ＥＣＭ材料を伴う生分解性足場
生分解性足場に対して、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の不連続領域が付加される。これにより、ＥＣＭの再構築プロセスと、該足場が提供できる物理的特性の範囲を組合わせることが可能である。各利用分野について最適な離散ＥＣＭ材料の量は開示されており、この温度は包帯剤の中に等分布され、かくしてＥＣＭの濃度を不要に高くすることが回避される。ＥＣＭの効果に加えて、基本材料の多孔質構造は、細胞に対し内方成長のための構造を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生分解性層の中に取込まれたフレーク、繊維、粒子、粉末などの形をしたＥＣＭ材料を有する生分解性層を含む足場に関する。
【背景技術】
【０００２】
足場は、新しい機能的組織を形成するプロセスにおいて、細胞の組織、成長及び分化を誘導するために用いられる構造である。
【０００３】
組織の再構築という最終目的を達成するために、足場はいくつかの特定的必要条件を満たさなくてはならない。細胞及び栄養素の両方の構造全体を通した細胞の成長及び拡散を容易にするためには高い気孔率及び適当な気孔サイズが必要である。足場は、外科的除去の必要性なく周囲の組織により吸収される必要があるため、生分解性は不可欠である。
【０００４】
足場として使用するために数多くの異なる（天然及び合成、生分解性及び常在性）材料が調査されてきた。これらの材料の大部分は、生体再吸収可能な縫合糸としてすでに利用されているため、研究主題としての組織工学の到来以前に医療分野では知られてきたものである。これらの材料の例としては、コラーゲン又は一部の線形脂肪族ポリエステルがある。
【０００５】
しかしながら、実験室で作られた足場をインビボで試験した場合、恐らくは例えば成長因子などのいかなる生体シグナル分子も合成的に作られた足場内に見出されないという事実に起因して、これらの足場内へ容易に細胞が成長しないという状態が見られることが多い。
【０００６】
足場の生物学的特性を改善し創傷の治癒を促進するために、いくつかの研究所は合成足場に成長因子を付加し、創傷治癒に対する有利な効果を観察した。これらの刊行物の全てにおいて、単一の成長因子がシート又はヒドロゲル内に取込まれていた。検査された成長因子は、ＦＧＦ−２（１；２）、２５μｇ／ｃｍ2の濃度でテストされたβ−ＦＧＦ−２（２）、ＦＧＦ−１（３；４）、ＥＧＦ（５）（１４）、又は２μｇ／ｃｍ2の濃度のＴＧＦ−β（６；７）であった。温血脊椎動物からの無細胞細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が組織工学及び形成外科手術において広範に使用されている（８）。無細胞ＥＣＭが複数の成長因子を含有することが示されてきた（９−１１）。ＥＣＭは数多くの生体分子を含有し、濃縮されたＥＣＭのこのシートに細胞が容易に定着するということがわかっている（１２；１３）。今日市場にあるＥＣＭはヒト又はブタ由来のものである。細胞は組織から取出され、該組織はその後凍結乾燥されシートの形にカットされる。ブタ由来のシートは異なるサイズをしている。これらのシートの価格は非常に高い。これらのシートは、未水和状態ではかなり堅い。一例としては、Acell社製シートがある。Acell社は、創傷の治癒を加速するＥＣＭシート（膀胱マトリックス、ＵＢＭ）を販売している。かかるシート（７×５ｃｍ）は重さが約１００ｍｇであり、密度は約１９０ｍｇ／ｃｍ3である。
【０００７】
創傷におけるＥＣＭ又はＥＣＭタンパク質の使用は、既知である。これらの製品はシート又はヒドロゲルの形をしている。シート製品の例としては、Healthpoint社製のＯＡＳＩＳ（凍結乾燥されたブタのＥＣＭシート）及びWrightmedical社製のGraftjacket（凍結乾燥されたヒトＥＣＭシート）がある。シートは足場ならびにタンパク質の複合混合物の両方を創傷細胞に対して提供する。市販されているＥＣＭタンパク質含有非足場製品の例としては、発育中のブタの歯のＥＣＭからのタンパク質抽出物を含有するヒドロゲルであるMolnlycke社製のXelmaがある。
【発明の開示】
【０００８】
概要
本出願は、足場内にＥＣＭを取込んだ場合に、ＥＣＭの成長促進効果が維持されるということを開示している。我々は、ＥＣＭ材料を含有する足場を使用した場合、驚くべきことに、濃度が高くても優れた細胞形態を提供しないということを立証する。６０％未満の濃度が、最良の細胞形態及び分布を得るのに充分なものである。さらに、足場内の離散(discrete)ＥＣＭ材料の濃度を変動させることによって足場の物理的特徴が変化するものの、これらの変化は足場の材料によって左右されるということを示す。本出願は、滅菌の後ＥＣＭ材料の生物活性を維持する滅菌戦略を示すことにより、この知識を患者に活用するものである。
【０００９】
詳細な開示
本発明は、離散ＥＣＭ粒子を含む一時的複合材料足場に関する。
【００１０】
足場に対しＥＣＭの不連続領域を付加することにより、足場が提供できる一連の物理的特性（例えば強度、柔軟性、可動性、耐久性）とＥＣＭの再構築特性を組合せることが可能である。さらにかかる足場の価格は、粉末が無細胞ＥＣＭの生産に由来する廃棄物であること及び各利用分野のための離散ＥＣＭ材料の最適量を決定し包帯剤中に等分布させ、かくして無意味に高濃度のＥＣＭを回避することができることの両方の理由で、その他のＥＣＭ足場よりも低くなる。ＥＣＭの効果に加えて、基材の多孔質構造は、細胞に対し、内方成長のための構造を提供する。１実施形態においては、粒子、フレーク、繊維又は粉末といったような離散ＥＣＭ材料を添加することによりＥＣＭの不連続領域が得られる。
【００１１】
ＥＣＭ材料の不連続相というのは、その形態及び密度に関して、それらが包埋されている粉砕材料と区別されるＥＣＭの材料を意味する。これは、例５に見られるような組織学切片によって又は例６に見られる走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）によって実証することができる。ＥＣＭの不連続領域を付加することにより、ＥＣＭの濃度を制御することができる。例（例えば例２及び３）で示されているように、細胞の成長を最適化するためには濃度を制御することが重要である。
【００１２】
足場形成（例えばフリーズドライ）の前に足場に対しＥＣＭ材料を付加することが好ましい。このようにして、ＥＣＭ材料は、足場内に均質に分布させられる。すなわち、それが足場を固化するのにかかる時間内（例えば凍結中）で、ＥＣＭ材料の密度は、足場の１方の端部においてもう１方の端部よりも高い可能性がある。しかしながら当該状況においては、足場の中心の密度が０を上回るのであれば、均質な分布が足場を通したかかる密度勾配を許容する。かくして、好ましい実施形態は、ＥＣＭの不連続領域の濃度が２０％（ｗ／ｗ）〜６０％（ｗ／ｗ）の間にある、ＥＣＭの均質に分布した不連続領域を含む仮連続足場に関する。
【００１３】
当該状況下では、仮足場というのは、創傷部位から消滅するか、加水分解するか、破壊させられるか、生物分解済み／生物再吸収性／生物吸収性のものであるか、溶解させられるか又はその他の形で消失する足場を意味する。創傷から取り除くべきものが全くなくなるため、これは臨床的に極めて大きな利点を有する。従って、新たに形成された組織が仮足場の除去により乱されたり、ストレスを受けたりすることがない。足場は、利用分野に応じて、１日〜１０週間の間で破壊させられることが標準的に好ましい。開放創の利用分野では、足場が１〜１０日の間、例えば２〜７日の間に破壊されることが好ましい。本発明の１態様においては、足場は生分解性のものである。
【００１４】
１実施形態においては、該足場は、連続足場である。これは連続相の足場である。不連続領域を伴う連続足場は、結果として複合材料をもたらす。
【００１５】
その他の複合材料の場合と同様、これは、著しく異なる物理的又は化学的特性をもち、そして完成した構造内で分離した全く異なるものであり続ける、２つ以上の成分材料から作られる工学処理材料である。
【００１６】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は動物及びヒトの組織の非細胞部分である。このためＥＣＭは、細胞をとり囲む複合材料である。従って、ＥＣＭの不連続領域は細胞の無い領域であることが好ましい。無細胞領域は、物理的、酵素的及び／又は化学的方法を使用することによって得られる。細胞層は、例えば組織をこすり取ることで物理的に除去することができる。組織中で細胞を互いに引き離すためには、洗浄剤及び酵素を使用することができる。低浸透圧は組織内の細胞のバーストを誘発し、その結果脱細胞化プロセスを促すことになるため、水又はその他の低張溶液を使用することもできる。
【００１７】
無細胞領域を得るためのもう１つの方法は、足場マトリックスに対しＥＣＭ粉末（ＥＣＭの不連続領域）を付加することによるものである。細胞の構成要素が免疫原性応答をひき起こし得ることから、無細胞生成物は、移植された場合のあらゆる免疫拒絶のリスクを最小限におさえる。
【００１８】
ＥＣＭ中には、大まかに言って３つの主要な構成要素、すなわち繊維質要素（特にコラーゲン、エラスチン又はレチクリン）、リンクタンパク質（例えばフィブロネクチン、ラミニン）及び空間充てん分子（通常はグリコサミノグリカン）が存在する。ＥＣＭは、細胞を引きつけ、成長因子及びサイトカインのタンクとして役立つことにより、細胞増殖を促進するものとして知られている（９；１０）。創傷中で用いられる微粒子ＥＣＭを含有する仮足場には、創傷の縁部からの細胞ならびに循環血からの細胞が多く存在することになる。細胞が足場に侵入するにつれて、足場材料は分解され、場合によって、該足場は新しい組織で置換されることになる。
【００１９】
ＥＣＭの不連続領域の濃度は、好ましくは１５％（ｗ／ｗ）超、すなわち２０％（ｗ／ｗ）超、例えば３０％（ｗ／ｗ）超である。ＥＣＭの不連続領域の濃度は、好ましくは９５％（ｗ／ｗ）未満、すなわち９０％（ｗ／ｗ）未満、例えば８０％（ｗ／ｗ）未満又は７０％（ｗ／ｗ）未満である。本発明の特に好ましい実施形態においては、濃度は２０％（ｗ／ｗ）〜６０％（ｗ／ｗ）、例えば２０％（ｗ／ｗ）〜４０％（ｗ／ｗ）である。
【００２０】
ヒトの皮膚は、主にケラチノサイトによって形成されている表皮の上層を含む。表皮の下は、主に線維芽細胞により、ただしそれだけでなく内皮細胞によっても形成されている真皮がある。
【００２１】
線維芽細胞の成長を促進する場合、当該例（例えば例３）は、０％（ｗ／ｗ）から約６０％（ｗ／ｗ）までＥＣＭの濃度を増大させた結果として、足場の表面上の細胞数及び細胞の形態の顕著な改善がもたらされるということを示している。かくして、本発明の１つの態様は、線維芽細胞の成長を促進するための４０％（ｗ／ｗ）〜６０％（ｗ／ｗ）のＥＣＭを含む創傷ケアデバイスに関するものである。
【００２２】
ケラチノサイトの成長を促進する場合、ゼラチン足場を用いた当該例は、０％（ｗ／ｗ）から約２５％（ｗ／ｗ）までＥＣＭの濃度を増大させると、その結果として、（ケラチノサイトが行なうはずであるような）細胞が共に成長する能力、細胞形態及び総細胞数の顕著な改善がもたされる、ということを示している。しかしながら、ＥＣＭの濃度を４０％（ｗ／ｗ）超に増大させると、その結果、表面上の細胞数、その形態及び細胞数に関する細胞成長の促進が低減されることになる。かくして、本発明の１つの態様は、ケラチノサイトの成長を促進するための２０％（ｗ／ｗ）〜３０％（ｗ／ｗ）のＥＣＭを含む創傷ケアデバイスに関する。
【００２３】
本発明の創傷用包帯剤は多数の層を含むことができる。これらの層は、任意には全てＥＣＭを含む1つ以上の主分解性材料層を内含することができる。ＥＣＭが２つ以上の層内に取込まれている場合、層を横断して用量が変動する可能性がある。１実施形態においては、第１層は４０％（ｗ／ｗ）〜６０％（ｗ／ｗ）のＥＣＭを含む、第２層は２０％（ｗ／ｗ）〜３０％（ｗ／ｗ）のＥＣＭを含む。
【００２４】
もう１つの実施形態においては、足場は、異なる細胞型の成長刺激のために設計されている。すなわち、線維芽細胞の成長刺激のために最適な濃度は、４０％（ｗ／ｗ）〜６０％（ｗ／ｗ）のＥＣＭであり、内皮細胞のための最適な濃度は３０％（ｗ／ｗ）〜６０％（ｗ／ｗ）であり、一方ケラチノサイトの成長刺激のためには、最適な濃度は２０％（ｗ／ｗ）〜３０％（ｗ／ｗ）である。本発明の１つの実施形態は、４０％（ｗ／ｗ）〜６０％（ｗ／ｗ）のＥＣＭの不連続領域濃度をもつ繊維芽細胞の刺激用の第１の足場と２０％（ｗ／ｗ）〜３０％（ｗ／ｗ）のＥＣＭの不連続領域濃度をもつケラチノサイトの刺激用の第２の足場という２つの足場を含んで成る創傷ケアデバイスに関する。２０％（ｗ／ｗ）〜３０％（ｗ／ｗ）のＥＣＭ材料の不連続領域濃度をもつ第３の足場を創傷ケアデバイスに付加することが可能である。
【００２５】
当該データは、繊維芽細胞の成長の刺激のための４０％（ｗ／ｗ）〜６０％（ｗ／ｗ）のＥＣＭ不連続領域を含む足場の使用を可能にしている。当該データはまた、ケラチノサイトの成長の刺激のための２０％（ｗ／ｗ）〜３０％（ｗ／ｗ）のＥＣＭ不連続領域を含む足場の使用をも可能にしている。
【００２６】
繊維芽細胞の成長を促進する場合に、成長する繊維芽細胞がケラチノサイトの成長を含め、成長因子を排出することになる、というのが我々の経験上言えることである。従って、本発明の好ましい一態様は、ＥＣＭの不連続領域の濃度が４０％（ｗ／ｗ）〜５０％（ｗ／ｗ）の間である足場に関する。これによって、繊維芽細胞の成長は、ケラチノサイト成長が結果として促進され創傷が治癒されるような形で促進される。
【００２７】
足場構造中のＥＣＭの濃度は、重量／重量百分率として計算される。すなわち、濃度（ｗ／ｗ）＝ＭECM／ＭECM＋Mscaffold）×１００％であり、式中ＭECMはＥＣＭのグラム単位の質量であり、Mscaffoldは足場のグラム単位の質量（ＥＣＭは含まず）である。
【００２８】
溶解性足場（例えばＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ）においては、溶媒中に足場を溶解させ、ＥＣＭをろ過させる。フリーズドライの後、材料を秤量する。
【００２９】
不溶性足場の場合には、材料は適切な包埋材料（例えばパラフィン）の中に包埋され、統計学上代表的な数に区分化され、ＥＣＭのみを染色して足場材料は染色しない適切な染色液を用いて染色される。画像分析を用いて、ＥＣＭの量は、足場との関係において計算される。
【００３０】
好ましいＥＣＭ材料は、材料の組織源に由来する生物活性ＥＣＭ構成要素を含有する。例えば、これらの材料は、繊維芽細胞成長因子−２（塩基性ＦＧＦ）、形質転換成長因子−ベータ（ＴＧＦ−beta）及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を含有し得る。同様に、本発明のＥＣＭ基材が、例えば、1つ以上のコラーゲン、グリコサミノグリカン、糖タンパク質及び／又はプロテオグリカンを内含する付加的な生物活性成分を含有することも好まれる。ＥＣＭは、大部分がＩＶタイプのコラーゲン、ラミニン及びプロテオグリカンで構成される基底膜を内含し得る。本発明のＥＣＭ材料は、好ましくは、ブタ、ウシ及びヒツジを含む（ただしこれらに制限されるわけではない）食肉生産向けに飼育された動物から収穫された組織から調製される。組織供給源としては、その他の温血脊椎動物も有用であるが、食肉生産に使用される動物からこのような組織を入手できる可能性がより大きいことから、かかる組織が好ましいものとなっている。ガラカトシル、アルファ１，３ガラクトース（ＧＡＬエピトープ）を含まなくするように遺伝子工学処理されたブタを、ＥＣＭ材料の生産用の組織供給源として使用してもよい。好ましい実施形態においては、ＥＣＭはブタ由来のものとなる。
【００３１】
ＥＣＭ材料は、いかなる動物からでも得ることができる。これは腸組織、膀胱、肝臓、脾臓、胃、リンパ節又は皮膚に由来し得るが、これらに制限されるわけではない。ヒトの死体皮膚、ブタ膀胱粘膜下層（ＵＢＳ）、ブタ膀胱マトリックス（ＵＢＭ）、又はブタ小腸粘膜下層（ＳＩＳ）に由来するＥＣＭが特に好ましい。
【００３２】
好ましくは、ヒト組織は疾病の転移を最小限におさえるために回避される。従って、好ましい実施形態においては、ＥＣＭの不連続領域は動物の組織から得られる。種の類似性のため、温血哺乳動物からのＥＣＭを使用することが好まれる。
【００３３】
特定の好ましい実施形態においては、ＥＣＭの不連続領域はＵＢＭ（膀胱マトリックス）粒子である。ＵＢＭ材料は、ＥＣＭタンパク質の独特のカクテルを含み、これらのタンパク質のうち定量化されているのは次のわずかなものである：ＴＧＦ−β２９３±８ｐｇ／ｇ、ｂ−ＦＧＦ３８６２±１７０ｐｇ／ｇ及びＶＥＧＦ４７５±２２ｐｇ／ｇ（すなわちｐｇＶＥＧＦ／ｇＵＢＭ）。３ｍｇ／ｃｍ2という平均密度で、濃度は、ＥＣＭシート中のＴＧＦ−β：約０．９ｐｇ／ｃｍ2、ｂ−ＦＧＦ：１１．６ｐｇ／ｃｍ2そしてＶＥＧＦ１．４ｐｇ／ｃｍ2である。
【００３４】
本発明の１つの態様は、成長因子の一定の投薬を伴う足場を提供することにある。本発明において使用される足場の１つの特性は、多孔質基材内部でＥＣＭの不連続領域を分布させ、かくして細胞がＥＣＭを利用しやすくすることにある。細胞が足場基質を通って移動する場合、ＥＣＭの不連続領域はプロテアーゼ活性に曝露され、分解され、その結果としてＥＣＭの不連続領域から生物活性成分が放出されると考えられている（１４）。かくして、生物活性成分の放出を、使用期間全体を通して幾分か一定に保つことができ、かくして創傷床及び細胞に対して幾分か恒常な投薬を提供することができる。１つの実施形態においては、ＥＣＭの不連続領域は、仮足場の内部で均等に分布している。
【００３５】
ＥＣＭは、いくつかの微粒化された形態、例えば粒子、フレーク、繊維又は粉末といった形で得られる。これらは全て、ＥＣＭの不連続領域、すなわち離散ＥＣＭ材料とみなされる。
【００３６】
ＥＣＭの不連続領域の１つの好ましい形態はＥＣＭ粒子である。好ましくは、約１５０μｇの平均直径をもつ粒子である。これは、体積加重平均用のMalvern Instrument社製のMastersizer２００によって決定される。例えば、１００μｍの表面積加重平均は、３μｍの最小粒子、７５０μｍの最大粒子を有し得る。体積加重平均はこの場合２５０μｍとなる。
【００３７】
多孔質足場内でＥＣＭの不連続領域を分布させることにより、ＥＣＭの不連続領域からの大きな影響なく足場の物理的特性（例えば強度、柔軟性、可動性、耐久性）を最適化することが可能である。
【００３８】
ＥＣＭの有益な効果及び多孔質足場が提供することのできる物理的特性の両方を得るために、足場といったような創傷包帯剤の中に微粒子ＥＣＭを内含させることができ、これを再生医療（例えば軟組織、骨、軟骨、靭帯及び腱の再形成）又は歯科応用分野に使用することができる。この多孔質足場は好ましくは生分解性材料で作られているべきである。仮足場は、凍結乾燥された形態、繊維質形態（製織又は不織）、発泡形態又はフィルム形態のいずれかであり得る。全ての形態において、ＥＣＭの不連続領域は、多孔質／繊維質構造の外部及び内部表面の両方から細胞に接近可能である。
【００３９】
足場に使用される材料は、合成及び天然の両方の供給源に由来する、あらゆる生分解性材料であってよい。天然材料で構築された足場のうち、特に好ましいものは、細胞外マトリックスの誘導体に基づくものである。かかる材料の例としては、タンパク質材料、例えばコラーゲン又はフィブリン、及び多糖類材料、例えばキトサン又はグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）がある。
【００４０】
１実施形態においては、生分解性足場は、タンパク質含有物質から作られる。これは、タンパク質分解酵素による分解を可能にすることになる。かかる足場は、好ましくは、コラーゲン、ケラチン、フィブリン、エラスチン、ラミニン、ビメンチン、ビドロネクチン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン及びこれらの誘導体などといったタンパク質又はゼラチンといったような未変性タンパク質で作られる。
【００４１】
ゼラチン、フィブリン、ヒアルロン酸、コラーゲン、キチン、キトサン、ケラチン、アルギン酸塩、ＰＬＡ及びＰＬＧＡといったような重合体材料を用いて足場を作ることにより、組合せ及び修飾を通して足場の物理的特徴（強度、柔軟性、可とう性）を変動させることが可能である。
【００４２】
もう１つの実施形態においては、生分解性足場は、炭水化物／多糖類含有物質で作られている。こうして、多糖類の加水分解による分解及び酵素分解が可能となる。かかる足場は、好ましくは、多糖類、例えば硫酸ヘパラン、硫酸コンドロイチン、硫酸デルマタン、ヘパリン、硫酸ケラタン及びこれらの誘導体、アルギン酸塩、ＨＳＣセルロース及びヒルロース誘導体（ＣＭＣ）、一部のアルギン酸塩、キトサン、キチン、ペクチン及びペクチン誘導体、ヒアルロン酸及びプロテオグリカン（ムコ多糖類）及びこれらの誘導体で作られる。
【００４３】
もう１つの態様においては、仮足場は合成である。かかる足場は主として、酵素消化と組合わさった加水分解により分解される。これらの足場は、好ましくは、ＰＬＡ（ポリラクチド）、ＰＧＡ（ポリグリコリド）、ＰＬＧＡ（ポリ（ラクチド−コ−グリコシド））、ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ、Ｐ細胞（ポリカプロラクトン）、ポリオルトエステル、ポリジオキサノン、ポリ無水物、ポリヒドロキシアルカノアート、及び上述の材料の共重合体から成る群から選択された材料で作られている。
【００４４】
周知の天然足場／ゲルの例としては、コラーゲンベース（３；６）、フィブリンベース（４）、キトサンベース（１）又はゼラチンベース（２；７）のものがある。
【００４５】
一般に用いられる合成材料はＰＬＡ−ポリ乳酸である。これは、人体内で分解して、体内から容易に除去される天然に発生する化学物質である乳酸を形成するポリエステルである。類似の材料としてはポリグリコール酸（ＰＧＡ）及びポリカプロラクトン（ＰＣＬ）がある。その分解機序はＰＬＡのものと類似であるが、これらはＰＬＡに比べてそれぞれ、速い及び遅い分解速度を示す。かかるＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ重合体は以下の通りに合成可能である。すなわち、窒素雰囲気を伴うグローブボックス内のバイアルに対して、トルエン中の４％（ｗ／ｗ）のオクタン酸第一スズ、ＭＰＥＧ、ＤＬ−ラクチド、グリコシドを加える。バイアルを閉じ、加熱し、中味が澄んで均質になるまで振とうし、その後１分〜２４時間１２０〜２００℃のオーブン内に入れる。合成は、その後の精製を容易にするため適切な溶媒（例えばジオキサン）中の溶液内で行なうこともできる。次に窒素雰囲気を伴うグローブボックス内のバイアルに対しＭＰＥＧ、ＤＬ−ラクチド、グリコリド、４％の２−エチルヘキサン酸第一スズ及びジオキサンを加えて、上述の通りに処理する。
【００４６】
重合体は、以下の通りに精製することができる。すなわち、重合体を適切な溶媒（例えばジオキサン、テトラ、ヒドロフラン、グロロホルム、アセトン）の中に溶解させ、−４０℃の温度で非溶媒（例えば水、メタノール、エタノール、１−プロパノール又は２−プロパノール）中で攪拌しながら沈殿させる。重合体を沈降させ、溶媒を廃棄し、重合体を一晩４０℃〜１２０℃で真空オーブン内にて乾燥させる。
【００４７】
以上で例示した通り、足場の基材は、その組合せを含めて合成及び／又は天然由来の材料で作ることができる。従って、足場は、タンパク質、多糖類、及び合成重合体の組合せを含むことができる。
【００４８】
本発明において使用される足場の１つの機能は、細胞成長を促進するマトリックスを提供することにある。足場内への細胞の内方成長を促進するための１つの基準は、室温で固体である足場にある。すなわち、足場は固定した物理的構造つまり両連続相（bi-contiuous）構造を有する。この構造により、細胞は足場を通って移動し、新しい組織を形成する補助を受ける。
【００４９】
細胞成長を促進するためのもう１つの基準は、少なくとも細胞の移動を可能にする気孔率又は複数の開放気孔を有する足場にある。
【００５０】
気孔率は、Ｐ＝１−ρ（Ｖ／Ｍ）として定義づけされ、式中Ｐは足場の気孔率、ρは使用される重合体系の密度、Ｍは重量そしてＶは製造された足場の体積である。
【００５１】
本発明の１つの実施形態は、本書で記述される通りＥＣＭの不連続領域を含む多孔質足場に関する。実施例において例示される通り、５０％超の気孔率が細胞成長を可能にする。かくして、１つの好ましい実施形態において、ここで記述される通りの足場は、８０％超、さらには９０％超又は９５％といった気孔率を含む。
【００５２】
多孔質足場は、互いに連結された開放気孔を有することが好ましい。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態においては、仮足場は０．１〜８ｍｍの間、好ましくは０．３〜３ｍｍの間、さらに一層好ましくは０．５〜２ｍｍの間の厚みを有する。本発明の特に好ましい実施形態においては、生分解性層の厚みは約１ｍｍである。本発明の好ましい実施形態においては、生分解性層は創傷と直接接触している。
【００５４】
本発明に従う足場は、創傷包帯剤としての使用を目指したものである。創傷包帯剤において念頭におくべき１つの要因は、それを柔軟でかつ形状適合性を有するものにすることである。柔軟で形状適合性を有するものというのは、該状況下において、それが開放創に適用された場合に不快でも苦痛でもなく、例えば縁部が敏感な創傷周囲を切り開いたりストレスを加えたりせず、創傷の屈曲と共に包帯剤が湾曲することを意味する。こうして、創傷部域とＥＣＭ含有足場の直接的接触も確保される。
【００５５】
このような柔軟で形状適合性を有するマトリックスの一例としては、１〜２％（ｗ／ｗ）溶液中で調製されフリーズドライされたキトサンがある。結果は、柔軟な開放マトリックスすなわち相互連結された開放気孔を伴う足場である。このマトリックスは、同様に、細胞の成長及び遊走を可能にするのに充分な開放気孔を有する。
【００５６】
１組の実施形態においては、本発明に従った包帯剤は、急性創傷、火傷、慢性創傷及び／又は外科創傷のために使用される。
【００５７】
もう１つの実施形態においては、本発明に従った包帯剤は、美容整形手術で使用される。
【００５８】
関連する実施形態においては、ＥＣＭの不連続領域を含む足場は、再生医療（例えば軟組織、骨、軟骨、靭帯及び腱の再形成）又は歯科応用分野のために用いられる。
【００５９】
これらの用途の多くにおいて、本発明に従った包帯剤が滅菌されていることが必要条件である。本発明の１つの実施形態は、ＥＣＭの不連続領域を含む滅菌された仮連続足場に関する。これは標準的には、この製品が滅菌されていることが包装上にマーキングされている、バクテリアタイト包装されたＥＣＭの不連続領域を含む仮連続足場として表現される。実施例４で例示される通り、例えば放射線照射による滅菌は、（足場のタイプに応じて）ＥＣＭの生物学的効果を維持する。バクテリアタイト材料は当業者にとって周知のものである。
【００６０】
参考文献
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【実施例】
【００６１】
実施例１：ＥＣＭ粒子を伴う及び伴わない合成足場内の一次ヒト繊維芽細胞の内方成長
４０％（ｗ／ｗ）でＵＢＭ（Ａ細胞）粒子（平均直径約１５０μｍ）を含有する生分解性ポリエステルでできた足場を、細胞形態及び３Ｄ成長の試験において、ＥＣＭ粒子無しの足場と比較した。
【００６２】
メトキシポリエチレングリコール−ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（Ｍｎ２，０００〜３０，０００、Ｌ：Ｇ １：１）を、１．５％溶液になるまで１，４−ジオキサン中で溶解させた。ＵＢＭ含有足場については、３ｍｌの重合体溶液（４０％ｗ／ｗの乾燥物質）に０．０３ｇのＵＢＭを添加し、高速混合し、３×３ｃｍのモールド内に注ぎ込んだ。溶液を−５℃で凍結させ、５時間−２０℃及び約６０時間２０℃で凍結乾燥した。試料をその後５時間デシケータ内で陰圧状態に置く（油圧ポンプ）。
【００６３】
２つの足場の表面上の播種された一次繊維芽細胞の成長及び形態試験を評価した。
【００６４】
１日目、３日目及び７日目からの結果を１〜５に等級付けした。なお、１は最悪のケース、５は最良のケースに対応している。ＥＣＭ粒子と混合した足場内で、細胞の分布及び成長には全ての日に等級５が与えられ、これは対照足場（全ての日に等級２．５）よりも優れていた。
【００６５】
結論：粉末化されたＥＣＭマトリックスの生物活性は、合成足場内への取込み後も活性を保持しており、足場単独の場合と比べて、足場上ではるかに優れた成長をひき起こした。
【００６６】
実施例２：５つの異なる濃度のＥＣＭを含有するゼラチン−ＥＣＭ複合材料中の細胞の形態及び３Ｄ成長
ゼラチン−ＥＣＭ足場の表面上に播種された一次繊維芽細胞の細胞形態と３Ｄ成長の研究。
ゼラチン足場を加熱により架橋させ、ＵＢＬの漸増的濃度（０、１２％（ｗ／ｗ）、２６％（ｗ／ｗ）、４１％（ｗ／ｗ）、５１％（ｗ／ｗ）及び５８％（ｗ／ｗ））を含有していた。濃度を、総固体量との関係におけるＵＢＭ量として計算し、これはすなわち、５８％（ｗ／ｗ）の足場が０．０５ｇの重合体及び１３．８ｍｇのＵＢＭ／ｃｍ3に対応する０．０７ｇのＵＢＭを含有していることを意味していた。
【００６７】
タイプＡ、ブルーム１７５のブタの皮膚由来のゼラチン（Sigma）を、１％溶液となるまで、ｍｉｌｌｉ−Ｑ水及びｔ−ＢｕＯＨ（９５：５）中で溶解させた。ＵＢＭ含有試料については、攪拌しながらＵＢＭを溶液に加えた（０、１２、２６、４１、５１、５８％ｗ／ｗ；０、０．００７、０．０１８、０．０３５、０．０５３、０．０７ｇ／足場）。５ｍｌのＵＢＭ含有ゼラチン溶液をモールド（Ｄ＝５ｃｍ）内に注ぎ込んだ。溶液の入ったモールドを１時間＋５℃に置き、その後−２０℃で凍結させ、５時間−２０℃で、そして３６時間２０℃で凍結乾燥した。その後１５時間１２０℃の真空オーブン内で試料を架橋させた。
【００６８】
この研究は、複合足場中のＵＢＭの濃度を増大させることにより、ＵＢＭ無しの場合に比べ、繊維芽細胞がより良く分布させられ、より高い増殖速度を有することを示した。研究の最初の数日間は、ＵＢＭ無しの足場上では細胞が適用された部域内でのみ成長しており、一方ＵＢＭの濃度が２６％（ｗ／ｗ）超である足場の表面上では細胞がより良くかつより均等に分布していることが観察された。１４日以降は、ＵＢＭを含有する複合足場と比べてＵＢＭ無しのゼラチン足場ではより少ない数の細胞しか見られないことが明らかであった。細胞形態に関しては、繊維芽細胞は、素のゼラチン足場では丸味のあるただし接着性の形態を有していたが、ＵＢＭの量が増大するにつれて、増々繊維芽細胞様形態が観察された。４１％（ｗ／ｗ）のＵＢＭから、繊維芽細胞の最良の形態及び分布が観察された。４１％（ｗ／ｗ）超にＵＢＭの濃度を増大させることで、複合足場内の細胞の形態又は分布が良くなる結果とはならなかった。
【００６９】
実施例３：６つの異なる濃度のＥＣＭ粒子を保持するＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ又はゼラチンの複合足場の調製及びその中の細胞の形態及び３Ｄ成長
ゼラチン及びＥＣＭの複合足場の調製：タイプＡ、Gelita pharmagrade 832のブタの皮膚由来のゼラチンを、１％溶液となるまで、ｍｉｌｌｉ−Ｑ水及びｔ−ＢｕＯＨ（９５：５）中で溶解させた。ＵＢＭ含有試料については、攪拌しながらＵＢＭを溶液に加えた；０、０．００６、０．０１３、０．０２１、０．０３３、０．０５、０．０７５ｇ／足場（０、１０、２０、３０、４０、５０、６０％ｗ／ｗ）。５ｍｌのＵＢＭ含有ゼラチン溶液をモールド（Ｄ＝５ｃｍ）内に注ぎ込んだ。溶液の入ったモールドを１時間+５℃に置き、その後−２０℃で凍結させ、５時間−２０℃で、そして１８時間２０℃で凍結乾燥した。その後１５時間１３０℃の真空オーブン内で試料を架橋させた。
【００７０】
ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ及びＥＣＭすなわちメトキシ−ポリエチレングリコール−ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（Ｍｎ２，０００〜３０，０００、Ｌ：Ｇ １：１）の複合足場の調製を、１．５％溶液となるまで１，４−ジオキサン内で溶解させた。ＵＢＭ含有試料については、攪拌しながらＵＢＭを溶液に加え；０、０．０１７、０．０３８、０．０６４、０．１、０．１５、０．２２５ｇ／足場（０、１０、２０、３０、４０、５０、６０％ｗ／ｗ）、高速混合し、７．３×７．３ｃｍのモールド内に１０ｍｌ注いだ。溶液を−５℃で凍結させ、５時間−２０℃でそして約１５時間２０℃で凍結乾燥した。その後２４時間、試料をデンケータ中で陰圧状態（油圧ポンプ）に置いた。
【００７１】
複合足場の細胞形態及び３Ｄ成長を評価するために、各タイプの足場から生検材料を打ち抜き、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン及びアンフォテリシンＢ）を含有する少量の成長培地中２．５×１０4細胞／ｃｍ2の密度で（初代繊維芽細胞はＤＭＥＭ中の１０％ＦＣＣ中；ＨＵＶＥＣはＥＧＭ−２中；初代ケラチノサイトは、ＫＧＭ−２中）足場の表面上に、初代ヒト繊維芽細胞（継代３）、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、継代４）又は初代ケラチノサイト（継代５）と共に播種した。付加的な成長培地を添加する前に、５％ＣＯ2で３７℃で足場をインキュベートした。足場の細胞付着、形態、成長及び集団の評価を、ニュートラルレッドでの細胞の染色とそれに続くEvolution MP冷却カラーカメラ（Media Cybernetics）の取付けられたLeica ＤＭＩＲＥ2倒立顕微鏡を用いた評価により、実施した。Imsge Pro Plus 5.1ソフトウェア（Media Cybernetics）を用いてデジタル画像を取り込んだ。細胞毒性検出キット（ＬＤＨ、Roche Diagnostics GmbH）を使用することで細胞数を計算した。上述のものと同じやり方で異なる足場タイプの上面に３つの異なる濃度（１．２５×１０4、２．５×１０4及び５×１０4細胞／ｃｍ2）で細胞を播種した。平坦な振とう機上で４℃で２０時間０．５％のＣＨＡＰＳを用いて細胞溶解する前にＰＢＳで足場を洗浄することにより、１日目、３日目及び７日目に足場を評価した。上清をマイクロプレートに移送し、メーカの指示に従ってＬＤＨ量を測定した。
【００７２】
繊維芽細胞
繊維芽細胞の定量測定は、時間の増大につれての細胞数の増加を示したが、ゼラチン足場内のＵＢＭの異なる濃度の間にはいかなる影響も見られなかった（図１）。
【００７３】
ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場中では、細胞は時間及び足場中のＵＢＭの量の両方と共に増大していた（図２）。ＵＢＭ無しのゼラチン足場内の細胞の形態及び３Ｄ成長は、研究の最初の何日かの間、接着性細胞が丸味のある形態で成長しそれらが適用された場所にとどまっていることを示した。これらの細胞は研究の残りの部分の間に僅かであるがさらに紡錘状の形状になった。足場に対し１０％（ｗ／ｗ）のＵＢＭを添加してもこのパターンは変化しなかったが、２０％（ｗ／ｗ）のＵＢＭでは、漸増的数の細胞が、通常の繊維芽細胞様形態を伴う紡錘状細胞となり、細胞は表面上でより大きく広がり始めていた。３０〜４０％（ｗ／ｗ）で、紡錘状細胞の比の最大値が観察され、足場の表面上の細胞成長からより３Ｄの細胞形態を伴う足場の深さ方向への細胞成長への変化が見られた。ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ内では、ＵＢＭの濃度が増大すると足場の上及び中の細胞数が増大するというわずかな例外を除いて、同じパターンが観察された。２０〜３０％（ｗ／ｗ）のＵＢＭでは、細胞の広がりの増加が見られ、さらに多くの細胞が紡鐘状の形態を有していた。４０％（ｗ／ｗ）以上からは、細胞は３Ｄ形態で成長し始めており、表面上で成長する代りに今度は足場の深さ方向に成長していた。
【００７４】
ケラチノサイト
１０％（ｗ／ｗ）ＵＢＭを伴うゼラチン足場の上面に初代ケラチノサイトを播種すると、ＵＢＭ無しの足場に比べ、細胞数が増大した。細胞数の最大値は、研究の最初の何日間かに１０〜２０％（ｗ／ｗ）のＵＢＭで見られたが、研究のその後の期間では、２０〜３０％（ｗ／ｗ）のＵＢＭが最大の効果を示した。ＵＢＭの濃度を増大させると、足場上の細胞数は減少する結果となった（図３）。
【００７５】
ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場上で、最大の細胞数はＵＢＭ無しの足場上で見られた。ＵＢＭの添加により、ＵＢＭの数の増加と共に足場内に見られる細胞数は減少する結果となった。この効果は研究の最後でさらに顕著になった。一般に、濃度の重複のため複製間に比較的大きな変動が見られた（図４）。細胞の形態及び３Ｄ成長は、ゼラチン足場の表面に接着する単一の成長するケラチノサイトを示した。１０％（ｗ／ｗ）のＵＢＭ足場中で、小さなシート内のように互いに密に連結し合った状態で増大した数の細胞が成長していた。この効果は経時的により顕著であると思われ、濃度を２０〜３０％（ｗ／ｗ）ＵＢＭに増大させることでさらに密着した成長がもたらされていたが、これは１０％（ｗ／ｗ）ＵＢＭの場合ほど密なものではなかった。２０〜３０％（ｗ／ｗ）超のＵＢＭでは、細胞数の減少と合わせて、細胞の広がりの増大を伴うより単独の細胞成長が見られた。ＵＢＭ無しのＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場内で、細胞は足場の中央で収集され、ほぼ一枚のシート内のように互いに密接して成長していた。ＵＢＭの濃度を増大させると、細胞数が減少すると共に細胞の広がりは増大する結果となった。２つの最高の濃度において、死細胞が足場構造内に捕捉された状態で発見された。
【００７６】
内皮細胞
Huvecが播種されたゼラチン足場は、最適な２０〜３０％（ｗ／ｗ）前後のＵＢＭ値まで数が増大する傾向を示し、その後減少が見られた（図５）。HuvecでのＭＰＥＧ−ＰＬＧＡは、ＵＢＭの濃度の増大が細胞数の増加を結果としてもたらすことを示した。一般に、Huvecを用いた両方のタイプの足場において隣接する濃度の重複を伴って大きな変動が見られた（図６）。細胞の形態及び３Ｄ成長は、ゼラチン足場内でＵＢＭを３０％（ｗ／ｗ）ＵＢＭまで増大させることで、通常の短かい伸展と共に平坦化する形態を伴って成長する表面に接着するHuvecの能力が上昇することを示した。４０％（ｗ／ｗ）以上では、細胞は、より丸味のある形態と細胞数の減少を伴って成長していた。ＵＢＭ無しのＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場において、Huvecは数が少なく、丸味のある形態で成長し、結果として７日目には細胞は全く無かった。１０〜２０％（ｗ／ｗ）のＵＢＭを足場に添加すると、細胞の広がり効果が得られるが、形態に対する効果は全くない。濃度を３０〜４０％（ｗ／ｗ）超まで増大させると、最適な細胞形態が得られ、濃度をさらに増大させると細胞はさらに一層３Ｄ成長する。一般にＵＢＭを含有するゼラチン及びＭＰＥＧ−ＰＬＧＡの両方の足場の細胞形態及び３Ｄ成長においても、変動が見られた。初代繊維芽細胞、初代ケラチノサイト及びヒト内皮細胞に対するＵＢＭ濃度増加の効果の概要：
【００７７】
【表１】
【００７８】
実施例４：初代繊維芽細胞の細胞形態及び３Ｄ成長に対する、ＥＣＭの滅菌＋／−足場内への取込みの効果
１．５％溶液となるまで、１，４−ジオキサン中にメトキシ−ポリエチレングリコール−ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（Ｍｎ２，０００〜３０，０００、Ｌ：Ｇ １：１）を溶解させた。ＵＢＭ含有試料については、０．０４５ｇの無滅菌ＵＢＭを１０ｍｌの重合体溶液（２３％ｗ／ｗの乾燥物質）に添加し、高速混合し、７×７ｃｍのモールドの中に注いだ。−５℃で溶液を凍結させ、５時間−２０℃でそして約１８時間２０℃で凍結乾燥した。その後、試料を１５時間デシケータ内で陰圧状態（油圧ポンプ）に置いた。
【００７９】
ＵＢＭを伴う及び伴わない試料は、０．１×２５ＫＧｙ及び２×２５ＫＧｙによりベータ照射した。もう１つの試料を同じ要領で調製したが、この場合、予備滅菌したＵＢＭ（２×２５ＫＧｙベータ照射）を使用し（０．０４５ｇ／５ｍｌ溶液）、調製の後試料を滅菌しなかった。
【００８０】
タイプＡ、ブルーム１７５のブタの皮膚由来のゼラチン（Sigma）を、１％溶液となるまで、ｍｉｌｌｉ−Ｑ水及びｔ−ＢｕＯＨ（９５：５）中で溶解させた。５ｍｌの溶液（２３％ｗ／ｗの乾燥物質）に対して０．０１５ｇの無滅菌ＵＢＭを攪拌しながら添加し、モールド（Ｄ＝５ｃｍ）内に注ぎ込んだ。溶液の入ったモールドを１時間＋５℃に置き、その後−２０℃で凍結させ、５時間−２０℃で、そして２０時間２０℃で凍結乾燥した。その後１５時間１２０℃の真空オーブン内で試料を架橋させた。ＵＢＭを伴う及び伴わない試料を０及び１×２５ＫＧｙ及び２×２５ＫＧｙでベータ照射した。もう１つの試料を同じ要領でＵＢＭ無しで調製した。０．１×２５ＫＧｙ及び２×２５ＫＧｙでの調製後、試料を滅菌した。
【００８１】
タイプＡ、ブルーム１７５のブタの皮膚由来のゼラチン（Sigma）を、１％溶液となるまで、ｍｉｌｌｉ−Ｑ水及びｔ−ＢｕＯＨ（９５：５）中で溶解させた。５ｍの溶液（２３％ｗ／ｗの乾燥物質）に対して０．０１５ｇの予備滅菌したＵＢＭ（１×２５ＫＧｙ）を攪拌しながら添加し、モールド（Ｄ＝５ｃｍ）内に注ぎ込んだ。溶液の入ったモールドを１時間＋５℃に置き、その後−２０℃で凍結させ、５時間−２０℃で、そして５０時間２０℃で凍結乾燥した。その後１５時間１３０℃の真空オーブン内で試料を架橋させた。
【００８２】
細胞形態及び３Ｄ成長研究は、ＵＢＭシートへの照射の増大により、ＵＢＭシート上の細胞数は減少するが、細胞の形態に対する効果は全くない、ということを示した。ゼラチン足場及び３０％（ｗ／ｗ）のＵＢＭを伴うゼラチンの中では、細胞数の減少及び標準的な繊維芽細胞様の細胞からさらに丸みのある細胞への形態の変化が見られ、ゼラチン足場内で最大の効果が見られた。ゼラチン足場内に取込む前のＵＢＭ粒子の滅菌は、足場の滅菌前のＵＢＭ粒子の取込みに比べて優れた細胞形態及び３Ｄ成長を提供する。ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ中では、照射の増大は、足場の加湿の増大に起因して繊維芽細胞様の形態をもつ細胞数の増加を結果としてもたらした。３０％（ｗ／ｗ）のＵＢＭを含有するＭＰＥＧ−ＰＬＧＡの足場の照射は、同じくＵＢＭ粒子が足場内への取込み前に照射された足場に比べ、繊維芽細胞のより３Ｄの形態及びさらに一層高い細胞数を結果としてもたらした。
【００８３】
この研究は、照射を受けていないゼラチン足場内で最高の生物活性が達成されること、そして照射が活性を減少させることを示した。反対に、ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場内にＵＢＭ粒子が取込まれ、その後で滅菌された場合に、最高の生物活性が見られた。照射は、ＵＢＭの生物活性を減少させると考えられている。照射は、生物活性との関係において材料に応じてプラス又はマイナス方向に足場材料に影響を及ぼし得る。足場材料（例えばＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ）が滅菌中のＵＢＭの保護効果を有し得ることを示す指摘が存在している。
【００８４】
実施例５：ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ中のＥＣＭの離散粒子
ＵＢＭ粒子を４１％（ｗ／ｗ）含有するＭＰＥＧ−ＰＬＧＡの足場に、少量の成長培地（抗生物物質（ペニシリン、ストレプトマイシン及びアンフォテリシンＢ）を含有するＤＭＥＭ中の１０％ＦＣＳ）中２．５×１０4細胞／ｃｍ2の密度で足場表面上に初代繊維芽細胞を播種した。付加的な成長培地を添加する前に、５％のＣＯ2で３７℃で足場をインキュベートした。７日後に足場を３日間Lillys定着剤中に入れてから、パラフィン内に包埋し、８μｍのスライスに切片化し、Meyerのヘマトキシリンエオジン（ＨＥ）により染色した。Evolution MP冷却カラーカメラ（Media Cybernetics）が取付けられたＢＸ−６０Olympus顕微鏡を用いて、デジタル画像（４倍及び２０倍の倍率）を収集し、Imge Pro Plus ５．１ソフトウェアを用いてデジタル画像を取り込んだ。
【００８５】
ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡの足場中のＥＣＭ粒子の分布のデジタル画像は、ＨＥにより赤色に染色され足場材料と識別された離散ＵＢＭ粒子を示した。足場内で成長する繊維芽細胞は青色に染色された（図７）。
【００８６】
実施例６：ＳＥＭにより示されたＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ中のＵＢＭの離散粒子
実施例１に記述されている通りに足場を調製した。
【００８７】
ＳＥＭ写真は、ＵＢＭ粒を伴う（図９）及び伴わない（図８）ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場を示している。写真は２５０という倍率で足場の上面で撮影される。ＳＥＭ写真は、Danish technological institute（２００５−１６０）で撮影された。
【００８８】
実施例７：ＥＣＭ粒子を保持する足場内の３次元内皮成長及び分化
１．５％溶液となるまで１，４−ジオキサン中にメトキシ−ポリエチレングリコール−ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（Ｍｎ２，０００−３０，０００、Ｌ：Ｇ １：１）を溶解させた。ＵＢＭ含有試料については、１０ｍｌの重合体溶液（２３％ｗ／ｗの乾燥物質）に０．０４５ｇの無滅菌ＵＢＭを添加し、高速混合し、７×７ｃｍのモールドの中に注ぎ込んだ。溶液を−５℃で凍結させ、５時間−２０℃で、そして約１６時間２０℃で凍結乾燥した。その後試料を１５時間、デシケータ内で陰圧状態（油圧ポンプ）に置いた。
【００８９】
臍帯由来の初代ヒト内皮細胞を、ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場及び２３％（ｗ／ｗ）のＵＢＭを含有する足場の表面上で初代ヒト真皮繊維芽細胞と同時培養した。６〜１０日間明確な内皮成長培地内に沈めた状態で構成体を培養し、その後これらをエアリフトしさらに９日間培養した。培養最終日に、構成体を４％のホルマリン緩衝液で定着させ、２等分し、パラフィン包埋した。
【００９０】
ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ（血小板内皮細胞培養分子）の免疫組織化学的ペルオキシターゼ染色により、内皮細胞を５μｍの切片上で視覚化した。繊維芽細胞を同定するために、平行な切片を、ヘマトキシリン対比染色を組合せたＰＥＣＡＭペルオキシダーゼで染色した。内皮成長及び分化は繊維芽細胞性能により影響されることから、全ての足場材料を２つの異なる繊維芽細胞集団を用いてテストしたが、異なる結果をもたらしてはいなかった。
【００９１】
全てのＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場が、繊維芽細胞及び内皮成長を支援している。全てのＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場の体積全体を通して繊維芽細胞が発見された。ＵＢＭ粒子が均質に分布し、足場は培養中無傷状態にとどまる。しかしながらＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場上での内皮細胞及び繊維芽細胞の培養は内皮表面成長のみをもたらし、内皮細胞は足場の上面の隣接する繊維芽細胞により産生されたマトリックスの内部で増殖する。ＵＢＭ粒子を添加することにより、足場のより深い層内での繊維芽細胞及び内皮成長が促進され、内皮細胞は毛細血管様の形態を採用する。内皮細胞は、ＵＢＭ粒子内へと移動するのではなくむしろその表面に沿って誘導される。従って、足場内にＵＢＭ粒子を内含させることで、内皮成長及び分化のきわめて確かな改善が導かれることがわかる。異なる繊維芽細胞集団は、異なる結果をもたらしていなかった。
【００９２】
ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場（図１０）及びＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ中の２３％（ｗ／ｗ）のＵＢＭ（図１１）は、成長がＵＢＭ粒子を保持する深層内へのものである、ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場の表面内での内皮細胞の成長を示している（内皮は赤色に染色される（黒色で示されている）−繊維芽細胞は見えない）。
【００９３】
内皮細胞の毛細血管様の形態は、２３％（ｗ／ｗ）のＵＢＭを保持するＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場のより深い層の中に見られた（図１２）。これらの構造は、ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場内には見られなかった。
【００９４】
実施例８：異なる濃度のＥＣＭ粒子を含有する足場の物理的及び機械的特性
調製された試料：
− ゼラチンマトリックスを伴う、フリーズドライされた足場、
− ゼラチンマトリックスと４０ｗ／ｗのＵＢＭ粒子を伴う、フリーズドライされた足場、
− ゼラチンマトリックスと８０ｗ／ｗのＵＢＭ粒子を伴うフリーズドライされた足場。
【００９５】
タイプＡのブタの皮膚由来のゼラチン（ＰＧ−８８２−６Gelita）を、１％溶液となるまで、ｍｉｌｌｉ−Ｑ水及びｔ−ＢｕＯＨ（９５：５）中で溶解させた。ＵＢＭ含有試料については、攪拌しながらＵＢＭを溶液に加えた（４０％ｗ／ｗ；０．０３３ｇ／５ｍｌ、８０％ｗ／ｗ：０．２ｇ／５ｍｌ）。５ｍｌのＵＢＭ含有ゼラチン溶液をモールド（Ｄ＝５ｃｍ）内に注ぎ込んだ。溶液の入ったモールドを２．５時間＋５℃に置き、その後−２０℃で凍結させ、５時間−２０℃で、そして１００時間２０℃で凍結乾燥した。その後１５時間１２０℃の真空オーブン内で試料を架橋させた。
【００９６】
調製された試料：
− ＰＬＧＡマトリックスを伴う、フリーズドライされた足場、
− ＰＬＧＡマトリックスと４０ｗ／ｗのＵＢＭ粒子を伴う、フリーズドライされた足場、
− ＰＬＧＡマトリックスと８０ｗ／ｗのＵＢＭ粒子を伴うフリーズドライされた足場。
【００９７】
１．５％溶液となるまで１，４−ジオキサン中にメトキシ−ポリエチレングリコール−ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（Ｍｎ２，０００−３０，０００、Ｌ：Ｇ １：１）を溶解させた。ＵＢＭ含有試料については、１０ｍｌの重合体溶液（４０％ｗ／ｗ；０．１ｇ／１０ｍｌ、８０％（ｗ／ｗ）；０．６ｇ／１０ｍｌ）にＵＢＭを添加し、高速混合し、７×７ｃｍのモールドの中に注ぎ込んだ。溶液を１，４−ジオキサン層上にて−５℃で凍結させ、５時間−２０℃で、そして約１００時間２０℃で凍結乾燥した。その後試料を１５時間、デシケータ内で陰圧状態（油圧ポンプ）に置いた。
【００９８】
物理的特性及び機械的試験
マトリックス材料及び添加されるＵＢＭの量に応じて異なる物理的及び機械的特性を達成することができる。
・ 添加されたＵＢＭの量に伴い気孔率は減少し、かくして密度は増大する。
・ マトリックスが疎水性である場合、ＵＢＭは大きい湿潤性を提供することになる。
・ ゼラチン足場は、少なくとも最高４０％（ｗ／ｗ）まではその引張り強度を保持し、その後、それは減少し、一方、ＰＬＧＡ足場はＵＢＭ粒子によってわずかに強化される。フリーズドライプロセスと組合わさって低い材料濃度は低い引張り強度を与え、このことは当該例中の試料についてもあてはまる。
【００９９】
【表２】
【０１００】
【表３】
【０１０１】
高さはノギスで測定される。
【０１０２】
密度は以下の式から計算される：
密度＝質量／（面積×高さ）
【０１０３】
気孔率は以下の式から計算される：
気孔率＝（重合体密度−試料密度）／重合体密度。
【０１０４】
重合体密度は、添加されるＵＢＭ（３ｍｇ／ｃｍ3）に応じて重量調整される。
【０１０５】
湿潤性は、水滴が試料により完全に吸収される時間として計算され、写真監視される。
【０１０６】
【表４】
【０１０７】
【表５】
【０１０８】
引張り試験は、Stable Micro Systems社製Texture Analyzer上で実施された。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】３つの異なる濃度（細胞／ｃｍ2）でのヒト初代繊維芽細胞が播種されたゼラチン足場のＬＤＨ測定値。棒は、Ａｂｓで測定された３日目の成長を表わす。
【図２】３つの異なる濃度（細胞／ｃｍ2）でのヒト初代繊維芽細胞が播種されたＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場のＬＤＨ測定値。棒は、Ａｂｓで測定された３日目の成長を表わす。
【図３】３つの異なる濃度（細胞／ｃｍ2）でのヒト初代ケラチノサイトが播種されたゼラチン足場のＬＤＨ測定値。棒は、Ａｂｓで測定された３日目の成長を表わす。
【図４】３つの異なる濃度（細胞／ｃｍ2）でのヒト初代ケラチノサイトが播種されたＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場のＬＤＨ測定値。棒は、Ａｂｓで測定された３日目の成長を表わす。
【図５】３つの異なる濃度（細胞／ｃｍ2）でのヒト初代臍細胞内皮細胞が播種されたゼラチン足場のＬＤＨ測定値。棒は、Ａｂｓで測定された３日目の成長を表わす。
【図６】３つの異なる濃度（細胞／ｃｍ2）でのヒト初代臍細胞内皮細胞が播種されたＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場のＬＤＨ測定値。棒は、Ａｂｓで測定された３日目の成長を表わす。
【図７】ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場内のＥＣＭ粒子の分布のデジタル画像である。
【図８】ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場のＳＥＭ写真（倍率２５０倍）である。
【図９】４０％のＥＣＭ粒子を含有するＭＰＥＧ−ＰＬＧＡのＳＥＭ写真（倍率２５０倍）である。
【図１０】ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場内の内皮成長のデジタル画像である。
【図１１】２３％のＥＣＭ粒子を含有するＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ中の内皮成長のデジタル画像である。
【図１２】足場のより深い層内の毛細血管様の形態の拡大図を示す、２３％のＥＣＭ粒子を含有するＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ内の内皮成長のデジタル画像である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生分解性層の中に取込まれたフレーク、繊維、粒子、粉末などの形をしたＥＣＭ材料を有する生分解性層を含む足場に関する。
【背景技術】
【０００２】
足場は、新しい機能的組織を形成するプロセスにおいて、細胞の組織、成長及び分化を誘導するために用いられる構造である。
【０００３】
組織の再構築という最終目的を達成するために、足場はいくつかの特定的必要条件を満たさなくてはならない。細胞及び栄養素の両方の構造全体を通した細胞の成長及び拡散を容易にするためには高い気孔率及び適当な気孔サイズが必要である。足場は、外科的除去の必要性なく周囲の組織により吸収される必要があるため、生分解性は不可欠である。
【０００４】
足場として使用するために数多くの異なる（天然及び合成、生分解性及び常在性）材料が調査されてきた。これらの材料の大部分は、生体再吸収可能な縫合糸としてすでに利用されているため、研究主題としての組織工学の到来以前に医療分野では知られてきたものである。これらの材料の例としては、コラーゲン又は一部の線形脂肪族ポリエステルがある。
【０００５】
しかしながら、実験室で作られた足場をインビボで試験した場合、恐らくは例えば成長因子などのいかなる生体シグナル分子も合成的に作られた足場内に見出されないという事実に起因して、これらの足場内へ容易に細胞が成長しないという状態が見られることが多い。
【０００６】
足場の生物学的特性を改善し創傷の治癒を促進するために、いくつかの研究所は合成足場に成長因子を付加し、創傷治癒に対する有利な効果を観察した。これらの刊行物の全てにおいて、単一の成長因子がシート又はヒドロゲル内に取込まれていた。検査された成長因子は、ＦＧＦ−２（１；２）、２５μｇ／ｃｍ2の濃度でテストされたβ−ＦＧＦ−２（２）、ＦＧＦ−１（３；４）、ＥＧＦ（５）（１４）、又は２μｇ／ｃｍ2の濃度のＴＧＦ−β（６；７）であった。温血脊椎動物からの無細胞細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が組織工学及び形成外科手術において広範に使用されている（８）。無細胞ＥＣＭが複数の成長因子を含有することが示されてきた（９−１１）。ＥＣＭは数多くの生体分子を含有し、濃縮されたＥＣＭのこのシートに細胞が容易に定着するということがわかっている（１２；１３）。今日市場にあるＥＣＭはヒト又はブタ由来のものである。細胞は組織から取出され、該組織はその後凍結乾燥されシートの形にカットされる。ブタ由来のシートは異なるサイズをしている。これらのシートの価格は非常に高い。これらのシートは、未水和状態ではかなり堅い。一例としては、Acell社製シートがある。Acell社は、創傷の治癒を加速するＥＣＭシート（膀胱マトリックス、ＵＢＭ）を販売している。かかるシート（７×５ｃｍ）は重さが約１００ｍｇであり、密度は約１９０ｍｇ／ｃｍ3である。
【０００７】
創傷におけるＥＣＭ又はＥＣＭタンパク質の使用は、既知である。これらの製品はシート又はヒドロゲルの形をしている。シート製品の例としては、Healthpoint社製のＯＡＳＩＳ（凍結乾燥されたブタのＥＣＭシート）及びWrightmedical社製のGraftjacket（凍結乾燥されたヒトＥＣＭシート）がある。シートは足場ならびにタンパク質の複合混合物の両方を創傷細胞に対して提供する。市販されているＥＣＭタンパク質含有非足場製品の例としては、発育中のブタの歯のＥＣＭからのタンパク質抽出物を含有するヒドロゲルであるMolnlycke社製のXelmaがある。
【発明の開示】
【０００８】
概要
本出願は、足場内にＥＣＭを取込んだ場合に、ＥＣＭの成長促進効果が維持されるということを開示している。我々は、ＥＣＭ材料を含有する足場を使用した場合、驚くべきことに、濃度が高くても優れた細胞形態を提供しないということを立証する。６０％未満の濃度が、最良の細胞形態及び分布を得るのに充分なものである。さらに、足場内の離散(discrete)ＥＣＭ材料の濃度を変動させることによって足場の物理的特徴が変化するものの、これらの変化は足場の材料によって左右されるということを示す。本出願は、滅菌の後ＥＣＭ材料の生物活性を維持する滅菌戦略を示すことにより、この知識を患者に活用するものである。
【０００９】
詳細な開示
本発明は、離散ＥＣＭ粒子を含む一時的複合材料足場に関する。
【００１０】
足場に対しＥＣＭの不連続領域を付加することにより、足場が提供できる一連の物理的特性（例えば強度、柔軟性、可動性、耐久性）とＥＣＭの再構築特性を組合せることが可能である。さらにかかる足場の価格は、粉末が無細胞ＥＣＭの生産に由来する廃棄物であること及び各利用分野のための離散ＥＣＭ材料の最適量を決定し包帯剤中に等分布させ、かくして無意味に高濃度のＥＣＭを回避することができることの両方の理由で、その他のＥＣＭ足場よりも低くなる。ＥＣＭの効果に加えて、基材の多孔質構造は、細胞に対し、内方成長のための構造を提供する。１実施形態においては、粒子、フレーク、繊維又は粉末といったような離散ＥＣＭ材料を添加することによりＥＣＭの不連続領域が得られる。
【００１１】
ＥＣＭ材料の不連続相というのは、その形態及び密度に関して、それらが包埋されている粉砕材料と区別されるＥＣＭの材料を意味する。これは、例５に見られるような組織学切片によって又は例６に見られる走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）によって実証することができる。ＥＣＭの不連続領域を付加することにより、ＥＣＭの濃度を制御することができる。例（例えば例２及び３）で示されているように、細胞の成長を最適化するためには濃度を制御することが重要である。
【００１２】
足場形成（例えばフリーズドライ）の前に足場に対しＥＣＭ材料を付加することが好ましい。このようにして、ＥＣＭ材料は、足場内に均質に分布させられる。すなわち、それが足場を固化するのにかかる時間内（例えば凍結中）で、ＥＣＭ材料の密度は、足場の１方の端部においてもう１方の端部よりも高い可能性がある。しかしながら当該状況においては、足場の中心の密度が０を上回るのであれば、均質な分布が足場を通したかかる密度勾配を許容する。かくして、好ましい実施形態は、ＥＣＭの不連続領域の濃度が２０％（ｗ／ｗ）〜６０％（ｗ／ｗ）の間にある、ＥＣＭの均質に分布した不連続領域を含む仮連続足場に関する。
【００１３】
当該状況下では、仮足場というのは、創傷部位から消滅するか、加水分解するか、破壊させられるか、生物分解済み／生物再吸収性／生物吸収性のものであるか、溶解させられるか又はその他の形で消失する足場を意味する。創傷から取り除くべきものが全くなくなるため、これは臨床的に極めて大きな利点を有する。従って、新たに形成された組織が仮足場の除去により乱されたり、ストレスを受けたりすることがない。足場は、利用分野に応じて、１日〜１０週間の間で破壊させられることが標準的に好ましい。開放創の利用分野では、足場が１〜１０日の間、例えば２〜７日の間に破壊されることが好ましい。本発明の１態様においては、足場は生分解性のものである。
【００１４】
１実施形態においては、該足場は、連続足場である。これは連続相の足場である。不連続領域を伴う連続足場は、結果として複合材料をもたらす。
【００１５】
その他の複合材料の場合と同様、これは、著しく異なる物理的又は化学的特性をもち、そして完成した構造内で分離した全く異なるものであり続ける、２つ以上の成分材料から作られる工学処理材料である。
【００１６】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は動物及びヒトの組織の非細胞部分である。このためＥＣＭは、細胞をとり囲む複合材料である。従って、ＥＣＭの不連続領域は細胞の無い領域であることが好ましい。無細胞領域は、物理的、酵素的及び／又は化学的方法を使用することによって得られる。細胞層は、例えば組織をこすり取ることで物理的に除去することができる。組織中で細胞を互いに引き離すためには、洗浄剤及び酵素を使用することができる。低浸透圧は組織内の細胞のバーストを誘発し、その結果脱細胞化プロセスを促すことになるため、水又はその他の低張溶液を使用することもできる。
【００１７】
無細胞領域を得るためのもう１つの方法は、足場マトリックスに対しＥＣＭ粉末（ＥＣＭの不連続領域）を付加することによるものである。細胞の構成要素が免疫原性応答をひき起こし得ることから、無細胞生成物は、移植された場合のあらゆる免疫拒絶のリスクを最小限におさえる。
【００１８】
ＥＣＭ中には、大まかに言って３つの主要な構成要素、すなわち繊維質要素（特にコラーゲン、エラスチン又はレチクリン）、リンクタンパク質（例えばフィブロネクチン、ラミニン）及び空間充てん分子（通常はグリコサミノグリカン）が存在する。ＥＣＭは、細胞を引きつけ、成長因子及びサイトカインのタンクとして役立つことにより、細胞増殖を促進するものとして知られている（９；１０）。創傷中で用いられる微粒子ＥＣＭを含有する仮足場には、創傷の縁部からの細胞ならびに循環血からの細胞が多く存在することになる。細胞が足場に侵入するにつれて、足場材料は分解され、場合によって、該足場は新しい組織で置換されることになる。
【００１９】
ＥＣＭの不連続領域の濃度は、好ましくは１５％（ｗ／ｗ）超、すなわち２０％（ｗ／ｗ）超、例えば３０％（ｗ／ｗ）超である。ＥＣＭの不連続領域の濃度は、好ましくは９５％（ｗ／ｗ）未満、すなわち９０％（ｗ／ｗ）未満、例えば８０％（ｗ／ｗ）未満又は７０％（ｗ／ｗ）未満である。本発明の特に好ましい実施形態においては、濃度は２０％（ｗ／ｗ）〜６０％（ｗ／ｗ）、例えば２０％（ｗ／ｗ）〜４０％（ｗ／ｗ）である。
【００２０】
ヒトの皮膚は、主にケラチノサイトによって形成されている表皮の上層を含む。表皮の下は、主に線維芽細胞により、ただしそれだけでなく内皮細胞によっても形成されている真皮がある。
【００２１】
線維芽細胞の成長を促進する場合、当該例（例えば例３）は、０％（ｗ／ｗ）から約６０％（ｗ／ｗ）までＥＣＭの濃度を増大させた結果として、足場の表面上の細胞数及び細胞の形態の顕著な改善がもたらされるということを示している。かくして、本発明の１つの態様は、線維芽細胞の成長を促進するための４０％（ｗ／ｗ）〜６０％（ｗ／ｗ）のＥＣＭを含む創傷ケアデバイスに関するものである。
【００２２】
ケラチノサイトの成長を促進する場合、ゼラチン足場を用いた当該例は、０％（ｗ／ｗ）から約２５％（ｗ／ｗ）までＥＣＭの濃度を増大させると、その結果として、（ケラチノサイトが行なうはずであるような）細胞が共に成長する能力、細胞形態及び総細胞数の顕著な改善がもたされる、ということを示している。しかしながら、ＥＣＭの濃度を４０％（ｗ／ｗ）超に増大させると、その結果、表面上の細胞数、その形態及び細胞数に関する細胞成長の促進が低減されることになる。かくして、本発明の１つの態様は、ケラチノサイトの成長を促進するための２０％（ｗ／ｗ）〜３０％（ｗ／ｗ）のＥＣＭを含む創傷ケアデバイスに関する。
【００２３】
本発明の創傷用包帯剤は多数の層を含むことができる。これらの層は、任意には全てＥＣＭを含む1つ以上の主分解性材料層を内含することができる。ＥＣＭが２つ以上の層内に取込まれている場合、層を横断して用量が変動する可能性がある。１実施形態においては、第１層は４０％（ｗ／ｗ）〜６０％（ｗ／ｗ）のＥＣＭを含む、第２層は２０％（ｗ／ｗ）〜３０％（ｗ／ｗ）のＥＣＭを含む。
【００２４】
もう１つの実施形態においては、足場は、異なる細胞型の成長刺激のために設計されている。すなわち、線維芽細胞の成長刺激のために最適な濃度は、４０％（ｗ／ｗ）〜６０％（ｗ／ｗ）のＥＣＭであり、内皮細胞のための最適な濃度は３０％（ｗ／ｗ）〜６０％（ｗ／ｗ）であり、一方ケラチノサイトの成長刺激のためには、最適な濃度は２０％（ｗ／ｗ）〜３０％（ｗ／ｗ）である。本発明の１つの実施形態は、４０％（ｗ／ｗ）〜６０％（ｗ／ｗ）のＥＣＭの不連続領域濃度をもつ繊維芽細胞の刺激用の第１の足場と２０％（ｗ／ｗ）〜３０％（ｗ／ｗ）のＥＣＭの不連続領域濃度をもつケラチノサイトの刺激用の第２の足場という２つの足場を含んで成る創傷ケアデバイスに関する。２０％（ｗ／ｗ）〜３０％（ｗ／ｗ）のＥＣＭ材料の不連続領域濃度をもつ第３の足場を創傷ケアデバイスに付加することが可能である。
【００２５】
当該データは、繊維芽細胞の成長の刺激のための４０％（ｗ／ｗ）〜６０％（ｗ／ｗ）のＥＣＭ不連続領域を含む足場の使用を可能にしている。当該データはまた、ケラチノサイトの成長の刺激のための２０％（ｗ／ｗ）〜３０％（ｗ／ｗ）のＥＣＭ不連続領域を含む足場の使用をも可能にしている。
【００２６】
繊維芽細胞の成長を促進する場合に、成長する繊維芽細胞がケラチノサイトの成長を含め、成長因子を排出することになる、というのが我々の経験上言えることである。従って、本発明の好ましい一態様は、ＥＣＭの不連続領域の濃度が４０％（ｗ／ｗ）〜５０％（ｗ／ｗ）の間である足場に関する。これによって、繊維芽細胞の成長は、ケラチノサイト成長が結果として促進され創傷が治癒されるような形で促進される。
【００２７】
足場構造中のＥＣＭの濃度は、重量／重量百分率として計算される。すなわち、濃度（ｗ／ｗ）＝ＭECM／ＭECM＋Mscaffold）×１００％であり、式中ＭECMはＥＣＭのグラム単位の質量であり、Mscaffoldは足場のグラム単位の質量（ＥＣＭは含まず）である。
【００２８】
溶解性足場（例えばＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ）においては、溶媒中に足場を溶解させ、ＥＣＭをろ過させる。フリーズドライの後、材料を秤量する。
【００２９】
不溶性足場の場合には、材料は適切な包埋材料（例えばパラフィン）の中に包埋され、統計学上代表的な数に区分化され、ＥＣＭのみを染色して足場材料は染色しない適切な染色液を用いて染色される。画像分析を用いて、ＥＣＭの量は、足場との関係において計算される。
【００３０】
好ましいＥＣＭ材料は、材料の組織源に由来する生物活性ＥＣＭ構成要素を含有する。例えば、これらの材料は、繊維芽細胞成長因子−２（塩基性ＦＧＦ）、形質転換成長因子−ベータ（ＴＧＦ−beta）及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を含有し得る。同様に、本発明のＥＣＭ基材が、例えば、1つ以上のコラーゲン、グリコサミノグリカン、糖タンパク質及び／又はプロテオグリカンを内含する付加的な生物活性成分を含有することも好まれる。ＥＣＭは、大部分がＩＶタイプのコラーゲン、ラミニン及びプロテオグリカンで構成される基底膜を内含し得る。本発明のＥＣＭ材料は、好ましくは、ブタ、ウシ及びヒツジを含む（ただしこれらに制限されるわけではない）食肉生産向けに飼育された動物から収穫された組織から調製される。組織供給源としては、その他の温血脊椎動物も有用であるが、食肉生産に使用される動物からこのような組織を入手できる可能性がより大きいことから、かかる組織が好ましいものとなっている。ガラカトシル、アルファ１，３ガラクトース（ＧＡＬエピトープ）を含まなくするように遺伝子工学処理されたブタを、ＥＣＭ材料の生産用の組織供給源として使用してもよい。好ましい実施形態においては、ＥＣＭはブタ由来のものとなる。
【００３１】
ＥＣＭ材料は、いかなる動物からでも得ることができる。これは腸組織、膀胱、肝臓、脾臓、胃、リンパ節又は皮膚に由来し得るが、これらに制限されるわけではない。ヒトの死体皮膚、ブタ膀胱粘膜下層（ＵＢＳ）、ブタ膀胱マトリックス（ＵＢＭ）、又はブタ小腸粘膜下層（ＳＩＳ）に由来するＥＣＭが特に好ましい。
【００３２】
好ましくは、ヒト組織は疾病の転移を最小限におさえるために回避される。従って、好ましい実施形態においては、ＥＣＭの不連続領域は動物の組織から得られる。種の類似性のため、温血哺乳動物からのＥＣＭを使用することが好まれる。
【００３３】
特定の好ましい実施形態においては、ＥＣＭの不連続領域はＵＢＭ（膀胱マトリックス）粒子である。ＵＢＭ材料は、ＥＣＭタンパク質の独特のカクテルを含み、これらのタンパク質のうち定量化されているのは次のわずかなものである：ＴＧＦ−β２９３±８ｐｇ／ｇ、ｂ−ＦＧＦ３８６２±１７０ｐｇ／ｇ及びＶＥＧＦ４７５±２２ｐｇ／ｇ（すなわちｐｇＶＥＧＦ／ｇＵＢＭ）。３ｍｇ／ｃｍ2という平均密度で、濃度は、ＥＣＭシート中のＴＧＦ−β：約０．９ｐｇ／ｃｍ2、ｂ−ＦＧＦ：１１．６ｐｇ／ｃｍ2そしてＶＥＧＦ１．４ｐｇ／ｃｍ2である。
【００３４】
本発明の１つの態様は、成長因子の一定の投薬を伴う足場を提供することにある。本発明において使用される足場の１つの特性は、多孔質基材内部でＥＣＭの不連続領域を分布させ、かくして細胞がＥＣＭを利用しやすくすることにある。細胞が足場基質を通って移動する場合、ＥＣＭの不連続領域はプロテアーゼ活性に曝露され、分解され、その結果としてＥＣＭの不連続領域から生物活性成分が放出されると考えられている（１４）。かくして、生物活性成分の放出を、使用期間全体を通して幾分か一定に保つことができ、かくして創傷床及び細胞に対して幾分か恒常な投薬を提供することができる。１つの実施形態においては、ＥＣＭの不連続領域は、仮足場の内部で均等に分布している。
【００３５】
ＥＣＭは、いくつかの微粒化された形態、例えば粒子、フレーク、繊維又は粉末といった形で得られる。これらは全て、ＥＣＭの不連続領域、すなわち離散ＥＣＭ材料とみなされる。
【００３６】
ＥＣＭの不連続領域の１つの好ましい形態はＥＣＭ粒子である。好ましくは、約１５０μｇの平均直径をもつ粒子である。これは、体積加重平均用のMalvern Instrument社製のMastersizer２００によって決定される。例えば、１００μｍの表面積加重平均は、３μｍの最小粒子、７５０μｍの最大粒子を有し得る。体積加重平均はこの場合２５０μｍとなる。
【００３７】
多孔質足場内でＥＣＭの不連続領域を分布させることにより、ＥＣＭの不連続領域からの大きな影響なく足場の物理的特性（例えば強度、柔軟性、可動性、耐久性）を最適化することが可能である。
【００３８】
ＥＣＭの有益な効果及び多孔質足場が提供することのできる物理的特性の両方を得るために、足場といったような創傷包帯剤の中に微粒子ＥＣＭを内含させることができ、これを再生医療（例えば軟組織、骨、軟骨、靭帯及び腱の再形成）又は歯科応用分野に使用することができる。この多孔質足場は好ましくは生分解性材料で作られているべきである。仮足場は、凍結乾燥された形態、繊維質形態（製織又は不織）、発泡形態又はフィルム形態のいずれかであり得る。全ての形態において、ＥＣＭの不連続領域は、多孔質／繊維質構造の外部及び内部表面の両方から細胞に接近可能である。
【００３９】
足場に使用される材料は、合成及び天然の両方の供給源に由来する、あらゆる生分解性材料であってよい。天然材料で構築された足場のうち、特に好ましいものは、細胞外マトリックスの誘導体に基づくものである。かかる材料の例としては、タンパク質材料、例えばコラーゲン又はフィブリン、及び多糖類材料、例えばキトサン又はグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）がある。
【００４０】
１実施形態においては、生分解性足場は、タンパク質含有物質から作られる。これは、タンパク質分解酵素による分解を可能にすることになる。かかる足場は、好ましくは、コラーゲン、ケラチン、フィブリン、エラスチン、ラミニン、ビメンチン、ビドロネクチン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン及びこれらの誘導体などといったタンパク質又はゼラチンといったような未変性タンパク質で作られる。
【００４１】
ゼラチン、フィブリン、ヒアルロン酸、コラーゲン、キチン、キトサン、ケラチン、アルギン酸塩、ＰＬＡ及びＰＬＧＡといったような重合体材料を用いて足場を作ることにより、組合せ及び修飾を通して足場の物理的特徴（強度、柔軟性、可とう性）を変動させることが可能である。
【００４２】
もう１つの実施形態においては、生分解性足場は、炭水化物／多糖類含有物質で作られている。こうして、多糖類の加水分解による分解及び酵素分解が可能となる。かかる足場は、好ましくは、多糖類、例えば硫酸ヘパラン、硫酸コンドロイチン、硫酸デルマタン、ヘパリン、硫酸ケラタン及びこれらの誘導体、アルギン酸塩、ＨＳＣセルロース及びヒルロース誘導体（ＣＭＣ）、一部のアルギン酸塩、キトサン、キチン、ペクチン及びペクチン誘導体、ヒアルロン酸及びプロテオグリカン（ムコ多糖類）及びこれらの誘導体で作られる。
【００４３】
もう１つの態様においては、仮足場は合成である。かかる足場は主として、酵素消化と組合わさった加水分解により分解される。これらの足場は、好ましくは、ＰＬＡ（ポリラクチド）、ＰＧＡ（ポリグリコリド）、ＰＬＧＡ（ポリ（ラクチド−コ−グリコシド））、ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ、Ｐ細胞（ポリカプロラクトン）、ポリオルトエステル、ポリジオキサノン、ポリ無水物、ポリヒドロキシアルカノアート、及び上述の材料の共重合体から成る群から選択された材料で作られている。
【００４４】
周知の天然足場／ゲルの例としては、コラーゲンベース（３；６）、フィブリンベース（４）、キトサンベース（１）又はゼラチンベース（２；７）のものがある。
【００４５】
一般に用いられる合成材料はＰＬＡ−ポリ乳酸である。これは、人体内で分解して、体内から容易に除去される天然に発生する化学物質である乳酸を形成するポリエステルである。類似の材料としてはポリグリコール酸（ＰＧＡ）及びポリカプロラクトン（ＰＣＬ）がある。その分解機序はＰＬＡのものと類似であるが、これらはＰＬＡに比べてそれぞれ、速い及び遅い分解速度を示す。かかるＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ重合体は以下の通りに合成可能である。すなわち、窒素雰囲気を伴うグローブボックス内のバイアルに対して、トルエン中の４％（ｗ／ｗ）のオクタン酸第一スズ、ＭＰＥＧ、ＤＬ−ラクチド、グリコシドを加える。バイアルを閉じ、加熱し、中味が澄んで均質になるまで振とうし、その後１分〜２４時間１２０〜２００℃のオーブン内に入れる。合成は、その後の精製を容易にするため適切な溶媒（例えばジオキサン）中の溶液内で行なうこともできる。次に窒素雰囲気を伴うグローブボックス内のバイアルに対しＭＰＥＧ、ＤＬ−ラクチド、グリコリド、４％の２−エチルヘキサン酸第一スズ及びジオキサンを加えて、上述の通りに処理する。
【００４６】
重合体は、以下の通りに精製することができる。すなわち、重合体を適切な溶媒（例えばジオキサン、テトラ、ヒドロフラン、グロロホルム、アセトン）の中に溶解させ、−４０℃の温度で非溶媒（例えば水、メタノール、エタノール、１−プロパノール又は２−プロパノール）中で攪拌しながら沈殿させる。重合体を沈降させ、溶媒を廃棄し、重合体を一晩４０℃〜１２０℃で真空オーブン内にて乾燥させる。
【００４７】
以上で例示した通り、足場の基材は、その組合せを含めて合成及び／又は天然由来の材料で作ることができる。従って、足場は、タンパク質、多糖類、及び合成重合体の組合せを含むことができる。
【００４８】
本発明において使用される足場の１つの機能は、細胞成長を促進するマトリックスを提供することにある。足場内への細胞の内方成長を促進するための１つの基準は、室温で固体である足場にある。すなわち、足場は固定した物理的構造つまり両連続相（bi-contiuous）構造を有する。この構造により、細胞は足場を通って移動し、新しい組織を形成する補助を受ける。
【００４９】
細胞成長を促進するためのもう１つの基準は、少なくとも細胞の移動を可能にする気孔率又は複数の開放気孔を有する足場にある。
【００５０】
気孔率は、Ｐ＝１−ρ（Ｖ／Ｍ）として定義づけされ、式中Ｐは足場の気孔率、ρは使用される重合体系の密度、Ｍは重量そしてＶは製造された足場の体積である。
【００５１】
本発明の１つの実施形態は、本書で記述される通りＥＣＭの不連続領域を含む多孔質足場に関する。実施例において例示される通り、５０％超の気孔率が細胞成長を可能にする。かくして、１つの好ましい実施形態において、ここで記述される通りの足場は、８０％超、さらには９０％超又は９５％といった気孔率を含む。
【００５２】
多孔質足場は、互いに連結された開放気孔を有することが好ましい。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態においては、仮足場は０．１〜８ｍｍの間、好ましくは０．３〜３ｍｍの間、さらに一層好ましくは０．５〜２ｍｍの間の厚みを有する。本発明の特に好ましい実施形態においては、生分解性層の厚みは約１ｍｍである。本発明の好ましい実施形態においては、生分解性層は創傷と直接接触している。
【００５４】
本発明に従う足場は、創傷包帯剤としての使用を目指したものである。創傷包帯剤において念頭におくべき１つの要因は、それを柔軟でかつ形状適合性を有するものにすることである。柔軟で形状適合性を有するものというのは、該状況下において、それが開放創に適用された場合に不快でも苦痛でもなく、例えば縁部が敏感な創傷周囲を切り開いたりストレスを加えたりせず、創傷の屈曲と共に包帯剤が湾曲することを意味する。こうして、創傷部域とＥＣＭ含有足場の直接的接触も確保される。
【００５５】
このような柔軟で形状適合性を有するマトリックスの一例としては、１〜２％（ｗ／ｗ）溶液中で調製されフリーズドライされたキトサンがある。結果は、柔軟な開放マトリックスすなわち相互連結された開放気孔を伴う足場である。このマトリックスは、同様に、細胞の成長及び遊走を可能にするのに充分な開放気孔を有する。
【００５６】
１組の実施形態においては、本発明に従った包帯剤は、急性創傷、火傷、慢性創傷及び／又は外科創傷のために使用される。
【００５７】
もう１つの実施形態においては、本発明に従った包帯剤は、美容整形手術で使用される。
【００５８】
関連する実施形態においては、ＥＣＭの不連続領域を含む足場は、再生医療（例えば軟組織、骨、軟骨、靭帯及び腱の再形成）又は歯科応用分野のために用いられる。
【００５９】
これらの用途の多くにおいて、本発明に従った包帯剤が滅菌されていることが必要条件である。本発明の１つの実施形態は、ＥＣＭの不連続領域を含む滅菌された仮連続足場に関する。これは標準的には、この製品が滅菌されていることが包装上にマーキングされている、バクテリアタイト包装されたＥＣＭの不連続領域を含む仮連続足場として表現される。実施例４で例示される通り、例えば放射線照射による滅菌は、（足場のタイプに応じて）ＥＣＭの生物学的効果を維持する。バクテリアタイト材料は当業者にとって周知のものである。
【００６０】
参考文献
１．Obara,K,Ishihara,M.,Fujita,M.,Kanatani,Y.,Hattori,H.,Matsui,T.,Takase,B.,Ozeki,Y.,Nakamura,S.,Ishizuka,T.,Tominaga,S.,Hiroi,S.,Kawai,T.,& Maehara,T,2005,「繊維芽細胞成長因子−２を含有する光架橋可能なキトサンヒドロゲルを用いた治癒機能障害のｄｂ／ｄｂマウスにおける創傷治癒の促進」Wound.Repair Regen.,vol.13.no.4,pp.390-397.
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12．Badylak,S,F.,Record,R.,Lindberg,K.,Hodde,J.,& Park,K.1998,「小腸粘膜下層：インビトロ細胞成長用の基質」J.Blomater,Sel.Poym.Ed,vol.9,pp.863-878.
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14．Li,F.,Li,W.,Johnson,S.,Ingram,D.,Yoder,M.,& Badylak,S.2004,「初代内皮細胞のための走化性因子としての細胞外マトリックスから誘導された低分子量ペプチド」Endothelium 2004.May,-Aug,;11(3-4):199.-206.,vol.11,pp,199-206.
【実施例】
【００６１】
実施例１：ＥＣＭ粒子を伴う及び伴わない合成足場内の一次ヒト繊維芽細胞の内方成長
４０％（ｗ／ｗ）でＵＢＭ（Ａ細胞）粒子（平均直径約１５０μｍ）を含有する生分解性ポリエステルでできた足場を、細胞形態及び３Ｄ成長の試験において、ＥＣＭ粒子無しの足場と比較した。
【００６２】
メトキシポリエチレングリコール−ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（Ｍｎ２，０００〜３０，０００、Ｌ：Ｇ １：１）を、１．５％溶液になるまで１，４−ジオキサン中で溶解させた。ＵＢＭ含有足場については、３ｍｌの重合体溶液（４０％ｗ／ｗの乾燥物質）に０．０３ｇのＵＢＭを添加し、高速混合し、３×３ｃｍのモールド内に注ぎ込んだ。溶液を−５℃で凍結させ、５時間−２０℃及び約６０時間２０℃で凍結乾燥した。試料をその後５時間デシケータ内で陰圧状態に置く（油圧ポンプ）。
【００６３】
２つの足場の表面上の播種された一次繊維芽細胞の成長及び形態試験を評価した。
【００６４】
１日目、３日目及び７日目からの結果を１〜５に等級付けした。なお、１は最悪のケース、５は最良のケースに対応している。ＥＣＭ粒子と混合した足場内で、細胞の分布及び成長には全ての日に等級５が与えられ、これは対照足場（全ての日に等級２．５）よりも優れていた。
【００６５】
結論：粉末化されたＥＣＭマトリックスの生物活性は、合成足場内への取込み後も活性を保持しており、足場単独の場合と比べて、足場上ではるかに優れた成長をひき起こした。
【００６６】
実施例２：５つの異なる濃度のＥＣＭを含有するゼラチン−ＥＣＭ複合材料中の細胞の形態及び３Ｄ成長
ゼラチン−ＥＣＭ足場の表面上に播種された一次繊維芽細胞の細胞形態と３Ｄ成長の研究。
ゼラチン足場を加熱により架橋させ、ＵＢＬの漸増的濃度（０、１２％（ｗ／ｗ）、２６％（ｗ／ｗ）、４１％（ｗ／ｗ）、５１％（ｗ／ｗ）及び５８％（ｗ／ｗ））を含有していた。濃度を、総固体量との関係におけるＵＢＭ量として計算し、これはすなわち、５８％（ｗ／ｗ）の足場が０．０５ｇの重合体及び１３．８ｍｇのＵＢＭ／ｃｍ3に対応する０．０７ｇのＵＢＭを含有していることを意味していた。
【００６７】
タイプＡ、ブルーム１７５のブタの皮膚由来のゼラチン（Sigma）を、１％溶液となるまで、ｍｉｌｌｉ−Ｑ水及びｔ−ＢｕＯＨ（９５：５）中で溶解させた。ＵＢＭ含有試料については、攪拌しながらＵＢＭを溶液に加えた（０、１２、２６、４１、５１、５８％ｗ／ｗ；０、０．００７、０．０１８、０．０３５、０．０５３、０．０７ｇ／足場）。５ｍｌのＵＢＭ含有ゼラチン溶液をモールド（Ｄ＝５ｃｍ）内に注ぎ込んだ。溶液の入ったモールドを１時間＋５℃に置き、その後−２０℃で凍結させ、５時間−２０℃で、そして３６時間２０℃で凍結乾燥した。その後１５時間１２０℃の真空オーブン内で試料を架橋させた。
【００６８】
この研究は、複合足場中のＵＢＭの濃度を増大させることにより、ＵＢＭ無しの場合に比べ、繊維芽細胞がより良く分布させられ、より高い増殖速度を有することを示した。研究の最初の数日間は、ＵＢＭ無しの足場上では細胞が適用された部域内でのみ成長しており、一方ＵＢＭの濃度が２６％（ｗ／ｗ）超である足場の表面上では細胞がより良くかつより均等に分布していることが観察された。１４日以降は、ＵＢＭを含有する複合足場と比べてＵＢＭ無しのゼラチン足場ではより少ない数の細胞しか見られないことが明らかであった。細胞形態に関しては、繊維芽細胞は、素のゼラチン足場では丸味のあるただし接着性の形態を有していたが、ＵＢＭの量が増大するにつれて、増々繊維芽細胞様形態が観察された。４１％（ｗ／ｗ）のＵＢＭから、繊維芽細胞の最良の形態及び分布が観察された。４１％（ｗ／ｗ）超にＵＢＭの濃度を増大させることで、複合足場内の細胞の形態又は分布が良くなる結果とはならなかった。
【００６９】
実施例３：６つの異なる濃度のＥＣＭ粒子を保持するＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ又はゼラチンの複合足場の調製及びその中の細胞の形態及び３Ｄ成長
ゼラチン及びＥＣＭの複合足場の調製：タイプＡ、Gelita pharmagrade 832のブタの皮膚由来のゼラチンを、１％溶液となるまで、ｍｉｌｌｉ−Ｑ水及びｔ−ＢｕＯＨ（９５：５）中で溶解させた。ＵＢＭ含有試料については、攪拌しながらＵＢＭを溶液に加えた；０、０．００６、０．０１３、０．０２１、０．０３３、０．０５、０．０７５ｇ／足場（０、１０、２０、３０、４０、５０、６０％ｗ／ｗ）。５ｍｌのＵＢＭ含有ゼラチン溶液をモールド（Ｄ＝５ｃｍ）内に注ぎ込んだ。溶液の入ったモールドを１時間+５℃に置き、その後−２０℃で凍結させ、５時間−２０℃で、そして１８時間２０℃で凍結乾燥した。その後１５時間１３０℃の真空オーブン内で試料を架橋させた。
【００７０】
ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ及びＥＣＭすなわちメトキシ−ポリエチレングリコール−ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（Ｍｎ２，０００〜３０，０００、Ｌ：Ｇ １：１）の複合足場の調製を、１．５％溶液となるまで１，４−ジオキサン内で溶解させた。ＵＢＭ含有試料については、攪拌しながらＵＢＭを溶液に加え；０、０．０１７、０．０３８、０．０６４、０．１、０．１５、０．２２５ｇ／足場（０、１０、２０、３０、４０、５０、６０％ｗ／ｗ）、高速混合し、７．３×７．３ｃｍのモールド内に１０ｍｌ注いだ。溶液を−５℃で凍結させ、５時間−２０℃でそして約１５時間２０℃で凍結乾燥した。その後２４時間、試料をデンケータ中で陰圧状態（油圧ポンプ）に置いた。
【００７１】
複合足場の細胞形態及び３Ｄ成長を評価するために、各タイプの足場から生検材料を打ち抜き、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン及びアンフォテリシンＢ）を含有する少量の成長培地中２．５×１０4細胞／ｃｍ2の密度で（初代繊維芽細胞はＤＭＥＭ中の１０％ＦＣＣ中；ＨＵＶＥＣはＥＧＭ−２中；初代ケラチノサイトは、ＫＧＭ−２中）足場の表面上に、初代ヒト繊維芽細胞（継代３）、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、継代４）又は初代ケラチノサイト（継代５）と共に播種した。付加的な成長培地を添加する前に、５％ＣＯ2で３７℃で足場をインキュベートした。足場の細胞付着、形態、成長及び集団の評価を、ニュートラルレッドでの細胞の染色とそれに続くEvolution MP冷却カラーカメラ（Media Cybernetics）の取付けられたLeica ＤＭＩＲＥ2倒立顕微鏡を用いた評価により、実施した。Imsge Pro Plus 5.1ソフトウェア（Media Cybernetics）を用いてデジタル画像を取り込んだ。細胞毒性検出キット（ＬＤＨ、Roche Diagnostics GmbH）を使用することで細胞数を計算した。上述のものと同じやり方で異なる足場タイプの上面に３つの異なる濃度（１．２５×１０4、２．５×１０4及び５×１０4細胞／ｃｍ2）で細胞を播種した。平坦な振とう機上で４℃で２０時間０．５％のＣＨＡＰＳを用いて細胞溶解する前にＰＢＳで足場を洗浄することにより、１日目、３日目及び７日目に足場を評価した。上清をマイクロプレートに移送し、メーカの指示に従ってＬＤＨ量を測定した。
【００７２】
繊維芽細胞
繊維芽細胞の定量測定は、時間の増大につれての細胞数の増加を示したが、ゼラチン足場内のＵＢＭの異なる濃度の間にはいかなる影響も見られなかった（図１）。
【００７３】
ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場中では、細胞は時間及び足場中のＵＢＭの量の両方と共に増大していた（図２）。ＵＢＭ無しのゼラチン足場内の細胞の形態及び３Ｄ成長は、研究の最初の何日かの間、接着性細胞が丸味のある形態で成長しそれらが適用された場所にとどまっていることを示した。これらの細胞は研究の残りの部分の間に僅かであるがさらに紡錘状の形状になった。足場に対し１０％（ｗ／ｗ）のＵＢＭを添加してもこのパターンは変化しなかったが、２０％（ｗ／ｗ）のＵＢＭでは、漸増的数の細胞が、通常の繊維芽細胞様形態を伴う紡錘状細胞となり、細胞は表面上でより大きく広がり始めていた。３０〜４０％（ｗ／ｗ）で、紡錘状細胞の比の最大値が観察され、足場の表面上の細胞成長からより３Ｄの細胞形態を伴う足場の深さ方向への細胞成長への変化が見られた。ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ内では、ＵＢＭの濃度が増大すると足場の上及び中の細胞数が増大するというわずかな例外を除いて、同じパターンが観察された。２０〜３０％（ｗ／ｗ）のＵＢＭでは、細胞の広がりの増加が見られ、さらに多くの細胞が紡鐘状の形態を有していた。４０％（ｗ／ｗ）以上からは、細胞は３Ｄ形態で成長し始めており、表面上で成長する代りに今度は足場の深さ方向に成長していた。
【００７４】
ケラチノサイト
１０％（ｗ／ｗ）ＵＢＭを伴うゼラチン足場の上面に初代ケラチノサイトを播種すると、ＵＢＭ無しの足場に比べ、細胞数が増大した。細胞数の最大値は、研究の最初の何日間かに１０〜２０％（ｗ／ｗ）のＵＢＭで見られたが、研究のその後の期間では、２０〜３０％（ｗ／ｗ）のＵＢＭが最大の効果を示した。ＵＢＭの濃度を増大させると、足場上の細胞数は減少する結果となった（図３）。
【００７５】
ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場上で、最大の細胞数はＵＢＭ無しの足場上で見られた。ＵＢＭの添加により、ＵＢＭの数の増加と共に足場内に見られる細胞数は減少する結果となった。この効果は研究の最後でさらに顕著になった。一般に、濃度の重複のため複製間に比較的大きな変動が見られた（図４）。細胞の形態及び３Ｄ成長は、ゼラチン足場の表面に接着する単一の成長するケラチノサイトを示した。１０％（ｗ／ｗ）のＵＢＭ足場中で、小さなシート内のように互いに密に連結し合った状態で増大した数の細胞が成長していた。この効果は経時的により顕著であると思われ、濃度を２０〜３０％（ｗ／ｗ）ＵＢＭに増大させることでさらに密着した成長がもたらされていたが、これは１０％（ｗ／ｗ）ＵＢＭの場合ほど密なものではなかった。２０〜３０％（ｗ／ｗ）超のＵＢＭでは、細胞数の減少と合わせて、細胞の広がりの増大を伴うより単独の細胞成長が見られた。ＵＢＭ無しのＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場内で、細胞は足場の中央で収集され、ほぼ一枚のシート内のように互いに密接して成長していた。ＵＢＭの濃度を増大させると、細胞数が減少すると共に細胞の広がりは増大する結果となった。２つの最高の濃度において、死細胞が足場構造内に捕捉された状態で発見された。
【００７６】
内皮細胞
Huvecが播種されたゼラチン足場は、最適な２０〜３０％（ｗ／ｗ）前後のＵＢＭ値まで数が増大する傾向を示し、その後減少が見られた（図５）。HuvecでのＭＰＥＧ−ＰＬＧＡは、ＵＢＭの濃度の増大が細胞数の増加を結果としてもたらすことを示した。一般に、Huvecを用いた両方のタイプの足場において隣接する濃度の重複を伴って大きな変動が見られた（図６）。細胞の形態及び３Ｄ成長は、ゼラチン足場内でＵＢＭを３０％（ｗ／ｗ）ＵＢＭまで増大させることで、通常の短かい伸展と共に平坦化する形態を伴って成長する表面に接着するHuvecの能力が上昇することを示した。４０％（ｗ／ｗ）以上では、細胞は、より丸味のある形態と細胞数の減少を伴って成長していた。ＵＢＭ無しのＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場において、Huvecは数が少なく、丸味のある形態で成長し、結果として７日目には細胞は全く無かった。１０〜２０％（ｗ／ｗ）のＵＢＭを足場に添加すると、細胞の広がり効果が得られるが、形態に対する効果は全くない。濃度を３０〜４０％（ｗ／ｗ）超まで増大させると、最適な細胞形態が得られ、濃度をさらに増大させると細胞はさらに一層３Ｄ成長する。一般にＵＢＭを含有するゼラチン及びＭＰＥＧ−ＰＬＧＡの両方の足場の細胞形態及び３Ｄ成長においても、変動が見られた。初代繊維芽細胞、初代ケラチノサイト及びヒト内皮細胞に対するＵＢＭ濃度増加の効果の概要：
【００７７】
【表１】
【００７８】
実施例４：初代繊維芽細胞の細胞形態及び３Ｄ成長に対する、ＥＣＭの滅菌＋／−足場内への取込みの効果
１．５％溶液となるまで、１，４−ジオキサン中にメトキシ−ポリエチレングリコール−ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（Ｍｎ２，０００〜３０，０００、Ｌ：Ｇ １：１）を溶解させた。ＵＢＭ含有試料については、０．０４５ｇの無滅菌ＵＢＭを１０ｍｌの重合体溶液（２３％ｗ／ｗの乾燥物質）に添加し、高速混合し、７×７ｃｍのモールドの中に注いだ。−５℃で溶液を凍結させ、５時間−２０℃でそして約１８時間２０℃で凍結乾燥した。その後、試料を１５時間デシケータ内で陰圧状態（油圧ポンプ）に置いた。
【００７９】
ＵＢＭを伴う及び伴わない試料は、０．１×２５ＫＧｙ及び２×２５ＫＧｙによりベータ照射した。もう１つの試料を同じ要領で調製したが、この場合、予備滅菌したＵＢＭ（２×２５ＫＧｙベータ照射）を使用し（０．０４５ｇ／５ｍｌ溶液）、調製の後試料を滅菌しなかった。
【００８０】
タイプＡ、ブルーム１７５のブタの皮膚由来のゼラチン（Sigma）を、１％溶液となるまで、ｍｉｌｌｉ−Ｑ水及びｔ−ＢｕＯＨ（９５：５）中で溶解させた。５ｍｌの溶液（２３％ｗ／ｗの乾燥物質）に対して０．０１５ｇの無滅菌ＵＢＭを攪拌しながら添加し、モールド（Ｄ＝５ｃｍ）内に注ぎ込んだ。溶液の入ったモールドを１時間＋５℃に置き、その後−２０℃で凍結させ、５時間−２０℃で、そして２０時間２０℃で凍結乾燥した。その後１５時間１２０℃の真空オーブン内で試料を架橋させた。ＵＢＭを伴う及び伴わない試料を０及び１×２５ＫＧｙ及び２×２５ＫＧｙでベータ照射した。もう１つの試料を同じ要領でＵＢＭ無しで調製した。０．１×２５ＫＧｙ及び２×２５ＫＧｙでの調製後、試料を滅菌した。
【００８１】
タイプＡ、ブルーム１７５のブタの皮膚由来のゼラチン（Sigma）を、１％溶液となるまで、ｍｉｌｌｉ−Ｑ水及びｔ−ＢｕＯＨ（９５：５）中で溶解させた。５ｍの溶液（２３％ｗ／ｗの乾燥物質）に対して０．０１５ｇの予備滅菌したＵＢＭ（１×２５ＫＧｙ）を攪拌しながら添加し、モールド（Ｄ＝５ｃｍ）内に注ぎ込んだ。溶液の入ったモールドを１時間＋５℃に置き、その後−２０℃で凍結させ、５時間−２０℃で、そして５０時間２０℃で凍結乾燥した。その後１５時間１３０℃の真空オーブン内で試料を架橋させた。
【００８２】
細胞形態及び３Ｄ成長研究は、ＵＢＭシートへの照射の増大により、ＵＢＭシート上の細胞数は減少するが、細胞の形態に対する効果は全くない、ということを示した。ゼラチン足場及び３０％（ｗ／ｗ）のＵＢＭを伴うゼラチンの中では、細胞数の減少及び標準的な繊維芽細胞様の細胞からさらに丸みのある細胞への形態の変化が見られ、ゼラチン足場内で最大の効果が見られた。ゼラチン足場内に取込む前のＵＢＭ粒子の滅菌は、足場の滅菌前のＵＢＭ粒子の取込みに比べて優れた細胞形態及び３Ｄ成長を提供する。ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ中では、照射の増大は、足場の加湿の増大に起因して繊維芽細胞様の形態をもつ細胞数の増加を結果としてもたらした。３０％（ｗ／ｗ）のＵＢＭを含有するＭＰＥＧ−ＰＬＧＡの足場の照射は、同じくＵＢＭ粒子が足場内への取込み前に照射された足場に比べ、繊維芽細胞のより３Ｄの形態及びさらに一層高い細胞数を結果としてもたらした。
【００８３】
この研究は、照射を受けていないゼラチン足場内で最高の生物活性が達成されること、そして照射が活性を減少させることを示した。反対に、ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場内にＵＢＭ粒子が取込まれ、その後で滅菌された場合に、最高の生物活性が見られた。照射は、ＵＢＭの生物活性を減少させると考えられている。照射は、生物活性との関係において材料に応じてプラス又はマイナス方向に足場材料に影響を及ぼし得る。足場材料（例えばＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ）が滅菌中のＵＢＭの保護効果を有し得ることを示す指摘が存在している。
【００８４】
実施例５：ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ中のＥＣＭの離散粒子
ＵＢＭ粒子を４１％（ｗ／ｗ）含有するＭＰＥＧ−ＰＬＧＡの足場に、少量の成長培地（抗生物物質（ペニシリン、ストレプトマイシン及びアンフォテリシンＢ）を含有するＤＭＥＭ中の１０％ＦＣＳ）中２．５×１０4細胞／ｃｍ2の密度で足場表面上に初代繊維芽細胞を播種した。付加的な成長培地を添加する前に、５％のＣＯ2で３７℃で足場をインキュベートした。７日後に足場を３日間Lillys定着剤中に入れてから、パラフィン内に包埋し、８μｍのスライスに切片化し、Meyerのヘマトキシリンエオジン（ＨＥ）により染色した。Evolution MP冷却カラーカメラ（Media Cybernetics）が取付けられたＢＸ−６０Olympus顕微鏡を用いて、デジタル画像（４倍及び２０倍の倍率）を収集し、Imge Pro Plus ５．１ソフトウェアを用いてデジタル画像を取り込んだ。
【００８５】
ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡの足場中のＥＣＭ粒子の分布のデジタル画像は、ＨＥにより赤色に染色され足場材料と識別された離散ＵＢＭ粒子を示した。足場内で成長する繊維芽細胞は青色に染色された（図７）。
【００８６】
実施例６：ＳＥＭにより示されたＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ中のＵＢＭの離散粒子
実施例１に記述されている通りに足場を調製した。
【００８７】
ＳＥＭ写真は、ＵＢＭ粒を伴う（図９）及び伴わない（図８）ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場を示している。写真は２５０という倍率で足場の上面で撮影される。ＳＥＭ写真は、Danish technological institute（２００５−１６０）で撮影された。
【００８８】
実施例７：ＥＣＭ粒子を保持する足場内の３次元内皮成長及び分化
１．５％溶液となるまで１，４−ジオキサン中にメトキシ−ポリエチレングリコール−ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（Ｍｎ２，０００−３０，０００、Ｌ：Ｇ １：１）を溶解させた。ＵＢＭ含有試料については、１０ｍｌの重合体溶液（２３％ｗ／ｗの乾燥物質）に０．０４５ｇの無滅菌ＵＢＭを添加し、高速混合し、７×７ｃｍのモールドの中に注ぎ込んだ。溶液を−５℃で凍結させ、５時間−２０℃で、そして約１６時間２０℃で凍結乾燥した。その後試料を１５時間、デシケータ内で陰圧状態（油圧ポンプ）に置いた。
【００８９】
臍帯由来の初代ヒト内皮細胞を、ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場及び２３％（ｗ／ｗ）のＵＢＭを含有する足場の表面上で初代ヒト真皮繊維芽細胞と同時培養した。６〜１０日間明確な内皮成長培地内に沈めた状態で構成体を培養し、その後これらをエアリフトしさらに９日間培養した。培養最終日に、構成体を４％のホルマリン緩衝液で定着させ、２等分し、パラフィン包埋した。
【００９０】
ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ（血小板内皮細胞培養分子）の免疫組織化学的ペルオキシターゼ染色により、内皮細胞を５μｍの切片上で視覚化した。繊維芽細胞を同定するために、平行な切片を、ヘマトキシリン対比染色を組合せたＰＥＣＡＭペルオキシダーゼで染色した。内皮成長及び分化は繊維芽細胞性能により影響されることから、全ての足場材料を２つの異なる繊維芽細胞集団を用いてテストしたが、異なる結果をもたらしてはいなかった。
【００９１】
全てのＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場が、繊維芽細胞及び内皮成長を支援している。全てのＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場の体積全体を通して繊維芽細胞が発見された。ＵＢＭ粒子が均質に分布し、足場は培養中無傷状態にとどまる。しかしながらＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場上での内皮細胞及び繊維芽細胞の培養は内皮表面成長のみをもたらし、内皮細胞は足場の上面の隣接する繊維芽細胞により産生されたマトリックスの内部で増殖する。ＵＢＭ粒子を添加することにより、足場のより深い層内での繊維芽細胞及び内皮成長が促進され、内皮細胞は毛細血管様の形態を採用する。内皮細胞は、ＵＢＭ粒子内へと移動するのではなくむしろその表面に沿って誘導される。従って、足場内にＵＢＭ粒子を内含させることで、内皮成長及び分化のきわめて確かな改善が導かれることがわかる。異なる繊維芽細胞集団は、異なる結果をもたらしていなかった。
【００９２】
ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場（図１０）及びＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ中の２３％（ｗ／ｗ）のＵＢＭ（図１１）は、成長がＵＢＭ粒子を保持する深層内へのものである、ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場の表面内での内皮細胞の成長を示している（内皮は赤色に染色される（黒色で示されている）−繊維芽細胞は見えない）。
【００９３】
内皮細胞の毛細血管様の形態は、２３％（ｗ／ｗ）のＵＢＭを保持するＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場のより深い層の中に見られた（図１２）。これらの構造は、ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場内には見られなかった。
【００９４】
実施例８：異なる濃度のＥＣＭ粒子を含有する足場の物理的及び機械的特性
調製された試料：
− ゼラチンマトリックスを伴う、フリーズドライされた足場、
− ゼラチンマトリックスと４０ｗ／ｗのＵＢＭ粒子を伴う、フリーズドライされた足場、
− ゼラチンマトリックスと８０ｗ／ｗのＵＢＭ粒子を伴うフリーズドライされた足場。
【００９５】
タイプＡのブタの皮膚由来のゼラチン（ＰＧ−８８２−６Gelita）を、１％溶液となるまで、ｍｉｌｌｉ−Ｑ水及びｔ−ＢｕＯＨ（９５：５）中で溶解させた。ＵＢＭ含有試料については、攪拌しながらＵＢＭを溶液に加えた（４０％ｗ／ｗ；０．０３３ｇ／５ｍｌ、８０％ｗ／ｗ：０．２ｇ／５ｍｌ）。５ｍｌのＵＢＭ含有ゼラチン溶液をモールド（Ｄ＝５ｃｍ）内に注ぎ込んだ。溶液の入ったモールドを２．５時間＋５℃に置き、その後−２０℃で凍結させ、５時間−２０℃で、そして１００時間２０℃で凍結乾燥した。その後１５時間１２０℃の真空オーブン内で試料を架橋させた。
【００９６】
調製された試料：
− ＰＬＧＡマトリックスを伴う、フリーズドライされた足場、
− ＰＬＧＡマトリックスと４０ｗ／ｗのＵＢＭ粒子を伴う、フリーズドライされた足場、
− ＰＬＧＡマトリックスと８０ｗ／ｗのＵＢＭ粒子を伴うフリーズドライされた足場。
【００９７】
１．５％溶液となるまで１，４−ジオキサン中にメトキシ−ポリエチレングリコール−ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（Ｍｎ２，０００−３０，０００、Ｌ：Ｇ １：１）を溶解させた。ＵＢＭ含有試料については、１０ｍｌの重合体溶液（４０％ｗ／ｗ；０．１ｇ／１０ｍｌ、８０％（ｗ／ｗ）；０．６ｇ／１０ｍｌ）にＵＢＭを添加し、高速混合し、７×７ｃｍのモールドの中に注ぎ込んだ。溶液を１，４−ジオキサン層上にて−５℃で凍結させ、５時間−２０℃で、そして約１００時間２０℃で凍結乾燥した。その後試料を１５時間、デシケータ内で陰圧状態（油圧ポンプ）に置いた。
【００９８】
物理的特性及び機械的試験
マトリックス材料及び添加されるＵＢＭの量に応じて異なる物理的及び機械的特性を達成することができる。
・ 添加されたＵＢＭの量に伴い気孔率は減少し、かくして密度は増大する。
・ マトリックスが疎水性である場合、ＵＢＭは大きい湿潤性を提供することになる。
・ ゼラチン足場は、少なくとも最高４０％（ｗ／ｗ）まではその引張り強度を保持し、その後、それは減少し、一方、ＰＬＧＡ足場はＵＢＭ粒子によってわずかに強化される。フリーズドライプロセスと組合わさって低い材料濃度は低い引張り強度を与え、このことは当該例中の試料についてもあてはまる。
【００９９】
【表２】
【０１００】
【表３】
【０１０１】
高さはノギスで測定される。
【０１０２】
密度は以下の式から計算される：
密度＝質量／（面積×高さ）
【０１０３】
気孔率は以下の式から計算される：
気孔率＝（重合体密度−試料密度）／重合体密度。
【０１０４】
重合体密度は、添加されるＵＢＭ（３ｍｇ／ｃｍ3）に応じて重量調整される。
【０１０５】
湿潤性は、水滴が試料により完全に吸収される時間として計算され、写真監視される。
【０１０６】
【表４】
【０１０７】
【表５】
【０１０８】
引張り試験は、Stable Micro Systems社製Texture Analyzer上で実施された。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】３つの異なる濃度（細胞／ｃｍ2）でのヒト初代繊維芽細胞が播種されたゼラチン足場のＬＤＨ測定値。棒は、Ａｂｓで測定された３日目の成長を表わす。
【図２】３つの異なる濃度（細胞／ｃｍ2）でのヒト初代繊維芽細胞が播種されたＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場のＬＤＨ測定値。棒は、Ａｂｓで測定された３日目の成長を表わす。
【図３】３つの異なる濃度（細胞／ｃｍ2）でのヒト初代ケラチノサイトが播種されたゼラチン足場のＬＤＨ測定値。棒は、Ａｂｓで測定された３日目の成長を表わす。
【図４】３つの異なる濃度（細胞／ｃｍ2）でのヒト初代ケラチノサイトが播種されたＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場のＬＤＨ測定値。棒は、Ａｂｓで測定された３日目の成長を表わす。
【図５】３つの異なる濃度（細胞／ｃｍ2）でのヒト初代臍細胞内皮細胞が播種されたゼラチン足場のＬＤＨ測定値。棒は、Ａｂｓで測定された３日目の成長を表わす。
【図６】３つの異なる濃度（細胞／ｃｍ2）でのヒト初代臍細胞内皮細胞が播種されたＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場のＬＤＨ測定値。棒は、Ａｂｓで測定された３日目の成長を表わす。
【図７】ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場内のＥＣＭ粒子の分布のデジタル画像である。
【図８】ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場のＳＥＭ写真（倍率２５０倍）である。
【図９】４０％のＥＣＭ粒子を含有するＭＰＥＧ−ＰＬＧＡのＳＥＭ写真（倍率２５０倍）である。
【図１０】ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ足場内の内皮成長のデジタル画像である。
【図１１】２３％のＥＣＭ粒子を含有するＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ中の内皮成長のデジタル画像である。
【図１２】足場のより深い層内の毛細血管様の形態の拡大図を示す、２３％のＥＣＭ粒子を含有するＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ内の内皮成長のデジタル画像である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＣＭの不連続領域の濃度が２０％（ｗ／ｗ）から６０％（ｗ／ｗ）の間にある、ＥＣＭの不連続領域を含んで成る仮連続足場。
【請求項２】
生分解性である、請求項１に記載の仮足場。
【請求項３】
ＥＣＭの不連続領域が均質に分布させられている、請求項１又は２に記載の仮足場。
【請求項４】
生分解性足場がタンパク質含有物質で作られている、請求項１〜３のいずれかに記載の仮足場。
【請求項５】
生分解性足場が多糖類含有物質で作られている、請求項１〜３のいずれかに記載の仮足場。
【請求項６】
生分解性足場が合成重合体含有物質で作られている、請求項１〜３のいずれかに記載の仮足場。
【請求項７】
生分解性足場が請求項４〜６に記載される材料のいずれかの組合せで作られている、請求項１〜６のいずれかに記載の仮足場。
【請求項８】
相互連結された開放気孔を有する請求項１〜７のいずれかに記載の仮足場。
【請求項９】
０．１〜８ｍｍの厚みを有する、請求項１〜８のいずれかに記載の仮足場。
【請求項１０】
製品が滅菌済みであることの表示をパッケージに付されて、足場がバクテリアタイト（bacterial tight）な状態で包装されている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の仮足場。
【請求項１】
ＥＣＭの不連続領域の濃度が２０％（ｗ／ｗ）から６０％（ｗ／ｗ）の間にある、ＥＣＭの不連続領域を含んで成る仮連続足場。
【請求項２】
生分解性である、請求項１に記載の仮足場。
【請求項３】
ＥＣＭの不連続領域が均質に分布させられている、請求項１又は２に記載の仮足場。
【請求項４】
生分解性足場がタンパク質含有物質で作られている、請求項１〜３のいずれかに記載の仮足場。
【請求項５】
生分解性足場が多糖類含有物質で作られている、請求項１〜３のいずれかに記載の仮足場。
【請求項６】
生分解性足場が合成重合体含有物質で作られている、請求項１〜３のいずれかに記載の仮足場。
【請求項７】
生分解性足場が請求項４〜６に記載される材料のいずれかの組合せで作られている、請求項１〜６のいずれかに記載の仮足場。
【請求項８】
相互連結された開放気孔を有する請求項１〜７のいずれかに記載の仮足場。
【請求項９】
０．１〜８ｍｍの厚みを有する、請求項１〜８のいずれかに記載の仮足場。
【請求項１０】
製品が滅菌済みであることの表示をパッケージに付されて、足場がバクテリアタイト（bacterial tight）な状態で包装されている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の仮足場。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２００９−５１３２０７（Ｐ２００９−５１３２０７Ａ）
【公表日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３７１０５（Ｐ２００８−５３７１０５）
【出願日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６７８３７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０４８８３１
【国際公開日】平成１９年５月３日（２００７．５．３）
【出願人】（５０００８５８８４）コロプラスト アクティーゼルスカブ (153)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６７８３７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０４８８３１
【国際公開日】平成１９年５月３日（２００７．５．３）
【出願人】（５０００８５８８４）コロプラスト アクティーゼルスカブ (153)
【Ｆターム（参考）】
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