Ｅｎｉｇｍａ―Ｍｄｍ２相互作用及びその用途
【課題】Ｅｎｉｇｍａ（ＰＤＬＩＭ７）−Ｍｄｍ２相互作用及びその使用。
【解決手段】本発明は、癌細胞でＥｎｉｇｍａの発現または活性抑制が、Ｍｄｍ２の不安定化とｐ５３の活性化を誘導することにより、効果的な癌細胞死滅を誘導することができ、ＳＲＦによって誘導されるＥｎｉｇｍａが、Ｍｄｍ２と共に癌組織で過発現されることを測定することによって、抗癌剤治療の予後を評価することができ、ＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２間の特異的相互結合を阻害する因子を選別することによって抗癌活性物質をスクリーニングすることができる。本発明のＥｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２相互作用及びＥｎｉｇｍａの発現調節は、癌予防及び治療方法、及び抗癌剤開発に有用に使用することができる。
【解決手段】本発明は、癌細胞でＥｎｉｇｍａの発現または活性抑制が、Ｍｄｍ２の不安定化とｐ５３の活性化を誘導することにより、効果的な癌細胞死滅を誘導することができ、ＳＲＦによって誘導されるＥｎｉｇｍａが、Ｍｄｍ２と共に癌組織で過発現されることを測定することによって、抗癌剤治療の予後を評価することができ、ＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２間の特異的相互結合を阻害する因子を選別することによって抗癌活性物質をスクリーニングすることができる。本発明のＥｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２相互作用及びＥｎｉｇｍａの発現調節は、癌予防及び治療方法、及び抗癌剤開発に有用に使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｅｎｉｇｍａ（ＰＤＬＩＭ７）−Ｍｄｍ２相互作用及びその用途に関するもので、より詳細には、ＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２間の相互作用及びＥｎｉｇｍａ発現調節を用いた癌治療方法及び抗癌剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ｐ５３は、細胞の増殖の停止及び死滅を調節する遺伝子を調節する因子であり、非正常的な細胞を除去することによって正常細胞が癌細胞になることを防いでくれる重要な因子として知られている（非特許文献１）。ｐ５３活性は、正常細胞の生存のために非常に厳格に調節されていて、前記調節を主に担当するのは、Ｈｄｍ２／Ｍｄｍ２（ｈｕｍａｎ／ｍｏｕｓｅ ｄｏｕｂｌｅ ｍｉｎｕｔｅ２；以下Ｍｄｍ２とする）である。前記Ｍｄｍ２は、ｐ５３をユビキチン化させて分解するＥ３ユビキチンリガーゼとしてｐ５３の細胞内濃度を調節する（非特許文献２、３、４）。また、Ｍｄｍ２は、ｐ５３の転写調節を受けて発現が調節される自己調節ループを形成する（非特許文献５）。また、前記Ｍｄｍ２は、ｐ５３以外にＭｄｍ２自体をユビキチン化させて分解する（非特許文献６、７）。
【０００３】
Ｍｄｍ２は、ｐ５３を不活性化させたり独自的に発癌性遺伝子を作動させたりし、実際にヒトの色々な癌組織に過発現されている（非特許文献８）。野生型のｐ５３を有している癌細胞でのＭｄｍ２機能の制御は、癌細胞の死滅を誘導することができるので、Ｍｄｍ２は、抗癌剤開発の有用な標的になっている（非特許文献９）。しかし、Ｍｄｍ２の機能制御によるｐ５３安定化による細胞死滅は、癌細胞だけではなく正常細胞でも起きて深刻な副作用をもたらし得るため、癌細胞において、より選択的にＭｄｍ２を調節することができる経路の解明が切実に求められている。
【０００４】
ＰＤＬＩＭ７タンパク質Ｅｎｉｇｍａは、ＰＤＺ及びＬＩＭドメインを有している（非特許文献１０）。前記ＥｎｉｇｍａのＬＩＭドメインは、三つのＺｉｎｃフィンガーで構成され、タンパク質キナーゼまたはインスリン信号伝達の連結因子等と結合する（非特許文献１１、１２、１３）。また、Ｅｎｉｇｍａは、甲状腺癌誘発因子であるＲｅｔ／ｐｔｃ２と結合して活性化させる（非特許文献１４）。しかし、Ｅｎｉｇｍａの細胞内機能は、明確には解明されていない。
【０００５】
Ｍｄｍ２を安定化させてｐ５３の活性を弱化させられることが知られた因子として、ＹＹ１、Ｇａｎｋｙｒｉｎ、Ｄａｘｘなどがある。前記ＹＹ１は、Ｍｄｍ２とｐ５３に結合してｐ５３の分解を促進させ、ＧａｎｋｙｒｉｎはＭｄｍ２の酵素活性を促進させてｐ５３の分解を促進させる（非特許文献１５、１６）。前記Ｄａｘｘは、Ｍｄｍ２と結合してＭｄｍ２を安定化させてｐ５３を抑制するが、Ｍｄｍ２の自己ユビキチン化活性には影響を与えない（非特許文献１７）。細胞が増殖する場合、Ｍｄｍ２の発現が増加するが（非特許文献１８）、その機序に対する意見は明確ではない。
【０００６】
それで、本発明者等は、Ｅｎｉｇｍａの機能を調査した結果、ＥｎｉｇｍａがＭｄｍ２依存的にｐ５３と結合してＭｄｍ２の自己ユビキチン化を特異的に阻害しながら、Ｍｄｍ２依存的ｐ５３ユビキチン化を促進してｐ５３分解を促進させるという点で、従来のＭｄｍ２−ｐ５３経路調節因子等と明確に差別化される新しいＭｄｍ２−ｐ５３調節機序を明らかにした。また、細胞が増殖する条件及びヒトの肝癌及び胃癌組織で、ＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２経路の存在がｐ５３を弱化させられることを初めて明らかにした。同時に、細胞でのＥｎｉｇｍａの過発現は、細胞生存能の増加及び抗癌剤耐性を誘導することを明らかにした。したがって、癌細胞においてＥｎｉｇｍａの発現を抑制してｐ５３を活性化させることができ、Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２相互結合阻害因子を選別して抗癌剤をスクリーニングすることができ、抗癌剤治療時にＥｎｉｇｍａの発現程度を確認して抗癌効果確認に使用できることを明らかにして、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍｉｃｈａｅｌ ａｎｄ Ｏｒｅｎ，Ｃｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．，２００３年，第１３巻，ｐ．４９−５８
【非特許文献２】Ｈａｕｐｔ等，Ｎａｔｕｒｅ，１９９７年，第３８７巻，ｐ．２９６−２９９
【非特許文献３】Ｈｏｎｄａ等，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９７年，第４２０巻，ｐ．２５−２７
【非特許文献４】Ｋｕｂｂｕｔａｔ等，Ｎａｔｕｒｅ、１９９７年，第３８７巻，ｐ．２９９−３０２
【非特許文献５】Ｍｉｃｈａｅｌ ａｎｄ Ｏｒｅｎ，Ｃｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．，２００３年，第１３巻，ｐ．４９−５８
【非特許文献６】Ｆａｎｇ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０００年，第２７５巻，ｐ．８９４５−８９５１
【非特許文献７】Ｈｏｎｄａ ａｎｄ Ｙａｓｕｄａ，Ｏｎｃｏｇｎｅ，２０００年，第１９巻，ｐ．４１７３−４１７６
【非特許文献８】Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００４年，第２巻，ｐ．１−８
【非特許文献９】Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２００７年，第３９巻，ｐ．１４７６−１４８２
【非特許文献１０】Ｂａｃｈ，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．，２０００年，第９１巻，ｐ．５−１７
【非特許文献１１】Ｂａｒｒｅｓ等，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，２００６年，第２０巻，ｐ．２８６４−２８７５
【非特許文献１２】Ｋｕｒｏｄａ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６年，第２７１巻，ｐ．３１０２９−３１０３２
【非特許文献１３】Ｗｕ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６年，第２７１巻，ｐ．１５９３４−１５９４１
【非特許文献１４】Ｄｕｒｉｃｋ等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９８年，第１８巻，ｐ．２２９８−２３０８
【非特許文献１５】Ｓｕｉ等，Ｃｅｌｌ，２００４年，第１１７巻，ｐ．８５９−８７２
【非特許文献１６】Ｈｉｇａｓｈｉｔｓｕｊｉ等，Ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ，２００５年，第８巻，ｐ．７５−８７
【非特許文献１７】Ｔａｎｇ等，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２００６年，第８巻，ｐ．８５５−８６２
【非特許文献１８】Ｆｅｎｇ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００４年，第２７９巻，ｐ．３５５１０−３５５１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、Ｅｎｉｇｍａの細胞内機能と癌発生及び癌細胞の生存との関連性を解明して、Ｅｎｉｇｍａの発現を阻害することによって癌細胞の死滅を誘導する方法及び製剤を提供して、ＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２間の相互結合またはＥｎｉｇｍａによるＭｄｍ２とｐ５３の発現調節を用いて、抗癌剤候補物質をスクリーニングする方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明は、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を有効成分として含む抗癌用組成物を提供する。
【００１０】
また、本発明は、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を有効成分として含む抗癌補助剤を提供する。
【００１１】
また、本発明は、薬学的に有効な量のＥｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を、癌にかかった個体に投与する工程を含む癌治療方法を提供する。
【００１２】
また、本発明は、薬学的に有効な量のＥｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を、個体に投与する工程を含む癌予防方法を提供する。
【００１３】
また、本発明は、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制を通じてＭｄｍ２の安定性を減少させて、ｐ５３の活性を増加させる方法を提供する。
【００１４】
また、本発明は、Ｅｎｉｇｍａに依存的なＭｄｍ２またはｐ５３の発現水準を用いた抗癌剤候補物質のスクリーニング方法を提供する。
【００１５】
また、本発明は、ＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２間の相互結合水準を用いた抗癌剤候補物質のスクリーニング方法を提供する。
【００１６】
また、本発明は、癌細胞でのＥｎｉｇｍａ発現水準を用いた癌の診断、治療結果確認または予後を評価する方法を提供する。
【００１７】
また、本発明は、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を含む癌の診断、治療結果確認または予後評価用キットを提供する。
【００１８】
また、本発明は、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を抗癌用組成物の製造に使用する用途を提供する。
【００１９】
また、本発明は、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を抗癌補助剤の製造に使用する用途を提供する。
【００２０】
同時に、本発明は、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を癌の診断、治療結果確認または予後評価用キットの製造に使用する用途を提供する。
【００２１】
本発明（１）は、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を有効成分として含む抗癌用組成物である。
本発明（２）は、前記Ｅｎｉｇｍａの発現抑制剤が、Ｅｎｉｇｍａ遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド、短干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）及びＲＮＡｉからなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする本発明（１）の抗癌用組成物である。
本発明（３）は、前記Ｅｎｉｇｍａの活性抑制剤が、Ｅｎｉｇｍａタンパク質に相補的に結合する化合物、ペプチド、ペプチドミメティクス及び抗体からなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする本発明（１）の抗癌用組成物である。
本発明（４）は、前記短干渉ＲＮＡが、配列番号２あるいは３で表わされる塩基配列を有することを特徴とする本発明（２）の抗癌用組成物である。
本発明（５）は、前記癌が、胃癌、肝癌及び大腸癌からなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする本発明（１）の抗癌用組成物である。
本発明（６）は、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を有効成分として含む抗癌補助剤である。
本発明（７）は、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を癌にかかった個体に投与する工程を含む癌治療方法である。
本発明（８）は、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制を通じてＨｄｍ２／Ｍｄｍ２（ｈｕｍａｎ／ｍｏｕｓｅ ｄｏｕｂｌｅ ｍｉｎｕｔｅ ２）の安定性を減少させる方法である。
本発明（９）は、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制を通じてｐ５３の活性を増加させる方法である。
本発明（１０）は、
１）候補物質が存在するまたは存在しない条件下でＥｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２を接触させる工程、
２）Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２の結合水準を測定する工程、及び
３）候補物質が存在しない時と比較してＥｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２の結合水準を減少させた候補物質を選別する工程を含む、抗癌剤候補物質のスクリーニング方法である。
本発明（１１）は、
１）Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２を発現する細胞と候補物質を接触させる工程と、
２）細胞内Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２の結合水準を測定する工程、及び
３）候補物質を処理しない対照群と比較して細胞内Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２の結合水準を減少させた候補物質を選別する工程とを含む、抗癌剤候補物質のスクリーニング方法である。
本発明（１２）は、
１）Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２を発現する細胞に候補物質を処理する工程と、
２）ＥｎｉｇｍａまたはＭｄｍ２の発現水準を測定する工程、及び
３）候補物質を処理しない対照群と比較してＥｎｉｇｍａまたはＭｄｍ２の発現水準を減少させた候補物質を選別する工程とを含む、抗癌剤候補物質のスクリーニング方法である。
本発明（１３）は、
１）Ｅｎｉｇｍａ、Ｍｄｍ２及びｐ５３を発現する細胞に候補物質を処理する工程と、
２）ｐ５３の発現水準を測定する工程、及び
３）候補物質を処理しない対照群と比較してｐ５３の発現水準を増加させた候補物質を選別する工程とを含む、抗癌剤候補物質のスクリーニング方法である。
本発明（１４）は、Ｅｎｉｇｍａと反応する抗体またはＥｎｉｇｍａ遺伝子に相補的な核酸のうちのいずれか一つ以上を用いて、癌細胞でのＥｎｉｇｍａ発現水準を測定する工程を含む、癌の診断、治療結果確認または予後を評価する方法である。
本発明（１５）は、Ｅｎｉｇｍａと反応する抗体またはＥｎｉｇｍａ遺伝子に相補的な核酸のうちのいずれか一つ以上を含む癌診断用キットである。
【発明の効果】
【００２２】
上述のように、癌細胞でのＥｎｉｇｍａの過発現は、Ｍｄｍ２の安定化とｐ５３の減少を招来し、これは、Ｍｄｍ２の自己ユビキチン化の抑制とｐ５３ユビキチン化増加によるものであることを確認した。したがって、Ｅｎｉｇｍａの発現を抑制することで、癌細胞を効果的に死滅させることができ、癌患者のＥｎｉｇｍａの発現を測定することで、抗癌治療時の予後を評価することができ、ＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２間に特異的相互結合を確認し、それを抑制する物質を選別することで、Ｍｄｍ２の安定化を弱化してｐ５３の活性を増加させて抗癌活性を示すことができる物質をスクリーニングできることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ｓｉ−Ｅｎｉｇｍａを含むベクターを示す模式図である。
【図２】Ｆ−Ｅｎｉｇｍａを発現するアデノウイルスを製作する方法を示す模式図である。
【図３】ｓｉ−Ｅｎｉｇｍａを含むアデノウイルスを製作する方法を示す模式図である。
【図４】ａは、Ｅｎｉｇｍａが過発現になった時、Ｍｄｍ２が安定化してｐ５３が分解されることが、ユビキチンプロテオゾーム分解経路であることを示すウエスタンブロット写真である。ｂは、Ｅｎｉｇｍａによるｐ５３タンパク質の減少が、ｐ５３の活性の減少で示されるということをレポーター分析方法で確認した図である。ｃは、Ｅｎｉｇｍａ過発現時にＭｄｍ２、ｐ５３、ｐ２１のｍＲＮＡ水準の変化をノーザンブロットで確認した写真である。ｄ及びｅは、ＥｎｉｇｍａによるＭｄｍ２の調節は、ｐ５３に非依存的で、Ｅｎｉｇｍａによるｐ５３と下位ｐ２１の調節は、Ｍｄｍ２に依存的であることを示すウエスタンブロット写真である。
【図５】ａ及びｂは、細胞内でＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２間の結合がｐ５３に非依存的で、Ｅｎｉｍｇａ−ｐ５３結合は、Ｍｄｍ２依存的に起きることを示すウエスタンブロット写真である。ｃは、試験管でＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２間の結合がｐ５３に非依存的で、Ｅｎｉｍｇａ−ｐ５３結合はＭｄｍ２依存的に起きることを示すウエスタンブロット写真である。ｄは、Ｅｎｉｇｍａが結合するＭｄｍ２の部位が４００−４９１であることを示した模式図とウエスタンブロット写真である。ｅ及びｆは、Ｍｄｍ２が結合するＥｎｉｇｍａの部位が、ＬＩＭ３であることを示した模式図とウエスタンブロット写真である。ｇは、Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２−ｐ５３間の相互結合を示した模式図である。
【図６】ａは、ＥＮＨ（Ｅｎｉｇｍａ ｈｏｍｏｌｏｇ）がＭｄｍ２と結合しないことを示すウエスタンブロット写真である。ｂは、ＥＮＨはＭｄｍ２−ｐ５３の細胞内濃度に影響を与えないことを示すウエスタンブロット写真である。
【図７】ａ及びｂは、細胞内でＥｎｉｇｍａが過発現されると、Ｍｄｍ２の自己ユビキチン化が阻害されながらｐ５３のユビキチン化が増加し、Ｅｎｉｇｍａの発現を抑制した時、現象が逆転することを示すウエスタンブロット写真である。ｃは、ＥｎｉｇｍａのＬＩＭ３ドメインがＭｄｍ２と結合してＭｄｍ２の自己ユビキチン化を抑制することを示すウエスタンブロット写真である。ｄは、ＥｎｉｇｍａによってＭｄｍ２がｐ５３をユビキチン化することが増加されることを示したウエスタン写真である。
【図８】ＥｎｉｇｍａがＰＣＡＦによるＭｄｍ２ユビキチン化には影響を与えないとことをインビトロ及び細胞内で検証した図である。
【図９】ａは、Ｅｎｉｇｍａのプロモーター部位のＳＲＥ存在とＳＲＥ除去突然変異体を示した模式図である。ｂは、Ｅｎｉｇｍａのプロモーターが血清によって活性化することをレポーター分析で示した図である。ｃ及びｄは、ＥｎｉｇｍａのプロモーターでＳＲＥ部位が血清、ＦＧＦ、及びＨＧＦによる活性化に重要部位であることを示した図である。ｅ及びｆは、ＥｎｉｇｍａプロモーターのＳＲＥ部位にＳＲＦが特異的に結合することを示したＥＭＳＡとＣｈＩＰ分析結果である。
【図１０】ａ及びｂは、血清によってＳＲＦとＥｎｉｇｍａの転写活性化が誘導されてタンパク質水準が増加し、それによってＭｄｍ２のタンパク質量が増加してｐ５３が抑制されることを示すウエスタンブロット写真とＲＴ−ＰＣＲ写真である。ｃ及びｄは、ＨＧＦによって誘導されるＭｄｍ２の安定化が、ＳＲＦとＥｎｉｇｍａに依存的であることを示すウエスタンブロット写真である。ｅは、ＨＧＦによるＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２経路の活性化が、ＭＡＰキナーゼに依存的であることを暗示すウエスタンブロット写真である。ｆないしｈは、ＨＧＦによるＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２経路の活性化が、実際マウスの肝にも存在することを示したウエスタンブロットとＲＴ−ＰＣＲ写真である。
【図１１】ａ及びｂは、血清が制限される条件で、ＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２経路の抑制を示したウエスタンブロットとＲＴ−ＰＣＲ写真である。
【図１２】ａとｂは、ヒトの正常繊維細胞でもＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２経路が存在し、ＭＡＰキナーゼに依存的な事実を示したウエスタンブロットとＲＴ−ＰＣＲ写真である。ｃとｄは、マウス胎児の正常繊維細胞でもＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２経路が存在し、ＭＡＰキナーゼに依存的な事実を示したウエスタンブロットとＲＴ−ＰＣＲ写真である。
【図１３】ａは、ヒトの肝癌組織と胃癌組織でＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２が過発現されていて、ｐ５３は発現されていないことを示すウエスタンブロット写真である。ｂは、ヒトの胃癌、大腸癌組織でＥｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２がともに過発現していることを示す蛍光抗体染色写真である。
【図１４】ａ及びｂは、Ｅｎｉｇｍａがアドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ；ＡＤＲ）による細胞殺傷力をｐ５３依存的に弱化させて、Ｅｎｉｇｍａが細胞生存能を増加させることを示した細胞計数法とクリスタルバイオレット染色写真である。ｃは、ＡＤＲ処理時にＥｎｉｇｍａの発現量によるＭｄｍ２−ｐ５３の発現変化を示すウエスタンブロット写真である。ｄは、ＡＤＲ処理時にＥｎｉｇｍａが細胞死滅をｐ５３依存的に調節することを示したＴＵＮＥＬ検証及び細胞周期分析写真である。
【図１５】ａ及びｂは、ｐ５３が発現されない細胞株の増殖にＥｎｉｇｍａが及ぼす影響を示した図で、ｃ及びｄは、前記条件でＭｄｍ２−ｐ５３発現様相を調査したウエスタンブロット及びクリスタルバイオレット染色写真である。
【図１６】ａ及びｂは、ＨＬＫ３肝癌細胞株でＥｎｉｇｍａによってアドリアマイシン（ＡＤＲ）耐性が誘発されて、Ｅｎｉｇｍａの発現を抑制すると癌細胞の抗癌剤感受性が高くなることを示した細胞計数法とウエスタンブロット写真である。ｃ及びｄは、ＡＤＲの外にエトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）またはｎｕｔｌｉｎ３ａのようなｐ５３を活性化させる抗癌剤処理時にも、ＥｎｉｇｍａはＭｄｍ２−ｐ５３を調節して細胞の自殺を妨害することを示す細胞計数法とウエスタンブロット写真である。ｅ及びｆは、実際マウス腫瘍モデルで、Ｅｎｉｇｍａが過発現されるとＡＤＲに対して抵抗性が生じて、Ｅｎｉｇｍａの発現が抑制されると腫瘍の成長が効果的に抑制されることを示したグラフと腫瘍塊の写真である。ｇは、マウス腫瘍塊内のＥｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２−ｐ５３の発現変化を示すウエスタンブロット写真である。
【図１７】ａは、図１６のａの条件でＨＬＫ細胞をクリスタルバイオレットで染色した写真であり、ｂは、図１６のａの条件でＨＬＫ細胞の周期を分析した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明で使用する用語を定義する。
【００２５】
本発明で使用する用語「予防」は、本発明の組成物の投与で癌の成長または転移を抑制するすべての行為を意味する。
【００２６】
本発明で使用する用語「治療」は、本発明の組成物の投与で癌の症状が好転または有利に変化するすべての行為を意味する。
【００２７】
本発明で使用する用語「投与」は、任意の適切な方法で個体に所定の本発明の組成物を提供することを意味する。
【００２８】
本発明で使用する用語「個体」は、本発明の組成物を投与して癌の症状が好転し得る疾患を有したヒト、サル、イヌ、ヤギ、ブタまたはネズミなどすべての動物を意味する。
【００２９】
本発明で使用する用語「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な受恵または危険の割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、これは個体の癌の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出割合、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素及びその他の医学分野でよく知られた要素によって決定され得る。
【００３０】
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明は、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制を通じてＭｄｍ２の安定性を減少させて、ｐ５３の活性を増加させる方法を提供する。
【００３１】
本発明者等は、Ｅｎｉｇｍａの発現に依存的にＭｄｍ２の安定性が調節されることを確認し（図４のａ、ｄ及びｅ参照）、Ｍｄｍ２はｐ５３を基質とするＥ３リガーゼなので、Ｍｄｍ２の安定化がｐ５３のユビキチンプロテオゾーム分解を促進してｐ５３の細胞内機能を抑制することを確認し（図４のａないしｅ参照）、ＥｎｉｇｍａによってＭｄｍ２の自己ユビキチン化が抑制されてｐ５３のユビキチン化が増加することを確認した（図７のａないしｄ参照）。
【００３２】
また、本発明者等は、ＥｎｉｇｍａによるＭｄｍ２−ｐ５３の発現調節が細胞の成長に及ぼす影響を調べるため、成長促進因子による細胞増殖誘導条件でＥｎｉｇｍａの機能を確認した結果、ＥｎｉｇｍａはＳＲＦによってその発現が促進され、Ｍｄｍ２を安定化させてｐ５３を抑制することによって細胞増殖を助ける役割をしていることが示された（図９のａないしｆ参照、及び図１０のａないしｅ参照）。
【００３３】
本発明のＥｎｉｇｍａの発現または活性抑制は、Ｅｎｉｇｍａ遺伝子の転写を抑制する物質、転写されたＥｎｉｇｍａｍＲＮＡの翻訳を抑制する物質、またはＥｎｉｇｍａタンパク質の機能を抑制する物質からなる群から選択されるものを使用することが好ましいが、これに限定されない。
【００３４】
前記転写抑制する物質には、Ｅｎｉｇｍａ遺伝子の転写を調節することが知られているプロモーター、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）、プロモーターに結合される転写調節因子に結合するタンパク質または化合物を使用することが好ましいが、これに限定されない。
【００３５】
前記ｍＲＮＡの翻訳を抑制する物質には、低分子化合物、アンチセンス核酸配列の製造やＲＮＡｉテクニックを用いたＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどを使用することが好ましいが、これに限定されない。
【００３６】
これを具体的に詳しく見ると下記のようになる。
１）ＲＮＡｉ
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、Ｅｎｉｇｍａ遺伝子に対応する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞または有機体に導入することにより、対応するｍＲＮＡの分解が起きる転写後遺伝子サイレンシングメカニズム（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）である。前記ＲＮＡｉ効果によって遺伝子発現が復帰される前に多重細胞分裂が持続するので、ＲＮＡｉはＲＮＡレベルで目標とするノックアウト（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）または「ノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）」を作る非常に強力な方法である。ＲＮＡｉは、ヒトの胚芽腎臓（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ）及びＨｅＬａ細胞を含むヒト細胞において成功的であることが確認された（Ｅｌｂａｓｈｉｒ等，Ｎａｔｕｒｅ，２００１年，第４１１巻，ｐ．４９４−４９８）。
【００３７】
遺伝子サイレンシングでのＲＮＡｉ技術は、標準分子生物学方法を用いる。不活性化させる標的遺伝子の配列に対応するｄｓＲＮＡは、標準方法、例えば、Ｔ７ ＲＮＡ重合酵素を用いた鋳型ＤＮＡの両鎖同時転写によって生成することができる。 ＲＮＡｉに使われるｄｓＲＮＡの生成キットは、商業的に販売されている製品（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．社の製品）を使用することができる。ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを製造するように処理されたプラスミドのトランスフェクション方法は、従来公知の技術である。
【００３８】
２）ｓｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡは、特定ｍＲＮＡの切断を通じてＲＮＡｉ現象を誘導することができる短い二重鎖ＲＮＡを意味する。
【００３９】
ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ同士が対をなす二重鎖ＲＮＡ部分が完全に対をなすことに限定されないで、ミスマッチ（対応する塩基が相補的ではない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）などによって対をなさない部分が含まれ得る。対をなす塩基の長さは、Ｅｎｉｇｍａの活性及び発現を妨害できる、１０ないし４０塩基、好ましくは１５ないし３０塩基である。ｓｉＲＮＡ末端構造は、標的遺伝子の発現をＲＮＡｉ効果よって抑制することができるものなら平滑末端または突出末端すべて可能である。粘着末端構造は、３’末端突出構造と５’末端の方が突出した構造すべて可能である。突出する塩基数は、限定されない。例えば、塩基数は１ないし８塩基、好ましくは２ないし６塩基であり得る。本明細書で、ｓｉＲＮＡの長さは、ポリヌクレオチドが対を成す長さである。ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現抑制効果を維持することができる範囲で例えば、一方の末端突出部分に低分子ＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ウイルスＲＮＡのような天然のＲＮＡ分子または人工のＲＮＡ分子）を含むことができる。ｓｉＲＮＡ末端構造は、両側すべてが切断構造を有する必要はなく、二重鎖ＲＮＡの一方の末端部位がリンカーＲＮＡによって接続されたステムループ型構造であることも可能である。リンカーの長さは、ステム部分の対をなすのに支障ない長さなら特別に限定されない。
【００４０】
ｓｉＲＮＡを公知された遺伝子で設計して製造する方法に対する開示内容として、例えば、文献［Ｃｈａｌｋ ＡＭ，Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ Ｃ，Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ ＥＬ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｎｄ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｓｉＲＮＡ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００４年６月１８日，第３１９（１）巻，ｐ．２６４−７４；Ｓｉｏｕｄ Ｍ，Ｌｅｉｒｄａｌ Ｍ．，Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｒｕｌｅｓ ａｎｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｓｉＲＮＡｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００４年，第２５２巻，ｐ．４５７−６９］を参考にすることができる。また、変形されたより安定したｓｉＲＮＡの製造のために例えば、文献［ＰＣＴ公開公報第２００４／０１５１０７号、米国特許第５，８９８，０３１号及び第６，１０７，０９４号］を参考にすることができる。
【００４１】
細胞内でｓｉＲＮＡを発生させることができるＤＮＡ−含有ベクターが開発されてきた。その方法は、一般的に細胞内でｓｉＲＮＡを形成するように効率的にプロセッシングされた短いヘアピンＲＮＡの転写を含む。これと関連して、文献［Ｐａｄｄｉｓｏｎ等，ＰＮＡＳ，２００２年，第９９巻，ｐ．１４４３−１４４８；Ｐａｄｄｉｓｏｎ等，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ，２００２年，第１６巻，ｐ．９４８−９５８；Ｓｕｉ等．ＰＮＡＳ，２００２年，第８巻，ｐ．５５１５−５５２０；及びＢｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２年，第２９６巻，ｐ．５５０−５５３］を参考にすることができ、これらは、多数の内生的及び外生的に発現された遺伝子を特異的に標的にできるｓｉＲＮＡを生成させる方法を記述している。
【００４２】
ｓｉＲＮＡの伝達に対しては、例えば、文献［Ｓｈｅｎ等，ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ，２００３年，第５３９巻，ｐ．１１１−１１４；Ｘｉａ等，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００２年，第２０巻，ｐ．１００６−１０１０；及びＲｅｉｇｈ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｓｉｏｎ，２００３年，第９巻，ｐ．２１０−２１６］を参考にすることができる。ｓｉＲＮＡが霊長類での抑制に成功的に使用され、追加的な詳細な説明に対しては、文献［Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ等，Ｒｅｔｉｎａ，２００４年２月，第２４（１）巻，ｐ．１３２−１３８］を参考にすることができる。
【００４３】
ｓｉＲＮＡの治療剤への使用に対しては、例えば、文献［韓国登録特許第１０−０６５３７３８号、韓国登録特許第１０−０７４９８５９号、韓国登録特許第１０−０９３０２８２号、及び韓国登録特許第１０−０８１００３４号］を参考にすることができる。
【００４４】
３）アンチセンス核酸配列
Ｅｎｉｇｍａをコードする核酸に対してアンチセンスである核酸分子を阻害剤に使用することができる。「アンチセンス」核酸は、Ｅｎｉｇｍａをコードする「センス」核酸に相補的な、例えば二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的またはｍＲＮＡ配列に相補的な核酸配列を含む。したがって、アンチセンス核酸は、センス核酸と水素結合を形成することができる。前記アンチセンス核酸は、全体Ｅｎｉｇｍａコード鎖または単にそれらの一部（例：コード領域）に相補的なことがある。前記アンチセンス核酸分子は、Ｅｎｉｇｍａ ｍＲＮＡの全体コード領域に相補的なことがあり、Ｅｎｉｇｍａ ｍＲＮＡのコードまたは非コード領域の単に一部（例：翻訳開始部）にのみアンチセンスであるオリゴヌクレオチドがさらに好ましい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば約５ないし５０ヌクレオチドの長さであり得る。アンチセンス核酸は、公知の方法を用いた化合合成及び酵素結合反応を用いて構成することができる。化学合成法、例えば、文献［Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９１年，第３２巻，ｐ．３０００５−３０００８］に記載されているように、アセトニトリル中でテトラエチルチウラムジスルファイドで硫化させるホスホアミダート化学のような方法によって非常に容易に製造することができる。前記アンチセンス核酸の生成に使用できる変形ヌクレオチドの例としては、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、５−カルボキシルメチルアミノメチル−２−チオウリジン、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、２，６−ジアミノプリン、５−メチル−２−チオウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニル、５−メチル−２−チオウラシル、（ａｃｐ３）ｗ及びワイブトキソシンが挙げられる。必要によって、前記アンチセンス核酸は、発現ベクターを用いて生物学的に生成することができる。
【００４５】
前記Ｅｎｉｇｍａタンパク質の機能を抑制する物質では、前記タンパク質に結合するペプチド、抗体、化合物またはペプチドミメティクスなどを使用することが好ましいが、これに限定されない。
【００４６】
これを具体的に詳しく下記に示す。
１）ペプチドミメティクス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｉｍｅｔｉｃｓ）
Ｅｎｉｇｍａポリペプチドのタンパク質結合ドメインを抑制したミメティクス（例、ペプチドまたは非ペプチド性薬剤）を製作して、元来のＥｎｉｇｍａポリペプチドがＭｍｄ２に結合することを抑制することができる（欧州特許出願ＥＰ０４１２７６５及びＥＰ００３１０８０）。
【００４７】
非加水分解性ペプチド類似体の主要残基としては、β−ターン・ジペプチドコア（Ｎａｇａｉ等，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ，１９８５年，第２６巻，ｐ．６４７）、ケトメチレンシュードペプチド類（Ｅｗｅｎｓｏｎ等，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，１９８６年，第２９巻，ｐ．２９５；及びＥｗｅｎｓｏｎ等，ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ９ｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＩＬ，１９８５年）、アゼピン（Ｈｕｆｆｍａｎ等，ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｄ．，ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８年）、ベンゾジアゼピン（Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ等，ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ；Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｄ．，ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８年）、β−アミノアルコール（Ｇｏｒｄｏｎ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，１９８５年，第１２６巻，ｐ．４１９）及び置換γ−ラクタム環（Ｇａｒｖｅｙ等，ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈｅｌｌ ｅｄ．，ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８年）を使用して生成することができる。
【００４８】
本発明では、Ｅｎｉｇｍａの発現を抑制するために、Ｅｎｉｇｍａ−ｓｉＲＮＡ発現ベクター（ｓｉＥｎｉｇｍａ）を製造する方法を提供する。
【００４９】
具体的に、韓国特許登録第８７７８２４号（米国特許出願１２／０９３０９３（２００８年５月８日）に提示された方法を基にしたＥｎｉｇｍａのｍＲＮＡに相補的な配列であり、好ましくは配列番号２あるいは３（５’−ＡＡＡＧＡＣＣＴＴＣＴＡＣＴＣＣＡＡＧＡＡ−３’あるいは５’−ＡＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＧＡＣＴＴＣＡ−３’）で表わされ、Ｈ１プロモーターによって発現されるようにｐＳｕｐｅｒプラスミドベクターにクローニングして組換えベクターを製作した。また、細胞内で伝達及び発現を所望する遺伝子を提供するアデノウイルス製作用ｐＳｈｕｔｔｌｅベクターに前記製作されたｐＳｕｐｅｒプラスミドベクターを制限酵素で処理してＨ１プロモーター、Ｅｎｉｇｍａ−ｓｉＲＮＡ、転写終了配列である五つのＴ塩基（Ｔ５）まで含むアデノウイルス製作用Ｅｎｉｇｍａ−ｓｉＲＮＡ発現ベクターを製作した。併せて、ＥｎｉｇｍａのｍＲＮＡがＣＭＶプロモーターによって発現されるように、ｐＣＭＶ−Ｔａｑ２ｂベクターにクローニングした後、細胞内に伝達が容易になるようにアデノウイルスＦ−Ｅｎｉｇｍａを製作した（図１ないし図３、及び米国特許出願１２／０９３０９３（２００８年５月８日）参照；韓国特許登録第８７７８２４号）。
【００５０】
また、本発明は、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を有効成分として含む抗癌用組成物または抗癌補助剤を提供する。
【００５１】
前記Ｅｎｉｇｍａの発現抑制剤は、Ｅｎｉｇｍａ遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド、短干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）及びＲＮＡｉからなる群から選択されるいずれか一つであることが好ましいが、これに限定されない。
【００５２】
前記Ｅｎｉｇｍａの活性抑制剤は、Ｅｎｉｇｍａタンパク質に相補的に結合する化合物、ペプチド、ペプチドミメティクス及び抗体からなる群から選択されたいずれか一つであることが好ましいが、これに限定されない。
【００５３】
前記癌は、胃癌、肝癌及び大腸癌からなる群から選択されたいずれか一つであることが好ましいが、これに限定されない。
【００５４】
本発明者等は、Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２が各種癌組織で過発現されることを確認し（図１３のａ及びｂ参照）、癌細胞でのＥｎｉｇｍａの過発現が抗癌剤耐性を誘導することを確認し、Ｅｎｉｇｍａの発現を抑制するｓｉＥｎｉｇｍａを処理する場合、癌細胞の効果的な死滅を誘導することを確認した（図１４のａないしｄ、図１６のａないしｇ、及び図１７参照）。したがって、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性阻害剤は、癌細胞の効果的な死滅を誘導するので抗癌治療剤の有効成分として有用に使用することができ、抗癌剤耐性を抑制することから抗癌補助剤の有効成分として有用に使用することができる。
【００５５】
本発明の抗癌用組成物または抗癌補助剤は、組成物総重量に対して前記有効成分を０．０００１〜５０重量％で含む。
【００５６】
本発明の抗癌用組成物または抗癌補助剤は、前記有効成分に追加で同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上含むことができる。
【００５７】
本発明の抗癌用組成物または抗癌補助剤は、前記記載した有効成分以外に追加で薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含んで製造することができる。薬剤学的に許容可能な担体は、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エチルアルコール、リポソーム及びこれら成分のうちの１成分以上を混合して使用することができ、必要によって抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び滑剤を付加的に添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができ、標的器官に特異的に作用するように標的器官特異的抗体またはその他リガンドを前記担体と結合させて使用することができる。さらに、当該技術分野の適正な方法で、またはレミングトンの文献（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（最近版）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）に開示されている方法を用いて、各疾患によってまたは成分によって好ましく製剤化することができる。
【００５８】
また、本発明は、薬学的に有効な量のＥｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を癌にかかった個体に投与する工程を含む癌治療方法を提供する。
【００５９】
前記Ｅｎｉｇｍａの発現抑制剤は、Ｅｎｉｇｍａ遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド、短干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）及びＲＮＡｉからなる群から選択されるいずれか一つであることが好ましいが、これに限定されない。
【００６０】
前記Ｅｎｉｇｍａの活性抑制剤は、Ｅｎｉｇｍａタンパク質に相補的に結合する化合物、ペプチド、ペプチドミメティクス及び抗体からなる群から選択されたいずれか一つであることが好ましいが、これに限定されない。
【００６１】
前記癌は、胃癌、肝癌及び大腸癌からなる群から選択されたいずれか一つであることが好ましいが、これに限定されない。
【００６２】
前記投与方法は、特別にこれに制限されるのではないが、目的とする方法によって非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）したり経口投与することができ、非経口投与が好ましく、静脈内注射による投与がさらに好ましいが、これに限定されない。
【００６３】
前記投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度などによってその範囲が多様である。一日投与量は、化合物の場合、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇで、好ましくは０．５〜１０ｍｇ／ｋｇであり、一日一回〜数回に分けて投与することがさらに好ましいが、これに限定されない。
【００６４】
本発明者等は、Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２が各種癌組織で過発現されることを確認し、癌細胞でのＥｎｉｇｍａの過発現が抗癌剤耐性を誘導することを確認し、Ｅｎｉｇｍａの発現を抑制するｓｉＥｎｉｇｍａを処理する場合、癌細胞の効果的な死滅を誘導することを確認することにより、前記Ｅｎｉｇｍａの発現または活性阻害剤が癌細胞の効果的な死滅を誘導するので、抗癌治療に使用できることが分かった。
【００６５】
また、本発明は、Ｅｎｉｇｍａに依存的なＭｄｍ２またはｐ５３の発現水準を用いた抗癌剤候補物質のスクリーニング方法を提供する。
【００６６】
本発明では、Ｅｎｉｇｍａの発現に依存的にＭｄｍ２が安定化されて発現が増加し、前記Ｍｄｍ２を媒介にｐ５３の発現が減少するので、前記ＥｎｉｇｍａまたはＭｄｍ２の発現を減少させたりｐ５３の発現水準を増加させたりする物質を選別することで、抗癌活性を有する物質をスクリーニングすることができる。
【００６７】
具体的に、前記スクリーニング方法は、
１）Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２を発現する細胞に候補物質を処理する工程と、
２）ＥｎｉｇｍａまたはＭｄｍ２の発現水準を測定する工程、及び
３）候補物質を処理しない対照群と比較してＥｎｉｇｍａまたはＭｄｍ２の発現水準を減少させた候補物質を選別する工程とで遂行することが好ましいが、これに限定されない。
【００６８】
また、前記スクリーニング方法は、
１）Ｅｎｉｇｍａ、Ｍｄｍ２及びｐ５３を発現する細胞に候補物質を処理する工程と、
２）ｐ５３の発現水準を測定する工程、及び
３）候補物質を処理しない対照群と比較してｐ５３の発現水準を増加させた候補物質を選別する工程とで遂行することが好ましいが、これに限定されない。
【００６９】
前記スクリーニング方法において、候補物質は、核酸、タンパク質、その他抽出物、化合物及び天然物からなる群から選択されるいずれか一つであることが好ましいが、これに限定されない。
【００７０】
前記スクリーニング方法において、発現水準は、遺伝子の転写活性水準を測定するかまたは発現されたタンパク質量を測定することにより求められるが、これに限定されない。
【００７１】
前記転写水準は、ルシフェラーゼ分析法を使用することが好ましく、タンパク質量はウエスタンブロット分析法を使用して測定することが好ましいが、これに限定されない。
【００７２】
また、本発明は、ＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２間の相互結合水準を用いた抗癌用組成物スクリーニング方法を提供する。
【００７３】
本発明者等は、ＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２が直接相互結合して、ｐ５３とはＭｄｍ２を通じて間接的に結合しているという事実を確認した（図５のａないしｃ参照）。また、ＥｎｉｇｍａのＬＩＭ３部位が、Ｍｄｍ２の４０１−４９１（ＲＩＮＧドメイン部位）に結合することを確認した（図５のｄないしｇ参照）。したがって、ＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２間の相互結合を阻害する物質は、Ｍｄｍ２の安定化を弱化させてｐ５３を活性化させ、抗癌活性を有する物質になり得ることが分かった。
【００７４】
前記スクリーニング方法は、
１）候補物質が存在するまたは存在しない条件下でＥｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２を接触させる工程と、
２）Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２の結合水準を測定する工程、及び
３）候補物質の不存在時と比較して、Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２の結合水準を減少させた候補物質を選別する工程とで遂行することが好ましいが、これに限定されない。
【００７５】
また、前記スクリーニング方法は、
１）Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２を発現する細胞と候補物質を接触させる工程と、
２）細胞内Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２の結合水準を測定する工程、及び
３）候補物質を処理していない対照群と比較して、細胞内Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２の結合水準を減少させた候補物質を選別する工程とで遂行することが好ましいが、これに限定されない。
【００７６】
前記スクリーニング方法において、候補物質は、核酸、タンパク質、その他抽出物、化合物及び天然物からなる群から選択されるいずれか一つであることが好ましいが、これに限定されない。
【００７７】
前記スクリーニング方法において、結合は、免疫沈降法によって測定することができる。免疫沈降は、例えば、文献に記載された方法によって遂行することができる（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，５１１−５２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８年）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、免疫沈降されたタンパク質の分析に一般的に使用され、結合されたタンパク質は適合した濃度のゲルを使用してタンパク質の分子量によって分析することができる。
【００７８】
前記スクリーニング方法において、細胞を用いるツーハイブリッドシステム（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）を使用することができる（“ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ”、“ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ”、“ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ”（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；“ＨｙｂｒｉＺＡＰ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ”（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；参考文献Ｄａｌｔｏｎ ａｎｄ Ｔｒｅｉｓｍａｎ，Ｃｅｌｌ，１９９２年，第６８巻，ｐ．５９７−６１２；Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ，１９９４年，第１０巻，ｐ．２８６−９２）。
【００７９】
前記スクリーニング方法において、表面プラズモン共鳴現象を用いたバイオセンサーは、本発明で結合された物質を探知または定量するための手段に使用することができる。前記バイオセンサーを使用する時、前記結合による相互作用は、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイム観察することができる。
【００８０】
また、本発明は、Ｅｎｉｇｍａと反応する抗体またはＥｎｉｇｍａ遺伝子に相補的な核酸のうちのいずれか一つ以上を使用して、癌細胞でのＥｎｉｇｍａ発現水準を測定する工程を含む、癌の診断、治療結果確認または予後を評価する方法を提供する。
【００８１】
また、本発明は、Ｅｎｉｇｍａと反応する抗体またはＥｎｉｇｍａ遺伝子に相補的な核酸のうちのいずれか一つ以上を含む癌診断用キットを提供する。
【００８２】
本発明者等は、癌細胞でＥｎｉｇｍａの過発現を確認した結果、ＳＲＦ、Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２がヒトの肝癌細胞と胃癌細胞で過発現されていることを確認し（図１３のａ及びｂ参照）、癌細胞でＥｎｉｇｍａの発現水準及びｐ５３依存的に癌細胞の成長及び抗癌剤耐性が誘導されることを確認した（図１４のａないしｄ、図１６のａないしｇ及び図１７参照）。したがって、Ｅｎｉｇｍａの発現水準を測定することで、抗癌治療時に薬物の癌細胞に対する死滅程度を確認することができ、抗癌治療の予後を評価する方法として使用できることが分かった。
【００８３】
本発明の癌診断方法において、正常以上に上昇したＥｎｉｇｍａの発現検出は、患者が癌にかかったことを意味する。また、癌で治療を受けたことがある、または治療を受けている個体の診断試料でのＥｎｉｇｍａの正常な発現検出は、癌治療が成功的であることを意味し、前記診断試料から正常以上に上昇したＥｎｉｇｍａの検出は、治療を継続しなければならないということを意味する。同時に、癌にかかった個体の診断試料でのＥｎｉｇｍａの正常な発現検出は、予後が良好であるということを意味し、前記診断試料から正常以上に上昇したＥｎｉｇｍａの検出は、予後が良くないということを意味する。
【００８４】
本発明の癌診断用キットは、Ｅｎｉｇｍａと反応する一つ以上の物質及び反応生成物検出用試薬とこれに対する指示事項（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を付加的に含むことができる。例えば、Ｅｎｉｇｍａと反応する一つ以上の物質は、ＥｎｉｇｍａのＲＮＡまたはＤＮＡに相補的なＲＮＡまたはＤＮＡ、及びＥｎｉｇｍａタンパク質に結合する抗体であり得、反応生成物検出用試薬は核酸またはタンパク質標識及び発色試薬であり得る。
【００８５】
また、本発明は、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を抗癌用組成物の製造に使用する用途を提供する。
【００８６】
また、本発明は、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を抗癌補助剤の製造に使用する用途を提供する。
【００８７】
同時に、本発明は、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を癌の診断、治療結果確認または予後評価用キットの製造に使用する用途を提供する。
【００８８】
前記Ｅｎｉｇｍａの発現抑制剤は、Ｅｎｉｇｍａ遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド、短干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）及びＲＮＡｉからなる群から選択されるいずれか一つであることが好ましいが、これに限定されない。
【００８９】
前記Ｅｎｉｇｍａの活性抑制剤は、Ｅｎｉｇｍａタンパク質に相補的に結合する化合物、ペプチド、ペプチドミメティクス及び抗体からなる群から選択されたいずれか一つであることが、好ましいがこれに限定されない。
【００９０】
前記癌は、胃癌、肝癌及び大腸癌からなる群から選択されたいずれか一つであることが好ましいが、これに限定されない。
【００９１】
本発明者等は、Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２が各種癌組織で過発現されることを確認し、癌細胞でのＥｎｉｇｍａの過発現が抗癌剤耐性を誘導することを確認し、Ｅｎｉｇｍａの発現を抑制するｓｉＥｎｉｇｍａを処理する場合、癌細胞の効果的な死滅を誘導することを確認することで、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性阻害剤は癌細胞の効果的な死滅を誘導することから抗癌治療剤の有効成分として有用に使用することができ、抗癌剤耐性を抑制することから抗癌補助剤の有効成分として有用に使用できることが分かった。
【実施例】
【００９２】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。
【００９３】
但し、下記の実施例は、本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるのではない。
【００９４】
＜実施例１＞ＥｎｉｇｍａによるＭｄｍ２の安定化とそれによるｐ５３の分解
本発明者等は、韓国生命工学研究院から提供を受けたＥｎｉｇｍａ ｃＤＮＡ（配列番号：１）を含むベクターを鋳型にして、一般的なＰＣＲ方法で得られた切片をｐＣＭＶ ｔａｑ２Ｂ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，米国）にクローニングして、Ｅｎｉｇｍａを過発現するベクターを製作した。また、Ｅｎｉｇｍａの発現を特異的に阻害する５’−ＡＡＡＧＡＣＣＴＴＣＴＡＣＴＣＣＡＡＧＡＡ−３’（配列番号：２）のヌクレオチド切片をｐＳｕｐｅｒプラスミドベクターにＨｉｎｄ ＩＩＩ／Ｂｇｌ ＩＩ部位にクローニングを行った（図２）。また、細胞内への導入を容易にするためにｓｉＥｎｉｇｍａを含むアデノウイルス（図３）と、Ｆｌａｇ−Ｅｎｉｇｍａを含むアデノウイルス（図２）は、韓国特許登録第６２７３７７号（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２００６年，第４３巻，ｐ．１０４２−１０５２）及び第８７７８２４号（米国特許出願第１２／０９３０９３号（２００８年５月８日）；Ｎａｔ Ｍｅｄ，２００６年，第１２巻，ｐ．８０９−８１６）に提示された方法を基に下記のように製作した。
【００９５】
アデノウイルス製作用ｐＳｈｕｔｔｌｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，米国）ベクターに前記で製作されたｐＳｕｐｅｒ Ｅｎｉｇｍａ−ｓｉＲＮＡプラスミドをＸｂａ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩで処理して、Ｈ１プロモーターおよびＴ５転写終了配列を含むＤＮＡ切片をクローニングすることによって製作した（ｐＳｈｕｔｔｌｅ／Ｅｎｉｇｍａ−ｓｉＲＮＡ）。Ｆ−Ｅｎｉｇｍａを発現するアデノウイルス製作のために、前記で製作されたｐＣＭＶ ｔａｑ２Ｂ−ＥｎｉｇｍａからＥｎｉｇｍａ部位のみをＮｏｔＩ／ＸｈｏＩで切断して、これをｐＣＭＶ ｓｈｕｔｔｌｅベクターにクローニングすることで製作した。アデノウイルス遺伝子を含んでいるｐＡｄＥａｓｙ−１とｐＳｈｕｔｔｌｅ／Ｅｎｉｇｍａ−ｓｉＲＮＡ及びｐＣＭＶｓｈｕｔｔｌｅ−Ｆ−Ｅｎｉｇｍａ間の組換えは、大腸菌ＢＪ５１８３菌株に同時に形質導入することで遂行された。大腸菌で相同組換えによって得られた組換えアデノウイルス由来物質含有プラスミドは、カナマイシン選択培地で育った大腸菌コロニーからＤＮＡを分離して制限酵素分析を通じて確認した。
【００９６】
組換えアデノウイルス由来物質含有プラスミドでアデノウイルス粒子製作は、下記のように遂行した。組換えアデノウイルス由来物質含有プラスミドをＰａｃ Ｉで切断して、アデノウイルスの複製原点である末端反復配列（ＴＲ）等が、両側の端に存在するように線形化して、６０ｍｍ培養皿で７０〜８０％の密度に育ったＨＥＫ２９３細胞にカルシウムホスファート方法で導入した。組換えアデノウイルス由来物質含有プラスミドが導入されてアデノウイルス粒子が作られる細胞は、２〜３日後周囲の細胞より大きくなり、４〜５日後に全体細胞の約５０％が集まったり培地の上に浮き上がったりし、これを培地とともに集めてウイルス粒子が含まれる一次細胞抽出液を確保した。細胞収集液を凍結解凍（ｆｒｅｅｚｉｎｇ−ｔｈａｗｉｎｇ）方法を通じて細胞内のウイルス粒子まで培地に脱出するようにして、この上澄み液を再び１００ｍｍ培養皿に６０〜７０％程度に準備された細胞に再感染させてウイルスの存在有無及び再感染の可能性を確認した。アデノウイルス感染後増殖によって細胞が死ぬようになれば、また集めて多量の２９３細胞株（ＡＴＣＣ）に再感染させることで、アデノウイルス粒子を増幅してプラーク形成法を用いてウイルス数を決定した。
【００９７】
＜１−１＞ＥｎｉｇｍａによるＭｄｍ２安定化検証
Ｅｎｉｇｍａによる２６Ｓプロテオゾーム依存的タンパク質分解に及ぼす影響を次のような方法で確認した。Ｆｌａｇ−Ｅｎｉｇｍａ発現ベクターを濃度別（＋：２μｇ、＋＋：５μｇ）でＨＬＫ３細胞株（全北医大、韓国）に導入して、１２時間ＭＧ１３２（１０μＭ）を処理したまたは処理していない細胞を集めてウエスタンブロット方法でタンパク質の発現様相を確認した。その結果、Ｍｄｍ２の発現程度は、Ｅｎｉｇｍａの発現に依存的に高く、一方、ｐ５３及びその下位分子ｐ２１は減少した（図４のａ）。
【００９８】
＜１−２＞Ｅｎｉｇｍａによって調節されるｐ５３の活性検証
Ｅｎｉｇｍａによるｐ５３の減少がｐ５３活性の減少と関連するかどうかを確認するために、ｐ５３によって調節される標的遺伝子のプロモーターの活性変化を調査した。ｐ５３ＲＥ−Ｌｕｃ、Ｂａｘ−Ｌｕｃ、ｐ２１−Ｌｕｃのレポーター遺伝子（０．５μｇ）をそれぞれＦｌａｇ−Ｅｎｉｇｍａ（＋：２μｇ、＋＋：５μｇ）と濃度別にＨＬＫ３細胞株あるいはｐ５３＋／＋またはｐ５３−／−の大腸癌細胞株（ＨＣＴ１１６、ＡＴＣＣ）に導入して、１２時間ＭＧ１３２（１０μＭ）を処理するかまたは処理せずに、細胞を集めてレポーター分析（Ｐｒｏｍｅｇａ，米国）を実施した。その結果、ｐ５３によって調節される下位分子の転写活性は、Ｅｎｉｇｍａの発現に濃度依存的に阻害されることが示された（図４のｂ）。
【００９９】
＜１−３＞Ｅｎｉｇｍａによる関連分子のｍＲＮＡの変化検証
ＥｎｉｇｍａによるＭｄｍ２及びｐ５３の発現変化が、ｍＲＮＡ水準で発生したのかどうか検証するためにノーザンブロットを実施した。Ｆｌａｇ−Ｅｎｉｇｍａ発現ベクターを濃度別（＋：２μｇ、＋＋：５μｇ）でＨＬＫ３細胞株に導入して、４８時間後、総ＲＮＡを分離（ＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ）して、それぞれのプローブ（Ｐ１／Ｐ２Ｍｄｍ２，ｐ５３，ｐ２１）でノーザンブロット方法を実施した。その結果、Ｅｎｉｇｍａの発現量と関係なくＰ１−Ｍｄｍ２、ｐ５３、ｐ２１のｍＲＮＡ量は一定であり、ｐ５３によって調節されるＰ２−Ｍｄｍ２のｍＲＮＡの量は、Ｅｎｉｇｍａの発現に依存的に減少した（図４のｃ）。この結果は、ＥｎｉｇｍａがＭｄｍ２−ｐ５３を転写後の工程で調節するということを提示している。
【０１００】
＜１−４＞ＥｎｉｇｍａによるＭｄｍ２依存的ｐ５３抑制
Ｅｎｉｇｍａによるｐ５３及びｐ２１の発現抑制が、Ｍｄｍ２依存的なのかどうかを確認するために、Ｍｄｍ２−／−ｐ５３−／−ＭＥＦ及びＭｄｍ２＋／＋ｐ５３−／−ＭＥＦ細胞株（Ｇ．Ｌｏｚａｎｏ，Ｍ．Ｄ．ＡＮＤＥＲＳＯＮ ＣＡＮＣＥＲ ＣＥＮＴＥＲ）を用いた。前記それぞれの細胞株に、ｐ５３を発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ−ｐ５３）を導入した１６時間後、Ａｄ−Ｆ−Ｅｎｉｍｇａ（５０ＭＯＩ）、Ａｄ−Ｌａｃｚ（５０ＭＯＩ）、Ａｄ−ｓｉＥｎｉｇｍａ（１００ＭＯＩ）、Ａｄ−ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ（１００ＭＯＩ）を再び導入して３２時間後に細胞を集めてウエスタンブロット方法でそれぞれのタンパク質の発現変化を確認した。その結果、Ｍｄｍ２の発現に依存的にｐ５３及びｐ２１の発現が減少した（図４のｄ）。
【０１０１】
＜１−５＞Ｅｎｉｇｍａによるｐ５３下位分子の抑制
Ｅｎｉｇｍａによるｐ２１の発現抑制が、ｐ５３を経由したものかどうかをｐ５３＋／＋、ｐ５３−／−細胞株を使用して確認した。ｐ５３＋／＋またはｐ５３−／−細胞株に、Ｆｌａｇ−Ｅｎｉｇｍａ、ｓｉＥｎｉｇｍａを導入して４８時間後に細胞を集めてウエスタンブロット方法で確認した。その結果、ｐ２１の変化は、ｐ５３の変化に起因したものであることが示され、Ｅｎｉｇｍａによる直接的な影響はないことが示された（図４のｅ）。
【０１０２】
＜実施例２＞ＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２間の相互作用検証
本発明者等は、ＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２間の相互作用を検証するために、Ｅｎｉｇｍａの突然変異体（Ｆ−ＰＤＺ、Ｆ−ＰＤＺ−ＬＩＭ１、Ｆ−ＥｎｉΔＬＩＭ３、Ｆ−ＬＩＭ）をｐＣＭＶ ｔａｑ２Ｂに一般的なＰＣＲクローニング法で製作し、Ｍｄｍ２の突然変異体（ＧＳＴ−１−１００、ＧＳＴ−１０１−４９１、ＧＳＴ−２０１−４９１、ＧＳＴ−３０１−４９１）をｐＥＢＧにＰＣＲクローニング法で製作した。インビトロで相互結合を確認するために、Ｈｉｓ−Ｍｄｍ２、Ｅｎｉｇｍａ、ＧＳＴ−ｐ５３、ＥｎｉΔＬＩＭ３タンパク質を大腸菌でそれぞれ分離精製した。
【０１０３】
＜２−１＞培養細胞でのＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２間の結合における、ｐ５３の役割検証
ｐ５３＋／＋またはｐ５３−／−の大腸癌細胞株（ＨＣＴ１１６）とＭｄｍ２−／−ｐ５３−／−ＭＥＦ及びＭｄｍ２＋／＋ｐ５３−／−ＭＥＦ細胞株（Ｇ．Ｌｏｚａｎｏ，Ｍ．Ｄ．ＡＮＤＥＲＳＯＮ ＣＡＮＣＥＲ ＣＥＮＴＥＲ）で、ＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２−ｐ５３間の相互結合をＩＰ法で確認した。その結果、ＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２間の相互作用は、ｐ５３と関係なく存在し、Ｍｄｍ２とｐ５３が一緒に存在する場合は、Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２−ｐ５３の結合体を形成することが示された（図５のａ及びｂ）。
【０１０４】
＜２−２＞インビトロでのＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２の相互作用検証
大腸菌で分離精製したそれぞれのタンパク質（１μｇ Ｈｉｓ−Ｍｄｍ２、０．５μｇ Ｅｎｉｇｍａ、１μｇ ＧＳＴ−ｐ５３）間の相互作用をインビトロで直接確認するためにインビトロ結合分析（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）を実施した。それぞれのタンパク質を混ぜて結合を誘導した後、ＧＳＴ ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ及びＩＰ方法でタンパク質間の結合有無を確認した。その結果、Ｅｎｉｇｍａは、Ｍｄｍ２と直接結合したが、ｐ５３とはＭｄｍ２を媒介して結合した（図５のｃ）。
【０１０５】
＜２−３＞ＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２間の結合部位決定
ＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２の製作されたそれぞれの突然変異体を使用して、二分子間の結合部位を決定した。まず、それぞれのＭｄｍ２突然変異体（５μｇ）をＦｌａｇ−Ｅｎｉｇｍａが常に発現されるように考案された２９３細胞株に導入して、以後、ＧＳＴ ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎしてＦｌａｇ抗体にウエスタンブロットして結合有無を確認した（図５のｄ）。同時に、それぞれのＥｎｉｇｍａ突然変異体（５μｇ）とＧＳＴ−Ｍｄｍ２発現ベクター（５μｇ）を２９３Ｔ細胞株（ＡＴＣＣ）にカルシウムホスファート方法で導入させて、２４時間後に細胞を集めてＦｌａｇ抗体でＩＰを遂行して、ＧＳＴ抗体でウエスタンブロットして結合有無を確認した（図５のｅ）。ＥｎｉｇｍａＬＩＭ３が除去された、細菌で発現させたＥｎｉΔＬＩＭ３とＭｄｍ２は、互いに結合しなかったし（図５のｃ）、Ｍｄｍ２の３０１−４９１部位とＥｎｉｇｍａのＬＩＭ３部位が結合部位であることが示された。ＬＩＭ３部位のみを含んだＧＳＴ−ＬＩＭ３突然変異体とＭｄｍ２間の結合を細胞株導入後、ＧＳＴ ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎとＭｄｍ２抗体でウエスタンブロットで確認して、ＥｎｉｇｍａのＬＩＭ３部位がＭｄｍ２の４０１−４９１に結合するということを確認することができた（図５のｆ）。したがって、知られたＭｄｍ２−ｐ５３間の相互結合に基づいて、Ｅｎｉｇｍａの“Ｃ”末端とＭｄｍ２の“Ｃ”末端が直接結合し、かつＭｄｍ２の“Ｎ”末端とｐ５３の“Ｎ”末端が結合している結合構造が分かった（図５のｇ）。
【０１０６】
＜２−４＞Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２結合の特異性検証
Ｅｎｉｇｍａと類似の分子構造を有したＥＮＨ（Ｅｎｉｇｍａ ｈｏｍｏｌｏｇ）を対象に、Ｍｄｍ２と結合有無を確認した。Ｆｌａｇ−ＥＮＨ、Ｆｌａｇ−Ｅｎｉｇｍａ及びＧＳＴ−Ｍｄｍ２発現ベクターを２９３Ｔ細胞株にカルシウムホスファート方法で導入して、４８時間後に細胞を集めてＧＳＴ ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎと、Ｆｌａｇ抗体でウエスタンブロットを遂行した。その結果、Ｍｄｍ２とＥＮＨ間の結合は、存在しなかった（図６のａ）。同時に、Ｆ−ＥＮＨ発現ベクターをＨＬＫ３細胞株に濃度別（２、５μｇ）で導入した後、Ｍｄｍ２及びｐ５３の発現変化を確認した。その結果、ＥＮＨは、Ｍｄｍ２とｐ５３の発現量に影響を与えなかった（図６のｂ）。したがって、ＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２間の結合及びこれによるＭｄｍ２の発現増加が、特異的相互作用であることが分かった。
【０１０７】
＜実施例３＞ＥｎｉｇｍａがＭｄｍ２の自己ユビキチン化（ｓｅｌｆ−ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ）とｐ５３のユビキチン化に及ぼす影響検証
本発明者等は、ＥｎｉｇｍａがＭｄｍ２と直接結合してＭｄｍ２を安定化させて、Ｍｄｍ２によるｐ５３の分解を促進させる機序を解明するために、Ｍｄｍ２の自己ユビキチン化とｐ５３ユビキチン化にＥｎｉｇｍａが及ぼす影響を細胞内及びインビトロで検証した。
【０１０８】
＜３−１＞細胞内でＭｄｍ２とｐ５３のユビキチン化にＥｎｉｇｍａが及ぼす影響
ＨＬＫ３細胞株に、Ｆｌａｇ−Ｅｎｉｇｍａ（５、１０μｇ）、ｓｉＥｎｉｇｍａ（１０、１５μｇ）を濃度別で導入し、集める１２時間前にＭＧ１３２を処理した。また、異なる２９３Ｔ細胞株には、Ｈｉｓ−Ｕｂ（５μｇ）とＦ−Ｅｎｉｇｍａ（５、１０μｇ）を導入して集める１２時間前にＭＧ１３２を処理した。準備した細胞破砕溶液で細胞タンパク質抽出液を作ってそれぞれの抗体としてＩＰを実施して、Ｕｂが結合したＭｄｍ２とｐ５３の増減をＵｂ抗体とＨｉｓ抗体としてウエスタンブロットして確認した。その結果、細胞内でＥｎｉｇｍａが過発現されるほどＭｄｍ２のユビキチン化は減少し、ｐ５３のユビキチン化は増加し、Ｅｎｉｇｍａの発現が抑制されるほどＭｄｍ２のユビキチン化は増加し、ｐ５３のユビキチン化は減少した（図７のａ及びｂ）。
【０１０９】
＜３−２＞ＥｎｉｇｍａによるＭｄｍ２の自己ユビキチン化阻害とｐ５３のユビキチン化検証
Ｅｎｉｇｍａの結合によるＭｄｍ２の自己ユビキチン化の変化を検証するために、インビトロユビキチン化分析を実施した。Ｈｉｓ−Ｍｄｍ２タンパク質（０．５μｇ）、Ｈｉｓ−Ｍｄｍ２（Ｃ４６４Ａ）（０．５μｇ）、Ｅｎｉｇｍａタンパク質（０．５、１μｇ）、Ｆ−ＥｎｉΔＬＩＭ３（１μｇ）に、ユビキチン反応混合物（Ｅ１、Ｅ２、Ｈｉｓ−Ｕｂ、ＡＴＰ含む）を入れて反応させた後、ＩＰ／ＩＢ方法を用いてＭｄｍ２の自己ユビキチン化変化と結合タンパク質の有無を確認した。その結果、Ｍｄｍ２と結合するＦ−ＥｎｉｇｍａによってＭｄｍ２の自己ユビキチン化が抑制され、Ｅｎｉｇｍａは、Ｍｄｍ２ＲＩＮＧフィンガー領域の４６４−システインがアラニンに置換されたＭｄｍ２（Ｃ４６４Ａ）変異体には影響を与えなかった（図７のｃ）。併せて、Ｆ−ＥｎｉｇｍａによるＭｄｍ２依存的ｐ５３のユビキチン化は、増加した（図７のｄ）。したがって、ＥｎｉｇｍａがＭｄｍ２のユビキチン化の方向を決定する因子であることが分かった。
【０１１０】
＜３−３＞ＰＣＡＦによるＭｄｍ２ユビキチン化に及ぼすＥｎｉｇｍａ阻害効果調査
ＰＣＡＦ（ｐ３００−ＣＢＰ関連因子）は、Ｍｄｍ２のユビキチン化を誘導する（Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２００７年，第９巻，ｐ．３３１−３３８）。細菌から分離精製した図８に提示したタンパク質を用いて、インビトロユビキチン実験を行なった時、ＥｎｉｇｍａはＰＣＡＦによるＭｄｍ２ユビキチン化に影響を与えなかった（図８のａ）。この現象は、Ｍｄｍ２−／−ｐ５３−／−ＭＥＦ細胞株でも検証された（図８のｂ）。この結果は、ＥｎｉｇｍａがＭｄｍ２自己ユビキチン化を特異的に阻害してｐ５３ユビキチン化を促進することを提示する。
【０１１１】
＜実施例４＞Ｅｎｉｇｍａプロモーターの活性化検証
ｐ５３は、細胞増殖抑制機能があって、Ｅｎｉｇｍａが細胞内でＭｄｍ２の安定化を誘導してｐ５３減少を起こすので、細胞増殖が起きる条件でＥｎｉｇｍａプロモーターが活性化するのか、活性化するのならどのような機序になるかを調査した。
【０１１２】
＜４−１＞血清によるＥｎｉｇｍａプロモーターの調節検証
Ｅｎｉｇｍａのプロモーターに血清応答因子（ＳＲＦ）が結合する血清応答部位（ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ；ＳＲＥ）が存在することを発見して、プロモーター配列中、ＳＲＥを含むまたは含まない断片をルシフェラーゼを有しているｐＧＬ２／３ベクターに挿入してＥｎｉｇｍａ−Ｌｕｃ（ｐＧＬ２）、ＳＲＥ−Ｌｕｃ、ΔＳＲＥ−Ｌｕｃ（ｐＧＬ３）レポーターベクターをそれぞれ製作した（図９のａ）。前記、Ｅｎｉｇｍａ−ＬｕｃをＨＬＫ３細胞株に導入（０．５μｇ）し、０．１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭにて２４時間培養した後、５％及び２０％ＦＢＳを添加して再び６時間培養した後、細胞を集めてルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、血清の濃度に依存的にＥｎｉｇｍａ−Ｌｕｃの活性度が増加した（図９のｂ）。
【０１１３】
＜４−２＞細胞成長因子−ＳＲＥ依存的Ｅｎｉｇｍａプロモーターの活性化検証
Ｅｎｉｇｍａ発現のＳＲＦ依存性を検証するために製作したＳＲＥ−Ｌｕｃ（０．５μｇ）、ΔＳＲＥ−Ｌｕｃ（０．５μｇ）をＨＬＫ３細胞株に導入して、０．１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭにて２４時間培養後、５％及び２０％ＦＢＳ、ＦＧＦ（２０、４０ｎｇ／ｍｌ）、またはＨＧＦ（２０、４０ｎｇ／ｍｌ）を添加して再び６時間培養した後、細胞を集めてルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、ＳＲＥが存在するレポーターでのみ処理した成長因子の濃度に依存的に活性度が増加した（図９のｃ及びｄ）。
【０１１４】
＜４−３＞ＥｎｉｇｍａプロモーターとＳＲＦの結合特異性検証
ＥｎｉｇｍａプロモーターのＳＲＥ部位［５’−ＣＴＡＴＡＴＡＡＧＧ−３’（配列番号：４）］に、ＳＲＦが特異的に結合するのかどうかを検証するために、ＥＭＳＡと細胞内ＣｈＩＰ分析を実施した。ＥＭＳＡ分析を行なうために、血清を処理したまたは処理していないＨＬＫ３の核タンパク質分画を製造した後、放射線（３２Ｐ−ＡＴＰ）で標識されたＳＲＥ（５’−ＣＴＡＴＡＴＡＡＧＧ Ｘ３）ヌクレオチドと反応させた後、抗−ＳＲＦ抗体と再び反応させて６％のアクリルアミドゲルでその結合有無を確認した。その結果、ＥｎｉｇｍａのＳＲＥ部位にＳＲＦが特異的に結合することが示された（図９のｅ）。
【０１１５】
また、培養細胞内でＥｎｉｇｍａプロモーターにＳＲＦが結合するかどうかを確認するために実施したＣｈＩＰ分析のために、血清を処理したまたは処理していないＨＬＫ３を１％ホルマリンで固定させた後、細胞を集めて超音波で破砕した。ＳＲＦ−ＤＮＡの結合体を抗−ＳＲＦ抗体としてＩＰして得た後、結合しているＤＮＡがＥｎｉｇｍａプロモーターのＳＲＥ部位なのかどうかを特異的なプライマーでＰＣＲして確認した。その結果、培養細胞でもＥｎｉｇｍａプロモーターのＳＲＥ部位にＳＲＦが結合していることが示された（図９のｆ）。以上の結果は、細胞増殖条件でＥｎｉｇｍａプロモーターは、ＳＲＦによって活性化になりその発現が増加するということを提示する。
【０１１６】
＜実施例５＞血清とＨＧＦによるＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２−ｐ５３経路調節
細胞増殖あるいは生存を促進させる条件で、Ｍｄｍ２の増加が報告されたことがある（Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ，２００５年，第２３巻，ｐ．１８３−１９２）。前記現象が、Ｅｎｉｇｍａによって起因することかどうかを調べるため、ＳＲＦによるＥｎｉｇｍａの活性化がＭｄｍ２を安定化させて、ｐ５３を抑制するかどうかを細胞及びマウスの肝（ｌｉｖｅｒ）で検証した。
【０１１７】
＜５−１＞血清によるＳＲＦ、Ｅｎｉｇｍａ、Ｍｄｍ２、ｐ５３の調節検証
ｐ５３＋／＋またはｐ５３−／−の大腸癌細胞株を血清を除去した条件で培養した後、１０％の血清を含んだ培地で時間別に再び培養して各タンパク質の変化をウエスタンブロットで、転写水準（ｍＲＮＡ）の変化は各条件で分離した総ＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲで確認した。その結果、血清の刺激によって、ＳＲＦが転写段階から増加してタンパク質量も増加し、ＳＲＦによって転写活性化したＥｎｉｇｍａのタンパク質量も増加することが示された。Ｅｎｉｇｍａの増加は転写体の変化なしにＭｄｍ２タンパク質の安定化を誘導し、ｐ５３タンパク質の分解として示された。ＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２一連の増加は、ｐ５３に非依存的だった（図１０のａ及びｂ）。
【０１１８】
ｐ５３＋／＋またはｐ５３−／−の大腸癌細胞株を１０％の血清を含んだ培地で培養した後、血清を除去した条件で各時間別に培養時の各分子の変化をウエスタンブロットとＲＴ−ＰＣＲ方法で確認した。その結果、成長が制限される条件で、ＳＲＦ、Ｅｎｉｇｍａの転写水準、タンパク質水準はすべて抑制され、Ｍｄｍ２のタンパク質水準は減少し、ｐ５３のタンパク質水準は増加した（図１１のａ及びｂ）。
【０１１９】
＜５−２＞ＨＧＦによるＳＲＦ、Ｅｎｉｇｍａ、Ｍｄｍ２、ｐ５３の調節検証
ＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２経路が、ＨＧＦによっても調節されるかどうかを調査した。ＳＲＦ、Ｅｎｉｇｍａの特異的関連性を示すために、ｓｉＥｎｉｇｍａ、ｓｉＳＲＦ各１０μｇをＨＬＫ３細胞株に導入して、血清を制限条件で培養した後、細胞を集める４時間前にＨＧＦ（４０、６０ｎｇ／ｍｌ）をそれぞれ処理した後、それぞれのタンパク質の変化をウエスタンブロットで確認した。その結果、ＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２の増加とｐ５３の減少を確認することができた（図１０のｃ）。また、Ｆ−ＳＲＦをＨＬＫ３細胞株に濃度別（５、１０μｇ）で直接導入して、ＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２の変化を観察した。その結果、Ｅｎｉｇｍａの発現は、ＳＲＦによって直接的に影響を受けることが示された（図１０のｄ）。
【０１２０】
＜５−３＞ＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２経路にＭＡＰキナーゼ関連性検証
細胞成長因子によるＳＲＦの活性化に、ＭＡＰキナーゼが係わっていることが知られているので（Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００２年，第５３巻，ｐ．１４７−１５７）、ＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２の経路の調節にもＭＡＰキナーゼが係わっていると仮定して、ＭＡＰキナーゼ特異的阻害剤であるＰＤ９８０５９を用いて検証した。Ｍｄｍ２＋／＋ｐ５３−／−ＭＥＦ細胞株にＡｄ−ｐ５３またはＡｄ−ＬａｃＺを導入した後、ＨＧＦを処理時にＰＤ９８０５９を一緒に処理した。その結果、ＰＤ９８０５９は、ＨＧＦによるＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２経路の活性化を抑制した（図１０のｅ）。
【０１２１】
正常細胞でＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２経路の存在有無を確認するために、ＭＲＣ５（ヒト正常繊維芽細胞）、ＭＥＦ（マウス胎児繊維芽細胞）を使用して血清による反応を確認した。ＭＲＣ５の場合には、ｓｉＳＲＦ（１０、１５μｇ）を導入したり、ＰＤ９８０５９が存在したりする場合、血清によるＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２経路の活性化が抑制され、ＭＥＦの場合も、ＰＤ９８０５９によってＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２経路の活性化が抑制された（図１２のａ及びｃ）。したがって、ＳＲＦ、Ｅｎｉｇｍａは、転写活性によるタンパク質量の増加があったが、Ｍｄｍ２（ｐ１−Ｍｄｍ２）及びｐ５３の場合は、転写体水準の変化はなかった。但し、ｐ２−Ｍｄｍ２の転写水準は、ｐ５３の発現量に依存的に変化した（図１２のｂ及びｄ）。この結果は、細胞が増殖する場合に、ＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａの転写体が順に先に作られてＥｎｉｇｍａタンパク質がＭｄｍ２を安定化させてｐ５３を減少させる経路があることを提示する。
【０１２２】
＜５−４＞ＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２−ｐ５３経路のインビボ検証
Ａｄ−ｐ５３あるいはＡｄ−ＬａｃＺウイルス（５×１０８ｐｆｕ）それぞれをマウス（Ｂａｌｂ／ｃ、Ｆｅｍａｌｅ、Ｔａｃｏｎｉｃ）の尾静脈に注射して２４時間経過後、ＨＧＦ（１００μｇ／ｋｇ）をマウスの尾静脈に再び注射して時間別に肝を摘出して、ＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２−ｐ５３の変化をウエスタンブロットで確認した。その結果、ＨＧＦは、肝細胞のＳＲＦを転写活性化させてタンパク質発現を誘導し、ＳＲＦによってＥｎｉｇｍａは、転写体水準で誘導されてタンパク質量が増えた。Ｅｎｉｇｍａの増加によってＭｄｍ２のタンパク質量が増加し、同時にｐ５３はタンパク質量を減少させた（図１０のｆ及びｇ）。
【０１２３】
Ｅｎｉｇｍａの直接的な発現量変化によるＭｄｍ２−ｐ５３の変化を観察するために、まず、マウスの尾静脈にＡｄ−ｐ５３を注射または注射せずに、２４時間経過後にマウスの尾静脈にＡｄ−Ｆ−Ｅｎｉｇｍａ、Ａｄ−ＬａｃＺ、ＰＢＳを注射して４８時間後に肝を摘出してウエスタンブロットしてそれぞれのタンパク質量を確認した。また、Ａｄ−ｓｉＥｎｉｇｍａ、Ａｄ−ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ及びＰＢＳを尾静脈に注射した後、肝摘出８時間前にＨＧＦを尾静脈に注射した。その結果、Ｅｎｉｇｍａの発現が高ければＭｄｍ２も安定化してｐ５３が減少し、Ｅｎｉｇｍａの発現が抑制されると、ＨＧＦによるＭｄｍ２の安定化が阻害されてｐ５３が増加した（図１０のｈ）。この結果は、生体内でもＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２−ｐ５３経路が存在することを暗示している。
【０１２４】
＜実施例６＞ヒトの癌患者組織でのＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２−ｐ５３経路の調査
本発明者等は、ヒトの癌組織（胃癌：忠南医大、韓国；肝癌：全北医大及び啓明医大、韓国）でもＳＲＦによるＥｎｉｇｍａの誘導がＭｄｍ２の安定化をもたらしてｐ５３の減少を誘導することができるのかどうかを調べるため、肝癌、胃癌組織と該当する正常組織を組織溶解緩衝液（Ｉｎｔｒｏｎ、韓国）で破砕してウエスタンブロットで調査した。その結果、１２例の肝癌及び胃癌組織で、ＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２の発現が高かったが、ｐ５３発現が検出されなかった（図１３のａ、「＊」参照）。また、ヒトの各種癌組織が植えられている組織アレイ（ｗｗｗ．ｔｉｓｓｕｅａｒｒａｙ．ｃｏｍ）で、Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２の発現を蛍光抗体法を用いて観察した。その結果、胃癌及び大腸癌組織の細胞質の頂端部位（ａｐｉｃａｌ ｒｅｇｉｏｎ）でＥｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２が一緒に過発現して示された（図１３のｂ）。この結果は、速く増殖している癌細胞でＳＲＦ−Ｅｎｉｇａｍ−Ｍｄｍ２が活性化していて、ｐ５３が弱化していることを暗示している。
【０１２５】
＜実施例７＞Ｅｎｉｇｍａによる細胞生存効果及び抗癌剤耐性誘導検証
本発明者等は、Ｅｎｉｇｍａが細胞の自殺を誘導するｐ５３を減少させて細胞の生存能を増加させ、抗癌剤耐性を誘発するかどうかを調査した。
【０１２６】
＜７−１＞Ｅｎｉｇｍａの発現抑制によるｐ５３依存的細胞自殺誘導
ｐ５３＋／＋またはｐ５３−／−のＨＣＴ１１６大腸癌細胞株に、Ｆｌａｇ−Ｅｎｉｇｍａ（５μｇ）またはｓｉＥｎｉｇｍａ（１０μｇ）を導入して、アドリアマイシン（ＡＤＲ ２０μｇ／ｍｌ）を処理して細胞生存に及ぼすＥｎｉｇｍａ効果が、ｐ５３依存的なのかどうかを細胞計数法とクリスタルバイオレット染色法で確認した。その結果、野生型のｐ５３を有した細胞でのみＥｎｉｇｍａの発現が高い場合に、アドリアマイシンに対する細胞生存能が増加し、Ｅｎｉｇｍａの発現が抑制される場合に、細胞生存能が減少した（図１４のａ及びｂ）。また、ｐ５３が発現されないＨ１２９９、Ｈ３５８、ＰＣ３、及びＨｅｐ３Ｂ細胞株では、Ｅｎｉｇｍａの発現を減少させた時に、ｐ５３＋／＋ＨＣＴ１１６大腸癌細胞株と比較して、細胞生存能に影響が大きくなかった（図１５）。Ｅｎｉｇｍａによる細胞の生存に及ぼす効果が、細胞自殺調節効果なのかどうかをＴＵＮＥＬ検証法及び細胞周期を分析して検証した。その結果、野生型ｐ５３を有した細胞株で、Ｅｎｉｇｍａの発現抑制による細胞自殺が効果的に示された（図１４のｄ）。したがって、アドリアマイシン処理時にＥｎｉｇｍａによる細胞生存能の増加効果は、ｐ５３を媒介にして細胞自殺誘導を抑制することによるものであることが分かった。
【０１２７】
同時に、アドリアマイシン（ＡＤＲ）（Ｓｉｇｍａ，米国）処理時に、Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２−ｐ５３経路の変化を確認するために、前記と同一条件でＡＤＲ（２μｇ／ｍｌ）を処理してウエスタンブロットを実施した。その結果、ｐ５３の存在と無関係にＡＤＲによるＭｄｍ２の減少は、Ｅｎｉｇｍａの過発現によって阻害され、Ｅｎｉｇｍａ発現依存的にＭｄｍ２−ｐ５３の発現も増加または減少した（図１４のｃ）。したがって、Ｅｎｉｇｍａは、Ｍｄｍ２を経由してｐ５３を減少させて癌細胞がアドリアマイシンに対する細胞生存能を増加させることが分かった。
【０１２８】
＜実施例８＞マウス異種移植（Ｍｏｕｓｅ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）モデルでのＥｎｉｇｍａによる癌細胞のＡＤＲ抵抗性誘導検証
本発明者等は、Ｅｎｉｇｍａの発現に依存的にｐ５３による細胞自殺が調節されることを確認して、実際に肝癌細胞株ＨＬＫ３で作ったマウス腫瘍モデルで、ＥｎｉｇｍａによるＡＤＲ抵抗性が誘導されるのかどうかを調査した。
【０１２９】
＜８−１＞ＥｎｉｇｍａがＨＬＫ３肝癌細胞株の生存能に及ぼす効果
Ｆ−Ｅｎｉｇｍａ（５μｇ）またはｓｉＥｎｉｇｍａ（１０μｇ）をＨＬＫ細胞株に導入して、アドリアマイシン（ＡＤＲ ２０μｇ／ｍｌ）を処理するかまたは処理せずに、細胞計数法で細胞の生存を調査した。その結果、Ｅｎｉｇｍａの発現が高い場合には、抗癌剤による細胞自殺が抑制され、Ｅｎｉｇｍａの発現が抑制される場合には、ＡＤＲがない場合にも細胞自殺が効果的に誘導された（図１６のａ及び図１７）。ＡＤＲ処理時に、Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２−ｐ５３経路の変化を確認するために、上記と同一条件でＡＤＲ（２μｇ／ｍｌ）を処理してウエスタンブロットを実施した。その結果、Ｅｎｉｇｍａの発現に依存的にＭｄｍ２−ｐ５３の発現が変化した（図１６のｂ）。
【０１３０】
＜８−２＞ＥｎｉｇｍａによるエトポシドとＮｕｔｌｉｎ３ａに対する抵抗性増加検証
エトポシド（ＥＴＣ）とｎｕｔｌｉｎ３ａ（Ｓｉｇｍａ，米国）は、機序は異なるがｐ５３を活性化させて癌細胞の自殺を誘導する抗癌剤であり（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４年，第３０３巻，ｐ．８４４−８４８４）、これらに対してもＥｎｉｇｍａが癌細胞に対して抵抗性を示すようにできるのかどうかを検証した。Ｆ−Ｅｎｉｇｍａ（５μｇ）が導入されたＨＬＫ３細胞に、ＥＴＣとｎｕｔｌｉｎ３ａをそれぞれ処理して細胞計数法で生存した細胞数を確認した。その結果、Ｅｎｉｇｍａが過発現されるとＥＴＣとｎｕｔｌｉｎ３ａに対しても抵抗性が誘導されることを確認した（図１６のｃ）。また、Ｆ−Ｅｎｉｇｍａの発現時に、ＥＴＣとｎｕｔｌｉｎ３ａ処理によるＭｄｍ２−ｐ５３の発現様相をウエスタンブロットで確認した。その結果、Ｆ−Ｅｎｉｇｍａの過発現によるＭｄｍ２の増加とｐ５３の減少を確認することができた（図１６のｄ）。
【０１３１】
＜８−３＞マウス移植腫瘍モデルでのＥｎｉｇｍａによるＡＤＲ抵抗性検証
ＥｎｉｇｍａによるＡＤＲ抵抗性誘導が、生体内でも起きるのかどうかを検証するために、ヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ，Ｆｅｍａｌｅ，ＳＬＣ，日本）に腫瘍モデルを製作して用いた。そのために、Ａｄ−Ｆ−Ｅｎｉｇｍａ（１００ ＭＯＩ）、Ａｄ−ＬａｃＺ（１００ ＭＯＩ）、Ａｄ−ｓｉＥｎｉｇｍａ（２００ ＭＯＩ）、Ａｄ−ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ（２００ ＭＯＩ）を、まず、ＨＬＫ細胞に感染させた後、前記マウス（ｎ＝５／実験群）の皮下に注射した。１４日後、ＡＤＲ（４ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈内に注射して、以後２８日間腫瘍塊の大きさを観察した。その結果、Ｆ−Ｅｎｉｇｍａが発現される癌細胞は、ＡＤＲを処理しない対照群と類似に増殖しながらＡＤＲに抵抗性を示し、Ｅｎｉｇｍａ発現が抑制される群は、癌細胞の増殖が最も多く抑制された（図１６のｅ及びｆ）。腫瘍塊を成す細胞中のＭｄｍ２−ｐ５３の発現変化を確認するために、上記の条件で前記マウスに腫瘍塊を作って、ＡＤＲで処理して３日後に腫瘍塊をマウスから分離して細胞破砕液を得た後、ウエスタンブロットで各タンパク質の発現様相を確認した。その結果、抗癌剤耐性がある場合、Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２が多く、ｐ５３が減少していた（図１６のｇ）。
【産業上の利用可能性】
【０１３２】
本発明は、ＥｎｉｇｍａのＭｄｍ２−ｐ５３のユビキチンプロテオゾーム分解の調節機序研究、及び癌細胞でのＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２−ｐ５３経路を通じた作用機序研究などに有用に使用することができる。また、Ｅｎｉｇｍａの発現調節を通じての抗癌剤開発、Ｅｎｉｇｍａ発現またはＥｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２相互結合を用いた抗癌剤スクリーニング方法開発、及びＥｎｉｇｍａ発現を用いた抗癌剤治療の予後を評価する方法開発に有用に使用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｅｎｉｇｍａ（ＰＤＬＩＭ７）−Ｍｄｍ２相互作用及びその用途に関するもので、より詳細には、ＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２間の相互作用及びＥｎｉｇｍａ発現調節を用いた癌治療方法及び抗癌剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ｐ５３は、細胞の増殖の停止及び死滅を調節する遺伝子を調節する因子であり、非正常的な細胞を除去することによって正常細胞が癌細胞になることを防いでくれる重要な因子として知られている（非特許文献１）。ｐ５３活性は、正常細胞の生存のために非常に厳格に調節されていて、前記調節を主に担当するのは、Ｈｄｍ２／Ｍｄｍ２（ｈｕｍａｎ／ｍｏｕｓｅ ｄｏｕｂｌｅ ｍｉｎｕｔｅ２；以下Ｍｄｍ２とする）である。前記Ｍｄｍ２は、ｐ５３をユビキチン化させて分解するＥ３ユビキチンリガーゼとしてｐ５３の細胞内濃度を調節する（非特許文献２、３、４）。また、Ｍｄｍ２は、ｐ５３の転写調節を受けて発現が調節される自己調節ループを形成する（非特許文献５）。また、前記Ｍｄｍ２は、ｐ５３以外にＭｄｍ２自体をユビキチン化させて分解する（非特許文献６、７）。
【０００３】
Ｍｄｍ２は、ｐ５３を不活性化させたり独自的に発癌性遺伝子を作動させたりし、実際にヒトの色々な癌組織に過発現されている（非特許文献８）。野生型のｐ５３を有している癌細胞でのＭｄｍ２機能の制御は、癌細胞の死滅を誘導することができるので、Ｍｄｍ２は、抗癌剤開発の有用な標的になっている（非特許文献９）。しかし、Ｍｄｍ２の機能制御によるｐ５３安定化による細胞死滅は、癌細胞だけではなく正常細胞でも起きて深刻な副作用をもたらし得るため、癌細胞において、より選択的にＭｄｍ２を調節することができる経路の解明が切実に求められている。
【０００４】
ＰＤＬＩＭ７タンパク質Ｅｎｉｇｍａは、ＰＤＺ及びＬＩＭドメインを有している（非特許文献１０）。前記ＥｎｉｇｍａのＬＩＭドメインは、三つのＺｉｎｃフィンガーで構成され、タンパク質キナーゼまたはインスリン信号伝達の連結因子等と結合する（非特許文献１１、１２、１３）。また、Ｅｎｉｇｍａは、甲状腺癌誘発因子であるＲｅｔ／ｐｔｃ２と結合して活性化させる（非特許文献１４）。しかし、Ｅｎｉｇｍａの細胞内機能は、明確には解明されていない。
【０００５】
Ｍｄｍ２を安定化させてｐ５３の活性を弱化させられることが知られた因子として、ＹＹ１、Ｇａｎｋｙｒｉｎ、Ｄａｘｘなどがある。前記ＹＹ１は、Ｍｄｍ２とｐ５３に結合してｐ５３の分解を促進させ、ＧａｎｋｙｒｉｎはＭｄｍ２の酵素活性を促進させてｐ５３の分解を促進させる（非特許文献１５、１６）。前記Ｄａｘｘは、Ｍｄｍ２と結合してＭｄｍ２を安定化させてｐ５３を抑制するが、Ｍｄｍ２の自己ユビキチン化活性には影響を与えない（非特許文献１７）。細胞が増殖する場合、Ｍｄｍ２の発現が増加するが（非特許文献１８）、その機序に対する意見は明確ではない。
【０００６】
それで、本発明者等は、Ｅｎｉｇｍａの機能を調査した結果、ＥｎｉｇｍａがＭｄｍ２依存的にｐ５３と結合してＭｄｍ２の自己ユビキチン化を特異的に阻害しながら、Ｍｄｍ２依存的ｐ５３ユビキチン化を促進してｐ５３分解を促進させるという点で、従来のＭｄｍ２−ｐ５３経路調節因子等と明確に差別化される新しいＭｄｍ２−ｐ５３調節機序を明らかにした。また、細胞が増殖する条件及びヒトの肝癌及び胃癌組織で、ＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２経路の存在がｐ５３を弱化させられることを初めて明らかにした。同時に、細胞でのＥｎｉｇｍａの過発現は、細胞生存能の増加及び抗癌剤耐性を誘導することを明らかにした。したがって、癌細胞においてＥｎｉｇｍａの発現を抑制してｐ５３を活性化させることができ、Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２相互結合阻害因子を選別して抗癌剤をスクリーニングすることができ、抗癌剤治療時にＥｎｉｇｍａの発現程度を確認して抗癌効果確認に使用できることを明らかにして、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍｉｃｈａｅｌ ａｎｄ Ｏｒｅｎ，Ｃｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．，２００３年，第１３巻，ｐ．４９−５８
【非特許文献２】Ｈａｕｐｔ等，Ｎａｔｕｒｅ，１９９７年，第３８７巻，ｐ．２９６−２９９
【非特許文献３】Ｈｏｎｄａ等，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９７年，第４２０巻，ｐ．２５−２７
【非特許文献４】Ｋｕｂｂｕｔａｔ等，Ｎａｔｕｒｅ、１９９７年，第３８７巻，ｐ．２９９−３０２
【非特許文献５】Ｍｉｃｈａｅｌ ａｎｄ Ｏｒｅｎ，Ｃｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．，２００３年，第１３巻，ｐ．４９−５８
【非特許文献６】Ｆａｎｇ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０００年，第２７５巻，ｐ．８９４５−８９５１
【非特許文献７】Ｈｏｎｄａ ａｎｄ Ｙａｓｕｄａ，Ｏｎｃｏｇｎｅ，２０００年，第１９巻，ｐ．４１７３−４１７６
【非特許文献８】Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００４年，第２巻，ｐ．１−８
【非特許文献９】Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２００７年，第３９巻，ｐ．１４７６−１４８２
【非特許文献１０】Ｂａｃｈ，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．，２０００年，第９１巻，ｐ．５−１７
【非特許文献１１】Ｂａｒｒｅｓ等，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，２００６年，第２０巻，ｐ．２８６４−２８７５
【非特許文献１２】Ｋｕｒｏｄａ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６年，第２７１巻，ｐ．３１０２９−３１０３２
【非特許文献１３】Ｗｕ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６年，第２７１巻，ｐ．１５９３４−１５９４１
【非特許文献１４】Ｄｕｒｉｃｋ等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９８年，第１８巻，ｐ．２２９８−２３０８
【非特許文献１５】Ｓｕｉ等，Ｃｅｌｌ，２００４年，第１１７巻，ｐ．８５９−８７２
【非特許文献１６】Ｈｉｇａｓｈｉｔｓｕｊｉ等，Ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ，２００５年，第８巻，ｐ．７５−８７
【非特許文献１７】Ｔａｎｇ等，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２００６年，第８巻，ｐ．８５５−８６２
【非特許文献１８】Ｆｅｎｇ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００４年，第２７９巻，ｐ．３５５１０−３５５１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、Ｅｎｉｇｍａの細胞内機能と癌発生及び癌細胞の生存との関連性を解明して、Ｅｎｉｇｍａの発現を阻害することによって癌細胞の死滅を誘導する方法及び製剤を提供して、ＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２間の相互結合またはＥｎｉｇｍａによるＭｄｍ２とｐ５３の発現調節を用いて、抗癌剤候補物質をスクリーニングする方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明は、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を有効成分として含む抗癌用組成物を提供する。
【００１０】
また、本発明は、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を有効成分として含む抗癌補助剤を提供する。
【００１１】
また、本発明は、薬学的に有効な量のＥｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を、癌にかかった個体に投与する工程を含む癌治療方法を提供する。
【００１２】
また、本発明は、薬学的に有効な量のＥｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を、個体に投与する工程を含む癌予防方法を提供する。
【００１３】
また、本発明は、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制を通じてＭｄｍ２の安定性を減少させて、ｐ５３の活性を増加させる方法を提供する。
【００１４】
また、本発明は、Ｅｎｉｇｍａに依存的なＭｄｍ２またはｐ５３の発現水準を用いた抗癌剤候補物質のスクリーニング方法を提供する。
【００１５】
また、本発明は、ＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２間の相互結合水準を用いた抗癌剤候補物質のスクリーニング方法を提供する。
【００１６】
また、本発明は、癌細胞でのＥｎｉｇｍａ発現水準を用いた癌の診断、治療結果確認または予後を評価する方法を提供する。
【００１７】
また、本発明は、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を含む癌の診断、治療結果確認または予後評価用キットを提供する。
【００１８】
また、本発明は、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を抗癌用組成物の製造に使用する用途を提供する。
【００１９】
また、本発明は、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を抗癌補助剤の製造に使用する用途を提供する。
【００２０】
同時に、本発明は、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を癌の診断、治療結果確認または予後評価用キットの製造に使用する用途を提供する。
【００２１】
本発明（１）は、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を有効成分として含む抗癌用組成物である。
本発明（２）は、前記Ｅｎｉｇｍａの発現抑制剤が、Ｅｎｉｇｍａ遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド、短干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）及びＲＮＡｉからなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする本発明（１）の抗癌用組成物である。
本発明（３）は、前記Ｅｎｉｇｍａの活性抑制剤が、Ｅｎｉｇｍａタンパク質に相補的に結合する化合物、ペプチド、ペプチドミメティクス及び抗体からなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする本発明（１）の抗癌用組成物である。
本発明（４）は、前記短干渉ＲＮＡが、配列番号２あるいは３で表わされる塩基配列を有することを特徴とする本発明（２）の抗癌用組成物である。
本発明（５）は、前記癌が、胃癌、肝癌及び大腸癌からなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする本発明（１）の抗癌用組成物である。
本発明（６）は、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を有効成分として含む抗癌補助剤である。
本発明（７）は、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を癌にかかった個体に投与する工程を含む癌治療方法である。
本発明（８）は、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制を通じてＨｄｍ２／Ｍｄｍ２（ｈｕｍａｎ／ｍｏｕｓｅ ｄｏｕｂｌｅ ｍｉｎｕｔｅ ２）の安定性を減少させる方法である。
本発明（９）は、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制を通じてｐ５３の活性を増加させる方法である。
本発明（１０）は、
１）候補物質が存在するまたは存在しない条件下でＥｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２を接触させる工程、
２）Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２の結合水準を測定する工程、及び
３）候補物質が存在しない時と比較してＥｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２の結合水準を減少させた候補物質を選別する工程を含む、抗癌剤候補物質のスクリーニング方法である。
本発明（１１）は、
１）Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２を発現する細胞と候補物質を接触させる工程と、
２）細胞内Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２の結合水準を測定する工程、及び
３）候補物質を処理しない対照群と比較して細胞内Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２の結合水準を減少させた候補物質を選別する工程とを含む、抗癌剤候補物質のスクリーニング方法である。
本発明（１２）は、
１）Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２を発現する細胞に候補物質を処理する工程と、
２）ＥｎｉｇｍａまたはＭｄｍ２の発現水準を測定する工程、及び
３）候補物質を処理しない対照群と比較してＥｎｉｇｍａまたはＭｄｍ２の発現水準を減少させた候補物質を選別する工程とを含む、抗癌剤候補物質のスクリーニング方法である。
本発明（１３）は、
１）Ｅｎｉｇｍａ、Ｍｄｍ２及びｐ５３を発現する細胞に候補物質を処理する工程と、
２）ｐ５３の発現水準を測定する工程、及び
３）候補物質を処理しない対照群と比較してｐ５３の発現水準を増加させた候補物質を選別する工程とを含む、抗癌剤候補物質のスクリーニング方法である。
本発明（１４）は、Ｅｎｉｇｍａと反応する抗体またはＥｎｉｇｍａ遺伝子に相補的な核酸のうちのいずれか一つ以上を用いて、癌細胞でのＥｎｉｇｍａ発現水準を測定する工程を含む、癌の診断、治療結果確認または予後を評価する方法である。
本発明（１５）は、Ｅｎｉｇｍａと反応する抗体またはＥｎｉｇｍａ遺伝子に相補的な核酸のうちのいずれか一つ以上を含む癌診断用キットである。
【発明の効果】
【００２２】
上述のように、癌細胞でのＥｎｉｇｍａの過発現は、Ｍｄｍ２の安定化とｐ５３の減少を招来し、これは、Ｍｄｍ２の自己ユビキチン化の抑制とｐ５３ユビキチン化増加によるものであることを確認した。したがって、Ｅｎｉｇｍａの発現を抑制することで、癌細胞を効果的に死滅させることができ、癌患者のＥｎｉｇｍａの発現を測定することで、抗癌治療時の予後を評価することができ、ＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２間に特異的相互結合を確認し、それを抑制する物質を選別することで、Ｍｄｍ２の安定化を弱化してｐ５３の活性を増加させて抗癌活性を示すことができる物質をスクリーニングできることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ｓｉ−Ｅｎｉｇｍａを含むベクターを示す模式図である。
【図２】Ｆ−Ｅｎｉｇｍａを発現するアデノウイルスを製作する方法を示す模式図である。
【図３】ｓｉ−Ｅｎｉｇｍａを含むアデノウイルスを製作する方法を示す模式図である。
【図４】ａは、Ｅｎｉｇｍａが過発現になった時、Ｍｄｍ２が安定化してｐ５３が分解されることが、ユビキチンプロテオゾーム分解経路であることを示すウエスタンブロット写真である。ｂは、Ｅｎｉｇｍａによるｐ５３タンパク質の減少が、ｐ５３の活性の減少で示されるということをレポーター分析方法で確認した図である。ｃは、Ｅｎｉｇｍａ過発現時にＭｄｍ２、ｐ５３、ｐ２１のｍＲＮＡ水準の変化をノーザンブロットで確認した写真である。ｄ及びｅは、ＥｎｉｇｍａによるＭｄｍ２の調節は、ｐ５３に非依存的で、Ｅｎｉｇｍａによるｐ５３と下位ｐ２１の調節は、Ｍｄｍ２に依存的であることを示すウエスタンブロット写真である。
【図５】ａ及びｂは、細胞内でＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２間の結合がｐ５３に非依存的で、Ｅｎｉｍｇａ−ｐ５３結合は、Ｍｄｍ２依存的に起きることを示すウエスタンブロット写真である。ｃは、試験管でＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２間の結合がｐ５３に非依存的で、Ｅｎｉｍｇａ−ｐ５３結合はＭｄｍ２依存的に起きることを示すウエスタンブロット写真である。ｄは、Ｅｎｉｇｍａが結合するＭｄｍ２の部位が４００−４９１であることを示した模式図とウエスタンブロット写真である。ｅ及びｆは、Ｍｄｍ２が結合するＥｎｉｇｍａの部位が、ＬＩＭ３であることを示した模式図とウエスタンブロット写真である。ｇは、Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２−ｐ５３間の相互結合を示した模式図である。
【図６】ａは、ＥＮＨ（Ｅｎｉｇｍａ ｈｏｍｏｌｏｇ）がＭｄｍ２と結合しないことを示すウエスタンブロット写真である。ｂは、ＥＮＨはＭｄｍ２−ｐ５３の細胞内濃度に影響を与えないことを示すウエスタンブロット写真である。
【図７】ａ及びｂは、細胞内でＥｎｉｇｍａが過発現されると、Ｍｄｍ２の自己ユビキチン化が阻害されながらｐ５３のユビキチン化が増加し、Ｅｎｉｇｍａの発現を抑制した時、現象が逆転することを示すウエスタンブロット写真である。ｃは、ＥｎｉｇｍａのＬＩＭ３ドメインがＭｄｍ２と結合してＭｄｍ２の自己ユビキチン化を抑制することを示すウエスタンブロット写真である。ｄは、ＥｎｉｇｍａによってＭｄｍ２がｐ５３をユビキチン化することが増加されることを示したウエスタン写真である。
【図８】ＥｎｉｇｍａがＰＣＡＦによるＭｄｍ２ユビキチン化には影響を与えないとことをインビトロ及び細胞内で検証した図である。
【図９】ａは、Ｅｎｉｇｍａのプロモーター部位のＳＲＥ存在とＳＲＥ除去突然変異体を示した模式図である。ｂは、Ｅｎｉｇｍａのプロモーターが血清によって活性化することをレポーター分析で示した図である。ｃ及びｄは、ＥｎｉｇｍａのプロモーターでＳＲＥ部位が血清、ＦＧＦ、及びＨＧＦによる活性化に重要部位であることを示した図である。ｅ及びｆは、ＥｎｉｇｍａプロモーターのＳＲＥ部位にＳＲＦが特異的に結合することを示したＥＭＳＡとＣｈＩＰ分析結果である。
【図１０】ａ及びｂは、血清によってＳＲＦとＥｎｉｇｍａの転写活性化が誘導されてタンパク質水準が増加し、それによってＭｄｍ２のタンパク質量が増加してｐ５３が抑制されることを示すウエスタンブロット写真とＲＴ−ＰＣＲ写真である。ｃ及びｄは、ＨＧＦによって誘導されるＭｄｍ２の安定化が、ＳＲＦとＥｎｉｇｍａに依存的であることを示すウエスタンブロット写真である。ｅは、ＨＧＦによるＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２経路の活性化が、ＭＡＰキナーゼに依存的であることを暗示すウエスタンブロット写真である。ｆないしｈは、ＨＧＦによるＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２経路の活性化が、実際マウスの肝にも存在することを示したウエスタンブロットとＲＴ−ＰＣＲ写真である。
【図１１】ａ及びｂは、血清が制限される条件で、ＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２経路の抑制を示したウエスタンブロットとＲＴ−ＰＣＲ写真である。
【図１２】ａとｂは、ヒトの正常繊維細胞でもＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２経路が存在し、ＭＡＰキナーゼに依存的な事実を示したウエスタンブロットとＲＴ−ＰＣＲ写真である。ｃとｄは、マウス胎児の正常繊維細胞でもＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２経路が存在し、ＭＡＰキナーゼに依存的な事実を示したウエスタンブロットとＲＴ−ＰＣＲ写真である。
【図１３】ａは、ヒトの肝癌組織と胃癌組織でＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２が過発現されていて、ｐ５３は発現されていないことを示すウエスタンブロット写真である。ｂは、ヒトの胃癌、大腸癌組織でＥｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２がともに過発現していることを示す蛍光抗体染色写真である。
【図１４】ａ及びｂは、Ｅｎｉｇｍａがアドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ；ＡＤＲ）による細胞殺傷力をｐ５３依存的に弱化させて、Ｅｎｉｇｍａが細胞生存能を増加させることを示した細胞計数法とクリスタルバイオレット染色写真である。ｃは、ＡＤＲ処理時にＥｎｉｇｍａの発現量によるＭｄｍ２−ｐ５３の発現変化を示すウエスタンブロット写真である。ｄは、ＡＤＲ処理時にＥｎｉｇｍａが細胞死滅をｐ５３依存的に調節することを示したＴＵＮＥＬ検証及び細胞周期分析写真である。
【図１５】ａ及びｂは、ｐ５３が発現されない細胞株の増殖にＥｎｉｇｍａが及ぼす影響を示した図で、ｃ及びｄは、前記条件でＭｄｍ２−ｐ５３発現様相を調査したウエスタンブロット及びクリスタルバイオレット染色写真である。
【図１６】ａ及びｂは、ＨＬＫ３肝癌細胞株でＥｎｉｇｍａによってアドリアマイシン（ＡＤＲ）耐性が誘発されて、Ｅｎｉｇｍａの発現を抑制すると癌細胞の抗癌剤感受性が高くなることを示した細胞計数法とウエスタンブロット写真である。ｃ及びｄは、ＡＤＲの外にエトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）またはｎｕｔｌｉｎ３ａのようなｐ５３を活性化させる抗癌剤処理時にも、ＥｎｉｇｍａはＭｄｍ２−ｐ５３を調節して細胞の自殺を妨害することを示す細胞計数法とウエスタンブロット写真である。ｅ及びｆは、実際マウス腫瘍モデルで、Ｅｎｉｇｍａが過発現されるとＡＤＲに対して抵抗性が生じて、Ｅｎｉｇｍａの発現が抑制されると腫瘍の成長が効果的に抑制されることを示したグラフと腫瘍塊の写真である。ｇは、マウス腫瘍塊内のＥｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２−ｐ５３の発現変化を示すウエスタンブロット写真である。
【図１７】ａは、図１６のａの条件でＨＬＫ細胞をクリスタルバイオレットで染色した写真であり、ｂは、図１６のａの条件でＨＬＫ細胞の周期を分析した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明で使用する用語を定義する。
【００２５】
本発明で使用する用語「予防」は、本発明の組成物の投与で癌の成長または転移を抑制するすべての行為を意味する。
【００２６】
本発明で使用する用語「治療」は、本発明の組成物の投与で癌の症状が好転または有利に変化するすべての行為を意味する。
【００２７】
本発明で使用する用語「投与」は、任意の適切な方法で個体に所定の本発明の組成物を提供することを意味する。
【００２８】
本発明で使用する用語「個体」は、本発明の組成物を投与して癌の症状が好転し得る疾患を有したヒト、サル、イヌ、ヤギ、ブタまたはネズミなどすべての動物を意味する。
【００２９】
本発明で使用する用語「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な受恵または危険の割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、これは個体の癌の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出割合、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素及びその他の医学分野でよく知られた要素によって決定され得る。
【００３０】
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明は、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制を通じてＭｄｍ２の安定性を減少させて、ｐ５３の活性を増加させる方法を提供する。
【００３１】
本発明者等は、Ｅｎｉｇｍａの発現に依存的にＭｄｍ２の安定性が調節されることを確認し（図４のａ、ｄ及びｅ参照）、Ｍｄｍ２はｐ５３を基質とするＥ３リガーゼなので、Ｍｄｍ２の安定化がｐ５３のユビキチンプロテオゾーム分解を促進してｐ５３の細胞内機能を抑制することを確認し（図４のａないしｅ参照）、ＥｎｉｇｍａによってＭｄｍ２の自己ユビキチン化が抑制されてｐ５３のユビキチン化が増加することを確認した（図７のａないしｄ参照）。
【００３２】
また、本発明者等は、ＥｎｉｇｍａによるＭｄｍ２−ｐ５３の発現調節が細胞の成長に及ぼす影響を調べるため、成長促進因子による細胞増殖誘導条件でＥｎｉｇｍａの機能を確認した結果、ＥｎｉｇｍａはＳＲＦによってその発現が促進され、Ｍｄｍ２を安定化させてｐ５３を抑制することによって細胞増殖を助ける役割をしていることが示された（図９のａないしｆ参照、及び図１０のａないしｅ参照）。
【００３３】
本発明のＥｎｉｇｍａの発現または活性抑制は、Ｅｎｉｇｍａ遺伝子の転写を抑制する物質、転写されたＥｎｉｇｍａｍＲＮＡの翻訳を抑制する物質、またはＥｎｉｇｍａタンパク質の機能を抑制する物質からなる群から選択されるものを使用することが好ましいが、これに限定されない。
【００３４】
前記転写抑制する物質には、Ｅｎｉｇｍａ遺伝子の転写を調節することが知られているプロモーター、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）、プロモーターに結合される転写調節因子に結合するタンパク質または化合物を使用することが好ましいが、これに限定されない。
【００３５】
前記ｍＲＮＡの翻訳を抑制する物質には、低分子化合物、アンチセンス核酸配列の製造やＲＮＡｉテクニックを用いたＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどを使用することが好ましいが、これに限定されない。
【００３６】
これを具体的に詳しく見ると下記のようになる。
１）ＲＮＡｉ
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、Ｅｎｉｇｍａ遺伝子に対応する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞または有機体に導入することにより、対応するｍＲＮＡの分解が起きる転写後遺伝子サイレンシングメカニズム（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）である。前記ＲＮＡｉ効果によって遺伝子発現が復帰される前に多重細胞分裂が持続するので、ＲＮＡｉはＲＮＡレベルで目標とするノックアウト（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）または「ノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）」を作る非常に強力な方法である。ＲＮＡｉは、ヒトの胚芽腎臓（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ）及びＨｅＬａ細胞を含むヒト細胞において成功的であることが確認された（Ｅｌｂａｓｈｉｒ等，Ｎａｔｕｒｅ，２００１年，第４１１巻，ｐ．４９４−４９８）。
【００３７】
遺伝子サイレンシングでのＲＮＡｉ技術は、標準分子生物学方法を用いる。不活性化させる標的遺伝子の配列に対応するｄｓＲＮＡは、標準方法、例えば、Ｔ７ ＲＮＡ重合酵素を用いた鋳型ＤＮＡの両鎖同時転写によって生成することができる。 ＲＮＡｉに使われるｄｓＲＮＡの生成キットは、商業的に販売されている製品（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．社の製品）を使用することができる。ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを製造するように処理されたプラスミドのトランスフェクション方法は、従来公知の技術である。
【００３８】
２）ｓｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡは、特定ｍＲＮＡの切断を通じてＲＮＡｉ現象を誘導することができる短い二重鎖ＲＮＡを意味する。
【００３９】
ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ同士が対をなす二重鎖ＲＮＡ部分が完全に対をなすことに限定されないで、ミスマッチ（対応する塩基が相補的ではない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）などによって対をなさない部分が含まれ得る。対をなす塩基の長さは、Ｅｎｉｇｍａの活性及び発現を妨害できる、１０ないし４０塩基、好ましくは１５ないし３０塩基である。ｓｉＲＮＡ末端構造は、標的遺伝子の発現をＲＮＡｉ効果よって抑制することができるものなら平滑末端または突出末端すべて可能である。粘着末端構造は、３’末端突出構造と５’末端の方が突出した構造すべて可能である。突出する塩基数は、限定されない。例えば、塩基数は１ないし８塩基、好ましくは２ないし６塩基であり得る。本明細書で、ｓｉＲＮＡの長さは、ポリヌクレオチドが対を成す長さである。ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現抑制効果を維持することができる範囲で例えば、一方の末端突出部分に低分子ＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ウイルスＲＮＡのような天然のＲＮＡ分子または人工のＲＮＡ分子）を含むことができる。ｓｉＲＮＡ末端構造は、両側すべてが切断構造を有する必要はなく、二重鎖ＲＮＡの一方の末端部位がリンカーＲＮＡによって接続されたステムループ型構造であることも可能である。リンカーの長さは、ステム部分の対をなすのに支障ない長さなら特別に限定されない。
【００４０】
ｓｉＲＮＡを公知された遺伝子で設計して製造する方法に対する開示内容として、例えば、文献［Ｃｈａｌｋ ＡＭ，Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ Ｃ，Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ ＥＬ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｎｄ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｓｉＲＮＡ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００４年６月１８日，第３１９（１）巻，ｐ．２６４−７４；Ｓｉｏｕｄ Ｍ，Ｌｅｉｒｄａｌ Ｍ．，Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｒｕｌｅｓ ａｎｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｓｉＲＮＡｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００４年，第２５２巻，ｐ．４５７−６９］を参考にすることができる。また、変形されたより安定したｓｉＲＮＡの製造のために例えば、文献［ＰＣＴ公開公報第２００４／０１５１０７号、米国特許第５，８９８，０３１号及び第６，１０７，０９４号］を参考にすることができる。
【００４１】
細胞内でｓｉＲＮＡを発生させることができるＤＮＡ−含有ベクターが開発されてきた。その方法は、一般的に細胞内でｓｉＲＮＡを形成するように効率的にプロセッシングされた短いヘアピンＲＮＡの転写を含む。これと関連して、文献［Ｐａｄｄｉｓｏｎ等，ＰＮＡＳ，２００２年，第９９巻，ｐ．１４４３−１４４８；Ｐａｄｄｉｓｏｎ等，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ，２００２年，第１６巻，ｐ．９４８−９５８；Ｓｕｉ等．ＰＮＡＳ，２００２年，第８巻，ｐ．５５１５−５５２０；及びＢｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２年，第２９６巻，ｐ．５５０−５５３］を参考にすることができ、これらは、多数の内生的及び外生的に発現された遺伝子を特異的に標的にできるｓｉＲＮＡを生成させる方法を記述している。
【００４２】
ｓｉＲＮＡの伝達に対しては、例えば、文献［Ｓｈｅｎ等，ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ，２００３年，第５３９巻，ｐ．１１１−１１４；Ｘｉａ等，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００２年，第２０巻，ｐ．１００６−１０１０；及びＲｅｉｇｈ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｓｉｏｎ，２００３年，第９巻，ｐ．２１０−２１６］を参考にすることができる。ｓｉＲＮＡが霊長類での抑制に成功的に使用され、追加的な詳細な説明に対しては、文献［Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ等，Ｒｅｔｉｎａ，２００４年２月，第２４（１）巻，ｐ．１３２−１３８］を参考にすることができる。
【００４３】
ｓｉＲＮＡの治療剤への使用に対しては、例えば、文献［韓国登録特許第１０−０６５３７３８号、韓国登録特許第１０−０７４９８５９号、韓国登録特許第１０−０９３０２８２号、及び韓国登録特許第１０−０８１００３４号］を参考にすることができる。
【００４４】
３）アンチセンス核酸配列
Ｅｎｉｇｍａをコードする核酸に対してアンチセンスである核酸分子を阻害剤に使用することができる。「アンチセンス」核酸は、Ｅｎｉｇｍａをコードする「センス」核酸に相補的な、例えば二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的またはｍＲＮＡ配列に相補的な核酸配列を含む。したがって、アンチセンス核酸は、センス核酸と水素結合を形成することができる。前記アンチセンス核酸は、全体Ｅｎｉｇｍａコード鎖または単にそれらの一部（例：コード領域）に相補的なことがある。前記アンチセンス核酸分子は、Ｅｎｉｇｍａ ｍＲＮＡの全体コード領域に相補的なことがあり、Ｅｎｉｇｍａ ｍＲＮＡのコードまたは非コード領域の単に一部（例：翻訳開始部）にのみアンチセンスであるオリゴヌクレオチドがさらに好ましい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば約５ないし５０ヌクレオチドの長さであり得る。アンチセンス核酸は、公知の方法を用いた化合合成及び酵素結合反応を用いて構成することができる。化学合成法、例えば、文献［Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９１年，第３２巻，ｐ．３０００５−３０００８］に記載されているように、アセトニトリル中でテトラエチルチウラムジスルファイドで硫化させるホスホアミダート化学のような方法によって非常に容易に製造することができる。前記アンチセンス核酸の生成に使用できる変形ヌクレオチドの例としては、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、５−カルボキシルメチルアミノメチル−２−チオウリジン、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、２，６−ジアミノプリン、５−メチル−２−チオウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニル、５−メチル−２−チオウラシル、（ａｃｐ３）ｗ及びワイブトキソシンが挙げられる。必要によって、前記アンチセンス核酸は、発現ベクターを用いて生物学的に生成することができる。
【００４５】
前記Ｅｎｉｇｍａタンパク質の機能を抑制する物質では、前記タンパク質に結合するペプチド、抗体、化合物またはペプチドミメティクスなどを使用することが好ましいが、これに限定されない。
【００４６】
これを具体的に詳しく下記に示す。
１）ペプチドミメティクス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｉｍｅｔｉｃｓ）
Ｅｎｉｇｍａポリペプチドのタンパク質結合ドメインを抑制したミメティクス（例、ペプチドまたは非ペプチド性薬剤）を製作して、元来のＥｎｉｇｍａポリペプチドがＭｍｄ２に結合することを抑制することができる（欧州特許出願ＥＰ０４１２７６５及びＥＰ００３１０８０）。
【００４７】
非加水分解性ペプチド類似体の主要残基としては、β−ターン・ジペプチドコア（Ｎａｇａｉ等，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ，１９８５年，第２６巻，ｐ．６４７）、ケトメチレンシュードペプチド類（Ｅｗｅｎｓｏｎ等，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，１９８６年，第２９巻，ｐ．２９５；及びＥｗｅｎｓｏｎ等，ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ９ｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＩＬ，１９８５年）、アゼピン（Ｈｕｆｆｍａｎ等，ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｄ．，ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８年）、ベンゾジアゼピン（Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ等，ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ；Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｄ．，ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８年）、β−アミノアルコール（Ｇｏｒｄｏｎ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，１９８５年，第１２６巻，ｐ．４１９）及び置換γ−ラクタム環（Ｇａｒｖｅｙ等，ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈｅｌｌ ｅｄ．，ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８年）を使用して生成することができる。
【００４８】
本発明では、Ｅｎｉｇｍａの発現を抑制するために、Ｅｎｉｇｍａ−ｓｉＲＮＡ発現ベクター（ｓｉＥｎｉｇｍａ）を製造する方法を提供する。
【００４９】
具体的に、韓国特許登録第８７７８２４号（米国特許出願１２／０９３０９３（２００８年５月８日）に提示された方法を基にしたＥｎｉｇｍａのｍＲＮＡに相補的な配列であり、好ましくは配列番号２あるいは３（５’−ＡＡＡＧＡＣＣＴＴＣＴＡＣＴＣＣＡＡＧＡＡ−３’あるいは５’−ＡＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＧＡＣＴＴＣＡ−３’）で表わされ、Ｈ１プロモーターによって発現されるようにｐＳｕｐｅｒプラスミドベクターにクローニングして組換えベクターを製作した。また、細胞内で伝達及び発現を所望する遺伝子を提供するアデノウイルス製作用ｐＳｈｕｔｔｌｅベクターに前記製作されたｐＳｕｐｅｒプラスミドベクターを制限酵素で処理してＨ１プロモーター、Ｅｎｉｇｍａ−ｓｉＲＮＡ、転写終了配列である五つのＴ塩基（Ｔ５）まで含むアデノウイルス製作用Ｅｎｉｇｍａ−ｓｉＲＮＡ発現ベクターを製作した。併せて、ＥｎｉｇｍａのｍＲＮＡがＣＭＶプロモーターによって発現されるように、ｐＣＭＶ−Ｔａｑ２ｂベクターにクローニングした後、細胞内に伝達が容易になるようにアデノウイルスＦ−Ｅｎｉｇｍａを製作した（図１ないし図３、及び米国特許出願１２／０９３０９３（２００８年５月８日）参照；韓国特許登録第８７７８２４号）。
【００５０】
また、本発明は、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を有効成分として含む抗癌用組成物または抗癌補助剤を提供する。
【００５１】
前記Ｅｎｉｇｍａの発現抑制剤は、Ｅｎｉｇｍａ遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド、短干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）及びＲＮＡｉからなる群から選択されるいずれか一つであることが好ましいが、これに限定されない。
【００５２】
前記Ｅｎｉｇｍａの活性抑制剤は、Ｅｎｉｇｍａタンパク質に相補的に結合する化合物、ペプチド、ペプチドミメティクス及び抗体からなる群から選択されたいずれか一つであることが好ましいが、これに限定されない。
【００５３】
前記癌は、胃癌、肝癌及び大腸癌からなる群から選択されたいずれか一つであることが好ましいが、これに限定されない。
【００５４】
本発明者等は、Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２が各種癌組織で過発現されることを確認し（図１３のａ及びｂ参照）、癌細胞でのＥｎｉｇｍａの過発現が抗癌剤耐性を誘導することを確認し、Ｅｎｉｇｍａの発現を抑制するｓｉＥｎｉｇｍａを処理する場合、癌細胞の効果的な死滅を誘導することを確認した（図１４のａないしｄ、図１６のａないしｇ、及び図１７参照）。したがって、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性阻害剤は、癌細胞の効果的な死滅を誘導するので抗癌治療剤の有効成分として有用に使用することができ、抗癌剤耐性を抑制することから抗癌補助剤の有効成分として有用に使用することができる。
【００５５】
本発明の抗癌用組成物または抗癌補助剤は、組成物総重量に対して前記有効成分を０．０００１〜５０重量％で含む。
【００５６】
本発明の抗癌用組成物または抗癌補助剤は、前記有効成分に追加で同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上含むことができる。
【００５７】
本発明の抗癌用組成物または抗癌補助剤は、前記記載した有効成分以外に追加で薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含んで製造することができる。薬剤学的に許容可能な担体は、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エチルアルコール、リポソーム及びこれら成分のうちの１成分以上を混合して使用することができ、必要によって抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び滑剤を付加的に添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができ、標的器官に特異的に作用するように標的器官特異的抗体またはその他リガンドを前記担体と結合させて使用することができる。さらに、当該技術分野の適正な方法で、またはレミングトンの文献（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（最近版）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）に開示されている方法を用いて、各疾患によってまたは成分によって好ましく製剤化することができる。
【００５８】
また、本発明は、薬学的に有効な量のＥｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を癌にかかった個体に投与する工程を含む癌治療方法を提供する。
【００５９】
前記Ｅｎｉｇｍａの発現抑制剤は、Ｅｎｉｇｍａ遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド、短干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）及びＲＮＡｉからなる群から選択されるいずれか一つであることが好ましいが、これに限定されない。
【００６０】
前記Ｅｎｉｇｍａの活性抑制剤は、Ｅｎｉｇｍａタンパク質に相補的に結合する化合物、ペプチド、ペプチドミメティクス及び抗体からなる群から選択されたいずれか一つであることが好ましいが、これに限定されない。
【００６１】
前記癌は、胃癌、肝癌及び大腸癌からなる群から選択されたいずれか一つであることが好ましいが、これに限定されない。
【００６２】
前記投与方法は、特別にこれに制限されるのではないが、目的とする方法によって非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）したり経口投与することができ、非経口投与が好ましく、静脈内注射による投与がさらに好ましいが、これに限定されない。
【００６３】
前記投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度などによってその範囲が多様である。一日投与量は、化合物の場合、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇで、好ましくは０．５〜１０ｍｇ／ｋｇであり、一日一回〜数回に分けて投与することがさらに好ましいが、これに限定されない。
【００６４】
本発明者等は、Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２が各種癌組織で過発現されることを確認し、癌細胞でのＥｎｉｇｍａの過発現が抗癌剤耐性を誘導することを確認し、Ｅｎｉｇｍａの発現を抑制するｓｉＥｎｉｇｍａを処理する場合、癌細胞の効果的な死滅を誘導することを確認することにより、前記Ｅｎｉｇｍａの発現または活性阻害剤が癌細胞の効果的な死滅を誘導するので、抗癌治療に使用できることが分かった。
【００６５】
また、本発明は、Ｅｎｉｇｍａに依存的なＭｄｍ２またはｐ５３の発現水準を用いた抗癌剤候補物質のスクリーニング方法を提供する。
【００６６】
本発明では、Ｅｎｉｇｍａの発現に依存的にＭｄｍ２が安定化されて発現が増加し、前記Ｍｄｍ２を媒介にｐ５３の発現が減少するので、前記ＥｎｉｇｍａまたはＭｄｍ２の発現を減少させたりｐ５３の発現水準を増加させたりする物質を選別することで、抗癌活性を有する物質をスクリーニングすることができる。
【００６７】
具体的に、前記スクリーニング方法は、
１）Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２を発現する細胞に候補物質を処理する工程と、
２）ＥｎｉｇｍａまたはＭｄｍ２の発現水準を測定する工程、及び
３）候補物質を処理しない対照群と比較してＥｎｉｇｍａまたはＭｄｍ２の発現水準を減少させた候補物質を選別する工程とで遂行することが好ましいが、これに限定されない。
【００６８】
また、前記スクリーニング方法は、
１）Ｅｎｉｇｍａ、Ｍｄｍ２及びｐ５３を発現する細胞に候補物質を処理する工程と、
２）ｐ５３の発現水準を測定する工程、及び
３）候補物質を処理しない対照群と比較してｐ５３の発現水準を増加させた候補物質を選別する工程とで遂行することが好ましいが、これに限定されない。
【００６９】
前記スクリーニング方法において、候補物質は、核酸、タンパク質、その他抽出物、化合物及び天然物からなる群から選択されるいずれか一つであることが好ましいが、これに限定されない。
【００７０】
前記スクリーニング方法において、発現水準は、遺伝子の転写活性水準を測定するかまたは発現されたタンパク質量を測定することにより求められるが、これに限定されない。
【００７１】
前記転写水準は、ルシフェラーゼ分析法を使用することが好ましく、タンパク質量はウエスタンブロット分析法を使用して測定することが好ましいが、これに限定されない。
【００７２】
また、本発明は、ＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２間の相互結合水準を用いた抗癌用組成物スクリーニング方法を提供する。
【００７３】
本発明者等は、ＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２が直接相互結合して、ｐ５３とはＭｄｍ２を通じて間接的に結合しているという事実を確認した（図５のａないしｃ参照）。また、ＥｎｉｇｍａのＬＩＭ３部位が、Ｍｄｍ２の４０１−４９１（ＲＩＮＧドメイン部位）に結合することを確認した（図５のｄないしｇ参照）。したがって、ＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２間の相互結合を阻害する物質は、Ｍｄｍ２の安定化を弱化させてｐ５３を活性化させ、抗癌活性を有する物質になり得ることが分かった。
【００７４】
前記スクリーニング方法は、
１）候補物質が存在するまたは存在しない条件下でＥｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２を接触させる工程と、
２）Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２の結合水準を測定する工程、及び
３）候補物質の不存在時と比較して、Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２の結合水準を減少させた候補物質を選別する工程とで遂行することが好ましいが、これに限定されない。
【００７５】
また、前記スクリーニング方法は、
１）Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２を発現する細胞と候補物質を接触させる工程と、
２）細胞内Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２の結合水準を測定する工程、及び
３）候補物質を処理していない対照群と比較して、細胞内Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２の結合水準を減少させた候補物質を選別する工程とで遂行することが好ましいが、これに限定されない。
【００７６】
前記スクリーニング方法において、候補物質は、核酸、タンパク質、その他抽出物、化合物及び天然物からなる群から選択されるいずれか一つであることが好ましいが、これに限定されない。
【００７７】
前記スクリーニング方法において、結合は、免疫沈降法によって測定することができる。免疫沈降は、例えば、文献に記載された方法によって遂行することができる（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，５１１−５２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８年）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、免疫沈降されたタンパク質の分析に一般的に使用され、結合されたタンパク質は適合した濃度のゲルを使用してタンパク質の分子量によって分析することができる。
【００７８】
前記スクリーニング方法において、細胞を用いるツーハイブリッドシステム（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）を使用することができる（“ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ”、“ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ”、“ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ”（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；“ＨｙｂｒｉＺＡＰ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ”（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；参考文献Ｄａｌｔｏｎ ａｎｄ Ｔｒｅｉｓｍａｎ，Ｃｅｌｌ，１９９２年，第６８巻，ｐ．５９７−６１２；Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ，１９９４年，第１０巻，ｐ．２８６−９２）。
【００７９】
前記スクリーニング方法において、表面プラズモン共鳴現象を用いたバイオセンサーは、本発明で結合された物質を探知または定量するための手段に使用することができる。前記バイオセンサーを使用する時、前記結合による相互作用は、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイム観察することができる。
【００８０】
また、本発明は、Ｅｎｉｇｍａと反応する抗体またはＥｎｉｇｍａ遺伝子に相補的な核酸のうちのいずれか一つ以上を使用して、癌細胞でのＥｎｉｇｍａ発現水準を測定する工程を含む、癌の診断、治療結果確認または予後を評価する方法を提供する。
【００８１】
また、本発明は、Ｅｎｉｇｍａと反応する抗体またはＥｎｉｇｍａ遺伝子に相補的な核酸のうちのいずれか一つ以上を含む癌診断用キットを提供する。
【００８２】
本発明者等は、癌細胞でＥｎｉｇｍａの過発現を確認した結果、ＳＲＦ、Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２がヒトの肝癌細胞と胃癌細胞で過発現されていることを確認し（図１３のａ及びｂ参照）、癌細胞でＥｎｉｇｍａの発現水準及びｐ５３依存的に癌細胞の成長及び抗癌剤耐性が誘導されることを確認した（図１４のａないしｄ、図１６のａないしｇ及び図１７参照）。したがって、Ｅｎｉｇｍａの発現水準を測定することで、抗癌治療時に薬物の癌細胞に対する死滅程度を確認することができ、抗癌治療の予後を評価する方法として使用できることが分かった。
【００８３】
本発明の癌診断方法において、正常以上に上昇したＥｎｉｇｍａの発現検出は、患者が癌にかかったことを意味する。また、癌で治療を受けたことがある、または治療を受けている個体の診断試料でのＥｎｉｇｍａの正常な発現検出は、癌治療が成功的であることを意味し、前記診断試料から正常以上に上昇したＥｎｉｇｍａの検出は、治療を継続しなければならないということを意味する。同時に、癌にかかった個体の診断試料でのＥｎｉｇｍａの正常な発現検出は、予後が良好であるということを意味し、前記診断試料から正常以上に上昇したＥｎｉｇｍａの検出は、予後が良くないということを意味する。
【００８４】
本発明の癌診断用キットは、Ｅｎｉｇｍａと反応する一つ以上の物質及び反応生成物検出用試薬とこれに対する指示事項（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を付加的に含むことができる。例えば、Ｅｎｉｇｍａと反応する一つ以上の物質は、ＥｎｉｇｍａのＲＮＡまたはＤＮＡに相補的なＲＮＡまたはＤＮＡ、及びＥｎｉｇｍａタンパク質に結合する抗体であり得、反応生成物検出用試薬は核酸またはタンパク質標識及び発色試薬であり得る。
【００８５】
また、本発明は、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を抗癌用組成物の製造に使用する用途を提供する。
【００８６】
また、本発明は、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を抗癌補助剤の製造に使用する用途を提供する。
【００８７】
同時に、本発明は、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を癌の診断、治療結果確認または予後評価用キットの製造に使用する用途を提供する。
【００８８】
前記Ｅｎｉｇｍａの発現抑制剤は、Ｅｎｉｇｍａ遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド、短干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）及びＲＮＡｉからなる群から選択されるいずれか一つであることが好ましいが、これに限定されない。
【００８９】
前記Ｅｎｉｇｍａの活性抑制剤は、Ｅｎｉｇｍａタンパク質に相補的に結合する化合物、ペプチド、ペプチドミメティクス及び抗体からなる群から選択されたいずれか一つであることが、好ましいがこれに限定されない。
【００９０】
前記癌は、胃癌、肝癌及び大腸癌からなる群から選択されたいずれか一つであることが好ましいが、これに限定されない。
【００９１】
本発明者等は、Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２が各種癌組織で過発現されることを確認し、癌細胞でのＥｎｉｇｍａの過発現が抗癌剤耐性を誘導することを確認し、Ｅｎｉｇｍａの発現を抑制するｓｉＥｎｉｇｍａを処理する場合、癌細胞の効果的な死滅を誘導することを確認することで、Ｅｎｉｇｍａの発現または活性阻害剤は癌細胞の効果的な死滅を誘導することから抗癌治療剤の有効成分として有用に使用することができ、抗癌剤耐性を抑制することから抗癌補助剤の有効成分として有用に使用できることが分かった。
【実施例】
【００９２】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。
【００９３】
但し、下記の実施例は、本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるのではない。
【００９４】
＜実施例１＞ＥｎｉｇｍａによるＭｄｍ２の安定化とそれによるｐ５３の分解
本発明者等は、韓国生命工学研究院から提供を受けたＥｎｉｇｍａ ｃＤＮＡ（配列番号：１）を含むベクターを鋳型にして、一般的なＰＣＲ方法で得られた切片をｐＣＭＶ ｔａｑ２Ｂ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，米国）にクローニングして、Ｅｎｉｇｍａを過発現するベクターを製作した。また、Ｅｎｉｇｍａの発現を特異的に阻害する５’−ＡＡＡＧＡＣＣＴＴＣＴＡＣＴＣＣＡＡＧＡＡ−３’（配列番号：２）のヌクレオチド切片をｐＳｕｐｅｒプラスミドベクターにＨｉｎｄ ＩＩＩ／Ｂｇｌ ＩＩ部位にクローニングを行った（図２）。また、細胞内への導入を容易にするためにｓｉＥｎｉｇｍａを含むアデノウイルス（図３）と、Ｆｌａｇ−Ｅｎｉｇｍａを含むアデノウイルス（図２）は、韓国特許登録第６２７３７７号（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２００６年，第４３巻，ｐ．１０４２−１０５２）及び第８７７８２４号（米国特許出願第１２／０９３０９３号（２００８年５月８日）；Ｎａｔ Ｍｅｄ，２００６年，第１２巻，ｐ．８０９−８１６）に提示された方法を基に下記のように製作した。
【００９５】
アデノウイルス製作用ｐＳｈｕｔｔｌｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，米国）ベクターに前記で製作されたｐＳｕｐｅｒ Ｅｎｉｇｍａ−ｓｉＲＮＡプラスミドをＸｂａ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩで処理して、Ｈ１プロモーターおよびＴ５転写終了配列を含むＤＮＡ切片をクローニングすることによって製作した（ｐＳｈｕｔｔｌｅ／Ｅｎｉｇｍａ−ｓｉＲＮＡ）。Ｆ−Ｅｎｉｇｍａを発現するアデノウイルス製作のために、前記で製作されたｐＣＭＶ ｔａｑ２Ｂ−ＥｎｉｇｍａからＥｎｉｇｍａ部位のみをＮｏｔＩ／ＸｈｏＩで切断して、これをｐＣＭＶ ｓｈｕｔｔｌｅベクターにクローニングすることで製作した。アデノウイルス遺伝子を含んでいるｐＡｄＥａｓｙ−１とｐＳｈｕｔｔｌｅ／Ｅｎｉｇｍａ−ｓｉＲＮＡ及びｐＣＭＶｓｈｕｔｔｌｅ−Ｆ−Ｅｎｉｇｍａ間の組換えは、大腸菌ＢＪ５１８３菌株に同時に形質導入することで遂行された。大腸菌で相同組換えによって得られた組換えアデノウイルス由来物質含有プラスミドは、カナマイシン選択培地で育った大腸菌コロニーからＤＮＡを分離して制限酵素分析を通じて確認した。
【００９６】
組換えアデノウイルス由来物質含有プラスミドでアデノウイルス粒子製作は、下記のように遂行した。組換えアデノウイルス由来物質含有プラスミドをＰａｃ Ｉで切断して、アデノウイルスの複製原点である末端反復配列（ＴＲ）等が、両側の端に存在するように線形化して、６０ｍｍ培養皿で７０〜８０％の密度に育ったＨＥＫ２９３細胞にカルシウムホスファート方法で導入した。組換えアデノウイルス由来物質含有プラスミドが導入されてアデノウイルス粒子が作られる細胞は、２〜３日後周囲の細胞より大きくなり、４〜５日後に全体細胞の約５０％が集まったり培地の上に浮き上がったりし、これを培地とともに集めてウイルス粒子が含まれる一次細胞抽出液を確保した。細胞収集液を凍結解凍（ｆｒｅｅｚｉｎｇ−ｔｈａｗｉｎｇ）方法を通じて細胞内のウイルス粒子まで培地に脱出するようにして、この上澄み液を再び１００ｍｍ培養皿に６０〜７０％程度に準備された細胞に再感染させてウイルスの存在有無及び再感染の可能性を確認した。アデノウイルス感染後増殖によって細胞が死ぬようになれば、また集めて多量の２９３細胞株（ＡＴＣＣ）に再感染させることで、アデノウイルス粒子を増幅してプラーク形成法を用いてウイルス数を決定した。
【００９７】
＜１−１＞ＥｎｉｇｍａによるＭｄｍ２安定化検証
Ｅｎｉｇｍａによる２６Ｓプロテオゾーム依存的タンパク質分解に及ぼす影響を次のような方法で確認した。Ｆｌａｇ−Ｅｎｉｇｍａ発現ベクターを濃度別（＋：２μｇ、＋＋：５μｇ）でＨＬＫ３細胞株（全北医大、韓国）に導入して、１２時間ＭＧ１３２（１０μＭ）を処理したまたは処理していない細胞を集めてウエスタンブロット方法でタンパク質の発現様相を確認した。その結果、Ｍｄｍ２の発現程度は、Ｅｎｉｇｍａの発現に依存的に高く、一方、ｐ５３及びその下位分子ｐ２１は減少した（図４のａ）。
【００９８】
＜１−２＞Ｅｎｉｇｍａによって調節されるｐ５３の活性検証
Ｅｎｉｇｍａによるｐ５３の減少がｐ５３活性の減少と関連するかどうかを確認するために、ｐ５３によって調節される標的遺伝子のプロモーターの活性変化を調査した。ｐ５３ＲＥ−Ｌｕｃ、Ｂａｘ−Ｌｕｃ、ｐ２１−Ｌｕｃのレポーター遺伝子（０．５μｇ）をそれぞれＦｌａｇ−Ｅｎｉｇｍａ（＋：２μｇ、＋＋：５μｇ）と濃度別にＨＬＫ３細胞株あるいはｐ５３＋／＋またはｐ５３−／−の大腸癌細胞株（ＨＣＴ１１６、ＡＴＣＣ）に導入して、１２時間ＭＧ１３２（１０μＭ）を処理するかまたは処理せずに、細胞を集めてレポーター分析（Ｐｒｏｍｅｇａ，米国）を実施した。その結果、ｐ５３によって調節される下位分子の転写活性は、Ｅｎｉｇｍａの発現に濃度依存的に阻害されることが示された（図４のｂ）。
【００９９】
＜１−３＞Ｅｎｉｇｍａによる関連分子のｍＲＮＡの変化検証
ＥｎｉｇｍａによるＭｄｍ２及びｐ５３の発現変化が、ｍＲＮＡ水準で発生したのかどうか検証するためにノーザンブロットを実施した。Ｆｌａｇ−Ｅｎｉｇｍａ発現ベクターを濃度別（＋：２μｇ、＋＋：５μｇ）でＨＬＫ３細胞株に導入して、４８時間後、総ＲＮＡを分離（ＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ）して、それぞれのプローブ（Ｐ１／Ｐ２Ｍｄｍ２，ｐ５３，ｐ２１）でノーザンブロット方法を実施した。その結果、Ｅｎｉｇｍａの発現量と関係なくＰ１−Ｍｄｍ２、ｐ５３、ｐ２１のｍＲＮＡ量は一定であり、ｐ５３によって調節されるＰ２−Ｍｄｍ２のｍＲＮＡの量は、Ｅｎｉｇｍａの発現に依存的に減少した（図４のｃ）。この結果は、ＥｎｉｇｍａがＭｄｍ２−ｐ５３を転写後の工程で調節するということを提示している。
【０１００】
＜１−４＞ＥｎｉｇｍａによるＭｄｍ２依存的ｐ５３抑制
Ｅｎｉｇｍａによるｐ５３及びｐ２１の発現抑制が、Ｍｄｍ２依存的なのかどうかを確認するために、Ｍｄｍ２−／−ｐ５３−／−ＭＥＦ及びＭｄｍ２＋／＋ｐ５３−／−ＭＥＦ細胞株（Ｇ．Ｌｏｚａｎｏ，Ｍ．Ｄ．ＡＮＤＥＲＳＯＮ ＣＡＮＣＥＲ ＣＥＮＴＥＲ）を用いた。前記それぞれの細胞株に、ｐ５３を発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ−ｐ５３）を導入した１６時間後、Ａｄ−Ｆ−Ｅｎｉｍｇａ（５０ＭＯＩ）、Ａｄ−Ｌａｃｚ（５０ＭＯＩ）、Ａｄ−ｓｉＥｎｉｇｍａ（１００ＭＯＩ）、Ａｄ−ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ（１００ＭＯＩ）を再び導入して３２時間後に細胞を集めてウエスタンブロット方法でそれぞれのタンパク質の発現変化を確認した。その結果、Ｍｄｍ２の発現に依存的にｐ５３及びｐ２１の発現が減少した（図４のｄ）。
【０１０１】
＜１−５＞Ｅｎｉｇｍａによるｐ５３下位分子の抑制
Ｅｎｉｇｍａによるｐ２１の発現抑制が、ｐ５３を経由したものかどうかをｐ５３＋／＋、ｐ５３−／−細胞株を使用して確認した。ｐ５３＋／＋またはｐ５３−／−細胞株に、Ｆｌａｇ−Ｅｎｉｇｍａ、ｓｉＥｎｉｇｍａを導入して４８時間後に細胞を集めてウエスタンブロット方法で確認した。その結果、ｐ２１の変化は、ｐ５３の変化に起因したものであることが示され、Ｅｎｉｇｍａによる直接的な影響はないことが示された（図４のｅ）。
【０１０２】
＜実施例２＞ＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２間の相互作用検証
本発明者等は、ＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２間の相互作用を検証するために、Ｅｎｉｇｍａの突然変異体（Ｆ−ＰＤＺ、Ｆ−ＰＤＺ−ＬＩＭ１、Ｆ−ＥｎｉΔＬＩＭ３、Ｆ−ＬＩＭ）をｐＣＭＶ ｔａｑ２Ｂに一般的なＰＣＲクローニング法で製作し、Ｍｄｍ２の突然変異体（ＧＳＴ−１−１００、ＧＳＴ−１０１−４９１、ＧＳＴ−２０１−４９１、ＧＳＴ−３０１−４９１）をｐＥＢＧにＰＣＲクローニング法で製作した。インビトロで相互結合を確認するために、Ｈｉｓ−Ｍｄｍ２、Ｅｎｉｇｍａ、ＧＳＴ−ｐ５３、ＥｎｉΔＬＩＭ３タンパク質を大腸菌でそれぞれ分離精製した。
【０１０３】
＜２−１＞培養細胞でのＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２間の結合における、ｐ５３の役割検証
ｐ５３＋／＋またはｐ５３−／−の大腸癌細胞株（ＨＣＴ１１６）とＭｄｍ２−／−ｐ５３−／−ＭＥＦ及びＭｄｍ２＋／＋ｐ５３−／−ＭＥＦ細胞株（Ｇ．Ｌｏｚａｎｏ，Ｍ．Ｄ．ＡＮＤＥＲＳＯＮ ＣＡＮＣＥＲ ＣＥＮＴＥＲ）で、ＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２−ｐ５３間の相互結合をＩＰ法で確認した。その結果、ＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２間の相互作用は、ｐ５３と関係なく存在し、Ｍｄｍ２とｐ５３が一緒に存在する場合は、Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２−ｐ５３の結合体を形成することが示された（図５のａ及びｂ）。
【０１０４】
＜２−２＞インビトロでのＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２の相互作用検証
大腸菌で分離精製したそれぞれのタンパク質（１μｇ Ｈｉｓ−Ｍｄｍ２、０．５μｇ Ｅｎｉｇｍａ、１μｇ ＧＳＴ−ｐ５３）間の相互作用をインビトロで直接確認するためにインビトロ結合分析（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）を実施した。それぞれのタンパク質を混ぜて結合を誘導した後、ＧＳＴ ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ及びＩＰ方法でタンパク質間の結合有無を確認した。その結果、Ｅｎｉｇｍａは、Ｍｄｍ２と直接結合したが、ｐ５３とはＭｄｍ２を媒介して結合した（図５のｃ）。
【０１０５】
＜２−３＞ＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２間の結合部位決定
ＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２の製作されたそれぞれの突然変異体を使用して、二分子間の結合部位を決定した。まず、それぞれのＭｄｍ２突然変異体（５μｇ）をＦｌａｇ−Ｅｎｉｇｍａが常に発現されるように考案された２９３細胞株に導入して、以後、ＧＳＴ ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎしてＦｌａｇ抗体にウエスタンブロットして結合有無を確認した（図５のｄ）。同時に、それぞれのＥｎｉｇｍａ突然変異体（５μｇ）とＧＳＴ−Ｍｄｍ２発現ベクター（５μｇ）を２９３Ｔ細胞株（ＡＴＣＣ）にカルシウムホスファート方法で導入させて、２４時間後に細胞を集めてＦｌａｇ抗体でＩＰを遂行して、ＧＳＴ抗体でウエスタンブロットして結合有無を確認した（図５のｅ）。ＥｎｉｇｍａＬＩＭ３が除去された、細菌で発現させたＥｎｉΔＬＩＭ３とＭｄｍ２は、互いに結合しなかったし（図５のｃ）、Ｍｄｍ２の３０１−４９１部位とＥｎｉｇｍａのＬＩＭ３部位が結合部位であることが示された。ＬＩＭ３部位のみを含んだＧＳＴ−ＬＩＭ３突然変異体とＭｄｍ２間の結合を細胞株導入後、ＧＳＴ ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎとＭｄｍ２抗体でウエスタンブロットで確認して、ＥｎｉｇｍａのＬＩＭ３部位がＭｄｍ２の４０１−４９１に結合するということを確認することができた（図５のｆ）。したがって、知られたＭｄｍ２−ｐ５３間の相互結合に基づいて、Ｅｎｉｇｍａの“Ｃ”末端とＭｄｍ２の“Ｃ”末端が直接結合し、かつＭｄｍ２の“Ｎ”末端とｐ５３の“Ｎ”末端が結合している結合構造が分かった（図５のｇ）。
【０１０６】
＜２−４＞Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２結合の特異性検証
Ｅｎｉｇｍａと類似の分子構造を有したＥＮＨ（Ｅｎｉｇｍａ ｈｏｍｏｌｏｇ）を対象に、Ｍｄｍ２と結合有無を確認した。Ｆｌａｇ−ＥＮＨ、Ｆｌａｇ−Ｅｎｉｇｍａ及びＧＳＴ−Ｍｄｍ２発現ベクターを２９３Ｔ細胞株にカルシウムホスファート方法で導入して、４８時間後に細胞を集めてＧＳＴ ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎと、Ｆｌａｇ抗体でウエスタンブロットを遂行した。その結果、Ｍｄｍ２とＥＮＨ間の結合は、存在しなかった（図６のａ）。同時に、Ｆ−ＥＮＨ発現ベクターをＨＬＫ３細胞株に濃度別（２、５μｇ）で導入した後、Ｍｄｍ２及びｐ５３の発現変化を確認した。その結果、ＥＮＨは、Ｍｄｍ２とｐ５３の発現量に影響を与えなかった（図６のｂ）。したがって、ＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２間の結合及びこれによるＭｄｍ２の発現増加が、特異的相互作用であることが分かった。
【０１０７】
＜実施例３＞ＥｎｉｇｍａがＭｄｍ２の自己ユビキチン化（ｓｅｌｆ−ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ）とｐ５３のユビキチン化に及ぼす影響検証
本発明者等は、ＥｎｉｇｍａがＭｄｍ２と直接結合してＭｄｍ２を安定化させて、Ｍｄｍ２によるｐ５３の分解を促進させる機序を解明するために、Ｍｄｍ２の自己ユビキチン化とｐ５３ユビキチン化にＥｎｉｇｍａが及ぼす影響を細胞内及びインビトロで検証した。
【０１０８】
＜３−１＞細胞内でＭｄｍ２とｐ５３のユビキチン化にＥｎｉｇｍａが及ぼす影響
ＨＬＫ３細胞株に、Ｆｌａｇ−Ｅｎｉｇｍａ（５、１０μｇ）、ｓｉＥｎｉｇｍａ（１０、１５μｇ）を濃度別で導入し、集める１２時間前にＭＧ１３２を処理した。また、異なる２９３Ｔ細胞株には、Ｈｉｓ−Ｕｂ（５μｇ）とＦ−Ｅｎｉｇｍａ（５、１０μｇ）を導入して集める１２時間前にＭＧ１３２を処理した。準備した細胞破砕溶液で細胞タンパク質抽出液を作ってそれぞれの抗体としてＩＰを実施して、Ｕｂが結合したＭｄｍ２とｐ５３の増減をＵｂ抗体とＨｉｓ抗体としてウエスタンブロットして確認した。その結果、細胞内でＥｎｉｇｍａが過発現されるほどＭｄｍ２のユビキチン化は減少し、ｐ５３のユビキチン化は増加し、Ｅｎｉｇｍａの発現が抑制されるほどＭｄｍ２のユビキチン化は増加し、ｐ５３のユビキチン化は減少した（図７のａ及びｂ）。
【０１０９】
＜３−２＞ＥｎｉｇｍａによるＭｄｍ２の自己ユビキチン化阻害とｐ５３のユビキチン化検証
Ｅｎｉｇｍａの結合によるＭｄｍ２の自己ユビキチン化の変化を検証するために、インビトロユビキチン化分析を実施した。Ｈｉｓ−Ｍｄｍ２タンパク質（０．５μｇ）、Ｈｉｓ−Ｍｄｍ２（Ｃ４６４Ａ）（０．５μｇ）、Ｅｎｉｇｍａタンパク質（０．５、１μｇ）、Ｆ−ＥｎｉΔＬＩＭ３（１μｇ）に、ユビキチン反応混合物（Ｅ１、Ｅ２、Ｈｉｓ−Ｕｂ、ＡＴＰ含む）を入れて反応させた後、ＩＰ／ＩＢ方法を用いてＭｄｍ２の自己ユビキチン化変化と結合タンパク質の有無を確認した。その結果、Ｍｄｍ２と結合するＦ−ＥｎｉｇｍａによってＭｄｍ２の自己ユビキチン化が抑制され、Ｅｎｉｇｍａは、Ｍｄｍ２ＲＩＮＧフィンガー領域の４６４−システインがアラニンに置換されたＭｄｍ２（Ｃ４６４Ａ）変異体には影響を与えなかった（図７のｃ）。併せて、Ｆ−ＥｎｉｇｍａによるＭｄｍ２依存的ｐ５３のユビキチン化は、増加した（図７のｄ）。したがって、ＥｎｉｇｍａがＭｄｍ２のユビキチン化の方向を決定する因子であることが分かった。
【０１１０】
＜３−３＞ＰＣＡＦによるＭｄｍ２ユビキチン化に及ぼすＥｎｉｇｍａ阻害効果調査
ＰＣＡＦ（ｐ３００−ＣＢＰ関連因子）は、Ｍｄｍ２のユビキチン化を誘導する（Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２００７年，第９巻，ｐ．３３１−３３８）。細菌から分離精製した図８に提示したタンパク質を用いて、インビトロユビキチン実験を行なった時、ＥｎｉｇｍａはＰＣＡＦによるＭｄｍ２ユビキチン化に影響を与えなかった（図８のａ）。この現象は、Ｍｄｍ２−／−ｐ５３−／−ＭＥＦ細胞株でも検証された（図８のｂ）。この結果は、ＥｎｉｇｍａがＭｄｍ２自己ユビキチン化を特異的に阻害してｐ５３ユビキチン化を促進することを提示する。
【０１１１】
＜実施例４＞Ｅｎｉｇｍａプロモーターの活性化検証
ｐ５３は、細胞増殖抑制機能があって、Ｅｎｉｇｍａが細胞内でＭｄｍ２の安定化を誘導してｐ５３減少を起こすので、細胞増殖が起きる条件でＥｎｉｇｍａプロモーターが活性化するのか、活性化するのならどのような機序になるかを調査した。
【０１１２】
＜４−１＞血清によるＥｎｉｇｍａプロモーターの調節検証
Ｅｎｉｇｍａのプロモーターに血清応答因子（ＳＲＦ）が結合する血清応答部位（ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ；ＳＲＥ）が存在することを発見して、プロモーター配列中、ＳＲＥを含むまたは含まない断片をルシフェラーゼを有しているｐＧＬ２／３ベクターに挿入してＥｎｉｇｍａ−Ｌｕｃ（ｐＧＬ２）、ＳＲＥ−Ｌｕｃ、ΔＳＲＥ−Ｌｕｃ（ｐＧＬ３）レポーターベクターをそれぞれ製作した（図９のａ）。前記、Ｅｎｉｇｍａ−ＬｕｃをＨＬＫ３細胞株に導入（０．５μｇ）し、０．１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭにて２４時間培養した後、５％及び２０％ＦＢＳを添加して再び６時間培養した後、細胞を集めてルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、血清の濃度に依存的にＥｎｉｇｍａ−Ｌｕｃの活性度が増加した（図９のｂ）。
【０１１３】
＜４−２＞細胞成長因子−ＳＲＥ依存的Ｅｎｉｇｍａプロモーターの活性化検証
Ｅｎｉｇｍａ発現のＳＲＦ依存性を検証するために製作したＳＲＥ−Ｌｕｃ（０．５μｇ）、ΔＳＲＥ−Ｌｕｃ（０．５μｇ）をＨＬＫ３細胞株に導入して、０．１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭにて２４時間培養後、５％及び２０％ＦＢＳ、ＦＧＦ（２０、４０ｎｇ／ｍｌ）、またはＨＧＦ（２０、４０ｎｇ／ｍｌ）を添加して再び６時間培養した後、細胞を集めてルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、ＳＲＥが存在するレポーターでのみ処理した成長因子の濃度に依存的に活性度が増加した（図９のｃ及びｄ）。
【０１１４】
＜４−３＞ＥｎｉｇｍａプロモーターとＳＲＦの結合特異性検証
ＥｎｉｇｍａプロモーターのＳＲＥ部位［５’−ＣＴＡＴＡＴＡＡＧＧ−３’（配列番号：４）］に、ＳＲＦが特異的に結合するのかどうかを検証するために、ＥＭＳＡと細胞内ＣｈＩＰ分析を実施した。ＥＭＳＡ分析を行なうために、血清を処理したまたは処理していないＨＬＫ３の核タンパク質分画を製造した後、放射線（３２Ｐ−ＡＴＰ）で標識されたＳＲＥ（５’−ＣＴＡＴＡＴＡＡＧＧ Ｘ３）ヌクレオチドと反応させた後、抗−ＳＲＦ抗体と再び反応させて６％のアクリルアミドゲルでその結合有無を確認した。その結果、ＥｎｉｇｍａのＳＲＥ部位にＳＲＦが特異的に結合することが示された（図９のｅ）。
【０１１５】
また、培養細胞内でＥｎｉｇｍａプロモーターにＳＲＦが結合するかどうかを確認するために実施したＣｈＩＰ分析のために、血清を処理したまたは処理していないＨＬＫ３を１％ホルマリンで固定させた後、細胞を集めて超音波で破砕した。ＳＲＦ−ＤＮＡの結合体を抗−ＳＲＦ抗体としてＩＰして得た後、結合しているＤＮＡがＥｎｉｇｍａプロモーターのＳＲＥ部位なのかどうかを特異的なプライマーでＰＣＲして確認した。その結果、培養細胞でもＥｎｉｇｍａプロモーターのＳＲＥ部位にＳＲＦが結合していることが示された（図９のｆ）。以上の結果は、細胞増殖条件でＥｎｉｇｍａプロモーターは、ＳＲＦによって活性化になりその発現が増加するということを提示する。
【０１１６】
＜実施例５＞血清とＨＧＦによるＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２−ｐ５３経路調節
細胞増殖あるいは生存を促進させる条件で、Ｍｄｍ２の増加が報告されたことがある（Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ，２００５年，第２３巻，ｐ．１８３−１９２）。前記現象が、Ｅｎｉｇｍａによって起因することかどうかを調べるため、ＳＲＦによるＥｎｉｇｍａの活性化がＭｄｍ２を安定化させて、ｐ５３を抑制するかどうかを細胞及びマウスの肝（ｌｉｖｅｒ）で検証した。
【０１１７】
＜５−１＞血清によるＳＲＦ、Ｅｎｉｇｍａ、Ｍｄｍ２、ｐ５３の調節検証
ｐ５３＋／＋またはｐ５３−／−の大腸癌細胞株を血清を除去した条件で培養した後、１０％の血清を含んだ培地で時間別に再び培養して各タンパク質の変化をウエスタンブロットで、転写水準（ｍＲＮＡ）の変化は各条件で分離した総ＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲで確認した。その結果、血清の刺激によって、ＳＲＦが転写段階から増加してタンパク質量も増加し、ＳＲＦによって転写活性化したＥｎｉｇｍａのタンパク質量も増加することが示された。Ｅｎｉｇｍａの増加は転写体の変化なしにＭｄｍ２タンパク質の安定化を誘導し、ｐ５３タンパク質の分解として示された。ＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２一連の増加は、ｐ５３に非依存的だった（図１０のａ及びｂ）。
【０１１８】
ｐ５３＋／＋またはｐ５３−／−の大腸癌細胞株を１０％の血清を含んだ培地で培養した後、血清を除去した条件で各時間別に培養時の各分子の変化をウエスタンブロットとＲＴ−ＰＣＲ方法で確認した。その結果、成長が制限される条件で、ＳＲＦ、Ｅｎｉｇｍａの転写水準、タンパク質水準はすべて抑制され、Ｍｄｍ２のタンパク質水準は減少し、ｐ５３のタンパク質水準は増加した（図１１のａ及びｂ）。
【０１１９】
＜５−２＞ＨＧＦによるＳＲＦ、Ｅｎｉｇｍａ、Ｍｄｍ２、ｐ５３の調節検証
ＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２経路が、ＨＧＦによっても調節されるかどうかを調査した。ＳＲＦ、Ｅｎｉｇｍａの特異的関連性を示すために、ｓｉＥｎｉｇｍａ、ｓｉＳＲＦ各１０μｇをＨＬＫ３細胞株に導入して、血清を制限条件で培養した後、細胞を集める４時間前にＨＧＦ（４０、６０ｎｇ／ｍｌ）をそれぞれ処理した後、それぞれのタンパク質の変化をウエスタンブロットで確認した。その結果、ＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２の増加とｐ５３の減少を確認することができた（図１０のｃ）。また、Ｆ−ＳＲＦをＨＬＫ３細胞株に濃度別（５、１０μｇ）で直接導入して、ＥｎｉｇｍａとＭｄｍ２の変化を観察した。その結果、Ｅｎｉｇｍａの発現は、ＳＲＦによって直接的に影響を受けることが示された（図１０のｄ）。
【０１２０】
＜５−３＞ＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２経路にＭＡＰキナーゼ関連性検証
細胞成長因子によるＳＲＦの活性化に、ＭＡＰキナーゼが係わっていることが知られているので（Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００２年，第５３巻，ｐ．１４７−１５７）、ＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２の経路の調節にもＭＡＰキナーゼが係わっていると仮定して、ＭＡＰキナーゼ特異的阻害剤であるＰＤ９８０５９を用いて検証した。Ｍｄｍ２＋／＋ｐ５３−／−ＭＥＦ細胞株にＡｄ−ｐ５３またはＡｄ−ＬａｃＺを導入した後、ＨＧＦを処理時にＰＤ９８０５９を一緒に処理した。その結果、ＰＤ９８０５９は、ＨＧＦによるＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２経路の活性化を抑制した（図１０のｅ）。
【０１２１】
正常細胞でＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２経路の存在有無を確認するために、ＭＲＣ５（ヒト正常繊維芽細胞）、ＭＥＦ（マウス胎児繊維芽細胞）を使用して血清による反応を確認した。ＭＲＣ５の場合には、ｓｉＳＲＦ（１０、１５μｇ）を導入したり、ＰＤ９８０５９が存在したりする場合、血清によるＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２経路の活性化が抑制され、ＭＥＦの場合も、ＰＤ９８０５９によってＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２経路の活性化が抑制された（図１２のａ及びｃ）。したがって、ＳＲＦ、Ｅｎｉｇｍａは、転写活性によるタンパク質量の増加があったが、Ｍｄｍ２（ｐ１−Ｍｄｍ２）及びｐ５３の場合は、転写体水準の変化はなかった。但し、ｐ２−Ｍｄｍ２の転写水準は、ｐ５３の発現量に依存的に変化した（図１２のｂ及びｄ）。この結果は、細胞が増殖する場合に、ＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａの転写体が順に先に作られてＥｎｉｇｍａタンパク質がＭｄｍ２を安定化させてｐ５３を減少させる経路があることを提示する。
【０１２２】
＜５−４＞ＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２−ｐ５３経路のインビボ検証
Ａｄ−ｐ５３あるいはＡｄ−ＬａｃＺウイルス（５×１０８ｐｆｕ）それぞれをマウス（Ｂａｌｂ／ｃ、Ｆｅｍａｌｅ、Ｔａｃｏｎｉｃ）の尾静脈に注射して２４時間経過後、ＨＧＦ（１００μｇ／ｋｇ）をマウスの尾静脈に再び注射して時間別に肝を摘出して、ＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２−ｐ５３の変化をウエスタンブロットで確認した。その結果、ＨＧＦは、肝細胞のＳＲＦを転写活性化させてタンパク質発現を誘導し、ＳＲＦによってＥｎｉｇｍａは、転写体水準で誘導されてタンパク質量が増えた。Ｅｎｉｇｍａの増加によってＭｄｍ２のタンパク質量が増加し、同時にｐ５３はタンパク質量を減少させた（図１０のｆ及びｇ）。
【０１２３】
Ｅｎｉｇｍａの直接的な発現量変化によるＭｄｍ２−ｐ５３の変化を観察するために、まず、マウスの尾静脈にＡｄ−ｐ５３を注射または注射せずに、２４時間経過後にマウスの尾静脈にＡｄ−Ｆ−Ｅｎｉｇｍａ、Ａｄ−ＬａｃＺ、ＰＢＳを注射して４８時間後に肝を摘出してウエスタンブロットしてそれぞれのタンパク質量を確認した。また、Ａｄ−ｓｉＥｎｉｇｍａ、Ａｄ−ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ及びＰＢＳを尾静脈に注射した後、肝摘出８時間前にＨＧＦを尾静脈に注射した。その結果、Ｅｎｉｇｍａの発現が高ければＭｄｍ２も安定化してｐ５３が減少し、Ｅｎｉｇｍａの発現が抑制されると、ＨＧＦによるＭｄｍ２の安定化が阻害されてｐ５３が増加した（図１０のｈ）。この結果は、生体内でもＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２−ｐ５３経路が存在することを暗示している。
【０１２４】
＜実施例６＞ヒトの癌患者組織でのＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２−ｐ５３経路の調査
本発明者等は、ヒトの癌組織（胃癌：忠南医大、韓国；肝癌：全北医大及び啓明医大、韓国）でもＳＲＦによるＥｎｉｇｍａの誘導がＭｄｍ２の安定化をもたらしてｐ５３の減少を誘導することができるのかどうかを調べるため、肝癌、胃癌組織と該当する正常組織を組織溶解緩衝液（Ｉｎｔｒｏｎ、韓国）で破砕してウエスタンブロットで調査した。その結果、１２例の肝癌及び胃癌組織で、ＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２の発現が高かったが、ｐ５３発現が検出されなかった（図１３のａ、「＊」参照）。また、ヒトの各種癌組織が植えられている組織アレイ（ｗｗｗ．ｔｉｓｓｕｅａｒｒａｙ．ｃｏｍ）で、Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２の発現を蛍光抗体法を用いて観察した。その結果、胃癌及び大腸癌組織の細胞質の頂端部位（ａｐｉｃａｌ ｒｅｇｉｏｎ）でＥｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２が一緒に過発現して示された（図１３のｂ）。この結果は、速く増殖している癌細胞でＳＲＦ−Ｅｎｉｇａｍ−Ｍｄｍ２が活性化していて、ｐ５３が弱化していることを暗示している。
【０１２５】
＜実施例７＞Ｅｎｉｇｍａによる細胞生存効果及び抗癌剤耐性誘導検証
本発明者等は、Ｅｎｉｇｍａが細胞の自殺を誘導するｐ５３を減少させて細胞の生存能を増加させ、抗癌剤耐性を誘発するかどうかを調査した。
【０１２６】
＜７−１＞Ｅｎｉｇｍａの発現抑制によるｐ５３依存的細胞自殺誘導
ｐ５３＋／＋またはｐ５３−／−のＨＣＴ１１６大腸癌細胞株に、Ｆｌａｇ−Ｅｎｉｇｍａ（５μｇ）またはｓｉＥｎｉｇｍａ（１０μｇ）を導入して、アドリアマイシン（ＡＤＲ ２０μｇ／ｍｌ）を処理して細胞生存に及ぼすＥｎｉｇｍａ効果が、ｐ５３依存的なのかどうかを細胞計数法とクリスタルバイオレット染色法で確認した。その結果、野生型のｐ５３を有した細胞でのみＥｎｉｇｍａの発現が高い場合に、アドリアマイシンに対する細胞生存能が増加し、Ｅｎｉｇｍａの発現が抑制される場合に、細胞生存能が減少した（図１４のａ及びｂ）。また、ｐ５３が発現されないＨ１２９９、Ｈ３５８、ＰＣ３、及びＨｅｐ３Ｂ細胞株では、Ｅｎｉｇｍａの発現を減少させた時に、ｐ５３＋／＋ＨＣＴ１１６大腸癌細胞株と比較して、細胞生存能に影響が大きくなかった（図１５）。Ｅｎｉｇｍａによる細胞の生存に及ぼす効果が、細胞自殺調節効果なのかどうかをＴＵＮＥＬ検証法及び細胞周期を分析して検証した。その結果、野生型ｐ５３を有した細胞株で、Ｅｎｉｇｍａの発現抑制による細胞自殺が効果的に示された（図１４のｄ）。したがって、アドリアマイシン処理時にＥｎｉｇｍａによる細胞生存能の増加効果は、ｐ５３を媒介にして細胞自殺誘導を抑制することによるものであることが分かった。
【０１２７】
同時に、アドリアマイシン（ＡＤＲ）（Ｓｉｇｍａ，米国）処理時に、Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２−ｐ５３経路の変化を確認するために、前記と同一条件でＡＤＲ（２μｇ／ｍｌ）を処理してウエスタンブロットを実施した。その結果、ｐ５３の存在と無関係にＡＤＲによるＭｄｍ２の減少は、Ｅｎｉｇｍａの過発現によって阻害され、Ｅｎｉｇｍａ発現依存的にＭｄｍ２−ｐ５３の発現も増加または減少した（図１４のｃ）。したがって、Ｅｎｉｇｍａは、Ｍｄｍ２を経由してｐ５３を減少させて癌細胞がアドリアマイシンに対する細胞生存能を増加させることが分かった。
【０１２８】
＜実施例８＞マウス異種移植（Ｍｏｕｓｅ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）モデルでのＥｎｉｇｍａによる癌細胞のＡＤＲ抵抗性誘導検証
本発明者等は、Ｅｎｉｇｍａの発現に依存的にｐ５３による細胞自殺が調節されることを確認して、実際に肝癌細胞株ＨＬＫ３で作ったマウス腫瘍モデルで、ＥｎｉｇｍａによるＡＤＲ抵抗性が誘導されるのかどうかを調査した。
【０１２９】
＜８−１＞ＥｎｉｇｍａがＨＬＫ３肝癌細胞株の生存能に及ぼす効果
Ｆ−Ｅｎｉｇｍａ（５μｇ）またはｓｉＥｎｉｇｍａ（１０μｇ）をＨＬＫ細胞株に導入して、アドリアマイシン（ＡＤＲ ２０μｇ／ｍｌ）を処理するかまたは処理せずに、細胞計数法で細胞の生存を調査した。その結果、Ｅｎｉｇｍａの発現が高い場合には、抗癌剤による細胞自殺が抑制され、Ｅｎｉｇｍａの発現が抑制される場合には、ＡＤＲがない場合にも細胞自殺が効果的に誘導された（図１６のａ及び図１７）。ＡＤＲ処理時に、Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２−ｐ５３経路の変化を確認するために、上記と同一条件でＡＤＲ（２μｇ／ｍｌ）を処理してウエスタンブロットを実施した。その結果、Ｅｎｉｇｍａの発現に依存的にＭｄｍ２−ｐ５３の発現が変化した（図１６のｂ）。
【０１３０】
＜８−２＞ＥｎｉｇｍａによるエトポシドとＮｕｔｌｉｎ３ａに対する抵抗性増加検証
エトポシド（ＥＴＣ）とｎｕｔｌｉｎ３ａ（Ｓｉｇｍａ，米国）は、機序は異なるがｐ５３を活性化させて癌細胞の自殺を誘導する抗癌剤であり（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４年，第３０３巻，ｐ．８４４−８４８４）、これらに対してもＥｎｉｇｍａが癌細胞に対して抵抗性を示すようにできるのかどうかを検証した。Ｆ−Ｅｎｉｇｍａ（５μｇ）が導入されたＨＬＫ３細胞に、ＥＴＣとｎｕｔｌｉｎ３ａをそれぞれ処理して細胞計数法で生存した細胞数を確認した。その結果、Ｅｎｉｇｍａが過発現されるとＥＴＣとｎｕｔｌｉｎ３ａに対しても抵抗性が誘導されることを確認した（図１６のｃ）。また、Ｆ−Ｅｎｉｇｍａの発現時に、ＥＴＣとｎｕｔｌｉｎ３ａ処理によるＭｄｍ２−ｐ５３の発現様相をウエスタンブロットで確認した。その結果、Ｆ−Ｅｎｉｇｍａの過発現によるＭｄｍ２の増加とｐ５３の減少を確認することができた（図１６のｄ）。
【０１３１】
＜８−３＞マウス移植腫瘍モデルでのＥｎｉｇｍａによるＡＤＲ抵抗性検証
ＥｎｉｇｍａによるＡＤＲ抵抗性誘導が、生体内でも起きるのかどうかを検証するために、ヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ，Ｆｅｍａｌｅ，ＳＬＣ，日本）に腫瘍モデルを製作して用いた。そのために、Ａｄ−Ｆ−Ｅｎｉｇｍａ（１００ ＭＯＩ）、Ａｄ−ＬａｃＺ（１００ ＭＯＩ）、Ａｄ−ｓｉＥｎｉｇｍａ（２００ ＭＯＩ）、Ａｄ−ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ（２００ ＭＯＩ）を、まず、ＨＬＫ細胞に感染させた後、前記マウス（ｎ＝５／実験群）の皮下に注射した。１４日後、ＡＤＲ（４ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈内に注射して、以後２８日間腫瘍塊の大きさを観察した。その結果、Ｆ−Ｅｎｉｇｍａが発現される癌細胞は、ＡＤＲを処理しない対照群と類似に増殖しながらＡＤＲに抵抗性を示し、Ｅｎｉｇｍａ発現が抑制される群は、癌細胞の増殖が最も多く抑制された（図１６のｅ及びｆ）。腫瘍塊を成す細胞中のＭｄｍ２−ｐ５３の発現変化を確認するために、上記の条件で前記マウスに腫瘍塊を作って、ＡＤＲで処理して３日後に腫瘍塊をマウスから分離して細胞破砕液を得た後、ウエスタンブロットで各タンパク質の発現様相を確認した。その結果、抗癌剤耐性がある場合、Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２が多く、ｐ５３が減少していた（図１６のｇ）。
【産業上の利用可能性】
【０１３２】
本発明は、ＥｎｉｇｍａのＭｄｍ２−ｐ５３のユビキチンプロテオゾーム分解の調節機序研究、及び癌細胞でのＳＲＦ−Ｅｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２−ｐ５３経路を通じた作用機序研究などに有用に使用することができる。また、Ｅｎｉｇｍａの発現調節を通じての抗癌剤開発、Ｅｎｉｇｍａ発現またはＥｎｉｇｍａ−Ｍｄｍ２相互結合を用いた抗癌剤スクリーニング方法開発、及びＥｎｉｇｍａ発現を用いた抗癌剤治療の予後を評価する方法開発に有用に使用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を有効成分として含む抗癌用組成物。
【請求項２】
前記Ｅｎｉｇｍａの発現抑制剤が、Ｅｎｉｇｍａ遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド、短干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）及びＲＮＡｉからなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする請求項１に記載の抗癌用組成物。
【請求項３】
前記Ｅｎｉｇｍａの活性抑制剤が、Ｅｎｉｇｍａタンパク質に相補的に結合する化合物、ペプチド、ペプチドミメティクス及び抗体からなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする請求項１に記載の抗癌用組成物。
【請求項４】
前記短干渉ＲＮＡが、配列番号２あるいは３で表わされる塩基配列を有することを特徴とする請求項２に記載の抗癌用組成物。
【請求項５】
前記癌が、胃癌、肝癌及び大腸癌からなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする請求項１に記載の抗癌用組成物。
【請求項６】
Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を有効成分として含む抗癌補助剤。
【請求項７】
Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を癌にかかった個体に投与する工程を含む癌治療方法。
【請求項８】
Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制を通じてＨｄｍ２／Ｍｄｍ２（ｈｕｍａｎ／ｍｏｕｓｅ ｄｏｕｂｌｅ ｍｉｎｕｔｅ ２）の安定性を減少させる方法。
【請求項９】
Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制を通じてｐ５３の活性を増加させる方法。
【請求項１０】
１）候補物質が存在するまたは存在しない条件下でＥｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２を接触させる工程、
２）Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２の結合水準を測定する工程、及び
３）候補物質が存在しない時と比較してＥｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２の結合水準を減少させた候補物質を選別する工程を含む、抗癌剤候補物質のスクリーニング方法。
【請求項１１】
１）Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２を発現する細胞と候補物質を接触させる工程と、
２）細胞内Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２の結合水準を測定する工程、及び
３）候補物質を処理しない対照群と比較して細胞内Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２の結合水準を減少させた候補物質を選別する工程とを含む、抗癌剤候補物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
１）Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２を発現する細胞に候補物質を処理する工程と、
２）ＥｎｉｇｍａまたはＭｄｍ２の発現水準を測定する工程、及び
３）候補物質を処理しない対照群と比較してＥｎｉｇｍａまたはＭｄｍ２の発現水準を減少させた候補物質を選別する工程とを含む、抗癌剤候補物質のスクリーニング方法。
【請求項１３】
１）Ｅｎｉｇｍａ、Ｍｄｍ２及びｐ５３を発現する細胞に候補物質を処理する工程と、
２）ｐ５３の発現水準を測定する工程、及び
３）候補物質を処理しない対照群と比較してｐ５３の発現水準を増加させた候補物質を選別する工程とを含む、抗癌剤候補物質のスクリーニング方法。
【請求項１４】
Ｅｎｉｇｍａと反応する抗体またはＥｎｉｇｍａ遺伝子に相補的な核酸のうちのいずれか一つ以上を用いて、癌細胞でのＥｎｉｇｍａ発現水準を測定する工程を含む、癌の診断、治療結果確認または予後を評価する方法。
【請求項１５】
Ｅｎｉｇｍａと反応する抗体またはＥｎｉｇｍａ遺伝子に相補的な核酸のうちのいずれか一つ以上を含む癌診断用キット。
【請求項１】
Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を有効成分として含む抗癌用組成物。
【請求項２】
前記Ｅｎｉｇｍａの発現抑制剤が、Ｅｎｉｇｍａ遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド、短干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）及びＲＮＡｉからなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする請求項１に記載の抗癌用組成物。
【請求項３】
前記Ｅｎｉｇｍａの活性抑制剤が、Ｅｎｉｇｍａタンパク質に相補的に結合する化合物、ペプチド、ペプチドミメティクス及び抗体からなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする請求項１に記載の抗癌用組成物。
【請求項４】
前記短干渉ＲＮＡが、配列番号２あるいは３で表わされる塩基配列を有することを特徴とする請求項２に記載の抗癌用組成物。
【請求項５】
前記癌が、胃癌、肝癌及び大腸癌からなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする請求項１に記載の抗癌用組成物。
【請求項６】
Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を有効成分として含む抗癌補助剤。
【請求項７】
Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制剤を癌にかかった個体に投与する工程を含む癌治療方法。
【請求項８】
Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制を通じてＨｄｍ２／Ｍｄｍ２（ｈｕｍａｎ／ｍｏｕｓｅ ｄｏｕｂｌｅ ｍｉｎｕｔｅ ２）の安定性を減少させる方法。
【請求項９】
Ｅｎｉｇｍａの発現または活性抑制を通じてｐ５３の活性を増加させる方法。
【請求項１０】
１）候補物質が存在するまたは存在しない条件下でＥｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２を接触させる工程、
２）Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２の結合水準を測定する工程、及び
３）候補物質が存在しない時と比較してＥｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２の結合水準を減少させた候補物質を選別する工程を含む、抗癌剤候補物質のスクリーニング方法。
【請求項１１】
１）Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２を発現する細胞と候補物質を接触させる工程と、
２）細胞内Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２の結合水準を測定する工程、及び
３）候補物質を処理しない対照群と比較して細胞内Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２の結合水準を減少させた候補物質を選別する工程とを含む、抗癌剤候補物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
１）Ｅｎｉｇｍａ及びＭｄｍ２を発現する細胞に候補物質を処理する工程と、
２）ＥｎｉｇｍａまたはＭｄｍ２の発現水準を測定する工程、及び
３）候補物質を処理しない対照群と比較してＥｎｉｇｍａまたはＭｄｍ２の発現水準を減少させた候補物質を選別する工程とを含む、抗癌剤候補物質のスクリーニング方法。
【請求項１３】
１）Ｅｎｉｇｍａ、Ｍｄｍ２及びｐ５３を発現する細胞に候補物質を処理する工程と、
２）ｐ５３の発現水準を測定する工程、及び
３）候補物質を処理しない対照群と比較してｐ５３の発現水準を増加させた候補物質を選別する工程とを含む、抗癌剤候補物質のスクリーニング方法。
【請求項１４】
Ｅｎｉｇｍａと反応する抗体またはＥｎｉｇｍａ遺伝子に相補的な核酸のうちのいずれか一つ以上を用いて、癌細胞でのＥｎｉｇｍａ発現水準を測定する工程を含む、癌の診断、治療結果確認または予後を評価する方法。
【請求項１５】
Ｅｎｉｇｍａと反応する抗体またはＥｎｉｇｍａ遺伝子に相補的な核酸のうちのいずれか一つ以上を含む癌診断用キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公開番号】特開２０１０−２２２３４８（Ｐ２０１０−２２２３４８Ａ）
【公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−３６００３（Ｐ２０１０−３６００３）
【出願日】平成２２年２月２２日（２０１０．２．２２）
【出願人】（５０８１３９４５７）コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー (19)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月２２日（２０１０．２．２２）
【出願人】（５０８１３９４５７）コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー (19)
【Ｆターム（参考）】
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