＭＡＨＡ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ ＵＫ）を１５μｇ／ｍｌの抗マウスインターフェロン−γモノクローナル抗体Ｒ４（ＥＡＣＣ）のリン酸緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）５０μｌで被覆した。４℃で一夜インキュベーションした後、ウェルを一度ＰＢＳで洗い、１０％ＦＣＳを含む１００μｌのＲＰＭＩを用いて室温で１時間ブロックした。免疫化したマウスからの脾細胞は１ｘ１０7細胞／ｍｌで再懸濁し、二重に抗体被覆ウェルへ加え、連続的に希釈した。ペプチドは１μｇ／ｍｌの最終濃度で各々のウェルへ加えられた。ペプチドを加えない追加のウェルはインターフェロン−γ分泌のペプチド依存性のための対照として使用された。５％ＣＯ2中、３７℃で１２−１８時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳおよび水で６回洗浄した。ウェルは次に１μｇ／ｍｌのビオチニル化抗マウスインターフェロン−γモノクローナル抗体ＸＭＧ１．２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）ＰＢＳ溶液と、室温で３時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、１μｇ／ｍｌのストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼポリマー（Ｓｉｇｍａ）溶液５０μｌを室温で２時間加えた。５０μｌのアルカリ性ホスファターゼ結合体基質溶液（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を加えることによりスポットが現れた。スポット出現後、水で洗うことにより反応を停止させた。スポットの数が立体顕微鏡の助けを借りて決定された。
【００７２】
チンパンジー末梢血リンパ球のＥＬＩＳＰＯＴアッセイはヒトＣＤ８ Ｔ細胞を検出するために開発されたアッセイおよび試薬（Ｍａｂｔｅｃｈ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ）を用いる非常に類似した方法を使用して実施された。
【００７３】
ＣＴＬアッセイ
ＣＴＬアッセイはＡｌｌｓｏｐｐら（１９９６）により記載されているように、クロム標識標的細胞およびエフェクター細胞として培養マウス脾臓細胞を使用して実施された。チンパンジーまたはマカク細胞を用いるＣＴＬアッセイは、標的細胞としてＥＢＶ−形質転換自己由来チンパンジーまたはマカクＢ細胞株を使用し、Ｈｉｌｌら（１９９２）によりヒトＣＴＬの検出で記載されているように実施された。
【００７４】
Ｐ．ベルゲイ攻撃誘発
マウスは記載されているように（Ｌａｎａｒら１９９６）２００μｌのＲＰＭＩに含まれる２０００（ＢＡＬＢ／ｃ）または２００（Ｃ５７ＢＬ／６）のＰ．ベルゲイＡＮＫＡ株スポロゾイトの静脈内接種により攻撃誘発させた。これらのスポロゾイトは感染マウスへ給餌後、２０−２５日間１８℃に維持されたアノフェレス ステフェンシ蚊の唾液腺から切開された。血液期マラリア感染（免疫化の失敗を示している）は、攻撃誘発の５−１２日後に採られたギームザ染色血液塗抹標本中のＰ．ベルゲイの環形出現を観察することにより検出された。
【００７５】
熱帯熱マラリア原虫攻撃誘発
チンパンジーは２０，０００のアノフェレス ガンビエ蚊の唾液腺から切開されたＮＦ５４株熱帯熱マラリア原虫スポロゾイトの麻酔下での静脈内接種により攻撃誘発させた。これらのチンパンジーからの血液試料は、末梢血中の低レベルの熱帯熱マラリア原虫寄生虫の出現を検出するために攻撃誘発の５日後から毎日、顕微鏡および寄生虫培養により試験された。
【００７６】
Ｐ８１５腫瘍攻撃誘発
マウスは２００μｌのＰＢＳに含まれる１ｘ１０5Ｐ８１５細胞の静脈内接種により攻撃誘発させた。動物は生存率がモニターされた。
【００７７】
インフルエンザウイルス攻撃誘発
マウスはインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４の１００ヘマグルチニン化単位（ＨＡ）の静脈内接種により攻撃誘発させた。攻撃誘発後、動物は毎日秤量され、生存率がモニターされた。
【００７８】
四量体を用いたペプチド特異性ＣＴＬの決定
Ｍａｍｕ−Ａ*０１−重鎖およびβ2−ミクログロブリンから成る四量体複合体はＯｇｇら（１９９８）により記載されているように作製された。リーダーを持たないＭａｍｕ−Ａ*０１ ＭＨＣクラスＩ重鎖の細胞外部分は５’プライマーＭａｍｕＮｄｅｌ：５’−ＣＣＴ ＧＡＣ ＴＣＡ ＧＡＣ ＣＡＴ ＡＴＧ ＧＧＣ ＴＣＴ ＣＡＣ ＴＣＣ ＡＴＧ［配列ＩＤ番号：７４］および３’プライマー：５’−ＧＴＧ ＡＴＡ ＡＧＣ ＴＴＡ ＡＣＧ ＡＴＧ ＡＴＴ ＣＣＡ ＣＡＣ ＣＡＴ ＴＴＴ ＣＴＧ ＴＧＣ ＡＴＣ ＣＡＧ ＡＡＴ ＡＴＧ ＡＴＧ ＣＡＧ ＧＧＡ ＴＣＣ ＣＴＣ ＣＣＡ ＴＣＴ ＣＡＧ ＧＧＴ ＧＡＧ ＧＧＧ Ｃ［配列ＩＤ番号：７５］を用いてｃＤＮＡからＰＣＲ−増幅された。前者のプライマーはＮｄｅＩ制限部位を含み、後者はＨｉｎｄIII部位を含んでおり、ビオチニル化酵素ＢｉｒＡ基質ペプチドをコードしている。ＰＣＲ生成物はＮｄｅＩおよびＨｉｎｄIIIで切断され細菌発現ベクターｐＧＭＴ７ポリリンカーの同じ部位へ結合された。リーダーを持たないβ2−ミクログロブリンをコードしているアカゲザル遺伝子はプライマーＢ２ＭＢＡＣＫ：５’−ＴＣＡ ＧＡＣ ＣＡＴ ＡＴＧ ＴＣＴ ＣＧＣ ＴＣＣ ＧＴＧ ＧＣＣ ［配列ＩＤ番号：７６］およびＢ２ＭＦＯＲ：５’−ＴＣＡ ＧＡＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＴＡ ＣＡＴ ＧＴＣ ＴＣＧ ＡＴＣ ＣＣＡ Ｃ［配列ＩＤ番号：７７］を用いてｃＤＮＡからＰＣＲ−増幅され、同様ｐＧＭＴ７のＮｄｅＩおよびＨｉｎｄIII部位にクローン化された。両方の鎖とも大月易菌株ＢＬ−２１で発現され、封入体から精製され、ペプチドＣＴＰＹＤＩＮＱＭ［配列ＩＤ番号：５４］の存在下で再び折り畳まれ、ＢｉｒＡ酵素（Ａｖｉｄｉｔｙ）を用いてビオチニル化され、およびＦＰＬＣおよびｍｏｎｏＱイオン交換カラムで精製された。ビオチニル化され、再び折り畳まれたＭＨＣ−ペプチド複合体の量は、単量体複合体がコンホメーション感受性モノクローナル抗体Ｗ６／３２により最初に捕捉され、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）−結合ストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ）、続いてのＡＰの比色基質により検出されるＥＬＩＳＡアッセイにより見積もられた。四量体複合体の形成はフィコエリスリン（ＰＥ）−結合ストレプトアビジン（ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ；Ｓｉｇｍａ）を再折り畳まれ、ビオチニル化された単量体へ４：１のＭＨＣ−ペプチド：ＰＥ−ストレプトアビジンモル比で加えることにより誘導された。複合体は暗所で４℃にて保存された。これらの四量体は免疫したマカクの末梢血リンパ球（ＰＢＬ）中のＭａｍｕ−Ａ*０１／ｇａｇ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度を分析するために使用された。
【００７９】
実施例２
マウスにおける免疫原性研究
プラスモジウム ベルゲイおよびプラスモジウム ヨエリイのスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質中のエピトープに対するＣＴＬ誘導の以前の研究は異なった送達系による種々のレベルのＣＴＬ誘導を示している。プラスミドＤＮＡ（Ｓｅｄｅｇａｈら１９９４）、複製するワクシニアウイルスで追加刺激されたインフルエンザウイルス（Ｌｉら１９９１）、アデノウイルス（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら１９９７）および粒子送達系（Ｓｃｈｏｄｅｌら１９９４）で部分保護が報告されている。５０マイクログラムのＣＳタンパク質をコードしているプラスミドによる筋肉内でのマウス免疫化は、１回注射後にこれらのマウスの脾臓中に中程度のＣＤ８＋細胞およびＣＴＬ活性を生み出した（図３、４）。
【００８０】
比較のため、ＢＡＬＢ／ｃマウスの群（ｎ＝５）に、異なった株（ＷＲ、ＮＹＶＡＣおよびＭＶＡ、すべてＰ．ベルゲイＣＳＰを発現する）の組換えワクシニアウイルスが１０6ｆｆｕ／ｐｆｕで静脈内に注射された。ペプチド特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度が１０日後にＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定された。ＭＶＡ．ＰｂＣＳＰは百万脾臓細胞当たり１８１＋／−４８、ＮＹＶＡＣ２２１＋／−２７およびＷＲ９４＋／−１９（平均＋／−標準偏差）のペプチド特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を誘導した。これらの結果は驚くべきことに複製欠陥ワクシニアウイルスはＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の初回刺激において複製する株より優れていることを示している。次に、初回刺激で誘導されたこれら中程度のＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の追加刺激が同種のまたは異種のベクターを用いてプラスミドＤＮＡまたはＭＶＡで試みられた。低レベルのＣＤ８＋ Ｔ細胞が、ＣＳ組換えＤＮＡワクチン単独、組換えＭＶＡワクチン単独または組換えＭＶＡ続いての組換えＤＮＡによる２回の免疫化で観察された（図３）。非常に高レベルのＣＤ８＋ Ｔ細胞が、ＤＮＡ初回刺激免疫応答を組換えＭＶＡで追加刺激することにより観察された。群当たり１０匹のマウスを使用した第二に実験においてＤＮＡ／ＭＶＡ連鎖における促進された免疫原性が確認された：ＤＮＡ／ＭＶＡ ８５６＋／−２０１；ＭＶＡ／ＤＮＡ １６８＋／−７２；ＭＶＡ／ＭＶＡ ３４５＋／−９０；ＤＮＡ／ＤＮＡ ９２＋／−４６。それ故、ＣＳタンパク質をコードしている組換えプラスミドによる第一の免疫化および組換えＭＶＡウイルスによる第二の免疫化の連鎖により、免疫化後に最も高いレベルのＣＤ８＋ Ｔリンパ球応答が得られた。
【００８１】
図３は異なった免疫化法後のマラリアＣＤ８ Ｔ細胞ＥＬＩＳＰＯＴデータを示している。結果は百万脾臓細胞当たりのペプチド特異的Ｔ細胞の数として示されている。マウスは２週間隔で、Ｘ軸に示されているようなＰｂＣＳＰ−ＭＶＡウイルスかまたはＰｂＣＳＰ−ＭＶＡウイルスまたはこれらの二つの組み合わせで免疫され、最後の免疫化２週間後にｐｂ９マラリアエピトープに特異的な脾臓細胞の数がアッセイされた。各々の点は個々のマウスで測定されたスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数を示している。最も高いＣＤ８＋ Ｔ細胞レベルはプラスミドＤＮＡで初回刺激し、組換えＭＶＡウイルスで追加刺激することにより誘導された。これは逆の順序での免疫化（ＭＶＡ／ＤＮＡ）、２回のＤＮＡ免疫化（ＤＮＡ／ＤＮＡ）または２回のＭＶＡ免疫化（ＭＶＡ／ＭＶＡ）よりも免疫原性であった。それはまたＤＮＡおよびＭＶＡ免疫化が同時に行われたよりも（ＤＮＡ＋ＭＶＡ ２ｗ）、１回のＤＮＡ免疫化（ＤＮＡ ４ｗ）またはより早いまたはより遅い時間点での１回のＭＶＡ免疫化（ＭＶＡ ２ｗおよびＭＶＡ ４ｗ）よりも免疫原性であった。
【００８２】
図４は同じ抗原をコードしているプラスミドＤＮＡによる初回刺激に続いての組換えＭＶＡ免疫化により、マラリアＣＤ８ Ｔ細胞ＥＬＩＳＰＯＴおよびＣＴＬレベルが大いに追加刺激されることを示している。ＡおよびＣ。Ｐ．ベルゲイＣＳＰからのＫd制限ペプチドＳＹＩＰＳＡＥＫＩ［配列ＩＤ番号：６７］および大腸菌β−ガラクトシダーゼからのＬd制限ペプチドＴＰＨＰＡＲＩＧＬ［配列ＩＤ番号：６９］と１８時間インキュベートした新しい脾臓細胞でのγ−インターフェロンＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用してＢＡＬＢ／ｃマウスでＣＤ８＋ Ｔ細胞応答が測定された。ＥＬＩＳＰＯＴ計測数は対数スケールで表されていることに注意されたい。ＢおよびＤ。同じマウスからの脾臓細胞が、同じペプチド（１μｇ／ｍｌ）でのインビトロ再刺激６日後に、１００：１のエフェクター：標的比で通常の51Ｃｒ−放出アッセイによってもアッセイされた。
【００８３】
マウスはＰ．ベルゲイＣＳＰおよびＴＲＡＰ、ＰｂＣＳＰ単独、Ｐ．ベルゲイＣＴＬエピトープを含んでいるマラリアエピトープカセット（ｐＴＨ．Ｈで標識されている）、またはβ−ガラクトシダーゼを発現しているプラスミドＤＮＡで免疫された。１回のＤＮＡ免疫化２３日後のマウスで測定されたＥＬＩＳＰＯＴおよびＣＴＬレベルが各々ＡおよびＢに示されている。同じアッセイが初回刺激２週間後に同じ抗原を発現する１ｘ１０7ｆｆｕの組換えＭＶＡをさらに受けた動物で実施された。これらの動物におけるＥＬＩＳＰＯＴおよびＣＴＬレベルは各々ＣおよびＤに示されている。各々の棒は個々の動物からのデータを示している。
【００８４】
ＨＩＶおよびマラリアエピトープの両方を縦列に含むエピトープ列ＨＭの免疫原性の研究もまた着手された。このエピトープ列を用いてもまた再び、ＤＮＡワクチンによる免疫化に続いての組換えＭＶＡワクチンでの免疫化の場合に最も高いＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＣＴＬレベルが脾臓で発生した（表４、図５）。
【００８５】
【表４】
【００８６】
表４は示されたようなプラスミドＤＮＡおよびＭＶＡの異なった免疫化法後のＨＩＶおよびマラリアエピトープに特異的なＣＤ８＋ Ｔ細胞のレベルを測定するために実施されたＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示している。数字は百万脾臓細胞当たりのスポット形成細胞である。ＨＭエピトープ列は図２に示されている。すべての場合にＢＡＬＢ／ｃマウスが使用された。マラリアエピトープは図２および３のようなｐｂ９であった。ＨＩＶエピトープはＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩ［配列ＩＤ番号：５１］であった。免疫化用量は５０μｇのプラスミドＤＮＡまたは１０7フォーカス形成単位の組換えＭＶＡであった。すべての免疫化は筋肉内であった。免疫化１および２の間隔はすべての場合、１４−２１日であった。
【００８７】
図５はプラスミドＤＮＡおよび組換えＭＶＡを用いる種々の免疫化法により、マラリアおよびＨＩＶエピトープに対してＢＡＬＢ／ｃマウスで誘導されたＣＴＬ応答を示している。マウスは表３の注および方法で説明されているように筋肉内で免疫された。高レベルのＣＴＬ（２５：１のエフェクター／標的比で＞３０％の特異的溶解）がプラスミドＤＮＡで初回刺激しおよび組換えＭＶＡで追加刺激した後にのみマラリアおよびＨＩＶエピトープに対して観察された。この実験に使用された抗原はＨＩＶ−マラリアエピトープ列である。組換えＭＶＡはＭＶＡ．ＨＡと表示されており、このエピトープ列を発現するプラスミドＤＮＡはｐＴＨ．ＨＭと表示されている。種々のエフェクター−標的比での特異的溶解レベルが示されている。これらは二つのペプチドｐｂ９およびＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩ［配列ＩＤ番号：５１］による脾臓細胞のインビトロ再刺激５日後に決定された。
【００８８】
ＣＴＬを誘導する多数の送達系の比較がＡｌｌｓｏｐｐら（１９９６）により報告されている。組換えＴｙ−ウイルス様粒子（Ｔｙ−ＶＬＰ）および脂質の尾を付けたマラリアペプチドの両方が良好なＣＴＬ誘導を示したが、Ｔｙ−ＶＬＰは良好なＣＴＬ誘導のために１回の免疫化しか必要としないことでより優れていた。しかしながら、本明細書に示されているようにＴｙ粒子の２回投与さえもスポロゾイト攻撃誘発に対して有意な保護を誘導しなかった（表７、ライン１）。
【００８９】
Ｐ．ベルゲイのスポロゾイト周囲タンパク質をコードしている組換え修飾ワクシニアアンカラウイルスによる免疫化も良好なＣＴＬレベルを発生した。しかしながら、Ｔｙ−ＶＬＰによる第一の免疫化続いてのＭＶＡ ＣＳワクチンによる第二の免疫化によりより高いレベルのＣＤ８＋ Ｔ細胞応答が達成された（表５）。
【００９０】
【表５】
【００９１】
表５ 示されたようなＴｙ−ＶＬＰおよび組換えＭＶＡウイルスの異なった免疫化法後の、マラリアエピトープｐｂ９に特異的なＣＤ８＋ Ｔ細胞レベルを測定するために実施されたＥＬＩＳＰＯＴおよびＣＴＬアッセイの結果。ＣＴＬおよびＥＬＩＳＰＯＴのデータは異なった実験からのものである。ＥＬＩＳＰＯＴレベル（百万脾臓細胞当たりのスポット）は再刺激されない細胞で測定され、ＣＴＬ活性はインビトロでｐｂ９ペプチドにより再刺激された細胞における４０：１のエフェクター：標的比での特異的溶解として示されている。両方とも３匹のマウスでの平均レベルとして表されている。ＢＡＬＢ／ｃマウスがすべての場合に使用された。免疫化量は５０μｇのＴｙ−ＶＬＰまたは１０7ｆｆｕ（フォーカス形成単位）の組換えＭＶＡであった。すべての免疫化は筋肉内で行われた。免疫化１および２の間隔は１４−２１日であった。ＭＶＡ．ＨＭはカセットＣＡＢを含んでいる。
【００９２】
遺伝子銃によるＤＮＡ送達を用いる免疫応答の初回刺激および組換えＭＶＡを用いる追加刺激
免疫原性および攻撃誘発
組換えＭＶＡで追加刺激できる、皮内にプラスミドをＤＮＡ送達するための遺伝子銃の使用およびそれによる免疫応答の初回刺激が研究された。ＢＡＬＢ／ｃマウスは以下の投与法で免疫された：
Ｉ）２週間隔での３回のｐＴＨ．ＰｂＣＳＰ（免疫化当たり４ｍｇ）による遺伝子銃免疫化
II）２回の遺伝子銃免疫化に続く２週間後のＭＶＡｉ．ｖ．
III）１回の筋肉内ＤＮＡ免疫化に続く２週間後のＭＶＡｉ．ｖ．
三つの免疫化法の免疫原性はＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して分析された。
特異的Ｔ細胞の最も高い頻度は２回の遺伝子銃免疫化に続くＭＶＡｉ．ｖ．追加刺激および１回の筋肉内ＤＮＡ免疫化に続くＭＶＡｉ．ｖ．追加刺激で観察された（図６）。
【００９３】
図６は異なった免疫化法後のマラリアエピトープｐｂ９に対する特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞レベルを測定するために実施されたＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示している。ＢＡＬＢ／ｃマウスの群（ｎ＝３）は示されているように免疫された（ｇ．ｇ＝遺伝子銃）。すべての免疫化の時間間隔は１４日であった。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは最後の免疫化の２週間後に行われた。
【００９４】
異なったマウス系統における同一抗原に対するＣＴＬ誘導
二つのＣＴＬエピトープ（Ｐ．ベルゲイから誘導されたＳＹＩＰＳＡＥＫＩ［配列ＩＤ番号：６７］およびＨＩＶから誘導されたＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩ［配列ＩＤ番号：６８］）によるＢＡＬＢ／ｃマウスでの前記の追加刺激効果が普遍的な現象であるかどうかを追求するため、２組の実験が実施された。インフルエンザ核タンパク質に対するＣＴＬ応答は５つの近交マウス系で研究された。最初の実験において、インフルエンザ核タンパク質から誘導された公表されているマウスＣＴＬエピトープで研究された（表３参照）。三つの異なったＨ−２ハプロタイプ、ＢＡＬＢ／ｃおよびＤＢＡ／２（Ｈ−２d）、Ｃ５７ＢＬ／６および１２９（Ｈ−２d）；ＣＢＡ／Ｊ（Ｈ−２d）のマウスが使用された。動物の一つの組はインフルエンザ核タンパク質をコードしているプラスミドＶ１Ｊ−ＮＰを用いて２週間隔で２回免疫された。同一動物の別の組はＶ１Ｊ−ＮＰで初回刺激され、２週間後にインフルエンザウイルスＮＰを発現している１０6ｆｆｕのＭＶＡ．ＮＰを用いて静脈内で追加刺激された。個々のマウスのＣＴＬレベルはペプチド再刺激された脾臓細胞の51Ｃｒ放出アッセイで決定された。図７に示されているように、ＤＮＡ初回刺激／ＭＶＡ追加刺激免疫化法が分析されたすべてのマウス系においてより高いレベルの溶解を誘導し、２回のＤＮＡ注入よりも優れている。
【００９５】
図７は異なったマウス系統におけるインフルエンザＮＰに対するＣＴＬ応答を示している。異なった系統のマウスは２週離して２回インフルエンザ核タンパク質をコードしているＤＮＡワクチンＶ１Ｊ−ＮＰで免疫されるか（白丸）、または同じＤＮＡワクチンで初回刺激され、インフルエンザウイルス核タンパク質を発現している組換えＭＶＡで追加刺激された（黒丸）。最後の免疫化から２週間後、各々のペプチドを用いてインビトロで脾臓細胞が再刺激された（表３）。ＣＴＬ活性はＭＨＣクラスＩ−致標的細胞を用いる標準51Ｃｒ−放出アッセイで決定された。
【００９６】
異なったマウス系統における異なった抗原に対するＣＴＬ誘導
プラスミドＤＮＡ初回刺激免疫応答に対するＭＶＡ追加刺激効果はさらに異なった抗原および異なった近交マウス系を用いて研究された。異なった系統のマウスは２回のＤＮＡ免疫化を用いる異なった抗原で免疫され、ＤＮＡ／ＭＶＡ免疫化と比較された。使用された抗原は大腸菌β−ガラクトシダーゼ、マラリア／ＨＩＶエピトープ列、マウス腫瘍エピトープ列および熱帯熱マラリア原虫ＴＲＡＰであった。二つのＤＮＡ免疫化を比較すると、ＤＮＡ初回刺激／ＭＶＡ追加刺激法がすべての異なったマウス系および試験された抗原の組み合わせでより高いレベルのＣＴＬを誘導した（図８）。
【００９７】
図８は異なった近交マウス系で誘導された異なった抗原に対するＣＴＬ応答を示している。マウスは２週間離して２回ＤＮＡワクチン免疫化で免疫されるか（白丸）、またはＤＮＡワクチンで初回刺激され、２週間後に同一の抗原を発現している組換えＭＶＡで追加刺激された（黒丸）。系統および抗原は以下の通りである：ＡではＣ５７ＢＬ／６；熱帯熱マラリア原虫ＴＲＡＰ。ＢではＤＢＡ／２；大腸菌β−ガラクトシダーゼ。ＣではＢＡＬＢ／ｃ；マラリアペプチド（ｐｂ９）に対するＨＭエピトープ列ＣＴＬ活性。ＤではＤＢＡ／２；ｐｂ９に対するＨＭエピトープ列ＣＴＬ活性。ＥではＢＡＬＢ／ｃ；ＨＩＶペプチドに対するＨＭエピトープ列ＣＴＬ活性。ＦではＤＢＡ／２；ＨＩＶペプチドに対するＨＭエピトープ列ＣＴＬ活性。ＧではＢＡＬＢ／ｃ；ＰＩＡ由来ペプチドに対する腫瘍エピトープ列ＣＴＬ活性。ＨではＤＢＡ／２；ＰＩＡ由来ペプチドに対する腫瘍エピトープ列ＣＴＬ活性。ペプチドエピトープの配列は表３に示されている。各々の曲線は個々のマウスからのデータを示している。
【００９８】
スポロゾイトは効果的に免疫応答を初回刺激でき、それはＭＶＡにより追加刺激可能である
マラリアが風土病である地域に住んでいるヒトは連続的にスポロゾイト接種に曝されている。マラリア特異的ＣＴＬはこれらの自然に曝されている個体においては低レベルであることが観察されている。低レベルのスポロゾイト誘導ＣＴＬ応答がＭＶＡにより追加刺激できるかどうかという問題を扱うため、ＢＡＬＢ／ｃマウスを照射した（マラリア感染を防ぐため）Ｐ．ベルゲイスポロゾイトで免疫し、ＭＶＡで追加刺激した。最後の免疫化から２週間後、脾臓細胞を再刺激して溶解活性を試験した。５０または３００＋５００スポロゾイトによる２回の注射では非常に低レベルまたは検出できないレベルの溶解しか誘導されなかった。
【００９９】
ＭＶＡによる追加刺激は高レベルのペプチド特異的ＣＴＬを誘導した。ＭＶＡ単独では中程度の溶解レベルのみを誘導した（図９）。
図９はスポロゾイト初回刺激ＣＴＬ応答がＭＶＡにより有意に追加刺激されることを示している。マウスはＡにおいては照射されたスポロゾイトの２回の低用量（５０＋５０）で、Ｂにおいてはスポロゾイトの２回の高用量（３００＋５００）で免疫された；マウスはＤでは低用量のスポロゾイト初回刺激、Ｅでは高用量のスポロゾイト初回刺激に続いてＭＶＡ．ＰｂＣＳＰで追加刺激された。ＭＶＡ．ＰｂＣＳＰでの免疫化後のＣＴＬ応答はＣに示されている。
【０１００】
初回刺激薬物としての組換えアデノウイルス
初回刺激−追加刺激免疫化法が初回刺激薬物としてプラスミドＤＮＡおよび組換えＴｙ−ＶＬＰを使用して例示されてきた。ここでは初回刺激薬物として非複製アデノウイルスを用いる例が提供される。大腸菌β−ガラクトシダーゼを発現する複製欠陥組換えアデノウイルス（Ａｄｅｎｏ−ＧＡＬ）が使用された。ＢＡＬＢ／ｃマウス群はプラスミドＤＮＡに続いてＭＶＡでまたはアデノウイルスに続いてＭＶＡで免疫された。使用されたすべての抗原送達系は大腸菌β−ガラクトシダーゼをコードしていた。プラスミドＤＮＡまたはアデノウイルスによるＣＴＬ応答の初回刺激およびＭＶＡによる追加刺激は類似のレベルのＣＴＬを誘導した（図１０）。
【０１０１】
図１０はプラスミドＤＮＡまたはアデノウイルスによる初回刺激およびＭＶＡによる追加刺激によるＣＴＬ応答を示している。ＢＡＬＢ／ｃマウス群（ｎ＝３）はプラスミドＤＮＡ（Ａ）またはβ−ガラクトシダーゼを発現する組換えアデノウイルス（Ｂ）で初回刺激された。プラスミドＤＮＡは筋肉内に、ＭＶＡは静脈内におよびアデノウイルスは皮内に投与された。脾臓細胞は最後の免疫化から２週間後にペプチドＴＰＨＰＡＲＩＧＬ［配列ＩＤ番号：６９］で再刺激された。ＣＴＬ活性はペプチドでパルス刺激したＰ８１５細胞で試験された。
【０１０２】
ＤＮＡ初回刺激、ワクシニア追加刺激法の免疫原性は使用されたワクシニアウイルス株の複製適性に依存している
複製適性が違う異なった株はＤＮＡ初回刺激ＣＴＬ応答を追加刺激する能力が異なっているかどうかを決定するために、組換えワクシニアウイルスの異なった株を使用して初回刺激−追加刺激法が試験された。ＭＶＡおよびＮＹＶＡＣのような複製欠陥組換えワクシニアウイルスによる追加刺激は、同量の複製適性ＷＲワクシニアウイルスによる追加刺激後のＣＴＬ応答と比較してより強いＣＴＬ応答の誘導を起こした（図１１）。
【０１０３】
図１１はプラスミドＤＮＡによる初回刺激、続いての異なった組換えワクシニアウイルスによる追加刺激によるＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＴＬ応答を示している。動物はｐＴＨ．ＰｂＣＳＰ（５０μｇ／マウス、ｉ．ｍ．）で初回刺激され、２週間後、ＰｂＣＳＰを発現する異なった株のワクシニアウイルス（マウス当たり１０6ｐｆｕ、ｉ．ｖ．）で追加刺激された。異なった組換えワクシニアウイルス株は、ＡではＭＶＡ、ＢではＮＹＶＡＣおよびＣではＷＲであった。複製株に対する複製欠陥ワクシニア株の優越性はさらなる実験でも観察された。ＢＡＬＢ／ｃマウス群（ｎ＝６）は５０μｇ／動物のｐＳＧ２．ＰｂＣＳＰ（ｉ．ｍ．）で初回刺激され、１０日後にＰｂＣＳＰを発現する１０6ｆｆｕ／ｐｆｕの組換えＭＶＡ、ＮＹＶＡＣおよびＷＲによりｉ．ｖ．で追加刺激された。ペプチド特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度はＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して決定された。頻度は：ＭＶＡ １１０３＋／−４３８、ＮＹＶＡＣ ８２６＋／−２４９およびＷＲ ４６８＋／−１３５であった。従って、ＣＤ８ Ｔ細胞免疫原性の尺度としてＣＴＬアッセイおよびＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いると、複製適性株と比較して複製欠陥ワクシニア株では驚くほど大きな免疫原性が観察された。
【０１０４】
ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を追加刺激するための組換えカナリアまたはニワトリポックスウイルスの使用
組換えカナリアポックスウイルス（ｒＣＰＶ）またはニワトリポックスウイルス（ｒＦＰＶ）は以前に記載されているシャトルベクターを使用して作製された（ＴａｙｌｏｒらＶｉｒｏｌｏｇｙ １９９２，１８７：３２１−３２８およびＴａｙ１ｏｒらＶａｃｃｉｎｅ １９８８，６：５０４−５０８）。これらのシャトルベクターのための戦略は、ＣＰＶまたはＦＰＶゲノムから誘導された配列から成る二つの隣接領域間のワクシニア特異的プロモーターの後ろに問題とするタンパク質をコードしている遺伝子を挿入することである。これらの隣接領域は必須ウイルス遺伝子内への挿入を避けるように選択される。組換えＣＰＶまたはＦＰＶは許容トリ細胞株（即ち、初代ニワトリ胎児線維芽細胞）でのインビボ組換えにより発生させた。任意の抗原またはエピトープ列のタンパク質配列がニワトリポックスまたはカナリアポックスウイルスを用いて発現できる。組換えＣＰＶまたはＦＰＶは抗原特異的抗体を用いて、または組換え遺伝子内へ抗体エピトープを含ませ、問題とするタンパク質の発現で特徴付けられる。組換えウイルスは初代ＣＥＦで増殖させる。免疫応答は、材料および方法で説明したようなプラスミドＤＮＡを用いて初回刺激される。このプラスミドＤＮＡ初回刺激免疫応答は、静脈内に、皮内に、または筋肉内に接種された１０7ｆｆｕ／ｐｆｕのｒＣＰＶまたはｒＦＰＶにより追加刺激される。ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答がモニターされ、攻撃誘発は前記のように実施された。
【０１０５】
実施例３
マウスにおけるマラリア攻撃誘発の研究
ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の誘導レベルの保護的効能を評価するため、免疫化ＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７ＢＬ／６マウスを２０００または２００のＰ．ベルゲイスポロゾイトの静脈注射により攻撃誘発した。このことはスポロゾイトによる肝臓細胞の感染を導く。しかしながら、肝臓内寄生虫に対する十分に強いＴリンパ球応答の存在下では生きている寄生虫は肝臓を離れないであろうので、血液期寄生虫は観察されないであろう。攻撃誘発の５−１２日後、攻撃誘発したマウスからの血液薄層は顕微鏡により寄生虫が評価された。
【０１０６】
Ｐ．ベルゲイのＣＳタンパク質およびＴＲＡＰ抗原をコードしている二つのプラスミドＤＮＡの混合物で２回免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスは、スポロゾイト攻撃誘発に対して保護されなかった。同じ二つの抗原をコードしている組換えＭＶＡウイルスの混合物で２回免疫されたマウスはスポロゾイト攻撃誘発に対して保護されなかった。最初に二つの組換えＭＶＡでおよび次に二つの組換えプラスミドで免疫されたマウスもスポロゾイト攻撃誘発に対して保護されなかった。しかしながら、最初に二つのプラスミドＤＮＡで、次に二つの組換えＭＶＡウイルスで免疫化された１５匹のマウスすべてがスポロゾイト攻撃誘発に対して完全に耐性であった（表６ＡおよびＢ）。
【０１０７】
観察された保護がＣＳ抗原またはＴＲＡＰまたはその両方に対する免疫応答によるものであるかどうかを評価するため、マウスの群が各々の抗原で別々に免疫された（表６Ｂ）。最初にＣＳプラスミドＤＮＡで、続いてＣＳ ＭＶＡウイルスで免疫された１０匹のマウスすべてがスポロゾイト攻撃誘発に対して完全に保護された。従って、前記の免疫化法が用いられる場合ＣＳ抗原単独で完全に保護的であり、ＴＲＡＰ抗原は同じ方法で実質上保護的である。
【０１０８】
ＣＤ８＋ Ｔ細胞リンパ球応答誘導レベルと保護の程度の間の良好な相関は、ＣＤ８＋応答が観察された保護に関係していることを強く示唆している。以前に採用された送達実験において、Ｐ．ベルゲイＣＳタンパク質中の主ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープに対するＣＤ８＋ Ｔリンパ球クローンは、スポロゾイト攻撃誘発を保護できることが示されている。誘導された保護が、このエピトープに対するＣＤ８＋ Ｔ細胞により本当に仲介されるのかどうかを決定するために、エピトープ列の一部としてＰ．ベルゲイからのこの９個のアミノ酸配列のみをコードしているプラスミドＤＮＡおよび組換えＭＶＡが用いられた（表６Ｂ）。（すべての他のエピトープはＰ．ベルゲイ以外の微生物からのものである。）最初にそのようなエピトープ列、続いて同様にＰ．ベルゲイＣＴＬエピトープを持つエピトープ列をコードしている組換えＭＶＡで１０匹のマウスを免疫化すると、スポロゾイト攻撃誘発から完全に保護された（表６Ｂ）。それ故、誘導された保護免疫応答は、このナノマーペプチド配列を標的とするＣＴＬ応答に違いないであろう。
【０１０９】
【表６】
【０１１０】
表６ 示されたようなプラスミドＤＮＡおよびＭＶＡの異なった免疫化法を用いた二つの攻撃誘発実験（ＡおよびＢ）の結果。すべての場合にＢＡＬＢ／ｃマウスが使用された。免疫化用量は５０μｇのプラスミドＤＮＡまたは１０6ｆｆｕの組換えＭＶＡであった。免疫化１および２の間隔はすべての場合１４−２１日であった。攻撃誘発は最後の免疫化から１８−２９日後に２０００のＰ．ベルゲイスポロゾイトを用いるｉ．ｖ．注射により実施され、血液薄膜は攻撃誘発後５、８および１０日目に評価された。ＣＳＰおよびＴＲＡＰは全Ｐ．ベルゲイ抗原を示しており、”エピトープ”とは単一のＰ．ベルゲイＫd制限ナノマーＣＴＬエピトープのみを含んでいる表１に示されたエピトープのカセットを示している。実験Ｂにおいてエピトープ列のみでの免疫化で１００％保護が得られたことに注目されたい。
【０１１１】
ｐｂ９をコードしている組換えＴｙ−ＶＬＰで２回免疫されたマウスは感染に対して完全に感受性であった。同様に、完全ＣＳタンパク質をコードしている組換えＭＶＡで２回免疫されたマウスは感染に対して完全に感受性であった。しかしながら、一度Ｔｙ−ＶＬＰで、続いて組換えＭＶＡで一度免疫されたマウスは、完全長ＣＳタンパク質を発現するＭＶＡで追加刺激された場合は８５％の、ｐｂ９を含むＨＭエピトープ列を発現するＭＶＡが追加刺激に使用された場合は９５％のマラリア発病率の減少を示した。
【０１１２】
【表７】
【０１１３】
表７ 示されたようなＴｙ−ＶＬＰおよびＭＶＡの異なった免疫化法を用いた攻撃誘発実験の結果。すべての場合にＢＡＬＢ／ｃマウスが使用された。免疫化では５０μｇのプラスミドＤＮＡまたは１０6ｆｆｕの組換えＭＶＡが静脈内に投与された。免疫化１および２の間隔はすべての場合１４−２１日であった。攻撃誘発は最後の免疫化から１８−２９日後に２０００のＰ．ベルゲイスポロゾイトによるｉ．ｖ．注射により実施され、血液薄膜は攻撃誘発後５、８および１０日目に評価された。ＣＳＰは全Ｐ．ベルゲイ抗原を示している。Ｔｙ−ＶＬＰは表１に示したようなエピトープカセットＣＡＢＤＨまたはＣＡＢＤＨＦＥを運んでいる。ＭＶＡ．ＨＭはカセットＣＡＢを含んでいる。
【０１１４】
組換えＭＶＡで追加刺激されることにより観察された促進された免疫原性および保護効能がこの特定のワクシニアウイルス株に独特のものかまたは他の組換えワクシニアと共有されているのかどうかを決定するため、以下の実験が実施された。マウスはＰ．ベルゲイＣＳタンパク質をコードしているＤＮＡワクチンで免疫され、（ｉ）この抗原をコードしている組換えＭＶＡ；（ｉｉ）同一の抗原をコードしている組換え野生型ワクシニアウイルス（ウェスタン リザーブ株）（Ｓａｔｃｈｉｄａｎａｎｄａｍら１９９１）、または（ｉｉｉ）同一のマラリア抗原をコードしている組換えＮＹＶＡＣ（ＣＯＰＡＫ）ウイルス（Ｌａｎａｒら１９９６）で追加刺激された。最も高程度の保護はＭＶＡ組換え体による追加刺激で観察された、８０％（表８）。非常に低レベルの保護（１０％）が野生型組換えワクシニアウイルスで、有意なレベルの保護（６０％）がＮＹＶＡＣ組換え体による追加刺激で観察された。それ故、記載した初回刺激−追加刺激法は任意の非複製ワクシニアウイルス株で保護的効能を誘導する。ＭＶＡ組換え体およびＮＹＶＡＣの両方がＷＲ株組換え体よりも有意に（各々Ｐ＜０．０５）良好であった。
【０１１５】
【表８】
【０１１６】
表８ 示されたようなプラスミドＤＮＡおよび種々のワクシニアの組み合わせの異なった免疫化法を用いた攻撃誘発実験の結果。すべての場合にＢＡＬＢ／ｃマウスが使用された。免疫化用量は５０μｇのプラスミドＤＮＡまたは１０6ｆｆｕ／ｐｆｕの組換えＭＶＡまたは１０4ｆｆｕ／ｐｆｕの組換え野生型（ＷＲ）ヮクシニアまたは１０6ｆｆｕ／ｐｆｕの組換えＮＹＶＡＣであった。ＷＲ株は宿主中で複製するであろうが他の株は複製しないであろうので、この実験においてはより低用量のＷＲが使用された。免疫化１および２の間隔は２３日であった。攻撃誘発は最後の免疫化から２８日後に２０００のＰ．ベルゲイスポロゾイトを用いるｉ．ｖ．注射により実施され、血液薄膜は攻撃誘発後７、９および１１日目に評価された。ｐｂＣＳＰは全Ｐ．ベルゲイ抗原を、およびＮＰはインフルエンザウイルスの核タンパク質抗原（対照抗原として使用された）を示している。グループＡの最初の免疫化は、非マラリア抗原であるベータガラクトシダーゼを発現するプラスミドＤＮＡベクターであった。
【０１１７】
表８に示されたさらなる実験において、マウスはＰ．ベルゲイＣＳタンパク質をコードしているＤＮＡワクチンで免疫され、（ｉ）この抗原をコードしている組換えＭＶＡ；（ｉｉ）同一の抗原をコードしている組換えＷＲワクシニアウイルス、または（ｉｉｉ）同一のマラリア抗原をコードしている組換えＮＹＶＡＣ（ＣＯＰＡＫ）ウイルスで追加刺激された（すべて１０6ｆｆｕ／ｐｆｕ）。高いおよび満足すべき程度の保護が組換えＮＹＶＡＣ（８０％）または組換えＭＶＡ（６６％）による追加刺激で観察された。低いおよび満足できないレベルの保護（２６％）がＷＲ組換えワクシニアウイルスによる追加刺激で観察された（表９）。ＭＶＡおよびＮＹＶＡＣ追加刺激は各々ＷＲ追加刺激より有意に高い保護を与えた（各々Ｐ＝０．０３およびＰ＝０．０１）。これらのデータは非複製ポックスウイルス株は高レベルの保護を誘導するためのより良好な追加刺激剤であることを再び強調している。
【０１１８】
【表９】
【０１１９】
表９ プラスミドＤＮＡおよび追加刺激免疫剤としての複製欠陥ワクシニア組換え体の異なった免疫化法を使用する攻撃誘発実験の結果。すべての場合にＢＡＬＢ／ｃマウスが使用された。免疫化用量は５０μｇのプラスミドＤＮＡまたは１０6ｆｆｕ／ｐｆｕの組換えＭＶＡまたは組換え野生型（ＷＲ）ワクシニアまたは組換えＮＹＶＡＣであった。免疫化１および２の間隔は２３日であった。攻撃誘発は最後の免疫化から２８日後に２０００のＰ．ベルゲイスポロゾイトを用いるｉ．ｖ．注射により実施され、血液薄膜は攻撃誘発後７、９および１１日目に評価された。ｐｂＣＳＰは全Ｐ．ベルゲイ抗原を、およびＮＰはインフルエンザウイルスの核タンパク質抗原（対照抗原として使用された）を示している。対照免疫化はβ−ガラクトシダーゼを発現するプラスミドＤＮＡベクター、続いてＭＶＡ．ＮＰによるものであった。
【０１２０】
組換えＭＶＡによる免疫応答追加刺激のための別の経路
組換えＭＶＡの静脈内注射はヒト免疫化には好適な経路ではなく、大量免疫化には実現不可能である。それ故、ＭＶＡ追加刺激の異なった経路での免疫原性および保護効能が試験された。マウスはプラスミドＤＮＡによりｉ．ｍ．で初回刺激された。２週間後、それらは以下の経路で投与されたＭＶＡで追加刺激された：静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）および皮内（ｉ．ｄ．）。この追加刺激２週間後、ペプチド特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞はＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより決定された。最も高いレベルを誘導した最も有効な経路はＭＶＡのｉ．ｖ．およびｉ．ｄ．接種であった。他の経路は中程度から弱い応答しか与えなかった（図１２）。
【０１２１】
図１２は異なった経路でＭＶＡを追加刺激した後のペプチド特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度を示している。結果は百万脾臓細胞当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数として示されている。マウスはプラスミドＤＮＡで初回刺激され、２週間後にＭＶＡを用いて示された経路で追加刺激された。ＳＹＩＰＳＡＥＫＩ［配列ＩＤ番号：６７］ペプチドに特異的な脾臓細胞の数が最後に免疫して２週間後にＩＮＦ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより決定された。各々の棒は個々にアッセイされた３匹のマウスからのＳＦＣの平均の数を表している。
【０１２２】
攻撃誘発実験においてｉ．ｖ．経路の追加刺激がｉ．ｄ．およびｉ．ｍ．経路と比較された。ｉ．ｄ．経路が高レベルの保護（８０％保護）を与えた。ｉ．ｍ．経路で追加刺激された動物の群では、５０％の動物が保護された。完全な保護はｉ．ｖ．で投与されたＭＶＡ追加刺激で達成された（表１０）。
【０１２３】
【表１０】
【０１２４】
表１０ 異なった経路のＭＶＡ追加刺激免疫化を用いた攻撃誘発実験の結果。
動物は筋肉内プラスミドＤＮＡ注射により初回刺激され、２週間後、示された組換えＭＶＡ（１０6ｆｆｕ／マウス）が示された経路により投与された。マウスは最後の免疫化から１６日後に２０００のＰ．ベルゲイスポロゾイトで攻撃誘発し、攻撃誘発の８および１０日後に血液期寄生虫血症がスクリーニングされた。エピトープはポリペプチド列ＨＭを示している。
【０１２５】
ＤＮＡ初回刺激の別経路：ペプチド特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を初回刺激するための遺伝子銃の使用
遺伝子銃送達は例えばＥｉｓｅｎｂｒａｕｎら ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９３，１２：７９１−７９７およびＤｅｇａｎｏら Ｖａｃｃｉｎｅ １９９８，１６：３９４−３９８に詳細に記載されている。
【０１２６】
免疫応答を初回刺激するためにプラスミドＤＮＡを使用するこれまで説明されてきたマウスマラリア攻撃誘発実験はプラスミドＤＮＡの筋肉内注射を使用した。バイオリスティック装置を使用するプラスミドＤＮＡの皮内送達は、特異的ＣＴＬ応答を初回刺激する別の経路である。プラスミドＤＮＡで金粒子を被覆し、遺伝子銃により皮内に送達された。マウス群（ｎ＝１０）は２週間間隔で３回、遺伝子銃のみで免疫化するか（４μｇ／免疫化）、遺伝子銃で２回、続いて静脈内ＭＶＡ．ＰｂＣＳＰ追加刺激により免疫するか、または５０μｇのｐＴＨ．ＰｂＣＳＰを用いて筋肉内で免疫されて２週間後にＭＶＡ．ＰｂＣＳＰが静脈内で追加刺激された。最後に免疫化して２週間後に、動物を２０００のスポロゾイトで攻撃誘発し、各々の免疫化法の保護効能を評価した。２回の遺伝子銃免疫化に続いて静脈内ＭＶＡ追加刺激を受けた群において、１０匹の動物のうち１匹が血液期寄生虫血症を発症した（９０％保護）。筋肉内ＤＮＡ追加刺激に続くＭＶＡｉ．ｖ．追加刺激により完全な保護が観察された。遺伝子銃により３回免疫された１０匹の動物のうち３匹が感染された（３０％保護）（表１１）。
【０１２７】
【表１１】
【０１２８】
表１１ ＤＮＡ初回刺激の異なった経路（遺伝子銃による皮内と筋肉内針注射）を比較している攻撃誘発実験の結果。ＢＡＬＢ／ｃマウス群（ｎ＝１０）は示されたように免疫された。各々の遺伝子銃免疫化は４μｇのプラスミドＤＮＡを表皮内へ送達した。ｉ．ｍ．免疫化では５０μｇのプラスミドＤＮＡが注射された。最後の免疫化から２０日後、マウスを前記のように攻撃誘発した。
【０１２９】
高感受性Ｃ５７ＢＬ／６マウスは保護される
Ｃ５７ＢＬ／６マウスはＰ．ベルゲイスポロゾイト攻撃誘発に対して非常に感受性である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは前赤血球抗原ＰｂＣＳＰおよびＰｂＴＲＡＰの両方によるＤＮＡ−ＭＶＡ初回刺激−追加刺激法を用いて免疫化され、マウス当たり２００または１０００の感染性スポロゾイトで攻撃誘発した（２００はこの系統での感染を誘導するために必要とされる量の２倍以上に相当する）。２００のスポロゾイトで攻撃誘発された１０匹のマウスすべてが滅菌免疫性を示した。１０００のスポロゾイトで攻撃誘発された群でさえも、６０％のマウスが保護された（表１２）。天然のままのＣ５７ＢＬ／６マウスはすべてスポロゾイト攻撃誘発で感染された。
【０１３０】
【表１２】
【０１３１】
表１２ Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用した攻撃誘発実験の結果。動物はＤＮＡに続いたＭＶＡ初回刺激−追加刺激法を用いてＰｂＣＳＰおよびＰｂＴＲＡＰで免疫化された。１４日後、マウスを示されているようにＰ．ベルゲイスポロゾイトで攻撃誘発した。
【０１３２】
実施例４
マウスのさらに二つの疾患モデルにおけるＤＮＡ−初回刺激／ＭＶＡ−追加刺激法の保護効能
免疫原性研究に続いて、ＤＮＡ−初回刺激／ＭＶＡ−追加刺激法の保護効能が二つの追加のマウス攻撃誘発モデルで試験された。二つの攻撃誘発モデルはＰ８１５腫瘍モデルおよびインフルエンザＡウイルス攻撃誘発モデルであった。両方のモデル系においてＣＴＬが保護を仲介していることが示された。
【０１３３】
Ｐ８１５腫瘍攻撃
ＤＢＡ／２マウス群（ｎ＝１０）はＤＮＡ、続いてＨＭエピトープ列の腫瘍エピトープ列を発現するＭＶＡの組み合わせで免疫された。最後の免疫化から２週間後、マウスは１０5のＰ８１５細胞の静脈内投与で攻撃された。この攻撃後、マウスは定期的に腫瘍関連徴候および生存率でモニターされた。
【０１３４】
図１３は二群のマウスの生存率を示している。攻撃６０日後、腫瘍エピトープ列で免疫された群では１０匹のマウスの内８匹が生き残っていた。ＨＭエピトープ列で免疫された群では２匹のみしか生き残っていなかった。この結果は統計的に有意である：２／１０対８／１０カイ２乗＝７．２。Ｐ＝０．００７。腫瘍エピトープ列で免疫された動物群における死の始まりはＨＭエピトープ列で免疫された群と比較すると遅くなっている。
【０１３５】
インフルエンザウイルス攻撃誘発
ＢＡＬＢ／ｃマウス群はプラスミドＤＮＡによる３回の遺伝子銃免疫化、２回の筋肉内プラスミドＤＮＡ注射、１回のｉ．ｍ．ＤＮＡ注射に続く１回のＭＶＡ．ＮＰ追加刺激ｉ．ｖ．または２回の遺伝子銃免疫化に続く１回のＭＶＡ．ＮＰ追加刺激ｉ．ｖ．で免疫された。プラスミドＤＮＡおよび組換えＭＶＡはインフルエンザウイルス核タンパク質を発現した。最後の免疫化から２週間後、マウスに鼻腔内で１００ＨＡのインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスを攻撃誘発した。動物は攻撃誘発後毎日生存でモニターした。
【０１３６】
完全保護が以下の動物群で観察された：
２回のＤＮＡ遺伝子銃免疫化に続く１回のＭＶＡ．ＮＰ追加刺激ｉ．ｖ．
１回のｉ．ｍ．ＤＮＡ注射に続く１回のＭＶＡ．ＮＰ追加刺激ｉ．ｖ．
２回のｉ．ｍ．ＤＮＡ注射。
【０１３７】
遺伝子銃で３回免疫した動物群では７１％の動物が生き残り（５／７）、対照とのこの差は統計的に有意ではなかった（Ｐ＞０．０５）。天然のままの群では２５％の動物が生き残り（図１４）、この群は二つの完全保護群と有意に異なっていた（Ｐ＜０．０５）。
【０１３８】
図１４はインフルエンザウイルス攻撃誘発実験の結果を示している。ＢＡＬＢ／ｃマウスは示されているように免疫された。ＧＧ＝遺伝子銃免疫化、ｉｍ＝筋肉内注射、ｉｖ＝静脈内注射。動物の生存を攻撃誘発後毎日モニターした。
【０１３９】
第二の実験において、１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスはＭＶＡ．ＮＰｉ．ｖ．のみ、３回の遺伝子銃、２回の遺伝子銃に続く１回のＭＶＡ．ＮＰ追加刺激ｉ．ｖ．および２回のＶＩＪ−ＮＰｉ．ｍ．注射に続く１回のＭＶＡ．ＮＰ追加刺激で免疫された。最後の免疫化から２週間後、マウスに１００ＨＡのインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスを攻撃誘発した。
【０１４０】
完全および統計的に有意な保護が以下の動物群で観察された： ２回の遺伝子銃免疫化に続く１回のＭＶＡ．ＮＰ追加刺激 ２回のＶＩＪ−ＮＰｉ．ｍ．注射に続く１回のＭＶＡ．ＮＰ追加刺激。
【０１４１】
１回のＭＶＡ．ＮＰｉ．ｖ．を受けた群は３０％（１０匹の内の３匹）の動物が生き残った。３回の遺伝子銃によるＤＮＡワクチン送達により免疫された群は７０％の動物が保護されたが天然のままの対照とは有意に異なっていなかった。この攻撃誘発実験において、４０％（１０匹の内の４匹）の天然のままの動物が攻撃誘発から生き残った。
【０１４２】
実施例５
非ヒト霊長類での免疫原性研究非ヒト霊長類での初回刺激追加刺激法の免疫原性および保護効能
マウスで観察されたＤＮＡ初回刺激／ＭＶＡ追加刺激法の強力な免疫原性が、霊長類でも強力な免疫原性を誘導することを示すために、本方法がマカクにおいて試験された。ワクチンはＨＩＶおよびＳＩＶ配列から誘導されたＣＴＬエピトープの列から成っており、プラスミドＤＮＡまたはＭＶＡにおいては各々ＤＮＡ．ＨおよびＭＶＡ．Ｈと表示されている。ポリエピトープ列中での定義されたＣＴＬエピトープの使用はマカクにおけるＳＩＶ特異的ＣＴＬを試験することを可能にする。抗原性ペプチドのＭＨＣクラスＩ制限のため、マカクはそのＭＨＣクラスＩハロタイプでスクリーニングされ、Ｍａｍｕ−Ａ*Ａ０１陽性動物が記載された実験に選択された。
三匹の動物（ＣＹＤ，ＤＩおよびＤＯＲＩＳ）が下記の本免疫化法で免疫された
０週 ＤＮＡ（８μｇ、ｉ．ｄ．、遺伝子銃）
８週 ＤＮＡ（８μｇ，ｉ．ｄ．、遺伝子銃）
１７週 ＭＶＡ（５ｘ１０8ｐｆｕ、ｉ．ｄ．）
２２週 ＭＶＡ（５ｘ１０8ｐｆｕ、ｉ．ｄ．）。
【０１４３】
各々の動物からの血液が実験の０、２、５、８、１０、１１、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４および２５週に採取された。動物は二つの異なった方法を使用してＣＴＬの誘導がモニターされた。各々の採血で単離されたＰＢＭＣはエピトープ列中にコードされているペプチドを用いてインビトロで再刺激され、クロム放出細胞毒性アッセイにより自己由来ペプチドを持つ標的細胞を認識する能力が試験された。さらに、新しく単離されたＰＢＭＣは四量体を用いて抗原特異性ＣＤ８＋ Ｔ細胞が染色された。
【０１４４】
２回の遺伝子銃免疫化後、四量体染色を使用して非常に低レベルのＣＴＬが検出された（図１５）。第一のＭＶＡ追加刺激２週間後、三匹すべての動物が四量体染色を使用して検出されるようなペプチド特異的ＣＴＬを発現した（図１５）。これはインビトロ再刺激に続く中程度のＣＴＬ応答の検出で反映された（図１６、９週）。第二のＭＶＡ．Ａによる追加刺激は非常に高レベルのＣＤ８＋抗原特異的Ｔ細胞（図１５）およびまた非常に高レベルのエピトープ特異的細胞毒性Ｔ細胞（図１６、２３週）を誘導した。
【０１４５】
図１５は四量体を用いるＳＩＶ特異的ＭＨＣクラスＩ制限ＣＤ８＋ Ｔ細胞の検出を示している。三匹のＭａｍｕ−Ａ*Ａ０１陽性マカクは、示されたようなプラスミドＤＮＡ（遺伝子銃）続いてのＭＶＡ追加刺激により免疫された。Ｍａｍｕ−Ａ*Ａ０１／ＣＤ８二重陽性Ｔ細胞はＦＡＣＳ分析後に同定された。各々の棒は示された時間でのＭａｍｕ−Ａ*０１／ｇａｇエピトープに特異的なＣＤ８＋ Ｔ細胞のパーセントを示している。１パーセントのＣＤ８ Ｔ細胞は約５０００／１０6末梢血リンパ球に相当する。従ってこれらのマカクの末梢血中のエピトープ特異性ＣＤ８ Ｔ細胞レベルは、マラリア研究で免疫化されおよび保護されたマウスの脾臓で観察されたレベルと少なくとも同じ程度には高い。
【０１４６】
図１６はＤＮＡ／ＭＶＡ免疫化後のマカクにおけるＣＴＬ誘導を示している。
３匹の異なったマカク（ＣＹＤ、ＤＩおよびＤＯＲＩＳ）からのＰＢＭＣは１８、１９および２３週に単離され、インビトロでペプチドＣＴＰＹＤＩＮＱＭ［配列ＩＤ番号：５４］で再刺激された。ペプチドＣＴＰＹＤＩＮＱＭ［配列ＩＤ番号：５４］による２回の再刺激後、培養物はペプチド−パルス自己由来標的細胞に対するそれらの溶解活性が試験された。強いＣＴＬ活性が観察された。
【０１４７】
実施例６
チンパンジーでの免疫原性および攻撃誘発の研究
プラスミドＤＮＡによる最初の免疫化および続いての組換えＭＶＡによる免疫化の同様な方法が、より高等な霊長類において熱帯熱マラリア原虫マラリアに対して有効であることを示すため、２匹のチンパンジーで免疫化および攻撃誘発の研究が実施された。チンパンジーＨ１はイントロンＡなしでＣＭＶプロモーターから熱帯熱マラリア原虫ＴＲＡＰを発現するプラスミド（ＣＭＶ−ＴＲＡＰ）の５００μｇによる最初の免疫化を受けた。チンパンジーＨ２は、熱帯熱マラリア原虫ＬＳＡ−１遺伝子のＣ末端部分を発現するＣＭＶ−ＬＳＡ−１を同量受けた。両方のチンパンジーは続いての２ヶ月かけてさらに３回の免疫化を受けたが、その各々の免疫化は三つのプラスミドで行われた。Ｈ１は前記のＣＭＶ−ＴＲＡＰに、イントロンＡを持つＣＭＶプロモーターを使用してＴＲＡＰを発現するｐＨＴ−ＴＲＡＰが加えられ、より高い発現レベルが導かれた。Ｈ１はまたＲＳＶプロモーターからＬＳＡ−１のＣ末端部分を発現するＲＳＶ−ＬＳＡ−１も受けた。Ｈ２は第二、第三および第四の免疫化時にＣＭＶ−ＬＳＡ−１、ｐＴＨ−ＬＳＡ−１およびＲＳＶ−ＴＲＡＰを受けた。用量はいつも各々のプラスミド５００μｇであった。
【０１４８】
ＲＳＶプラスミドはそれらに含まれている抗原を発現しなかったことが後で発見され、従って、Ｈ１のみがＴＲＡＰを発現するプラスミドで、Ｈ２はＬＳＡ−１を発現するプラスミドで免疫された。
【０１４９】
これらのＤＮＡ免疫化の間および後のいくつかの時間点で細胞免疫応答のアッセイが実施され、最後のアッセイは４回目のＤＮＡ免疫化の３ヶ月後に実施されたが、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイまたはＣＤ８＋ Ｔ細胞のＣＴＬアッセイのどちらもマラリア特異的Ｔ細胞は検出できなかった。
【０１５０】
両方の動物は次に６週間の期間に渡って熱帯熱マラリア原虫ＴＲＡＰ抗原をコードしている組換えＭＶＡウイルスを１０8ｆｆｕの用量で３回免疫した。３回目の組換えＭＶＡ免疫化の直前および後にＴＲＡＰ抗原へのＴ細胞応答が、ラテックスビーズへ結合された全ＴＲＡＰタンパク質に対するＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して両方のチンパンジーで検出された。このアッセイはＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の両方を検出する。特異的ＣＤ８＋ Ｔ応答が両方の免疫化チンパンジーにおいて一連の短い８−１１アミノ酸ペプチドで探された。ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答のためのそのような分析は、チンパンジーＨ１でのみＣＤ８＋ Ｔ細胞が検出可能であったことを示した。これらのＣＤ８＋ Ｔリンパ球の標的エピトープは配列ＫＴＡＳＣＧＶＷＤＥＷ［配列ＩＤ番号：７８］のＴＲＡＰからの１１アミノ酸ペプチド（ｔｒ５７）であった。Ｈ１からのこれらのＣＤ８＋ Ｔ細胞はｔｒ５７ペプチドでパルス刺激した自己由来標的細胞に対しておよび組換えＰｆＴＲＡＰ−ＭＶＡウイルスが感染した自己由来標的細胞に対して溶解活性を持っていた。５００リンパ球当たり約１のこれらの特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の高い前駆体頻度が、最後のＭＶＡ免疫化から２ケ月後にＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いてチンパンジーＨ１の末梢血中に検出された。ＴＲＡＰを発現するプラスミドＤＮＡで初回刺激されなかったチンパンジーＨ２では特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答は明らかに検出されなかった。
【０１５１】
３回目のＰｆＴＲＡＰ−ＭＶＡ免疫化から２ヶ月後、攻撃誘発７日後にチンパンジーに確かに検出可能な血液期感染を起こすことが以前に観察されている数である２０００のスポロゾイトによりＨ１およびＨ２の攻撃誘発が実施された（Ｔｈｏｍａｓら１９９４、未発表データ）。攻撃誘発は熱帯熱マラリア原虫のＮＦ５４株で実施された。このことは重要で、なぜならプラスミドＤＮＡおよび組換えＭＶＡ中のＴＲＡＰ配列は、ＮＦ５４ ＴＲＡＰ対立遺伝子とは多数のアミノ酸相違を持つ熱帯熱マラリア原虫のＴ９／９６株からのものであるためである（Ｒｏｂｓｏｎら１９９０）。それ故、このスポロゾイト攻撃誘発は異種というよりも同種の寄生虫株で実施される。チンパンジーＨ２において、インビトロ寄生虫培養検出の使用によりスポロゾイト攻撃誘発７日後に予測されるように寄生虫が末梢血で検出可能であった。しかしながら、Ｈ１においては、培養での血液期寄生虫の出現は７日目から３日遅れた血液試料からであり、肝臓期感染に対するいくらかの保護効果と一致している。以前の候補マラリアワクチンの研究で、ヒトにおける末梢血中の寄生虫出現の遅れは肝臓の寄生虫密度の実質的減少に関係していると推定されている（Ｄａｖｉｓら１９８９）。従って、最初に熱帯熱マラリア原虫ＴＲＡＰプラスミドＤＮＡ、続いて組換えウイルスにより発現された同一の抗原により免疫されたチンパンジーＨ１は、強いＣＤ８＋ Ｔリンパ球応答および異種スポロゾイト攻撃誘発からのいくらかの保護の証拠を示した。
【０１５２】
考察
これらの実施例はヒトマラリア感染の齧歯動物モデルにおける高レベルの保護的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を誘導する、マラリアに対する免疫化のための新しい方法を示している。また、サブユニットワクチンを使用するスポロゾイト攻撃誘発に対する先例のない完全保護も示されている（ＣＳエピトープ含有ワクチンによるＤＮＡ初回刺激およびＭＶＡ追加刺激を用いて表６では３６匹のマウスの内３６匹が保護された）。ＤＮＡ初回刺激／ＭＶＡ追加刺激法を用いた保護的免疫応答の誘導がウイルス感染インフルエンザＡモデルおよび癌（Ｐ８１６腫瘍モデル）の二つの追加のマウスモデルで示された。ヒトでの使用のためのワクチンにより重要であるのは、この免疫化法はまた霊長類のＣＤ８＋ Ｔ細胞に対して高度に免疫原性であることである。強いＳＩＶ−ｇａｇ特異的ＣＴＬが、エピトープ列を発現するプラスミドＤＮＡおよびＭＶＡにより３匹のマカクの内の３匹で誘導された。誘導されたレベルはＳＩＶ感染動物で観察されたレベルに匹敵する。チンパンジー研究からのデータは、同じ免疫化法がより高等な霊長類で熱帯熱マラリア原虫に対する強いＣＤ８＋ Ｔリンパ球応答を誘導でき、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト攻撃誘発に対する保護のいくつかの証拠があることを示している。
【０１５３】
Ｔｙ−ＶＬＰはＰ．ベルゲイ齧歯動物マラリアに対して良好なレベルのＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導すると以前に報告されているが（Ａｌｌｓｏｐｐら１９９５）、この構築物単独では保護的ではない。ここで組換えＭＶＡ追加刺激による続いての免疫化はＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を非常に大きくし、高レベルの保護を発生させることが発見された（表７）。
【０１５４】
従来、組換えＭＶＡウイルスはマラリアワクチンとしての効能は評価されていない。組換えＭＶＡ単独では有意に保護的ではなく、また組換えＭＶＡによる初回刺激に続いての組換えプラスミドＤＮＡによる第二の免疫化も保護的でない。
【０１５５】
しかしながら、Ｔｙ−ＶＬＰまたはプラスミドＤＮＡによる最初の免疫化後の組換えＭＶＡによる第二の免疫化では印象的なレベルの保護が得られた。非組換えＭＶＡウイルスは天然痘に対する数千のヒトのワクチン接種に安全に使用されており、優れた安全性プロフィールを持っているようである。ワクシニアウイルスのこの株の増大した安全性および免疫原性の分子的基礎は分子研究により詳細に解明されている（Ｍｅｙｅｒら１９９１；Ｓｕｔｔｅｒら１９９４）。
【０１５６】
プラスミドＤＮＡはＰ．ヨエリイ齧歯動物マラリアのためのマラリアワクチンとして以前に試験されている。高レベル（しかし完全ではない）の保護がいくつかの系統で見られているが、他の系統のマウスでは多数回の免疫化後でさえもわずかな保護かまたは保護しないことが観察されている（Ｄｏｏｌａｎら１９９６）。プラスミドＤＮＡは熱帯熱マラリア原虫に対する免疫化法として提案されているが、これまで成功は達成されていない。本明細書に提供された証拠は、ヒトマラリア寄生虫熱帯熱マラリア原虫に対する保護的免疫性を誘導するための免疫化法にプラスミドＤＮＡが使用されるであろうことを示した最初の証拠である。
【０１５７】
本明細書に示された方法と類似の免疫化法は、ヒトにおける熱帯熱マラリア原虫に対する有用な保護的免疫性を誘導するために期待できる。齧歯動物またはチンパンジーで保護的免疫性を誘導するためにこれらの研究で用いられたワクチン構築物の五つは熱帯熱マラリア原虫配列を含んでおり、それ故熱帯熱マラリア原虫に対するヒト免疫化に使用できるであろうことに注意しなければならない。これらは１．熱帯熱マラリア原虫ＴＲＡＰプラスミドＤＮＡワクチン、２．熱帯熱マラリア原虫ＴＲＡＰ組換えＭＶＡウイルス、３．多数の熱帯熱マラリア原虫エピトープのエピトープ列、ならびに単一のＰ．ベルゲイＣＴＬエピトープをコードしているＴｙ−ＶＬＰ、４．３と同一のエピトープ列をコードしているプラスミドＤＮＡ、５．３および４の多くのマラリアエピトープを含むより長いＨＭエピトープ列をコードしている組換えＭＶＡである。同様に、ヒトクラスＩ分子のＨＩＶエピトープをコードしているプラスミドＤＮＡおよびＭＶＡは、ＨＩＶ感染に対する予防的または治療的免疫化に使用できる。
【０１５８】
これらの研究は、追加刺激として非複製または複製欠陥ポックスウイルスを用いる新規連続的免疫化法はマラリア寄生虫に対する強い保護的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導することができるという明瞭な証拠を提供した。実施例はポックスウイルスの複製株と比較されたＣＤ８＋ Ｔ細胞応答および保護の驚くほどのおよび本質的な促進を明瞭に示している。マラリア寄生虫からのＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープの免疫原性は他の抗原中のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープとは本質的に異なるべきと信じる理由はないので、本明細書に記載された免疫化法は他の疾患に対して価値のあるＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を発生させるのに有効であると証明されることが期待される。本免疫化法の決定的工程は前に存在しているＣＴＬ応答を追加刺激するための非複製または複製欠陥組換えポックスウイルスの使用である。ＣＴＬ応答は、ＤＮＡワクチンｉ．ｄ．およびｉ．ｍ．、組換えＴｙ−ＶＬＰ、組換えアデノウイルスおよび照射スポロゾイトのような異なった抗原送達系を使用して初回刺激できることが示されている。このことはＨＩＶ、インフルエンザウイルスおよび腫瘍に対するＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の発生で示されたデータにより支持される。他の疾患のいくつかの既知の例の中でＣＤ８＋ Ｔ細胞免疫応答が重要であるのは以下のものである：ＨＩＶ、単純ヘルペス、帯状ヘルペス、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、エプスタイン−バール、麻疹、デング熱およびＨＴＬＶ−１ウイルスにより；細菌結核菌およびリステリア種により；および原虫寄生体トキソプラズマおよびトリパノソーマにより起こされる感染および疾患。インフルエンザＡウイルスに対する保護的ＣＴＬ応答の誘導は図１４に示されている。さらに、本明細書で記載された免疫化法は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答が保護的役割を果たしている癌の形に対する免疫化で価値があると期待される。
【０１５９】
腫瘍に対してＤＮＡ初回刺激ＭＶＡ追加刺激法を使用した保護的ＣＴＬ応答の誘導は図１３に示されている。ヒトにおける特別の例にはメラノーマ、乳癌および結腸癌が含まれる。
【０１６０】
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【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】図１はマラリアエピトープカセットＣＡＢＤＨＦＥを持つＴｙ−ＶＬＰを発現するために使用された構築物を示している。
【図２】図２はＨ、ＭおよびＨＭタンパク質の図的概要を示している。
【図３】図３は異なった免疫化法後のマラリアＣＤ８ Ｔ細胞ＥＬＩＳＰＯＴデータを示している。
【図４】図４は同じ抗原をコードしているプラスミドＤＮＡによる初回刺激に続いての組換えＭＶＡ免疫化により、マラリアＣＤ８ Ｔ細胞ＥＬＩＳＰＯＴおよびＣＴＬレベルが大いに追加刺激されることを示している。ＡおよびＣ。Ｐ．ベルゲイＣＳＰからのＫd制限ペプチドＳＹＩＰＳＡＥＫＩ［配列ＩＤ番号：６７］および大腸菌β−ガラクトシダーゼからのＬd制限ペプチドＴＰＨＰＡＲＩＧＬ［配列ＩＤ番号：６９］と１８時間インキュベートした新しい脾臓細胞でのγ−インターフェロンＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用してＢＡＬＢ／ｃマウスでＣＤ８＋ Ｔ細胞応答が測定された。ＥＬＩＳＰＯＴ計測数は対数スケールで表されていることに注意されたい。ＢおよびＤ。
【図５】図５はプラスミドＤＮＡおよび組換えＭＶＡを用いる種々の免疫化法により、マラリアおよびＨＩＶエピトープに対してＢＡＬＢ／ｃマウスで誘導されたＣＴＬ応答を示している。
【図６】図６は異なった免疫化法後のマラリアエピトープｐｂ９に対する特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞レベルを測定するために実施されたＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示している。
【図７】図７は異なったマウス系統におけるインフルエンザＮＰに対するＣＴＬ応答を示している。異なった系統のマウスは２週離して２回インフルエンザ核タンパク質をコードしているＤＮＡワクチンＶ１Ｊ−ＮＰで免疫されるか（白丸）、または同じＤＮＡワクチンで初回刺激され、インフルエンザウイルス核タンパク質を発現している組換えＭＶＡで追加刺激された（黒丸）。
【図８】図８は異なった近交マウス系で誘導された異なった抗原に対するＣＴＬ応答を示している。マウスは２週間離して２回ＤＮＡワクチン免疫化で免疫されるか（白丸）、またはＤＮＡワクチンで初回刺激され、２週間後に同一の抗原を発現している組換えＭＶＡで追加刺激された（黒丸）。
【図９】図９はスポロゾイト初回刺激ＣＴＬ応答がＭＶＡにより有意に追加刺激されることを示している。マウスはＡにおいては照射されたスポロゾイトの２回の低用量（５０＋５０）で、Ｂにおいてはスポロゾイトの２回の高用量（３００＋５００）で免疫された；マウスはＤでは低用量のスポロゾイト初回刺激、Ｅでは高用量のスポロゾイト初回刺激に続いてＭＶＡ．ＰｂＣＳＰで追加刺激された。ＭＶＡ．ＰｂＣＳＰでの免疫化後のＣＴＬ応答はＣに示されている。
【図１０】図１０はプラスミドＤＮＡまたはアデノウイルスによる初回刺激およびＭＶＡによる追加刺激によるＣＴＬ応答を示している。ＢＡＬＢ／ｃマウス群（ｎ＝３）はプラスミドＤＮＡ（Ａ）またはβ−ガラクトシダーゼを発現する組換えアデノウイルス（Ｂ）で初回刺激された。プラスミドＤＮＡは筋肉内に、ＭＶＡは静脈内におよびアデノウイルスは皮内に投与された。脾臓細胞は最後の免疫化から２週間後にペプチドＴＰＨＰＡＲＩＧＬ［配列ＩＤ番号：６９］で再刺激された。ＣＴＬ活性はペプチドでパルス刺激したＰ８１５細胞で試験された。
【図１１】図１１はプラスミドＤＮＡによる初回刺激、続いての異なった組換えワクシニアウイルスによる追加刺激によるＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＴＬ応答を示している。
【図１２】図１２は異なった経路でＭＶＡを追加刺激した後のペプチド特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度を示している。
【図１３】図１３は二群のマウスの生存率を示している。攻撃６０日後、腫瘍エピトープ列で免疫された群では１０匹のマウスの内８匹が生き残っていた。
【図１４】図１４はインフルエンザウイルス攻撃誘発実験の結果を示している。ＢＡＬＢ／ｃマウスは示されているように免疫された。ＧＧ＝遺伝子銃免疫化、ｉｍ＝筋肉内注射、ｉｖ＝静脈内注射。動物の生存を攻撃誘発後毎日モニターした。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの標的抗原に対する保護的ＣＤ８＋ Ｔ細胞免疫応答を発生するためのキットであって、以下：
（ｉ） 標的抗原の一つまたはそれ以上のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源、ならびに医薬品として受容可能な担体から成る初回刺激組成物；および
（ｉｉ）初回刺激組成物のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープと同一である少なくとも一つのＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを含む標的抗原の一つまたはそれ以上のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源、ここでＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源は非複製または複製欠陥組換えポックスウイルスベクターである、ならびに医薬品として受容可能な担体から成る追加刺激組成物；
からなり、ただし、（ｉ）のエピトープ源がウイルスベクターであるならば、（ｉｉ）におけるウイルスベクターは異なったウイルスから誘導される、キット。
【請求項１】
少なくとも一つの標的抗原に対する保護的ＣＤ８＋ Ｔ細胞免疫応答を発生するためのキットであって、以下：
（ｉ） 標的抗原の一つまたはそれ以上のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源、ならびに医薬品として受容可能な担体から成る初回刺激組成物；および
（ｉｉ）初回刺激組成物のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープと同一である少なくとも一つのＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを含む標的抗原の一つまたはそれ以上のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源、ここでＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ源は非複製または複製欠陥組換えポックスウイルスベクターである、ならびに医薬品として受容可能な担体から成る追加刺激組成物；
からなり、ただし、（ｉ）のエピトープ源がウイルスベクターであるならば、（ｉｉ）におけるウイルスベクターは異なったウイルスから誘導される、キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公開番号】特開２００７−２３０４４（Ｐ２００７−２３０４４Ａ）
【公開日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２２１１４４（Ｐ２００６−２２１１４４）
【出願日】平成１８年８月１４日（２００６．８．１４）
【分割の表示】特願平１１−５０１８９０の分割
【原出願日】平成１０年６月９日（１９９８．６．９）
【出願人】（５０６２７７３３９）オクソン・セラピューティックス・リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月１４日（２００６．８．１４）
【分割の表示】特願平１１−５０１８９０の分割
【原出願日】平成１０年６月９日（１９９８．６．９）
【出願人】（５０６２７７３３９）オクソン・セラピューティックス・リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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